【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]本発−はイムノアッセイ等において用いられる高い特異
性と低い交叉反応性とを有すみ抗体、この種の抗体生産
能を有するクローン、？−０種の杭体を含有する抗血清
、およびこれらの製法に−する０次に本発明は、この種
の抗体重九は該抗体を含有する抗血清を用いる分析法に
関す為。さらに本発明は、上記クローンを用いる特定抗体の製法
に関する。ホルモン等の生体内活性物質を高感度でかつ特異的に測
定する分析法としてイムノアッセイ法が知られている。この方法は、競合的な抗原／抗体反応を利用するもので
、一定量の抗体と可変量の抗原とを用いる分析法である
。たとえば、ラジオイムノアッセイ法は一般に次の一つ
のステップから成り立っている。（１） Ｉｌｉ識抗原及び特異抗体の作成。（２）非榔鐵技原存在下における＊ｍ抗原と特異杭体と
の反応。（３）標識抗原と抗体との反応物からの標識抗原の分離
。（４）簾射活性の測定１次いで標準−線を用いる定量。標識抗体と非榔鐵抗原とを用いることもできる。ステップｌが最も重要で掬定に用いる試殖としての抗体
は、被検物質（抗原）に対して厳書な特異性を有するこ
とが要求される。しかし、この要求が満たされない場合
がある。すなわち非常に高い特異性を有すると考えられ
るイムノアッセイにおいてさえも、用いられる抗体が被
検物質と類似構造を有する他の物質と交叉反応を生じる
場合があ〕、これがイムノアッセイの一点の７つとなる
場合がある。 ・このような難点を克服する公知手段は次の二つの方法に
大別される。すなわちｌ）物理化学的方法を利用して、被検物質の試料から各
種の交叉反応性物質を除去した後に測定する。Ｊ）抗血清中の交叉反応性抗体を免疫歇着剤を用いてあ
らかじめ徴収して除去する。または検出物質に対し出来
るだけ高い特異性を有する高度に？ＩＩｌされ九抗体を
測定に用いる。目的物質に対して最高の特異性を有する抗体を得る丸め
に、動物宿主に投与する前に担体蛋白質に抗原を化学構
造上適当な部位において、結合させることくよって、抗
体くよって認識されるべき抗原の、特異抗原決定基部位
を担体蛋白の表面に露出させることが提案されている。特異抗原決定基部位が露出されると、低交叉反応性抗体
の産生が誘起される。しかし現在までに行なわれて来九この種のアブリーチは
、一般に複雑な手法と金成過禍を必要とする欠点がある
。しかも交叉反応性抗体の産生を避けることができない
場合もある。仁の種の１―は、イムノアッセイ法の限界
を規定している。本発明は、Ｄ−／ルタｉ／＠とＤ−９ジンとの共重合体
（以下Ｄ−ＧＬという）０１１１！用によって。交叉反応性抗体の量を減少することができ、しかもある
種の物質（九とえば被検物質）Ｋ対して優れた特異性を
有する抗体を得ることがで自るという知見に基いている
。仁の共重合体（Ｄ−ＧＬ）は％ ＧＩＩ胞（抗体産生
前駆細胞）に作用して効果的な免疫無応答性（寛容性）
を誘発する。すなわちＤ−ＧＬと締金された抗原を動物
に投与し丸場合、一般に生体内のＤ−ア建ノ酸は容ａＫ
代謝されないし、重要Ｄ−ＧＬＦｉ生体内のＴ細ｊＩＩ
ＩＯ免疫応答性を集質的Ｋｌｌ起しない。従って、Ｄ
−ＧＬと結合された抗原を動物に投与した場合、抗原と
Ｄ−ＧＩＩの結合物はＢ９ンパ球表藺の免疫グ胃プリン
受容体と結会し、これＫよって、辷れらＯ＃ｌ施内に不
可逆的な無応答性（寛容性）を誘起する。従って本発明は第１抗原に対し高い特異性を有し、′＊
丸上記第７抗原と構造的Ｋ１１ｌ似し九一つ以上０＊原
決定畠を有する菖Ｊ杭原に対して低い交叉性を有す為目
的とする抗体を作成する方法において、Ｄ−ダルタ電ン
蒙と１−リジンとＯ共重合体と上ｌ！館ココ抗原の共有
結合物を哺乳動物Ｋｍ与し、これＫよって上１ｅｊｌｌ
Ｊ抗原に対す為効果的な免Ｉ１２無応答性を上記動物Ｋ
ｌｌ起した後に上記動物を上記第１抗原て免疫すること
を特徴とする改嵐された抗体の作成方法を提供する。本発明の方法は、上記の他の抗原（第２抗原）とＤ−Ｇ
Ｌ （Ｄ−／ルタンイ酸とＤ−リジンとの共重合体）と
の共有結合物を哺乳動物に投与することｋよって抗原に
対して免疫無応答性を誘起した後、との哺乳動物を上記
の第１抗原で免疫することを特徴としている。本発明の方法によ如、上記抗体を産生する能力を有する
一定の遺伝的構造をもつ細胞（以下クローンという）を
哺乳動物の生体内に産生することができる。従って１本
発明によるＤ−ＧＬと交叉反応性抗原との結合物を哺乳
動物に投与することによ如、交叉反応性抗原に対して実
質的に有効な免疫無応答性を誘起し、次にこＯ哺乳動物
を所望の抗原すなわち特定の免疫決定基を含有する抗原
で免疫することによって低交叉反応性で特定の決定基に
対して高い特異性を備え九抗体を産生ずることができる
。上述Ｏ高い特異性を有する抗体を、精製抗体の形で、を
九は上記抗体を含有する杭血清の形で産生することがで
自ゐ、鵞え哺乳−物の生体からと東出し九ターーンを抗
体産生に利用することもで自る。すなわち所ＭＥり夕謬
−ンを適当な朧瘍細麿との融食（ハイブリッド化）Ｋよ
って永久に生自クツけさぜ、このターーンから抗体を産
生することもで自為、質って、一度クロー／が得られる
と、もとの生龜九哺乳動物がいなくても所望の抗体を産
生することがで自る。従って、誘発＠によシ、上記の方法で得られたりｐ−ノ
を利用する上記抗体ＧＩＩ法が提供される。よく知られ
えように、適当なり四−ンが入手で龜れば、これを適当
な腫瘍細胞と締金することによ〉、融會１ＩＡｊｌｉｉ
（）飄イプリドーマ）を容ＴｏＫ４ｊｈることがで自る
。九とえば、ある種のりｐ−ンと骨髄腫瘍細胞（ｘＩ３
ｒ＊ｌｏ＋ｍ ｃａｌｌｇ ） ０癒金細ＩＩＩ（ハイ
プリドーマ）は文献中に、九とえばケー２−（！δｈｌ
＠ｒ ）等〔ネーチェア（−一）。Ｊｌ４巻、参Ｆｊ−４ｃＦ７（／Ｆ７ｊ）、およびユー
ロピアン ジャーナル、オプ、イミュノージー（ｍｕｒ
、 Ｊ、！ｍｍｕｎｏ１． ）、４巻、！／／−Ｊ／デ
（ｌｒｙｊ））Ｋよｌ；（ルｘタイｙ （Ｍｉｌｓｔｏ
ｉｎ）等（ＭＩＬｔｕｒｅ。２４４巻、ｊｊｔＯ−４１２（／り７７）〕によ如；そ
してクオルシエ（Ｗａｌｓｈ ） （Ｍａｔｕｒｅ、コ
ａａ６％参りＩ（ｌデフ７）〕により上記されている。次いで諌ハイブリッド細脂を麹の動物Ｋ１１ｌｌｌする
と、諌動物生体内（例えばマウスの腹水中など）で増殖
を続け、大量の特異抗体を産生する。従ってこのハイブ
リッド細胞は所望の抗体の新丸な源泉となシ得る。次に本発明は、前述の方法によ〉得られ九抗体またはこ
の種の抗体を含有する抗血清を利用し九イムノアッセイ
法を提供す為、上記抗体は上記物質に対して特異性を有
しているので、従って、アッセイは抗体と上記物質との
反応によって行なわれる◎この場合、アッセイされるべき物質は抗原として作用す
るのである。本発明によるイムノアッセイ渋を、ラジオ
イムノアッセイ渋、非アイソトープイムノアラ竜イ法（
たとえば酵素、遊離基、細胞、ウィルス、金属イオン、
螢光体、化学的発光体勢で標識を行った方法）で行なう
むとかで會る０本発１ｉＫよるアラ七イ法は、交叉反応
性抗原の存在下にも行なうことができる。本発明の目的に利用されるＤ−１）Ｌ社分子量が、約２
７．ｔ）００ｆｉら約／２ＱＯＯ００４ｈｔ）＃ヨイ＊
Ｄ−グルタミン酸とＤ−リジンのモル比は７０：Ｊｌ
）〜ＪＩＳニア０のものが利用され、たとえばＤ−グル
タミン酸：Ｄ−リジン＝ｔＯ：＋ｏのものである。この
種の共重合体は、例えばＭｌｌ・ａ−４ｅａａ （米国
）社から市販されているが。一方、常法により、Ｄ−グルタミン酸−ｒ−メチルエス
テルのＮ−力＾ボン駿無水１１ｋｌトｔ−Ｍ−カルボベ
ンジルオキシ−Ｌ −１７’／ンのＮ −カルボン酸無
水物とを適当なアミンの存在下共重合し、次いで保験基
をと）はずすことによって調製することもできる。イムノアッセイ用抗体産生に、たとえば多数の天然物を
用いることができるう好ましい材料の例はステロイド類
、及びそのグルクロン酸抱合体および硫酸抱合体、カテ
コールアミン類、はデチド類及びそのサブユニットなら
びに関連化合物（フラグメント）その他の各種薬剤等で
ある。社体的なステロイドの例は、テストステロン（以下Ｔと
略す）、５α−ジヒドロテストステロン（１：Ｊ下ＤＴ
（Ｔ ト略ｔ ） 、アンドロステロン（Ａｎｄｒｏｓ
ｔｓｒｏｎｅ ）、エチオコラノ０７（ＩＣｔｉｏ−ｃ
ｈｏｌａｎｏｌｏｎｅ ）、プログステｏ ン（Ｐｒｏ
ｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ）１７α−ハイドロキシプログス
テロン（１７α−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅａｔｅｒｏ
ｎｅ ）、プレグネノｏｙ（Ｐｒｏ−ｇｎｅｎ０１０ｎ
θ）、テヒドロエピアンＰロステロン（ＤｅｈｙｃＬｒ
ｏｅｐｉａｎｄｒｏａｔｅｒｏｎｓ ）、エストラジオ
−Ａ／ （０ｅｓｔｒａｄｉｏｌ ）、エストｏ ｙ
（０ｅｓｔｒｏｎｅ ）、エストリオール（０ｅｓｔｒ
ｉｏｌ ） 、アルドステロン（ＡｌｄＯｓｔｅｒｏｎ
・）、デオキシコルチプステロン（Ｄｅｏｘｙｃｏｒｔ
ｉｃｏｅｔｅｒｏｎａ ）、コルチゾール（Ｃｏｒ−ｔ
ｉｓｏｌ ）、コルチゾｙ （Ｃｏｒｔｉｓｏｎｅ ）
、コルチ＝ｔｘテｏ ｙ （ＣｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒＯ
ｎｅ ） 、 １１−デオキシコーチゾール（１１−ａ
ｅｏｘｙｃｏｒｔｔａｏｌ） 、胆汁酸（グリップール
酸（ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ ）、コール酸
（Ｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ ）、デオキシコール酸（Ｄ
ｅ−＝ｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａａｌ ）、リトコール酸
（ＬｉｔｈＯＱｈｏ１１０ａｃｉ４ ）など）及びその
抱合体である。カテコールアミン類の例は、ドパーミン（Ｄｏ−ｐａｍ
ｉｎｅ ）、ノルエピネフリｙ （Ｎｏｒｅｐｉｎｅｐ
ｈｒｉｎｅ ）、エピネフリｙ （Ｆｆｐｉｎｅｐｈｒ
ｉｎｅ ）である。はデチドホルモン類の例はガストリン（Ｇａｓ−チｔｒｉｎ ） 、コレシストキニン−パンクレオフミン
（Ｃｈｏｌｅｃｙａｔｏｋｉｎｉｎ−ｐａｎｃｒｅｏｚ
ｙｍｉｎ ）、インシュリン（工ｎ５ｕｌｉｎ）、プロ
インシュリン（Ｐｒｏ−１ｎｓｕｌｉｎ ）、Ｃ−ｄブ
タイド（Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ）、グルカゴン（Ｇｌｕ
ａａｇＯｎ ） 、卵−胞刺激ホルモン（１１′ＳＨ）
、 黄体ホルモン（ｘＪＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロ
ピン（ＨＣＧ ） 、ソマトスタチン（８ｏｍａ−ｔｏ
ｓｔａｔｉｎ ）、甲状腺刺激ホルモｙ （Ｔ０ｎ ）
およびこれらのサブユニットならびに関連化合物などで
ある。薬剤の例ばβ−遮断剤のプロプラノロール（ｔ−Ｐｒｏ
ｐｒａｎｏｌｏｌ ）など、鎮痛剤のＬ型またＦｉＤ型
のシクラゾシン（Ｃｙｃｌａｚｏｃｉｎｅ ）などであ
る。例えば抗′ｒ抗体または抗血清が常用の免疫法で作成さ
ルる場合、ＤＨＴの構造はＴの構造に酷似しているので
、ＤＨＴは交叉反応性抗原として作用する。１＋ｊＪ様
に、抗ＤＨＴ抗体または抗血清が作成される場合、Ｔは
交叉反応性抗原として作用する。このように［７て、各
種ステロイドは他のステロイドに対する交叉反応性抗原
として作用するのである。上記の物質は一般的に・・ブテンの類である。すなわち、これらの物質は抗体と結合することは出来る
が、生体に投与される前に担体と結合って抗体産生を誘
起するためには゛、上記物質を適当な担体上に結合させ
なければならなｈｏたとえば、ある橿の抗原に対して特
異的な抗体（たとえば抗テストステロン抗体、以下抗Ｔ
抗体と称する）を誘起するためには、この抗原を適当な
神体と結合して免疫に用いなければならない。しかし、こうして得られたＴクローンおよび抗体は類似
構造を有する物質（例、ＤＨＴ ）と強い交叉反応性を
有す石のが普通のことである。本発明によれば、Ｄ −
ＧＬ共重合体と交叉反応性抗原（この場合にはＤＨＴで
ある）との結合産物で動物を処理することにより、上記
の交叉反応性を有する抗ＤＨＴクローンおよび抗体の生
成を特ＧＬとの共有結合物を用いて動物を処理するとと
厘鳳上記はズチドの構造の一部は所望抗Ｖの構造の一部と共
通である）。この−例は、消化管ホルモンの一種である
コレン゛ストキニンーパンクレオチミン（以下ＣＣＫ−
ＰＺと略す）のＣ−末端の８つのアミノ酸からなるオク
タベゾチドの抗体である。尚参考のためにガストリン（
ヒト）、ＣＣＫ −ＰＺおよび関連化合物の構造式（ア
ミノ酸配列）を示す。ヒトガストリｙ ： （Ｐｙｒｏ）Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−。Ｇｌｕ −Ｇ １ｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
−Ｇｌｙ−擾（８０，Ｈ）Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨＩＣＣＫ −Ｐ
Ｚ ： Ｌｙａ−ム１ａ−Ｐｒｏ−８ｏｒ−Ｇｌｙ−
ムｒｇ−Ｖａｌ−Ｂｅｒ−Ｍｅｔ−工１ｅ−Ｌｙｓ−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−８６ｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏ−Ｂａｒ−Ｈｌｓ−ムｒｇ−工１ｅ−８ｅｒ−Ａｌｉ
ｌｐ−ムｒｇ−ム８ｐ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−量８０、ＨＧｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅ ｔ−Ａ８ ｐ−Ｐｈｅ −ＮＨ
