본 발명은 세포의 특성에 대한 분석장치에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 광원의 파장 분석용 필터박스를 이용하여 세포막 이온 전류, 세포 내부의 이온 변화, 수축 및 세포 주변 온도를 함께 측정하고 분석할 수 있는 세포 분석 장치에 관한 것이다.The present invention relates to an analysis device for the characteristics of the cell, and more particularly, using a filter box for the wavelength analysis of the light source to measure and analyze the cell membrane ion current, ion change inside the cell, contraction and ambient temperature together It relates to a cell analysis device that can be.
세포는 생명개체의 최소 단위이면서 자체의 생명현상 유지를 위하여 세포 외부환경 변화를 감지하고 이에 대응하는 기능이 필요하다.Cells are the smallest unit of living organisms and require the ability to detect and respond to changes in the extracellular environment to maintain their own life.
세포외 환경변화를 감지하기 위해서는 세포막을 통한 신호가 세포 내로 전달되는 기전(起電)이 존재하여야 한다. 대표적인 기전으로는 세포막에 존재하는 이온통로가 있다. 세포막에 존재하는 이온통로를 통하여 이온이 이동하게 되면 세포막전류가 발생하게 되며 이러한 변화는 곧 세포막 전압의 변화를 발생시키게 된다. 인체에서 예를 들어 손에 바늘로 찔렸을 때 아프다고 느끼면서 손을 움직여 바늘로부터 멀어지게 되는데 그 순간에 생체에서 발생하는 생리적인 변화는 먼저 바늘로찔린 부위의 신경에서 세포막 전압이 발생하게 된다.In order to detect changes in the extracellular environment, a mechanism for transmitting signals through the cell membrane to the cell must exist. Representative mechanisms include ion channels present in cell membranes. When the ions move through the ion channel present in the cell membrane, a cell membrane current is generated, and this change causes a change in the cell membrane voltage. In the human body, for example, when a needle is stuck in the hand, it feels painful and moves the hand away from the needle. At that moment, the physiological changes occurring in the living body first generate a cell membrane voltage in the nerve of the needle.
일반적으로 세포 내부의 전압은 -60 mV 정도 형성되지만, 통증에 의한 전압변화가 발생할 때 세포막 전압은 최대 +30 mV까지 변하게 된다. 이렇게 막전압의 변화가 신경세포막을 따라 감각을 담당하는 대뇌부위로 전달되게 되면 아프다고 하는 감각을 인지하게 되는 것이다. 이어 대뇌에서 더 이상의 손상을 막기 위해 손을 움직여 피하라는 신호를 발생시키게 되며, 이 경우도 대뇌 신경의 세포막전압의 변화를 일으키게 된다. 이러한 세포막 전압이 신경을 따라 손을 움직이는 근육에 전달되게 되면 근육수축이 일어나면서 회피반응이 나타나게 되는 것이다.Normally, the voltage inside the cell is about -60 mV, but when the voltage changes due to pain, the membrane voltage changes up to +30 mV. When the change in the membrane voltage is transmitted along the nerve cell membrane to the cerebral region responsible for the sense, the sense of pain is perceived. Subsequently, to prevent further damage in the cerebrum, a signal is generated to move and avoid the hand. In this case, a change in cell membrane voltage of the cerebral nerve is caused. When these membrane voltages are transmitted to the muscles that move the hands along the nerves, muscle contraction occurs and an avoidance reaction occurs.
또 다른 예를 들면 병원에서 실시하는 심전도 검사는 심장근세포 하나 하나에서 발생하는 세포막전압의 변화가 총합적으로 나타나는 현상이다. 이러한 현상은 신경세포 및 근육세포(골격근, 심근 및 평활근)에서 나타난다.In another example, an ECG test performed in a hospital is a phenomenon in which changes in cell membrane voltage occurring in each cardiomyocyte are collectively expressed. This phenomenon occurs in neurons and muscle cells (skeletal muscle, myocardium and smooth muscle).
이와 같이 신호가 전달될 때 세포막전압의 변화가 일차적인 역할을 담당하게 되며, 이러한 세포막 전압발생에는 세포막에 존재하는 이온통로들이 중요한 역할을 담당하게 된다.When the signal is transmitted as described above, the change of the cell membrane voltage plays a primary role, and the ion channel existing in the cell membrane plays an important role in generating the cell membrane voltage.
세포막 이온통로를 통한 전류의 변화를 기록하여 이온통로의 활성을 연구하며, 막전류의 크기는 한 세포막 전체를 통해서 약 nA 수준이고 단일이온통로를 통한 이온전류의 크기는 0.01 - 10 pA 수준이다.The ion channel activity is studied by recording the change of the current through the cell membrane ion channel. The magnitude of the membrane current is about nA through the entire membrane and the magnitude of the ion current through the single ion channel is 0.01-10 pA. .
이렇게 낮은 전류 값으로 나타나기 때문에 증폭정도와 이에 따른 노이즈 발생을 줄여서 전류 크기를 검출할 수 있는 기기를 개발하는 것이 중요하다.Because of this low current value, it is important to develop a device that can detect the magnitude of current by reducing the amplification degree and the noise generation.
1950년대 최초로 세포막전압을 인위적으로 변화시키면서 세포막전류의 변화를 측정하는 막전압 고정장치를 개발하고, 이 장치를 이용한 일련의 연구결과는 노벨생리의학상의 대상이 되었다.For the first time in the 1950s, we developed a membrane-voltage holding device that measures changes in cell membrane currents by artificially changing cell membrane voltages, and a series of studies using this device have been the subject of Nobel Physiological medicine.
이어서, 세포막 단일 이온통로에 대한 연구 기기로서 패치 클램프(patch clamp)가 1979년에 개발되었고, 이 개발자도 역시 노벨생리의학상을 수상하였다.Subsequently, a patch clamp was developed in 1979 as a research instrument for cell membrane single ion channels, which also won the Nobel Prize in Physiology.
최근에는 상기 기기들을 이용하여 여러 종류의 단일 세포에서 세포막을 통한 이온통로들에 대한 연구가 무수히 진행되었고 지금은 거의 모든 실험실에서 보편적으로 사용하는 장비가 되었다.In recent years, numerous studies have been conducted on ion channels through cell membranes in a variety of single cells using the above-mentioned devices, and are now a universal device used in almost all laboratories.
그러나, 연구가 진행되면서 새로운 실험상의 방법이 개발이 필요하게 되었다. 그 이유는 대뇌에서 정보를 받아 해석하고 보관하는 기전을 연구하면서 신경과 신경사이의 신호전달이 어떻게 이루어지는 지에 대한 연구가 필요하게 되었고 이러한 연구를 위해서는 당연히 세포막 이온전류의 변화를 여러 부위에서 동시에 기록하면서 연구할 수 있는 기기 개발이 필요하게 된 것이다.However, as research progressed, new experimental methods needed to be developed. The reason for this is that research on the mechanism of receiving, interpreting, and storing information in the cerebral area requires research on how the signal transmission between nerves and nerves occurs. There is a need to develop a device that can be studied.
한편, 신체의 세포 내부 이온 농도 변화와 세포 기능과의 관계를 연구하는 분야도 있다. 세포 내부 이온 농도 변화에 주목하는 이유는 세포 내부 이온 조성이 세포 외부 이온과 상이하기 때문이다.On the other hand, there is also a field to study the relationship between changes in the body's intracellular ion concentration and cell function. The reason for paying attention to the change in the intracellular ion concentration is that the intracellular ion composition is different from the extracellular ion.
