KR101587483B1 - A pharmaceutical composition for prevention or treatment of proliferative vitreoretinopathy comprising the inhibitor of mitochondrial complex as an effective component - Google Patents
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Abstract
Translated fromKoreanDescription
Translated fromKorean본 발명은 세포 내 미토콘드리아성 복합체 Ⅰ(Mitochondrial complex Ⅰ)의 저해제를 유효성분으로 함유하는 증식성 유리체망막병증(proliferative vitreoretinopathy, PVR)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of proliferative vitreoretinopathy (PVR) containing an inhibitor of intracellular mitochondrial complex I as an active ingredient.
세포사(death)는 조직 항상성을 유지하기 위한, 세포 분열에 대한 보충적 및 길항적 과정 모두이며, 몇몇 생리학적 공정 및 질병에서 중추적인 역할을 한다. 가장 광범위하게 연구된 범주인 세포사멸 (apoptosis)은, 카스파제 (caspase)의 대량 활성화, 염색사 응축, 및 세포 부피의 감소에 의하여 특징된다. 세포괴사 (Necrosis)는 세포 부피의 증가, 세포소기관의 팽창, 및 혈장 막의 파열에 의하여 특징되며, 이는 대개 우발적인, 비통제된 유형의 세포사로 여겨진다. 조절된 세포괴사(Necroptosis)는 조절된 괴사성 세포사로, 이는 사멸 수용체 리간드의 존재 하에서 광범위한 카스파제 저해에 의하여 촉발되고, 괴사성 세포사 형태에 의하여 특징된다. 자가소화 (autophagy)는 분해성 리소좀 경로로, 이는 리소좀 효소에 의한 벌크 분해를 위한, 액포 내 세포질성 물질의 축적에 의하여 특징된다. 자가소화가 세포 생존에 중추적인 역할을 하지만, 증가된 자가소화 활성은 종종 세포 사멸과 연관된다. 유사분열성 파멸 (mitotic catastrophe: MC)은, DNA 손상 후 유사분열 진행에 대한 실패로 인한 결과로 생성되는 세포 사멸의 유형으로, 이는 4배수성 또는 핵내 배수성(endopolyploidy)을 일으킨다. MC를 경험한 세포들은 일반적으로 다중 소핵을 갖는 거대 세포들을 형성한다.Death is both a complementary and antagonistic process for cell division to maintain tissue homeostasis and plays a pivotal role in several physiological processes and diseases. The most extensively studied category, apoptosis, is characterized by mass activation of caspases, condensation of the chromosomes, and reduction of cell volume. Necrosis is characterized by an increase in cell volume, expansion of cell organelles, and rupture of the plasma membrane, which is usually considered an accidental, uncontrolled type of cell death. Modulated Necroptosis is a regulated necrotic cell death, characterized by extensive necrosis inhibition and necrotic cell death in the presence of the death receptor ligand. Autophagy is a degradable lysosome pathway, which is characterized by the accumulation of cytoplasmic material in the vacuole for bulk degradation by lysosomal enzymes. Although self-digestion plays a pivotal role in cell survival, increased self-renewal activity is often associated with apoptosis. Mitotic catastrophe (MC) is a type of apoptosis that results from failure of mitosis progression after DNA damage, which causes quadruple or endopolyploidy. Cells that have experienced MC generally form giant cells with multiple micronuclei.
망막 색소 상피 (retinal pigment epithelial: RPE) 세포는 망막의 광수용기 외분절 (POS)에 인접한 세포의 단일 층을 형성하며, 이들 세포는 POS 세포의 유지에 중추적인 역할을 한다. RPE 세포사는, 연령-관련 황반변성 (Age-related macular degeneration: AMD) 및 증식성 유리체망막병증 (vitreoretinopathy: PVR)과 같은 몇몇 안과 병리학적 질환들에서 중요한 인자이다. AMD는 황반의 점진적인 퇴화이며, 크게 건성 또는 습성으로 분류된다. AMD의 건성 형태가 보다 흔하며, 황반에서 드루젠(drusen)의 존재에 의하여 특징된다. 호흡기 복합체 I의 미토콘드리아성 DNA 변이체들은 증가된 AMD 위험과 관련된다. RPE에서의 손상 및 그의 사멸은 결정적이며, 아마도 AMD를 촉발시키기 때문에, RPE 세포사에 대한 보호는 AMD의 개시를 지연시킬 수 있다. 역으로, RPE 세포들은 PVR에서 망막 앞막의 형성에 현저히 기여한다. 따라서, 망막 앞막에서의 RPE 세포사의 도입은 PVR에서의 세포 증식을 저해하는 새로운 시도일 수 있다. 이들 안과 병리학적 상태의 맥락에서 RPE 세포사에 대한 대부분의 연구들은 세포사, 세포사멸 및 세포괴사 중 2 개의 유형에 집중되어 왔다.Retinal pigment epithelial (RPE) cells form a monolayer of cells adjacent to the photoreceptor outer segment (POS) of the retina, and these cells play a pivotal role in the maintenance of POS cells. RPE cell lines are an important factor in some ophthalmologic diseases such as age-related macular degeneration (AMD) and proliferative vitreoretinopathy (PVR). AMD is a gradual degeneration of the macula, largely classified as dry or wet. AMD's dry form is more common and is characterized by the presence of drusen in the macula. Mitochondrial DNA variants of respiratory complex I are associated with increased AMD risk. Protection against RPE cell death may delay the onset of AMD, since damage to RPE and its death is crucial and probably triggers AMD. Conversely, RPE cells contribute significantly to the formation of the anterior membrane of the retina in PVRs. Therefore, introduction of RPE cell death in the retina frontal membrane may be a new attempt to inhibit cell proliferation in PVR. In the context of these ophthalmologic conditions, most studies on RPE cell death have focused on two types of cell death, apoptosis and cell necrosis.
RPE 세포사의 이해에 있어서 발전들이 이루어져 왔으나, 이들 안과 병리학적 상태와 관련된 RPE 세포사에서 자가소화의 역할에 대한 정보는 아주 적다. 매일, RPE 세포는 POS의 원위 부분을 대식작용 및 소화시키며, 이들은 궁극적으로 리소좀에서 분해된다. RPE 내 대식작용 및 자가소화의 상호작용은, 시력을 지지하기 위하여, POS 분해 및 레티노이드 수준의 유지 두가지를 모두 필요로 한다. 노안의 RPE 세포들에서, 이러한 생리학적 리소좀성 부하는 더욱 증가되어, 손상된 물질의 제거를 더욱 증가시킬 수 있고, 손상된 거대분자들과 세포소기관들의 늙은 RPE 세포들에 의한 불충분한 소화는 리포푸신(lipofuscin)과 같은, 생물학적 "폐기물"의 점진적인 축적을 일으킬 것이다. 이에 따라, 벗겨진 POS 파편의 리소좀 의존성 분해에서의 비정상은 RPE 세포의 분해에 기여할 수 있다. 자가소화에서 연령-관련 변화는 AMD 환자에서 발견되는 유전적 감수성에 기초할 수 있으며, AMD의 병리학과 관련될 수 있다는 것이 이전의 연구에서 제안되었다. 그러나, 자가소화가 AMD에서 RPE 세포사를 조절하는 메커니즘은 여전히 불투명하다. PVR에서 RPE 세포들의 증식에서 자가소화의 역할 및 그의 PVR에 대한 치료 전략으로서의 그의 조절은 아직 문서화되지 않았다.Although advances have been made in the understanding of RPE cell death, little is known about the role of self-extinguishing in RPE cell death associated with these ophthalmic pathological conditions. Each day, RPE cells metabolize and digest the distal part of the POS, which ultimately break down in lysosomes. The interaction of glomerular and self-extinguishing in the RPE requires both POS degradation and maintenance of retinoid levels to support vision. In presbyopic RPE cells, this physiological lysosomal load may be further increased to further increase the removal of damaged materials, and insufficient digestion by the damaged RPE cells of damaged macromolecules and cell organelles may be associated with lipofuscin will cause a gradual accumulation of biological "wastes ", such as lipofuscin. Thus, abnormalities in lysosome-dependent degradation of stripped POS fragments can contribute to the degradation of RPE cells. Previous studies have suggested that age-related changes in self-extinguishing may be based on the genetic susceptibility found in AMD patients and may be related to the pathology of AMD. However, the mechanism by which self-extinguishing regulates RPE cell death in AMD is still unclear. The role of self-digestion in the proliferation of RPE cells in PVR and its regulation as a therapeutic strategy for PVR has not yet been documented.
