KR101161323B1

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Publication number: KR101161323B1
Application number: KR1020090124933A
Authority: KR
Inventors: 최무현; 이용찬; 원재선
Original assignee: 최무현
Priority date: 2009-12-15
Filing date: 2009-12-15
Publication date: 2012-07-02
Anticipated expiration: 2029-12-15
Also published as: KR20110068097A

Abstract

Translated fromKorean

본 발명은 단량체에 접착특이성이 있는 접착체가 반복-연결되어 있는 접착체반복사슬을 제작하고, 이 반복사슬에 다수의 단량체를 접착시키어 반복사슬과 여러 단량체들에 의해 만들어진 반복사슬-다수단량체 복합체를 만들어, 복합체 내에서 단량체사이의 결합 가교의 형성이 용이하게 함으로써, 다수의 단량체들이 결합 가교로 연결된 다량체의 생산방법에 관한 것으로,

보다 상세하게는 본 발명은 단백질 단량체에 접착 특이성을 갖는 접착단백질이 반복 연결되어 있는 접착단백질 반복사슬 재조합 단백질을 제작하고, 이 반복사슬 단백질에 다수의 단백질 단량체를 접착시키어 반복사슬과 여러 단량체들에 의해 만들어진 반복사슬-다수단량체 복합체를 만들어, 복합체 내에서 단량체사이의 결합 가교의 형성이 용이하게 함으로써, 다수의 단량체들이 결합 가교로 연결된 다량체의 생산방법에 관한 것으로,

보다 상세하게는 본 발명은 단백질 단량체에 접착 특이성을 갖는 접착단백질이 반복 연결되어 있는 접착단백질 반복사슬 재조합 단백질을 제작하고, 이 반복사슬 단백질에 다수의 단백질 단량체를 접착시키어 반복사슬과 여러 단량체들에 의해 만들어진 반복사슬-다수단량체 복합체를 만들어, 복합체 내에서 단량체사이의 이황화 결합 가교의 형성이 용이하게 함으로써, 다수의 단량체들이 이황화 결합 가교로 연결된 다량체의 생산방법에 관한 것으로,

보다 상세하게는 연쇄상 구균(Streptococcal)의 단백질 G(protein G)의 도메인 Ⅲ(Fab 접착 도메인)가 반복-연결되는 재조합 반복사슬 단백질을 접착틀(binding matrix)로 이용하여, 이 도메인 Ⅲ 반복사슬 단백질에 다수의 항체 단백질 단량체를 접착시키어 반복사슬과 다수의 항체 단량체 복합체를 만들어, 복합체 내에서 항체 단량체사이의 이황화 결합 가교의 형성이 용이하게 함으로써, 다수의 단량체들이 이황화 결합 가교로 연결된 이량체 및 다량체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 기존에 알려진 재접힘(refolding) 방법에 비해 이황화 결합 가교 이량체의 수득률을 기존의 재접힘 방법에 비해 최대 200배 향상시킴으로써 이황화 결합 가교 이량체를 대량 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

단량체, 이량체, 다량체, 반복사슬, 재조합 단백질, 반복사슬-다수단량체 복합체, 결합 가교, 가교 결합, 이황화 결합 가교.

The present invention is to prepare an adhesive repeating chain in which an adhesive having an adhesive specificity to a monomer is repeatedly-connected, and a plurality of monomers are bonded to the repeating chain to form a repeating chain-multimeric monomer complex made of a repeating chain and various monomers. The present invention relates to a method for producing a multimer in which a plurality of monomers are linked by a bond crosslinking, by facilitating formation of a bond crosslinking between monomers in a composite.

More specifically, the present invention provides an adhesive protein repeat chain recombinant protein in which an adhesive protein having adhesion specificity to a protein monomer is repeatedly linked, and attaches a plurality of protein monomers to the repeat chain protein to the repeat chain and various monomers. The present invention relates to a method for producing a multimer in which a plurality of monomers are linked by a bond crosslinking by making a repeating chain-multimer complex made by the same and facilitating formation of a bond crosslinking between monomers in the complex.

More specifically, the present invention provides an adhesive protein repeat chain recombinant protein in which an adhesive protein having adhesion specificity to a protein monomer is repeatedly linked, and attaches a plurality of protein monomers to the repeat chain protein to the repeat chain and various monomers. The present invention relates to a method for producing a multimer in which a plurality of monomers are linked by disulfide bond crosslinking by making a repeating chain-multimer complex made by the same and facilitating formation of disulfide bond crosslinking between monomers in the complex.

More specifically, this domain III repeat chain protein is used as a binding matrix by using a recombinant repeating chain protein in which domain III (Fab adhesion domain) of protein G ofStreptococcal is repeatedly-linked. By attaching a plurality of antibody protein monomers to the repeating chain and a plurality of antibody monomer complexes to facilitate the formation of disulfide bond crosslinks between the antibody monomers in the complex, a plurality of monomers are linked to the disulfide bond crosslinks and a large amount A method of producing a sieve.

The method of the present invention can be usefully used for mass production of disulfide bonded crosslinked dimers by improving the yield of disulfide bonded crosslinked dimers by up to 200 times compared to conventional refolding methods compared to the known refolding methods. .

Monomers, dimers, multimers, repeating chains, recombinant proteins, repeating chain-multimeric complexes, binding crosslinking, crosslinking, disulfide bond crosslinking.

Description

Translated fromKorean

단량체에 접착특이성이 있는 접착체의 반복사슬과 다수단량체의 복합체 내에서의 결합 가교의 생성 증가를 통한 결합 가교로 연결된 이량체 및 다량체의 생산방법{High yield production methods for cross-linking bond bridged dimer and multimer by increasing the bond bridge formation utilizing the complex of multiple monomers and tandem-repeat chain of monomer specific binding group}High yield production methods for cross-linking bond bridged dimer by increasing the formation of binding crosslinks in the repeating chain of the adhesive having monomeric adhesion specificity and the complex of the multimers and multimer by increasing the bond bridge formation utilizing the complex of multiple monomers and tandem-repeat chain of monomer specific binding group}

본 발명은 단량체로부터 이량체 및 다량체를 높은 수득률로 생산하는 방법에 관한 것이다. 이를 위하여 접착특이성이 있는 접착체의 반복사슬을 이용하여 반복사슬-다수단량체 복합체 형태의 다량체를 생산하고 복합체내의 단량체들 사이의 결합 가교 형성이 용이함을 이용하여 결합 가교로 연결된 다량체를 생산하는 것이다. 이는 접착체의 반복사슬을 접착틀(binding matrix)로 이용하여 반복사슬-다수단량체 복합체 형태의 다량체의 형성을 극대화하고, 형성된 반복사슬-다수단량체 복합체로부터 결합 가교의 생성 효율을 높여 이량체 및 다량체를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a process for producing dimers and multimers at high yields from monomers. To this end, it is possible to produce a multimer in the form of a repeating chain-multimer complex by using a repeating chain of an adhesive having adhesive specificity, and to produce a multimer linked by bond crosslinking by using a bond crosslinking between monomers in the complex. will be. This maximizes the formation of multimers in the form of repeating chain-multimer complexes by using the repeating chain of the adhesive as a binding matrix, and increases the efficiency of the formation of bond crosslinks from the formed repeating chain-multimer complex complex. A method for mass production of multimers.

항체-독소(Antibody-toxin)는 암세포에 특이적으로 접착하는 항체에 독소를 결합시킴으로써 합성된다(Pastan I.et al., Annu Rev Med. 58(2007) 221-237).
단일클론항체(monoclonal antibody, MAb) B3은 대장암, 위암, 난소암, 유방암 및 폐암 등의 표면에서 과발현되는 탄수화물 항원(carbohydrate antigen, Le^Y)에 접착한다(L.H. Pai,et al., Proc Natl Acad Sci U S A 88(1991) 3358-3362; I. Pastan, et al., Cancer Res. 51(1991) 3781-3787). 항체-PE38 형태의 융합 단백질에 사용된 PE38은 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin, PE)의 유도체 중 하나로서, PE의 N-말단을 잘라낸 분자량이 38kd인 단백질 독소이다(J. Hwang,et al., Cell. 48(1987) 129-136; V.K. Chaudhary, et al., J Biol Chem 265(1990) 16306-16310).
항체의 항원 접착부위를 포함하는 단편으로서 Fab는 Fd 사슬(V_H 및 C_H1) 및 경쇄 사슬(V_L및 C_L)를 포함한다. Fab 항체-독소 형태의 융합 단백질에 사용된 Fab는 Fd 사슬(V_H 및 C_H1) 및 경쇄 사슬(V_L및 C_L)를 포함한다. Fab-독소는 단일사슬 Fv (single chain Fv, scFv; V_H와 V_L을 링커로 이어 붙여서 단일사슬 형태로 만들어낸 Fv, C_H1과 C_L이 없음)를 이용한 scFv-독소에 비해 두 가지 이점을 가진다. 첫째로, Fab-독소의 수득률이 scFv-독소에 비해 10배 높다(J. Buchner, et al.,Biotechnology (N Y). 9(1991) 157-162; J. Buchner, et al.,Biotechnology10(1992) 682-685). 둘째로, 마우스 혈장에서 Fab-독소의 안정성이 개선된다(M. Choe, et al.,Cancer Res. 54(1994) 3460-3467).
두 개의 Fab-독소가 이황화 가교결합으로 연결된 2가의 Fab-독소 이량체 ([Fab-독소]₂)는 1가의 scFv-독소에 비해 높은 세포독성을 가진다고 보고된 바 있다(S.H. Choi,et al., Bull. Kor. Chem. Soc. 22(2001) 1361-1365; J.H. Park,et al., Mol Cells 12(2001) 398-402; M.H. Yoo,et al., J. Microbiol. Biotechnol. 16(2006) 1097-1103). 이황화결합으로 가교결합 되어 생성된 이량체는 단량체인 Fab-독소의 Fab 도메인과 독소 사이에 위치하는 시스테인(Cystein, Cys) 잔기에 의한 이황화 결합이 두 개의 Fab-독소 사이에서 이루어짐으로서 이량체 [Fab-독소]₂가 제조된다.
다량체의 가장 단순한 형태인 이량체 항체-독소는 단량체인 항체-독소에 비해 여러 가지 이점을 가지는 것으로 기대된다. 예를 들면, 이량체는 두 개의 항원 접착 도메인을 갖는 2가이므로, 단량체의 각 도메인의 친화도(affinity)보다도 강한 접착력을 갖게 하여, 이량체가 높은 복합도 (avidity)를 가짐으로서 더 강하게 접착하게 한다. 또한, 2가의 이량체 항체-독소는 표적 세포에 동시에 두 개의 독소 도메인(생물학적 또는 화학적 기능기)을 운반하여, 1가의 단량체 항체-독소에 비해 높은 세포독성으로 표적세포를 사멸시키는 것이 가능하다. 아울러, Fab-독소는 재조합 항체-독소의 생산을 위해 종종 이용되는 scFv-독소에 비해 높은 안정성을 가진다(D. Rothlisberger,et al., J Mol Biol 347(2005) 773-789).
두 개의 B3(Fab)-ext-PE38가 이황화 결합으로 가교결합된 이량체인 [B3(Fab)-ext-PE38]₂는 단일클론항체 B3의 Fab 도메인을 슈도모나스 외독소 A[Pseudomonas Aexotoxin A] 유도체인 PE38를 결합시켜 제조할 수 있으며(대한민국 등록특허 10-0566091), [B3(Fab)-ext-PE38]₂는 B3(Fab)-ext-PE38에 비해 위암 세포주인 CRL-1739 세포주에 대해 약 11배 높은 세포독성을 가지는 것으로 보고된 바 있다(J.H. Park, et al.,Mol Cells 12(2001) 398-402).
기존에는 이황화 결합으로 가교 결합된 이량체를 단지 재접힘 후 정제하였다(S.H. Choi, et al.,Bull. Kor. Chem. Soc. 22(2001) 1361-1365; J.H. Park, et al.,Mol Cells 12(2001) 398-402; M.H. Yoo, et al.,J. Microbiol. Biotechnol. 16(2006) 1097-1103). 기존에 보고된 이황화 결합된 이량체의 재접힘 공정(refolding process)의 발전을 통하여 이량체의 수득률이 0.014% ~ 0.25% 로 증가되었다. 상기 재접힘 공정 동안, 이황화 결합된 이량체는 2개의 항체-독소(Fab-PE38) 단량체의 Fab 도메인과 PE38 사이에 위치하는 시스테인 잔기의 무작위적 접근에 의해 형성되었다. 재접힘 반응의 대부분의 생성물은 Fab-독소 단량체이고, 이의 수득률이 약 10%에 달하는 점에 비추어 볼 때, 상기 재접힘 공정이 이황화 결합된 이량체의 수득률을 증가시켰음에도 불구하고 이량체의 수득률은 단량체에 비해 매우 낮은 것이다. 단량체 항체-독소(Fab-독소)는 자신들 사이의 자체적인 접착 친화성 (self-binding-affinity)이 없으므로 이황화결합가교로 연결되어 이루어진 이량체는 재접힘 반응에서 두 개의 항체-독소 단량체의 시스테인 잔기 상호간의 무작위적인 충돌에 의한 이황화결합가교의 형성으로 생성되는 것이다. 상기 재접힘 공정의 재접힘 완충용액에 녹아있는 단량체들에서 두 단량체의 시스테인 잔기 상호간의 충돌빈도(collision frequency)는 매우 낮고, 이 때문에 시스테인 간의 산화반응에 의한 이황화 결합 가교의 형성이 용이하지 않음에 기인하여 재접힘과정 중에 생성되는 이량체의 수득률은 매우 낮다.
따라서 지금까지 본 발명자들은 환원 및 산화, 및 화학적 가교제 (chemical cross-linker)를 통해 항체-독소 단량체로부터 이황화 결합된 이량체의 생산을 포함하는 다양한 생산방법을 시도하였지만 단순히 환원, 산화, 및 화학적 가교제의 방법을 통해서 이량체 수득률을 크게 향상시키지는 못하였다.Antibody-toxins are synthesized by binding toxins to antibodies that specifically bind to cancer cells (Pastan I.et al., Annu Rev Med. 58 (2007) 221-237).
Monoclonal antibody (MAb) B3 adheres to carbohydrate antigens (Le^Y ) that are overexpressed on the surface of colon, gastric, ovarian, breast and lung cancers (LH Pai,et al., Proc Natl Acad Sci USA 88 (1991) 3358-3362; I. Pastan,et al., Cancer Res. 51 (1991) 3781-3787). The antibodies used in the fusion proteins of the PE38 -PE38 form is one of the derivative of the Pseudomonas exotoxin(Pseudomonas exotoxin, PE), a molecular weight cut off the N- terminus of the PE 38kd protein toxin(J. Hwang, et al., Cell0.48 (1987) 129-136; VK Chaudhary,et al., J Biol Chem 265 (1990) 16306-16310).
As fragments comprising the antigenic attachment site of the antibody, the Fab comprises Fd chains (V_H and C_H1 ) and light chain chains (V_L and C_L ). Fabs used in fusion proteins in the Fab antibody-toxin form include Fd chains (V_H and C_H1 ) and light chain chains (V_L and C_L ). Fab-toxins have two advantages over scFv-toxins using single-chain Fv (single chain Fv, scFv; Fv, C_H1 and C_L free from V_H and V_L in linkages) Has First, Fab-toxin yield is 10 times higher than scFv-toxin (J. Buchner, et al.,Biotechnology (NY). 9 (1991) 157-162; J. Buchner, et al.,Biotechnology 10 (1992) 682-685). Second, the stability of Fab-toxins in mouse plasma is improved (M. Choe, et al.,Cancer Res. 54 (1994) 3460-3467).
Bivalent Fab-toxin dimers ([Fab-toxin]₂ ), in which two Fab-toxins are linked by disulfide crosslinks, have been reported to have higher cytotoxicity than monovalent scFv-toxins (SH Choi,et al. , Bull.Kor.Chem.Soc. 22 (2001) 1361-1365; JH Park,et al., Mol Cells 12 (2001) 398-402; MH Yoo,et al., J. Microbiol. Biotechnol . 16 (2006) 1097-1103). The dimer produced by crosslinking with disulfide bonds is a dimer [Fab] as a disulfide bond is formed between two Fab-toxins by a cysteine (Cys) residue positioned between the Fab domain of the monomer Fab-toxin and the toxin. Toxin]₂ is prepared.
The dimeric antibody-toxin, the simplest form of the multimer, is expected to have several advantages over the antibody-toxin, which is a monomer. For example, since dimers are bivalent with two antigen adhesion domains, they have a stronger adhesion than the affinity of each domain of the monomer, allowing the dimers to adhere more strongly by having a higher avidity. do. In addition, the bivalent dimeric antibody-toxin carries two toxin domains (biological or chemical functional groups) simultaneously to the target cell, thereby killing the target cell with higher cytotoxicity than the monovalent monomeric antibody-toxin. In addition, Fab-toxins have higher stability than scFv-toxins often used for the production of recombinant antibody-toxins (D. Rothlisberger,et al., J Mol Biol 347 (2005) 773-789).
[B3 (Fab) -ext-PE38]_2, a dimer in which two B3 (Fab) -ext-PE38s are crosslinked with disulfide bonds, is used to convert the Fab domain of monoclonal antibody B3 intoPseudomonas Aexotoxin A derivative. (B3 (Fab) -ext-PE38]₂ is about 11-fold with respect to the CRL-1739 cell line, a gastric cancer cell line, compared to B3 (Fab) -ext-PE38. It has been reported to have high cytotoxicity (JH Park, et al.,Mol Cells 12 (2001) 398-402).
Conventionally, dimers crosslinked with disulfide bonds were only purified after refolding (SH Choi, et al.,Bull.Kor.Chem. Soc. 22 (2001) 1361-1365; JH Park, et al.,Mol Cells 12 (2001) 398-402; MH Yoo, et al.,J. Microbiol. Biotechnol . 16 (2006) 1097-1103). Through the development of the previously reported refolding process of disulfide-bonded dimers, the yield of dimers has been increased from 0.014% to 0.25%. During this refolding process, disulfide bound dimers were formed by a random approach of cysteine residues located between the Fab domain of the two antibody-toxin (Fab-PE38) monomers and PE38. Most of the product of the refolding reaction is a Fab-toxin monomer, and in view of its yield reaching about 10%, the yield of dimers despite the fact that the refolding process increased the yield of disulfide bonded dimers. Is very low compared to monomers. Since the monomeric antibody-toxin (Fab-toxin) has no self-binding-affinity between them, dimers formed by disulfide bridges are cysteine residues of two antibody-toxin monomers in the refolding reaction. It is produced by the formation of disulfide bridges by random collisions. In the monomers dissolved in the refolding buffer of the refolding process, the collision frequency between the cysteine residues of the two monomers is very low, and thus, the formation of disulfide bond crosslinks due to oxidation reaction between cysteines is not easy. Due to this, the yield of dimers produced during the refolding process is very low.
Thus, the present inventors have tried various production methods including reduction and oxidation, and production of disulfide-bonded dimers from antibody-toxin monomers through chemical cross-linkers, but simply reducing, oxidation, and chemical cross-linking agents. The method did not significantly improve the dimer yield.

