JPS623796A - Production of interleukin 2 - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To produce interleukin 2 out of a microbial cell, by introducing a plasmid having the DNA of signal peptide and the interleukin 2 gene linked to said DNA into a bacterial cell of Bacillus genus, and culturing the bacterial cell. CONSTITUTION:A plasmid containing the signal peptide DNA and the interleukin 2 gene linked to said DNA (e.g. pTY-amyIL2B42 obtained by integrating the interleukin 2 gene into plasmid pTUB285) is introduced into a cell of Bacillus genus bacterium, and the bacterial cell (e.g. Bacillus subtilis Marburg strain) is cultured. Interleukin 2 is produced and accumulated out of said bacterial cell.

Description

Translated fromJapanese

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野この発明はインターロイキン２（以下「ＩＬ２Ｊと記す
）の製造法に関する。ＩＬ２は免疫不全あるいは、腫瘍
等の治療薬として使用できる可能性が大きい。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Field of Industrial Application This invention relates to a method for producing interleukin 2 (hereinafter referred to as "IL2J").IL2 has great potential to be used as a therapeutic agent for immunodeficiency, tumors, etc.

従来の技術ＩＬ２の製造法の一つとして、ＩＬ２をコードする遺伝
子が挿入されているプラスミドを有する大腸菌を培養す
る方法が知られている（欧州特許出願公開筒００９１５
３９号）。しかし従来の組換えＤＮＡ法によシ育種され
た微生物は、いずれも細胞内にＩＬ２は生成蓄積され、
ＩＬ２を回収するためには、細胞破砕と、細胞質蛋白の
ＩＬ２の分離といり繁雑な工程を必要としていた。BACKGROUND ART As one method for producing IL2, there is a known method of culturing E. coli containing a plasmid into which a gene encoding IL2 has been inserted (European Patent Application Publication No. 00915
No. 39). However, in all microorganisms bred using conventional recombinant DNA methods, IL2 is produced and accumulated within the cells.
In order to recover IL2, complicated steps were required, including cell disruption and separation of IL2 from cytoplasmic protein.

発明が解決しようとする問題点従ってこの発明の目的は、微生物Ｉｖｌｉｆｌ胞外にＩ
Ｌ２を生成せしめることによるＩＬ−２の製造法を開発
することにある。Problems to be Solved by the Invention Therefore, it is an object of the present invention to
The purpose of this invention is to develop a method for producing IL-2 by producing L2.

問題点を解決するだめの手段上述の問題点に対し、本発明者らはシグナル４１グチド
のＤＮＡと同ＤＮＡに接続されているＩＬ２遺伝子を有
するプラスミドが導入されているバチルス属の細菌を培
養し、同細菌の細胞外にＩＬ２を生成蓄積せしめること
よシなるＩＬ２の製造法を見出した。Means to Solve the Problems In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors cultured bacteria of the genus Bacillus into which a plasmid having the DNA of signal 41 and the IL2 gene connected to the same DNA was introduced. discovered a method for producing IL2 that does not involve producing and accumulating IL2 outside the cells of the same bacterium.

バチルス属の細胞内で機能する分泌ベクターＤＮＡとし
ては、α−アミラーゼのシグナル配列を有するｐＴＵＢ
　２２６　（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　９５　、８
７−９３（１９８４）参照）　、　ｐＴＵＢ２８５（Ｇ
ｅｎｅ　、３４　、１−３（１９８５）参照）などがあ
る。これらのベクターへのＩＬ２遺伝子の挿入箇所はそ
れぞれ上記文献に記載されている。As a secretion vector DNA that functions in cells of the genus Bacillus, pTUB having a signal sequence of α-amylase is used.
226 (J.Biochem, 95, 8
7-93 (1984)), pTUB285 (G
ene, 34, 1-3 (1985)). The insertion sites of the IL2 gene into these vectors are described in the above-mentioned documents.

ＩＬ２遺伝子として、欧州特許出願公開第００９１５３
９号に記載されているｐＩＬ２−５０Ａなどすべての遺
伝子が使用できる。As IL2 gene, European Patent Application Publication No. 009153
All genes such as pIL2-50A described in No. 9 can be used.

上記ベクターＤＮＡとＩＬ２遺伝子を接続して、組換え
ＤＮＡを調製する方法は、例えば第１図に示すように合
成りＮＡ　リンカ−を用いて接続する方法、その他通常
の方法が使用できる。A method for preparing recombinant DNA by connecting the above vector DNA and the IL2 gene can be, for example, the method of connecting using a synthetic NA linker as shown in FIG. 1, or other conventional methods.