로테논(Rotenone)은 식물에 의해 생산되는 천연 이소플라보노이드로, 미토콘드리아성 복합체 I의 선택적이며 화학양론적인 저해제이다. 더욱 구체적으로, 로테논은 NADH-유비퀴논 산화물 환원제 효소 복합체에 의한 NADH 산화를 차단하여, 미토콘드리아성 호흡의 저해 및 ATP 합성에서의 감소를 결과로서 초래한다. 로테논 처리는 또한 반응성 산소종 (ROS)의 생산을 결과로서 일으켜, 결과적으로 세포사를 일으킨다. 몇몇 연구들은, 로테논이 아마도 미토콘드리아 기능의 저해 및 산화적 스트레스의 생성에 반응하여 자가소화성 액포의 축적을 유발한다는 것을 보여주었다. 그와 관계없이, 로테논의 활성은 각종 세포에서 연구되어 왔으며, RPE 세포에 대한 로테논의 효과는 거의 연구되지 않았다. 시험관 내 시스템을 이용한 이전의 연구들은, 저농도의 로테논이 RPE 세포들에서 mtDNA 손상을 결과로서 초래함을 밝혔으며, 노령의 RPE 세포에서 로테논 처리에 의해 유발된 증가된 자가소화가 드루젠 및 AMD의 형성에 영향을 미칠 수 있음을 제안하였다. 그러나, 로테논이 RPE 세포사를 조절하는 메커니즘은 불명확한 것으로 남아있다.
Rotenone is a natural isoflavonoid produced by plants, a selective and stoichiometric inhibitor of mitochondrial complex I. More specifically, rotenone blocks NADH oxidation by the NADH-ubiquinone oxidase reductase complex, resulting in inhibition of mitochondrial respiration and reduction in ATP synthesis. Rhenonon treatment also results in the production of reactive oxygen species (ROS), resulting in cell death. Several studies have shown that rotenones probably lead to the accumulation of self-extinguishing vacuole in response to inhibition of mitochondrial function and the production of oxidative stress. Regardless of this, rotronectin activity has been studied in a variety of cells, and the effect of rotenone on RPE cells has rarely been studied. Previous studies using in vitro systems have shown that low concentrations of rotenone result in mtDNA damage in RPE cells, and increased autolysis induced by rotenone treatment in old RPE cells leads to increased production of DRUGEN and < RTI ID = 0.0 > And may affect the formation of AMD. However, the mechanism by which rotenone modulates RPE cell death remains unclear.
본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 안과 병리학적 질환인 PVR의 예방 또는 치료용으로서 RPE 세포의 세포사를 조절할 수 있는 약학적 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
The object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition capable of controlling the cell death of RPE cells for the prevention or treatment of PVR, which is an ophthalmological pathological disease.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 미토콘드리아성 복합체 Ⅰ(Mitochodrial complex Ⅰ) 저해제를 유효성분으로 함유하는 증식성 유리체망막병증(Proliferative vitreoretinopathy: PVR)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating proliferative vitreoretinopathy (PVR) containing mitochondrial complex I inhibitor as an active ingredient .
상기 미토콘드리아성 복합체 Ⅰ 저해제는 로테논(Rotenone)인 것이 바람직하다.The mitochondrial complex I inhibitor is preferably Rotenone.
상기 유효성분에는 자기소화(Autophagy) 억제제를 더 포함하는 것이 바람직하다.The active ingredient preferably further comprises an autophagy inhibitor.
상기 자기소화 억제제는 3-메틸아데닌(3-methyladenine), 바필로바이신 A1(bafilomycin A1) 및 클로로퀸(chloroquine)으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것이 바람직하다.It is preferable that the autolysis inhibitor is at least one selected from the group consisting of 3-methyladenine, bafilomycin A1 and chloroquine.
상기 유효성분은 RPE(Retinal pigment epithelial) 세포의 세포사(Cell death)를 조절하는 것이 바람직하다.The active ingredient preferably controls the cell death of RPE (retinal pigment epithelial) cells.
상기 세포사 조절은 세포사멸(Apoptosis)을 유도하는 것이 바람직하다.Preferably, the cell death regulation induces apoptosis.
본 발명에 따르면, 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 유효성분은 RPE 세포의 세포사를 조절함으로써 안과 병리학적 질환인 PVR에 대한 효과적인 치료제로서 개발될 수 있는 가능성이 있다.
According to the present invention, the active ingredient contained in the pharmaceutical composition of the present invention may be developed as an effective therapeutic agent for PVR which is an ophthalmological disease by controlling the cell death of RPE cells.
도 1은 로테논이 ARPE-19 retinal pigment epithelial cells에서 MC(mitotic catastrophe)를 유도함을 보여주는 결과들이다.
도 2는 RPE-MC 세포에서 증가된 자기소화가 발생함을 보여주는 결과들이다. 여기에서, C는 control, 3MA는 3-methyladenine, Baf는 bafilomycin A 및 CQ는 chloroquine을 나타낸다.
도 3은 RPE-MC 세포가 자기소화 저해에 취약함을 보여주는 결과들이다.
도 4는 자기소화 저해에 의한 RPE-MC 세포사의 증대를 보여주는 결과들이다.
도 5는 RPE-CM 세포에서 Parkin-mediated mitophagy가 발생되는 것을 보여주는 결과들이다.
도 6은 Mitophagy가 RPE-MC 세포의 세포 보호에 기여함을 보여주는 결과들이다.
도 7은 알파 B 크리스탈린이 RPE-CM 세포를 세포사멸로부터 보호됨을 보여주는 결과들이다.Figure 1 shows that rottenone induces MC (mitotic catastrophe) in ARPE-19 retinal pigment epithelial cells.
Figure 2 shows the results of increased self-digestion in RPE-MC cells. Here, C represents control, 3MA represents 3-methyladenine, Baf represents bafilomycin A, and CQ represents chloroquine.
Figure 3 shows the results showing that RPE-MC cells are vulnerable to auto-digestion inhibition.
Figure 4 shows the results of RPE-MC cell death enhancement due to autolytic inhibition.
Fig. 5 shows the results of the generation of Parkin-mediated mitophagy in RPE-CM cells.
Fig. 6 shows the results showing that Mitophagy contributes to cytoprotection of RPE-MC cells.
Figure 7 shows the results showing that alpha B-crystal is protected from apoptosis of RPE-CM cells.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명자들은, 미토콘드리아성 복합체 I 저해에 의하여 손상된 RPE 세포의 사멸을 조절하는 메커니즘을 명확히 하기 위하여 본 연구를 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 발명자들은 로테논이 RPE 세포들에서 MC를 유도함을 확인하였다. 추가적으로, 본 발명자들은 미토콘드리아성 복합체 I에 의하여 유도된 유사분열성 파멸 (RPE-MC 세포)을 겪은 RPE 세포들이 자가소화 저해에 취약함을 확인하였다.The present inventors conducted this study to clarify the mechanism of regulating the death of RPE cells damaged by mitochondrial complex I inhibition. As a result, the inventors of the present invention have confirmed that rotenone induces MC in RPE cells. In addition, the present inventors have found that RPE cells that have undergone mitotic damages induced by mitochondrial complex I (RPE-MC cells) are vulnerable to autolysis inhibition.
따라서, 본 발명은 미토콘드리아성 복합체 Ⅰ(Mitochodrial complex Ⅰ) 저해제를 유효성분으로 함유하는 증식성 유리체망막병증(Proliferative vitreoretinopathy: PVR)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating proliferative vitreoretinopathy (PVR) containing mitochondrial complex I inhibitor as an active ingredient.
상기 미토콘드리아성 복합체 Ⅰ 저해제는 로테논(Rotenone)인 것이 바람직하다.The mitochondrial complex I inhibitor is preferably Rotenone.
상기 로테논은 식물에 의하여 생산되는 이소플라보노이드계 화합물로서 미토콘드리아성 복합체 Ⅰ의 저해제로 작용한다.The rottenone is an isoflavonoid compound produced by plants and acts as an inhibitor of mitochondrial complex I.
상기 유효성분에는 자기소화(Autophagy) 억제제를 더 포함하는 것이 바람직하다.The active ingredient preferably further comprises an autophagy inhibitor.