이에, 본 발명자들은 단량체 B3(Fab)-ext-PE38가 이황화 결합된 이량체인 [B3(Fab)-ext-PE38]₂를 더 많이 생산하기 위한 방법을 찾던 중, 연쇄상 구균(Streptococcal)의 단백질 G(protein G)의 Fab 접착 도메인이 2번이상 반복되는 반복사슬 재조합 단백질을 제작하였으며 이를 접착틀(binding matrix)로 이용하여, 복수의 단량체 가 이 반복사슬에 동시에 접착한 복합체 형태의 다량체를 제작하였다. 단백질 G의 세번째 도메인(도메인 Ⅲ)은 IgG의 Fab 단편에 접착할 수 있으며, Fab 단편의 C_H1 도메인이 단백질 G의 도메인에 높은 친화도로 접착할 수 있음이 보고된 바 있다(J.P. et al.,Nature359(1992) 752-754). 상기 재접힘 공정에 비해 본 발명의 상기 반복사슬은 하기의 이점을 가지고 있다. 상기 반복사슬을 구성하는 도메인들은 항체-독소 단량체에 대해 높은 친화도로 접착한다. 반복사슬에 다수의 단량체를 접착시켜 생성된 반복사슬-다수단량체 복합체 내에서의 단량체들 사이의 농도는 여러 단량체가 반복사슬에 접착되어 고정된 상태이므로 단량체가 자유로이 움직일 수 있는 공간이 매우 제한되게 되어 단량체의 국부농도(local concentration)가 매우 높은 상태가 된다. 이는 각 항체-독소 단량체의 시스테인 잔기의 충돌빈도를 높이게 되어 단량체간의 이황화 결합을 촉진시킬 수 있고, 그 결과 이황화 결합 가교 이량체의 대량생산을 가능케 하였다. 이와 같은 메커니즘의 대표적인 예는 효소 반응 속도론에서 효소 반응의 속도가 현저히 증가하는 것을 설명하는 접근효과(proximity effect)가 있다(Nicholas C. Price and Lewis Stevens. Fundamentals of Enzymology, 3rd Ed. Oxford University Press). 따라서 상기 반복사슬을 단량체 항체-독소와 단순히 혼합함으로써 복합체를 손쉽게 제조할 수 있었으며, 이렇게 생성된 다량체 내의 단량체들 사이의 결합을 공유결합성 결합으로 바꾸어 더욱 안정된 다량체 분자를 만들기 위해, 상기 복합체내 단량체 항체-독소의 시스테인 잔기를 환원 및 산화시킴으로써 Fab 도메인과 PE38 사이 시스테인 잔기의 이황화 결합의 생성을 두 개의 단량체 간에 촉진하여 [B3(Fab)-ext-PE38]₂를 대량 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the inventors of the present invention, while searching for a method for producing a more disulfide-linked dimer [B3 (Fab) -ext-PE38]₂ , the monomer B3 (Fab) -ext-PE38, the protein G ofStreptococcal A repeat chain recombinant protein was produced in which the Fab adhesion domain of (protein G) was repeated two or more times. Using this as a binding matrix, a multimer in complex form in which a plurality of monomers adhered to the repeat chain simultaneously was produced. It was. It has been reported that the third domain of protein G (domain III) can adhere to the Fab fragment of IgG, and that the C_H1 domain of the Fab fragment can adhere to the domain of protein G with high affinity (JP et al.,Nature 359 (1992) 752-754). The repetitive chain of the present invention has the following advantages over the refolding process. The domains that make up the repeating chain adhere with high affinity to the antibody-toxin monomer. The concentration between monomers in the repeating chain-multimeric monomer complex formed by adhering a plurality of monomers to the repeating chain is fixed because the various monomers are attached to the repeating chain and are fixed. The local concentration of the monomers is very high. This increases the collision frequency of the cysteine residues of each antibody-toxin monomer, thereby facilitating disulfide bonds between monomers, thereby enabling mass production of disulfide bond crosslinked dimers. Representative examples of such mechanisms have a proximity effect that explains the significant increase in the rate of enzyme reactions in enzyme kinetics (Nicholas C. Price and Lewis Stevens. Fundamentals of Enzymology, 3rd Ed. Oxford University Press). . Therefore, the complex could be easily prepared by simply mixing the repeating chain with the monomeric antibody-toxin, and in order to make a more stable multimeric molecule by converting the bond between monomers in the multimer thus produced into a covalent bond, Reduction and oxidation of cysteine residues in the monomeric antibody-toxin in the body promotes the production of disulfide bonds of the cysteine residues between the Fab domain and PE38 between the two monomers, allowing mass production of [B3 (Fab) -ext-PE38]₂ By this, the present invention was completed.

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본 발명의 목적은 단량체로부터 다량체를 대량 생산하는 것으로서, 단량체에 대해 접착 특이성을 갖는 접착체의 반복사슬을 접착틀(binding matrix)로 이용하여 다수 단량체들과 접착시켜 상기 단량체의 반복사슬-다수단량체 복합체를 대량 생산하고, 생산된 반복사슬-다수단량체 복합체 내에서 단량체들 사이에 단량체 내의 짝이 없는 시스테인 잔기의 충돌빈도가 높아짐을 이용하여 결합 가교의 형성을 촉진하여 상기 단량체의 결합 가교 다량체 생산을 기존의 생산 방법에 비해 극대화 하는 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to mass-produce multimers from monomers, and by using a repeating chain of an adhesive having an adhesive specificity to the monomer as a binding matrix, it is bonded with a plurality of monomers to repeat the chain-multiple of the monomers. The mass production of monomer complexes and the formation of bond crosslinks by promoting the formation of bond crosslinks by increasing the collision frequency of unpaired cysteine residues in the monomers between monomers in the produced repeating chain-polymer complexes It is to provide a way to maximize production compared to the existing production method.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 단량체에 특이적으로 접착하는 접착체의 반복사슬을 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 반복사슬과 단량체를 혼합하여, 상기 반복사슬과 단량체의 반복사슬-다수 단량체 복합체를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 다량체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 단량체에 특이적으로 접착하는 접착체의 반복사슬을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 반복사슬과 단량체를 혼합하여, 상기 반복사슬과 단량체의 반복사슬-다수 단량체 복합체를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 반복사슬-다수 단량체 복합체 내의 단량체들 간에 결합 가교가 형성된 후, 결합 가교가 형성된 반복사슬-다수 단량체 복합체로부터 반복사슬을 분리하는 단계를 포함하는, 다량체의 제조 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention
1) preparing a repeating chain of an adhesive that specifically bonds to a monomer; And
2) mixing the repeating chain and the monomer of step 1), to provide a method for producing a multimer, characterized in that it comprises the step of producing a repeating chain-multimer monomer complex of the repeating chain and monomer.
In addition, the present invention
1) preparing a repeating chain of an adhesive that specifically bonds to a monomer;
2) mixing the repeating chain and monomer of step 1) to prepare a repeating chain-multimer monomer complex of the repeating chain and monomer; And
3) after the binding cross-linking is formed between the monomers in the repeating chain-multiple monomer complex of step 2), separating the repeating chain from the repeating chain-multiple monomer complex formed with the binding crosslinking, to provide.

