KR101632756B1 - Method for assessing cultured cell - Google Patents

Abstract

Translated fromKorean

본 발명은 개체에 의한 편차가 있으므로 일정한 기준으로는 판단이 곤란했던 배양 세포의 종류 및 기능을 평가하는 방법에 관한 것으로서, 예를 들면 골형성능을 평가하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 배양 세포의 평가 방법은, 배양 세포로부터 목적으로 하는 세포를 판정하기 위해, 배양 세포의 복수의 검사값 또는 지표를 측정하고, 이들의 조합에 의해 정밀하게 세포의 기능을 예측, 판정하기 위한 평가 방법으로서, 각각의 검사값에 대하여 일정의 적합한 범위를 지정할 뿐만 아니라 적응 범위에서 벗어난 샘플이라도 다른 검사값 또는 지표를 참조함으로써 목적으로 하는 세포인 것을 판정 가능한 것을 특징으로 한다.The present invention relates to a method for evaluating the type and function of cultured cells, which are difficult to judge based on a certain standard because of deviation due to an individual. For example, the present invention provides a method for evaluating bone shape performance. The method for evaluating a cultured cell according to the present invention is a method for evaluating a cell in which a plurality of test values or indicators of a cultured cell are measured in order to determine a target cell from the cultured cells, The present invention is characterized in that it is possible to determine that a target cell is a target cell by referring not only to a certain suitable range for each test value but also to another test value or indicator even if the sample is out of the adaptation range.

Description

Translated fromKorean

배양 세포의 평가 방법{METHOD FOR ASSESSING CULTURED CELL}METHOD FOR ASSESSING CULTURED CELL [0002]

본 발명은 배양 세포의 평가 방법에 있어서, 특히 배양된 골형성성 세포(骨形成性 細胞)의 새로운 평가 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a new evaluation method of cultured osteogenic cells (osteogenic cells) in a method for evaluating cultured cells.

결손된 생체 조직의 재생을 도모하는 재생 의료의 실현이 요구되고 있다. 재생 의료는 본래 생체가 갖고 있는 치유 능력으로는 회복할 수 없게 된 생체 조직을, 세포, 생체 재료, 세포 성장 인자를 사용하여, 원래의 조직과 동일한 형태나 기능을 만들어내는 의료 기술이다.And realization of regenerative medicine for regenerating defective tissue is demanded. Regenerative medicine is a medical technology that uses the cells, biomaterials, and cell growth factors to produce the same shape and function as the original tissue.

재생 의료에는 일반적으로 간엽계 간세포(mesenchymal stem cell, 間葉系 幹細胞)가 이용되고 있다. 이 간엽계 간세포는 지방 세포나 골아세포 등의 여러 가지 세포로 분화 유도할 수 있는 것이 알려져 있지만, 수득된 세포가 목적으로 하는 기능을 갖고 있는지 여부를 사전에 판단하는 것은 곤란했다.Mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cells) are generally used for regenerative medicine. It is known that these hepatic hepatic cells can induce differentiation into various cells such as adipocytes and osteoblasts. However, it is difficult to judge in advance whether or not the obtained cells have a desired function.

또한, 골의 재생 의료에서도 골수 유래의 간엽계 간세포가 중심으로 이용되고, 그 외 지방 유래 간세포, 골막 유래 간세포, 활막 유래 간세포 등의 보고가 있다. 그 중에서도 골수 유래의 간엽계 간세포 또는 골수 간질 세포는, 채취가 비교적 용이하고 매우 높은 골형성능을 갖기 때문에, 현재 거의 모든 골 재생의 임상 응용에 이용되고 있다.In bone regeneration medicine, bone marrow-derived hepatic stem cells are mainly used, and other fat-derived hepatocytes, periosteum-derived hepatocytes, and synovial-derived hepatocytes are reported. Among them, mesenchymal stem cells or bone marrow stromal cells derived from bone marrow are used for clinical application of almost all bone regeneration since they are relatively easy to harvest and have very high bony performance.

그러나 이제까지의 본 발명자들의 보고에서, 사람 유래의 골형성성 세포에서는 세포의 개체 차가 큰 것이 명확해졌다. 또한 골형성능은 배양에 의해 빠르게 손실되는 것이 명확해졌다. 따라서 실제로 이식하는 세포가 골형성능을 갖는지 여부의 검토는 중요하지만, 이제까지 보고되어 있는 방법으로는 충분하지 않은 것으로 판명되었다. 특히 종래에는 세포의 알칼리 포스파타제 활성(ALP 활성)(특허문헌 1), 골계 마커의 유전자 발현(비특허문헌 1) 등이 이용되고 있다. ALP 활성은 골형성성 세포에 유용한 평가이지만, 그것만으로는 골형성성 세포를 정의하는 것은 곤란하다. 또한 골계 마커의 유전자 발현도 유용한 평가이지만, 본 발명자들의 연구 결과에서는 발현에 개체 차가 커서, 평가로서 이용할 경우에는 곤란한 경우도 인식되었다. 특히 개체 차가 큰 사람 유래 세포의 평가를 위해서는, 하나의 기준으로는 충분하지 않고, 복수의 평가법을 조합하여 신뢰성을 높이는 것이 중요하다고 생각되지만, 이와 같은 평가법은 이제까지 보고되어 있지 않다.However, in the reports of the present inventors so far, it has become clear that the osteogenic cells derived from humans have large individual differences in cells. It has also become clear that bone morphology is rapidly lost by culture. Thus, although it is important to examine whether the cells that actually transplant have a bony performance, it has been found that the methods reported so far are not sufficient. In particular, conventionally, alkaline phosphatase activity (ALP activity) of cells (Patent Document 1) and gene expression of bone marker (Non-Patent Document 1) have been used. Although ALP activity is an evaluation useful for osteogenic cells, it is difficult to define osteogenic cells alone. In addition, gene expression of the osteogenic marker is also a useful evaluation, but the present inventors have also recognized that the results of the present inventors indicate that the individual difference in expression is so large that it is difficult to use it as an evaluation. In particular, in order to evaluate human-derived cells having a large individual difference, it is considered that it is not sufficient as a single criterion and it is important to improve reliability by combining a plurality of evaluation methods. However, such an evaluation method has not been reported so far.

골형성성 세포라는 것은 골아세포 등의 골 형성에 필수인 세포라고 정의하지만, 여기서는 특히 이소성(異所性)으로 골 형성을 할 수 있는 세포를 골형성성 세포라고 정의하고 있다. 이소성이라는 것은, 본래 골이 없는 부분에서 골을 형성할 수 있는 능력이다. 이소성의 골형성능은 예를 들면 사람 세포를 유지하는 담체와 함께 면역부전(免疫不全) 동물의 피하로 이식하는 것에 의해 검증된다. 실제로 골 재생이 기대되는 부위는 골의 근방이지만, 골이 없는 부분을 향해 골 재생을 실시할 필요가 있으므로, 본래 골 재생에 필요해지는 능력은 이 이소성의 골형성능이 가장 적절한 평가법이라고 생각된다. 그러나 이제까지 이와 같은 관점에서 제작된 세포의 평가 방법은 없다.An osteogenic cell is defined as a cell essential for bone formation such as an osteoblast. Herein, cells capable of forming osteoblasts, in particular, are defined as osteogenic cells. Ectopicity is the ability to form a bone in a region that is originally free of bone. Ectopic osseointegration performance is verified by implanting, for example, subcutaneously into an immunodeficient animal with a carrier that maintains human cells. In fact, it is necessary to perform bone regeneration toward a bone-free portion in the vicinity of the bone, in which bone regeneration is expected in the vicinity of the bone. However, there is no method for evaluating cells produced from this viewpoint.

일본 공개특허공보 제2005-58225호Japanese Laid-Open Patent Publication No. 2005-58225

Nishimura et al., J Bone Miner Metab. 26, 203-212Nishimura et al., ≪ / RTI > J Bone Miner Metab. 26, 203-212

즉 이식에 의해 골 형성을 실시하기 위해서는, 도 1에 도시한 공정을 거친다. 도 1에 도시한 바와 같이, 이식 재료, 예를 들면 의사 골과립(擬似 骨顆粒)과 함께 골형성성 세포를 공존시켜 이식 부위에서 파골 세포에 의해 의사 골과립을 분해시키고, 한편 골아세포 등에 의해 진성골(眞性骨)을 재생시킨다. 이때 이식 재료중에서의 골형성성 세포의 수는 물론 중요한 인자이지만, 한편 적정한 골형성능이 유지되어 있는 것이 중요하다. 만약에 이들 골형성성 세포의 수가 적거나, 또는 골형성능이 열화된 세포를 이용한 경우에는 적정한 골 형성은 실시되지 않지만, 실제의 골 형성의 확인에는 상당히 장기간이 필요해진다. 만약에 골 형성이 적정하게 실시되어 있지 않은 경우에는, 다시 간엽계 간세포의 채취, 배양부터 이식 수술, 재생 확인을 실시하지 않으면 안되고, 수개월의 기간을 쓸데없이 낭비하게 될 뿐만 아니라 이식 수술 등의 환자에게 부담을 주는 처치를 반복하게 된다. 따라서 배양 세포의 기능을 적절하게 평가하는 것이 중요하다.That is, in order to perform bone formation by implantation, the process shown in Fig. 1 is carried out. As shown in FIG. 1, osteogenic cells are coexisted with a graft material, for example, pseudo-bone granules (pseudo bone granules) to decompose the osteoclast granules by osteoclasts at the graft site, Regenerates the genuine bone. At this time, the number of osteogenic cells in the graft material is of course an important factor, but it is important that the proper osseous performance is maintained. If the number of these osteogenic cells is small or the cells with degraded osteoid performance are used, adequate bone formation is not performed, but a considerably long period of time is required for confirmation of actual osteogenesis. If bone formation is not properly carried out, it is necessary to collect and cultivate hepatic mesenchymal stem cells again, to perform transplantation surgery and regeneration confirmation, and to waste the period of several months in a useless manner, And it is repeated. Therefore, it is important to properly evaluate the function of cultured cells.