예를 들면, 세포 외부에는 Na이온이 대략 145 mM, Cl이온이 120 mM, Ca이온이 2 mM정도 존재하지만 세포 내부에는 Na이온은 10 mM이하, Cl이온은 20-50 mM, Ca이온은 10-7M로 존재한다.For example, approximately 145 mM of Na ions, 120 mM of Cl ions, and 2 mM of Ca ions are present outside the cells, but within the cells, Na ions are less than 10 mM, Cl ions are 20-50 mM, and Ca ions are 10. Present at-7 M
특히 Ca이온의 경우 세포 외부에 비해서 세포 내부가 약 10000배 이상 낮은농도를 유지하고 있다. 그 이유는 세포 내부의 Ca이온이 조금만 변화해도 세포기능에 막대한 영향을 끼치기 때문이다.In particular, Ca ions maintain a concentration of about 10000 times lower inside cells than outside cells. The reason is that even a slight change in the Ca ions inside the cell has a profound effect on cell function.
실제로 생체에서 Ca이온 농도 변화가 매우 중요한 대표적인 부위가 근육이다. 근육세포 내부의 Ca이온은 정상적으로 100 nM 정도 유지되지만 농도가 조금만 올라가도 세포 내부 Ca이온의 수축단백에 결합되어 수축단백을 활성화시킴으로써 근육세포의 수축을 유발하게 된다.In fact, the most representative site where changes in Ca ion concentration are very important in vivo is muscle. Ca ions inside the muscle cells are normally maintained about 100 nM, but even if the concentration rises slightly, they bind to the contraction proteins of the intracellular Ca ions and activate the contraction proteins, causing the contraction of muscle cells.
심장근도 마찬가지로 매 심장이 뛸 때마다 심장근세포의 변화가 발생된다. 즉, 심장근세포 안의 Ca이온농도가 증가하면 심장근세포의 수축이 일어나고, 세포 내부의 Ca이온농도가 감소하게 되면 이완이 발생하게 된다.Similarly, cardiomyocytes change every time the heart beats. That is, when the Ca ion concentration in the cardiac muscle cells increases, the contraction of the cardiac muscle cells occurs, and when the Ca ion concentration inside the cells decreases, relaxation occurs.
이외에도 세포 내부의 Ca이온농도변화는 사실 우리 몸의 모든 부위 세포에서 중요한 기능을 담당하고 있는 바, 인체 세포 내에서 발생하는 모든 생명현상 기전에 Ca이온이 관여하지 않는 부위가 없을 만큼 중요하다.In addition, the change in the concentration of Ca ions inside the cell is actually important in all the cells of the body of the body, so important that there is no site where Ca ions are not involved in all life phenomena occurring in the human cells.
그러므로 세포 내부의 Ca이온농도변화가 어떤 기전에 의해 발생되며 세포 내부의 Ca이온농도를 어떤 기전에 의해 조절되는 지 밝히는 것이 매우 중요한 연구과제이다.Therefore, it is very important to find out which mechanisms cause changes in Ca ion concentration in cells and how they are regulated in cells.
이러한 연구과제를 해결해 나가는 과정에서 개발된 방법 중에서 최근에는 형광물질을 이용하여 세포 내부의 이온농도변화 측정하는 방법이 많이 사용되고 있다.Recently, a method of measuring ion concentration changes in cells using fluorescent materials has been widely used among methods developed in the process of solving these research tasks.
형광물질을 이용해서 Ca이온변화를 측정하는 원리는 세포 내부에 투입된 형광물질이 Ca이온농도의 변화에 따라 Ca이온과 결합하는 정도를 파악하는 것이다.The principle of measuring changes in Ca ions using fluorescent materials is to determine the degree of binding of fluorescent materials introduced into cells to Ca ions as the Ca ion concentration changes.
즉, Ca이온농도가 증가하여 Ca이온이 형광물질에 결합하게 되면 형광물질의 형광특성이 달라지게 되며, 이러한 형광물질의 형광특성의 변화는 자극 스펙트럼(Excitation spectrum) 또는 발광 스펙트럼(Emission spectrum)으로 변화를 확인할 수 있다.That is, when Ca ion concentration increases and Ca ions bind to the fluorescent material, the fluorescent property of the fluorescent material is changed, and the change of the fluorescent property of the fluorescent material is changed into an excitation spectrum or emission spectrum. You can see the change.
상기와 같은 방법에 사용되는 형광물질들로는 Fura-2, Indo-1, Fluo-3 등 매우 많은 종류의 형광물질이 개발되었다.As the fluorescent materials used in the above method, many kinds of fluorescent materials such as Fura-2, Indo-1, and Fluo-3 have been developed.
Fura-2의 경우는 Ca이 결합하게 되면 도 1에 도시한 바와 같이 자극 스펙트럼이 달라지는 대표적인 형광물질이다.In the case of Fura-2, when Ca is combined, it is a representative fluorescent substance whose stimulation spectrum is changed as shown in FIG. 1.
Indo-1의 경우는 도 2에 도시한 바와 같이 Ca이 결합하게 되는 발광 스펙트럼이 변화하는 대표적인 형광물질이다.Indo-1 is a representative fluorescent material in which the emission spectrum to which Ca binds changes as shown in FIG. 2.
Fluo-3의 경우는 예외적으로 스펙트럼 변화는 발생하지 않고 Ca이온농도가 증가하면 형광 강도가 증가하게 된다. 형광강도를 측정하여 Ca이온농도로 환산하기 위해서는 특정 수식이 필요하다.In the case of Fluo-3, the spectral change does not occur and the fluorescence intensity increases when the Ca ion concentration increases. In order to measure the fluorescence intensity and convert it to Ca ion concentration, a specific equation is required.
특정 수식이 필요한 이유를 정확한 형광강도 측정이 가능한 Fura-2로 예를 들어 설명하면 다음과 같다.The reason why a specific equation is needed is described as an example of Fura-2 capable of accurate fluorescence intensity measurement.
형광물질과 Ca과의 화학식은 다음과 같이 표현할 수 있다.The chemical formula of the fluorescent substance and Ca can be expressed as follows.
(여기서, Df는 자유 상태(Free form)의 형광물질 농도이고, Db는 Ca에 결합되어 있는 형광물질 농도이다.)Where Df is the free form phosphor concentration and Db is the concentration of phosphor bound to Ca.
평형상수를 Kd라고 하면,If equilibrium constant is Kd ,
이 때 Ca·Db는 곧 Db이므로 다음과 같이 정리할 수 있다.At this time, Ca · Db is Db , which can be summarized as follows.
Fura-2는 340nm 파장의 빛에서는 Ca이 형광물질에 결합할수록 형광강도(F340)가 증가하게 되고, 380nm 파장의 빛에서는 Ca이 형광물질에서 떨어질수록 즉 자유 상태의 형광물질이 많아질수록 형광강도(F380)가 증가하게 된다. 발생하는 형광강도는 형광물질 농도에 비례하므로 다음과 같은 수식이 형성되게 된다.In 340 nm wavelength light, Fura-2 increases the fluorescence intensity (F340 ) as Ca is bound to the fluorescent material. The strength F380 is increased. Since the generated fluorescence intensity is proportional to the concentration of the fluorescent substance, the following formula is formed.
「수학식 4」의 F340은 340nm 파장의 빛에 발생하는 형광강도이며 이 요소에는 Ca에 결합된 형태의 형광물질인 Db에 발생하는 형광과, Ca이 결합되지 않는 자유 상태의 형광물질인 Df에서 발생하는 형광이 섞여 있게 된다.F340 of [Equation 4] is the fluorescence intensity generated in light of 340nm wavelength, and this element includes fluorescence generated in Db which is a form of Ca-bonded phosphor, and a free state phosphor which is not bonded to Ca. Fluorescence generated at Df is mixed.
「수학식 5」의 F380도 마찬가지여서 위와 같은 수식이 구성되게 된다. 여기서, a,b,c,d는 각 형광물질농도에 따른 비례상수이다.The same applies to the F380 shown in Equation 5 above. Here, a, b, c, and d are proportional constants according to the concentrations of fluorescent materials.
