KR101139103B1 - Apheresis device - Google Patents

Abstract

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본 발명은 알츠하이머 질환을 치료하는데 사용되는 아페레시스 장치에 관한 것이다. 본 발명의 아페레시스 장치는 혈류 또는 혈장류가 접촉되는 고형의 지지체를 포함한다.The present invention relates to an aperesis device used to treat Alzheimer's disease. The aperesis device of the present invention includes a solid support to which blood flow or plasma is contacted.

Description

Translated fromKorean

아페레시스 장치 {APHERESIS DEVICE}Aperesis device {APHERESIS DEVICE}

본 발명은 혈류 또는 혈장류와 접촉될 수 있는 고체 담체를 포함하는 아페레시스 장치에 관한 것이다.The present invention relates to an aperesis device comprising a solid carrier that can be in contact with the bloodstream or plasma.

아페레시스에 의한 치료 방법은 이의 치료적 효과가 혈액의 병원성 단백질, 단백질-결합된 병원성 기질, 유리 병원성 기질 또는 병원성 세포를 체외 제거하는 것에 근거한다. 병원성 단백질이 단지 세포 비함유 혈장으로부터 제거될 수 있을 경우, 혈장은 막 혈장 분리기에 의해 (혈장 분리) 또는 혈액분리기에 의해 혈구 세포로부터 분리된다. 비선택적 혈장 교환 (혈장아페레시스 (plasmapheresis))에서, 교환된 환자의 혈장은 전체적으로 분리되며, 이러한 경우, 병원체 이외에 모든 그 밖의 중요한 단백질이 제거된다. 이러한 이유로, 제거된 혈장의 전해질, 사람 알부민 또는 새로운 혈장으로의 대체가 필요하다. 선택적 혈장아페리시스 방법에서, 병원성 단백질은 흡착, 침전 또는 여과에 의해 분리된 혈장으로부터 상당히 특이적으로 제거될 수 있어서, 제거가 수행된 이후 실질적인 용적 손실 없이 혈장을 재사용할 수 있게 된다. 이러한 선택적 방법은 대체 용액 없이 수행될 수 있다는 이점을 갖는다. 선택적 전혈 아페레시스 방법에 있어서, 병원성 단백질은 사전 혈장 분리 없이 사전처리되지 않은 혈액으로부터 직접적으로 특이적으로 흡착되므로써, 혈장 분리법과는 대조적으로 혈장 분리 및 대체 용액 첨가 이 둘 모두가 생략될 수 있다. 아페레시스의 또 다른 아류형은 세포가 혈액으로부터 제거되는 혈구아페레시스(cytapheresis)이다. 이 방법에 의해, 백혈구, 적혈구, 혈소판, 과립구 또는 줄기 세포가 선택적으로 회수될 수 있다.The method of treatment by aperesis is based on the ex vivo removal of pathogenic proteins, protein-bound pathogenic substrates, free pathogenic substrates or pathogenic cells of blood. If the pathogenic protein can only be removed from the cell free plasma, the plasma is separated from the blood cells by a membrane plasma separator (plasma separation) or by a blood separator. In non-selective plasma exchange (plasmapheresis), the plasma of the exchanged patient is separated entirely, in which case all other important proteins other than the pathogen are removed. For this reason, replacement of the removed plasma with electrolyte, human albumin or fresh plasma is needed. In the selective plasma aperesis method, the pathogenic protein can be removed quite specifically from the separated plasma by adsorption, precipitation or filtration, allowing the plasma to be reused without substantial volume loss after the removal is performed. This optional method has the advantage that it can be carried out without an alternative solution. In the selective whole blood aperesis method, the pathogenic protein is directly adsorbed directly from untreated blood without prior plasma separation, thereby eliminating both plasma separation and replacement solution addition as opposed to plasma separation. . Another subtype of aperesis is cytapheresis, in which cells are removed from the blood. By this method, leukocytes, erythrocytes, platelets, granulocytes or stem cells can be selectively recovered.

최근 아페레시스(예를 들어, 혈장아페리세스 또는 혈구아페레시스로서)가 기증자의 혈장을 회수하는 데 주로 사용되고 있지만 (혈장 팩으로서, 각종 혈장 분획 또는 혈액 산물의 회수를 위해), 아페레시스 방법은 치료 분야에서도 점점 더 중요해지고 있다. 최근, 모든 계열의 대사 질병 (metabolic illnessess) (예를 들어, (가족성) 고콜레스테롤혈증 (hypercholesterinemia), 분리된 Lp(a)가 증가하는 진행성 관상 동맥 심질환 (progressive coronary heart disease), 고이단백혈증 증후군 (chylomicronemia syndrome), 간부전 (liver failure) 등), 신장 질환 (renal diseases) (굿패스처 증후군 (Goodpasture Syndrome), 루푸스 신염 (lupus nephritis)이 있는 전신 홍반성 루푸스 (systemic Lupus erythematodes), 베게너 육아종증 (Wegener's granulomatosis), 용혈성 요독증 (hemolytic-uremic syndrome), 특발성 국소 분절성 사구체신염 (idopathic focal-sclerosing glomerulonephritis), 파라단백질혈증 관련 증후군 (paraproteinemia-associated syndromes), 한냉글로불린혈증성 자반증 (cryoglobulonemic purpura), 신장 이식의 경우에서의 HLA 감작 등), 신경계 질환 (근무력증 (Myastenia gravis), 귈레인 바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome), 만성 탈수초성 다발신경염 (chronic demyelinizing polyradiculoneuritis), 파라단백질혈증성 다발신경병증 (paraproteinemic polyneuropathy), 랑버트-이튼 증후군 (Lambert-Eaton syndrome), 레프섬 증후군 (Refusum syndrome) 등), 면역계 질환 (류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 면역 억제성 혈우병 (immune inhibitor hemophilia), 천포창 (pemphigus), 등), 순환계 및 미소순환계 질환 (과점도 증후군 (hyperviscosity syndorme), 항인지질항체 증후군 (antiphospholipid antibody syndrome), 골수 이식 후의 혈전성 미세혈관병 (thromotic microangiopathy), 노화 관련 황반병변 (age-related macular degeneration), 급성 청력장애 (acute hearing loss), 미소순환계의 말초 순환 장애 (peripheral disturbances of microcirculation), 지연성 심장 근육병 (idiopathic dilatory cardiomyopathy), 심장 이식후의 이식 맥관장애 (transplant vasculopathy), 동형접합체 가족성 고콜레스테롤혈증 (homozygotic familial hypercholesterinemia), 국소 분절성 사구체신염 (focal segmental glomerulosclerosis), 용혈성 요독 증후군 (hemolytic-uremic syndrome), 등), 중독증 (intoxications), 급성 간 부전 (acute liver insufficiency), 신생물 (neoplasmas), 과수화 (hyperhydration), 갑상선 중독증 (thyreotoxicosis) 등이 아페레시스 방법에 의해 치료된다[참조: Pschyrembel (257. Edition), keyword "Plasmapherese"; www. nephrologie.de/172Apharese.htm)].Although aperesis (for example, as plasma aperes or hemophiliasis) has recently been used mainly to recover the donor's plasma (as a plasma pack, for the recovery of various plasma fractions or blood products), aperes Sheath methods are becoming increasingly important in the field of therapy. Recently, metabolic illnessess of all classes (e.g. (family) hypercholesterinemia, progressive coronary heart disease with increased Lp (a), hyperlipoproteinemia) Chylomicronemia syndrome, liver failure, etc., renal diseases (Goodpasture Syndrome, systemic Lupus erythematodes with lupus nephritis, Wegener's granulomatosis) (Wegener's granulomatosis), hemolytic-uremic syndrome, idiopathic focal-sclerosing glomerulonephritis, paraproteinemia-associated syndromes, cold cryoglobulonemic purpura globulonemic purpura Sensitization of HLA in the case of transplantation, etc.), neurological diseases (Myastenia gravis), Guillain-Barre synd rome), chronic demyelinizing polyradiculoneuritis, paraproteinemic polyneuropathy, Lambert-Eaton syndrome, Refusum syndrome, etc. (Rheumatoid arthritis, immunosuppressive hemophilia, pemphigus, etc.), circulatory and microcirculatory diseases (hyperviscosity syndorme, antiphospholipid antibody syndrome, Thromotic microangiopathy after bone marrow transplantation, age-related macular degeneration, acute hearing loss, peripheral disturbances of microcirculation, delayed heart Myopathic dilatory cardiomyopathy, transplant vasculopathy after homograft, homozygous familial Homozygotic familial hypercholesterinemia, focal segmental glomerulosclerosis, hemolytic-uremic syndrome, etc., intoxications, acute liver insufficiency, neoplasmas , Hyperhydration, thyreotoxicosis, etc. are treated by the aperesis method. Pschyrembel (257. Edition), keyword "Plasmapherese"; www. nephrologie.de/172Apharese.htm).

알츠하이머 질환(AD)은 진행성 신경계 장애이며, 최근까지도 효과적인 치료는 가능하지 않다. 이 질환의 특징은 아밀로이드 β-펩티드를 함유하는 대뇌 플라크, 및 미소세관 관련된 TAU 단백질로부터의 섬유성 뉴우런 구조이다. 아밀로이드-β 및 TAU가 병인과 관련있는 것으로서 간주되나, 가장 최근의 연구 결과는 아밀로이드-β가 이러한 병인의 주요 작용제임을 시사하는 것으로 보인다. 따라서, 아밀로이드-β 생성, 아미로이드-β 응집 또는 이러한 응집물에 의해 유발되는 신경독성 현상을 예방하고자 하는 치료제가 점점 더 개발되고 있다. 지금까지 이루어진 AD에 대한 치료 방법의 포괄적인 설명은 울페(Wolfe)의 조사 논문에 제시된다[참조: Nature Reviews Drug Discovery 1 (2002) 859-866].Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurological disorder and until recently no effective treatment has been possible. Characteristic of this disease is cerebral plaques containing amyloid β-peptides, and fibrous neuronal structures from microtubule related TAU proteins. Amyloid-β and TAU are considered to be related to the etiology, but the most recent studies appear to suggest that amyloid-β is the major agent of this etiology. Thus, therapeutic agents are increasingly being developed to prevent amyloid-β production, amyloid-β aggregation or neurotoxic phenomena caused by such aggregates. A comprehensive description of the treatment methods for AD thus far is presented in Wolfe's research paper (Nature Reviews Drug Discovery 1 (2002) 859-866).

아미로이드-β 플라크는 내재성 막횡단 단백질인 소위 아미로이드-β 전구체 단백질(APP)로부터 출발하여 형성된다(막 횡단 단백질의 생리적 기능이 분명하게 입증되어 있는 것은 아니지만, 가장 최근의 연구 결과는 APP가 키네신(kinesin) I에 대한 소위 막 수송(cargo) 수용체로서 작용함을 시사한다). APP는 소위 세크라타제에 의해 단백질 분해적으로 분해되며, 이 경우 40개의 아미노산 길이를 갖는 Aβ 펩티드(Aβ₄₀)가 생리적으로 주로 형성된다. 이외의 Aβ 펩티드의 보다 짧거나 보다 긴 형태는 또한 주로 높은 응집성을 나타내는 42개의 아미노산(Aβ₄₂)의 형태를 형성한다. 그러므로, 이러한 Aβ₄₂-형은 아밀로이드 플라크 내 우세적인 형태이다. 따라서, 이러한 상이한 분해에 대한 원인이 되는 세크레타제 (α-, 및 주로 β- 및 감마 세크레타제)는 또한 가능한 AD 치료법에 의해 목적이 되는 주표적물을 형성한다. 그러므로, AD 치료에서의 이러한 효소 (예를 들어, 벤조디아제핀, 설폰아미드, 벤조카프롤락탐과 같은)에 대해 조절제 또는 억제제를 각각 사용하는 것이 시도되었다.Amyloid-β plaques are formed starting from the endogenous transmembrane protein, the so-called amyloid-β precursor protein (APP) (although the physiological function of the transmembrane protein is not clearly demonstrated, the most recent findings from APP Suggests that it acts as a so-called membrane receptor for kinesin I). APP is proteolytically degraded by so-called secretases, in which the Αβ peptide (Aβ₄₀ ) with a length of 40 amino acids is formed physiologically. Other shorter or longer forms of the Αβ peptide also form the form of 42 amino acids (Aβ₄₂ ) which mainly show high cohesion. Therefore, this Aβ₄₂ -type is the predominant form in amyloid plaques. Thus, the secretases (α-, and predominantly β- and gamma secretases), which contribute to these different degradations, also form major targets targeted by possible AD therapies. Therefore, it has been attempted to use modulators or inhibitors, respectively, for these enzymes in AD treatment (such as, for example, benzodiazepines, sulfonamides, benzocaprolactams).

