본 발명은 일반적으로 연쇄체 단백질에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 한 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위 C-말단에 동일하거나 상이한 다른 한 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위 N-말단이 결합된 연쇄체 단백질 및 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 단백질의 직렬 연쇄체 (concatamer)가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지(hinge)에 결합되어 융합된 단량체 (monomer) 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합에 의해 형성된 이량체(dimer) 단백질 및 이의 당화된 이량체 단백질에 관한 것이다.The present invention relates generally to concatemer proteins. More specifically, the present invention relates to a chain protein in which the soluble site C-terminus of one biologically active protein is the same or different from the soluble site N-terminus of another biologically active protein, and the extracellular domain of the protein involved in the immune response. A dimer protein and its glycosylated dimer formed by disulfide bonds in the hinge portion of two monomer proteins fused with a concatamer of a soluble protein bound to the hinge of an immunoglobulin Fc fragment It relates to a body protein.
사이토카인(cytokine)은 인간의 자가항원(autoantigen)과 같이 부적절한 자극에 의해 병리학적으로 악화된 염증 반응이 유발될 때 작용하고, 사이토카인 작용 억제제인 가용성 물질들은 사이토카인을 인식할 수 있는 항체와 가용성 수용체 (soluble receptor)가 사용되고 있으며, 이 물질들에 대한 많은 특허가 있다(국제특허출원 공개 제W093/016184호, 제W096/02576호, 제W096/023067호 및 제 W01997/03682호 및 미국특허 제6,225,117호, 제5,656,272호, 제6,210,661호, 제 5,977,318호, 제5,789,192호 및 제5,434,131호). 상기한 항체와 가용성 수용체 물질들은 사이토카인과 미리 결합하여 사이토카인이 세포막에 존재하는 수용체와 결합하는 것을 방해하거나 수용체와 직접 결합함으로써 사이토카인에 의한 신호전달을 억제하는 공통적인 기작을 갖고 있다.Cytokines act when pathologically exacerbated inflammatory responses are caused by inappropriate stimuli, such as human autoantigens. Soluble substances, cytokine inhibitors, Soluble receptors are used, and there are many patents for these materials (International Patent Application Publications W093 / 016184, W096 / 02576, W096 / 023067 and W01997 / 03682 and US Patents). 6,225,117, 5,656,272, 6,210,661, 5,977,318, 5,789,192 and 5,434,131). The above antibodies and soluble receptor substances have a common mechanism of inhibiting cytokine signal transduction by binding to cytokines in advance and preventing cytokines from binding to receptors present in the cell membrane or by directly binding to the receptors.
사이토카인 작용 억제제로 사용되는 가용성 수용체는 인간 면역글로불린 (hIg, human immunoglobulin)의 중쇄부위(heavy chain)와 연결하여 사용할 수 있는 것으로 카폰(Capon DJ) 등의 문헌(Nature 337:525, 1989)에 의해 개시되었고, 이후 가용성 수용체와 항체의 융합 단백질들이 많은 특허를 통해 교시되었다(미국특허 제5,844,095호, 제6,225,448호, 제6,090,914호, 제6,100,383호, 제6,046,310호 및 제5,521,288호).Soluble receptors used as cytokine inhibitors can be used in conjunction with the heavy chain of human immunoglobulin (hIg), as described in Capon DJ et al. (Nature 337: 525, 1989). And fusion proteins of soluble receptors and antibodies have been taught in many patents (US Pat. Nos. 5,844,095, 6,225,448, 6,090,914, 6,100,383, 6,046,310 and 5,521,288).
일반적으로, 사이토카인의 가용성 수용체와 면역글로불린의 융합체는 원래분자의 단량체(monomer) 또는 면역글로불린과 융합되지 않은 분자에 비해 다음과 같은 장점을 갖고 있다(카폰 등의 상기 문헌):In general, the fusion of cytokine soluble receptors and immunoglobulins has the following advantages over monomers of the original molecule or molecules that are not fused with immunoglobulins (Kapon et al., Supra):
1) 이량체(dimer) 형태에서 융합 단백질은 이가화(bivalency)가 되므로 리간드(ligand)에 대한 총 친화력(avidity)이 증가;1) In dimer form, the fusion protein is bivalent, thus increasing the total affinity for the ligand;
2) 혈청내에서 파괴되지 않고 존재할 수 있는 기간의 증가, 즉 분자의 안정성 증가;2) an increase in the period of time that can remain in the serum without destruction, ie, increase the stability of the molecule;
3) 면역글로불린 중쇄의 Fc(fragment crystallizable) 조각을 통한 효과세포 (effector cell)의 활성화; 및3) activation of effector cells through fragment crystallizable (Fc) fragments of immunoglobulin heavy chains; And
4) 단백질 분리 정제의 편리성(예, 프로테인 A를 이용한 분리 정제).4) Convenience of protein isolation and purification (eg, separation and purification using protein A).
대부분의 수용체 세포외역(extracellular domain)과 면역글로불린 상쇄간의 융합체는 중쇄부위의 CH1 도메인을 제외한 형태로 제작되고 있는데 그 결과 면역글로불린의 경쇄(light chain)와 결합하지 않은 이량체로 제조된다. 이와 같이, 면역반응을 매개하는데 관여하는 단백질 또는 상기 단백질의 수용체의 경우, 원래 분자의 단량체보다는 면역글로불린과 연결하여 사용하는 것이 바람직하다는 것이 알려져 있다. 보다 구체적으로 살펴보면, 사이토카인의 한 종류인 종양괴사인자(tumor necrosis factor, 이하 'TNF'로 약칭할 수 있다)의 경우, TNF-의존성 염증 반응을 억제하기 위해 국제특허출원 공개 제W092/16221호 및 제W095/34326호에서와 같이 종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor receptor, 이하 'TNFR'로 약칭할 수 있다)를 사용하거나, 미국특허 제5,447,851호 및 국제특허출원 공개 제W094/06476호에서와 같이 TNFR-면역글로불린의 융합 단백질이 사용되고 있다. 많은 문헌에 의하면 TNFR-면역글로불린 융합 단백질은 원래 분자의 단량체 또는 면역글로불린과 융합되지 않는 분자보다 TNF에 대해 더 높은 친화력(affinity)을 갖는 것으로 보고되고 있다[레스라우어(Lesslauer W)등의 문헌(Eur. J. Immunol. 21:2883, 1991), 아쉬케나지(Ashkenazi A) 등의 문헌(PNAS USA 88:10535, 1991), 페펠(Peppel K) 등의 문헌(J. Exp. Med. 174:1483, 1991), 몰러(Mohler KM) 등의 문헌(J. Immunol. 151.1548, 1993)].Most of the fusion between the extracellular domain of the receptor and the immunoglobulin offset is produced in the form except the CH1 domain of the heavy chain region, and as a result, it is produced as a dimer which does not bind to the light chain of the immunoglobulin. As such, it is known that in the case of a protein involved in mediating an immune response or a receptor of the protein, it is preferable to use the immunoglobulin in connection with the monomer of the original molecule. More specifically, in the case of tumor necrosis factor, which is a type of cytokine (hereinafter, abbreviated as 'TNF'), international patent application publication No. W092 / 16221 for suppressing TNF-dependent inflammatory response And tumor necrosis factor receptor (hereinafter abbreviated as 'TNFR') as in WO095 / 34326, or in US Pat. No. 5,447,851 and WO094 / 06476. Likewise, a fusion protein of TNFR-immunoglobulin is used. Many documents report that TNFR-immunoglobulin fusion proteins have a higher affinity for TNF than molecules of the original molecule or molecules that are not fused with immunoglobulins (Lesslauer W et al. (Eur. J. Immunol. 21: 2883, 1991), Ashhkenazi A et al. (PNAS USA 88: 10535, 1991), Peppel K et al., J. Exp. Med. 174: 1483 , 1991), Mohler KM et al. (J. Immunol. 151.1548, 1993).
종양괴사인자의 작용을 억제하거나 면역반응을 조절함에 있어서 유효작용부위인 종양괴사인자 수용체, CD2 및 CTLA4의 세포외역 부위를 다가화 혹은 다량체화하면 그 효능의 증가를 예상할 수 있는데, 이러한 목적으로 종양괴사인자 수용체의 세포외역 부위를 면역글로불린의 중쇄와 연결한 융합된 단량체 단백질(중쇄융합단백질)과 종양괴사인자 수용체의 세포외역 부위를 면역글로불린의 경쇄와 연결한 융합된 단량체 단백질(경쇄융합단백질)을 동시에 한 세포주내에서 발현시키면 중쇄와 경쇄간의 결합에 의하여 이량체 구조의 융합 단백질을 제조할 수 있다. 이때 이량체는 유효부위가 생체내에서와 동일하게 병렬 배열된 형태로 제조되고 그 효능은 종래의 단량체에 비하여 현저히 증가됨이 제시된 바 있다[스켈론(Scallon BJ) 등의 문헌(Cytokine 7:759, 1995)] .Multipotent or multimerization of extracellular regions of tumor necrosis factor receptors, CD2 and CTLA4, which are effective sites in suppressing the action of tumor necrosis factor or regulating immune response, can be expected to increase its efficacy. A fused monomer protein (heavy chain fusion protein) connecting the extracellular domain of the tumor necrosis factor receptor with a heavy chain of immunoglobulin and a fused monomer protein (light chain fusion protein) connecting the extracellular domain of the tumor necrosis factor receptor with a light chain of immunoglobulin. ) Is expressed in one cell line at the same time, it is possible to prepare a fusion protein of a dimeric structure by binding between the heavy chain and the light chain. In this case, it has been suggested that the dimers are prepared in the same parallel arrangement as in vivo, and the efficacy is significantly increased compared to the conventional monomers [Scallon BJ et al. (Cytokine 7: 759, 1995)].
그러나, 상기와 같은 면역글로불린 융합 단백질의 제조 방법은 융합 단백질을 제조할 때에 중쇄와 경쇄 각각에 융합시킨 두 개의 유전자를 동시에 생산세포주에 주입해야하고, 세포가 두 종류의 융합 단백질을 생산할 때 두 단백질의 생산수율이 현저히 떨어지며, 생산된 중쇄융합단백질과 경쇄융합단백질들이 100% 결합되지 않아 단량체인 중쇄융합단백질 또는 경쇄융합단백질로부터 중쇄융합단백질과 경쇄융합단백질의 융합된 이량체를 순수 분리하는 공정 등의 기술적 곤란으로 인하여 실용화되기가 어려운 문제점이 있다. 이러한 이유 등으로 지금까지는 면역글로불린 융합 단백질 제제는 두 개의 융합단백질이 단순히 서로 병렬 배열된 이량체 형태로 제조 사용되고 있었다.However, the method for producing an immunoglobulin fusion protein as described above requires the injection of two genes fused to each of the heavy and light chains to the production cell line at the same time when the fusion protein is produced, and the two proteins when the cell produces two kinds of fusion proteins. Production yield is significantly lowered, and the process for separating the fused dimer of heavy chain fusion protein and light chain fusion protein from the heavy chain fusion protein or light chain fusion protein which is not 100% of the produced heavy chain fusion protein and light chain fusion protein. Due to the technical difficulty of the problem is difficult to be practical. For this reason, so far, immunoglobulin fusion protein preparations have been used in the form of dimers in which two fusion proteins are simply arranged in parallel with each other.
따라서, 면역반응에 관여하는 단백질의 효과를 개선하기 위하여 단일 유전자를 발현시켜 단일분자의 형태의 효능이 개선된 다가화 혹은 다량체화 단백질 제제를 생산하는 방법에 대한 요구가 다수 존재하고 있었다.Therefore, there has been a great demand for a method for producing a multivalent or multimerized protein preparation in which a single gene is expressed to improve the efficacy of a single molecule in order to improve the effect of a protein involved in an immune response.
본 발명자들은 한 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위 C-말단에 동일하거나 상이한 다른 한 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위 N-말단이 결합된 연쇄체(concatamer) 형태의 단백질을 DNA 재조합 기술에 의해 제조하였다. 또한, 본 발명자들은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지(hinge) 부위에 결합된 단량체(monomer) 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합(disulfide bond)된 이량체(dimer) 단백질를 코딩하는 DNA 작제물을 제조한 후 이를 토대로 DNA 재조합 기술을 통해 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 및 이의 당화 단백질을 생성하였고, 또한 본 발명자들은 그와 같이 생성된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 및 이의 당화 단백질이 단순 융합된 이량체 단백질에 비하여 향상된 효능을 나타내고, 특히 연쇄 융합된 이량체 단백질이 당화되는 경우 안정성이 현저히 향상된다는 것을 발견하였다.The inventors have produced a concatamer form of protein in which the soluble site N-terminus of the same or different soluble site C-terminus of one biologically active protein is joined by DNA recombination technology. In addition, the present inventors have found that a dimer in which a serial chain of a protein involved in an immune response is disulfide bond at a hinge portion of two monomer proteins bound to a hinge region of an immunoglobulin Fc fragment. After constructing the DNA construct encoding the protein, based on the DNA recombination technology, the serial chain fused dimer protein and its glycosylated protein were generated, and the inventors also observed the serial chain fused dimer protein and the resulting It has been found that glycated proteins show improved efficacy over simple fused dimeric proteins, especially when the chain fused dimeric proteins are glycosylated.
따라서, 한 가지 관점으로서, 본 발명은 한 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위 C-말단에 동일하거나 상이한 다른 한 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위 N-말단이 결합된 인쇄체 단백질을 제공한다.Thus, in one aspect, the present invention provides a print protein wherein the soluble site C-terminus of one biologically active protein is bound to the soluble site N-terminus of another biologically active protein that is the same or different.
다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합된 이량체 단백질을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a dimeric protein in which a series chain of proteins involved in an immune response is bound to the hinge of an immunoglobulin Fc fragment and two fused monomeric proteins are disulfide-bonded at the hinge portion.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a DNA construct that encodes a fused monomeric protein in which a serial chain of proteins involved in an immune response is bound to the hinge of an immunoglobulin Fc fragment.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 포함한 재조합 DNA 플라스미드를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a recombinant DNA plasmid comprising a DNA construct that encodes a fused monomeric protein in which a serial chain of proteins involved in an immune response is bound to the hinge of an immunoglobulin Fc fragment.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 포함한 재조합 DNA 플라스미드로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.In another aspect, the invention provides a host cell transformed or transfected with a recombinant DNA plasmid comprising a DNA construct encoding a fusion monomer protein in which a serial chain of proteins involved in an immune response is bound to the hinge of an immunoglobulin Fc fragment. To provide.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 포함한 재조합 DNA 플라스미드로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를, 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물이 발현되도록 하기에 적합한 조건하에서 배양하고, 배양물로부터 상기 단량체 단백질의 이량체 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하여, 상기 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합에 의해 융합된 이량체 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.In another aspect, the invention provides a host cell transformed or transfected with a recombinant DNA plasmid comprising a DNA construct encoding a fusion monomer protein in which a serial chain of proteins involved in an immune response is bound to the hinge of an immunoglobulin Fc fragment. Incubated under suitable conditions such that a serial construct of a protein involved in an immune response is bound to the hinge of an immunoglobulin Fc fragment to express a DNA construct encoding a fused monomeric protein, and the amount of the monomeric protein from the culture Including a step of separating and purifying the sieve protein, it provides a method for producing a dimer protein in which the two monomer proteins are fused by disulfide bond in the hinge portion.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질을 코딩하고 당화 모티브가 삽입된 DNA 작제물을 포함한 재조합 DNA 플라스미드로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를, 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물이 발현되도록 하기에 적합한 조건하에서 배양하고, 배양물로부터 당질화된 상기 단량체 단백질의 이량체 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하여, 상기 단량체 단백질 두개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합에 의해 융합되고 당질화된 이량체 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention is directed to a recombinant DNA plasmid comprising a DNA construct in which a serial chain of proteins involved in an immune response binds to the hinge of an immunoglobulin Fc fragment, encodes a fused monomeric protein and incorporates a glycosylation motif. Or the transfected host cell is cultured under conditions suitable for the serial chain of the protein involved in the immune response to bind to the hinge of the immunoglobulin Fc fragment and express the DNA construct encoding the fused monomeric protein, and from the culture Provided is a method for preparing a glycosylated dimer protein in which the two monomer proteins are fused and dissociated by disulfide bonds in the hinge portion, including the step of separating and purifying the dimerized protein of the monomerized glycoprotein.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물에 당화 모티브를 삽입하기 위해 사용되는 DNA 프라이머를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a DNA primer that is used to insert a glycosylation motif into a DNA construct that encodes a fused monomeric protein in which a serial chain of proteins involved in an immune response is bound to the hinge of an immunoglobulin Fc fragment. do.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합에 의해 융합되고 당화된 이량체 단백질을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a dimeric protein in which a series chain of proteins involved in an immune response is bound to the hinge of an immunoglobulin Fc fragment and two fused monomer proteins are fused and glycosylated by disulfide bonds at the hinge portion. .
또 다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지부분에서 디설파이드 결합에 의해 융합된 이량체 단백질을 약제학적 유효량으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 약제 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutically effective amount of a dimeric protein in which a tandem chain of proteins involved in an immune response is bound to the hinge of an immunoglobulin Fc fragment and fused by disulfide bonds at the hinge portion. Provided are pharmaceutical compositions containing together with a pharmaceutically acceptable carrier.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 면역반응에 관여하는 단백질의 직렬 연쇄체가 면역글로불린 Fc 조각의 힌지에 결합되어 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부분에서 디설파이드 결합에 의해 융합되고 당화된 이량체 단백질을 약제학적 유효량으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 약제 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a dimeric protein in which a serial chain of a protein involved in an immune response is bound to the hinge of an immunoglobulin Fc fragment and fused and glycosylated dimer protein is fused and glycosylated at the hinge portion. Provided are pharmaceutical compositions containing in an effective amount together with a pharmaceutically acceptable carrier.
도 1은 종래의 단순 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 중합효소 연쇄반응에 의해 제조하는 과정을 도시한 개략도이다.1 is a schematic diagram illustrating a process for preparing a DNA construct encoding a conventional simple fused monomer protein by polymerase chain reaction.
도 2는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 중합효소 연쇄반응에 의해 제조하는 과정을 나타낸 개략도이다.Figure 2 is a schematic diagram showing a process for preparing a DNA construct encoding a serial chain fused monomer protein according to the present invention by a polymerase chain reaction.
도 3a는 종래의 단순 융합된 단량체 단백질을 예시하는 TNFR/Fc, CD2/Fc 또는 CTLA4/Fc 융합 단백질이 세포내에서 이량체화하여 형성되는 단순 융합된 이량체 단백질 [TNFR/Fc]2, [CD2/Fc]2또는 [CTLA4/Fc]2융합 단백질의 구조를 도시한 것이다.3A shows a simple fused dimer protein [TNFR / Fc]2 , [CD2] formed by dimerizing intracellularly of a TNFR / Fc, CD2 / Fc or CTLA4 / Fc fusion protein illustrating a conventional simple fused monomeric protein. / Fc]2 or [CTLA4 / Fc]2 fusion protein.
도 3b는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질을 예시하는 TNFR-TNFR/Fc, CD2-CD2/Fc 또는 CTLA4-CTLA4/Fc 융합 단백질이 세포내에서 이량체화하여 형성되는 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [TNFR-TNFR/Fc]2, [CD2-CD2/Fc]2또는 [CTLA4-CTLA4/Fc]2융합 단백질의 구조를 도시한 것이다.Figure 3b is a serial chain fused dimer formed by dimerization intracellularly of a TNFR-TNFR / Fc, CD2-CD2 / Fc or CTLA4-CTLA4 / Fc fusion protein illustrating a series chain fused monomeric protein according to the present invention. The structure of protein [TNFR-TNFR / Fc]2 , [CD2-CD2 / Fc]2 or [CTLA4-CTLA4 / Fc]2 fusion protein is shown.
도 4a는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질의 한 예로서 [TNFR1-TNFR1/Fc]2의 구조를 도시한 것이다.4A shows the structure of [TNFR1-TNFR1 / Fc]2 as an example of a serial chain fused dimer protein according to the present invention.
도 4b는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질의 다른 예로서[TNFR2-TNFR2/Fc]2의 구조를 도시한 것이다.4B shows the structure of [TNFR2-TNFR2 / Fc]2 as another example of a serial chain fused dimer protein according to the present invention.
도 4c는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질의 또 다른 예로서 [CD2-CD2/Fc]2의 구조를 도시한 것이다.4C shows the structure of [CD2-CD2 / Fc]2 as another example of a series chain fused dimer protein according to the present invention.
도 4d는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질의 또 다른 예로서 [CTLA4-CTLA4/Fc]2의 구조를 도시한 것이다.4D shows the structure of [CTLA4-CTLA4 / Fc]2 as another example of a serial chain fused dimer protein according to the present invention.
도 5는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질의 다른 예로서 TNFR1-TNFR1/Fc을 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pTR11Ig-Top10'를 작제하는 과정을 도해한 다이아그램이다.FIG. 5 is a diagram illustrating a process for constructing the recombinant expression plasmid pTR11Ig-Top10 'of the present invention expressing TNFR1-TNFR1 / Fc as another example of a serial chain fused monomeric protein according to the present invention.
도 6은 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CD2-CD2/Fc을 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pCD22Ig를 작제하는 과정을 도해한 다이아그램이다.Figure 6 is a diagram illustrating the process for constructing the recombinant expression plasmid pCD22Ig of the present invention expressing the serial chain fused monomer protein CD2-CD2 / Fc according to the present invention.
도 7은 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR1-TNFR1/Fc를 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pTR11Ig-Top10'의 지도이다.Figure 7 is a map of the recombinant expression plasmid pTR11Ig-Top10 'of the present invention expressing the serial chain fused monomeric protein TNFR1-TNFR1 / Fc according to the present invention.
도 8은 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR1-TNFR1/Fc를 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pTR22Ig-Top10'의 지도이다.8 is a map of the recombinant expression plasmid pTR22Ig-Top10 'of the present invention expressing the serial chain fused monomeric protein TNFR1-TNFR1 / Fc according to the present invention.
도 9는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CD2-CD2/Fc를 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pCD22Ig의 지도이다.9 is a map of the recombinant expression plasmid pCD22Ig of the present invention expressing the serial chain fused monomer protein CD2-CD2 / Fc according to the present invention.
도 10은 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CTLA4-CTLA4/Fc를 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pCT44Ig의 지도이다.10 is a map of the recombinant expression plasmid pCT44Ig of the present invention expressing the serial chain fused monomeric protein CTLA4-CTLA4 / Fc according to the present invention.
도 11은 본 발명에 따라 4개의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgTNFR1-TNFR1/Fc를 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pTR11Ig-MG의 지도이다.FIG. 11 is a map of the recombinant expression plasmid pTR11Ig-MG of the present invention expressing the serial chain fused monomer protein mgTNFR1-TNFR1 / Fc with four glycosylated motif peptides inserted according to the present invention.
도 12는 본 발명에 따라 2개의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgTNFR2-TNFR2/Fc를 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pTR22Ig-MG의 지도이다.Figure 12 is a map of the recombinant expression plasmid pTR22Ig-MG of the present invention expressing the serial chain fused monomer protein mgTNFR2-TNFR2 / Fc with two glycosylated motif peptides inserted according to the present invention.
도 13은 본 발명에 따라 2개의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgCD2-CD2/Fc를 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pCD22Ig-MG의 지도이다.FIG. 13 is a map of the recombinant expression plasmid pCD22Ig-MG of the present invention expressing the serial chain fused monomer protein mgCD2-CD2 / Fc with two glycosylated motif peptides inserted according to the present invention.
도 14는 본 발명에 따라 3개의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgCTLA4-CTLA4/Fc를 발현하는 본 발명의 재조합 발현 플라스미드 pCT44Ig-MG의 지도이다.FIG. 14 is a map of the recombinant expression plasmid pCT44Ig-MG of the present invention expressing the serial chain fused monomer protein mgCTLA4-CTLA4 / Fc with three glycosylated motif peptides inserted according to the present invention.
도 15는 본 발명에 따라 순수 정제된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [TNFR1-TNFR1/Fc]2및 [TNFR2-TNFR2/Fc]2을 환원 조건 및 비환원 조건하에서 SDS-PAGE를 실시한 결과를 보여준다.FIG. 15 shows the results of SDS-PAGE of purely purified serial chain fused dimer proteins [TNFR1-TNFR1 / Fc]2 and [TNFR2-TNFR2 / Fc]2 under reduced and non-reduced conditions. .
도 16은 종래의 예시적인 단순 융합된 이량체 단백질 [TNFR1/Fc]2(●) 및 [TNFR2/Fc]2(○) 및 본 발명에 따른 예시적인 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [TNFR1-TNFR1/Fc]2(▼) 및 [TNFR2-TNFR2/Fc]2(▽)이 TNF 알파의 세포독성을 억제하는 효과를 나타낸 그래프이다.FIG. 16 shows conventional exemplary simple fused dimer proteins [TNFR1 / Fc] 2 (•) and [TNFR2 / Fc]2 (○) and exemplary serial chain fused dimer protein [TNFR1-TNFR1 according to the present invention; / Fc]2 (▼) and [TNFR2-TNFR2 / Fc]2 (▽) are graphs showing the effect of inhibiting cytotoxicity of TNF alpha.
도 17은 종래의 예시적인 단순 융합된 이량체 단백질 [TNFR1/Fc]2(●) 및 [TNFR2/Fc]2(○) 및 본 발명에 따른 예시적인 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [TNFR1-TNFR1/Fc]2(▼) 및 [TNFR2-TNFR2/Fc]2(▽)이 TNF 베타의 세포독성을 억제하는 효과를 나타낸 그래프이다.FIG. 17 shows conventional exemplary simple fused dimer proteins [TNFR1 / Fc]2 (•) and [TNFR2 / Fc]2 (○) and exemplary serial chain fused dimeric proteins [TNFR1-TNFR1 according to the present invention. / Fc]2 (▼) and [TNFR2-TNFR2 / Fc]2 (▽) are graphs showing the effect of inhibiting the cytotoxicity of TNF beta.
도 18은 종래의 예시적인 단순 융합된 이량체 단백질 [CD2/Fc]2(●), 공지된 면역억제제 사이클로스포린 A(▼) 및 본 발명에 따른 예시적인 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [CD2-CD2/Fc]2(○)이 활성 T 림프구의 증식을 억제하는 효과를 나타낸 그래프이다.18 shows a conventional exemplary simple fused dimer protein [CD2 / Fc]2 (•), known immunosuppressive cyclosporin A (▼) and exemplary serial chain fused dimeric protein according to the present invention [CD2-CD2] / Fc]2 (o) is a graph showing the effect of inhibiting proliferation of active T lymphocytes.