상기 자기소화 억제제는 3-메틸아데닌(3-methyladenine), 바필로바이신 A1(bafilomycin A1) 및 클로로퀸(chloroquine)으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것이 바람직하다.It is preferable that the autolysis inhibitor is at least one selected from the group consisting of 3-methyladenine, bafilomycin A1 and chloroquine.
상기 유효성분은 RPE(Retinal pigment epithelial) 세포의 세포사(Cell death)를 조절하는 것이 바람직하다.The active ingredient preferably controls the cell death of RPE (retinal pigment epithelial) cells.
상기에서 "세포사(Cell death)"라 함은 세포의 조절된 또는 조절되지 않는 소멸(demise)을 의미하며, 예를 들어, 세포사멸(Apoptosis), 세포괴사(Necrosis), 조절된 세포괴사(Necroptosis), 자가소화(Autophagy) 및 유사분열성 파멸(Mitotic catastrophe)를 포함할 수 있다.The term " cell death "as used herein refers to controlled or uncontrolled demise of a cell and includes, for example, apoptosis, necrosis, regulated necrosis ), Autophagy, and mitotic catastrophe.
상기 세포사 조절은 세포사멸(Apoptosis)을 유도하는 것이 바람직하다.Preferably, the cell death regulation induces apoptosis.
이와 같은 세포사멸 유도에 의하여 RPE 세포의 세포사멸이 촉진되며, 본 발명의 유효성분은 안과 병리학적 질환인 증식성 유리체망막병증(Proliferative vitreoretinopathy: PVR)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서 적용될 수 있다.The induction of apoptosis induces apoptosis of RPE cells, and the active ingredient of the present invention can be applied as a pharmaceutical composition for the prophylactic or preventive treatment of proliferative vitreoretinopathy (PVR), which is an ophthalmic pathological disease .
본 발명의 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into various forms such as oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups and aerosols, injections of sterilized injection solutions, And can be administered by various routes including oral administration or intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, rectal, topical administration, and the like.
이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.Such pharmaceutical compositions may further comprise carriers, excipients or diluents, and examples of suitable carriers, excipients or diluents that may be included include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, But are not limited to, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, amorphous cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, And the like. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a filler, an anti-coagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, an antiseptic, and the like.
바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.In a preferred embodiment, the solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient, for example starch, calcium carbonate, Sucrose, lactose, gelatin and the like are mixed and formulated. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like may also be used.
바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.Examples of the oral liquid preparation include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like. In addition to water and liquid paraffin which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, Perfumes, preservatives, and the like.
바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.As a preferable specific example, the preparation for parenteral administration includes sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-drying agents, suppositories, and the like. Examples of the non-aqueous solvent and suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. Injectables may include conventional additives such as solubilizers, isotonic agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers, preservatives, and the like.
본 발명의 유효성분을 함유하는 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition containing the active ingredient of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, a "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dosage level will depend on the type of disease, severity, The sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of the treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
바람직한 구체예로서, 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 10mg , 바람직하게는 2 내지 5mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
In a preferred embodiment, the effective amount may vary depending on the age, sex, and body weight of the patient. In general, 1 to 10 mg, preferably 2 to 5 mg per kg of body weight is administered daily or every other day or one to three times a day can do. However, the dosage may not be limited in any way because it may be increased or decreased depending on route of administration, severity of disease, sex, weight, age, and the like.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples.
<<실시예Example>>
1. 재료 및 방법1. Materials and Methods
1.1. 시약1.1. reagent
하기 시약들을 상업적으로 수득하였다. 토끼 다클론성 항-인간 Bcl-2, Tom20, GFP, YFP, p-Parkin, 및 마우스 단일클론성 항-인간 Parkin 및 Beclin-1 항체 (Santa Cruz Biotechnology 사제), 토끼 다클론성 항-인간 카스파제-3, 카스파제-7, LC3B, HRP-접합된 당나귀 항-토끼, 양 항-마우스 IgG 항체, 및 RIPA 버퍼 (Cell Signaling 사제), 토끼 다클론성 항-인간 PINK1 (Abcam Cambridge 사제), FITC-접합된 염소 항-토끼 및 텍사스 레드-접합된 (Texas Red-conjugated) 말 항-마우스 IgGs (Vector 사제), 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)/F12, Opti-MEM, 및 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco BRL 사제), LysoTracker 및 Lipofectamine (Invitrogen 사제), β-액틴 항체, Hoechst 33342, 다이메틸 설폭사이드 (DMSO), RN아제 A, 프로테나아제 K, 프로피디움 요오드화물 (PI), 단백질-A 아가로오스, 3-메틸아데닌 (3MA), 바필로마이신 A1 (Baf-A1), 아넥신 V-FITC 세포자살 검출 키트, Mdivi-1, 아크리딘 오렌지, 클로로퀸, 및 로테논 (Sigma 사제), 판(pan) 카스파제 저해제 (Calbiochem 사제), 5,5',6,6'-테트라클로로-1,1',3,3'-테트라에틸벤즈이미다졸 카르보시아닌 요오드화물 (JC-1) (Molecular Probes 사제), SuperSignal WestPico 증진된 화학발광 웨스턴 블롯팅 검출 시약 및 우태아 혈청 (FBS) (Thermo), 및 siPORT 아민 (Ambion 사제).The following reagents were obtained commercially. Human Parkin and Beclin-1 antibodies (Santa Cruz Biotechnology), rabbit polyclonal anti-human caspase-1, human monoclonal anti-human Bcl-2, Rabbit anti-mouse IgG antibody, and RIPA buffer (manufactured by Cell Signaling), rabbit polyclonal anti-human PINK1 (manufactured by Abcam Cambridge), anti-rabbit anti- FITC-conjugated goat anti-rabbit and Texas Red-conjugated horse anti-mouse IgGs (Vector), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) / F12, Opti-MEM, and penicillin-streptomycin (Gibco BRL), LysoTracker and Lipofectamine (Invitrogen), β-actin antibody, Hoechst 33342, dimethyl sulfoxide (DMSO), RNase A, proteinase K, propidium iodide (PI) Agarose, 3-methyladenine (3MA), barfilomycin A1 (Baf-A1), annexin V-FITC cell suicide detection kit, Mdivi-1, , Chloroquine, and rotenone (manufactured by Sigma), a pan caspase inhibitor (manufactured by Calbiochem), 5,5 ', 6,6'-tetrachloro-1,1', 3,3'- (JC-1) (Molecular Probes), SuperSignal WestPico Enhanced Chemiluminescence Western blotting Detection Reagent and Fetal Bovine Serum (FBS) (Thermo), and siPORT Amine (Ambion).
1.2. 세포 배양1.2. Cell culture
ARPE-19 세포를 미국 균주 보관소 (American Type Culture Collection: ATCC)로부터 구매하고, 공기 분위기 하에서 37℃, 5% CO2에 유지시켰다. 세포들을 DMEM 및 10% FBS로 보충된 Ham F12 배지의 1:1 혼합물 내에서 생장시켰다.ARPE-19 cells were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC) and maintained at 37 ° C and 5% CO2 in an air atmosphere. Cells were grown in a 1: 1 mixture of Ham F12 medium supplemented with DMEM and 10% FBS.
1.3.1.3.로테논Roteon 처리 process
ARPE-19 세포를 계대배양하여 24시간 후, 원래의 배지를 제거하였다. 세포들을 PBS로 세척한 후, 동일한 새로운 배지에서 인큐베이션하였다. 로테논을 저장 용액(stock solution)에서 배지를 첨가하여 약물의 2.5μM 희석액을 수득하였다. 0, 24, 48, 72, 또는 96시간 후, 세포들을 수확하고, 트립판 블루로 염색한 후, 혈구계산기를 이용하여 계수하였다. 본 발명에서 사용된 PBS의 농도는 본 발명자들의 이전의 연구에서의 ARPE-19 세포 증식에 대한 어떤 영향도 없었다.ARPE-19 cells were subcultured and after 24 hours, the original medium was removed. Cells were washed with PBS and then incubated in the same fresh medium. The rithenone was added to the stock solution in the medium to obtain a 2.5 μM dilution of the drug. After 0, 24, 48, 72, or 96 hours, the cells were harvested, stained with trypan blue and counted using a hemocytometer. The concentration of PBS used in the present invention had no effect on ARPE-19 cell proliferation in our previous studies.
