KR100903555B1 - Cytochrome P450 Hydroxylase Gene from Pseudonocadia Autotrophica - Google Patents

Abstract

Translated fromKorean

본 발명은 슈도노카디아 오토트로피카의 사이토크롬 P450 하이드록실레이즈 유전자에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 슈도노카디아 유래의 신규 사이토크롬 P450 하이드록실레이즈 유전자 CYP601-1, CYP601-2, CYP602, CYP605에 대한 것이다.The present invention relates to the cytochrome P450 hydroxylase gene of Pseudonocadia autotrophica. More specifically, the present invention relates to novel cytochrome P450 hydroxylase genes CYP601-1, CYP601-2, CYP602, CYP605 derived from Pseudonocadia.

사이토크롬 P450 하이드록실레이즈Cytochrome P450 hydroxylase

Description

Translated fromKorean

슈도노카디아 오토트로피카의 사이토크롬 P450 하이드록실레이즈 유전자 {Cytochrome P450 hydroxylase genes from Pseudonocardia autotrophica}Cytochrome P450 hydroxylase genes from Pseudonocardia autotrophica}

도 1은 5가지 종류의 방선균의 사이토크롬 P450 하이드록실레이즈의 중심 부위(central regions)를 나타낸 아미노산 서열이다.1 is an amino acid sequence showing the central regions of cytochrome P450 hydroxylase of five kinds of actinomycetes.

도 2는 슈도노카디아와 다른 방선균들의 CYP 간의 분자계통학적 트리(phylogenetic tree)를 나타낸 도면이다.FIG. 2 is a diagram illustrating a phylogenetic tree between pseudonocardia and CYP of other actinomycetes. FIG.

본 발명은 슈도노카디아 오토트로피카의 사이토크롬 P450 하이드록실레이즈 유전자에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 슈도노카디아 오토트로피카 유래의 신규 사이토크롬 P450 하이드록실레이즈 유전자 CYP601-1, CYP601-2, CYP602, CYP605 유전자의 염기 서열 확인 방법에 대한 것이다.The present invention relates to the cytochrome P450 hydroxylase gene of Pseudonocadia autotrophica. More specifically, the present invention relates to a method for identifying the nucleotide sequence of novel cytochrome P450 hydroxylase genes CYP601-1, CYP601-2, CYP602, and CYP605 genes derived from Pseudoocdia autotrophica.

사이토크롬 P450 하이드록실레이즈(Cytochrome P450 hydroxylase, 이하 CYP라고 약칭함)는 모든 진핵생물, 동물, 식물, 곰팡이 그리고 미생물 내에 존재하는 헴(heme)을 포함하는 효소로서, 일반적으로 다양한 대사산물이나 외래 생체 이물의 초기 산화과정에 관여한다.Cytochrome P450 hydroxylase (abbreviated as CYP) is an enzyme that contains all eukaryotes, animals, plants, fungi and heme in microorganisms. It is involved in the initial oxidation of foreign bodies.                        

CYP는 다양한 항생제 전구 물질의 활성화와 난분해성 물질의 해독 작용에 관여하며, 폴리케타이드, 지방산, 스테로이드를 비롯한 여러 종류의 화합물을 기질로 삼는다(Roberts, G.A. et al.,J. Bacteriol. 184, 3898-3908).CYP is involved in the activation of various antibiotic precursors and detoxification of hardly degradable substances, and is based on a variety of compounds including polyketides, fatty acids and steroids (Roberts, GA et al.,J. Bacteriol . 184, 3898-3908).

최근 많은 생물체의 전체 유전체 서열이 알려짐에 따라 각각의 종들에서 CYP 유전자의 종류가 다양하고 그 수도 종별로 다르다는 것이 밝혀졌다. 다세포 생물의 경우 인간에는 약 57개, 초파리(Drosophila melanogaster)에는 약 90개, 애기장대(Arabidopsis thaliana)에는 약 275개의 CYP가 존재하며, 단세포 생물의 경우 효모(Saccharomyces cerevisiae)에는 약 3개, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에는 약 20개의 CYP가 존재하는 것으로 밝혀졌으며, 대장균(E.coli)의 경우에는 없는 것으로 나타났다(Lamb, D.B. et al.,J.Biol. Chem.277, 24000-24005.).Recently, as the whole genome sequence of many organisms is known, it has been found that the CYP genes vary in each species and the number of species differs by species. In the case of multicellular organisms, about 57 in humans, about 90 inDrosophila melanogaster , about 275 CYP inArabidopsis thaliana , about 3 in yeast (Saccharomyces cerevisiae ), and in tuberculosis bacteria(Mycobacterium tuberculosis) has been found to have about 20 CYP exist, E. coli for the(E.coli) there was no (Lamb, DB et al., J.Biol. Chem. 277, 24000-24005.).

특히 이미 보고된 박테리아계의 CYP 중에서 약 40%가 산업적으로 유용한 토양 미생물인 스트렙토마이세스(Streptomyces)속의 45종에서 발견되었다(Nelson DR. 1999.Arch. Biochem. Biophys. 369. 1-10).In particular, about 40% of previously reported bacterial CYPs were found in 45 species ofStreptomyces , an industrially useful soil microorganism (Nelson DR. 1999.Arch. Biochem. Biophys. 369. 1-10).

이러한 스트렙토마이세스속의 CYP들은 세포내에 용해된 상태로 존재하고, 기초대사에는 관여하지 않지만 스테로이드, 지방산, 페르몬, 루코트리엔 등과 같은 생체내 화합물의 산화, 과산화, 환원반응에 특이적으로 관여하는 것으로 알려져 있다(Omura T. 1999.Biochem. Biophy. Res. Commun. 266. 690-698).Such Streptomyces CYP in the genus is dissolved in cells and is not involved in basal metabolism, but is known to be specifically involved in the oxidation, peroxidation and reduction of in vivo compounds such as steroids, fatty acids, pheromones, and leukotrienes. Omura T. 1999.Biochem. Biophy. Res. Commun. 266. 690-698).

방선균은 포자를 형성하고, 필라멘트 형태의 균사체를 이루며 주위의 환경 변화에 따라 독특한 형태적 분화를 거치는 대표적인 그람 양성 토양미생물로서, 항생제, 항암제와 같은 다양한 종류의 유용한 생리적 활성 물질을 생산해 내는 균주 이다.Actinomycetes are representative gram-positive soil microorganisms that form spores, form filamentous mycelium, and undergo unique morphological differentiation according to changes in the surrounding environment, and produce various kinds of useful physiologically active substances such as antibiotics and anticancer agents.

특히 희소 방선균인 슈도노카디아 오토트로피카는 비타민 D3 하이드록실레이즈의 기능을 갖는 균주로서 생리활성 물질 변형과 관련하여 매우 유용한 균주로 알려져 있다.In particular, the rare actinomycetes Pseudonocadia autotrophica is a strain having a function of vitamin D3 hydroxylase and is known as a very useful strain in connection with modification of bioactive substances.

CYP는 방선균 유래의 여러 종류의 항생제, 항암제, 항진균제의 생합성 과정에 관여한다. 즉, 다양한 화학구조의 기질을 산화시켜 물질의 구조 및 위치 특이적 활성을 유도한다(Lamb D.C. et al.Biochem. Biophys. Res. Commun. 307, 610-619).CYP is involved in the biosynthesis process of several antibiotics, anticancer agents and antifungal agents derived from actinomycetes. That is, by oxidizing substrates of various chemical structures to induce structure and site specific activity of the material (Lamb DC et al.Biochem. Biophys. Res. Commun. 307, 610-619).

예를 들면, 사카로폴리스포라 에리트래아(Saccharopolyspora erythraea)에서 CYP107A1 (EryF)은 에리트로마이신 생합성 과정 중 6-데옥시에리트로놀리드 B (6-deoxyerythronolide B)를 에리트로놀리드 B (erythronolide B)로 하이드록실레이션 시킨다(Weber, J.M. et al.,Science. 252. 114-116).For example, inSaccharopolyspora erythraea , CYP107A1 (EryF) converts 6-deoxyerythronolide B to erythronolide B during erythromycin biosynthesis. Hydroxylation (Weber, JM et al.,Science. 252. 114-116).

스트렙토마이세스 베네수에라(Streptomyces venesuelae)의 CYP107L1(PikC)는 YC-17과 나보마이신을 하이드록실레이션 시킨다(Xue Y, D. Wilson, et al.,Chem. Biol. 5. 661-667).CYP107L1 (PikC) fromStreptomyces venesuelae hydroxylates YC-17 and nabomycin (Xue Y, D. Wilson, et al.,Chem. Biol. 5. 661-667).

또한 스트렙토마이세스 프라이애(Streptomyces fradiae)의 CYP113B과 CYP105L1은 티로신 생합성 과정 중에 작용한다(Merxon-Davies L.A. et al.,Mol. Microbiol. 13. 349-355.).CYP113B and CYP105L1 ofStreptomyces fradiae also act during tyrosine biosynthesis (Merxon-Davies LA et al.,Mol. Microbiol. 13. 349-355.).