ＩＣＣＫ−８−Ｐ ： Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｍａ
ｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ′−Ｍｅｔ−ムｓｐ−０３ＨＰｈｅ−ＩＪＨ２ペンタがストリン ： Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−ムａ
ｐ−Ｐｈｅ −ＭＨ２コレシストキニン−バンクレオ
チミン（Ｃｈｏｌｅ−胆嚢収縮を起こす消化管ホルモン
で、お個のアミノ酸からなるポリはデチドである。その
生物活性はｃ−末端の８つのアき）酸部分（ＣＣＫｏｏ
ｔａｐｅｐｔｌｅ 、以下ＣＣＫ−８−Ｐ と略す）
に存在することが知られている。また、ＣＣＫ−８，−
ＰのＣ末端５個のアミノ酸配列は胃において酸分泌全刺
激するホルモンであるがストリンのＣ末端５個のアミノ
酸配列と同じである。従つ−て、従来の抗ＣＣＫ−８−
Ｐ抗体はガス） ＩＪンと高い交叉性を示すことが知ら
れている。一方、ＣＣＫ−８−Ｐおよびその反応性リセデターは脳
にも存在することが近年見出された。こＯホルモ７ （
７）神経伝達物質（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔθｒ
）としての機枠を調べることや胃鴫管の疾患との関係の
あるこのホルモンの分泌と作用を知ることが望まれてい
る。従って、ＣＣＫ−８−Ｐに特異的に反応する抗体の
提供が重要である。結合物を動物に投与することによって、−ｍ−９１１＆
−＋Ｒンタガストリンおよびまたはガスト０リン様化合
物と交叉反応する抗体を産生ずるクローンｌを不活化し
た後、１紀動物をＣＣＫ−Ｑ −Ｐ−ＫＬＨで免疫する
ことｆよって、ＣＣＫ−ｇ−Ｐと特異的に反応し得る抗
体を生産し得るクローンおよびこの種の抗体を得ること
ができる。従って本発明によると、所望の抗原のＣ端側フラグメン
トとしてのインタがストリンとＤ−ＧＬとの共有結合物
を用いて動物を処理した後に、この動物をガストリンで
免疫することＫよ抄、クローン（ＣＣＫ−ＰＺと交叉反
応する一クローン）の産生を抑制すれば、ガストリンに
対して特異性を有する抗体を得ることができる。下記の実施例から分るように、ｋゾチドの分別（ｒｒａ
ｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ） Ｉｃよって、全はブチＦか
ら特定の抗原決定基を容易に除去することができない場
合でも、Ｄ−ＧＩｔと交叉反応性はゾチドとの共有結合
物を免疫動物に投与することによ的って、ン望の特異網抗体を得ることができる。リゾチームの抗原決定基の組成が” ８ｕｒｆａｏ・Ｉ
ｔＬｍｕｘｌｔｉＯｎ ｍｏｄｅｌ ” に基づく合成
ペプチドを使って証明されている〔ムｔａｓｓｌ、 Ｍ
、 Ｌ Ｉｍｍｕｎｏ−ｃｈ＠ｍ１ｓｔｒｙ Ｈ＄巻９
０９−９８６ Ｎ （１９７８年）〕。その場合の如く、抗原決定基が不規則な間隔で存在する
アミノ酸によって形成されるような場合、−たとえば抗
原決定基がムＢＯＤ なるアミノ酸で形成されていると
すると、全く異なったアミノ酸配列を有するペプタイド
でもたまたま立体的に共通の抗原決定基Ｂ−０を形成す
る部分があり九場合、アミノ酸Ｂ−０を含む抗原決定基
をＤ−ＧＬと結合して得られた物質を動物に投毒し、こ
れｋよってアずノ酸Ｂ−０を含む抗原決定基との交叉反
ｉ性をもつクローンを消去すると、この結果、抗原決定
基ム−Ｄに向かった特異的クローンを１選択的に増加さ
せ、特定の部位に向かった抗体のみを産生増巾すること
ができる。上記抗原とＤ−ＧＬとの結合物は、（１）上記抗原とＤ
−ＧＬをＷ接結合する方法あるいは（２）抗原とＤ−
ＧＬとを架橋して間接的に結合する方法によって調製さ
れる。架橋物としては、 Ｂｒｌａｎｇｅｒらによるオ
キシム化合物、サクシニル化合物およびクロルカルボン
酔化合物〔例えば、Ｂ、？。＋！２１１ ７１！ＩＥｒｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、 ！、 ｓ！４→（Ｉ Ｑ−５７） ）カルボキシ
メチルチオエーテル誘導体（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎムｅｔ
ａｌ、日ｔｅｒｏｌ＊２０．７８９ （１９７２）
）、カルボキシメチルエーテル誘導体（Ｐ、Ｎ、 Ｒａ
ｏ ｅｔ ａｌ。Ｊ、５ｔｅｒｏｔａ Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ９．５３９
（１９７８） ）などが用いられる。結合法としてはカルボジイミド法（Ｃａｒｂｏ−法ｄｉｉｍｉｄｅ Ｍｅｔｈｏｄ ）、無水物ｊｌ （Ｍ
ｉｘｅｄ Ａｎｈｙ−ｄｒｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ ）、シ
ョツテンバウマン法（Ｓｃｈｏｔｔｅｎ−Ｂａｕｍａｎ
ｎ Ｍｅｔｈｏａ ）、イノΦサゾリウム法などがあげ
られる。なお、−Ｊｌ ｆ（、基が上記化合物に導入されれば、
グルタアルデハイド法管用いて結合することができ、又
−ＮＨ２基または−ＥＩＨ基が導入されればｍ−マレイ
ミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ・サクシニミドーエス
テル、サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル−
シクロヘキサン）−１−カルボキシレート、サクシニミ
ジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート等ま
たはＮ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）
プロピオネート、Ｎ−サクシニミジル−（４−アリ「フ
ェニルジチオ）プロピオネート等が用いられる。その他ズデチＰ化学において常用されるはデチド類の他
物質との結合方法は、全て、Ｄ−ＧＬと、抗原との結合
に利用できる。また本発明で用いられる免疫抗原は通常はノ・ブテンで
あるので、抗原を通常の免疫方法で常用される適当なキ
ャリアーと結合したＶｔＫ用いられる。好適なキャリアーとして例えば、スカシガイのヘモシフ
＝ ７ （Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈａｅｍ
ｏｃｙａｎｔｎ。以下ＫＬＨと略す）、種々の異種動物、例えばヒト、ヤ
ギ等の血清ｒ−グロブリンやアルプきンなどが例示され
る。これらのキャリアーと抗原、そのサブユニットまたは関
連フラグメントとの結合方法は、交叉性抗原そのサブユ
ニットまたは関連フラグメントとＤ −ＧＬとの結合方
法と同様で直接結合させるか、適当な中間物で架橋して
結合する方法が用いられる。徒者の場合Ｄ−ＧＬと交叉
反応性抗原の結合に用いたと同じ中間物と方法が用いら
れる。免疫方法は常法による。動物によって抗原（ハプテンと
キャリアとの結合物）の生理食塩水溶液を腹腔内もしく
は足前と背中に、初回は完全フロインドアジュバントと
共に、２回目はＩ不完全フロインドアジュバントと共に
投与する。その後、マウスでは生理食塩水のみでよい。ウサギのよ
うな大動物では完全フロインドアジュバントと不兜全フ
ロインドアシュパン）！交互に投４することができる。投与量は抗原とキャリアーの結合比、キャリ′アーの分
子量等によるが、通常は小動物例えばマウスでｌ／μｆ
／〜１００μｔ７１匹、ウサギ等の大動物では０．１■
〜１■／１同／１匹を２〜５回、２−４週間毎にくり返
し投与する。交叉反応性抗原と、Ｄ−ＧＬとの結合物を通常は第１回
の免疫操作の２−３日前に投与する。本ちろん抗原の種類によっては、第１回、第２回の費疫
処理后で本抗原とＤ −ＧＬとの結合物を投与して−も
よい。ポ交叉性抗原とＤ−ＧＬとの結合物の投与量はマウスの
ような不動物では、１００μ２〜５００ ｔｔｆ、ウサ
ギ等の大動物では２−１０１９が好ましい。この投与量
は交叉反応性を示す抗原（ハプテン）のＤ−ＧＬに対す
る結合量、結合位置や中間に介在する化合物の種類等に
より多少変化する。実用的には、抗原とＤ−ＧＬとの結合物は生食溶液とし
て腹腔内に投与される。交叉反応性抗原とＤ−ＧＬとの結合物の結合様式は免疫
用抗原とキャリアとの結合様式と同一であることが好ま
しいので、同一の中間物を交叉反応性抗原とＤ−ＧＬと
の結合および抗原とキャリアとの結合に用いることが好
ましい。上舵の如く、Ｄ−ＧＬと交叉反応性抗原との結的無応答
性を誘起することができる。その後、る特定の抗原決定
基に対して極めて高い特異性ｌを有する抗体を産生じ得
るクローン、抗体もしくけ核抗体を含有する抗血清を得
ることができる。前述の知りはマウスのような小動物ばかりでなくウサギ
のような大動物に於いても確認された。動物種が違えば
結果も違うと予想されるにも拘らず、小動物でも大動物
でも同じ結果が得られたことは実用的にとても重要であ
る。何故ならばウサギのような大動物を使用すると、マ
ウ／のような小動物よりも、もつと大量の抗体を得るこ
とができるからである。ＴとＤＨＴのような、構造類似の化合物を識別し得る抗
体の作成は従来困難であったが、本発明によって、一つ
の抗原を他の交叉反応性抗原から識別し得る抗体を産生
じ得る多数のクローンを選択的に得ることができる。Ｉ
Ｐ！Ｆ異性抗体を産生するクローンの住体内での頻度が
増加する結果、特定のクローンを摘出、単離することが
実際に可能となる。公知文献によると、特定の、抗原を
分別する能力を有するクローンを動物から取り出せる確
率は約百万分の１ないし一千万分の１であり、−従って
との種の摘出および単離は事実上不可能とされていた。しかＬ７、本発明によって得られる特異的抗体産生能を
有するクローンは、交叉反応性決定基を含有する抗原で
免疫し九場合においてさえも、所望の抗原決定基と構造
上類似の交叉抗原決定基との差を特異的に識別すること
がで龜る。本発明の方法は、との種の特異抗体を高い確
率で生成することを可能にし、従って、この種の特異性
抗体量生能を有するクローンの生成の確率も高めていゐ
。Ｄ−ＧＬと低交叉反応性抗原との結合法、結合つて１本
発明の方法を、すべての抗体生産法に適用することがで
きる。次に本発明は、試料中に含有された特定物質の量が不明
である場合Ｋ、この物質を簡単に定量する方法を提供す
る。この方法は後記方法によって得られた抗体または抗
血清を用いることを特徴としてい・る。下記の実施例において用いられた試薬および分析法は次
の通りである。（１１ＤＨＴ −３＋ （〇−カルボキシメチル）オキ
シム（以下ＤＨＴ −３−ＣＭＯと略す）の合成法。（イ） 反応式：％式％））））イト°ロクロライド （東京化成工業株式会社）＋１．
３ ｇ （２，７ｍｍｏｌｅ ）２Ｎ−ＮａＯＨ１，
２５１１ｄエタノール １５ｄ（ハ）操 作上記原料を還流器付丸底容器に入れ３時間加熱還流後反
応液に精製水４５−を加え、Ｉｃ希ＮａＯＨ液にてｐｌ
’ｉを８にした。この液を分液ロートに移し、酢酸エチ
ル約３０−を加えて振とうし、次いで酢酸エチル層を分
液して除き、未反応ＤＨＴを除去した。次いで水層に氷
を加えて冷却し、希塩酸で酸性（約ｐＨ４）にし冷酢酸
エチルを加え生成したＤＨＴ−３−（ｏ−カルボキシメ
チル）オキシムを抽出し、骸酢酸エチル）−を無水硫酸
ナトリウムで脱水後、酢酸エチルを蒸発除去し残渣を熱
メタノールから再結晶し、目的物を得る。（２： テストステロン−３−（ｏ−カルボキシメチ
ル）オキシム（以下？ −３−ＣＭＯと略ス）の合成法
。３Ｈ−ＤＨＴ Ｋ代、ｔ テ３Ｈ−Ｔ、 ＤＨＴＫ 代
ニーｒ−Ｔ ヲ夫々同モル量用いる他は（１）と同様の
操作を行なって目的物を得た。（３１ｈａｐｔｅｎ −Ｄ −ａＬの合成法（イ）
ＤＨＴ −ａ −（０−カルボキシメチル）オキシム−
Ｄ−ＧＬ（以下ＤＨＴ −３−Ｄ−ＧＬと略す）の合成
法（Ｂｒｌａｎｇｅｒ等による混合酸無水物法に準拠す
る）反応式：（１１使用原料ＤＨＴ−３−ＣＭＯ，（）レーサーとしての３Ｈラベル
したＤＨＴ −３−ＣＭＯを含む）２０″ｑ乾燥ジオキサン （１ｍ＋５ｄ）ｔｒｉ −ｎ−
ブチルアミン ２０μｔクロルギ酸インブ
チルエステル １０ μを精製水
６−Ｄ−（）Ｌ （ＭＹ ４９，０００ ） ３０
ＷＩ Ｎ −ＮａＯＨ１５０μｔ（ｋｌ） ８作ＤＨＴ−３−０Ｍ０２０ｗ９を無水ジオキサン（ジオキ
サンにモレキュラーシープ５ムを加え脱水したもの）１
−に溶解し、攪拌下にｔｒｉ −ｎ−プチルアンン加μ
ｔを加え１１゛Ｃに保ちつつ５分間攪拌した。次いでク
ロルギ酸イソブチルエステルｌＯμｔを加え１１°Ｃに
保ちつつ１時間攪拌下に反応する。別にＤ−ＧＬ３０′Ｈ９を精製水６−に溶解し、ｌ Ｎ
ＮａＯＨ１５０μｔを加え混和し、この液にジオキサ
ン５−を徐々に加えた。このＤ−ＧＬ溶液を攪拌下上配反応液に一度に加えた。１０分後、ｐＨを調べ、ＩＮ−ＮａＯＨを極く少しずつ
加えてｐａを６．５〜７．０に戻し、約２時間１０°Ｃ
前後で攪拌を続ける。次いでこの反応液を４°Ｃで一夜
水にて透析し、翌朝希塩酸で約Ｔ）Ｈ４，５に調節する
と沈澱が析出した。この液を４°Ｃで７時間放置し沈澱
を完了した。次いでこの液を遠心分離しく ４’Ｃ，３
，００Ｏｒｐｍ。９分間）上清は捨て、沈澱物に精製水ｌＯαを加え、ｌ
Ｎ−ＮａＯＨでｐＨを約７．０に調整して沈澱物を溶
解する。この溶液を４でで精製水で１夜透析し１次いで
凍結乾燥した。トレーサーとして加えたＨ−ＤＨＴ−３−ＣＭＯ１■当
りの放射活性と反応生成物１ｔｎｇの放射活性よりＤ−
ＧＬＩモル当りに結合したＤＨＴの数を算出した。得ら
れた反応生成物のＤＨＴ対Ｄ−ＧＬのモル比は３０＝１
であった。Ｋｒｌａｎｇｅｒ等による混合酸無水物法の原籍（、Ｔ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２２８．７１３ （１９５７
） ）より算出したＢＡＡに対する水およびジオキサン
の葉ではＤ−ＧＬを添加した時にグル状になるために、
