【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、抗生物質やＩＩＩ！１ｉの修飾剤として極め
て有用なり一アミノ酸の酵素合成などに特に有効に用い
られる、アラニン脱水素酵素（以下ＡｌａＤＨと略す）
、アラニンラセマーゼ（以下ＡｌａＲと略す）及びＤ−
アミノ酸トランスアミナーゼ（以下Ｄ−ＡＴＡと略す）
をコードする遺伝子を有する新規なプラスミドに関する
ものである。[Detailed Description of the Invention] (Industrial Application Field) The present invention is applicable to antibiotics and III! Alanine dehydrogenase (hereinafter abbreviated as AlaDH) is extremely useful as a modifier of 1i and is particularly effectively used for the enzymatic synthesis of single amino acids.
, alanine racemase (hereinafter abbreviated as AlaR) and D-
Amino acid transaminase (hereinafter abbreviated as D-ATA)
This invention relates to a novel plasmid containing a gene encoding .
（従来技術）従来バチルス ステアロサーモフィラスＩＦ”０１２５
５０由来の耐熱性Ａ ｌ ａＤＨをコードする遺伝子を
有するプラスミドｐＩＣＤ１１２（特願昭６１−２６０
２２２号）や、同じくバチルスステアロサーモフィラス
ＩＦ０１２５５０由来の耐熱性ＡＩａＲをコードする遺
伝子を有するプラスミドｐＩＣＲ４（バイオケミストリ
ー（ａｔｏｃｈｅ−′１ｉｓｔｒｙ） ２５．３２６８
−３２７４ （１９８６） ）やバチルス エスピー
ＹＭ−１由来の耐熱性Ｄ−ＡＩＡをコードする遺伝子を
有するプラスミドｐＩＣＴ１１３（特願昭６２−３９１
７３号）などが構築されている。又、上記Ａ ｌ ａＤ
Ｈ及びＤ−ＡＴＡの２つの遺伝子を含有するプラスミド
ｐＩＣＤＴ１１１（特願昭６１−２６０２２２号）が構
築されている。(Prior art) Conventional Bacillus stearothermophilus IF”0125
Plasmid pICD112 (patent application 1986-260
222) and the plasmid pICR4 (biochemistry (atoche-'1istry) 25.3268, which has a gene encoding the thermostable AIaR also derived from Bacillus stearothermophilus IF012550).
-3274 (1986)) and Bacillus sp.
Plasmid pICT113 (patent application No. 62-391
No. 73) etc. have been constructed. Also, the above A laD
A plasmid pICDT111 (Japanese Patent Application No. 61-260222) containing two genes, H and D-ATA, has been constructed.
（発明が解決しようとする問題点）しかし、遺伝子組換え技術を用いてＡ Ｉ ａ Ｄ ｌ
−１、ＡｌａＲ及びＤ−ＡＴＡの三酵素を調製し、同時
に該三酵素を使用する場合、前述した該三酵素をコード
する遺伝子を有する別個な三つ（もしくは二つ）のプラ
スミドで別々に宿主を形質転換し、形質転換株を選択後
、それらを別々に培養して該三酵素を調製する必要があ
る。この方法では操作が繁雑で、時間、費用等がかかり
、経済的に有利でない。(Problem to be solved by the invention) However, using genetic recombination technology, AI
-1, AlaR, and D-ATA, and when using the three enzymes at the same time, separate three (or two) plasmids containing the genes encoding the three enzymes described above to host the host separately. After transforming and selecting transformed strains, it is necessary to culture them separately to prepare the three enzymes. This method requires complicated operations, takes time, costs, etc., and is not economically advantageous.
（問題点を解決するための手段）そこで本発明は、該三酵素をコードする遺伝子を一つの
プラスミド上に構築することにより、形質転換、培養な
どの該三酵素の調製を一度に行い、大幅な省エネルギー
、省力、省時間を可能とならしめることを目的とする。(Means for Solving the Problems) Therefore, the present invention constructs the genes encoding the three enzymes on one plasmid, thereby making it possible to prepare the three enzymes at once through transformation, culture, etc. The purpose is to make it possible to save energy, labor, and time.
即ち、本発明は、Ａ ｌ ａＤＨ，Ａ Ｉ ａＲ及びＤ
−ＡＴＡをコードする遺伝子を有するプラスミドである
。That is, the present invention provides A I aDH, A I aR and D
- A plasmid containing the gene encoding ATA.
本発明のプラスミドを得るには、例えば、ＡｌａＤＨを
コードする遺伝子を右するＤＮＡ断片、ＡｌａＲをコー
ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片、およびＤ−ＡＴＡをコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得し、取得した三
つのＤＮＡ断片とベクターとしての役割を有するＤＮＡ
を、ジャーナル オプ モレキュラー バイオロジー（
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏ ） ９６．１７ｌ−１８４（１９７５）に記載の
方法に従い、制限酵素で消化し、次いでリガーゼを用い
て結合することにより調製することができる。In order to obtain the plasmid of the present invention, for example, a DNA fragment containing the gene encoding AlaDH, a DNA fragment containing the gene encoding AlaR, and a DNA fragment containing the gene encoding D-ATA were obtained. Three DNA fragments and DNA that serves as a vector
, Journal of Molecular Biology (
Journal of Molecular Biol
o) It can be prepared by digesting with restriction enzymes and then ligating with ligase according to the method described in 96.17l-184 (1975).
本発明に好ましく用いられるＡｌａ［））ｌ、ＡｌａＲ
をコードする遺伝子としては、耐熱性、安定性などの点
から、例えば好熱性の微生物の染色体ＤＮＡ由来の遺伝
子があげられる。その中でもＡＩ ａＤＨ，Ａ ｌ ａ
Ｒ活性の高いバチルス ステアロサーモフィラス由来の
遺伝子が望ましい。これらの具体例としてＩＦＯｌ ２
５５０．ＡＴＣ０７９５３などがある。又、Ｄ−ＡＴＡ
をコードする遺伝子としては、同じく耐熱性、安定性な
どの点から好熱性の微生物の染色体ＤＮＡ由来の°遺伝
子があげられる。中でもバチルス属の中等度高熱菌由来
の遺伝子が好ましい。これらの具体例としてバチルス
エスピー ＹＭ−１、バチルス エスピー ＹＭ−２（
微工研菌寄第８０５８＠）などがあげられる。Ala[))l, AlaR preferably used in the present invention
From the viewpoint of heat resistance, stability, etc., examples of the gene encoding this include genes derived from the chromosomal DNA of thermophilic microorganisms. Among them, AI aDH, A la
A gene derived from Bacillus stearothermophilus with high R activity is desirable. A specific example of these is IFOl 2
550. There are ATC07953 and others. Also, D-ATA
Examples of genes encoding this include the ° gene derived from the chromosomal DNA of thermophilic microorganisms from the viewpoint of heat resistance and stability. Among these, genes derived from moderately hyperthermic bacteria of the genus Bacillus are preferred. Bacillus is a specific example of these
Bacillus sp. YM-1, Bacillus sp. YM-2 (
Examples include Microtechnology Research Institute No. 8058@).
また、ベクターとしての役割を有するプラスミドとして
は、特にプラスミドｐＵＣ１８が好ましい。また制限酵
素としては、例えばＥＣＯＲＬＳａＣＩなどがあげられ
、リガーゼとしては例えばＴ４ＤＮＡリガーゼがあげら
れる。In addition, plasmid pUC18 is particularly preferred as a plasmid that functions as a vector. Examples of restriction enzymes include ECORL SaCI, and examples of ligases include T4 DNA ligase.
本発明のプラスミドとしては、例えば前記した方法で、
プラスミドｐＵｃ１８に、バチルス ステアロサーモフ
ィラスＩ ＦＯｌ ２５５０の染色体ＤＮＡ由来のＡＩ
ａＤＨｌおよびＡｌａＲをコードする遺伝子と、バチル
ス エスピー ＹＭ−１の染色体ＤＮＡ由来のＤ−ＡＴ
Ａをコードする遺伝子を導入したプラスミドｐＩｃＤＲ
Ｔ１１１があげられる。As the plasmid of the present invention, for example, by the method described above,
Plasmid pUc18 contains AI derived from the chromosomal DNA of Bacillus stearothermophilus I FOl 2550.
Genes encoding aDHl and AlaR and D-AT derived from chromosomal DNA of Bacillus sp. YM-1
Plasmid pIcDR into which the gene encoding A is introduced
T111 is mentioned.
本発明のプラスミドは、例えば常温で生育する細菌に導
入する事ができ、このプラスミドを導入することにより
形質転換された細菌を得ることができる。この常温で生
育する細菌としては例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ）属に属する細菌があげられ、エシェリヒ
ア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ。The plasmid of the present invention can be introduced, for example, into bacteria that grow at room temperature, and transformed bacteria can be obtained by introducing this plasmid. Examples of bacteria that grow at room temperature include Escherichia
Bacteria belonging to the genus Escherichia coli (Escherichia c.
