【発明の詳細な説明】本発明はメルカプト基を有する反応性微粒子に関する。[Detailed description of the invention]The present invention relates to reactive fine particles having mercapto groups.
メルカプト基は反応性に富むため、メルカプトＪを有す
る粒子は実用的に有用である。たとえば、メルカプタン
の還元力を利用して、溶液中の酸化性物質を還元する目
的で使用すれば、反応後還元剤に用いた粒子は沢過・遠
心分離・デカンテーション等により容易に反応系外に除
去できるので、還元生成物の分離精製を能率的に行うこ
とができる。まだメルカプト基は金属イオンと反応して
メルカプチドあるいはキレートを生成するので、メルカ
プト基含有ポリマーは金属補集の目的に使用することが
できる。さらに本発明の応用の中でとくに大きな分野を
なしているのは生物学的活性物質の固定化である。Since mercapto groups are highly reactive, particles having mercapto J are practically useful. For example, if the reducing power of mercaptan is used to reduce oxidizing substances in a solution, the particles used as the reducing agent can be easily removed from the reaction system by filtering, centrifuging, decantation, etc. Since the reduction product can be removed quickly, separation and purification of the reduction product can be carried out efficiently. Since mercapto groups still react with metal ions to form mercaptides or chelates, mercapto group-containing polymers can be used for metal scavenging purposes. Furthermore, a particularly large field of application of the present invention is the immobilization of biologically active substances.
生物学的活性物質を担体に固定化したものは、例えば生
化学、生物工学および医学、特に診断医学の分野におい
て多くの用途がある。゛生物学的活性物質゛′とは生物
学的システムとの相互作用に好適な化合物もしくは機能
単位、もしくはこの生物学的システム自体である。たと
えば酵素、酵素反応の基質、酵素反応阻害剤、補酵素、
抗体、抗原、補体、核酸、ホルモン、ビタミン、レクチ
ン、ウィルス、細胞、細胞表面のレセプター、血液凝固
因子、血液凝固阻止因子、線溶因子、線溶阻止因子など
である。Immobilization of biologically active substances on carriers has many uses, for example in the fields of biochemistry, biotechnology and medicine, especially in diagnostic medicine. A "biologically active substance" is a compound or functional unit suitable for interaction with a biological system, or the biological system itself. For example, enzymes, enzyme reaction substrates, enzyme reaction inhibitors, coenzymes,
These include antibodies, antigens, complements, nucleic acids, hormones, vitamins, lectins, viruses, cells, cell surface receptors, blood coagulation factors, blood clotting inhibitors, fibrinolytic factors, and fibrinolytic inhibitors.
担体に固定化した酵素は大規模な工業生産に有用である
。また担体に固定化した全ての生物学的活性物質はアフ
イニテイクロマトグラフィで物質を精製するだめに有用
である。さらに壕だ生物学的活性物質を担体に固定化し
たものは医学的診断に有用である。また、近年免疫学的
活性物質や酵素などを担体に固定化して血液もしくは血
漿と体外で接触づせて血中の有害成分を除去したのち、
血液もしくは血漿を体内に戻すことにより血液を浄化す
る方法が鱈病に対する新しい治療法として注目されてい
る。Enzymes immobilized on carriers are useful for large scale industrial production. Any biologically active substance immobilized on a carrier is also useful for purifying the substance by affinity chromatography. Furthermore, immobilized biologically active substances on carriers are useful for medical diagnosis. In addition, in recent years, immunologically active substances and enzymes have been immobilized on carriers and brought into contact with blood or plasma outside the body to remove harmful components from the blood.
A method of purifying blood by returning blood or plasma to the body is attracting attention as a new treatment for cod disease.
生物学的活性物質の医学的診断への応用の中でもとくに
重要な分野は免疫学的検査である。A particularly important field in the application of biologically active substances to medical diagnosis is immunological testing.
放射免疫測定で代表される標識免疫測定においては、被
測定物質または被測定物質と選択的に結合する物質を固
相表面に結合しておくと、測定を高感度でかつ簡便に実
施できることはよく知られていることである。In labeled immunoassays, such as radioimmunoassays, it is often possible to carry out measurements easily and with high sensitivity by binding the analyte or a substance that selectively binds to the analyte to the solid phase surface. It is known.
生物学的活性物質を固定化すべき担体が微粒子状である
ことが必須の条件となる応用例は、免疫学的検査用の凝
集試薬である。凝集反応を利用する免疫学的検査法は、
抗原と抗体との反応を利用してその一方を免疫学的に検
出または定量する場合に、測定したい物質に結合する側
の物質を粒子状担体に固定化させておき、その粒子が被
測定物質の存在下で凝集を起こす現象を利用して高感度
の測定を行なう方法で、免疫学的臨床検査の重要な手段
となっている。また逆に測定したい物質を粒子状担体に
固定化ζぜておき、その被測定物質と特異的に反応する
抗原または抗体の存在による被測定物質固定化粒子の凝
集が、被検液中の被測定物質の存在により阻止畑れるこ
とにより被測定物質を検出または定量する方法も免疫学
的臨床検査において広く用いられている。寸だ特定の細
胞と選択的に結合する物質を粒子状担体に固定化はせて
おき、その粒子が細胞に結合するか否かによって細胞の
識別を行なう方法も免疫学的検査の手段としてしばしば
採用をれている。An example of an application in which it is essential that the carrier on which the biologically active substance is immobilized be in the form of fine particles is an agglutination reagent for immunological testing. Immunological testing methods that utilize agglutination reactions are
When using the reaction between an antigen and an antibody to immunologically detect or quantify one of them, the substance that binds to the substance to be measured is immobilized on a particulate carrier, and the particles become the substance to be measured. It is a highly sensitive measurement method that utilizes the phenomenon of agglutination in the presence of , and is an important means of immunological clinical testing. Conversely, when the substance to be measured is immobilized on a particulate carrier, aggregation of the particles immobilized with the analyte due to the presence of antigens or antibodies that specifically react with the analyte can occur. A method of detecting or quantifying a analyte by inhibiting the presence of the analyte is also widely used in immunological clinical tests. A method that involves immobilizing a substance that selectively binds to specific cells on a particulate carrier and identifying cells based on whether or not the particles bind to the cells is also often used as a means of immunological testing. I have been hired.
このような免疫活性粒子を用いた免疫学的検査用試薬に
おける粒子状担体としては、従来、ヒトを含む哺乳動物
や鳥類の赤血球、カオリンや炭素など無機物の粒子、天
然ゴムラテックスやポリスチレンなどの有機高分子化合
物のラテックスが凝集反応用として広く用いられている
。Particulate carriers in immunological test reagents using such immunoactive particles have conventionally been red blood cells of mammals including humans and birds, inorganic particles such as kaolin and carbon, and organic particles such as natural rubber latex and polystyrene. Latex of polymer compounds is widely used for aggregation reactions.
これらのうち赤血球は多種類の抗原・抗体を固定化する
ことが可能で応用範囲が最も広い。Among these, red blood cells can immobilize many types of antigens and antibodies and have the widest range of applications.
しかし採取する動物個体によって品質等に差があること
、安定性に難があり保存が離しいこと、またヒト血清に
より非特異的に凝集する場合があることなどの問題点が
ある。However, there are problems such as differences in quality depending on the individual animal collected, poor stability and long storage times, and nonspecific agglutination by human serum.
非生物由来の粒子として最も広く用いられているのはポ
リスチレン粒子であり、これは合成高分子化合物である
ところから品質を一定にすることが可能でまだそれ自体
では安定である。The most widely used particles of non-biological origin are polystyrene particles, which are synthetic polymer compounds that allow for constant quality and are still stable in themselves.
ポリスチレンは疎水性で種々の蛋白質を吸着する性質が
あるため、通常ポリスチレンへの抗原または抗体の固定
化は物理吸着によって行なわれる。しかし物理吸着によ
って抗原寸たは抗体を固定化した場合には固定化した抗
原（または抗体）と遊離の抗原（まだは抗体）との間に
平衡が存在し、そのため測定の目的物質である対応する
抗体（または抗原）に対し粒子に固定化した抗原（また
は抗体）と遊離の抗原（または抗体）との間に競争反応
が起とシ、その競争反応は凝集に対して抑制的に作用す
る。その結果、多くの例において感度と安定性の不足が
指摘きれている。また轟然のことながらポリスチレンに
対して物理的に吸着きれにくい物質は固定化することが
できない。これらの問題点のだめにポリスチレン粒子は
赤血球を担体とする場合に比較して限られた範囲でしか
実用に供されていない。Since polystyrene is hydrophobic and has the property of adsorbing various proteins, antigens or antibodies are usually immobilized on polystyrene by physical adsorption. However, when antigen size or antibodies are immobilized by physical adsorption, an equilibrium exists between the immobilized antigen (or antibody) and the free antigen (still antibody), and therefore the target substance of measurement is the target substance. A competitive reaction occurs between the antigen (or antibody) immobilized on particles and the free antigen (or antibody), and this competitive reaction acts to suppress agglutination. . As a result, a lack of sensitivity and stability has been pointed out in many cases. Furthermore, it is surprising that substances that are difficult to physically adsorb to polystyrene cannot be immobilized. Because of these problems, polystyrene particles have only been put to practical use to a limited extent compared to when red blood cells are used as carriers.