水およびジオキサンを多量Ｋ ７ＪＯλ、Ｄ−ＧＬが反
応液中でグル状になるのを防ぎ、かつ反応が適当に進む
ようにジオキサンと水の量を決めた。この工夫により混合酸無水物法でＤ −ＧＬとオキシム
の結合が可能となり且つ、充分の曽のオキシム、がＤ
−ＧＬに結合するのを可能にした。（ロ） テストステロン−３−（ｏ−カルボキシメチル
）オキシム−Ｄ−ＧＬ（以下Ｔ−３−Ｄ−ＧＬと略す）
の作成Ｔ−３−オキシム（トレーサーとしての３ＨラベルＴ−
３−オキシムを含む）を用いる他は前記と同様の操作を
行ってＴ−３−Ｄ−ＧＬ ３７４ （Ｔ ： Ｄ、−Ｇ
Ｌのモル比は３０：１）を得た。（４） ｈａｐｔｅｎ −ＫＬＨの合成法（イ） Ｍ
Ｔ −３−（０−カルボキシメチル）オキシム−ＫＬＨ
（以下ＤＩ−１’ｌ’ −３−ＫＬ）Ｉと略す）の作成
法（ａ） 使用原料ＤＨＴ−３−ＣＭＯ１２ｑ無水ジオキサン ０．５ｍ＋２．５ｓ
ｇｔｒｉ −ｎ−ブチルアミン １０ ｌ
ｉｔクロルギ酸イソブチルエステル ５μを精
製水 ４ｄＫＬＨ（Ｍｗ １００，０００ ） １５０ Ｈ
９１Ｎ ＮａＯＨ７５μｔ（ｂｌ操作上記原料を用いて前記同様の操作を行なってＤＩＥＴ −３−ＫＬＨ５４，７ｙｔａｙ（ＤＨ
Ｔ ： ＫＬＨのモル比は１０ ： １ ）を得た。（ｏ） Ｔｅ５ｔｏａｔｅｒｏｎｅ −３−（ｏ
−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ）ｏｘｉｍｅ−ＫＬ
Ｈ（以下Ｔ −３−ＫＬＨと略す）の作成法Ｔ−３−ＣＭＯ４０１Ｗ無水ジオキサン ２ｄ＋５ｍＩｔｒ１
−ｎ−！チルアｉン ４０μｔ１ａｏ−ブ
チルクロルギ酸 ２０μを檀製氷
１０ｍ１！ＫＬ）Ｉ ３００
＃Ｉ ＮＮａＯＨ３００μｔを用いて前記と同様の操作を行ってＴ−３−ＫＩＪ）Ｉ
１９７１ｑ（Ｔ二ＫＬＨのモル比は８：１）を４＃た
。（５１Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓｅｙ ＠作法ｖ：
、４１）’Ｈ−Ｔ標準液１．２，３Ｈ−Ｔ （５８Ｃ１／ｍｍｏｌ ）を工ｐ
） −ルで希釈し、２０，０００６ｐｍ／１０１ｔｔ
（Ｔとしテ４５ｐｆ）含むエタノール溶液を作成する。２） ’）Ｉ−ＤＨＴｍｍ液５α−ジヒドロ−１，２，４，５，６，７−’Ｈ−Ｔ（
１１４Ｃ１７／ｍａｔｏｘ ）をエタノールで希釈し、
４ｏ、ｏｏｏｄｐｍ／ｌｏμｚ （ＤＨＴとしテ４５ｐ
ｆ）含むエタノール溶液を作成した。３） ０．０５Ｍ ）リス緩衝液ｐＨ８，０（０，０
５ｔｌｌｒ Ｂ１３ム、０．１チＢＧＧを含む）４）飽和硫階アンモニウム溶液５）非放射ラベルのＴＩＩ準液６）非放射ラベルのＤＨＴ標準液操作法１）抗テストステロン抗血清の力価の測定上記３Ｈ−Ｔ標準液１０μｔをガラスチューブに入れ、
蒸発乾固した。これにトリス緩衝液で段階希釈した抗血
清０．２−を加え混和する。２時間室温で放ｔｘｔ後０．２−の飽和硫酸アンモニウ
ム溶液を加え混和した。次いで遠心分離（３０００ｒｐ
ｍ、 ｔｏ仕分間した。上清０．２−をバイアルに移し
、シンチレータ−（ＰＰＯ２，ＯＦをトルエン１ｔに溶
解したもの）２−を加え、放射活性を測定した。操作法２）抗テストステロン抗血清のＤＩＩＴとの交叉
反応性の測定上記）１−Ｔ標準液各ｌＯμｔを二基列のガラスチュー
ブに入れ、一つの系には非放射ラベルのＴ標準液を他の
一つの系には非放射ラベルのＤＩ（Ｔ標準液をそれぞれ
加え、非ラベルステロイドをそれぞれ段階的に量を増し
て加え、次いでそれぞれを蒸発乾固した。０．２−の抗
血清（トリス緩衝液で希釈し）をガラスチューｆ中（９
３Ｈ−Ｔ （４５ｐｆ） （７）６０％と結合し得る濃
度にして上記ガラスチューブに加え混和する。２時間室
温で放置後、上記操作法１）と同様の操作を行なう。交叉反応性はアプラハムの方法（ＡｂｒａｈａｍＧ、Ｅ
、 ： ：ｒ、ｃｌｘｎ、 １ｎｄＯＣｒ、２９ （１
９６９） ８６８−８７０ ）に基き算出する。操作法３）抗ＤＨＴ抗血清の力価の測定’Ｈ−Ｔ標準液
に代えて、”Ｈ−ＤＨＴ標皐液を用いる他は、前記操作
法１）と同様の操作を行ない測定した。操作法４）抗ＤＨＴ抗血清のＴとの交叉反応性の測定’Ｈ−ＴＶｃ代ｔて、５Ｈ−ＤＨＴヲ用イル他ハ、前記
操作法２）と同様の操作を行ない測定した。実施例１マウスにおける低交叉反応性抗テストステロン特異抗体
の作製Ｃ５７ＢＬ１５系８−１ｏ週雌マウス１群４−５匹を３
群用いた。第１群は対照群でＤＨＴ −３−Ｄ −ＧＬ
を投与しないで生理食塩水を投与した。第２＃は５００
μｔのＤＨＴ −３−Ｄ −ＧＬを、Ｔ−３−ＫＬＨ［
よる初期免疫３日前に、マウスの腹腔内に投与した。各
群にＴ−３−ＫＬＨ（１００μｔ／匹）の生理食塩水溶
液を完全フロインドアジュバントと共に腹腔内に投与し
た。３週間後同量のＴ−３−ＫＬＨの生理食塩水溶液を
不完全７０インドアリユパントと共に各マウスに投与し
た。５ 、７．９ 、１７週後には、同量のＴ −３−
ＫＬＨの生理食塩水溶液を各マウスにそれぞれ投与した
。第３群には、ＤＨ’ｌ’−３−Ｄ−ＧＬ（５００ｔ１
ｆ）をＴ−３−ＫＬＨ４’２：ｊル第２回（初回から３
週間後）、第３回（初回から５週間後）免疫の各３日前
に夫々投４した。２週間毎に採血を行ない抗体価および
交叉反応性を測定した。結果の一部を表ＩＫ示す。交叉
反応性はアブラハム法で測定した。注）壷１ 抗体価は４５１）ｆの３Ｈ−テストステロン
の５０１１と結合可能の血清の希釈倍数の逆数で表示し
である。会２ 交叉反応性（Ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ
）鴎）は次式で示される。×１００壷３ 抗体価の平均値は相乗平均で表示され、交叉反応
性は算術平均上標準偏差で表示しである。会４ ＤＨＴ−３−Ｄ−ＧＬで前処理しなかったが同
物質を初回免疫後に投与した。表１から明らかな如く、第２群は対照群の第１群に比べ
抗体価はやや低いものの対照群とよく似た様相の抗体産
生を示していることが判かる。−力筒３群では全経過に
わたって有デThe present invention is an antibody with high specificity and low cross-reactivity used in immunoassays, etc., and a clone capable of producing this type of antibody. The present invention relates to an antiserum containing 0 types of antibodies and a method for producing them.The present invention relates to an analytical method using an antiserum containing this type of antibody. Furthermore, the present invention relates to a method for producing a specific antibody using the above clone. Immunoassay methods are known as analytical methods for measuring in vivo active substances such as hormones with high sensitivity and specificity. This method utilizes a competitive antigen/antibody reaction and is an analytical method that uses a fixed amount of antibody and variable amount of antigen. For example, radioimmunoassay methods generally consist of one step: (1) Creation of Ili recognition antigen and specific antibody. (2) Reaction between the *m antigen and the specific pile body in the presence of non-striped steel. (3) Separation of labeled antigen from the reaction product of labeled antigen and antibody. (4) Measurement of blinding activity 1. Then quantification using a standard line. Labeled antibodies and non-iron antigens can also be used. Step 1 is the most important step, and the antibody used as a trial culture for scooping is required to have strict specificity for the test substance (antigen). However, this requirement may not be met. In other words, even in immunoassays that are considered to have extremely high specificity, the antibodies used may cross-react with other substances that have a similar structure to the test substance, and this is one of the seven points of immunoassays. There is. - Known means to overcome these difficulties can be roughly divided into the following two methods. That is, l) Measurement is performed after removing various cross-reactive substances from a sample of the test substance using a physicochemical method. J) Cross-reactive antibodies in the antiserum are collected and removed in advance using an immunosuppressant. Or highly specific with the highest possible specificity for the detected substance? IIl antibody is used for the measurement. To obtain antibodies with the highest specificity for the target substance, the antigen is conjugated to a carrier protein at a chemically appropriate site prior to administration to an animal host, which allows the antigen to be recognized by the antibody. It has been proposed to expose specific antigenic determinant sites of an antigen on the surface of a carrier protein. Exposure of specific antigenic determinant sites induces the production of low cross-reactive antibodies. However, the nine types of abreach that have been carried out to date generally have the drawback of requiring complex techniques and extensive preparation. Moreover, the production of cross-reactive antibodies may not be avoided in some cases. One of the kernel seeds defines the limitations of immunoassay methods. The present invention is a copolymer of D-/Luta i/@ and D-9 gin (hereinafter referred to as D-GL) 0111! Depending on the use. This method is based on the knowledge that it is possible to reduce the amount of cross-reactive antibodies and to obtain antibodies that have excellent specificity for a certain type of substance (for example, a test substance). D-GL copolymer (D-GL) acts on % GII cells (antibody-producing progenitor cells) to effectively prevent immune unresponsiveness (tolerance).