１ｉ）が好ましい。この中でもエシェリヒア コリＨ８
１０１が特に好ましい。1i) is preferred. Among these, Escherichia coli H8
101 is particularly preferred.
また、本発明のプラスミドにより上記常温で生育する１
Ｉｌｉ！ｉを形質転換するには、例えばジャーナル モ
レキュラー バイオロジー５３．１５９−１６２（１９
７０）の方法に従って、０℃付近で塩化カルシウム処理
した上記細菌と本発明のプラスミドとを接触させること
により行えばよい。In addition, the plasmid of the present invention allows the above-mentioned 1 to grow at room temperature.
Ili! For example, the Journal Molecular Biology 53.159-162 (19
This may be carried out by contacting the above-mentioned bacteria treated with calcium chloride with the plasmid of the present invention at around 0° C. according to the method of 70).
以上のようにして形質転換された細菌の例として、プラ
スミドｐＩＣＤＲＴ１１１が導入されたエシェリヒア
コリ ＨＢＩ ０１／ｐ ＩＣＤＲＴ１１１株があげら
れる。この菌株は耐熱性のＡ１ａＤＨ生産能、耐熱性の
ＡｌａＲ生産能、耐熱性のＤ−ＡＴＡ生産能及びアンピ
シリン耐性を有する点以外は、公知のエシェリヒア コ
リ ＨＢｌｏｌと同じ菌学的性質を有している。この菌
体は、非伝達性を伝達性に変えることなく、また非病原
性を病原性に変えることなく、安全性が保持されている
。As an example of a bacterium transformed as described above, Escherichia in which plasmid pICDRT111 was introduced is
Coli HBI 01/p ICDRT111 strain is mentioned. This strain has the same mycological properties as the known Escherichia coli HBloI, except that it has a heat-resistant A1aDH production ability, a heat-resistant AlaR production ability, a heat-resistant D-ATA production ability, and ampicillin resistance. . This bacterial cell maintains safety without changing from non-transmissible to transmissible or from non-pathogenic to pathogenic.
本発明のプラスミドは、下記の氏ユに示されるＤ−アミ
ノ酸の合成、すなわち、Ａ Ｉ ａ Ｄ ｌ−１、Ｄ−
ＡＴＡ、Ａ ｌ ａＲ及びギＰａ脱水素酵素（以下ＦＤ
Ｈと略す）の触媒作用により、触媒量のＤＬ−アラニン
（以下０Ｌ−Ａｌａと略す）とＮＡＤ”の存在下、ギ酸
、アンモニア及びα−ケト酸からＤ−アミノ酸を合成す
る方法（特願昭６１−４８２３３号）等に特に有効に使
用することができ、Ａ ｌ ａＤＨ，Ａ Ｉ ａＲおよ
びＤ−Ａ丁への調製を容易にするものである。The plasmid of the present invention can be used for the synthesis of D-amino acids shown in the following sequence, namely, A I a D l-1, D-
ATA, Al aR and Gi-Pa dehydrogenase (hereinafter referred to as FD)
A method for synthesizing D-amino acids from formic acid, ammonia and α-keto acids in the presence of catalytic amounts of DL-alanine (hereinafter abbreviated as 0L-Ala) and NAD (patent application No. No. 61-48233), etc., and facilitates the preparation of Al aDH, Al aR, and D-A D.
腹−ユアンモニア（発明の効果）本発明のプラスミドは前述したように、有用な微生物、
例えば常温で生育する細菌を形質転換することにより、
細菌にＡＩａＤＨ，ＡｌａＲ，Ｄ−ＡＴＡ生産能を同時
に賦与することができ、形質転換された細菌からＡ Ｉ
ａＤＨ，Ａ Ｉ ａＲ及びＤ−ＡＴＡを大量にかつ容
易に、しかも同時に得ることができるので、前述したＤ
−アミノ酸の製造等に非常に有用である。As mentioned above, the plasmid of the present invention can be used as a useful microorganism,
For example, by transforming bacteria that grow at room temperature,
Bacteria can be endowed with the ability to produce AIaDH, AlaR, and D-ATA at the same time, and AI
Since aDH, AI aR and D-ATA can be obtained in large quantities easily and at the same time, the above-mentioned D
-Very useful for the production of amino acids, etc.
（実施例）次に、実施例に基づいて本発明の詳細な説明するが、本
発明はこれに限定されるものではない。(Examples) Next, the present invention will be described in detail based on Examples, but the present invention is not limited thereto.
（１）耐熱性Ａ Ｉ ａＤＨをコードする遺伝子を有す
るプラスミドｐｌｃＤ１１２の調製プラスミドｐｌｃＤ１１２は、ベクターｐＢＲ３２２に
、バチルス ステアロサーモフィラスＩＦ○１２５５０
の染色体ＤＮＡ由来のＡ Ｉ ａＤＨをコードする遺伝
子を導入したプラスミドである。(1) Preparation of plasmid plcD112 having a gene encoding thermostable A I aDH Plasmid plcD112 was added to vector pBR322 using Bacillus stearothermophilus IF○12550.
This is a plasmid into which a gene encoding A I aDH derived from the chromosomal DNA of A.
後述する（７）に記載したのと同様の方法でプラスミド
ｐＩｃＤ１１２を導入したエシェリヒアコリ Ｈ８１０
１株を、５０μｇ／Ｉｄのアンピシリンを含む１Ｎのス
ーパーブロース（１ρ中にポリペプトン１５ｇ、酵母エ
キス２Ｃｌ、グリセロール５ｄ、１００ｍの１Ｍリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７，６）を含む）で３７℃、２〜
３時間培養後、クロラムフェニコール溶液（１１ｄのエ
タノールにクロラムフェニコール３４Ｉｔｇを添加）を
６−加え、更に１６時間培養した。Escherichia coli H810 into which plasmid pIcD112 was introduced by the same method as described in (7) below.
One strain was incubated at 37°C for 2 hours in 1N super broth containing 50μg/Id of ampicillin (1ρ contains 15g of polypeptone, 2Cl of yeast extract, 5d of glycerol, and 100ml of 1M potassium phosphate buffer (pH 7,6)). ~
After culturing for 3 hours, 6 hours of chloramphenicol solution (chloramphenicol 34 Itg added to 11 d of ethanol) was added, and the cells were further cultured for 16 hours.
培養後、菌体を遠心分離により回収し、溶液工（５０ｍ
Ｍグルコース、２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐｔ１８
．０） 、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５Ｎ１ｇ／ｄリゾチ
ーム）２０ｄと激しく混合し３０分間放置した。次に、
溶液１ｆ（０，２Ｎ ＮａＯＨ，１％５ＤＳ（ソデイ
ウムドデシルサルフエート））４０ｄを加え、軽く撹拌
し氷上に１０分間放置後、５Ｍ酢酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ４，８）を３０ｔｄ加え激しく撹拌して氷上に１０分
間放置した後、遠心分離によりタンパク、ＲＮＡ、およ
び染色体ＤＮＡを含む沈殿を上清と分離した。次に粗プ
ラスミドを含む上清に１１０ｍの冷エタノールを加え、
−８０℃で３０分間放置後、遠心分離によりプラスミド
ＤＮＡをエタノール沈殿として回収した。沈殿を乾燥俊
、１６ｄＴＥ （１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８
，ｏ） 、１ｍＭ ＥＤＴＡ） 、 ＩＪホヌクＬｚ
アーゼＡ （ＲＮａｓｅ Ａ１生化学工業製、１０ａｙ
／ｄ）２００μｐを加え３７℃で１時間反応させ、フェ
ノール−クロロホルム（１：１）抽出により変性タンパ
クを除去し、２倍聞のエタノールを添加して一８０℃で
３０分間放置し、プラスミドＤＮＡをエタノール沈殿と
して回収した。After culturing, the bacterial cells were collected by centrifugation and diluted with a solution (50 m
M glucose, 25mM Tris-HCl buffer (pt18
．． 0), 10mM EDTA, 5N1g/d lysozyme) 20d and left for 30 minutes. next,
Add 40d of solution 1f (0.2N NaOH, 1% 5DS (sodium dodecyl sulfate)), stir gently and leave on ice for 10 minutes, then add 5M potassium acetate buffer (p
After adding 30 td of H4,8), stirring vigorously and leaving on ice for 10 minutes, the precipitate containing protein, RNA, and chromosomal DNA was separated from the supernatant by centrifugation. Next, 110 m cold ethanol was added to the supernatant containing the crude plasmid.