AD와 관련된 또 다른 유전자는 아포리포단백질 E이며, 이에 대해서는 세개의 대립 변이체 (APOE2, APOE3, 및 APOE4)가 존재한다. 하나 또는 두개의 APOE4 복사체를 갖는 사람은 AD의 위험성이 보다 높은 반면, APOE2 캐리어는 이러한 전체 집단과 비교하여 위험성이 보다 낮은 것으로 나타났다. 또한, 스타틴, 즉 콜레스테롤 생합성을 억제하는 약제를 취한 사람은 AD에 대한 위험성이 현저히 감소되는 것으로 나타났다. 따라서, AD의 추가의 치료법은 예를 들어, 스타틴으로 콜레스테롤 생합성을 억제시키는 데 집중되었다.Another gene associated with AD is Apolipoprotein E, with three allelic variants (APOE2, APOE3, and APOE4). Persons with one or two APOE4 copies have a higher risk of AD, whereas APOE2 carriers have a lower risk compared to this entire population. In addition, people taking statins, namely drugs that inhibit cholesterol biosynthesis, have been shown to significantly reduce the risk for AD. Thus, additional therapies for AD have focused on inhibiting cholesterol biosynthesis with, for example, statins.

AD 치료를 위한 또 다른 방법은 세크레타제-억제제에 의해 수행될 수 있는, 대뇌 플라크 중에서 아밀로이드 응집을 억제하는 것과 관련된다. 또한, 생리적으로 관련된 농도에서 아연은 Aβ의 응집을 유도할 수 있기 때문에 아연 함량을 낮추는 것이 제안되었다.Another method for the treatment of AD involves inhibiting amyloid aggregation in cerebral plaques, which can be performed by secretase-inhibitors. In addition, it has been proposed to lower zinc content because zinc at physiologically relevant concentrations can induce aggregation of Aβ.

끝으로, 예를 들어 Aβ₄₂와의 면역화와 같은 면역학적 방법이 개시되어 있으나, 이는 임상적 연구의 범주내에서 심각한 부작용으로 인해 중단되었다[참조: Willke, Bild der Wissenschaft, 9(2003), 24-28].Finally, immunological methods such as, for example, immunization with Aβ₄₂ have been disclosed, which have been discontinued due to serious side effects within the scope of clinical studies. Willke, Bild der Wissenschaft, 9 (2003), 24- 28].

선행 기술에서 제안된 추가의 AD 치료법은 APP 발현의 방지 및 Aβ 제거(clearance) 증가와 관련되며, 여기에서 APP 프로모터 영역과 상호작용하는 물질은 APP 발현에 대해 연구되었다. Aβ 제거와 관련하여, 특정 프로테아제, 예컨대 인슐린 저하 효소 및 네프롤리신(neprolysin)의 활성 증가, 또는 항-Aβ-항체의 말초 투여(De Mattos et al., PNAS 98(15)(2001), 8850-8855)이 제안되었다. 끝으로, 예를 들어, AD 환자의 혈청에서 아밀로이드 β 수준을 낮추므로써 이미 존재하는 아밀로이드 플라크를 재용해시키려는 시도가 이루어졌다. 이러한 맥락에서, 아페레시스 방법에 의해 뇌에서 β-아밀로이드 단백질의 플라크 침착물을 감소시키는 것이 제안되었으나(US 6,551,266, 아페레시스에 의해 500kD 초과의 분자량을 갖는 거대분자의 제거가 제안되었음), 이는 사실상 AD에 대해서는 기재되는 바는 없었다. 그러나, 아페레시스 방법에 의해 직접적으로 뇌 세포내 이미 존재하는 플라크의 용해는 가능하지 않다 (혈액/뇌 배리어는 플라크 또는 500kD보다 큰 분자가 통과할 수 없다).Further AD therapies proposed in the prior art are associated with the prevention of APP expression and increased Aβ clearance, wherein substances interacting with the APP promoter region have been studied for APP expression. Regarding Αβ removal, increased activity of certain proteases such as insulin lowering enzymes and neprolysin, or peripheral administration of anti-Aβ-antibodies (De Mattos et al., PNAS 98 (15) (2001), 8850 -8855) has been proposed. Finally, attempts have been made to re-dissolve existing amyloid plaques, for example by lowering amyloid β levels in the serum of AD patients. In this context, it has been proposed to reduce plaque deposits of β-amyloid protein in the brain by the Aperesis method (US 6,551,266, removal of macromolecules having a molecular weight greater than 500 kD by Aperesis). This was virtually not described for AD. However, lysis of plaques already present in brain cells directly by the Aperesis method is not possible (blood / brain barrier cannot pass plaque or molecules larger than 500 kD).

그러므로, 본 발명의 목적은 알츠하이머 질환에 대한 새로운 치료법 및 예방법을 제공하는 것이다.It is therefore an object of the present invention to provide new therapies and prophylaxis for Alzheimer's disease.

따라서, 본 발명에 의해, 혈류 또는 혈장류와 접촉될 수 있는 고체 담체를 포함하고, 아밀로이드-β 전구체 단백질(APP)-결합 수용체를 포함하는 아페레시스 장치가 제공된다. 본 발명의 아페레시스 장치의 경우, APP의 또는 APP 분해 생성물, 특히 Aβ₄₀ 또는 Aβ₄₂의 의미있는 제거가 AD 환자, 또는 AD의 위험이 있는 환자에게서 아페레시스에 의해 수행될 수 있다. 중추신경계(CNS)와 혈장 간에는 Aβ₄₂ 동적 평형 상태로 존재하는 것으로 공지되어 있다. 마우스 모델에서, 항 Aβ항체의 말초 투여가, 항 Aβ항체가 혈액/뇌 배리어를 극복하지 않으면서 CNS 및 혈장 Aβ₄₂ 제거에 영향을 미쳐서, 뇌에서 Aβ₄₂ 부하를 감소시키는 것이 입증되었다 [참조: DeMattos PNAS 2001, 상기]. 이러한 결과는 마쯔오카(Matsuoka) 등의 문헌(Journal of Neuroscience 2003: 29-33)에 의해 다른 Aβ₄₂ 결합 분자(겔솔린(gelsolin) 및 G_M1)의 말초 투여에 의해서 확인되었다. 따라서, 뇌내 플라크의 형성 과정은 혈액 중에서 Aβ₄₂ 를 트래핑하므로써 예방될 수 있다. 이와 같이 함에 있어서, 환자의 혈액 또는 혈장에 접촉되는 아페레시스 장치내 수용체가 Aβ₄₂ 에 대해 또는 APP의 다른 분해형에 대해 특이적인지 아닌지의 여부는 중요하기 않으며, APP 및 이의 (단백질분해적) 분해 생성물, 특히, Aβ₄₂ 이 이러한 특이적 흡착에 의해 혈액으로부터 제거되는 것만이 필수적이고, 이에 따라 "잘못된" 단백질 분해(즉, Aβ₄₂ 로)를 일으키지 않을 것이다. 따라서, 본 발명은 미국 특허 제 6,551,266호의 것과는 완전히 상이한 아페레시스의 적용법, 즉, 플라크 자체가 아닌, 가능성이 있는 플라크 형성 블록의 제거를 기초로 한다. 이외에, 아페레시스에 의한 플라크의 제거는, 혈액 혈장아페레시스가 뇌내 플라크 형성 영역에 이를 수도 없기 때문에 AD의 치료에 효과적이지 않은 것처럼 처음부터 선택권이 제거되어야 한다.Thus, according to the present invention, there is provided an aperesis device comprising a solid carrier capable of contacting blood flow or plasma, and comprising an amyloid-β precursor protein (APP) -binding receptor. In the case of the aperesis device of the present invention, meaningful removal of APP or APP degradation products, in particular Aβ₄₀ or Aβ₄₂ , can be performed by aperesis in patients with AD or in patients at risk of AD. It is known to exist in Aβ₄₂ dynamic equilibrium between the central nervous system (CNS) and plasma. In mouse models, peripheral administration of anti-Aβ antibodies has been shown to reduce Aβ₄₂ load in the brain by affecting CNS and plasma Aβ₄₂ clearance without anti-Aβ antibodies overcoming the blood / brain barrier. DeMattos PNAS 2001, supra. This result was confirmed by peripheral administration of other Aβ₄₂ binding molecules (gelsolin and G_M1 ) by Matsuoka et al. (Journal of Neuroscience 2003: 29-33). Thus, the formation of plaque in the brain can be prevented by trapping Aβ₄₂ in the blood. In doing so, it is not important whether the receptor in the aperesis device that contacts the patient's blood or plasma is specific for Aβ₄₂ or for other degradation forms of APP, and APP and its (proteolytic) It is only necessary that the degradation product, in particular Aβ_42, is removed from the blood by this specific adsorption, and thus will not cause "wrong" proteolysis (ie with Aβ₄₂ ). Thus, the present invention is based on the application of aperesis, which is completely different from that of US Pat. No. 6,551,266, namely the removal of plaque-forming blocks likely, rather than the plaque itself. In addition, the removal of plaque by aperesis must be removed from the beginning as it is not effective for the treatment of AD because blood plasma aperesis cannot reach the plaque forming region in the brain.

다른 한편, 본 발명에 따른 아페레시스는 체내 자체에서 Aβ의 고갈을 유발시키는 방법(참조예: Demattos et al., PNAS 98(15) (2001), 8850-8855 with peripheral anti-Aβ antibodies)에 비해, 본 발명의 경우에서는 어떠한 자가면역 반응도 유발될 수 없다는 점에서 중대한 이점을 갖는다. 또한, 본 발명에 따르면, 적당한 체내에만 작용할 수 있는(가능하게는 특정 부위에 이식된 후에만) 물질이 환자에게 공급될 필요가 없고, 병원성 제가 선택적으로 제거된다. 즉, 질병의 원인이 체내 반응물을 제거하지 않고 특이적으로 체외로 분리된다.On the other hand, the aperesis according to the present invention is a method for causing depletion of Aβ in the body itself (see, for example, Demattos et al., PNAS 98 (15) (2001), 8850-8855 with peripheral anti-Aβ antibodies). In contrast, the present invention has a significant advantage in that no autoimmune response can be induced. In addition, according to the invention, there is no need to supply the patient with a substance that can act only in the proper body (possibly only after being implanted in a particular site), and the pathogen is selectively removed. That is, the cause of the disease is specifically separated in vitro without removing the reactants in the body.

이와 같이 하므로써, 본 발명에 따르면, 모든 구체예에서 현존하거나 이미 공지된 아페레시스 장치가 용이하게 본 발명에 사용될 수 있다. 특히, 고체 담체(및 아페레시스 장치)를 선택하는 경우에는, 이의 의학적-기술적 유용성이 고려되어야 한다. 이러한 담체, 방법 또는 장치가 문헌 WO 제 97/48483호, US 특허 제 5,476,715호, 제 6,036,614호, 제 5,817,528호 또는 제 6,551,266호에 기재되어 있다. 상응하는 시중의 혈장아페레시스 장치로는 프레세니우스(Fresenius), 아피나(Affina), 플라즈마셀렉트(Plasmaselect), 아사히(ASAHI), 카네카(Kaneka), 브라운(Braun)사 등에 의한, 예컨대, LDL-테라소르브®(LDL-Therasorb®), 이뮤노소르바®(Immunosorba®), 프로소르바®(Prosorba®), 글로바핀®(Globaffin®), Ig-테라소르브®(Ig-Therasorb), 이뮤소르바®(Immusorba®), 리포소르바®(Liposorba®), HELP®, DALI®, 빌리루빈(bilirubin)-담즙산 흡수장치 BR-350, 프로메테우스®(Prometheus®) 해독장치, MARS®, 메티캡(Medicap) 또는 플라스마 PLO-시스템(Plasma FLO-System)으로부터의 ADA소르브-시스템이 시판된다. 이들 시스템은 모두, 이들의 상용형이 항상 주로 단일 단백질의 특이적 제거를 목적으로 하는 것은 아니지만, 아페레시스 당업자들에게 어떠한 문제도 없이, 예를 들어, 면역아페레시스(immunapheresis)으로서, 및/또는 아페레시스 장치에서 고체 담체(예를 들어, 칼럼으로서)를 구비시키므로써 본 발명에 따라 적용될 수 있다.In this way, according to the invention, in all embodiments existing or known aperesis devices can be readily used in the invention. In particular, when selecting a solid carrier (and aperesis device), its medical-technical usefulness should be considered. Such carriers, methods or devices are described in documents WO 97/48483, US Pat. Nos. 5,476,715, 6,036,614, 5,817,528 or 6,551,266. Corresponding commercially available plasma aperesis devices include Fresenius, Apina, Plasmaselect, Asahi, Kaneka, Braun, etc. , LDL-Therasorb®, Immunosorba®, Prosorba®, Globaffin®, Ig-Therasorb® (Ig-) Therasorb, Imusorba®, Liposorba®, HELP®, DALI®, Bilirubin-Bile Acid Absorber BR-350, Prometheus® Detoxification Device, MARS ®, ADA Sorb-System from Medicap or Plasma FLO-System is commercially available. All of these systems are not always intended for the specific removal of a single protein primarily, but without any problem to those skilled in the art of aperesis, for example as immunoapheresis, and And / or may be applied according to the invention by having a solid carrier (eg, as a column) in an aperesis device.