암포테리신을 합성하는 스트렙토마이세스 노도서스(Streptomyces nodosus) 내에는 CYP161A3(AmphL), CYP105H4(AmpN)이 (Caffrey P, S. Lynch, et al., Chem Biol. 8. 713-723.) 존재하고, 나이스타틴을 합성하는 스트렙토마이세스 노우세이(Streptomyces noursei) 내에는 CYP161A3, CYP161A1(NysL)이(Trygve Brautaset et al., Chem. Biol. 7.395-403.) 존재하며, 라파마이신을 합성하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)내에는 CYP122A2(RapJ), CYP107G1 (RapN)가 각각 존재한다(Molnar I, J.F. Aparicio, et al.,Gene. 169. 1-7).CYP161A3 (AmphL), CYP105H4 (AmpN) (Caffrey P, S. Lynch, et al., Chem Biol. 8. 713-723.) Are present inStreptomyces nodosus that synthesizes amphotericin. In theStreptomyces noursei that synthesizes nystatin, CYP161A3 and CYP161A1 (NysL) are present (Trygve Brautaset et al., Chem. Biol. 7.395-403.), And streptomycin that synthesizes rapamycin. There are CYP122A2 (RapJ) and CYP107G1 (RapN), respectively, inStreptomyces hygroscopicus (Molnar I, JF Aparicio, et al.,Gene . 169. 1-7).

그리고 독소루비신을 생합성하는 스트렙토마이세스 푸세티우스(Streptomyces peucetius) 내에는 CYP129A2, CYP131A1이(S. Liu, J. Ferguson, et al., J. Bacteriol. 177. 6688-6692.) 존재하며, 니코마이신을 합성하는 스트렙토마이세스 텐대(Streptomyces tendae)와 스트렙토마이세스 안소크로모제네스(Streptomyces ansochromogenes)에는 각각 CYP162A1(NikQ), CYP105K2(SanL), SanQ가 존재한다(Chen H, K.H. et al.,Chem. Biol. 9. 104-112.).And CYP129A2 and CYP131A1 (S. Liu, J. Ferguson, et al., J. Bacteriol. 177. 6688-6692.) Are present inStreptomyces peucetius biosynthesizing doxorubicin. a is, the respective CYP162A1 (NikQ), CYP105K2 (SanL ), SanQ presence Streptomyces tendae(Streptomyces tendae) and Streptomyces not soak our jeneseu(Streptomyces ansochromogenes) synthesizing (Chen H, KH et al. , Chem.Biol . 9. 104-112.).

전술한 바와 같이, CYP는 방선균 내의 다양한 생화학 과정뿐 아니라 인체에서도 역시 생체 분자의 생합성에 광범위하게 관여한다. CYP가 관여하는 생체 과정이 다양하므로 CYP의 연구로부터 파급될 수 있는 산업상의 효과는 매우 다양하다.As mentioned above, CYP is widely involved in biosynthesis of biomolecules as well as in various biochemical processes in actinomycetes. Because of the wide variety of biological processes involved in CYP, the industrial effects that can be disseminated from CYP's research vary widely.

이러한 특성의 신규 CYP의 확보는 새로운 유용한 생리활성 물질의 합성 및 변형을 유도할 수 있는 유용한 유전자원이다.The acquisition of new CYPs of this nature is a useful gene source that can induce the synthesis and modification of new useful bioactive substances.

따라서 신규 CYP의 유전자원의 확보 및 개발은 매우 시급한 연구 과제인데, 생존조건이나 배양 조건이 매우 까다로운 희귀 방선균에 존재하는 CYP 유전자는, 희귀 방선균 자체의 존재가 극미하여 CYP의 존재 여부나 구체적 기능을 알 수 없었 다. 특히 대표적인 희귀 방선균인 슈도노카디아 오토트로피카의 CYP 유전자는 그 존재 여부와 실체가 규명되지 아니하였다.Therefore, securing and developing new CYP genes is an urgent research task. CYP genes present in rare actinomycetes, which have very difficult survival and culture conditions, have very rare presence of actinomycetes themselves. I didn't know. In particular, the existence and substance of the CYP gene of Pseudonocadia autotrophica, a rare rare actinomycete, have not been identified.

따라서 당업계에서는 여러가지 산화 반응을 촉매하는 다양하고, 인체에 유용한 생리활성 물질의 생합성 및 변형 기능을 나타내는 등, 산업적으로 유용한 효소인 CYP의 분리 및 염기서열 특성을 규명함으로써, 새로운 유용 생리활성물질 창출에 적용할 수 있는 CYP 유전자군의 확보가 요청되고 있다.Therefore, in the art, it is possible to create new useful bioactive substances by identifying the isolation and sequence characteristics of CYP, which is an industrially useful enzyme, such as biosynthesis and modification functions of various and useful bioactive substances that catalyze various oxidation reactions. There is a demand for securing a family of CYP genes that can be applied.

따라서, 본 발명의 목적은 i) 슈도노카디아 오토트로피카로부터 전체 염색체(total chromosomal DNA)를 분리하는 단계; ii) 상기 전체 염색체로부터 재조합 콜로니를 제작하는 단계; iii) 5'-TXCTXCTXATCGCXGGXCACGAGAC-3'(Deg-1, X는 G 또는 C를 나타낸다)과 5'-GCXAGGTTCTGXCCXAGGCACTGGTG-3'(Deg-2, X는 G 또는 C를 나타낸다)의 축퇴성 프라이머를 제작하는 단계; iv) 상기 재조합 콜로니를 주형으로 하고 상기 축퇴성 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 증폭하는 단계; v) 상기 iv)단계에서 증폭된 DNA 단편을 pGEM T-easy vector(Promega, USA)에 클로닝하여 E. coli DH5a을 형질전환시키는 단계; vi) 상기 형질전환된 E. coli DH5a로부터 재조합 플라스미드를 추출하는 단계; 그리고 vii) 상기 재조합 플라스미드의 염기 서열을 분석하는 단계를 포함하는, 슈도노카디아 오토트로피카의 CYP 유전자의 염기 서열 확인 방법에 있어서, 상기 ii)단계의 재조합 콜로니는 상기 전체 염색체를EcoRV로 처리하여 얻은 40kb 이상의 DNA 절편을 pOJ446에 클로닝하여 제작하는 것이고; 상기 iii)단계의 축퇴성 프라이머는 방선균 유래의 CYP의 아미노산 서열 중 보존되어 있는 산소 결합 부위와 헴 리간드 포켓으로부터 제작되며; 상기 vi)단계의 재조합 플라스미드는 상기 형질전환된 E. coli DH5a를 100μg/ml 앰피실린이 첨가된 LB 배지에서 배양한 후 알카라인 용해와 아세트산나트륨 침전을 통하여 얻어지고; 상기 vii)단계가 상기 재조합 플라스미드 DNA를 BamHI(Promega, USA)와 PstI(Promega, USA)로 처리하여 주형으로 사용하고, 상기 전체 염색체와 상기 축퇴성 프라이머로부터 증폭된 PCR 산물을 프로브로 사용하여 서던 하이브리드화(Southern hybridization)를 수행함으로써 상기 재조합 플라스미드의 염기 서열을 분석하는 것임을 특징으로 하는, 슈도노카디아 오토트로피카의 CYP 유전자의 염기 서열 확인 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for separating chromosomal DNA from pseudonocardia autotrophica; ii) producing recombinant colonies from the whole chromosome; iii) Degenerate primers of 5'-TXCTXCTXATCGCXGGXCACGAGAC-3 '(Deg-1, X represents G or C) and 5'-GCXAGGTTCTGXCCXAGGCACTGGTG-3' (Deg-2, X represents G or C) step; iv) amplifying by using the recombinant colonies as a template and performing PCR using the degenerate primers; v) transforming E. coli DH5a by cloning the DNA fragment amplified in step iv) into pGEM T-easy vector (Promega, USA); vi) extracting the recombinant plasmid from the transformed E. coli DH5a; And vii) analyzing the nucleotide sequence of the recombinant plasmid, wherein the recombinant colony of step ii) comprises treating the entire chromosome withEco RV. DNA fragments obtained by cloning were obtained by cloning in pOJ446; The degenerate primer of step iii) is prepared from a conserved oxygen binding site and a heme ligand pocket in the amino acid sequence of CYP derived from actinomycetes; The recombinant plasmid of step vi) is obtained through alkaline lysis and sodium acetate precipitation after culturing the transformed E. coli DH5a in LB medium to which 100 μg / ml ampicillin is added; In step vii), the recombinant plasmid DNA is treated with BamHI (Promega, USA) and PstI (Promega, USA) as a template, and the PCR product amplified from the whole chromosome and the degenerate primer is used as a probe. It is to provide a method for identifying the nucleotide sequence of the CYP gene of Pseudonodia autotrophic, characterized in that by analyzing the nucleotide sequence of the recombinant plasmid by performing a hybridization (Southern hybridization).