F340과 F380의 두 형광강도의 비(R)를 구하면 다음과 같다.The ratio (R) of two fluorescence intensities of F340 and F380 is obtained as follows.
상기 R이 가질 수 있는 최대값(Rmax)는 F340값이 최대이고 F380값이 최소일 때이며, 이를 만족하기 위해서는 모든 형광물질이 Ca에 결합되어 있을 때, 즉 Db와 Df가 같고, Df가 0이 되는 것임을 알 수 있다.The maximum value (Rmax ) that R can have is when the value of F340 is maximum and the value of F380 is minimum. To satisfy this, when all the fluorescent materials are bonded to Ca, that is, Db and Df are the same. , It can be seen that Df is 0.
반대로 R이 가질 수 있는 최소값(Rmin)은 F340값이 최소이고 F380값이 최대일 때이며, 이를 만족하기 위해서는 모든 형광물질이 자유 상태일 때, 즉 Db가 0이고, Df와 DT가 같을 때임을 알 수 있다.Conversely, the minimum value Rmin can have is when the value of F340 is minimum and the value of F380 is maximum. To satisfy this, all phosphors are free, that is, Db is 0, and Df and D It can be seen thatT is the same.
그러므로 최대값과 최소값을 정의 하면,Therefore, defining the maximum and minimum values
「수학식 6」 내지 「수학식 8」를 이용하여 정리하면 다음과 같이 된다.The following equations are used to summarize the equations (6) to (8).
여기서, d/c의 경우 형광물질 농도가 변화가 없을 때 F380값이 최대일 때와 F380값이 최소일 때의 비이기 때문에 「수학식 9」를 최종 정리하면 다음과 같이 된다.Here, when the F380 value is a final clean up "Equation 9", due to the rain is the time of day when the maximum and the minimum value F380 are as follows: time when the d / c The fluorophore concentration is not changed.
여기서, Kd, Rmin, Rmax, F380max/F380min은 모두 상수이므로 상기 값만 구하면 비로부터 Ca이온농도로 환산이 가능하다.Since Kd , Rmin , Rmax , and F380max / F380min are all constants, it is possible to convert the ratio into Ca ion concentration from the ratio by obtaining only the above values.
이와 같이 비를 이용하여 세포 내부의 이온농도를 측정하는 가장 큰 이유는 형광물질 농도가 변화하기 때문이다.Thus, the biggest reason for measuring the ion concentration in the cell using the ratio is that the concentration of the fluorescent material changes.
즉, 형광강도를 이용하여 세포 내부의 이온농도를 측정하게 되는데, 형광물질 자체의 농도가 변화하게 되면 형광강도에 영향을 미치게 되며, 결과적으로 실제 기록한 신호가 형광물질 농도의 변화 때문인지 아니면 목표하고자 하는 이온농도 변화 때문인지 알 수 없게 된다.That is, the ion concentration inside the cell is measured by using the fluorescence intensity. If the concentration of the fluorescent substance itself is changed, the fluorescence intensity is affected. It is unknown whether the ion concentration changes.
실제로 형광물질은 다양한 원인에 의해 농도가 감소하게 된다. 가장 중요한 두 요인은 세포 내부에 있던 형광물질이 세포 밖으로 빠져나가는 경우와, 자극원인 빛에 의해 형광물질이 분해되어 형광능력을 상실하게 되는 경우가 있다.In fact, the fluorescent material is reduced in concentration due to various causes. The two most important factors are that the fluorescent material inside the cell escapes out of the cell, and the fluorescent material is decomposed by the light as a stimulus and loses its fluorescence ability.
그러므로 정확한 농도변화를 보고자 할 경우에는 반드시 형광물질 농도변화에 상관없이 이온농도를 환산할 수 있는 방법을 사용하여야 하며 이러한 이유로 비(ratio)를 이용하는 것이다. 비를 사용하게 되면 형광물질 농도의 변화가 발생하더라도 그 비는 이온농도 변화에 의해서만 변하게 되므로 형광물질 농도에 관계없이 위 수식에 의해 이온농도를 산출할 수 있다.Therefore, if you want to see the exact concentration change, you must use the method that can convert the ion concentration regardless of the change in the concentration of fluorescence material. When the ratio is used, even if a change in the concentration of the fluorescent substance occurs, the ratio is changed only by the change in the ion concentration, and thus the ion concentration can be calculated by the above formula regardless of the concentration of the fluorescent substance.
하지만 전술한 바와 같은 이온 농도의 측정은 상당히 아이디얼한 경우이고, 실제적으로 세포 내부의 이온농도는 다른 이온과 상호관계를 가지고 있다.However, the measurement of the ion concentration as described above is quite ideal, and in practice, the ion concentration inside the cell has a correlation with other ions.
예를 들면, 세포 내부에 있는 Ca이온은 1/1000정도만 유리 Ca이온으로 존재하고, 대부분의 Ca이온은 세포 내부의 Ca버퍼에 의해 결합되어 존재한다.For example, only about 1/1000 of Ca ions inside the cell are present as free Ca ions, and most of the Ca ions are bound by the Ca buffer inside the cell.
이러한 Ca버퍼는 세포 내부의 pH가 변화하게 되면 그 결합능이 크게 변화하게 되므로 pH가 변화하는 상황에서는 Ca이온농도변화가 크게 발생하게 된다.Since the Ca buffer has a large change in binding capacity when the pH inside the cell changes, Ca ion concentration changes greatly occur in a pH changing situation.
또한 Ca이온 형광물질 자체도 pH변화에 의해 그 결합능이 달라지게 되므로 반드시 Ca이온농도를 측정시 pH도 같이 기록해야 하는 필요성이 존재한다.In addition, since the binding capacity of the Ca ion fluorescent substance itself is changed by the pH change, there is a necessity to record the pH together when measuring the Ca ion concentration.
그러나 지금까지 형광강도를 측정하는 기기는 대부분 단일 이온농도만 측정할 수 있기 때문에 실험조건에 따라 pH가 변화할 가능성이 있음에도 불구하고 이를 무시할 수밖에 없었다.However, until now, most instruments measuring fluorescence intensity can only measure the concentration of a single ion, so that despite the possibility of changing pH depending on the experimental conditions, it was inevitable.
또 다른 경우는 세포내 Na농도가 증가하게 되면 세포막에 존재하는 Na/Ca교환기전에 의해서 세포내 Ca이온농도에 변화가 발생하게 된다. 그러므로 이러한 기전 연구에는 Ca이온과 Na이온을 동시에 기록하는 방법이 매우 유용한 연구방법이 된다.In another case, when intracellular Na concentration increases, intracellular Ca ion concentration changes due to Na / Ca exchange mechanism in the cell membrane. Therefore, the method of recording Ca ions and Na ions at the same time is a very useful research method.
이외에도 Cl이온도 Na이온과 연계되어 이동하는 경우가 많고 Na과 pH 또한 서로 밀접한 관련을 가지고 있다.In addition, Cl is often associated with temperature Na ions, and Na and pH are closely related to each other.
상술한 문제점들을 해결하기 위해 안출된 본 발명의 목적은 세포 내부의 형광물질을 파장에 따라 선택적으로 분리할 수 있도록 하는 광원 파장 분석용 필터박스를 제공하는 데 있다.An object of the present invention devised to solve the above problems is to provide a filter box for light source wavelength analysis that can selectively separate the fluorescent material in the cell according to the wavelength.
본 발명의 또 다른 목적은 필터박스를 이용하여 세포막의 이온전류, 세포 내부의 이온농도의 변화 및 세포 주변의 온도를 동시에 측정할 수 있는 필터박스를 이용한 세포 분석 장치를 제공하는 데 있다.Still another object of the present invention is to provide a cell analysis device using a filter box that can simultaneously measure the ion current of the cell membrane, the change in ion concentration inside the cell, and the temperature around the cell using the filter box.