これらの問題点の解決を図る目的で最近、スチレン−メ
タクリル酸コポリマーラテックスにヒト絨毛性ゴナドト
ロピンをカルボジイミドを使用シテ結合ａせた試薬（Ｄ
Ｔ ２，６４Ｓ！２１８）、カルボキシル化スチレン
−ブタジェンコポリマー、カルボキシル化ポリスチレン
、アミノ基ヲもつカルボキシル化ポリスチレン、アクリ
ル酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、メタクリル
酸ポリマー、アクリロニトリル−ブタジェン−スチレン
コポリマー、ポリ酢酸ビニルアクリレート、ポリビニル
ピリジン、塩化ビニル−アクリレートコポリマーなど種
々のラテックスポリマーにカルボジイミドを縮合剤とし
てヒト繊毛性ゴナドトロピン、ヒト血清アルブミンまだ
は変性ガンマグロブリンをアミド結合を介して縮合きせ
た粒径０．０１〜０．９ ミクロンの粒子からなる試薬
（特公昭５ろ−１２９６６）、メタクリル酸、２−ヒド
ロキシエチルメタクリレートおよびメチルメタクリレー
トを共重合して製造したヒドロキシル基とカルボキシル
基ヲ含有するメチルメタクリレート系ラテックスにトレ
ホネーマ抗原を臭化シアノゲンまだはカルボジイミド法
で結合させた試薬（臨床病理２７、補冊、５２２頁（１
９７８））、ポリスチレン粒子を芯として、それをスチ
レン−グリシジルメタクリレートコポリマーの外皮で被
覆したラテックスのエポキシ基とヒト繊毛ゴナドトロピ
ンまだはインシュリンを反応さ゛せて、それらをラテッ
クスに結合烙せた試薬（特開昭５５−１１０１１８）な
ど、共有結合によシ抗原または抗体や担体に結合させた
試薬が提案されている。In order to solve these problems, a reagent (D
T 2,64S! 218), carboxylated styrene-butadiene copolymer, carboxylated polystyrene, carboxylated polystyrene with amino groups, acrylic acid polymer, acrylonitrile polymer, methacrylic acid polymer, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer, polyvinyl acetate acrylate, polyvinylpyridine, chloride From particles with a particle size of 0.01 to 0.9 microns, human ciliated gonadotropin, human serum albumin, or denatured gamma globulin are condensed with various latex polymers such as vinyl-acrylate copolymers using carbodiimide as a condensation agent via amide bonds. (Japanese Patent Publication No. 12966), Trefonema antigen is added to a methyl methacrylate latex containing hydroxyl and carboxyl groups produced by copolymerizing methacrylic acid, 2-hydroxyethyl methacrylate and methyl methacrylate. Reagents bound by the carbodiimide method (Clinical Pathology 27, Supplementary volume, p. 522 (1)
978)), a reagent in which human ciliary gonadotropin and insulin were bound to the latex by reacting the epoxy groups of the latex with polystyrene particles as the core and coated with a styrene-glycidyl methacrylate copolymer shell (Japanese Patent Application Laid-open No. Reagents covalently bonded to antigens, antibodies, or carriers have been proposed, such as 110118/1982).
これら先行技術においてはカルボジイミドにより免疫活
性物質を粒子に結合させる方法が多用されているが、カ
ルボジイミドを使用すると免疫活性物質分子間および分
子内の縮合反応を惹起する。これはのぞましくない副反
応であって免疫活性物質の活性を損なうものである。臭
化シアノゲンを用いれば免疫活性物質分子間および分子
内の縮合反応を回避することはできるが、この場合には
ヒドロキシル基を有するポリマーと臭化シアノーゲンと
の反応の再現性を得ることが難かしく、その結果免疫活
性物質を固定化した粒子の免疫活性が変動しやすい。こ
れらの免疫活性物質固定化法に比較して重合体に導入さ
れたエポキシ基と蛋白質まだはポリペプチドを反応させ
る方法は免疫活性の失活も少なく再現性も良好である。In these prior art methods, a method of binding an immunoactive substance to particles using carbodiimide is often used, but when carbodiimide is used, condensation reactions occur between and within molecules of the immunoactive substance. This is an undesirable side reaction that impairs the activity of the immunologically active substance. If cyanogen bromide is used, it is possible to avoid condensation reactions between and within molecules of the immunoactive substance, but in this case, it is difficult to obtain reproducibility of the reaction between a polymer having a hydroxyl group and cyanogen bromide. As a result, the immunoactivity of particles immobilized with immunoactive substances tends to fluctuate. Compared to these methods of immobilizing immunoactive substances, the method of reacting an epoxy group introduced into a polymer with a protein or polypeptide causes less deactivation of immune activity and has good reproducibility.
しかしエポキシ基を利用する上記先行技術においては重
合体粒子表面にスチレンに由来する部分が存在するため
蛋白質を非特異的に吸着する傾向を有している。However, the above-mentioned prior art techniques that utilize epoxy groups tend to non-specifically adsorb proteins because of the presence of styrene-derived moieties on the surface of the polymer particles.
一般にヒトまたは動物の体液中には多種類の蛋白質が含
まれ、とくに血漿または血清中にはこれが高濃度で含有
されている。検体体液から蛋白質が担体粒子に吸着され
ると、それが目的とする抗原−抗体反応などの免疫学的
反応に干渉し、凝集反応の選択性や感度の低下をもたら
すおそれがある。In general, human or animal body fluids contain many types of proteins, and plasma or serum in particular contains these proteins at high concentrations. When proteins from a sample body fluid are adsorbed onto carrier particles, they may interfere with the target immunological reaction such as an antigen-antibody reaction, leading to a decrease in the selectivity and sensitivity of the agglutination reaction.
本発明者らはこのような問題点を解消することを目的に
検討を行なった結果、担体として２．６−ジオキシプロ
ピルメタクリレートを主成分とする架橋重合体よシなる
平均直径０．０６μｍ〜１０μｎ〕の親水性微粒子がす
ぐれていることを見出しだ（特開昭５６−［０４Ｄ ５
、特開昭５６−１４１５５９）。上記２．３−ジオキシ
プロピルメタクリレートを主成分とする架橋重合体には
アミン基まだはカルボキシル基を容易に導入できるので
、これらの官能基を用いて生物学的活性物質を固定化す
ることができる。しかしアミン基を導入した微粒子は陽
電荷を、カルボキシル基を導入した微粒子は陰電荷を帯
びる。The present inventors conducted studies with the aim of solving these problems, and as a result, we found that the average diameter of the carrier is 0.06 μm or more, which is made of a crosslinked polymer mainly composed of 2,6-dioxypropyl methacrylate. It was found that hydrophilic fine particles with a diameter of 10 μm are superior (Japanese Patent Application Laid-Open No. 1983-04D 5).
, Japanese Patent Publication No. 56-141559). Since amine groups and carboxyl groups can be easily introduced into the crosslinked polymer mainly composed of 2,3-dioxypropyl methacrylate, biologically active substances can be immobilized using these functional groups. can. However, fine particles introduced with amine groups are positively charged, and fine particles introduced with carboxyl groups are negatively charged.
微粒子が帯電するのを避けたい場合には２．６−シオキ
シプロビルメタクリレート単位のヒドロキシル基を官能
基として利用し、微粒子を臭化シアノゲルで処理するこ
とによシ活性化したのち、免疫学的活性物質と反応をせ
る方法で、免疫学的活性物質を微粒子とに固定化するこ
とができる。しかし臭化シアノゲンは毒性が強くて取扱
いに危険が伴なう上に、臭化シアノゲン活性化法による
生物学的活性物質固定化は既述のように再現性に難があ
る。When it is desired to avoid charging the fine particles, the hydroxyl group of the 2,6-cyoxypropyl methacrylate unit is used as a functional group, and the fine particles are activated by treatment with bromide cyanogel, and then immunological An immunologically active substance can be immobilized on microparticles by a method of reacting with an immunologically active substance. However, cyanogen bromide is highly toxic and dangerous to handle, and as described above, immobilization of biologically active substances by the cyanogen bromide activation method has difficulty in reproducibility.
本発明者らはできるだけ中性の微粒子を担体として、生
物学的活性物質を、簡便にかつ再現性よく固定化する方
法を検削した結果、本発明に達しだ。すなわち本発明は
、グリシジルアクリレートおよＯ・（または）グリシジ
ルメタクリレートのくシ返し単位を有する重合体からな
るものである。The present inventors have developed a method for immobilizing a biologically active substance simply and with good reproducibility using microparticles as neutral as possible as a carrier, and as a result, the present invention was achieved. That is, the present invention consists of a polymer having repeat units of glycidyl acrylate and O.(or) glycidyl methacrylate.