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본 발명의 생산방법을 이용한 예로서 항체-독소를 이황화 결합 가교로 연결한 이량체를 생산하였을 때 기존에 보고된 재접힘(refolding) 방법에 비해 단량체항체-독소의 이황화 결합 가교 이량체의 수득률을 약 200배 이상 증가시킴으로써 이량체의 생산량을 극대화시킬 수 있었다. 본 발명에 의해 생산된 이량체는 기존에 보고된 단량체 항체-독소에 비해 높은 항원 접착력, 독성 및 안정성을 가지며, 특히 위암 세포주에 대해 약 11배 높은 세포독성을 가지는 것으로 알려져 있어 이를 대량 생산함으로써 항암 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.As an example using the production method of the present invention, the yield of the monomeric antibody-toxin disulfide-linked crosslinked dimer was compared with that of the previously reported refolding method. By increasing about 200 times, the dimer production could be maximized. The dimers produced by the present invention have high antigen adhesion, toxicity and stability compared to previously reported monomeric antibody-toxins, and are particularly known to have about 11 times higher cytotoxicity against gastric cancer cell lines. It can be usefully used to develop therapeutics.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 결합가교에 의해 형성된 다량체의 대량 생산을 목적으로 하여 단량체에 대해 접착 특이성을 갖는 접착체의 반복사슬을 접착접착틀(binding matrix)로 이용하여, 단량체와 반복사슬의 복합체를 제작하면 그 복합체 내에서 단량체의 국부농도 (local concentration)가 매우 높은 상태가 되게 만든 결과가 된다. 이러한 복합체의 생산은 복합체 내의 단량체간의 충돌빈도를 매우 높이고, 이로써 결합 가교의 생성을 촉진 시켜 결합 가교 다량체의 수득률을 향상시키는 방법을 제공한다.
다수의 단량체를 가교 결합으로 연결시켜 다량체를 만드는 과정은 가교 결합의 형성이 얼마나 효율적인가에 의해 다량체의 생산량이 결정된다. 생체 내에서 사용하고자 하는 물질의 경우 다량체를 형성하는 가교 결합은 공유결합이어야 생체 내에서 단량체로 분해되지 않고 다량체의 안정성을 유지할 수 있다. 이러한 공유결합성 가교결합을 형성하기 위해서는 공유결합을 형성할 수 있는 화학적 기능기들 간의 접촉이 있어야 하는데 단백질과 같은 거대 분자에서 이러한 화학적 기능기들은 단백질 분자 전체 크기에 비해 매우 작은 크기이다. 따라서 거대 단백질 분자가 반응 용액에서 자유로이 움직이고 있을 경우 매우 작은 부분인 화학적 기능기가 서로 접촉할 확률은 매우 작으며, 이러한 기능기가 접촉할 확률을 획기적으로 높이는 방법이 없이는 효율적인 결합가교에 의해 연결된 다량체의 생산이 어렵다.
본 발명은 이러한 생성효율이 낮은 단량체 간의 가교결합의 형성을 획기적으로 높이기 위하여 단량체에 접착성이 있는 접착체의 반복사슬을 만들어, 여기에 단량체를 접착시키어 단량체들 간의 거리를 수 나노미터에서 수십 또는 수백 나노미터 크기의 분자 크기의 수준으로 되게 함으로써, 단량체들이 용액에서 자유로이 운동하면서 충돌하는 것과는 달리, 한정된 공간에 고정되어 분자 자신의 크기 정도의 공간에서 움직이며 상호 접촉하게 한다. 이러한 조건에서 다수의 단량체들이 붙어 있는 한 개의 반복사슬에서는 단량체의 국지적 농도가 매우 높은 상태가 되며, 같이 붙어 있는 단량체들 간의 접촉 빈도는 매우 높아지고 그에 따라 가교결합을 형성할 수 있는 화학적 기능기간의 접촉빈도도 증가하여 다량체의 형성을 획기적으로 증가시킬 수 있다.
본 발명이 적용될 수 있는 대상은 단지 단백질 단량체와 이황화 공유결합성 가교결합에만 국한 되지 않고, 유기 화합물, 생물분자, 단백질 등의 단량체들과 아마이드결합, 이스터결합, 글라이코시딕결합, 이써(에테르)결합 등의 공유결합들에도 적용된다는 것은 명백하다. 공유결합성 가교 결합이 가장 다량체의 안정성을 높이는 가교 결합이지만 이 가교결합이 반드시 공유결합에만 국한되는 것은 아니다. 즉 이온결합 등의 가교결합으로 다량체를 형성하는 경우에도 본 발명의 사상이 적용될 수 있다. 또한 단량체 간의 가교를 형성하기 위하여 가교사슬을 넣어 단량체-가교사슬-단량체의 형태로 이량체 또는 다량체를 형성하는 경우에도 그 다량체의 형성효율을 증가시키기 위하여 본 발명의 사상이 적용될 수 있다(Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques. Academic Press, Inc., 1995; Wong S. S., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking. CRC Press, Inc., 1991.).
구체적으로, 본 발명에 따른 방법은 하기 1) 내지 2)의 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 단량체에 특이적으로 접착하는 접착체의 반복사슬을 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 반복사슬과 단량체를 혼합하여, 상기 반복사슬과 단량체의 반복사슬-다수 단량체 복합체를 제조하는 단계.
또한, 상기 방법에 하기 3)의 단계를 추가적으로 포함하는 방법으로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention is to produce a complex of a monomer and a repeating chain by using a repeating chain of the adhesive having an adhesive specificity for the monomer as a binding matrix for the purpose of mass production of multimers formed by bond crosslinking. The result is a very high local concentration of monomers in the complex. The production of such complexes provides a method of greatly increasing the collision frequency between monomers in the complex, thereby promoting the formation of the binding crosslinks, thereby improving the yield of the binding crosslinking multimer.
The process of making a multimer by connecting a plurality of monomers by crosslinking determines the yield of the multimer by how efficient the formation of the crosslinking is. In the case of a substance to be used in vivo, the crosslinks forming the multimers must be covalent to maintain the stability of the multimers without being decomposed into monomers in vivo. In order to form such covalent crosslinks, there must be contact between chemical functional groups capable of forming covalent bonds. In macromolecules such as proteins, these chemical functional groups are very small compared to the total size of the protein molecule. Therefore, when the large protein molecules are freely moving in the reaction solution, the probability that the chemical functions, which are very small parts, are in contact with each other is very small, and without the method of dramatically increasing the probability that these functional groups are in contact with each other, Production is difficult
The present invention is to create a repeating chain of adhesive adhesive to the monomer in order to significantly increase the formation of cross-linking between the monomers having low production efficiency, by bonding the monomer to it, the distance between the monomers from several nanometers to tens or By bringing the molecular size to the order of hundreds of nanometers, the monomers are fixed in a confined space, moving and contacting each other in a space about the size of the molecule itself, as opposed to colliding freely in solution. Under such conditions, in one repeating chain in which a plurality of monomers are attached, the local concentration of the monomers becomes very high, and the contact frequency between the monomers attached together is very high, and thus the contact of chemical functional periods that can form crosslinks is thus achieved. The frequency can also increase, dramatically increasing the formation of multimers.
The object of the present invention is not limited to only protein monomers and disulfide covalent crosslinking, but also monomers such as organic compounds, biomolecules, proteins, amide bonds, ester bonds, glycosidic bonds and ethers (ethers). Apparently, it also applies to covalent bonds such as bonds. Covalent crosslinks are crosslinks that increase the stability of most multimers, but the crosslinks are not necessarily limited to covalent bonds. That is, the idea of the present invention can be applied even when the multimer is formed by crosslinking such as ionic bond. In addition, in the case of forming a dimer or a multimer in the form of a monomer-crosslinked chain-monomer by adding a crosslinking chain to form a crosslinking between monomers, the idea of the present invention may be applied to increase the formation efficiency of the multimer ( Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques.Academic Press, Inc., 1995; Wong SS, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking.CRC Press, Inc., 1991.).
Specifically, the method according to the invention is preferably carried out by a method comprising the steps of 1) to 2), but is not limited thereto:
1) preparing a repeating chain of an adhesive that specifically bonds to a monomer; And
2) mixing the repeating chain and the monomer of step 1) to prepare a repeating chain-multimer monomer complex of the repeating chain and monomer.
In addition, the method is preferably performed by a method additionally comprising the following step 3):

3) 상기 단계 2)의 반복사슬-다수 단량체 복합체 내의 단량체들 간에 결합 가교가 형성된 후, 결합 가교가 형성된 반복사슬-다수 단량체 복합체로부터 반복사슬을 분리하는 단계.3) after the binding bridge is formed between the monomers in the repeating chain-multiple monomer complex of step 2), separating the repeating chain from the repeating chain-multiple monomer complex with the binding crosslinking.

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상기 방법에 있어서, 단계 1)의 접착특이성 접착체의 반복사슬을 제작함에 있어서 서로 다른 단량체에 대한 접착 특이성을 갖는 서로 다른 접착체로 이루어진 반복사슬을 제작하여 접착틀(binding matrix)로 이용하는 것이 가능하다. 이를 통해 각각의 접착체에 특이적으로 접착하는 서로 다른 단량체간의 이종이량체(heterodimer) 및 이종다량체(heteromultimer)의 제작이 가능하다.In the above method, in manufacturing the repeating chain of the adhesive specific adhesive in step 1), it is possible to prepare a repeating chain composed of different adhesives having adhesive specificities for different monomers and use it as a binding matrix. . Through this, it is possible to prepare heterodimers and heteromultimers between different monomers that specifically adhere to respective adhesives.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 접착특이성 접착체의 반복사슬의 제작함에 있어서 서로 다른 접착 특이성 접착체를 갖는 반복사슬의 제작이 가능하다. 이를 통해 각각의 접착체에 특이적으로 접착하는 서로 다른 단량체간의 이종이량체(heterodimer) 및 이종다량체 (heteromultimer)의 제작이 가능하다.In the above method, in the preparation of the repeating chain of the adhesive specific adhesive in step 1), it is possible to prepare the repeating chain having different adhesive specific adhesives. Through this, it is possible to prepare heterodimers and heteromultimers between different monomers that specifically adhere to respective adhesives.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 단백질 단량체 및 그의 접착특이성 단백질은 단백질의 native form으로부터 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 즉 재조합 형태의 단량체도 접착 특이성을 가지는 상대가 있으면 본 발명의 방법에 의해 결합가교 다량체 생산에 사용되어질 수 있다. 상기의 단백질의 유전정보를 암호화하는 DNA 단편은 그 단백질을 발현하는 생물체의 염색체 DNA 또는 mRNA로부터 정방향 및 역방향 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 통해 클로닝하여 제조하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the above method, the protein monomer of step 1) and its adhesion specific protein are preferably derived from the native form of the protein, but are not limited thereto. That is, the recombinant monomer may also be used to produce a crosslinked multimer by the method of the present invention if there is a partner having adhesive specificity. DNA fragments encoding the genetic information of the protein is more preferably prepared by cloning by PCR using a forward and reverse primer pair from the chromosomal DNA or mRNA of the organism expressing the protein, but is not limited thereto.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 결합 가교는 단백질 단량체와 이황화 공유결합성 가교 결합 뿐만 아니라, 유기 화합물, 생물분자 또는 단백질의 단량체들과 아마이드결합, 이스터결합, 글라이코시딕결합 또는 이써결합의 공유결합들도 포함된다. 공유결합성 가교 결합이 가장 다량체의 안정성을 높이는 가교 결합이지만 상기 가교결합이 공유결합에만 한정되는 것은 아니며, 이온결합으로 다량체가 형성될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 반복사슬은 하기 a) 내지 c)의 단계를 포함하는 제조방법으로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
a) 접착특이성 접착체 단백질 및 그의 사이를 연결하는 링커를 암호화하는 DNA 단편을 발현벡터에 반복하여 클로닝하여, 접착체 단백질이 반복되는 컨스트럭트를 제조하는 단계;
b) 상기 단계 a)의 컨스트럭트를 숙주세포에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하는 단계; 및In the above method, the binding crosslinking of step 3) is not only a protein monomer and a disulfide covalent crosslinking bond, but also an amide bond, an ester bond, a glycosidic bond or an ether bond with a monomer of an organic compound, a biomolecule or a protein. Covalent bonds are also included. Covalent crosslinking is a crosslinking that increases the stability of the most multimers, but the crosslinking is not limited to covalent bonds, and multimers may be formed by ionic bonding.
In the above method, the repeating chain of step 1) is preferably prepared by a manufacturing method comprising the steps of a) to c), but is not limited thereto:
a) repeatedly cloning a DNA fragment encoding an adhesive specific adhesive protein and a linker linking the same to an expression vector to prepare a construct in which the adhesive protein is repeated;
b) preparing a transformant by transforming the construct of step a) into a host cell; And

c) 상기 단계 b)의 형질전환체를 배양한 후, 발현된 반복사슬을 크로마토그래피로 분리 및 정제하는 단계.c) after culturing the transformant of step b), separating and purifying the expressed repeating chain by chromatography.

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상기 컨스트럭트는 반복사슬내의 접착체 단백질이 3번 이상 반복되는 구조를 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The construct preferably has a structure in which the adhesive protein in the repeating chain is repeated three or more times, but is not limited thereto.