도 1은 일반적인 형광물질의 자극 스펙트럼을 도시한 그래프이다.1 is a graph showing a stimulation spectrum of a general fluorescent material.
도 2는 일반적인 형광물질의 발광 스펙트럼을 도시한 그래프이다.2 is a graph illustrating an emission spectrum of a general fluorescent material.
도 3은 본 발명에 따른 필터 박스의 구성을 개략적으로 도시한 평면도이다.3 is a plan view schematically showing the configuration of a filter box according to the present invention.
도 4는 본 발명에 따른 필터 박스의 광학 조절 장치를 도시한 분리 사시도이다.Figure 4 is an exploded perspective view showing the optical control device of the filter box according to the present invention.
도 5는 본 발명에 따른 세포 분석 장치의 전체 구성을 도시한 블록도이다.5 is a block diagram showing the overall configuration of a cell analysis apparatus according to the present invention.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 실시된 실험에서 얻은 세포 내부의 Ca 이온 농도 변화, pH 이온 농도 변화, 그리고 수축의 변화를 나타낸 그래프이다.6 is a graph showing changes in Ca ion concentration, change in pH ion concentration, and shrinkage in cells obtained in an experiment conducted according to an embodiment of the present invention.
<< 도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명 >><< Explanation of symbols for main part of drawing >>
10...필터 박스 20...통10 ... filter box 20 ... canister
30...핫 미러 40a~40c...다이크로익 미러30.Hot Mirror 40a ~ 40c ... Dichroic Mirror
50a~50c...포커싱 렌즈 60a~60d...필터50a ~ 50c ... Focus Lens 60a ~ 60d ... Filter
80...광학 조절 장치 82...베이스80 ... optical control 82 ... base
84...채널 86...이동 블록84 ... channel 86 ... move block
90...위치 고정대 98...고정판90 position fixing 98 fixing plate
110...광원 120...형광강도 측정부110 ... light source 120 ... fluorescence intensity measuring unit
124...광증폭기 126...제어부124 Optical Amplifier 126 Control Unit
130...길이 변화 측정부 140...온도 센서130 ... length change measuring unit 140 ... temperature sensor
150...패치 클램프 증폭기150 ... patch clamp amplifier
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 필터박스는 광원에서 발생된 빛이 유입되는 개구부가 형성되는 통과; 통의 하부에 설치되고 길이 방향으로 채널이 형성되는 베이스와, 상기 채널에 삽입되고 다수의 결합공이 수직되는 방향으로 형성되는 이동 블록과, 상기 결합공에 나사 결합되는 고정 나사에 의해 상기 이동 블록에 고정되며 대향되는 양측에 수직되는 방향으로 고정편이 형성되는 위치 고정대와, 상기 고정편에 대응되는 삽입홈이 형성되며 핫 미러, 다이크로익 미러, 포커싱 렌즈 및 필터 중 어느 하나가 설치된 고정판으로 이루어지는 광학 조절 장치를 포함한다.The filter box of the present invention for achieving the above object is a passage through which an opening through which light generated from a light source is introduced; The base is installed in the lower portion of the barrel and the channel is formed in the longitudinal direction, the moving block is inserted into the channel and formed in the direction in which the plurality of coupling holes are vertical, and the moving block by a fixing screw screwed to the coupling hole Position holder that is fixed and is formed in a direction perpendicular to the opposite sides of the fixed, and the insertion groove is formed corresponding to the fixing piece is formed of an optical plate consisting of a hot mirror, a dichroic mirror, a focusing lens and a fixing plate provided with any one of the filters And an adjusting device.
그리고 필터 박스는 광학 조절 장치가 설치된 통을 2개 또는 3개 이상 서로 연통시켜 내부에 설치된 다이크로익 미러로 빛을 반사 및 통과시키는 것이 바람직하다.In addition, the filter box preferably communicates with the dichroic mirror installed therein by passing two or three or more cylinders in which the optical control device is installed to communicate with each other.
상술한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 세포 분석 장치는 광원과, 형광강도를 측정하기 위해서 세포 내부에 함유된 형광물질의 강도를 측정하는 형광강도 측정부와, 세포 내부 이온농도의 변화에 따라 세포막의 길이 변화를 파악하는 길이 변화 검출부와, 세포의 온도를 측정하는 온도 센서와, 세포의 이온 전류를 검출하는 패치 클램프 증폭기로 구성된다.Cell analysis apparatus of the present invention for achieving the above-mentioned other object is a light source, a fluorescence intensity measuring unit for measuring the intensity of the fluorescent material contained in the cell to measure the fluorescence intensity, and according to the change in the ion concentration in the cell It consists of a length change detection part which catches the change of the length of a cell membrane, the temperature sensor which measures the temperature of a cell, and the patch clamp amplifier which detects the ion current of a cell.
이하 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 첨부된 도면에 의거하여 상세히 설명한다. 도 3은 본 발명에 따른 필터박스의 구성을 개략적으로 도시한 평면도이다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. 3 is a plan view schematically showing the configuration of a filter box according to the present invention.
필터박스(10)는 광원에 의해 발생된 형광물질을 파장에 따라 분리하게 된다.The filter box 10 separates the fluorescent material generated by the light source according to the wavelength.
이를 위하여 필터박스(10)는 'T'자 모양의 통(20) 내부에 핫 미러(Hot mirror;30), 다수의 다이크로익 미러(Dichroic Mirror)(40a~40c), 다이크로익 미러에 대응되는 다수의 포커싱 렌즈(50a~50c) 및 다수의 필터(60a~60d)로 구성된다.To this end, the filter box 10 includes a hot mirror 30, a plurality of dichroic mirrors 40a to 40c, and a dichroic mirror in the 'T' shape cylinder 20. Comprising a plurality of corresponding focusing lens (50a ~ 50c) and a plurality of filters (60a ~ 60d).
상기 'T'자 모양의 통(20)은 몇 개의 유닛(unit)(22)(24)(26)을 통합하여 완성되며, 각 유닛(22)(24)(26)의 내부에는 후술하는 광학 조절 장치(80)가 설치된다.The 'T' shaped barrel 20 is completed by integrating several units 22, 24, 26, and each of the units 22, 24, 26 is described later in the optical The adjusting device 80 is installed.
상기 핫 미러(30)는 광원이 처음으로 유입되는 통(20)의 개구부 내측에 설치되며, 이러한 핫 미러(30)는 광원 중에서 적외선만 반사시켜 후술하는 CCD 카메라로 보내고 나머지는 통과시키는 미러로서, 타 파장의 광원보다 상대적으로 높은 열을 발생시키는 광원이라 하여 핫 미러(30)로 정의한다.The hot mirror 30 is installed inside the opening of the barrel 20 into which the light source is first introduced, and the hot mirror 30 reflects only infrared rays among the light sources and sends them to a CCD camera to be described later. A light source that generates heat that is relatively higher than a light source having a different wavelength is defined as a hot mirror 30.
다수의 다이크로익 미러(40a~40c)가 통(20)의 내부에 설치되는 바, 좀 더 바람직하게는 3개의 다이크로익 미러가 단색의 빛을 선택적으로 분기시키고 나머지는 통과시키는 위치에 설치된다.A plurality of dichroic mirrors 40a to 40c are installed in the inside of the barrel 20, more preferably, three dichroic mirrors are installed at a position to selectively diverge the monochromatic light and pass the rest. do.
즉, 제 1다이크로익 미러(40a)는 통의 중심부에 설치되고, 제 2다이크로익 미러(40b)는 제 1다이크로익 미러(40a)를 기준으로 우측에 설치되며, 제 3다이크로익 미러(40c)는 제 1다이크로익 미러(40a)의 하부측에 설치된다.That is, the first dichroic mirror 40a is installed at the center of the barrel, and the second dichroic mirror 40b is installed at the right side with respect to the first dichroic mirror 40a, and the third dichroic The blade mirror 40c is provided on the lower side of the first dichroic mirror 40a.