한편, 세포의 배양 중에 골형성능의 판정을 실시할 때에도, 분화 유도중의 검사에 대해서는 필요한 시간도 수주일이 걸리므로 용이하게 반복할 수 없다.On the other hand, even when the bone-shape performance is determined during culturing of the cells, it takes several weeks for the examination during induction of differentiation, so that it can not be easily repeated.

그러나 종래 실시되었던 목적으로 하는 세포, 예를 들면 골형성성 세포인지 여부의 평가는 전술한 바와 같이 단일 판정 수법에 의해 실시되고, 평가 기준을 올리면 이식 후의 재생률은 어느 정도 높아지지만, 본래 사용 가능했던 배양 세포를 부적절하다고 판정할 수 있는 것으로 생각되며, 한편 평가 기준을 낮추면 골형성 불능의 배양 세포를 이식에 이용하게 된다. 또한 본 발명자들의 연구에 의해, 사람 세포에서는 거의 모든 검사값에 개체간의 편차가 크고, 일정한 기준값만으로 또는 단일 판정 기준만으로는 정확한 판단이 곤란하고, 현실적인 판정조차 곤란한 것이 명확해졌다.However, evaluation of whether or not the cell is a target cell that has been conventionally performed, for example, an osteogenic cell is carried out by a single judgment method as described above. If the evaluation standard is raised, the regeneration rate after transplantation is somewhat increased, It is considered that the cultured cells can be judged to be inadequate. On the other hand, when the evaluation standard is lowered, cultured cells unable to undergo osteogenesis are used for transplantation. Further, studies by the present inventors have revealed that, in human cells, the deviation between individuals is large in almost all of the test values, and it is difficult to accurately judge only with a constant reference value or a single determination criterion, and it is clear that even realistic judgment is difficult.

본 발명은 상기 과제를 감안하여 실시된 것으로서, 목적으로 하는 세포임을 판정할 수 있고 신뢰할 수 있는 평가 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 따른 평가 방법은 골형성성 세포에 대해 적합하게 사용할 수 있지만, 사람 세포가 가진 편차의 문제는 골형성성 세포 이외에도 널리 재생 의료나 세포 치료의 대상이 되는 많은 세포에 공통적인 문제라고 생각된다. 따라서 본 발명의 효과는 골형성성 세포 뿐만 아니라 널리 사람 세포를 이용한 세포 치료에 있어서, 수득된 세포가 목적으로 하는 세포인지 여부, 그리고 치료에 필요한 기능을 갖고 있는지 여부에 대한 유효한 평가 방법을 제공하는 것이다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to provide a reliable evaluation method capable of determining a target cell. Although the evaluation method according to the present invention can be suitably used for osteogenic cells, the problem of deviation of human cells is considered to be a problem common to many cells that are widely used for regenerative medicine or cell therapy in addition to osteogenic cells do. Therefore, the effect of the present invention provides an effective evaluation method for whether or not the obtained cells are the target cells and whether or not they have the functions required for treatment, in cell therapy using widely bone cells as well as osteogenic cells will be.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명자들이 예의 연구를 실시한 결과, 배양 세포에서 목적으로 하는 세포를 판정하기 위해, 배양 세포의 복수의 검사값 또는 지표를 측정하고, 이들을 조합함으로써 신뢰할 수 있는 평가 방법을 작성할 수 있는 것을 발견했다. 또한, 골형성성 세포(골형성 (+)세포)에 대해서는, 도 2에 도시한 골형성능 검사 수법을 개발하여 이식 후에 골형성이 적정하게 실시되는지 여부의 예측, 평가를 이식 수술 전에 적정하고 또 정밀하게 실시함으로써 유용한 골형성성 세포의 평가 방법을 작성할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.As a result of intensive studies conducted by the present inventors in order to solve the above-described problems, in order to determine a target cell in a cultured cell, a plurality of test values or indicators of the cultured cells are measured and combined to prepare a reliable evaluation method I found that I could. For the osteogenic cells (osteogenic (+) cells), the bone morphometric performance test method shown in Fig. 2 was developed and the prediction and evaluation as to whether or not the osteogenesis was appropriately performed after the implantation was evaluated before the implantation operation It is possible to prepare a method for evaluating a useful osteogenic cell by carrying out the method of the present invention precisely. Thus, the present invention has been completed.

즉, 본 발명에 따른 배양 세포의 평가 방법은, 배양 세포에서 목적으로 하는 세포를 판정하기 위해 배양 세포의 복수의 검사값 또는 지표를 측정하고, 이들의 조합에 의해 정밀하게 세포의 기능을 예측, 판정하기 위한 평가 방법으로서,That is, the method for evaluating cultured cells according to the present invention is a method for evaluating a cultured cell by measuring a plurality of test values or indicators of cultured cells to determine a target cell in the cultured cells, As an evaluation method for determining,

각각의 검사값에 대하여 일정의 적합한 범위를 지정할 뿐만 아니라 적응 범위에서 벗어난 샘플이라도 다른 검사값 또는 지표를 참조함으로써 목적으로 하는 세포임을 판정할 수 있는 것을 특징으로 한다.It is possible to determine that the target cell is a target cell by referring not only to a certain suitable range for each test value but also to a different test value or indicator even if the sample is out of the adaptation range.

또한, 본 발명의 배양된 골형성성 세포의 평가 방법은 1차 판정 기준, 2차 판정 기준 및 3차 판정 기준을 가진 배양 세포의 평가 방법에 있어서,Further, the method for evaluating cultured osteogenic cells of the present invention is a method for evaluating cultured cells having a primary determination standard, a secondary determination standard, and a tertiary determination standard,

1차 판정을 실시한 세포를, 추가로 2차 판정을 실시함으로써 골형성 (+)세포를 판정하고,Cells subjected to the primary determination are further subjected to secondary determination to determine bone formation (+) cells,

골형성 (+)세포인지의 여부를 판단하기 어려운 세포를, 추가로 3차 판정을 실시함으로써 골형성 (+)세포를 판정하는 것을 특징으로 한다.(+) Cells are judged by further performing a tertiary judgment on cells which are difficult to judge whether they are osteogenic (+) cells.

상기 1차 판정에서, 판정 기준은 ALP 활성(알칼리 포스파타제 활성), ALP 인덱스(분화 유도군의 ALP 활성값÷비분화 유도군의 ALP 활성값) 및 세포 증식능(분화 유도 후의 세포수÷초기 파종 세포수)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 1차 판정의 기준값 이상을 만족하는지 여부인 것이 바람직하다.In the primary determination, the criteria are ALP activity (ALP activity), ALP index (ALP activity value of differentiation inducing group / ALP activity value of non-differentiation inducing group) and cell proliferation ability (number of cells after induction of differentiation / Number) satisfies at least the reference value of the primary determination.

상기 2차 판정에서, 판정 기준은 ALP 활성, ALP 인덱스, 세포 증식능 전부가 2차 판정의 기준값 이상을 만족하는지 여부이고,In the secondary determination, the determination criterion is whether or not all the ALP activity, the ALP index, and the cell proliferation ability satisfy the reference value of the secondary determination or more,

1차 판정, 2차 판정 양쪽의 기준을 만족한 세포를 골형성 (+)세포라고 판정하고,Cells satisfying both criteria of the first judgment and the second judgment were judged to be osteogenic (+) cells,

1차 판정에서 기준을 만족하지 않았지만 2차 판정에서 기준을 만족한 세포에 대해서는 3차 판정 기준으로 이행하고,Cells that did not meet the criteria in the primary determination but met the criteria in the secondary determination proceeded to the tertiary determination criteria,

2차 판정에서 기준을 만족하지 않은 세포를 골형성 (-)세포라고 판정하는 것이 바람직하다.It is preferable to determine that the cells that do not satisfy the criteria in the secondary determination are osteogenic (-) cells.

상기 3차 판정에서, 판정 기준은 플로우 사이토메트리에 의한 표면 항원(HLA-DR) 해석, TRAP 염색 및 알리자린레드 염색으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 기준을 만족하는지 여부이고,In the tertiary determination, the criteria are whether or not at least one selected from the group consisting of surface antigen (HLA-DR) analysis by flow cytometry, TRAP staining and alizarin red staining satisfies the criteria,

이 기준을 만족한 세포를 골형성 (+)세포, 만족하지 않은 세포를 골형성 (-)세포라고 판정하는 것이 바람직하다.It is preferable to determine that the cells satisfying this criterion are osteogenic (+) cells and the unsatisfactory cells are osteogenic (-) cells.

상기 1차 판정에서, 기준값은 골형성 (-)세포의 각 (평균값+2SD)인 것이 바람직하다.In the primary determination, it is preferable that the reference value is the angle (average value + 2SD) of osteogenic (-) cells.

상기 2차 판정에서, 기준값은 골형성 (+)세포의 각 (평균값-2SD) 또는 골형성 (+)세포의 각 측정값의 하한값인 것이 바람직하다.In the secondary determination, the reference value is preferably a lower limit value of each measured value of the osteogenic (+) cells (average value -2 SD) or osteogenic (+) cells.

상기 3차 판정에서, 표면 항원(HLA-DR) 해석의 기준은 측정된 HLA-DR 양성 세포가 약 6% 이상인 것이 바람직하다.In the tertiary determination, it is preferable that the HLA-DR-positive cells measured by the surface antigen (HLA-DR) analysis are about 6% or more.

상기 1차 판정에서, ALP 활성의 기준값은 약 166 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)인 것이 바람직하다.In this first determination, the reference value of ALP activity is preferably about 166 units (μmol p-nitrophenol / min / μg protein produced).

상기 1차 판정에서, ALP 인덱스의 기준값은 약 3.95인 것을 특징으로 하는 배양된 골형성성 세포의 평가 방법.Wherein in the primary determination, the reference value of the ALP index is about 3.95.

상기 1차 판정에서, 세포 증식능의 기준값은 약 9.7인 것이 바람직하다.In the above primary determination, the reference value of the cell proliferation ability is preferably about 9.7.

