본 발명은 세스트린2를 포함하는 전립선 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for preventing or treating prostate disease comprising sestrin2.
전립선(前立腺, prostate)은 정액의 구성성분인 전립선액을 생산해 요도로 배출하는 남성 생식기관으로 방광 바로 밑에서 요도를 반지처럼 감싸고 있다. 전립선에서 만들어진 전립선액은 정소에서 만들어져서 이동해 온 정자에게 영양을 공급하며, 사정된 정액이 굳지 않도록 액체 상태를 유지시킴으로써 정자가 활발하게 운동할 수 있도록 돕는다.The prostate is a male reproductive organ that produces prostatic fluid, a component of semen, and drains it into the urethra. It surrounds the urethra like a ring just below the bladder. Prostatic fluid produced in the prostate provides nutrients to sperm produced in the testis and moves through it, and helps sperm move actively by maintaining a liquid state so that ejaculated semen does not harden.
전립선과 관련된 질환으로 전립선비대증, 전립선염 및 전립선암이 대표적이다. ‘전립선비대증’ 또는 ‘양성전립선비대증(benign prostatic hyperplasia, BPH)’(Benign prostatic hyperplasia, BPH)은 요도 주위 전립선의 비정상적 증식으로 인해 요도를 압박하는 것에 의해 배뇨장애 등 각종 증상을 유발하게 되는데, 전립선의 조절되지 않는 비대와 요도의 억제로 인해 요로 간헐적 증가, 요로 빈도 증가, 요로 응급, 요로 흐름 약화 및 불완전한 방광 비움을 포함한 하부 요로 기능 장애를 일으키며, 이로 인해 삶의 질이 나빠지며 일상 생활에 부정적인 영향을 미치게 된다. 전립선비대증의 발병원인은 아직 명확하게 밝혀지지 않았으나, 신체적인 노화와 남성호르몬의 변화가 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 노화가 진행되면서 흔히 전립선 무게가 증가하며, 노인 남성에게서 전립선비대증이 흔히 관찰되는 점에서 노화가 가장 큰 원인으로 알려져 있으나, 최근 20대의 전립선 비대증 진료 인원의 연평균 증가율이 12.6%로 높은 증가율을 나타내는 등, 젊은 층에서의 발병 역시 증가하고 있는 추세이다. 노인이 아니더라도 혈액 내에 테스토스테론(Testosterone)이 과다하게 존재하면 전립선 조직에 존재하는 5-알파환원효소에 의해 디하이드로테스토스테론(DHT, dihydrotestosterone)이 다량 합성되며, 디하이드로테스토스테론은 전립선 상피와 버팀질 세포 핵에 존재하는 안드로겐 수용체에 결합하여 상피와 버팀질의 세포질의 성장을 유도하게 되는 것드로 알려져 있다. 또한 노화가 진행되는 경우 전립선을 포함한 모든 조직에 세포의 노화가 축적되고, 노화된 세포는 대사적으로 활성화되어 BPH의 발병을 유도할 수 있는 과도한 염증성 분비를 나타내며, 세포 증식, 전립선 섬유증 및 상피-중간엽 전이(EMT)를 증가시킨다. 이 밖에도 세포증식과 세포사멸의 불균형, 성호르몬, 사이토카인의 비정상적 비율, 염증, 세포노화, 산화적 스트레스 등 여러 가지 병태생리학적 요인도 보고되었다. 그러나 BPH의 근본 원인은 아직까지 많이 알려져 있지 않았다. 전립선비대증은 그 자체가 치명적인 질환은 아니지만 삶의 질을 저하시키며, 적절한 치료를 하지 않고 방치하는 경우에는 신장 내 여러 결석질환을 유발하고 지속적인 방광내 잔뇨로 인한 요로감염, 심한 경우에는 요로패혈증을 일으겨 생명 유지에도 영향을 줄 수 있다.Representative diseases related to the prostate include benign prostatic hyperplasia, prostatitis, and prostate cancer. Benign prostatic hyperplasia (BPH) is a condition in which the prostate gland around the urethra protrudes abnormally, causing various symptoms such as urination disorders by compressing the urethra. Uncontrolled enlargement of the prostate and suppression of the urethra cause lower urinary tract dysfunction, including increased urinary frequency, urinary urgency, weakened urinary flow, and incomplete bladder emptying, which worsens the quality of life and negatively affects daily life. The cause of benign prostatic hyperplasia has not yet been clearly identified, but it is known that physical aging and changes in male hormones have an effect. As aging progresses, the weight of the prostate often increases, and since benign prostatic hyperplasia is commonly observed in elderly men, aging is known to be the biggest cause. However, the annual average increase rate of the number of patients in their 20s receiving treatment for benign prostatic hyperplasia has recently been high at 12.6%, showing that the incidence in the younger age group is also increasing. Even in people who are not elderly, if testosterone is excessively present in the blood, dihydrotestosterone (DHT) is synthesized in large quantities by 5-alpha reductase present in the prostate tissue, and dihydrotestosterone is known to bind to androgen receptors present in the nuclei of prostate epithelial and supportive cells, inducing the growth of the epithelium and supportive cytoplasm. In addition, as aging progresses, cellular senescence accumulates in all tissues, including the prostate, and aged cells are metabolically activated and exhibit excessive inflammatory secretion that can induce the onset of BPH, and increase cell proliferation, prostatic fibrosis, and epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). In addition, various pathophysiological factors such as imbalance of cell proliferation and apoptosis, abnormal ratio of sex hormones and cytokines, inflammation, cell aging, and oxidative stress have been reported. However, the fundamental cause of BPH is still not well known. Benign prostatic hyperplasia is not a fatal disease in itself, but it lowers the quality of life, and if left untreated, it can cause various stone diseases in the kidney, urinary tract infections due to persistent residual urine in the bladder, and in severe cases, urosepsis, which can affect life support.
전립선염은 전립선에 염증이 생기는 질병으로, 성인 남성의 약 50%가 평생동안 한번은 증상을 경험한다고 할 정도로 흔한 질환이다. 전립선염 중 감염에 의한 세균성 전립선염은 5~10% 정도에 불과하며, 대부분은 만성 비세균성 전립선염이 차지한다. 세균성 전립선염은 요로계 감염 시 세균이 요도를 통해 직접 감염이 되는 경우가 가장 흔하며, 이 외에도 전립선액의 배설장애, 전립선 내로의 요 역류, 치질이나 대장염과 같은 염증의 전염 등으로도 야기될 수 있다. 만성 비세균성 전립선염은 과음, 흡연, 과로, 스트레스 등 잘못된 생활습관이나, 노화에 의한 체내 과도한 염증 반응, 오래 앉아있거나 자전거 타기와 같이 전립선에 지속적인 자극을 주는 것이 원인으로 여겨진다.Prostatitis is a disease in which the prostate gland becomes inflamed. It is a common disease that about 50% of adult men experience symptoms at least once in their lifetime. Of the prostatitis cases, only 5-10% are bacterial prostatitis caused by infection, and most are chronic nonbacterial prostatitis. Bacterial prostatitis is most often caused by direct infection of the urethra with bacteria during urinary tract infection, but it can also be caused by problems with the excretion of prostatic fluid, urinary reflux into the prostate, and the spread of inflammation such as hemorrhoids or colitis. Chronic nonbacterial prostatitis is thought to be caused by bad lifestyle habits such as excessive drinking, smoking, overwork, and stress, excessive inflammatory reactions in the body due to aging, and continuous stimulation of the prostate such as sitting for a long time or riding a bicycle.
