KR101590586B1

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Info

Publication number: KR101590586B1
Application number: KR1020110051641A
Authority: KR
Inventors: 이동기; 장찬일
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2011-05-30
Filing date: 2011-05-30
Publication date: 2016-02-01
Anticipated expiration: 2031-05-30
Also published as: WO2012165854A3; WO2012165854A2; WO2012165854A9; US20140249304A1; KR20120133127A

Abstract

본 발명은 RNAi-매개 특정 표적 유전자 발현을 억제할 뿐만 아니라 면역 반응을 촉진할 수 있는 이중가닥의 긴 간섭 RNA 구조(long interfering dsRNA, liRNA) 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 서열 특이적으로 RNA 간섭 반응을 통해 특정 표적 유전자의 발현을 억제시킬 뿐만 아니라, 구조 의존적으로 단백질 키나아제 R (PKR) 경로를 자극시켜 인터페론 β의 발현을 유도할 수 있는 이중가닥의 긴 간섭 RNA 구조에 관한 것이다.

Description

표적 유전자 발현 억제 및 면역 반응을 동시에 유발하는 이중가닥의 긴 간섭 ＲＮＡ {Long interfering dsRNA with abilities to trigger RNA interference and immunostimulation simultaneously}

본 발명은 표적 유전자 발현 억제 및 면역 반응을 동시에 촉진하는 이중가닥의 긴 간섭 RNA에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열 의존적으로 특이적 표적 유전자의 발현을 억제시킬 뿐만 아니라, 구조 의존적으로 면역반응을 유발시킬 수 있는 이중가닥의 긴 간섭 RNA 구조에 관한 것이다.

긴 이중 가닥(double-stranded, ds) RNA는 대부분의 바이러스의 복제 중에 형성되지만, 진핵 세포에는 존재하지 않는다. 따라서, 진핵 유기체는 긴 dsRNA를 바이러스-관련 분자 패턴으로 인식하고 강력한 항 바이러스 면역 반응을 일으킨다. 포유류 세포에 긴 dsRNA를 도입할 경우, 단백질 키나아제 R (protein kinase R, PKR) 및 2,5-올리고아데닐산 합성효소 (OAS)가 활성화된다 (GANTIER, M.P. and WILLIAMS, B.R.,CytokineGrowthFactorRev., 18:363-371, 2007). 활성화된 PKR은 진핵생물 번역 개시인자 eIF-2α를 인산화하여 번역 개시를 막고, IκBα를 인산화하여 NF-κB 경로를 활성화시킨다 (GIL, Jetal.,Mol.Cell.Biol., 19:4653-4663, 1999). 그 결과, 세포사멸을 유발하며, 유형 I 인터페론, 예컨대, 인터페론 β의 발현을 증가시킨다. 차례로, dsRNA에 의해 활성화된 OAS는 RNaseL를 활성화시켜 비-특이적 mRNA 분해 및 세포사멸을 유발한다 (Iordanovetal.,Mol.Cell.Biol., 21:61-72, 2001). 따라서, 포유류 세포에 긴 dsRNA의 도입은 다양한 사이토카인의 유도와 함께 강력한 항-증식성 활성을 유발한다.

아울러, 폴리이노신산:폴리시티딘산[poly(I:C)]과 같은 긴 dsRNA의 항-증식성 활성 및 면역자극성 활성은 암세포를 죽이기 위한 신규한 전략을 개발하는데 유용하게 이용되고 있다. 그러나, poly(I:C)는 강력하고 지속적으로 사이토카인을 발현시켜, 비조절될 경우 잠재적으로 독성을 유발할 수 있다.

현재 개발중인 또 다른 RNA-기반 항암 치료제 전략은 RNA 간섭(RNAi) 메카니즘에 기반한다. RNAi는 다양한 종에 보존되어 있는 전사후 유전자 발현 억제 메카니즘이다 (HANNON, G.J.,Nature, 418:244-251, 2002). 긴 dsRNA가 세포 내에 도입될 경우, 이들은 Dicer라 불리는 RNase III 효소에 의해 21 내지 23 bp의 짧은 dsRNA로 절단된다. 상기 짧은 dsRNAs는 RNA-유도 발현 억제 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC)에 의해 인지되고, 열역학적으로 불안정한 5'-말단을 지닌 RNA 가닥은 활성 RISC 복합체로 우선적으로 통합되어 표적 mRNA의 특이적 절단을 실행한다. RNAi-기반 유전자 발현 억제는 작은 분자 또는 단일클론 항체에 의해 표적이 불가능한 유전자를 포함한 거의 모든 종양유전자를 특이적으로 억제할 수 있는 가능성 때문에 암 치료제로서 상당한 잠재력을 가지고 있다 (PECOT, C.Vet al.,NatRevCancer,11:59-67, 2010).