상기 2차 판정에서, ALP 활성의 기준값은 약 67 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)인 것이 바람직하다.In this secondary determination, the reference value of ALP activity is preferably about 67 units (μmol p-nitrophenol / min / ug protein produced).

상기 2차 판정에서, ALP 인덱스의 기준값은 약 1.01인 것이 바람직하다.In the secondary determination, the reference value of the ALP index is preferably about 1.01.

상기 2차 판정에서, 세포 증식능의 기준값은 약 5.6인 것이 바람직하다.In the secondary determination, the reference value of the cell proliferation ability is preferably about 5.6.

본 발명에 따른 골형성성 세포의 평가 방법에 있어서, 판정 기준으로서 이용되는 ALP 활성은 골형성성 세포, 예를 들면 골아세포에서 높은 활성이 인식된다. 분화 유도 후의 ALP 활성이 낮은 경우에는, 골형성성 세포를 포함하지 않거나 또는 골형성능을 갖지 않은 세포일 가능성을 생각할 수 있지만, 본 발명자들의 연구에 의해 분화 유도군과 비분화 유도군의 ALP 활성의 비율인 ALP 인덱스가 상승할 경우에는 골형성성 세포로서, 또한 골형성능을 가진 경우가 있는 것이 나타나 있다. 한편, ALP 활성이 충분히 높으면 골형성성 세포의 분화 유도는 양호할 가능성이 매우 높다. 그러나 만약에 ALP 활성이 높아도 세포 증식능이 손실되면 골이식 후에 충분한 골형성을 기대할 수 없다.In the method for evaluating osteogenic cells according to the present invention, the ALP activity used as a judgment standard is recognized to be high in an osteogenic cell, for example, an osteoblast. When the ALP activity after induction of differentiation is low, it may be considered that the cells do not contain osteogenic cells or have no osteoid performance. However, the inventors of the present invention have found that the ALP activity of the differentiation inducing group and the non- In the case of an increase in the ALP index as a ratio indicates that the osteogenic cell has a bony function. On the other hand, if ALP activity is sufficiently high, induction of differentiation of osteogenic cells is highly likely to be good. However, even if the activity of ALP is high, loss of cell proliferative ability does not result in sufficient bone formation after bone grafting.

따라서 본 발명에 따른 평가 방법에서는, 세포 증식능의 평가도 실시하고 있다.Therefore, in the evaluation method according to the present invention, the cell proliferation ability is also evaluated.

상기 3가지 평가(ALP 활성, ALP 인덱스, 세포 증식능)를 조합해도 골형성성 세포의 유무를 판단하기 어려운 그룹에 대해서는, 보다 신중한 평가가 필요해진다. 본 발명자들은 이와 같은 그룹에 대해서는, 추가로 플로우 사이토메트리에 의한 표면 항원(HLA-DR)의 해석, TRAP 염색, 알리자린레드 염색의 결과를 이용하여, 어떠한 것이라도 양성(플로우 사이토메트리에 의한 HLA-DR 분획 양성, TRAP 양성, 알리자린레드 양성)을 갖고 보조적으로 골형성성 세포가 있다고 판단함으로써, 거의 모든 개체 차를 가진 샘플에 타당한 근거를 부여하는 것이다.A more careful evaluation is required for a group in which it is difficult to determine the presence or absence of osteogenic cells by combining the above three evaluations (ALP activity, ALP index, cell proliferation ability). The inventors of the present invention found that any of these groups were positive (flow cytometry HLA-DR by flow cytometry, analysis of surface antigen (HLA-DR), TRAP staining and alizarin red staining) DR fraction positive, TRAP positive, alizarin red positive) and adjuvant osteogenic cells, thus providing a reasonable basis for samples with almost all individual differences.

이 HLA-DR 양성 세포와 골형성능의 직접적인 관계는 불명확하지만, 본 발명자들이 확인한 바, HLA-DR 활성과 골형성능에는 명확한 상관 관계가 나타났다. 또한 TRAP 염색(주석산 내성 산성 포스파타제 염색)은 파골 세포 마커로서 이용되고 있지만, 파골 전구 세포로부터 파골 세포로의 성숙에는 골아세포(골형성성 세포)와의 상호작용(interaction)이 필요하므로, 간세포가 골형성성 세포로 분화되는 과정의 간접적인 지표로서 이용할 수 있다고 생각된다. 또한, 알리자린레드 염색은 시험관내에서의 석회화능을 나타내고, 칼슘의 침착을 염색한 것이다. 본 발명자들이 확인한 바, 골형성능을 나타내는 세포에서는 알리자린레드 염색 양성이 되고, 골형성능이 많은 세포에서 손실되는 계대(繼代)가 진행된 세포에서는 염색 음성이 되는 것이 나타났다.The direct relationship between this HLA-DR positive cell and the bone morphology is unclear, but the present inventors have found a clear correlation between HLA-DR activity and bone morphology. In addition, although TRAP staining (tartaric acid-resistant acid phosphatase staining) is used as an osteoclast marker, since maturation from osteoclast precursor cells to osteoclasts requires interaction with osteoblasts (osteogenic cells) And can be used as an indirect indicator of the process of differentiation into forming cells. In addition, alizarin red staining indicates the ability to calcify in vitro and stains the deposition of calcium. As a result of the inventors' observation, it was found that the cells exhibiting the osteosynthetic performance were negative for alizarin red staining, and the oocyte-laden cells showed negative staining on the cells that had undergone the loss.

이와 같이 본 발명에서는, 비교적 간단하고 명확한 수법인 ALP 활성 평가, ALP 인덱스, 세포 증식능 판정에 의해, 명확히 골형성능을 가진 것과 골형성능을 갖고 있지 않은 것을 선택하고, 이들 평가에서 명확하지 않은 군에 대해서는 HLA-DR 해석, TRAP 염색, 알리자린레드 염색을 실시하여, 골형성능을 충분히 기대할 수 있음에도 불구하고 「골형성능 없음」으로 하여 파기되는 것을 방지하는 것이다.As described above, in the present invention, those having clearly osteoform performance and those having no osteoform performance are selected by the ALP activity evaluation, the ALP index, and the cell proliferation ability determination, which are comparatively simple and clear methods, HLA-DR analysis, TRAP staining, and alizarin red staining are performed to prevent the bone structure from being destroyed as " no bony structure "

본 발명에 의하면, 개체에 의한 편차가 있으므로 일정의 기준으로 판단이 곤란했던 목적 세포의 종류 및 기능을 평가할 수 있는 방법을 제공할 수 있다. 또한 골형성성 세포의 평가를 실시하는 경우, 배양 세포의 골형성능에 대해 거의 확실히 평가하는 것이 가능해지고, 세포를 이용한 치료에 필수인 평가에 관한 방법을 제공할 수 있다.According to the present invention, it is possible to provide a method for evaluating the type and function of a target cell in which it is difficult to judge based on a certain criterion because there is a deviation due to an individual. In addition, when the evaluation of osteogenic cells is carried out, it becomes possible to almost completely evaluate the bone morphology of the cultured cells, and it is possible to provide a method for evaluation necessary for treatment using cells.

도 1은 골형성능 검사 스케쥴,
도 2는 본 발명에 따른 골형성성 세포의 평가 방법을 나타내는 플로우차트,
도 3은 본 발명이 바람직하게 적용되는 골형성성 세포의 배양 공정, 분화 유도 공정의 설명도,
도 4는 사람 배양 골아세포 유사(樣) 세포의 ALP 활성의 분포를 도시한 도면,
도 5는 사람 배양 골아세포 유사 세포의 ALP 인덱스의 분포를 도시한 도면,
도 6은 사람 배양 골아세포 유사 세포의 증식능의 분포를 도시한 도면,
도 7은 ALP 활성 측정 결과,
도 8은 세포 증식능 측정 결과,
도 9는 플로우 사이토메트리에 의한 표면 항원 해석 결과,
도 10은 TRAP 염색 측정 결과, 및
도 11은 알리자린레드 염색 결과이다.FIG. 1 is a diagram illustrating a bone structure test schedule,
2 is a flowchart showing a method for evaluating osteogenic cells according to the present invention,
Fig. 3 is an explanatory diagram of a process for culturing osteogenic cells to which the present invention is preferably applied, a process for inducing differentiation,
FIG. 4 shows the distribution of ALP activity in human cultured osteoblast-like cells,
5 shows the distribution of ALP indices of human cultured osteoblast-like cells,
6 shows the distribution of the ability of human cultured osteoblast-like cells to proliferate,
7 shows the results of ALP activity measurement,
8 shows the results of measurement of cell proliferation ability,
FIG. 9 shows the result of surface antigen analysis by flow cytometry,
Figure 10 shows the results of TRAP staining, and
Fig. 11 shows the result of alizarin red staining.

이하, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대해 설명한다. 이하, 목적으로 하는 세포가 골형성성 세포인 경우를 예로 들어 설명을 실시한다. 우선 본 발명의 골형성성 세포의 평가 방법에 의해 효과적으로 치료로 응용이 가능한 과립형 배양 골의 제조 방법에 대해, 도 3을 이용하여 설명한다. 과립형 배양 골은 골수액의 채취, 골수 유래 간엽계 간세포의 배양, 간엽계 간세포의 파종, 배양 골아세포 유사 세포로의 분화 유도를 실시함으로써 제조할 수 있다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described. Hereinafter, description will be given taking as an example the case where the target cells are osteogenic cells. First, a method for producing a granular culture bone which can be effectively applied for treatment by a method for evaluating an osteogenic cell of the present invention will be described with reference to Fig. Granule type cultured bone can be prepared by collecting bone marrow fluid, culturing bone marrow-derived mesenchymal stem cells, seeding mesenchymal stem cells, and inducing differentiation into cultured osteoblast-like cells.

또한, 이하의 공정은 골수 유래 세포를 이용한 형태를 나타내고 있지만, 본 발명의 평가 방법은 골수 이외에도 골막, 지방, 말초혈 등으로부터 분리 배양하고, 동일한 방법으로 배양 골아세포 유사 세포로 분화 유도함으로써 제작되는 과립형 배양 골에서도 바람직하게 사용할 수 있다.In addition, although the following steps show a form using bone marrow derived cells, the evaluation method of the present invention is produced by separately culturing from bone marrow, fat, peripheral blood, etc. in addition to bone marrow, and inducing differentiation into cultured osteoblast-like cells by the same method It can be preferably used also in a granular culture.