도 19는 종래의 예시적인 단순 융합된 이량체 단백질 [CTLA4/Fc]2(●), 공지된 면역억제제 사이클로스포린 A(▼) 및 본 발명에 따른 예시적인 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [CTLA4/Fc]2(○)이 활성 T 림프구의 증식을 억제하는 효과를 나타낸 그래프이다.Figure 19 shows a conventional exemplary simple fused dimer protein [CTLA4 / Fc]2 (●), known immunosuppressive cyclosporin A (▼) and exemplary serial chain fused dimeric protein according to the invention [CTLA4 / Fc ]2 (○) is a graph showing the effect of inhibiting the proliferation of active T lymphocytes.
도 20은 종래의 예시적인 단순 융합된 이량체 단백질 [TNFR1/Fc]2(●), 본 발명에 따른 예시적인 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [TNFR1-TNFR1/Fc]2(○) 및 본 발명에 따른 예시적인 당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [mgTNFR1-TNFR1/Fc]2(▽)의 혈중 반감기를 나타내는 그래프이다.20 shows a conventional exemplary simple fused dimer protein [TNFR1 / Fc]2 (●), an exemplary series chain fused dimer protein [TNFR1-TNFR1 / Fc]2 (○) according to the present invention and the present invention Is a graph showing the blood half-life of an exemplary glycosylated serial chain fused dimer protein [mgTNFR1-TNFR1 / Fc]2 (▽) according to FIG.
도 21은 종래의 예시적인 단순 융합된 이량체 단백질 [CD2/Fc]2(●), 본 발명에 따른 예시적인 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [CD2-CD2/Fc]2(○) 및 본 발명에 따른 예시적인 당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [mgCD2-CD2/Fc]2(▽)의 혈중 반감기를 나타내는 그래프이다.Figure 21 shows a conventional exemplary simple fused dimer protein [CD2 / Fc]2 (●), an exemplary serial chain fused dimeric protein [CD2-CD2 / Fc]2 (○) according to the present invention and the present invention Is a graph showing the blood half-life of an exemplary glycosylated serial chain fused dimer protein [mgCD2-CD2 / Fc]2 (▽) according to.
도 22는 종래의 예시적인 단순 융합된 이량체 단백질 [CTLA4/Fc]2(●), 본 발명에 따른 예시적인 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [CTLA4-CTLA4/Fc]2(○) 및 본 발명에 따른 예시적인 당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질[mgCTLA4-CTLA4/Fc]2(▽)의 혈중 반감기를 나타내는 그래프이다.22 shows a conventional exemplary simple fused dimer protein [CTLA4 / Fc]2 (●), an exemplary serial chain fused dimeric protein [CTLA4-CTLA4 / Fc]2 (○) according to the present invention and the present invention Is a graph showing the blood half-life of an exemplary glycosylated serial chain fused dimer protein [mgCTLA4-CTLA4 / Fc]2 (▽) according to FIG.
도 23은 PBS(●), 종래의 예시적인 단순 융합된 이량체 단백질 [TNFR1/Fc]2(■) 및 [TNFR1/Fc]2(▲) 및 본 발명에 따른 예시적인 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [TNFR1-TNFR1/Fc]2(×) 및 [TNFR2-TNFR2/Fc]2(△)에 의한 DBA/1 생쥐에서 콜라겐 유도 관절염(CIA) 억제 효과를 나타낸 그래프이다.Figure 23 shows PBS (•), conventional exemplary simple fused dimer proteins [TNFR1 / Fc]2 (■) and [TNFR1 / Fc]2 (▲) and exemplary serial chain fused dimers according to the present invention. It is a graph showing the collagen-induced arthritis (CIA) inhibitory effect in DBA / 1 mice by proteins [TNFR1-TNFR1 / Fc]2 (×) and [TNFR2-TNFR2 / Fc]2 (Δ).
일반적으로, 본 발명은 연쇄체 단백질에 관한 것이며, 보다 특정적으로는 면역접합체(Immunoadhesin)에 관한 것이다. 면역접합체의 전형은 면역글로불린의 Fc 영역과 수용체 또는 흡착 분자의 리간드-결합 영역을 융합시킨 항체-유사분자이다. 공지된 전형적인 면역접합체는 항원 인지를 담당하는 항체 분자의 가변 영역이 수용체의 리간-결합 영역에 의해 치환되고 항체 Fc 영역은 보유되는 형태이다. 많은 문헌을 통해 구조적으로 다양한 형태의 면역접합체가 제시되어 왔다. 그러나, 본 발명에 따른 면역접합체의 구조는 지금까지 공지된 면역접합체의 구조와는 상이하고, 또한 본 발명에 따른 구조의 면역접합체를 가상적으로 또는 추정적으로 제조할 수 있음을 암시하는 문헌은 없다.In general, the present invention relates to chain proteins, and more particularly to immunoconjugates. Typical of immunoconjugates are antibody-like molecules that fuse an Fc region of an immunoglobulin with a ligand-binding region of a receptor or adsorption molecule. Known typical immunoconjugates are forms in which the variable region of the antibody molecule responsible for antigen recognition is replaced by the ligand-binding region of the receptor and the antibody Fc region is retained. Many literatures have suggested structurally diverse forms of immunoconjugates. However, there is no literature suggesting that the structure of the immunoconjugate according to the present invention is different from the structure of the immunoconjugate known so far, and that the immunoconjugate of the structure according to the present invention can be prepared virtually or spectrally. .
용어 정의Term Definition
본 발명에 따른 면역접합체의 구조적 특징으로 인해 이러한 구조의 특성상 본원 명세서에 사용되는 용어의 정의를 명백히 할 필요가 있다. 일반적으로는, 본 발명에서 별도로 정의하지 아니한, 모든 기술적 및 과학적인 관련 용어는 이 발명이 속한 기술 분야에서 통상적으로 통용되는 의미를 가진다. 그러나, 다음의 용어들은 통상적인 의미를 나타내지만 그 의미를 명확히 하고 또한 본 발명의 범위를 명백히 하고자 다음과 같이 정의한다.Due to the structural features of the immunoconjugates according to the invention it is necessary to clarify the definitions of terms used in the present specification due to the nature of these structures. In general, all technical and scientific related terms, unless otherwise defined in the present invention, have the meaning commonly used in the technical field to which the present invention belongs. The following terms, however, represent common meanings but are defined as follows to clarify the meaning and to clarify the scope of the present invention.
본원 명세서에 사용된 용어 "면역글로불린"은 다양한 종류의 항원을 특이적으로 인식하도록 B 세포에 의해 생성되고 B 세포의 항원 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 가리킨다. 이 분자는 Y 모양으로 두 개의 동일한 경쇄와 두 개의 동일한 중쇄로 구성된다. 경쇄와 중쇄 모두는 가변 및 고정 영역을 포함한다. 4개의 쇄는 힌지 영역이라고 하는 중쇄의 플렉서블 영역(flexible region)에 위치한 디설파이드 결합에 의해 함께 고정되어 있다. 중쇄와 경쇄 모두의 가변 영역은 결합하여 두개의 동일한 항원-결합 부위를 형성한다. 중쇄 고정 영역에 의해 면역글로불린 A(IgA), D(IgD), E(IgE), G(IgG) 및 M(IgM)인 다섯 개 부류로 나누어진다. 각각의 부류는 이소타입이라고 하며 특특한 구조적 특징과 상이한 생물학적 특성을 갖고 있다. 예를 들면, IgG는 Fc 구조에서 다른 이소타입과 약간 상이하다. 또한, IgG 및 IgA는 많은 아부류가 있다. 예를 들면, 인간 IgG 이소타입내에 4가지의 아부류 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 있으며 각각은1,2,3 및4 중쇄를 갖는다. 보체 활성화, 식세포-Fc 수용체에의 결합, 항원-의존 세포독성과 같은 면역글로불린 분자의 기능은 중쇄의 Fc 영역에 존재하는 구조적 결정소에 의해 매개된다. 이러한 중쇄의 Fc 영역은 본 발명에 따른 이량체 단백질의 구성 요소로서 사용되며 상기 모든 분류 또는 아부류의 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다.As used herein, the term "immunoglobulin" refers to a protein molecule that is produced by B cells and specifically serves as an antigen receptor for B cells to specifically recognize various types of antigens. This molecule is Y-shaped and consists of two identical light chains and two identical heavy chains. Both light and heavy chains comprise variable and fixed regions. The four chains are held together by disulfide bonds located in the flexible region of the heavy chain called the hinge region. The variable regions of both heavy and light chains combine to form two identical antigen-binding sites. The heavy chain anchorage region is divided into five classes: immunoglobulin A (IgA), D (IgD), E (IgE), G (IgG) and M (IgM). Each class is called isotypes and has distinct structural and biological characteristics. For example, IgG is slightly different from other isotypes in the Fc structure. In addition, IgG and IgA have many subclasses. For example, there are four subclasses IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 in the human IgG isotype, each of which is One, 2, 3 and Has 4 heavy chains. The function of immunoglobulin molecules such as complement activation, binding to phagocytic-Fc receptors, antigen-dependent cytotoxicity is mediated by structural determinants present in the Fc region of the heavy chain. The Fc region of this heavy chain is used as a component of the dimeric protein according to the invention and can be derived from any of the above classes or subclasses of immunoglobulins.
본원 명세서에 사용된 용어 "면역글로불린 Fc 조각"은 면역글로불린분자는기능적으로 구분되는 조각들로 나누어지는데 이 가운데 항원 결합력은 없으나 쉽게 결정체를 형성하는 조각으로서 힌지 부위(hinge region), CH2와 CH3 도메인이 결합하여 이루어지고 항체에서 효과물질 및 세포들과의 결합에 관여하는 부분을 가리킨다. 따라서, 본 발명과 관련하여 언급되는 Fc 조각은 일부 문헌에 기술된 바와는 다를 수 있으나 힌지 영역을 포함하며 이것은 단순히 본 발명을 설명하는데 있어 편리를 도모하기 위한 것으로 당업자는 본원 명세서 및 도면을 참고로 하여 충분히 이해할 것이다.As used herein, the term “immunoglobulin Fc fragment” refers to fragments in which immunoglobulin molecules are functionally divided into fragments which do not have antigen binding ability but easily form crystals, such as hinge regions, CH2 and CH3 domains. It refers to the part which is made by binding and is involved in binding of an effective substance and cells in an antibody. Thus, the Fc fragment referred to in the context of the present invention may differ from that described in some documents, but includes a hinge region, which is merely for convenience in describing the present invention and those skilled in the art can refer to the specification and the drawings. Will fully understand.
본원 명세서에 사용된 용어 "생물학적 활성 단백질"은 일반적으로 생리학적 또는 약물학적 활성을 나타내는 단백질, 펩타이드 및 폴리펩타이드를 가리키며, 연쇄체 또는 면역접합체를 형성한 후 고유 활성중 적어도 일부분은 유지된다. 본원에서 "생물학적 활성"이라는 용어는 생리학적 또는 약물학적 활성으로 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 효소를 함유한 것과 같은 일부 연쇄체는 유기 용매에서 반응을 촉매할 수 있다. 마찬가지로, 콘카나발린 A, 면역글로불린 등과 같은 단백질을 함유한 일부 고분자 결합체는 또한 실험실 진단제로서 유용하다.As used herein, the term “biologically active protein” generally refers to proteins, peptides and polypeptides that exhibit physiological or pharmacological activity, wherein at least a portion of the intrinsic activity is retained after forming the chain or immunoconjugate. The term "biological activity" is not limited to physiological or pharmacological activity herein. For example, some chains, such as those containing enzymes, can catalyze the reaction in organic solvents. Likewise, some polymer conjugates containing proteins such as concanavalin A, immunoglobulins, and the like are also useful as laboratory diagnostics.
단백질, 펩타이드 및 폴리펩타이드로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 헤모글로빈, 혈청 단백질(예, 인자 VII, VIII 및 IX를 포함한 혈액 인자), 면역글로불린, 사이토킨(예, 인터루킨), α-, β- 및 γ-인터페론, 콜로니 자극 인자(G-CSF 및 GM-CSF 포함), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF) 및 포스포리파제-활성화 단백질 (PLAP)이 포함된다. 다른 일반적인 생물학적 또는 치료학적 단백질로는 인슐린, 식물 단백질(예, 렉틴 및 리신), 종양 괴사 인자(TNF) 및 연관된 대립형질체, 성장 인자(예, TCFα 또는 TGFβ와 같은 조직 성장 인자 및 내피 성장 인자), 호르몬(예, 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬 및 부갑상선 호르몬, 황체호르몬 분비 호르몬 및 이의 유도체), 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(calcitonin gene related peptide, CGRP), 합성 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리쓰로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드 (growth hormone releasing peptide, GHRP), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor, THF) 등이 포함된다. 면역글로불린으로는 IgG, IgE, IgM, IgA, IgD 및 이들의 단편이 포함된다. 인터루킨, 인터페론 및 콜로니 자극 인자와 같은 일부 단백질은 또한 보통 재조합 기술을 이용한 결과로서 비당화 형태로 존재할 수 있다.Proteins, peptides and polypeptides include, but are not limited to, hemoglobin, serum proteins (e.g. blood factors including factors VII, VIII, and IX), immunoglobulins, cytokines (e.g. interleukins), α-, β-, and γ Interferons, colony stimulating factors (including G-CSF and GM-CSF), platelet induced growth factor (PDGF) and phospholipase-activating protein (PLAP). Other common biological or therapeutic proteins include insulin, plant proteins (eg lectins and lysines), tumor necrosis factor (TNF) and associated alleles, growth factors (eg, tissue growth factors such as TCFα or TGFβ and endothelial growth factors). ), Hormones (eg vesicle-stimulating hormone, thyroid-stimulating hormone, antidiuretic hormone, pigment and parathyroid hormone, luteinizing hormone secretion hormone and derivatives thereof), calcitonin, calcitonin gene related peptide , CGRP), synthetic enkephalin, somatomedin, erythropoietin, hypothalamic secretion factor, prolactin, chronic gonadotropin, tissue plasminogen activator, growth hormone secretion peptide (growth hormone releasing peptide, GHRP), thymic humoral factor (THF), and the like. Immunoglobulins include IgG, IgE, IgM, IgA, IgD and fragments thereof. Some proteins, such as interleukins, interferons, and colony stimulating factors, can also exist in unglycosylated form as a result of normal recombinant techniques.
비당화 형태 또한 본 발명의 생물학적 활성 물질에 포함된다.Unglycosylated forms are also included in the biologically active substances of the invention.
또한, 본 발명의 생물학적 활성 물질은 생체내 생활성(bioactivity)을 증명하는 폴리펩타이드중 일부분을 포함한다. 이의 예로는 아미노산 서열, 항체 단편, 단일쇄 결합 항원(참조: 미국특허 제4,946,778호), 항체 또는 단편의 융합체를 포함한 결합 분자, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 촉매성 항체 등이 포함된다. 기타 단백질로는 두드러기쑥, 항원 E, 꿀벌의 독액, 진드기 알레르겐 등과 같은 알레르겐 단백질이 포함된다.In addition, the biologically active substance of the present invention includes a portion of a polypeptide that demonstrates bioactivity in vivo. Examples include amino acid sequences, antibody fragments, single chain binding antigens (US Pat. No. 4,946,778), binding molecules including fusions of antibodies or fragments, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, catalytic antibodies, and the like. . Other proteins include allergen proteins such as urticaria, antigen E, bee venom, tick allergens, and the like.
또한, 본 발명의 생물학적 활성 물질은 효소를 포함한다. 효소의 예로는 탄수화물-특이적 효소, 단백질분해 효소, 산화환원 효소, 트랜스퍼라제, 하이드롤라제, 라이아제, 이소머라제 및 리가제가 포함된다. 구체적인 효소로는 이들로 한정하는 것은 아니지만 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제 및 빌리루빈 옥시다제를 들 수 있다. 탄수화합물-특이적 효소의 예로는 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 글루코우로니다제 등이 포함된다.In addition, biologically active substances of the present invention include enzymes. Examples of enzymes include carbohydrate-specific enzymes, proteolytic enzymes, redox enzymes, transferases, hydrolases, lyases, isomerases and ligases. Specific enzymes include, but are not limited to, asparaginase, arginase, arginine deaminase, adenosine deaminase, peroxide dismutase, endotoxinase, catalase, chymotrypsin, lipase, uricase, adenosine diphosphatase , Tyrosinase and bilirubin oxidase. Examples of carbohydrate-specific enzymes include glucose oxidase, glucosidase, galactosidase, glucocerebrosidase, glucoronidase, and the like.
본원 명세서에 사용된 용어 "면역반응에 관여하는 단백질"은 세포성 및 체액성 면역반응에서 세포간 신호 전달 과정을 담당하여 면역반응을 활성화 또는 억제시키는 단백질을 총칭한다. 면역이란 세균 또는 바이러스 등의 자신이 아닌 것으로 부터 자신을 보호하는 과정이다. 면역 반응은 세포성 및 체액성 면역 반응으로 나눌 수 있으며, T 세포와 B 세포 등의 림프구가 가장 중요한 역할을 한다. T 세포는 주로 세포성 면역 반응을 주관하며 바이러스에 감염된 세포나 암세포 들을 직접적으로 공격하여 죽이기도 하고 면역 또는 염증 반응을 활성화시키는 사이토카인이라는 물질을 분비하여 다른 면역 세포의 작용을 돕기도 한다. B 세포는 세균과 바이러스 등의 자신이 아닌 외부의 물질(항원)이 체내에 들어을 경우 항체를 만들어 이를 몰아내도록 하며 이를 체액성 면역 반응이라 한다. 세포성 면역과 체액성 면역 모두에서는 세포간의 신호 전달이 매우 필수적인 과정이며 이 과정에서 세포내 신호전달을 담당하는 세포 표면 수용체 단백질과 이 수용체에 결합하는 신호물질인 리간드 단백질이 작용한다.The term "protein involved in an immune response" as used herein refers to a protein that is responsible for the intercellular signal transduction process in cellular and humoral immune responses to activate or inhibit the immune response. Immunity is the process of protecting yourself from something other than yourself, such as bacteria or viruses. Immune responses can be divided into cellular and humoral immune responses, and lymphocytes such as T cells and B cells play the most important role. T cells primarily control cellular immune responses, directly attack and kill virus-infected cells or cancer cells, and secrete a substance called cytokine that activates an immune or inflammatory response. B cells, when bacteria or viruses, enter the body other than their own (antigens) to make antibodies to drive them out, which is called a humoral immune response. In both cellular immunity and humoral immunity, signal transduction between cells is a very essential process. In this process, cell surface receptor proteins responsible for intracellular signaling and ligand proteins, which bind to the receptors, work.
본 발명에 따른 면역반응에 관여하는 단백질의 대표적인 예로는 사이토카인, 사이토카인 수용체, 접착 분자(adhesion molecules), 종양 괴사 인자(TNF) 수용체,효소, 수용체 티로신 키나제, 케모카인 수용체, 기타 세포 표면 단백질, 가용성 리간드 등이 포함된다. 사이토카인은 이들로 한정되는 것은 아니지만 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-17, TNF, TGF, IFN, GM-CSF, G-CSF, EPO, TPO, M-CSF 등을 포함한다. 사이토카인 수용체는 이들로 한정되는 것은 아니지만 성장호르몬 수용체(GHR), IL-13R, IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL-9R, IL-15R, TNFR, TGFR, IFNR(예, IFN-Rα-쇄, IFN-Rβ-쇄), 인터페론-αR, -βR 및 -R, GM-CSFR, G-CSFR, EPOR, cMp1, gp130, Fas(Apo 1), 을 포함한다. 효소는 이들로 한정되는 것은 아니지만 인플루엔자 C 헤마글루티닌 에스테라제, 우로키나제 등을 포함한다. 케모카인 수용체의 예로는 CCR1, CXCR1-4를 들 수 있다. 수용체 티로신 키나제의 예로는 TrkA, TrkB, TrkC, H사, REK7, Rse/Tyro-3, 간세포 성장 인자 R, 혈소판-유래된 성장 인자 R, Flt-1이 포함된다. 다른 세포 표면 단백질의 예로는 CD2, CD4, CD5, CD6, CD22, CD27, CD28, CD30, CD31, CD40, CD44, CD100, CD137, CD150, LAG-3, B7, B61,β-뉴렉신, CTLA-4, ICOS, ICAM-1, 보체 R-2(CD21), IgER, 리소좀막 gp-1,α2-마크로글로불린 수용체-연관된 단백질, 나트륨배설 펩타이드 R을 들 수 있다. 가용성 리간드로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 IL-10, 헤레굴린, 각화세포 성장 인자가 포함된다.Representative examples of proteins involved in the immune response according to the present invention include cytokines, cytokine receptors, adhesion molecules, tumor necrosis factor (TNF) receptors, enzymes, receptor tyrosine kinases, chemokine receptors, other cell surface proteins, Soluble ligands and the like. Cytokines are not limited to these IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-17, TNF , TGF, IFN, GM-CSF, G-CSF, EPO, TPO, M-CSF and the like. Cytokine receptors include, but are not limited to, growth hormone receptors (GHR), IL-13R, IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL -9R, IL-15R, TNFR, TGFR, IFNR (e.g. IFN- Rα -chain, IFN- Rβ -chain), interferon-α R,-β Rand- R, GM-CSFR, G-CSFR, EPOR, cMp1, gp130, Fas (Apo 1), and the like. Enzymes include, but are not limited to, influenza C hemagglutinin esterase, urokinase and the like. Examples of chemokine receptors include CCR1, CXCR1-4. Examples of receptor tyrosine kinases include TrkA, TrkB, TrkC, Company H, REK7, Rse / Tyro-3, hepatocyte growth factor R, platelet-derived growth factor R, Flt-1. Examples of other cell surface proteins include CD2, CD4, CD5, CD6, CD22, CD27, CD28, CD30, CD31, CD40, CD44, CD100, CD137, CD150, LAG-3, B7, B61,β -neulexin, CTLA- 4, ICOS, ICAM-1, complement R-2 (CD21), IgER, lysosomal membrane gp-1,α 2-macroglobulin receptor-associated protein, sodium excretion peptide R. Soluble ligands include, but are not limited to, IL-10, heregulin, keratinocyte growth factor.
본 발명에 따른 면역반응에 관여하는 단백질에 대한 리간드 및 용도는 하기 표 1 내지 7에 요약한 바와 같이 당업자에게 잘 알려져 있다.Ligands and uses for proteins involved in the immune response according to the invention are well known to those skilled in the art as summarized in Tables 1-7 below.
표 1. 면역반응에 관여하는 단백질-접착 분자Table 1. Protein-adhesive Molecules Involved in Immune Responses
표 2. 면역반응에 관여하는 단백질-효소Table 2. Protein-enzymes involved in immune response
표 3. 면역반응에 관여하는 단백질-사이토카인 수용체Table 3. Protein-Cytokine Receptors Involved in Immune Responses
표 4. 면역반응에 관여하는 단백질-종양괴사인자 수용체Table 4. Protein-tumor necrosis factor receptors involved in immune response
표 5. 면역반응에 관여하는 단백질-수용체 티로신 키나제Table 5. Protein-Receptor Tyrosine Kinases Involved in Immune Responses
표 6. 면역반응에 관여하는 단백질-세포 표면 단백질Table 6. Protein-Cell Surface Proteins Involved in Immune Responses
표 7. 면역반응에 관여하는 단백질-가용성 리간드Table 7. Protein-soluble Ligands Involved in Immune Responses
본원 명세서에 사용된 용어 "세포외역 가용성 부위(soluble extracellulardomain)"는 인지질로 구성된 세포막을 관통하는 단백질(integral protein)에서 소수성 아미노산으로 구성되어 있어 세포막을 통과하는 부분(transmembrane domain)을 기준으로 세포외부로 노출되어 있는 부분을 가리킨다. 이 부위는 대부분 친수성 아미노산이 단백질 표면으로 향하는 구조(folding)를 하고 있어서 수용액상에서 가용성(soluble)을 나타낸다. 대부분의 세포표면 수용체 단백질에서 리간드와 결합하는 기능을 담당하는 것은 세포외역 부위이며 세포내역 부위(intracellular domain)는 세포내 신호전달 기능을 담당하고 있다.As used herein, the term "soluble extracellulardomain" is composed of hydrophobic amino acids in an integral protein that penetrates a cell membrane composed of phospholipids and thus extracellularly based on a transmembrane domain that crosses the cell membrane. Indicates the exposed part. This site is mostly soluble in aqueous solution because of the folding of the hydrophilic amino acids towards the protein surface. In most cell surface receptor proteins, the ligand-binding function is the extracellular domain and the intracellular domain is responsible for intracellular signaling.
본원 명세서에 사용된 용어 "직렬 연쇄 융합된"은 두 개의 생물학적 활성 단백질의 가용성 부위가 연결되어 하나의 긴 폴리펩타이드를 형성하고 있는 형태를 가리킨다.As used herein, the term “serial chain fused” refers to the form in which the soluble sites of two biologically active proteins are joined to form one long polypeptide.
본원 명세서에 사용된 용어 "연쇄체 단백질"은 직렬 연쇄 융합된 단백질을 가리킨다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 조각의 힌지 부위에 결합된 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 C-말단(C-terminal)에 이와 동일한 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 N-말단(N-terminal)이 펩타이드 결합되어 동일한 두 개의 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위가 하나의 긴 폴리펩타이드를 형성하고 있는 형태를 가리킨다.The term "chain protein" as used herein refers to a series chain fused protein. For example, at the C-terminal of the extracellular soluble site of a protein involved in the immune response bound to the hinge site of an immunoglobulin Fc fragment, the N of the extracellular soluble site of the protein involved in the same immune response. N-terminal refers to a form in which an extracellular soluble site of a protein that is peptide-linked and involved in two identical immune responses forms one long polypeptide.
본원 명세서에 사용된 용어 "단순 융합된 단량체 단백질"은 면역글로불린 Fc 조각의 힌지 부위에 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위가 결합하여 하나의 폴리펩타이드로 형성된 단량체 구조의 융합 단백질을 가리킨다. 단순 융합된 단량체 단백질은 편의상 "단백질 명칭/Fc"로 표기할 수 있다. 예를 들면 면역반응에 관여하는 단백질 TNFR1의 세포외역 가용성 부위와 면역글로불린 Fc 조각이 결합된 단순 융합된 단량체 단백질은 TNFR1/Fc로 표기된다. 또한, 면역글로불린 Fc 조각의 유래를 표기할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 조각이 IgG1으로부터 유래된 경우에는 TNFR1/IgG1Fc로 표기된다.As used herein, the term “simple fused monomeric protein” refers to a fusion protein of monomeric structure formed by binding an extracellular soluble site of a protein involved in an immune response to the hinge region of an immunoglobulin Fc fragment. Simple fused monomeric proteins may be referred to as "protein name / Fc" for convenience. For example, a simple fused monomeric protein in which an extracellular soluble site of the protein TNFR1 involved in an immune response and an immunoglobulin Fc fragment are bound is designated TNFR1 / Fc. The origin of immunoglobulin Fc fragments can also be indicated. For example, if the immunoglobulin Fc fragment is derived from IgG1, it is labeled TNFR1 / IgG1Fc.