得られた組換えＤＮＡを用いてバチルス属細菌を形質転
換する方法も又、通常の方法である。即ち宿主として用
いるバチルス属細菌トしては、バチルス・ズブチリス、
マーパーグ株、バチヤス、メガテリウム１ノゞチルス０
プミリス、パチルスーアミロリキファシエンス、バチル
ス・リフェニフォルミス、バチルス・プレビス、バチル
ス−ステアロサーモフィラム等の中で修飾、制限系を有
しない宿主として利用可能な菌株が考えられる。The method of transforming Bacillus bacteria using the obtained recombinant DNA is also a conventional method. In other words, the Bacillus bacteria used as hosts include Bacillus subtilis, Bacillus subtilis,
Marperg strain, Batyas, Megatherium 1 Nochirus 0
Bacterial strains that can be used as hosts without modification or restriction systems are considered, such as Bacillus pumilis, Patylsus amyloliquefaciens, Bacillus rifeniformis, Bacillus plevis, and Bacillus stearothermophilum.

このようなバチルス属細菌宿主を上記組換えＤＮＡによ
り形質転換する方法は、Ｃｏｈｅｎらのプロトプラスト
形質転換法（Ｃｈａｎｇ　＋　Ｓ、　＋　ａｎｄ　Ｃｏ
ｈｅｎ　＋Ｓ、　Ｎ、　、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ　、　１６８　、１１１　（１９７９）参
照）やＤｕｎｃａｎらのコンピテントセル法（Ｄｕｎｃ
ａｎ　＋Ｃ，Ｈ，＊　Ｗｉｌａｏｎ　ｌｃ、Ａ、　＋−
ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ　ｌＦ、Ｅ、　ｅＧｅｎｅ　、　１
　、１５３　（１９７７）参照）がある。A method for transforming such a Bacillus bacterial host with the above recombinant DNA is the protoplast transformation method of Cohen et al. (Chang + S, + and Co
hen +S, N, , Mo1. Gen, Ge
netics, 168, 111 (1979)) and the competent cell method of Duncan et al.
an +C,H,* Wilaon lc,A, +-
and Young IF, E, eGene, 1
, 153 (1977)).

これらの方法を使ってＩＬ２発現プラスミドを形質転換
し、ベクターＤＮＡ上の選択マーカー形質、及びＩＬ２
産生能の有無によシ形質転換株を選択できる。ＩＬ２の
定性及び定量分析は英国特許出願公開第９１５３９号に
記載された方法によシ行うことができる。These methods are used to transform the IL2 expression plasmid, and the selectable marker trait on the vector DNA and the IL2 expression plasmid are transformed.
Transformants can be selected based on the presence or absence of production ability. Qualitative and quantitative analysis of IL2 can be carried out by the method described in GB 91539.

得られた形質転換株であるＩＬ２生産能を有するバチル
ス属細菌を用いてＩＬ２を生産する方法は、ＩＬ２生産
能を有する微生物を炭素源、窒素源、及び無機イオン、
更に必要によシビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素
を含有する通常の培地を用いて培養すればよい。培養方
法は好気条件下で通常３０℃から４０℃の範囲で行う。A method for producing IL2 using the obtained transformed strain, a Bacillus bacterium capable of producing IL2, involves using a microorganism capable of producing IL2 as a carbon source, a nitrogen source, and an inorganic ion.
Furthermore, if necessary, the culture may be carried out using an ordinary medium containing organic micronutrients such as vitamins and amino acids. The culturing method is usually carried out under aerobic conditions at a temperature in the range of 30°C to 40°C.

得られた培養液よシＩＬ２ｙｌｌ被グチｋを採取する方
法は遠心によシ菌体を除去した後、培養上清を硫安分画
等によシ濃縮し、英国特許出願公開第９１５３９号に記
載されている方法で行うことができる。The method for collecting IL2yl cells from the obtained culture solution is to remove the bacterial cells by centrifugation, and then concentrate the culture supernatant by ammonium sulfate fractionation, etc., as described in British Patent Application Publication No. 91539. It can be done using the method described.