·골수액의 채취· Collection of bone marrow fluid

골수액은 수술 약 1개월 전에 채취한다. 우선 골수액 채취부에 국소마취를 실시하여, 후상장골능(後上腸骨稜)으로부터 무균적으로 흡인하여 회수한다.Bone marrow fluid is collected about one month before surgery. First, local anesthesia is performed on the bone marrow harvesting section, and aseptic suction is performed from the posterior supernumerary (posterior superior iliac crest) to recover.

· 골수 유래 간엽계 간세포의 배양· Culture of hepatocytes from mesenchymal stem cells from bone marrow

세포 배양용 배지로 4배 희석한 골수액(10)을 세포 배양용 플라스크(12)에 뿌려 도 3의 (A)와 같이 배양을 시작하고, 배양 개시 후 4일째에 전량 배지 교환을 실시한다. 또한, 세포 배양용 배지에는 1차 배양, 분화 배양 모두, 혈청이 들어간 αMEM 또는 무혈청 배지 중 어느 것을 사용할 수 있다.When thebone marrow fluid 10 diluted four times with the cell culture medium is sprayed on thecell culture flask 12, the culture is started as shown in (A) of Fig. 3, and the whole medium is changed on the fourth day after the start of the culture. In the cell culture medium, either αMEM containing serum or serum-free medium can be used for both the primary culture and the differentiation culture.

배양 과정에서의 일반 세균 및 진균에 감염되지 않은 상태의 확인은, 배지 교환시마다 배지를 관찰(감염되면 배지가 탁함)함으로써 실시하고, 또한 배양 개시시, 분화 유도전 및 배양 골아세포 유사 세포의 회수 시에 무균 시험(일본 약국방(藥局方)의 기준을 만족하는지 여부)으로 확인한다.Confirmation of the state not infected with general bacteria and fungi in the culture process is carried out by observing the medium every time the medium is exchanged (if the medium becomes infected, the medium becomes turbid), and at the start of culture, before the induction of differentiation, (As to whether it meets the Japanese Pharmacopoeia criteria).

그 후, 주 2회 전량 배지 교환을 실시한다. 계대의 타이밍은 세포의 상태를 보고 판단하지만, 배양 개시부터 약 21~28일 후에 실시한다. 계대시에는 살아있는 세포수를 계측한다.After that, the entire medium is exchanged twice a week. The timing of the passage is determined by observing the state of the cells, but is performed about 21 to 28 days after the initiation of culturing. Measure the number of living cells in the passage.

· 간엽계 간세포의 파종· Sowing of Hepatocyte

계대는 이하와 같이 실시한다. 플라스크의 배지를 빼낸 후, 둘베코 인산 버퍼(D-PBS)로 세정하고, 그 후 D-PBS를 빼내고 세포 해리제를 첨가하여, 37℃에서 10분간 배양한다. 세포가 해리되어 있는 것을 확인한 후, D-PBS 또는 배지를 첨가하여 세포를 회수한 후, 원심한다. 배지에 다시 현탁하여 세포 수를 계측한다. 계측 후, 도 3의 (B)와 같은 다공질 의사 골과립(14)이 미리 투입된 심저 용기(16)에, 배양한 골수액(10)을 투입한다. 골수액(10)을 의사 골과립(14)이 들어간 심저 용기(16)에 투입하면, 도 3의 (C)와 같이 골수액(10) 및 의사 골과립(14)은 부유한다.The passages are carried out as follows. After removing the culture medium from the flask, the plate is washed with Dulbecco's phosphate buffer (D-PBS), then D-PBS is removed, a cell dissociating agent is added, and the plate is incubated at 37 ° C for 10 minutes. After confirming that the cells are disassociated, D-PBS or medium is added to recover the cells, followed by centrifugation. The cells are suspended again in the medium to measure the number of cells. After the measurement, the culturedbone marrow fluid 10 is introduced into thebasal vessel 16 into which the porousdoctor bone granules 14 as shown in Fig. 3 (B) are previously charged. 3 (C), thebone marrow fluid 10 and thepseudo-bone graft 14 float when thebone marrow fluid 10 is injected into thebasal vessel 16 containing thepseudo-bone grains 14 therein.

·배양 골아세포 유사 세포로의 분화 유도· Induction of differentiation into cultured osteoblast-like cells

다공질 의사 골과립(14)에 세포를 파종하고 나서, 세포의 기능 회복을 위해 하룻밤 정치(靜置)한다. 1일 후에는, 도 3의 (D)와 같이 골 형성에 관여하는 세포 등의 세포 및 다공질 의사 골과립(14)은 심저 용기(16)의 하부에 침전되어 있다. 이를 확인한 후, 배지를 분화 유도 배지로 교환한다. 분화 유도 기간은 1~3 주일간이고, 배지 교환은 주 2회 정도 실시한다. 분화 유도가 진행되면, 도 3의 (E)와 같이 의사 골과립(14) 주위에 부착된 배양 골아세포 유사 세포의 형태가 변화되고, 골기질 단백을 분비하여 하나의 덩어리로 되어간다.After sowing the cells in the porousdoctor bone graft 14, the cells are allowed to stand overnight for restoration of cell function. After one day, as shown in Fig. 3 (D), cells such as cells involved in bone formation and the porouspseudo-bone grains 14 are settled in the lower portion of thebasal vessel 16. After confirming this, the medium is replaced with a differentiation induction medium. The differentiation induction period is 1 to 3 weeks, and the medium exchange is performed twice a week. As the induction of differentiation proceeds, the morphology of cultured osteoblast-like cells attached around thepseudo-bone granules 14 is changed as shown in (E) of FIG. 3, and the osteoblastic protein is secreted into a lump.

한편, 이 과정과 병행하여 평가하기 위해 세포를 12웰의 배양 접시에 파종한다. 세포는 1웰당 2×10⁴로 한다.On the other hand, the cells are sown in a 12-well culture dish for evaluation in parallel with this process. Cells should be 2 x 10⁴ per well.

이하, 본 발명에 따른 골형성성 세포의 평가 방법에 대해, 도 2의 플로우차트를 이용하여 설명한다. 도 2에 도시된 바와 같이, 골형성성 세포는 1차 판정 기준, 2차 판정기준, 3차 판정기준을 기초로 판정된다. 또한, 도 2의 괄호 내의 비율은 당초의 세포에 대한 비율을 나타낸다. 그러나 이들 비율은 일례로서 특별히 한정되지 않고, 이용하는 세포의 선택에 따라 다르다.Hereinafter, a method of evaluating osteogenic cells according to the present invention will be described with reference to the flowchart of Fig. As shown in Fig. 2, the osteogenic cells are judged on the basis of the primary judgment standard, the secondary judgment standard and the tertiary judgment standard. In addition, the ratio in parentheses in Fig. 2 represents the ratio to the original cells. However, these ratios are not particularly limited as an example and differ depending on the selection of the cell used.

1차 판정 기준Primary judgment criteria

1차 판정은 ALP 활성, ALP 인덱스, 세포 증식능을 기초로 실시된다.Primary determinations are based on ALP activity, ALP index, and cell proliferative capacity.

1차 판정에서, 상기 3가지 평가 방법 중 어느 하나의 기준값을 초과하는 경우에 세포는 1차 판정 기준(○)이라고 결정되고, 모든 기준값을 초과하지 않은 경우에 세포는 1차 판정 기준(×)이라고 결정된다.In the primary determination, when the cell exceeds the reference value of any one of the above three evaluation methods, the cell is determined as the primary determination reference (O), and when the cells do not exceed all of the reference values, .

2차 판정 기준Secondary Criteria

2차 판정도, 1차 판정과 마찬가지로 ALP 활성, ALP 인덱스, 세포 증식능을 기초로 실시된다. 그러나 하기에 나타내는 바와 같이 이들의 평가 기준값은 1차 판정과 다르다.The secondary determination is also carried out on the basis of ALP activity, ALP index, and cell proliferation ability as in the primary determination. However, as shown below, these evaluation reference values are different from the primary determination.

1차 판정 기준(○) 세포는, 2차 판정에서 상기 3가지 평가 방법 전체에서 기준값을 초과하는 경우에 세포는 골형성 (+)세포라고 판정되고, 어느 하나의 기준값을 초과하지 않는 경우는 세포는 골형성 (-)세포라고 판정된다.In the secondary determination, the cells are judged to be osteogenic (+) cells when they exceed the reference value in all of the above three evaluation methods, and when they do not exceed any of the reference values, (-) cells.

1차 판정 기준(×) 세포는, 2차 판정에서 상기 3가지 평가 방법 전체를 만족하는 경우에 세포는 3차 판정 기준으로 이행되고, 어느 하나의 기준값을 초과하지 않는 경우는 세포는 골형성 (-)세포라고 판정된다.Cells of the first judgment criterion (x) are subjected to the third criterion when the whole of the above three evaluation methods are satisfied in the second judgment, and when the cells do not exceed any one of the reference values, -) cells.

3차 판정 기준Tertiary decision criteria

3차 판정은, 플로우 사이토메트리에 의한 표면 항원 해석, TRAP 염색, 알리자린레드 염색을 기초로 실시된다.The tertiary determination is carried out on the basis of surface antigen analysis by flow cytometry, TRAP staining, and alizarin red staining.

3차 판정 기준에서, 어느 하나가 양성인 경우에 세포는 골형성 (+)세포라고 판정되고, 모두 음성인 경우에 세포는 골형성 (-)세포라고 판정된다.In the third criterion, the cells are judged to be osteogenic (+) cells when one is positive and the cells are judged to be osteogenic (-) cells when all are negative.

본 발명에 따른 골형성성 세포의 평가 방법에서는, 이와 같이 복수의 판정 기준을 조합하여 골형성 (+)세포인지 여부를 판정하고 있다. 이들 방법을 조합하는 것의 중요성은 이하와 같다.In the method for evaluating osteogenic cells according to the present invention, it is judged whether osteogenic (+) cells are formed by combining a plurality of criteria. The importance of combining these methods is as follows.