induce. In other words, when an antigen conjugated with D-GL is administered to an animal, the amount of D-aranoic acid in the body is generally
Not metabolized and important D-GLFi in vivo
Kll does not cause IO immunoreactivity. Therefore, D
- When an antigen conjugated to GL is administered to an animal, the conjugate of antigen and D-GII binds to the immunogenic gastric purinergic receptors on the surface of B9 lymphocytes, thus causing K induces irreversible unresponsiveness (tolerance) within the facility. Therefore, the present invention has high specificity for the first antigen;
In the method for producing the target antibody, D-Dalta electron has low cross-reactivity to Iris J. 1-Lysine, O copolymer and above! A covalent conjugate of a covalent antigen is given to a mammal, Km, and thus the above 1ejll
The above animal K has an effective immune I12 unresponsiveness to
The present invention provides a method for producing modified antibodies, which comprises immunizing the animal with the first antigen after the animal has been raised. In the method of the present invention, the above-mentioned other antigen (second antigen) and D-G
After inducing immune unresponsiveness to the antigen by administering a covalent conjugate of L (D-/copolymer of lutanic acid and D-lysine) to the mammal, It is characterized by immunization with the first antigen of According to the method of the present invention, cells having a certain genetic structure (hereinafter referred to as clones) capable of producing the above-mentioned antibodies can be produced in a mammalian body. Therefore, by administering the conjugate of D-GL and a cross-reactive antigen according to the present invention to a mammal, substantially effective immune unresponsiveness to the cross-reactive antigen can be induced, and then Antibodies with low cross-reactivity and high specificity for a particular determinant can be produced by immunizing a mammal with a desired antigen, ie, an antigen containing a particular immunodeterminant. The above-mentioned antibodies with high specificity can be produced in the form of purified antibodies, and in the form of serum containing the above-mentioned antibodies, from the living body of a goose or mammal. can also be used for antibody production. In other words, by fusion (hybridization) of the evening sun with a suitable oborosuumaro, it will be permanently reborn, and from this turn it will also be able to produce antibodies. Once the clones are obtained, the desired antibodies can be produced in the absence of the original native mammal. Accordingly, there is provided a method for the above-described antibody GII which utilizes p-- or which can be obtained by the above-described method without induction. As is well known, if suitable foursomes are available, by joining them with suitable tumor cells, fusion can be achieved.
() It is possible to express ToK4jh. For example, certain neuropone and bone marrow tumor cells (xI3
r*lo+m callg)
@r) etc. [Nechea (-1). Volume Jl, Reference Fj-4cF7 (/F7j), and European Journal, Op, Immunology (mur
, J,! mmuno1. ), Volume 4,! //-J/de(lryj))Kyol;(ru x tiey (Milsto)
(MILture. Vol. 244, jjtO-412 (/77)); When fat is injected into koji animal K11llll, it continues to proliferate in the animal's body (for example, in the ascites of mice) and produces a large amount of specific antibodies.Therefore, these hybrid cells can serve as a new source of desired antibodies. Next, the present invention provides an immunoassay method using the antibody obtained by the method described above or an antiserum containing this type of antibody, so that the antibody has specificity for the substance. Therefore, the assay is carried out by the reaction of the antibody with the above-mentioned substance. In this case, the substance to be assayed acts as an antigen. Immunoara Ryui method (
For example, enzymes, free radicals, cells, viruses, metal ions,
The array method using 1 iK of 1 iK can also be performed in the presence of cross-reactive antigens, such as those carried out using fluorophores or chemiluminescent methods. D-1) Company L molecular weight used for the purpose of the present invention is about 2
7. t) 00fi et al./2QOO004ht) #yoi*
The molar ratio of D-glutamic acid and D-lysine is 70:Jl
) to JIS near 0 are used, for example, D-glutamic acid:D-lysine=tO:+o. Copolymers of this type are commercially available, for example, from Mll.a-4eaa (USA). On the other hand, by a conventional method, 11 kl of N-carboxylic anhydride of D-glutamic acid-r-methyl ester and N-carboxylic acid anhydride of t-M-carbobenzyloxy-L-17'/n were added to a suitable amine. It can also be prepared by copolymerizing in the presence of , and then removing the protective group. Preferred materials include steroids and their glucuronide and sulfate conjugates, catecholamines, detides and their subunits, and related compounds (for example, a large number of natural products can be used to produce antibodies for immunoassays). fragments) and other various drugs. Examples of social steroids are testosterone (hereinafter abbreviated as T), 5α-dihydrotestosterone (1:J lower DT),
(T), androsterone (Andros
tsrone), Ethiocolano 07 (ICtio-c
holanolone), progstein (Pro
gesterone) 17α-hydroxyprogesterone (17α-hydroxyprogeatero)
ne ), Pregnen oy (Pro-gnen010n
θ), Tehydroepian Prosterone (DehycLr
oepiandroaterons), Estradiol-A/ (0estradiol), Est o y
(0estrone), estriol (0estrone), estriol (0estrone), estriol (0estrone),
iol), aldosterone (AldOsteron)
), deoxycortypsterone (Deoxycort
icoeterona), cortisol (Cor-t
isol), cortisol y (Cortisone)
, CorticosterO
ne), 11-deoxycortisol (11-a
eoxycorttaol), bile acids (glycocholic acid), cholic acid (cholic acid), deoxycholic acid (D
e-=oxycholic aal), lithocholic acid (LithOQho110aci4), etc.) and conjugates thereof. Examples of catecholamines are dopamine (Do-pam
ine), norepinephrine
hrine), epinephry (Ffpinephr)
ine). Examples of detide hormones are gas-titrin, cholecystokinin-pancreofum.
ymin), insulin (n5ulin), proinsulin (Pro-1nsulin), C-peptide (C-peptide), glucagon (Glu
aagOn), follicle-stimulating hormone (11'SH)
, progestin (xJH), human chorionic gonadotropin (HCG), somatostatin (8oma-to
statin), thyroid stimulating hormone y (T0n)
and their subunits and related compounds. Drugs such as the β-blocker propranolol (t-Pro
pranolol), L-type and FiD-type analgesics such as Cyclazocine. For example, when anti-'r antibodies or antisera are produced by conventional immunization methods, DHT acts as a cross-reactive antigen because its structure closely resembles that of T. 1+jJ-like, T acts as a cross-reactive antigen when anti-DHT antibodies or antisera are generated. Thus, various steroids act as cross-reactive antigens for other steroids. The above substances are generally of the butene family. In other words, these substances can bind to antibodies, but in order to bind to a carrier and induce antibody production before being administered to a living body, the above-mentioned substances must be bound to a suitable carrier. For example, an antibody specific to a certain trumpet antigen (e.g. anti-testosterone antibody, hereinafter referred to as anti-T)
In order to induce antibodies (referred to as antibodies), this antigen must be combined with a suitable antibody and used for immunization. However, the T clones and antibodies thus obtained usually have strong cross-reactivity with substances having similar structures (eg, DHT). According to the invention, D −
By treating animals with the conjugate product of a GL copolymer and a cross-reactive antigen (in this case DHT), we are able to generate anti-DHT clones and antibodies with the above-mentioned cross-reactivity that are shared with the specific GL. When animals are treated with the conjugate, part of the structure of Zuchid is common to part of the structure of the desired anti-V). An example of this is the gastrointestinal hormone cholenostkinin-pancreothymine (CCK-
This is an octabezotide antibody consisting of the C-terminal 8 amino acids of PZ (abbreviated as PZ). For reference, gastrin (
Figure 2 shows the structural formulas (amino acid sequences) of CCK-PZ (human), CCK-PZ, and related compounds. Human gastrointestinal y: (Pyro)Glu-Gly-P
ro-Trp-Leu-Glu-. Glu-G 1u-Glu-Glu-Ala-Tyr
-Gly-(80,H) Trp-Met-Asp-Phe-NHICCK -P
Z: Lya-mu1a-Pro-8or-Gly-
Mrg-Val-Ber-Met-Eng.1e-Lys-A
sn-Leu-Gln-86r-Leu-Asp-Pr
o-Bar-Hls-Murg-Engineering 1e-8er-Ali
lp-murg-mu8p-Tyr-Met-amount 80, H Gly-Trp-Me t-A8 p-Phe -NH
ICCK-8-P: Asp-Tyr-Ma
t-Gly-Trp'-Met-Musp-03H Phe-IJH2 PentaStrine: Gly-Trp-Met-Mua
p-Phe-MH2 Cholecystokinin-Bancleothymine (Chole- A gastrointestinal hormone that causes gallbladder contraction, poly detide consisting of individual amino acids. Its biological activity is the c-terminal 8 acetate) Part (CCKoo
(hereinafter abbreviated as CCK-8-P)
is known to exist in Also, CCK-8,-
The C-terminal 5 amino acid sequence of P, which is a hormone that stimulates acid secretion in the stomach, is the same as the C-terminal 5 amino acid sequence of Strine. Therefore, conventional anti-CCK-8-
P antibody is known to exhibit high cross-reactivity with IJ. On the other hand, it has recently been discovered that CCK-8-P and its reactive receptors also exist in the brain. Koo Hormo 7 (
7) Neurotransmittθr
), and to learn about the secretion and action of this hormone, which is related to diseases of the gastrointestinal tract. Therefore, it is important to provide antibodies that specifically react with CCK-8-P. -m-911&
After inactivating clones producing antibodies that cross-react with -+R ntagastrin and or gastroin-like compounds, primary animals are immunized with CCK-Q-P-KLH. It is possible to obtain clones and antibodies of this type that can produce antibodies that can specifically react with. According to the invention, therefore, after treating an animal with a covalent conjugate of strin and D-GL as a C-terminal fragment of the desired antigen, the animal is immunized with gastrin. (One clone that cross-reacts with CCK-PZ) can be suppressed to obtain an antibody specific for gastrin. As can be seen from the examples below, fractionation of kzotide (rra
gmentation) Ic.Thus, even if specific antigenic determinants cannot be easily removed from D-GIt, cross-reactivity with D-GIt can be reduced by administering covalent conjugates with zotide to immunized animals. Thus, the desired specific antibody can be obtained. The composition of the antigenic determinant of lysozyme is 8urfao I.
It has been demonstrated using a synthetic peptide based on the tLmuxltiOn model [Mutassl, M.
, L Immuno-ch@m1stry H$ Volume 9
09-986 N (1978)]. If, as in that case, the antigenic determinant is formed by amino acids occurring at irregular intervals - for example, if the antigenic determinant is formed by the amino acids MuBOD - then the antigenic determinant has a completely different amino acid sequence. Even peptides happen to have a sterically common antigenic determinant B-0, and in this case, a substance obtained by combining an antigenic determinant containing amino acid B-0 with D-GL is administered to animals. Therefore, when clones with cross-reactivity with the antigenic determinant containing azunoic acid B-0 are eliminated, as a result, specific clones directed toward the antigenic determinant Mu-D are selectively increased. This allows for the production and amplification of only antibodies directed to specific sites. The conjugate of the above antigen and D-GL includes (1) the above antigen and D-GL;
- Method of W-bonding GL or (2) Antigen and D-
It is prepared by a method of indirectly binding by crosslinking with GL. Examples of crosslinkers include oxime compounds, succinyl compounds and chlorocarboxylic compounds according to Brlanger et al. [eg, B, ? . +! 211 71! I Erlanger et al, J. Biol, Che.
m,! , s! 4→(IQ-57) ) carboxymethyl thioether derivative (Weinstein et al.
al, Japan terol*20.789 (1972)
), carboxymethyl ether derivatives (P, N, Ra
o et al. J, 5terota Biochem, 9.539
(1978)) etc. are used. The bonding method is the carbodiimide method (Carbo-diimide method), anhydride jl (M
ixed Anhy-drle Method), Schotten-Bauman method (Schotten-Bauman method)
nMethoa), the ino-sazolium method, and the like. In addition, if -Jl f(, group is introduced into the above compound,
It can be bonded using the glutaraldehyde method, and if -NH2 group or -EIH group is introduced, m-maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimide ester, succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl-
cyclohexane)-1-carboxylate, succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate, etc. or N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)
Propionate, N-succinimidyl-(4-aryphenyldithio)propionate, etc. are used.Other methods of bonding detides with other substances commonly used in ZudetiP chemistry are all methods of bonding D-GL with antigens. Also, since the immunizing antigen used in the present invention is usually no-butene, VtK is used in which the antigen is bound to a suitable carrier commonly used in ordinary immunization methods. Preferred carriers include, for example, keyhole limpet. Keyhole limpet haem = 7
ocyantn. (hereinafter abbreviated as KLH), serum r-globulin and alpkin of various different animals, such as humans and goats. The method of binding these carriers to the antigen, its subunit or related fragment is similar to the method of binding the cross-reactive antigen, its subunit or related fragment, to D-GL, either directly or by cross-linking with a suitable intermediate. A method of combining is used. In the latter case, the same intermediates and methods used to conjugate D-GL and cross-reactive antigens are used. The immunization method is a conventional method. Depending on the animal, a physiological saline solution of the antigen (conjugate of hapten and carrier) is administered intraperitoneally or in the paws and back, the first time with complete Freund's adjuvant and the second time with I incomplete Freund's adjuvant. Thereafter, mice only need saline. For large animals like rabbits, complete Freund's adjuvant and complete Freund's adjuvant)! 4 throws can be made alternately. The dosage depends on the binding ratio of antigen and carrier, the molecular weight of carrier, etc., but it is usually 1/μf for small animals such as mice.