한편, 고도로 보존된 스트레스 유발성 단백질인 세스트린2(Sestrin2)는 세포 스트레스 자극을 조절하고 세포 항상성을 유지하여 산화 스트레스, 저산소증, 기아 및 DNA 손상과 같은 다양한 자극으로부터 유기체를 보호하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 여러 연구에서 세스트린2는 다양한 병리학적 조건에서 AMPK/mTOR 신호 전달 경로의 활성화를 통해 긍정적인 역할을 한다. 세스트린2는 AMPK 활성화를 통해 노화된 심장의 허혈성 스트레스를 개선하는 데 필수적인 역할을 하며(Quan N., et al., 2018), 미토파지를 상향 조절하여 AMPK/mTOR를 통해 신경 제거된 근육 위축을 예방하는 것으로 보고되었다(Yang, X., et al., 2021). 그럼에도 불구하고, 세스트린2의 발현 수준은 심장과 골격근을 포함한 다양한 조직에서 나이가 들수록 감소하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 나이와 관련된 대사 항상성 장애를 나타낼 수 있다.Meanwhile, Sestrin2, a highly conserved stress-induced protein, is known to regulate cellular stress stimuli and maintain cellular homeostasis, protecting organisms from various stimuli such as oxidative stress, hypoxia, starvation, and DNA damage. Several studies have shown that Sestrin2 plays a positive role in various pathological conditions through the activation of the AMPK/mTOR signaling pathway. Sestrin2 plays an essential role in improving ischemic stress in aged hearts through AMPK activation (Quan N., et al., 2018), and has been reported to prevent denervated muscle atrophy through AMPK/mTOR by upregulating mitophagy (Yang, X., et al., 2021). Nevertheless, the expression level of Sestrin2 has been found to decrease with age in various tissues, including the heart and skeletal muscle, which may indicate age-related metabolic homeostasis disorders.
또한 Hao Fu(2018) 등에 의하면 세스트린 2는 전립선암 세포주에서 발현이 낮으며, 인간 전립선암 PC3에서 Sestrin2를 과발현하면 종양 증식이 억제되고 이온화 방사선(IR)에 대한 민감성을 증가시키는 것을 보고하였으나, 세스트린2가 노화 또는 성 호르몬에 의하여 발병되는 전립선 비대증에서의 정확한 역할은 전혀 알려져 있지 않다.In addition, Hao Fu et al. (2018) reported that Sestrin 2 has low expression in prostate cancer cell lines, and that overexpression of Sestrin 2 in human prostate cancer PC3 inhibits tumor proliferation and increases sensitivity to ionizing radiation (IR). However, the exact role of Sestrin 2 in benign prostatic hyperplasia caused by aging or sex hormones is completely unknown.
본 발명의 목적은 세스트린2를 포함하는 전립선 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.The purpose of the present invention is to provide a composition for preventing or treating prostate disease containing sestrin2.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 세스트린2(sestrin2) 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 전립선 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In order to solve the above problem, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating prostate disease, which comprises sestrin2 protein or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient.
상기 전립선 질환은 전립선비대증 또는 전립선염일 수 있다.The above prostate disease may be benign prostatic hyperplasia or prostatitis.
세스트린2는 Hi95로도 알려져 있으며, 인간에서 SESN2 유전자 에 의해 인코딩되는 단백질이다. 세스트린2 단백질은 세포 성장과 생존을 조절하는 기능을 하는 것으로 알려져 있으며, 다양한 스트레스 조건에 대한 세포 반응에 관여할 수 있다. 또한 산화 스트레스를 억제하고 AMPK(아데노신 모노포스페이트 의존성 단백질 키나제)-포유류 라파마이신 표적(mTOR) 신호 전달을 조절하는 진화적으로 보존된 스트레스 유도성 단백질 계열을 구성하며, 대사 항상성의 중요한 조절자 역할을 한다.Sestrin2, also known as Hi95, is a protein encoded by the SESN2 gene in humans. Sestrin2 protein is known to function in regulating cell growth and survival, and may be involved in cellular responses to various stress conditions. It also constitutes an evolutionarily conserved family of stress-inducible proteins that suppress oxidative stress and modulate adenosine monophosphate-dependent protein kinase (AMPK)-mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling, acting as an important regulator of metabolic homeostasis.
본 발명의 목적 달성을 위하여 본 발명의 효과를 달성하는 한, 다양한 유래 및/또는 형태의 세스트린2 단백질(또는 유전자)이 사용될 수 있다. 야생형 서열은 물론, 세포내에서의 발현 또는 단백질의 안정성 등과 같은 특징이 유리하도록 염기서열의 일부가 인위적으로 변형된 유전자, 및 자연적으로 발견되는 염기서열 일부가 변형된 유전자 또는 이들의 모두의 단편을 포함하는 것이다. 유전자 염기서열의 변형은 상응하는 아미노산의 변형을 수 반하거나 하지 않을 수 있으며, 아미노산의 변형을 수반하는 경우에는 이러한 변형이 유발된 유전자는 이에 의해 코딩되는 단백질에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 암호화하는 것으로, 돌연변이체(mutants), 유도체(derivatives), 대립유전자(alleles), 변형체(variants) 및 동질체 (homologues)를 포함하는 것이다. 유전자 염기서열의 변이가 단백질 중의 아미노산의 변형을 수반하지 않는 경우는 예를 들어 축중변이가 있고, 이러한 축중변이체(degeneracymutants)도 본 발명의 상기 유전자에 포함된다. 인위적 유전자 염기서열의 변형은 당업자에게 잘 알려져 있는 방법, 예를 들어, 부위-유도성 돌연변이법 (sitedirected mutagenesis), 에러유발 PCR, 점돌연변이법 등에 의해 제조될 수 있다.In order to achieve the purpose of the present invention, various derived and/or formed Sestrin2 proteins (or genes) may be used as long as the effects of the present invention are achieved. In addition to the wild type sequence, it includes a gene in which a part of the base sequence is artificially modified to advantageously exhibit characteristics such as expression in a cell or protein stability, and a gene in which a part of the base sequence found naturally is modified, or a fragment of all of them. The modification of the gene base sequence may or may not entail a modification of the corresponding amino acid, and when it entails a modification of the amino acid, the gene in which such modification is induced encodes a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added and/or inserted in the protein encoded by it, and includes mutants, derivatives, alleles, variants and homologues. When the mutation of the gene base sequence does not entail a modification of the amino acid in the protein, there is, for example, a degeneracy mutation, and such degeneracy mutants are also included in the gene of the present invention. Mutations in the artificial genetic sequence can be prepared by methods well known to those skilled in the art, for example, site-directed mutagenesis, error-prone PCR, point mutagenesis, etc.