After being left at −80° C. for 30 minutes, plasmid DNA was recovered as an ethanol precipitate by centrifugation. Dry the precipitate, add 16dTE (10mM Tris-HCl buffer (pH 8)
, o), 1mM EDTA), IJ Honuku Lz
Aase A (RNase A1 Seikagaku Kogyo, 10ay
/d) Add 200 μp and react at 37°C for 1 hour, remove denatured protein by extraction with phenol-chloroform (1:1), add 2 volumes of ethanol and leave at -80°C for 30 minutes to extract plasmid DNA. was recovered as an ethanol precipitate.
続いてベレット状のプラスミドを少蚤のＴＥに溶解し、
塩化セシウム（１ｄのプラスミド溶液に１ｇを添加）及
びエチジウムブロマイド（１０ｄの塩化セシウム溶液に
１０Ｑ／ｄｉのエチジウムブロマイド溶液を０．８−添
加）を加え、４５．Ｏｏｏｒｐｍで１２時間超遠心分離
し、ｃｃｃ（ｃ。Next, the pellet-shaped plasmid was dissolved in a small amount of TE,
Add cesium chloride (1 g added to 1 d of plasmid solution) and ethidium bromide (0.8-add of 10 Q/di ethidium bromide solution to 10 d of cesium chloride solution), 45. Ultracentrifuged for 12 hours at Ooorpm, ccc (c.
ｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ）
Ｄ Ｎ Ａのバンドのみを回収し、旦−ブタノール抽
出によりエチジウムブロマイドを除去した後、ＴＥに対
して充分透析し、精製ｐＩＣＤ１１２を得た。valently closed circular)
Only the DNA band was collected, ethidium bromide was removed by extraction with butanol, and then thoroughly dialyzed against TE to obtain purified pICD112.
（２）耐熱性ＡＩａＲをコードする遺伝子を有するプラ
スミドｐｌｃＲ１１３（ｐｌｃＲ４をサブクローニング
したもの）および耐熱性Ｄ−Ａ Ｔ Ａをコードする遺
伝子を有するプラスミドｐＩＣＴ１１３の調製プラスミドｐＩＣＲ１１３は、ベクターｐＢＲ３２２に
、バチルス ステアロサーモフィラスＩＦＯ１２５５０
の染色体ＤＮＡ由来のＡＩａＲをコードする遺伝子を導
入したプラスミドであり、プラスミドｐｌｃＴ１１３は
、ベクターｐｌＪｃ１８に、バチルス エスピー ＹＭ
−１の染色体ＤＮＡ由来のＤ−ＡＴＡをコードする遺伝
子を導入したプラスミドである。(2) Preparation of plasmid plcR113 (subcloned from plcR4) carrying the gene encoding thermostable AIaR and plasmid pICT113 carrying the gene encoding thermostable DATA Plasmid pICR113 was added to vector pBR322 using Bacillus stearoma. Thermophilus IFO12550
Plasmid plcT113 is a plasmid into which a gene encoding AIaR derived from the chromosomal DNA of Bacillus sp.
This is a plasmid into which a gene encoding D-ATA derived from the chromosomal DNA of -1 was introduced.
後述する（７）に記載したのと同様の方法でプラスミド
ｐＩｃＲ１１３を導入したエシェリヒアコリ Ｈ８１０
１株を、５０μｇ／ｄのアンピシリンを含む１ｇのスー
パーブロースで３７℃、２〜３時間培養後、クロラムフ
ェニコール溶液（１−のエタノールに３４Ｒｇを添加）
を６ｍ加え、更に１６時間培養した。Escherichia coli H810 into which plasmid pIcR113 was introduced by the same method as described in (7) below.
After culturing one strain in 1 g of super broth containing 50 μg/d of ampicillin at 37°C for 2 to 3 hours, incubate with chloramphenicol solution (34Rg added to ethanol of 1).
6 m was added and cultured for an additional 16 hours.
培養後、菌体を遠心分離により回収し、溶液■２０Ｉ１
１と激しく混合し３０分間放置した。次に溶液ｌＩ４０
ｍを加え、軽く撹拌し氷上に１０分間放置後、５Ｍ酢酸
カリウム緩衝液（ｐＨ４，８）を３０１ｄ加え激しく撹
拌し、氷上に１０分間放置後遠心分離によりタンパク、
ＲＮＡ、および染色体ＤＮＡを含む沈殿を上清と分離し
た。次に粗プラスミドを含む上清に１１０ＩＩｉの冷エ
タノールを加え、−８０℃、３０分放置後、遠心分離に
よりプラスミドＤＮＡをエタノール沈殿として回収した
。沈殿を乾燥後、１６ｄＴＥ、ＲＮａｓｅ Ａ２００μ
ｇを加え３７℃で１時間反応させ、フェノール−クロロ
ボルム（１：１）抽出により変性タンパクを除去し、２
倍量のエタノールを添加して一８０℃で３０分間放置し
、プラスミドＤＮＡをエタノール沈殿として回収した。After culturing, the bacterial cells were collected by centrifugation and diluted with solution ■20I1.
1 and left for 30 minutes. Then solution lI40
After stirring gently and leaving on ice for 10 minutes, add 301d of 5M potassium acetate buffer (pH 4, 8), stirring vigorously, and leaving on ice for 10 minutes, then centrifuge to remove proteins.
The precipitate containing RNA and chromosomal DNA was separated from the supernatant. Next, 110 IIi of cold ethanol was added to the supernatant containing the crude plasmid, and after being left at -80°C for 30 minutes, the plasmid DNA was recovered as an ethanol precipitate by centrifugation. After drying the precipitate, 16dTE, RNase A 200μ
g and reacted at 37°C for 1 hour, denatured protein was removed by phenol-chloroborm (1:1) extraction, and 2
A double amount of ethanol was added and the mixture was left at -80°C for 30 minutes, and the plasmid DNA was recovered as an ethanol precipitate.
続いてベレット状のプラスミドを少量のＴＥに溶解し、
塩化セシウム（１ａｄ！のプラスミド溶液に１ｇを添加
）及びエチジウムブロマイド（１０ｍの塩化セシウム溶
液にエチジウムブロマイド溶液（１０η／ｄ）０．８ｍ
を添加）を加え、４５．００Ｏｒｐｍで１２時間超遠心
分離し、ｃｃｃＤＮＡのバンドのみを回収し、旦−ブタ
ノール抽出によりエチジウムブロマイドを除去した後、
ＴＥに対して充分に透析し、精製ｐｌｃＲ１１３を得た
。また、精製ｐＩｃＴ１１３もｐｌｃＲ１１３と同様の
手順で調製した。Next, the pellet-shaped plasmid was dissolved in a small amount of TE,
Cesium chloride (1 g added to 1 ad! of plasmid solution) and ethidium bromide (0.8 m of ethidium bromide solution (10 η/d) to 10 m of cesium chloride solution)
was added) and ultracentrifuged at 45.00 rpm for 12 hours to collect only the cccDNA band, and then ethidium bromide was removed by butanol extraction.
Purified plcR113 was obtained by thorough dialysis against TE. In addition, purified pIcT113 was also prepared using the same procedure as plcR113.