メルカプト基を含有するポリマーとしては、ポリｌ）−
チオスチレン、ポリｐ−ビニルベンジルメルカプタン、
ポリシスティン、ポリビニルメルカプタン、ポリ（２，
３−７フルカプトプロビルビニルエーテル）、ポリ（メ
ルカプトアセトアルデヒドビニルアセタール）、ポリ（
２，３−ンメルカブトグロピオンアルデヒドビニルアセ
クール）などが知られている（大河原信・住友義治、工
業化学雑誌第６１巻、１５０８頁（１９５８））。これ
らのポリマーは粉末状にすることはできるが、粒度調節
は甚だ困難であり、捷だ蛋白質の非特異吸着が多くて生
物学的活性物質固定化用の担体としては実質上使用でき
ない。免疫学的反応を凝集反応により検知するためには
、担体微粒子の直径は２０μｍ以下でかつ粒度をある程
度調節できるものでなければならない。これまで、直径
が２０μｍ以下で粒度分布が狭く、メルカプト基を肴す
る微粒子は知られていなかった。以下に本発明の実施態
様を説明する。Examples of polymers containing mercapto groups include polyl)-
Thiostyrene, poly p-vinylbenzyl mercaptan,
Polycystine, polyvinyl mercaptan, poly(2,
3-7 flucaptopropyl vinyl ether), poly(mercaptoacetaldehyde vinyl acetal), poly(
2,3-mercabutoglopionaldehyde vinyl acecur) and the like are known (Shin Okawara and Yoshiharu Sumitomo, Industrial Chemistry Magazine Vol. 61, p. 1508 (1958)). Although these polymers can be made into powder, it is extremely difficult to control the particle size, and there is a large amount of non-specific adsorption of fragile proteins, so that they cannot be practically used as a carrier for immobilizing biologically active substances. In order to detect an immunological reaction by an agglutination reaction, the carrier fine particles must have a diameter of 20 μm or less and the particle size must be adjustable to some extent. Until now, fine particles with a diameter of 20 μm or less, a narrow particle size distribution, and a mercapto group have not been known. Embodiments of the present invention will be described below.
グリシジルアクリレートおよび／まだはグリシジルメタ
クリレートのくり返し単位を有する重合体からなる平均
粒径０．０ろ〜２０μｍの微粒子は、たとえば特願昭５
７−５４２４５に記載した方法により製造できる。Fine particles having an average particle size of 0.0 to 20 μm made of a polymer having repeating units of glycidyl acrylate and/or glycidyl methacrylate are disclosed in Japanese Patent Application No. 5, for example.
It can be produced by the method described in No. 7-54245.
重合体微粒子製造時のグリシジルアクリレートとグリシ
ジルメタクリレ−１・との混合割合は任意であり、いず
れか一方のみを単独で使用してもよい。The mixing ratio of glycidyl acrylate and glycidyl methacrylate-1 during production of polymer fine particles is arbitrary, and either one may be used alone.
本発明の重合体微粒子は、他の共重合成分を加えること
がしばしば好ましい結果をもたらす。Addition of other copolymerization components to the polymer fine particles of the present invention often yields favorable results.
共重合成分添加の効用は粒径の調節である。共重合成分
としてのぞましいのは親水性単量体であり、とくに水溶
性単量体がのぞましい。共重合に用いる水溶性単量体と
して適当なものは、例えば２−オキシエチルアクリレー
ト、２−オキシエチルメタクリレート、２−オキシプロ
ピルアクリレート、２−オキシプロビルメククリレ−１
・、重合度２ないし２５のポリエチレングリコールモノ
アルキルエーテルのアクリル酸エステル寸たはメタクリ
ル酸エステル、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ
−ビニルピロリドン、グリセロールメタクリレ−１・な
どである。The effect of adding a copolymer component is to adjust the particle size. Hydrophilic monomers are preferred as copolymerization components, and water-soluble monomers are particularly preferred. Suitable water-soluble monomers used in the copolymerization include, for example, 2-oxyethyl acrylate, 2-oxyethyl methacrylate, 2-oxypropyl acrylate, and 2-oxypropylamecrylate-1.
・Acrylic ester or methacrylic ester of polyethylene glycol monoalkyl ether with a degree of polymerization of 2 to 25, acrylamide, methacrylamide, N
-vinylpyrrolidone, glycerol methacrylate-1, etc.
これらの水溶性単量体は２種以上併用してもよい。これ
ら水溶性単量体を共重合した場合には、生物学的活性物
質を固定化した後に、重合体微粒子表面で何らの結合物
によって覆われることもなく露出しているのは、水溶性
単量体に由来する親水性部分である。蛋白質は水性媒体
中では親水性重合体には吸着しにくいので、本発明によ
る生物学的活性物質固定化微粒子は、検体体液に対して
安定で非特異的凝集を起としにくく、寸だ細胞に対する
非特異的付着がない。グリシジルアクリレートとグリシ
ジルメタクリレ−４の和に対する共重合成分の和の比率
はモル比で１００：０ないし５：９５の範囲で変えるこ
とができる。Two or more of these water-soluble monomers may be used in combination. When these water-soluble monomers are copolymerized, after the biologically active substance is immobilized, the water-soluble monomers are exposed on the surface of the polymer fine particles without being covered with any bond. It is a hydrophilic moiety derived from polymers. Since proteins are difficult to adsorb to hydrophilic polymers in aqueous media, the biologically active substance-immobilized microparticles according to the present invention are stable in sample body fluids, resistant to non-specific aggregation, and highly effective against cells. No non-specific attachment. The molar ratio of the sum of the copolymer components to the sum of glycidyl acrylate and glycidyl methacrylate-4 can be varied within the range of 100:0 to 5:95.
本発明の重合体微粒子は例えば次の方法によって製造す
ることができる。The polymer fine particles of the present invention can be produced, for example, by the following method.
重合反応は通常乳化重合、沈澱重合まだは懸濁重合によ
って好ましく行なわれる。これらいずれの方法も重合と
同時に重合体が粒子状になって析出するので本発明の目
的に適している。The polymerization reaction is usually preferably carried out by emulsion polymerization, precipitation polymerization or suspension polymerization. All of these methods are suitable for the purpose of the present invention because the polymer is precipitated in the form of particles at the same time as polymerization.
沈澱重合は、単量体は溶解するが重合によって生成する
重合体は溶解しない媒体中で重合を行なう方法であって
、単量体と重合媒体との組合せを選択することによって
生成する重合体粒子の平均直径を０．０３々いし１０μ
ｍの範囲に入るよう調節することが比較的容易であり、
粒径の分布も比較的狭い。捷た沈澱重合は、乳化重合や
懸濁重合の場合と異なって、乳化剤や懸濁安定剤を使用
しないので、重合反応後これらの添加剤を除去する必要
がないのも利点の一つである。Precipitation polymerization is a method in which polymerization is carried out in a medium in which monomers are dissolved but the polymer produced by polymerization is not dissolved, and polymer particles are produced by selecting a combination of monomers and polymerization medium. The average diameter of
It is relatively easy to adjust to fall within the range of m,
The particle size distribution is also relatively narrow. Unlike emulsion polymerization or suspension polymerization, suspended precipitation polymerization does not use emulsifiers or suspension stabilizers, so one of the advantages is that there is no need to remove these additives after the polymerization reaction. .
沈殿重合に用いられる媒体としては、例えは酢酸エチル
、酢酸ｎ−グロビル、酢酸イソプロピル、山−酸ブチル
各異性体およびプロピオン酸の上記相当エステルなどの
エステル類、メチルエチルケトン、メチルｎ−プロピル
ケトン、メチルインプロピルケトン、メチルブチルケト
ン各異性体などのケトン類、ベンゼン、トルエン０−キ
シレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、四塩化炭素など
である。Examples of the medium used in precipitation polymerization include esters such as ethyl acetate, n-globyl acetate, isopropyl acetate, isomers of butyl acetate, and the above-mentioned equivalent esters of propionic acid, methyl ethyl ketone, methyl n-propyl ketone, and methyl esters. These include ketones such as isomers of inpropyl ketone and methyl butyl ketone, benzene, toluene, 0-xylene, m-xylene, p-xylene, and carbon tetrachloride.
架橋剤を重合系に添加することは必須ではないが、通常
重合に当って重合性炭素炭素二重結合を分子内に２基以
上含む多官能性単量体を添加して積極的に重合体を架橋
させるととがのそ寸しい。そのような目的で重合系に添
加するに適した多官能性単量体は多数存在するが、若干
例をあげれば、ジビニルベンセン、エチレングリコール
ジメタクリレート、Ｎ、Ｎ’−メチレンヒスアクリルア
ミド、コハク酸ジビニル、コハク酸ジアリル、メタクリ
ル酸ビニル、メタクリル酸アリル、ｔ−リアリルシアヌ
レート、トリアリルインシアヌレートなとである。架橋
剤の添加量は通常全単量体中の６０モル係以下である。Although it is not essential to add a crosslinking agent to the polymerization system, it is usually possible to actively polymerize by adding a polyfunctional monomer containing two or more polymerizable carbon-carbon double bonds in the molecule during polymerization. When cross-linked, the sharpness becomes very small. There are many polyfunctional monomers suitable for adding to the polymerization system for such purposes, to name a few: divinylbenzene, ethylene glycol dimethacrylate, N,N'-methylenehisacrylamide, and succinic acid. These include divinyl, diallyl succinate, vinyl methacrylate, allyl methacrylate, t-lylyl cyanurate, and triallyl cyanurate. The amount of the crosslinking agent added is usually 60 mol or less based on the total monomers.
まだ架橋結合は重合反応後生成型合体の反応性を利用し
てこれを多官能化合物と反応づせることによって導入す
ることもできる。例えば生成重合体に含まれるエポキシ
基とエチレンジアミ、 ンなどのジアミンとを反応き
せることにょシ重合体を架橋でせることかできる。Furthermore, crosslinking can also be introduced by utilizing the reactivity of the type of coalescence produced after the polymerization reaction and reacting it with a polyfunctional compound. For example, a polymer can be crosslinked by reacting an epoxy group contained in the resulting polymer with a diamine such as ethylenediamine.