본원 명세서에 사용된 용어 "단순 융합된 이량체 단백질"은 단순 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 융합된 이량체 구조의 융합 단백질을 가리킨다. 단순 융합된 이량체 단백질은 편의상 "[단백질 명칭/Fc]2"로 표기할 수 있다. 예를 들면 면역반응에 관여하는 단백질 TNFR1의 세포외역 가용성 부위와 면역글로불린 Fc 조각이 결합된 단순 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 융합된 이량체 구조의 융합 단백질은 [TNFR1/Fc]2로 표기된다. 마찬가지로, 면역글로불린 Fc 조각의 유래를 표기할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 조각이 IgG1으로부터 유래된 경우에는 [TNFR1/IgG1Fc]2로 표기된다.The term “simple fused dimer protein” as used herein refers to a fusion protein of dimeric structure in which two simple fused monomeric proteins are fused by disulfide bonds at the hinge site. Simple fused dimeric proteins may be referred to as "[protein name / Fc]2 " for convenience. For example, a fusion protein of a dimeric structure in which two simple fused monomeric proteins in which an extracellular soluble site of the protein TNFR1 involved in the immune response and an immunoglobulin Fc fragment are bound by fusion by disulfide bonds at the hinge site is [TNFR1 / Fc ]2 . Likewise, the origin of immunoglobulin Fc fragments can be indicated. For example, when an immunoglobulin Fc fragment is derived from IgG1, it is denoted [TNFR1 / IgG1Fc]2 .
본원 명세서에 사용된 용어 "연쇄 융합된 단량체 단백질"은 단순 융합된 단량체 단백질에서 힌지 부위에 결합된 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 N-말단에 이와 동일한 한 개의 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 C-말단이 직렬의 연쇄체 형태로 결합하여 하나의 폴리펩타이드로 형성된 단량체 구조의 융합 단백질을 가리킨다. 연쇄 융합된 단량체 단백질은 편의상 "단백질 명칭-단백질 명칭/Fc"로 표기할 수 있다. 예를 들면 면역반응에 관여하는단백질 TNFR1의 세포외역 가용성 부위와 면역글로불린 Fc 조각이 결합된 단순 융합된 단량체 단백질의 TNFR1의 세포외역 가용성 부위에 동일한 TNFR1의 세포외역 가용성 부위가 결합된 연쇄 융합된 단량체 단백질은 TNFR1-TNFR1/Fc로 표기된다. 마찬가지로, 면역글로불린 Fc 조각의 유래를 표기할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 조각이 IgG1으로부터 유래된 경우에는 TNFR1-TNFR1/IgG1Fc로 표기된다.As used herein, the term "chain fused monomeric protein" refers to one such immune response at the N-terminus of the extracellular soluble site of the protein involved in the immune response bound to the hinge site in the simple fused monomeric protein. The C-terminus of the extracellular soluble region of the protein refers to a fusion protein of monomeric structure formed in one polypeptide by binding in series chain form. The chain fused monomeric protein may be labeled as "protein name-protein name / Fc" for convenience. For example, a chain fused monomer in which an extracellular soluble site of TNFR1 is bound to an extracellular soluble site of TNFR1 of a simple fused monomer protein in which an extracellular soluble site of protein TNFR1 and an immunoglobulin Fc fragment are linked to an immune response. Proteins are designated TNFR1-TNFR1 / Fc. Likewise, the origin of immunoglobulin Fc fragments can be indicated. For example, if the immunoglobulin Fc fragment is derived from IgG1, it is labeled TNFR1-TNFR1 / IgG1Fc.
본원 명세서에 사용된 용어 "연쇄 융합된 이량체 단백질"은 연쇄 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 융합된 이량체 구조의 융합 단백질을 가리킨다. 연쇄 융합된 이량체 단백질은 편의상 "[단백질 명칭-단백질 명칭/Fc]2"로 표기할 수 있다. 예를 들면 면역반응에 관여하는 단백질 TNFR1의 세포외역 가용성 부위와 면역글로불린 Fc 조각이 결합된 단순 융합된 단량체 단백질의 TNFR1의 세포외역 가용성 부위에 동일한 TNFR1의 세포외역 가용성 부위가 결합된 연쇄 융합된 단량체 단백질 두 개가 힌지 부위에서 디설파이드 결합에 의해 융합된 이량체 구조의 융합 단백질은 [TNFR1-TNFR1/Fc]2로 표기된다. 마찬가지로, 면역글로불린 Fc 조각의 유래를 표기할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 Fc 조각이 IgG1으로부터 유래된 경우에는 [TNFR1-TNFR1/IgG1Fc]2로 표기된다.The term "chain fused dimer protein" as used herein refers to a fusion protein of dimeric structure in which two chain fused monomeric proteins are fused by disulfide bonds at the hinge site. The chain fused dimer protein may be conveniently labeled "[protein name-protein name / Fc]2 ". For example, a chain fused monomer in which an extracellular soluble site of TNFR1 is bound to an extracellular soluble site of TNFR1 of an extracellular soluble site of protein TNFR1 and an immunoglobulin Fc fragment involved in an immune response. A fusion protein of dimer structure in which two proteins are fused by disulfide bonds at the hinge site is designated [TNFR1-TNFR1 / Fc]2 . Likewise, the origin of immunoglobulin Fc fragments can be indicated. For example, when the immunoglobulin Fc fragment is derived from IgG1, it is denoted [TNFR1-TNFR1 / IgG1Fc]2 .
본원 명세서에 사용된 "벡터"라는 용어는 외래 유전자를 숙주 세포 내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하며, 숙주 세포 내로 유입할 수 있는 방안을 갖추어야 하고, 자신의 존재를 검출할 수 있는 수단을 구비하여 한다. 여기서, 외래 유전자로는 예를 들면 연쇄 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물이 그에 해당한다.The term "vector" as used herein refers to a DNA molecule as a carrier that can stably transport foreign genes into a host cell. To be a useful vector, it must be replicable, have a way to enter the host cell, and have a means to detect its presence. Here, the foreign gene corresponds to, for example, a DNA construct encoding a chain fused monomeric protein.
본원 명세서에 사용된 "재조합 발현 플라스미드"라는 용어는 일반적으로 외래 유전자가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 벡터에 작동적으로 연결되어 형성된 환상의 DNA 분자를 말한다. 재조합 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 이종 DNA가 생성될 수 있다. 당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.As used herein, the term "recombinant expression plasmid" generally refers to a circular DNA molecule formed operably linked to a vector such that a foreign gene can be expressed in a host cell. The recombinant expression vector can replicate independently of the host chromosomal DNA once it is in the host cell and produce several copies of the vector and inserted heterologous DNA thereof. As is well known in the art, in order to raise the expression level of a transfected gene in a host cell, the gene must be operatively linked to transcriptional and translational expression control sequences that function in the selected expression host. Preferably, the expression control sequence and the gene of interest are included in one expression vector including the bacterial selection marker and the replication origin. If the expression host is a eukaryotic cell, the expression vector must further comprise an expression marker useful in the eukaryotic expression host.
본원 명세서에 사용된 "작동적으로 연결된(operably linked)"이라는 용어는 벡터의 각 구성 성분들이 고유한 작용을 할 수 있도록 형성된 성분들의 배열을 의미한다. 따라서, 코딩 서열에 작동적으로 연결된 조절 서열(control sequence)은 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 조절 서열이 코딩 서열의 발현을 지시하도록 작용하는 한 조절 서열이 코딩 서열과 인접해 있을 필요는 없다. 예를 들면, 개재 서열(intervening sequence)이 프로모터 서열과 코딩 서열사이에 존재할 수 있는데, 이 경우 프로모터 서열은 코딩 서열에 "작동적으로 연결"되었다고 할 수있다.As used herein, the term "operably linked" refers to an arrangement of components formed such that each component of the vector can have a unique action. Thus, a control sequence operably linked to a coding sequence can affect the expression of the coding sequence. The regulatory sequence need not be contiguous with the coding sequence as long as the regulatory sequence acts to direct expression of the coding sequence. For example, an intervening sequence may be present between the promoter sequence and the coding sequence, in which case the promoter sequence may be said to be "operably linked" to the coding sequence.
본원 명세서에 사용되는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, 챠이니즈 햄스터 난소 세포(CHO) 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, 사람 태아신장 293 세포(human embryonic kidney cells), BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 클로닝할 때에는 동물세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. COS 세포를 이용하는 경우에는 COS 세포에서 SV40 라지 T 안티겐(large T antigen)이 발현하고 있으므로 SV40의 복제개시점을 갖는 플라스미드는 세포중에서 다수 카피(copy)의 에피솜(episome)으로 존재하도록 되고 통상보다 고 발현이 기대될 수 있다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종으로부터 얻을 수 있거나, 숙주 세포와 다른 종의 것일 수 있거나, 또는 그것은 어떠한 이종 또는 상동성 DNA를 포함하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.Host cells as used herein may be prokaryotic or eukaryotic cells. In addition, a host having a high DNA introduction efficiency and a high expression efficiency of the introduced DNA is usually used. this. Well-known eukaryotic and prokaryotic hosts such as E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungi, yeast, insect cells such as Spodoptera fruitgiper (SF9), Chinese hamster ovary cells (CHO) and mouse cells Animal cells, COS 1, COS 7, human embryonic kidney cells, African green monkey cells such as BSC 1, BSC 40 and BMT 10, and tissue cultured human cells are examples of host cells that can be used. to be. When cloning the DNA construct encoding the fusion protein of the present invention, it is preferable to use animal cells as a host. In the case of using COS cells, since SV40 large T antigen is expressed in COS cells, the plasmid having the origin of replication of SV40 is present as a large number of copies of the episome in the cells. Higher expression can be expected. The introduced DNA sequence may be obtained from the same species as the host cell, may be of a different species than the host cell, or it may be a hybrid DNA sequence comprising any heterologous or homologous DNA.
본 발명에 따른 직렬 연쇄체 형태의 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 발현시키기 위해 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 소 유두종바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열을 포함한다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pBluescript, pGEX2T, pUC, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 이. 콜라이에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현벡터는 2μ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941이다.A wide variety of expression host / vector combinations can be used to express DNA sequences encoding fusion proteins in the form of serial concatemers according to the present invention. Suitable expression vectors for eukaryotic hosts include, for example, expression control sequences derived from SV40, bovine papillomavirus, adenovirus, adeno-associated virus, cytomegalovirus and retrovirus. Expression vectors that can be used in bacterial hosts include e.g. pBluescript, pGEX2T, pUC, pCR1, pBR322, pMB9 and derivatives thereof. Bacterial plasmids that exemplify what is obtained in E. coli, plasmids with a broader host range such as RP4, phage DNA that can be exemplified by a wide variety of phage lambda derivatives such as λgt10 and λgt11, NM989, and M13 and filaments Other DNA phages are included, such as sex single stranded DNA phages. Useful expression vectors for yeast cells are 2μ plasmids and derivatives thereof. A useful vector for insect cells is pVL 941.
본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.As used herein, the term “transformation” means introducing DNA into a host so that the DNA is replicable as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration.
본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.As used herein, the term "transfection" means that the expression vector is accepted by the host cell whether or not any coding sequence is actually expressed.
본원 명세서에 사용된 용어 "모티프 서열"은 발현된 단백질이 세포막 밖으로 수송되도록 유도하는 아미노산 서열로서 리더 서열이라고도 한다. 세포막 밖으로 수송되는 표면 단백질 혹은 분비 단백질은 일반적으로 세포막에서 모티브 펩티다제 (signal peptidase)에 의해 잘려지게 되는 N-말단 서열을 가지고 있다. 이 특정 N-말단 서열을 모티브 서열 또는 펩타이트(signal sequence or peptide), 혹은 리더 서열 또는 펩타이드(leader sequence or peptide)라 부른다. 분비(수송)가 가능한 단백질 혹은 세포외막이나 주변 세포질에 존재하는 모든 단백질들은 모두 자기만을 위한 특정 모티브 서열을 가지고 있다. 이러한 각각의 단백질 가지고 있는 모티브 서열 사이에는 어떤 특별한 상동성(homology)을 가지고 있지 않으며, 같은 단백질이라도 유래한 숙주(host)에 따라서 그 모티브 서열이 다름을 알 수 있다. 모티브 서열이 작용하는데는 그 1차 구조, 즉 아미노산 서열보다 그들이 가지고 있는 2차 구조 혹은 비극성, 전하 잔기(apolar, charged residue)의 분포가 더 중요하다. 이러한 특징을 가진 모티브 서열사이에는 특별한 상동성이 없지만 몇 가지 공통되는 특징은 있다. 모티브 서열은 우선 N-말단 쪽에 한 개 혹은 몇 개의 아주 짧은 양전하를 띤 친수성 영역(hydrophilic region)인 N 도메인이 있으며 이 도메인에 뒤이어 다소 긴 소수성 영역인 H-도메인이 이어져 있다. 대장균인 경우 모티브 서열의 길이는 약 18 - 30개의 아미노산으로 구성되어 있다. N-도메인은 극성을 나타내고(polar) Lys, Arg과 같은 양전하를 띈 아미노산이 많이 존재한다. H-도메인에는 주로 소수성 잔기와 Ala, Leu 같은 아미노산이 많이 존재하며 Pro, Lys, Arg, Asn, Glu과 같이 극성을 나타내거나 전하를 띤 아미노산은 드물다. 대신 많은 양의 Ala, Leu은 모티브 펩타이드 α-나선 구조를 이루어 막전이가 보다 쉽게 일어나도록 도와준다. H-도메인과 실제 분비하고자 하는 단백질 사이에는 C-도메인이 존재한다. 이 영역은 일반적으로 덜 소수성이며 LebB, LspA와 같은 모티브 펩티다제에 의해 인식이 가능한 서열이 있다. 아직까지 이 모티브 펩티다제들이 정확하게 어느 부위를 자르는지 정확하게 예측할 수는 없지만 일반적으로 C-영역에 있는 Ala-X-Ala 서열 다음 부분을 대부분 자르고 있다. 위에서 언급한 모티브 서열 가지고 있는 전단백질(preprotein)들은 여러 단백질들과 상호작용을 하며 세포막에 도달한 후, 모티브 펩티다제에 의해 특정 부위가 잘린 후 성숙한 형태의 단백질로 바뀐다. 이러한 특징을 가진 모티브 서열은 세포 표면 발현 모체를 선택하는데 있어서 매우 중요한 역할을 한다. 외래 단백질과 융합된 단백질은 안정적으로 세포 표면 밖으로 매우 높은 효율로 이동시켜야 한다. 일반적으로 표면 발현 모체를 선택하는데 있어 우수한 분비능을 가진 표면 단백질을 선택하여야 하며 통상적으로 분비능이 우수한 분비 모티브 서열을 가지고 있는 표면 단백질을 이용한다.As used herein, the term “motif sequence” is also referred to as a leader sequence as an amino acid sequence that directs the expressed protein to be transported out of the cell membrane. Surface proteins or secreted proteins that are transported out of the cell membrane generally have an N-terminal sequence that is cut by the signal peptidase in the cell membrane. This particular N-terminal sequence is called a motive sequence or peptide or a leader sequence or peptide. Proteins that can be secreted (transported) or all proteins in the extracellular membrane or in the surrounding cytoplasm all have their own specific motif sequences. It can be seen that there is no particular homology between the motif sequences of each of these proteins, and that the motif sequences differ depending on the host from which the same protein is derived. For the motive sequence to work, the primary structure, that is, the distribution of their secondary structure or apolar, charged residue, is more important than the amino acid sequence. There is no particular homology between the motif sequences with these features, but there are some common features. The motive sequence first consists of an N domain, one or several very short positively charged hydrophilic regions on the N-terminus, followed by a rather long hydrophobic region, the H-domain. In the case of E. coli, the motif sequence consists of about 18-30 amino acids. N-domains are polar and there are many positively charged amino acids such as Lys and Arg. H-domains contain mostly hydrophobic residues and many amino acids such as Ala and Leu, and rarely polarized or charged amino acids such as Pro, Lys, Arg, Asn, and Glu. Instead, a large amount of Ala and Leu forms the motif peptide α-helix structure, which facilitates membrane transition. There is a C-domain between the H-domain and the protein actually to be secreted. This region is generally less hydrophobic and has sequences recognizable by motif peptidase such as LebB, LspA. It is not yet possible to predict exactly where these motive peptidases will be cut, but most of them are cut after the Ala-X-Ala sequence, usually in the C-region. Preproteins with the motive sequence mentioned above interact with various proteins and reach cell membranes, which are then cut into specific forms by motive peptidase and then matured into proteins. Motif sequences with these features play a very important role in selecting cell surface expressing parents. Proteins fused with foreign proteins must be stably transferred out of the cell surface at very high efficiency. In general, in selecting a surface expression parent, it is necessary to select a surface protein having a good secretion ability, and a surface protein having a secretory motif sequence having a high secretion ability is generally used.
본 발명에 따른 연쇄 융합된 이량체 단백질의 제조Preparation of Chain Fused Dimer Proteins According to the Invention
본 발명에 따른 연쇄 융합된 이량체 단백질은 일반적으로 (a) 면역글로불린 Fc 조각을 코딩하는 유전자와 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 운전자로부터 단순 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 제조하고, (b) 제조된 단순 융합된 단량체 단백질 코딩 DNA 작제물 및 상기 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 유전자에 동일한 제한효소 인식서열을 중합효소 연쇄반응으로 삽입하며, (c) 상기 제한효소 인식서열과 일치하는 제한효소를 사용하여, 상기 단순 융합된 단량체 단백질 코딩 DNA 작제물 및 상기 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 유전자의 제한효소 인식서열 부위를 절단하고, (d) 양쪽 DNA 서열의 절단된 부분을 라이게이즈로 연결하여 연쇄 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 제조하며(도 2), (e) 제조된 연쇄 융합된 단량체 단백질 코딩 DNA 작제물을 벡터에 작동적으로 연결하여 재조합 발현 플라스미드를 작제하고, (f) 작제된 재조합 발현 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키며, (g) 형성된 형질전환체 또는 형질감염체를 연쇄 융합된 단량체 단백질 코딩 DNA 작제물이 발현되도록 하기에 적절한 조건하에서 배양하여 배양물로부터 목적하는 연쇄 융합된 이량체 단백질을 분리 정제함으로써 제조한다.The chain fused dimer protein according to the present invention generally comprises (a) a DNA encoding a simple fused monomeric protein from a gene encoding an immunoglobulin Fc fragment and an operator encoding an extracellular soluble site of a protein involved in the immune response. Constructing the construct, (b) inserting the same restriction enzyme recognition sequence into the polymerase chain reaction into the prepared simple fused monomeric protein coding DNA construct and the gene encoding the extracellular soluble site of the protein involved in the immune response. (C) restriction enzyme recognition of a gene encoding an extracellular soluble site of the simple fused monomeric protein coding DNA construct and the protein involved in the immune response, using a restriction enzyme consistent with the restriction enzyme recognition sequence Cleavage of the sequence site, and (d) chain fusion by ligation of the cleaved portions of both DNA sequences Preparing a DNA construct encoding the monomeric protein (FIG. 2), (e) operably linking the resulting chain fused monomeric protein coding DNA construct to a vector to construct a recombinant expression plasmid, and (f) the constructed Transforming or transfecting a host cell with a recombinant expression plasmid, and (g) forming the transformant or transfectant formed under appropriate conditions to allow the expression of the chain fused monomeric protein coding DNA construct to be carried out from the culture. It is prepared by separating and purifying the chain fused dimer protein.
면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편은 특정 제한효소의 인식서열과 리더 서열의 코딩 서열을 갖는 한 프라이머와 상기 세포외역 가용성 부위의 3' 말단서열과 면역글로불린 Fc의 특정 부위의 5'말단의 일부 서열을 코딩하는 안티센스 서열을 갖는 다른 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 생성한다.A DNA fragment encoding an extracellular soluble site of a protein involved in an immune response includes a primer having a recognition sequence of a specific restriction enzyme and a coding sequence of a leader sequence, and a 3 'terminal sequence of the extracellular soluble site and an immunoglobulin Fc. It is produced by polymerase chain reaction using another primer having an antisense sequence encoding some sequence at the 5 'end of the site.
면역글로불린 Fc의 특정 부위를 코딩하는 DNA 단편은 상기 면역반응 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위의 3'말단의 일부 서열을 포함하고, 상기 면역글로불린 Fc의 특정 부위의 5'말단을 코딩하는 서열을 갖는 한 프라이머와 특정 제한효소의 인식서열과 면역글로불린 Fc의 특정부위의 3'말단을 코딩하는 안티센스의 서열을 갖는 다른 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 이용하여 생성한다.The DNA fragment encoding the specific site of the immunoglobulin Fc comprises a sequence of 3 'end of the extracellular soluble site of the protein involved in the immune response, and the sequence encoding the 5' end of the specific site of the immunoglobulin Fc. One primer having a primer and another primer having a recognition sequence of a specific restriction enzyme and an antisense sequence encoding the 3 'end of a specific region of an immunoglobulin Fc are generated by polymerase chain reaction.
이와 같이 생성된 상기 면역반응 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA단편과 면역글로불린 Fc의 특정 부위를 코딩하는 DNA 단편을 한 시험관에서 혼합하고 DNA 가닥을 분리한 후, 공통되는 서열사이에서 상보적 결합이 일어나도록 유도한다. 이후 중합효소를 이용하여 각 DNA 가닥의 3' 말단으로부터 중합반응을 일으켜 완전한 두 가닥의 DNA 단편을 생성한다. 이를 주형으로 하여 상기 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 서열을 갖는 프라이머와 상기 면역글로불린 Fc의 특정부위의 3'말단을 코딩하는 프라이머를 사용한 중합효소연쇄반응을 일으켜, 상기 단백질의 세포외역 가용성 부위의 DNA단편과 상기 면역글로불린 Fc의 특정부위의 DNA단편의 서열을 포함하는 면역글로불린 융합 유전자를 증폭시킨다.The DNA fragment encoding the extracellular soluble site of the protein involved in the immune response thus generated and the DNA fragment encoding the specific site of immunoglobulin Fc are mixed in one test tube, and the DNA strands are separated. Induce complementary coupling to occur. The polymerase is then used to polymerize from the 3 'end of each DNA strand to produce two complete DNA fragments. Using this as a template, a polymerase chain reaction was carried out using a primer having a sequence encoding an extracellular soluble site of the protein and a primer encoding a 3 'end of a specific site of the immunoglobulin Fc, resulting in an extracellular soluble site of the protein. Amplifying an immunoglobulin fusion gene comprising a sequence of DNA fragments and DNA fragments of specific regions of the immunoglobulin Fc.
이렇게 생성된 면역글로불린 융합 유전자와 상기 단백질의 세포외역 가용성 부위의 서열을 갖는 DNA단편에 동일한 제한효소 인식서열을 중합효소 연쇄반응을 이용하여 삽입한 후, 제한효소를 사용하여 상기 제한효소 인식서열 부위를 절단하고, 절단된 부분을 라이게이즈로 연결하여 연쇄체 형태의 면역글로불린 융합 유전자를 제조한다.The same restriction enzyme recognition sequence was inserted into the DNA fragment having the immunoglobulin fusion gene and the sequence of the extracellular soluble region of the protein by using a polymerase chain reaction, and then the restriction enzyme recognition sequence region using the restriction enzyme. And cleaved portions were ligated to prepare immunoglobulin fusion genes in chain form.
이러한 면역글로불린 융합 유전자는 단백질의 세포외 분비를 촉진하기 위해 단백질에 모티브 서열이 포함되도록 제작할 수 있다. 예를 들면, CTLA-4분자는 비정상적으로 길며 수용성이 높은 N-말단의 친수성이 높은 여유분(redundancy)을 갖는 매우 특이한 리더 서열를 갖고 있다(Harper K, et al., J Immunol 147:1037-1044, 1991; and Brunet JF, Nature 328:267-270, 1987). 통상 대부분의 막표면 단백질이나 분비형 단백질은 그 N-말단에 소수성이 높은 20-24 개의 아미노산으로 구성되는 리더 서열을 갖는다. 그러나 본 CTLA-4분자는 16개의 친수성이 높은 N-말단의 16개의 아미노산과 소수성이 높은 전형적인 막영역에 해당되는 21개의 아미노산 등 도합 37개의 아미노산으로 구성되고 있다. 따라서, 종래에는 CTLA4Ig 융합단백질을 제조할 때에 분자의 리더 서열을 온코스타틴 M(Linsley PS et al., J Exp Med 174:561-569, 1991) 혹은 IL-6(Yamada A, et al., Microbiol Immunol 40:513-518, 1996)의 리더 서열로 전부 교체하여 발현하고 있다. 본 발명에 이르러, 정상적인 상태에서 CTLA-4분자는 리더서열의 특성에 의하여 세포내부에 잔류되지만 최소한 N말단 6개의 아미노산이상을 제거하면 발현세포밖으로 분비가 용이하게 이루어짐이 확인되었다. 바람직한 리더 서열은 ACLGFQRHKAQKNLAA이 제외된 MRTWPCTLLFFIPVFCKA의 아미노산 서열이다.Such immunoglobulin fusion genes can be constructed to include a motif sequence in a protein to promote extracellular secretion of the protein. For example, the CTLA-4 molecule has an unusually long leader sequence with an unusually long, water-soluble, N-terminal hydrophilic redundancy (Harper K, et al., J Immunol 147: 1037-1044, 1991; and Brunet JF, Nature 328: 267-270, 1987). Usually, most membrane surface and secretory proteins have a leader sequence consisting of 20-24 amino acids having high hydrophobicity at their N-terminus. However, this CTLA-4 molecule is composed of a total of 37 amino acids including 16 hydrophilic N-terminal 16 amino acids and 21 amino acids corresponding to a typical hydrophobic membrane region. Therefore, conventionally, when preparing a CTLA4Ig fusion protein, the leader sequence of the molecule is expressed oncotin M (Linsley PS et al., J Exp Med 174: 561-569, 1991) or IL-6 (Yamada A, et al., Microbiol). Immunol 40: 513-518, 1996), and replaced with all of the leader sequence. According to the present invention, it was confirmed that CTLA-4 molecules in the normal state remain inside the cells due to the characteristics of the leader sequence, but when at least six or more amino acids at the N-terminal are removed, the secreted cells are easily secreted out of the expression cells. Preferred leader sequences are the amino acid sequences of MRTWPCTLLFFIPVFCKA excluding ACLGFQRHKAQKNLAA.
상기 제조된 면역글로불린 융합 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 발현 플라스미드를 제조한 후, 이 플라스미드를 숙주 세포에 도입하여 형질감염체 또는 형질전환체를 제조하고, 이들 세포를 증폭 배양하여 생성된 연쇄체 형태의 융합 단백질을 정제함으로써 목적하는 연쇄 융합된 이량체 단백질을 얻을 수 있다.After inserting the prepared immunoglobulin fusion gene into a vector to prepare a recombinant expression plasmid, the plasmid was introduced into a host cell to prepare a transfectant or transformant, and the amplified culture of these cells produced a chain form. By purifying the fusion protein, the desired chain fused dimer protein can be obtained.