（３）プラスミドｐｌｃＤ１１２のＥｃｏＲＶ−＠ ｉ
ｎｄｌｌ［断片の調製（１）で得られたｐＩＣＤ１１２ ４０μびを制限酵素
Ｈｉｎｄｌ［（宝酒造社製）４０Ｕを含む＠ ｉ ｎｄ
ＤＩ用緩衝波緩衝液ｉＨトリス−塩酸！１［Ｉ液（ｐｌ
−１７，５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２．６０ｍＭＮａＣ
ｌ ）３００１１１中で３時間反応させ、５ＭＮａ１ｌ
３μｇ、冷エタノール６５０μｍを添加し、遠心分
離によりＤＮＡをエタノール沈殿として回収した。回収
したＤＮＡベレットを２０μ４１ ノＴＥ１．−溶解し
、４０Ｕ（７）制限酵素ＥＣ０ＲＶ（宝酒造社製）を含
むＥｃｏＲＶ用緩衝液（１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７，５） 、７ｍＭＭａＣｌ 、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール牛血清アルブミン（ＢＳＡ））３００μρ中で３７℃、
３時間反応させ、冷エタノール６００μｍを添加し遠心
分離することにより、ＤＮＡをエタノール沈殿として回
収した。このＤＮＡを２０μρのＴＨに溶解し、０．７
％Ｌ Ｍ Ｐ （ ｌｏｗ ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎ
ｔ ）アガロース（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ ＬａｂＯｒａｔＯｒｉｅＳ製）を用いて４℃にお
いて１００ｖで５〜６時間電気泳動を行い、Ａ ｌ ａ
ＤＨをコードする遺伝子を含有する１．４ＫｂのＨｉｎ
ｄＩ［Ｉ−ＥＣＯＲＶ断片を分離し、この断片を含むア
ガロースを切り取り、５倍容母のＴＥを加え６５℃で５
分間加熱してアガロースを溶解した。この溶液を、フェ
ノール抽出、フェノール−クロロホルム（１：１）抽出
、クロロホルム抽出を各１回行った後、エタノール沈殿
としてＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を少量の
ＴＥに溶解し、逆相液体クロマトグラフィー（ＮＥＮＳ
ＯＲＢ”２０、デュポン製）により精製し、５０％メタ
ノールで溶出し、乾固した後２０μｇのＴＨに溶解し、
プラスミドｐｌｃＤ１１２の精製ＥＣ０ＲＶ−Ｈｔｎｄ
Ｉ［ｌ断片を調製した。(3) EcoRV-@i of plasmid plcD112
ndll [40 μ of pICD112 obtained in fragment preparation (1) and restriction enzyme Hindl [(manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) containing 40 U @ i nd
DI buffer wave buffer iH Tris-HCl! 1 [I solution (pl
-17,5), 7mM MgCl2.60mM NaC
l) React for 3 hours in 300111, add 1 l of 5M Na
3 μg and 650 μm of cold ethanol were added, and the DNA was recovered as an ethanol precipitate by centrifugation. The recovered DNA pellet was transferred to 20μ41 TE1. - EcoRV buffer (10mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 7mM MaCl, 150mM
NaCl, 7mM 2-mercaptoethanol bovine serum albumin (BSA)) at 37°C in 300μρ;
After reacting for 3 hours, 600 μm of cold ethanol was added and centrifuged to recover DNA as an ethanol precipitate. This DNA was dissolved in 20μρ of TH and 0.7
%L M P (low melting point
t) Agarose (Bethesda Research)
Electrophoresis was performed at 100 V for 5 to 6 hours at 4°C using a
1.4 Kb Hin containing the gene encoding DH
Isolate the dI[I-ECORV fragment, cut out the agarose containing this fragment, add 5 volumes of mother TE, and incubate at 65°C for 50 minutes.
The agarose was dissolved by heating for a minute. This solution was subjected to phenol extraction, phenol-chloroform (1:1) extraction, and chloroform extraction once each, and then DNA fragments were recovered as ethanol precipitation. This DNA fragment was dissolved in a small amount of TE and subjected to reverse phase liquid chromatography (NENS
ORB"20, manufactured by DuPont), eluted with 50% methanol, dried, and then dissolved in 20 μg of TH.
Purification of plasmid plcD112 EC0RV-Htnd
The I[l fragment was prepared.
（４）プラスミドＤＩＣＲ１１３のＥＣＯＲＩ −３ａ
ｃ ｌ断片の調製（２）で得られたｐｌｃＲ１１３４０μ９を、制限酵素
５ａｃｌ（宝酒造社製）３００ＬＪを含むＳａｃ Ｉ用
緩衝液（１０ｍＭ トリス−塩酸！Ｉ衝液（ｐＨ８，
０） 、７ｍＭ ＩＶｔｇｃ ＋ 、７ｍＭ ２
−ＭＥ、０．０１％ＢＳＡ）４００μｍ中で５時間反応
させ消化した後、５Ｍ ＮａＣ１８μｐ１冷工タノー
ル８５０μｍを添加し、遠心分離によりＤＮＡをエタノ
ール沈殿として回収した。回収したＤＮＡベレットを２
０μｍのＴＥに溶解し、１５０Ｕの制限酵素ＥＣ０ＲＩ
（宝酒造社製）を含むＥＣＯＲＩ用ｍｌ液（５０ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（ｐｆ１７．５） 、７ｍＭ
ＭＯＣＩ 、１００ｍＭ ＮａＣＩ 、７ｍＭ
２−ＭＥ、０．０１％ＢＳＡ）４００μｍ中で３７℃、
５時間反応させ、冷エタノール８００μｍを添加するこ
とにより、ＤＮＡをエタノール沈殿として回収した。こ
のＤＮＡを２０μｍのＴＥに溶解し、０．７％ＬＭＰア
ガロースを用いて４℃において１００ｖで５〜６時間電
気泳動を行い、ＡＩａＲをコードする遺伝子を有する１
、９ＫｂのＥｃｏＲｌ−３ａｃ ｌ断片を分離し、この
断片を含むアガロースを切り取り、５倍容量のＴＥを加
え６５℃で５分間加熱してアガロースを溶解した。この
溶液を、フェノール抽出、フェノール−クロロホルム（
１：１）抽出、クロロホルム抽出を各１回行いエタノー
ル沈殿としてＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を
少量のＴＥに溶解し、逆相液体クロマトグラフィーによ
りＩＩ製し、５０％メタノールで溶出した後、乾固して
プラスミドｐＩｃＲ１１３の精製ＥｃｏＲｌ−３ａｃ
Ｉ断片ｅａｓｔ、た。(4) ECORI-3a of plasmid DICR113
The plcR11340μ9 obtained in preparation of the cI fragment (2) was added to a Sac I buffer (10mM Tris-HCl!I buffer (pH 8,
0), 7mM IVtgc + , 7mM 2
-ME, 0.01% BSA) After reaction and digestion in 400 μm for 5 hours, 850 μm of 5M NaC 18 μp1 cold ethanol was added, and the DNA was recovered as an ethanol precipitate by centrifugation. 2 recovered DNA pellets
150 U of restriction enzyme EC0RI dissolved in 0 μm TE
ml solution for ECORI (50mM) containing (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.)
Tris-HCl buffer (pf17.5), 7mM
MOCI, 100mM NaCI, 7mM
2-ME, 0.01% BSA) at 37°C in 400 μm;
After reacting for 5 hours, 800 μm of cold ethanol was added to collect the DNA as an ethanol precipitate. This DNA was dissolved in 20 μm TE and electrophoresed using 0.7% LMP agarose at 100 V for 5 to 6 hours at 4°C.
, a 9 Kb EcoRl-3acl fragment was separated, the agarose containing this fragment was cut out, 5 times the volume of TE was added, and the agarose was dissolved by heating at 65° C. for 5 minutes. This solution was extracted with phenol, phenol-chloroform (
1:1) extraction and chloroform extraction were performed once each, and the DNA fragments were recovered as ethanol precipitation. This DNA fragment was dissolved in a small amount of TE, purified by reverse phase liquid chromatography, eluted with 50% methanol, and dried to obtain purified EcoRl-3ac plasmid pIcR113.
I fragment east, t.
（５）プラスミドｐＩｃＴ１１３のＥＣ０ＲＩ−ｓａｃ
を断片の調製（２）で得られたプラスミドｐｌｃＴ１１３３０μ９を
Ｓａｃ ｌ３００Ｕを含む５ａＣ１用緩衝液４００μｍ
中で３７℃で５時間反応させ消化した後、５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ ８Ｍｇ１冷エタノール８５０μｐを添加し、遠
心分離によりＤＮＡをエタノール沈殿として回収した。(5) EC0RI-sac of plasmid pIcT113
Plasmid plcT11330μ9 obtained in fragment preparation (2) was added to 400μm of 5aC1 buffer containing 300U of Sac1.
After reaction and digestion at 37°C for 5 hours, 5M Na
850 μp of Cl 8 Mg 1 cold ethanol was added, and the DNA was recovered as an ethanol precipitate by centrifugation.
回収したＤＮＡベレットを２０μｍのＴＥに溶解し、Ｅ
ＣＯＲ（１５０Ｕを含むＥＣ０ＲＩ用緩衝液４００μｐ
中で５時間反応させ消化した後、８００μｇの冷エタノ
ールを添加し遠心分離によりＤＮＡをエタノール沈殿と
して回収した。The recovered DNA pellet was dissolved in 20 μm TE and E
EC0RI buffer 400μp containing COR (150U)
After reaction and digestion for 5 hours in the DNA, 800 μg of cold ethanol was added and the DNA was recovered as an ethanol precipitate by centrifugation.
このプラスミドｐＩＣＴ１１３のＥ ＣＯＲＩ −３ａ
ｃ ｌ断片はベクターＩＪｃＩ ８由来の部分である。E CORI-3a of this plasmid pICT113
The cl fragment is derived from vector IJcI8.