1.4.1.4.김사Gimsa((giemsagiemsa) 염색) dyeing
ARPE-19 세포들을 로테논 없이 또는 로테논과 함께 배양하고, 그 후 메탄올로 10분 동안 고정시켰다. 핵 형태학 관찰을 위하여, 슬라이드를 김사 용액으로 15분 동안 염색하였다.ARPE-19 cells were incubated with or without rotenone and then fixed with methanol for 10 minutes. For nuclear morphological observation, the slides were stained with a gingival solution for 15 minutes.
1.5.1.5.DNADNA저배수성의Low-purity 정량 및 Quantitative and유세포Flow cell 분석에 의한 세포 사이클 상 분석 Analysis of cell cycle phase by analysis
0.5% Tween-20으로 보충된 빙냉된 95% 에탄올을 세포 현탁액에 첨가하여 70% 에탄올의 최종 농도로 하였다. 고정된 세포들을 펠렛화하고 1% BSA-PBS 용액 중에서 세척하였다. 세포들을 11 Kunitz U/ml RNase를 포함하는 1mL의 PBS 중에 재현탁시키고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, BSA-PBS로 한번 세척하고, 50 ㎍/ml PI 용액 중에 재현탁시켰다. 세포들을 어두운 중에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 35 mm 메쉬를 통하여 여과하고, FACSCalibur (Becton-Dickinson) 유세포 분석기를 이용하여 염색 1시간 내에 DNA 함량을 결정하였다. 세포성 DNA 함량을 CellQuest 소프트웨어 (Becton-Dickinson)를 이용하여 분석하였다.Cooled 95% ethanol supplemented with 0.5% Tween-20 was added to the cell suspension to a final concentration of 70% ethanol. Fixed cells were pelleted and washed in 1% BSA-PBS solution. The cells were resuspended in 1 mL of PBS containing 11 Kunitz U / ml RNase, incubated at 4 DEG C for 30 minutes, washed once with BSA-PBS and resuspended in 50 mu g / ml PI solution. The cells were incubated in the dark at 4 ° C for 30 minutes, then filtered through a 35 mm mesh and the DNA content was determined within 1 hour of staining using a FACSCalibur (Becton-Dickinson) flow cytometer. Cellular DNA content was analyzed using CellQuest software (Becton-Dickinson).
1.6. 공-면역침전1.6. Co-immunoprecipitation
세포 추출물을 추출 버퍼 내 적절한 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 면역복합체들은, 단백질 A-세파로오스 비즈를 이용하여 2시간 동안 침전되었으며, SDS 샘플 버퍼 중에서 비등시키기 전 추출 버퍼로 5회 세척하였다. 40㎍의 단백질을 포함하는 면역침전된 단백질 또는 분취액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, 웨스턴 블롯 분석을 기재한 바와 같이 수행하였다. 각 공-면역침전 실험은 상호(reciprocal) 면역침전을 통하여 확인되었다.Cell extracts were incubated overnight at 4 ° C with appropriate antibodies in extraction buffer. Immune complexes were precipitated with protein A-sepharose beads for 2 hours and washed 5 times with extraction buffer before boiling in SDS sample buffer. Immunoprecipitated proteins or aliquots containing 40 [mu] g of protein were separated on SDS-polyacrylamide gels and Western blot analysis was performed as described. Each co-immunoprecipitation experiment was confirmed by reciprocal immunoprecipitation.
1.7. 인간1.7. human파킨Parkin 및 AndPINK1PINK1siRNAsiRNA
인간 파킨 siRNA (SMART 풀; L-003603-00-0005) 및 PINK1 siRNA (SMART 풀; L-004030-00-0020)을 Thermo Scientific으로부터 구매하였다. 음성 대조구로서, 동일한 뉴클레오티드를 긁어모아 비게놈성 조합을 형성하였다.Human parkin siRNA (SMART pool; L-003603-00-0005) and PINK1 siRNA (SMART pool; L-004030-00-0020) were purchased from Thermo Scientific. As a negative control, the same nucleotides were scraped together to form a non-genomic combination.
1.8.1.8.siRNAsiRNA 형질전환 Transformation
siPORT 아민 및 Opti-MEM 배지를 이용하여, siRNA 형질전환을 수행하였다. 세포들을 6-웰 플레이트에서 40~50%의 컨플루언스 (confluent)에 도달할 때까지 생장시키고, 웰 당 100 nM의 최종 siRNA 농도로 트랜스팩션시켰다. 형질전환 혼합물을 각 웰에 첨가하고, 세포들을 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 2ml의 성장 배지를 첨가하고, 세포들을 또다른 20시간 동안 인큐베이션하였다. siRNA 형질전환 후, 배지를 제거하고, 각 웰을 PBS 용액 중에서 세척하였다.siRNA transfection was performed using siPORT amine and Opti-MEM medium. Cells were grown in 6-well plates until reaching 40-50% confluent and transfected with a final siRNA concentration of 100 nM per well. The transfection mixture was added to each well and the cells were incubated for 4 hours. Thereafter, 2 ml of growth medium was added, and the cells were incubated for another 20 hours. After siRNA transformation, the medium was removed and each well was washed in PBS solution.
1.9. 하위세포성1.9. Subcellular분획화Fractionation
ARPE-19 세포 (107 세포/웰)를 Tris-계 Mg2+/Ca2+-결핍 버퍼 (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 및 25 mM Tris, pH 7.6)에서 세척하고, 빙냉된 저장성(hypotonic) CaRSB 버퍼 (10 mM NaCl, 1.5 mM CaCl2, 10 mM Tris, pH 7.5, 및 1x 프로테아제 저해제 칵테일)에서 10분 동안 팽윤되도록 두었다. 세포들을 Dounce 균질기에서 60 회 스트로크 (strokes)에 의하여 분쇄시키고, 미토콘드리아 안정화 버퍼 (210 mM 만니톨, 70 mM 수크로오스, 5 mM EDTA, 및 5 mM Tris, pH 7.6)를 첨가하여 미토콘드리아를 안정화시켰다. 세포들을 3,000 rpm에서 15분 동안 2회 원심분리하여 핵을 수집한 후, 상등액을 4℃에서 20분 동안 14,000 rpm으로 회전시켰다. 펠레 및 상등액은 미토콘드리아 및 세포질 분획을 각각 포함하였다. 세포(5×107)는 빙냉된 저장성 CaRSB 버퍼 중에서 팽윤되었으며, Dounce 균질기를 이용하여 분쇄하였다. 그 후 세포 균질물을 3,000 rpm에서 15분 동안 2회 회전시켜 가라앉혔다.ARPE-19 cells (107 cells / well) for Tris- total Mg2+ / Ca2+ - in the wash buffer deficiency (135 mM NaCl, 5 mM KCl, and 25 mM Tris, pH 7.6), and the ice-cold hypotonic ( in hypotonic) CaRSB buffer (10 mM NaCl, 1.5
1.10.1.10.웨스턴Western블롯Blot 분석 analysis
세포들을 빙냉된 PBS로 2회 세척하고, 빙냉된 가용화 버퍼 (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl [pH 7.6], 0.5% 트리톤 (Triton) X-100, 2 mM PMSF, 2 ㎕/mL 아프로티닌, 및 2 ㎕/mL 류펩틴) 200 ㎕ 중에 재현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 용균물을 4℃에서 15분 동안 14,000 rpm으로 원심분리하였다. 세포 용균물의 단백질 농도를, 브래드포드 (Bradford) 단백질 분석 키트 (Bio-Rad)를 이용하여 결정하였으며, 균등량의 단백질들을 7.5% 내지 15% 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 겔 상에 로딩하였다. 그 후 단백질을 질소셀룰로오스 막 (Amersham Pharmacia Biotech 사제) 상으로 옮기고, 각 항체를 이용하여 프로브 탐지하였다. 증진된 화학발광성 기재 (SuperSignal WestPico; Pierce 사제)를 이용하여, 항체를 이용한 면역 염색을 수행하였으며, 사진 필름을 이용하여 이를 검출하였다 (LAS-3000 Plus; Fuji). 당량 단백질 부하는 폰소 S (Ponceau S) 염색에 의하여 확인하였다.Cells were washed twice with ice-cold PBS and resuspended in ice-cold solubilization buffer (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 0.5% Triton X-100, 2 mM PMSF, , And 2 [mu] l / mL leupeptin) and incubated at 4 [deg.] C for 30 minutes. Was centrifuged at 14,000 rpm for 15 minutes at 4 < 0 > C. The protein concentration of the cell lysate was determined using a Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad), and an equal amount of protein was eluted with 7.5% to 15% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS -PAGE) gel. Then, the proteins were transferred onto a nitrocellulose membrane (Amersham Pharmacia Biotech), and probes were detected using each antibody. Immunostaining with an antibody was performed using an enhanced chemiluminescent substrate (SuperSignal WestPico; Pierce), and detected using a photographic film (LAS-3000 Plus; Fuji). Equivalent protein loading was determined by Ponceau S staining.