그러므로, 본 발명에 따르면, "APP 결합 수용체"에 의해 모든 이러한 물질은 APP 리간드, 및 이의 생물학적 부산물, 특히 Aβ₄₂ 에 대해 친화성을 가지며, AD 환자 또는 AD의 위험이 있는 사람의 혈액 또는 혈장으로부터 이러한 폴리펩티드를 제거할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 APP- 또는 Aβ₄₂ 수용체는 각각 바람직하게는 (폴리클로날 또는 모노클로날) 항체, 단백질, 펩티드, 강글리오시드(ganglioside) 또는 핵산일 수 있다.Therefore, according to the present invention, all such substances by "APP binding receptor" have affinity for APP ligands, and their biological by-products, in particular Aβ₄₂ , from blood or plasma of AD patients or humans at risk of AD. It is understood that such polypeptides can be eliminated. These APP- or Aβ₄₂ receptors may each preferably be (polyclonal or monoclonal) antibodies, proteins, peptides, gangliosides or nucleic acids.

이러한 관점에서, 항 APP 항체, 항-Aβ₄₀ 항체 또는 항-Aβ₄₂ 항체, APP 결합 단백질, 특히, 겔솔린, apoJ 또는 apoE, APP 결합 펩티드, APP 결합 강글리오시드, 특히, G_M1, 또는 APP 결합 핵산, 특히 압타머(aptamer), 또는 이들 수용체의 혼합물이 특히 바람직하다.In this regard, anti-APP antibody, anti-Aβ₄₀ antibody or anti-Aβ₄₂ antibody, APP binding protein, in particular, gelsolin, apoJ or apoE, APP binding peptide, APP binding ganglioside, in particular, G_M1 , or APP Particular preference is given to binding nucleic acids, in particular aptamers, or mixtures of these receptors.

이러한 항체의 예로는 3D6(Aβ_1-5), 2H3(Aβ_1-12), 2G3(Aβ_33-40), 21F12(Aβ_33-42), 12H7(Aβ_33-42)(Johnson-Wood et al., PNAS 1997:1550-1555), 10D5, 16C11(Bard et al., Nature Medicine 2000:916-919), 데마토스(DeMattos) 등(2001)에 의해 기술된 항체(m266, m243) 뿐만 아니라 동일한 특이성의 항체가 있다. 이러한 항체는 예를 들어, APP, Aβ₄₂, 또는 이들의 단편 또는 변이체를 함유하는 백신 제형으로 포유동물을 면역화시키고, 이후, 선택적으로 세포 융합 및 클론 선택 프로토콜(모노클로날 항체인 경우) 동안에 얻어진다.Examples of such antibodies include 3D6 (Aβ_1-5 ), 2H3 (Aβ_1-12 ), 2G3 (Aβ_33-40 ), 21F12 (Aβ_33-42 ), 12H7 (Aβ_33-42 ) (Johnson-Wood et al. , PNAS 1997: 1550-1555), 10D5, 16C11 (Bard et al., Nature Medicine 2000: 916-919), DeMattos et al. (2001) as well as the antibodies (m266, m243) described by There are antibodies of specificity. Such antibodies are immunized with a mammalian formulation, eg, with a vaccine formulation containing APP, Aβ₄₂ , or fragments or variants thereof, and then optionally obtained during cell fusion and clone selection protocols (if monoclonal antibodies). Lose.

겔솔린(Matsuoka et al. 2003, 상기 참조), apoJ 및 apoE(DeMattos et al., 2001, 상기 참조)는 APP 결합 단백질 수용체의 또 다른 예이다. G_M1은 APP 결합 강글리오시드 수용체의 예이다[참조: Matsuoka et al., 2003, 상기 참조].Gelsolin (Matsuoka et al. 2003, supra), apoJ and apoE (DeMattos et al., 2001, supra) are another example of an APP binding protein receptor. G_M1 is an example of an APP binding ganglioside receptor (Matsuoka et al., 2003, supra).

APP 결합 단백질의 또 다른 예로는 CETP(콜레스테릴-에스테르-전이 단백질) 및 ERAB 단백질(크기 261aa; He et al., JBC 273(17)(1998), 10741-10746; Lustbader et al., Science 304(2004), 448-452; 특히 aa 1-186, 및 1-158, 각각)이 있다. APP 결합 펩티드의 예로는 APP 결합 단백질로부터 유래된 APP 결합 단편이 있다. APP 결합 펩티드의 특정 예로는 KTYNLKKGQT-C("펩티드 4077"), GIAVASKTYNLKKGQTHTLEDFQRVLDV(ERAB 93-120), SKTYNLKKGQTHT(ERAB 98-110), C-HQKLVFFAED("펩티드 1323"), C-EVHHQKLVFFAEDVGS("펩티드 1324"), C-HQKIVFFAED("펩티드 1325"), 및 FGFPEHLLVDFLQSLS-C("펩티드 1208"), (및 APP 결합 영역을 포함하는 그 밖의 모든 ERAB, CETP, 또는 β-파괴 단편 각각)(이들 펩티드에서, 말단 시스테인은 원래의 단백질 서열 부분이 아니고, 펩티드의 커플링을 위해 부착된 것일 뿐이다)가 있다.Another example of an APP binding protein is CETP (cholesteryl-ester-transfer protein) and ERAB protein (size 261aa; He et al., JBC 273 (17) (1998), 10741-10746; Lustbader et al., Science 304 (2004), 448-452; in particular aa 1-186, and 1-158, respectively. An example of an APP binding peptide is an APP binding fragment derived from an APP binding protein. Specific examples of APP binding peptides are KTYNLKKGQT-C ("peptide 4077"), GIAVASKTYNLKKGQTHTLEDFQRVLDV (ERAB 93-120), SKTYNLKKGQTHT (ERAB 98-110), C-HQKLVFFAED ("peptide 1323"), C-EVHHQKLVFFAEDV "), C-HQKIVFFAED (" peptide 1325 "), and FGFPEHLLVDFLQSLS-C (" peptide 1208 "), (and all other ERAB, CETP, or β-break fragments each including an APP binding region) (in these peptides) Terminal cysteine is not part of the original protein sequence, but only attached for coupling of peptides).

APP 결합 수용체로서 펩티드는 D- 또는 L-아미노산 또는 D와 L 아미노산의 조합으로 어셈블링될 수 있으며, 선택적으로 추가의 변경, 고리 폐쇄 또는 유도체 화에 의해 변경될 수 있다. Aβ₄₂에 대한 적합한 펩티드 수용체는 예를 들어 상업적으로 입수할 수 있는 펩티드 라이브러리로부터 제공될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 펩티드는 길이가 5개 이상, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산, 특히 8개 이상의 아미노산이고, 길이가 11개 이하, 바람직하게는 14 또는 20개 이하의 아미노산이 바람직하다. 그러나, 본 발명에 따르면, 보다 긴 펩티드도 어떠한 문제 없이 APP 결합 수용체로서 사용될 수 있다. 추가로, 올리고머(예컨대, 폴리에틸렌-이민 및 폴리리신)이 수용체로서 적합하다.Peptides as APP binding receptors can be assembled into D- or L-amino acids or a combination of D and L amino acids and optionally modified by further alterations, ring closure or derivatization. Suitable peptide receptors for Aβ₄₂ may be provided from, for example, commercially available peptide libraries. Preferably, such peptides are at least 5, preferably at least 6 amino acids, in particular at least 8 amino acids, preferably up to 11, preferably up to 14 or 20 amino acids in length. However, according to the present invention, longer peptides can be used as APP binding receptors without any problem. In addition, oligomers (eg polyethylene-imine and polylysine) are suitable as receptors.

이러한 APP 결합 수용체를 제조하기 위해, 예를 들어 조합 화학에 의해 또는 가장 많이 변화되는 구조에 대한 고출력 스크리닝법에 의해 제조된 펩티드 라이브러리, 파지 라이브러리가 적합하다[참조예: Phage Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor), et al.: Willats WG, Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002 Dec., 50(6): 837-54; http://www. microcollections.de/showpublications.php#)]. 무작위화에 근거하는 파지 라이브러리 이외에, 리보좀 디스플레이 또는 세균 디스플레이를 이용하는 라이브러리가 적합하다. 이를 생성시키기 위한 적합한 라이브러리 및 방법은 당업자들에게 공지되어 있으며, US 2004/0110281 A, WO 00/72880 A 및 WO 02/059148 A에 기술되어 있다.To prepare such APP-binding receptors, peptide libraries, phage libraries prepared by combinatorial chemistry or by high-power screening methods for structures that are most varied are suitable. See, eg, Phage Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor), et al .: Willats WG, Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002 Dec., 50 (6): 837-54; http: // www. microcollections.de/showpublications.php#)]. In addition to phage libraries based on randomization, libraries using ribosomal displays or bacterial displays are suitable. Suitable libraries and methods for generating them are known to those skilled in the art and are described in US 2004/0110281 A, WO 00/72880 A and WO 02/059148 A.

또한, 핵산에 기초하는 APP 결합 수용체("압타머"; 또한 "데코이"-올리고데옥시누클레오티드(이들 서열로 인해, 전사 인자에 대해 결합 부위를 구성하는 ds 올리고누클레오티드))가 사용될 수 있으며, 후자는 가장 많이 변화되는 (올리고누클레오티드-) 라이브러리(예를 들어, 2-180 핵산 잔기를 갖는)로 발견될 수 있다[참조예: Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5 (5) (2002), 690-700; Famulok et al., Acc. Chem. Res. 3 (2000), 591-599; Mayer et al., PNAS 98(2001), 4961-4965, 및 기타 다수의 문헌]. 핵산 주쇄는 예를 들어 천연 포스포로디에스테르 화합물에 의해, 또한 포스포로티오에이트 또는 조합물 또는 화학적 변이체(예를 들어 PNA로서)에 의해 형성될 수 있으며, 본 발명에 따르면, 염기로서 주로 U, T, A, C, G, H 및 mC가 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 누클레오티드의 2'-잔기는 바람직하게는 H, OH, F, Cl, NH₂, O-메틸, O-에틸, O-프로필 또는 O-부틸이며, 핵산이 다른 방식으로 개질되는 것, 즉, 예를 들어 올리고누클레오티드 합성에서 통상적으로 사용되는 것과 같이 보호기가 제공되는 것이 가능하다. 그러므로, APP 결합 압타머는 본 발명의 범주내에서 바람직한 APP 결합 친화성 분자이다.In addition, APP binding receptors based on nucleic acids (“aptamers”; also “decoy” -oligodeoxynucleotides (due to these sequences, ds oligonucleotides that make up the binding site for transcription factors)) can be used, the latter Can be found with the most varied (oligonucleotide-) libraries (eg, having 2-180 nucleic acid residues). See, eg, Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5 (5) (2002), 690-700; Famulok et al., Acc. Chem. Res. 3 (2000), 591-599; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965, and many others. Nucleic acid backbones can be formed, for example, by natural phosphorodiester compounds and also by phosphorothioates or combinations or chemical variants (for example as PNAs), according to the invention, mainly based on U, T, A, C, G, H and mC can be used. The 2'-residues of nucleotides which can be used according to the invention are preferably H, OH, F, Cl, NH₂ , O-methyl, O-ethyl, O-propyl or O-butyl, and the nucleic acid is otherwise It is possible that modifications are provided, ie protecting groups are provided, for example, as commonly used in oligonucleotide synthesis. Therefore, APP binding aptamers are preferred APP binding affinity molecules within the scope of the present invention.

APP에 대한 압타머는 이후 기술되는 방법에 의해 발견되며, 예를 들어, 부동화된 APP(또는 상기 기술된 형태 중 또 다른 하나)는 핵산 혼합물과 접촉되며, 여기에서 높은 친화성 결합 핵산은 낮은 친화성 결합 핵산으로부터 또는 전혀 결합하지 않은 핵산으로부터 분리된다. 핵산과의 혼합물은 일반적으로 예를 들어 조합 화학에 의해 제조된 핵산 라이브러리이다. 핵산 라이브러리는 다수개의 서로 상이한 핵산을 함유하며, 이러한 핵산에서 적어도 일부 서열 영역에 무작위화(천연 및/또는 비천연 누클레오티드에 의해)가 제공된다. 보존된 서열 영역에는 제공될 필요가 없다. m개의 상이한 누클레오티드로의 n개의 위치에서의 무작위화는 n^m개의 엘레먼트를 갖는 라이브러리를 형성할 것이다.Aptamers for APP are found by the methods described below, for example, immobilized APP (or another one of the forms described above) is contacted with a nucleic acid mixture, where a high affinity binding nucleic acid has a low affinity From a binding nucleic acid or from a nucleic acid that does not bind at all. Mixtures with nucleic acids are generally nucleic acid libraries prepared, for example, by combinatorial chemistry. Nucleic acid libraries contain a number of different nucleic acids, and randomization (by natural and / or non-natural nucleotides) is provided in at least some sequence regions in such nucleic acids. There is no need to provide a conserved sequence region. Randomization at n positions into m different nucleotides will form a library with n^m elements.