본원에 사용되는 단백질은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일 실시예에서, 단백질의 제조방법은 유전자 재조합 기술을 이용하는 것이다. 예를 들면, 상기 단백질을 코딩하는 상응하는 유전자를 포함하는 벡터를 원핵 또는 진핵세포 세포, 예를 들면 곤충세포, 포유류 세포에 전달하여 발현시킨 후 정제하여 사용할 수 있다. 상기 플라스미드는 예를 들면, pET28b(Novagen)과 같은 발현 벡터에 해당 유전자를 클로닝하여 세포주에 전달이입한 후, 발현된 단백질을 정제하여 사용할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 합성된 단백질은 침전, 투석, 이온교환 크로마토그라피, 겔-퍼미에이션 크로마토그라피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 항스크리닝 단백질 항체를 이용한 친화성 컬럼 등을 포함하는 컬럼 크로마토그라피로 분리 정제될 수 있다. 본 발명에서 세스트린2 단백질(이하 세스트린2로 지칭함)은 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.The protein used in the present invention can be produced using a method known in the art. In one embodiment, the method for producing the protein uses genetic recombination technology. For example, a vector containing a corresponding gene encoding the protein can be delivered to a prokaryotic or eukaryotic cell, such as an insect cell or a mammalian cell, expressed, and then purified and used. The plasmid can be used by cloning the corresponding gene into an expression vector such as pET28b (Novagen), transfecting it into a cell line, and then purifying the expressed protein, but is not limited thereto. The synthesized protein can be separated and purified by column chromatography including precipitation, dialysis, ion exchange chromatography, gel-permeation chromatography, HPLC, reverse phase-HPLC, SDS-PAGE for prep, and an affinity column using an anti-screening protein antibody. In the present invention, the Sestrin 2 protein (hereinafter referred to as Sestrin 2) can preferably be composed of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명의 용어, "단백질"이란, 아미노산이 펩티드결합으로 연결된 형태의 화합물을 의미하며, 본 명세서에서 상기 단백질은 펩타이드와 같은 의미로 사용될 수 있다.The term "protein" of the present invention means a compound in the form of amino acids linked by peptide bonds, and in this specification, the protein can be used in the same meaning as peptide.
상기 본 발명의 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 이들 조합에 의해 용이하게 변형될 수 있다. 따라서, 서열번호 1과 높은 상동성을 갖는 펩타이드 또는 단백질, 예를 들면 그 상동성이 70% 이상, 구체적으로 80% 이상의 높은 상동성을 갖는 펩타이드와 단백질 보다 바람직하게는 90% 이상의 높은 상동성을 갖는 펩타이드와 단백질도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The amino acid sequence of the present invention can be easily modified by substitution, deletion, insertion or a combination of these of one or more amino acids. Therefore, it should be interpreted that a peptide or protein having a high homology with SEQ ID NO: 1, for example, a peptide and protein having a high homology of 70% or more, specifically 80% or more, and preferably 90% or more, is also included in the scope of the present invention.
본 발명에서 "폴리뉴클레오티드"란, 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA), 리보핵산(ribonucleic acid, RNA) 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 뉴클레오티드 단위체가 공유결합에 의해 사슬모양으로 길게 이어진 뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 세스트린2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 또한, 상기 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.In the present invention, the "polynucleotide" may be deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), or a mixture thereof, and means a polymer of nucleotides in which nucleotide units are long in a chain shape by covalent bonds. The polynucleotide of the present invention means a polynucleotide encoding the Sestrin2 protein of the present invention. In addition, the polynucleotide of the present invention may be variously modified in the coding region within a range that does not change the amino acid sequence of the protein expressed from the coding region, taking into account the codon preferred in the organism that is to express the protein, and various modifications or modifications may be made in a portion excluding the coding region within a range that does not affect the expression of the gene. That is, as long as the polynucleotide of the present invention encodes a protein having an activity equivalent thereto, one or more nucleic acid bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, and these are also included in the scope of the present invention.
상기 본 발명의 재조합 벡터는 세포 내에 도입하여 본 발명의 단백질을 발현시키기 위한 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터 등 공지의 발현벡터를 사용할 수 있으며, 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다.The recombinant vector of the present invention is a means for introducing the protein of the present invention into a cell, and a known expression vector such as a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, etc. can be used, and the vector can be easily produced by a person skilled in the art according to any known method using DNA recombination technology.
본 발명은 세스트린2(sestrin2)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터로 형질전환된 세스트린2 과발현 세포주, 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating benign prostatic hyperplasia, which comprises as an active ingredient a polynucleotide encoding sestrin2, or a vector comprising the polynucleotide, or a sestrin2-overexpressing cell line transformed with the vector, or a culture medium thereof.
본 발명의 용어, "전립선 비대증(前立腺肥大症, benign prostatic hyperplasia)"이란, 전립선의 크기 또는 무게가 증가하는 증상을 말하며, 비대해진 전립선에 의해 방광출구 폐색을 일으켜 다양한 하부요로 증상을 일으킨다. 조직학적으로는 전립선의 간질이나 상피조직세포가 증식된 것으로 정의할 수 있다.The term "benign prostatic hyperplasia" of the present invention refers to a symptom in which the size or weight of the prostate increases, and causes bladder outlet obstruction due to the enlarged prostate, resulting in various lower urinary tract symptoms. Histologically, it can be defined as proliferation of stromal or epithelial tissue cells of the prostate.
본 발명의 용어, "예방"이란, 상기 조성물의 투여로 전립선 비대증을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.The term "prevention" of the present invention means any act of inhibiting or delaying benign prostatic hyperplasia by administering the composition.
본 발명의 용어, "치료"란, 상기 조성물의 투여로 전립선 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.The term "treatment" of the present invention means any action by which the symptoms of prostate disease are improved or beneficially changed by administration of the composition.
본 발명에서, 상기 약학 조성물은 전립선 질환의 예방 또는 치료방법에 이용될 수 있으며, 구체적으로 상기 예방 또는 치료방법은 전립선 질환이 발병되거나 또는 발병될 것으로 예상되는 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.In the present invention, the pharmaceutical composition can be used in a method for preventing or treating a prostate disease, and specifically, the method for preventing or treating a prostate disease can include a step of administering the composition to a subject other than a human who has developed or is expected to develop a prostate disease.
본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 상기 조성물을 도입하는 것을 의미한다.The term "administration" in the present invention means introducing the composition to a subject by an appropriate method.