본래C.elegans에서 발견된, 긴(0.3 내지 1 kb) dsRNAs는 광대한 범위의 유기체에서 서열-특이적 유전자 발현 억제를 유도하는데 성공적으로 이용되어져 왔다 (Fireetal.,Nature, 391:806-811, 1998). 그러나, 포유류 세포에서 긴 dsRNA를 이용한 RNAi-매개 특이적 유전자 발현 억제는 실패하였는데, 이는 긴 dsRNA에 의해 유발된 항바이러스 반응 때문에, 비-특이적 mRNA 분해가 발생되고 단백질 합성이 억제되었기 때문이다 (Starketal.,Annu.Rev.Biochem., 67:227-264, 1998).

또한, 포유류 세포에서 특이적 유전자 발현 억제는 Dicer 절단 생성물의 구조를 모방한, 유도구조 3' 돌출부(overhangs)를 지닌 19 bp의 합성 RNA duplex를 이용하여 유도되는데 (Elbashiretal.,Nature, 411:494-498, 2001), 이 작은 간섭 RNA (small interfering RNA, 이하 siRNA) 구조는 포유류 세포에서 인터페론을 유도하지 않고 비-특이적 mRNA의 하향 조절(down-regulation)도 없이, 특이적 유전자 발현 억제를 발생시켰다. 이러한 이유로, 일반적으로, 긴 RNA duplex는 포유류 세포에서 대부분의 연구를 위한 RNAi 유도구조로서 회피되었다.

RNAi 치료제 개발에 있어서, 연구자들은 선천적 면역 반응을 유도하지 않고 특이적 표적 유전자 발현 억제를 발생시키는데 초점을 맞추어 왔다. 그러나, 항암 치료제 또는 항바이러스성 치료제 개발에 있어서, 면역자극과 함께 siRNA-매개 유전자 발현 억제는 치료목적으로 유용할 수 있다 (Schleeetal.,MolTher, 14:463-470, 2006).

이에, 본 발명자들은 면역자극성 RNAi의 신규한 유도구조로서, 닉(nick)을 가진 긴 dsRNA 구조[긴 간섭 dsRNA(long interefering dsRNA, liRNA)라고 지칭함]를 제공하고자 예의 노력한 결과, 돌출부(overhangs) 사이가 염기쌍에 의해 다중연결된 siRNA 유닛으로 구성되는 liRNA를 고안하고, 상기 liRNA가 특이적으로 표적 유전자의 발현을 억제하는 siRNA의 고유 기능을 가질 뿐만 아니라, 면역반응도 촉진시킨다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 siRNA의 특이적 표적 유전자 발현 억제와 함께, 면역 반응을 동시에 촉진할 수 있는 이중가닥의 긴 간섭 RNA(long interefering dsRNA, liRNA) 구조를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 돌출부(overhang)를 가지는 이중가닥 siRNA가 상보적 염기쌍 결합에 의해 선형으로 연결된 이중가닥의 긴 간섭 RNA (long interefering dsRNA, liRNA)를 제공하는데, 여기서 돌출부를 가지는 이중가닥 siRNA는 19 내지 59nt 길이의 안티센스 가닥과 센스 가닥으로 구성되며, 안티센스 가닥과 센스 가닥이 13 내지 50bp의 상보적 이중나선 구조를 이루고, 이중나선 구조의 양쪽 5' 말단 또는 양쪽 3' 말단에 4 내지 46nt의 돌출부를 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 이중가닥의 긴 간섭 RNA를 함유하는 유전자 발현 억제 또는 면역 반응 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 이중가닥의 긴 간섭 RNA를 포함하는 항바이러스성 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 이중가닥의 긴 간섭 RNA를 포함하는 항암 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 liRNA는 상기 liRNA를 구성하는 siRNA의 서열 특이적 표적 유전자 발현 억제 기능뿐만 아니라, 본 발명의 liRNA의 구조 의존적으로 면역반응을 촉진시키는 효과가 있다. 예컨대, siRNA를 siSurvivin 또는 siβ-catenin 등의 암 관련 유전자를 표적하는 siRNA로 사용할 경우, 암 관련 유전자의 발현 억제 효과와 더불어 인터페론 유도를 통한 면역반응을 촉진시켜, 궁극적으로는 암 세포 성장 억제의 시너지(synergistic) 효과를 나타내는바, 향후 항암 치료제로서 매우 유용하다.