상기한 본 발명의 목적은 i) 슈도노카디아 오토트로피카로부터 전체 염색체(total chromosomal DNA)를 분리하는 단계; ii) 상기 전체 염색체로부터 재조합 콜로니를 제작하는 단계; iii) 5'-TXCTXCTXATCGCXGGXCACGAGAC-3'(Deg-1, X는 G 또는 C를 나타낸다)과 5'-GCXAGGTTCTGXCCXAGGCACTGGTG-3'(Deg-2, X는 G 또는 C를 나타낸다)의 축퇴성 프라이머를 제작하는 단계; iv) 상기 재조합 콜로니를 주형으로 하고 상기 축퇴성 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 증폭하는 단계; v) 상기 iv)단계에서 증폭된 DNA 단편을 pGEM T-easy vector(Promega, USA)에 클로닝하여 E. coli DH5a을 형질전환시키는 단계; vi) 상기 형질전환된 E. coli DH5a로부터 재조합 플라스미드를 추출하는 단계; 그리고 vii) 상기 재조합 플라스미드의 염기 서열을 분석하는 단계를 포함하는, 슈도노카디아 오토트로피카의 CYP 유전자의 염기 서열 확인 방법에 있어서, 상기 ii)단계의 재조합 콜로니는 상기 전체 염색체를EcoRV로 처리하여 얻은 40kb 이상의 DNA 절편을 pOJ446에 클로닝하여 제작하는 것이고; 상기 iii)단계의 축퇴성 프라이머는 방선균 유래의 CYP의 아미노산 서열 중 보존되어 있는 산소 결합 부위와 헴 리간드 포켓으로부터 제작되며; 상기 vi)단계의 재조합 플라스미드는 상기 형질전환된 E. coli DH5a를 100μg/ml 앰피실린이 첨가된 LB 배지에서 배양한 후 알카라인 용해와 아세트산나트륨 침전을 통하여 얻어지고; 상기 vii)단계가 상기 재조합 플라스미드 DNA를 BamHI(Promega, USA)와 PstI(Promega, USA)로 처리하여 주형으로 사용하고, 상기 전체 염색체와 상기 축퇴성 프라이머로부터 증폭된 PCR 산물을 프로브로 사용하여 서던 하이브리드화(Southern hybridization)를 수행함으로써 상기 재조합 플라스미드의 염기 서열을 분석하는 것임을 특징으로 하는, 슈도노카디아 오토트로피카의 CYP 유전자의 염기 서열 확인 방법을 제공함으로써 달성된다.
희소 방선균인 슈도노카디아 오토트로피카는 스트렙토마이세스와는 속명이 다른 균주로서, 슈도노카디아 오토트로피카에 CYP 유전자가 존재하는지 밝혀진 바가 없었다. 따라서 본 발명의 슈도노카디아 오토트로피카의 CYP 유전자의 염기 서열 확인 방법에 따르면, 슈도노카디아 오토트로피카에 CYP 유전자가 존재함을 알 수 있다. 이로써 여러가지 산화 반응을 촉매하는 다양하고 인체에 유용한 생리활성 물질의 생합성 및 변형 기능을 나타내는 등 상업적으로 유용한 효소인 CYP 유전자를 확보할 수 있다.The object of the present invention described above is i) separating total chromosomal DNA from Pseudonocardia autotrophica; ii) producing recombinant colonies from the whole chromosome; iii) Degenerate primers of 5'-TXCTXCTXATCGCXGGXCACGAGAC-3 '(Deg-1, X represents G or C) and 5'-GCXAGGTTCTGXCCXAGGCACTGGTG-3' (Deg-2, X represents G or C) step; iv) amplifying by using the recombinant colonies as a template and performing PCR using the degenerate primers; v) transforming E. coli DH5a by cloning the DNA fragment amplified in step iv) into pGEM T-easy vector (Promega, USA); vi) extracting the recombinant plasmid from the transformed E. coli DH5a; And vii) analyzing the nucleotide sequence of the recombinant plasmid, wherein the recombinant colony of step ii) comprises treating the entire chromosome withEco RV. DNA fragments obtained by cloning were obtained by cloning in pOJ446; The degenerate primer of step iii) is prepared from a conserved oxygen binding site and a heme ligand pocket in the amino acid sequence of CYP derived from actinomycetes; The recombinant plasmid of step vi) is obtained through alkaline lysis and sodium acetate precipitation after culturing the transformed E. coli DH5a in LB medium to which 100 μg / ml ampicillin is added; In step vii), the recombinant plasmid DNA is treated with BamHI (Promega, USA) and PstI (Promega, USA) as a template, and the PCR product amplified from the whole chromosome and the degenerate primer is used as a probe. It is achieved by providing a method for identifying the base sequence of the CYP gene of Pseudonodia diatrophyrocarat, characterized in that the nucleotide sequence of the recombinant plasmid is analyzed by performing a hybridization (Southern hybridization).
The rare actinomycetes, Pseudonocadia autotrophica, is a different strain from Streptomyces, and it is not known whether the CYP gene exists in Pseudonocadia autotrophica. Therefore, according to the method for confirming the nucleotide sequence of the CYP gene of Pseudo norcadia autotrophica of the present invention, it can be seen that the CYP gene is present in Pseudonocadia autotropha. As a result, it is possible to secure CYP gene, which is a commercially useful enzyme such as biosynthesis and modification function of various physiologically active substances useful for various oxidation reactions.

CYP601-1은 개시코돈이 ATG이고 413개의 아미노산으로 이루어져 있으며G+C 함량은 72.8% (FramePlot-2.3)이고, 스트렙토마이세스 노우세이(Streptomyces noursei)의 NysN과 74%의 상동성(identity)을 나타내었다.CYP601-1 has an initiation codon of ATG, 413 amino acids, G + C content of 72.8% (FramePlot-2.3), and 74% homology with NysN ofStreptomyces noursei. Indicated.

pESK601내에서 CYP601-1유전자의 하류를 프라이머 워킹에 의해 염기서열을 분석한 결과, 또 다른 CYP가 존재하는 것이 확인되었고 이 유전자를 CYP601-2라고 명명하였다. CYP601-2의 염기서열에서는 기존의 CYP 보존부위와는 상이한 염기서열이 존재하고 있었기 때문에 CYP 축퇴성 프라이머로는 증폭이 되지 않았다.A sequence analysis of primers downstream of the CYP601-1 gene in pESK601 confirmed the presence of another CYP and named this gene CYP601-2. In the nucleotide sequence of CYP601-2, the nucleotide sequence different from the existing CYP conserved region was present, and thus the amplification was not performed with the CYP degenerate primer.

CYP601-2의 개시코돈은 ATG 이고 403개의 아미노산으로 이루어져 있으며, G+C 함유량은 72.5%이고 (FramePlot-2.3), 스트렙토마이세스 노우세이(Streptomyces noursei)의 NysL과 68%의 상동성(identity)을 나타내었다.The initiation codon of CYP601-2 is ATG, consisting of 403 amino acids, G + C content of 72.5% (FramePlot-2.3), and 68% homology with NysL ofStreptomyces noursei . Indicated.

pESK602의 CYP602는 개시코돈이 ATG 이고 404개의 아미노산으로 이루어져 있으며 G+C 함유량가 73.7%이고 (FramePlot-2.3), 로도코커스 파시안스(Rhodococcus fascians)의 FAS1과 43%의 상동성(identity)을 나타내었다.CYP602 of pESK602 had an initiation codon of ATG, 404 amino acids, 73.7% G + C content (FramePlot-2.3), and 43% identity to FAS1 ofRhodococcus fascians . .

마지막으로 pESK605의 CYP605는 개시코돈이 ATG 이고 403개의 아미노산으로 이루어져 있으며 G+C 함유량은 72.4%이고 (FramePlot-2.3), 사카로폴리스포라 에리트래아(Saccharopolyspora erythraea)의 CYP107B1와 51%의 상동성을 나타내었다(표 1).Finally, the CYP605 of pESK605 had ATG, 403 amino acids, G + C content of 72.4% (FramePlot-2.3), and 51% homology with CYP107B1 ofSaccharopolyspora erythraea. Is shown (Table 1).

특히 pESK601의 경우, 항진균 활성을 나타내는 폴리엔 마크로라이드 항생물질(polyene macrolide antibiotics)의 생합성 과정에 관여하는 CYP와 매우 높은 유사성을 보였다. 따라서 CYP601 유전자 주변에 폴리엔 생합성에 관여하는 추가적인 생합성 유전자가 존재하는 지를 검증하기 위하여, pESK601을BamHI 제한 효소로 처리하여 CYP601 유전자가 포함된 약 3kb 단편을 서브클로닝 하였다. 3kb의 DNA 단 편의 염기서열을 분석한 결과, 3kb 단편에는 CYP 유전자 이외에 2개의 open reading frame (ORF)이 추가적으로 존재하였고, NCBI의 BlastX로 상동성을 검색한 결과, 첫 번째 ORF는 나이스타틴 글라이코실트랜스퍼라제(nystatin glycosyltransferase) 유전자nysDI, 암포테리신 글라이코실트랜스퍼라제(amphotericin glycosyltransferase) 유전자amphDI과 각각 79%, 75%의 상동성을 보였으며, 두 번째 ORF는 나이스타틴 아미노트랜스퍼라제(nystatin aminotransferase) 유전자nysDII, 암포테리신 아미노트랜스퍼라제(amphotericin aminotransferase) 유전자amphDII와 각각 82%, 81%의 상동성을 보였다.In particular, pESK601 showed very high similarity with CYP, which is involved in the biosynthesis process of polyene macrolide antibiotics that exhibit antifungal activity. Therefore, in order to verify the presence of additional biosynthetic genes involved in polyene biosynthesis around the CYP601 gene, pESK601 was treated withBam HI restriction enzyme to subcloned about 3 kb fragment containing the CYP601 gene. As a result of analyzing the nucleotide sequence of the 3 kb DNA fragment, the 3 kb fragment contained two additional open reading frames (ORFs) in addition to the CYP gene, and the homology was detected by NClast's BlastX. room transferase (nystatin glycosyltransferase) genesnysDI, amphotericin glycosyltransferase (amphotericin glycosyltransferase) genesamphDI and were 79%, showed a homology of 75%, the second ORF is age statin amino transferase (nystatin aminotransferase ) The genesnysDII and amphotericin aminotransferase geneamphDII were 82% and 81% homologous, respectively.