바람직하게는, 본 발명에 따른 연쇄 융합된 이량체 단백질의 제조를 위해 사용되는 숙주 세포는 골수종 세포주, CHO 세포, 원숭이 COS 세포, 사람 태아신장 293 세포 및 백큐로바이러스-감염된 곤충 세포이다. 이들 시스템에서 형성된 목적하는 폴리펩타이드는 집합하여 세포 배양 배지로 분비된다. 그런 다음, 본 발명의 연쇄 융합된 이량체 단백질은 면역글로불린과 상당 부분 동일한 방식으로 프로테인 A 또는 프로테인 G 친화성 크로마토그래피에 의해 실질적으로 정제할 수 있다. 사실, 효율적인 포유동물 세포 발현 및 이러한 유형의 정제는 면역반응에 관여하는 단백질을 이량체 단백질로서 발현하는데 상당한 이점이 된다.Preferably, the host cells used for the production of the chain fused dimer protein according to the invention are myeloma cell lines, CHO cells, monkey COS cells, human fetal kidney 293 cells and backcurovirus-infected insect cells. The desired polypeptides formed in these systems are collected and secreted into the cell culture medium. The chain fused dimer proteins of the invention can then be substantially purified by protein A or protein G affinity chromatography in much the same way as immunoglobulins. In fact, efficient mammalian cell expression and this type of purification provide significant advantages for expressing the proteins involved in the immune response as dimer proteins.
본 발명에 따른 당화된 연쇄 융합된 이량체 단백질의 제조Preparation of glycosylated chain fused dimer protein according to the present invention
숙주 세포로서 진핵 세포에 의해 생성되는 분비 단백질들은 당쇄의 수식에 의해 변형된다. 당쇄의 수식은 단백질의 물리적 성질은 물론 단백질의 생체내에서 의 안정성 및 기능에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 한가지 바람직한 양태는 숙주 세포로서 상기된 동물 세포주를 이용한 유전자 재조합 기술을 이용하여 목적하는 연쇄 융합된 이량체 단백질의 생산을 용이하게 하며, 또한 체내 안정성을 증가시키기 위해 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성부위에 부가적인 당쇄를 첨가하는 것을 포함한다.Secretory proteins produced by eukaryotic cells as host cells are modified by the modification of sugar chains. The modification of sugar chains is known to affect the physical properties of the protein as well as its stability and function in vivo. Thus, one preferred embodiment of the present invention facilitates the production of the desired chain fused dimer protein using genetic recombination techniques using the animal cell lines described above as host cells, and is also involved in immune responses to increase body stability. Adding an additional sugar chain to the extracellular soluble site of the protein.
당쇄의 수식에는 두 가지 유형이 있다. 하나는, O-형 당쇄 수식으로 아미노산 세린이나 쓰레오닌의 잔기에 올리고당이 결합하는 것이고, 또 다른 하나는 N-형 당쇄수식으로 아스파라긴의 잔기에 올리고당이 결합하는 형태이다. 특히, N-형 당쇄수식은 특정 아미노산 배열을 가질 때 일어나며 그 서열은 Asn-X-Ser/Thr로 알려져 있다(여기서, X는 프롤린을 제외하고 어떤 아미노산도 가능하다). N-연결된 올리고당과 O-연결된 올리고당의 구조는 서로 다르며 일반적으로 각 타입에서 발견되어지는 당 잔기들 또한 서로 다르다. 예를 들어, O-연결된 당 잔기에서는, N-아세틸갈락토사민이 변함없이 세린이나 쓰레오닌에 연결되어 있다. 모든 N-연결된 올리고당에서는, N-아세틸글루코사민이 아스파라긴에 연결되어 있다. O-연결된 올리고당은 일반적으로 1-4개의 당잔기만을 포함하고 있는 반면에, N-연결된 올리고당은 N-아세틸글루코사민과 만노스를 항상 포함하며 적어도 5개 이상의 당잔기로 이루어져 있다.There are two types of sugar chain formulas. One is an O-type sugar chain modification in which oligosaccharides are bound to residues of amino acids serine or threonine, and the other is an N-type sugar chain formula in which oligosaccharides are bonded to residues of asparagine. In particular, N-type sugar chain formulas occur when they have a specific amino acid sequence and the sequence is known as Asn-X-Ser / Thr (where X is any amino acid except proline). The structures of N-linked oligosaccharides and O-linked oligosaccharides are different and generally the sugar residues found in each type are also different. For example, in O-linked sugar residues, N-acetylgalactosamine is invariably linked to serine or threonine. In all N-linked oligosaccharides, N-acetylglucosamine is linked to asparagine. O-linked oligosaccharides generally contain only 1-4 sugar residues, whereas N-linked oligosaccharides always contain N-acetylglucosamine and mannose and consist of at least 5 sugar residues.
본 발명은 부가적인 당쇄 결합 부위를 갖도록 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 서열상에, 상기된 O-형 또는 N-형 당쇄수식이 발생하도록 하나 이상의 뉴클레오타이드를 변이시키고 그 DNA를 동물 숙주 세포를 통해 발현하면서 자연적으로 당쇄수식이 일어나도록 하는 것이다. 한 가지 양태로서, 본 발명에 따른 당화된 연쇄 융합된 이량체 단백질은 N-형 당쇄수식이 일어날 수 있는 Asn-X-Ser/Thr 서열이 부가 및/또는 증가하도록 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 서열을 변이시킴으로써 달성된다.The present invention mutates one or more nucleotides on the DNA sequence encoding the extracellular soluble site of a protein involved in an immune response to have an additional sugar chain binding site so that the O-type or N-type sugar chain modification described above occurs. By expressing DNA through animal host cells, sugar chain modification occurs naturally. In one embodiment, the glycosylated chain fused dimer protein according to the present invention is a cell of a protein involved in an immune response such that an Asn-X-Ser / Thr sequence capable of N-type glycoformation can be added and / or increased. Achievement is by mutation of a DNA sequence encoding an exogenous soluble site.
당화를 위한 DNA 서열의 변이는 통상적인 방법에 의해 실시될 수 있다. 한 가지 바람직한 양태로서, 연쇄체 결합부위, 즉 두 개의 면역반응에 관여하는 단백질의 세포외역 가용성 부위가, 세포내 단백분해효소의 공격으로부터 보호되도록 하여 혈중에서의 반감기를 증가시키는 효과를 얻기 위해, 서로 결합되는 부위에 중합효소 연쇄반응을 이용하여 다당화(multiglycosylation)로 수식되는 연쇄 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 제작할 수 있다. 특정적인 양태로서, 당화 모티브 펩타이드 서열은 제한효소 EcoRI과 세포외역 가용성부위의 리더 서열을 포함한 한 프라이머와 연쇄체 형태의 융합 유전자의 첫 번째 세포외역 가용성부위의 3' 말단의 일부를 코딩하는 염기서열과 두 번째 세포외역 가용성부위의 5' 말단의 일부를 코딩하는 염기서열을 가지고 당화 모티브로 치환된 염기서열을 가진 안티센스 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 제작한 DNA 단편과, 연쇄체 형태의 융합 유전자의 첫 번째 세포외역 가용성부위의 3' 말단의 일부를 코딩하는 염기서열과 두 번째 세포외역 가용성부위의 5' 말단의 일부를 코딩하는 염기서열을 가지고 당화 모티브로 치환된 염기서열을 가진 한 프라이머와 면역글로블린 G1의 Fc 부위의 3' 말단과 제한효소 XbaI를 코딩하는 안티센스 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응으로 제작된 DNA 단편을 한 시험관에 동시에 넣고 2차 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 삽입하였다.Variation of the DNA sequence for glycosylation can be carried out by conventional methods. In one preferred embodiment, to obtain the effect of increasing the half-life in the blood by allowing the chain binding site, ie, the extracellular soluble site of the protein involved in two immune responses, to be protected from the attack of intracellular proteases, DNA constructs encoding chain fused monomeric proteins modified by multiglycosylation can be prepared using polymerase chain reaction at sites bonded to each other. In a specific embodiment, the glycosylation motif peptide sequence is a nucleotide sequence encoding a portion of the 3 'end of the first extracellular soluble region of a primer and concatemer type fusion gene including the restriction enzyme EcoRI and the leader sequence of the extracellular soluble region. DNA fragments produced by polymerase chain reaction using an antisense primer having a nucleotide sequence encoding a portion of the 5 'end of the second extracellular soluble region and a nucleotide sequence substituted with a glycosylation motif, As long as it has a nucleotide sequence encoding a portion of the 3 'end of the first extracellular soluble region of the fusion gene and a nucleotide sequence encoding a portion of the 5' end of the second extracellular soluble region and is substituted with a glycosylation motif. Using the primer and the antisense primer encoding the restriction enzyme XbaI at the 3 'end of the Fc region of immunoglobulin G1 DNA fragments prepared by polymerase chain reaction were simultaneously inserted into one test tube and inserted by performing a secondary polymerase chain reaction.
본 발명의 구체적인 양태는 면역반응에 관여하는 단백질인 TNFR1, TNFR2, CD2 및 CTLA4의 세포외역 가용성 부위를 포함한다. 이들의 양태에 관한 첨부된 도면, 서열목록 및 실시예 참고로 하여 본 발명은 구체화될 것이다.Specific embodiments of the invention include extracellular soluble sites of TNFR1, TNFR2, CD2 and CTLA4, proteins involved in immune responses. The present invention will be embodied with reference to the accompanying drawings, sequence listing and examples relating to these aspects.
종양괴사인자-알파[TNF-α, 카케크틴(cachectin)으로도 알려져 있음]와 종양괴사인자-베타[TNF-β,림포톡신(lymphotoxin)으로도 알려져 있음]는 다면적인 사이토카인으로 염증, 세포 면역 반응, 패혈증, 세포독성, 악액질, 류마티스성 관절염, 염증 관련 질환[타타글리아(Tartaglia LA) 등의 문헌(Immunol. Today 13:151, 1992)]과 항바이러스성 반응[뷰틀러(Butler P)의 문헌(Peptide Growth Factor Ⅱ, 1990, Springer -Verlag, Berlin, pp.39-70)]을 유발한다. 세포 독성을 포함한 대부분의 TNF-α와 TNF-β의 작용들은 이들 각각이 삼중체 형태로 TNF 수용체에 결합함에 기인한다[엑(Eck MJ) 등의 문헌(J.Biol. Chem. 267:2119, 1992)]. TNF 수용체에는 분자량 55 킬로달톤(KDa)인 타입 I(TNFR1, p55)과 분자량 약 75 칼로달톤(KDa)인 타입 Ⅱ(TNFR2, p75)의 두 가지가 존재한다[스미스(Smith CA) 등의 문헌(Science 248:1019, 1990), 로처(Loetscher H) 등의 문헌(Cell 61:351, 1990), 샬(Schall) 등의 문헌(Cell 61:361, 1990)]. 이 두 수용체는 모두 TNF-α와 TNF-β에 대하여 거의 유사한 친화력을 나타내는 것으로 보고되었다(샬 등의 상기 문헌). 이들 가용성 수용체의 면역글로불린과의 융합 단백질은 TNF-α와 TNF-β와 결합함으로써 세포막에 존재하는 수용체와의 결합을 방해하여 그 작용을 억제하는 효과를 나타내며, TNF-의존성 염증을 완화시킬 수 있는 효과적인 물질로 사용되고 있다.Tumor necrosis factor-alpha (also known as TNF-α , also known as cachectin) and tumor necrosis factor-beta (also known as TNF-β, lymphotoxin) are multifaceted cytokines that cause inflammation and cellular Immune Responses, Sepsis, Cytotoxicity, Cachexia, Rheumatoid Arthritis, Inflammation-Related Diseases (Tagaglia LA et al. (Immunol. Today 13: 151, 1992)) and antiviral responses [Butler P (Peptide Growth Factor II, 1990, Springer-Verlag, Berlin, pp. 39-70). Most of the actions of TNF-α and TNF-β , including cytotoxicity, are due to their binding to TNF receptors in triplet form [Eck MJ et al., J. Biol. Chem. 267: 2119, 1992). There are two types of TNF receptors: type I (TNFR1, p55) having a molecular weight of 55 kilodaltons (KDa) and type II (TNFR2, p75) having a molecular weight of approximately 75 calodaltons (KDa) [Smith et al. (Science 248: 1019, 1990), Loetscher H et al. (Cell 61: 351, 1990), and Schall et al. (Cell 61: 361, 1990). Both receptors have been reported to exhibit nearly similar affinity for TNF-α and TNF-β (Shal et al., Supra). The fusion proteins of these soluble receptors with immunoglobulins have the effect of inhibiting the binding of TNF-α and TNF-β by inhibiting their binding to receptors present in the cell membrane, and alleviating TNF-dependent inflammation. It is used as an effective material.
면역반응을 조절하는 세포표면 항원중에 T 림프구의 충분한 활성반응을 얻기 위한 이차자극을 제공하는 공조자극계 항원인 CD2 및 CTLA4의 경우도 종양괴사인자 수용체와 동일한 방법으로 가용성 형태의 경우 각종 면역 질환을 치료할 수 있는 치료제로 사용될 수 있다. 체내의 면역반응은 T 림프구의 특정 수용체와 결합하는항원제시세포의 표면 항원 분자들 즉, T 림프구와 항원제시세포의 백혈구 항원 분자들에 의해 이루어지며, 항원제시 과정 중에 이차 신호인 공조신호가 없으면 T 림프구는 세포사멸 또는 클론 활성 무력화 유도에 의해 소멸된다. CD2의 경우는 항원제시세포의 LFA-3과 결합하는 T 림프구의 백혈구 항원으로 백혈구 세포의 부착 및 동조자극에 관여하며 CD28에 의한 동조자극과 병행하여 T 림프구의 활성화를 촉진한다. CTLA4의 경우는 T-림프구가 활성화한 후 발현되며, 휴식기가 되면 발현량이 증가하는 양상을 나타낸다. CTLA4는 항원제시세포의 B7과의 결합력이 CD28의 20배 이상이며, B7과 결합한 후 T-림프구의 활성을 억제하는 신호를 전달한다.The co-stimulatory antigens CD2 and CTLA4, which provide secondary stimulation for the full activation of T lymphocytes among cell surface antigens that regulate immune responses, can be treated in the same way as tumor necrosis factor receptors. It can be used as a therapeutic agent. The immune response in the body is made by the surface antigen molecules of antigen-presenting cells that bind to specific receptors of T lymphocytes, that is, the leukocyte antigen molecules of T lymphocytes and antigen-presenting cells. T lymphocytes die by inducing apoptosis or inactivating clone activity. CD2 is a leukocyte antigen of T lymphocytes that binds to LFA-3 of antigen-presenting cells and is involved in leukocyte cell adhesion and co-stimulation and promotes T lymphocyte activation in parallel with co-stimulation by CD28. In the case of CTLA4, T-lymphocytes are expressed after activation, and the expression level is increased during the resting period. CTLA4 has a binding capacity of antigen-presenting cells to B7 at least 20 times that of CD28, and transmits a signal that inhibits the activity of T-lymphocytes after binding to B7.
한 부류의 특정 양태로서, 본 발명은 서열번호: 6의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR1-TNFR1/Fc, 서열번호: 8의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR2-TNFR2/Fc, 서열번호: 18의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CD2-CD2/Fc 및 서열번호: 20의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CTLA4-CTLA4/Fc을 제공한다.In a particular aspect of the class, the invention provides a series of sequential chain fused monomer proteins TNFR1-TNFR1 / Fc of SEQ ID NO: 6, a series of sequential chain fusion monomer proteins TNFR2-TNFR2 / Fc of SEQ ID NO: 18, A chain fused monomer protein CD2-CD2 / Fc and a serial chain fused monomer protein CTLA4-CTLA4 / Fc of SEQ ID NO: 20 are provided.
다른 부류의 특정 양태로서, 본 발명은 서열번호: 5의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR1-TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물(TNFR1-TNFR1-IgG), 서열번호: 7의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR2-TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물 (TNFR2-TNFR2-IgG), 서열번호: 17의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CD2-CD2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물(CD2-CD2-IgG) 및 서열번호: 19의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CTLA4-CTLA4/Fc를 코딩하는 DNA 작제물(CTLA4-CTLA4-IgG)을 제공한다.In another class of specific embodiments, the present invention provides a DNA construct encoding a serial chain fused monomer protein TNFR1-TNFR1 / Fc of SEQ ID NO: 5 (TNFR1-TNFR1-IgG), a serial chain fused monomer of SEQ ID NO: 7 DNA construct encoding the protein TNFR2-TNFR2 / Fc (TNFR2-TNFR2-IgG), DNA construct encoding the serial chain fused monomer protein CD2-CD2 / Fc of SEQ ID NO: 17 (CD2-CD2-IgG), and A DNA construct (CTLA4-CTLA4-IgG) encoding the serial chain fused monomer protein CTLA4-CTLA4 / Fc of SEQ ID NO: 19 is provided.
또 다른 부류의 특정 양태로서, 본 발명은 서열번호: 5의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR1-TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된재조합 발현 플라스미드 pTR11Ig-Top10', 서열번호: 7의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR2-TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pTR22Ig-Top10', 서열번호: 17의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CD2-CD2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pCD22Ig 및 서열번호: 19의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CTLA4-CTLA4/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pCT44Ig를 제공한다. 이들 재조합 발현 플라스미드는 부다페스트 협약하의 국제기탁기관 KCCM에 기탁하고 각각 수탁번호 KCCM 10288, KCCM 10291, KCCM 10402 및 KCCM 10400를 부여받았다.In another class of embodiments, the invention provides a recombinant expression plasmid pTR11Ig-Top10 ', SEQ ID NO: 5, wherein the DNA construct encoding the serial chain fused monomeric protein TNFR1-TNFR1 / Fc is operably linked to a vector. : Recombinant expression plasmid pTR22Ig-Top10 ', SEQ ID NO: 17, wherein the DNA construct encoding the serial chain fused monomer protein TNFR2-TNFR2 / Fc is linked to the vector, the serial chain fused monomer protein CD2-CD2 / Recombinant expression plasmid pCD22Ig with a DNA construct encoding an Fc operably linked to the vector and a recombinant expression operably linked to the vector with a DNA construct encoding the serial chain fused monomer protein CTLA4-CTLA4 / Fc of SEQ ID NO: 19 Provides plasmid pCT44Ig. These recombinant expression plasmids were deposited with the International Depositary Organization KCCM under the Budapest Convention and were assigned accession numbers KCCM 10288, KCCM 10291, KCCM 10402 and KCCM 10400, respectively.
또 다른 부류의 특정 양태로서, 본 발명은 서열번호: 5의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR1-TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pTR11Ig-Top10'로 형질감염 또는 형질전환된 포유동물 숙주 세포(예, TR11Ig-CHO), 서열번호: 7의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR2-TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pTR22Ig-Top10'로 형질감염 또는 형질전환된 포유동물 숙주 세포(예, TR22Ig-CHO), 서열번호: 17의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CD2-CD2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pCD22Ig로 형질감염 또는 형질전환된 포유동물 숙주 세포 및 서열번호: 19의 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 CTLA4-CTLA4/Fc 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pCT44Ig로 형질감염 또는 형질전환된 포유동물 숙주세포를 제공한다. 상기 재조합 발현 플라스미드 pTR11Ig-Top10'로 형질감염된 챠이니즈 햄스터 난소 세포주 TR11Ig-CHO 및 상기 재조합 발현 플라스미드 pTR22Ig-Top10'로 형질감염된 챠이니즈 햄스터 난소 세포주 TR22Ig-CHO는 부다페스트 협약하의 국제기탁기관 KCCM에 기탁하고 각각 수탁번호 KCLRF-BP-00046 및 KCLRF-BP-00047을 부여받았다.In another class of specific embodiments, the invention is transfected with a recombinant expression plasmid pTR11Ig-Top10 ', wherein the DNA construct encoding the serial chain fused monomeric protein TNFR1-TNFR1 / Fc of SEQ ID NO: 5 is operably linked to a vector. Or a recombinant expression plasmid pTR22Ig-, in which a DNA construct encoding a transformed mammalian host cell (eg TR11Ig-CHO), a serial chain fused monomer protein TNFR2-TNFR2 / Fc of SEQ ID NO: 7, is operably linked to a vector. Mammalian host cells transfected or transformed with Top 10 '(eg TR22Ig-CHO), a DNA construct encoding the serial chain fused monomer protein CD2-CD2 / Fc of SEQ ID NO: 17, is operably linked to a vector Mammalian host cells transfected or transformed with the recombinant expression plasmid pCD22Ig and a DNA construct encoding the serial chain fused monomeric protein CTLA4-CTLA4 / Fc of SEQ ID NO: 19 are operative for the vector. Mammalian host cells transfected or transformed with the recombinant expression plasmid pCT44Ig linked thereto are provided. The Chinese hamster ovary cell line TR11Ig-CHO transfected with the recombinant expression plasmid pTR11Ig-Top10 'and the Chinese hamster ovary cell line TR22Ig-CHO transfected with the recombinant expression plasmid pTR22Ig-Top10' were deposited in the International Depository KCCM under the Budapest Convention. Accession numbers KCLRF-BP-00046 and KCLRF-BP-00047 were respectively assigned.
또 다른 부류의 특정 양태로서, 본 발명은 서열번호: 10의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgTNFR1-TNFR1/Fc, 서열번호: 12의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgTNFR2-TNFR2/Fc, 서열번호: 22의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgCD2-CD2/Fc 및 서열번호: 24의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgCTLA4-CTLA4/Fc을 제공한다.In another class of specific embodiments, the invention relates to a serial chain fused monomer protein mgTNFR1-TNFR1 / Fc with a glycosylation motif peptide of SEQ ID NO: 10, a serial chain fused monomer with a glycosylation motif peptide of SEQ ID NO: 12 Serial chain fused monomer protein inserted with glycosylation motif peptide of protein mgTNFR2-TNFR2 / Fc, SEQ ID NO: 22 Serial chain fused monomer protein mgCTLA4-CTLA4 with glycosylation motif peptide of SEQ ID NO: 24 Provide / Fc.
또 다른 부류의 특정 양태로서, 본 발명은 서열번호: 9의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgTNFR1-TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물, 서열번호: 11의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgTNFR2-TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물, 서열번호: 21의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgCD2-CD2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물 및 서열번호: 23의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgCTLA4-CTLA4/Fc를 코딩하는 DNA 작제물을 제공한다. 당화 모티브 펩타이드를 생성할 수 있게 하기 위하여 TNFR/Fc, CD2/Fc 및 CTLA4/Fc 연쇄체 형태의 융합 유전자의 세포외역 가용성 부위 결합부위를 코딩하는 염기서열에 해당하는 양방향 프라이머를 제작하였다. 이 프라이머는 연쇄체 형태의 융합 유전자의 임의의 아미노산을 코딩하는 염기서열이 아스파라긴(asparagin, N)을 코딩하는 염기서열 (AAT, AAC)로 치환될 수 있는 염기서열과 세린(serine, S) 혹은 트레오닌 (threonine, T)을 코딩하는 염기서열(세린:TCC, 트레오닌:ACC, ACG, ACA)로 치환될 수 있는 염기서열을 가지도록 하였다. 프라이머 제작시 복수의 아미노산 코드 서열중 한 서열의 선택은 중합효소 연쇄반응의 효율을 최대화하기 위하여 염기서열이 최소로 치환될 수 있는 조건 및 프라이머 결합 온도(melting temperature, Tm)를 고려하여 결정되었다.In another class of specific embodiments, the present invention provides a DNA construct encoding a serial chain fused monomer protein mgTNFR1-TNFR1 / Fc into which a glycosylation motif peptide of SEQ ID NO: 9 is inserted, wherein the glycosylation motif peptide of SEQ ID NO: 11 is inserted. DNA construct encoding the serial chain fused monomer protein mgTNFR2-TNFR2 / Fc, DNA construct encoding the serial chain fused monomer protein mgCD2-CD2 / Fc with the glycosylation motif peptide of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: : DNA construct encoding a serial chain fused monomer protein mgCTLA4-CTLA4 / Fc with 23 glycosylation motif peptide. In order to generate glycosylated motif peptides, bidirectional primers corresponding to base sequences encoding extracellular soluble site binding sites of fusion genes in the form of TNFR / Fc, CD2 / Fc and CTLA4 / Fc chains were prepared. This primer has a base sequence and serine (S) or nucleotide sequence that can be replaced by a nucleotide sequence encoding any amino acid of a fusion gene in the concatemer form (AAT, AAC) encoding asparagin (N). A base sequence encoding threonine (threonine, T) (serine: TCC, threonine: ACC, ACG, ACA) was to have a base sequence that can be substituted. Selection of one of a plurality of amino acid code sequences in the preparation of the primer was determined in consideration of the conditions under which the base sequence can be minimally substituted and the melting temperature (Tm) in order to maximize the efficiency of the polymerase chain reaction.
또 다른 부류의 특정 양태로서, 본 발명은 서열번호: 9의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgTNFR1-TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pTR11Ig-MG, 서열번호: 11의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgTNFR2-TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pTR22Ig-MG, 서열번호: 21의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgCD2-CD2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pCD22Ig-MG 및 서열번호: 23의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgCTLA4-CTLA4/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pCT44Ig-MG를 제공한다. 이들 재조합 발현 플라스미드는 부다페스트 협약하의 국제기탁기관 KCCM에 기탁하고 각각 수탁번호 KCCM 10404, KCCM 10407, KCCM 10401 및 KCCM 10399를 부여받았다.In another class of specific embodiments, the invention provides a recombinant expression plasmid pTR11Ig in which a DNA construct encoding a serial chain fused monomer protein mgTNFR1-TNFR1 / Fc into which a glycosylation motif peptide of SEQ ID NO: 9 is inserted is operably linked to a vector. Of the recombinant expression plasmid pTR22Ig-MG, SEQ ID NO: 21, wherein the DNA construct encoding the serial chain fused monomer protein mgTNFR2-TNFR2 / Fc into which the glycosylation motif peptide of SEQ ID NO: 11 is inserted is operably linked to the vector. Serial chain fused monomer protein mgCD2-CD2 / Fc with a glycosylated motif peptide inserted A serial chain with a recombinant expression plasmid pCD22Ig-MG and a glycosylated motif peptide of SEQ ID NO: 23 operably linked to a vector Recombinant expression plasmid pCT44I with a DNA construct encoding the fused monomer protein mgCTLA4-CTLA4 / Fc operably linked to the vector Provide g-MG. These recombinant expression plasmids were deposited with the International Depositary Organization KCCM under the Budapest Convention and were assigned accession numbers KCCM 10404, KCCM 10407, KCCM 10401 and KCCM 10399, respectively.