도 1은 liRNA 구조, 즉Survivin또는GFP를 표적하는 liRNAs의 구조를 도식화한 것이다.
도 2는 liRNAs의 크기 분포 패턴을 poly(I:C)와 siRNAs와 비교하기 위해 함께 도시한 것이다.
도 3은SurvivinmRNA를 표적하는 liRNA의 유전자 발현 억제 활성에 관한 그래프이다. 그래프에 모든 데이타는 세번의 독립된 실험의 평균+표준편차를 나타내며, liRNAs의 농도는 안티센스 가닥의 농도로 표시된다. (a) liRNA-트랜스펙션된 세포의GAPDHmRNA 발현 수준. Y 축은 liRNA-트랜스펙션된 샘플로부터 동일한 양의 총 RNA를 이용해 측정된GAPDHmRNA 수준을 나타낸다. (b) liRNA-트랜스펙션된 세포의SurvivinmRNA 발현 수준. Y 축은 liRNA-트랜스펙션된 샘플로부터 동일한 양의 총 RNA를 이용해 측정된SurvivinmRNA를 나타낸다. (c)SurvivinmRNA 수준을GAPDH(대조군) mRNA 수준으로 나눈 것이다.
도 4는 liRNAs에 의해 유발된 인터페론 유도에 관한 실험 그래프이다. 각각의 liRNA(0.3 nM)를 HeLa 세포에 트랜스펙션시킨 뒤 12시간 및 24시간 후, qRT-PCR를 이용하여IFN-β 수준을 측정하였다. mock-처리된 샘플(0 nM)의IFN-β mRNA 수준을 1로 세팅하였다. 그래프 상 모든 데이타는 세번의 독립적인 실험의 평균+표준편차를 나타낸다.
도 5는 liRNAs에 의한 암 세포 성장 억제에 관한 실험 그래프이다. 각각의 liRNA, siRNA, 또는 poly(I:C)를 HeLa 세포에 트랜스펙션시킨 뒤, 정해진 시간 지점에 세포수를 계수하여 세포 성장을 측정하였다. 그래프 상 모든 데이타는 세번의 독립적인 실험의 평균+표준편차를 나타낸다.
도 6은 liRNA-매개 세포 사멸이 PKR-의존적인지 여부를 확인하기 위한 실험 그래프이다. 그래프 상 모든 데이타는 세번의 독립적인 실험의 평균+표준편차를 나타낸다.
도 7은Survivin및 β-카테닌을 표적하는 liRNA의 구조와, 이들을 표적하는 siRNA 사이가 링커로 연결되어 있는 liRNA의 구조를 도식화한 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

본원에서 "siRNA (small interfering RNA)"란, 서열 특이적으로 효율적인 유전자 발현 억제(gene silencing)를 매개하는 짧은 이중 가닥의 RNA(dsRNA)로서, 이중가닥 RNA가 다이서(Dicer) 효소에 의해 절단되어 생성되는 19 내지 23 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각을 의미한다.

본원에서 "표적 유전자"란 상기 siRNA에 의해 발현이 선택적으로 억제되거나 불활성화되는 유전자이다. 이러한 불활성화는, siRNA가 표적 유전자의 mRNA를 절단함에 의해 달성된다. 본 발명의 siRNA의 바람직한 실시예로는, 대부분의 종양으로부터 공통적으로 발현되는 서바이빈(Survivin)의 발현을 억제하도록, 서바이빈의 mRNA와 상보결합할 수 있는 siRNA 및 β-카테닌의 mRNA와 상보결합할 수 있는 siRNA를 이용하였으나, RAS, MYC, ERBB, BCR-ABL, TEL-AML1, BCL-22 등의 기타 종양 또는 암 관련 유전자뿐만 아니라 다른 질병에 관련된 유전자도 본 발명의 liRNA의 표적 유전자가 될 수 있으며, 본 명세서에 제공된 지침을 고려할 때 당해 기술분야에서의 통상의 지식을 가진 자라면 기술분야에서 잘 알려진 방법에 따라 다양한 임의의 표적 유전자의 발현을 감소시키는 작용을 하는 다른 siRNA-서열 기반 liRNA 분자를 손쉽게 생성할 수 있을 것이다.

본원에서 "liRNA"란 돌출부(overhangs) 사이가 염기쌍에 의해 다중연결된 siRNA로 구성된 유닛이 반복되는 긴 이중가닥의 RNA로서, 서열 의존적으로 특이적 표적 유전자 발현 억제를 실행할 뿐만 아니라, 구조 의존적으로 면역반응을 일으킬 수 있는 긴 이중가닥의 RNA를 의미한다. liRNA를 구성하는 siRNA의 개수에는 제한이 없으며, 2개 이상, 즉 3개, 4개 이상의 서로 다른 종류의 siRNA가 반복되는 liRNA 또한 모두 포함하는 개념이다.