이러한 결과는 슈도노카디아 오토트로피카의 염색체 내에 폴리엔 마크로라이드 계열의 신규 항진균제 생합성 유전자 군이 존재함을 알 수 있으며, 신규 유용 CYP 유전자 군의 확보를 통한 새로운 유용생리활성물질 창출이 가능하다.These results indicate that a new group of anti-fungal biosynthetic genes of polyene macrolide family exist in the chromosome of Pseudonocadia autotrophica, and it is possible to create new useful physiologically active substances by securing a new useful CYP gene group.

CYP nameCYP nameSize^aSize^aMatch in the database^bMatch in the database^bSpeciesSpeciesProteinsProteinsIdentities (%)Identities (%)CYP601-1CYP601-1413413Streptomyces nourseiStreptomyces nourseiNysNNysN7474Streptomyces nodosusStreptomyces nodosusAmphNAmphN7575CYP601-2CYP601-2403403Streptomyces nourseiStreptomyces nourseiNysLNysL6868Streptomyces nodosusStreptomyces nodosusAmphLAmphL6464CYP602CYP602404404Rhodococcus fasciansRhodococcus fasciansFAS1FAS14343Kineococcus radiotoleransKineococcus radiotoleransCytochrome P450Cytochrome P4503939CYP605CYP605403403Saccharopolyspora erythraeaSaccharopolyspora erythraeaCYP107B1CYP107B15151Streptomyces collinusStreptomyces collinusRubURubU5151

^aNumber of amino acids.^a Number of amino acids.

^bBlastX database search at NCBI.
^b BlastX database search at NCBI.

이하, 본 발명을 하기의 실시 예를 통해서 보다 구체적으로 설명하지만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 이들 실시예만으로 한정하고자 하는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the following examples are only for illustrating the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention to only these examples.

[실시예 1]Example 1

균주 및 플라스미드 배양방법Strain and Plasmid Culture Methods

본 실험에서 사용된 균주는 슈도노카디아 오토트로피카 KCTC9441로서 R2YE 액체배지에서 균사체(mycelium)상태로 성장시킨 후 20% glycerol stock으로 -20℃에 냉동보관하여 사용하였다. 슈도노카디아 오토트로피카의 유전체 DNA군(genomic library) 분리에 사용될 균체를 얻기 위하여 YEME (Sucrose 340g, Yeast extract 3g, Bacto-peptone 5g, Malt extract 3g, Glucose 10g, D.W. 1L) 액체 배지에 stock을 충분히 접종하였다.The strain used in this experiment was Pseudoocdia autotrophica KCTC9441, grown in mycelium state in R2YE liquid medium, and stored frozen at -20 ° C with 20% glycerol stock. To obtain the cells to be used for the isolation of genomic library of Pseudonocadia autotrophica, stocks were added to YEME (Sucrose 340g, Yeast extract 3g, Bacto-peptone 5g, Malt extract 3g, Glucose 10g, DW 1L) liquid medium. Inoculated sufficiently.

28℃에서 5일간 배양한 후, 원심분리기 (8000rpm)를 이용하여 균체를 수확하였다. 코스미드 라이브러리 제작과 클로닝에 사용된E. coli DH5α는 LB 배지 (0.5% yeast extract, 1% tryptone peptone, 0.5% NaCl, 0.1% glucose)에서 성장시켰고, 필요에 따라 항생제인 아프라마이신(apramycin) 50μg/ml 또는 앰피실린(ampicillin) 100μg/ml가 첨가된 LB 배지에서 배양하였다After incubating at 28 ° C. for 5 days, the cells were harvested using a centrifuge (8000 rpm).E. coli DH5α was used for the production and cloning of the cosmid library. It was grown in LB medium (0.5% yeast extract, 1% tryptone peptone, 0.5% NaCl, 0.1% glucose) and, if necessary, the antibiotic apramycin (apramycin). ) Were cultured in LB medium to which 50μg / ml or 100μg / ml of ampicillin was added.

[실시예 2]Example 2

코스미드 라이브러리 제작Cosmid library production

코스미드 라이브러리는Streptomyces-E. colishuttle 코스미드 벡터인 pOJ446을 이용하여 제작되었다. YEME에서 배양된 슈도노카디아 오토트로피카부터 전체 염색체(total chromosomal DNA)를 순수하게 분리하여,EcoRV로 처리한 후 40kb이상의 DNA 절편을 pOJ446에 클로닝 하였으며, 제작된 재조합 콜로니는 10⁴ 이상의 농도(titer)가 확인되었다.Cosmid libraries are described inStreptomyces-E. coli shuttle was fabricated using a cosmid vector, pOJ446. From the pseudo-no Arcadia auto trophy car cultured in YEME the pure separation of whole chromosome (total chromosomal DNA), were cloned DNA fragment than 40kb after treatment withEco RV in pOJ446, the recombinant colonies were produced from 10⁴ concentration of at least ( titer).

[실시예 3]Example 3

코스미드 라이브러리 검색을 위한 축퇴성 프라이머 제작Degenerate Primer Fabrication for Cosmid Library Search

방선균 유래의 사이토크롬 P450 하이드록실레이즈들은 상당히 유사한 아미노산 서열을 가지고 있으며, 특히 산소 결합 부위(oxygen-binding site)와 헴 리간드 포켓(heme liganding pocket)에서의 유사성은 매우 높다. 따라서 이 두 보존 영역(conserved region)에서의 아미노산 서열의 유사성을 이용하여 축퇴성 프라이머 (Deg-1 : 5'-TXCTXCTXATCGCXGGXCACGAGAC-3', Deg-2 : 5'-GCXAGGTTCTGXCCXAGGCACTGGTG-3'; X는 G 또는 C를 나타낸다)쌍을 제작하였다. 이는 도 1에 도시되어 있다. 도 1은 5가지 종류의 방선균의 CYP의 중심 부위를 나타낸 아미노산 서열이며, 이는 서열 번호 5번 내지 9번으로 나타내었다.Actinomycetes-derived cytochrome P450 hydroxylases have a fairly similar amino acid sequence, particularly in the oxygen-binding site and the heme liganding pocket. Therefore, degenerate primers (Deg-1: 5'-TXCTXCTXATCGCXGGXCACGAGAGAC-3 ', Deg-2: 5'-GCXAGGTTCTGXCCXAGGCACTGGTG-3'; C)) pairs were prepared. This is shown in FIG. Figure 1 is an amino acid sequence showing the central region of the CYP of five kinds of actinomycetes, which is shown by SEQ ID NO: 5-9.

[실시예 4]Example 4

PCR에 의한 P450 하이드록실레이즈 유전자의 증폭Amplification of the P450 hydroxylase gene by PCR

슈도노카디아 오토트로피카의 전체 염색체 DNA와 재조합 콜로니의 DNA를 주형으로 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 수행을 위한 혼합물조성은 20μM의 프라이머, 100mM Tris-HCL [pH8.3], 20mM MgCl₂가 포함된 10X PCR 버퍼(Takara, Japan), 1U Taq polymerase(Takara), 10% 디메틸술폭시화물(dimethyl sulfoxide)이다. PCR 반응은 96℃에서 30초 동안 변성(denaturation) 시키고, 40℃에서 30초 동안 프라이머 부착(primer annealing) 시킨 후, 72℃에서 35초 동안 연장(extention) 시켰다. 이를 30회 반복시킨 후, 1.5% 아가로스 젤에서 PCR 산물을 확인하였다.PCR was carried out using the whole chromosomal DNA of Pseudo norcadia autotrophica and the DNA of recombinant colonies as templates. The mixture composition for the PCR was carried out in 20μ M primer, 100mM Tris-HCL [pH8.3] , 10X PCR buffer containing a_{20mM MgCl 2 (Takara, Japan)} , 1U Taq polymerase (Takara), 10% dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxide. The PCR reaction was denatured at 96 ° C. for 30 seconds, primer annealing at 40 ° C. for 30 seconds, and then extended at 72 ° C. for 35 seconds. After this was repeated 30 times, PCR products were identified on 1.5% agarose gel.

[실시예 5]Example 5

CYP 축퇴성 프라이머에 의한 슈도노카디아 오토트로피카 코스미드 라이브러리 검색Pseudonocardia Autotrophica Cosmid Library Search by CYP Degenerate Primer

슈도노카디아 오토트로피카로부터 추출한 유전체 DNA군(genomic DNA)을 주형로 하여 제작된 CYP 축퇴성 프라이머로 PCR을 수행한 결과 350bp의 유전자가 증폭되었으며, 증폭된 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 방선균 유래 CYPs와의 매우 높은 유사성이 확인되었다. 그러나 기존에 규명된 방선균 유래 다른 CYP와의 아미노산 서열을 비교하면 그 어떤 유전자와도 100% 동일하지 않음이 밝혀졌다. 따라서 슈도노카디아 오토트로피카 내에는 신규 CYP 유전자가 존재하고 있음을 알 수 있었고, 슈도노카디아 오토트로피카의 전체 염색체를 주형으로 코스미드 라이브러리를 제작하여 CYP 축퇴성 프라이머와의 PCR반응을 이용하여 신규 CYP 유전자를 검색하였다.PCR was performed using CYP degenerate primers prepared from genomic DNA extracted from Pseudonocadia autotrophica as a template, and 350 bp of genes were amplified, and the nucleotide sequence of the amplified genes was analyzed. Very high similarity with CYPs was confirmed. However, comparing the amino acid sequence with other previously identified actinomycetes-based CYP revealed that it is not 100% identical to any gene. Therefore, it was found that a new CYP gene exists in Pseudonocadia autotropha, and a cosmid library was prepared using the entire chromosome of Pseudonocadia autotrophica, using PCR reaction with CYP degenerate primers. New CYP genes were searched.