実施例（１）ＩＬ２遺伝子のｐＴＵＢ２８５への組込みは第１
図に示すように行った。ｐＩＬ２−５ＯＡを制限酵素Ｈ
ｇ　ｉＡＩ及びＤｒａＩにょシ切断して生じる約４５０
ｂｐの断片を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
シ分離、精製した。次にこの断片を３３ｍＭＴｒｉｓ−
ａｃｅｔａｔｅ　（Ｐ［（７，９）　、６６　ｍＭ酢酸
カリヮム、１０　ｍＭ　ｈ　１ｌｆ２マグネシウム、０
．５　ｍＭジチオスレイトール、１００μ々驚牛血清ア
ルブミン、０．２ｍＭｄＡＴＰ　、　ｄｃＴＰ　、　ｄ
ＧＴＰ　、　ｄＴＴＰ存在下で４単位の７４　ＤＮＡポ
リメラーゼ（全酒造ｉＲ）と３７℃で１５分間反応させ
、平滑末端化した。これと別にＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧな
るＨｌｎｄ　ｍリンカ−（全酒造製）を６６　ｍＭＴｒ
ｌｓ−ＨＯ２（ｐＨ７，６）　、１０　ｍＭＭｇ（ｔ２
．１　ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭスペルミジン塩酸塩、１５
ｍＭジチオスレイトール、２００　Ａｉｉ’７匂牛血清
アルブミン反応液中でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（
全酒造製）３単位と３７℃で１時間反応させてリン酸化
した。続いて同じ゛反応液中で上記の平滑末端化した断
片へのリン酸化したリンカ−の付加を、Ｔ　４　ＤＮＡ
リガーゼ（全酒造製）１．４単位と４℃で一晩反応させ
ることによシ行った。反応終了後等量の水飽和フェノー
ルと混和し、水層を回収した。水層は等量のクロロホル
ムで一回抽出し、水層よＪ　ＤＮＡをエタノール沈澱に
より回収した。Example (1) Integration of IL2 gene into pTUB285 in the first step
This was done as shown in the figure. pIL2-5OA with restriction enzyme H
About 450 g produced by iAI and DraI cleavage
The bp fragments were separated and purified by 5% polyacrylamide gel electrophoresis. Next, this fragment was added to 33mM Tris-
acetate (P[(7,9), 66 mM potassium acetate, 10 mM h1lf2 magnesium, 0
．． 5mM dithiothreitol, 100μ dithiothreitol, 0.2mM dATP, dcTP, d
This was reacted with 4 units of 74 DNA polymerase (Zen Shuzo iR) at 37°C for 15 minutes in the presence of GTP and dTTP to form blunt ends. Separately, a Hlnd m linker called CCAAGCTTGG (manufactured by Zenshuzo Co., Ltd.) was added to 66 mMTr.
ls-HO2 (pH 7,6), 10 mM Mg (t2
．． 1mM ATP, 1mM spermidine hydrochloride, 15
T4 polynucleotide kinase (
It was phosphorylated by reacting with 3 units (manufactured by Zenshuzo Co., Ltd.) at 37°C for 1 hour. Subsequently, a phosphorylated linker was added to the blunt-ended fragment in the same reaction solution, and T4 DNA was added to the blunt-ended fragment.
This was carried out by reacting with 1.4 units of ligase (manufactured by Zenshuzo Co., Ltd.) at 4°C overnight. After the reaction was completed, the mixture was mixed with an equal amount of water-saturated phenol, and the aqueous layer was collected. The aqueous layer was extracted once with an equal volume of chloroform, and J DNA was recovered from the aqueous layer by ethanol precipitation.

ＤＮＡは１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ）１７．５
　）　、７ｍＭ　ＭｇＣｌ２．６０　ｍＭ　ＮａＣ４に
溶解し、５０単位のＨＩｎｄＩ［［を加え３７℃で４時
間反応させ、ＨＩｎｄＩＩＩの付着末端を生じせしめた
。反応終了、後、フェノール抽出、クロロホルム抽出、
エタノール沈澱の後、５％のｚ　＋７アクリルアミドグ
ル電気泳動によりｖンカーの除去を行った。DNA in 10 mM Tris-HCl (p) 17.5
) was dissolved in 7mM MgCl2.60mM NaC4, and 50 units of HIndI [[ was added thereto and reacted at 37°C for 4 hours to generate a cohesive end of HIndIII. After completion of reaction, phenol extraction, chloroform extraction,
After ethanol precipitation, v-linker removal was performed by 5% z +7 acrylamide gel electrophoresis.