이에 따라, 핫 미러(30)를 통과한 빛은 제 1다이크로익 미러(40a)에서 선택된 빛만 반사시켜 제 3다이크로익 미러(40c)를 향하도록 하고, 나머지 빛은 투과하여 제 1다이크로익 미러(40a)를 향하도록 한다.Accordingly, the light passing through the hot mirror 30 reflects only the light selected by the first dichroic mirror 40a to face the third dichroic mirror 40c, and the remaining light passes through the first dichroic mirror. Facing the blade mirror 40a.
이어서, 제 2다이크로익 미러(40b)로 조사된 빛은 일부는 반사되고 일부는 투과되어 후술하는 필터들에 도달한다.Subsequently, the light irradiated to the second dichroic mirror 40b is partially reflected and partially transmitted to reach the filters described below.
마찬가지로 제 3다이크로익 미러(40c)로 조사된 빛도 일부는 반사되고 일부는 투과되어 후술하는 필터들에 도달한다.Similarly, the light irradiated to the third dichroic mirror 40c is partially reflected and partially transmitted to reach the filters described below.
이러한 다이크로익 미러(40a~40c)의 전방에는 포커싱 렌즈(50a~50c)가 설치되며, 이 포커싱 렌즈(50a~50c)의 위치를 조절하여 후술하는 광증폭기에 초점이 정확히 맞도록 유도한다.Focusing lenses 50a to 50c are provided in front of the dichroic mirrors 40a to 40c, and the focusing of the focusing lenses 50a to 50c is guided so that the focal point is correctly focused.
그리고 상술한 필터들은 측정하고자 하는 파장의 빛에 대응하는 개수로 설치되는 것이 바람직하며, 본 발명에서는 4개의 필터(60a~60d)가 사용되는 것을 예를 들어 설명한다.In addition, the above-described filters are preferably installed in a number corresponding to the light of the wavelength to be measured, and in the present invention, four filters 60a to 60d are used as an example.
이러한 필터들은 다이크로익 미러(40a~40c)와 함께 발생된 형광을 특정 파장대의 빛으로 분리하게 된다. 이렇게 분리된 빛은 후술하는 광증폭기(Photo Multiplier Tube;PMT)로 진입하게 된다.These filters separate fluorescence generated with the dichroic mirrors 40a to 40c into light of a specific wavelength band. The separated light enters a photo amplifier (PMT), which will be described later.
전술한 구성요소인 핫미러, 다이크로익 미러, 포커싱 렌즈 및 필터들은 통의 내부에 설치되는 광학 조절 장치(80)에 의해 위치 조절 및 교체가 용이하게 구성된다. 도 4를 참조하여 좀 더 상세히 설명한다.The above-mentioned components, the hot mirror, the dichroic mirror, the focusing lens and the filters, are easily configured and replaced by the optical adjusting device 80 installed inside the barrel. This will be described in more detail with reference to FIG. 4.
각 유닛(22)(24)(26)의 하부에는 도 4에 도시한 바와 같이 길이 방향으로 채널(84)이 형성되는 베이스(82)가 배치된다.The base 82 in which the channel 84 is formed in the longitudinal direction is arrange | positioned under each unit 22, 24, 26 as shown in FIG.
베이스(82)의 채널 좌우측에는 안내홈(84a)이 채널(84)을 따라 형성되며 후술하는 이동 블록(86)의 가이드(86a)가 삽입된다.Guide grooves 84a are formed along the channels 84 on the left and right sides of the channel of the base 82, and the guides 86a of the moving block 86 described later are inserted.
이동 블록(86)은 상기 안내홈(84a)에 대응되는 가이드(86a)가 대향되는 양측면에 형성되며, 상면에는 다수의 결합공(88)이 수직되는 방향으로 형성된다.The moving block 86 is formed at both side surfaces of the guide 86a corresponding to the guide groove 84a, and is formed in a direction in which the plurality of coupling holes 88 are vertical.
좀 더 바람직하게, 상기 다수의 결합공(88)은 이동 블록(86)의 중심부를 기준으로 대향되는 양측 각각에 3개씩 도합 6개가 형성되어 후술하는 위치 고정대(90)의 설치 위치를 변경시킬 수 있다.More preferably, the plurality of coupling holes 88 are formed in a total of six on each of the two sides opposite to the center of the moving block 86 is formed to change the installation position of the position holder 90 to be described later have.
위치 고정대(90)는 중심부에 형성된 나사공(92)을 관통하는 고정나사(94)가상기 이동 블록(86)의 결합공(88)에 결합됨으로써 이동 블록(86)과 일체가 되며, 위치 고정대(90)의 양측에는 고정편(96)이 설치된다.Position fixing unit 90 is a fixing screw 94 penetrating through the screw hole 92 formed in the center is coupled to the coupling hole 88 of the moving block 86 is integrated with the moving block 86, position fixing table Fixing pieces 96 are provided on both sides of the 90.
이러한 위치 고정대(90)에 결합되는 고정판(98)은 본 발명에서 사용되는 핫 미러, 다이크로익 미러, 렌즈 및 필터를 설치하기 위해 제안된다. 이를 위하여 고정판(98)의 중심부에는 핫 미러, 다이크로익 미러, 렌즈 및 필터 등이 설치되는 설치공(100)이 형성된다.A fixing plate 98 coupled to this position holder 90 is proposed for installing hot mirrors, dichroic mirrors, lenses and filters used in the present invention. To this end, an installation hole 100 in which a hot mirror, a dichroic mirror, a lens, and a filter is installed is formed at the center of the fixing plate 98.
그리고 고정판(98)을 상기 위치 고정대(90)에 고정시키거나 교환을 위하여 상기 고정판(98)의 양측면에는 상기 고정편(96)에 대응되는 삽입홈(102)이 형성된다.In addition, insertion grooves 102 corresponding to the fixing piece 96 are formed on both sides of the fixing plate 98 to fix or replace the fixing plate 98 to the position holder 90.
이와 같이 구성되는 광학 조절 장치(80)의 작용을 다이크로익 미러로 예를 들어 살펴보면, 다이크로익 미러(40a)의 경우에는 일부의 빛은 반사시키고 일부의 빛은 통과시켜야 하기 때문에 베이스(82)의 길이 방향에 대해 빛의 반사각도에 해당하는 만큼 위치를 맞추어야 한다.Looking at the operation of the optical control device 80 configured as described above as a dichroic mirror, for example, in the case of the dichroic mirror 40a, some light must be reflected and some light must pass through the base 82. The position should be aligned with respect to the reflection angle of light with respect to the longitudinal direction of).
이에 따라, 이동 블록(86)에 위치 고정대(90)를 반사각도 만큼 위치를 잡은 상태에서, 고정나사(94)를 나사공(92)의 통과 후 결합공(88)에 나사 결합시킴으로써 위치 고정대(90)를 고정시킨다.Accordingly, in a state in which the position holder 90 is positioned by the reflection angle in the moving block 86, the fixing screw 94 is screwed into the coupling hole 88 after passing through the screw hole 92, thereby positioning the position holder ( 90).
그리고, 이동 블록(86)을 베이스(82)의 채널(84)에 밀어 넣어 적당한 위치에 배치시킨 후, 다이크로익 미러(40a)가 설치된 고정판(98)을 위치 고정대(90)에 설치한다. 즉, 고정판(98)의 삽입홈(102)을 위치 고정대(90)의 고정편(96)에 끼워 넣는다.Then, the moving block 86 is pushed into the channel 84 of the base 82 and disposed at an appropriate position. Then, the fixing plate 98 provided with the dichroic mirror 40a is installed on the position holder 90. That is, the insertion groove 102 of the fixing plate 98 is inserted into the fixing piece 96 of the position holder 90.