본 발명의 용어 "개체"란, 전립선 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미하고, 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The term "subject" of the present invention means all animals, including rats, mice, and livestock, including humans, that have developed or can develop prostate disease, and specific examples thereof include mammals, including humans, but are not limited thereto.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들 면, 상기 조성물은 유효성분으로 1일 0.01 내지 500 mg/kg으로, 구체적으로 5 내지 100 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한 번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 세스트린2 단백질을 0.001 내지 50% 중량 백분율로 포함할 수 있다.The composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. The term "pharmaceutically effective amount" of the present invention means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dosage level may be determined according to factors including the type and severity of the individual, age, sex, activity of the drug, sensitivity to the drug, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field. For example, the composition may be administered as an active ingredient at a dosage of 0.01 to 500 mg/kg per day, specifically 5 to 100 mg/kg, and the administration may be administered once a day or in several divided doses. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may contain the Sestrin2 protein of the present invention at a weight percentage of 0.001 to 50% based on the total weight of the composition.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And may be administered singly or in multiple doses. It is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects by taking all of the above factors into consideration, and this can be easily determined by those skilled in the art.
본 발명의 전립선 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.The pharmaceutical composition for preventing or treating prostate disease of the present invention may further contain, in addition to the effective ingredients described above, a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent. The carrier, excipient and diluent may include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
본 발명의 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be formulated and used in the form of oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, or sterile injection solutions, respectively, according to conventional methods. Specifically, when formulating, it can be prepared using diluents or excipients such as fillers, weighting agents, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants that are commonly used. Solid preparations for oral administration include, but are not limited to, tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. Such solid preparations can be prepared by mixing at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc can also be used. In addition to liquids for oral administration, liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, flavoring agents, and preservatives can be added to prepare the preparations. Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories. Non-aqueous solvents and suspending agents can be used, such as propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate. Suppository bases can be used, such as withepsol, macrogol, Tween 61, cacao butter, laurin butter, and glycerogelatin.
본 발명의 상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally (e.g., intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically) depending on the intended method, and the dosage varies depending on the patient's condition and weight, the degree of disease, the drug form, the route of administration, and the time, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
본 발명에 따른 세스트린2는 전립선의 크기, 무게 또는 상피 두께를 감소시킬 수 있다.Sestrin2 according to the present invention can reduce the size, weight or epithelial thickness of the prostate.
본 발명은 세스트린2를 유효성분으로 포함하는 전립선 질환에 의한 배뇨장애 개선용 약학 조성물을 제공한다. 이때 상기 전립선 질환은 전립선비대증 또는 전립선염일 수 있다.The present invention provides a pharmaceutical composition for improving urination disorder caused by prostate disease, which contains sestrin2 as an effective ingredient. In this case, the prostate disease may be benign prostatic hyperplasia or prostatitis.
또한 본 발명은 세스트린2를 유효성분으로 포함하는 전립선비대증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.In addition, the present invention provides a health functional food for preventing or improving benign prostatic hyperplasia containing Sestrin 2 as an effective ingredient.
본 발명은 세스트린2를 포함하는 전립선 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 전립선 질환이 유도된 동물모델에서 전립선의 크기, 무게 또는 상피 두께를 감소시키고 전립선 조직의 세포사멸 또는 세포증식을 조절하여 전립선 비대증을 억제하는 것을 확인함으로써 전립선 질환을 치료 또는 예방할 수 있다.The present invention relates to a composition for preventing or treating prostate disease, including sestrin2. Specifically, it is possible to treat or prevent prostate disease by confirming that the composition reduces the size, weight or epithelial thickness of the prostate in an animal model in which prostate disease is induced, and suppresses benign prostatic hyperplasia by regulating apoptosis or cell proliferation of prostate tissue.
도 1은 노화 전립선 질환 동물 모델에서 전립선 조직 내 세스트린2의 발현정 도를 나타낸 결과이다. (A) 3개월령, 13개월령 및 24개월령 마우스의 전립선 조직 내 세스트린2의 mRNA 발현량 (B) 3개월령, 13개월령 및 24개월령 마우스의 전립선 조직의 세스트린2 면역조직화학 염색 (스케일바 : 20 μm) (C) 3개월령, 13개월령 및 24개월령 마우스의 전립선 조직 내 세스트린2의 웨스턴 블롯 결과. (D) (C) 정량화 그래프. (3개월령과 비교하여 * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001).
도 2는 노화 전립선 질환 동물 모델에서 세스트린2가 전립선의 크기 및 무게에 미치는 효과를 나타낸 것이다. (A) 3개월령, 24개월령 마우스, 및 24개월령 세스트린2 단백질 투여군 마우스(24months+Sestrin2)의 전립선 크기 측정 사진 (B) 3개월령, 24개월령 마우스, 및 24개월령 세스트린2 단백질 투여군 마우스(24months+Sestrin2)의 체중, 전립선 무게 및 체중으로 표준화한 전립선 무게 (C) (B)의 체중으로 표준화한 전립선 무게를 나타낸 그래프. (3개월령과 비교하여 *p < 0.05; *p < 0.01; *** p < 0.001, 24개월령과 비교하여 #p < 0.05; ##p < 0.01; ### p < 0.001).
도 3은 노화 전립선 질환 동물 모델에서 세스트린2가 전립선 상피 두께에 미치는 효과를 나타낸 것이다. (A) 3개월령, 24개월령 마우스, 및 24개월령 세스트린2 단백질 투여군 마우스(24months+Sestrin2)의 H&E 염색 사진 (스케일바 : 50 μm) (B) (A) 정량화 그래프. (3개월령과 비교하여 *p < 0.05; *p < 0.01; *** p < 0.001, 24개월령과 비교하여 #p < 0.05; ##p < 0.01; ### p < 0.001).
도 5는 테스토스테론(TP) 유도 전립선 비대증 동물 모델에서 세스트린2가 전립선의 크기 및 무게에 미치는 효과를 나타낸 것이다. (A) 대조군(Control), TP 투여군(TP), TP 및 피나스테라이드 투여군(TP+Fina) 및 TP 및 세스트린2 투여군(TP+Sestrin2) 마우스의 전립선 크기 측정 사진 (B) 대조군(Control), TP 투여군(TP), TP 및 피나스테라이드 투여군(TP+Fina) 및 TP 및 세스트린2 투여군(TP+Sestrin2) 마우스의 체중, 전립선 무게 및 체중으로 표준화한 전립선 무게 (C) (B)의 체중으로 표준화한 전립선 무게를 나타낸 그래프. (대조군과 비교하여 *p < 0.05; *p < 0.01; *** p < 0.001, TP군과 비교하여 #p < 0.05; ##p < 0.01; ### p < 0.001).