APP 특이적 친화성 핵산을 위치시키기 위해, 하기 단계가 수행된다. a) 칼럼(내측으로)에 APP(등)가 적재되고, APP (등)이 칼럼에 부동화되는 단계; b) 핵산 혼합물이 칼럼의 제 1 말단에 적용되어, 칼럼의 제 1칼럼으로부터 제 2 말단으로 칼럼을 통해 흐르는 담체 물질의 정해진 용적 흐름이 제공되는 단계; c) 칼럼의 제 1말단으로부터 증가되는 거리에서 핵산의 APP(등)으로의 친화성이 감소되면서 핵산이 결합되고 부동화되는 단계; d) 칼럼을 통한 담체 물질의 용적 흐름이 정해진 수행 시간 후에 완료되는 단계; e) 칼럼이 칼럼 세그먼트로 수개의 파티션(partition)에 의해 분할되고, 각각의 세그먼트가 관련 수행 경로 좌표를 수용하는 단계; f) 하나 이상의 세그먼트로부터 부동화된 핵산이 비특이적으로 탈착되어 상기 세그먼트와 관련된 수행 경로 좌표의 할당에 의해 회수되는 단계. "칼럼의 내측으로"라는 표현은 루멘 내에 있음을 의미하며 상당히 일반적이다. "칼럼"이라는 표현은 모든 유형의 고체 담체 시스템을 포함하고, 또한 완전히 폐쇄된 것은 아닌 담체 시스템도 가능하다.To locate the APP specific affinity nucleic acid, the following steps are performed. a) loading APP (etc.) into the column (inwardly), and APP (etc.) immobilizing the column; b) a nucleic acid mixture is applied at the first end of the column to provide a defined volume flow of carrier material flowing through the column from the first column to the second end of the column; c) binding and immobilizing the nucleic acid with decreasing affinity of the nucleic acid to APP (etc.) at an increased distance from the first end of the column; d) the volumetric flow of carrier material through the column is completed after a defined run time; e) the column is divided by several partitions into column segments, each segment containing an associated performance path coordinate; f) immobilized nucleic acid immobilized from one or more segments is recovered by assignment of performance pathway coordinates associated with said segment. The expression "inward of a column" means within the lumen and is quite common. The expression "column" includes all types of solid carrier systems, and also carrier systems that are not completely closed.

APP (등)의 부동화는 통상적인 칼럼 크로마토그래피 방법에 따라 수행될 수 있다. 칼럼으로서, 임의의 기계적인 구조는 두개의 말단을 갖는 루멘을 갖는 것으로 나타낼 수 있다. 구조 물질로서는, 칼럼에는 통상적인 모든 물질, 예를 들어 금속, 유리 및/또는 합성물질이 가능하다. 칼럼은 APP- (등) 결합 매트릭스가 내측으로 구비될 수 있고/있거나 구조 물질은 표적 분자의 직접 결합에 적합할 수 있거나 이를 위해 제조된 것이다. 핵산의 혼합물은 다수의, 일반적으로 10⁶ 내지 10²²/Mol, 특히 10¹⁰ 내지 10²¹/Mol의 서로 상이한 핵산 종을 갖는 핵산 라이브러리를 나타낸다. 칼럼에 적용되는 라이브러리에 있어서, 각각의 핵산 종은 통계학적으로 예를 들어 10 내지 10¹⁷, 특히 100 내지 10¹³개의 분자를 나타낸다. 일반적으로 담체 물질은 핵산 라이브러리가 가용성이고 안정한 액체이다. 이를 위해, 핵산 라이브러리에 대해 통상적인 모든 완충액 및 이의 유사물이 적합하다. 담체 물질의 용적 흐름은 핵산 라이브러리를 적용하기 전에 조정될 수 있다. 이후, 핵산 라이브러리는 칼럼의 도입측에서 담체 물질 흐름에 첨가된다. 그러나, 핵산 라이브러리는 또한 직접 첨가될 수도 있다. 칼럼의 셋업 및 조절된 용적 흐름에 의해 결정되는 수행 시간이 경과한 후, 핵산 라이브러리에 의해 가해진 "플러그"는 칼럼의 배출측(확산에 의한 폴딩(folding)에 의해 넓어진)에 다시 "플러그"로부터 분리되고 칼럼에 부동화된 결합된 핵산을 남긴다. 적합하게는, 칼럼을 통한 용적 흐름은 거의 없는 것으로, 또는 비난류형으로, 바람직하게는 층형(칼럼 용적에 대해, 특히 칼럼 단면에 대해 담체 물질의 가속 벡터의 합이 최소, 이상적으로 0임)이 되도록 조절된다. 칼럼내 APP 분자의 전체 수는 일반적으로 적용된 핵산 라이브러리에서의 개별 종의 핵산 분자 수의, 10² 내지 10¹⁶배, 특히 10³ 내지 10¹⁵배일 것이다. APP 분자로의 핵산의 결합은 바람직하게는 예를 들어 온도, 이온 강도, pH 및 완충액 상태에 있어서 적합하게 조절된 적합한 완충액 중에서 아프레시스 동안에 핵산의 후 사용에 상응하는 조건 하에서 일어난다. 이후, 핵산 라이브러리의 용매 뿐만 아니라 담체 물질은 그의 성분과 관련하여 이에 따라 선택되어야 한다. 다수의 칼럼 세그먼트로의 칼럼 분리는 예를 들어, 칼럼을 부분으로 절삭하므로써 수행될 수 있으며, 이러한 절삭 부분은 바람직하게는 용적 흐름 벡터에 대해 직교한다. 그러나, 칼럼은 또한 칼럼 세그먼트로 미리 어셈블링될 수 있으며, 이 경우 어느 한 칼럼 세그먼트는 바람직하게는 용적 흐름 벡터의 방향으로(용적 흐름 벡터에 직교하는 어셈블링 단면) 다음 칼럼 세그럼트와 단단하게 인접한다. 이후, 칼럼 세그먼트의 이미 형성된 복합체를 떼어 놓으므로써 분리가 수행될 수 있다. 충분히 강한 리간드로의 용리에 의해 물리 화학적이거나 열적으로 APP를 치환, 복합 (complexing), 개질 및/또는 분해시키므로써 비특이적 탈착이 수행될 수 있다. 또한, 기계적 공정, 예를 들어, 초음파처리가 탈착을 위해 또는 탈착을 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 상술된 탈착 방법의 조합이 사용될 수 있다. 핵산이 사용된 탈착 방법에 의해 분해되지 않아야 함은 말할 필요도 없다.Passivation of APP (etc.) can be performed according to conventional column chromatography methods. As a column, any mechanical structure can be represented as having a lumen with two ends. As the structural material, the column can be any conventional material, for example metal, glass and / or synthetic. The column may be provided with an APP- (etc.) binding matrix inwards and / or the structural material may be suitable for or prepared for direct binding of the target molecule. Mixtures of nucleic acids represent nucleic acid libraries having a plurality of, generally 10⁶ to 10²² / Mol, in particular 10¹⁰ to 10²¹ / Mol, of different nucleic acid species. In the library applied to the column, each nucleic acid species statistically represents for example 10 to 10¹⁷ , in particular 100 to 10¹³ molecules. Generally, the carrier material is a liquid in which the nucleic acid library is soluble and stable. For this purpose, all buffers and analogs thereof customary for nucleic acid libraries are suitable. The volumetric flow of carrier material can be adjusted before applying the nucleic acid library. The nucleic acid library is then added to the carrier material stream at the inlet side of the column. However, nucleic acid libraries can also be added directly. After the run time, as determined by the column set-up and the regulated volume flow, the "plug" applied by the nucleic acid library is returned from the "plug" back to the column's outlet side (widened by fold by diffusion). Leave bound nucleic acid separated and immobilized on the column. Suitably, there is little volume flow through the column, or in non-flow, preferably layered (the sum of the acceleration vectors of the carrier material is minimal, ideally zero for column volume, in particular for column cross-section). To be adjusted. The total number of APP molecules in the column will generally be 10² to 10¹⁶ times, in particular 10³ to 10¹⁵ times, the number of nucleic acid molecules of the individual species in the applied nucleic acid library. The binding of the nucleic acid to the APP molecule preferably takes place under conditions corresponding to the later use of the nucleic acid during apressis in a suitable buffer suitably adjusted for example in temperature, ionic strength, pH and buffer state. The carrier material as well as the solvent of the nucleic acid library should then be selected accordingly with respect to its components. Column separation into multiple column segments can be performed, for example, by cutting the column into parts, which cutting parts are preferably orthogonal to the volume flow vector. However, the column can also be preassembled into column segments, in which case either column segment is preferably solid in the direction of the volume flow vector (assembly cross section orthogonal to the volume flow vector) with the next column segment. Adjacent. Subsequently, separation may be carried out by separating the already formed complex of the column segment. Nonspecific desorption can be performed by physicochemically or thermally displacing, complexing, modifying and / or degrading APP by eluting with a sufficiently strong ligand. In addition, mechanical processes, such as sonication, can be used for desorption or to enhance desorption. In addition, a combination of the above-described desorption methods may be used. It goes without saying that the nucleic acid should not be degraded by the desorption method used.

상기 기술된 단계는, 핵산 라이브러리가 APP (등)에 대해 본원에 기술된 경우에서 표적 분자에 대한 친화성에 따라 공간적으로 친화성 크로마토그래피에 의해 단백질 혼합물과의 유사체로 분리될 수 있다는 발견에 근거한다. 추가로, 본 발명은 비특이적 탈착에 의해 일어나는 다양한 친화성을 갖는 탈착 핵산의 혼합이, 비특이적 탈착 전에 그 안에 결합된 핵산을 갖는 칼럼이 사실상 친화성 섹션으로 분할된다는 점과, 이에 따라 얻어진 친화성 섹션 또는 칼럼 세그먼트에 결합된 핵산이 각각 예를 들어 PCR 또는 RT-PCT의 범위내에서 간섭하는 리간드 커플링 없이 용이하고 비특이적으로 탈착될 수 있고, 비특이적으로 증폭될 수 있다는 점에서 회피될 수 있다는 발견에 근거한다. 후속되는 물품 선택도 회피된다. 탈착에는 리간드, 특히 고농도의 리간드도 요구되지 않는다, 결국, 실질적으로 모든 결합된, 그리고 이후 탈착된 핵산 분자가 증폭에 이용될 수 있다. 이는 저농도의 핵산으로 수행가능하게 한다. 기본적으로, 통계학적 평균으로, 핵산 라이브러리내 각각의 종이 어느 한 분자에 의해 대표되는 것이라면 이미 충분하다. 칼럼 세그먼트내 APP 분자 수가 통계학적으로 1인 경우, 단일 핵산 종도 표적 분자에 대한 그의 친화성에 따라 분리될 수 있다.The above described steps are based on the discovery that nucleic acid libraries can be separated into analogs with protein mixtures by spatial affinity chromatography, depending on the affinity for the target molecule in the case described herein for APP (etc.). . Further, the present invention provides that the mixing of desorption nucleic acids with various affinity caused by nonspecific desorption results in that the column with the nucleic acid bound therein is separated into affinity sections in effect before the nonspecific desorption, and thus the affinity section obtained Or in the discovery that the nucleic acid bound to the column segment can be easily and nonspecifically desorbed and nonspecifically amplified without interfering ligand coupling, for example within the scope of PCR or RT-PCT. Based. Subsequent item selection is also avoided. Desorption also does not require ligands, especially high concentrations of ligands. Consequently, substantially all bound and then desorbed nucleic acid molecules can be used for amplification. This makes it possible to perform with low concentrations of nucleic acid. Basically, by statistical mean, each species in the nucleic acid library is already sufficient if it is represented by either molecule. If the number of APP molecules in the column segment is statistically 1, single nucleic acid species may also be separated according to their affinity for the target molecule.