/~100μt71 animals, 0.1■ for large animals such as rabbits
~1■/1 animal/mouse is administered 2 to 5 times, repeated every 2 to 4 weeks. A conjugate of cross-reactive antigen and D-GL is usually administered 2-3 days before the first immunization. Of course, depending on the type of antigen, a conjugate of the present antigen and D-GL may be administered after the first and second epidemic treatments. The dosage of the conjugate of po-crossantigen and D-GL is preferably 100 μ2 to 500 ttf for non-animals such as mice, and 2-1019 for large animals such as rabbits. This dosage varies somewhat depending on the amount of cross-reactive antigen (hapten) bound to D-GL, the binding position, the type of intermediate compound, etc. Practically, the conjugate of antigen and D-GL is administered intraperitoneally as a saline solution. It is preferable that the binding mode of the conjugate between the cross-reactive antigen and D-GL is the same as the binding mode between the immunizing antigen and the carrier. It is also preferable to use it for binding an antigen and a carrier. Like the upper rudder, it is possible to induce unresponsiveness between D-GL and cross-reactive antigens. Thereafter, it is possible to obtain clones, antibodies, or antisera containing nuclear antibodies capable of producing antibodies with extremely high specificity for a particular antigenic determinant. The above knowledge has been confirmed not only in small animals such as mice, but also in large animals such as rabbits. Although it is expected that the results would be different for different animal species, it is of great practical importance that the same results were obtained for both small and large animals. This is because it is possible to obtain larger amounts of antibodies using large animals such as rabbits than from small animals such as mice. Although it has traditionally been difficult to generate antibodies that can discriminate between structurally similar compounds such as T and DHT, the present invention provides a large number of antibodies capable of discriminating one antigen from other cross-reactive antigens. clones can be selectively obtained. I
P! As a result of the increased frequency of clones producing F-isomer antibodies within the body, it becomes actually possible to extract and isolate specific clones. According to known literature, the probability of extracting a specific clone capable of differentiating antigens from an animal is approximately 1 in 1 million to 1 in 10 million - therefore, extraction and isolation of species is not a reality. It was considered impossible. However, even in cases where clones capable of producing specific antibodies obtained by the present invention are immunized with antigens containing cross-reactive determinants, cross-antigenic determinants that are structurally similar to the desired antigenic determinants This makes it difficult to specifically identify the difference between the two. The method of the present invention makes it possible to produce species-specific antibodies with high probability, and therefore increases the probability of producing clones capable of producing specific antibody amounts of this species. The method of binding D-GL to a low cross-reactive antigen, and the method of the present invention can be applied to all antibody production methods. Next, the present invention provides a method for easily quantifying a specific substance when the amount of the substance contained in a sample is unknown. This method is characterized by using antibodies or antiserum obtained by the method described below. The reagents and analytical methods used in the examples below are as follows. (11 Synthesis method of DHT-3+ (〇-carboxymethyl)oxime (hereinafter abbreviated as DHT-3-CMO). (a) Reaction formula: % formula % ) ) ) ) Itolochloride (Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) +1.
3 g (2.7 mmole) 2N-NaOH1,
2511d Ethanol 15d (c) Procedure Place the above raw materials in a round bottom container with a reflux device, heat under reflux for 3 hours, add purified water 45- to the reaction solution, and plify with Ic dilute NaOH solution.
'i was set to 8. This liquid was transferred to a separatory funnel, and about 30 cm of ethyl acetate was added thereto and shaken, and then the ethyl acetate layer was separated and removed to remove unreacted DHT. Next, ice was added to the aqueous layer to cool it, acidify it with dilute hydrochloric acid (about pH 4), add cold ethyl acetate to extract the formed DHT-3-(o-carboxymethyl)oxime, and add the skeleton ethyl acetate to anhydrous sodium sulfate. After dehydration, ethyl acetate is removed by evaporation, and the residue is recrystallized from hot methanol to obtain the desired product. (2: Method for synthesizing testosterone-3-(o-carboxymethyl)oxime (hereinafter referred to as -3-CMO). 3H-DHT K, t, 3H-T, DHTK The desired product was obtained by performing the same operation as in (1) except that the molar amount was used. (Synthesis method of 31hapten-D-aL (a)
DHT-a-(0-carboxymethyl)oxime-
Synthesis method of D-GL (hereinafter abbreviated as DHT-3-D-GL) (based on the mixed acid anhydride method by Brlanger et al.) Reaction formula: (11 raw material DHT-3-CMO, () 3H as a racer) (contains labeled DHT-3-CMO) 20″q dry dioxane (1m+5d)tri-n-
Butylamine 20μt Chlorformic acid inbutyl ester 10μ purified water
6-D-()L (MY 49,000) 30
WI N -NaOH150μt (kl) 8 products DHT-3-0M020w9 in anhydrous dioxane (dioxane mixed with 5 μm of molecular sheep and dehydrated) 1
- and add tri-n-butylamine under stirring.
t was added and stirred for 5 minutes while maintaining the temperature at 11°C. Next, lOμt of chloroformic acid isobutyl ester was added, and the mixture was reacted with stirring for 1 hour while maintaining the temperature at 11°C. Separately, D-GL30'H9 was dissolved in purified water 6-, and 1N
150 μt of NaOH was added and mixed, and dioxane 5- was gradually added to this solution. This D-GL solution was added all at once to the upper reaction mixture while stirring. After 10 minutes, check the pH, add IN-NaOH little by little to bring the pa back to 6.5-7.0, and store at 10°C for about 2 hours.
Continue stirring back and forth. Next, this reaction solution was dialyzed against water at 4°C overnight, and the next morning the solution was adjusted to about T)H4.5 with diluted hydrochloric acid to form a precipitate. This solution was left at 4°C for 7 hours to complete precipitation. This liquid is then centrifuged. 4'C,3
,00Orpm. 9 minutes) Discard the supernatant, add 1Oα of purified water to the precipitate, and
Adjust the pH to about 7.0 with N-NaOH to dissolve the precipitate. This solution was dialyzed overnight against purified water at 4 ml and then lyophilized. D-
The number of DHT bound per mole of GLI was calculated. The molar ratio of DHT to D-GL in the resulting reaction product was 30=1
Met. Origin of the mixed acid anhydride method by Krlanger et al.
, Biol, Chem, 228.713 (1957
) )) Because water and dioxane leaves become glue-like when D-GL is added to BAA,
Large amounts of water and dioxane The amounts of dioxane and water were determined so as to prevent K7JOλ, D-GL from forming a glue in the reaction solution and to allow the reaction to proceed appropriately. This device enables the combination of D-GL and oxime using the mixed acid anhydride method, and allows sufficient amount of oxime to be added to D-GL.
- allowed to bind to GL. (b) Testosterone-3-(o-carboxymethyl)oxime-D-GL (hereinafter abbreviated as T-3-D-GL)
Creation of T-3-oxime (3H label T- as a tracer)
T-3-D-GL 374 (T: D, -G
The molar ratio of L was 30:1). (4) Synthesis method of hapten-KLH (a) M
T-3-(0-carboxymethyl)oxime-KLH
(hereinafter abbreviated as DI-1'l'-3-KL) I) (a) Raw materials used DHT-3-CMO12q Anhydrous dioxane 0.5m+2.5s
gtri-n-butylamine 10 l
it Chlorformic acid isobutyl ester 5μ purified water 4d KLH (Mw 100,000) 150 H
91N NaOH75μt (bl operation) DIET-3-KLH54,7ytay (DH
The molar ratio of T:KLH was 10:1). (o) Te5toaterone -3-(o
-carboxymethyl )oxime-KL
Production method of H (hereinafter abbreviated as T-3-KLH) T-3-CMO401W Anhydrous dioxane 2d+5mItr1
-n-! Chiluain 40μt1ao-butylchloroformic acid 20μ made into ice
10m1! KL) I 300
#I Perform the same operation as above using 300 μt of NNaOH to obtain T-3-KIJ)I
1971q (molar ratio of T to KLH was 8:1) was added to 4#. (51Radioimmunoassey @Etiquette v:
, 4 1) 'H-T standard solution 1.2,3H-T (58C1/mmol) was prepared.
) - diluted with 20,0006pm/101tt
Prepare an ethanol solution containing (45 pf). 2) ')I-DHTmm liquid 5α-dihydro-1,2,4,5,6,7-'H-T(
114C17/matox) was diluted with ethanol,
4o, ooodpm/loμz (DHT 45p
f) An ethanol solution containing: 3) 0.05M) Squirrel buffer pH 8.0 (0.0
4) Saturated ammonium sulfate solution 5) Non-radiolabeled TII quasi-solution 6) Non-radiolabeled DHT standard solution Procedure 1) Measurement of the titer of anti-testosterone antiserum Put 10μt of the above 3H-T standard solution into a glass tube,
Evaporated to dryness. Add and mix 0.2- of antiserum serially diluted with Tris buffer. After leaving the mixture at room temperature for 2 hours, 0.2-saturated ammonium sulfate solution was added and mixed. Then centrifugation (3000 rpm)
m, to sorting. 0.2- of the supernatant was transferred to a vial, scintillator (PPO2, OF dissolved in 1 t of toluene) 2- was added, and radioactivity was measured. Procedure 2) Measurement of cross-reactivity of anti-testosterone antiserum with DIIT (above) Place 10 μt of each 1-T standard solution into two rows of glass tubes, one system containing non-radiolabeled T standard solution and the other. To one system, a non-radiolabeled DI (T standard solution) was added, each stepwise increase of an unlabeled steroid was added, and each was then evaporated to dryness. diluted with buffer) in a glass tube (9
3H-T (45pf) (7) Add to the above glass tube and mix at a concentration that can bind to 60%. After leaving it at room temperature for 2 hours, the same operation as the above procedure 1) is performed. Cross-reactivity was determined by Abraham's method (AbrahamG,E
, : :r, clxn, 1ndOCr, 29 (1
969) 868-870). Procedure 3) Measurement of the titer of anti-DHT antiserum The measurement was carried out in the same manner as in procedure 1) above, except that H-DHT standard solution was used instead of the HT standard solution. Method 4) Measurement of cross-reactivity of anti-DHT antiserum with T'H-TVC and 5H-DHT were measured by performing the same procedure as in Procedure 2) above. Example 1 Preparation of low cross-reactive anti-testosterone specific antibodies in mice Groups of 4-5 female mice of C57BL15 line 8-1o weeks
I used it in groups. The first group is a control group with DHT-3-D-GL.
Physiological saline was administered without administration. 2nd # is 500
DHT-3-D-GL of μt was converted to T-3-KLH[
was administered intraperitoneally to mice 3 days before the initial immunization. A physiological saline solution of T-3-KLH (100 μt/mouse) was administered intraperitoneally to each group together with complete Freund's adjuvant. After 3 weeks, the same amount of T-3-KLH in saline was administered to each mouse along with an incomplete 70-day intraleopant. After 5, 7.9, and 17 weeks, the same amount of T-3-
A saline solution of KLH was administered to each mouse. The third group includes DH'l'-3-D-GL (500t1
f) T-3-KLH4'2:j 2nd time (3rd time from the first time)
4 weeks later) and 3 days before the third immunization (5 weeks after the first immunization). Blood was collected every two weeks to measure antibody titer and cross-reactivity. Some of the results are shown in Table IK. Cross-reactivity was determined by the Abraham method. Note) Bottle 1 Antibody titer is expressed as the reciprocal of the dilution factor of serum that can bind 5011 of 3H-testosterone of 451)f. Meeting 2 Cross-reactivity
) is expressed by the following formula. ×100 Bottle 3 The average value of the antibody titer is expressed as the geometric mean, and the cross-reactivity is expressed as the standard deviation above the arithmetic mean. Group 4: The mice were not pretreated with DHT-3-D-GL, but the same substance was administered after the first immunization. As is clear from Table 1, although the antibody titer of the second group was slightly lower than that of the first control group, it was found that the second group exhibited antibody production similar to that of the control group. - In the 3rd group of force cylinders, there is no data over the entire course.