본 발명은 일 관점에서, 각각 19 내지 59nt 길이의 안티센스 가닥과 센스 가닥으로 구성되고, 안티센스 가닥과 센스 가닥이 13 내지 50bp의 상보적 이중나선 구조를 이루고 있으며, 이중나선 구조의 양쪽 5' 말단 또는 양쪽 3' 말단에 4 내지 46nt의 돌출부를 가지는 이중가닥 siRNA가, 상보적 염기쌍 결합에 의해 선형으로 연결된 이중가닥의 긴 간섭 RNA를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 이중나선 구조의 양쪽 말단의 돌출부는 서로 상보적인 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서, 돌출부는 양쪽 5' 말단 또는 양쪽 3' 말단 둘 모두에 존재할 수 있으며, 이러한 상보적인 서열에 의해 siRNA가 상보적 염기쌍 결합에 의해 빠르고 길게 선형으로 연결될 수 있다. 또한 상기 돌출부는 Tm>30℃인 것을 특징으로 할 수 있는데, 돌출부의 Tm값이 30도 이하인 경우 생체 내 온도에서 duplex를 유지하지 못하고 풀릴 가능성이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 센스가닥과 상보적인 안티센스 가닥의 서열은 표적 유전자의 mRNA에 적어도 70%이상 상보적인 서열인 것을 특징으로 할 수 있다. 이때 돌출부의 서열은 표적 유전자의 mRNA에 상보적이거나 상보적이지 않은 서열일 수 있다.

본 발명에 있어서, liRNA의 안티센스 가닥의 돌출부 서열은 표적 유전자의 mRNA에 적어도 70% 이상 상보적인 서열인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 liRNA를 구성하는 siRNA는 서열 특이적으로 유전자 발현을 억제시키는 기능을 하고, 면역 반응의 유도는 liRNA의 구조에 기인한 것이므로, 암 이외의 바이러스등 다른 질병 관련 유전자를 표적하는 임의의 siRNA 서열로도 대체가능하다고 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 상기 이중가닥의 긴 간섭 RNA의 안티센스 가닥은 서로 다른 2개 이상의 표적유전자의 mRNA 서열에 각각 70% 이상 상보적인 서열인 것을 특징으로 할 수 있다. 서로 다른 표적 유전자를 표적하는 siRNA로 구성된 유닛이 반복되는 liRNA는 효과적으로 동시에 2개 이상의 유전자의 발현을 억제할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 liRNA는 13 내지 50bp마다 닉(nick)을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 닉은 서열들이 반복됨으로서 형성되며, liRNA를 작은 siRNA 유닛으로 분해시키는데 도움이 되거나, 풀리는 것(unwinding)을 유리하게 하고 RISC에 의한 가닥 통합을 유도할 수 있다.

본 발명의 liRNA는 특이적으로 표적 유전자 발현을 억제시키면서 동시에 면역반응을 일으키는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 liRNA가 특이적 표적 유전자 발현 억제를 일으킬 수 있는지 측정한 결과, siRNA와 유사한 수준으로 유전자 발현 억제능을 보였으며, 이러한 반응은 서열 의존적임을 확인하였다.

아울러, 본 발명에 따른 liRNA에 의한 면역반응은 인터페론 β를 유도하는 반응임을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 liRNA에 의해 유도되는 인터페론 반응 수준을 liSurvivin-mut와 비교한 결과, 서열 비의존적으로 면역반응을 일으킴을 확인하였다(도 4). 또한, 트랜스펙션 24시간 후에도 인터페론 β의 수준이 계속적으로 증가하는 poly(I:C)와는 달리, 본 발명에 따른 인터페론 반응은 트랜스펙션 24시간 후 대부분 기저수준까지 감소되었는데, 본 발명의 liRNA는 poly(I:C)와 다른 패턴으로 인터페론을 유발함을 확인하였다.

더욱이, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 liRNA에 의해 유발되는 면역반응의 PKR 의존성을 확인한 결과, Poly(I:C)와 같은 일반적인 긴 이중결합 RNA와 같이 PKR 의존성임을 확인하였고(도 6), PKR이 활성화되지 않았을 때, 즉 liSurvivin의 세포를 PKR 저해제인 2-AP로 처리하였을 때, siSurvivin과 유사한 세포 성장 억제능을 보였는데, 이로서, 본 발명의 liRNA의 강력한 항 증식성 활성은 PKR-의존성 면역반응과 PKR-비의존성 표적 유전자 발현 억제의 조합에서 비롯된 것임을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 liRNA와 종래 siRNA 또는 비-표적 긴 dsRNA의 암세포 성장 억제능을 측정한 결과, 본 발명의 특이적 유전자 발현 억제와 면역반응의 조합은 암 세포 성장 억제에 시너지 효과를 발생시켜 본래의 siRNA 또는 비-표적 면역자극성 긴 dsRNA 보다 더 효과적으로 암 세포 성장을 억제함을 확인하였다(도 5).

따라서, 본 발명의 liRNA는 liRNA 구조 내 siRNA 유닛에 의해 특이적으로 표적 유전자의 발현을 억제(서열-의존적)할 뿐만 아니라 liRNA의 구조적 특징에 의해 PKR을 활성화시켜 인터페론 β를 유도하여 (구조-의존적, 서열-비의존적), 시너지 효과(예를 들어, 암 관련 유전자를 표적하는 경우에는 암세포 증식 억제 활성)를 갖는 것으로 확인되었다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 liRNA를 함유하는 유전자 발현 억제 또는 면역반응 촉진용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 항바이러스 유전자에 대한 siRNA를 유닛으로 함유하는 liRNA를 포함하는 항바이러스 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 항암 유전자에 대한 siRNA를 유닛으로 함유하는 liRNA를 포함하는 항암조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 유전자 발현 억제, 면역반응 촉진용 조성물 또는 항바이러스 또는 항암조성물은 상기 liRNA를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 liRNA는 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절한 약학적으로 유효한 양으로 약학 조성물에 포함될 수 있다.