도 6은 테스토스테론(TP) 유도 전립선 비대증 동물 모델에서 세스트린2가 전립선 상피 두께에 미치는 효과를 나타낸 것이다. (A) 대조군(Control), TP 투여군(TP), TP 및 피나스테라이드 투여군(TP+Fina) 및 TP 및 세스트린2 투여군(TP+Sestrin2) 마우스의 H&E 염색 사진 (스케일바 : 50 μm) (B) (A) 정량화 그래프. (대조군과 비교하여 *p < 0.05; **p < 0.01; *** p < 0.001, TP군과 비교하여 #p < 0.05; ##p < 0.01; ### p < 0.001).Figure 1 shows the results of showing the expression level of Sestrin 2 in prostate tissues in an animal model of aging prostate disease. (A) mRNA expression level of Sestrin 2 in prostate tissues of 3-month-old, 13-month-old, and 24-month-old mice. (B) Immunohistochemical staining of Sestrin 2 in prostate tissues of 3-month-old, 13-month-old, and 24-month-old mice (scale bar: 20 μm). (C) Western blot result of Sestrin 2 in prostate tissues of 3-month-old, 13-month-old, and 24-month-old mice. (D) (C) Quantification graph. (Compared to 3-month-old: * p <0.05; ** p <0.01; *** p < 0.001).
Figure 2 shows the effect of Sestrin2 on the size and weight of the prostate in an animal model of aging prostate disease. (A) Photographs of prostate sizes of 3-month-old, 24-month-old, and 24-month-old Sestrin2 protein-administered mice (24 months+Sestrin2). (B) Body weight, prostate weight, and prostate weight normalized to body weight of 3-month-old, 24-month-old, and 24-month-old Sestrin2 protein-administered mice (24 months+Sestrin2). (C) Graph showing prostate weight normalized to body weight in (B). (Compared to 3-month-old: *p <0.05; *p <0.01; *** p < 0.001, compared to 24-month-old: #p <0.05;##p<0.01;### p < 0.001).
Figure 3 shows the effect of Sestrin2 on prostate epithelial thickness in an animal model of aging prostate disease. (A) H&E staining images of 3-month-old mice, 24-month-old mice, and 24-month-old Sestrin2 protein-administered mice (24 months+Sestrin2) (scale bar: 50 μm) (B) (A) Quantification graph. (Compared to 3-month-old: *p <0.05; *p <0.01; *** p < 0.001, compared to 24 months-old: #p <0.05;##p<0.01;### p < 0.001).
Figure 5 shows the effect of Sestrin2 on the size and weight of the prostate in a testosterone (TP)-induced benign prostatic hyperplasia animal model. (A) Photographs of prostate size measurements in mice treated with TP, TP, TP and finasteride (TP+Fina), and TP and Sestrin2 (TP+Sestrin2). (B) Body weight, prostate weight, and prostate weight normalized to body weight in mice treated with TP, TP, TP and finasteride (TP+Fina), and TP and Sestrin2 (TP+Sestrin2). (C) A graph showing the prostate weight normalized to body weight in (B). (Compared to the control group: *p <0.05; *p <0.01; *** p < 0.001, compared to the TP group: #p <0.05;##p<0.01;### p < 0.001).
Figure 6 shows the effect of Sestrin2 on prostatic epithelial thickness in a testosterone (TP)-induced benign prostatic hyperplasia animal model. (A) H&E staining images of mice in the control group (Control), TP administration group (TP), TP and finasteride administration group (TP+Fina), and TP and Sestrin2 administration group (TP+Sestrin2) (scale bar: 50 μm) (B) (A) Quantification graph. (Compared to the control group, *p <0.05; **p <0.01; *** p < 0.001, compared to the TP group, #p <0.05;##p<0.01;### p < 0.001).
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 여기서 소개되는 내용은 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the embodiments described herein and may be embodied in other forms, and the contents introduced herein are provided to sufficiently convey the idea of the present invention.
<<실시예Example 1. 노화 전립선 질환 동물 모델에서1. In an animal model of aging prostate disease세스트린2Sestrin 2 효과>Effect>
노화 동물 모델Aging animal models
23개월령차 마우스를 노화에 의한 전립선 질환 모델로 사용하였다. 수컷 C57BL/6 마우스(8주령 마우스 6마리, 12개월령 마우스 6마리, 23개월령 마우스 12마리) 총 24마리를 한국기초과학지원연구원 노화과학동물시설(한국, 광주)에서 입수하여 본 실험 전 7일 동안 충남대학교 실험동물센터에서 순화과정 후 실험에 사용하였다. 본 발명에 사용한 모든 동물 실험 프로토콜은 충남대학교 동물윤리위원회(202307A-CNU-136)의 승인을 받았으며, 국립 보건원의 실험 동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었다. 모든 동물은 실온(20-24℃) 및 습도(50-60%)의 특정 병원균이 없는 조건에서 사육하였다.23-month-old mice were used as a model of prostate disease caused by aging. A total of 24 male C57BL/6 mice (6 mice aged 8 weeks, 6 mice aged 12 months, and 12 mice aged 23 months) were obtained from the Korea Basic Science Institute Aging Science Animal Facility (Gwangju, Korea) and used in the experiment after an acclimatization process at the Chungnam National University Experimental Animal Center for 7 days prior to the present experiment. All animal experiment protocols used in the present invention were approved by the Chungnam National University Animal Ethics Committee (202307A-CNU-136) and were performed in accordance with the National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. All animals were raised under specific pathogen-free conditions at room temperature (20-24℃) and humidity (50-60%).
상기 준비된 23개월 마우스 6마리에게 희생 전 연속 14일 동안 세스트린2 재조합 단백질(0.1mg/kg, MyBioSource, San Diego, USA)을 복강 내 주사했다.Six 23-month-old mice prepared above were intraperitoneally injected with Sestrin2 recombinant protein (0.1 mg/kg, MyBioSource, San Diego, USA) for 14 consecutive days before sacrifice.
전립선 적출Prostatectomy
각각 동물 실험 종료 하루 전, 사료섭취에 따른 체중 변화의 최소화를 위하여 24시간 절식 후, 모든 실험 동물의 체중을 측정하였다. 실험이 끝난 후 마우스를 CO2로 마취하여 전립선절제술을 시행하였다. 해부현미경을 이용하여 각 마우스의 전립선을 잘라내고 적출한 전립선에 붙어있는 지방 및 이물질 제거 후 전립선의 무게를 측정하였다. 이후, 전립선 조직의 절반은 즉시 10% 중성 포르말린(Sigma Aldrich, St. Louis, USA)으로 고정하였고, 나머지 전립선 조직은 -70℃에서 동결시켰다.The day before the end of each animal experiment, all experimental animals were fasted for 24 hours to minimize weight changes due to feed intake. After the experiment, the mice were anesthetized withCO2 and underwent prostatectomy. The prostate of each mouse was removed using a dissecting microscope, and the fat and foreign substances attached to the removed prostate were removed, and the weight of the prostate was measured. After that, half of the prostate tissue was immediately fixed in 10% neutral formalin (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), and the remaining prostate tissue was frozen at -70℃.