전술한 바와 같이, 이제까지의 골형성능의 확인에도 ALP 활성이 이용되어 왔다. 그러나 도 4에 도시한 바와 같이, ALP 활성의 분포에는 골형성능을 가진 세포와 갖지 않은 세포에서 근접되어 있어, 명확한 경계를 설정하는 것은 곤란했다. 낮게 설정하면 골형성능을 갖지 않은 세포를 많이 혼입시키게 되고, 높게 설정하면 골형성능을 가진 세포를 제외하게 된다.As described above, ALP activity has also been used to confirm the bone shape performance so far. However, as shown in Fig. 4, the distribution of ALP activity is close to that of cells having and without osteosynthesis, making it difficult to set clear boundaries. If set low, cells that do not have osteogenesis performance will be incorporated in large numbers, and if set high, osteogenesis cells will be excluded.

실제로 ALP 활성을 이용하여 판정 기준을 생각하는 경우, 예를 들면 골형성을 나타낸 세포의 ALP 활성의 평균값-2SD로 경계를 설정하는 것을 생각할 수 있다. ALP 활성값이 정규 분포를 한다고 상정한 경우, 실제로 골형성능을 가진 세포의 95.45%를 회수할 수 있지만, 도 4를 보면 한편 골형성능을 갖지 않은 세포도 대부분 회수해버릴 가능성이 있다.In fact, when considering the criteria based on the ALP activity, it is conceivable to set the boundary to the mean value -2SD of the ALP activity of the cells showing bone formation, for example. Assuming that the ALP activity value is a normal distribution, 95.45% of the cells having the bony performance can be recovered. However, as shown in Fig. 4, most of the cells having no bony performance are likely to be recovered.

또한, 골형성 (+)세포의 하한값으로 설정하는 것도 생각할 수 있다. 그러나 도 4를 보면 골형성 (+)세포의 하한값 이상에서도 골형성능을 갖지 않은 세포도 다수 존재한다.It is also conceivable to set the lower limit value of the osteogenic (+) cells. However, as shown in FIG. 4, there are many cells that do not have a bony function even at the lower limit of the bone formation (+) cell.

전술한 바와 같이, 본 발명자들에 의해 골형성능의 판정에 ALP 인덱스의 유용성이 보고되어 있다. 그러나 도 5를 보면 ALP 인덱스의 분포도 골형성능을 가진 세포와 갖지 않은 세포에서 근접되어 있어, 명확한 경계를 설정하는 것은 곤란했다.As described above, the usefulness of the ALP index has been reported by the present inventors in the determination of the bony performance. However, as shown in FIG. 5, the distribution of the ALP index is close to that of the cells having the bony performance, and it is difficult to set clear boundaries.

또한, 이제까지 골형성능의 판정에는 사용되고 있지 않지만, 본 발명자들에 의해 세포 증식능 중 특히 분화 유도 시의 증식능이 골형성능과 관계가 있는 것이 명확해지고 있다. 그러나, 도 6을 보면 세포 증식능의 분포도 골형성능을 가진 세포와 갖지 않은 세포에서 근접되어 있어, 명확한 경계를 설정하는 것은 곤란했다.Further, although it has not yet been used for the determination of the bone shape performance, it has become clear by the inventors of the present invention that the cell growth ability, particularly the ability to proliferate upon induction of differentiation, is related to the bone shape performance. However, as shown in Fig. 6, the distribution of cell proliferation ability is also close to that of cells having and without osteosynthesis, and it is difficult to set clear boundaries.

이상과 같기 때문에, 종래 이용되어 온 지표나 그 단순한 조합으로는 골형성 (+)세포의 적절한 판정은 곤란한 것을 알 수 있다.As described above, it can be seen that it is difficult to appropriately determine the osteogenic (+) cells using the conventionally used indicators or simple combinations thereof.

따라서, 본 발명자들은 상기 판정 방법으로는 골형성 (+)세포와 골형성 (-)세포의 데이터에서 겹치는 부분이 많기 때문에, 골형성 (+)세포만을 회수할 수 있는 엄격한 기준(1차 판정 기준)을 처음으로 마련한 것이다.Therefore, the inventors of the present invention have found that since there are many portions overlapping in the data of osteogenic (+) cells and osteogenesis (-) cells in the above determination method, strict criteria for collecting only osteogenic (+) cells ) For the first time.

그러나 1차 판정 기준에서는 선택되지 않은 부분에 골형성 (+)세포를 많이 포함하므로, 2차 판정 기준 및 3차 판정 기준을 이용하여 이들의 구제(救濟)를 실시하고 있다.However, since the primary selection criteria includes a large number of osteogenic (+) cells in the non-selected areas, these are rescued using the secondary and tertiary criteria.

또한, 1차 판정 기준을 만족하는 세포에도 약간은 골형성 (-)세포가 포함될 가능성이 있다. 이 때문에, 이들 세포에 대해서도 2차 판정 기준을 실시하고 있다.In addition, cells satisfying the primary criteria may contain some osteogenic (-) cells. For this reason, secondary determination criteria are also applied to these cells.

이와 같이 본 발명에 따른 골형성성 세포의 평가 방법에서는 1차 판정 ~ 3차 판정이 실시되지만, 그 결과로서 판정된 골형성 (+)세포는 본 발명자들에 의해 거의 100% 골형성 (+)세포라는 것이 명확해지고 있다.As described above, in the method for evaluating osteogenic cells according to the present invention, the first to third determination are carried out. As a result, the osteogenic (+) cells determined as a result are almost 100% It is becoming clear that it is a cell.

계속해서, 1차 판정 및 2차 판정에서 이용되는 기준에 대해 설명한다. 우선 기준값, 평가 방법(ALP 활성, ALP 인덱스, 세포 증식능)에 대해 상세히 설명한다.Subsequently, the criteria used in the primary determination and the secondary determination will be described. First, reference values, evaluation methods (ALP activity, ALP index, cell proliferation ability) will be described in detail.

본 발명에서 1차 판정의 기준값은 골형성 (-)세포의 각 (평균값+2SD)로 설정했다. 이 때, 표본 데이터가 정규 분포를 한다고 가정한 경우, 골형성능을 갖지 않은 세포가 잘못 포함될 확률은 (100-95.45)/2 =2.275%이다.In the present invention, the reference value of the primary determination is set to the angle (average value + 2SD) of osteogenic (-) cells. At this time, if the sample data is assumed to have a normal distribution, the probability of erroneously including non-osseous cells is (100-95.45) / 2 = 2.275%.

또한, 2차 판정의 기준값은 골형성 (+)세포의 각 (평균값-2SD) 또는 골형성 (+)세포의 각 측정값의 하한값으로 설정했다.The reference value of the secondary determination was set as the lower limit value of each measured value of the osteogenic (+) cells (mean value -2 SD) or osteogenic (+) cells.

상기 기준값은, 세포를 채취하는 환자의 모집단(성별, 연령, 인종 등)에 따라서 변화되는 것도 생각할 수 있다. 즉, 기준값은 환자에게 맞는 적절한 값을 선택하는 것이 중요하다. 따라서 이하에 나타내는 기준값은 본 발명자들이 채취한 환자의 세포에 의해 결정된 것이며, 이들에 한정되는 것이 아니다. 또한 많은 데이터에 의해 이 수치를 보다 엄밀히 설정하는 것도 가능하다.It is also conceivable that the reference value is changed according to the population (sex, age, race, etc.) of the patient from which the cells are to be collected. That is, it is important to select an appropriate value for the reference value for the patient. Therefore, the reference values shown below are determined by the cells of the patient collected by the present inventors and are not limited thereto. It is also possible to set this numerical value more strictly by a large amount of data.

또한, 이하에 나타내는 2차 판정의 구체적인 기준값은, 골형성 (+)세포의 각 측정값의 하한값을 예로 들고 있지만, 골형성 (+)세포의 각 (평균값-2SD)를 이용해도 타당한 결과가 얻어진다.Although a specific reference value of the secondary determination shown below is a lower limit value of each measured value of osteogenic (+) cells as an example, it is also possible to obtain a valid result by using the angle (mean value -2SD) Loses.

·ALP 활성· ALP activity

ALP 활성의 측정에는, 예를 들면 p-니트로페닐포스페이트 정제 세트(Sigma-Aldrich사)와 세포 집계 키트인 WST-8(도진카가쿠 겐큐죠사제)을 이용할 수 있다.For measurement of ALP activity, for example, a p-nitrophenyl phosphate purification kit (Sigma-Aldrich) and a cell aggregation kit WST-8 (manufactured by Tojin Kagaku Corporation) can be used.

이하, ALP 활성 측정을 상기 제품으로 실시하는 경우를 예로 측정 방법을 나타낸다. 우선 WST-8 용액을 각 웰에 100㎕씩 첨가한다. 탄산가스 인큐베이터 내에서 1~4시간 정색(呈色) 반응을 실시한 후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 흡광도를 측정한다. WST-8 분석 후, 세포막 단백을 용해 추출하고, 그 용해액에 p-니트로페닐포스페이트 용액을 첨가하고, 실온에서 10분간 정치 후, 반응을 NaOH로 중단하고, p-니트로페놀(p-니트로페닐포스페이트의 ALP에 의한 분해 산물)의 흡광도를 측정한다. ALP 활성은 시간당 p-니트로페놀의 몰수/단백질의 질량(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)으로 표시된다. 또는 p-니트로페놀 흡광도(OD; 405nm)/WST-8 흡광도(OD;450nm)로서 나타낼 수도 있다.Hereinafter, a measurement method will be described as an example of the case where the ALP activity measurement is performed with the above product. First, 100 μl of WST-8 solution is added to each well. After performing a color reaction for 1 to 4 hours in a carbonic acid gas incubator, the absorbance is measured using a microplate reader. After the WST-8 analysis, the cell membrane protein was dissolved and extracted, and a p-nitrophenyl phosphate solution was added to the solution. After standing at room temperature for 10 minutes, the reaction was stopped with NaOH and p-nitrophenol The decomposition product of phosphate by ALP) is measured. ALP activity is expressed as moles of p-nitrophenol per hour / mass of protein (produced μmol p-nitrophenol / min / μg protein). Or as p-nitrophenol absorbance (OD; 405 nm) / WST-8 absorbance (OD; 450 nm).