이와 같은 다이크로익 미러(40a)의 설치방식은 핫 미러(30), 포커싱 렌즈(50a~50c), 필터(60a~60d)에도 동일하게 적용되며, 각 유닛별로 상술한 설치방식이 적용된다.The installation method of the dichroic mirror 40a is equally applied to the hot mirror 30, the focusing lenses 50a to 50c, and the filters 60a to 60d, and the above-described installation method is applied to each unit.
상술한 바와 같은 광학 조절 장치가 설치되는 필터박스(10)는 두가지 이상의 파장이 혼재된 빛을 분리하여 분석작업에 이용할 수 있다.The filter box 10 in which the optical control device as described above is installed may be used for analysis by separating light having two or more wavelengths mixed therein.
이상과 같은 필터박스(10)는 당업계에 종사하는 자라면 본 발명의 기술분야 이외에도 다양한 종류의 다이크로익 미러(40a~40c)와 필터(60a~60d)를 교체하여 원하는 파장의 빛을 분리하여 연구의 목적으로 사용할 수 있음을 밝힌다.The filter box 10 as described above is a person skilled in the art to separate the light of the desired wavelength by replacing various types of dichroic mirrors (40a ~ 40c) and filters (60a ~ 60d) in addition to the technical field of the present invention. It can be used for research purposes.
이하 설명하고자 하는 세포 분석 장치는 상술한 필터박스를 사용하여 세포 내부의 이온농도를 측정할 뿐만 아니라, 세포막의 이온전류 및 세포 주변의 온도를 동시에 측정할 수 있다.The cell analysis device to be described below may not only measure the ion concentration in the cell using the filter box described above, but also simultaneously measure the ion current of the cell membrane and the temperature around the cell.
도 5는 본 발명에 따른 세포 분석 장치의 전체 구성을 도시한 블록도이다.5 is a block diagram showing the overall configuration of a cell analysis apparatus according to the present invention.
본 발명은 광원(110)과, 형광강도를 측정하기 위해서 세포(C) 내부에 함유된 형광물질의 강도를 측정하는 형광강도 측정부(120)와, 세포 내부 이온농도의 변화에 따라 세포막의 길이 변화를 파악하는 길이 변화 검출부(130)와, 세포(C)의 온도를 측정하는 온도 센서(140)와, 세포의 이온 전류를 검출하는 패치 클램프 증폭기(150)로 구성된다.The present invention, the light source 110, the fluorescence intensity measuring unit 120 for measuring the intensity of the fluorescent material contained in the cell (C) in order to measure the fluorescence intensity, and the length of the cell membrane in accordance with the change in the ion concentration in the cell It consists of a length change detection part 130 which catches a change, the temperature sensor 140 which measures the temperature of the cell C, and the patch clamp amplifier 150 which detects the ion current of a cell.
이와 같이 구성되는 세포 분석 장치에서 반드시 필요한 것 중의 하나인 광원은 다양한 파장의 빛을 발생할 수 있는 모노크로매터(Monochromator)를 사용하며, 모노크로매터는 충분한 시분해능을 가지기 위해서 광원의 전환속도가 3msec 이내에빛파장을 바꿀 수 있을 정도로 빠른 전환이 가능하다.One of the necessities of the cell analysis device configured as described above is a monochromator capable of generating light of various wavelengths, and the monochromator has a switching speed of 3 msec in order to have sufficient time resolution. It is possible to switch fast enough to change the light wavelength within.
이와 같이 빠른 전환이 가능해야 하는 것은 세포 내부의 Ca이온농도가 증가하고 감소하는 데 걸리는 시간이 고작 200msec이내이기 때문이다.Such rapid conversion should be possible because the time taken for the increase and decrease of the Ca ion concentration inside the cell is within 200 msec.
이러한 광원(110)으로부터 발생된 빛에 의해 세포 내부의 형광물질이 발광하게 되고, 발광된 형광물질의 형광강도는 형광강도 측정부(120)에서 측정된다.The fluorescent material inside the cell emits light by the light generated from the light source 110, and the fluorescence intensity of the emitted fluorescent material is measured by the fluorescence intensity measuring unit 120.
형광강도 측정부(120)는 세포수준의 연구를 위한 현미경(122)과, 발생된 형광을 분리하기 위한 필터박스(10)와, 발생된 형광강도를 측정하기 위한 광증폭기 (124)와, 소프트웨어가 탑재된 제어부(126)로 이루어진다.The fluorescence intensity measuring unit 120 includes a microscope 122 for cell-level research, a filter box 10 for separating generated fluorescence, an optical amplifier 124 for measuring generated fluorescence intensity, and software. The control unit 126 is mounted.
상기 현미경(122)은 자극 광원(Excitation Light)과 발광 광원(Emission Light)이 모두 잘 투과가 되며, 현미경(122)에 사용되는 형광용 대물렌즈는 특수 제작된 것으로 자극 광원 파장대의 자외선도 잘 투과되는 것을 사용한다. 여기서 자극 광원은 여기(勵起) 상태로 된 전자에 의해 발생된 자극 스펙트럼을 형성하는 파장대를 나타내는 광원이고, 발광 광원은 전자의 천이(遷移)에 따라 방출되는 전자파의 스펙트럼을 형성하는 파장대를 나타내는 광원이다.The microscope 122 transmits both the excitation light and the emission light well, and the fluorescence objective lens used in the microscope 122 is specially manufactured and transmits the ultraviolet light well in the wavelength range of the stimulation light source. Use what happens. Here, the stimulus light source is a light source representing a wavelength band forming a stimulus spectrum generated by electrons in an excited state, and the light emitting light source represents a wavelength band forming a spectrum of electromagnetic waves emitted in accordance with the transition of electrons. It is a light source.
그리고 현미경(122)은 세포로 접근이 용이하도록 인버트 현미경(Invert microscope)을 사용하고 있다. 인버트 현미경은 세포(C)에 접근하는 대물렌즈가 세포의 하부에 위치하는 현미경이다.In addition, the microscope 122 uses an Invert microscope to easily access cells. Inverted microscope is a microscope in which the objective lens approaching the cell (C) is located at the bottom of the cell.
한편, 필터박스(10)는 전술한 실시예에서 상세하게 언급하였음으로 여기서의 설명은 생략한다.On the other hand, the filter box 10 has been described in detail in the above-described embodiment, so description thereof will be omitted.
광증폭기(124a~124d)는 형광강도를 측정하는 장치로서, 광전관의 감도를 향상시키기 위해 광전면과 2차 전자 증배관을 조합시킨 것이며, 음극에서 방출된 다수의 광전자가 2차 전자 증배관에 충돌하면서 순차 저자수가 증가하여 양극에서 얻어지는 큰 전류로 빛의 강도를 측정하는 장치이다.The optical amplifiers 124a to 124d are devices for measuring the fluorescence intensity. The optical amplifier combines a photoelectric surface and a secondary electron multiplier to improve the sensitivity of the phototube. A plurality of photoelectrons emitted from the cathode are applied to the secondary electron multiplier. It is a device that measures the intensity of light with a large current obtained from the anode by increasing the number of low sequential numbers during collision.
즉, 세포 내부에 함유된 형광물질의 양이 얼마 되지 않기 때문에 빛의 강도를 가장 민감하게 측정할 수 있는 광증폭기(124a~124d)를 이용하여 형광강도를 측정하는 것이다.That is, since the amount of the fluorescent material contained within the cell is very little, the fluorescence intensity is measured by using optical amplifiers 124a to 124d which can measure the light intensity most sensitively.