상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 세프테졸에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 liRNA는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히 하기 실시예에서는, 암에 관한 대표적인 유전자인Survivin을 표적하는 liRNA의 표적 유전자 침묵 현상 및 인터페론 유도에 대한 강력한 항 증식성 효과를 예시하였으나, 본 발명의 liRNA의 유전자 발현 억제 반응은 서열-의존적이고, 면역반응은 구조-의존적인 것이므로, 본 발명에 따른 liRNA 구조는 기타 다른 질병 관련 표적 유전자의 siRNA를 이용한 경우에도 동일한 시너지 효과를 얻을 수 있다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

본 발명에 따른liRNA 구조의 제작

본 실험에서 사용된 siRNAs 및 liRNAs는 Bioneer사로부터 화학적으로 합성된 RNAs를 구입하고, 제조업자의 프로토콜에 따라 어닐링(annealing)함으로써 제공되었다. 본 발명에 따른 liRNAs는 두개의 화학적으로 합성된 38nt 단일-가닥 (ss) RNAs의 어닐링에 의해 제작되었다(도 1). 안티센스 가닥의 5'-말단 19 nt는 상응하는 19bp의 siRNAs와 동일하고, 표적 mRNA에 상보적인 19 nt 연장부는 다른 siRNA 유닛과 어닐링을 보장하도록 3'말단에 제작되었다. 38 nt 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-말단 19nt에 상보적인 5'-말단 19nt 및 안티센스 가닥의 3'-말단 19nt에 상보적인 3'-말단 19nt를 가지도록 설계되었다. 따라서, 두 가닥의 어닐링으로 19 bp마다 닉을 가지는 다중결합 긴 dsRNAs가 형성되었다.

항암 liRNA를 개발하기 위해, 본 발명자들은SurvivinmRNA를 표적하는 liRNA (liSurvivin)를 제작하였다.Survivin은 암 치료제를 위한 매력적인 대상이며, siRNA를 이용한Survivin유전자 발현의 억제는 세포 성장을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다 (Changetal.,MolTher, 17:725-732, 2009b; Ryanetal.,CancerTreatRev,35:553-562, 2009). 음성 대조군으로서, 본 발명자들은 seed sequence가 변형된 liSurvivin(안티센스 서열의 5'말단으로부터 2번째 내지 7번째 뉴클레오티드가 돌연변이됨, liSurvivin-mut로 지칭함) 및GFPmRNA를 표적하는 liRNA(liGFP)를 고안하였다(도 1).

본 실시예에서 사용된 siRNAs 및 liRNAs의 서열 및 구조는 하기 표 1과 도 1에 각각 나타내었다.

[표 1] 본 연구에서 이용된RNAs의 서열

또한, 본 발명에 따른 liRNA는 서로 다른 표적 유전자를 표적하는 siRNA로 구성된 유닛으로도 제작가능한바, 본 발명자는 siSurvivin 및 siβ-catenin으로 구성된 liRNA를 설계하였고, 아울러 siRNA 사이에 링커를 포함한 liRNA도 제작하였다(도 7). liRNA를 구성하는 siRNA의 개수에는 제한이 없으며, 2개 이상, 즉 3개, 4개 이상의 서로 다른 종류의 siRNA가 반복되는 liRNA 또한 제작이 가능하다.

한편, liRNAs의 크기 분포를 아가로스 겔에서 분석하고 이를 poly(I:C)와 비교하였다. liRNAs의 길이는 최대 600 bp 이상의 범위였고, 이는 poly(I:C)의 크기 분포 패턴과 유사한 것으로 확인되었다(도 2).

liRNA의 특이적 표적 유전자 발현 억제

본 발명에 따른 liRNAs가 특이적 표적 유전자 발현 억제를 발생시킬 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 우선, HeLa 세포를 10% 소태아혈청(FBS)이 추가된 Dulbecco 개질된 Eagle's 배지(Gibco)에서 배양하고 세포를 항생제 없는 완전 배지에서 컨플루언시(confluency) 70%로 트렌스펙션 24시간 전에 12-well 플레이트에 플레이팅하였다. Lipofectamine2000 (Invitrogen)을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 각각의 siRNA (0.3 nM) 또는 liRNA (0.3 nM)를 HeLa 세포로 트랜스펙션시켰다.