重合開始剤としては通常のラジカル重合開始剤、例えば
２，２′−アゾビスインブチロニトリル、２，２７−ア
ゾビス（２，Ａ−ジメチルバレロニトリル）、２，２′
−アゾビス（２、４−ジメチル−４−メトキシバレロニ
トリル）、などのアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、ジラ
ウロイルパーオキサイド、ジーｔｅｒｔ−ブチルパーオ
キサイドなどの過酸化物を用いることができる。As the polymerization initiator, common radical polymerization initiators such as 2,2'-azobisinbutyronitrile, 2,27-azobis(2,A-dimethylvaleronitrile), 2,2'
Azo compounds such as -azobis(2,4-dimethyl-4-methoxyvaleronitrile), and peroxides such as benzoyl peroxide, dilauroyl peroxide, and di-tert-butyl peroxide can be used.
重合温度も通常のラジカル重合の温度範囲でよく、２０
℃ないし８０℃がとくに好ましい。重合開始剤の重合混
合液中の濃度は、通常０．００１ないしＤ、０３モル／
を程度である。単量体の重合混合液中の濃度は通常５な
いし５０重量％の範囲が好ましい。単量体濃度が５０重
量％を超えると生成する重合体粒子が凝集する傾向があ
る。また単量体濃度が５重量係未満でも本発明は実施可
能であるが、得られる重合体微粒子が少なくなるので生
産性が低くなる。なお重合は窒素またはアルゴン々との
不活性ガスで置換して行なうのがのぞましい。The polymerization temperature may be within the normal radical polymerization temperature range, and may be 20
C. to 80.degree. C. is particularly preferred. The concentration of the polymerization initiator in the polymerization mixture is usually 0.001 to D, 0.3 mol/D.
This is the degree. The concentration of the monomer in the polymerization mixture is usually preferably in the range of 5 to 50% by weight. When the monomer concentration exceeds 50% by weight, the resulting polymer particles tend to aggregate. Although the present invention can be carried out even if the monomer concentration is less than 5% by weight, the number of polymer fine particles obtained will decrease, resulting in lower productivity. The polymerization is preferably carried out by replacing the atmosphere with an inert gas such as nitrogen or argon.
乳化重合は直径０．５μｍ以下の微粒子を製造するのに
適している。乳化剤としては、アニオン性、カチオン性
およびノニオン性いずれのタイプの界面活性剤も使用で
きる。重合開始剤としては、たとえば過硫酸のナトリウ
ム、カリウムまだはアンモニウム塩のような水溶性無機
過酸化物、２．２’−アゾビス（２−アミジノプロパン
）塩酸塩、４，４′−アゾビス−４−シアンペンタン酸
のような水溶性有機アゾ化合物が好ましく用いられる。Emulsion polymerization is suitable for producing fine particles with a diameter of 0.5 μm or less. As the emulsifier, anionic, cationic and nonionic surfactants can be used. Examples of the polymerization initiator include water-soluble inorganic peroxides such as sodium, potassium or ammonium persulfates, 2,2'-azobis(2-amidinopropane) hydrochloride, 4,4'-azobis-4 - Water-soluble organic azo compounds such as cyanopentanoic acid are preferably used.
これらの重合開始剤から遊離基を発生きせるだめには、
通常温度を上げて熱反応により分解させるが、紫外線を
照射して光反応により分解づせてもよい。重合温度は、
グリシジルアクリレートまたはグリシジルメタクリレー
トのエポキシ基の加水分解を避けるだめに７０℃以下で
行なうのかのぞ捷しい。To prevent generation of free radicals from these polymerization initiators,
Usually, the temperature is raised to cause decomposition by a thermal reaction, but it may also be irradiated with ultraviolet rays to cause decomposition by a photoreaction. The polymerization temperature is
In order to avoid hydrolysis of the epoxy group of glycidyl acrylate or glycidyl methacrylate, it is difficult to carry out the reaction at a temperature of 70° C. or lower.
１０μｍ以上の粒子は懸濁重合によって調製できるが、
懸濁重合によって調製した粒子は粒度分布が比較的広い
ので、粒度を揃える必要がある場合には分級しなければ
ならない。直径１０μｍ以上で粒度分布がとくに狭い粒
子が必要な場合には、乳化重合捷だは沈殿重合によって
調製した、直径１０μｍ以下の粒度分布が狭い粒子の存
在下に再び単量体を追加して重合させる、いわゆるシー
ド重合を行なうととがのぞましい。Particles larger than 10 μm can be prepared by suspension polymerization, but
Particles prepared by suspension polymerization have a relatively wide particle size distribution, so they must be classified if uniform particle size is required. When particles with a diameter of 10 μm or more and a particularly narrow particle size distribution are required, monomers are added again to polymerize in the presence of particles with a diameter of 10 μm or less and a narrow particle size distribution prepared by emulsion polymerization or precipitation polymerization. It is desirable to carry out so-called seed polymerization.
粒子の形状は多くの場合球形であるが球形であることは
必要条件ではなく不規則な形状であっても差し支えない
。不規則な形状の粒子の直径は最大径と最小径の和の１
／／２とする。平均直径は式（１）によって定義される
ｃｌＫよって表わされる。ただしｄｌは１番目の粒子の
直径、Ｎは粒子の総数である。The shape of the particles is often spherical, but sphericity is not a necessary condition, and irregular shapes may be used. The diameter of irregularly shaped particles is 1 of the sum of the maximum and minimum diameters.
//2. The average diameter is represented by clK defined by equation (1). However, dl is the diameter of the first particle, and N is the total number of particles.
Ｎ粒子をクロマトグラフの固定量に用いる場合、血液浄化
の目的で使用する場合、および標識免疫測定の固相に使
用する場合は、粒子の直径が６μｍ以上であることがの
ぞましい。When N 2 particles are used in a fixed amount for chromatography, for the purpose of blood purification, and as a solid phase for labeled immunoassay, the diameter of the particles is preferably 6 μm or more.
凝集反応が判定しやすいのは経験的に平均直径が０．１
μｍ以上１０μｍ以下の場合である。まだ細胞標識の目
的には平均直径は０，０６μｍ以上５皿以下の範囲が好
ましい。−１だ染料ないし顔料によシ適邑に着色した粒
子は凝集反応、細胞標識いずれの目的に対しても好都合
である。また細胞標識に対しては螢光、を付与した粒子
も好ましい。Empirically, it is easy to determine the agglutination reaction when the average diameter is 0.1.
This is the case when the thickness is not less than μm and not more than 10 μm. However, for the purpose of cell labeling, the average diameter is preferably in the range of 0.06 μm or more and 5 plates or less. Particles suitably colored with -1 dyes or pigments are convenient for both aggregation reactions and cell labeling purposes. Particles provided with fluorescence are also preferred for cell labeling.
重合体微粒子にメルカプト基を導入するためには、重合
体微粒子を水または不活性な液状有機化合物に分散させ
て、メルカプト基を導入するための試薬と反応させる。In order to introduce mercapto groups into polymer particles, the polymer particles are dispersed in water or an inert liquid organic compound and reacted with a reagent for introducing mercapto groups.
メルカプト基を導入するだめの試薬としては、硫化水素
、分子内にメルカプト基を２基以上有するポリチオール
または分子内にアミン基とメルカプト基の両方を有する
化合物などが好ましい。硫化水素はガス状で反応系に吹
き込んでもヨく、またナトリウム塩すなわち水硫化すト
リウムなどのアルカリ金属塩として使用してもよい。分
子内にメルカプト基を２基以上有するポリチオールの例
を若干あげれば、ジチオグリコール、ジチオエリスリト
ール、ジチオスレイトール、トルエン−３，４−ジチオ
ールなどである。まだ、分子内にアミン基とメルカプト
基の両方を有する化合物としては、たとえば２−アミノ
エタンチオール、２−アミノチオフェノール、４−アミ
ノチオフェノール、システィン、システィンエチルエス
テル、システィンメチルエステルナトがあげられる。メ
ルカプト基導入反応の温度は０℃ないし１００℃の範囲
が適当である。まだ反応は攪拌しつつ行なうのがよい。Preferred reagents for introducing mercapto groups include hydrogen sulfide, polythiols having two or more mercapto groups in the molecule, or compounds having both amine groups and mercapto groups in the molecule. Hydrogen sulfide may be blown into the reaction system in gaseous form or may be used as an alkali metal salt such as sodium salt, thorium bisulfide. Some examples of polythiols having two or more mercapto groups in the molecule include dithioglycol, dithioerythritol, dithiothreitol, and toluene-3,4-dithiol. Examples of compounds having both an amine group and a mercapto group in the molecule include 2-aminoethanethiol, 2-aminothiophenol, 4-aminothiophenol, cysteine, cysteine ethyl ester, and cysteine methyl ester. . The temperature for the mercapto group introduction reaction is suitably in the range of 0°C to 100°C. It is better to carry out the reaction while stirring.