본 발명의 방법의 특정의 이점을 이하 기재하고자 한다. 친화성에 따른 핵산의 분리는 한 컬럼 세그먼트중의 핵산이 상이한 특이성을 지니면서 유사한 친화성을 지니게 되는 결과를 초래한다(APP의 상이한 영역이 APP 친화성 핵산에 의해서 결합되거나 APP 친화성 핵산을 위한 결합 부위이다).Particular advantages of the process of the invention are described below. Separation of nucleic acids according to affinity results in the nucleic acids in one column segment having different specificities and similar affinity (different regions of APP are bound by APP affinity nucleic acid or binding for APP affinity nucleic acid). Site).

기본적으로는, 요구된 친화성이 부여된 한 세그먼트가 탈착을 위해서 추가로 처리되면 충분하다. 그러나, 이를 위한 선결요건은, 체적 흐름 벡터에 대한 상관관계에서 첫 번째 컬럼 세그먼트가 추가로 처리되는 최대 친화성의 경우를 제외하고는 적용된 핵산 라이브러리에서의 친화성 분포를 알아야 한다. 따라서, 일반적으로, 회수된 핵산에 대한 각 세그먼트의 작동-경로 좌표를 각각 할당하면서, 각각의 세그먼트의 고정화된 핵산은 개별적으로 탈착되고 회수될 수 있는 것이 바람직하다.Basically, it is sufficient that one segment has been further processed for desorption given the required affinity. However, a prerequisite for this should be to know the affinity distribution in the applied nucleic acid library, except in the case of maximum affinity where the first column segment is further processed in the correlation to the volume flow vector. Thus, in general, it is preferred that the immobilized nucleic acid of each segment can be detached and recovered separately, respectively assigning the action-path coordinates of each segment to the recovered nucleic acid.

기본적으로는, 모든 형태의 탈착이 가능하다. 바람직하게는, 비특이적 탈착이 통상의 물리화학적 또는 열적 방법에 의해서 수행된다. 열적 탈착은 컬럼 세그먼트, 또는 그 안에 있는 용액을 각각 가열함으로써 수행된다. 가열은 전기적 가열 또는 마이크로파의 조사 또는 IR에 의해서 수행될 수 있다. PCR 기술로부터의 가열 기술이 특히 적합하다. 폴리머라제에 의한 핵산, 또는 압타머(aptamer)의 증폭 이외에, 그 밖의 증폭 방법이, 예를 들어, 리가아제에 의한 방법이 이용될 수 있다. 비특이적 탈착은 APP의 화학적 변화, 예를 들어, 과요오드산 나트륨 등에 의한 산화, 또는 비특이적 복합체 형성, 예를 들어, 보레이트 등에 의해서 탄수화물중의 시스-트랜스 디올 결합을 차단함으로써 보조될 수 있다.Basically, all forms of desorption are possible. Preferably, nonspecific desorption is carried out by conventional physicochemical or thermal methods. Thermal desorption is performed by heating each of the column segments, or solutions therein. Heating can be performed by electrical heating or by irradiation of microwaves or IR. Particularly suitable are heating techniques from PCR techniques. In addition to the amplification of the nucleic acid or aptamer by the polymerase, other amplification methods may be used, for example, by the ligase. Nonspecific desorption can be assisted by blocking cis-trans diol binding in carbohydrates by chemical alteration of APP, eg, oxidation with sodium periodate or the like, or by nonspecific complex formation, eg, borate or the like.

따라서, 비특이적 탈착이 PCR 또는 RT-PCR의 바람직하게는 연장된 고온상에서 열적 탈착에 의해 수행되는 경우가 바람직하다. 그 결과, 상승 효과가 달성되며, 그 이유는 일반적으로 특히 낮은 농도의 핵산 종에서 핵산 라이브러리로 작업하는 경우, 증폭이 요구되기 때문이다. 수율을 높이기 위해서, 예를 들어, 5 내지 60, 바람직하게는 20 내지 60, 가장 바람직하게는 45 내지 55 사이클로 수행된다. 증폭의 범위내에서, 하나 이상의 표지된 프라이머로 작업하는 것이 가능하다. 프라이머는 하나 이상의 내인성뉴클레아제 분해부위를 지닐 수 있다. 그러한 분해 부위는, 예를 들어, 증폭된 물질을 프라이머 서열의 더 큰 영역으로부터 유리시키는 역할을 한다. 프라이머 내에 있거나 소정의 핵산 중에 있는 뉴클레오티드 형성 블록은 형광염료에 의해서 표지될 수 있다. 형광 염료로서, 예를 들어, 알렉사 TM 플루오린 488(Alexa TM Fluorine 488), 플루오린 532, 플루오린 546, 플루오린 568, 플루오린 594, 오레곤 그린 488(Oregon Green 488), 플루오레세인(Fluoresceine), 로다민 6G, 테트라메틸로다민, 로다민 B 및 텍사스 레드(Texas Red)가 언급될 수 있다. 증폭된 물질은, 변화 동안 도입된 그룹이 적합하여 각각 상이한 친화성 매트릭스에 리간드로서 결합될 수 있는 한, 상이한 단부에서 두 가지의 상이한 화학적 변화에 의해서 표지될 수 있다.Thus, it is preferred if the nonspecific desorption is carried out by thermal desorption on a preferably extended high temperature of PCR or RT-PCR. As a result, a synergistic effect is achieved, because amplification is generally required, especially when working with nucleic acid libraries at low concentrations of nucleic acid species. In order to increase the yield, for example, it is carried out in 5 to 60, preferably 20 to 60, most preferably 45 to 55 cycles. Within the scope of amplification, it is possible to work with one or more labeled primers. The primer may have one or more endogenous nuclease cleavage sites. Such cleavage sites serve to release, for example, the amplified material from a larger region of the primer sequence. Nucleotide forming blocks in the primer or in a given nucleic acid can be labeled with a fluorescent dye. As fluorescent dyes, for example, Alexa ™ Fluorine 488, Fluorine 532, Fluorine 546, Fluorine 568, Fluorine 594, Oregon Green 488, Fluoresceine ), Rhodamine 6G, tetramethyltamine, rhodamine B and Texas red may be mentioned. The amplified material can be labeled by two different chemical changes at different ends, as long as the groups introduced during the change are suitable and can each be bound as ligands to different affinity matrices.

비친화성 또는 저친화성 핵산의 신뢰 가능한 분리를 위해서는, 적합한 방법 스테이지 사이에 세척 단계를 도입시키는 것이 권장가능하다. 특히, 1회 이상의 세척단계가 단계 d) 내지 e) 사이에 수행되면 바람직하다. 세척의 경우, 예를 들어, 용매, 또는 핵산 라이브러리의 매질, 또는 담체 물질이 각각 적합하다.For reliable separation of non-affinity or low affinity nucleic acids, it is advisable to introduce washing steps between suitable process stages. In particular, it is preferred if at least one washing step be carried out between steps d) to e). For washing, for example, a solvent, or a medium of a nucleic acid library, or a carrier material are respectively suitable.

APP(등)에 의한 컬럼의 내부 코팅 및 이의 고정이, 바람직하게는 높은 화학적 반응성 기(예, 트레실 클로라이드, 시아노브로마이드 및/또는 과요오드산염)에 의한 활성화 후에 공유결합에 의해서, 또는 화학적으로 낮은 반응성 기(예, 아민, 히드록시, 케토 및/또는 카르복실)로 변화된 후에 이작용성 스페이서 링크를 통해서 수행되는 것이 바람직하다. 적합한 스페이서 링크를 위한 스페이서 주쇄의 예는 치환된 및 비치환된 C₂-C₁₀알킬기, 치환된 및 비치환된 C₂-C₁₀알케닐기, 치환된 또는 비치환된 C₂-C₁₀알키닐기, 치환된 및 비치환된 C₄-C₇ 카르보시클로알킬기, 치환된 및 비치환된 C₄-C₇ 카르보시클로알케닐기, 치환된 및 비치환된 C₇-C₁₄ 아르알킬기, 및 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자를 지니는 헤테로시클릭 분자이고, 여기서, 치환체는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 티올, 티오알콕시, 히드록실, 아릴, 벤질, 페닐, 니트로, 할로겐, 2 내지 10개의 탄소원자와 1 내지 4 개의 산소 또는 황 원자를 지니는 에테르기, 폴리알킬글리콜, 할로겐, 히드록실, 티올, 케토, 카르복실, 아미드, 에테르 화합물, 티오에테르, 아미딘 유도체, 구아니딘 유도체, 글루타밀 유도체, 니트레이트(ONO₂), 니트로(NO₂), 니트릴, 티오플루오로메틸(-CF₃), 트리플루오로메톡시(-OCF₃), O-알킬, S-알킬, NH-알킬, N-디알킬, O-아르알킬, S-아르알킬, NH-아르알킬, 아미노, 아지도(N₃), 히드라지노(NHNH₂), 히드록실아미노(ONH₂), 술폭시드(SO), 술폰(SO₂), 술피드(S-), 디술피드(S-S), 실릴로 이루어질 수 있다. 전형적으로는, 스페이서 링크는 이작용성이며, 그러한 작용성은 동일하거나 상이할 수 있으며, 예를 들어, "N-히드록시숙신이미드 및 히드라지드"로 이루어진 군으로부터 선택된다.Internal coating of the column by APP (etc.) and its immobilization are preferably by covalent bonding after activation by high chemically reactive groups (eg tresyl chloride, cyanobromide and / or periodate), or chemically Preferably through a bifunctional spacer link after being changed to a low reactive group (e.g., amine, hydroxy, keto and / or carboxyl). Examples of spacer backbones for suitable spacer links are substituted and unsubstituted C₂ -C₁₀ Alkyl group, substituted and unsubstituted C₂ -C₁₀ Alkenyl groups, substituted or unsubstituted C₂ -C₁₀ Alkynyl groups, substituted and unsubstituted C₄ -C₇ carbocycloalkyl groups, substituted and unsubstituted C₄ -C₇ carbocycloalkenyl groups, substituted and unsubstituted C₇ -C₁₄ aralkyl groups, And heterocyclic molecules having heteroatoms selected from nitrogen, oxygen, and sulfur, wherein the substituents are alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, thiol, thioalkoxy, hydroxyl, aryl, benzyl, phenyl, nitro, halogen, Ether groups having 2 to 10 carbon atoms and 1 to 4 oxygen or sulfur atoms, polyalkylglycol, halogen, hydroxyl, thiol, keto, carboxyl, amide, ether compound, thioether, amidine derivative, guanidine derivative , Glutamyl derivatives, nitrates (ONO₂ ), nitro (NO₂ ), nitrile, thiofluoromethyl (-CF₃ ), trifluoromethoxy (-OCF₃ ), O-alkyl, S-alkyl, NH- Alkyl, N-dialkyl, O-aralkyl, S-aralkyl, NH-aralkyl, amino, azi (N_3), may be formed of a hydrazino (NHNH_2), hydroxyl amino (ONH_2), sulfoxide (SO), sulfone (SO_2), sulfide (S-), disulfide (SS), silyl . Typically, the spacer link is difunctional, and such functionality may be the same or different, eg selected from the group consisting of "N-hydroxysuccinimide and hydrazide".

하나 이상의 컬럼 세그먼트로부터 얻을 수 있는 핵산내의 다양성을 감소시키기 위해서, 각각의 컬럼 세그먼트가 통계적 평균으로 0.1 내지 10³, 바람직하게는 1 내지 10², 가장 바람직하게는 1 내지 10개의 APP (등) 분자를 함유하는 것이 바람직하다. 이와 연관되어, 적용되는 핵산 라이브러리는 이의 통계적 평균으로 0.1 내지 10³, 바람직하게는 1 내지 10², 가장 바람직하게는 1 내지 10개의 한 종의 핵산분자를 함유할 수 있다.In order to reduce the diversity in nucleic acids that can be obtained from one or more column segments, each column segment has a statistical mean of 0.1 to 10³ , preferably 1 to 10² , most preferably 1 to 10 APP (etc.) molecules. It is preferable to contain. In this connection, the nucleic acid library applied may contain from 0.1 to 10³ , preferably from 1 to 10² , most preferably from 1 to 10 one species of nucleic acid in its statistical mean.

컬럼의 구조 물질에 있어서, 기본적으로는 친화성 크로마토그래프로부터 공지된 모든 물질이 이용될 수 있다. 이들 중에는 실리카겔 또는 폴리머 컬럼, 예컨대, 화학적 유도체화 또는 플라즈마 활성화에 의해서 활성화된 후의 폴리에틸렌 컬럼이 있다. 컬럼 세그먼트의 길이는 적합하게는 0.1　㎛ 내지 1　mm, 바람직하게는 0.1 내지 100　㎛, 가장 바람직하게는 0.5 내지 10　㎛의 범위내에 있다. 그러한 섹션은 예를 들어, 마이크로톰에 의해서 용이하게 제조될 수 있다. 컬럼의 내경은 적합하게는 0.05 내지 1　mm, 바람직하게는 0.1 내지 0.5　mm, 가장 바람직하게는 0.2 내지 0.4　mm의 범위 내에 있다.For the structural material of the column, basically all materials known from affinity chromatography can be used. Among these are silica gel or polymer columns such as polyethylene columns after being activated by chemical derivatization or plasma activation. The length of the column segment is suitably in the range of 0.1 μm to 1 μm, preferably 0.1 to 100 μm and most preferably 0.5 to 10 μm. Such a section can be easily manufactured by, for example, a microtome. The inner diameter of the column is suitably in the range from 0.05 to 1 mm 3, preferably from 0.1 to 0.5 mm mm, most preferably from 0.2 to 0.4 mm mm.