그 다음, Isol-RNA Lysis Reagent kit (5Prime)를 이용하여 세포 용해물로부터 총 RNAs를 추출하고, 이 RNAs를 cDNA 합성을 위한 주형으로 이용하여, 제조업자의 프로토콜에 따라 ImProm-II™ Reverse Transcription System (Promega)를 수행하였다. step one real-time PCR system (Applied Biosystems)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라Survivin및GAPDH(internal control)의 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR로 분석하였다. 각 유전자에 대한 프라이머 서열은 하기와 같다:

GAPDH-forward 5'-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3' (서열번호 11)

GAPDH-reverse 5'-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3' (서열번호 12)

Survivin-forward 5'-GCA CCA CTT CCA GGG TTT AT-3' (서열번호 13)

Survivin-reverse 5'-CTC TGG TGC CAC TTT CAA GA-3' (서열번호 14)

IFN-β-forward 5'-AGA AGT CTG CAC CTG AAA AGA TAT T-3' (서열번호 15)

IFN-β-reverse 5'-TGT ACT CCT TGG CCT TCA GGT AA-3' (서열번호 16)

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, liSurvivin는SurvivinmRNA 수준을 siSurvivin와 유사한 수준으로 효과적으로 감소(knock-down)시키는 한편,GAPDHmRNA 수준은 감소시키지 않는 것으로 관찰되었다. 대조적으로, seed-changed liSurvivin과 liGFP는SurvivinmRNA 수준을 유효하게 감소시키지 못했다. 이러한 결과는, liRNA, 즉, 닉을 가지는 긴 dsRNA 구조는 seed sequence-의존성 특이적 표적 유전자 발현 억제를 발생시킬 수 있음을 나타낸다. 또한, seed-changed liRNA (liSurvivin-mut)가 표적 유전자 발현 억제를 제대로 발생시키지 못한 것으로 볼 때, liRNA에 의한 특이적 유전자 발현 억제는 RNAi 메카니즘을 통해 일어나는 것임을 알 수 있다.

liRNAs에 의한 인터페론의 유도

다음으로, 본 발명자는 liRNAs의 암 세포에서 인터페론 반응을 유도하는 능력을 실험하였다. 우선, liSurvivin, liSurvivin-mut, 및 liGFP를 HeLa 세포로 트랜스펙션시키고, 인터페론 (IFN)-β 발현 수준을 측정하였다. 본 발명자들은 또한IFN-β 유도 수준을 liRNAs와 비교하기 위해 siSurvivin, siGFP, 및 poly(I:C)를 트랜스펙션시켰다.

그 결과, siRNAs는 이전에 보고된 바와 같이, HeLa 세포에서 어떤 인터페론 반응도 유도하지 않았다 (Changetal.,Mol.Cells, 27:689-695, 2009a) (도 4). 대조적으로, poly(I:C)는 트랜스펙션 12시간 후 및 24시간 후 강력한 인터페론 반응(>100 fold)을 유도하였다. 이러한 RNAs과 다르게, liRNAs는 트랜스펙션 12시간 후 중간 수준의IFN-β 유도(~11 내지 ~16 fold) 반응을 보였다.IFN-β mRNA 수준은 트랜스펙션 24시간 후 대부분 기저 수준까지 감소되었으나, poly(I:C) 유도된 IFN-β 수준은 계속적으로 증가하였다(도 4). 이러한 결과는 트랜스펙션된 liRNAs가 poly(I:C)와 비교하여 상이한 패턴으로IFN-β 발현을 유도할 수 있음을 나타낸다.

PKR에 의존적인liRNAs의 항암 활성

본 발명자들은 일반적인 긴 dsRNAs와 같이, 본 발명에 따른 liRNAs에 의해 유발되는 암 세포 성장 억제 또한 단백질 키나아제 R (protein kinase R, PKR)-의존성인지 살펴보기 위해, RNA 트랜스펙션 이전에 5mM의 PKR 억제제 2-AP(Sigma aldrich)로 세포를 전-처리하고, 24시간 마다 깨끗한 5mM 2-AP 함유 배지로 교체하면서, 5일 후 세포를 계수하여, liRNA-매개 세포 성장 억제에 미치는 영향을 관찰하였다.

그 결과, 예상대로, 2-AP 처리는 siSurvivin에 의한 세포 성장 억제에 영향을 미치지 않았다(도 6). 대조적으로, poly(I:C)와 같이, liGFP 및 seed-changed liSurvivin에 의한 세포 성장 억제는 HeLa 세포를 2-AP로 전-처리하였을 때, 상당히 감소하였다. 2-AP 처리는 liSurvivin-매개 세포 성장 억제도 감소시켰다. liSurvivin은 세포를 2-AP로 처리하였을 때, siSurvivin와 유사한 세포 성장 억제능을 보였는데, 이는 liRNA 구조에 의한 서열-비의존적 항종양 활성이 PKR-의존적이라는 메카니즘과 일치하고, liSurvivin의 강화된 항증식성 활성은 PKR-의존성 면역자극 및 PKR-비의존성 표적 유전자 발현 억제의 조합의 결과라고 할 수 있다.