또 다른 부류의 특정 양태로서, 본 발명은 서열번호: 9의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgTNFR1-TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pTR11Ig-MG로 형질전환 또는 형질감염된 포유동물 숙주 세포, 서열번호: 11의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgTNFR2-TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pTR22Ig-MG로 형질전환 또는 형질감염된 포유동물 숙주 세포, 서열번호: 21의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgCD2-CD2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pCD22Ig-MG로 형질전환 또는 형질감염된 포유동물 숙주 세포 및 서열번호: 23의 당화 모티브 펩타이드가 삽입된 직렬 연쇄 융합된 단량체 단백질 mgCTLA4-CTLA4/Fc를 코딩하는 DNA 작제물이 벡터에 작동적으로 연결된 재조합 발현 플라스미드 pCT44Ig-MG로 형질전환 또는 형질감염된 포유동물 숙주 세포를 제공한다.In another class of specific embodiments, the invention provides a recombinant expression plasmid pTR11Ig in which a DNA construct encoding a serial chain fused monomer protein mgTNFR1-TNFR1 / Fc into which a glycosylation motif peptide of SEQ ID NO: 9 is inserted is operably linked to a vector. Recombinant expression of a mammalian host cell transformed or transfected with -MG, a DNA construct encoding a serial chain fused monomer protein mgTNFR2-TNFR2 / Fc into which a glycosylation motif peptide of SEQ ID NO: 11 is inserted, operably linked to a vector A mammalian host cell transformed or transfected with plasmid pTR22Ig-MG, a DNA construct encoding a serial chain fused monomer protein mgCD2-CD2 / Fc, into which a glycosylation motif peptide of SEQ ID NO: 21 is inserted, is operably linked to a vector Mammalian host cells transformed or transfected with the recombinant expression plasmid pCD22Ig-MG and the glycosylation motif of SEQ ID NO: 23 Peptide is infected with the inserted serial chain fusion monomeric protein mgCTLA4-CTLA4 / Fc DNA construct encoding operation on the vector typically associated recombinant expression plasmids transformed or transfected with a pCT44Ig-MG provides a mammalian host cell.
본 발명에 따라 제조된 형질전환체 또는 형질감염체를 배양하고 배양물로부터 분리된 본 발명의 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질은 상기 표1에 수록한 바와 같이 면역글로불린에 결합된 연쇄체 형태의 면역반응에 관여하여 단백질의 종류에 따라 치료제, 진단제 및 연구용 도구로 다양하고 유용하게 사용될 수 있으며 이들의 용법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 특히 치료제로서 사용하는 경우는 통상적으로 알려져 있는 유효량을 적용할 수 있으나 특정 환자에 대한 특정 유효량은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 규정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 변할 수 있음은 이해될 것이다. 또한, 당업자는 본 발명에 따른 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질이 치료제로 사용되는 경우 이들의 투여 방식 및 경로도 면역반응에 관여하는 단백질의 통상적인 투여 방식 및 경로를 적용할 수 있음을 이해할 것이다.The serial chain fused dimer protein of the present invention cultured with a transformant or transfectant prepared according to the present invention and isolated from the culture is immunized in the form of a chain linked to an immunoglobulin as listed in Table 1 above. Depending on the type of protein involved in the reaction can be used in a variety of useful therapeutic agents, diagnostics and research tools and their usage is well known to those skilled in the art. In particular, when used as a therapeutic agent, an effective amount known in general may be applied, but a specific effective amount for a specific patient may include activity, age, weight, general health, sex, diet, time of administration, route of administration, and release rate of the specific compound used. It will be appreciated that this may vary depending on a number of factors, including the combination of the drug and the severity of the particular disease being prevented or treated. Those skilled in the art will also understand that when the serial chain fused dimeric proteins according to the invention are used as therapeutic agents, their mode of administration and route may also apply the usual mode of administration and route of protein involved in the immune response.
본 발명은 하기 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단순히 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명할 것이다. 설명의 편의를 위해 본 발명과 관련하여 하기 실시예에 따라 제조된 DNA 작제물, 재조합 발현 플라스미드, 형질전환 세포주, 사용된 프라이머에 관한 서열목록 및 기탁 정보를 아래 표 8 및 9에 요약한다.The invention will be explained in more detail through the following examples. However, these examples are merely to illustrate the invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the invention is not limited by these examples. For convenience of explanation, the sequence listing and deposit information for DNA constructs, recombinant expression plasmids, transformed cell lines, primers used, prepared according to the following examples in connection with the present invention are summarized in Tables 8 and 9 below.
표 8. DNA 작제물 등에 관한 정보Table 8. Information about DNA constructs, etc.
표 9. 프라이머에 관한 정보Table 9. Information about primers
실시예 1Example 1
인체 TNFRHuman body TNFR
A. 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 제조(도 1 및 도 5)A. Preparation of DNA constructs encoding simple fused monomeric protein TNFR1 / Fc (FIGS. 1 and 5)
a. TNFR1의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편a. DNA fragments encoding extracellular soluble sites of TNFR1
인체 TNF 수용체 타입 I(TNFR1, p55)의 세포외역 가용성 부위와 인체 면역글로불린 G1의 Fc 부위가 연결된 융합 유전자를 제조하기 위해 문헌[홀튼 등의 Biotechniques 8:528, 1990)]에 기술되어 있는 방법과 동일한 방법으로 중합효소 연쇄반응 방법(PCR)을 수행하였다.The method described in Holton et al. Biotechniques 8: 528, 1990 for the production of a fusion gene wherein the extracellular soluble site of human TNF receptor type I (TNFR1, p55) is linked to the Fc site of human immunoglobulin G1; The polymerase chain reaction method (PCR) was performed in the same manner.
제한효소 EcoRI의 인식서열과 리더 서열(서열번호 2의 펩타이드 1-20)의 코딩 서열을 갖는 한 프라이머(서열번호: 25의 뉴클레오타이드)와 상기 세포외역 가용성 부위(TNFR1-ED)의 3' 말단서열과 면역글로블린 Gl(IgG1)의 힌지 부위(hinge region: H)의 5' 말단의 일부 서열을 코딩하는 안티센스 서열(서열번호: 26의 뉴클레오타이드)을 갖는 다른 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 TNFR1의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편을 생성하였다. 이 반응을 위한 주형 cDNA는 건강한 성인의 단핵구 세포(T림파구)에서 추출한 mRNA를 역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 제조하였다.One primer (SEQ ID NO: 25 nucleotide) having the recognition sequence of the restriction enzyme EcoRI and the coding sequence of the leader sequence (peptides 1-20 of SEQ ID NO: 2) and the 3 'terminal sequence of the extracellular soluble site (TNFR1-ED) And TNFR1 by polymerase chain reaction using another primer having an antisense sequence (nucleotide of SEQ ID NO: 26) encoding a partial sequence of the 5 'end of the hinge region (H) of immunoglobulin Gl (IgG1). DNA fragments encoding extracellular soluble sites were generated. Template cDNA for this reaction was prepared by reverse transcriptase-polymerase chain reaction of mRNA extracted from healthy adult monocytes (T lymphocytes).
건강한 성인의 혈액을 채취하고 알피엠아이-1640[RPMI-1640(Gibco BRL, USA)] 배지와 1:1로 희석하여 이를 피콜-하이팩 [Ficoll-hypaque(Amersham, USA)]를 사용하여 밀도구배 원심분리(density-gradient centrifugation)하여 상부에 형성된 T 림프구 세포층을 얻었다. 그리고 알피엠아이-1640 배지로 3회 세척하고 여기에 10% 우태아혈청(FBS, Gibco BRL,5 USA) 함유 알피엠아이-1640 배지를 가하여 T 림프구 세포가 5×105개/ml로 하고, 류코아굴루티닌[leukoagglutinin (Pharmacia, USA)]을 3.5㎍/ml가 되도록 첨가한 후, 5% CO2배양기에, 37℃에서 2일간 배양하였다.Collect blood from healthy adults and dilute 1: 1 with RPMI-1640 (Gibco BRL, USA) medium and centrifuge the density gradient using Ficoll-hypaque (Amersham, USA). Density-gradient centrifugation was performed to obtain a T lymphocyte cell layer formed on top. After washing three times with ALPM-1640 medium and adding ALPM-1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, 5 USA), the T lymphocyte cells were 5 × 105 cells / ml. After adding leukoagglutinin (Pharmacia, USA) to 3.5 μg / ml, the cells were incubated at 37 ° C. for 2 days in a 5% CO2 incubator.
mRNA는 트리리젠트 [Tri-Reagent(MRC, USA)] mRNA 분리 키트를 이용하여 순수 분리하였다. 우선 인간 T 림프구 2×107개의 세포를 인산완충 생리식염수용액(phosphate buffered saline, PBS, pH7.2)으로 3회 세척한 후 1㎖ 트리리젠트로 수차례 섞어서 RNA를 용해시켰다. 이 튜브에 0.2㎖ 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 강하게 흔들어준 후, 실온에서 15분간 방치한 다음, 4℃에서 15,000rpm으로 15분간 원심분리하였다. 상층액을 1.5㎖ 튜브로 옮기고 0.5㎖ 이소프로판올(isopropanol)을 첨가한 후, 4℃에서 15,000rpm으로 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 버린 후, 침전물에, 75% 에탄올(Ethanol)-25% 디이피씨[DEPC(Sigma, USA)]를 처리한 3차 증류수를 1㎖ 첨가하여 2∼3회 섞은 후 4℃에서 15,000rpm으로 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 완전히 제거하고 공기 중에서 건조시켜 잔여 에탄올을 제거한 후 RNA를 디이피씨를 처리한 3차 증류수 50㎕로 녹였다.mRNA was purely isolated using the TriRegent [Tri-Reagent (MRC, USA) mRNA separation kit. First, human T lymphocytes 2 × 107 cells were washed three times with phosphate buffered saline (PBS, pH 7.2) and mixed several times with 1 ml trigent to dissolve RNA. 0.2 ml chloroform was added to the tube, shaken vigorously, and left at room temperature for 15 minutes, followed by centrifugation at 15,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. The supernatant was transferred to a 1.5 ml tube and 0.5 ml isopropanol was added, followed by centrifugation at 15,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. After the supernatant was discarded, 1 ml of tertiary distilled water treated with 75% Ethanol-25% DPC (DEPC (Sigma, USA)) was added to the precipitate and mixed 2-3 times, followed by 15,000 rpm at 4 ° C. Centrifugation for 15 minutes. The supernatant was completely removed, dried in air to remove residual ethanol, and RNA was dissolved in 50 µl of tertiary distilled water treated with DPC.
cDNA 합성은 1.5㎖ 튜브에 정제된 2㎍ mRNA와 1㎕ 올리고 디티[oligo dT(dT30, Promega, USA)] 프라이머를 10μM의 농도로 혼합하고, 70℃에서 2분간 가열한 후, 얼음에 넣어 2분간 식혔다. 이 혼합물에 200U 엠-엠엘브이(M-MLV) 역전사효소[reverse transcriptase(Promega, USA)], 10㎕ 5× 반응완충용액(reaction buffer) [250mM 트리스-에이치씨엘(Tris-HCl), pH 8.3, 375mM 염화칼륨(KCl), 15mM염화마그네숨(MgCl2), 50mM 디티티(DTT)], 1㎕ 디엔티피[dNTP(각각 10mM의 농도, Takara, Japan)]를 넣고 디이피씨를 처리한 3차 증류수로 50㎕가 되도록 첨가한후, 42℃에서 1시간 반응시켜 1차 cDNA를 합성하였다.After cDNA synthesis, the oligonucleotide mix and the 1㎕ 2㎍ mRNA purified on 1.5㎖ tube dt [oligo dT (dT30, Promega, USA)] at a concentration of 10μ M primer, heated for 2 minutes at 70 ℃, the ice Cool for 2 minutes. To this mixture was added 200 U M-MLV reverse transcriptase (Promega, USA), 10 μl 5 × reaction buffer [250 mM Tris-HCl, pH 8.3 , 375mM potassium chloride (KCl), 15mM magnesium chloride (MgCl2 ), 50mM Dititi (DTT), 1μl DNT [dNTP (concentration of 10mM, Takara, Japan)], and then treated with DPI After adding 50 μl of distilled water, the mixture was reacted at 42 ° C. for 1 hour to synthesize primary cDNA.
b. 면역글로블린 G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편b. DNA fragment encoding the Fc region of immunoglobulin G1
TNFR 세포외역 가용성부위의 3'말단의 일부 서열을 포함하고 IgG1의 힌지 부위의 5'말단을 코딩하는 서열을 갖는 한 프라이머[서열번호: 27의 뉴클레오타이드)와 Xbal의 인식서열과 IgG1 Fc의 3' 말단을 코딩하는 안티센스의 서열을 갖는 다른 프라이머(서열번호: 28의 뉴클레오타이드)를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 면역글로블린 G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편을 생성시켰다. 이 반응을 위한 주형 cDNA는 회복기에 있는 원인 불명의 열 환자의 말초 혈액 세포(B 림파구)에서 추출한 mRNA를 역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 제조하였다.One primer (SEQ ID NO: 27 nucleotide) containing the sequence 3 ′ end of the TNFR extracellular soluble region and having the sequence encoding the 5 ′ end of the hinge region of IgG1, the recognition sequence of Xbal and the 3 ′ of IgG1 Fc Another primer (nucleotide of SEQ ID NO: 28) having an antisense sequence encoding the terminus was used to generate a DNA fragment encoding the Fc region of immunoglobulin G1 by polymerase chain reaction. Template cDNA for this reaction was prepared using reverse transcriptase-polymerase chain reaction from mRNA extracted from peripheral blood cells (B lymphocytes) of ten patients with unknown causes during recovery.
c. 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물c. DNA constructs encoding simple fused monomeric protein TNFR1 / Fc
상기 생성된 TNFR1의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편과 면역글로블린 G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편을 한 시험관에서 혼합한 후, 공통되는 서열(TNFR1 세포외역 가용성 부위 3' 말단과 IgG1 힌지 부위의 5' 말단을 포함하는 서열)사이에서 상보적 결합이 일어나도록 유도하였다. 이를 주형으로 하여 TNFR1의 5' 말단을 코딩하는 서열을 갖는 프라이머(서열번호: 25의 뉴클레오타이드)와 IgG1 Fc의 3'말단을 코딩하는 프라이머(서열번호: 28의 뉴클레오타이드)를 사용한 중합효소 연쇄반응을 일으켜, 상기 TNFR1 세포외역 가용성 부위의 DNA 단편과 IgG1 Fc부위의 DNA 단편의 서열을 포함하는 목적하는 TNFR1/Fc 코딩 DNA 작제물을 증폭시켰다. 제조된 유전자는 발현 후 단백질의 분비를 용이하게 하기 위한 리더 시퀀스를 포함한다.The DNA fragment encoding the extracellular soluble site of the generated TNFR1 and the DNA fragment encoding the Fc site of immunoglobulin G1 were mixed in one test tube, and then the common sequence (TNFR1 extracellular soluble site 3 ′ end and IgG1 hinge site) were mixed. Sequence comprising the 5 'end of) to induce complementary binding. As a template, a polymerase chain reaction was carried out using a primer having a sequence encoding the 5 'end of TNFR1 (nucleotide of SEQ ID NO: 25) and a primer encoding the 3' end of IgG1 Fc (nucleotide of SEQ ID NO: 28). Thus, the desired TNFR1 / Fc coding DNA construct including the sequence of the DNA fragment of the TNFR1 extracellular soluble region and the DNA fragment of the IgG1 Fc region was amplified. The produced gene contains a leader sequence for facilitating secretion of the protein after expression.
d. 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 클로닝d. Cloning of DNA Constructs Encoding Simple Fused Monomer Protein TNFR1 / Fc
상기 제조된 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물을 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 소화시키고, 시판되고 있는 클로닝 벡터(stratagene사 제품) 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KS Ⅱ(+)]의 EcoRI/XbaI 부위에 삽입하여 클로닝하였다. 전체 코딩 영역 서열을 DNA 서열화에 의해 확인하였다(서열번호: 1). 이때 생성된 융합 단백질은 단순 융합된 단량체 단백질로서 TNFR1/Fc라 명명하였고, 타원형 구조는 융합 유전자의 1 차 발현 산물 단백질의 구조를 나타낸다. 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR1/Fc의 추정 아미노산 서열은 서열번호: 2에 해당한다.The DNA construct encoding the simple fused monomer protein TNFR1 / Fc prepared above was digested with restriction enzymes EcoRI and XbaI and commercially available cloning vector (stratagene) piBluescript KS II (+) Cloned by insertion into the EcoRI / XbaI site. The entire coding region sequence was confirmed by DNA sequencing (SEQ ID NO: 1). The resulting fusion protein was named TNFR1 / Fc as a simple fused monomer protein, and the elliptical structure represents the structure of the primary expression product protein of the fusion gene. The putative amino acid sequence of the simple fused monomeric protein TNFR1 / Fc corresponds to SEQ ID NO: 2.
B. 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 제조(도 1 및 도 5)B. Preparation of DNA constructs encoding simple fused monomeric protein TNFR2 / Fc (FIGS. 1 and 5)
a. TNFR2의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편a. DNA fragments encoding extracellular soluble sites of TNFR2
인체 TNF 수용체 타입 Ⅱ(TNFR2, p75)의 세포외역 가용성 부위와 인체 면역글로불린 G1의 Fc 부위가 연결된 융합 유전자를 상기 TNFR1의 제조 과정과 동일한 절차에 따라 제조하였다.A fusion gene, in which an extracellular soluble site of human TNF receptor type II (TNFR2, p75) and an Fc site of human immunoglobulin G1 was linked, was prepared according to the same procedure as in the preparation of TNFR1.
제한효소 EcoRI의 인식서열과 리더 서열(서열번호 4의 펩타이드 1-22)의 코딩 서열을 갖는 한 프라이머(서열번호: 29의 뉴클레오타이드)와 상기 세포외역 가용성 부위(TNFR2-ED)의 3' 말단서열과 면역글로블린 G1(IgG1)의 힌지 부위(hinge region: H)의 5' 말단의 일부 서열을 코딩하는 안티센스 서열(서열번호: 30의 뉴클레오타이드)을 갖는 다른 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 TNFR2의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편을 생성하였다. 이 반응을 위한 주형 cDNA는 TNFR1에서와 동일하게 건강한 성인의 단핵구 세포(T림파구)에서 추출한 mRNA를 역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 제조하였다.One primer (SEQ ID NO: 29 nucleotide) having the recognition sequence of the restriction enzyme EcoRI and the coding sequence of the leader sequence (peptide 1-22 of SEQ ID NO: 4) and the 3 'terminal sequence of the extracellular soluble site (TNFR2-ED) And TNFR2 by polymerase chain reaction using another primer having an antisense sequence (nucleotide of SEQ ID NO: 30) encoding a partial sequence of the 5 'end of the hinge region (H) of immunoglobulin G1 (IgG1). DNA fragments encoding extracellular soluble sites were generated. Template cDNA for this reaction was prepared by reverse transcriptase-polymerase chain reaction of mRNA extracted from healthy adult monocytes (T lymphocytes) as in TNFR1.
b. 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물b. DNA constructs encoding simple fused monomeric protein TNFR2 / Fc
상기 생성된 TNFR2의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편과 상기 TNFR1에 기술된 바와 같이 제조된 면역글로블린 G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편을 한 시험관에서 혼합한 후, 공통되는 서열(TNFR2 세포외역 가용성 부위 3' 말단과 IgG1 힌지 부위의 5' 말단을 포함하는 서열)사이에서 상보적 결합이 일어나도록 유도하였다. 이를 주형으로 하여 TNFR2의 5' 말단을 코딩하는 서열을 갖는 프라이머(서열번호: 29의 뉴클레오타이드)와 IgG1 Fc의 3'말단을 코딩하는 프라이머(서열번호: 28의 뉴클레오타이드)를 사용한 중합효소 연쇄반응을 일으켜, 상기 TNFR2 세포외역 가용성 부위의 DNA 단편과 IgG1 Fc 부위의 DNA 단편의 서열을 포함하는 목적하는 TNFR2/Fc 코딩 DNA 작제물을 증폭시켰다. 제조된 유전자는 발현 후 단백질의 분비를 용이하게 하기 위한 리더 시퀀스를 포함한다.The DNA fragment encoding the extracellular soluble region of the generated TNFR2 and the DNA fragment encoding the Fc region of the immunoglobulin G1 prepared as described in TNFR1 were mixed in one test tube, and then the common sequence (TNFR2 extracellular domain) was mixed. Complementary binding was induced between the soluble site 3 'end and the sequence comprising the 5' end of the IgG1 hinge site. As a template, a polymerase chain reaction was carried out using a primer having a sequence encoding the 5 'end of TNFR2 (nucleotide of SEQ ID NO: 29) and a primer encoding the 3' end of IgG1 Fc (nucleotide of SEQ ID NO: 28). Thus, the desired TNFR2 / Fc coding DNA construct comprising the sequences of the DNA fragment of the TNFR2 extracellular soluble region and the DNA fragment of the IgG1 Fc region was amplified. The produced gene contains a leader sequence for facilitating secretion of the protein after expression.
c. 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 클로닝c. Cloning of DNA Constructs Encoding Simple Fused Monomer Protein TNFR2 / Fc
상기 제조된 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물을 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 소화시키고, 시판되고 있는 클로닝 벡터(stratagene사 제품) 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KS Ⅱ(+)]의 EcoRI/XbaI 부위에 삽입하여 클로닝하였다. 전체 코딩 영역 서열을 DNA 서열화에 의해 확인하였다(서열번호: 3). 이때 생성된 융합 단백질은 단순 융합된 단량체 단백질로서 TNFR2/Fc라 명명하였고, 타원형 구조는 융합 유전자의 1 차 발현 산물 단백질의 구조를 나타낸다. 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR2/Fc의 추정 아미노산 서열은 서열번호: 4에 해당한다.The DNA construct encoding the simple fused monomer protein TNFR2 / Fc prepared above was digested with restriction enzymes EcoRI and XbaI, and a commercially available cloning vector (stratagene) piBluescript KS II (+) Cloned by insertion into the EcoRI / XbaI site. The entire coding region sequence was confirmed by DNA sequencing (SEQ ID NO: 3). The resulting fusion protein was named TNFR2 / Fc as a simple fused monomer protein, and the elliptical structure represents the structure of the primary expression product protein of the fusion gene. The putative amino acid sequence of the simple fused monomeric protein TNFR2 / Fc corresponds to SEQ ID NO: 4.
C. 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR1-TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 제조(도 2 및 도 5)C. Preparation of DNA constructs encoding chain fused monomeric proteins TNFR1-TNFR1 / Fc (FIGS. 2 and 5)
TNFR1 세포외역 가용성 부위가 연쇄체(concatamer)의 형태를 갖는 융합 유전자, 즉 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR1-TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물을 만들기 위해, TNFR1 세포외역 가용성 부위의 염기 서열과 상기 제조된 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물에 동일한 제한효소(BamHI) 인식서열을 중합효소 연쇄반응을 이용하여 삽입한 후 BamHI으로 절단된 부분을 라이게이즈 (ligase)로 연결하였다. 이 반응은 상기 제조된 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물(서열번호: 1의 뉴클레오타이드)을 주형으로 사용하였다.To prepare a DNA construct in which the TNFR1 extracellular soluble site encodes a concatamer, ie, a chain fused monomeric protein TNFR1-TNFR1 / Fc, the base sequence of the TNFR1 extracellular soluble site and the preparation The same restriction enzyme (BamHI) recognition sequence was inserted into the DNA construct encoding the simple fused monomer protein TNFR1 / Fc using polymerase chain reaction, and then the BamHI cleaved portion was linked with a ligase. . This reaction used a DNA construct encoding the simple fused monomeric protein TNFR1 / Fc prepared above (nucleotide of SEQ ID NO: 1) as a template.
서열번호: 25의 뉴클레오타이드에 해당하는 프라이머와 서열번호: 33의 뉴클레오타이드에 해당하는 프라이머를 사용하여 3' 말단에 BamHI 인식 서열을 갖는 TNFR1 세포외역 가용성 부위의 단편을 증폭하였고, 또한 서열번호: 28이 뉴클레오타이드에 해당하는 프라이머와 서열번호: 32의 뉴클레오타이드에 해당하는 프라이머를 사용하여 5' 말단에 BamHI 인식서열온 갖는 다른 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR1/Fc를 코딩하는 단편을 각각 증폭하였다. 중합효소 연쇄반응은 1㎕ 1차 cDNA, 2U 피에프유(Pfu) DNA 중합효소[polymerase (Stratagene, USA)], 10㎕ 10X 반응완충용액(reaction buffer) [200mM 트리스-HCI, pH 8.75, 100mM 황산암모늄 [(NH4)2SO4], 100mM 염화칼륨(KCl), 20mM 염화마그네숨(MgCl2)], 1% 트리톤(등록상표 Triton) X-100, 1mg/㎖ 우혈청알부민(BSA), 3㎕ 프라이머1(10μM), 3㎕ 프라이머2(10μM), 2㎕ 디엔티피(dNTP, 각각 10mM)를 넣고 3차 증류수로 100㎕가 되도록 첨가한 후 실시하였다. 반응 조건은 94℃에서 5분 동안 처리한 다음 95℃ 1분, 58℃ 1분30초, 72℃ 1분30초씩 31회 반응시키고, 72℃ 15분간 더 반응 시켜 중합효소 연쇄반응 산물이 완전한 평활 말단(blunt end)이 되도록 하였다.The primer corresponding to the nucleotide of SEQ ID NO: 25 and the primer corresponding to the nucleotide of SEQ ID NO: 33 were used to amplify a fragment of the TNFR1 extracellular soluble site having a BamHI recognition sequence at the 3 'end, and also SEQ ID 28: The primers corresponding to the nucleotides and the primers corresponding to the nucleotides of SEQ ID NO: 32 were used to amplify each of the fragments encoding the other simple fused monomer protein TNFR1 / Fc having the BamHI recognition sequence at the 5 'end. Polymerase chain reaction was performed with 1 μl primary cDNA, 2U Pfu DNA polymerase [polymerase (Stratagene, USA)], 10 μl 10X reaction buffer [200 mM Tris-HCI, pH 8.75, 100 mM Ammonium Sulfate [(NH 4)2 SO4 ], 100 mM potassium chloride (KCl), 20 mM Magnesium Chloride (MgCl2 )], 1% Triton® X-100, 1 mg / ml bovine serum albumin (BSA), 3 ㎕ the primer 1 (10μ M), 3㎕ primer 2 (10μ M), 2㎕ dienti blood (dNTP, 10mM each) were placed was added so that the 100㎕ with deionized water. The reaction conditions were treated at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 31 reactions at 95 ° C. for 1 minute, 58 ° C. for 1 minute 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute 30 seconds, and further at 72 ° C. for 15 minutes to completely smooth the polymerase chain reaction product. It was made to be a blunt end.