1.11.1.11.LC3LC3--GFPGFP,,YFPYFP--파킨Parkin, 및, AndPINK1PINK1--GFPGFP의ofARPEARPE-19 세포로의 형질감염 및-19 < / RTI >공초점Confocal 현미경분석 Microscope analysis
pEGFP 내로 클로닝된 인간 LC3의 포유동물 표현 구축물은 Dr. N. Mizushima (Tokyo Medical and Dental University, Tokyo, Japan)에 의하여 제공되었다. YFP hparkin 및 GFP hPINK1은 Dr. J Chung (Seoul National University, Seoul, Korea)에 의하여 제공되었다. ARPE-19 세포들을 6개-웰 플레이트 내에 접종하고 (105 세포/웰) Lipofectamine 2000을 제조자 설명서에 따라 사용하여, 각 구축물을 이용하여 일시적으로 형질전환시켰다. 간략하게는, 2㎍의 플라스미드 DNA를 6㎕의 Lipofectamine 2000과 혼합하고, Opti-MEM과 함께 인큐베이션하였다. 플라스미드 DNA-Lipofectamine 2000 복합체를 세포에 첨가하고, 그 혼합물을 37℃에서 4시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 배지를 2㎕의 생장 배지로 교체하고, 세포들을 추가 20시간 동안 유지시켰다. 형질전환한지 24시간 후, 플라스미드 DNA 형질전환 배지를 제거하고, 각 웰을 PBS 용액으로 세척하였다. 세포들을 나타낸 바와 같이 처리하고, 4℃에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정시켰다. 형광 이미지들을 수득하고, Zeiss LSM 510 레이저-스캐닝 공초점 현미경 (Goettingen, Germany)을 이용하여 분석하였다. 점찍힌(punctuate) 패턴을 나타낸 세포들을 정량화하기 위하여, 각 실험으로부터 적어도 300개의 세포들을 실험군에 대하여 모르는 관찰자에 의하여 계수하였다.The mammalian expression constructs of human LC3 cloned into pEGFP are described in < RTI ID = 0.0 > N. Mizushima (Tokyo Medical and Dental University, Tokyo, Japan). YFP < / RTI > hparkin and GFP < RTI ID = J Chung (Seoul National University, Seoul, Korea). ARPE-19 cells were inoculated into 6-well plates (105 cells / well) and transiently transfected using each construct using Lipofectamine 2000 according to the manufacturer's instructions. Briefly, 2 μg of plasmid DNA was mixed with 6 μl of Lipofectamine 2000 and incubated with Opti-MEM. Plasmid DNA-Lipofectamine 2000 complex was added to the cells, and the mixture was further incubated at 37 DEG C for 4 hours. After incubation, the medium was replaced with 2 의 of growth medium and the cells were maintained for an additional 20 hours. After 24 hours of transformation, the plasmid DNA transformation medium was removed and each well was washed with PBS solution. Cells were treated as indicated and fixed with 4% paraformaldehyde for 15 min at 4 ° C. Fluorescence images were obtained and analyzed using a Zeiss LSM 510 laser-scanning confocal microscope (Goettingen, Germany). To quantify the cells showing the punctuate pattern, at least 300 cells from each experiment were counted by an observer unknown to the experimental group.
1.12. 투과 전자 현미경1.12. Transmission electron microscope
처리한지 48시간 후, 세포들을 수확, 펠렛화하고, 인산염 버퍼 중 2.5% 글루타르알데히드 내에서 고정시켰다. 세포들을 인산염 버퍼로 헹구고, 샘플들을 1시간 동안 1%의 4산화오스뮴 내에서 후고정시키고, 등급화된 일련의 에탄올 내에서 탈수시키고, 산화프로필렌과 함께 인큐베이션하고, Epon812에서 하룻밤 동안 보관하였다. 샘플들을 Epon812 내에 임베딩하고(embedded), 60℃ 오븐 내에서 경화시켰다. Reichert Ultracut E 마이크로톰을 이용하여 초박형 단편들을 수득하였다. 단편들을 우라닐 아세테이트, 납 시트레이트로 염색하고, 투과 전자 현미경 (Hitachi)를 이용하여 관찰하였다. 각 처리군 또는 대조구에 대하여, 임의 선택된 투과 전자 현미경 필드로부터 적어도 200개의 세포들이 관찰되었다.Forty-eight hours after treatment, the cells were harvested, pelleted, and fixed in 2.5% glutaraldehyde in phosphate buffer. Cells were rinsed with phosphate buffer, samples were postfixed in 1% osmium tetroxide for 1 hour, dehydrated in graded series of ethanol, incubated with propylene oxide, and stored overnight at Epon 812. Samples were embedded in Epon 812 and cured in a 60 ° C oven. Ultra-thin fragments were obtained using a Reichert Ultracut E microtome. The fragments were stained with uranyl acetate and lead citrate and observed using a transmission electron microscope (Hitachi). For each treatment group or control, at least 200 cells from an arbitrarily selected transmission electron microscopy field were observed.
1.13.1.13.TUNELTUNEL 염색 dyeing
세포자살이 진행되는 세포들을 관찰하기 위하여, 형광 TUNEL (말단 데옥시리보뉴클레오티딜 전이효소-매개된 dUTP-다이곡시제닌 닉 앤드 라벨링: terminal deozyribonucleotidyl deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP-digoxigenin nick end labeling) 분석을, 현장 사멸 검출 키트를 이용하여 수행하였다. 간략하게, 커버슬립 상에서 성장된 세포들을 4% 파라포름알데히드 내에서 15분 동안 고정시킨 후, PBS 중에 헹구었다. 세포들을 37℃에서 1시간 동안 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 (TdT)와 함께 인큐베이션시킨 후, 항-다이곡시제닌-FITC를 실온에서 30분 동안 적용하였다. 핵을 프로피디윰 요오드화물/퇴색방지제(antifade)로 대비염색시켰다. Zeiss LSM 510 레이저-스캐닝 공초점 현미경을 이용하여 형광 이미지들을 관찰하고 분석하였다. 각 실험으로부터 적어도 300 세포의, 총 세포 수를 계수하고, 양성 염색을 보인 세포들의 수를 에피형광 광학렌즈 하에서, 이에 대한 정보를 알지못하는(blinded) 관찰자에 의해 계산하였다.In order to observe cells that undergo apoptosis, fluorescence TUNEL (terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP-digoxigenin nick end labeling) analysis was performed using terminal deoxyribonucleotidyl deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP-digoxigenin nick end labeling Was performed using a site killing detection kit. Briefly, cells grown on cover slips were fixed in 4% paraformaldehyde for 15 minutes and then rinsed in PBS. The cells were incubated with the terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) for 1 hour at 37 ° C and anti-di-gracycline-FITC was then applied for 30 minutes at room temperature. The nuclei were contrast dyed with propidium iodide / antifade. Fluorescence images were observed and analyzed using a Zeiss LSM 510 laser-scanning confocal microscope. The total number of cells of at least 300 cells from each experiment was counted and the number of cells showing positive staining was calculated by an observer blinded to the information under an epifluorescent optical lens.
1.14.1.14.훼스트Fest((HoechstHoechst) 염색) dyeing
세포들을 수확하고, 세포 원심분리기를 이용하여 세포 현탁액을 투명한 무지방 유리 슬라이드 상에서 원심분리시켰다. 샘플을 4 ㎍/ml Hoechst 33342를 이용하여 37℃에서 30분 동안 염색시키고, 4% 파라포름알데히드 중에서 10분 동안 고정시켰다. 적어도 300개의 세포들인, 각 실험으로부터의 총 세포 수를 DIC 광학렌즈 하에서 계수하고, 훼스트 염색에서 응축된 또는 단편화된 핵을 나타내는 세포들의 수를 에피형광 광학 렌즈 하에서, 이에 대한 정보를 알지못하는 관찰자에 의해 계산하였다.The cells were harvested and the cell suspension centrifuged on a clear, non-fat glass slide using a cell centrifuge. Samples were stained with 4 ug / ml Hoechst 33342 at 37 캜 for 30 minutes and fixed in 4% paraformaldehyde for 10 minutes. The total number of cells from each experiment, at least 300 cells, was counted under a DIC optical lens and the number of cells showing condensed or fragmented nuclei in the Fest staining was measured under an epifluorescent optical lens with an observer .