노화Aging전립선 질환Prostate Disease 동물 모델에서In animal models세스트린Sestrin 2의 발현 변화Expression changes of 2
자연적 BPH와 세스트린2의 상관관계를 평가하기 위하여 노화된 마우스 전립선에서 Sestrin2의 발현을 조사했다. 상시 수득한 3개월령, 13개월령 및 24개월령 마우스의 전립선 조직에서 정량적 실시간 PCR을 수행하였다. TRIzol 시약(Takara, Japan)을 사용하여 마우스의 전립선 조직에서 총 RNA를 분리했다. 마우스 백혈병 바이러스 역전사효소(Moloney-murine leukemia virus reverse transcriptase, Promega, Madison, USA)와 무작위 헥사머 프라이머(BioFact, Korea)를 사용하여 RNA를 상보적인 DNA로 역합성했다. 정량적 실시간 PCR은 QuantStudio 1 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, Waltham, USA)을 이용하여 SYBR green(Smartgene, Daejeon, Korea)으로 4회 수행하였다. 각 그룹의 비교 역치 사이클(Ct) 값을 사용하여 상대 mRNA 발현을 조사하고 β-액틴으로 정규화하여 그 결과를 도 1A에 나타내었다. 실험은 Han, D(2022) 방법에 따라 수행되었으며, 사용된 프라이머의 서열은 아래와 같습니다.: 마우스 세스트린2: 정방향 5’-TAGCCTGCAGCCTCACCTAT-3’, 역방향 5’-TATCTGATGCCAAAGACGCA-3’; 마우스β-액틴: 정방향 5’- GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’, 역방향 5’- CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’.To evaluate the correlation between natural BPH and Sestrin2, the expression of Sestrin2 was investigated in aged mouse prostates. Quantitative real-time PCR was performed on prostate tissues from 3-month-old, 13-month-old, and 24-month-old mice obtained periodically. Total RNA was isolated from mouse prostate tissues using TRIzol reagent (Takara, Japan). RNA was desynthesized into complementary DNA using Moloney-murine leukemia virus reverse transcriptase (Promega, Madison, USA) and random hexamer primers (BioFact, Korea). Quantitative real-time PCR was performed four times with SYBR green (Smartgene, Daejeon, Korea) using a QuantStudio 1 real-time PCR system (Applied Biosystems, Waltham, USA). The relative mRNA expression was examined using the comparative threshold cycle (Ct) values of each group, which were normalized to β-actin, and the results are shown in Fig. 1A. The experiments were performed according to the method of Han, D (2022), and the sequences of the primers used are as follows: mouse sestrin2 : forward 5'-TAGCCTGCAGCCTCACCTAT-3', reverse 5'-TATCTGATGCCAAAGACGCA-3'; mouseβ-actin : forward 5'- GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3', reverse 5'- CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'.
도 1A에서 보는 바와 같이 세스트린2의 mRNA 수준은 연령이 증가함에 따라 점차적으로 유의하게 하향 조절되었다.As shown in Figure 1A, the mRNA level of Sestrin2 was significantly and gradually down-regulated with age.
면역조직학 분석Immunohistochemical analysis
상기 수득한 마우스의 고정된 전립선 조직을 파라핀에 묻혀서 5μm 두께의 단면으로 절단하였다. 상기 파라핀 절편을 수집하고 헤마톡실린/에오신(H/E)에 대해 염색했다. 면역 염색을 위해 파라핀 절편을 탈파라핀화하고 탈수한 후 구연산염 완충액(pH 6.0)을 사용하여 항원 복구를 수행했다. 이후 절편을 3% 과산화수소와 함께 배양하여 내인성 퍼옥시다제를 억제했다. 그 다음, 정상 염소 혈청으로 블로킹한 후, 절편을 4℃에서 밤새 1차 세스트린2 항체(Proteintech, Illinois, USA)와 함께 배양하였다. 이후, 실온에서 1시간 동안 양 고추 냉이 퍼옥시다제 결합 2차 항체와 함께 배양한 후, 표적 항원을 디아미노벤지딘 키트(Vector Lab, Newark, USA)로 시각화하고 절편을 헤마톡실린(Dako, Glostrup, 덴마크)으로 대비염색하고, 그 결과를 도 1B에 나타내었다. 도 1B에서 보는 바와 같이, 세스트린2는 모든 연령의 전립선 선조에서 상피 세포의 정점 표면에서 분명하게 발현되며(갈색), 발현 수준은 개월령이 증가할수록 현저히 감소하여 24개월 만에 가장 낮은 발현을 보였다.The fixed prostate tissues of the obtained mice were embedded in paraffin and cut into 5-μm-thick sections. The paraffin sections were collected and stained with hematoxylin/eosin (H/E). For immunostaining, the paraffin sections were deparaffinized and dehydrated, and antigen retrieval was performed using citrate buffer (pH 6.0). The sections were then incubated with 3% hydrogen peroxide to inhibit endogenous peroxidase. Then, after blocking with normal goat serum, the sections were incubated with primary sestrin2 antibody (Proteintech, Illinois, USA) overnight at 4°C. Afterwards, after incubation with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody for 1 hour at room temperature, the target antigen was visualized with a diaminobenzidine kit (Vector Lab, Newark, USA), and the sections were counterstained with hematoxylin (Dako, Glostrup, Denmark), and the results are shown in Fig. 1B. As shown in Fig. 1B, Sestrin2 was clearly expressed (brown) at the apical surface of epithelial cells in prostate progenitors of all ages, and the expression level decreased significantly with increasing age, showing the lowest expression at 24 months.
웨스턴Western블롯팅Blotting 분석 analyze
상기수집된 전립선 조직을 방사면역침강 분석(RIPA; Sigma) 완충액에 용해시킨 후 비신코닌산(BCA; Thermofisher) 분석을 사용하여 정량화하였다. 웨스턴 블롯팅은 Hong, G.-L. 등(2020)의 방법에 따라 수행하였으며, 사용된 1차 항체는 β-actin(Abcam) 및 Sestrin2(Proteintech)였다. 2차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 강화된 화학발광 검출 키트(LPS Solution, Daejeon, Korea)를 사용하여 각 단백질 발현을 시각화하였다. 신호 강도는 CS 분석기 4(ATTO, Tokyo, Japan)를 사용하여 정량화하여 도 1C에 나타내었으며, 이를 정량화하여 도 1D에 그래프로 나타내었다. 도 1C 및 도 1D에서 보는 바와 같이, 웨스턴 블롯 분석에서는 세스트린2의 단백질 수준이 개월령이 증가함에 따라 점차 감소하는 것으로 나타났다.The collected prostate tissues were dissolved in radioimmunoprecipitation assay (RIPA; Sigma) buffer and quantified using bicinchoninic acid (BCA; Thermofisher) analysis. Western blotting was performed according to the method of Hong, G.-L. et al. (2020), and the primary antibodies used were β-actin (Abcam) and Sestrin2 (Proteintech). After incubation with secondary antibodies, the expression of each protein was visualized using an enhanced chemiluminescence detection kit (LPS Solution, Daejeon, Korea). The signal intensity was quantified using a CS analyzer 4 (ATTO, Tokyo, Japan) and shown in Fig. 1C, and this was quantified and presented as a graph in Fig. 1D. As shown in Fig. 1C and Fig. 1D, the Western blot analysis showed that the protein level of Sestrin2 gradually decreased with increasing age.