도 7에 ALP 활성 측정 결과의 예를 나타낸다.Fig. 7 shows an example of the results of ALP activity measurement.

골형성 (-)세포의 ALP 활성 평균값+2SD는 2.31{p-니트로페놀 흡광도(OD;405nm)/WST-8 흡광도(OD;450nm)}이었다. 이 값은 166 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)에 상당한다. 이 때문에 본 발명자들은 ALP 활성의 1차 판정의 기준값을 약 166 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)로 설정했다. 즉, ALP 활성의 1차 판정의 기준값은 166±5 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)인 것이 바람직하다.The average value of ALP activity of osteogenic (-) cells + 2 SD was 2.31 {p-nitrophenol absorbance (OD; 405 nm) / WST-8 absorbance (OD; This value corresponds to 166 units (μmol p-nitrophenol / min / μg protein produced). For this reason, the present inventors set the reference value for the first judgment of ALP activity to about 166 units (μmol p-nitrophenol / min / μg protein produced). That is, the reference value for the primary determination of ALP activity is preferably 166 ± 5 units (μmol p-nitrophenol / min / μg protein produced).

이러한 세포 당 ALP 활성의 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)로의 환산식은 본 연구에 이용한 세포로부터 본 발명자들에 의해 구해진 것이다.The expression for conversion of the unit of ALP activity per cell (the resulting μmol p-nitrophenol / min / ug protein) was obtained by the present inventors from the cells used in this study.

골형성 (+)세포의 ALP 활성 측정값의 하한값은 0.93{p-니트로페놀 흡광도 (OD;405nm)/WST-8 흡광도(OD;450nm)}이었다. 이 값은 67 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)에 상당한다. 이 때문에 본 발명자들은 ALP 활성의 2차 판정의 기준값을 약 67 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)로 설정했다. 즉, ALP 활성의 2차 판정의 기준값은 67±5 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질)인 것이 바람직하다.The lower limit value of the measured value of ALP activity of osteogenic (+) cells was 0.93 {p-nitrophenol absorbance (OD; 405 nm) / WST-8 absorbance (OD; 450 nm)}. This value corresponds to 67 units (μmol p-nitrophenol / min / μg protein produced). For this reason, the present inventors set the reference value of the secondary determination of ALP activity to about 67 units (μmol p-nitrophenol / min / μg protein produced). That is, the reference value of the secondary determination of ALP activity is preferably 67 +/- 5 units (μmol p-nitrophenol / min / μg protein produced).

·ALP 인덱스· ALP index

ALP 인덱스는 분화 유도 배지를 첨가한 세포(분화 유도군)와, 컨트롤로서 통상 배지를 넣은 세포(비분화 유도군)에 대해 ALP 활성을 측정하고, (분화 유도군의 ALP 활성/비분화 유도군의 ALP 활성)에 의해 산출된다.The ALP index was determined by measuring the ALP activity on the cells to which the differentiation induction medium (differentiation induction group) and the control medium (control differentiation induction group) were differentiated (ALP activity / non-differentiation inducing group Of ALP activity).

골형성 (-)세포의 ALP 인덱스 평균값+2SD는 3.95이었다. 이 때문에 본 발명자들은 ALP 인덱스의 1차 판정의 기준값을 약 3.95로 설정했다. 즉, ALP 인덱스의 1차 판정의 기준값은 3.95±0.15인 것이 바람직하다.The mean value of ALP index + 2SD of osteogenic (-) cells was 3.95. Therefore, the present inventors set the reference value of the primary determination of the ALP index to about 3.95. That is, the reference value of the primary determination of the ALP index is preferably 3.95 0.15.

또한, 골형성 (+)세포의 ALP 인덱스 측정값의 하한값은 1.01이었다. 이 때문에 본 발명자들은 ALP 인덱스의 2차 판정의 기준값을 1.01로 설정했다. 즉, ALP 인덱스의 2차 판정의 기준값은 1.01±0.15인 것이 바람직하다.In addition, the lower limit value of the ALP index value of osteogenic (+) cells was 1.01. Therefore, the present inventors set the reference value of the secondary determination of the ALP index to 1.01. That is, the reference value of the secondary determination of the ALP index is preferably 1.01 0.15.

·세포 증식능· Cell growth ability

세포 증식능은 배양 전후에서의 세포 수의 비율, 즉 (분화 유도 후의 세포 수/초기 파종 세포 수)에 의해 구할 수 있다. 실제로는 분화 유도 기간 종료 후에 세포 수를 측정함으로써 수득되지만, 파종한 세포를 일정하게 함으로써 (회수된 세포 수/파종한 세포 수)로서 산출하는 것이 가능하다. 여기서는 분화 유도 기간 중의 세포 증식률을 세포 증식능이라고 정의한다. 또한 예를 들면 상기 세포 집계 키트(WST-8)의 OD값의 비로 판정할 수 있다. 즉, 상기 정색 반응을 실시한 후, 450nm의 흡광도(OD값)를 측정하고, 분화 유도 전의 세포 수에 대한 WST-8의 OD값으로 나눠 분화 유도 중의 세포 증식률을 구할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 세포 증식능 판정은 1계대에서 4계대까지에 대해 적용할 수 있다.The cell proliferating ability can be determined by the ratio of the number of cells before and after the culture, that is, the number of cells after induction of differentiation / the number of seeding cells to be initially seeded. In practice, it is obtained by measuring the number of cells after the termination of the differentiation induction period, but it can be calculated as the number of seeded cells / the number of seeded cells by making the seeded cells constant. Here, the cell proliferation rate during the differentiation induction period is defined as the cell proliferation ability. Further, it can be determined by the ratio of the OD value of the cell aggregation kit (WST-8). That is, after performing the color reaction, the absorbance (OD value) at 450 nm is measured, and the cell growth rate during induction of differentiation can be determined by dividing the OD value of WST-8 with respect to the number of cells before induction of differentiation. In addition, the cell proliferation ability determination according to the present invention can be applied to the first to fourth passages.

도 8에 세포 증식능 측정 결과의 예를 도시한다.Fig. 8 shows an example of the result of cell proliferation assay.

골형성 (-)세포의 증식능 평균값+2SD는 9.7이었다. 이 때문에 본 발명자들은 세포 증식능의 1차 판정의 기준값을 약 9.7로 설정했다. 즉, 세포 증식능의 1차 판정의 기준값은 9.7±0.3인 것이 바람직하다.The mean value of proliferative capacity of osteogenic (-) cells + 2 SD was 9.7. Therefore, the present inventors set the reference value of the primary determination of the cell proliferation ability to about 9.7. That is, the reference value for the primary determination of the cell proliferation ability is preferably 9.7 + - 0.3.

또한, 골형성 (+)세포의 증식능 측정값의 하한값은 5.6이었다. 이 때문에 본 발명자들은 세포 증식능의 2차 판정의 기준값을 약 5.6으로 설정했다. 즉, 세포 증식능의 2차 판정의 기준값은 5.6±0.3인 것이 바람직하다.In addition, the lower limit of the measured value of the proliferative capacity of osteogenic (+) cells was 5.6. Therefore, the present inventors set the reference value of the secondary determination of the cell proliferation ability to about 5.6. That is, the reference value of the secondary determination of the cell proliferation ability is preferably 5.6 + - 0.3.

계속해서 3차 판정에서 이용되는 기준, 평가 방법(플로우 사이토메트리에 의한 표면 항원(HLA-DR) 해석, TRAP 염색, 알리자린레드 염색)에 대해 상세히 설명한다.Subsequently, the criteria used in the tertiary determination, the evaluation method (surface antigen analysis by flow cytometry (HLA-DR) analysis, TRAP staining, alizarin red staining) will be described in detail.

본 발명에서 3차 판정의 기준은 표면 항원(HLA-DR) 양성 세포가 6% 이상, TRAP 양성, 알리자린레드 양성이라고 설정했다.In the present invention, the criterion for the tertiary determination is that the surface antigen (HLA-DR) positive cells are more than 6%, TRAP positive, and alizarin red positive.

·플로우 사이토메트리에 의한 표면 항원 해석· Surface antigen analysis by flow cytometry

6색 플로우 사이토메트리 분석은 기존의 플로우 사이토미터를 사용할 수 있지만, 여기서는 FACS Aria 플로우 사이토미터(BDIS사)를 사용했다.Six-color flow cytometry analysis can be performed using conventional flow cytometry, but here, a FACS Aria flow cytometer (BDIS) was used.

항체에는 이하의 물질이 사용되었다. 형광 이소티오시아네이트 복합체(FITC-), 피코에리트린 복합체(PE-), 페리디닌클로로필 단백질 복합체(PerCP-Cy5.5-), 아로피코시아닌 복합체(APC-), Alexa Fluor 405 복합체가 사용되었다.The following materials were used for the antibody. The fluorescence isothiocyanate complex (FITC-), the phycoerythrin complex (PE-), the peridinin chlorophyll protein complex (PerCP-Cy5.5-), the aripycocyanin complex (APC-) and the Alexa Fluor 405 complex .

또한 상기 복합체 외에, 항체로서 HLA-ABC, HLA-DR, CD3, CD14, CD19, CD34, CD73, CD90, CD106, CD146, 마우스-IgG1k, 마우스-IgM에 대한 비오틴화 항체(모두 BD Pharmingen사), CD10 및 CD 29에 대한 비오틴화 항체(Dako사), CD45에 대한 비오틴화 항체(인비트로젠사)도 사용되었다. FITC를 공유 결합시킨 CD105 항체(Immunotech사)도 사용되었다. 상기 비오틴화 항체는 스트렙토아비딘퍼시픽블루(인비트로젠사) 또는 스트렙토아비딘 PerCP-Cy5.5(BD Pharmingen사) 복합체에 의해 검출되었다.(All BD Pharmingen) for HLA-ABC, HLA-DR, CD3, CD14, CD19, CD34, CD73, CD90, CD106, CD146, mouse- IgG1k and mouse- IgM as antibodies, Biotinylated antibodies to CD10 and CD 29 (Dako), and biotinylated antibodies against CD45 (Invitrogen) were also used. A CD105 antibody (Immunotech) with covalently conjugated FITC was also used. The biotinylated antibody was detected by streptavidin-pacific blue (Invitrogen) or streptavidin PerCP-Cy5.5 (BD Pharmingen) complex.