상기 컨스트럭트는 접착체 단백질은 링커(linker)를 통해 연결되어 있으며, 상기 G₄S 링커로는 GGGGS가 사용될 수 있으나 이에 한정하지 않으며, 상기 링커는 더 연장되어 GGGGSGGGGS 또는 GGGGSGGGGSGGGGS일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 상기 G₄S 링커는 매우 유연성이 높은 구조이다(R. Arai,et al., Protein Eng 14(2001) 529-532).
본 발명에서는 접착체 단백질 및 링커를 암호화하는 DNA 단편을NdeI과EcoRI로 절단한 후, 상기와 같은 효소로 절단한 pCW1의 벡터 부위에 클로닝하여 플라스미드(plasmid) pTR1을 제조하였다. 다시 접착체 단백질 및 G₄S를 암호화하는 DNA 단편을NdeI과BspEI로 절단하여 상기 접착체 단백질 DNA 단편, 및 상기 도메인 사이 링커로서 한개의 G₄S를 암호화하는 226 bp의 폴리뉴클레오티드 단편을 분리정제하고 이를 pTR1을NdeI과AgeI으로 절단하여 얻어진 플라스미드의 부위에 클로닝하여 플라스미드 pTR2를 제조하였다. 상기와 같은 클로닝 방법을 10번까지 반복하여 접착체 단백질이 10번 반복되는 컨스트럭트를 갖는 플라스미드를 제조하였다(표 1 참조). 상기 플라스미드를E.coli BL21(DE3)에 형질전환하여 과발현시킨 후, 킬레이팅 세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피(chelating sepharose fast flow chromatography) 및 크기배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)를 이용하여 분리 및 정제하였다.The construct is an adhesive protein is linked through a linker (linker), GGGGS may be used as the G₄ S linker, but is not limited to this, the linker is further extended may be GGGGSGGGGS or GGGGSGGGGSGGGGS, but is not limited thereto. Do not. The G₄ S linker is a highly flexible structure (R. Arai,et al., Protein Eng 14 (2001) 529-532).
In the present invention, the DNA fragment encoding the adhesive protein and the linker was cleaved withNde I andEcoR I, and then cloned into the vector site of pCW1 digested with the above enzyme to prepare plasmid pTR1. The DNA fragment encoding the adhesive protein and G₄ S was further cleaved withNde I andBsp EI to obtain the adhesive protein DNA fragment and a 226 bp polynucleotide fragment encoding one G₄ S as a linker between the domains. The plasmid pTR2 was prepared by isolation purification and cloning the pTR1 intoNde I andAge I to the site of the resulting plasmid. The above cloning method was repeated 10 times to prepare a plasmid having a construct in which the adhesive protein was repeated 10 times (see Table 1). The plasmid was transformed and overexpressed inE. coli BL21 (DE3), and then separated and purified by chelating sepharose fast flow chromatography and size-exclusion chromatography. It was.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단량체는 상기한 반복사슬 접착틀을 구성하고 있는 접착체 단백질에 대해 특이적으로 접착하는 부위인 매트릭스 접착도메인(MB)(matrix binding sequence)을 갖는다. 단량체가 표적(target)을 갖고 있는 경우에, 단량체는 표적에 대한 표적 접착도메인(TB)(target binding sequence)을 갖고 있다. 이러한 경우에 단량체의 표적(target) 물질을 반복사슬을 제작하는데 사용할 수도 있으며, 이때는 단량체의 표적 접착도메인(TB)과 접착틀 매트릭스 접착도메인(MB)(matrix binding sequence)이 같은 경우가 된다. 또한 단량체의 표적 접착도메인(TB)(target binding sequence)이 아닌 도메인에 접착하는 단량체의 표적물질이 아닌 물질로 반복사슬을 제작하여 접착틀 매트릭스로 사용하는 경우에는, 단량체의 접착틀 매트릭스 접착도메인(MB)이 표적물질에 접착하는 표적 접착도메인(TB)(target binding sequence)과 다른 도메인이 되며, 단량체가 접착틀 매트릭스 접착도메인(MB)과 표적에 대한 표적 접착도메인(TB)을 따로 갖고 있게 된다.In the above method, the monomer of step 2) has a matrix binding domain (MB) which is a site that specifically bonds to the adhesive protein constituting the above-mentioned repeating chain bonding frame. When the monomer has a target, the monomer has a target binding sequence (TB) to the target. In this case, the target material of the monomer may be used to prepare a repeating chain, in which case the target adhesion domain (TB) and the matrix matrix adhesion domain (MB) of the monomer are the same. In addition, when a repeating chain is made of a material that is not a target material of a monomer that adheres to a domain other than the target binding domain (TB) of the monomer and is used as an adhesive frame matrix, the adhesive frame matrix adhesion domain of the monomer ( MB) becomes a different domain from the target binding sequence (TB) that adheres to the target material, and the monomers have the adhesion matrix matrix adhesion domain (MB) and the target adhesion domain (TB) to the target separately. .

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상기 방법에 있어서, 단계 2)의 반복사슬-다수단량체 복합체의 형성에 있어서 서로 다른 접착특이성 접착체들의 반복사슬을 사용하면 각각의 접착체에 특이적으로 접착하는 서로 다른 단량체간의 이종이량체(heterodimer) 및 이종다량체(heteromultimer)의 제작이 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단량체 복합체로부터 결합가교로 연결된 다량체의 제작을 위해 단량체 내에 짝이 없는 시스테인(matchless-cysteine)을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 즉 단량체간의 결합가교에 사용될 수 있는 방법으로는 상기한 단량체내에 짝이 없는 시스테인간의 이황화 결합 가교 이외의 범용하게 사용되는 다양한 종류의 화학적 결합과 가교제(chemical cross-linker)들이 사용될 수 있다. 단량체가 시스테인을 포함하는 경우 한 개의 단량체 내에 짝이 없는 시스테인을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단량체는, 상기한 단량체와 기능성 단백질(F)(functional group)(기능기)이 연장사슬(extension sequence, Ext)에 의해 연결되어 만들어진 새로운 단량체가 사용될 수 있다.
상기 기능성 단백질(F)은 효소, 독소기능기 단백질, 바이러스 등의 생체, 화합물, 약물작용을 위한 약물화합물, 라이포좀, 바이오센서, 프로드러그 등과 같은 기능기(functional group)(F)는 모두 가능하다.
상기 연장사슬(Ext)은 단량체로부터 연장되어 기능기 단백질(F)로 이어져, 단량체와 기능기 단백질을 융합시키며, 상기 연장사슬(Ext)에는 단량체내에 짝이 없는 시스테인(matchless-cysteine)이 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 두 개의 단량체 사이의 단량체내에 짝이 없는 시스테인의 산화에 의해 이황화 결합 가교가 형성됨으로써 이량체가 이루어지며, 또한 이 연장사슬(Ext)에는 이황화 결합 가교로 이량체를 이루게 하는 단량체내에 짝이 없는 시스테인중의 마지막 시스테인과 기능기(F) 사이에 유연한 아미노산 서열(Flx, flexible sequence)이 포함되며, 이 유연사슬(Flx)은 벌키(bulky)하지 않은 아미노산인 GASQEND(글리신, 알라닌, 세린, 글루타민, 글루탐산, 아르파라긴, 아스파르트산)을 포함하는 유연한(flexible) 아미노산 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 혼합은 상기 단량체와 혼합한 후, 3 ~ 5℃에서 밤새 보온한 다음, 35 ~ 40℃에서 1 ~ 2시간 동안 보온하는 것으로 수행되는 것이 바람직하고, 4℃에서 밤새 보온한 후, 37℃에서 1시간 동안 보온하는 것으로 수행되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the above method, the use of a repeating chain of different adhesive specific adhesives in the formation of the repeating chain-multimeric polymer complex of step 2) is a heterodimer between different monomers that specifically adheres to each adhesive. ) And heteromultimers are possible.
In the above method, it is preferable to include but not limited to matchless-cysteine in the monomer for preparation of crosslinked multimers from the monomer complex of step 2). That is, as a method that can be used for the crosslinking of monomers, various kinds of chemical bonds and chemical cross-linkers that are widely used other than disulfide bond crosslinking between unpaired cysteines in the above monomers may be used. When the monomer comprises cysteine, it is preferable to include unpaired cysteine in one monomer, but is not limited thereto.
In the above method, as the monomer of step 2), a new monomer made by connecting the aforementioned monomer and a functional protein (F) (functional group) by an extension sequence (Ext) may be used.
The functional protein (F) can be any functional group (F) such as enzymes, toxin functional proteins, viruses, such as living organisms, compounds, drug compounds for drug action, liposomes, biosensors, prodrugs, etc. Do.
The extension chain Ext extends from the monomer to the functional protein F, thereby fusing the monomer and the functional protein, and the extension chain Ext includes matchless-cysteine in the monomer. Preferably, but not limited to, a dimer is formed by disulfide bond crosslinking by oxidation of unpaired cysteine in the monomer between two monomers, and this extension chain (Ext) forms a dimer by disulfide bond crosslinking. A flexible amino acid sequence (Flx) is included between the last cysteine in the unpaired cysteine and the functional group (F) in the monomer, which is the non-bulky amino acid GASQEND (glycine). Consisting of flexible amino acid sequences, including alanine, serine, glutamine, glutamic acid, arparagine, and aspartic acid) One preferred, but not always limited thereto.
In the above method, the mixing of step 2) is preferably carried out by mixing with the monomer, then warming at 3 ~ 5 ℃ overnight, then warming at 35 ~ 40 ℃ for 1 to 2 hours, at 4 ℃ After warming overnight, it is more preferably carried out by warming at 37 ° C. for 1 hour, but not always limited thereto.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 결합 가교는 단백질 단량체와 이황화 공유결합성 가교결합 뿐만 아니라, 유기 화합물, 생물분자 또는 단백질의 단량체들과 아마이드결합, 이스터결합, 글라이코시딕결합 또는 이써(에테르)결합 등의 공유결합들도 포함된다. 공유결합성 가교 결합이 가장 다량체의 안정성을 높이는 가교 결합이지만 상기 가교결합이 공유결합에만 한정되는 것은 아니며, 이온결합 등으로도 다량체가 형성될 수 있다.In the above method, the binding crosslinking of step 3) is not only a protein monomer and a disulfide covalent crosslinking but also an amide bond, an ester bond, a glycidic bond or an ether (ether) with monomers of an organic compound, a biomolecule or a protein. Covalent bonds such as bonds are also included. Covalent crosslinking is the most crosslinking to increase the stability of the multimer, but the crosslinking is not limited only to the covalent bond, the multimer may be formed by ionic bond or the like.