중합효소 연쇄반응 산물들을 0.8% 아가로즈 젤(agarose gel)에 전기영동한 후, 큐엑스 투 젤 추출 키트[Qiaex Ⅱ gel extraction kit(Qiagen, USA)]를 이용하여 순수 분리하였다. 순수분리된 중합효소 연쇄반응 산물들을 제한효소 BamHI으로 처리한 후 페놀/클로로포름 추출 방법으로 순수 분리하였다 이어서, BamHI으로 처리된 두 종류의 DNA 단편을 라이게이즈로 결합시켰다.The polymerase chain reaction products were electrophoresed on 0.8% agarose gel, and then purely separated using Qiaex II gel extraction kit (Qiagen, USA). The purely isolated polymerase chain reaction products were treated with restriction enzyme BamHI and then purely separated by phenol / chloroform extraction method. Then, two kinds of DNA fragments treated with BamHI were bound by ligation.
D. 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR2-TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물의 제조(도 2 및 도 5)D. Preparation of DNA constructs encoding chain fused monomeric proteins TNFR2-TNFR2 / Fc (FIGS. 2 and 5)
TNFR2 세포외역 가용성 부위의 염기 서열과 상기 제조된 단순 융합된 단량체 단백질 TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물에 동일한 제한효소(BamHI) 인식서열을 중합효소 연쇄반응을 이용하여 삽입한 후 BamHI으로 절단된 부분을 라이게이즈로 연결하여 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR2-TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물을 제조하였다.The same restriction enzyme (BamHI) recognition sequence was inserted into the DNA construct encoding the nucleotide sequence of the TNFR2 extracellular soluble site and the simple fused monomer protein TNFR2 / Fc prepared by the polymerase chain reaction, and then digested with BamHI. The portions were ligated to prepare DNA constructs encoding the chain fused monomeric protein TNFR2-TNFR2 / Fc.
3'말단에 BamHI 인식서열을 갖는 TNFR2 세포외역 가용성부위의 단편은 서열번호: 34의 뉴클레오타이드에 해당하는 프라이머와 서열번호: 35의 뉴클레오타이드에 해당하는 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 중합효소 연쇄반응은 TNFR1의 경우와 동일하게 실시하였다. 단 서열번호: 3의 상기 제조된 단순 융합된 단량체 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 주형으로 사용하였다. 중합효소 연쇄반응 산물은 TNFR1의 경우와 동일하게 분리하였다.A fragment of the TNFR2 extracellular soluble region having the BamHI recognition sequence at the 3 'end was amplified using a primer corresponding to the nucleotide of SEQ ID NO: 34 and a primer corresponding to the nucleotide of SEQ ID NO: 35. Polymerase chain reaction was performed in the same manner as in the case of TNFR1. However, the DNA construct encoding the above prepared simple fused monomeric protein of SEQ ID NO: 3 was used as a template. The polymerase chain reaction product was isolated in the same manner as in the case of TNFR1.
E. 당화 모티브를 갖는 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR1-TNFR1/Fc를 코딩하는 DNA 작제물E. DNA Construct Encoding a Chain Fused Monomer Protein TNFR1-TNFR1 / Fc with a Glycosylation Motif
TNFR1 세포외역 가용성부위의 결합부위에서 소수성을 나타내는 펩타이드 부위(서열번호: 6 197-216의 펩타이드)를 제외하고 첫 번째 TNFR1 세포외역 가용성부위의 3'의 말단의 일부(서열번호: 5 565-591의 뉴클레오타이드)와 두 번째 TNFR1 세포외역 가용성부위의 5' 말단의 일부(서열번호:5 649-681의 뉴클레오타이드)를 포함한 안티센스 프라이머(서열번호: 37의 뉴클레오타이드)와 제한효소 EcoRI을 가지고 리더 서열을 포함한 프라이머(서열번호: 25의 뉴클레오타이드)를 사용한 중합 효소 연쇄반응을 이용하여 DNA 단편을 제작하였다.Part of the 3 'end of the first TNFR1 extracellular soluble site (SEQ ID NOs: 5 565-591), except for the peptide site (SEQ ID NO: 6 197-216 peptide) showing hydrophobicity at the binding site of the TNFR1 extracellular soluble site Nucleotide) and a portion of the 5 'end of the second TNFR1 extracellular soluble region (nucleotides of SEQ ID NO: 5 649-681) and a leader sequence with a restriction enzyme EcoRI with an antisense primer (SEQ ID NO: 37 nucleotides) DNA fragments were prepared by polymerase chain reaction using a primer (nucleotide of SEQ ID NO: 25).
또한 상기한 프라이머에서 서열번호: 5의 565-567(CTG, Leu), 574-576(ACG, Thr), 652-654(CTA, Leu) 및 670-672(AGA, Arg)에 해당하는 뉴클레오타드를 AAC(Asn, N)로, 서열번호. 5의 571-573(TGC, Cys) 및 580-582(TTG, Leu)에 해당하는 뉴클레오타이드를 ACC(Thr, T)로, 서열번호: 5의 658-660(GAC, Asp)을 TCC(Ser, S)로 대치한 염기서열을 포함하도록 제작(서열번호: 36 및 37의 뉴클레오타이드)하여 총 4개의 당화 모티브 펩타이드 부위(서열번호: 10 189-191, 192-194, 198-200, 204-206의 펩타이드)를 삽입하였다.Also in the above primers nucleo corresponding to 565-567 (CTG, Leu), 574-576 (ACG, Thr), 652-654 (CTA, Leu) and 670-672 (AGA, Arg) of SEQ ID NO: 5 The tar to AAC (Asn, N), SEQ ID NO. The nucleotides corresponding to 571-573 (TGC, Cys) and 580-582 (TTG, Leu) of 5 are ACC (Thr, T), and 658-660 (GAC, Asp) of SEQ ID NO: 5 is TCC (Ser, (SEQ ID NOs: 36 and 37 nucleotides) to prepare a total of four glycosylated motif peptide sites (SEQ ID NOs: 10 189-191, 192-194, 198-200, and 204-206). Peptide) was inserted.
이 반응에서 연쇄체 형태의 TNFR1-TNFR1/Fc 유전자(서열번호: 5의 뉴클레오타이드)를 주형으로 사용하였다. 최초 중합효소 연쇄반응시 안티센스 프라이머의 절반만이 주형으로 사용된 연쇄체 형태의 TNFR1-TNFR1/Fc 유전자에 결합하도록 유도하였으며 연쇄반응이 진행되면서 주형에 결합되지 아니한 부위가 중합효소에 의해 완전한 두가닥의 DNA를 이루도록 하여 리더 서열을 포함한 TNFR1 세포외역 부위 3' 말단에 두 번째 세포외역 가용성부위의 일부를 코딩하는 5' 말단 염기 서열이 결합된 상태의 DNA 단편을 얻을 수 있게 하였다. 이와 같이 두 번째 세포외역 가용성부위의 일부 5' 말단 염기서열은 이후 2차 중합효소 연쇄반응시 다음에 설명하는 두 번째 DNA 단편과 상보적 결합이 가능하는 작용을 하게 된다.In this reaction, the TNFR1-TNFR1 / Fc gene (nucleotide of SEQ ID NO: 5) in the form of a chain was used as a template. In the first polymerase chain reaction, only half of the antisense primers were induced to bind to the TNFR1-TNFR1 / Fc gene in the form of the chain used as a template, and as the chain reaction progressed, the sites not bound to the template were completely doubled by the polymerase. The DNA fragment of the 5 'terminal nucleotide sequence encoding a part of the second extracellular soluble region at the 3' end of the TNFR1 extracellular site including the leader sequence was obtained. As such, the partial 5 'terminal sequence of the second extracellular soluble region is capable of complementary binding to the second DNA fragment described later in the second polymerase chain reaction.
두 번째 DNA 단편은 첫 번째 TNFR1 세포외역 가용성부위 3' 말단의 일부(서열번호: 5 565-591의 뉴클레오타이드)와 두 번째 TNFR1 세포외역 가용성부위의 5'말단의 일부(서열번호: 5 649-681의 뉴클레오타이드)를 포함한 한 프라이머(서열번호: 36의 뉴클레오타이드)와 제한효소 XbaI의 인식서열과 IgG1 Fc의 3' 말단을 코딩하는 안티센스의 서열을 갖는 다른 프라이머(서열번호: 28의 뉴클레오타이드)를 사용한 중합효소 연쇄반응을 이용하여 제작하였다. 이 반응도 상기한 바와 같이 세포외역 가용성부위에 해당하는 프라이머의 절반만이 주형에 결합하도록 유도하였으며, 결과적으로 상기한 DNA 단편과 동일하게 TNFR1 세포외역 부위 5' 말단에 첫 번째 세포외역 가용성부위 3' 말단의 일부를 코딩하는 염기 서열을 갖도록 하였다.The second DNA fragment is a portion of the 3 'end of the first TNFR1 extracellular soluble region (SEQ ID NO: 5 565-591) and a portion of the 5' end of the second TNFR1 extracellular soluble region (SEQ ID NOs: 5 649-681 Polymerization using one primer (nucleotide of SEQ ID NO: 36) including the nucleotides of (SEQ ID NO: 36) and another primer (SEQ ID NO: 28 nucleotide) having the recognition sequence of restriction enzyme XbaI and the antisense sequence encoding the 3 'end of IgG1 Fc. It was produced using the enzyme chain reaction. As described above, only half of the primer corresponding to the extracellular soluble site was induced to bind to the template. As a result, the first extracellular soluble site 3 'at the 5' end of the TNFR1 extracellular site was identical to the above DNA fragment. It was intended to have a nucleotide sequence encoding a portion of the terminal.
이어서 상기한 두 종류의 중합효소 연쇄반응 결과물인 DNA 단편을 동일한 시험관에 혼합한 후 중복되는 상보적 염기서열 사이에서의 결합을 유도한 후, 연쇄체 형태 유전자의 각 5' 및 3' 말단에 해당하는 프라이머(서열번호: 25와 28)를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하므로써 두 DNA 단편을 결합시켰으며 이를 mgTNFR1-TNFR1-IgG라고 명명하였다.Subsequently, DNA fragments resulting from the above-described two kinds of polymerase chain reactions were mixed in the same test tube, and then induced binding between overlapping complementary sequences, corresponding to the 5 'and 3' ends of the chain form genes. Two DNA fragments were combined by performing a polymerase chain reaction using primers (SEQ ID NOs: 25 and 28), which were named mgTNFR1-TNFR1-IgG.
F. 당화 모티브를 갖는 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR2-TNFR2/Fc를 코딩하는 DNA 작제물F. DNA constructs encoding chain fused monomeric protein TNFR2-TNFR2 / Fc with glycosylation motif
TNFR2 세포외역 가용성부위의 결합부위에서 소수성을 나타내는 펩타이드 부위(서열번호: 8 203-263의 펩타이드)를 제외하고 첫 번째 TNFR2 세포외역 가용성부위의 3'의 말단의 일부(서열번호: 7 586-606의 뉴클레오타이드)와 두 번째 TNFR2 세포외역 가용성부위의 5' 말단의 일부(서열번호: 7 790-807의 뉴클레오타이드)를 포함한 안티센스 프라이머(서열번호: 39의 뉴클레오타이드)와 제한효소 EcoRI을 가지고 리더 시퀀스를 포함한 프라이머(서열번호: 29의 뉴클레오타이드)를 사용한 중합효소 연쇄반응을 이용하여 DNA 단편을 제작하였다.Part of the 3 'end of the first TNFR2 extracellular soluble site (SEQ ID NO: 7 586-606), except for the peptide site (SEQ ID NO: 8 203-263 peptide) showing hydrophobicity at the binding site of the TNFR2 extracellular soluble site Nucleotides) and a portion of the 5 'end of the second TNFR2 extracellular soluble region (nucleotides of SEQ ID NO: 7 790-807) and a leader sequence with a restriction enzyme EcoRI with an antisense primer (SEQ ID NO: 39 nucleotides) DNA fragments were prepared by polymerase chain reaction using a primer (nucleotide of SEQ ID NO: 29).
또한 상기한 프라이머에서 서열번호: 7의 595-597(GTC, Val) 및 799-801(GGG, Gly)에 해당하는 뉴클레오타이드를 AAC(Asn, N)로 대치한 염기서열을 포함하도록 제작(서열번호: 38 및 39의 뉴클레오타이드)한 프라이머를 이용하여 총 2개의 당화 모티브 펩타이드 부위(서열번호: 12 199-201, 206-208의 펩타이드)를 삽입하였다.In addition, the nucleotides corresponding to the nucleotides corresponding to 595-597 (GTC, Val) and 799-801 (GGG, Gly) of SEQ ID NO: 7 with AAC (Asn, N) were prepared from the above primers (SEQ ID NO: : A total of two glycosylated motif peptide sites (SEQ ID NOs: 12 199-201 and 206-208 peptides) were inserted using primers 38 and 39 nucleotides).
이 반응에서 연쇄체 형태의 TNFR2-TNFR2/Fc 유전자(서열번호: 7의 뉴클레오타이드)를 주형으로 사용하였다. 최초 중합효소 연쇄반응시 안티센스 프라이머의 절반만이 주형으로 사용된 연쇄체 형태의 TNFR2-TNFR2/Fc 유전자에 결합하도록 유도하였으며 연쇄반응이 진행되면서 주형에 결합되지 아니한 부위가 중합효소에 의해 완전한 두가닥의 DNA를 이루도록 하여 리더 시퀀스를 포함한 TNFR2 세포외역 부위 3' 말단에 두 번째 세포외역 가용성부위의 일부를 코딩하는 5' 말단 염기 서열이 결합된 상태의 DNA 단편을 얻을 수 있게 하였다. 이와 같이 두 번째 세포외역 가용성부위의 일부 5' 말단 염기서열은 이후 2차 중합효소 연쇄반응시 다음에 설명하는 두 번째 DNA 단편과 상보적 결합이 가능하는 작용을 하게 된다.In this reaction, the chain form of the TNFR2-TNFR2 / Fc gene (nucleotide of SEQ ID NO: 7) was used as a template. In the first polymerase chain reaction, only half of the antisense primers were induced to bind to the TNFR2-TNFR2 / Fc gene in the form of a chain used as a template. The DNA fragment of the 5 'terminal nucleotide sequence encoding a part of the second extracellular soluble region at the 3' end of the TNFR2 extracellular site including the leader sequence was obtained. As such, the partial 5 'terminal sequence of the second extracellular soluble region is capable of complementary binding to the second DNA fragment described later in the second polymerase chain reaction.
두 번째 DNA 단편은 첫 번째 TNFR2 세포외역 가용성부위 3' 말단의 일부(서열번호: 7 586-606의 뉴클레오타이드)와 두 번째 TNFR2 세포외역 가용성부위의 5'말단의 일부(서열번호: 7 790-807의 뉴클레오타이드)를 포함한 한 프라이머(서열번호: 38의 뉴클레오타이드)와 제한효소 XbaI의 인식서열과 IgG1 Fc의 3' 말단을 코딩하는 안티센스의 서열을 갖는 다른 프라이머(서열번호: 28의 뉴클레오타이드)를 사용한 중합효소 연쇄반응을 이용하여 제작하였다. 이 반응도 상기한 바와 같이 세포외역 가용성부위에 해당하는 프라이머의 절반만이 주형에 결합하도록 유도하였으며, 결과적으로 상기한 DNA 단편과 동일하게 TNFR2 세포외역 부위 5' 말단에 첫 번째 세포외역 가용성부위 3' 말단의 일부를 코딩하는 염기 서열을 갖도록 하였다.The second DNA fragment is a portion of the 3 'end of the first TNFR2 extracellular soluble region (SEQ ID NO: 7 586-606) and a portion of the 5' end of the second TNFR2 extracellular soluble region (SEQ ID NO: 7 790-807 Polymerization using one primer (nucleotide of SEQ ID NO: 38) containing the nucleotide of (SEQ ID NO: 38) and another primer (SEQ ID NO: 28 nucleotide) having a recognition sequence of restriction enzyme XbaI and an antisense sequence encoding the 3 'end of IgG1 Fc. It was produced using the enzyme chain reaction. This reaction also induced only half of the primer corresponding to the extracellular soluble site to bind to the template. As a result, the first extracellular soluble site 3 'at the 5' end of the TNFR2 extracellular site was identical to the above DNA fragment. It was intended to have a nucleotide sequence encoding a portion of the terminal.
이어서 상기한 두종류의 중합효소 연쇄반응 결과물인 DNA 단편을 동일한 시험관에 혼합한 후 중복되는 상보적 염기서열 사이에서의 결합을 유도한 후, 연쇄체 형태 유전자의 각 5' 및 3' 말단에 해당하는 프라이머(서열번호: 29와 28)를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하므로써 두 DNA 단편을 결합시켰으며 이를 mgTNFR2-TNFR2-IgG라고 명명하였다.Subsequently, DNA fragments resulting from the above-described two kinds of polymerase chain reactions were mixed in the same test tube, followed by induction of binding between overlapping complementary sequences, which corresponded to the respective 5 'and 3' ends of the chain-form genes. Two DNA fragments were combined by performing a polymerase chain reaction using primers (SEQ ID NOs: 29 and 28), which were named mgTNFR2-TNFR2-IgG.
G. 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR-TNFR/Fc 및 이의 당화 단백질을 코딩하는 DNA 작제물의 클로닝G. Cloning of the DNA construct encoding the chain fused monomeric protein TNFR-TNFR / Fc and its glycosylated protein
상기 제조된 연쇄 융합된 단량체 단백질 TNFR-TNFR/Fc 및 이의 당화 단백질을 코딩하는 DNA 작제물을 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KS Ⅱ(+), Stratagene, USA]의 EcoRI/XbaI 부위에 삽입하여 클로닝하였다. 이때 생성된 융합 단백질은 연쇄 융합된 단량체 단백질로서 TNFR1-TNFR1/Fc와 TNFR2-TNFR2/Fc, 이의 당화 단백질로서 mgTNFR1-TNFR1/Fc와 mgTNFR2-TNFR2/Fc라 명명하였고, 이들의 추정 아미노산 서열은 각각 서열번호: 6, 8, 10 및 12에 해당한다.DNA constructs encoding the prepared chain fused monomeric protein TNFR-TNFR / Fc and glycosylated proteins thereof were inserted into the EcoRI / XbaI site of pBluescript KS II (+), Stratagene, USA]. Cloned. The resulting fusion protein was named as TNFR1-TNFR1 / Fc and TNFR2-TNFR2 / Fc as a chain fused monomeric protein, and mgTNFR1-TNFR1 / Fc and mgTNFR2-TNFR2 / Fc as glycosylation proteins thereof, and their putative amino acid sequences were respectively. Corresponds to SEQ ID NOs: 6, 8, 10 and 12.
벡터로 사용할 10㎕ 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KS Ⅱ (+), Stratagene, USA)]를 15U EcoRI과 15U XbaI, 5㎕ 10X 반응완충용액(reaction buffer) [100mM 트리스-HCl, pH 7.5, 100mM 염화마그네슘(MgCl2), 10mM 디티티 (DTT), 500nM 염화나트륨(NaCl)], 5㎕ 0.1% 우혈청알부민[BSA(Takara, Japan)]을 섞은 후, 3차 증류수로 50㎕가 되도록 첨가한 후 37℃에서 2시간 반응시켜 DNA를 소화시켰다. 반응물을 0.8% 아가로즈 겔에 전기영동한 후, 큐엑스 투 젤 추출 키트 [Qiaex Ⅱ gel extraction kit(Qiagen, USA)]로 순수 분리하였다.10 μl piBluescript KS II (+, Stratagene, USA) to be used as a vector was added to 15 U EcoRI, 15 U XbaI, 5 μl 10X reaction buffer [100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM magnesium chloride (MgCl2 ), 10 mM Diti (DTT), 500 nM sodium chloride (NaCl)], 5 μl 0.1% bovine serum albumin [BSA (Takara, Japan)] were mixed and added to 50 μl with tertiary distilled water. After the reaction at 37 ℃ for 2 hours to digest the DNA. The reaction was electrophoresed on a 0.8% agarose gel, followed by pure separation with Qiaex II gel extraction kit (Qiagen, USA).
EcoRI과 XbaI으로 소화된 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KS Ⅱ(+), Stratagene, USA] 100ng과 제한효소로 소화시킨 20ng의 중합효소 연쇄반응 산물을 혼합하고 0.5U 티포(T4) DNA 라이게이즈[ligase(Amersham, USA)], 1㎕ 10X반응완충용액(reaction buffer) [300mM 트리스-에이치씨엘(Tris-HCl), pH 7.8, 100mM 염화마그네습(MgCl2), 100mM 디티티(DTT), 10mM 에이티피(ATP)]를 넣은 후 3차 증류수로 10㎕가 되도록 첨가한 후 16℃ 수조(water bath)에서 16시간 동안 반응시켰다. 대장균[E. coil Top10(Novex, USA)]을 리비듐 클로라이드(RbCl, ribidium chloride, Sigma, USA)법으로 컴피턴트 세포(competent cell)를 만든 후 형질전환시켜 암피실린(ampicillin, Sigma, USA)을 50㎍/㎖ 함유한 엘비(LB) 고체 배지에 도말하고 37℃에서 16시간 배양하였다. 생성된 콜로니들을 암피실린이 50㎍ /㎖ 함유된 엘비(LB) 액체배지 4㎖에 접종한 후 37℃에서 16시간동안 진탕 배양하였다. 이 중 1.5㎖을 샘브룩(Sambrook J) 등의 문헌(Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1.25-1.31, p1.63-1.69, p7.26-7.29, 1989)에 기술된 알칼리 분해(alkaline lysis)법으로 플라스미드를 소량 추출한 후, EcoRI과 XbaI으로 소화시켜 클로닝의 유무를 확인하였다.0.5U Tipo (T4) DNA liger was mixed with 100ng of PBluescript KS II (+), Stratagene, USA digested with EcoRI and XbaI and 20ng of polymerase chain reaction digested with restriction enzymes. Ligase (Amersham, USA), 1 μl 10 × reaction buffer [300 mM Tris-HCl, pH 7.8, 100 mM MgCl2 , 100 mM DTT (DTT) , 10 mM ATP]] was added to 10 μl with tertiary distilled water and reacted for 16 hours in a 16 ° C. water bath. Escherichia coli [E. coil Top10 (Novex, USA)] was made into competent cells using rubidium chloride (RbCl, ribidium chloride, Sigma, USA) method and transformed to transform 50 μg / ml of ampicillin (ampigillin, Sigma, USA). It was plated in a solid medium containing (LB) and incubated for 16 hours at 37 ℃. The resulting colonies were inoculated into 4 ml of Elbi (LB) liquid medium containing 50 μg / ml of ampicillin, followed by shaking culture at 37 ° C. for 16 hours. 1.5 ml of this was subjected to alkali decomposition (see Sambrook J et al., Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1.25-1.31, p1.63-1.69, p7.26-7.29, 1989). A small amount of plasmid was extracted by alkaline lysis, and then digested with EcoRI and XbaI to confirm cloning.
전체 코딩영역 서열은 다이데옥시 체인 터미네이션 [Dideoxy chain termination(생어(Sanger F) 등의 문헌, PNAS USA, 74:5483, 1977)]법을 이용한 다음과 같은 DNA 서열화 방법에 의해 확인하였다. 상기의 알칼리 분해법으로 추출한 플라스미드 와 시쿼네이즈(등록상표 Sequenase ver. 2.0, Amersham, USA) 및35S 디에이티피(dATP, Amersham, USA)를 사용하여 제품 사용법에 준하는 방법으로 DNA 서열화 반응을 진행시켰다. 6% 폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel)에 위의 시료를 로딩(loading)하고 전압을 1800∼2000V 사이로 유지하여 젤의 온도를 50℃로 유지하면서 2시간 전기영동한 후, 건조시킨 다음 엑스레이 필름(Kodak, USA)에 2일동안 노출시킨 후 DNA 염기 서열을 판독하였다.The entire coding region sequence was confirmed by the following DNA sequencing method using dideoxy chain termination (Dideoxy chain termination (Sanger F et al., PNAS USA, 74: 5483, 1977)). The DNA sequencing reaction was carried out using a plasmid extracted from the above alkali decomposition method and a sequenase (registered trademark Sequenase ver. 2.0, Amersham, USA) and35 S dieti (dATP, Amersham, USA) according to the method of use of the product. Loading the sample on a 6% polyacrylamide gel (polyacrylamide gel) and maintaining the voltage between 1800 ~ 2000V, followed by electrophoresis for 2 hours while maintaining the temperature of the gel at 50 ℃, dried and then x-ray film ( The DNA sequence was read after 2 days of exposure to Kodak, USA.
실시예 2 및 3Examples 2 and 3
CD2 및 CTLA4CD2 and CTLA4
CD2 및 CTLA4의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편은, 제한효소 EcoRI의 인식서열과 리더 서열[CD2(서열번호: 14의 펩타이드 1-24), CTLA4(서열번호: 16의 펩타이드 1-21)]의 코딩 서열[CD2(서열번호: 13의 뉴클레오타이드, CTLA4(서열번호: 15의 뉴클레오타이드)]을 갖는 한 프라이머[CD2(서열번호: 40의 뉴클레오타이드), CTLA4(서열번호: 43의 뉴클레오타이드)]와, 제한효소 PstI의 인식서열과 상기 세포외역 가용성 부위의 3' 말단 서열을 코딩하는 안티센스 서열[CD2(서열번호: 13의 뉴클레오타이드), CTLA4(서열번호: 15의 뉴클레오타이드)]을 갖는 다른 프라이머[CD2(서열번호: 41), CTLA4(서열번호: 44)]를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 생성시켰다. 이 반응을 위한 주형 cDNA는 건강한 성인의 단핵구 세포(T림파구)에서 추출한 mRNA를 역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 제조하였다.DNA fragments encoding the extracellular soluble sites of CD2 and CTLA4 include the recognition sequence and leader sequence of the restriction enzyme EcoRI [CD2 (peptide 1-24 of SEQ ID NO: 14), CTLA4 (peptide 1-21 of SEQ ID NO: 16) ] One primer [CD2 (SEQ ID NO: 40 nucleotide), CTLA4 (SEQ ID NO: 43 nucleotide)] having a coding sequence [CD2 (SEQ ID NO: 13 nucleotide, CTLA4 (SEQ ID NO: 15))] , Another primer [CD2] having an recognition sequence of restriction enzyme PstI and an antisense sequence (CD2 (nucleotide of SEQ ID NO: 13), CTLA4 (nucleotide of SEQ ID NO: 15)) encoding the 3 'terminal sequence of the extracellular soluble site (SEQ ID NO: 41), CTLA4 (SEQ ID NO: 44)], and the template cDNA for this reaction is a reverse transcriptase-polymerase that expresses mRNA extracted from monocytes (T lymphocytes) of healthy adults. Using a chain reaction It was.