ベクターＤＮＡは以下のように調製した。ｐＴＵＢ２８
５をＨＩｎｄ　ｍで切断後生じる大きい方の断片（５，
３ｋｂｐ　）を１．０％アガロース電気泳動によシ分離
・精製した。Vector DNA was prepared as follows. pTUB28
The larger fragment generated after cutting 5 with HInd m (5,
3kbp) was separated and purified by 1.0% agarose gel electrophoresis.

このベクターＤＮＡと上記のリンカ−を付加したＩＬ２
遺伝子断片との結合は、２０μ！の６６ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｔ（ｐＨ７，６）　、６　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１　
ｍＭ　ＡＴＰ　。This vector DNA and IL2 with the above linker added
The binding with the gene fragment is 20μ! 66mM Tris-
HCt (pH 7,6), 6 mM MgCl2.1
mM ATP.

１０ｍＭジチオスレイトールの反応液中で１．４単位の
Ｔ　４　ＤＮＡ　リガーゼを加え、４℃で一晩反応させ
ることによシ行った。This was carried out by adding 1.4 units of T 4 DNA ligase to a reaction solution of 10 mM dithiothreitol and reacting overnight at 4°C.

（２）組換えプラスミドのバチルス・ズプチ藻ス２０７
−２５株への導入はＳ、　Ｃｈａｎｇ　ｒ　Ｓ、Ｎ、　
Ｃｏｈｅｎらのプロトゲラスト形質転換法（Ｍｏ１ｅ、
　Ｇｅｎ。(2) Recombinant plasmid Bacillus sputum 207
-25 strain was introduced with S, Chang r S, N,
Cohen et al.'s protogellast transformation method (Mo1e,
Gen.

Ｇｅｎｅｔ４ｃｍ　、　１６８　、１１１　（１９７９
）参照）によった。パーツｆ　ルス−ｘ”ブチ、ｐス２０７−２５株を１００ｒｒ
Ｌ／！のペンアッセイ培地中で３７℃で２時間培養した
後５ＪＭしｌＱｍ／の１０■のリゾチームを含む０．５
　Ｍシェークロース、２．０ｒｎＭマレイン酸、２０ｍ
ＭＭｇＣｔ２（以下「Ｓ八ツ」と記す）に懸濁し、３７
℃で１時間保温することによシプロトプラスト化した。Genet4cm, 168, 111 (1979
)). Part f Rusu-x” Buchi, ps 207-25 stock 100rr
L/! After incubation for 2 hours at 37°C in pen assay medium containing 5JM and 10μ of lysozyme/0.5
M Shake Rose, 2.0rnM Maleic Acid, 20m
Suspended in MMgCt2 (hereinafter referred to as "S Yatsu"), 37
Cyprotoplasts were formed by incubating at ℃ for 1 hour.

上記の連結されたＤＮＡを含む溶液２０μｌに２倍濃度
の８ＭＭ溶液２０μｌとこのプロトゲラスト溶液０．５
ｄを加え、更に４０％ＰＫＧ６０００　１．５−を加え
てよく混合し、２分間室温に放置後、。Add 20 μl of the above ligated DNA-containing solution to 20 μl of the 2x 8MM solution and 0.5 μl of this protogellast solution.
Add d, and then add 40% PKG6000 1.5-, mix well, and leave at room temperature for 2 minutes.

ＳＭＭ　５　ｍを加え、低速遠心でプロトプラストを集
めた。そして、集められたプロトプラストは標準濃度の
インアッセイ培地を含むＳＭＭに懸濁した。5 m of SMM was added and protoplasts were collected by low speed centrifugation. The collected protoplasts were then suspended in SMM containing a standard concentration of in-assay medium.