生成したメルカプト基含有微粒子は、空気中の酸素によ
る酸化を防ぐために水性媒体中に窒素またはアルゴン雰
囲気下に保存する。長期間にわたって保存する場合には
２，２′−ジチオビスピリジンと反応させてメルカプト
基を２−ピリジルジスルフィドに変換しておくことがの
ぞましい。その場合、担体微粒子を使用するに際して、
ジチオスレイトールまたはメルカプトエタノールなどで
処理すれば保護基が除去されて担体微粒子上にメルカプ
ト基が再生する。The produced mercapto group-containing fine particles are stored in an aqueous medium under a nitrogen or argon atmosphere to prevent oxidation by oxygen in the air. When storing for a long period of time, it is preferable to convert the mercapto group into 2-pyridyl disulfide by reacting with 2,2'-dithiobispyridine. In that case, when using carrier fine particles,
When treated with dithiothreitol or mercaptoethanol, the protecting group is removed and the mercapto group is regenerated on the carrier fine particles.
メルカプト基を導入てれた重合体微粒子に生物学的活性
物質を固定化するためには結合剤を使用する。結合剤と
しては分子内にメルカプト基と反応して結合する官能基
を有し、その他にアミン基または、カルボキシル基と反
応して結合する官能基を有する化合物が好適である。そ
のような化合物として容易に入手できるものに、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドと４−（マレイミドメチル）シ
クロヘキサン−１−カルボン酸とのエステル（略称：Ｏ
ＨＭ）があるが、勿論これに限定されるものではない。A binder is used to immobilize a biologically active substance on the polymer particles into which mercapto groups have been introduced. As the binder, a compound having a functional group in its molecule that reacts with a mercapto group and bonds therewith, and also has a functional group that reacts with and bonds with an amine group or a carboxyl group is suitable. One of the easily available such compounds is the ester of N-hydroxysuccinimide and 4-(maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylic acid (abbreviation: O
HM), but of course it is not limited to this.
メルカプト基含有重合体微粒子と結合剤とを反応させる
と、結合剤のメルカプト基反応性官能基が重合体微粒子
のメルカプト基と反応して結合し、重合体微粒子にアミ
ン基またはカルボキシル基と反応する官能基が導入てれ
る。生物学的活性物質は蛋白質であるかまだはポリペプ
チド部分を含んでいるので、アミノ基およびカルボキシ
ル基を含有しており、上記結合剤によって処理きれた重
合体微粒子と接触させると、重合体微粒子上に固定化さ
れる。生物学的活性物質を固定化したのち、過剰の結合
剤官能基が残存する場合にンは血清アルブミン、ゼラチシなど目的とする反応に干渉
しない親水性蛋白質を過剰の官能基と反応させることに
よって、その反応性を失わぜることかできる。その際官
能基消去用の親水性蛋白質は固定化の目的である生物学
的活性物質と混合して同時に反応させてもよく、まだ生
物学的活性物質を先に単独で反応させてその後で反応さ
せてもよい。また上記アルブミンやゼラチンなどの親水
性蛋白質の代シにグリシン、アレニンなどのアミノ酸を
用いることも可能である。When the mercapto group-containing polymer particles are reacted with the binder, the mercapto group-reactive functional group of the binder reacts and bonds with the mercapto group of the polymer particles, and the polymer particles react with the amine group or carboxyl group. Functional groups are introduced. Since the biologically active substance is a protein or contains a polypeptide moiety, it contains amino groups and carboxyl groups, and when brought into contact with the polymer fine particles treated with the above-mentioned binder, the polymer fine particles form. fixed on top. If an excess of binding agent functional groups remains after immobilizing a biologically active substance, it can be achieved by reacting a hydrophilic protein such as serum albumin or gelatin that does not interfere with the desired reaction with the excess functional groups. It is possible to lose that reactivity. In this case, the hydrophilic protein for functional group elimination may be mixed with the biologically active substance to be immobilized and reacted at the same time, or the biologically active substance may be reacted alone first and then reacted. You may let them. It is also possible to use amino acids such as glycine and arenine as a substitute for the hydrophilic proteins such as albumin and gelatin.
また生物学的活性物質にはメルカプト基を含有している
ものがある。メルカプト基を含有する生物学的活性物質
は、分子内にメルカプト基と反応して結合する官能基を
２基以上有する化合物を結合剤として、担体微粒子に固
定化することができる。この目的で使用できる結合剤と
して容易に入手できるものに、Ｎ、Ｎ’−ｏ−フェニレ
ンジマレイミドお、）： ヒＮ 、Ｎ’ −ｐ−フェニ
レンジマレイミドがあるが、勿論これらに限定されるも
のではない。生物学的活性物質を固定化したのち、担体
上に過剰の結合剤官能基が残存する場合には、メルカプ
トエタノールやチオグリセリンなどの水溶性メルカプタ
ンを過剰の官能基と反応させることによって、その反応
性を失なわせることができる。Furthermore, some biologically active substances contain mercapto groups. A biologically active substance containing a mercapto group can be immobilized on carrier microparticles using a compound having two or more functional groups that react with and bond to a mercapto group as a binder. Easily available binders that can be used for this purpose include, but are of course not limited to, N,N'-o-phenylene dimaleimide and (): It's not a thing. If an excess of binder functional groups remains on the carrier after immobilization of the biologically active substance, the reaction can be reduced by reacting a water-soluble mercaptan such as mercaptoethanol or thioglycerin with the excess functional groups. It can make you lose your sexuality.
固定化の対象となる生物学的活性物質の中で特に重要な
ものは免疫活性物質である。ここで免疫活性物質とは抗
原および抗体のみでなく、補体、ＦＣレセプター、Ｃ３
レセプターなど液性免疫反応ないし細胞性免疫反応に関
与しである物質に特異的に結合する物質を意味するもの
とする。具体例を若干あげれば、梅毒トレポネーマ抗原
、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ抗原）、Ｂ型肝炎表面抗原
に対する抗体（抗ＨＢｓ）、風疹抗原、トキソプラズマ
抗原、ストレプトリジン０１抗ストレプトリジンＯ抗体
、マイコプラズマ抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（Ｉ
−Ｉ ＯＧ ） 、抗ｉ（ＯＧ抗体、熱凝集ヒト■ｇｏ
、’）ウマチ因子、核蛋白、ＤＮＡ、抗ＤＮＡ抗体、Ｃ
反応性蛋白（ＣＲＰ）、抗ＣＲＰ抗体、抗エストロゲン
抗体、ａ−フェトプロティン（α−ＦＰ）、抗α−ＦＰ
抗体、癌胎児性抗原（ＣＥ Ａ、 ）、抗ＣＥＡ抗体、
Ｏｌｑ、抗０１ｑ抗体、Ｃ３、抗ｃ３抗体、抗り３ｂ抗
体、抗Ｃ６ｂｌ抗体、Ｃ４、抗Ｃ４抗体、グロティンー
Ａ、コングルチニン、イムノコングルレニンなどである
。Among biologically active substances to be immobilized, immunologically active substances are particularly important. Here, immunoactive substances include not only antigens and antibodies, but also complement, FC receptors, C3
It means a substance that specifically binds to a substance that is involved in a humoral immune reaction or a cell-mediated immune reaction, such as a receptor. Some specific examples include Treponema pallidum antigen, hepatitis B surface antigen (HBs antigen), antibody against hepatitis B surface antigen (anti-HBs), rubella antigen, toxoplasma antigen, streptolysin 01 anti-streptolysin O antibody, mycoplasma antigen. , human chorionic gonadotropin (I
-I OG), anti-i (OG antibody, heat-agglutinated human Go
,') equine factor, nuclear protein, DNA, anti-DNA antibody, C
reactive protein (CRP), anti-CRP antibody, anti-estrogen antibody, a-fetoprotein (α-FP), anti-α-FP
antibody, carcinoembryonic antigen (CEA, ), anti-CEA antibody,
These include Olq, anti-01q antibody, C3, anti-c3 antibody, anti-3b antibody, anti-C6bl antibody, C4, anti-C4 antibody, glotin-A, conglutinin, and immunoconglutinin.
また、生物学的活性物質としてすべての酵素は固定化の
対象、となる。若干の具体例をあげれば、ウレアーゼ、
カタラーゼ、クレアチンキナーゼ、リボヌクレアーゼ、
アミラーゼ、トリフシン、パパイン、リゾチーム、アミ
ノアシラーゼ、ミオシンＡＴＰアーゼ、アスパルターゼ
、ギモトリプリン、リパーゼ、アスパラギナーゼ、イン
ベルターゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼなどがあるが、勿論これらに
限定きれるものではない。In addition, all enzymes are targets of immobilization as biologically active substances. To give some specific examples, urease,
catalase, creatine kinase, ribonuclease,
Examples include amylase, tryfusin, papain, lysozyme, aminoacylase, myosin ATPase, aspartase, gimotrypurine, lipase, asparaginase, invertase, glucose oxidase, peroxidase, β-galactosidase, but are not limited to these.
他の重要な生物学的活性物質の重要な例はホルモンであ
る。若干の具体例をあげれば、インシュリン、黄体形成
ホルモン、卵胞刺激ホルモン、ヒト生長ホルモン、甲状
腺刺激ホルモン、Ｔ３ 、Ｔ４ 、グルカゴン、プロラ
クチン、カルチトニン、アンジオテンシン、ＡＯＴＨ，
ＬＨ−ＲＨ、レニンなどがある。An important example of other important biologically active substances are hormones. Some specific examples include insulin, luteinizing hormone, follicle stimulating hormone, human growth hormone, thyroid stimulating hormone, T3, T4, glucagon, prolactin, calcitonin, angiotensin, AOTH,
Examples include LH-RH and renin.