STRO-1 항체(R&D Systems사제)는 PE-결합 항마우스 IgM으로 검출되었다. 또한, 요오드화 프로피디움(도진카가쿠 켄큐죠사)이 죽은 세포를 검출하기 위해 이용되었다.The STRO-1 antibody (R & D Systems) was detected with PE-conjugated anti-mouse IgM. In addition, propidium iodide (Tojin Kagaku Kenkujosa) was used to detect dead cells.

상기 수십종류의 항체를 이용하여 플로우 사이토메트리에 의한 표면 항원 해석을 실시했다. 본 발명자들이 검토한 결과, 골수 유래의 간엽계 간세포에는 동일한 수법으로 배양되어도 골형성능을 가진 세포가 수득되는 경우와 수득되지 않는 경우가 있는 것이 명확해졌지만, HLA-DR에 대한 항체 이외의 상기 항체의 발현에 있어서, 골형성능을 가진 세포와 갖지 않은 세포에서는 차이가 나타나지 않았다. 그러나 유일하게 HLA-DR에 대한 항체의 발현만 유의적인 차이가 있는 것이 명확해졌다. 이 때문에 본 발명에 따른 표면 항원 해석에서는 항체로서 HLA-DR에 대한 비오틴화 항체를 사용하고 있다.Surface antigens were analyzed by flow cytometry using the above-mentioned dozens of kinds of antibodies. As a result of the studies conducted by the present inventors, it has become clear that the cells in the bone marrow-derived mesenchymal stem cells are cultured by the same method, but the cells having the bony performance are sometimes obtained or not. However, , There was no difference between the cells with and without osteoblastic performance. However, it was clear that only the expression of antibodies to HLA-DR was significantly different. Therefore, in the surface antigen analysis according to the present invention, a biotinylated antibody against HLA-DR is used as an antibody.

이하, 본 발명에 바람직한 HLA-DR에 대한 비오틴화 항체를 이용하는 경우의 표면 항원 해석 방법에 대해 나타낸다. 계대수 0 및 3의 세포는 트리프신-EDTA에 의해 검출되고, 1×10⁶의 세포는 50㎕의 빙냉(氷冷)한 인산 완충 생리식염수(PBS:닛수이 세이야쿠사)중에 현탁시켰다. 계속해서 세포는 빙상에서 20분간, HLA-DR에 대한 비오틴화 항체와 함께 배양되었다. 그 후 세포는 세정되고, 빙상에서 20분간 스트렙토아비딘 복합체와 함께 배양되었다. 마지막으로 세포는 세정되고, 200㎕의 빙냉한 PBS에 재현탁시키고, 요오드화 프로피디움으로 염색되어 플로우 사이토미터에 의해 분석되었다. 데이터의 분석은 FlowJo 소프트웨어(TreeStar사)를 이용하여 실시했다.Hereinafter, a preferred method of analyzing the surface antigen when using a biotinylated antibody against HLA-DR is described. Passage number of thecells 0 and 3 is detected by the tree peusin -EDTA, of 1 × 10⁶ cells were ice-cooled (氷冷) a phosphate-buffered physiological saline 50㎕: was suspended in (PBS units Sui Seiya flexors). Subsequently, the cells were incubated with biotinylated antibodies against HLA-DR for 20 minutes on ice. The cells were then washed and incubated with the streptavidin complex for 20 minutes on ice. Finally, the cells were washed, resuspended in 200 [mu] l of ice cold PBS, stained with iodinated propidium and analyzed by flow cytometry. Data analysis was performed using FlowJo software (TreeStar).

도 9는 플로우 사이토메트리에 의한 표면 항원 해석 결과를 도시하고 있다. 도 9의 X축, Y축은 다른 항체(각각 HLA-DR, CD14)에 대한 반응을 나타내고 있다. 우측 하부의 수치는 Y축의 항체(CD14) 음성, X축의 항체(HLA-DR) 양성의 분획을 나타내고 있다.Fig. 9 shows the results of surface antigen analysis by flow cytometry. The X-axis and Y-axis in FIG. 9 show the responses to different antibodies (HLA-DR, CD14, respectively). The lower right figure shows the Y-axis antibody (CD14) negative and the X-axis antibody (HLA-DR) positive fraction.

도 9의 (A)에 도시한 바와 같이, 측정된 HLA-DR 양성 세포가 6% 이상인 경우, 골형성 (+)세포를 포함하는 세포 분획이라고 판정된다. 그러나 도 9의 (B)에 도시한 바와 같이, 측정된 HLA-DR 양성 세포가 6% 미만인 경우, 골형성 (+)세포를 포함하지 않을 가능성이 높은 분획으로서 판정된다.As shown in Fig. 9 (A), when the measured HLA-DR positive cells are 6% or more, it is determined that the cell fraction contains osteogenic (+) cells. However, as shown in Fig. 9 (B), when the measured HLA-DR positive cells are less than 6%, it is judged as fractions which are highly likely not to contain osteogenic (+) cells.

이 HLA-DR 양성 세포의 6%라는 하한값은 본 발명자들이 많은 피험자에게서 발견한 경험적으로 정한 값이지만, 본 발명은 이 수치에 한정되지 않는다. 즉, 추가로 많은 샘플의 데이터에 의해 이 수치를 더 엄밀히 설정하는 것은 가능하며, 그 경우에는 구체적으로는 골을 형성한 세포의 평균값에서 2SD 등을 뺀 값과, 골을 형성하지 않은 세포의 평균값에 2SD 등을 더한 값 중, 보다 높은 수치로서 근사할 수 있다.The lower limit of 6% of the HLA-DR positive cells is an empirically determined value found by a large number of subjects of the present inventors, but the present invention is not limited to this value. In other words, it is possible to set the numerical value more strictly by the data of a larger number of samples. Specifically, in this case, the value obtained by subtracting 2SD from the average value of the cells forming the bone, and the average value of the non- Of the values obtained by adding 2SD and the like to the values of the above-mentioned values.

·TRAP 염색· TRAP staining

TRAP 염색은 예를 들면 고정액이 50mM 주석산 함유 완충액(pH5.0, 발색 기질 30mg/vial)인 TRAP 염색 키트(와코 준야쿠 고교사)를 사용할 수 있다. 이하에 상기한 TRAP 염색 키트를 이용한 경우의 TRAP 염색 평가 방법을 나타낸다.For TRAP staining, for example, a TRAP staining kit (Wako Junya Kogyo Co.), which is a buffer solution containing 50 mM tartaric acid (pH 5.0, color development substrate 30 mg / vial), may be used. The TRAP staining evaluation method using the above TRAP staining kit is shown below.

우선 D-PBS를 워터배스로 데우고, α-MEM에 10% 혈청, 1% 페니실린스트렙토마이신, 1% 암포테리신 B와 덱사메타손, β글리세로인산, 아스코르브산을 포함하는 분화 유도 배지에서 배양을 실시한다.First, D-PBS was warmed up in a water bath and cultured in a differentiation induction medium containing 10% serum, 1% penicillin streptomycin, 1% amphotericin B, dexamethasone,? -Glycerophosphate and ascorbic acid in? -MEM do.

또한 엄밀함을 수득하기 위해서는, 상기 배지 이외에 배지로서 Osteo Clast precursor Basal Medium M-CSF(-), RANKL(-), Osteo Clast precursor Basal Medium M-CSF(+), RANKL(+)를 사용하여 결과를 비교하는 것이 바람직하다.In order to obtain the strictness, the results were also obtained by using Osteo Clast precursor Basal medium M-CSF (-), RANKL (-), Osteo Clast precursor Basal medium M-CSF (+) and RANKL (+ It is preferable to compare them.

계속해서, 배양 중의 96 웰 플레이트의 배지를 제거하고 D-PBS를 250㎕/웰씩 첨가하여 세정하고, D-PBS를 제거한다. 계속해서 TRAP 염색 키트의 고정액을 50㎕/웰씩 첨가하고, 5분간 고정을 실시한다. 5분 후, 고정액을 제거하여 증류수를 250㎕/웰씩 첨가하여 세정하고, 증류수를 제거한다. 이 증류수에서의 세정을 3회 반복하여 실시한다. 3회째의 증류수를 제거하기 전에 클린벤치의 전기를 끄고, TRAP 염색 키트의 발색 기질에 50mM 주석산 함유 완충액을 5㎖ 첨가하고 볼텍스로 혼합하여, 발색 기질의 조제를 실시한다. 발색 기질의 조제 후, 증류수를 제거하고 발색 기질을 100㎕/웰씩 첨가하여, CO₂ 5%, 37℃(습도 95% rH 이상)에서 1시간 인큐베이트를 실시한다. 인큐베이트 후, 발색기질을 제거하고, 증류수를 250㎕/웰씩 첨가하여 세정하며, 증류수를 제거한다. 이 증류수에서의 세정을 2회 반복하여 실시한다. 세정 후 증류수를 50㎕/웰씩 첨가하고, 현미경 하에서 염색된 세포가 있는지 검경(檢鏡)하고, 세포 사진의 촬영을 실시한다.Subsequently, the culture medium of the 96-well plate in culture was removed, D-PBS was added at a rate of 250 μl / well, followed by washing, and D-PBS was removed. Subsequently, 50 占 퐇 / well of the fixation solution of the TRAP staining kit was added and fixed for 5 minutes. After 5 minutes, the fixing solution is removed, 250 μl / well of distilled water is added to the solution, and the distilled water is removed. The washing in the distilled water is repeated three times. Before removing the third distilled water, turn off the clean bench, add 5 ml of a buffer containing 50 mM tartaric acid to the color development substrate of the TRAP staining kit, and mix with a vortex to prepare a color development substrate. After the preparation of the chromogenic substrate, the distilled water was removed, and 100 μl / well of the chromogenic substrate was added thereto. The incubation was carried out at 5% CO₂ and 37 ° C. (humidity 95% rH or more) for 1 hour. After incubation, the chromogenic substrate is removed, and 250 쨉 l / well of distilled water is added thereto to clean, and the distilled water is removed. The washing in the distilled water is repeated twice. After washing, distilled water was added at a rate of 50 쨉 l / well, and microscopic examination of the cells stained was carried out, and cell photographs were taken.