바람직하지 않은 핵산은 핵산의 분리(결합 또는 기계적 분리) 전에 제거되는 것이 적합하다. 바람직하지 않은 핵산은, 예를 들어, 컬럼의 APP-유리 내부 표면에 결합하는 핵산이다. 이어서, APP-유리 컬럼은 상향류로 제공될 수 있으며, 핵산 라이브러리가 우선적으로 그러한 컬럼을 통해서 유도된다.Undesirable nucleic acids are suitably removed prior to separation (binding or mechanical separation) of the nucleic acid. Undesirable nucleic acids are, for example, nucleic acids that bind to the APP-glass inner surface of the column. The APP-free column can then be provided upstream, and the nucleic acid library is primarily driven through such column.

상기된 유형의 방법에 있어서, 작업은, 예를 들어, 연속적으로 연결된 컬럼에 의해서 연속적이거나, 예를 들어, 선행 컬럼으로부터의 용리액의 간헐적 수거에 의해서 불연속일 수 있다.In the method of the type described above, the operation can be continuous, for example by a continuously connected column, or discontinuous, for example by intermittent collection of the eluent from the preceding column.

친화성 분리를 더 개선시키기 위해서, 기본적으로는 다양한 방식으로 진행시킬 수 있다. 임의적으로 증폭 후에 하나 또는 수개의 세그먼트로부터 탈착된 핵산이 본 발명의 방법에 반복적으로 적용될 수 있고/거나, 탈착 동안의 용리 조건을 상승시킬 수 있다(온도, 이온 강도, pH, 완충 조건). 또한, 컬럼 세그먼트내의 APP의 공간 밀도, 및 그에 따른 결합된 핵산의 공간 밀도, 즉, APP 분자의 수를 감소시킬 수 있다.In order to further improve affinity separation, it can basically proceed in various ways. Nucleic acid desorbed from one or several segments optionally after amplification can be repeatedly applied to the methods of the invention and / or elute conditions of elution during desorption (temperature, ionic strength, pH, buffer conditions). It is also possible to reduce the spatial density of APP in the column segment, and hence the spatial density of the bound nucleic acid, ie the number of APP molecules.

APP-결합 압타머(상기된 본 발명에 따르면, Aβ₄₂-결합 압타머를 포함)는 본 발명의 범위내에 있는 바람직한 APP-결합 수용체이다.APP-binding aptamers (according to the invention described above, including Aβ₄₂ -binding aptamers) are preferred APP-binding receptors within the scope of the present invention.

본 발명에 따르면, 펩티드, 항체 또는 핵산으로 구성되는 APP-결합 수용체가 알츠하이머(위험) 환자에서의 APP 및 이의 단백질 분해 생성물의 체외 제거를 위한 적합한 담체 물질로 사용된다.According to the present invention, APP-binding receptors consisting of peptides, antibodies or nucleic acids are used as suitable carrier materials for the in vitro removal of APP and its proteolytic products in Alzheimer's (danger) patients.

의학적 경로의 실행에서 본 발명을 이용하는 경우, 담체는 무균이며 비발열성이어야 하며, 이러한 요건에 부합되는 임의의 담체 물질 또는 수용체/담체 조합물이 본 발명에 바람직하다(참조예, US 6,030,614 또는 US 5,476,715). 적합한 예로서는, EP 110　409　A 및 DE 36　17　672　A에 기재된 바와 같은, 비닐 함유 단량체(예, 아크릴산, 예컨대, TSK 토요피얼(TSK Toyopearl), 프락토겔 TSK(Fractogel TSK))의 기공성 호모폴리머, 코- 또는 터-폴리머, 옥시란 함유 화합물(예, 에피클로로히드린)로 변화(활성화)되고 임의로 NH₃, 아미노 또는 카르복실 함유 화합물과 추가로 반응한 담체, 또는 CNBr 또는 CNCl 흡착제가 있다 (EP 10 409A 및 DE 36 17 672A). 치료 목적으로 특히 바람직한 흡착 물질은 혈구의 손실을 방지하기에 적합하며, 보체계를 활성화시키지 않거나 약간만 활성화시키며, 가능한 한 먼 체외 순환에서의 응집체 형성을 방지한다. 또한, 사용된 담체 물질은, 바람직하게는, 수용체에 결합되는 경우 무균화 과정에 대해서, 특히 에틸렌-옥시드 포화, 글루타르알데히드 포화, 감마-조사, 증기 처리, UV 처리, 용매 처리 및/또는 세정제 처리 등에 대해서 충분히 안정해야 한다. 입수 가능한 형태의 APP-결합 수용체의 결합을 위한 적합한 작용기를 포함하는 세파로스(sepharose), 아가로스(agarose), 아크릴, 비닐, 덱스트란 등을 기재로 하는 생성물이 사용될 수 있다. 추가의 적합한 담체는 모노리스(monolith) (가교된 글리시딜-메타크릴레이트-코-에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트-폴리머를 기재로 하는 담체) 수폴(Supol)을 포함한다[문헌: Poschalko et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, Nov. 5; 125 (44): 13415-26].When using the present invention in the practice of a medical route, the carrier must be sterile and nonpyrogenic, and any carrier material or receptor / carrier combination that meets these requirements is preferred in the present invention (see, eg, US 6,030,614 or US 5,476,715). ). Suitable examples are pore homopolymers of vinyl-containing monomers (eg acrylic acid such as TSK Toyopearl, Fractogel TSK), as described in EP 110 409 A and DE 36 17 672 A. , Co- or ter-polymers, carriers that have been converted (activated) to oxirane containing compounds (eg epichlorohydrin) and optionally further reacted with NH₃ , amino or carboxyl containing compounds, or CNBr or CNCl adsorbents. (EP 10 409A and DE 36 17 672A). Particularly preferred adsorbent materials for therapeutic purposes are suitable for preventing the loss of blood cells, do not activate or only slightly activate the complement system, and prevent the formation of aggregates in the extracorporeal circulation as far as possible. In addition, the carrier material used is preferably for sterile processes when bound to the receptor, in particular for ethylene-oxide saturation, glutaraldehyde saturation, gamma-irradiation, steam treatment, UV treatment, solvent treatment and / or It should be sufficiently stable against detergent treatment and the like. Products based on sepharose, agarose, acrylic, vinyl, dextran, and the like, including suitable functional groups for binding of available forms of APP-binding receptors can be used. Further suitable carriers include monolith (carrier based on crosslinked glycidyl-methacrylate-co-ethylene glycol dimethacrylate-polymer) Supol (Poschalko et al. , J. Am. Chem. Soc. 2003, Nov. 5; 125 (44): 13415-26.

수용체를 적합한 담체에 결합시키는 경우, 당업자에게 공지된 화학 작용 (예, Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Ed., Academic Press Inc., San Diego, CA, 1995, 785pp.)이 이용될 수 있다.When binding the receptor to a suitable carrier, chemical reactions known to those skilled in the art (eg, Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Ed., Academic Press Inc., San Diego, CA, 1995, 785 pp.) Can be used.

추가의 양태에서, 본 발명은, 각 환자의 치료를 위한 장치를 적합하게 제작함으로써, 알츠하이머 병을 치료하기 위한 또는 치료 설비를 제공하기 위한, 또는 이러한 질환을 예방하기 위한 본 장치의 용도에 관한 것이다. 그러한 치료를 수행하는 경우, 환자는 APP 폴리펩티드를 효과적으로 제거하기에 충분한 시간 동안 아페레시스(apheresis) 장치에 연결되며, 여기서, 환자의 혈류 또는 혈장류가 APP-결합 수용체를 포함하는 고형 담체와 접촉되며, 이때 APP 및/또는 APP의 단백질 분해 생성물, 특히 Aβ₄₂가 결합된다. 아페레시스 처리 동안에, 물론, 말초 또는 중추정맥 삽입기기(peripheral or central-venous vein access) 또는 동정맥루는 충분히 항응집되어야 하며, 요국되는 정량화 및 측정 데이타가 기록되어야 한다. 또한, 대부분 아페레시스 방법에서, 혈장 및 혈구의 일차 분리는 적합한 혈장 처리전에 요구될 것이다. 예방적 측정이 요구되는 특정의 사람은 혈통적 원인이 있는 사람, 노년(연령 >50, >60 또는 >70) 또는 AD에 대한 위험 인자, 특히 유전적 인자가 있는 사람이다.In a further aspect, the present invention relates to the use of the device to treat Alzheimer's disease or to provide a treatment facility or to prevent such a disease by suitably fabricating a device for the treatment of each patient. . When performing such treatment, the patient is connected to an apheresis device for a time sufficient to effectively remove the APP polypeptide, wherein the patient's blood or plasma is in contact with a solid carrier comprising an APP-binding receptor. Wherein the APP and / or proteolytic product of APP, in particular Aβ_42, is bound. During aperesis treatment, of course, peripheral or central-venous vein access or arteriovenous fistula should be sufficiently anti-aggregated and critical quantification and measurement data recorded. In addition, in most aperesis methods, primary separation of plasma and blood cells will be required prior to appropriate plasma treatment. Certain people in need of prophylactic measures are those with pedigree causes, old age (age>50,> 60 or> 70) or risk factors for AD, particularly those with genetic factors.

본 발명은 도면뿐만 아니라 이하 실시예로 상세히 설명될 것이며, 이는 본 발명을 제한하는 것이 아니다.The invention will be described in detail in the following examples as well as in the drawings, which do not limit the invention.

도 1은 펩티드 1208(BSA에 결합되고 ELISA 플레이트에 코팅됨)로의 Aβ₄₂ 의 결합을 나타낸다.1 shows binding of Aβ₄₂ to peptide 1208 (bound to BSA and coated on an ELISA plate).

도 2는 Aβ₄₂(ELISA 플레이트에 코팅됨)로의 펩티드 1208(및 1208-BSA)의 결합을 나타낸다.2 shows binding of peptide 1208 (and 1208-BSA) to Aβ₄₂ (coated on an ELISA plate).

도 3은 1208-BSA로의 Aβ₄₂의 경쟁적 결합을 나타낸다.3 shows competitive binding of Aβ₄₂ to 1208-BSA.

1. APP 수용체 수반 담체의 생산1. Production of APP Receptor Carrier

1.1 모노리틱 컬럼1.1 monolithic columns

CIM^® 에폭시 모노리틱 컬럼(BIA 분리, SI)을 제조자의 지시에 따라서 pH8.0의 0.5　m Na 포스페이트 완충액으로 평형시키고, 제조자의 지시에 따라서 Aβ 펩티드에 대한 단일클론성 항체를 활성화시키고, CIM 컬럼에 커플링시켰다. 컬럼을 포스페이트 완충액(+ 1　M NaCl)으로 수회 세척하고, 과량의 에폭시기를 임의로 차단하였다.Equilibrate the CIM^® epoxy monolithic column (BIA separation, SI) with 0.5 m Na phosphate buffer at pH 8.0 according to the manufacturer's instructions, activate the monoclonal antibody against the Αβ peptide according to the manufacturer's instructions, and CIM column Coupled to. The column was washed several times with phosphate buffer (+ 1 M NaCl) and optionally blocked excess epoxy groups.

세척 및 평형 용리액중의 검사에 의해서 품질을 검사하고; 용리액중에 활성 에폭시기와 항체 유출이 없는 단지 산이 아페레시스 장치에 추가로 사용되며 설치된다.Quality is checked by inspection in washes and equilibrium eluates; Only acids without active epoxy groups and antibody effluents in the eluate are used and installed in addition to the aperesis device.

1.2 세파로스 컬럼1.2 Sepharose Column

아가로스 벌크 물질(세파로스 CL4B)을 무균이며 비발열 용기에 무균하게 넣고, 물질을 무균하에 세척하고, 겔 물질을 각각의 세척 단계 사이에 완전히 건조시켰다. 후속하여, 세파로스를 오토클레이브중에서 115℃에서 30분 동안 증기 살균하였다.The agarose bulk material (Sepharose CL4B) was aseptically placed in a sterile, non-heated vessel, the material was washed aseptically and the gel material was completely dried between each wash step. Subsequently, Sepharose was steam sterilized at 115 ° C. for 30 minutes in an autoclave.