1.15. 세포자살,1.15. Cell suicide,세포소기관Cell organelle 함량, 및 미토콘드리아 막 전위의 Content, and mitochondrial membrane potential유세포적Flow cell 측정 Measure
산성 세포소기관 함량의 정량화를 위하여, 세포들을 50 nM LysoTracker 적색 또는 1 μg/ml의 아크리딘 오렌지 중에서, 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 상기 세포자살성 세포의 정량화를 위하여, 세포를 5 ㎕의 아넥신 V-FITC 접합물 및 10 ㎕의 프로피디늄 요오드화물 용액을 포함하는 500 ㎕의 아넥신 V-결합 버퍼와 함께 인큐베이션시켰다. 실온에서 10분 동안 인큐베이션 한 후, 유세포 분석으로 세포들을 분석하였다. 미토콘드리아성 막 전위의 측정을 위하여, 세포들을 37℃에서 30분 동안 4 ㎍/ml JC-1와 함께 인큐베이션하였다. 데이터를 획득하고 ADC XL (Beckman Coulter)로 분석하였다.For quantification of acidic organelles content, cells were incubated in 50 nM LysoTracker red or 1 μg / ml acridine orange for 30 min at 37 ° C. For quantification of the apoptotic cells, the cells were incubated with 500 [mu] l Annexin V-binding buffer containing 5 [mu] l annexin V-FITC conjugate and 10 [mu] l propyl iodide solution. After incubation at room temperature for 10 minutes, cells were analyzed by flow cytometry. For determination of mitochondrial membrane potential, cells were incubated with 4 / / ml JC-1 for 30 minutes at 37 째 C. Data were acquired and analyzed with ADC XL (Beckman Coulter).
1.16. 통계 분석1.16. Statistical analysis
적어도 3회 이상의 독립된 실험을 시험관 내에서 실시하였다. 결과는 3회 실험으로부터의 평균±S.D.로 나타내었다. 실험 및 대조구의 결과는, 스튜던트 t 검정을 이용하여 통계적 유의성에 대해 검정하였다. 모든 경우에서, 0.05 미만의 p 값은 유의한 것으로 여겨졌다.
At least three independent experiments were performed in vitro. Results were expressed as mean ± SD from three experiments. Experimental and control results were tested for statistical significance using the Student t test. In all cases, a p value of less than 0.05 was considered significant.
2. 결과2. Results
2.1.2.1.로테논은RotenonARPEARPE-19 망막 색소 상피 세포에서-19 in retinal pigment epithelial cellsMCMC를 유도한다..
24 시간의 로테논 처리는 ARPE-19 세포의 생육성을 감소시키지 않았지만, 72 시간의 처리는 투여량-의존적인 방식으로 세포 생육성을 현저히 감소시켰다. 48 시간 동안 2.5~25μM의 로테논 처리는 ARPE-19 세포 (도 1A)의 생육성을 약간 (약 10~20%) 감소시켰다. 중요하게는, 2.5~25μM 로테논으로 처리된 대부분의 ARPE-19는 다수의 핵 및 불균일한 형태를 가졌다 (도 1B). 2.5μM는, 48 시간 동안 처리된 ARPE-19 세포들의 생육성에서 약간의 감소를 가져온 최저 투여량이기 때문에, 로테논-유도된 세포독성의 메커니즘 및 세포 소멸과 로테논-유도된 다핵화 사이의 상관관계에 대한 추가적인 연구에 이 농도를 사용하였다. 유세포 (flow cytometry) 분석은 대부분의 로테논-처리된 ARPE-19 세포들이 48시간 까지 4배수성(4C)이 되었음을 나타내었다 (도 1C). 포함된 대부분의 세포들은 >4N 수준의 DNA이고, 다핵화되었기 때문에, 이들 세포들이 MC를 통하여 사멸에 영향받기 쉬울 수 있다는 것이 가능해 보였다. 따라서, 본 발명자들은 투과 전자 현미경 하에 세포들을 관찰하였다. 투과 전자 현미경은 로테논-처리된 세포들 내 소핵들의 존재를 증명하였다 (도 1D). 이들 데이터는, 로테논이 ARPE-19 세포에서 MC를 유도한다는 것을 나타낸다.Ratron treatment for 24 hours did not decrease ARPE-19 cell viability, but treatment for 72 hours significantly reduced cell viability in a dose-dependent manner. Treatment with rotenone at 2.5-25 μM for 48 hours reduced the viability of ARPE-19 cells (FIG. 1A) slightly (about 10-20%). Importantly, most ARPE-19 treated with 2.5-25 μM rotenone had multiple nuclei and heterogeneous morphology (FIG. 1B). Since 2.5 μM is the lowest dose that resulted in a slight decrease in the viability of ARPE-19 cells treated for 48 hours, the mechanism of rottennone-induced cytotoxicity and the correlation between the extinction of cells and rotenone-induced polynucleation This concentration was used for further study of the relationship. Flow cytometry analysis showed that most rotenone-treated ARPE-19 cells were quadruplicated (4C) up to 48 hours (Fig. 1C). Since most of the cells involved are> 4 N levels of DNA and are multinucleated, it seems possible that these cells may be susceptible to death through MC. Therefore, the present inventors observed cells under a transmission electron microscope. Transmission electron microscopy demonstrated the presence of micronuclei in rottenon-treated cells (Fig. 1D). These data indicate that rotenone induces MC in ARPE-19 cells.
2.2.2.2.증가된Increased 자가소화는 Self-extinguishingARPEARPE-19 세포에서-19 cellsMCMC를 수반한다.≪ / RTI >
본 발명자들은 그 다음으로, 로테논이 RPE-MC 세포에서 자가 소화를 증가시키는지의 여부를 시험하였다. 웨스턴 블롯 분석은 로테논-처리된 ARPE-19 세포에서 LC3-II 수준의 증가를 증명하였다 (도 2A). 로테논 처리는 Beclin-1 또는 ATG5의 발현 수준을 변경시키지는 않았다. 그러나, 로테논은 ARPE-19 세포들에서 VPS-34의 발현 수준은 약간 증가시켰다 (도 A). 로테논은 Beclin-1과 Bcl-2 사이의 상호작용은 감소시켰지만, Beclin-1과 Vps-34 사이의 상호작용은 증가시켰다 (도 2B). 유세포 분석을 이용하여 LysoTracker 또는 아크리딘 오렌지로 라벨링된 세포소기관을 포함한 세포들을 관찰 및 정량화하였으며, 이 분석은 로테논이 산성 소포 세포소기관의 발달을 증가시켰다는 것을 증명하였다 (도 2C). 투과 전자 현미경은 로테논이 RPE-MC 세포에서 자가포식소체 (autophagosome)의 수를 증가시킴을 보여주었다 (도 2D). 이들 데이터는 증가된 자가소화가 RPE-MC 세포에 존재함을 나타낸다.The present inventors then tested whether the rottenone increases the self-digestion in RPE-MC cells. Western blot analysis demonstrated an increase in LC3-II levels in rotenone-treated ARPE-19 cells (Figure 2A). Rotthenone treatment did not alter the level of expression of Beclin-1 or ATG5. However, rottenone slightly increased the level of VPS-34 expression in ARPE-19 cells (Fig. A). Rotthenone reduced the interaction between Beclin-1 and Bcl-2, but increased the interaction between Beclin-1 and Vps-34 (FIG. 2B). Flow cytometry was used to observe and quantify cells, including cell organelles labeled with LysoTracker or acridine orange, and this assay demonstrated that the rotenone increased the development of acidic vesicle organelles (FIG. 2C). Transmission electron microscopy showed that rotenone increased the number of autophagosomes in RPE-MC cells (FIG. 2D). These data indicate that increased self-extinguishing is present in RPE-MC cells.