Survivin 표적liRNA와siRNAs 또는 비-표적 긴dsRNAs의 암 세포 성장억제능에 대한 비교

본 발명자들은 종양유전자-표적 liRNA에 의해 유발된 특이적 유전자 발현 억제 및 면역자극의 조합이 siRNA 또는 면역 자극성 dsRNA 단독에 비해 강화된 항암 활성을 보이는지 시험하기 위해, liSurvivin, seed-changed liSurvivin, 또는 liGFP를 HeLa에 트랜스펙션시키고, 이들이 세포의 성장을 억제하는 능력을 측정하였다.

세포를 24-well 플레이트에서 2.5×10⁴ 밀도로 트랜스펙션 24시간 전에 seeding 하고, 트랜스펙션 직전에 배지를 교체하고, 혈청-함유 배양 배지 내 트랜스펙션 복합체의 100 μl 희석액을 세포에 추가하였다. 모든 실험을 두번씩 수행하였다. 처리 후 1일, 3일, 및 5일째 트립판 블루를 이용하여 생존 세포 계수를 측정하여 세포 성장 억제를 측정하였다.

그 결과, 도 5에 도시한 바와 같이, siSurvivin-트랜스펙션된 세포는 감소된 세포 성장을 보이는 반면, siGFP-트랜스펙션된 세포는 대조군(0 nM)과 동일한 성장 속도를 보였다. liGFP 또는 liSurvivin-mut는 poly(I:C)와 유사한 효과적인 세포 성장 억제를 보였으나, siSurvivin에 비해서는 약간 덜 효과적이었다. 이러한 결과는 poly(I:C)와 같이 liRNA 구조는 구조-의존적이면서 서열-비의존적으로 암 세포 성장 억제를 유도할 수 있음을 나타낸다. 실험된 모든 RNAs 가운데 liSurvivin은 최대 5일까지 암 세포 성장을 대부분 완벽히 억제함으로서 가장 강력한 세포 성장 억제를 유발하였다. 이러한 결과로,Survivin유전자 넉-다운(knock-down) 및 긴 dsRNA-매개 면역자극의 조합으로 암 세포 성장 억제에 시너지 효과가 발생되었음을 알 수 있다.

상기와 같은 실험들을 통해, 본 발명자들은Survivin유전자 발현을 억제하도록 설계된 liRNA가 암세포주에 대하여 강력한 항증식성 활성을 가지며, 이러한 liRNA의 강화된 항증식성 활성은 구조의 이중 기능, 즉, ⅰ) 긴 dsRNA를 모방한 liRNA의 구조적 특징에 의한 PKR 활성과, ⅱ) liRNA 구조내 siRNA 유닛에 의한 종양유전자의 서열 특이적 발현 억제에 의한 것임을 확인하였다.

또한, poly(I:C)와 대조적으로, 본 발명의 liRNAs는 IFN-β를 중간 수준으로 유도하고, 유도 패턴이 지속적이기보다 일시적인데, 중요한 것은,Survivin 유전자 발현 억제와 결합시, 이러한 마일드한 수준의 면역 자극은 poly(I:C)보다 더 강력한 항증식성 효과를 유도한다는 것이다. 이러한 결과를 통해 볼 때, 본 발명에 따른 liRNA 구조는 미래의 dsRNA-기반 항암 치료제 개발에 있어서, poly(I:C)를 대체할 수 있을 것이다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration<120> Long interfering dsRNA with abilities to trigger RNA interference and immunostimulation simultaneously<130> P11-B046<160> 16<170> KopatentIn 2.0<210> 1<211> 21<212> DNA_RNA<213> Artificial Sequence<220><223> antisense strand of siRNA for Survivin mRNA<220><223> molecule is combined RNA/DNA<220><221> misc_feature<222> (1)..(19)<223> ribonucleotides<220><221> misc_feature<222> (20)..(21)<223> deoxyribonucleotides<400> 1ugaaaauguu gaucuccuut t 21<210> 2<211> 21<212> DNA_RNA<213> Artificial Sequence<220><223> sense strand of siRNA for Survivin mRNA<220><223> molecule is combined RNA/DNA<220><221> misc_feature<222> (1)..(19)<223> ribonucleotides<220><221> misc_feature<222> (20)..(21)<223> deoxyribonucleotides<400> 2aaggagauca acauuuucat t 21<210> 3<211> 21<212> DNA_RNA<213> Artificial Sequence<220><223> antisense strand of siRNA for GFP mRNA<220><223> molecule is combined RNA/DNA<220><221> misc_feature<222> (1)..(19)<223> ribonucleotides<220><221> misc_feature<222> (20)..(21)<223> deoxyribonucleotides<400> 3ugcgcuccug gacguagcct t 21<210> 4<211> 21<212> DNA_RNA<213> Artificial Sequence<220><223> sense strand of siRNA for GFP mRNA<220><223> molecule is combined RNA/DNA<220><221> misc_feature<222> (1)..(19)<223> ribonucleotides<220><221> misc_feature<222> (20)..(21)<223> deoxyribonucleotides<400> 4ggcuacgucc aggagcgcat t 21<210> 5<211> 38<212> RNA<213> Artificial Sequence<220><223> Antisense strand of liSurvivin<400> 5ugaaaauguu gaucuccuuu ccuaagacau ugcuaagg 38<210> 6<211> 38<212> RNA<213> Artificial Sequence<220><223> sense strand of liSurvivin<400> 6aaggagauca acauuuucac cuuagcaaug ucuuagga 38<210> 7<211> 38<212> RNA<213> Artificial Sequence<220><223> Antisense strand of mutant-liSurvivin<220><221> misc_feature<222> (2)..(7)<223> mutation<400> 7ucuuuuaguu gaucuccuuu ccuaagacau ugcuaagg 38<210> 8<211> 38<212> RNA<213> Artificial Sequence<220><223> sense strand of mutant-liSurvivin<220><221> misc_difference<222> (13)..(18)<223> mutation<400> 8aaggagauca acuaaaagac cuuagcaaug ucuuagga 38<210> 9<211> 38<212> RNA<213> Artificial Sequence<220><223> antisense strand of liGFP<400> 9ugcgcuccug gacguagccu ucgggcaugg cggacuug 38<210> 10<211> 38<212> RNA<213> Artificial Sequence<220><223> sense strand of liGFP<400> 10ggcuacgucc aggagcgcac aaguccgcca ugcccgaa 38<210> 11<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> GAPDH-forward primer<400> 11gagtcaacgg atttggtcgt 20<210> 12<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> GAPDH-reverse primer<400> 12gacaagcttc ccgttctcag 20<210> 13<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Survivin-forward primer<400> 13gcaccacttc cagggtttat 20<210> 14<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Survivin-reverse primer<400> 14ctctggtgcc actttcaaga 20<210> 15<211> 25<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> IFN-bata-forward primer<400> 15agaagtctgc acctgaaaag atatt 25<210> 16<211> 23<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> IFN-bata-reverse primer<400> 16tgtactcctt ggccttcagg taa 23