[실시예 6]Example 6

코스미드 라이브러리의 검색Search of Cosmid Library

마이크로플레이트 리더(Microplate reader)로서 미생물생장 과정 중의 O.D. (Optical density) 값의 변화를 측정하여 미생물의 생장상태를 분석하는 Bioscreen C (Transgalatic Ltd., Finland)를 이용하여 재조합 콜로니들을 배양한 후, 재조합 크스미드 DNA를 분리하여 주형으로 사용하고 앞서 제작된 CYP 축퇴성 프라이머와 PCR 반응 (변성 [96℃, 30초], 흡착 [40℃, 30초], 연장 [72℃, 35초], 30 주기)을 수행하였다. 이와 같은 PCR-based method로 약 1600여개의 재조합 콜로니들을 검색하였다.As a microplate reader, O.D. After culturing the recombinant colonies using Bioscreen C (Transgalatic Ltd., Finland), which analyzes the growth of (Optical density) value and analyzes the growth state of the microorganism, the recombinant ximide DNA is isolated and used as a template. PCR reactions with CYP degenerate primers (modification [96 ° C., 30 sec], adsorption [40 ° C., 30 sec], extension [72 ° C., 35 sec], 30 cycles) were performed. About 1600 recombinant colonies were searched by the PCR-based method.

[실시예 7]Example 7

PCR 산물의 분석Analysis of PCR Products

PCR 수행결과 증폭된 DNA 단편은 pGEM T-easy vector (Promega, USA)에 클로닝하여E. coli DH5α에 형질전환시켰다. 형질전환된 콜로니는 100μg/ml 앰피실린이 첨가된 LB 배지에서 배양하여 균체를 회수하고, 알카라인 용해와 아세트산나트륨 (sodium acetate) 침전을 통하여 재조합 플라스미드를 추출하여 염기서열 분석을 수행하였다.PCR performed resulting amplified DNA fragment was cloned into a pGEM T-easy vector (Promega, USA) and was transformed toE. coli DH5α. The transformed colonies were cultured in LB medium to which 100μg / ml ampicillin was added to recover the cells, and sequencing was performed by extracting recombinant plasmids through alkaline lysis and sodium acetate precipitation.

[실시예 8]Example 8

슈도노카디아 오토트로피카 로부터 CYP 유전자군의 분리 및 염기서열 분석Isolation and Sequencing of CYP Genotype from Pseudonodia Diatrotrophica

PCR-based method 검색방법을 통해 선별된 코스미드들로부터 CYP 축퇴성 프라이머에 의해 증폭된 약 350bp의 PCR 산물을 DIG-labeling해서 프로브로 사용하고, 각각BamHI와PstI로 처리된 코스미드 DNA를 주형로 이용하여 Southern hybridization을 수행하였다. 이 때 신호가 보이는 단편을 제한효소로 처리된 pWHM3(Streptomyces-E. colishuttle vector)에 클로닝하여 염기서열을 분석하였고, CYP 유전자가 절단되어 클로닝이 된 경우에는 코스미드를 주형로 프라이머를 제작하여 염기서열을 분석하였다.About 350bp of PCR product amplified by CYP degenerate primers was used as a probe by DIG-labeling the cosmid DNA selected from the cosmids selected by PCR-based method, and cosmid DNA treated withBam HI andPst I, respectively, was used. Southern hybridization was performed using the template. At this time, the fragment showing the signal was cloned into pWHM3 (Streptomyces-E. Coli shuttle vector) treated with restriction enzymes, and the nucleotide sequence was analyzed. When the CYP gene was cleaved and cloned, a primer was prepared using a cosmid as a template. The sequence was analyzed.

[실시예 9]Example 9

선별된 코스미드내의 P450 하이드록실레이즈 유전자 염기서열 확인Confirmation of P450 Hydroxylase Gene Sequences in Selected Cosmids

선별된 코스미드내의 P450 하이드록실레이즈 유전자 위치를 예측하고 이를 클로닝을 하기 위해 각각의 코스미드 DNA를BamHI (Promega, USA)와PstI (Promega, USA)로 처리하여 주형로 사용하여 Southern hybridization을 수행하였다. 각각의 코스미드로부터 증폭된 약 350bp PCR 산물을 DIG-labeling해서 프로브로 사용하였고, 포지티브 컨트롤(positive control)로는 프로브를 사용하였다. 각각 선별된 코스미드 단편을 클로닝하여 염기서열 분석을 하였고, 분석된 염기서열을 비교하여 프라이머를 합성하고 염기서열을 분석하는 반응을 반복하였다.In order to predict and clone the P450 hydroxylase gene location in selected cosmids, each cosmid DNA was treated withBam HI (Promega, USA) andPst I (Promega, USA) and subjected to Southern hybridization. It was. About 350 bp PCR product amplified from each cosmid was DIG-labeled and used as a probe, and the probe was used as a positive control. The selected cosmid fragments were cloned and subjected to sequencing. The primers were synthesized by comparing the analyzed nucleotide sequences, and the reaction was repeated.

이와같이, 본 발명에 따르면, 항생제, 항암제, 항진균제의 생합성 과정에 포함된 특이적인 사이토크롬 P450 하이드록실레이즈(CYP)에 의해 새로운 유용생리활성물질이 합성되며, 변형되는 것이다.As such, according to the present invention, new useful physiologically active substances are synthesized and modified by specific cytochrome P450 hydroxylases (CYP) included in the biosynthesis process of antibiotics, anticancer agents, and antifungal agents.

따라서, 신규 CYP의 유전자군을 클로닝하고, 그 염기서열의 특성을 규명함으로써, 새로운 유용생리활성물질 창출에 적용할 수 있는 CYP 유전자군의 확보는 산업적으로 매우 유용한 것이다.
Therefore, by cloning the gene group of the new CYP and characterizing the nucleotide sequence, it is very useful industrially to secure the CYP gene group applicable to the creation of new useful physiologically active substances.