이러한 광증폭기(124a~124d)는 상술한 필터박스(10)의 필터(60a~60d)에 대응되어 설치된다.These optical amplifiers 124a to 124d are installed corresponding to the filters 60a to 60d of the filter box 10 described above.
상기 광증폭기(124a~124d)는 단일 광자를 탐지할 수 있는 광전자 증폭기이며, 이 광전자 증폭기를 사용하는 방법에는 광자의 수를 세는 광전자 카운터법 (Photon counter)과 광량에 따른 전류의 크기를 재는 광전류법(Photocurrent)이 있다.The optical amplifiers 124a to 124d are optoelectronic amplifiers capable of detecting a single photon, and a photon counter for counting photons and a photocurrent for measuring the amount of current according to the amount of light are used in the method using the optoelectronic amplifier. There is a Photocurrent.
광전류법 보다 광전자 카운터법이 외부 노이즈에 의한 영향도 적고 훨씬 민감하게 신호를 기록할 수가 있어 본 발명에서는 광전자 카운터법을 사용한다.Since the photoelectron counter method has less influence by external noise and can record signals more sensitively than the photocurrent method, the optoelectronic counter method is used in the present invention.
제어부(126)는 광전자 카운터법에 의해 기록된 광자의 수를 통해 형광물질의 양을 파악하고, 형광물질의 양에 비례하는 세포 내부의 Ca이온농도를 파악하게 되는 것이다.The control unit 126 determines the amount of the fluorescent material through the number of photons recorded by the photoelectron counter method, and the concentration of Ca ion in the cell proportional to the amount of the fluorescent material.
상술한 바와 같은 형광강도 측정부(120)에 연결된 길이 변화 검출부(130)는 근육세포에서의 세포 내부 이온농도에 따라 변화되는 세포(C)의 길이 변화를 기록함으로써 세포 내부의 이온에 대한 총체적인 연구를 가능하게 한다.The length change detection unit 130 connected to the fluorescence intensity measurement unit 120 as described above records the change in the length of the cell (C) which is changed depending on the concentration of the intracellular ions in the muscle cells, thereby studying the ions inside the cell. To make it possible.
이와 같은 길이 변화 검출부(130)는 필터박스(10)에 연결되는 CCD 카메라 (132)와, CCD 카메라(132)에서 얻어진 이미지를 통해 세포(C) 양끝의 위치를 파악하여 양끝의 길이를 전압신호로 보내는 에찌 검출기(134)와, 보내진 전압신호를 디지털 신호로 변환시키는 AD/DA 컨버터(136)로 이루어진다.The length change detection unit 130 detects the position of both ends of the cell C through the CCD camera 132 connected to the filter box 10 and the image obtained by the CCD camera 132, and determines the length of both ends of the voltage signal. And an AD / DA converter 136 for converting the sent voltage signal into a digital signal.
여기서, AD/DA 컨버터(136)에서 변환된 디지털 신호는 상술한 제어부(126)로 보내져서 데이터로 기록된다.Here, the digital signal converted by the AD / DA converter 136 is sent to the controller 126 described above and recorded as data.
이와 같은 길이 변화 및 세포 내부의 이온농도 변화외에도 실험시 세포의 온도변화도 세포 기능에 중요한 영향을 끼치게 된다.In addition to the length change and the ion concentration change inside the cell, the temperature change of the cell during the experiment also has an important effect on the cell function.
즉, 세포(C)의 온도변화를 측정하기 위해서 세포(C)에 가해지는 관류용액의 온도 변화를 측정하고, 측정된 온도는 AD/DA 컨버터(136)를 이용하여 제어부(126)에 기록한다.That is, in order to measure the temperature change of the cell C, the temperature change of the perfusion solution applied to the cell C is measured, and the measured temperature is recorded in the controller 126 using the AD / DA converter 136. .
그리고, 본 발명의 세포 분석 장치는 다수의 패치 클램프 증폭기(150)를 포함한다.In addition, the cell analysis apparatus of the present invention includes a plurality of patch clamp amplifiers 150.
패치 클램프 증폭기(150)는 세포(C) 및 AD/DA 컨버터(136)에 각각 연결되고, 그 결과 패치 클램프 증폭기(150)에서 측정된 세포(C)의 이온전류는 디지털 신호로 변환되어 제어부로 입력된다.The patch clamp amplifier 150 is connected to the cell C and the AD / DA converter 136, respectively, and as a result, the ion current of the cell C measured by the patch clamp amplifier 150 is converted into a digital signal to the controller. Is entered.
따라서, 형광강도 측정부(120)와 함께 세포막의 이온전류를 측정하여 세포내 이온에 대한 총체적인 연구를 가능케 한다.Therefore, by measuring the ionic current of the cell membrane with the fluorescence intensity measurement unit 120 to enable a comprehensive study of the intracellular ions.
이상과 같이 구성되는 본 발명에 따른 세포 분석 장치는 다음과 같은 작용을 나타낸다.The cell analysis device according to the present invention configured as described above exhibits the following actions.
먼저, 세포(C)에 서로 다르게 파장이 나타나는 여러 종류의 형광물질을 혼합시킨다.First, various kinds of fluorescent materials having different wavelengths are mixed in the cells (C).
그리고, 광원(110)을 조사하여 형광물질을 발광시키면 현미경(122)을 통해세포(C) 내부의 형광물질이 감지된다.When the fluorescent material is emitted by irradiating the light source 110, the fluorescent material inside the cell C is detected through the microscope 122.
이어서, 현미경(122)을 통과한 빛은 필터박스(10)로 진입되고, 진입된 일부의 빛은 핫 미러(30)를 통과하고 나머지 빛은 길이 변화 검출부(130)로 반사된다.Subsequently, light passing through the microscope 122 enters the filter box 10, and a part of the light entering passes through the hot mirror 30 and the remaining light is reflected by the length change detector 130.
핫 미러(30)를 통과한 빛은 제 1포커싱 렌즈(50a)에서 초점이 조절되어 정확하게 제 1광증폭기(124a)로 빛이 조사되도록 한다.The light passing through the hot mirror 30 is focused at the first focusing lens 50a so that the light is accurately irradiated onto the first optical amplifier 124a.
제 1다이크로익 미러(40a)로 조사된 빛은 정해진 파장의 빛만 반사되고, 나머지는 제 1다이크로익 미러(40a)를 투과하여 제 2다이크로익 미러(40b)로 향한다.The light irradiated to the first dichroic mirror 40a reflects only light having a predetermined wavelength, and the rest passes through the first dichroic mirror 40a to the second dichroic mirror 40b.
먼저, 제 1다이크로익 미러(40a)에서 반사된 빛은 제 2포커싱 렌즈(50b)에서 초점이 조절되어 제 1광증폭기(124a)와 제 2광증폭기(124b)에 정확하게 빛이 도달되게 하는데, 제 1다이크로익 미러(40a)를 통과한 빛은 제 3다이크로익 미러(40c)에서 일부는 반사되어 정해진 파장의 빛만을 투과시키는 제 1필터(60a)를 통해 제 1광증폭기(124a)로 진입한다.First, the light reflected from the first dichroic mirror 40a is focused in the second focusing lens 50b so that the light reaches the first optical amplifier 124a and the second optical amplifier 124b accurately. The first optical amplifier 124a passes through the first dichroic mirror 40a through the first filter 60a which partially reflects the light from the third dichroic mirror 40c and transmits only light having a predetermined wavelength. Enter).
그리고, 제 3다이크로익 미러(40c)를 통과한 파장의 빛은 제 2필터(60b)를 통과한 후 제 2광폭기(124b)로 진입한다.Then, light having a wavelength passing through the third dichroic mirror 40c passes through the second filter 60b and then enters the second amplifier 124b.