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상기 방법에 있어서, 단계 3)의 결합 가교의 형성에 있어서 서로 다른 접착특이성을 갖는 접착체들의 반복사슬에 의해 형성된 이종 다수단량체 복합체내의 서로 다른 단량체들간의 결합 가교를 형성시킴으로서 결합 가교 이종다량체의 제작이 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단량체 복합체로부터 결합가교로 연결된 다량체의 제작을 위해 단량체 내에 짝이 없는 시스테인(matchless-cysteine)을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 즉 단량체간의 결합가교에 사용될 수 있는 방법으로는 상기한 단량체내에 짝이 없는 시스테인간의 이황화 결합 가교 이외의 범용하게 사용되는 다양한 종류의 화학적 결합과 가교제(chemical cross-linker)들이 사용될 수 있다. 단량체가 시스테인을 포함하는 경우 한 개의 단량체 내에 짝이 없는 시스테인을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단량체는, 상기한 단량체와 기능성 단백질(F)(functional group)(기능기)이 연장사슬(extension sequence, Ext)에 의해 연결되어 만들어진 새로운 단량체가 사용될 수 있다.
상기 기능성 단백질(F)은 효소, 독소기능기 단백질, 바이러스 등의 생체, 화합물, 약물작용을 위한 약물화합물, 라이포좀, 바이오센서, 프로드러그 등과 같은 기능기(functional group)(F)는 모두 가능하다.
상기 연장사슬(Ext)은 단량체로부터 연장되어 기능기 단백질(F)로 이어져, 단량체와 기능기 단백질을 융합시키며, 상기 연장사슬(Ext)에는 단량체내에 짝이 없는 시스테인(matchless-cysteine)이 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 두 개의 단량체 사이의 단량체내에 짝이 없는 시스테인의 산화에 의해 이황화 결합 가교가 형성됨으로써 이량체가 이루어지며, 또한 이 연장사슬(Ext)에는 이황화 결합 가교로 이량체를 이루게 하는 단량체내에 짝이 없는 시스테인중의 마지막 시스테인과 기능기(F) 사이에 유연한 아미노산 서열(Flx, flexible sequence)이 포함되며, 이 유연사슬(Flx)은 벌키(bulky)하지 않은 아미노산인 GASQEND(글리신, 알라닌, 세린, 글루타민, 글루탐산, 아르파라긴, 아스파르트산)을 포함하는 유연한(flexible) 아미노산 서열로 이루어져 있는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 혼합은 상기 단량체와 혼합한 후, 3 ~ 5℃에서 밤새 보온한 다음, 35 ~ 40℃에서 1 ~ 2시간 동안 보온하는 것으로 수행되는 것이 바람직하고, 4℃에서 밤새 보온한 후, 37℃에서 1시간 동안 보온하는 것으로 수행되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the above method, in the formation of the binding crosslink in step 3), the formation of the binding crosslinking heteromer is achieved by forming the binding crosslinking between the different monomers in the heteromonomer complex formed by the repeating chains of the adhesives having different adhesion specificities. Production is possible.
In the above method, it is preferable to include but not limited to matchless-cysteine in the monomer for preparation of crosslinked multimers from the monomer complex of step 2). That is, as a method that can be used for the crosslinking of monomers, various kinds of chemical bonds and chemical cross-linkers that are widely used other than disulfide bond crosslinking between unpaired cysteines in the above monomers may be used. When the monomer comprises cysteine, it is preferable to include unpaired cysteine in one monomer, but is not limited thereto.
In the above method, as the monomer of step 2), a new monomer made by connecting the aforementioned monomer and a functional protein (F) (functional group) by an extension sequence (Ext) may be used.
The functional protein (F) can be any functional group (F) such as enzymes, toxin functional proteins, viruses, such as living organisms, compounds, drug compounds for drug action, liposomes, biosensors, prodrugs, etc. Do.
The extension chain Ext extends from the monomer to the functional protein F, thereby fusing the monomer and the functional protein, and the extension chain Ext includes matchless-cysteine in the monomer. Preferably, but not limited to, a dimer is formed by disulfide bond crosslinking by oxidation of unpaired cysteine in the monomer between two monomers, and this extension chain (Ext) forms a dimer by disulfide bond crosslinking. A flexible amino acid sequence (Flx) is included between the last cysteine in the unpaired cysteine and the functional group (F) in the monomer, which is the non-bulky amino acid GASQEND (glycine). Consisting of flexible amino acid sequences, including alanine, serine, glutamine, glutamic acid, arparagine, and aspartic acid) One preferred, but not always limited thereto.
In the above method, the mixing of step 2) is preferably carried out by mixing with the monomer, then warming at 3 ~ 5 ℃ overnight, then warming at 35 ~ 40 ℃ for 1 to 2 hours, at 4 ℃ After warming overnight, it is more preferably carried out by warming at 37 ° C. for 1 hour, but not always limited thereto.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 결합 가교의 형성에 있어서 이황화 결합 가교를 사용하는 경우, 각 단량체의 환원된 시스테인 잔기의 산화에 의해 이황화 결합 가교에 의한 다량체가 생산 된다. 단량체 간의 산화는 환원된 단백질 복합체를 글루타치온 산화 형태(glutathione oxidized form, GSSG)를 포함하는 산화 완충용액에 첨가시켜 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는 단백질 복합체를 실온에서 2-멀캅토에탄올(Merchaptoethanol)을 첨가한 TrisHCl(pH8.2)을 첨가하여 환원시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 환원된 단백질 복합체를 MOPS(pH6.5)가 포함된 세척 완충용액으로 1회 세척하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. TrisHCl(pH8.2)로 3회 더 세척한 다음, GSSG 및 TrisHCl(pH8.2)가 포함된 산화 완충용액을 첨가하여 산화 반응시킨 다음, 37℃에서 2시간 동안 보온하였다. 상기 방법에 있어서 보온온도와 시간은 37℃와 2시간이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 결합 가교 다량체의 분리는 크로마토그래피를 이용하여 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 일반적인 단백질의 분리 및 정제를 위해 사용되는 방법은 모두 가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 다량체는 단량체의 이황화 결합 이량체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 명세서의 융합단백질 분자형태의 단량체는 '접착도메인-연장사슬(Ext)-기능성 단백질' 형태로 만들어진 것으로서, 이 접착도메인에는 단량체의 표적접착도메인(TB)과 이와는 다른 독립적인 접착틀 매트릭스 접착도메인(MB)이 같이 들어 있으며, 상기한 연장사슬이 단량체내 짝이 없는 시스테인을 포함하는 경우에 단량체내 짝이 없는 시스테인에 의해 두 분자의 접착도메인-연장사슬(Ext)-기능성 단백질사이에 이황화 결합 가교가 만들어짐으로써 [접착도메인-연장사슬(Ext)-기능성 단백질]₂의 형태로 이량체가 이루어지는 것이다.
본 발명자들은 발명을 완성하기 위해 단량체는 항체의 단백질 단편인 Fab를 가진 항체-독소를 사용하였고, 접착특이성 접착체 단백질로서는 연쇄상 구균(Streptococcus)의 단백질 G(protein G)의 Fab 접착 도메인인 도메인III(domain III)(DIII)을 사용하였다. 단량체로서는 항체-독소의 형태이외에 항체의 단편인 Fab를 포함하는 항체로부터 유래된 항체분자(항체분자 단량체 또는 항체-기능기 융합분자 단량체)는 모두 가능하다. 단량체간의 이황화 결합 가교 이량체([항체분자 단량체]₂)의 생산량을 최대화하기 위해, 연쇄상 구균(Streptococcal)의 단백질 G(protein G)의 Fab 접착 도메인인 도메인III(domain III)(DIII)이 2번 이상 반복되는 반복사슬 재조합 단백질을 각각 제조하여 이를 [항체분자 단량체]₂를 제조하기 위한 접착틀로 사용하였다. 구체적으로, 상기 반복사슬들에 항체분자 단량체 단백질들을 혼합하여 하나의 재조합 반복사슬 단백질에 여러 개의 항체분자 단량체들이 비공유 결합된 반복사슬-항체분자 단량체 복합체 형태의 다량체들을 제조한 후, 항체분자 단량체내 시스테인 잔기를 환원 및 산화하여 Fab 단편과 독소 사이 시스테인 잔기의 이황화 결합을 형성시킴으로써 [항체분자 단량체]₂를 제조하였다.
본 발명자들은 상기 방법에 의한 [항체분자 단량체]₂의 생산 수준을 기존의 재접힘(refolding) 방법에 의한 생산 수준과 비교하기 위해, SDS-PAGE로 분리한 후 밀도분석을 통해 [항체분자 단량체]₂의 수득율을 분석한 결과, 본 발명의 방법에 의한 [항체분자 단량체]₂의 수득률이 기존에 보고된 재접힘(refolding)에 의한 수득률에 비해 현저하게 높았다. 즉, [항체분자 단량체]₂의 수득률은 연쇄상 구균의 단백질 G의 Fab 접착 도메인인 도메인III(domain III)이 2번 이상 반복되는 재조합 단백질에 접착된 총 항체분자 단량체의 약 36 내지 52%의 범위이며, 이는 기존에 보고된 재접힘 수득률에 비해 200배 이상 현저히 높은 수치임을 알 수 있었다.
결론적으로, 단백질 G의 Fab 접착 도메인인 도메인III(domain III)의 반복사슬을 사용하여 접착된 항체분자 단량체들의 이황화 결합 가교 이량체를 형성시킬 수 있으며, 상기 반복사슬의 사용을 통해 [항체분자 단량체]₂의 생산을 현저히 증가시키는 것을 알 수 있다. 단백질 G의 Fab 접착 도메인인 도메인III(domain III)의 반복사슬 및 항체분자 단량체의 접착 특이성을 이용하면, 간단히 환원 및 산화에 의해 [항체분자 단량체]₂를 효율적으로 대량 생산할 수 있음을 알 수 있다.In this method, when disulfide bond crosslinking is used in the formation of the bond crosslink in step 3), a multimer is produced by disulfide bond crosslinking by oxidation of the reduced cysteine residue of each monomer. Oxidation between the monomers is preferably performed by adding the reduced protein complex to an oxidation buffer containing glutathione oxidized form (GSSG), but is not limited thereto.
In the present invention, the protein complex is preferably reduced at room temperature by adding TrisHCl (pH8.2) added with 2-mercaptoethanol (Merchaptoethanol), but is not limited thereto. Preferably, the reduced protein complex is washed once with a washing buffer containing MOPS (pH 6.5), but is not limited thereto. After washing three more times with TrisHCl (pH8.2), and then oxidized by addition of an oxidation buffer containing GSSG and TrisHCl (pH8.2), and then warmed at 37 ℃. In the above method, the warming temperature and time are preferably 37 ° C. and 2 hours, but are not limited thereto.
In the above method, the separation of the binding cross-linking multimer of step 3) is preferably performed using chromatography, but is not limited thereto, and any method used for separation and purification of a general protein may be possible.
In the above method, the multimer of step 3) is preferably a disulfide bond dimer of a monomer, but is not limited thereto. The monomer of the fusion protein molecular form of the present specification is made in the form of an 'adhesive domain-extension chain (Ext) -functional protein', and this adhesion domain includes a target adhesion domain (TB) of the monomer and another independent adhesion frame matrix adhesion domain. (MB) together and disulfide bonds between two domains of adhesion domain-extension-functional proteins by unpaired cysteines in monomers when the extension chains contain unpaired cysteines in monomers By the crosslinking, the dimer is formed in the form of [adhesive domain-extension chain (Ext) -functional protein]₂ .
In order to complete the invention, the inventors used an antibody-toxin whose monomer is Fab, which is a protein fragment of an antibody.Adhesive-specific adhesive protein, domain III, which is a Fab adhesion domain of protein G ofStreptococcus (domain III) (DIII) was used. As the monomer, any antibody molecule (antibody molecule monomer or antibody-functional group fusion molecule monomer) derived from an antibody including Fab, which is a fragment of the antibody, in addition to the form of antibody-toxin can be used. In order to maximize the yield of disulfide-linked cross-linking dimer ([antibody molecular monomer]₂ ) between monomers, domain III (DIII), which is Fab adhesion domain of protein G ofStreptococcal Repetitive chain recombinant proteins, each of which was repeated more than once, were prepared and used as an adhesive frame for preparing [antibody molecular monomer]₂ . Specifically, after the antibody chain monomers are mixed with the repeating chains to prepare multimers in the form of a repeating chain-antibody molecule monomer complex in which several antibody molecule monomers are non-covalently linked to one recombinant repeating chain protein, the antibody molecule monomer [Antibody molecular monomer]₂ was prepared by reducing and oxidizing the inner cysteine residue to form a disulfide bond of the cysteine residue between the Fab fragment and the toxin.
In order to compare the production level of [antibody molecule monomer]₂ by the above method with the production level by the conventional refolding method, the antibody was separated by SDS-PAGE and then analyzed by density analysis [antibody molecule monomer]._As a result of analyzing the yield of_2, the yield of [antibody molecule monomer]₂ by the method of the present invention was significantly higher than the yield by refolding reported previously. That is, the yield of [antibody molecule monomer]₂ is in the range of about 36 to 52% of the total antibody molecule monomer adhered to the recombinant protein in which domain III (domain III), which is the Fab adhesion domain of protein G of Streptococcus, is repeated two or more times. This was found to be 200 times higher than that of the previously reported refolding yield.
In conclusion, it is possible to form disulfide bond cross-linked dimers of adherent antibody molecule monomers using a repeat chain of domain III, which is a Fab adhesion domain of protein G, and through the use of the repeat chain [antibody molecule monomer ]₂ significantly increases the production. Using the repeating chain of domain III, the Fab adhesion domain of protein G, and the adhesion specificity of the antibody molecule monomer, it can be seen that the mass production of [antibody molecule monomer]₂ can be efficiently carried out simply by reduction and oxidation. .

본 발명의 방법에 의해 제작된 접착 특이성 반복사슬은 반복사슬-다수단량체 복합체를 형성하는 특성이 있으므로 이 반복사슬을 수지(resin)에 고정화시킴으로서 반복사슬-다수 단량체 복합체 형태의 다량체 형성을 통하여 상기한 바이오산업 및 의료산업 분야의 유용 단백질 분자의 순수 분리 정제를 위한 매우 높은 분자회수율을 갖는 고효율의 항체로부터 유도된 단량체 또는 특정 반복사슬에 친화도가 있는 단량체의 친화도순수분리(affinity purification)가 가능할 것이다(Zachariou M., Affinity Chromatography: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Humana Press; 2nd edition).Since the adhesive specificity repeating chain produced by the method of the present invention has a property of forming a repeating chain-multimeric monomer complex, the repeating chain is immobilized on a resin to form a repeater-multimer monomer complex in the form of a multimer. Affinity purification of monomers derived from highly efficient antibodies with very high molecular recovery or monomers with affinity for specific repeat chains for the pure separation and purification of useful protein molecules in a bio and medical industry Zachariou M., Affinity Chromatography: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) .Human Press; 2nd edition.

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또한, 본 발명은 접착특이성이 있는 접착단백질 반복사슬 재조합 단백질의 발현을 암호화하는 유전자 컨스트럭트를 제공한다.The present invention also provides a gene construct encoding the expression of adhesion protein repeat chain recombinant protein having adhesion specificity.

본 발명에서는 단백질 G(protein G)의 도메인 Ⅲ(Fab 접착 도메인)가 반복된 재조합 단백질을 암호화하는 유전자 컨스트럭트를 제조하였다.In the present invention, a gene construct encoding a recombinant protein in which domain G of protein G (Fab adhesion domain) is repeated is prepared.

상기 재조합 단백질은 2개의 Fab 접착 도메인 사이에 1개의 링커인 G₄S(GGGGS)를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The recombinant protein preferably includes, but is not limited to, one linker G₄ S (GGGGS) between two Fab adhesion domains.

상기 재조합 단백질은 단백질 G의 도메인 Ⅲ(Fab 접착 도메인)가 3 내지 10번 반복된 구조인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The recombinant protein is preferably a structure in which domain III (Fab adhesion domain) of Protein G is repeated 3 to 10 times, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제공한다.The present invention also provides an expression vector comprising the gene construct according to the present invention.

상기 발현 벡터는 원하는 유전자에 그 유전자의 mRNA로의 전사 및 단백질로 번역에 대한 조절 정보를 가지고 있는 특정의 핵산 서열이 원하는 단백질의 유전자가 잘 발현이 되고 단백질의 생산이 가능하도록 원하는 유전자에 연결되어 있게 갖고 있는 것이 바람직하다.The expression vector has a specific nucleic acid sequence having regulatory information on transcription and translation into the mRNA of the gene to the desired gene is linked to the desired gene so that the gene of the desired protein is well expressed and the production of the protein is possible. It is desirable to have.