2.3.2.3.RPERPE--MCMC 세포들은 자가소화 저해에 취약하다. Cells are vulnerable to inhibition of self-digestion.
본 발명자들은 그 후, 자가소화의 저해가 RPE-MC 세포의 생육성에 영향을 미치는지의 여부를 검사하였다. 특히, 3MA, 바필로마이신 (bafilomycin) A1 (Baf-A1) 및 클로로퀸 (chloroquine) (CQ)과 같은 자가소화 저해제는 그들의 생육성을 현저하게 감소시켰다 (도 3A). 그 다음으로, ARPE-19 세포들을 녹색 형광 단백질 (GFP)-LC3 융합 플라스미드로 형질감염시키고, Baf-A1 또는 클로로퀸 존재 또는 부재 하에서 로테논으로 처리하고, 그 후 공초점 현미경을 이용하여 관찰하였다. Baf-A1 또는 클로로퀸 처리 후, LC3-GFP 눈물점의 수가 현저하게 증가되었다 (도 3B). 웨스턴 블롯 분석은 3MA가 로테논-처리된 ARPE-19 세포에서 LC3-II의 축적을 방지하였음을 나타내었다. 웨스턴 블롯 분석에 의한 LC3-II의 회전율 평가에 근거한, 자가소화 플럭스 (flux) 분석은 Baf-A1 또는 클로로퀸의 리소좀성 분해의 방지가 LC3-II의 축적을 유도하였음을 보여주었다. 로테논-단독 처리는 카스파제-3 및 카스파제-7 절개 (cleavage) 생성물을 유도하였다. 자가소화 저해와 연결된 로테논도 카스파제-3 및 카스파제-7 절개 생성물을 유도하였다. 그러나, 자가소화 저해는, 로테논-단독 처리에 비하여 이들 절개 생성물의 축적을 증대시키지 않았으며 (도 3C), 이는 자가소화 저해가 세포자살을 증대시키지 않았음을 나타낸다. 이들 데이터는, 자가소화 플럭스의 저해가 RPE-MC 세포들의 사멸을 유도하고, ARPE-19 세포를 로테논에 노출시킴으로써 유도된 자가소화는 세포보호성이라는 것을 나타낸다. 나아가 본 발명자들은 자가소화 저해제가 로테논-유도된 다핵화에 영향을 미치는지의 여부를 검사하였다. 본 발명자들의 데이터는 자가소화 저해제가 ARPE-19 세포에서 로테논-유도된 다핵화를 역전시키지 않았음을 나타낸다 (도 3D).The present inventors then examined whether the inhibition of auto-digestion affects the viability of RPE-MC cells. In particular, autoadjuvant inhibitors such as 3MA, bafilomycin A1 (Baf-A1) and chloroquine (CQ) significantly reduced their bioavailability (FIG. 3A). Next, ARPE-19 cells were transfected with a green fluorescent protein (GFP) -LC3 fusion plasmid, treated with rothenone in the presence or absence of Baf-Al or chloroquine, and then observed using a confocal microscope. After treatment with Baf-Al or chloroquine, the number of LC3-GFP tear points was significantly increased (FIG. 3B). Western blot analysis showed that 3MA prevented the accumulation of LC3-II in rotinone-treated ARPE-19 cells. Based on the turnover evaluation of LC3-II by Western blot analysis, self-extinguishing flux analysis showed that the prevention of lysosomal degradation of Baf-A1 or chloroquine induced the accumulation of LC3-II. The rotenone-alone treatment induced caspase-3 and caspase-7 cleavage products. Induced rotenone caspase-3 and caspase-7 incision products linked to autolysis inhibition. However, the autogenous inhibition did not increase the accumulation of these incision products compared to the rotenone-alone treatment (Fig. 3C), indicating that the autoprotease inhibition did not increase cell suicide. These data demonstrate that inhibition of self-extinguishing flux leads to the death of RPE-MC cells and that autolysis induced by exposure of ARPE-19 cells to rotonone is cytoprotective. Furthermore, the present inventors have examined whether the autolytic inhibitor affects the rotenone-induced polynucleation. Our data indicate that the autolytic inhibitor did not reverse rotophen-induced polynuclear in ARPE-19 cells (FIG. 3D).
2.4. 자가소화 저해에 의한2.4. By self-extinguishing inhibitionRPERPE--MCMC 세포 사멸의 증대가 Increased cell death비세포자살성Non-cell suicide 세포 사멸 경로를 통하여 일어난다. Through the apoptotic pathway.
본 발명자들은 세포 사멸의 메커니즘을 결정하기 위하여 몇가지 분석을 수행하였다. 웨스턴 블롯 분석은 카스파제-3 및 카스파제-7이 로테논 단독-처리된 ARPE-19 세포 (도 4A) 중에서 활성화되었음을 증명하였다. 유세포 분석은, 아넥신 V-양성 세포의 백분율 값이 약 10%였음을 증명하였다 (도 4B). 추가적으로, zVAD-fmk와의 인큐베이션은 로테논-단독 처리에 의하여 유도된 세포 사멸을 완전히 방지하였다. 그러나, zVAD-fmk와의 인큐베이션은 자가소화 저해제 (도 4C)에 의한 세포 사멸의 증대를 단지 부분적으로만 방지하였다. TUNEL 분석은, TUNEL-양성 세포의 백분율 값을 증대시키지 않았음을 증명한다 (도 4D). 이들 데이터는 도 3C와 관련하여, 자가소화 저해는, 로테논-유도된 MC가 진행되는 RPE 세포에서의 비세포자살성 세포 사멸을 주로 유도하는 한편, 로테논-단독 치료는 RPE 세포들에서 세포자살성 세포 사멸을 유도한다는 것을 제시한다.We performed several assays to determine the mechanism of apoptosis. Western blot analysis demonstrated that caspase-3 and caspase-7 were activated in rotenone alone-treated ARPE-19 cells (Figure 4A). Flow cytometry demonstrated that the percentage value of annexin V-positive cells was approximately 10% (Fig. 4B). In addition, incubation with zVAD-fmk completely prevented apoptosis induced by rotenone-only treatment. However, incubation with zVAD-fmk only partially prevented the increase of apoptosis by the autolysin inhibitor (Fig. 4C). TUNEL analysis did not increase the percentage of TUNEL-positive cells (Fig. 4D). These data, in conjunction with FIG. 3C, show that autolysis inhibition mainly induces non-apoptotic cell death in RPE cells in which rotenone-induced MC progresses, while rotonone- Induced apoptotic cell death.
2.5.2.5.파킨Parkin--매개된Mediated마이토파지(parkin-mediated mitophagy)가Parkin-mediated mitophagyRPERPE--MCMC 세포에서 일어난다. It occurs in cells.
본 발명자들은 그 후, 마이토파지가 RPE-MC 세포들에서 일어나는지의 여부를 검사하였다. 웨스턴 블롯 분석은 로테논이 파킨 단백질을 현저히 상향조절하였음을 나타내었다. 파킨은 대조구 세포의 미토콘드리아에서는 없지만, 로테논-처리된 세포들의 미토콘드리아 내로 전위되었다 (도 5A). 로테논은 미토콘드리아에서 포스포릴화 파킨 (p-파킨)의 양도 증가시켰다. 로테논은 PINK1를 현저하게 상향조절하지 않았으며, 로테논 처리는 미토콘드리아 분획에서 PINK1의 양을 증가시켰다. 유세포 분석은 로테논-처리된 세포들에서 MMP의 감소를 나타내었다 (도 5B). 공초점 현미경은 탈분극화된 미토콘드리아를 식별하였으며, 이는 정상의 미토콘드리아로부터 중간 내지 낮은 MitoTracker 미토콘드리아 염색을 나타내었으며,이는 미토콘드리아 막전위가 소실되지 않았음을 보여주는 것으로, 이에 따라 더욱 강한 염색을 나타내었다. 파킨 및 PINK1 수준은 탈분극화 미토콘드리아에서 현저히 증가되었다 (도 5C 및 도 5D). 파킨 및 PINK1 모두의 과잉발현은 LC3-II의 축적을 증가시켰다 (도 5E). 이들 발견은 파킨-매개 마이토파지가 RPE-MC 세포들에서 일어남을 나타낸다.The present inventors then examined whether or not the myotope occurred in RPE-MC cells. Western blot analysis showed that the rotenone significantly up-regulated the protein of the protein. The parkin was absent in the mitochondria of control cells, but was displaced into the mitochondria of rottenon-treated cells (Fig. 5A). Rotthenone increased the amount of phosphorylated parkins (p-parkins) in mitochondria. Rotenone did not significantly up-regulate PINK1, and rothenone treatment increased the amount of PINK1 in the mitochondrial fraction. Flow cytometry showed a decrease in MMP in rottenon-treated cells (Figure 5B). The confocal microscope identified depolarized mitochondria, which showed moderate to low MitoTracker mitochondrial staining from normal mitochondria, indicating that the mitochondrial membrane potential was not lost, resulting in stronger staining. The levels of parkin and PINK1 were significantly increased in depolarizing mitochondria (Fig. 5C and Fig. 5D). Overexpression of both parkin and PINK1 increased accumulation of LC3-II (Fig. 5E). These findings indicate that a parkin-mediated myotope occurs in RPE-MC cells.