（６）プラスミドｐＩＣＴ１１３のＥＣ０ＲＩ−８ａｃ
ｌ断片とプラスミドｐＩＣＲ１１３の１亙ＯＲｌ−８
ａｃ Ｉ断片ノ連結（５）でｍ製したベクターｐＬＩｃ１Ｂ由来の部分であ
るｐＩｃＴ１１３のＥＣＯＲｌ−８ａｃ １断片を２０
μρのＴＥに溶解し、（４）で調製したｐＩＣＲ１１３
のＥｃｏＲｌ−８ａｃ ｌ断片を２０μｇのＴＥに溶解
した。ｐｌｃＴ１１３の旦ｃｏＲｌ−３ａｃ ｌ断片溶
液１．１！、ｐＩＣＲ１１３のＥＣＯＲｌ−８ａｃ Ｉ
の断片溶液８μｍをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）
７００ｔＪを含むＴ４ＤＮＡリガーゼ用緩衝液（６６ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（＋）１１７．６） 、６．６ｍ
Ｍ ＩｖｌＣ！□、１０ｍＭ ジチオスライトール
（ＤＴＴ）、１ｅＨＡＴＰ）２０μｐ中で一晩反応させ
ＤＮＡ断片を連結した。(6) EC0RI-8ac of plasmid pICT113
l fragment and 1 ORl-8 of plasmid pICR113
The ECORl-8ac 1 fragment of pIcT113, which is the part derived from the vector pLIc1B prepared by ligation of the ac I fragment (5), was
pICR113 prepared in (4) by dissolving in μρ TE
The EcoRl-8acl fragment was dissolved in 20 μg of TE. plcT113 coRl-3acl fragment solution 1.1! , ECORl-8ac I of pICR113
8 μm of the fragment solution was treated with T4 DNA ligase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.).
T4 DNA ligase buffer containing 700tJ (66m
M Tris-HCl buffer (+) 117.6), 6.6m
M IvlC! □, 10mM dithiothreitol (DTT), 1eHATP) was reacted overnight in 20 μp to ligate the DNA fragments.
（７）（６）で連結したＤＮＡによるエシェリヒア コ
リ ＨＢＩＯＩの形質転換エシェリヒア コリ ＨＢｌｏｌを１００ａｄ！のＹＴ
培地（ポリペプトン１ｇ、酵母エキス０．５９、ＮａＣ
ｌ０．５ｇを含む１００ｍ（７）培地、ｐＨ７，２）で
２〜３時間培養し、遠心分離により菌体を回収して冷１
００ｍＭ ＭａＣＩ□で洗浄後、冷１００ｍＭ Ｃ
ａＣｌ□に懸濁し１時間氷上に放置した。次に遠心分離
により上清を除去後、冷１００ｍＭ ＣａＣｌ２５ｄ
に再懸濁し、コンピテントセルとした。(7) Transformation of Escherichia coli HBIOI with the DNA ligated in (6) 100ad of Escherichia coli HBlol! YT of
Medium (polypeptone 1g, yeast extract 0.59, NaC
Cultured for 2 to 3 hours in 100m (7) medium containing 0.5 g of chloride, pH 7.2), collected by centrifugation, and cooled.
After washing with 00mM MaCI□, cold 100mM C
It was suspended in aCl□ and left on ice for 1 hour. Next, after removing the supernatant by centrifugation, add cold 100mM CaCl25d
The cells were resuspended in the cellulose and used as competent cells.
次に（６）で得られた連結したＤＮＡ溶液１０μｍとコ
ンピテントセル懸濁液２００μｍを０℃で混合し、時々
撹拌しながら氷上に６０分間放置した侵、４２℃で２分
間放置し、氷上で急冷した。Next, 10 μm of the ligated DNA solution obtained in (6) and 200 μm of the competent cell suspension were mixed at 0°C and left on ice for 60 minutes with occasional stirring. It was rapidly cooled.
次にこの懸濁液に１１！１のＹＴ培地を加え、３７℃で
１時間振盪培養した後、アンピシリン含有（５０μ９／
ｍｅ）ＹＴ−寒天培地（寒天２０ｇ／ｊ１）にブレーテ
ィングし、３７℃で一晩培養し、形成したコロニーをア
ンピシリン含有ＹＴ−寒天培地に再ブレーティングし、
３７℃で一晩培養して得られたコロニーを形質転換株と
した。Next, 11!1 YT medium was added to this suspension, and after culturing with shaking at 37°C for 1 hour, ampicillin-containing (50μ9/
me) Blating on YT-agar medium (agar 20g/j1), culturing at 37°C overnight, re-plating the formed colonies on YT-agar medium containing ampicillin,
Colonies obtained by culturing overnight at 37°C were used as transformed strains.
（８）目的とするプラスミドを保有する形質転換株の選
択（７）で得られた１５個の形質転換株より１０株をアン
ピシリン含有（１００μｇ／ｍ）ＹＴ培地５Ｉｄで一晩
培養し、該株から（１）と同様の方法に従い、小スケー
ルで各プラスミドを単離した。(8) Selection of transformants harboring the desired plasmid Ten of the 15 transformants obtained in (7) were cultured overnight in YT medium 5Id containing ampicillin (100 μg/m). Each plasmid was isolated on a small scale according to the same method as in (1).
これらのプラスミドを（４）の方法に従いＥＣ０ＲＩお
よびＳａｃ Ｉで消化したところ、全てのプラスミドが
、それぞれ１ケ所ずつ切られて約４゜５Ｋｂの単一なバ
ンドを生じた。また、ＥＣ０ＲＬ Ｓａｃ Ｉのダブル
消化により、約２．７Ｋｂと約１．９Ｋｂの２本のバン
ドを生じたことより、すべてのプラスミドが、ベクター
ｐＵｃ１８由来の部分であるｐｌｃＴ１１３のＥＣＯＲ
Ｉ−比Ａｃｌ断片とＡＩａＲをコードする遺伝子を有す
るｐｌｃＲ１１３のＥｃｏＲｌ−８ａｃ Ｉ断片が１つ
ずつ結合したものであることがわかった。これらのプラ
スミドをｐｌｃＲ１１４とした。When these plasmids were digested with ECORI and Sac I according to the method described in (4), all plasmids were cut at one site each, resulting in a single band of about 4.5 Kb. Furthermore, double digestion of EC0RL Sac I produced two bands of approximately 2.7 Kb and approximately 1.9 Kb, indicating that all plasmids contained ECOR of plcT113, which is a portion derived from vector pUc18.
It was found that one I-ratio Acl fragment and one EcoRl-8ac I fragment of plcR113 having the gene encoding AIaR were combined. These plasmids were named plcR114.
（９）プラスミドｐｌｃＴ１１３のＥＣ０ＲＩ−ＥＣＯ
ＲＩ断片の調製（２）で得られたｐＩＣＴ１１３ ４０μ９をＥｃｏＲ
Ｉ １５０Ｕを含むＥＣＯＲＩ用緩衝液４００μβ中
で３７℃、５時間反応させ消化した後、冷エタノール８
００μｍ添加し遠心分離によりエタノール沈殿として回
収した。このＤＮＡを２０μｍのＴＥに溶解し、（３）
と同様にしてＬＭＰアガロース電気泳動により分離後、
Ｄ−ＡＴＡをコードする遺伝子を有する約１．７Ｋｂの
ＤＮＡ断片を切り出し、（４）と同様にして精製し、２
０μｍのＴＥに溶解してプラスミドｐＩＣＴ１１３のＥ
ｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片溶液を得た。(9) EC0RI-ECO of plasmid plcT113
pICT113 40μ9 obtained in RI fragment preparation (2) was
After reaction and digestion at 37°C for 5 hours in 400 μβ of ECORI buffer containing 150 U of I, cold ethanol 8
00 μm was added and collected as an ethanol precipitate by centrifugation. This DNA was dissolved in 20 μm TE, (3)
After separation by LMP agarose electrophoresis in the same manner as
An approximately 1.7 Kb DNA fragment containing the gene encoding D-ATA was excised and purified in the same manner as in (4).
Plasmid pICT113 was dissolved in 0 μM TE.
A coRI-EcoRI fragment solution was obtained.
（１０）プラスミドｐｌｃＲ１１４のＥＣＯＲＩによる
消化（８）で調製したｐＩＣＲ１１４の一部（約４μｇ）を
、１０ＵのＥｃｏＲＩを含むＥｃｏＲＩ用緩衝液５０μ
ρ中で３７℃、５時間反応させ消化した後、２００μｍ
の冷エタノールを添加し、遠心分離によりエタノール沈
殿として回収し、１０μｍのＴＥに溶解してプラスミド
ｐＩＣＲ１１４のＥｃｏＲＩ消化物溶液を得た。(10) Digestion of plasmid plcR114 with ECORI A portion (approximately 4 μg) of pICR114 prepared in (8) was added to 50 μg of EcoRI buffer containing 10 U of EcoRI.
After reaction and digestion in ρ for 5 hours at 37°C, 200 μm
of cold ethanol was added, the ethanol precipitate was collected by centrifugation, and dissolved in 10 μm TE to obtain an EcoRI digest solution of plasmid pICR114.