결과는 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, GraphPad Prism 5으로 모든 통계 분석에 Tukey 방법을 사용한 일원 분산 분석(One-way ANOVA)을 사용했다. p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 통계 분석은 이하 실험에서 동일하게 적용하였다.Results are expressed as mean ± standard deviation, and one-way ANOVA with Tukey's method was used for all statistical analyses using GraphPad Prism 5. p < 0.05 was considered statistically significant. Statistical analysis was applied identically in the following experiments.
전립선 크기 및 무게 변화Changes in prostate size and weight
노화 전립선 질환 동물 모델에서 세스트린2의 투여가 전립선 질환에 영향을 미치는지 확인하였다. 상기에서 수득한 3개월령, 24개월령 및 세스트린2를 7 mg/kg/day로 14일간 복강 투여한 마우스의 적출된 전립선의 사진을 도 2A에 나타내었다. 도 2A에서 보는 바와 같이, 3개월령된 마우스의 전립선에 비해 24개월령 마우스의 총 해부학적 전립선 크기가 증가했다. 그러나 세스트린2를 처리한 24개월령 쥐의 전립선 크기는 24개월령 쥐의 전립선 크기에 비해 감소했다. 도 2B에는 3개월령, 24개월령 및 세스트린2를 7 mg/kg/day로 14일간 복강 투여한 마우스의 전립선 무게 및 몸무게로 표준화한 전립선 상대 무게를 나타내고 이를 도 2C에 그래프로 나타내었다. 도 2B 및 도 2C에서 보는 바와 같이, 해부학적 결과와 일치하게, 3개월령 마우스에 비해 24개월령 마우스에서 전립선 상대 무게가 현저히 증가했지만, Sestrin2 투여로 24개월령 마우스에서는 전립선 크기가 유의하게 감소한 것을 확인하였다.In an animal model of aging prostate disease, we investigated whether administration of Sestrin2 affects prostate disease. The images of the excised prostates of mice aged 3 months and 24 months and administered Sestrin2 at 7 mg/kg/day for 14 days intraperitoneally are shown in Fig. 2A. As shown in Fig. 2A, the total anatomical prostate size of 24-month-old mice increased compared to that of 3-month-old mice. However, the prostate size of 24-month-old mice treated with Sestrin2 decreased compared to that of 24-month-old mice. Fig. 2B shows the prostate weights and the relative prostate weights normalized to body weight of mice aged 3 months and 24 months and administered Sestrin2 at 7 mg/kg/day for 14 days intraperitoneally, and Fig. 2C presents these as a graph. As shown in Figures 2B and 2C, consistent with the anatomical results, the relative prostate weight was significantly increased in 24-month-old mice compared to 3-month-old mice, but Sestrin2 administration significantly reduced the prostate size in 24-month-old mice.
전립선 상피두께 측정Measurement of prostate epithelial thickness
전립선 비대증은 전립선 크기 및 무게 증가와 함께 상피 두께의 증가를 포함한다. 이에 세스트린2의 투여가 노화 유도 전립선 질환 모델에서 전립선 상피의 두께에 영향을 미치는지 확인하였다.Benign prostatic hyperplasia involves an increase in epithelial thickness along with an increase in prostate size and weight. Therefore, we investigated whether administration of Sestrin2 affects the thickness of the prostate epithelium in an age-induced prostate disease model.
상기에서 수득한 각 군의 전립선 조직을 상기와 동일한 방법으로 헤마톡실린/에오신(H/E) 염색하여 도 3A에 나타내었으며, 상피 두께를 측정하여 도 3B에 나타내었다. 도 3A 및 도 3B에서 보는 바와 같이, 노화 유도된 마우스군 전립선의 상피 두께는 대조군과 비교하여 약 2배 증가하였다. 전립선 세포의 형태 또한, 3개월령의 전립선은 직육면체 내지 단순 원주 상피를 갖는 둥글고 규칙적인 선방의 조직학적 패턴을 보였으나 24개월령 마우스의 전립선은 각 선방의 불규칙한 윤곽을 나타내었으며, 압축된 키가 큰 원주 상피 및 더 많은 접힘을 갖는 전립선 과형성 조직학 패턴을 보여주었다. 그러나 Sestrin2 투여는 24개월령 생쥐의 조직학적 패턴을 변화시켜 선방의 성장과 접힘을 감소시키고, 상피 패턴을 단순한 원주형으로 변화시켰다.The prostate tissues of each group obtained above were stained with hematoxylin/eosin (H/E) in the same manner as above, and are shown in Fig. 3A, and the epithelial thickness was measured, and is shown in Fig. 3B. As shown in Fig. 3A and Fig. 3B, the epithelial thickness of the prostates of the aged mouse group increased by about 2-fold compared to the control group. The morphology of prostate cells In addition, the prostates of 3-month-old mice showed a histological pattern of round and regular acinar cells with rectangular parallelepiped to simple columnar epithelium, but the prostates of 24-month-old mice showed irregular outlines of each acinar cell, and showed a histological pattern of prostatic hyperplasia with compressed tall columnar epithelium and more folds. However, Sestrin2 administration changed the histological pattern of 24-month-old mice, reducing the growth and folding of acinar cells, and changing the epithelial pattern to a simple columnar shape.
<<실시예Example 2. 테스토스테론 유도 전립선 비대증 동물 모델에서2. In an animal model of testosterone-induced benign prostatic hyperplasia세스트린2Sestrin 2 효과>Effect>
테스토스테론 유도 동물 모델Testosterone-induced animal model
4주간 마우스에 테스토스테론(Testosterone propionate, TP)을 투여하여 전립선 비대증을 유도하였다. 7주령 수컷 C57BL/6 마우스 24마리(오리엔트바이오, 한국,성남)에서 입수하여 본 실험 전 7일 동안 충남대학교 실험동물센터에서 순화과정 후 실험에 사용하였다. 상기 모든 동물 실험 프로토콜은 충남대학교 동물윤리위원회(202307A-CNU-136)의 승인을 받았으며, 국립 보건원의 실험 동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었다. 모든 동물은 실온(20-24℃) 및 습도(50-60%)의 특정 병원균이 없는 조건에서 사육하였다.Testosterone propionate (TP) was administered to mice for 4 weeks to induce benign prostatic hyperplasia. Twenty-four 7-week-old male C57BL/6 mice (Orient Bio, Seongnam, Korea) were obtained and used in the experiment after acclimatization for 7 days at the Chungnam National University Laboratory Animal Center. All of the above animal experiment protocols were approved by the Chungnam National University Animal Ethics Committee (202307A-CNU-136) and performed in accordance with the National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. All animals were raised under specific pathogen-free conditions at room temperature (20-24℃) and humidity (50-60%).