도 10의 (A)와 같이 측정된 TRAP 염색이 양성인 경우, 골형성 (+)세포를 포함하는 분획이라고 판정된다.When TRAP staining measured as shown in Fig. 10 (A) is positive, it is determined that the fraction contains osteogenic (+) cells.

그러나, 도 10의 (B)와 같이 측정된 TRAP 염색이 음성인 경우, 골형성 (+)세포를 포함하지 않을 가능성이 높은 분획이라고 판정된다.However, when the TRAP staining measured as shown in FIG. 10 (B) is negative, it is determined that there is a fragment which is likely to not contain osteogenic (+) cells.

·알리자린레드 염색· Alizarin red dyeing

알리자린레드 염색을 실시하기 위해, 세포를 2.0×10⁴/웰의 밀도로 12웰 디시에 파종한다. 익일, 분화 유도 배지로 교환하고, 이후 배지는 주에 2회씩 교환하여 3주간 분화 유도를 실시한다.To perform alizarin red staining, the cells are seeded in 12 wells at a density of 2.0 x 10 <⁴ > / well. Next day, the medium is changed to the differentiation induction medium, and then the medium is changed twice a week to induce differentiation for 3 weeks.

계속해서, 배지를 빼내고(흡인(吸引)하고), 세포를 D-PBS로 2회 세정한다. 그 후, 고정액(70% 에탄올)에 의해 -20℃에서 1시간 세포를 고정한다. 고정액을 흡인하고, 증류수로 2회 세정을 실시한다.Subsequently, the medium is removed (aspirated) and the cells are washed twice with D-PBS. Thereafter, cells are fixed with fixative (70% ethanol) at -20 ° C for 1 hour. The fixation liquid is sucked and washed twice with distilled water.

계속해서, 알리자린레드 S 용액(40mM, pH4.2)을 첨가하여 실온에서 10분간 염색을 실시한다. pH는 25% 암모늄 수용액으로 조정한다. 염색액을 흡인하고, 세포를 증류수로 비특이적 염색이 완전히 없어질 때까지 세정한다. 그 후 마크로 및 현미경 사진을 촬영한다.Subsequently, a solution of Alizarin Red S (40 mM, pH 4.2) was added, and the mixture was stained at room temperature for 10 minutes. The pH is adjusted with 25% aqueous ammonium solution. The staining solution is aspirated and the cells are washed with distilled water until nonspecific staining is completely eliminated. Then, the macro and microscopic photographs are taken.

도 11에 알리자린레드의 염색 결과를 도시한다. 또한 좌측은 분화 유도를 실시하지 않은 시료(컨트롤), 우측은 분화 유도 후의 시료이다.Fig. 11 shows the result of staining of alizarin red. The left side is a sample (control) without induction of differentiation, and the right side is a sample after induction of differentiation.

도 11의 (A)와 같이, 측정된 알리자린레드 염색이 양성인 경우, 골형성 (+)세포를 포함하는 분획이라고 판정된다.As shown in Fig. 11 (A), when the measured aligarine red staining is positive, it is determined that the fraction contains osteogenic (+) cells.

그러나 도 11의 (B)와 같이, 측정된 알리자린레드 염색이 음성인 경우, 골형성 (+)세포를 포함하지 않을 가능성이 높은 분획이라고 판정된다.However, as shown in Fig. 11 (B), when the measured aligarnin red stain is negative, it is judged that there is a fragile fragile fragment that does not contain osteogenic (+) cells.

본 발명에 따른 배양 세포의 평가 방법에서는, 복수의 검사값, 또는 지표에 대한 적응 순서, 판정 기준을 설정한 후 이들을 플로우차트화함으로써, 경험의 유무에 상관없이 정밀하게 세포의 골형성능을 판정하는 것이 바람직하다. 특히 적어도 3 이상의 검사값, 지표를 포함하고, 이들 조합에 의해 통계학적인 근거를 가지고 정밀하게 세포의 기능을 예측, 판정하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 편차를 가진 사람 세포에 대해 복수의 검사값, 지표를 플로우차트화하여 평가함으로써,편차의 영향을 임상상 문제없는 정도까지 개선하는 것을 가능하게 하고 있다.In the method for evaluating cultured cells according to the present invention, after setting a plurality of test values or an adaptation order and a criterion for an indicator, the flow charts are used to accurately determine the bone form performance of cells regardless of the experience . In particular, it is desirable to include at least three test values and indicators, and to precisely predict and determine the function of the cells with a combination of these on a statistical basis. In the present invention, a plurality of test values and indicators are measured and evaluated for human cells having deviations in a flow chart, thereby making it possible to improve the influence of the deviations to a level without problems.

또한, 본 발명에 따른 배양 세포의 평가 방법에서는, 각각의 검사값에 대하여 적응 범위에 포함되는 샘플이라도, 다른 지표를 참조함으로써 목적으로 하는 세포가 아닌 것이 판정될 수도 있다.Further, in the method for evaluating cultured cells according to the present invention, it may be judged whether or not a sample is included in an adaptation range for each test value, by referring to another index, and not a target cell.

10 : 골수액
12 : 세포 배양용 플라스크
14 : 다공질 의사 골과립
16 : 심저 용기10: bone marrow solution
12: Flask for cell culture
14: Porous physiological bone grains
16:

Claims (14)

Translated fromKorean

1차 판정 기준, 2차 판정 기준 및 3차 판정 기준을 가진 배양 세포의 평가 방법에 있어서,
1차 판정을 실시한 세포를, 추가로 2차 판정을 실시함으로써 골형성 (+)세포를 판정하고,
골형성 (+)세포인지 여부를 판단하기 어려운 세포를, 추가로 3차 판정을 실시함으로써 골형성 (+)세포를 판정하는, 배양된 골형성성 세포의 평가 방법으로서,
상기 1차 판정에서, 판정 기준은 ALP 활성(알칼리 포스파타제 활성), ALP 인덱스(분화 유도군의 ALP 활성값÷비분화 유도군의 ALP 활성값) 및 세포 증식능(분화 유도 후의 세포수÷초기 파종 세포수)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 1차 판정의 기준값 이상을 만족하는지 여부이며, 각 기준값은, 각각, 166±5 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질), 3.95±0.15, 9.7±0.3이고,
상기 2차 판정에서, 판정 기준은 ALP 활성, ALP 인덱스, 세포 증식능 전부가 2차 판정의 기준값 이상을 만족하는지 여부이고, 각 기준값은, 각각, 67±5 단위(생성된 μmol p-니트로페놀/분/㎍ 단백질), 1.01±0.15, 5.6±0.3이며,
1차 판정, 2차 판정 양쪽의 기준을 만족한 세포를 골형성 (+)세포로 판정하고,
1차 판정에서 기준을 만족하지 않았지만, 2차 판정에서 기준을 만족한 세포에 대해서는 3차 판정 기준으로 이행하며,
2차 판정에서 기준을 만족하지 않았던 세포를 골형성 (-)세포로 판정하고,
상기 3차 판정에서, 판정 기준은 플로우 사이토메트리에 의한 표면 항원(HLA-DR) 해석, TRAP 염색 및 알리자린레드 염색으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 기준을 만족하는지 여부이고, 각 기준은, 각각, 측정된 HLA-DR 양성 세포가 6% 이상, 양성, 양성이며,
이 기준을 만족한 세포를 골형성 (+)세포, 만족하지 않은 세포를 골형성 (-)세포라고 판정하는 것을 특징으로 하는, 배양된 골형성성 세포의 평가 방법.A method for evaluating cultured cells having a primary determination standard, a secondary determination standard, and a tertiary determination standard,
Cells subjected to the primary determination are further subjected to secondary determination to determine bone formation (+) cells,
A method for evaluating a cultured osteogenic cell in which osteogenic (+) cells are judged by subjecting a cell, in which it is difficult to judge whether or not osteogenic (+) cells are difficult,
In the primary determination, the criteria are ALP activity (ALP activity), ALP index (ALP activity value of differentiation induced group ÷ ALP activity value of non-differentiation induction group) and cell proliferation ability (number of cells after differentiation induction / And the reference values are respectively 166 ± 5 units (μmol p-nitrophenol / min / μg protein produced), 3.95 ± 0.15, and 9.7 ± 0.3,
In the secondary determination, the determination criteria is whether or not all the ALP activity, ALP index, and cell proliferation ability satisfy the reference value of the secondary determination, and each reference value is 67? 5 units (μmol p-nitrophenol / Min / 占 퐂 protein), 1.01 ± 0.15, 5.6 ± 0.3,
Cells satisfying both criteria of the first judgment and the second judgment were judged to be osteogenic (+) cells,
Cells that did not meet the criteria in the primary determination but met the criteria in the secondary determination proceed to the tertiary determination criteria,
Cells that did not meet the criterion in the secondary determination were judged to be osteogenic (-) cells,
In the tertiary determination, the criteria are whether or not at least one selected from the group consisting of surface antigen (HLA-DR) analysis by flow cytometry, TRAP staining and alizarin red staining satisfies the criteria, Each of the measured HLA-DR positive cells was more than 6% positive, positive,
The cells satisfying this criterion are judged to be osteogenic (+) cells, and the unsatisfactory cells are judged to be osteogenic (-) cells.삭제delete삭제delete삭제delete삭제delete삭제delete삭제delete삭제delete삭제delete삭제delete삭제delete삭제delete삭제delete삭제delete

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