살균 후에, 세파로스를 60% 아세톤/물중의 무균 용기에 취하고, CNBr 및 트리에틸아민(96ml의 아세톤당 14　g의 CNBr; 66.2　ml의 87% 아세톤중의 30　ml의 트리에틸아민)으로 활성화시켰다. 이어서, 아세톤/HCl 용액을 가하였다(392　ml의 무균이며 비발열성 물; 16.3　ml의 5N HCl, 408　ml의 아세톤). 활성화된 세파로스를 세척하고 활성화된 기의 가수분해를 방지하기 위해서 2 시간 이내에 커플링 반응에 공급하였다.After sterilization, Sepharose was taken into a sterile container in 60% acetone / water and activated with CNBr and triethylamine (14 μg CNBr per 96 mL acetone; 30 μL triethylamine in 66.2 mL 87% acetone). . Acetone / HCl solution was then added (392 ml sterile, nonpyrogenic water; 16.3 ml 5N HCl, 408 ml acetone). Activated Sepharose was washed and fed to the coupling reaction within 2 hours to prevent hydrolysis of the activated groups.

무균-여과된 항체 용액(각각 m266 및 m243)을 반응 용기에 도입하고, 90분 이상 동안 교반하였다. 최종적으로, 반응 용액을 용리액에서 반응 생성물이 검출되지 않을 때까지 완전히 세척하고(등장성 포스페이트 완충액으로), 항체 커플링된 세파로스를 유리 소결시키면서 무균 및 탈발열성물질화된 유리 컬럼에 충전하고, 최종 품질 검사를 하였다(반응 생성물, 및 중금속 등에 대한 용리액 분석; 입자 분석, 발열원성; 무균성).Sterile-filtered antibody solutions (m266 and m243, respectively) were introduced into the reaction vessel and stirred for at least 90 minutes. Finally, the reaction solution is washed thoroughly (no isotropic phosphate buffer) in the eluent until no reaction product is detected, and the antibody coupled Sepharose is charged into a sterile and depyrogenic glass column while glass sintering, and the final Quality checks were made (elution analysis for reaction products, heavy metals, etc .; particle analysis, pyrogenicity; aseptic).

2. 알츠하이머 환자의 아페레시스 처리를 위한 동물 모델2. Animal Models for Aperesis Treatment in Alzheimer's Patients

당뇨병 "게르하트 캐츠(Gerhardt Katsch)"에 대한 연구에서, 작은 동물 모델 래트에서 아페레시스 치료를 위한 소형의 체외 시스템이 개발되었다. 세계적으로, 그러한 아페레시스 시험 시스템은 아주 제한적인 범위로만 이용되고 있다. 동일한 시험 동물에 대한 반복된 아페레시스 처리 및 치료의 성공을 평가하는 후속 기간에서의 후속된 시험은 아주 새로운 시험이며 국제 공개문헌에서는 기재된 바 없다.In the study of diabetes "Gerhardt Katsch", a small in vitro system for the treatment of aperesis in small animal model rats was developed. Globally, such aperesis test systems are only used in a very limited range. Subsequent trials in subsequent periods of evaluating the success of repeated aperesis treatments and treatments for the same test animal are brand new trials and have not been described in international publications.

아페레시스는 체외 혈액으로부터 병원성 물질이 추출되는 또 다른 치료 방법이다. 인간 의학에서, 이러한 아페레시스는 100 가지 이상의 질환의 치료에 대해서 사용되어 왔다. 아페레시스의 도움으로, 질환 관련 물질이 완전히 또는 적어도 부분적으로 자가 면역 질환, 예컨대, 류마티스 관절염, 중증근육무력증, 내분비성 눈병증, 다발성 경화증, 전신 루프스 홍반, 스티프-맨 증후군(Stiff-Man Syndrome), 및 타입 1 당뇨병중의 혈액i.a.로부터 제거될 수 있다. 지금까지, 그러나 아페레시스는 감염된 환자의 생활의 질이 아주 부담되고 현저하게 저하되는 치료 내성의 만성 질환의 치료를 위한 또 다른 방법으로만 허용되고 있다. 그러한 실질적인 이유는 성공적인 아페레시스 치료법의 작용 기전에 관한 상세한 지식이 없다는 것이다.Aperesis is another method of treatment in which pathogenic substances are extracted from extracorporeal blood. In human medicine, such aperesis has been used for the treatment of more than 100 diseases. With the help of aperesis, the disease-related substance is completely or at least partially autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, myasthenia gravis, endocrine ophthalmopathy, multiple sclerosis, systemic lupus erythema, Stiff-Man Syndrome ), And blood ia intype 1 diabetes. To date, however, aperesis has only been allowed as another method for the treatment of chronic diseases of treatment resistance, in which the quality of life of the infected patient is very burdened and markedly degraded. The practical reason is that there is no detailed knowledge of the mechanism of action of successful aperesis therapy.

예를 들어, 타입 I 당뇨병 및 류마티스 관절염 둘 모두에 대한 알려진 동물 모델을 사용함으로써 아페레시스 방법의 작용 기전이 추가로 명백해질 수 있으며 아페레시스 치료에 대한 신규한 방법이 예비 임상적으로 시험될 수 있다. 아페레시스 치료를 수행하기 위해서, 시험 동물에게 우선 영구적인 혈관 카테터를 장착한다. 체외 순환에서, 혈액의 혈장 및 세포 성분이 혈장 필터에 의해서 분리된다. 세포 성분은 동물에게 즉각적으로 재주입되면서, 혈장은 재주입되기 전에 다양한 흡착 방법(면역흡착 및 그 밖의 방법)으로 정제될 수 있다. 그러한 반복된 아페레시스 치료의 양호한 관용성은 상이한 래트종(체질량, 헤마토크릿, 일반적인 조건)에서 이미 입증되었다. 아페레시스 시험 시스템은 최소 체충 250g의 동물에서 시험되고, 래트 모델에서 자가면역 질환에 대해서 사용되었다(타입 I 당뇨병, 콜라겐 타입 II-유도된 관절염).For example, by using known animal models for both type I diabetes and rheumatoid arthritis, the mechanism of action of the aperesis method may be further clarified and new methods for the treatment of aperesis may be preclinically tested. Can be. To perform aperesis treatment, the test animal is first equipped with a permanent vascular catheter. In the extracorporeal circulation, plasma and cellular components of blood are separated by plasma filters. As the cellular components are immediately reinjected into the animal, the plasma can be purified by various adsorption methods (immunosorption and other methods) before being reinjected. Good tolerance of such repeated aperesis treatments has already been demonstrated in different rat species (body mass, hematocrit, general conditions). The Aperesis test system was tested in animals of at least 250 g of worms and was used for autoimmune diseases in rat models (type I diabetes, collagen type II-induced arthritis).

작은 동물 모델에서의 혈장아페레시스를 위한 체외 시스템은 상이한 형태의 흡착을 위해서 사용될 수 있다. 만성 질환에 대한 모델에서의 이러한 시험 시스템의 이용은 (A) 새로운 치료 및 예방 방법의 시험, 및 상이한 아페레시스 기술의 작용 기전의 설명, 및 (C) 각각의 아페레시스 치료법을 위한 처방의 결정을 가능하게 한다. IDK는 새롭게 개발된 아페레시스 방법의 임상전 시험에서의 적격의 파트너이며, 동물 실험에서의 시험을 통한 개발단계로부터 환자에서의 임상 적용까지 새로운 치료 방법의 이전과 마케팅에 근본적으로 기여할 수 있다(http://www.praeklinik.de/).In vitro systems for plasma aperesis in small animal models can be used for different forms of adsorption. The use of this test system in a model for chronic disease may include (A) testing new therapeutic and prophylactic methods, explaining the mechanism of action of different aperesis techniques, and (C) prescribing prescriptions for each aperesis treatment. Make the decision possible. IDK can fundamentally contribute to the newly Oh and qualified partner in Peregrine Systems How preclinical testing of the development, transfer and marketing of new treatments to clinical application in patients from the development stage through testing in laboratory animals(http http://www.praeklinik.de/ ).

실험적인 아페레시스 치료법을 개시하기 전에 동물에게 동맥 및 정맥 카테터가 제공되거나, 영구적으로 카테터 처리된 래트(시험 물질을 적용 및 혈액 샘플을 채집할 뿐만 아니라 동물 모델에서의 아페레시스 치료 및 클램프 시험을 수행하기에 적합한 혈관 카테터)가 이용된다. 아페레시스에서, 초기 혈구와 혈장은 제 1 단계에서 혈장 필터에 의해서 분리된다. 혈구는 동물에게 즉시 재주입되면서(정맥 카테터를 통해서), 분리된 혈장은 동물에게 재주입되기 전에 실시예 1에서 제조된 흡착 수단을 통해서 유도된다(여기서, 리간드는 고정된 친화성 펩티드에 결합시킴으로써 혈장으로부터 분리된다).Arterial and venous catheters are given to animals prior to initiating experimental aperesis therapy, or permanently catheterized rats (application of test substance and collection of blood samples as well as aperesis treatment and clamp testing in animal models) Vascular catheters suitable for carrying out this) are used. In aperesis, the initial blood cells and plasma are separated by a plasma filter in the first stage. The blood cells are immediately reinjected into the animal (via the venous catheter), and the separated plasma is derived through the adsorption means prepared in Example 1 before being reinjected into the animal (wherein the ligand is bound to an immobilized affinity peptide by Separated from plasma).

3. Aβ₄₂ 압타머3.Aβ₄₂ Aptamer

3.1 트레실 클로라이드에 의한 실리카겔 컬럼의 활성화3.1 Activation of Silica Gel Columns by Tresyl Chloride

컬럼을 아세톤으로 세정한다. 활성화를 위해, 무수 용액(2　ml의 아세톤, 1　ml의 트레실 클로라이드, 피리딘 수 방울)이 컬럼을 통과하고(컬럼 용적의 10 배) 얼음 상에서 밤새 인큐베이팅된다. 이어서, 컬럼을 컬럼 용적의 20 배의 100% 아세톤(무수)으로 세정한다. 활성화된 컬럼을 1　mM HCl중에 저장한다.The column is washed with acetone. For activation, anhydrous solution (2 mL of acetone, 1 mL of tresyl chloride, a few drops of pyridine) is passed through the column (10 times the column volume) and incubated on ice overnight. The column is then washed with 20% 100% acetone (anhydrous) twice the column volume. The activated column is stored in 1 μm HCl.

3.2 폴리에틸렌 컬럼의 활성화3.2 Activation of Polyethylene Columns

실온에서, 폴리에틸렌 튜브를 컬럼 용적의 20배의 용액(진한 황산(H₂SO₄)중의 2% 과망간산칼륨(KMnO₄) (w/v))으로 세정하고, 이어서, 증류수로 세정한다. 컬럼 표면의 추가의 커플링 전에, 적어도 하나 이상의 반응성 알테히드기(예, 1% 글루타르알데히드)를 지니는 이가 및 다가 분자가 가교를 위해서 사용된다. 이들을 4℃에서 1 시간 동안 컬럼에 통과시킨다. 이어서, 반응이 환원 조건, 예를 들어, 나트륨 시아노보로히드라이드(0.15　M NaCl중의 0.00025% w/v, pH 3.9)에 의해서 안정화된다.At room temperature, the polyethylene tube is washed with 20 times the volume of the column volume (2% potassium permanganate (KMnO₄ ) (w / v) in concentrated sulfuric acid (H₂ SO₄ )), followed by distilled water. Prior to further coupling of the column surface, divalent and polyvalent molecules with at least one reactive aldehyde group (eg 1% glutaraldehyde) are used for crosslinking. They are passed through the column at 4 ° C. for 1 hour. The reaction is then stabilized by reducing conditions, eg sodium cyanoborohydride (0.00025% w / v in 0.15 M NaCl, pH 3.9).

3.3 활성화된 실리카겔 컬럼에 대한 Aβ₄₂의 커플링3.3 Coupling of Aβ₄₂ to Activated Silica Gel Columns

트레실 클로라이드-활성화된 컬럼을 0.1　M Na₂CO₃ (pH 8.5)로 세정한다. 커플링을 위해서, 펩티드 또는 단백질(2　mg/ml 0.1　M Na₂CO₃, pH 8.5)을 37℃에서 2 시간 동안 및 이어서 얼음상에서 4 시간 동안 수회 컬럼을 통과시킨다. 컬럼의 자 유 결합 부위를 차단하기 위해서, 후속하여 과량의 0.2　M 글리신, pH 8을 컬럼에 통과시킨다.Tresyl chloride-activated column is washed with 0.1 M Na₂ CO₃ (pH 8.5). For coupling, the peptide or protein (2 mg / ml 0.1 M Na₂ CO₃ , pH 8.5) is passed through the column several times at 37 ° C. for 2 hours and then on ice for 4 hours. To block the free binding site of the column, an excess of 0.2 M glycine,pH 8, is subsequently passed through the column.