또한, 면역글로블린 G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편은, 제한효소 PstI의 인식서열과 IgG1의 상쇄부위의 5'말단을 코딩하는 서열을 갖는 한 프라이머(서열번호: 42의 뉴클레오타이드)와 XbaI의 인식서열과 IgG1 Fc의 3' 말단을 코딩하는 안티센스의 서열을 갖는 다른 프라이머(서열번호: 28)를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 생성시켰다. 이 반응을 위한 주형 cDNA는 회복기에 있는 원인 불명의 열 환자의 말초 혈액 세포(B 림파구)에서 추출한 mRNA를 역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 제조하였다.In addition, the DNA fragment encoding the Fc region of immunoglobulin G1 is one primer (SEQ ID NO: 42 nucleotide) having the recognition sequence of restriction enzyme PstI and the sequence encoding the 5 'end of the offset region of IgG1, and the recognition of XbaI. It was generated by polymerase chain reaction using another primer (SEQ ID NO: 28) having a sequence and an antisense sequence encoding the 3 'end of IgG1 Fc. Template cDNA for this reaction was prepared using reverse transcriptase-polymerase chain reaction from mRNA extracted from peripheral blood cells (B lymphocytes) of ten patients with unknown causes during recovery.
이어서 상기 생성된 CD2 및 CTLA4의 세포외역 가용성 부위를 코딩하는 DNA 단편과 면역글로블린 G1의 Fc 부위를 코딩하는 DNA 단편을 제한효소 PstI으로 소화시키고 티포 디엔에이 라이게이즈(T4 DNA ligase)를 이용하여 결합시키므로써 단순 이량체 형태의 CD2/Fc 및 CTLA4/Fc 유전자를 제작하였다. 제조된 유전자는 발현 후 단백질의 분비를 용이하게 하기 위한 리더 서열을 포함한다.Subsequently, the DNA fragments encoding the extracellular soluble regions of the generated CD2 and CTLA4 and the DNA fragments encoding the Fc region of immunoglobulin G1 are digested with restriction enzyme PstI and bound using a T4 DNA ligase. The simple dimeric forms of the CD2 / Fc and CTLA4 / Fc genes were constructed. The produced gene contains a leader sequence for facilitating secretion of the protein after expression.
상기 생성된 융합 유전자 단편을 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 소화시키고, 시판되고 있는 클로닝 벡터(stratagene사 제품) 피블루스크립트 케이에스투 플러스 [pBluescript KS Ⅱ(+)]의 EcoRI/ XbaI 부위에 삽입하여 클로닝하였다. 전체 코딩 영역 서열을 DNA 서열화에 의해 확인하였다(서열번호:13 및 15). 이때 생성된 융합 단백질을 각각 CD2/Fc, CTLA4/Fc라 명명하였고, 이들의 추정 아미노산 서열은 각각 서열번호: 14 및 16에 해당한다.The resulting fusion gene fragment was digested with restriction enzymes EcoRI and XbaI and cloned by inserting into the EcoRI / XbaI site of a commercial cloning vector (stratagene) pBluescript KS II (+). . The entire coding region sequence was confirmed by DNA sequencing (SEQ ID NOs: 13 and 15). The resulting fusion proteins were named CD2 / Fc and CTLA4 / Fc, respectively, and their putative amino acid sequences correspond to SEQ ID NOs: 14 and 16, respectively.
중합효소 연쇄반응은 1㎕ 1차 cDNA, 2U 피에프유(Pfu) DNA 중합효소 [polymerase (Stratagene, USA)], 10㎕ 10X 반응완충용액(reaction buffer) [200mM 트리스-에이치씨엘, pH 8.75, 100mM 황산암모늄[(NH4)2SO4], 100mM 염화칼륨(KCl), 20mM 염화마그네습(MgCl2)], 1% 트리톤(등록상표 Triton) X-100, 1mg/㎖ 우혈청알부민(BSA), 3㎕ 프라이머1(10uM), 3㎕ 프라이머2(10uM), 2㎕ 디엔티피(dNTP, 각각 10mM)를 넣고 3차 증류수로 100㎕가 되도록 첨가한 후 실시하였다. 반응 조건은 94℃에서 5분 동안 처리한 다음 95℃ 1분, 58℃ 1분30초, 72℃ 1분30초씩 31회 반응시키고, 72℃ 15분간 더 반응 시켜 중합효소 연쇄반응 산물이 완전한 평활 말단이 되도록 하였다.The polymerase chain reaction was carried out with 1 μl primary cDNA, 2U Pfu DNA polymerase [polymerase (Stratagene, USA)], 10 μl 10X reaction buffer [200 mM Tris-H, CL, pH 8.75, 100 mM ammonium sulfate [(NH4 )2 SO4 ], 100 mM potassium chloride (KCl), 20 mM magnesium chloride (MgCl2 )], 1% Triton® X-100, 1 mg / ml bovine serum albumin (BSA) 3 μl Primer 1 (10 uM), 3 μl Primer 2 (10 uM), 2 μl DENTIPY (dNTP, 10 mM each) were added and added to 100 μl of tertiary distilled water. The reaction conditions were treated at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 31 reactions at 95 ° C. for 1 minute, 58 ° C. for 1 minute 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute 30 seconds, and further at 72 ° C. for 15 minutes to completely smooth the polymerase chain reaction product. To be terminal.
연쇄체 형태의 CD2-CD2/Fc 및 CTLA4-CTLA4/Fc 융합 유전자는 다음과 같이 제조하였다.CD2-CD2 / Fc and CTLA4-CTLA4 / Fc fusion genes in the concatemer form were prepared as follows.
CD2 및 CTLA4의 세포외역 가용성 부위가 연쇄체(concatamer)의 형태를 갖는 융합 유전자를 만들기 위해, CD2 및 CTLA4 세포외역 가용성 부위의 서열을 상술한 제한효소 PstI과 티포 디엔에이 폴리머레이즈(T4 DNA polymerase)를 이용하여 평활말단을 갖도록 한 단순 이량체 형태의 융합 유전자에서 세포외역과 면역글로블린의 결합 분위에 라이게이즈를 이용하여 평활 말단 접합(blunt end ligation)시키므로써 삽입하였다. 구체적으로, CD2 및 CTLA4 세포외역 가용성부위의 리더 서열이 종료되는 부위[CD2(서열번호: 14의 펩타이드 25), CTLA4(서열번호: 16의 펩타이드 22)]를 코딩하는 코딩서열[CD2(서열번호: 13의 뉴클레오타이드), CTLA4(서열번호: 15의 뉴클레오타이드)]을 갖는 한 프라이머[CD2(서열번호: 45의 뉴클레오타이드), CTLA4(서열번호: 47의 뉴클레오타이드)]와 상기 세포외역 가용성 부위의 3' 말단 서열을 코딩하는 안티센스 서열[CD2(서열번호: 13의 뉴클레오타이드), CTLA4(서열번호: 15의 뉴클레오타이드)]을 갖는 다른 프라이머[CD2(서열번호: 46), CTLA4(서열번호: 48)]를 사용하여 중합효소 연쇄반응으로 생성시켰다. 이 반응은 상기한 단순 이량체 융합 유전자[CD2/Fc(서열번호: 13의 뉴클레오타이드), CTLA4/Fc(서열번호: 15의 뉴클레오타이드)]를 주형으로 사용하였다.In order to make a fusion gene in which the extracellular soluble sites of CD2 and CTLA4 have the form of concatamers, the restriction enzymes PstI and T4 DNA polymerase, which specify the sequence of the CD2 and CTLA4 extracellular soluble sites, are described. In the simple dimeric form of the fusion gene having a blunt end, the blunt end ligation was inserted into the binding region between the extracellular domain and the immunoglobulin using a ligase. Specifically, the coding sequence encoding the site [CD2 (peptide 25 of SEQ ID NO: 14), CTLA4 (peptide 22 of SEQ ID NO: 16)] where the leader sequence of the CD2 and CTLA4 extracellular soluble region ends : 13 nucleotides), one primer [CT2 (SEQ ID NO: 45 nucleotide)], CTLA4 (SEQ ID NO: 15 nucleotide)] and 3 'of the extracellular soluble site Another primer [CD2 (SEQ ID NO: 46), CTLA4 (SEQ ID NO: 48)] having an antisense sequence (CD2 (nucleotide of SEQ ID NO: 13), CTLA4 (nucleotide of SEQ ID NO: 15)) encoding a terminal sequence Using the polymerase chain reaction. This reaction used the above simple dimer fusion gene (CD2 / Fc (nucleotide of SEQ ID NO: 13), CTLA4 / Fc (nucleotide of SEQ ID NO: 15)) as a template.
또한, 피블루스크립트 케이에스투 플러스[pBluescript KS Ⅱ(+)]에 삽입된 단순 이량체 형태의 CD2/Fc 및 CTLA4/Fc를 제한효소 PstI으로 소화시켜 3' 말단이 돌출된 형태(3' overhang)의 절단면을 생성하도록 하였다. 절단면의 3' 돌출 말단을 티포 디엔에이 폴리머레이즈(T4 DNA polymerase)을 처리하여 부분적으로 제거 (partial deletion)시켜 평활 말단이 되도록 하였다. 세포외역 가용성 부위가 연쇄체(concatamer)의 형태를 갖는 융합 유전자를 만들기 위해, 상기한 중합효소 연쇄반응으로 제작한 CD2 및 CTLA4 세포외역 가용성 부위를 평활 말단으로 제작된 단순 이량체 유전자의 절단면에 라이게이즈를 이용하여 평활 말단 접합(blunt end ligation)시키므로써 삽입하여 클로닝하였다. 이때 생성된 융합 단백질은 연쇄 융합된 단량체 단백질로서 각각 CD2-CD2/Fc와 CTLA4-CTLA4/Fc라 명명하였고, 이들의 추정 아미노산 서열은 각각 서열번호: 18 및 20에 해당한다.In addition, the 3 'end protrudes (3' overhang) by digesting the simple dimer form CD2 / Fc and CTLA4 / Fc inserted into pBluescript KS II (+) with restriction enzyme PstI. To produce a cut surface. The 3 ′ overhanging end of the cut section was treated with T4 DNA polymerase to partially remove the fragment to form a smooth end. In order to make a fusion gene in which the extracellular soluble site has the form of a concatamer, the CD2 and CTLA4 extracellular soluble sites prepared by the above-described polymerase chain reaction are shown on the cleavage plane of the simple dimer gene produced at the blunt ends. Inserts were cloned by blunt end ligation using this. The resulting fusion proteins were chain fused monomeric proteins named CD2-CD2 / Fc and CTLA4-CTLA4 / Fc, respectively, and their putative amino acid sequences correspond to SEQ ID NOs: 18 and 20, respectively.
다당화(multiglycosylation) 형태의 연쇄체 융합 유전자는 다음과 같이 제작하였다.Multiglycosylation forms of the chain fusion gene were constructed as follows.
당화 모티브 펩타이드 서열은 제한효소 EcoRI과 세포외역 가용성부위의 리더 시퀀스를 포함한 한 프라이머와 연쇄체 형태의 융합 유전자의 첫 번째 세포외역 가용성부위의 3' 말단의 일부를 코딩하는 염기서열과 두 번째 세포외역 가용성부위의 5' 말단의 일부를 코딩하는 염기서열을 가지고 당화 모티브로 치환된 염기서열을 가진 안티센스 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 제작한 DNA 단편과, 연쇄체 형태의 융합 유전자의 첫 번째 세포외역 가용성부위의 3' 말단의 일부를 코딩하는 염기서열과 두 번째 세포외역 가용성부위의 5' 말단의 일부를 코딩하는 염기서열을 가지고 당화 모티브로 치환된 염기서열을 가진 한 프라이머와 면역글로블린 G1의 Fc 부위의 3' 말단과 제한효소 XbaI를 코딩하는 안티센스 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응으로 제작된 DNA 단편을 한 시험관에 동시에 넣고 2차 중합효소 연쇄반응을 수행하므로써 삽입하였다.The glycosylation motif peptide sequence includes a base sequence encoding a portion of the 3 'end of the first extracellular soluble region of a primer and a concatemer-type fusion gene including the restriction enzyme EcoRI and a leader sequence of the extracellular soluble region and a second extracellular region. DNA fragments produced by polymerase chain reaction using an antisense primer having a nucleotide sequence encoding a portion of the 5 'end of the soluble region and a nucleotide sequence substituted with a glycosylation motif, and the first of a fusion gene in a chain form One primer and an immunoglobulin G1 having a nucleotide sequence encoding a portion of the 3 'end of the extracellular soluble region and a nucleotide sequence encoding a portion of the 5' terminal of the second extracellular soluble region and a nucleotide sequence substituted with a glycosylation motif. Polymerase chain using 3 'terminus of Fc region and antisense primer encoding restriction enzyme XbaI Into a DNA fragment produced in the same time in one test tube was inserted By performing a second polymerase chain reaction.
CD2/Fc 및 CTLA4/Fc 연쇄체 융합 유전자의 경우도 상기한 TNFR/Fc의 방법과 동일한 방법으로 변형된 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄반응을 이용하여 당화 모티브 펩타이드를 삽입시켰으며 TNFR/Fc의 경우와는 다르게 CD2 및 CTLA4 세포외역 가용성부위 결합되는 펩타이드 서열은 그대로 유지하였다.In the case of the CD2 / Fc and CTLA4 / Fc chain fusion genes, the glycosylation motif peptide was inserted using a polymerase chain reaction using a modified primer in the same manner as the TNFR / Fc method described above. In contrast, the peptide sequences bound to the CD2 and CTLA4 extracellular soluble sites were maintained.
CD2/Fc 및 CTLA4/Fc 연쇄체 융합 단백질의 다당화 과정은 CD2/Fc의 경우 서열번호:17의 598-600(CCT, Pro) 및 616-618(GAG, Glu)에 해당하는 뉴클레오티드를 AAT(Asn, N)로 대치한 염기서열을 포함하도록 제작한 프라이머(서열번호:49 및 50의 뉴클레오티드)를 이용하여 총 2개의 당화 모티브 펩타이드 부위(서열번호:200-202, 206-208의 펩타이드)를 삽입하여 완성하였고, CTLA4/Fc의 경우는 서열번호:19의 403-405(GTA, Val), 424-426(CCA, Pro)에 해당하는 뉴클레오티드를 AAT(Asn, N)로, 서열번호:19의 409-411(GAT, Asp), 445-407(GTG, Val)에 해당하는 뉴클레오티드를 각각 ACA(Thr, T) 및 ACG(Thr, T)로 대치한 염기서열을 포함하도록 제작한 프라이머(서열번호:51및 52의 뉴클레오티드)를 이용하여 총 3개의 당화 모티브 펩타이드 부위(서열번호:24 136-138, 142-144, 147-149의 펩타이드)를 삽입하여 완성하였다. 이때 생성된 융합 단백질은 연쇄 융합된 단량체 단백질로서 각각 mgCD2-CD2/Fc 및 mgCTLA4-CTLA4/Fc라 명명하고 이들의 추정 아미노산 서열은 각각 서열번호 22 및 24에 해당한다.The polyglycosylation of CD2 / Fc and CTLA4 / Fc concatemer fusion proteins was performed using AAT (nucleotides corresponding to 598-600 (CCT, Pro) and 616-618 (GAG, Glu) of SEQ ID NO: 17 for CD2 / Fc. A total of two glycosylated motif peptide sites (SEQ ID NOs: 200-202, 206-208 peptides) were prepared using primers (SEQ ID NOs: 49 and 50 nucleotides) prepared to include nucleotide sequences substituted with Asn, N). In the case of CTLA4 / Fc, nucleotides corresponding to 403-405 (GTA, Val) and 424-426 (CCA, Pro) of SEQ ID NO: 19 were converted to AAT (Asn, N), and SEQ ID NO: 19. Primers prepared to include nucleotides corresponding to 409-411 (GAT, Asp) and 445-407 (GTG, Val) of ACA (Thr, T) and ACG (Thr, T), respectively. No. 51 and 52 nucleotides) were used to insert a total of three glycosylated motif peptide sites (SEQ ID NOs: 24 136-138, 142-144, 147-149). The resulting fusion proteins are chain fused monomeric proteins, named mgCD2-CD2 / Fc and mgCTLA4-CTLA4 / Fc, respectively, and their putative amino acid sequences correspond to SEQ ID NOs: 22 and 24, respectively.
실시예 4Example 4
단순/연쇄 융합된 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질의 발현 및 정제Expression and Purification of Simple / Chain-fused Dimeric TNFR / Fc Fusion Proteins
챠이니즈 햄스터 난소 세포주 케이원(CHO-K1, ATCC CCL-61, Ovary, Chinese hamster, Cricetulus griseus)에서 융합 단백질을 발현시키기 위하여, TNFR/Fc 융합 유전자를 포함한 블루스크립트 케이에스투 플러스 플라스미드 DNA를 형질 전환된 대장균에서 추출한 후, 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 소화시켜 얻은 TNFR/Fc 단편을 동물세포 발현 벡터인 피씨알쓰리(pCR™3, Invitrogen, USA) 플라스미드의 EcoRI/ XbaI 부위에 삽입하여, 발현 벡터를 제조한 후 이를 각각 플라스미드 pTR11-Top10' 및 플라스미드 pTR22-Top10'로 명명하고, 2001년 7월 10일자로 한국미생물 보존센터(KCCM)에 각각 KCCM 10288, 및 KCCM 10291의 수탁번호로 기탁하였다.To express the fusion protein in the Chinese hamster ovary cell line K1 (CHO-K1, ATCC CCL-61, Ovary, Chinese hamster, Cricetulus griseus), the BlueScript KS2 Plus plasmid DNA containing the TNFR / Fc fusion gene was transformed. After extracting from E. coli, TNFR / Fc fragment obtained by digestion with restriction enzymes EcoRI and XbaI was inserted into the EcoRI / XbaI site of the animal cell expression vector plasmid (pCR ™ 3, Invitrogen, USA) plasmid to prepare an expression vector. The plasmids were named plasmids pTR11-Top10 'and plasmid pTR22-Top10', respectively, and were deposited with the accession numbers of KCCM 10288 and KCCM 10291 to the Korea Microorganism Conservation Center (KCCM) on July 10, 2001.
형질 감염은 상기 TNFR/Fc 융합 유전자를 포함한 플라스미드 pTR11-Top10' 및 플라스미드 pTR22-ToP10' DNA 중 어느 하나를 지브코 비알엘(Gibco BRL, USA)사의 리포펙타민(Lipofectamine™) 시약과 혼합함으로써 수행하였다. 1∼3 × 105cells/well의 농도의 챠이니즈 햄스터 난소 세포주 케이원(CHO-K1) 세포를 6구 조직 배양판 (six-well tissue culture plate, Nunc, USA)에 접종하고 10% 우태아혈청(FBS)을 함유한 디엠이엠(DMEM) 배지에서 세포가 50 ∼ 80%가 되도록 배양한 후, 혈청이 없는 디엠이엠(DMEM) 배지에서 상기 TNFR/Fc 융합 유전자를 포함한 플라스미드 pTR11-Top10' 및 플라스미드 pTR22-Top10' DNA 중 어느 하나를 1∼ 2㎍ 취하고, 리포펙타민(Gibco BRL, USA)을 2∼25㎕ 취하여 상온에서 15~45분간 반응시킨 DNA-리포좀 혼합체(Liposome complex)를 세포 배양판에 첨가시켰다. 5시간동안 배양한 후 혈청이 20%가 함유된 디엠이엠(DMEM) 배지를 첨가하여 18∼24시간 배양하였다. 최초 형질 감염 후에 세포를 1.5 mg/㎖의 제네티신(Geneticin, G418, Gibco BRL, USA)이 첨가된 10% 우태아혈청 디엠이엠(DMEM) 배지에서 3주간 배양하고, 형성된 집락을 분리하여 증폭 배양하였다. 융합 유전자의 발현 여부는 퍼옥시데이즈가 표지된 염소 항 인간 면역 글로블린(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)을 사용한 효소 면역 검사법(ELISA)을 통해 검사하였다.Transfection was performed by mixing any one of the plasmid pTR11-Top10 'and plasmid pTR22-ToP10' DNAs containing the TNFR / Fc fusion gene with Lipofectamine ™ reagent from Gibco BRL, USA. It was. CHO-K1 cells inoculated in 6-well tissue culture plates (Nunc, USA) at concentrations of 1 to 3 × 105 cells / well were inoculated into 10% fetal bovine serum. After culturing to 50-80% of the cells in DMEM medium containing (FBS), plasmid pTR11-Top10 'and plasmid containing the TNFR / Fc fusion gene in DMEM medium without serum A cell culture plate of a DNA-liposome complex in which 1-2 µg of any one of pTR22-Top10 'DNA was taken and 2-25 µl of lipofectamine (Gibco BRL, USA) was reacted at room temperature for 15 to 45 minutes. Was added. After incubation for 5 hours, the medium was incubated for 18 to 24 hours with the addition of DMEM medium containing 20% serum. After the initial transfection, cells were incubated for 3 weeks in 10% fetal bovine serum DMM (DMEM) medium with 1.5 mg / ml of Geneticin (G418, Gibco BRL, USA) and the colonies formed were isolated and amplified. Incubated. The expression of the fusion gene was examined by enzyme immunoassay (ELISA) using Peroxidase labeled goat anti-human IgG (KPL, USA).
효소 면역 검사법(ELISA)은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 먼저, 1mg/㎖ 염소 항 인간 면역 글로블린(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)를 0.1M 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)에 1:2000으로 희석한 후, 96구 효소 면역 검사판(96-well flexible plate, Falcon, USA)에 100㎕씩 분주하고 랩으로 봉한 후 4℃에서 16시간 이상 방치하여 항체가 검사판 표면에 코팅되게 하였다. 이를 세척완충용액(washing buffer) [0.1% 트윈-20(Tween-20) 함유 , 1X 인산완충 생리식염수(PBS, Phosphate buffered saline)]로 3회 세척한 후 희석용액[diluent buffer(1X 인산완충 생리식염수 48.5㎖, 우태아 혈청 1.5㎖, 트윈-20 50㎕]를 180㎕씩 분주하였다. 첫 구(well)에 배양한 상층액 20㎕를 넣은 후 마이크로 피펫 (micropipette)을 이용하여 연속적으로 희석하였고, 양성 대조군으로 0.01㎍/㎕ 인간 면역 글로블린(human IgG, Sigma, USA)를, 음성 대조군으로 형질감염되지 않은 챠이니즈 햄스터의 난소 케이원(CHO-K1) 세포의 배양액을 사용하여 동일하게 희석하였다. 희석이 끝난 96구 효소 면역 검사판(Falcon, USA)를 호일로 싸서 37℃에서 1시간 30분간 반응시킨 후, 세척용액으로 3회 세척하였다. 퍼옥시데이즈가 표지된 염소 항 인간 면역 글로블린(Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA)를 희석용액으로 1:5000 희석한 다음 이를 100㎕씩 분주하고 호일로 싼 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 세척용액으로 3회 세척한 후 티엠비 퍼옥시데이즈 시스템(TMB microwell peroxidase substrate system, KPL, USA)을 이용하여 발색시키고, 흡광기(microplate reader, Bio-RAD, Model 550, Japan)로 파장 630nm에 대한 흡광도를 측정하여 발현 여부를 확인하였다.Enzyme immunoassay (ELISA) was performed by the following method. First, dilute 1 mg / mL goat anti-human immunoglobulin (Peroxidase labeled goat anti-human IgG, KPL, USA) at 1: 2000 in 0.1 M sodium bicarbonate, and then use a 96-neck enzyme immunoassay plate (96- Well flexible plate, Falcon, USA) was dispensed 100 μl each and sealed with a wrap and left at 4 ° C. for at least 16 hours to allow the antibody to be coated on the test plate surface. This was washed three times with a washing buffer [0.1% Tween-20, containing 1X Phosphate buffered saline (PBS), and then diluted with diluent buffer (1X Phosphate buffered saline). 48.5 mL of saline solution, 1.5 mL of fetal bovine serum, and 50 μl of Tween-20] were dispensed by 180 μL, and 20 μl of the supernatant cultured in the first well, followed by serial dilution using a micropipette. 0.01 μg / μl human immunoglobulin (human IgG, Sigma, USA) as a positive control was diluted in the same manner using a culture of ovarian K1 (CHO-K1) cells of Chinese hamsters not transfected with the negative control. The diluted 96-neck enzyme immunoassay plate (Falcon, USA) was wrapped in foil and allowed to react for 1 hour and 30 minutes at 37 ° C., followed by three washes with a washing solution Peroxidase-labeled goat anti human immunoglobulin (Peroxidase). dilute labeled goat anti-human IgG (KPL, USA) After diluting with 1: 5000, the solution was dispensed with 100 μl, wrapped in foil, and reacted for 1 hour at 37 ° C. After the reaction, the solution was washed three times with a washing solution, followed by a TMB microwell peroxidase substrate system. , KPL, USA), and the absorbance (microplate reader, Bio-RAD, Model 550, Japan) was measured by measuring the absorbance of the wavelength 630nm to confirm the expression.
이렇게 제조된 형질전환체(transfectant)를 각각 TR11Ig-CHO 및 TR22Ig-CHO로 명명하고, 2001년 7월 7일자로 한국세포주 연구재단 (KCLRF)에 각각 KCLRF-BP-00046 및 KCLRF-BP-00047의 수탁번호로 기탁하였으며, 상기 형질전환체가 생성한 융합 단백질을 정제할 목적으로 무혈청배지(serum free media) 중 CHO-S-SFM Ⅱ(Gibco BRL, USA)에 적응시키기 위하여 다음의 과정으로 진행하였다. 약 3×105개의 세포를 6구판(6-well plate)에 접종한 후 16시간동안 5% CO237℃ 배양기에서 배양하여 정착시킨후 현미경 하에서 약 30∼50%의 면적에 cell이 부착된 것을 확인하고 10% 우태아 혈청 함유 DMEM와 CHO-S-SFM Ⅱ의 비율을 8:2가 되도록 배지를 교체하여 배양하였다. 이 비율로 3회 계대 배양한 후, 각각 6:4의 비율로 3회, 4:6의 비율로 3회, 3:7의 비율로 3회, 2:8의 비율로 3회, 및 1:9의 비율로 3회 계대 배양한 후 최종적으로 100% CHO-S-SFM Ⅱ 배지에서 계대 배양하여, 이의 발현량을 효소 면역 검사법을 이용하여 측정하였다.The transfectants thus prepared were named TR11Ig-CHO and TR22Ig-CHO, respectively, and as of July 7, 2001, KCLRF-KCLRF-BP-00046 and KCLRF-BP-00047 were respectively identified. Deposited by accession number, the following procedure was carried out to adapt to CHO-S-SFM II (Gibco BRL, USA) in serum-free media for the purpose of purifying the fusion protein produced by the transformant. . After inoculating about 3 × 105 cells in a 6-well plate and incubating in a 5% CO2 37 ° C. incubator for 16 hours, the cells were attached to an area of about 30-50% under a microscope. After confirming that the ratio of DMEM and CHO-S-SFM II containing 10% fetal bovine serum was cultured by changing the medium to 8: 2. After three passages at this ratio, three times at a ratio of 6: 4, three times at a ratio of 4: 6, three times at a ratio of 3: 7, three times at a ratio of 2: 8, and 1: Subcultured three times at a rate of 9 and finally passaged in 100% CHO-S-SFM II medium, its expression was measured using an enzyme immunoassay.