（１１）プラスミドｐｌｃＴ１１３のＥｃｏＲＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片とｐｌｃＲ１１４のＥ ＣＯＲ１消化物との
連結（９）で調製したプラスミドｐｌｃＴ１１３のＥｃｏＲ
Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片溶液８μｐと、（１０）で調製した
ｐＩｃＲ１１４のＥ ＣＯＲ１消化物溶液０．５μ」と
をＴ４ＤＮＡリガーゼ７ＯＯＵを含むＴ４ＤＮＡリガー
ゼ用緩衝液２０μｐ中で、１６℃−晩反応させＤＮＡ断
片を連結した。(11) EcoRI-Ec of plasmid plcT113
EcoR of plasmid plcT113 prepared by ligating the oRI fragment with the E COR1 digest of plcR114 (9)
8 μp of the I-EcoRI fragment solution and 0.5 μp of the pIcR114 E COR1 digest solution prepared in (10) were reacted overnight at 16°C in 20 μp of T4 DNA ligase buffer containing 70OU of T4 DNA ligase, and the DNA fragments were obtained. Connected.
（１２）（１１）で連結したＤＮＡによるエシェリヒア
コリ ＨＢｌｏｌの形質転換（７）と同様にして［４したコンピテントセル２００μ
ｍと（１１）で連結したＤＮＡを含む反応液１０μ」と
を混合し、（７）と同様にして形質転換株を得た。(12) Transformation of Escherichia coli HBLol with the DNA ligated in (11) [4] Transformation of Escherichia coli HBLol using 200μ
m and 10μ of the reaction solution containing the DNA linked by (11) were mixed to obtain a transformed strain in the same manner as in (7).
（１３）Ｄ−Ａ’Ｔ’Ａ活性を有する形質転換株の選択（１２）で得られた約２０００個の形質転換株のうち１
６８個のコロニーを５００μρの緩衝液Ｉ（１０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，２）、０．０１％２
−ＭＥ、５０ＵＭピリドキサールー５゛−リン酸（ＰＬ
Ｐ））に懸濁し、３０秒間超音波破砕したものを酵素液
としてＤ−ＡＴＡ活性を測定した。(13) Selection of transformed strains having D-A'T'A activity (12) 1 out of approximately 2000 transformed strains obtained in (12)
68 colonies were added to 500μρ of Buffer I (10mM
Potassium phosphate buffer (pH 7,2), 0.01%2
-ME, 50UM pyridoxal-5'-phosphate (PL
D-ATA activity was measured using an enzyme solution that was suspended in P)) and disrupted by ultrasonication for 30 seconds.
＜ｐ−ＡＴＡ活性の測定方法〉トリス−塩酸緩衝液（１）８８．１ ）５０Ｕｍｏ Ｉ
、ＰＬＰ５０ｎｍ’ｏ Ｉ 、ａ−ケトグルタル酸１０
μｍｏｌ、Ｄ−アラニン２５μｍｏｌζ乳駁脱水素酵素
＜ＬＤＨ，ベーリンガーマンハイム山之内Ｉｊ）５ｔＪ
、ＮＡＤ）−１０，２μｍｏｌ及び酵素を含む１−の反
応液を５０℃でキュベツト中で反応させ、ＮＡＤＨの減
少に由来する３４０ｎｍの吸光度の減少を測定した。尚
１Ｕはこの条件下１分間に１μｍｏｌのＮＡＤ）（の減
少を触媒する酵素量とした。上記方法に従って１６８個
のコロニーのＤ−ＡＴＡ活性を測定した結果、２つのコ
ロニーにＤ−ＡＴＡ活性が認められた。<Method for measuring p-ATA activity> Tris-HCl buffer (1) 88.1 ) 50 Umo I
, PLP50nm'o I , a-ketoglutaric acid 10
μmol, D-alanine 25 μmolζ Milk dehydrogenase <LDH, Boehringer Mannheim Yamanouchi Ij) 5tJ
A reaction solution of 1- containing 10.2 μmol of NADH) and the enzyme was reacted in a cuvette at 50° C., and the decrease in absorbance at 340 nm due to the decrease in NADH was measured. In addition, 1 U is the amount of enzyme that catalyzes the decrease of 1 μmol of NAD per minute under these conditions.As a result of measuring the D-ATA activity of 168 colonies according to the above method, two colonies showed no D-ATA activity. Admitted.
（１４）Ｄ−ＡＴＡ活性保持株のプラスミドの確認（１３）で選択した２株から（１）と同様にして小スケ
ールでプラスミドを単離した。これらのプラスミドを、
５ａＣＩで消化したところ約６゜２Ｋｂの単一のバンド
を生じ、ＥｃｏＲＩで消化したところｐＩＣＲ１１４の
ＥＣＯＲＩ消化物と同じ約４．５Ｋｂのバンドおよびｐ
ＩＣＴ１１３のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片と同じ約１
．７にｂのバンドを生じた。またＥＣＯＲＩとＳａｃ
Ｉのダブル消化によりｐｌｃＴ１１３のＥｃｏＲＩ−Ｅ
ＣＯＲＩＣＯＲ間じ約１．７Ｋｂのバンド、ｐＩＣＲ１
１４のＥｃｏＲｌ−８ａｃ Ｉ断片と同じ約１，９Ｋｂ
のバンドおよびｐｌｃＴ１１３のＥｃｏＲｌ−８ａｃ
Ｉ断片と同じ約２．７Ｋｂのバンドを生じたことから、
これらのプラスミドは、ｐｌｃＲ１１４のＥＣＯＲＩ消
化物にｐＩｃＴ１１３のＥＣＯＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片が
結合したものであることがわかった。(14) Confirmation of plasmids in strains retaining D-ATA activity Plasmids were isolated on a small scale from the two strains selected in (13) in the same manner as in (1). These plasmids,
Digestion with 5aCI yielded a single band of approximately 6°2 Kb, and digestion with EcoRI yielded a band of approximately 4.5 Kb, the same as the ECORI digest of pICR114, and pICR114.
Approximately 1 same as EcoRI-EcoRI fragment of ICT113
．． 7, a band b was generated. Also ECORI and Sac
EcoRI-E of plcT113 by double digestion of I
Approximately 1.7 Kb band between CORICOR, pICR1
Approximately 1,9 Kb same as the EcoRl-8ac I fragment of 14
band and EcoRl-8ac of plcT113
Since it produced a band of approximately 2.7 Kb, which is the same as the I fragment,
These plasmids were found to be the ECORI-EcoRI fragment of plcT113 fused to the ECORI-digested product of plcR114.
これらのプラスミドをｐＩＣＲＴｌｌｌとした。These plasmids were named pICRTll.
よって、得られたプラスミドｐｌｃＲＴ１１１はＡｌａ
Ｒをコードする遺伝子と、Ｄ−ＡＴＡをコードする遺伝
子とを同時に有するプラスミドである。Therefore, the obtained plasmid plcRT111 is Ala
This is a plasmid that simultaneously contains a gene encoding R and a gene encoding D-ATA.
プラスミドｐｌｃＲＴ１１１の制限酵素切断地図を第１
図に示す。The restriction enzyme cleavage map of plasmid plcRT111 is
As shown in the figure.
（１５）プラスミドｐＩＣＲＴ１１１の調製前述した方
法で、ｐｌｃＲＴｌｌｌにより形質転換されたエシェリ
ヒア コリ Ｈ８１０１株から、精製ｐｌｃＲＴ１１１
を調製した。(15) Preparation of plasmid pICRT111 Purified plcRT111 was purified from Escherichia coli H8101 strain transformed with plcRTll by the method described above.
was prepared.
（１６）プラスミドｐＩＣＲＴ１１１のＨｉｎｄｍ−８
ｍａＩ断片の調製プラスミドｐＩＣＲＴ１１１ ５μ９をＳｍａ工 ２０
Ｕ（宝酒造社製）を含む３ｍａ工用緩衝液（１０ｍＭト
リス−塩Ｍ ’Ｉｌｉ ｄｉ液（１）Ｉ（８，０） 、
７＋ｎＨＭｇｃＩ 、２０ｍＭ ＫＣＩ、７ｍＭ
２−ＭＥ、０．０１％ＢＳＡ）５０Ｕｇ中で３７℃で
５時間反応さ゛せ消化した後、５Ｍ ＮａＣ１１μｐ
１冷エタノール１００μｍを添加し、遠心分離によりＤ
ＮＡをエタノール沈殿として回収した。(16) Hindm-8 of plasmid pICRT111
Preparation of maI fragment Plasmid pICRT111 5μ9 was transformed into SmaI fragment 20
3ma engineering buffer (10mM Tris-salt M'Ili di solution (1) I(8,0) containing U (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.),
7+nHMgcI, 20mM KCI, 7mM
After reaction and digestion in 50 Ug of 2-ME, 0.01% BSA at 37°C, 11 μp of 5M NaC.