<110> Hanson biotech<120> Isolation and nucleotide seq. of novel CYP genes of P.autotrophica.<160> 9<170> KopatentIn 1.71<210> 1<211> 1242<212> DNA<213> CYP601-1 genes of P.autotrophica.<400> 1atgagcaccg gcaccgcgag gtccacgccg tcggacaccg ccaccggctg ccccgtcacc 60ggggccgggg caggtgccgc cacctgcccg gtggcgttcc cgctgcgccg tccgggaaga 120ccgttcccgc ccccggagta cgccgactac cgcgacggcg gtgagcccgt ccggtccgag 180ctgcccagcg gcccggtctg gctggtcacc cggcacgccg acgtgcgtgc cgtgctcacc 240gacccgcgga tcagcgccga cccctcccga ccgggcttcc cgaaggcggc ccggaccggt 300ggggccccgt ccgcggacga ggtgcccggc tggttcgtgt cgatggaccc gccggagcac 360gaccggttcc gccggaccct gatccccgag ttcaccgtcc gcaaggtgcg cgcgctgcgc 420ccggagatcc agcagatcgt cgacgaccgg atcgaggcga tcctcgcgaa ggacggcgcc 480gccgacctga tcgaggactt cgcgctgccg gtgccgtccc tggtgatcgc gggcatgctc 540ggcgtcccgc gggccgaccg cgacttcttc gaggcgaaga cccgcgtcct ggtcactctc 600agctccagcg acgaggaacg cgacgcggcg accgcggccc tgctgcgcta cctgggccgg 660ctcatccgga tcaaggagcg gcgccccggc accgacctga 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cccggcccgt 1140ccggtgcagg agatgcgccg cggctccgag ggactgtccg gtggtctgac ggagctgccc 1200gtcacctggt ga 1212<210> 3<211> 1215<212> DNA<213> CYP602 genes of P.autotrophica.<400> 3atgaccgaca ccgccacgga cttcacgctc ccgctgcaca tgcgccgcga ccggttcctg 60cccgacgccg agctggagcg catccgcgac tccggcgacg tcccacgggt gcggaccgcc 120ttcggcgccg aggcctacct cgtcacccgc tacgacgacg tgcggcacgt gctcggcgac 180gccgcgacct actccaacgc cgggagcgcc gagctgaccc gcccggacgc accgccgctg 240tcggagcgcg agcaggagca gatgcgggcc ggccagctgc tgctgcagga cccgccggag 300cacacccggc tgcgccgctt cctcacccgc gagttcaccc agcgccggat ggcccgcctg 360gagccgcgga tcaccgagat cgtcgacgag cacctcgacg cgctggaggc cgccgggccg 420ggtgccgacc tggtctccct gttcgccctg ccggtgccgt cgatggtcat ctgcgagctg 480ctcggggtgc cctacaccga ccgcgacgag ttcaccgccc ggtcgacgcg cctgctcgac 540gtgtccctgc ccgcccggga gcggctggcc gtgggccggg agaaccgcgc ctacatgagc 600cggctcgtcg acgcggctct ggccgacccg ggcgaggaca tcctcgggat gctgatccgc 660gagcacggcg aggagatcag ccacgacgag ctggtcggga tcgcgtcgct gctgctgatc 720gccgggcacg agacgacgtc gaacatgctg tcgctgggca ccctggcgct gctggaggac 780ccggagcagg ccgcgctgct gcgcagcgac cccgagctgg cccggcccgc cgtggaggag 840ttgctccggt ggctgtcgat cgtgcacacc ggtgtggtcc gggtgacgac gaccgacacc 900gtcctgcgcg acaccccgat cccggcgcgg tcgctggtga tgtgctcgct gcccaccgcc 960aaccgcgaca ccgggtccgg gttcgacgac cccgcccggc tcgacctcac ccgcggcgcg 1020gccggacatg tcgcgttcgg gcacggtgtg caccactgcc tgggtgcccc gctggcccgg 1080atggagatgg cgacggcgtt cccggccctg ctccgccgct tcccgacgct cgccccggcc 1140gggccggtcc cgcccgaggc cttccgggcc taccacttcg tctacggcat gcacacgctg 1200ccggtgacct ggtga 1215<210> 4<211> 1212<212> DNA<213> CYP605 genes of P.autotrophica.<400> 4atgacgatcg accacgacac ccggccggtg gtgctggacc aggacttctt cgacgatccc 60gatgagctct accgcgagct gcgcgacgcg cgtccggtca cccgtgcgac cggcccgaac 120gggctgacgt tctggatgat cacccgctac gacgacgccc gcgccgcgct gaacgacccg 180cggctgcgga aggattcccg gcggctgccc gaggtgctgc agcggcacgg cgcgacctcg 240ttccgccagt tcgccgactc gctcgtcggg cacatgctca acgccgaccc accggaccac 300acccggctgc gcaagctggt cgggcgggcg ttcaccgtcc gcgcgatcgc ccggctgcgg 360ccgcggatcg agcagatcgc caccgagctc gccgacgccg ccgagcaggc gggtcccgag 420ctggacctgc tggaccactt cgcgttcccg ctgccgatga cggtcatctc cgagatcctc 480ggcgtcccgg gggagcggcg cgaggacttc cggcactggt cgaacctgct gctctccagc 540ggccccgacg aggagcgcgc cgcggccgcc gcgtcgatgg cgcagttcct gtccgagctc 600gtcgccgaca agtccgccca ccccggcgac gacatgctgt ccgagatcgt ccgcgcctcg 660gaggacggcg actcgctcag ctccaccgag gtcaccgcga tggcgttcct gctgctggtc 720gccgggcacg agaccacggt caacctcatc ggcaacggca tgctggcgct gctgcgcgac 780cccgaccagc acgcccggct gcgcgccgac cccgaccggg tgccgcaggc ggtcgaggag 840ttcctgcgct acgacggacc ggtcaacctc gccacgatcc gcttcaccga cgagcccgtc 900gagtactccg gtgtgacgat cccggccggc gaggtcgtgc tggtctcact gatcggggcc 960aaccgcgacc ccgggcgcta cccggacccg cagcggttcg accccgatcg cgacacctcc 1020gggcacctcg ctttcggcta cggcatccac cactgcctcg gcgccccgct ggcccgcctc 1080gaggccgacg tcgcgttccg gacgctgctc gcgcggttcc cggacatggc gctcgccggc 1140gcccccgggc agtaccggga gagcacgctg atccacgcgc tcacggcgct cccggtgcgc 1200ctgaacgcat ga 1212<210> 5<211> 117<212> PRT<213> CYP of Rhodococcus fascians<400> 5Leu Ile Met Leu Gly Gly His Glu Thr Thr Ala Ser Met Ile Gly Leu 1 5 10 15 Ser Val Leu Ala Leu Leu His His Pro Glu Gln Ala Ala Met Met Ile 20 25 30 Glu Asp Pro Asn Cys Val Asn Ser Gly Ile Glu Glu Leu Leu Arg Trp 35 40 45 Leu Ser Val Ala His Ser Gln Pro Pro Arg Met Ala Val Thr Glu Val 50 55 60 Gln Ile Ala Gly Val Thr Ile Pro Ala Gly Ser Phe Val Ile Pro Ser 65 70 75 80 Leu Leu Ala Ala Asn Arg Asp Ser Asn Leu Thr Asp Arg Pro Asp Asp 85 90 95 Leu Asp Ile Thr Arg Gly Val Ala Gly His Leu Ala Phe Gly His Gly 100 105 110 Val His Phe Cys Leu 115 <210> 6<211> 116<212> PRT<213> CYP monooxygenase of Amycolatopsis mediterranei<400> 6Leu Leu Leu Ile Ala Gly Tyr Asp Thr Thr Ala Ser Met Leu Gly Leu 1 5 10 15 Gly Ile Phe Val Leu Leu Gln Arg Pro Ala Gln Leu Ala Thr Leu Arg 20 25 30 Asp Asp Pro Ser Arg Ile Ala Asp Ala Val Glu Gly Leu Leu Arg Tyr 35 40 45 Leu Ser Val Val Asn Pro Gly Ile Phe Arg Phe Ala Lys Glu Asp Leu 50 55 60 Glu Phe Ala Gly Glu His Ile Pro Ala Gly Ser Thr Val Val Val Ser 65 70 75 80 Val Val Ala Thr Asn Arg Asp Ala Arg His Trp Pro Asp Pro Asp Leu 85 90 95 Asp Leu Thr Arg Pro Arg Gly Pro His Leu Ala Phe Gly His Gly Val 100 105 110 His Gln Cys Leu 115 <210> 7<211> 116<212> PRT<213> CYP of Streptomyces coelicolor A3(2)<400> 7Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu 1 5 10 15 Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Thr Asn Pro Gly Arg Leu Ala Glu Leu Arg 20 25 30 Ala Asp Pro Ala Leu Leu Pro Gly Ala Val Glu Glu Leu Met Arg Val 35 40 45 Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Leu Arg Met Ala Thr Glu Asp Ile Asp 50 55 60 Val Asp Gly Gln Thr Ile Arg Ala Gly Asp Gly Val Val Phe Ser Thr 65 70 75 80 Ser Val Ile Asn Arg Asp Glu Ser Val Tyr Pro Glu Pro Asp Ala Leu 85 90 95 Asp Trp His Arg Pro Ala Arg His His Val Ala Phe Gly Phe Gly Ile 100 105 110 His Gln Cys Leu 115 <210> 8<211> 117<212> PRT<213> CYP of Streptomyces ansochromogenes<400> 8Met Leu Leu Val Ala Gly His Gln Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu 1 5 10 15 Gly Val Val Ala Leu Leu Glu Asn Pro Glu His Lys Ala Arg Ile Ala 20 25 30 Ala Asp Ser Ser Leu Leu Pro Pro Ala Ile Glu Glu Met Leu Arg Tyr 35 40 45 Phe Ser Val Val Glu Asn Ala Pro Ala Arg Val Ala Thr Glu Asp Ile 50 55 60 Ala Ile Gly Gly Val Thr Ile Arg Lys Asn Glu Gly Ile Val Val Ser 65 70 75 80 Gly Leu Ala Ala Asp Trp Asp Asp Glu Val Phe Gly His Pro Asp Arg 85 90 95 Leu Asp Phe Glu Arg Gly Ala Arg His His Val Ala Phe Gly Tyr Gly 100 105 110 Val His Gln Cys Leu 115 <210> 9<211> 116<212> PRT<213> CYP of Streptoalloteichus hindustanus<400> 9Leu Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met Leu Ala Leu Gly 1 5 10 15 Ala Phe Ala Leu Leu Glu His Pro Glu Gln Leu Ala Glu Leu Arg Ala 20 25 30 Asn Pro Asp Leu Met Pro Gly Ala Val Glu Glu Leu Met Arg Tyr Leu 35 40 45 Ser Ile Val His Ile Gly Pro Val Arg Thr Ala Val Ala Asp Val Glu 50 55 60 Ile Glu Gly Gln Leu Ile Arg Ala Gly Glu Ser Val Thr Val Ser Val 65 70 75 80 Pro Ala Ala Asn Trp Asp Pro Ala Lys Phe Pro Glu Pro Glu Arg Leu 85 90 95 Asp Leu Thr Arg Arg Thr Ser Gly His Leu Ala Phe Gly His Gly Val 100 105 110 His Gln Cys Leu 115<110> Hanson biotech<120> Isolation and nucleotide seq. of novel CYP genes of         P.autotrophica.<160> 9<170> KopatentIn 1.71<210> 1<211> 1242<212> DNA<213> CYP601-1 genes of P. autotrophica.<400> 1atgagcaccg gcaccgcgag gtccacgccg tcggacaccg ccaccggctg ccccgtcacc 60ggggccgggg caggtgccgc cacctgcccg gtggcgttcc cgctgcgccg tccgggaaga 120ccgttcccgc ccccggagta cgccgactac cgcgacggcg gtgagcccgt ccggtccgag 180ctgcccagcg gcccggtctg gctggtcacc cggcacgccg acgtgcgtgc cgtgctcacc 240gacccgcgga tcagcgccga cccctcccga ccgggcttcc cgaaggcggc ccggaccggt 300ggggccccgt ccgcggacga ggtgcccggc tggttcgtgt cgatggaccc gccggagcac 360gaccggttcc gccggaccct gatccccgag ttcaccgtcc gcaaggtgcg cgcgctgcgc 420ccggagatcc agcagatcgt cgacgaccgg atcgaggcga tcctcgcgaa ggacggcgcc 480gccgacctga tcgaggactt cgcgctgccg gtgccgtccc tggtgatcgc gggcatgctc 540ggcgtcccgc gggccgaccg cgacttcttc gaggcgaaga cccgcgtcct ggtcactctc 600agctccagcg acgaggaacg cgacgcggcg accgcggccc tgctgcgcta cctgggccgg 660ctcatccgga tcaaggagcg gcgccccggc accgacctga tcagccggct cgccgcgacc 720gggacgttgt cgcgccagga gctctccggt gtggccatgc tgctgctgat cgccggtcac 780gagacgacgg cgaacaacat cggcctcggc atcgtccaac tactgacgaa cccgcagtgg 840atcggcgacg accgcgtcgt cgaggagctg ctgcgctact actcggtggc cgacctggtc 900gcgttccggg tcgcgctggc cgacgtcgag atcggcgggc gcacgatccg cgcgggcgag 960ggcatcctgc cgctgctggc cgccgccaac cacgacgacg acgccttcga cggcgccggc 1020gcgttcgacc cggaacgctc cgcgcgctcg cacgtggcct tcggctacgg cgtgcaccag 1080tgcctgggcc agaacctggt gcggctggag atggagatcg cctaccgcac gctgttcgac 1140cggatcccga cgctgcgcct ggcggtgccc gccgatgacc tgcgcgtgaa gtacgacggc 1200gtgttgttcg gtctgcacga gctcccggtg acctggggct ga 1242<210> 2<211> 1212<212> DNA<213> CYP601-2 genes of P. autotrophica.