상기 24마리 수컷 C57BL/6 마우스를 6마리씩 4개 군으로 무작위로 나누고 하기 3개 군에 테스토스테론 7 mg/kg로 피하주사하여 전립선비대증을 유도하였다. TP는 콘 오일(sigma aldrich)에 용해 후, 매일 1회씩 27 gauge 주사바늘이 부착된 1ml 주사기로 28일 간 피하 주사하였다. 대조군은 동량의 콘 오일을 피하주사하였다. TP 유도 마우스 3개 군 중 1개 군에는 세스트린 재조합 단백질 0.1 mg/kg을 복강주사하였으며, 1개 군에는 양성대조군으로 피나스테라이드(Finasteride) 10 mg/kg을 경구투여하였다. TP 유도 마우스 1개 군 및 콘 오일투여군에는 인산완충생리식염수(PBS)를 복강주사하였다(표 1).The above 24 male C57BL/6 mice were randomly divided into 4 groups of 6 mice each, and the 3 groups were subcutaneously injected with 7 mg/kg of testosterone to induce benign prostatic hyperplasia. TP was dissolved in corn oil (Sigma Aldrich) and injected subcutaneously once daily for 28 days using a 1 ml syringe with a 27 gauge needle. The control group was injected subcutaneously with the same amount of corn oil. One group of TP-induced mice was intraperitoneally injected with 0.1 mg/kg of Sestrin recombinant protein, and one group was orally administered 10 mg/kg of Finasteride as a positive control. One group of TP-induced mice and the corn oil-administered group were intraperitoneally injected with phosphate-buffered saline (PBS) (Table 1).
TP 및 피나스테라이드 투여는 마우스 희생 전 28일 동안 진행하였고, 세스트린2 재조합 단백질은 마우스 희생 전 14일 동안 동시에 진행하였다.TP and finasteride administration was performed for 28 days before mouse sacrifice, and Sestrin2 recombinant protein was performed simultaneously for 14 days before mouse sacrifice.
전립선 적출Prostatectomy
각각 동물 실험 종료 하루 전, 사료섭취에 따른 체중 변화의 최소화를 위하여 24시간 절식 후, 모든 실험 동물의 체중을 측정하였다. 실험이 끝난 후 마우스를 CO2로 마취하여 전립선절제술을 시행하였다. 해부현미경을 이용하여 각 마우스의 전립선을 잘라내고 적출한 전립선에 붙어있는 지방 및 이물질 제거 후 전립선의 무게를 측정하였다. 이후, 전립선 조직의 절반은 즉시 10% 중성 포르말린(Sigma Aldrich, St. Louis, USA)으로 고정하였고, 나머지 전립선 조직은 -70℃에서 동결시켰다.The day before the end of each animal experiment, all experimental animals were fasted for 24 hours to minimize weight changes due to feed intake. After the experiment, the mice were anesthetized withCO2 and underwent prostatectomy. The prostate of each mouse was removed using a dissecting microscope, and the fat and foreign substances attached to the removed prostate were removed, and the weight of the prostate was measured. After that, half of the prostate tissue was immediately fixed in 10% neutral formalin (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), and the remaining prostate tissue was frozen at -70℃.
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전립선 크기 및 무게 변화Changes in prostate size and weight
TP 유도 전립선 동물 모델에서 세스트린2의 투여가 전립선 비대증에 영향을 미치는지 확인하였다. 상기에서 수득한 각 군의 마우스의 적출된 전립선의 사진을 도 5A에 나타내었다. 도 5A에서 보는 바와 같이, 대조군(Control)과 비교하여 TP군 마우스의 총 해부학적 전립선 크기가 증가하였으며, 피나스테라이드를 투여한 군(TP+Fina)은 전립선의 크기가 감소하였다. 또한 본 발명의 세스트린2를 투여한 군(TP+Sestrin2) 마우스 전립선은 크기가 현저히 감소하였다.In a TP-induced prostate animal model, it was confirmed whether administration of Sestrin2 affects prostate hypertrophy. The photographs of the extracted prostates of each group of mice obtained above are shown in Fig. 5A. As shown in Fig. 5A, compared to the control group (Control), the total anatomical prostate size of the TP group mice increased, and the group administered with finasteride (TP+Fina) showed a decrease in the size of the prostate. In addition, the size of the prostates of the mice administered with Sestrin2 of the present invention (TP+Sestrin2) was significantly reduced.
도 5B에는 각 군 마우스의 전립선 무게 및 몸무게로 표준화한 전립선 상대 무게를 나타내고 이를 도 5C에 그래프로 나타내었다. 도 5B 및 도 5C에서 보는 바와 같이, 해부학적 결과와 일치하게, 대조군 마우스에서 전립선 상대 무게가 현저히 증가했지만, 세스트린2 투여로 TP 유도 전립선 비대증 마우스에서는 전립선 크기가 유의하게 감소한 것을 확인하였다.Figure 5B shows the prostate weight and the relative prostate weight normalized to the body weight of each group of mice, and this is represented graphically in Figure 5C. As shown in Figures 5B and 5C, consistent with the anatomical results, the relative prostate weight was significantly increased in the control mice, but the prostate size was significantly reduced in the TP-induced benign prostatic hyperplasia mice by Sestrin2 administration.
전립선 상피두께 측정Measurement of prostate epithelial thickness
전립선 비대증은 전립선 크기 및 무게 증가와 함께 상피 두께의 증가를 포함한다. 이에 세스트린2의 투여가 TP 유도 전립선 비대증 모델에서 전립선 상피의 두께에 영향을 미치는지 확인하였다.Benign prostatic hyperplasia involves an increase in epithelial thickness along with an increase in prostate size and weight. Therefore, we investigated whether administration of Sestrin2 affects the thickness of the prostatic epithelium in a TP-induced BPH model.
상기에서 수득한 각 군의 전립선 조직을 상기와 동일한 방법으로 헤마톡실린/에오신(H/E) 염색하여 도 6A에 나타내었으며, 상피 두께를 측정하여 도 6B에 나타내었다. 도 6A 및 도 6B에서 보는 바와 같이, TP 유도된 마우스군(TP) 전립선의 상피 두께는 대조군과 비교하여 약 2배 증가하였으며, 양성 대조군인 피나스테라이드 투여는 TP로 유도된 전립선 상피 두께 증가를 현저히 억제하였다. 또한 본 발명의 세스트린2의 투여 역시 TP로 유도된 전립선 상피 두께 증가를 현저히 억제하였으며, 양성 대조군인 피나스테라이드와 동등 이상의 효과를 나타냄을 확인하였다.The prostate tissues of each group obtained above were stained with hematoxylin/eosin (H/E) in the same manner as above, and are shown in Fig. 6A, and the epithelial thickness was measured, and is shown in Fig. 6B. As seen in Figs. 6A and 6B, the epithelial thickness of the prostate of the TP-induced mouse group (TP) increased about 2-fold compared to the control group, and the administration of finasteride, as a positive control group, significantly inhibited the increase in prostate epithelial thickness induced by TP. In addition, it was confirmed that the administration of Sestrin2 of the present invention also significantly inhibited the increase in prostate epithelial thickness induced by TP, and exhibited an effect equal to or greater than that of finasteride, as a positive control group.
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