1 Add 100 μm of cold ethanol and remove by centrifugation.
NA was recovered as an ethanol precipitate.
回収したＤＮＡペレットを２０μｐのＴＥに溶解し、Ｈ
ｉｎｄＤＩ ２０ＬＩを含む）ｌｉｎｄｌＩＩ用緩衝
液５０μｍ中で５時間反応させ消化した後、５ＭＮａＣ
ｌ Ｏ，５ｕｌ、エタノール１００μＡを添加し遠心
分離によりＤＮＡをエタノール沈殿として回収した。The collected DNA pellet was dissolved in 20μp TE and
After reaction and digestion for 5 hours in 50 μm of lindlII buffer (containing 20LI of indDI), 5M NaC
1 O, 5 ul, and 100 μA of ethanol were added, and the DNA was recovered as an ethanol precipitate by centrifugation.
回収したＤＮＡベレットを２０μρのＴＥに溶解し、ｐ
ＩｃＲＴｌｌｌのＨｉ ｎｄｌｌｌ−８ｍａＩ断片溶液
とした。The recovered DNA pellet was dissolved in 20 μρ TE and p
A Hindllll-8maI fragment solution of IcRTllll was prepared.
（１７）プラスミドｐＩＣＤ１１２の）ｌ ｉ ｎｄｌ
［−ＥＣＯＲＶ断片とプラスミドｐＩＣＲＴ１１１（７
）Ｈｉ ｎｄｌｌｒ−８ｍａＩ断片の連結（３）で調製
したｐＩＣＤ１１２のＨｉｎｄｌ［［−ＥＣＯＲＶ断片
溶液１０／、１と（１６〉でＷ４製したｐｌｃＲＴｌｌ
ｌのＨｉ ｎｄＩ［Ｉ−８ｍａＩ断片溶液１０μρをＴ
４ＤＮＡリガーゼ７００Ｕを含むＴ４ＤＮΔリガーゼ用
緩衝液３０μρ中で一晩反応させ、ＤＮＡ断片を連結し
た。(17) of plasmid pICD112)
[-ECORV fragment and plasmid pICRT111 (7
) Hindllr-8maI fragment ligation (3) pICD112 Hindl[[-ECORV fragment solution 10/, 1 and plcRTll prepared in W4 with (16>
Add 10μρ of HindI[I-8maI fragment solution to T
The DNA fragments were ligated by reacting overnight in 30 μρ of T4DNA ligase buffer containing 700 U of 4DNA ligase.
（１８）＜１７）で連結した［）ＮＡによるエシェリヒ
ア コリ Ｈ８１０１の形質転換エシェリヒア コリ ＨＢｌｏｌを１００ｊ１１！のＹ
Ｔ培地で２〜３時間培養し、遠心分離により菌体を回収
した。次に、菌体を冷１００ｍＭ ＭａＣｌ で洗浄
後、冷１００ ｍ Ｍ Ｃａ Ｃ＋ ２に懸濁し、１
時間氷上に放置した。次に遠心分離により上清を除去後
、冷１００ｍＭ Ｃａ０１２５ｍに再懸濁し、コンピ
テントセルとした。Transformation of Escherichia coli H8101 with [)NA ligated with (18)<17) Escherichia coli HBlol was transformed into 100j11! Y of
The cells were cultured in T medium for 2 to 3 hours, and the cells were collected by centrifugation. Next, the bacterial cells were washed with cold 100mM MaCl, suspended in cold 100mM CaC+2, and
Leave on ice for an hour. Next, after removing the supernatant by centrifugation, the cells were resuspended in cold 100mM Ca0125m to obtain competent cells.
（１７）で得られた連結したＤＮＡ溶液５μｍとコンピ
テントセル懸濁液２００μｐ＠Ｏ℃で混合し、時々撹拌
しながら氷上に６０分間装いた後、４２℃で２分間放置
し、氷上で急冷した。次にこの懸濁液に１１１１のＹＴ
培地を加え、３７℃で１時間振盪培養した後、アンピシ
リン含有（５０μグ／１ｄ）ＹＴ−寒天培地（寒天２０
ｇ／４１）にブレーティングし、３７℃で一晩培養し、
形成したコロニーをアンピシリン含有ＹＴ−寒天培地に
再ブレーティングし、３７℃で一晩培養して得られたコ
ロニーを形質転換株とした。Mix 5 μm of the ligated DNA solution obtained in (17) and 200 μp of the competent cell suspension at 0°C, place on ice for 60 minutes with occasional stirring, leave at 42°C for 2 minutes, and quench on ice. did. Next, add 1111 YT to this suspension.
After adding the medium and culturing with shaking at 37°C for 1 hour, YT-agar medium containing ampicillin (50 μg/1 d) (Agar 20
g/41), cultured overnight at 37°C,
The formed colonies were replated on YT-agar medium containing ampicillin, and the colonies obtained by culturing overnight at 37°C were used as transformed strains.
（１９ン目的とするプラスミドを保有する形質転換株の
選択１）ＡＩａＤＨの活性染色フィルター（東洋濾紙社製Ｎｏ、５Ｃ）上に（１８）で
得られた形質転換株のレプリカを作成し、プロシーディ
ング オブ ナチュラル アカデミ−オブ サイエンス
オブ ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ） ７２． ２２
７４−２２７８ （１９７５）記載の方法に従い、５０
ｍＭ グリシン−ＫＣＩ−ＫＯＨ緩衝液（１）Ｈ９，Ｏ
）、５０ｍＭ Ｌ−アラニン、１．３ｍＭ ＮＡＤ
＋、０．１２８ｍＭフェナジンメトサルフェート（ＰＭ
Ｓ）、０．４８ｍＭニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢ
Ｔ）を含む反応液２ａｌｔと反応させ、発色によりＡ
ｌ ａＤＨ活性を有する形質転換株を見分け、分離した
。(19) Selection of a transformed strain carrying the desired plasmid 1) Create a replica of the transformed strain obtained in (18) on an AIaDH active staining filter (No. 5C, manufactured by Toyo Roshi Co., Ltd.), and perform the procedure. Academy of Natural Sciences (Proc. Natl.
8cad, Sci, USA) 72. 22
74-2278 (1975), 50
mM glycine-KCI-KOH buffer (1) H9,O
), 50mM L-alanine, 1.3mM NAD
+, 0.128mM phenazine methosulfate (PM
S), 0.48mM Nitro Blue Tetrazolium (NB
T) was reacted with reaction solution 2alt containing A.
A transformed strain having laDH activity was identified and isolated.
２）プラスミドの確認１）で得られたＡ ｌ ａＤＨ活性保有株のうちの６株
をアンピシリン含有（１００μｇ／ａｉり ＹＴ培地５
Ｍ！で一晩培養し、（１）と同様の方法に従い、小スケ
ールで各プラスミドを単離した。2) Confirmation of plasmid 6 of the A1 aDH activity-bearing strains obtained in 1) were placed in YT medium 5 containing ampicillin (100 μg/ai).
M! The cells were cultured overnight, and each plasmid was isolated on a small scale according to the same method as in (1).
これらのプラスミドを（３）の方法に従いＨｉ ｎｄｌ
ｌｌ″Ｃ＆消化したところ、全てのプラスミドが、各１
ケ所切られ約７．６Ｋｂの単一なバンドを生じた。また
、ＥＣＯＲＩ消化により約５．９Ｋｂのバンドおよびｐ
ＩＣＴ１１３のＥｃｏＲＩ−ＥｃＯＲＩ断片と同じ約１
．７Ｋｂのバンドを生じた。These plasmids were transformed into Hindl according to method (3).
Upon digestion, all plasmids were
A single band of approximately 7.6 Kb was obtained. Furthermore, ECORI digestion revealed a band of approximately 5.9 Kb and p
Approximately 1 same as the EcoRI-EcORI fragment of ICT113
．． A 7 Kb band was generated.
ＥｃｏＲＬ Ｓａｃ Ｉのダブル消化では、上記的１．
７Ｋｂのバンド、ｐＩＣＲ１１３のＥｃｏＲｌ−８ａＣ
Ｉ断片と同じ約１．９Ｋｂのバンド、および約４．１Ｋ
ｂのバンドを生じた。For double digestion of EcoRL Sac I, 1.
7 Kb band, EcoRl-8aC of pICR113
A band of approximately 1.9 Kb, the same as the I fragment, and a band of approximately 4.1 K
A band of b was generated.