아울러, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다.In addition, the present invention provides a transformant transformed into a host cell with the expression vector according to the present invention.

상기 발현벡터의 숙주세포로의 도입은 형질 전환(transformation), 트랜스펙션(transfection), 컨쥬게이션(conjugation), 원형질체 융합(protoplast fusion), 일렉트로포레이션(electroporation), 인산칼슘-침전(calcium phosphate-precipitation), 직접 현미주사(direct microinjection) 등과 같은 여러 가지 적절 한 방법들 중의 한 방법에 의해 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.Introduction of the expression vector into a host cell may include transformation, transfection, conjugation, protoplast fusion, electroporation, and calcium phosphate. It can be introduced into the appropriate host cell by one of several suitable methods, such as -precipitation, direct microinjection.

상기 숙주세포는 원핵 세포이거나 진핵 세포일 수 있다. 바람직한 것은 진핵세포, 예를 들면 CHO 세포와 같은 포유동물 세포이며, 정확한 부위에서 정확한 폴딩(folding)또는 글리코실화를 포함하는 단백질 분자들에 대한 단백질 생성 후의 변형을 제공하는 세포인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서는 연쇄상 구균의 단백질 G의 Fab 접착 도메인이 3 내지 7번 반복되는 재조합 단백질을 접착틀로 이용하여 항체 분자 단량체로부터 [항체 분자 단량체]₂를 대량 생산할 수 있음을 확인하였다.The host cell may be a prokaryotic or eukaryotic cell. Preferred are mammalian cells, such as eukaryotic cells, for example CHO cells, cells which provide modification after protein production for protein molecules, including correct folding or glycosylation at the correct site, but are not limited thereto. It doesn't work.
In the present invention, it was confirmed that the [antibody molecular monomer]₂ can be mass-produced from the antibody molecular monomer using a recombinant protein in which the Fab adhesion domain of Streptococcus protein G is repeated 3 to 7 times as an adhesion frame.

따라서, 본 발명의 접착특이성 접착체의 반복사슬은 단량체간의 이량체의 생산을 현저히 증가시키데 이용할 수 있으며, 이를 암호화하는 유전자 컨스트럭트, 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터를 형질전환시킨 형질전환체는 항체분자 단량체가 결합가교에 의해 연결된 다량체의 대량 생산을 위해 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the repeating chain of the adhesive specific adhesive of the present invention can be used to significantly increase the production of dimers between monomers, gene constructs encoding the expression vector, an expression vector comprising the gene construct, and the expression. A transformant transformed with a vector may be usefully used for mass production of multimers in which antibody molecule monomers are linked by crosslinking.

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이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.However, the following Examples illustrate the present invention in detail, and the content of the present invention is not limited by the Examples.

<실시예 1> 연쇄상 구균의 단백질 G의 Fab 접착 도메인의 반복사슬 컨스트럭트의 제조Example 1 Preparation of Repeat Chain Construct of Fab Adhesion Domain of Protein G of Streptococcus

본 발명자들은 단백질 G(protein G)의 도메인 Ⅲ(domain Ⅲ)를 한국생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 받은 연쇄상구균(KCTC 3098)의 염색체 DNA(chromosomal DNA)로부터 P1[5'-GGGCATATGCATCACCATCACCATCACACCGGTACACCAGCCGTGACAA-3'(서열번호 1)]과 P2[5'-CCCGAATTCTTATCCGGACCCGCCTCCACCTTCAGTTACCGTAAA-3'(서열번호 2)] 프라이머(primer)를 이용하여 PCR을 통해 직접적으로 클로닝하였다. 상기 PCR 산물(243 bp)을NdeI과EcoRI으로 자른 후, 상기와 같은 효소로 자른 pCW1의 벡터 부분에 클로닝하였다. 그런 다음, 상기 도메인 Ⅲ의 암호화 서열을 디데옥시 DNA 서열 검사법에 의해 확인하였다. 각 도메인 Ⅲ 사이 G₄S 링커는 스페이서(spacer)로 첨가하였다. 상기 결과물인 플라스미드(plasmid) pTR1을 다시NdeI과BspEI로 잘랐다. 그런 다음, 도메인 Ⅲ 및 하나의 G₄S를 암호화하는 225 bp 단편을,NdeI과AgeI으로 자른 동일한 플라스미드의 큰 단편에 붙여 넣었다. 상기 결과물인 플라스미드인 pTR2를NdeI과AgeI로 자른 다음, 상기 잘려진 큰 단편을 226 bp 단편과 붙여, 이를 'pTR3'이라 하였다. 상기와 같은 클로닝 방법을 사용하여, 단백질 G의 도메인 Ⅲ가 10번까지 반복된 플라스미드(pTR10)를 제조하였다(표 1). 이전에 보고된 방법을 이용하여, H6-B3(L)를 암호화하는 pMC75H를 제조하였다(대한민국 등록특허 10-0566091 참조).The inventors of the present invention have found that P1 [from the chromosomal DNA of Streptococcus (KCTC 3098), which received domain III of protein G from the Korea Collection for Type Cultures (KCTC). Cloning directly via PCR using 5'-GGGCATATG CATCACCATCACCATCACACCGGT ACACCAGCCGTGACAA-3 '(SEQ ID NO: 1)] and P2 [5'-CCCGAATTC TTATCCGGA CCCGCCTCCACCTTCAGTTACCGTAAA-3' (SEQ ID NO: 2)] primer It was. The PCR product (243 bp) was cut withNde I andEcoR I, and then cloned into the vector portion of pCW1 cut with the above enzyme. The coding sequence of the domain III was then confirmed by dideoxy DNA sequencing. G₄ S linker between each domain III was added as a spacer. The resulting plasmid pTR1 was cut again withNde I andBsp EI. The 225 bp fragment encoding domain III and one G₄ S was then pasted into large fragments of the same plasmid cut withNde I andAge I. The resulting plasmid pTR2 was cut intoNde I andAge I, and then the large cut fragment was attached to a 226 bp fragment, which was called 'pTR3'. Using the above cloning method, a plasmid (pTR10) in which domain III of protein G was repeated up to 10 was prepared (Table 1). Using previously reported method, pMC75H encoding H6-B3 (L) was prepared (see Republic of Korea Patent Registration 10-0566091).

본 발명에서 사용된 플라스미드 및 단백질Plasmids and Proteins Used in the Invention플라스미드Plasmid단백질 명칭Protein Name참고문헌referencespCW1pCW1B3(Fd)-ext-PE38:
Fd-SKPSIST-KASG₄C(G₄S)₂GGPE-PE38^aB3 (Fd) -ext-PE38:
Fd-SKPSIST-KASG₄ C (G₄ S)₂ GGPE-PE38^aJ.H. Park, et al.,Mol Cells 12(2001) 398-402JH Park, et al.,Mol Cells 12 (2001) 398-402pMC75HpMC75HH6-B3(L): (His)₆^b-경쇄(Light chain)H6-B3 (L): (His)₆^b -Light chain본 명세서This specificationpTR1~10pTR1-10TR1~10: (His)₆-(DⅢ-G₄S)_n, n=1~10^cTR1 ~ 10: (His)_6- (DIII-G₄ S)_n , n = 1-10^c본 명세서This specification

^aSKPSIST: 천연형 경첩서열(hinge sequence)의 변이된 서열(CKPCICT);^a SKPSIST: mutated sequence of native hinge sequence (CKPCICT);

ext, KASG₄C(G₄S)₂: 시스테인 잔기(Cys residue)를 갖는 연장 펩티드 사슬;ext, KASG₄ C (G₄ S)₂ : extended peptide chain with cysteine residues;

G₄: GGGG의 아미노산 서열;G₄ : amino acid sequence of GGGG;

PE38: 38 kd의 절단된 슈도모나스 외독소(truncatedPseudomonas Exotoxin);PE38: 38 kd truncatedPseudomonas Exotoxin;

^b(His)₆: 6개의 히스티딘 태그(Histidine tag); 및^b (His)₆ : 6 Histidine tags; And

^cDⅢ: 연쇄상 구균(Streptococcal) 단백질 G의 도메인 Ⅲ.^c DIII: Domain ofStreptococcal Protein G III.

이전에 보고된 방법을 이용하여, 상기 반복사슬 컨스트럭트를 과발현시켰다(J.H. Park, et al.,Mol Cells 12(2001) 398-402).Using the previously reported method, the repeating chain construct was overexpressed (JH Park, et al.,Mol Cells 12 (2001) 398-402).

순수한 용해물을 킬레이팅 세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피(chelating sepharose fast flow chromatography)(Amersham Bioscience, Sweden)로 분리한 후, Hiload Superdex-75 pg 또는 Hiload Superdex-200 pg(26/60)(Amersham Bioscience, Sweden)을 사용하여 크기배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)로 분리하였다. 모든 컨스트럭트는 순도 95% 이상이 되도록 정제하였다(도 2의 A).
<실시예 2> 재접힘 과정을 통한 B3(Fab)-ext-PE38 및 [B3(Fab)-ext-PE38]₂의 제조
본 발명자들은 B3(Fd)-ext-PE38 및 H6-B3(L)의 봉입체(inclusion body)의 과발현, 제조 및 재접힘(refolding)은 이전에 보고된 방법과 같이 수행하였다(J.H. Park, et al.,Mol Cells12(2001) 398-402). 상기 재접힘된 단백질들을 Q-세파로스 FF(Q-sepharose FF), Hitrap 단백질 G HP(Hitrap protein G HP), 및 Hiload Superdex-200 pg(26/60)(Amersham Bioscience, Sweden) 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.
구체적으로, B3(Fab)-ext-PE38는 B3(Fd)-ext-PE38 및 H6-B3(L) 사이 사슬간(interchain) 이황화 결합에 의해 제조하였다. 사슬간(interchain) 이황화 결합에 관련된 두 개의 시스테인 잔기는 B3(Fd)-ext-PE38의 C_H1 도메인 및 H6-B3(L)의 C_L 도메인 끝에 위치하였다. 또한, [B3(Fab)-ext-PE38]₂는 재접힘 과정 동안 B3(Fab)-ext-PE38내 ext에 위치하는 단량체내 짝이 없는 시스테인 잔기에 의해 두 개의 단량체 사이의 단량체간 이황화 결합에 의해 생성되기도 하였다. 크기 배제 크로마토그래피 후, B3(Fab)-ext-PE38 및 [B3(Fab)-ext-PE38]₂의 정제도는 비환원의 SDS-폴리아크릴아마이드 겔의 밀도분석을 이용하여 측정한 결과, 순도 95% 이상으로 나타났다(도 2의 B). 본 실시예의 종래의 [B3(Fab)-ext-PE38]₂의 재접힘 과정을 통한 수득률은 약 0.06%로 나타났으며, 본 발명의 방법을 이용하면 종래 수득률에 비하여 200배 이상 상승한다.
<실시예 3> 단백질 G의 반복사슬 컨스트럭트 및 B3(Fab)-ext-PE38의 접착Pure lysates were separated by chelating sepharose fast flow chromatography (Amersham Bioscience, Sweden), followed by Hiload Superdex-75 pg or Hiload Superdex-200 pg (26/60) (Amersham Bioscience, Sweden) was isolated by size-exclusion chromatography. All constructs were purified to be at least 95% pure (A in FIG. 2).
Example 2 Preparation of B3 (Fab) -ext-PE38 and [B3 (Fab) -ext-PE38]₂ by Refolding
We performed overexpression, preparation and refolding of inclusion bodies of B3 (Fd) -ext-PE38 and H6-B3 (L) as previously reported methods (JH Park, et al. .,Mol Cells 12 (2001) 398-402). The refolded proteins were subjected to Q-sepharose FF, Hitrap protein G HP, and Hiload Superdex-200 pg (26/60) (Amersham Bioscience, Sweden) chromatography. Purification by
Specifically, B3 (Fab) -ext-PE38 was prepared by interchain disulfide bonds between B3 (Fd) -ext-PE38 and H6-B3 (L). Two cysteine residues involved in interchain disulfide bonds were located at the ends of the C_H1 domain of B3 (Fd) -ext-PE38 and the C_L domain of H6-B3 (L). In addition, [B3 (Fab) -ext-PE38]₂ is used for inter-monomer disulfide bonds between two monomers by unpaired cysteine residues in monomers located at ext in B3 (Fab) -ext-PE38 during the refolding process. It was also produced by After size exclusion chromatography, the purity of B3 (Fab) -ext-PE38 and [B3 (Fab) -ext-PE38]₂ was measured using density analysis of non-reducing SDS-polyacrylamide gel,purity 95 It was found to be more than% (FIG. 2B). The yield through the refolding process of the conventional [B3 (Fab) -ext-PE38]₂ of the present Example was found to be about 0.06%, using the method of the present invention more than 200 times higher than the conventional yield.
Example 3 Repeated Chain Construct of Protein G and Adhesion of B3 (Fab) -ext-PE38

본 발명자들은 정제된 단백질 G의 반복사슬 컨스트럭트와 단량체 B3(Fab)-ext-PE38 사이 접착 반응을 유도하기 위해, B3(Fab)-ext-PE38(715 ㎍)와 TR 단백질(각28 ㎍)을 혼합하여 4℃에서 밤새 보온한 후, 37℃에서 1시간 동안 보온하였다. 그런 다음, 상기 반응 혼합물을 크기배제 크로마토그래피(Superdex-200^TMHR)로 분리하였다. 용출된 단백질 복합체를 B3(Fab)-ext-PE38 단독(K_av=0.33) 또는 [B3(Fab)-ext-PE38]₂ 단독(K_av=0.20)을 대조군으로 사용하여 비교하였다. 용출된 단백질 피크의 K_av값을 [수학식 1]을 사용하여 계산하였다.In order to induce an adhesion reaction between the repeat chain construct of purified protein G and the monomer B3 (Fab) -ext-PE38, the inventors found that B3 (Fab) -ext-PE38 (715 μg) and TR protein (each 28 μg) was mixed and warmed at 4 ° C. overnight, and then warmed at 37 ° C. for 1 hour. The reaction mixture was then separated by size exclusion chromatography (Superdex-200^™ HR). Eluted protein complexes were compared using B3 (Fab) -ext-PE38 alone (K_av = 0.33) or [B3 (Fab) -ext-PE38]₂ alone (K_av = 0.20) as a control. The K_av value of the eluted protein peak was calculated using [Equation 1].