【な枝体産生が認められなかった。又、ＤＨＴ −３−Ｄ −ＧＬで前処理をうけた第２群
では対照群に比べ、ＤＨＴとの交叉反応性が著明に低下
していることが判かる。又、表１の結果を個々のマウスについてその抗体の抗体
価と抗体の交叉反応性の関係を夫々グロットして調べる
と抗体価と交叉反応性の間に相関々係は關められなかっ
た、一般的にみてＤＨＴ −３−’Ｄ −ＧＬで前処理
した場合、ＤＨＴとの交叉反応性は低下し＾４−一、そ
れと抗体価の低下との間に相関関係は認められなかった
。すなわち交叉反応性が低いと抗体価が低いといった関
連性も認められない。これらの事実から明らかなように
、ＤＨＴ−３−Ｄ−ＧＬの事前膜島により、ＭＴと交叉
反応性を示すクローンを除去してやると、その次のＴ−
３−４ＬＨでの免疫によりテストステロンに関してより
高い特異性を有する抗生体生産能を有するクローンのｒ成が選択的に強化される
。このように低交叉性の抗体を選択的に産生ずることは
本発明の実用上の有利さを示すものである。実施例２マウスにおける低交叉反応性杭ジヒドロテストステロン
特異抗体の作製本実権例２に於いても、Ｃ５７ＢＬ／６系雌マウス１群
５〜７匹８週令を５群用いた。第１群は対照群でＴ−３
−Ｄ−ＧＬで前処理しないで、ＤＴ（Ｔ回−３−ＫＬＨで初期免疫を行々い、初回から３週後に第
２回免疫、初回から５週後に第３回免疫、次いで２週毎
に追加免疫を行なう。他群のマウスの免疫時期、方法は
コントロール群と同じで回ある。第２群はＤＨＴ −３−ＫＬＨでの初期免疫前３
日前日前に各５００μｍのＴ −Ｄ−ＧＬを各マウスの腹腔
内Δに投与した。第３群は別の対照群で、各５００μｔのＤ
ＨＴ−３−Ｄ−ＧＬ ５ＱＱμ２をＤＨＴ −３−ＫＬ
Ｈでの初回緒免役曲３′日前に各マウスの腹腔内に投与した。第４群と第５群の各マウスをＤＨＴ −３−ＫＬＨによ
って第１回免疫し、その３週間後に第２回免疫し、第２
回免疫の３日前に各５００μｔのＴ−３−Ｄ−ＧＬおよ
びＤＨＴ −３−Ｄ−ＧＬをそれぞれ腹腔内投与した。以上５群について初回免疫７週後より２週間毎に採血し
、血清中の抗体価、交叉反応性を調べた。初回免疫後１
３週０の結果を第２表に示す。表 ２注）秦１、※２共に表１の脚注に同じ。表２の結果は実施例１で示されたのと同様にＴ−３−Ｄ
−ＧＬの前投与により、第２群で示されるごとく低交叉
反応性抗ＤＨＴ抗体の産生が認められた。初期免疫後にＴ−３−Ｄ−ＧＩＩおよびＤＨ’ｌ’ −
３−Ｄ−ＧＬで処理された第４および５群では抗ＤＨＴ
抗体の有童義な産生はＵめられ々かった。ＤＨＴ−３−Ｄ−ＧＬで前処理後、ＤＨＴ −３−ＫＬ
Ｈで免疫された槙３群においてつくられた抗ＤＨＴ抗体
のＴとの交叉反応性は対照群と同様に高かった。また抗
体価は第２．３群と同様であった。このことよりＴ−３−Ｄ−ＧＬで処置すると、Ｔとの交
叉反応性の低い抗ＤＨＴ抗体が得られることがわかる。実施例３ウサギ（家兎）の抗Ｔまたけ抗ＤＨＴ抗体の作製本実権例に於いては体重的３ｋｌ？の雌家兎１群ドアシ
ュバントで乳化したＤＨＴ−３−ＫＬＨ（各間後にＤＨ
Ｔ−３−ＫＬＨ（各２００μｆ）を不完全フロインドア
ジュバントと共に皮下注射することにより、第２回免疫
を行なった。それ以後１ケ月毎に、完全フロインドアジ
ュバントと不完全フロインドアジュバントとを交代に用
いて、ＤＨＴ−３−ＫＬＨ（各２００μｆ）Ｋよる第３
、第４回免疫を行なった。第２群は対照群で、Ｔ−３−
Ｄ−ＧＬを投与しないで、ＤＨＴ −３−ＫＬＨで第１
群と同様に免疫した。第３群はＤせ？−３−ＫＬＨＦ）
第２回（３週間后）、第３回（Ｘ週間后）投与による免
疫の夫々３日前に各１０ＷｑのＴ −３−Ｄ −ＧＬを
ウサギの腹腔内に投与した。第４群は各１０１９のＤＨＴ −３−Ｄ −ＧＬをＴ−
３−回ＫＬＨでの初期免疫前３日前にウサギの腹腔内に投与し
た。第５群は対照群でＤＨ’Ｉ’ −３−Ｄ −ＧＬを投与
せず、？ −３−ＫＬＨで第４群と同様に免疫を行なっ
た。第６群は’ｌ’ −３−ＫＬＨによる第２回（初回免疫
の３週間後）、第３回（初回免疫の７週間後）免疫の夫
々３日前に各１０ｗｑのＤＨＴ −３−Ｄ −ＧＬを各
ウサギの腹腔内に投与１．た。採血を各免疫後１０日０
に行なった。その結果、第３群および第６群では全経過
にわたって有意な抗体産生は認められなかった。対照群である第２群からの抗ＤＨＴ抗体および第５群（
コントロール群）から得られた抗テス体のテストステロ
ンに対する交叉反応性は１００チ、又笥５群の抗テスト
ステロン抗体のＤＨＴに対する交叉反応性は９５．２％
であった。しかし第１群および第４群では交叉反応物質
に対して有に意−◆低い反応性を示した。すなわち第１群の抗ＤＨＴ
抗体のテストステロンに対する交叉は１１．９優、また
第４群の抗テストステロン抗体のＤＨＴに対する交叉は
２２．０１であった。実施例４ウサギ抗Ｔ特異抗体および抗ＤＨ？特異抗体を用いたヒ
ト血中ＴおよびＤＨＴの測定】）上記実施例の第１および第４群のウサギでそれぞれ
低交叉反応性の抗Ｔ特異抗体及び抗ＤＨＴ特異抗体が得
られたので、これらの抗体のヒ）Ｊｆ１１清中のＴ及び
ＤＨＴの検出法への実用性を検討するために、ヒト血清
にそれぞれ既知ｔのテストステロンおよびＤｌ（Ｔを添
加して、上記抗血清を使ったラジオイムノアッセイで測
定されたＴおよびＤＨＴ量と実際に添加した量との関係
をしらべてみた。曲片テストステロンレベルの測定の際
にはより実際の場合に則し、プール血清（血清Ｔ値の低
い女性の血清を用いたう）１−にＴ １．２，４ｎｆ、
あるいはＤＨＴＱ、ｌ、０．２．０．３ｎ？をそれぞれ
加え、抽出操作過権における回収率を測定するためＫさ
らに”−Ｔ２，９０．Ｏｄｐｍあるいは３Ｈ−ＤＨＴ２
．０００ ａｐｍを加え混和した。各試料ごとにヘキサ
ン：エーテル（３：２）３−を加えＶｏｒｔｅｘミキサ
ーにて１分間振とうした。損とう稜試験管を、ドライア
イス−アセトン浴Ｋｌθ秒間つけ、有機溶媒層を別の試
験管に移した。有機溶媒はエバポレーターでとげし、残
渣にエタノール２−を加え混和し、このエタノール溶液
を各抗血清を用いての阻害曲線の測定可能範囲に相当す
るような量ずつ小試験管に移し、蒸発乾固し、ＤＨＴ
−Ｄ −ＧＬ前処理によって得らｔ１＋低交叉反応性抗
Ｔ抗体を用いてラジオイムノアッセイにて測定した。一
方、＃妃のエタノール溶液０．５−をバイヤルに移し、
エタノールを蒸発させ、シンチレータ−を残渣に加えて
カントをはかり、抽出操作過稈における回収率算出に用
い、ラジオイムノアッセイによって得られた値を補正し
た。また血中ＤＨＴレベルを測定する際にはヒト女性プ
ール血清ｌ−にＤＨＴ Ｏ１２，０，５ｆｉｆまたはＴ
Ｏ１２，０，５ＤＩＰをそれぞれ加え、抽出操作過程に
おける回収率を測定するために３）１−ＤＨＴ ２．Ｑ
ＱＱｄ、ｐ、ｍ。あるいは５Ｈ−Ｔ ２．０００ ｔｌ、ｐ、ｒｎ、を加
えよく混和した。ヘキサン：エーテル（３：２）３−を
混合物に加え、前述と同様にして抽出を行ない、抽出残
渣に２−のエタノールを加え、このエタノール溶液の一
部を小試験管に移し、その量を各抗血清によるＤＨＴの
阻害曲線の測定可能範囲にはいるように調整し、蒸発乾
固し、テストステロン−Ｄ −ＧＬ処理によって得られ
た低交叉反応性抗血清を用いてラジオイムノアッセイに
て測定した。一方エタノール溶液０．５−バイヤルに移
し、エタノールを蒸発させ、シンチレータ−を残渣に加
えてカウントをはかり、抽出操作過程における回収率算
出にもちいラジオイムノアッセイによって得られた値を
補正し念。その結果は、低交叉反応性抗血清体を使って正常女性血
清にＴを１．２．４ｎｆ添加した場合、その添加前の正
常血清のＴ価は０．３０１１１１Ｐであったが、それぞ
れの添加後の対応するＴ価は１．１５ ｎｒ 、２．３
０ ｎｆ、 ４．６０ ｎｆであ−１）７）。なお、同様な実験系［Ｔに代えてＤＨＴを０．１．０．
２および０．３ｎｌを加え、測定されたテストステロン
量へのＤＨＴの影響をみると無添加血清のレベルと殆ん
ど同じであって、有意膚な影箒のないことがわかった。一方、正常女性血清［ＤＨＴを０．２ オよび０．５ｎ
ｆを加えて血清中のＤＨＴ ｔを低交叉反応性杭ＤＨ？
抗体を用いて測定した結果は添加前の正常血清ではＤＨ
Ｔ Ｏ，２１ｎｔが測定されたのに対し、それぞれのＤ
ＨＴを添加後では０．４１および（１，７２ｔｌｌ の
ＤＨＴが測定され、それぞれの値は添加されｆＦＤＨＴ
とよく一欽し九。なお、同様な実験系Ｋ ＤＨＴ （７
）代りＫＴを０．２．０．５１Ｆを加え、測定されてく
るＤＨＴ量へのＴの影響をみると無添加血清のレベルと
殆んど同じであって、有意−な影響のないことがゎかっ
★。 １この結果は実施例３の低交叉反応性抗面清を使
用すると血清中のＴ或いはＤＨ？レベルが正確に測定さ
れることを示す。 ゛低交叉反応性つサギ抗ＤＨＴ抗体を用いてヒト血中のＤ
ＨＴを測定する。女性プール血清０．１−に表３の如（ＤＨＴとＴの量を
それぞれ（５ｎｆ、 １Ｏｎｆ）、（１０ｏｒ。５ｎｒ）、あるいけ（ｔｏｎ９、ｔｏｆｌｙ）ずつ加え
測定は上記１）の例に従った。その結果各量の交叉反応
性抗原である〒が試料に含まれていても測定されるＤＨ
Ｔの量はそれぞれの場合について、５．６７ｎｆ、 １
０．１７ＨＰおよび９，２０ ｎｆであった。このこと
により前記実施例３で得られた低交叉反応性抗ＤＨＴ抗
体は、たとえ交叉反応性抗原であるＴが多量に含憧れて
い・てもＤＨＴを正確に検出することができることがわ
かった。表 ３また同様に血清０．１−にテストステロンとＤＨ’ｒを
表４の如くそれぞれ（ｓｎｔ、 １ｏｎｒ ）、（ｘｏ
ｎｆ、ｓ ｎｔｉ ） 、および（１０ｎｆ、１０ｎｆ
）ずつ加え、低交叉反応性つサギ抗テストステロン抗
体を用いてテストステロン量を測定した所、夫々の場合
について６．８（’１？、 １０．３ｎｆおよび１０．
５９ｎｐのテストステロンの価であった。このように低交叉反応性抗テストステロン抗体の場合［
４，交叉反応性抗原であるＤＩ’ｉＴの存在下でテスト
ステロンを正確に測定することができる。表 ４３）実際のヒト検体の測定（直接法）直接法とＦｉＴとＤＨＴを前屯って分離する操作を何も
行なわないで分析する方法を意味する。一方比較の為に
従来法即ちは−パークロマトグラフイーでＴとＤＨＴを
夫々分別した後ｒ ａｔ中＋１嘴辻ｆｒ Ｘ ｆｉｌｌ
中ａｍ 冬ｙＲす−３，１）血清中のＴの測定イ）共通の処理０．１−の男性血清サンプルまたは０．５−の女性血清
サンプルをそれぞれ試験管にとり、’Ｈ−Ｔ ヲ３，０
００ ＋１．Ｉ）、ｍ、を抽出過程又は抽出、り四マド
グラフ分画過卑における回収率測定のために加えよく混
和した。さら忙男性血清サンプルにけ純水０．５−を加える。ヘ
キサン：エーテル（３： ２）を３−加ま、ＶＯｒｔ６
！ミキサーで１分間振とうした。試験管をドライアイス
−アセトン浴に：１０秒間浸し、血清部分を凍結させ、
有機溶媒層を別の試験管に移し、有機溶媒をエバポレー
ターでとげした。口）直接法男性自消サンプルの各残渣にエタノール０．４−を加え
混和した。このエタノール溶液を艶〜４００ Ｔ）ｆの
範囲に入れるために、正常範囲では１００μｔを、また
第５表の１，２．３号のような高テストステロン血清の
場合には関μｔを各小試験管に移した。抽出操作過程に
おける回収率測定の為に１００μｔをバイヤルに移し、
蒸発乾固後桟１１ｆＫシンチレータ−を加えカウントし
た。女性血清サンプルには上記ヘキサン−エーテル抽出残渣
にエタノール０．７．−を加オ、溶液０．５−を小試験
管に移した。抽出工種の回収率測定のために１００μｔ
をバイヤルに移し、蒸発乾固後、残渣にシンチレータ−
を加えカウントした。共に小試験管に移したエタノール
溶液のエタノールを窒素ガス気流下蒸発除去し、残渣を