앞서 제 2다이크로익 미러(40b)를 향한 빛은 제 3포커싱 렌즈(50c)에서 초점이 조절되어 제 3광증폭기(124c)와 제 4광증폭기(124d)에 정확하게 빛이 도달되게 하는데, 제 1다이크로익 미러(40a)를 통과한 빛은 제 2다이크로익 미러(40b)에서 정해진 파장의 빛은 반사되어 제 3필터(60c)를 향하고, 제 3필터(60c)에서 정해진 파장의 빛만 필터링된 후 제 3광증폭기(124c)로 진입한다.Prior to the second dichroic mirror 40b, the light is focused on the third focusing lens 50c so that the light reaches the third optical amplifier 124c and the fourth optical amplifier 124d accurately. Light passing through the first dichroic mirror 40a is reflected by the light of the wavelength determined by the second dichroic mirror 40b to the third filter 60c, and only the light having the wavelength determined by the third filter 60c. After filtering, it enters the third optical amplifier 124c.
마지막으로, 제 2다이크로익 미러(40b)를 통과한 빛은 제 4필터(60d)에서 정해진 빛만 필터링된 후 제 4광증폭기(124d)로 진입한다.Finally, the light passing through the second dichroic mirror 40b enters the fourth optical amplifier 124d after filtering only the light determined by the fourth filter 60d.
상기 각각의 광증폭기(124a~124d)로 진입된 빛들은 광전자 카운터법에 의해 광전자의 수가 세어지고, 그 수는 제어부(126)로 입력된다.The light entering each of the optical amplifiers 124a to 124d is counted by the optoelectronic counter method, and the number is input to the controller 126.
한편, 핫 미러(30)에서 반사된 빛은 CCD 카메라(132)에 의해 이미지로 변환되어 세포의 형태가 이미지화된다.On the other hand, the light reflected from the hot mirror 30 is converted into an image by the CCD camera 132 to image the shape of the cell.
이미지화된 세포는 에찌 검출기(134)에 의해 세포 양끝의 위치가 파악되어 양끝의 길이가 전압신호로 측정된다. 측정된 길이는 AD/DA 컨버터(136)에서 디지털 신호로 변환되어 제어부(126)로 보내지고 데이터로 기록된다.The imaged cells are detected by the edge detector 134, and the ends of the cells are detected, and the lengths of both ends thereof are measured by voltage signals. The measured length is converted into a digital signal by the AD / DA converter 136 and sent to the controller 126 and recorded as data.
그리고, 온도 센서(140)에 의해 측정된 세포의 온도변화는 AD/DA 컨버터 (136)에 의해 디지털 신호로 변환되어 제어부(136)에 기록된다.The temperature change of the cell measured by the temperature sensor 140 is converted into a digital signal by the AD / DA converter 136 and recorded in the controller 136.
또한, 패치 클램프 증폭기(150)는 세포의 이온전류를 측정하고, 측정된 이온전류는 AD/DA 컨버터(136)에서 디지털 신호로 변환되어 제어부(136)로 입력된다.In addition, the patch clamp amplifier 150 measures the ion current of the cell, the measured ion current is converted into a digital signal in the AD / DA converter 136 is input to the controller 136.
따라서, 형광강도 측정부(120)와 함께 세포막의 이온전류를 측정하여 세포내 이온에 대한 총체적인 연구를 가능케 한다.실시예Therefore, by measuring the ionic current of the cell membrane with the fluorescence intensity measurement unit 120 to enable a comprehensive study of the intracellular ions.Example
따라서, 리아노다인, NH4Cl 및 HOE694 순서로 투입된다.Therefore, it is introduced in the order of lianodyne, NH4 Cl and HOE694.
라이노다인은 세포내 Ca이온저장고로부터 유리를 억제하는 작용을 한다.Rhinodyne acts to inhibit release from intracellular Ca ion reservoirs.
NH4Cl는 세포에 가해지면 세포내 pH가 알칼리로 이동하고, 씻어주면 세포내 pH가 산성으로 이동하게 된다.When NH4 Cl is added to the cells, the intracellular pH shifts to alkali, and when washed, the intracellular pH shifts to acidic.
HOE694는 세포막에 있는 광전자 이동자(proton transporter) 억제제로서 세포내 pH가 산성이 되었을 때 세포내 pH를 정상 pH로 회복시키는 기전을 억제하는 약물이다.HOE694 is a proton transporter inhibitor in the cell membrane that inhibits the mechanism of restoring the intracellular pH to normal pH when the intracellular pH becomes acidic.
세포내 pH를 기록하기 위해서 carboxy SNARF-1이라는 형광물질을 사용하였으며 세포내 Ca이온을 기록하기 위해서 Fura-2라는 형광물질을 사용하였다.이상과 같은 수치와 표의 값들은 전술한 구성 및 작용에서 설명한 바와 같은 과정을 통해 측정할 수 있고, 이를 근거로 하여 종래 기술에서 언급된 수학식 1 내지 수학식 10을 이용하면 Ca 이온 농도를 계산함과 동시에, 형광강도 측정부(120)를 이용하여 세포 내부에 하유된 형광물질의 강도를 측정할 수 있고, 길이 변화 검출부(130)를 이용하여 세포 내부 이온농도의 변화에 따라 세포막의 길이 변화를 파악할 수 있으며, 온도 센서(140)로는 세포의 온도를 측정하고, 패치 클램프를 이용하여 세포의 이온 전류를 측정할 수 있게 되는 것이다.본 실험에서 보다시피 다른 두 종류의 형광물질을 이용하여 NH4Cl로 세포내 pH 변화를 유도하였을 때 세포내 pH변화, Ca이온농도변화, 그리고 세포길이변화 (수축)를 본 발명에 따른 세포 분석 장치를 이용하여 동시에 기록할 수 있음을 보여주고 있다.A fluorescent substance called carboxy SNARF-1 was used to record intracellular pH and a fluorescent substance called Fura-2 was used to record intracellular Ca ions. Through the process as described above, using the equations (1) to (10) mentioned in the prior art on the basis of calculating the Ca ion concentration, at the same time, using the fluorescence intensity measurement unit 120 inside the cell It is possible to measure the intensity of the fluorescent material remaining in the, it is possible to determine the change in the length of the cell membrane in accordance with the change in the ion concentration in the cell using the length change detector 130, the temperature sensor 140 measures the temperature of the cell The patch clamp can be used to measure the ionic current of the cell. As you can see in this experiment, two different kinds of fluorescent materials were used to intracellular into NH4 Cl. Induction of pH change shows that intracellular pH change, Ca ion concentration change, and cell length change (contraction) can be recorded simultaneously using the cell analysis device according to the present invention.
이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명에 따른 필터박스에 의해서 두 종류 이상의 형광물질의 형광강도를 동시에 기록할 수 있게 된다.As described above, the fluorescence intensity of two or more kinds of fluorescent materials can be simultaneously recorded by the filter box according to the present invention.
두 종류 이상의 형광물질로부터 실시간으로 형광강도를 측정할 수 있으며, 특히 4대의 광증폭기를 이용하여 비를 기록하기 때문에 더욱 정밀하고 정확하게 이온 농도 변화를 기록할 수 있다.Fluorescence intensity can be measured in real time from two or more kinds of fluorescent materials. In particular, since the ratio is recorded using four optical amplifiers, ion concentration changes can be recorded more precisely and accurately.
이와 동시에 세포의 길이 변화와 세포 내로 투입되는 관류용액의 온도를 측정하여 더욱 정확하게 세포 내부의 변화를 관찰할 수 있다.At the same time, changes in cell length and temperature of the perfusion solution introduced into the cell can be measured to more accurately observe changes in the cell.
또한, 필터박스는 각 옵티컬 유닛을 쉽게 교체가 가능하여 필요한 파장대의 빛을 쉽게 분리할 수 있다.In addition, the filter box can easily replace each optical unit to easily separate the light of the required wavelength range.
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