−ｇらに、インスリンレセプター・アセチルコリンレセ
プター・補体レセプターなどの細胞表面レセプター、コ
ンカナバリンＡ・フィトヘマグルチニン・ダイズアグル
チニンなどのレクチン、β−トロンボグロブリン・トロ
ンボプラスチン・プロトロンビン・第■因子・フイブリ
ノゲン・プラスミノゲン・アンチトロピン■など血液凝
固および線溶系の諸因子もまだ固定化の対象として有用
な物質である。-g et al., cell surface receptors such as insulin receptor, acetylcholine receptor, complement receptor, lectins such as concanavalin A, phytohemagglutinin, soybean agglutinin, β-thromboglobulin, thromboplastin, prothrombin, factor II, fibrinogen, plasminogen, etc. Factors involved in blood coagulation and fibrinolysis, such as antitropin ■, are also useful substances for immobilization.
次に実施例に基づいて本発明を説明する。Next, the present invention will be explained based on examples.
実施例１グリシジルメタクリレート１４．５０部（重量基準、以
下同じ）、２−ヒドロキシエチルメタクリレート１．５
０部、トリエチレングリコールジメタクリレー） １．
６５部、プロピオン酸エチル２５．００部および四塩化
炭素２５．００部を混合し、２．２′−アゾビス（２，
４−ジメチルバレロニトリル）を０．０５０部添加溶解
したのち、アルゴン雰囲気下４５℃で１６時間重合させ
た。Example 1 14.50 parts of glycidyl methacrylate (based on weight, same hereinafter), 1.5 parts of 2-hydroxyethyl methacrylate
0 parts, triethylene glycol dimethacrylate) 1.
65 parts of ethyl propionate, 25.00 parts of ethyl propionate, and 25.00 parts of carbon tetrachloride were mixed, and 2.2′-azobis(2,
After adding and dissolving 0.050 part of 4-dimethylvaleronitrile), polymerization was carried out at 45° C. for 16 hours under an argon atmosphere.
０．４１部の凝集塊を除いて１６．００部のよく分散し
た重合体微粒子を得た。重合体微粒子を走査電子顕微鏡
で観察すると、直径は２７μｍでほとんど均一の球形で
あった。この重合体微粒子２部を１００部の水に分散し
、ジチオスレイトール１部を添加溶解して窒素雰囲気下
６０℃で３時間攪拌した。遠沈水洗をくり返したのち、
重合体微粒子を０．１６％硫酸水溶液中に２％の含有″
で分散きぜ、５０℃で２４時間加水分解処理を行なった
。このようにしてメルカプト基を導入した重合体微粒子
の元素分析値は、０４８．６７飴、Ｈ６，８６％、８８
７５％であった。丑だ重合体微粒子のメルカプト基をＥ
ｌｌｍａｎの試薬（５，５’−７チオビス（２−二１・
口安息香酸）；Ｇ、 Ｌ、 Ｅ ｌ １ｍａｎ 、 Ａ
ｒｃｈ、 Ｂ ｉ ｏｃｈｅｍ、 Ｂｉ ｏｐｈｙｓ、
８２．７０（１９５９））を用いて定量した結果、０
９６ミリグラム当量／グラムであった。After removing 0.41 parts of agglomerates, 16.00 parts of well-dispersed polymer particles were obtained. When the polymer fine particles were observed with a scanning electron microscope, they were found to have a diameter of 27 μm and an almost uniform spherical shape. 2 parts of the polymer particles were dispersed in 100 parts of water, 1 part of dithiothreitol was added and dissolved, and the mixture was stirred at 60° C. for 3 hours under a nitrogen atmosphere. After repeated centrifugation and washing,
Contains 2% polymer fine particles in 0.16% sulfuric acid aqueous solution.''
After dispersion, hydrolysis treatment was performed at 50°C for 24 hours. The elemental analysis values of the polymer fine particles into which mercapto groups were introduced in this way were 048.67 candy, H6, 86%, 88
It was 75%. The mercapto group of Ushida polymer particles is E
llman's reagent (5,5'-7thiobis(2-21.
benzoic acid); G, L, El 1man, A
rch, Biochem, Biophys,
82.70 (1959)), the result was 0.
It was 96 milligram equivalents/gram.
実施例２実施例１と同様に重合して得だ重合体微粒子２部を１０
０部の水に分散し、６０℃に昇温しで硫化水素ガスを吹
き込みつつ、３時間攪拌した。次に重合体微粒子を遠心
沈降させて、Ｎ／２０ロ水酸化ナトリウム水溶液で洗浄
し、ζらに水洗してから０．１６％硫酸水溶液に２％の
含量で分散させ、残存エポキシ基を加水分解する目的で
５０℃に２４時間保った。次に重合体微粒子を遠心分離
し、蒸留水で洗浄した。重合体微粒子に導入されたメル
カプト基を、Ｅｌ １ｍａｎの試薬によシ定量した結果
、ｏ、 ０７ ｓ ミリグラム当量／グラムであった。Example 2 2 parts of polymer fine particles obtained by polymerization in the same manner as in Example 1 were added to 10
The mixture was dispersed in 0 parts of water, heated to 60° C., and stirred for 3 hours while blowing hydrogen sulfide gas. Next, the polymer particles were centrifuged, washed with N/20 aqueous sodium hydroxide solution, washed with water, and then dispersed in a 0.16% sulfuric acid aqueous solution at a concentration of 2% to remove residual epoxy groups. It was kept at 50°C for 24 hours for decomposition purposes. Next, the polymer particles were centrifuged and washed with distilled water. The amount of mercapto groups introduced into the polymer particles was determined using Elman's reagent and was found to be 0.07 milligram equivalents/gram.
実施例３グリシジルメタクリレート、スルホプロピルメタクリレ
ート、トリエチレングリコールジメククリレートをモル
比で８５：１０：５となるように混合した。０．０１％
ドデシル硫酸ナトリウムと０８０１モル／ｌの４．４′
−アゾビス−４−ンアンペンタン酸の存在下で全モノ−
マー濃度が１０％となるようにして反応をおこなった。Example 3 Glycidyl methacrylate, sulfopropyl methacrylate, and triethylene glycol dimecrylate were mixed in a molar ratio of 85:10:5. 0.01%
4.4' of sodium dodecyl sulfate and 0801 mol/l
-Total mono- in the presence of azobis-4-ene ampentanoic acid
The reaction was carried out at a concentration of 10%.
反応液のｐＨはＺ２と彦るようＮａＯＨによりあわせて
おいた。激しく攪拌し乳化状態を保ちながら、ｉ’ｏｏ
ｗの高圧水銀灯の光を照射して２０℃で約１５分間反応
をおこなった。The pH of the reaction solution was adjusted to Z2 using NaOH. While stirring vigorously to maintain an emulsified state, i'oo
The reaction was carried out at 20° C. for about 15 minutes by irradiating light from a high-pressure mercury lamp.
反応後、ＣＣｌ２により未反応のモノマーを抽出し、除
去した。生成ポリマーの収率は６２％であった。After the reaction, unreacted monomers were extracted and removed with CCl2. The yield of the produced polymer was 62%.
６部ｍｙ／ｎｒｌの微粒子分散液と６０ ”ｇ／ ｍｌ
のジチオエリスリトール溶液とを等容混合し、５０℃で
一晩反応烙せた。微粒子を２５４００Ｇ。6 parts my/nrl of microparticle dispersion and 60”g/ml
and dithioerythritol solution were mixed in equal volumes and heated at 50° C. overnight. 25400G of fine particles.
３０分の遠心分離、再分散を繰り返すことで、０５モル
／を水酸化ナトリウム水溶液で洗浄し、さらに水で洗浄
した。得られたメルカプト基含有型量体微粒子を１’
Ｏｍ？ ／ ｍｌ！となるように水に分散させ、Ｎ２雰
囲気下に保存した。この微粒子の直径を走査電子顕微鏡
により測定したところ０．１７μｍηであった。重合体
微粒子中のメルカプト基をＥｌｌｍａｎの試薬により測
定した結果、ｏ、 ｓ ２ ミリグラム当量／グラムで
あった。By repeating centrifugation for 30 minutes and redispersion, 05 mol/ml was washed with an aqueous sodium hydroxide solution and further washed with water. The obtained mercapto group-containing mer fine particles were
Om? / ml! It was dispersed in water and stored under N2 atmosphere. The diameter of the fine particles was measured using a scanning electron microscope and was found to be 0.17 μmη. The mercapto groups in the polymer fine particles were measured using Ellman's reagent and were found to be o, s 2 milliequivalents/gram.