ラジオイムノアッセイに用いた。ハ）ば−パークロマトグラフイー法上記の直接法と同様にして得られたヘキサン−エーテル
による抽出残渣にクロロホルムを５Ｘ＋ｔｔｔ加え、ペ
ーパーに塗布した。この操作を合計３回行った。別に同
様のぼ−パーに標準マーカーとしてテストステロンｌＯ
μｔを塗布した。Ｒ−パーをＢｕｓｈＡ（シクロヘキサ
ン；メタノール：水＝１０：１２）の溶媒を含むクロマ
トグラフ・タンクにセットした。２時間後、ＢｕｓｈＡ
の上層を加えて１６時間展開し大。展開後標単マーカー
としてのテストステロンのスポットを２５４ｎｍのＵＪ
吸収で検出した。この標準マーカーのスポットに相当す
る検体用ペーパーの部分の長さを３倒カツトし、エタノ
ール３−で抽出した。エタノールを窒素気流下で蒸発除
去した。そして以下直接法と同様に操作し、ラジオイム
ノアッセイに用い＊。二）ラジオイムノアッセイＴ標準曲線の作成のためＴ・エタノール溶液（′ｒとし
テ０．２０１５０．１００．２００、または４００ Ｍ
含む）を各２本ずつ試験管にとった。これらの小試験管
とサンプルを含む小試験管に、Ｈ−Ｔ・エタノール溶液
（２０，０００（ｌＩ）ｎｌ／１０μｔ） １ｏｐｔを
それぞれ加えエタノールを蒸発除去した。家兎抗Ｔ抗血
清をｌ′Ｈ−Ｔ ２０，０００ｃｌｐｍ （Ｔとして４
５’Ｅ）ｆ）ｔ６０チ結合しうるような濃度（ＢＯ＝ω
９ｇ）にするためＫ、０．０５Ｍ ）リス緩衝液（Ｔ）
）１８．０．０．０５１ ＢｓＡ （ウシ血清アルブミ
ン）、０．１％ ＢＧＧ （ウシ血清ｒ−グ四プリン）
を含む〕で希釈し、各小試験管ＫＯ１２−ずつ加え、Ｖ
ＯｒｔｌＸ ｆｆ１ｉＸ＠ｒで混和した。別に％ ’Ｈ
−’１’２０．０００＋１１）１ｍのみを含む小試験管
２本にトリス緩衝液各・０．２−を加え、混和し、Ｂ□
＝ｅ１００嘔用とする。各溶液を２時間室温で放置し、
飽和硫安水溶液０．２−を加え混和した。３，０００
ｒＴｌｍで１０分間遠心分離し、上清０．２−をバイヤ
ルに移し、シンチレータ−２７！を加えカウントした。そして測定されたカウントをＢ／Ｂｏ （＊ ）に換算
した。３．２）女性血清中の１）１１Ｔの測定血清サンプル量
、抽出及びは−パークロマトグラフによるＤＨＴとＴの
分離操作は女性血清サンプル中のＴの測定に用いられた
ものと同様に行った。ＤＨ’ｒの検出は１チｍ−ジニト
ロベンゼン・エタノール溶液と２．５Ｎ水酸化ナトリウ
ム・エタノール溶液の等量混倉溶液の噴霧によっておこ
なつ九。ＤＨＴのラジオイムノアッセイはＤＩＩＴ・エタノール
標準液と”Ｈ−ＤＩＩＴ・エタノール溶液（４０ｅＯ０
０ｄｐｍ／１０４ｔ）を用いてテノラジオイムノアツセ
イ法と同様に行つ九。直接法および常法によるイーパークロマトグラフィー共
に、ラジオイムノアッセイによって得られた値を回収率
によって補正した。直接法の場合にはＴ又はＩ）ＩＴの回収率は５〜１００
優の範囲内ＫＩｈ抄、測宇値にバラツキがなかったので
、３Ｈ−Ｔ又は３Ｈ−ＤＨ？添加による回収率補正は通
常の場合不要と考えられる。結果を第５表、第６１！に示す。結果と解析表 ５上表から明らか表如く、両測定法の測定値はそれぞれ明
瞭な一致を示している。表 ６（女性血清）上表から明らかな如く、両測定法の測定値はよい二数を
示している。以上の実験事実から明らかな如く、本発明により提供さ
れる低交叉反応性抗体を用いる直接法により、交叉反応
性抗原の存在下でも簡便正確に目的物質を測定すること
ができる。従来法のは−パークロマトグラフイーのように、交叉反
応性抗原をあらかじめ分別する必要も危く簡単に目的物
を測定することができる。本発明により、交叉反応性抗
原とＤ−ＧＬとの結合物で動物を前処理すると、これに
よって、交叉反応性抗原に対する免疫無応答性を誘起し
、その結果、特異性抗体およ〜び上記抗体生渚能を有す
るクローンとを得ることができる。この方法は、？−３
−Ｄ−ＧＬ ＋ＤＨ？ −３−Ｄ −ＧＬ を用いた前
述の例に限定されるものでは）〈て、次の実施例５に示
きれるように、他の例にも応用することができる。す表
わち実権例５では、ＴおよびＤＨＴとの担体の結合部位
を変えているが、この場合［４、実質的に同様な結果が
得られる。この例では、！およびＤＨＴをふたたびモデ
ル抗原として使用し、それらと担体との結合部位を３位
から１５位に変身、これＫよって、担体分子の表面に露
出するハプテンの構造を変えている。実施例５１５β−カルボキシエチルメルカプトテストステロン（
以下１５β−Ｃ１１ｉＭ −Ｔと略す）及び１５β−カ
ルボキシエチルメルカプト−５α−ジヒド四テストステ
四ン（以下１５β−ＣＥＭ −５α−ＤＩ（’ｒと略す
）とＫＬｉ［ｉたはＤ−ＧＩ、との結合物を用いて得ら
れる抗血清の性質について１５β−ＣＥＭ −ＴはＲａｏ ％Ｐ、Ｎ ａｎｌ Ｐ
、Ｈ，Ｍｏｏｒｓ Ｊｒニステロイド堡（１９７６）
Ｐ １０１．１５β−Ｃ１！！Ｎ −５α−ＤＨＴはＲ
ａｏ、Ｐ、Ｎ、 、 Ａ、Ｈ，Ｋｈａｎ ａｔｏｌ Ｐ
、Ｈ，Ｍｏｏｒｓ、Ｊｒ ：ステロイ）” ２９ （１
９７７）Ｉ’、１７に夫々記載の方法によって合成した
亀のを使用した。１５β−ＣＩＣＭ −ＴとＤ−ＧＬ又
はＫＬ）Ｉとの結合方法および１５β−ＣｌｆｉＭ −
５α−ＤＨＴとＤ−ＧＬ又はＫＬＨとの結合はそれぞれ
前記ＤＨＴ −３−ＣＭＯまたは？ −３−ＣＭＯとＤ
−Ｇ１又はＫＬＨとの結合と同様の方法で行つ九、夫々
得られた結合物をＴ −１５−Ｄ−ＧＬ、！−１５−Ｋ
ＬＨ，ＤＨＴ −１５−Ｄ −ＧＬ、 ＭＴ −１５−
４ＬＨと略する。本実施例に於いては、Ｃ５７ＢＩＩ／６系ｉ１−マウス
（８−１０週）１群７匹を６群用いた。第２群はＤＨＴ −１５−Ｄ−ＧＬを５００μ？／１匹
初聾免疫３日前ｌ（ｖウスの腹腔内に投与した。第１群は対照群でＤＨＴ −１５−Ｄ−ＧＬを含まない
生理食塩水を同様に投与する。日前に腹腔内に投与した。第２回免疫、第２回以後２週間毎に追加免疫を行なった
。第４．５．６群はＤＨＴ −３５−ＫＬＨで免疫され
、た。内に投与した。第５群と同様に、＠４群（対照群）のマ
ウスにＴ−１５−Ｄ−ＧＬに代えて生理食塩水を投与し
た。後より、２週間毎に採血し、血清中の抗体価と交叉反応
性とを調べた。抗体価の最も高い初層免疫から第１３週
後に得られた抗血清での結果は８Ｈ−！４５ ｍ）ｆを
５０１結合し得る抗血清の希釈倍数の逆数で表わすと対
照群（第１群）の抗体価は１．６００〜９．００００間
にあり、また第２群の抗体価は１，０００〜３，５００
０間にある０丁−１５−Ｄ−ＧＬを投与し光第３群では
抗体産生は認められなかった。一方、ムｂｒａｈａｍの方法（前述）Ｋよって求めた場
合第１群のマウスの抗血清の、ＤＨＴ［対する交叉反応
性は４．１〜８．２−の範囲にあり、ＤＨＴ −１５−
Ｄ−ＧＬで処理した第２群マウス抗血清の交叉反応性は
０．２７〜０．９４１の範Ｈにあった。この数字は今市文献に報告された抗テストステロン抗血
清のＤＨＴとの交叉反応性の価よりも良好である。従っ
て、本発明による抗血清のＤＨＴとの交叉反応性値実際
に無視することができようＯ従来報告された抗Ｔ抗血清のＤＨＴとの交叉反応性の最
低値は１８１１Ｇである。この数値を得る九め［Ｒａｏ
等は１５β−Ｃ１１ｆＭ−チーＢ８Ａを用イタ（Ｐ、Ｎ
、Ｒａｏ ａｎｄ Ｐ、ＨｏＭｏｏｒｅ ：ｆｒ、ｘテ
四イド２Ｂ（１９７６）本実織例でも同じく１５β−〇
ＩｌｆＭ −Ｔμを用いている。本実施例の第１群から
得られた交叉゛反応性は、上記の最低値におよそ等しい
のである。第４．５．６群から得られた抗ＤＨ’ｌ’抗血清の結果
は以下の通シであった。’ｕ−ｐｕｔ−４−！−ｆＰｐｒｔ５０１結合ＬＩＩル
抗血清Ｏ希べ釈倍数の逆数で表わすと、第４群（対照群
）の抗ＤＨ？抗体価は１，５００〜５．６００の範ＷＡ
Ｋある。Ｔ−３５−Ｄ−ＧＬを投４Ｌ＊＠５群の対応する抗体価
は１，０００〜７．６００の範囲に入る。ＤＨＴ −３５−Ｄ−ＧＬを投与し九第６群では抗体産
生は認められなかった。？−１５−Ｄ−ＧＬで処理した第５群のテストステロン
との交叉反応性はアプラハム法によると、６．５〜１９
．０チの範囲にあったが、対照群（第４群゛）の交叉反
応性は４８．３〜６８．５−の範囲Ｋｂつた。この結果は、’ｊ −１５−Ｄ−ＧＬ処理（投与）Ｋよ
って有意にテストステロンとの交叉反応性が抑えられて
いることを示している。またＤＨＴ −Ｄ −ＧＬを投与し九票６群に抗体産生
が認められない理由は、ＤＨ？抗体童生能を有するり四
−ンが、Ｉ）ＩＴ−Ｄ−ＧＬの投与により特異的に不藩
性化されたためであると考えられる。下記の実施例６−９（’−？デタイドの例）において用
いた試薬および分析法社次の通りである。（１１ハプテン−Ｄ −ＧＬの合成ペンタガストリン−Ｄ−ＧＬ結金物の作成Ｌｉｕらの方
法（バイオケ定ストリー（Ｂｉｏ−ａｈｓｍｉｓｔｒｙ
）、第１８巻、ｐ６９０ （１９７９） ）に準拠し
て合成した。（ａｃ＠ｔｙｌ ｍ＠ｒｏａｐｔｏ −ａｕａｃｉｎｙ
’ｌ ） −Ｄ −ＧＬ（以下ムａ−８−Ｄ−ＧＬ
と略す）の合成り−ＧＬ（分子量４．９万） ４０ｑ
（１，１６６μｍｏ１）を９００μｔの０．１２５ Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）に溶解し、ｌ Ｎ ＮａＯ
ＨテｐＨヲ７．２に調整する。この溶液に８−アセチル
ーカテトコハク酸無水物のりメチルホルムアオド（以下
ＤＭＦと略す）溶液（酸無水物２００■を１−のＤＭＩ
Ｆ Ｋ溶解する）５０μｔ（５７゜４μｍｏｌ）を加え
て（資）分間室温で攪拌する。反物と未反応の試薬とに
分離した。４４もこの反応生成物を含む溶液・１００μ
ｔａｌｃ Ｏ，５ＭＮ−４Ｙａｄｔシアｔ ｙ （ｐＨ
７，３）水溶液１００μｊ（５０μｍｏｌ ）を加え
、３７°ＣでＩ分間イレキューペートした。エルマン（
ＩＩ！ｌ１ｍａｎ ）らの方法〔アーカイック バイオ
ヶｔ−−バイオフイジイーク（ムｒＯｈ、Ｂ１００Ｍｍ
、Ｂ１０ｐｈ７ｅ。第羽巻ｐ７０ （１９５９） ） ＫよりＤ−ＧＩＩＫ
導入出した。即ち１．この反応溶液（資）μｔＫ脱酸素
した０、ＯＩＭの（５，５’−リチオビス（２−二トｐ
安息香酸）のメタノール溶液） ０．１ ｍを加え、ｐ
Ｈ８，０のトリス緩衝液Ｊ’ｓ＋／中でｍ分間反応させ
、次いで４１２ｎｍの吸光度を測定する。Ｄ−ＧＬＩ分子当りに導入されたＳ−アセト−サクシニ
ル−Ｄ −ＧＬをＡｃ−Ｂ工、−Ｉ）−Ｇｌ。と表示する）尚回収率は約７７嗟である。Ｄ−ＧＬが２
８０ｎｍでの吸収をもたないため、Ｄ−ＧＬ誘導体を含
む画分の回収率は吸光度測定により求められない。従ってＮ−サクシイきりルー３−（４−ヒドロキシフェ
ニル）ゾロビオ＄−）トＤ−ＧＬを反応させ、この反応
産物をモニターとしてセファデックスＧ−２５−カラム
に流し一蕎各番番龜吸光度（２８０ｎｍ）を測定するこ
とにより回収率を求めた。（ロ） ｍ−マレイイドベンゾイルーはンタガストリン
（以下、ＵＢ−−Ｓンタガストリンと略す）の作成声Ｒンタがストリン１１ Ｗ （１６，ｘ／ｍｏｘ ）
ｔＯ０ＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）＠９．５ｓｆＫ
溶解し、これにｍ−マレイｔｐベンゾイルー麗−とｐａ
キシサクシンイｔｒエステル（以下、Ｍｎ２と略す）
２５．３１１Ｆ（８０，５＃ｍＯ１、ｌ−のＤＭＰに溶
か１−九本の）を−変に加え攪拌をする。薄層クロマト
グラフ〔展開溶媒シクロヘキサン：酢噛エチル（１：Ｊ
’）、容量比〕によ抄反応が充分進んでいることを確認
の上、反応開始から５分後に反応液にジクロルメタ／３
−を加え、充分振とうした後、遠心分離する。上層の緩衝溶液を別の試験管に移す。下層のジクロルメ
タン層に少量のリン酸緩衝液を加え振とうし、遠心分離