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여기서, V_e는 피크의 용출 부피(elution volume)이고, V_o는 컬럼의 빈공간 부피(void volume)이며, 이는 블루 덱스트란 2000(blue dextran 2000)의 용출 부피이며; V_t는 Superdex-200 컬럼의 층 부피(bed volume)이다.
TR3에 접착된 B3(Fab)-ext-PE38(K_av=0.22)가 [B3(Fab)-ext-PE38]₂의 용리 부피에 근접하였다. 또한, TR2를 제외한 모든 복합체들에는 동시에 적어도 둘 이상의 B3(Fab)-ext-PE38 분자들이 접착되어 있었다. TR3로부터 TR6까지의 복합체들은 이량체로 나타났으며, TR7~10 복합체는 삼량체로 나타났다.
<실시예 4> 단백질 G의Domain III 반복사슬 재조합 단백질과 B3(Fab)-ext-PE38들이 접착된 복합체로부터 [B3(Fab)-ext-PE38]₂의 제조
본 발명자들은 상기 정제된 TR1 ~ TR10 단백질 및 이에 접착된 B3(Fab)-ext-PE38들을 이용하여 [B3(Fab)-ext-PE38]₂를 생산하기 위해, 2-멀캅토에탄올로 환원시키고 글루타치온 산화 형태(glutathione oxidized form, GSSG)로 산화시킨 후 분자를 비환원(도 2A) 및 환원(도 2B) SDS-PAGE에 의해 분석하였다.Where V_e is the elution volume of the peak and V_o is the void volume of the column, which is the elution volume of blue dextran 2000; V_t is the bed volume of the Superdex-200 column.
B3 (Fab) -ext-PE38 (K_av = 0.22) adhered to TR3 was close to the elution volume of [B3 (Fab) -ext-PE38]₂ . In addition, at least two B3 (Fab) -ext-PE38 molecules were attached to all complexes except TR2 at the same time. Complexes from TR3 to TR6 were shown as dimers, while TR7 ~ 10 complexes were shown as trimers.
<Example 4> protein G of Domain IIIrepeat chain recombinant protein and B3 (Fab)Preparation of-ext-PE38 are from the adhesive composite [B3 (Fab) -ext-PE38 ] 2
The present inventors reduced and prepared with 2-mercaptoethanol to produce [B3 (Fab) -ext-PE38]₂ using the purified TR1 to TR10 proteins and B3 (Fab) -ext-PE38 adhered thereto. After oxidation to glutathione oxidized form (GSSG) the molecules were analyzed by non-reducing (FIG. 2A) and reducing (FIG. 2B) SDS-PAGE.

구체적으로, 단백질 복합체를 금속 킬레이팅 세파로스 비드(metal chelating sepharose bead)에 10℃에서 1시간 동안 고정시켰다. 10 μl의 금속 킬레이팅 세파로스 비드[100 mM TrisHCl (pH8.2)에 50% 현탁]를 각각의 반응 혼합물에 첨가한 후, 고정된 단백질 복합체를 실온에서 40 mM의 2-멀캅토에탄올(Merchaptoethanol)을 첨가한 100 mM TrisHCl(pH8.2)을 첨가하여 환원하였다. B3(Fab)-ext-PE38의 시스테인 잔기를 환원시키는데 필요한 2-멀캅토에탄올의 농도를 결정하기 위해 수행한 예비실험에서, B3(Fab)-ext-PE38의 시스테인 잔기의 완전한 환원은 20 ~ 40 mM의 2-멀캅토에탄올의 첨가에 의해 이루어졌다. 그런 다음, 환원된 단백질 복합체를 100 mM MOPS(pH6.5)가 포함된 세척 완충용액으로 1회 세척한 후, 100 mM TrisHCl(pH8.2)로 3회 더 세척하였다. 상기 세척 단계 후, 단백질 복합체를 5 mM GSSG 및 100 mM TrisHCl(pH8.2)가 포함된 산화 완충용액을 첨가하여 산화 반응시킨 다음, 37℃에서 2시간 동안 보온하였다. 상기 산화 반응 후, 2X SDS 시료 완충용액을 첨가한 다음, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 쿠마시 염색으로 분석한 후, 농도계측기를 이용하여 밀도분석을 통해 [B3(Fab)-ext-PE38]₂의 생성율을 분석하였다. 또한, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에서, [B3(Fab)-ext-PE38]₂의 밴드의 강도를 [B3(Fab)-ext-PE38]₂ 및 B3(Fab)-ext-PE38의 강도의 합인 총 밴드 강도로 나눈 값을 이용하여 [B3(Fab)-ext-PE38]₂의 총단량체 투여 대비 이량체 수득율을 산출하였다(표 2). B3(Fab)-ext-PE38 단독 및 TR1에 접착된 B3(Fab)-ext-PE38를 음성 대조군으로 사용하였다.Specifically, the protein complex was fixed in metal chelating sepharose beads at 10 ° C. for 1 hour. After addition of 10 μl of metal chelating Sepharose beads [50% suspension in 100 mM TrisHCl (pH8.2)] to each reaction mixture, the immobilized protein complex was added to 40 mM 2-mercaptoethanol (Merchaptoethanol) at room temperature. ) Was added by addition of 100 mM TrisHCl (pH8.2). In a preliminary experiment conducted to determine the concentration of 2-mercaptoethanol required to reduce the cysteine residues of B3 (Fab) -ext-PE38, the complete reduction of the cysteine residues of B3 (Fab) -ext-PE38 was 20-40. by addition of mM 2-mercaptoethanol. The reduced protein complex was then washed once with wash buffer containing 100 mM MOPS (pH6.5), followed by three more washes with 100 mM TrisHCl (pH8.2). After the washing step, the protein complex was oxidized by addition of an oxidation buffer containing 5 mM GSSG and 100 mM TrisHCl (pH8.2), and then warmed at 37 ° C. for 2 hours. After the oxidation reaction, 2X SDS sample buffer solution was added and analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Coomassie staining, followed by density analysis using a densitometer [B3 (Fab ) -ext-PE38]₂ was analyzed. In addition, in SDS- poly acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), [B3 (Fab) -ext-PE38] band, the intensity of the_{2 [B3 (Fab) -ext-} PE38] 2 and B3 (Fab) - Dimer yield compared to total monomer administration of [B3 (Fab) -ext-PE38]₂ was calculated using the total band intensity divided by the sum of the intensities of ext-PE38 (Table 2). B3 (Fab) -ext-PE38 alone and B3 (Fab) -ext-PE38 adhered to TR1 were used as negative controls.

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[B3(Fab)-ext-PE38][B3 (Fab) -ext-PE38]₂₂의 수득율Yield항체-독소Antibody-Toxin수득률 (%)Yield (%)B3(Fab)-ext-PE38B3 (Fab) -ext-PE38검출되지 않음Not detectedB3(Fab)-ext-PE38: TR1B3 (Fab) -ext-PE38: TR1검출되지 않음Not detectedB3(Fab)-ext-PE38: TR2B3 (Fab) -ext-PE38: TR2검출되지 않음Not detectedB3(Fab)-ext-PE38: TR3B3 (Fab) -ext-PE38: TR347% ± 0.2547% ± 0.25B3(Fab)-ext-PE38: TR4B3 (Fab) -ext-PE38: TR444% ± 0.1944% ± 0.19B3(Fab)-ext-PE38: TR5B3 (Fab) -ext-PE38: TR548% ± 0.1248% ± 0.12B3(Fab)-ext-PE38: TR6B3 (Fab) -ext-PE38:TR636% ± 0.0236% ± 0.02B3(Fab)-ext-PE38: TR7B3 (Fab) -ext-PE38: TR752% ± 0.1152% ± 0.11

그 결과, [B3(Fab)-ext-PE38]₂는 B3(Fab)-ext-PE38 단독, TR1과의 복합체, 및 TR2와의 복합체 3가지의 시료에서 검출되지 않았다. TR3 ~ TR7 복합체 내에서의 단량체간의 높아진 충돌 상호작용은 이황화결합으로 가교 결합된 이량체의 상당한 증가된 생산을 나타내었다. TR3 ~ TR7 복합체의 시료에서 [B3(Fab)-ext-PE38]₂의 수득률은 각각 47%, 44%, 48%, 36% 및 52%를 나타내었다. [B3(Fab)-ext-PE38]₂의 생산은 산화제 첨가 후 2시간 내에 이루어졌으며, 추가적인 보온에 의해 유의적인 증가가 나타나지 않았다. 이로써 TR 단백질에 접착되는 B3(Fab)-ext-PE38 분자의 ext내 시스테인 잔기는 반복사슬을 통해 쉽게 가까이 근접하여 함께 접착되어 있음을 알 수 있었다.As a result, [B3 (Fab) -ext-PE38]₂ was not detected in three samples of B3 (Fab) -ext-PE38 alone, a complex with TR1, and a complex with TR2. Elevated collision interactions between monomers in the TR3 to TR7 complexes resulted in a significant increased production of crosslinked dimers with disulfide bonds. The yields of [B3 (Fab) -ext-PE38]₂ in the samples of the TR3 to TR7 complexes were 47%, 44%, 48%, 36% and 52%, respectively. The production of [B3 (Fab) -ext-PE38]₂ took place within 2 hours after the addition of the oxidant and no significant increase was seen by further warming. As a result, it was found that cysteine residues in the ext of the B3 (Fab) -ext-PE38 molecule adhered to the TR protein were easily and closely adhered together through a repeating chain.

본 발명은 결합가교 다량체를 생산하는 방법으로 단량체와 친화도를 통해 특이적으로 접착하는 접착체의 반복사슬을 이용함으로서 반복사슬-다수단량체 복합체의 형성을 촉진시킬수 있으며 나아가 생성된 반복사슬-다수단량체 복합체를 결합 가교 다량체의 형태로 제작할 수 있다는 것이다. 이는 기존의 결합가교 다량체 생산방법에 비교해 현저하게 높은 생산율을 야기하여 결합 가교 이량체를 대량 생산할 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용할 수 있다.The present invention can promote the formation of a repeating chain-multimeric monomer complex by using a repeating chain of an adhesive that specifically bonds with a monomer through affinity as a method of producing a crosslinking multimer, and further, generates a repeating chain-multiple. The monomer complex can be produced in the form of a bond crosslinking multimer. This causes a significantly higher production rate compared to the conventional method for producing a crosslinked crosslinking polymer, so that the crosslinked dimer can be mass produced, and thus it can be industrially useful.