なお、４０チＰＥＧ　６０００溶液とは４０？のＰＥＧ
６０００を５ＷＬｌ！の２倍濃度−のＳＭＭにあわせ蒸
留水で１００−としたものである。プロトプラストを上
記培地中で３７℃で３時間振とり培養した後、１００μ
に徳のカナマイシンを含むＤＩ（３培地のプレート（０
，８％寒天、０．５Ｍコハク酸Ｎａ　２．０．５％カザ
ミノ酸、０．５％イーストエキストラクト、０．３５％
に２ＨＰＯ４，０，１５％藷、、ＰＯ４，０，５％りｋ
　：ｆｆ　−ス、０．０２　ＭＭｇＣｔ２．０．０１％
牛血清アルブミン）上に敷き、３７℃で７２時間培養し
、再生させた。ｐＴＵＢ２８５にはカナマイシン耐性を
示す遺伝子があるので、プラスミドを保持する宿主細菌
のみがコロニーを再生する。再生コロニーはランダムに
選択し保持するプラスミドを分離・精製し制限酵素によ
る切断試験を行いＩＬ２遺伝子が挿入されたプラスミド
ｐＹＴ−ａｍｙ　ＩＬ２Ｂ４２を保持するクローンを同
定した。By the way, 40% PEG 6000 solution is 40? PEG of
5WLLl for 6000! The concentration of SMM was adjusted to 100 with distilled water. After culturing protoplasts in the above medium at 37°C for 3 hours with shaking, 100μ
A plate of DI (3 medium) containing Kanamycin (0
, 8% agar, 0.5M Na succinate 2.0.5% Casamino acids, 0.5% yeast extract, 0.35%
Add 2HPO4,0,15%, PO4,0,5%
:ff-su, 0.02 MMgCt2.0.01%
The cells were spread on bovine serum albumin) and cultured at 37°C for 72 hours to regenerate. Since pTUB285 contains a gene that exhibits kanamycin resistance, only host bacteria that carry the plasmid will reproduce colonies. Regenerated colonies were randomly selected, the retained plasmids were isolated and purified, and a restriction enzyme cleavage test was performed to identify clones retaining the plasmid pYT-amy IL2B42 into which the IL2 gene had been inserted.

（３）　　ｐＹＴ−ａｍｙ　ＩＬ２Ｂ４２を保持する形
質転換株を０．５チイーストエキストラクト、１．０％
ポリ４グトン、０、５４　ＮａＣＬ　、　０．２％グル
コース、ｓ　ｔｔｔ／ｍｌカナマイシン、ｐＨ７，５の
培地１００ｍＡ’中で３７℃で振とり培養し、菌体を遠
心分離によシ除去した培養上清をＩＬ２活性アッセイ用
サンプルとした。その結果１０，０００〜１５，０００
単位／　ｍｌのＩＬ２活性が認められた。(3) Transformed strain harboring pYT-amy IL2B42 was treated with 0.5% yeast extract, 1.0%
The culture medium was shaken and cultured at 37°C in 100 mA' of poly4gtone, 0.54 NaCL, 0.2% glucose, sttt/ml kanamycin, pH 7.5, and the bacterial cells were removed by centrifugation. The supernatant was used as a sample for IL2 activity assay. Result: 10,000-15,000
Units/ml of IL2 activity was observed.

ｐＴＵＢ　２８　ｓ　（第２図参照）は以下の手順で構
築された。ｐＴＵＢ　４はｐＵＢｌｌｏのＢ　ａｍＨＩ
部分にα−アミラーゼの全遺伝子を含んだ２．３ｋｂの
ＤＮＡ断片が組込まれたプラスミドである。この組込ま
れたＤＮＡ断片の全塩基配列はすでに決定されている（
文献Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１５６　、３２７　（
１９８３）参照）。pTUB28s (see Figure 2) was constructed using the following procedure. pTUB 4 is B amHI of pUBllo
This is a plasmid in which a 2.3 kb DNA fragment containing the entire α-amylase gene is integrated. The entire base sequence of this integrated DNA fragment has already been determined (
Reference J, Bacteriol 156, 327 (
(1983)).

またｐＵＢ　１１０はバチルス属細菌内で増殖可能なプ
ラスミドでクローニング・ベクターとして広く用い　　
−られている。ｐＴＵＢ４をＥｃｏＲＩで切断すると、
４．９ｋｂと１．９　ｋｂの断片にわかれる。４．９ｋ
ｂの断片について大腸菌ＤＮＡ　Ｊリメラーゼ■のクレ
ノー７ラグメントによシ平滑末端とした後、Ｈ１ｎｄｌ
ｌｌリンカ−を付加したのち、Ｔ　４　ＤＮＡ　’）ガ
ーゼによりｆｆｌ状化させて得られるプラスミドがｐＴ
ＵＢ２０１である。pUB110 is a plasmid that can be propagated within Bacillus bacteria and is widely used as a cloning vector.
- is being given. When pTUB4 is cut with EcoRI,
It is divided into 4.9 kb and 1.9 kb fragments. 4.9k
After making the fragment b blunt-ended with the Klenow 7 fragment of E. coli DNA J limerase, H1ndl
After adding a ll linker, the plasmid obtained by converting the T4 DNA' into ffl form with gauze is called pT.
It is UB201.