Ｋｐｎ Ｉ、Ｈｉ ｎｄＩ［Ｉのダブル消化では、ｐＩ
ＣＲＴＩ １１の挽且工１ 、Ｈｉ ｎ ｄ ｍ消化物
と同じ約６．２Ｋｂのバンド、およびｐＩＣＤ１１２の
ＥｃｏＲＶ−Ｈｉ ｎｄｌｆｆ断片と同じ約１，４Ｋｂ
のバンドを生じた。In double digestion of Kpn I, Hin dI[I, pI
Reconstruction 1 of CRTI 11, approximately 6.2 Kb band same as Hindm digest, and approximately 1,4 Kb same as EcoRV-Hindlff fragment of pICD112.
This resulted in a band of
以上のことから、これらのプラスミドは、ｐＩＣＲＴＩ
１１の＠ ｉ ｎｄｌｌＩ−８ｍａ Ｉ、断片とＤＩ
ＣＤ１１２のＥＣ０ＲＶ−Ｈｉ ｎｄｌｌ断片断とが結
合したものであることが分かった。From the above, these plasmids are pICRTI
11 @i ndllI-8ma I, fragment and DI
It was found that the fragment was bound to the EC0RV-Hindll fragment of CD112.
これらプラスミドをｐｌｃＤＲＴｌｌｌとした。These plasmids were named plcDRTlll.
よって、得られたプラスミドｐｌｃＤＲＴ１１１はＡＩ
ａＲをコードする遺伝子、Ｄ−ＡＴＡをコードする遺伝
子および△ｌ ａＤＨをコードする遺伝子を有するプラ
スミドである。Therefore, the obtained plasmid plcDRT111 is AI
This is a plasmid having a gene encoding aR, a gene encoding D-ATA, and a gene encoding Δl aDH.
プラスミドｐｌｃＤＲＴ１１１の制限酵素切断地図を第
２図に示す。A restriction enzyme cleavage map of plasmid plcDRT111 is shown in FIG.
（２０）Ａ Ｉ ａＤＨ，Ａ Ｉ ａＲＳＤ−ＡＴＡ活
性の測定プラスミドｐＵＣＩ ８、ｐＩｃＤ１１２、ｐＩＣＲ１
１４、ｐＩＣＴ１１３、ｐｌｃＲＴｌｌｌおよびｐＩＣ
ＤＲＴｌｌｌでそれぞれ形質転換されたエシェリヒア
コリ Ｈ８１０１を１．５ｊのアンピシリン含有ＹＴ培
地（５０μｇ／！ｄ）で３７℃−晩培養し、７．０００
ｒｐｍで５分間の遠心分離により菌体を回収した。回収
した菌体の湿重量はそれぞれ４．８ｇ、６．７ｇ、５．
７ｔＪ、７．２ｇ、５．１ｇ、３．８ｇであった。(20) Measurement of A I aDH, A I aRSD-ATA activity Plasmid pUCI 8, pIcD112, pICR1
14, pICT113, plcRTllll and pIC
Escherichia transformed with DRTllll, respectively.
E. coli H8101 was cultured overnight at 37°C in 1.5j of YT medium containing ampicillin (50μg/!d), and
Bacterial cells were collected by centrifugation at rpm for 5 minutes. The wet weights of the collected bacterial cells were 4.8 g, 6.7 g, and 5.
They were 7tJ, 7.2g, 5.1g, and 3.8g.
各菌体を５戒の緩衝Ｊ（１０ｍＭリン酸緩函液（ｐＨ７
，２） 、０．０１％２−ＭＥ、５０μＭ ＰＬＰ）
に懸濁し１０分間超音波破砕し、１８．ＯＯＯｒｐｍで
２０分間遠心分離し、得られた上清を上記緩衝液に対し
て透析し、無細胞抽出液を得た。Each bacterial cell was soaked in 5 precepts of buffer J (10mM phosphate buffer solution (pH 7).
, 2), 0.01% 2-ME, 50 μM PLP)
18. Centrifugation was performed at OOOrpm for 20 minutes, and the resulting supernatant was dialyzed against the above buffer to obtain a cell-free extract.
この無細胞抽出液を用いて、以下の方法に従い各酵素活
性を測定した。Using this cell-free extract, each enzyme activity was measured according to the following method.
また、タンパク質は、ローリ−らの方法（ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー對ｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒ ）
１９３ 、２６５（１９５１））に従って測定した。In addition, proteins were prepared using the method of Lowry et al. (Journal
of biological chemistry - our own
of biological chemistry)
193, 265 (1951)).
その結果を表−１に示す。The results are shown in Table-1.
＜Ｄ−ＡＴＡ活性の測定方法〉前述した通りの方法で行なった。<Method for measuring D-ATA activity>This was done in the same manner as described above.
＜Ａ ｌ ａＲ活性の測定方法〉グリシン−ＫＣＩ−ＫＯＨ１ｌｉｉ液（ｐＨ９，０）１
００μｍｏ ｌ 、ＰＬＰ５０ｎｍｏ Ｉ 、Ｄ−アラ
ニン５０．ｃｚｍｏ ｌ 、ＮＡＤ” ２．５μｍｏ
Ｉ 、Ａｌ ａＤＨ（バチルス ステアロサーモフィラ
ス■Ｆ○１２５５０由来）１０Ｕ及び酵素を含む１ｄの
反応液を５０℃でキュベツト中で反応させ、ＮＡＤＨの
増加に由来する３４０ｎｍの吸光度の上昇を測定した。<Method for measuring Al aR activity> Glycine-KCI-KOH1lii solution (pH 9,0) 1
00 μmol, PLP50nmol I, D-alanine 50. czmol, NAD” 2.5μmo
I, 1 d of reaction solution containing 10 U of Al aDH (derived from Bacillus stearothermophilus F○12550) and enzyme was reacted in a cuvette at 50°C, and the increase in absorbance at 340 nm due to the increase in NADH was measured. .
尚１Ｕは、この条件下１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの
増加を触媒する酵素量とした。Note that 1 U is the amount of enzyme that catalyzes an increase in NADH of 1 μmol per minute under these conditions.
＜Ａ Ｉ ａＤＨ活性の測定方法〉グリシン−ＫＣＩ −ＫＯＨＩｉｉ液（１）１１１０．
７） １００μｍｏ１、Ｌ−アラニン５０μｍｏ ｌ
、ＮＡＤ”２．５μｍｏｌおよび酵素を含む１ｄの反応
液を５０℃でキュベツト中で反応させ、ＮＡＤＨの増加
に由来する３４０ｎｍの吸光度の上昇を測定した。尚１
Ｕは、この条件下１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの増加
を触媒する酵素量とした。<Method for measuring AI aDH activity> Glycine-KCI-KOHIii solution (1) 1110.
7) 100μmol1, L-alanine 50μmol
, 1 d of reaction solution containing 2.5 μmol of NAD and enzyme was reacted in a cuvette at 50°C, and the increase in absorbance at 340 nm due to the increase in NADH was measured. Note 1
U is the amount of enzyme that catalyzes an increase in NADH by 1 μmol per minute under these conditions.
表 −１Table-1
第１図はプラスミドｐＩＣＲＴ１１１の制限酵素切断地
図を表わす。第２図はプラスミドｐＩ ＣＤＲＴ １１１ （７）ｉ
ｉ１１限酵素切断地図を表わす。図中内の一本線はベクターｐＬＪｃ１８に由来する部分
、ロコは目的酵素をコードする部分を表わし、肛はＡ
Ｉ ａ［）Ｈｌａｌｒ はＡ Ｉ ａＲ，ｄ−ａｔａは
Ｄ−ＡＴＡを特徴する特許出願人 ダイセル化学工業株式会社第１図FIG. 1 represents a restriction enzyme cleavage map of plasmid pICRT111. Figure 2 shows plasmid pI CDRT 111 (7)i
Represents the i11 restriction enzyme cleavage map. The single line in the figure represents the part derived from vector pLJc18, the loco represents the part encoding the target enzyme, and the anus represents A.
I a[)Hlalr is A I aR, d-ata is D-ATA Patent applicant Daicel Chemical Industries, Ltd. Figure 1
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62140707AJPS63304986A (en) | 1987-06-04 | 1987-06-04 | Plasmid |
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62140707AJPS63304986A (en) | 1987-06-04 | 1987-06-04 | Plasmid |
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63304986Atrue JPS63304986A (en) | 1988-12-13 |
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62140707APendingJPS63304986A (en) | 1987-06-04 | 1987-06-04 | Plasmid |
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63304986A (en) |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1818411A1 (en) | 2006-02-13 | 2007-08-15 | Lonza AG | Process for the preparation of optically active chiral amines |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1818411A1 (en) | 2006-02-13 | 2007-08-15 | Lonza AG | Process for the preparation of optically active chiral amines |
| EP2202318A1 (en) | 2006-02-13 | 2010-06-30 | Lonza AG | Process for the preparation of optically active chiral amines |
| EP2202317A1 (en) | 2006-02-13 | 2010-06-30 | Lonza AG | Process for the preparation of optically active chiral amines |
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