이 세포들을 우혈청배지가 없는 CHO-S-SFM Ⅱ(Gibco BRL, USA) 배지에서 대량 배양후 각각의 융합 단백질을 함유한 배양액을 200×g, 12분간 원심분리하여 세포 찌꺼기들을 완전히 제거하고 프로테인 에이 컬럼(HiTrap protein A column, Amersham, USA)을 이용한 다음의 방법으로 순수 분리하였다. 20mM 인산화 나트륨 (Sodium phosphate, pH 7.0, sigma, USA)을 1㎖/min의 속도로 2분간 통과시킨 후, 10㎖ 배양액을 동일한 속도로 컬럼을 통과시켜 프로테인 에이에 융합 단백질이 결합하도록 하였다. 20mM 인산화 나트륨(pH 7.0)을 2분간 동일 속도로 통과시켜 세척한 후, 0.1M 시트르산(C6H8O7. H2O. citric acid, pH 3.0, sigma, USA)을 3분간 동일속도로 통과시키면서 500㎕씩 1.5㎖ 튜브에 순차적으로 추출물을 분주하였다. 이를 1M 트리스(Tris, pH 11.0, USB, Sigma)를 이용하여 PH 7.0으로 적정하였으며 각 튜브의 융합 단백질의 존재 유무는 상기에 기술한 효소면역 검사법(ELISA)을 통하여 확인하였다. 순수 분리한 융합 단백질은 센트리콘 30(Centricon 30, Amicon, USA)을 사용하여 4℃에서 2000×g, 30분간 원심분리하여 농축하였다.After culturing these cells in CHO-S-SFM II (Gibco BRL, USA) medium without bovine serum medium, the culture medium containing each fusion protein was centrifuged at 200 × g for 12 minutes to completely remove cell debris and protein. Pure water was separated by the following method using HiTrap protein A column, Amersham, USA. After passing 20 mM sodium phosphate (Sodium phosphate, pH 7.0, sigma, USA) for 2 minutes at a rate of 1ml / min, 10ml culture was passed through the column at the same rate to allow the protein to bind to protein A. After washing by passing 20 mM sodium phosphate (pH 7.0) at the same rate for 2 minutes, 0.1M citric acid (C6 H8 O7 .H2 O. citric acid, pH 3.0, sigma, USA) was washed at the same rate for 3 minutes. The extracts were sequentially dispensed into 1.5 ml tubes at 500 μl while passing through. This was titrated to pH 7.0 using 1M Tris (Tris, pH 11.0, USB, Sigma) and the presence of fusion protein in each tube was confirmed by the enzyme immunoassay (ELISA) described above. Purely isolated fusion protein was concentrated using centricon 30 (Centricon 30, Amicon, USA) by centrifugation at 2000 × g, 30 minutes at 4 ℃.
실시예 5Example 5
정제된 TNFR1-TNFR1/Fc 및 TNFR2-TNFR2/Fc의 SDS-PAGE(도 15)SDS-PAGE of purified TNFR1-TNFR1 / Fc and TNFR2-TNFR2 / Fc (FIG. 15)
프로테인 A 컬럼을 이용하여 순수 정제된 단백질을 환원제(디설파이드 결합파괴)인 DTT를 첨가한 환원 조건과 DTT가 포함되지 않은 비환원 조건으로 SDS-PAGE를 수행하였다. 각각의 SDS-PAGE상에서의 분자량 측정 결과는 다음의 표와 같다.SDS-PAGE was carried out using a Protein A column under reduced conditions with the addition of DTT as a reducing agent (disulfide bond breakdown) and non-reducing conditions without DTT. Molecular weight measurement results on each SDS-PAGE are shown in the following table.
TNFR/Fc 단백질은 세포내에서 이량체로 존재함을 확인할 수 있었다. TNFR1-TNFR1-Ig의 아미노산 서열로 추정한 분자량은 약 70 kDa, SDS-PAGE 상에서 약 102 kDa으로 추정된다. 이 차이는 당단백질의 전기영동 상에서 나타나는 일반적인 현상으로 당화된 부분에 의해 전기영동상에서의 이동속도가 늦어지므로 일어나는 특징이다.표 10. TNFR-TNFR/Fc의 SDS-PAGE상에서의 분자량TNFR / Fc protein was confirmed to exist as a dimer in the cell. The molecular weight estimated by amino acid sequence of TNFR1-TNFR1-Ig is estimated to be about 70 kDa, about 102 kDa on SDS-PAGE. This difference is a common phenomenon in the electrophoresis of glycoproteins and is characterized by the slowing of the movement speed in the electrophoretic phase due to the glycosylated portion.
실시예 6Example 6
단순/연쇄 융합된 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질의 TNF 알파(α)와 TNF (β)의 세포 독성 중화 효과 실험Cytotoxic neutralization effects of TNF alpha (α ) and TNF (β ) of simple / chain fused dimer TNFR / Fc fusion proteins
TNFR/Fc 융합 단백질의 TNF 알파(α)와 TNF 베타(β)에 유도되는 세포독성을 억제하는 효과를 검사하기 위하여 L929 세포[ATCC, Mus musculus (mouse), NCTC clone 929(derivative of Strain L; L-929;L cell)]를 이용하였다. 이 분석은 TNF에 의해 유도되는 세포독성을 억제하는 TNFR의 활성[스칼론(Scallon BJ) 등, Cytokine 7:759, 1995)]에 기초를 두고 있다.To examine the effects of TNFR / Fc fusion protein on inhibiting cytotoxicity induced by TNF alpha (α ) and TNF beta (β ), L929 cells [ATCC, Mus musculus (mouse), NCTC clone 929 (derivative of Strain L; L-929; L cell)]. This assay is based on the activity of TNFR (Scallon BJ et al., Cytokine 7: 759, 1995) that inhibits cytotoxicity induced by TNF.
L929 세포를 96구 판(96-well plate)에 3×104cells/well이 되게 접종하고, 37℃, CO2배양기에서 24시간 배양한다. 이어서, 엑티노마이신 디(Actinomycin D, Sigma, USA)를 3㎍/㎖이 되게 첨가하고, 100% 세포독성을 나타내는 농도(0.5 ∼ 2 ng/㎖)의 TNF 알파 및 베타(RD, USA)와 10배씩 연속적으로 희석한 TNFR 표본과 함께 16~18시간 배양한다. 이어서 96구 판에 있는 세포를 염색시약인 크리스탈 바이올렛(crystal violet, Wako pure chemical industries, Japan)으로 염색하고 세포 활성도는 흡광도 595 nm에서 흡광기(spectrophotometer, Bio-RAD, Model-550, Japan)를 이용하여 측정하였다.L929 cells are seeded in 96-well plates at 3 × 104 cells / well and incubated for 24 hours in a 37 ° C., CO2 incubator. Subsequently, Actinomycin D (Sigma, USA) was added to 3 µg / ml, and TNF alpha and beta (RD, USA) at concentrations (0.5-2 ng / ml) showing 100% cytotoxicity. Incubate for 16-18 hours with 10-fold serially diluted TNFR samples. Subsequently, cells in 96-well plates were stained with crystal violet (Wako pure chemical industries, Japan) staining reagent, and cell activity was measured by absorbance (spectrophotometer, Bio-RAD, Model-550, Japan) at 595 nm. It measured using.
하기의 표 11은 각 TNFR/Fc 융합 단백질의 억제농도 중간값(IC50)으로서, 단순 이량체 형태의 융합 단백질 (TNFR1-Ig, TNFR2-Ig)보다 연쇄체 형태의 융합 단백질(TNFR1-TNFR1-Ig, TNFR1-TNFR2-Ig, TNFR2-TNFR1-Ig, TNFR2-TNFR2-Ig)이 두 종류의 TNF에 대한 세포독성을 억제하는 효과가 모두 현저히 높은 것을 알 수 있다. 또한 기존의 단순 이량체 형태와 본 발명의 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질이 TNF 알파(도 16)와 베타(도 17)의 세포독성을 억제하는 효과를 대비하면 본 발명의 연쇄체 형태의 TNFR/Fc 융합 단백질이 TNF 알파와 베타의 세포독성을 현저하게 억제하는 것이 더욱 명백하게 나타난다.Table 11 below shows the median inhibitory concentration (IC50 ) of each TNFR / Fc fusion protein, which is a fusion protein (TNFR1-TNFR1-) rather than a simple dimer form (TNFR1-Ig, TNFR2-Ig). It can be seen that Ig, TNFR1-TNFR2-Ig, TNFR2-TNFR1-Ig, TNFR2-TNFR2-Ig) have significantly higher effects of inhibiting cytotoxicity against both types of TNF. In addition, in contrast to the effect of the conventional simple dimer form and the dimeric TNFR / Fc fusion protein of the concatemer form of the present invention to inhibit the cytotoxicity of TNF alpha (Fig. 16) and beta (Fig. 17), the concatemer of the present invention It is even more apparent that the form of TNFR / Fc fusion protein significantly inhibits the cytotoxicity of TNF alpha and beta.
표 11. 세포독성 억제 중간값(IC50)Table 11. Median Cytotoxicity Inhibition (IC50 )
실시예 7Example 7
단순/연쇄 융합된 이량체 CD2/Fc 융합 단백질과 CTLA4/Fc 융합 단백질의 활성 면역 세포 증식 억제 효과 실험Experimental Effects of Simple / chain-fused Dimer CD2 / Fc Fusion Protein and CTLA4 / Fc Fusion Protein on the Inhibitory Effect of Active Immune Cell Proliferation
발열 환자의 B 림프구에 엡스타인-바 바이러스(Ebstein-Barr virus)를 형질 감염시켜 만든 B 림프구 세포주인 WT100BIS를 T 림프구의 항원제시세포로 사용하기 위하여 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640에 배양하였다. 이를 2,000rpm에서 2분간 침전시킨 후 5.0×105/㎖이 되도록 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640에 다시 푼 다음 3,000 라드(rd)의 감사선(-ray)으로 조사 (irradiation)시켰다.In order to use WT100BIS, a B lymphocyte cell line transfected with Ebstein-Barr virus in B lymphocytes of a fever patient, as an antigen presenting cell of T lymphocytes, 10% fetal bovine serum containing RMPMI 1640 was used. Incubated. The precipitate was precipitated at 2,000 rpm for 2 minutes, and then re-dissolved in 10% fetal bovine serum RPMI 1640 to 5.0 × 105 / ml. -ray) was irradiated.
T 림프구는 건강한 사람의 혈액에서 피콜-하이팩 [Ficoll-hypaque (Amersham, USA)]를 이용하여 분리한 다음 2.0×106/㎖이 되도록 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640으로 배양하였다.T lymphocytes were isolated from the blood of healthy humans using Ficoll-hypaque (Amersham, USA) and incubated with 10% fetal bovine serum containing RPMI 1640 to 2.0 × 106 / ml. .
일차 혼합 림프구 반응 [Primary Mixed Lymphocyte Reaction(MLR)]을 실행하기 위하여 WT100BIS와 T 림프구를 150mm 세포 배양 접시에 각각 15㎖씩 섞고 3일간 배양한 후에 15㎖의 10% 우테아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640을 첨가하여 3일간 더 배양하였다. 총 6일간 배양한 후에 상기의 방법대로 피콜-하이팩 [Ficoll-hypaque (Amersham, USA)]을 이용하여 살아있는 T 림프구를 순수 분리. 분리한 림프구는 45% 우태아 혈청, 45% 알피엠아이(RPMI) 1640, 10% 디엠에스오(DMSO)로 만든 배지를 이용하여 얼린 후 액체질소에 보관하였다.In order to perform the Primary Mixed Lymphocyte Reaction (MLR), 15 ml of WT100BIS and T lymphocytes were mixed in a 150 mm cell culture dish and incubated for 3 days, followed by 15 ml of 10% Utea serum-containing RMPI (RPMI). 1640 was added and incubated for 3 more days. After culturing for 6 days in total, live T lymphocytes were purely separated using Ficoll-hypaque (Amersham, USA) as described above. The isolated lymphocytes were frozen in medium made of 45% fetal calf serum, 45% RMP 1640, 10% DMSO and stored in liquid nitrogen.
일차 혼합 림프구 반응을 시킨 T 림프구를 2차 혼합 림프구 반응을 실시하기 위하여 녹인 후, 알피엠아이(RPMI) 1640 배지를 이용하여 2회 세척하였고 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640에 3.0x105cells/㎖이 되도록 하였다.T lymphocytes subjected to the primary mixed lymphocyte reaction were dissolved to perform the secondary mixed lymphocyte reaction, washed twice with RPMI 1640 medium and 3.0 × 10 in 10% fetal bovine serum containing RMPMI 1640.5 cells / ml were allowed.
항원제시세포로 사용할 WT100BIS는 새로 배양하여 상기의 방법대로 배양한 후 3,000 라드(rd)의 감사선(-ray)으로 조사(irradiation)시켜 준비하고 7.5× 104Cells/㎖이 되도록 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640에 준비하였다. 준비된 WT100BIS를 100㎕씩 96구 평판 세포 배양판에 넣고 CD2/Fc 및 CTLA4/Fc 융합 단백질을 최종 농도 10, 1, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4㎍/㎖ 되도록 혼합한 후 상기의 일차 혼합 림프구 반응을 시킨 T 림프구를 100㎍씩 첨가하였다. 이를 5% CO237℃ 배양기에서 2일간 배양한 후, 10% 우태아 혈청 함유 알피엠아이(RPMI) 1640를 100㎕ 첨가하고 2일간 더 배양하였다. 총 4일간의 배양 중 마지막 6시간은3H-타이미딘[thymidine (Amersham)]을 1.2μCi/㎖가 되도록 첨가하여 배양하였다.WT100BIS to be used as antigen presenting cells was newly cultured and cultured according to the above method. -ray) and prepared in 10% fetal bovine serum RMPI (RPMI) 1640 to 7.5 × 104 Cells / ㎖. 100 μl of the prepared WT100BIS was added to 96-well plate cell culture plates, and the CD2 / Fc and CTLA4 / Fc fusion proteins were mixed at a final concentration of 10, 1, 10-1 , 10-2 , 10-3 , 10-4 μg / ml Then, 100 μg of T lymphocytes subjected to the primary mixed lymphocyte reaction were added. After incubation for 2 days in a 5% CO2 37 ℃ incubator, 100 μl of 10% fetal bovine serum RMP 1640 was added and further incubated for 2 days. The last 6 hours of the total 4 days of incubation were incubated with3 H-thymidine (Amersham) added to 1.2μ Ci / ml.
배양이 종료된 후 96구 세포 배양판을 4℃, 110×g, 10분간 원심 분리하여 T-림프구를 침전시켜 상층액을 제거하였고, 200㎕ 1X 인산완충용액으로 세척하였다. 동일한 조건으로 원심 분리한 후 인산완충용액을 제거하고, 남아있는3H-타이미딘 [thymidine (Amersham)]을 제거하기 위해 차가운 200㎕ 10% 티씨에이 [trichloridic acid(TCA, Merck)]를 첨가하고 2분간 흔들어 준 후 5분간 4℃에서 반응시켰다.After incubation, 96-cell cell culture plate was centrifuged at 4 ° C., 110 × g, for 10 minutes to precipitate T-lymphocytes to remove supernatant, and washed with 200 μl 1 × phosphate buffer solution. After centrifugation under the same conditions, the phosphate buffer solution was removed and cold 200 µl 10% trichloridic acid (TCA, Merck) was added to remove the remaining3 H-thymidine (Amersham). After shaking for 2 minutes and reacted at 4 ℃ for 5 minutes.
위와 동일한 조건에서 원심 분리한 후 상층액을 제거하였으며 차가운 200㎕ 70% 에탄올을 첨가한 후 4℃에서 5분간 방치하여 T 림프구를 고정하였다. 원심 분리한 후 상층액을 제거하였고, 상기의 방법과 동일한 조건으로 10% 티씨에이(TCA)를 처리하여 남아있는3H-타이미딘 [thymidine (Amersham)]를 완전히 제거하였다.After centrifugation under the same conditions as above, the supernatant was removed, and 200 μl of cold 200 μl was added, followed by standing at 4 ° C. for 5 minutes to fix T lymphocytes. The supernatant was removed after centrifugation, and the remaining3 H-thymidine (Amersham) was completely removed by treatment with 10% TCA under the same conditions as described above.
여기에 100㎕ 2% 에스디에스 [SDS(pH 8.0)]/0.5N 수산화나트륨(NaOH)을 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시켜 세포 용해를 실시하였고, 25℃ 110×g 10분간 원심 분리하여 T 림프구를 침전시키고 상층액 중 50㎕를 96구 샘플판(Wallac)으로 옮겼다. 상층액에 1.5배의 옵티페이스 슈퍼믹스 [OptiPhase SuperMix(Wallac)]를 넣어 5분간 흔들어 준 후 액체 흡광기 [1450 MicroBeta TriLux microplate liquid scintillation and luminescence counter(Wallac)]를 이용하여3H에 대한 cpm값을 측정하여 T 림프구의 증식여부를 확인하였다. 도 18 및 도 19에서와 같이 연쇄 융합된 이량체 CD2/Fc 및 CTLA4/Fc가 단순 융합된 이량체에 비해 탁월하게 활성 면역세포 증식을 억제함을 알 수 있었다.100 μl 2% SD [SDS (pH 8.0)] / 0.5N sodium hydroxide (NaOH) was added thereto and reacted at 37 ° C. for 30 minutes to carry out cell lysis, and centrifuged at 25 ° C. 110 × g for 10 minutes. Lymphocytes were precipitated and 50 μl in supernatant was transferred to a 96-neck sample plate (Wallac). Add 1.5 times the OptiPhase SuperMix (Wallac) to the supernatant and shake for 5 minutes, then cpm for3 H using a liquid absorber [1450 MicroBeta TriLux microplate liquid scintillation and luminescence counter (Wallac)]. The proliferation of T lymphocytes was confirmed by measuring. As shown in FIGS. 18 and 19, it was found that the chain-fused dimers CD2 / Fc and CTLA4 / Fc inhibited the proliferation of active immune cells superiorly compared to the simple-fused dimers.
실시예 8Example 8
당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질의 마우스 혈중 농도 반감기 증가 효과 실험Experimental Effects of Glycosylated Serially Conjugated Dimer Proteins on Mouse Blood Concentration Half-Life
당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 [mgTNFR1-TNFR1/Fc]2, [mgTNFR2-TNFR2/Fc]2, [mgCD2-CD2/Fc]2및 [mgCTLA4-CTLA4/Fc]2의 혈중 반감기 측정은 마우스 (ICR, 샘타코)의 복강에 정제된 각 융합 단백질 5㎍을 주사한 후 최고 120 시간(5일)동안 일정 간격으로 혈액을 채취한 후 단백질의 농도를 효소면역 검사법(ELISA)을 이용하여 확인하므로 써 수행하였다. 도 20, 21, 22에서와 같이 당화된 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질이 자연 형태의 동일 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질에 비해 혈중 반감기가 증가되었음을 알 수 있었으며 이는 지속적인 효과를 통해 효능증대를 기대할 수 있는 결과라 할 수 있다.Blood half-life measurements of glycosylated serial chain fused dimer proteins [mgTNFR1-TNFR1 / Fc]2 , [mgTNFR2-TNFR2 / Fc]2 , [mgCD2-CD2 / Fc]2 and [mgCTLA4-CTLA4 / Fc]2 were measured in mice. After injecting 5 µg of each purified fusion protein into the abdominal cavity of (ICR, Samtaco), blood was collected at regular intervals for up to 120 hours (5 days), and then the concentration of the protein was confirmed using an enzyme immunoassay (ELISA). So it was done. As shown in FIGS. 20, 21 and 22, the glycosylated serial chain fused dimer protein was found to have an increased half-life in blood compared to the natural form of the same serial chain fused dimer protein, which can be expected to increase efficacy through continuous effects. It is a result.
실시예 9Example 9
DBA/1 생쥐의 콜라겐 유도 관절염에 대한 단순/연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc융합 단백질의 효과 실험Effect of simple / stranded dimer TNFR / Fc fusion protein on collagen-induced arthritis in DBA / 1 mice
아스로젠 씨아이에이 보조제(Arthrogen-CIA ajuvant, Chondrex, USA) 중의 0.05M의 아세트산에 2mg/㎖의 농도로 녹인, 타입 Ⅱ 콜라겐을 DBA/1 생쥐 한 마리당 꼬리에 100 ㎍씩 주입하여 콜라겐 유도 관절염(CIA; Collagen Induced Arthritis)을 발병시켰다. 부스팅(Boosting)은 3주 후에 하였으며 불완전 프로인트보조제(incomplete Freund's adjuvant, Difco, USA)를 이용하였다.Type II collagen, dissolved in 0.05 M acetic acid in Arthrogen-CIA ajuvant (Chondrex, USA) at a concentration of 2 mg / ml, was injected into the tail of each DBA / 1 mouse at 100 µg for collagen-induced arthritis. CIA; Collagen Induced Arthritis. Boosting was done after 3 weeks and incomplete Freund's adjuvant (Difco, USA) was used.
DBA/1 생쥐에 타입 Ⅱ 콜라겐 100㎍으로 면역화시킨 후에 3-4 주 후에 관절염 증상이 나타났다. 증상이 나타난 후 3-5일이 지나면 생쥐의 발이 빨갛게 부어오르며, 염증성 관절염(inflammatory arthritis)은 3-4주 이상 지속되었으며, 염증이 약화되어도 관절은 영구히 경직된다. 관절염 심도의 주관적 척도를 나타내는 표 12에 근거하여 1주일에 2-3회 측정하였다(각 실험군에서 5마리 생쥐에서의 평균값을 구함). 콜라겐 유도 관절염에 대한 단순 및 연쇄체 형태의 이량체의 TNFR/Fc 효과를 측정하기 위하여 생쥐에 TNFR/Fc 또는 인산완충 생리식염수(PBS)를 복강내로 주사하였다. TNFR/Fc는 실험군당 5마리의 생쥐에 제19일 내지 45일동안 2일에 한번씩 10 ㎍을 주사하였다(도 23의 화살표시). 5마리의 대조군 생쥐에는 PBS를 주사하였다. 상기 측정결과를 나타낸 도 7에서와 같이, 기존 단순 이량체 형태의 TNFR/Fc 융합단백질을 주입한 생쥐의 경우 대조군인 인산완충 생리식염수를 주사한 생쥐에서 발병한 관절염 지표의 수치와 비교할 때 약 26∼38% 감소된 효과를 보였으나 (제 45일 측정치를 기준), 연쇄체 형태의 이량체인 [TNFR1-TNFR1/Fc]2, [TNFR2-TNFR2/Fc]2를 주입한 경우는 42~55% 감소된 효과를 나타냈다. 이와 같이 종래의 단순 융합된 이량체 형태의 TNFR/Fc 융합 단백질에 비해 직렬 연쇄 융합된 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질이 생쥐의 관절염을 현저히 감소시키는 것을 알 수 있다.Arthritis symptoms developed 3-4 weeks after immunization with 100 μg of type II collagen in DBA / 1 mice. Three to five days after the onset of symptoms, the mouse's feet swell red, and inflammatory arthritis lasted for more than three to four weeks. Measurements were made 2-3 times a week, based on Table 12, which shows the subjective scale of arthritis depth (average of five mice in each experimental group). Mice were injected intraperitoneally with TNFR / Fc or phosphate buffered saline (PBS) to determine the TNFR / Fc effect of simple and concatemer dimers on collagen induced arthritis. TNFR / Fc was injected into the 5 mice per experimental group 10 μg once every two days for 19 to 45 days (in the arrow of Fig. 23). Five control mice were injected with PBS. As shown in Fig. 7 showing the measurement results, in the case of the mice injected with the conventional simple dimer-type TNFR / Fc fusion protein, compared with the level of arthritis index developed in mice injected with phosphate-buffered saline as a control group Although the effect was reduced by 38% (based on the 45-day measurement), 42-55% were injected with [TNFR1-TNFR1 / Fc]2 and [TNFR2-TNFR2 / Fc]2 , which are dimers in the form of concatemers. It showed a reduced effect. Thus, it can be seen that the serial chain fused dimer TNFR / Fc fusion protein significantly reduces arthritis in mice compared to the conventional simple fused dimer form of TNFR / Fc fusion protein.
표 12. 관절염의 심도스코어Table 12. Depth Scores for Arthritis
*생쥐의 각 다리의 심도스코어를 더하여 계산하며 한 마리당 16이 최고이다.* Depth scores for each leg of the mouse are added and 16 is the best.
상기 결과들은 연쇄체 형태의 이량체 TNFR/Fc 융합 단백질이 생쥐의 CIA의 발병율을 저하시키는데 기존의 단순 이량체 형태의 융합 단백질에 비해 효과적이며, 따라서 관절염 치료에 사용함에 있어서 연쇄체 형태의 단백질제제가 기존의 단백질 제제에 비해 효과적인 치료제로 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.These results suggest that the chain dimer TNFR / Fc fusion protein is more effective in reducing the incidence of CIA in mice compared to the conventional simple dimer form fusion protein, and thus, in the treatment of arthritis Indicates that it can be used as an effective therapeutic agent over conventional protein preparations.
본 발명의 연쇄체 단백질, 직렬 연쇄 융합된 이량체 단백질 및 이의 당화 수식 단백질은 증가된 효능 및 고도의 안정성을 나타내고 고수율로 생성할 수 있다.The chain proteins, serial chain fused dimer proteins and glycosylated proteins thereof of the present invention exhibit increased efficacy and high stability and can be produced in high yields.
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| US6132992A (en)* | 1993-02-01 | 2000-10-17 | Bristol-Myers Squibb Co. | Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell |
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| Publication | Publication Date | Title |
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| JP4288159B2 (en) | Immunoconjugate with serial linkage | |
| Peppel et al. | A tumor necrosis factor (TNF) receptor-IgG heavy chain chimeric protein as a bivalent antagonist of TNF activity. | |
| AU2002313952A1 (en) | Concatameric immunoadhesion | |
| KR100510234B1 (en) | Cytokine that Induces Apoptosis | |
| CA2429027C (en) | Antibodies against human receptor h4-1bb | |
| EP1606318B1 (en) | Improved fc fusion proteins | |
| KR100545720B1 (en) | Glycated immunoglobulins and immunoconjugates comprising them | |
| AU720943B2 (en) | Receptor protein designated 2F1 | |
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| US20220056102A1 (en) | Multi-functional fusion proteins and uses thereof | |
| US20030187224A1 (en) | Chimeric OPG polypeptides | |
| WO1996029348A1 (en) | Monoclonal antibody against human receptor protein 4-1bb and methods of its use for treatment of diseases | |
| WO2022179545A1 (en) | Dual-target star targeting cd19 and cd22 | |
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| US20230340054A1 (en) | Interleukin-2 muteins and uses thereof | |
| KR100418329B1 (en) | Concatameric Immunoadhesin | |
| EP2771356B1 (en) | Chimeric molecule involving oligomerized fasl extracellular domain | |
| RU2815388C2 (en) | Multifunctional fusion proteins and their use | |
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