Claims

각각 19 내지 59nt 길이의 안티센스 가닥과 센스 가닥으로 구성되고, 안티센스 가닥과 센스 가닥이 13 내지 50bp의 상보적 이중나선 구조를 이루고 있으며, 이중나선 구조에서 안티센스의 5' 말단 및 센스의 3' 말단에 4 내지 46nt의 돌출부를 가지고, 상기 안티센스의 5' 말단 돌출부는 센스의 3' 말단 돌출부와 상보적인 서열을 포함하며, 이중가닥 siRNA가 상보적 염기쌍 결합에 의해 선형으로 연결되어 13 내지 50bp마다 닉(nick)을 가지고, 면역반응을 유발하는 것을 특징으로 하는 이중가닥의 긴 간섭 RNA (long interefering dsRNA, liRNA).
제 1항에 있어서, 이중나선 구조의 양쪽 5' 말단 또는 양쪽 3' 말단의 돌출부는 Tm>30℃인 것을 특징으로 하는 liRNA
제 1항에 있어서, 센스가닥과 상보적인 안티센스 가닥의 서열은 표적 유전자의 mRNA에 적어도 70% 이상 상보적인 서열인 것을 특징으로 하는 liRNA.
제 1항에 있어서, 안티센스 가닥의 돌출부의 서열은 표적 유전자의 mRNA에 적어도 70% 이상 상보적인 서열인 것을 특징으로 하는 liRNA.
제 1항에 있어서, 안티센스 가닥은 2개 이상의 표적 유전자의 mRNA 서열에 각각 70% 이상 상보적인 서열인 것을 특징으로 하는 liRNA.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 liRNA는 암 관련 유전자를 표적으로 하는 것을 특징으로 하는, liRNA.
제 7항에 있어서, 상기 암 관련 유전자는Survivin 또는 β-catenin인 것을 특징으로 하는 liRNA
제 1항에 있어서, 상기 liRNA는 특이적으로 표적 유전자의 발현 억제와 동시에 면역반응을 유발하는 것을 특징으로 하는, liRNA.
제 1항에 있어서, 상기 면역반응은 인터페론 β를 유도하는 반응인 것을 특징으로 하는 liRNA.
제 1항에 있어서, 상기 면역반응은 단백질 키나아제 R (protein kinase R, PKR)-의존성인 것을 특징으로 하는, liRNA.
제 9항에 있어서, 표적 유전자의 발현 억제는 서열의존적으로 일어나고, 면역반응은 구조의존적으로 발생하는 것을 특징으로 하는, liRNA.
제 1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 liRNA를 함유하는 유전자 발현 억제 또는 면역 반응 촉진용 조성물.
제 1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 liRNA를 함유하는 항바이러스 조성물.
제 7항 또는 제 8항의 liRNA를 함유하는 항암 조성물.