<400> 2atgaccagcc cgacgacctg cccggtcacc ggcggcgggc ccccgccgtc cctggagggc 60cagaccccgc cggtgctgcg gctgagcccg ctgctgcggg agctgcagca gcaggcaccc 120gtgtgccggg tccggacccc caccggcgac gaggcctggc tggtcacccg ctacgccgag 180ctgaaagcac tgctgcacga cgagcgcctc ggccgcgcgc acgccgatcc ggcgaacgcg 240ccgcggtacg tgcgcaaccc gttcctggac ctgttggtcg tcgacgacgc ccagcaggcc 300cgggacttgc acaccgagat gcggcgcctg ctcaccccgc agttctccgc gcgccgggtg 360ctgggcctgg cgcccacggt gtccgcggtc gccgagcagg tgctcgacgg gttcgtcgcc 420gcgggcaacc ccggcgacct gcacggcggg ttctccatgc tcgctactcg catgacggtg 480ctgtgcgaac tcatcgggat cccgccgcag gaccgacccg agactggtgc gtgcaccatc 540atgacgatgg gggaggtgga cgacgtcgag cgagtcgcca cggtccaggc cgagctgttc 600gggctgctgt ccgccgtccc ccggcgcaag cgggccgagc ccaccgacga cgtcgtgtcc 660cggctgttcg cgcaggtgcc cgacgagcgg atcggcccga tcgccgccgg tgtgctgtta 720gccgggctcg acagcgtccc cagccacgtc gacctgggcg tactgctgtt cgcgacccac 780cccgaccagc tggcggccgc gctcgccgac gagcgcacca tgcgcgaggg cgtcgaggag 840atcctgcgct gcgccaaggc gggcggatcg gtgctgcccc gctatgccac cgacgacgtc 900gagatcggtg gcgtcaccct gcgcaccggc gacctggtgc tgctggactt caccctggtc 960aacttcgaca cccaggtgtt cgacgagccg gaggtgttcg acatccgccg ggagtcgaac 1020ccgcacctga ccttcggaca cggcatgtgg cactgcatcg gcgcaccgct ggcccggatg 1080gcgctgcgga ccgccttcac ccggctgttc acccggctgc cggacctgcg cccggcccgt 1140ccggtgcagg agatgcgccg cggctccgag ggactgtccg gtggtctgac ggagctgccc 1200gtcacctggt ga 1212<210> 3<211> 1215<212> DNA<213> CYP602 genes of P. autotrophica.<400> 3atgaccgaca ccgccacgga cttcacgctc ccgctgcaca tgcgccgcga ccggttcctg 60cccgacgccg agctggagcg catccgcgac tccggcgacg tcccacgggt gcggaccgcc 120ttcggcgccg aggcctacct cgtcacccgc tacgacgacg tgcggcacgt gctcggcgac 180gccgcgacct actccaacgc cgggagcgcc gagctgaccc gcccggacgc accgccgctg 240tcggagcgcg agcaggagca gatgcgggcc ggccagctgc tgctgcagga cccgccggag 300cacacccggc tgcgccgctt cctcacccgc gagttcaccc agcgccggat ggcccgcctg 360gagccgcgga tcaccgagat cgtcgacgag cacctcgacg cgctggaggc cgccgggccg 420ggtgccgacc tggtctccct gttcgccctg ccggtgccgt cgatggtcat ctgcgagctg 480ctcggggtgc cctacaccga ccgcgacgag ttcaccgccc ggtcgacgcg cctgctcgac 540gtgtccctgc ccgcccggga gcggctggcc gtgggccggg agaaccgcgc ctacatgagc 600cggctcgtcg acgcggctct ggccgacccg ggcgaggaca tcctcgggat gctgatccgc 660gagcacggcg aggagatcag ccacgacgag ctggtcggga tcgcgtcgct gctgctgatc 720gccgggcacg agacgacgtc gaacatgctg tcgctgggca ccctggcgct gctggaggac 780ccggagcagg ccgcgctgct gcgcagcgac cccgagctgg cccggcccgc cgtggaggag 840ttgctccggt ggctgtcgat cgtgcacacc ggtgtggtcc gggtgacgac gaccgacacc 900gtcctgcgcg acaccccgat cccggcgcgg tcgctggtga tgtgctcgct gcccaccgcc 960aaccgcgaca ccgggtccgg gttcgacgac cccgcccggc tcgacctcac ccgcggcgcg 1020gccggacatg tcgcgttcgg gcacggtgtg caccactgcc tgggtgcccc gctggcccgg 1080atggagatgg cgacggcgtt cccggccctg ctccgccgct tcccgacgct cgccccggcc 1140gggccggtcc cgcccgaggc cttccgggcc taccacttcg tctacggcat gcacacgctg 1200ccggtgacct ggtga 1215<210> 4<211> 1212<212> DNA<213> CYP605 genes of P. autotrophica.<400> 4atgacgatcg accacgacac ccggccggtg gtgctggacc aggacttctt cgacgatccc 60gatgagctct accgcgagct gcgcgacgcg cgtccggtca cccgtgcgac cggcccgaac 120gggctgacgt tctggatgat cacccgctac gacgacgccc gcgccgcgct gaacgacccg 180cggctgcgga aggattcccg gcggctgccc gaggtgctgc agcggcacgg cgcgacctcg 240ttccgccagt tcgccgactc gctcgtcggg cacatgctca acgccgaccc accggaccac 300acccggctgc gcaagctggt cgggcgggcg ttcaccgtcc gcgcgatcgc ccggctgcgg 360ccgcggatcg agcagatcgc caccgagctc gccgacgccg ccgagcaggc gggtcccgag 420ctggacctgc tggaccactt cgcgttcccg ctgccgatga cggtcatctc cgagatcctc 480ggcgtcccgg gggagcggcg cgaggacttc cggcactggt cgaacctgct gctctccagc 540ggccccgacg aggagcgcgc cgcggccgcc gcgtcgatgg cgcagttcct gtccgagctc 600gtcgccgaca agtccgccca ccccggcgac gacatgctgt ccgagatcgt ccgcgcctcg 660gaggacggcg actcgctcag ctccaccgag gtcaccgcga tggcgttcct gctgctggtc 720gccgggcacg agaccacggt caacctcatc ggcaacggca tgctggcgct gctgcgcgac 780cccgaccagc acgcccggct gcgcgccgac cccgaccggg tgccgcaggc ggtcgaggag 840ttcctgcgct acgacggacc ggtcaacctc gccacgatcc gcttcaccga cgagcccgtc 900gagtactccg gtgtgacgat cccggccggc gaggtcgtgc tggtctcact gatcggggcc 960aaccgcgacc ccgggcgcta cccggacccg cagcggttcg accccgatcg cgacacctcc 1020gggcacctcg ctttcggcta cggcatccac cactgcctcg gcgccccgct ggcccgcctc 1080gaggccgacg tcgcgttccg gacgctgctc gcgcggttcc cggacatggc gctcgccggc 1140gcccccgggc agtaccggga gagcacgctg atccacgcgc tcacggcgct cccggtgcgc 1200ctgaacgcat ga 1212<210> 5<211> 117<212> PRT<213> CYP of Rhodococcus fascians<400> 5Leu Ile Met Leu Gly Gly His Glu Thr Thr Ala Ser Met Ile Gly Leu  1 5 10 15Ser Val Leu Ala Leu Leu His His Pro Glu Gln Ala Ala Met Met Ile             20 25 30Glu Asp Pro Asn Cys Val Asn Ser Gly Ile Glu Glu Leu Leu Arg Trp         35 40 45Leu Ser Val Ala His Ser Gln Pro Pro Arg Met Ala Val Thr Glu Val     50 55 60Gln Ile Ala Gly Val Thr Ile Pro Ala Gly Ser Phe Val Ile Pro Ser 65 70 75 80Leu Leu Ala Ala Asn Arg Asp Ser Asn Leu Thr Asp Arg Pro Asp Asp                 85 90 95Leu Asp Ile Thr Arg Gly Val Ala Gly His Leu Ala Phe Gly His Gly            100 105 110Val His Phe Cys Leu        115<210> 6<211> 116<212> PRT<213> CYP monooxygenase of Amycolatopsis mediterranei<400> 6Leu Leu Leu Ile Ala Gly Tyr Asp Thr Thr Ala Ser Met Leu Gly Leu  1 5 10 15Gly Ile Phe Val Leu Leu Gln Arg Pro Ala Gln Leu Ala Thr Leu Arg             20 25 30Asp Asp Pro Ser Arg Ile Ala Asp Ala Val Glu Gly Leu Leu Arg Tyr         35 40 45Leu Ser Val Val Asn Pro Gly Ile Phe Arg Phe Ala Lys Glu Asp Leu     50 55 60Glu Phe Ala Gly Glu His Ile Pro Ala Gly Ser Thr Val Val Val Ser 65 70 75 80Val Val Ala Thr Asn Arg Asp Ala Arg His Trp Pro Asp Pro Asp Leu                 85 90 95Asp Leu Thr Arg Pro Arg Gly Pro His Leu Ala Phe Gly His Gly Val            100 105 110His Gln Cys Leu        115<210> 7<211> 116<212> PRT<213> CYP of Streptomyces coelicolor A3 (2)<400> 7Ile Leu Leu Val Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu  1 5 10 15Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Thr Asn Pro Gly Arg Leu Ala Glu Leu Arg             20 25 30Ala Asp Pro Ala Leu Leu Pro Gly Ala Val Glu Glu Leu Met Arg Val         35 40 45Leu Ser Ile Ala Asp Gly Leu Leu Arg Met Ala Thr Glu Asp Ile Asp     50 55 60Val Asp Gly Gln Thr Ile Arg Ala Gly Asp Gly Val Val Phe Ser Thr 65 70 75 80Ser Val Ile Asn Arg Asp Glu Ser Val Tyr Pro Glu Pro Asp Ala Leu                 85 90 95Asp Trp His Arg Pro Ala Arg His His Val Ala Phe Gly Phe Gly Ile            100 105 110His Gln Cys Leu        115<210> 8<211> 117<212> PRT<213> CYP of Streptomyces ansochromogenes<400> 8Met Leu Leu Val Ala Gly His Gln Thr Thr Ala Asn Met Ile Ser Leu  1 5 10 15Gly Val Val Ala Leu Leu Glu Asn Pro Glu His Lys Ala Arg Ile Ala             20 25 30Ala Asp Ser Ser Leu Leu Pro Pro Ala Ile Glu Glu Met Leu Arg Tyr         35 40 45Phe Ser Val Val Glu Asn Ala Pro Ala Arg Val Ala Thr Glu Asp Ile     50 55 60Ala Ile Gly Gly Val Thr Ile Arg Lys Asn Glu Gly Ile Val Val Ser 65 70 75 80Gly Leu Ala Ala Asp Trp Asp Asp Glu Val Phe Gly His Pro Asp Arg                 85 90 95Leu Asp Phe Glu Arg Gly Ala Arg His His Val Ala Phe Gly Tyr Gly            100 105 110Val His Gln Cys Leu        115<210> 9<211> 116<212> PRT<213> CYP of Streptoalloteichus hindustanus<400> 9Leu Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ala Asn Met Leu Ala Leu Gly  1 5 10 15Ala Phe Ala Leu Leu Glu His Pro Glu Gln Leu Ala Glu Leu Arg Ala             20 25 30Asn Pro Asp Leu Met Pro Gly Ala Val Glu Glu Leu Met Arg Tyr Leu         35 40 45Ser Ile Val His Ile Gly Pro Val Arg Thr Ala Val Ala Asp Val Glu     50 55 60Ile Glu Gly Gln Leu Ile Arg Ala Gly Glu Ser Val Thr Val Ser Val 65 70 75 80Pro Ala Ala Asn Trp Asp Pro Ala Lys Phe Pro Glu Pro Glu Arg Leu                 85 90 95Asp Leu Thr Arg Arg Thr Ser Gly His Leu Ala Phe Gly His Gly Val            100 105 110His Gln Cys Leu        115 