2.6.2.6.마이토파지는My TopazRPERPE--MCMC 세포들의 세포 보호에 기여한다. It contributes to cell protection of cells.
자가소화 저해제들은 RPE-MC 세포들의 생육성을 감소시키기 때문에, 마이토파지는 로테논-처리된 RPE 세포의 자가소화-관련 보호에 기초가 되는 것으로 나타난다. 마이토파지가 세포보호 역할을 한다는 것을 입증하기 위하여, 본 발명자들은 세포 사멸에 대한 파킨 고갈의 효과를 시험하였다. 파킨 넉다운(knockdown)은 LC3-II 수준에서 로테논-유도된 증가를 부분적으로 방지하였다 (도 6A). 주목할 만하게, 파킨 넉다운은 로테논 단독 처리에 의해 유도된 RPE 세포 사멸을 현저히 심하게 하였다 (도 6B). 이들 발견은, 마이토파지가 RPE-MC 세포의 생존에 어떤 역할을 함을 나타낸다. 투과 전자 현미경은 로테논-처리된 세포에서의 분해된 미토콘드리아 및 자가포식소체(자가포식소체)의 존재를 밝혔다. 라이소좀으로 삼켜진 미토콘드리아는 RPE-MC 세포에서도 관찰되었으며 (도 6Ca-Cd), 이는 RPE-MC 세포 내에서 활성 마이토파지를 나타낸다. 로테논 및 3MA로 처리된 RPE-MC 세포들에서 관찰되는 자가포식소체 또는 라이소좀은 없었으며, 이들 세포에서, 분해된 미토콘드리아들은 소화되지 않고 남아있었다 (도 6Cd). 로테논 및 Baf-A1 또는 클로로퀸으로 처리된 RPE-MC 세포들에는 다양한 자가포식소체가 존재하였고, 다양한 분해된 미토콘드리아가 자가포식소체들로부터 분리되었다 (도 6 Ce 및 Cf). 이들 발견은 자가소화 저해제들이 RPE-MC 세포에서 분해된 미토콘드리아의 제거를 차단하였음을 나타낸다. 이들 발견은 파킨-매개된 마이토파지가 RPE-MC 세포의 자가소화-관련 세포보호의 기초가 된다는 것을 입증한다.Because self-digestion inhibitors reduce the bio-producibility of RPE-MC cells, it appears that mytopagy is based on the self-extinguishing-related protection of rotenone-treated RPE cells. To demonstrate that mytopagia plays a protective role for cells, the present inventors have tested the effect of the protein depletion on cell death. Parkin knockdown partially prevented rotaton-induced increase at the LC3-II level (Figure 6A). Notably, the parkin knockdown significantly exacerbated RPE cell death induced by rotenone alone (Fig. 6B). These findings indicate that mytopagy plays a role in the survival of RPE-MC cells. Transmission electron microscopy revealed the presence of degraded mitochondria and autophagic bodies (autophagocytes) in rottenon-treated cells. The mitochondria swallowed with lysosomes were also observed in RPE-MC cells (Fig. 6Ca-Cd), indicating active myotopes in RPE-MC cells. There were no autopoietic or lysosomes observed in RPE-MC cells treated with rottenone and 3MA, and in these cells, the degraded mitochondria remained undigested (Fig. 6Cd). RPE-MC cells treated with rothenone and Baf-A1 or chloroquine had various autophagic bodies and various degraded mitochondria were isolated from autoporotic bodies (Fig. 6 Ce and Cf). These findings indicate that autolysis inhibitors blocked the removal of degraded mitochondria in RPE-MC cells. These findings demonstrate that the parkin-mediated myotopagy is the basis of RPE-MC cell autolysis-related cell protection.
2.7. 알파 B2.7. Alpha B크리스탈린(crystallin)은CrystallineRPERPE--MCMC 세포를 세포자살로부터 보호한다. Protect cells from cell suicide.
알파 B 크리스탈린 (αB-크리스탈린)은 RPE 세포들에서 주요한 항세포자살성 인자이기 때문에, 본 발명자들은 αB-크리스탈린이 RPE-MC 세포들에서 항세포자살성 효과를 내는지의 여부를 검사하였다. αB-크리스탈린 넉다운은, 로테논 단독으로 처리한 세포에 비교하여 RPE-MC 세포 생육성에서의 감소를 현저히 증대시켰다 (도 7A). 이들 데이터는, αB-크리스탈린이, RPE-MC 세포들이 세포 사멸로 빠지는 것을 방지한다는 것을 나타낸다. 특히, TUNEL 분석은 αB-크리스탈린 넉다운이 자가소화 저해제들로 처리된 RPE 세포들에서 세포자살을 유도하였음을 나타내었으며 (도 7B), 이는 αB-크리스탈린이 자가 소화 저해로 인해 세포 사멸되기 쉬운 RPE 세포들에서 항세포자살성 활성을 나타낸다는 것을 나타낸다. 유세포 분석은 αB-크리스탈린 넉다운이 아넥신 V-양성 RPE-MC 세포들의 현저히 증가된 축적이라는 결과를 일으킨다는 것을 나타내었으며, 이는 αB-크리스탈린 넉다운이 RPE-MC 세포들의 자가소화 저해-유도된 사멸이 비세포자살성 세포 사멸에서 세포자살성 세포 사멸로 방향을 바꾸도록 유발시킨다는 것을 나타낸다 (도 7C). 이들 발견은 αB-크리스탈린이 RPE-MC 세포들에서 항세포자살성 활성을 내어, 그들이 세포자살을 경험하는 것을 방지한다는 것을 제시한다.
Since alpha B -crystalline ([alpha] B-cristalline) is a major anti-apoptotic factor in RPE cells, the present inventors have examined whether [alpha] B-cristalline exerts anti-cell suicidal effects in RPE-MC cells. αB-cristalin knockdown significantly increased the reduction in RPE-MC cell viability compared to cells treated with rotenone alone (FIG. 7A). These data indicate that? B-crystalin prevents RPE-MC cells from being killed by cell death. In particular, TUNEL analysis showed that αB-cristalin knockdown induced apoptosis in RPE cells treated with autolysin inhibitors (FIG. 7B), suggesting that αB-cristalline is an RPE that is prone to cell death due to autophosphorylation inhibition Indicating that they exhibit anti-apoptotic activity in cells. Flow cytometry showed that αB-cristalin knockdown resulted in a markedly increased accumulation of annexin V-positive RPE-MC cells, suggesting that αB-cristalline knockdown inhibited the autolysis of RPE-MC cells Indicating that apoptosis induces a change in direction from apoptotic apoptotic cell death to apoptotic apoptosis (Fig. 7C). These findings suggest that αB-cristalin produces anti-cell suicidal activity in RPE-MC cells, preventing them from experiencing cell suicide.
Claims (6)
Translated fromKorean상기 미토콘드리아성 복합체 Ⅰ 저해제는 로테논(Rotenone)이고,
상기 자기소화 억제제는 3-메틸아데닌(3-methyladenine), 바필로바이신 A1(bafilomycin A1) 및 클로로퀸(chloroquine)으로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는,
증식성 유리체망막병증(Proliferative vitreoretinopathy: PVR)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.A mitochondrial complex I inhibitor and an autophagy inhibitor as active ingredients,
Wherein said mitochondrial complex I inhibitor is Rotenone,
Wherein the self-digestion inhibitor is at least one selected from the group consisting of 3-methyladenine, bafilomycin A1 and chloroquine.
A pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of proliferative vitreoretinopathy (PVR).
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