3.4 활성화된 폴리에틸렌 컬럼에 대한 당단백질의 커플링3.4 Coupling of Glycoproteins to Activated Polyethylene Columns

활성화된 컬럼을 0.1　M Na₂CO₃ (pH 8.5)로 세정한다. 커플링을 위해서, Aβ₄₂ (2　mg/ml, 0.1　M Na₂CO₃, pH 8.5)을 37℃에서 2 시간 동안 및 이어서 얼음상에서 4 시간 동안 수회 컬럼을 통과시킨다. 컬럼의 자유 결합 부위를 차단하기 위해서, 후속하여 과량의 0.2　M 글리신, pH 8을 컬럼에 통과시킨다. 반응을 개선시키기 위해서, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC), 5% w/v를 가할 수 있다.The activated column is washed with 0.1 M Na₂ CO₃ (pH 8.5). For coupling, Aβ₄₂ (2 mg / ml, 0.1 M Na₂ CO₃ , pH 8.5) is passed through the column several times at 37 ° C. for 2 hours and then on ice for 4 hours. To block the free binding site of the column, an excess of 0.2 M glycine,pH 8, is subsequently passed through the column. To improve the reaction, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (EDC), 5% w / v can be added.

3.5 목적하지 않는 분자를 제거하기 위한 컬럼의 생산3.5 Production of columns to remove unwanted molecules

트레실 클로라이드-활성화된 컬럼을 0.1　M Na₂CO₃ (pH 8.5)으로 세정한다. 하나 또는 몇 가지의 일차 또는 이차 아민을 지닌 분자에 대해서 제거가 수행되어야 하면, 이러한 분자, 또는 혼합물(2　mg/ml 0.1　M Na₂CO₃, pH 8.5)을 실온에서 밤새 수회 컬럼에 통과시킨다. 컬럼의 자유 결합 부위를 차단하기 위해서, 이어서 과량의 0.2　M 글리신, pH 8을 컬럼에 통과시킨다. 하나 이상의 일차 또는 이차 아민을 지닌 특정의 분자의 제거가 요구되지 않으면, 컬럼의 모든 결합 부위가 글리신으로 차단된다.Tresyl chloride-activated column is washed with 0.1 M Na₂ CO₃ (pH 8.5). If removal should be performed on molecules with one or several primary or secondary amines, these molecules, or mixtures (2 mg / ml 0.1 M Na₂ CO₃ , pH 8.5) are passed through the column several times overnight at room temperature. To block the free binding site of the column, an excess of 0.2 M glycine,pH 8, is then passed through the column. If removal of a particular molecule with one or more primary or secondary amines is not required, all binding sites of the column are blocked with glycine.

추가의 유도체화 방법은 이하 참조 문헌을 참조할 수 있다. 문헌[Patterson, W. J., National Aeronautics and Space Administration, Technical Memorandum, NASA TMX-73311, U.S. Government Printing Office, Washington, D. C., 1976, Ma, S. M., Gregonis, D. E., von Wagenen, R. A., and Andrade, J. D., in "Hydrogels for Medical and Related Applications" (J. D. Andrade, Ed.), Amer. Chem. Soc. Symp. Series, Vol. 31, p. 241, 1976, Harris, J. M., Struck, E. C., Case, M. G., Paley, M. S., Van Alstine, J. M., and Brooks, D. E., J. Polymer Sci., Polymer Chem. Ed., 22, 341 (1984), Regnier and Noel, Regnier, F. E., and Noel, R. J., J. Chromatog. Sci., 14, (1976), Yalpani, M. and Brooks, D. E., J. Polymer Sci., Polymer Chem. Ed., 23, 395 (1985)].Further derivatization methods can be found in the following references. Patterson, W. J., National Aeronautics and Space Administration, Technical Memorandum, NASA TMX-73311, U.S. Government Printing Office, Washington, D. C., 1976, Ma, S. M., Gregonis, D. E., von Wagenen, R. A., and Andrade, J. D., in "Hydrogels for Medical and Related Applications" (J. D. Andrade, Ed.), Amer. Chem. Soc. Symp. Series, Vol. 31, p. 241, 1976, Harris, J. M., Struck, E. C., Case, M. G., Paley, M. S., Van Alstine, J. M., and Brooks, D. E., J. Polymer Sci., Polymer Chem. Ed., 22, 341 (1984), Regnier and Noel, Regnier, F. E., and Noel, R. J., J. Chromatog. Sci., 14, (1976), Yalpani, M. and Brooks, D. E., J. Polymer Sci., Polymer Chem. Ed., 23, 395 (1985).

3.6 Aβ₄₂ 에 대한 핵산 접촉의 수행 및 컬럼의 분리3.6 Performing Nucleic Acid Contact on Aβ₄₂ and Separation of Columns

코팅된 컬럼을 누출 없이 일렬로 연결하는데, 먼저 목적하지 않은 분자를 제거하기 위한 컬럼, 및 이어서, Aβ₄₂ 컬럼이 연결된다. 평형 목적을 위해서, 적합한 완충액, 예를 들어, 완충용액(10　mM 트리스-HCl, 50　mM KCl, 1.5　mM MgCl₂ 및 젤라틴 0.001% (w/v) pH 8.3)을 얼음상에서 1 시간 동안 컬럼에 통과시킨다. 조합성 핵산 라이브러리의 핵산을 1ml의 동일한 완충액에 취하고 이중 가닥의 용융을 위해서 95℃에서 10분 동안 가열시키고, 이들을 컬럼에 수회(4 내지 30회) 통과시킨다. 이어서, 컬럼을 분리하고 얼음상에서 밤새 선택된 완충액(상기 참조)으로 세척한다. 흐름 방향으로의 컬럼의 분리가 적합한 커팅 기구에 의해서 수행된다.The coated columns are connected in a line without leaking, first to remove unwanted molecules, and then to Aβ₄₂ columns. For equilibrium purposes, suitable buffers such as buffers (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂ and gelatin 0.001% (w / v) pH 8.3) are passed through the column for 1 hour on ice. Let's do it. The nucleic acids of the combinatorial nucleic acid library are taken up in 1 ml of the same buffer and heated at 95 ° C. for 10 minutes for melting of the double strands and they are passed through the column several times (4 to 30 times). The column is then separated and washed with ice of choice (see above) overnight on ice. Separation of the column in the flow direction is carried out by a suitable cutting device.

4. 펩티드 1208(FGFPEHLLVDFLQSLS-C)에 대한 Aβ₄₂의 결합 시험4. Binding Test of Aβ₄₂ to Peptide 1208 (FGFPEHLLVDFLQSLS-C)

펩티드 1208에 대한 아밀로이드-베타-결합의 분석을 위해서, 우선 펩티드를 담체 단백질(BSA)에 커플링시켰으며, 상기 펩티드의 농도는 500μMol(약 1mg/ml)이다. 1208-BSA 컨주게이트를 ELISA 플레이트에 결합시키는데, 웰당 100ng의 펩티드를 결합시켰다. ELISA 플레이트를 PBS, 1% BSA로 포화시키고, 이어서, 아밀로이드-베타 (1-42)의 결합을 8-100ng/웰의 농도 범위에서 분석하였다. 결합된 아밀로이드-베타는 특이적 마우스 항체로 검출되었다. 마지막으로, 결합된 아밀로이드-베타의 양을 바이오티닐화된 항-마우스 항체 및 스트렙타비딘-커플링된 퍼옥시다제를 사용하여 정량하였다. 기질로서, ABTS가 사용되었으며, ELISA 리더에서 405nm 파장으로 분석을 수행하였다(도 1).For analysis of amyloid-beta-binding to peptide 1208, the peptide was first coupled to a carrier protein (BSA) and the concentration of the peptide was 500 μMol (about 1 mg / ml). The 1208-BSA conjugate was bound to an ELISA plate with 100 ng of peptide per well. ELISA plates were saturated with PBS, 1% BSA, and then the binding of amyloid-beta (1-42) was analyzed at a concentration range of 8-100 ng / well. Bound amyloid-beta was detected with specific mouse antibodies. Finally, the amount of bound amyloid-beta was quantified using biotinylated anti-mouse antibody and streptavidin-coupled peroxidase. As substrate, ABTS was used and analysis was performed at 405 nm wavelength in ELISA reader (FIG. 1).

펩티드 1208의 결합에 대한 분석을 위해서, 아밀로이드-베타 (1-42)를 ELISA 플레이트(웰당 500ng)에 결합시켰다. 이어서, ELISA 플레이트를 PBS, 1% BSA로 포화시키고, 이어서, 유리 펩티드 1208 또는 1208-BSA 컨주게이트를 각각 가하였다(1.6 내지 50ng). 결합된 펩티드를 특이적 모노클론성 항체로 검출하였다. 최종의 정량화를 위해서, 바이오티닐화된 항-마우스 항체 및 스트렙타비딘-커플링된 퍼옥시다제를 사용하였다. 기질로서, ABTS가 사용되었으며, ELISA 리더에서 405nm 파장으로 분석을 수행하였다(도 2).For analysis of the binding of peptide 1208, amyloid-beta (1-42) was bound to ELISA plates (500 ng per well). The ELISA plates were then saturated with PBS, 1% BSA, followed by addition of free peptide 1208 or 1208-BSA conjugates (1.6-50 ng), respectively. Bound peptides were detected with specific monoclonal antibodies. For final quantification, biotinylated anti-mouse antibodies and streptavidin-coupled peroxidase were used. As substrate, ABTS was used and analysis was performed at 405 nm wavelength in ELISA reader (FIG. 2).

1208-BSA 컨주게이트를 ELISA 플레이트(웰당 100ng의 펩티드)에 결합시키고, 플레이트를 PBS, 1% BSA로 포화시켰다. 이어서, 자유 펩티드 1208 또는 대조군-펩티드(농도 범위 30 내지 2000ng/)의 존재하에 아밀로이드-베타(1-42)(100ng/웰)의 결합을 분석하였다. 결합된 아밀로이드-베타의 검출은 상기된 바와 같았다(도 3).The 1208-BSA conjugate was bound to an ELISA plate (100 ng of peptide per well) and the plate was saturated with PBS, 1% BSA. The binding of amyloid-beta (1-42) (100 ng / well) was then analyzed in the presence of free peptide 1208 or control-peptide (concentration range 30-2000 ng /). Detection of bound amyloid-beta was as described above (FIG. 3).

Claims (7)

Translated fromKorean

혈류 또는 혈장류와 접촉할 수 있는 고형 담체를 포함하는 아페레시스 장치로서, 고형 담체가 아밀로이드-β-전구체-단백질(APP)-결합 수용체를 포함함을 특징으로 하는 아페레시스 (apheresis) 장치.An aperesis device comprising a solid carrier capable of contacting blood flow or plasma, wherein the solid carrier comprises an amyloid-β-precursor-protein (APP) -binding receptor .제 1항에 있어서, APP-결합 수용체가 항-APP 항체, 항-Aβ₄₀ 항체, 항-Aβ₄₂ 항체, APP-결합 단백질, APP-결합 펩티드, APP-결합 강글로시드 (gangliosides), 또는 APP-결합 핵산, 또는 이들 수용체의 혼합물임을 특징으로 하는 아페레시스 장치.The method of claim 1, wherein the APP-binding receptor is an anti-APP antibody, anti-Aβ₄₀ antibody, anti-Aβ₄₂ antibody, APP-binding protein, APP-binding peptide, APP-binding gangliosides, or APP An aperesis device characterized in that the binding nucleic acid, or a mixture of these receptors.제 1항 또는 제 2항에 있어서, 담체가 무균이며 비발열원성 (pyrogen-free) 컬럼임을 특징으로 하는 아페레시스 장치.3. The aperesis device of claim 1 or 2, wherein the carrier is a sterile, pyrogen-free column.제 1항 또는 제 2항에 있어서, 알츠하이머 질환을 치료 또는 예방하기 위한 아페레시스 장치.The aperesis device according to claim 1 or 2 for treating or preventing Alzheimer's disease.제 2항에 있어서, APP-결합 단백질이 겔솔린(gelsolin), apoJ(apolipoprotein J) 또는 apoE(apolipoprotein E)임을 특징으로 하는 아페레시스 장치.The aperesis device according to claim 2, wherein the APP-binding protein is gelsolin, apoJ (apolipoprotein J) or apoE (apolipoprotein E).제 2항에 있어서, APP-결합 강글로시가 GM1(monosialotetrahexosylganglioside)임을 특징으로 하는 아페레시스 장치.The aperesis device according to claim 2, wherein the APP-binding ganglosy is GM1 (monosialotetrahexosylganglioside).제 2항에 있어서, APP-결합 핵산이 압타머 (aptamer)임을 특징으로 하는 아페레시스 장치.The aperesis device according to claim 2, wherein the APP-binding nucleic acid is an aptamer.

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