実施例４実施例２で調製したメルカプト基導入重合体微粒子分散
液の水をジメチルスルホギシド（以−Ｆ Ｄ Ｍ Ｓ
Ｏと略記）で置換して、重合体微粒子をＤＭＳＯ中に２
％の謡度で分散させた。この分散液５７ｎ１．を等容の
０．５％ＯＨＭ／ＤＭＳＯ溶液と混合し、窒素雰囲気下
に３０℃で１時間攪拌し／こ。反応後型合体微粒子をＤ
ＭＳＯで遠心洗浄した。沈降した重合体微粒子を１ｍｇ
／ｍｇのヒトガンマグロブリン／ＰＢＳ溶液（ＰＢＳ
ニリン酸塩緩衝食塩水、リン酸塩濃度０．０１モル／１
゜食塩０．１４モル／ ｌ、 ｐＩ（７，Ｄ ） ３
＋艷に分散し、窒素雰囲気下４℃に１６時間保った。次
いでこの分散液２葱を水洗乾燥したのち、６Ｎ塩酸中で
１１０℃に２０時間加熱することにより固定化きれた蛋
白質を加水分解してアミノ酸分析によシ生成アミノ酸を
測定した。その結果、ガンマグロブリン固定化量は重合
体微粒子１７ｎ７当り１０．５μｇであった。前記４℃
で１６時間保ったのち乾燥しなかったヒトガンマグロブ
リン固定化重合体微粒子分散液１ｍｌを、２モル／ｌグ
リシン水溶液（１）Ｈ７，５） １ ｍＡと混合し、窒
素雰囲気下に２５℃で１時間攪拌した。そしてＰＢＳで
洗浄したのち、１％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと
略記）添加ＰＢＳに、重合体微粒子含量が′ｌヂになる
ように分散させた。とのヒトｉ ％ＢＳＡ添加ＰＢＳに
よる）１ｏμｚとを、スライドグラス上で混合し、肉眼
により凝集の有無を判定した。その結果、無希釈、１０
倍希釈および’＋１）０倍希釈の抗血清では明らかに凝
集が認められだが、１０００倍希釈抗血清では凝集が認
められなかった。この凝集が抗原抗体反応による特異的
なものであることは、次のようにして阻止試験によシ確
認した。ヒトＩｇＧの１ｍｇ７ｍ１．０．１７ｎｌ／１
ｒｄｌ、０．０１７＃９／ｆｆｆおよびｏ ｍｙ／ｄの
溶液（溶媒は１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ）を各々等容の５倍
希釈抗ヒ）ＩｇＧ抗血清と混合し、６７℃で３０分イン
キュベートした。しかる後、その混合分散液１０μＬと
ヒトガンマグロブリン固定化重合体微粒子分散液１０μ
ｔとをスライドグラス上で混合して凝集を観察しだ。そ
の結果、ヒトＩｇＧ濃度００１およびＯｍ１／ｍｅの場
合は強い凝集が、０．１ｍ’ｉ／ｄの場合は弱い凝集が
認められだが、１ ”！ ／ ｍ１２の場合は凝集が完
全に阻止された。Example 4 The water of the mercapto group-introduced polymer fine particle dispersion prepared in Example 2 was mixed with dimethyl sulfogide (hereinafter referred to as FDMS).
Polymer fine particles were dissolved in DMSO by substituting 2
Distributed by % singing degree. This dispersion liquid 57n1. was mixed with an equal volume of 0.5% OHM/DMSO solution and stirred at 30° C. for 1 hour under nitrogen atmosphere. After the reaction, the combined fine particles are D
Centrifugal washing was performed with MSO. 1 mg of precipitated polymer fine particles
/mg human gamma globulin/PBS solution (PBS
diphosphate buffered saline, phosphate concentration 0.01 mol/1
゜Salt 0.14 mol/l, pI (7, D) 3
The mixture was dispersed in a vessel and kept at 4°C for 16 hours under a nitrogen atmosphere. Next, this Dispersion 2 of green onion was washed with water and dried, and then heated in 6N hydrochloric acid at 110° C. for 20 hours to hydrolyze the immobilized proteins, and the amino acids produced by the dispersion were measured by amino acid analysis. As a result, the amount of gamma globulin immobilized was 10.5 μg per 17n7 of polymer particles. The above 4℃
1 ml of the human gamma globulin-immobilized polymer fine particle dispersion that did not dry after being kept at 16 hours was mixed with 1 mA of a 2 mol/l glycine aqueous solution (1) H7,5) and incubated at 25°C under a nitrogen atmosphere for 1 ml. Stir for hours. After washing with PBS, the particles were dispersed in PBS containing 1% bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA) so that the polymer fine particle content was 1. and 10 μz (in PBS supplemented with human i% BSA) were mixed on a slide glass, and the presence or absence of agglutination was determined visually. As a result, undiluted, 10
Agglutination was clearly observed with the antiserum diluted 1:1 and 0:1, but no agglutination was observed with the antiserum diluted 1000 times. It was confirmed by the inhibition test as follows that this agglutination was specific due to antigen-antibody reaction. 1mg7ml of human IgG1.0.17nl/1
Solutions of rdl, 0.017 #9/fff and o my/d (solvent: PBS supplemented with 1% BSA) were each mixed with an equal volume of 5-fold diluted 5-fold diluted IgG antiserum and incubated at 67°C for 30 minutes. . After that, 10 μL of the mixed dispersion and 10 μL of the human gamma globulin-immobilized polymer fine particle dispersion were added.
t and were mixed on a slide glass and observed for aggregation. As a result, strong aggregation was observed at human IgG concentrations of 001 and Om1/me, weak aggregation was observed at 0.1 m'i/d, but aggregation was completely inhibited at 1''!/m12. .
実施例５実施例１で得られたメルカプト基導入重合体微粒子を、
実施例４と同様にしてＯＨＭで処理し、ヒトガンマグロ
ブリンを固定化した。実施例１と同様にして固定化蛋白
質量を定量した結果、重合体微粒子１７ｎｇ当りＺ８μ
ｇであった。また実施例１と同様にしてスラ昏ドグラス
上で抗ヒトＩｇＧ抗血清（ヤギ）と反応さぜだ結果、無
希釈、１０倍希釈、２０倍希釈および４０倍希釈抗血清
では凝集が認められだが、１００倍希釈抗血清では凝集
が認められなかった。なお抗ヒ）ＩｇＧ抗血清（ヤギ）
の代りに抗ヒトフィブリノーゲン抗血清（ヤギ）を用い
た場合には上記のどの希釈倍率でも凝集は認められなか
った。Example 5 The mercapto group-introduced polymer fine particles obtained in Example 1 were
It was treated with OHM in the same manner as in Example 4 to immobilize human gamma globulin. As a result of quantifying the amount of immobilized protein in the same manner as in Example 1, Z8 μ per 17 ng of polymer fine particles was determined.
It was g. In addition, in the same manner as in Example 1, the anti-human IgG antiserum (goat) was reacted on a glass glass, and as a result, no agglutination was observed with the undiluted, 10-fold diluted, 20-fold diluted and 40-fold diluted antiserum. , no agglutination was observed with the 100-fold diluted antiserum. In addition, anti-human) IgG antiserum (goat)
When anti-human fibrinogen antiserum (goat) was used instead, no agglutination was observed at any of the above dilutions.
実施例６（重合体微粒子へのＢＳＡの固定化）実施例６で調製したメルカプト基含有重合体微粒子１０
”ｇを１−のＤＭＳＯに分散させた。Example 6 (Immobilization of BSA on polymer fine particles) Mercapto group-containing polymer fine particles 10 prepared in Example 6
"g was dispersed in 1-DMSO.
分散液に１０ｍｇのＯＨＭを加えて６０℃で１時間反応
させた。ＤＭＳＯでコロイド微粒子を洗浄した後、１０
７ｎりのＯＨＭ処理コロイド微粒子を１πりのＢＳＡを
含むＰＢＳｌｙｎｌに分散させ、３０℃で１時間反応さ
せ、さらに１０７ｎ７のヒト血清アルブミン（ＢＳＡと
略す）を加えて４℃で一晩反応きせだ。ｐ Ｈ８，０の
０．１モル／ｌトリス塩酸塩緩衝液（Ｔｒｉｓと略す）
で粒子を洗浄し、１ｆｏのＨＳ Ａを含むＴｒｉｓ緩衝
液に分散させ、４℃で保存した。10 mg of OHM was added to the dispersion and reacted at 60° C. for 1 hour. After washing the colloidal particles with DMSO, 10
7n of OHM-treated colloidal particles were dispersed in PBSlyn containing 1π of BSA, reacted for 1 hour at 30°C, and then 107n7 of human serum albumin (abbreviated as BSA) was added and reacted overnight at 4°C. 0.1 mol/l Tris-hydrochloride buffer (abbreviated as Tris) with pH 8.0
The particles were washed with water, dispersed in Tris buffer containing 1fo HSA, and stored at 4°C.