次Ｋ　１．９　ｋｂの断片をＡｌｕＩによシ切断し、α
−アミラーゼのプロモーター、及びシグナル配列を含ん
だ４２４　ｂｐの断片を分離・精製し、これにＨｌ　ｎ
ｄ　ｍリンカ−を付加して上記のｐＴＵＢ２０１のＨ１
ｎｄｕ部位に組込んで得られるプラスミドがｐＴＵ８２
１８である。ｐＴＵＢ　２１８をＨｌｎｄＩＩ［で部分
分解した後、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー　フ
ラグメントによシ干滑末端化しＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪガ
ーゼにより環状化し、さらにこれをＨｌｎｄ　ｍで切断
した後、ｐＫＴＨ７４よ、りＨ１ｎｄＩＩＩで切シ出さ
れる１、４　ｋｂの断片ヲ組込ミ、バチルス・サチルス
・マーパーク株に導入すると、β−ラクタマーゼ産生能
を付与するプラスミドがｐＴＵＢ　２８５である。ｐＫ
ＴＨ７４はｐＢＲ３２２にコードされるβ−ラクタマー
ゼ遺伝子のうち、そのシグナル配列を欠いた部分がＧＣ
ＡＡＧＣＴＧＣなるＨｌｎｄｌ［リンカ−を介して、ｐ
ＢＲ３２２のＨｌｎｄ　ｌｌ［部分に組込まれたもので
ある（文献Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。The next K 1.9 kb fragment was cut with AluI and α
- Isolate and purify a 424 bp fragment containing the amylase promoter and signal sequence, and add it to Hl n
H1 of the above pTUB201 by adding a d m linker
The plasmid obtained by integrating into the ndu site is pTU82.
It is 18. pTUB 218 was partially digested with HlndII, then blunt-ended with E. coli DNA polymerase I Klenow fragment, circularized with T4 DNA IJ gauze, further cut with Hlndm, and then cut with HlndIII from pKTH74. pTUB 285 is a plasmid that confers the ability to produce β-lactamase when the 1 to 4 kb fragment is introduced into a Bacillus subtilis marpark strain. pK
TH74 is the part of the β-lactamase gene encoded by pBR322 that lacks the signal sequence.
AAGCTGC Hlndl [via linker, p
It was incorporated into the Hlnd ll [portion of BR322 (Reference Proc, Natl.

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　、　７９　、５５８２　（１９８
２）参照）。Acad, Sci, 79, 5582 (198
2)).

以上のようにｐＴＵＢ　２８５はｐＵＢｌｌｏのＢａｍ
ＨＩ部位に、その塩基配列がすべて決定されている２、
３ｋｂの外来ＤＮＡ断片が挿入された・ぐチルス属細菌
内で増殖可能なプラスミドである。As mentioned above, pTUB 285 is pUBllo's Bam
All base sequences have been determined at the HI site2.
This is a plasmid into which a 3 kb foreign DNA fragment has been inserted, and which can proliferate in bacteria belonging to the genus Gutilus.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図は、本発明のインターロイキン２遺伝子を有する
プラスミドの造成経過説明図である。第２図は、本発明において使用されたプラスミドベクタ
ーｐＴＵＢ　２８５の説明図である。特許用゛願大　味の素株式会社第１図ＩＬ２　　ζＯＮ＾ｉ　Ｈ９１ＡＩ／　Ｏｒａ＋FIG. 1 is an explanatory diagram of the construction process of a plasmid having the interleukin 2 gene of the present invention. FIG. 2 is an explanatory diagram of the plasmid vector pTUB 285 used in the present invention. Patent application Ajinomoto Co., Ltd. Figure 1 IL2 ζON^ i H91AI/ Ora+

Claims (2)

Translated fromJapanese

【特許請求の範囲】[Claims]（１）シグナルペプチドのＤＮＡと同ＤＮＡに接続され
ているインターロイキン２遺伝子を有するプラスミドが
導入されているバチルス属の細菌を培養し、同細菌の細
胞外にインターロイキン２を生成蓄積せしめることを特
徴とするインターロイキン２の製造法。(1) Cultivating a Bacillus bacterium into which a plasmid containing the interleukin 2 gene connected to the signal peptide DNA is introduced, and producing and accumulating interleukin 2 outside the cells of the bacterium. Characteristic manufacturing method of interleukin 2.（２）シグナルペプチドが以下のアミノ酸配列を有する
ものである特許請求の範囲第１項記載の製造法。【アミノ酸配列があります】(2) The production method according to claim 1, wherein the signal peptide has the following amino acid sequence. [There is an amino acid sequence]