단량체는 여러 종류의 물질로부터 만들 수 있으며 그에 대한 예로서는 리간드, 또는 그 리간드의 접착성을 갖는 일부 조각, 예를 들어 TGF alpha, TGF beta, IL2, IL6, TNF, GMSCF 등등, 또한 각종 리간드 수용체 또는 그 수용체의 접착성을 갖는 일부 조각, 예를 들어 TBP1, TBP2, IFN alpha 또는 beta 수용체, 고나도트로핀 수용체 등의 각종 수용체 등이 단량체를 만드는데 이용될 수 있다 (Nienhaus, G. Ulrich. Protein-ligand interactions : methods and applications. Humana Press , 2005). 약물전구체변환, 물질검출, 물질분해, 물질생성 등의 작용을 하는 각종 효소, 세포살상효과를 갖는 독소작용기 등을 포함하는 단백질, 유전자치료를 위한 바이러스 등의 생체, DNA 전달을 위한 양이온꼬리체 화합물, 약물작용을 위한 약물화합물 등의 화합물, 약물전달을 위해 만든 화공학적 산물인 라이포좀(liposome), 표적분자의 실시간 검출을 위한 바이오쎈서, 또는 프로드러그 등과 같은 기능기(F, functional group)등이 단량체를 만드는데 이용될 수 있다. [참조: (Farah, R. A., et al., Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 8, 321-356, 1998)(Trail, P. A., et al., Science 261, 212-215, 1993)(Hinman, L. M., et al., Cancer Res. 53, 3336-3342, 1993)(Pastan, I. Biochim. Biophys. Acta 1333, C1-C6, 1997)(Kreitman, P. J., et al., J. Clin. Oncol. 18, 1622-1636, 2000)(Zalutsky, M. R. & Vaidyanathan, G. Curr. Pharm. Des. 6, 1433-1455, 2000)(Goldenberg, D. M. in Clinical Uses of Antibodies (eds Baum, R. P., et al.)1-13(Kluwer academic, The Netherlands, 1991))(Lode, H. N. & Reisfeld, R. A. Immunol. Res. 21, 279-288, 2000)(Penichet, M. L. & Morrison, S. L. J. Immmunol. Methods 248, 91-101, 2001)(Lasic, D.D. & Papahadjopoulos, D. Science 267, 1275-1276, 1995)(Park. J. W., et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 92, 1327-1331, 1995)(Niculescu-Davaz, I., et al., Anticancer Drug Des. 14, 517-538,1999)(SToldt, H. S., et al., Eur. J. Cancer 33, 186-192, 1997)].The monomer can be made from several kinds of materials and examples thereof include ligands, or some fragments having adhesive properties thereof, for example TGF alpha, TGF beta, IL2, IL6, TNF, GMSCF and the like, and also various ligand receptors or their Some fragments with adhesive properties of the receptor, such as various receptors such as TBP1, TBP2, IFN alpha or beta receptors, gonadotropin receptors, etc. can be used to make monomers (Nienhaus, G. Ulrich. Protein-ligand interactions: methods and applications.Humana Press, 2005). Various enzymes for drug precursor conversion, substance detection, substance decomposition, substance production, proteins including toxin functional groups having cytotoxic effect, and living bodies such as viruses for gene therapy, cation tail compound for DNA delivery , Compounds such as drug compounds for drug action, liposomes, which are chemical products made for drug delivery, bio groups for real-time detection of target molecules, or functional groups such as prodrugs, etc. It can be used to make this monomer. (Farah, RA, et al., Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 8, 321-356, 1998) (Trail, PA, et al., Science 261, 212-215, 1993) (Hinman, LM, et al., Cancer Res. 53, 3336-3342, 1993) (Pastan, I. Biochim. Biophys. Acta 1333, C1-C6, 1997) (Kreitman, PJ, et al., J. Clin. Oncol. 18, 1622-1636, 2000) (Zalutsky, MR & Vaidyanathan, G. Curr. Pharm. Des. 6, 1433-1455, 2000) (Goldenberg, DM in Clinical Uses of Antibodies (eds Baum, RP, et al.) 1-13 (Kluwer academic, The Netherlands, 1991) (Lode, HN & Reisfeld, RA Immunol. Res. 21, 279-288, 2000) (Penichet, ML & Morrison, SLJ Immunol. Methods 248, 91-101, 2001) (Lasic, DD & Papahadjopoulos, D. Science 267, 1275-1276, 1995) (Park. JW, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 92, 1327-1331, 1995) (Niculescu-Davaz, I., et al., Anticancer Drug Des. 14, 517-538,1999) (SToldt, HS, et al., Eur. J. Cancer 33, 186-192, 1997).

상기한 바와 같이 자연계에는 리간드와 수용체, 항체와 항원, 및 동종이량체(homodimer) 또는 이종이량체(heterodimer), 나아가 다량체(multimer)를 형성하는 단백질 등 알려진 접착 친화관계를 갖는 물질들의 종류가 매우 다양하다. 이러한 경우들에 대한 상호 접착 친화성을 갖는 물질들을 각각 단량체와 접착체로서 이용하여 본 출원의 방법에 의해 단량체로부터 결합가교 다량체를 대량 제조할 수 있다.As mentioned above, there are many kinds of substances with known adhesion affinity, such as ligands and receptors, antibodies and antigens, and proteins that form homodimers or heterodimers, and even multimers. Very diverse Materials having mutual adhesion affinity for these cases may be used as monomers and adhesives, respectively, to mass produce conjugated multimers from monomers by the methods of the present application.

본 발명의 방법에 의해 제작된 접착 특이성 반복사슬은 반복사슬-다수단량체 복합체를 형성하는 특성이 있으므로 이 반복사슬을 수지(resin)에 고정화시킴으로서 상기한 바이오산업 및 의료산업 분야의 유용 단백질 분자의 순수 분리 정제를 위한 고효율의 친화도순수분리(affinity purification)가 가능할 것이다(Zachariou M., Affinity Chromatography: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Humana Press; 2nd edition).Since the adhesive specificity repeating chain produced by the method of the present invention has a property of forming a repeating chain-multimeric monomer complex, it is possible to fix the repeating chain in a resin, thereby purifying useful protein molecules in the bioindustry and medical industry. High efficiency affinity purification for separation purification will be possible (Zachariou M., Affinity Chromatography: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Humana Press; 2nd edition).

도 1은 본 발명의 결합 가교를 이용한 다량체 생산 방법의 개요도를 나타내는 그림이다.1 is a diagram showing a schematic diagram of a multimer production method using the binding crosslinking of the present invention.

도 2는 본 발명에서 정제된 단백질을 SDS-폴리아크릴라마이드 겔로 확인한 결과를 나타내는 그림이다:Figure 2 is a diagram showing the results confirmed by the SDS-polyacrylamide gel purified protein in the present invention:

도 2A는 단백질 G의 반복사슬 재조합 단백질을 환원 SDS-PAGE 시료 완충용액과 혼합한 뒤, 환원 16% SDS-폴리아크릴라마이드 겔로 확인한 결과이며, 1번부터 7번 줄은 각각 TR1 ~ TR7 단백질이다; 및Figure 2A is a result of mixing the repetitive chain recombinant protein of protein G with reducing SDS-PAGE sample buffer, reduced 16% SDS-polyacrylamide gel, thelines 1 to 7 are TR1 ~ TR7 protein, respectively ; And

도 2B는 본 발명에서 생산한 항체-독소인 B3(Fab)-ext-PE38(M) 및 [B3(Fab)-ext-PE38]₂(D)를 비환원 8% SDS-폴리아크릴라마이드 겔로 확인한 결과이며, 화살표는 위에서부터 각각 [B3(Fab)-ext-PE38]₂, B3(Fab)-ext-PE38 및 B3(Fd)-ext-PE38을 나타낸다(H6-B3(L)은 작은 분자량(대략 25kDa)을 갖기 때문에 도면에 나타나지 않았다).Figure 2B is a non-reducing 8% SDS-polyacrylamide gel of the antibody-toxins B3 (Fab) -ext-PE38 (M) and [B3 (Fab) -ext-PE38]₂ (D) produced in the present invention. The arrow indicates the result [B3 (Fab) -ext-PE38]₂ , B3 (Fab) -ext-PE38 and B3 (Fd) -ext-PE38, respectively, from above (H6-B3 (L) is a small molecular weight) (Not shown in the figure because it has approximately 25 kDa).

도 3은 B3(Fab)-ext-PE38와 TR1 ~ TR7 단백질의 복합체로부터 [B3(Fab)-ext-PE38]₂의 형성을 SDS-폴리아크릴라마이드 겔로 확인한 결과를 나타내는 그림이다:FIG. 3 shows the results of confirming the formation of [B3 (Fab) -ext-PE38]₂ from the complex of B3 (Fab) -ext-PE38 and TR1 to TR7 proteins by SDS-polyacrylamide gel:

도 3A는 단백질 시료(각각 10 g)를 금속 킬레이팅 아가로스 비드에 접착시키고(1) 40 mM 2-멀캅토에탄올로 30분 동안 실온에서 환원한 다음(2), 단백질 복합체 를 GSSG로부터 산화된 5 mM 글루타치온(Glutathione)으로 2시간 동안 37℃에서 산화한 다음(3), 각 시료의 1/2을 비환원 8% SDS-폴리아크릴라마이드 겔을 사용하여 분리한 결과이다(화살표는 위에서부터 각각 [B3(Fab)-ext-PE38]₂, B3(Fab)-ext-PE38 및 B3(Fd)-ext-PE38을 나타낸다); 및FIG. 3A shows protein samples (10 g each) adhered to metal chelating agarose beads (1) reduced with 40 mM 2-mercaptoethanol for 30 minutes at room temperature (2), and the protein complexes oxidized from GSSG. Oxidation with 5 mM glutathione at 37 ° C. for 2 hours (3), and then half of each sample was separated using a non-reducing 8% SDS-polyacrylamide gel (arrows from above). Each represent [B3 (Fab) -ext-PE38]₂ , B3 (Fab) -ext-PE38 and B3 (Fd) -ext-PE38); And

도 3B는 각 시료의 나머지 1/2을 환원 12% SDS-폴리아크릴라마이드 겔을 사용하여 분리한 결과이다(화살표는 B3(Fab)-ext-PE38에 접착된 TR 단백질을 나타내고, TR1 단백질(분자량 8 kDa)은 분리하는데 있어서 크기가 너무 작기 때문에 도면에 나타나지 않았다).FIG. 3B is the result of separation of the other half of each sample using a reduced 12% SDS-polyacrylamide gel (arrow shows TR protein adhered to B3 (Fab) -ext-PE38 and TR1 protein ( The molecular weight 8 kDa) is not shown in the figure because it is too small to separate).

<110> CHOE, MuHyeon<120> High yield production methods for dimer and multimers formed by cross-linking bond bridge by increasing the bond bridge formation utilizing the complex of monomers and tandem-repeat chain of molecule with binding specificity<130> 9p-03-33<160> 2<170> KopatentIn 1.71<210> 1<211> 49<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> P1 primer<400> 1gggcatatgc atcaccatca ccatcacacc ggtacaccag ccgtgacaa 49<210> 2<211> 45<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> P2 primer<400> 2cccgaattct tatccggacc cgcctccacc ttcagttacc gtaaa 45<110> CHOE, MuHyeon<120> High yield production methods for dimer and multimers formed by cross-linking bond bridge by increasing the bond bridge formation utilizing the complex of monomers and tandem-repeat chain of molecule with binding specificity<130> 9p-03-33<160> 2<170> Kopatentin 1.71<210> 1<211> 49<212> DNA<213> Artificial Sequence<220>P223 primer<400> 1gggcatatgc atcaccatca ccatcacacc ggtacaccag ccgtgacaa 49<210> 2<211> 45<212> DNA<213> Artificial Sequence<220>P223 primer<400> 2cccgaattct tatccggacc cgcctccacc ttcagttacc gtaaa 45

Claims

Translated fromKorean

1) 단량체에 특이적으로 접착하는 접착체의 반복사슬을 제조하는 단계; 및1) preparing a repeating chain of an adhesive that specifically bonds to a monomer; And

2) 상기 단계 1)의 반복사슬과 단량체를 혼합하여, 상기 반복사슬과 단량체의 반복사슬-다수 단량체 복합체를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 다량체의 제조 방법.2) mixing the repeating chain and the monomer of step 1), the method for producing a multimer, characterized in that it comprises the step of producing a repeating chain-multimer monomer complex of the repeating chain and monomer.

제 1항에 있어서, 상기 반복사슬-다수 단량체 복합체 내의 단량체들 간에 결합 가교가 형성된 후, 결합 가교가 형성된 반복사슬-다수 단량체 복합체로부터 반복사슬을 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다량체의 제조 방법.The multimer according to claim 1, further comprising the step of separating the repeating chain from the repeating chain-multiple monomer complex in which the bond crosslinking is formed after the binding crosslinking is formed between the monomers in the repeating chain-multiple monomer complex. Method of preparation.

제 1항에 있어서, 단량체는 단백질인 것을 특징으로 하는 다량체의 제조 방법.The method of claim 1, wherein the monomer is a protein.

제 1항에 있어서, 단량체는 항체, 리간드, 수용체 또는 그들의 조각, 또는 그들의 재조합체, 또는 그들의 유도체, 또는 그들과 생물화학 기능기의 융합체인 것을 특징으로 하는 다량체의 제조 방법.The method according to claim 1, wherein the monomers are antibodies, ligands, receptors or fragments thereof, or their recombinants, or derivatives thereof, or fusions of them with biochemical functional groups.

제 4항에 있어서, 항체는 항체의 조각, Fab 단편 또는 Fab 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 다량체의 제조 방법.The method of claim 4, wherein the antibody comprises a fragment, Fab fragment or Fab fragment of the antibody.

제 4항에 있어서, 생물화학 기능기는 효소, 독소작용기 단백질, 바이러스를 포함하는 생체, 화합물, 약물작용을 위한 약물화합물, 라이포좀, 바이오센서, 프로드러그를 포함하는 기능기(functional group)인 것을 특징으로 하는 다량체의 제조 방법.The method according to claim 4, wherein the biochemical functional group is a functional group including an enzyme, a toxin functional protein, a living body including a virus, a compound, a drug compound for drug action, a liposome, a biosensor, and a prodrug Method for producing a multimer, characterized in that.

제 1항에 있어서, 접착체는 단백질인 것을 특징으로 하는 다량체의 제조 방법.The method of claim 1, wherein the adhesive is a protein.

제 1항에 있어서, 접착체는 단량체에 접착하는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1 wherein the adhesive is a protein that adheres to the monomer.

제 1항에 있어서, 접착체는 항체, 항체의 조각, 또는 Fab 단편에 접착하는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the adhesive is a protein that adheres to the antibody, fragment of the antibody, or Fab fragment.

제 1항에 있어서, 접착체는 단백질 G(protein G)인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1 wherein the adhesive is protein G.

제 1항에 있어서, 접착체는 단백질 G의 조각인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1 wherein the adhesive is a piece of protein G.

제 11항에 있어서, 단백질 G의 조각은 단백질 G의 항체접착 도메인인 것을 특징으로 하는 방법.12. The method of claim 11, wherein the fragment of protein G is an antibody adhesion domain of protein G.

제 12항에 있어서, 단백질 G의 항체접착 도메인은 도메인 Ⅲ인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 12, wherein the antibody adhesion domain of Protein G is domain III.