（１３Ｓ Ａの測定）特願昭５６−１５８１９３に記した方法でＢＳＡの測定
をおこなった。すなわち、実施例１に記した微粒子の重
合においてＣＣｌ４を溶媒に混合しないで、同様の条件
で重合をおこない、直径４μｍ月の粒子を調製した。こ
の粒子をアミン化し、加水分解した。特願昭５５−４３
６１８に記載の方法に準じてグルタルアルデヒドで活性
化し、ＰＢＳに濃度が１％になるように分散烙せた。こ
の分散液と抗ＢＳＡ抗血清（ウサギ）を等容混合し、６
０℃で６時間反応はせた後、Ｉ−１，Ｓ Ａを粒子分散
液中で１係となるように加え、さらに１時間反応を続け
た。１５００Ｇの遠心沈降と再分散を繰り返すことによ
る洗浄の後、１％Ｈ８Ａを含むＴｒｉｓに分散はせ、抗
ＢＳＡ抗血清固定化固相を調製した。ＢＳＡを１μｇ／
ｍｌ、 １００ ｎｇ／ ｍｌ、１０ ｎｇ ／ ｍ
ｌ −、１ｎｇ ／ｒｎｌ含むＴｒｉｓ １００μｔに
各々抗ＢＳＡ抗血清固定化固相分散液ｉｏｏμｔを加え
、２時間６０℃で反応させた後に０．０２５％のＢＳＡ
結合コロイド微粒子分散液１０μｔを加え、２時間反応
さぜた。反応後Ｔｒｉｓ６ｍｊ！を加え１５００Ｇ５分
の遠心で固相粒子とコロイド微粒子を分離し、上清のコ
ロイド微粒子をボイック積分球式濁度計（日本精密光学
）により測定した。第１図に、１１００ｎ／ｍｌでの濁
度を１００％とした各ＢＳＡ濃度での散乱光強度を示し
だ。第１図かられかるように、ＢＳＡは１πｇ ／ ｒ
ｄ 〜１００ ｎｇ ／ ｉｌｌ！の範囲で測定できた
。(Measurement of 13SA) BSA was measured by the method described in Japanese Patent Application No. 56-158193. That is, in the polymerization of fine particles described in Example 1, polymerization was carried out under the same conditions without mixing CCl4 with the solvent, and particles with a diameter of 4 μm were prepared. The particles were aminated and hydrolyzed. Patent application 1984-1984
It was activated with glutaraldehyde according to the method described in 618, and dispersed and heated in PBS to a concentration of 1%. This dispersion and anti-BSA antiserum (rabbit) were mixed in equal volumes, and
After reacting at 0° C. for 6 hours, I-1,SA was added to the particle dispersion so as to become 1 part, and the reaction was continued for an additional 1 hour. After washing by repeating centrifugal sedimentation at 1500G and redispersion, the mixture was dispersed in Tris containing 1% H8A to prepare an anti-BSA antiserum-immobilized solid phase. 1μg/BSA
ml, 100 ng/ml, 10 ng/m
Anti-BSA antiserum-immobilized solid phase dispersion solution iooμt was added to Tris 100μt containing 1 ng/rnl and 1 ng/rnl, and after reacting at 60°C for 2 hours, 0.025% BSA was added.
10 μt of the bound colloid fine particle dispersion was added, and the reaction was stirred for 2 hours. Tris6mj after reaction! was added and centrifuged at 1500G for 5 minutes to separate solid phase particles and colloidal particles, and the colloidal particles in the supernatant were measured using a Boick integrating sphere turbidity meter (Nippon Seimitsu Optics). Figure 1 shows the scattered light intensity at each BSA concentration, where the turbidity at 1100 n/ml is taken as 100%. As can be seen from Figure 1, BSA is 1πg/r
d~100 ng/ill! It was possible to measure within the range of .
実施例７Ｎ、Ｎ’−ｐ−フェニレンジマレイミドノＰＢＳ飽和溶
液（ｐＨ７，０） １．５ ｍｌと実施例１で述べた方
法によって調製したメルカプト基含有微粒子担体の６．
３％ＰＢＳ分散液（］）］Ｉ−１７．０） ３−とを混
合した後、３０℃で１５分間放置した。次に微粒子を遠
心分離し、Ｉ）Ｈ６，３のＰＢＳ３ｒｎｌに再分散した
。そこへ濃度５ ｎｇ ／ ｍｅのβ−Ｄガラクトシダ
ーゼ溶液２０μｌを加えて、６０℃で６０分静置した。Example 7 1.5 ml of N,N'-p-phenylene dimaleimide PBS saturated solution (pH 7.0) and mercapto group-containing microparticle carrier prepared by the method described in Example 1.
After mixing 3% PBS dispersion (])] I-17.0) 3-, the mixture was left at 30°C for 15 minutes. The microparticles were then centrifuged and redispersed in I) H6,3 PBS3rnl. 20 μl of a β-D galactosidase solution with a concentration of 5 ng/me was added thereto, and the mixture was allowed to stand at 60° C. for 60 minutes.
反応後１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨをＺＯにし、５％Ｂ
ＳＡ／ＰＢＳ溶液２０μｔと１Ｍ塩化マグネシウム水溶
液２μｔを加えた。この分散液を遠心し、分離した微粒
子を、０、１ Ｍの塩化ナトリウム、１ｍＭの塩化マグ
ネシウム、０１％のＢＳＡ、ｏ、１％のナトリウムアジ
ドを含む００１Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）１０
ｍｌに再分散した。After the reaction, adjust the pH to ZO with 1N sodium hydroxide, and add 5% B
20 μt of SA/PBS solution and 2 μt of 1M aqueous magnesium chloride solution were added. This dispersion was centrifuged, and the separated fine particles were mixed with a 001M phosphate buffer (pH 7,0 )10
ml was redispersed.
このようにして調製したβ−Ｄ−ガラクトシダーセ固定
化微粒子の酵素活性を次のようにして測定した。前記β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ固定化微粒子分散液（１％）５
０μ７と０．１ ｍＭ ４−スチルウンペリフエリルβ
−Ｄ−ガラクトシドの溶液（媒質はβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ固定化微粒子分散液と同じ）１５ｏμｔとを混合
し、ろ０℃で２０分間振盪した。反応はｐＨ１０，３の
グリシン緩衝溶液２．５−を加えることにより停止させ
、生成した４−メチルウンベリフェロンの螢光強度を測
定した。３６ｉ］ｎｍの励起光で４５０ ｎｍの螢光を
測定した。較正用の標準試料には新しく調製した１μＭ
４−メチルウンベリフェロン溶液を用いた。その結果、
酵素反応によって生成した４−メチルウンベリフェロン
は４０ ｎｍｏｌであった。The enzyme activity of the β-D-galactosidase-immobilized microparticles thus prepared was measured as follows. Said β
-D-galactosidase immobilized fine particle dispersion (1%) 5
0 μ7 and 0.1 mM 4-stylumperipheryl β
-D-galactoside solution (medium is the same as the β-D-galactosidase-immobilized fine particle dispersion) was mixed with 15 μt and shaken at 0° C. for 20 minutes. The reaction was stopped by adding 2.5-glycine buffer solution of pH 10.3, and the fluorescence intensity of the produced 4-methylumbelliferone was measured. Fluorescence at 450 nm was measured with excitation light at 36i] nm. The standard sample for calibration was freshly prepared 1 μM
A 4-methylumbelliferone solution was used. the result,
The amount of 4-methylumbelliferone produced by the enzymatic reaction was 40 nmol.
第１図は実施例ホのＢＳＡ測定結果を示す線図である。特許出願人 東 し 株 式 会 社FIG. 1 is a diagram showing the BSA measurement results of Example E.Patent applicant Higashi Shikikai Co., Ltd.
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5531483AJPS59182804A (en) | 1983-04-01 | 1983-04-01 | Reactive fine particle and production thereof |
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5531483AJPS59182804A (en) | 1983-04-01 | 1983-04-01 | Reactive fine particle and production thereof |
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59182804Atrue JPS59182804A (en) | 1984-10-17 |
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5531483APendingJPS59182804A (en) | 1983-04-01 | 1983-04-01 | Reactive fine particle and production thereof |
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59182804A (en) |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61118398A (en)* | 1984-10-19 | 1986-06-05 | エクスプロアテリングス・アクチイエボラーゲツト・テー・ベー・エフ | Polymer coated partcle having fixed metal ion on surface |
| US5075221A (en)* | 1988-10-07 | 1991-12-24 | Eastman Kodak Company | Stabilized extraction composition containing a sulfhydryl-containing reducing agent and its use in chlamydial and gonococcal determinations |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5573704A (en)* | 1978-11-21 | 1980-06-03 | Elf Aquitaine | Polymer having active group |
| JPS5630405A (en)* | 1979-08-23 | 1981-03-27 | Toray Ind Inc | Preparation of hydrophilic, water-insoluble fine particle |
| JPS57135801A (en)* | 1980-12-23 | 1982-08-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Hydrophilic latex particles, manufacture and diagnostic drug containing same |
| JPS6476426A (en)* | 1987-09-18 | 1989-03-22 | Toshiba Corp | Compatible optical reproducing device |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5573704A (en)* | 1978-11-21 | 1980-06-03 | Elf Aquitaine | Polymer having active group |
| JPS5630405A (en)* | 1979-08-23 | 1981-03-27 | Toray Ind Inc | Preparation of hydrophilic, water-insoluble fine particle |
| JPS57135801A (en)* | 1980-12-23 | 1982-08-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Hydrophilic latex particles, manufacture and diagnostic drug containing same |
| JPS6476426A (en)* | 1987-09-18 | 1989-03-22 | Toshiba Corp | Compatible optical reproducing device |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61118398A (en)* | 1984-10-19 | 1986-06-05 | エクスプロアテリングス・アクチイエボラーゲツト・テー・ベー・エフ | Polymer coated partcle having fixed metal ion on surface |
| US5075221A (en)* | 1988-10-07 | 1991-12-24 | Eastman Kodak Company | Stabilized extraction composition containing a sulfhydryl-containing reducing agent and its use in chlamydial and gonococcal determinations |
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4415700A (en) | Hydrophilic latex particles and use thereof | |
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| JPS58171670A (en) | Immunoactive fine particle | |
| JPS6315552B2 (en) | ||
| JPS62231169A (en) | Immunological diagnostic reagents | |
| JPH0564744B2 (en) | ||
| JPH0431669B2 (en) | ||
| JPS58128326A (en) | Fine particle having immobilized immunologically active substance and preparation thereof | |
| JPH0564743B2 (en) | ||
| JPS6291183A (en) | Immobilized physiologically active substances | |
| JPS61159168A (en) | Immunological reagent for diagnosis |