Claims (5)

Translated fromKorean

i) 슈도노카디아 오토트로피카로부터 전체 염색체(total chromosomal DNA)를 분리하는 단계;i) separating total chromosomal DNA from Pseudo norcadia autotrophica;ii) 상기 전체 염색체로부터 재조합 콜로니를 제작하는 단계;ii) producing recombinant colonies from the whole chromosome;iii) 5'-TXCTXCTXATCGCXGGXCACGAGAC-3'(Deg-1, X는 G 또는 C를 나타낸다)과 5'-GCXAGGTTCTGXCCXAGGCACTGGTG-3'(Deg-2, X는 G 또는 C를 나타낸다)의 축퇴성 프라이머를 제작하는 단계;iii) Degenerate primers of 5'-TXCTXCTXATCGCXGGXCACGAGAC-3 '(Deg-1, X represents G or C) and 5'-GCXAGGTTCTGXCCXAGGCACTGGTG-3' (Deg-2, X represents G or C) step;iv) 상기 재조합 콜로니를 주형으로 하고 상기 축퇴성 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 증폭하는 단계;iv) amplifying by using the recombinant colonies as a template and performing PCR using the degenerate primers;v) 상기 iv)단계에서 증폭된 DNA 단편을 pGEM T-easy vector(Promega, USA)에 클로닝하여 E. coli DH5a을 형질전환시키는 단계;v) transforming E. coli DH5a by cloning the DNA fragment amplified in step iv) into pGEM T-easy vector (Promega, USA);vi) 상기 형질전환된 E. coli DH5a로부터 재조합 플라스미드를 추출하는 단계; 그리고vi) extracting the recombinant plasmid from the transformed E. coli DH5a; Andvii) 상기 재조합 플라스미드의 염기 서열을 분석하는 단계를 포함하는, 슈도노카디아 오토트로피카의 CYP 유전자의 염기 서열 확인 방법에 있어서,vii) a method for identifying a nucleotide sequence of CYP gene of pseudonocadia autotrophica, comprising analyzing the nucleotide sequence of the recombinant plasmid,상기 ii)단계의 재조합 콜로니는 상기 전체 염색체를EcoRV로 처리하여 얻은 40kb 이상의 DNA 절편을 pOJ446에 클로닝하여 제작하는 것이고; 상기 iii)단계의 축퇴성 프라이머는 방선균 유래의 CYP의 아미노산 서열 중 보존되어 있는 산소 결합 부위와 헴 리간드 포켓으로부터 제작되며; 상기 vi)단계의 재조합 플라스미드는 상기 형질전환된 E. coli DH5a를 100μg/ml 앰피실린이 첨가된 LB 배지에서 배양한 후 알카라인 용해와 아세트산나트륨 침전을 통하여 얻어지고; 상기 vii)단계가 상기 재조합 플라스미드 DNA를 BamHI(Promega, USA)와 PstI(Promega, USA)로 처리하여 주형으로 사용하고, 상기 전체 염색체와 상기 축퇴성 프라이머로부터 증폭된 PCR 산물을 프로브로 사용하여 서던 하이브리드화(Southern hybridization)를 수행함으로써 상기 재조합 플라스미드의 염기 서열을 분석하는 것임을 특징으로 하는, 슈도노카디아 오토트로피카의 CYP 유전자의 염기 서열 확인 방법.Recombinant colony of step ii) is to clone the DNA fragment of 40kb or more obtained by treating the whole chromosome withEco RV to pOJ446; The degenerate primer of step iii) is prepared from a conserved oxygen binding site and a heme ligand pocket in the amino acid sequence of CYP derived from actinomycetes; The recombinant plasmid of step vi) is obtained through alkaline lysis and sodium acetate precipitation after culturing the transformed E. coli DH5a in LB medium to which 100 μg / ml ampicillin is added; In step vii), the recombinant plasmid DNA is treated with BamHI (Promega, USA) and PstI (Promega, USA) as a template, and the PCR product amplified from the whole chromosome and the degenerate primer is used as a probe. Method of confirming the nucleotide sequence of CYP gene of Pseudonodia autotrophica, characterized in that by analyzing the nucleotide sequence of the recombinant plasmid by performing a hybridization (Southern hybridization).제1항에 있어서, 상기 CYP 유전자가 서열번호 1의 서열을 포함하는 슈도노카디아 오토트로피카의 CYP601-1 유전자인 것임을 특징으로 하는 슈도노카디아 오토트로피카의 CYP 유전자의 염기 서열 확인 방법.The method according to claim 1, wherein the CYP gene is a CYP601-1 gene of Pseudonodia diaphitrophica comprising the sequence of SEQ ID NO: 1.제1항에 있어서, 상기 CYP 유전자가 서열번호 2의 서열을 포함하는 슈도노카디아 오토트로피카의 CYP601-2 유전자인 것임을 특징으로 하는 슈도노카디아 오토트로피카의 CYP 유전자의 염기 서열 확인 방법.The method of claim 1, wherein the CYP gene is a CYP601-2 gene of Pseudonodia diaphitropha comprising the sequence of SEQ ID NO: 2.제1항에 있어서, 상기 CYP 유전자가 서열번호 3의 서열을 포함하는 슈도노카디아 오토트로피카의 CYP602 유전자인 것임을 특징으로 하는 슈도노카디아 오토트로피카의 CYP 유전자의 염기 서열 확인 방법.The method of claim 1, wherein the CYP gene is a CYP602 gene of Pseudonodia diaphitropha comprising the sequence of SEQ ID NO: 3.제1항에 있어서, 상기 CYP 유전자가 서열번호 4의 서열을 포함하는 슈도노카디아 오토트로피카의 CYP605 유전자인 것임을 특징으로 하는 슈도노카디아 오토트로피카의 CYP 유전자의 염기 서열 확인 방법.The method of claim 1, wherein the CYP gene is a CYP605 gene of Pseudonodia diaphitrophica comprising the sequence of SEQ ID NO: 4.

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