後、上層を先の溶液に加える。ＭＢｉｌ −−Ｚンタガストリノを含む緩衝液部からほ
ぼ完全に未反応のＭｎ２が除かれたζトラ薄層クロマト
グラフによ抄確認した。一方、・窒素気流によ抄脱酸素された２−メルカプトエ
タノール水溶液加μｔ（７０ｔｋｍＯ１）ニ、上記のＭ
Ｂ日−Ｒンタがストリンを含む緩衝液加μｔを加え、室
温でｍ分間反応させた後、エルマン法により消費された
２−メルカプトエタノールのモル数を求め★。このモル
数がインタガストリンに導入されたマレイミドペンジイ
ル基に相当する。はフタガストリフ１分子当りに導入さ
れたマレイミドペンジイル基（Ｍ、Ｂ ）は０．９であ
った。（以下この化合物を日。、９ｇインタガストリン
表示する。）（ハ）インタガストリン−Ｄ −ＧＩ、結合物の作成前
記（イ）項で調製したムａ−８１ｓ−Ｄ−ＧＬ浴溶液（
ロ）項で調製し九ＭＢ０．。−インタガストリン溶液を
混合し、次の通シ反応させた。窒素気流下で充分脱酸素
後、５Ｍヒドロキシルア建ノン水溶液 １）Ｈ７，３）
５００μｔを混合物に加え、室温で攪拌をつづけた。１時間後、反応液の一部分をとり、エルマン法によ抄チ
ェックしたところ、−未反応８Ｈ基は存在しなかった。このことは、ＭＢ−−！！ンタがストリンと反応しなか
っ九８Ｈ基が存在していないこと、すなわちＤ−ＧＬ上
のすべての８Ｈ基は１ＭＢ−はンタがストリンと反応し
たことを青味する。ヒドロキシルアミン水溶液を加えてから２時間後に２メ
ルカプトエタノール（最終濃度１ ｍＭ ）を加え、さ
らに領分攪拌した。この反応液を透析膜（セロファン膜）を用いて０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２） Ｋて約冴時間透析した
。（透析後得られた溶液を直擬屯しくは希釈して使用し
た。）この様圧して作成されたはンタがストリン−Ｄ −ＧＬ
結金物のＤ−ＧＬＫ対するペンタガストリ／のモル比は
１５：１であった。（以下インタガストリン０．−Ｄ−ＧＬと表示する。）（２１Ｃ（４−８−Ｐ −＝？−ホールリンインド ヘ
モシアニン（ＣＣＫ −Ｂ −ｐ −ＫＴＪＨと以下略
称する）の作成区ＬＨ（以下ムｃ−Ｂ −ＫＬＨと略称する）の作成は
、前記（１）（イ）項記載のムａ−Ｂ−Ｄ−ＧＬ の作
成と同様に行なった。合成に先立って、ＫＬＨ７０”ＩＰを１．４−の１ｑＡ
Ｋ、ＣｏＳ溶液に溶解し、０．１２５ Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，２）で透析した。この溶液の２８０ｎｍで
の吸光度を測定することにより、ＫＬＨの量を算出した
。とのＫＬＨ溶液０．７ ｄ （ＫＩ、Ｉ！として２６．
０６０岬１分子量を約１０万とすると、−ｎ １ｎＯ１ハイド
ライド６．５μｍｏｌ を加え、（り（イ）項と同様
の操作で合成した。ＫＬＨ１分子に対しＦｉ６．８であ
った。（以下アセチル−８ａ、５−ＫＬＨ−と表示する
。）（ｏｌ ｍ −マレイｉドベ７ゾイル−ＣＣＫ −ｆ
３−Ｐ（以下ＭＢ−ＣＣＫ−８−Ｐと略称する・）Ｍ１
３−ハンタガストリンの作成と同様の方法で作成した。フラグメント縮恰法によ妙合成した０、４２ｗｑ（３８
５ｎ ｍｏｌ ）のＣＣＫ −ｆ３− Ｐを０．２Ｍリ
ン酸緩衝液０．５−に溶解し、６００ ＃ｆ （１，９
μｍｏｂ ）のＭＢ８と反応させた。反応には１．２ｑ
のＭＢ８を１００μｔのＤＭＩＦに溶解したＭＢＥＩ溶
液関μｔを用いた。得られた生成物のＣＣＫ−８−１）：ＭＢの比は１ ：
１．０であった。（以下ＭＢ、、。−ＣＣＫ −Ｂ−
Ｐと表示する。）（ハ） ＣＣＫ −ｇ −Ｐ −ＬＬＨ上記（２）（イ
）項で得られたアセチル−８６，ａ−ＫＩＪＨ溶液２．
３ ｗｔ （７５，９ａｍｏｌ ）と上記（２１呻）項
で得られたＭＢｌ、。−ＣＣＫ−ｇ−Ｐ溶液を混合し、
０．ｓＭＮＨ，ｏＨＯ，３ＣＣ（０，１５ｍｍｏｌ ）
を加え、１１）（ハ）項同様の操作を〈シ返した。得られたＣＣＫ −８−ＰとＫＬ１’ｌ ノ比は約５＝
１であった。（３） ＣＣＫ −８−Ｐ−牛血清アルブｆ ｙ （
Ｂｏｖｉｎｓ−・ｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ） （以下
ＣＣＫ−９−Ｐ−Ｂ８ムと略称する）の作成り８Ａ ２５ｗ５ｙ （３５１ｎｍｏｌ）と８−アセチ
ルエル〆カプトサクシニツクアンノ・イドライＰ１．５Ｍｌ
（ｓ、ｇ＃ｍｏ１）を用いて（１）（イ）項と同様の操
７．６ ： １であった。（ｏ） ＭＢ −ＣＣＫ −８−Ｐの作成ｃｃＫ−８
−Ｐ Ｏ，５＊ （４５７ｎｍｏｘ ）を０．５−の０
．１ Ｍ ９ン酸緩衝液ｐＨ８，ＯＫ溶解しこれを７０
０μｆのＭＢ８２．２９μｍｏｌと反応サセタ。反応ＫｄＭＢ日１．４ｑを１００μｔのＤＭＩＦ Ｋ溶
かし大溶液関μｔを用い、（１）１０）項と同様の操作
で合成した。ＭＢ：ＣＣＫ−８−Ｐの比け１．０ ： １であった。（以下ＭＢ、ｏ−ＣＣＫ −８−Ｐと表示する。）（ハ
） ＣＣＫ −３−Ｐ −ＢＢムの作成前記（３）（イ
）項の液１．９ ｙｄ （３４ｎ ｍｏｂ ）と（３）
（ロ）項で得られた液を混合し、Ｑ、５ Ｍ ＮＨｌＯ
ＨＯ，３５ＣＣ（１７５ａ ｍｏｌ ） ｔ ７Ｊ１
ｆｉ−１ｍＨ］ｌＮ と同ｍｆ）８作を行々つた。得られたＣＣＫ−ｇ −Ｐ ： Ｂ８ムの比は約５＝１
であった。以下ＣＣＫ−ｇ−Ｐ、−ＢＳＡと表示する。（４）ｋンタがストリン−Ｂｅムの作成（イ） ｕＢ
−ハンタガストリンの作成はンタがストリン０．５１１
ｖ（７５０ｎｍｏｌ）を０．５−の０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ８，０）に溶解し、これを−φ礪のＭＢ８１．
０５■（３，３μｍｏｌ ）と反応させた０反応にはＭ
Ｂ８２，１ ｗｑを１００μｔのＤＭＩＦ Ｋ溶かした
溶液間μｔを用い、前記（２）（ロ）項同様の操作を行
なった。１（３３ニー＜ンタガストリンの比は１．０ ： １で
あつ九。以下ＭＢ、、ｏ−／−？ンタガストリンと表示する。１口）／−？ンタガストリンーＢｅムの作成（３）（イ
）項同様にして得られた溶液２．５４ｍ（１１２ｎｍｏ
１）と（４）（イ）の液を混合し、０．５ＭＮ％ＯＨ（
Ｄ Ｏ，４Ｃｃ（２００ｐ ！ＥＩＯＩ ）を加え、（
１）（ハ）項と同様の操作を行なった。得られたはンタガストリンーＢ８ムのＲンタがストリン
：Ｂｓムの比は約５：１であった。以下はンタガストリ
ン、−ＢＡＡと表示する。（５）前記（１１項において、分子量３４，３００のＤ
−ＧＬＫ代えて分子量１１．５万のＤ−ＧＬを用いて、
（１）項同様の÷子反応量にて操作を行なって、はンタ
ガストリン♂、−Ｄ−ＧＬを得た。このものの分子表面
上での！−ＧＩＪに結合された抗原決定基（ベンタガス
ト１１ン）の密度は同様であった。実施例６（イ）免疫スケジュールと崩清採取各ダルーゾロ匹ずつの（Ｃ５７ＢＩＪ／６ＪＸＤＢＡ／
２）？、マウスを免疫した。全群の各マウスを各１０μｆのＣＣＫ−ｇ−Ｐ−ＫＬＨ
（各０．２−の完全フロインドアジュバントエマルジョ
ン）で免疫し、３週間後、各１０μＶのＣＣＫ−９−Ｐ
−ＩＣＬＨ（各０．２−の不完全アリュパントエマル
ジョン）でさらに免疫した。第２回免疫の２週間後、各ｌＯμｔのＣＣＫ −Ｑ−Ｐ
−ＫＬＨを水酸化アル電ニュウムグル（アルミニニウ
ム２■）Ｋ吸着させたもので、追加免疫した。追加免疫の２週間後および４週間後、各１ＯＪｌｆｔ）
ＣＣＫ−Ｊ −Ｐ −Ｉｌｌを含む０．２−生理食塩
水でさらに免疫した。免疫は全て腹腔内投与でおこなった。第２群の全マウス
に、初回免疫の３日前に各マウス当り３００μｔのはン
タガストリン□、−Ｄ−ＣｋＸｓを含ｔｒ Ｏ，５ＣＣ
の生理食塩水を腹腔内投与した。第１群（′：１ントロール）の各マウスに生理的食塩水
０．５ ｍｇ （ばンタガストリン、、−Ｄ−ＧＬを含
まず）のみを投与した。第３群のマウスは、２回目・の免疫の３日前と、３回目
の免疫の３日前に、各３００μｔのぼンタガストリン、
、−Ｄ−ＧＬを含む０．５０ｃの生理食塩水溶液を腹腔
内投与した。各免疫個体からの血清の採取は後眼窩静脈叢より行なっ
た。（ロ）抗体力価の測定抗体力価の測定は、ラジオイムノアッセイ法により行な
った・固相ラジオイムノアッセイ用ポリビニール丸底マイクロ
プレートの各ウェルに抗原（ＣＣＩＣ−ｆ３−Ｐ−Ｂ８
ＡまたはＲンタガストリンーＢｅム）ｌＯμｆ／−を含
有する０、０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２で０．１５
ＭのＮａＣＡを含む）を、１００μｔずつ加え、室温で
２時間インキエベートすることＫよシ、該抗原をポリビ
ニール板の表面に結合させる。この後、各ウェルの溶液
を捨て、ウェルを水道水で４回充分洗い落とす。その後
、水分を充分切って、ｌ ％ ＢＳＡを含む生理食塩水
２００μｔを各ウェルに加え４°Ｃで一夜放置すること
によって、ポリビニールの蛋白結合能をＢＳＡで完成に
マスクした。その後、各ウェルの溶液を捨てウェルを水道水で４回充
分洗い流し、水分を充分切って、次いでイムノアッセイ
に用いた。各抗血清をｌ ４ Ｂ１１− ＰＢ８で希釈して、その
０．１−を上記のプレートのウェルに加える。４°Ｃで一夜放置後、水道水で３回充分洗い流し、２
Ｍ ＮａＣｔ−ＰＢ８で６回洗浄し、最後に水道水で洗
い、充分水を切る。１“工でラベルした免疫吸着剤を用
いて特異精製したウサギ抗マウスエルＧ抗体θ自か會希
を１４ ＢＨム−ＰＢ８で希釈後０．１−を各ウェルに
加え、−夜装置した。この操作により、ポリビニール上
の抗原と反応する抗体があればこれと結合し、この抗体
は１″８ニ一ウサギ抗マウスエｆＧ抗体の結合度によっ
て知ることができる。各ウェルのアイントーデ溶液をピ
はストで取り除き、水で各ウェルを充分洗った後、各ウ
ェルを熱ニクロム線にて切り離し、各ウェルの放射活性
を測定した。（ハ）結果各採面時の各グループごとにゾール血清の抗体量を測定
し、抗体量のもつとも高かった第１回免疫後１１週目の
抗体について、さらに測定した。得られた結果は第１図の如くである。標準血清として用
いたのはグループ１の第１回免疫後７週目のゾール抗血
清であった。第１１週後に各マウスから得られたメンゾ
ル中の抗体量を、標準抗血清に含まれた抗体量を１とし
て、比率で現わし・た。標準として用いられたゾール抗血清は、次の様な力価を
もつものであった。下記のｃｃｘ −８を用いた液相ラジオイムノ△アッセイ系において６００倍希釈のこのプール抗血清は
コレシストキニン（ＣＣＫ−３３）の０．００１５１１
ｍｏｌを結合することができた。はンタガストリン、。−Ｄ−ＧＬを投与しなかを投与し
たマウスより得た抗体（第２および第３群。図１では、
それぞれム印および・印で表わす）のばンタガストリノ
と交叉反応する抗体の力価が非常に低いことが判った。％にば／夕がストリン０．−Ｄ−（）Ｌを初回免疫後（
２回目の免疫３日前と３回目の免疫の３８前）Ｋ投与し
たグループ３のマウスから以上の結果から１本発明によ
ｌ）、ＣＣＫ−８−アに４１１異的なｉｔノ酸配列に対
して即ち、れたことが分った。実施例７ＣＣＫ −８とはンタガストリンとが共存する液相イム
ノアッセイ系を用いて、上記方法で得られた抗体の交叉
反応性を次の過砂測室した。ＢＯｌｔＯｎ −Ｈ１ｌｎｔ＠ｒ試薬を用いて１１１１
１でＣＣＫ −８−Ｆをラベルした（ （ＩＩ、 ａａ
ｎｋａｒａら、Ｊ、Ｂｉｏｌ。Ｃｈ＠ｗ、 、第２５４巻、９３４９〜９３５１頁、１
９７９年）。以下このラベルした化合物を１１８１− ＢＨ−ＣＣＫ
−８と略す。〕。各小試験管Ｋ Ｏ，０２Ｍ リン酸
緩衝液（ｐＨ８，０，０，１慢ｒ？チンを含む）各５０
ｕｔｆ溶では、各試験管に種々の量のはンタガスト１）
ン加、ｔ、さらＫｘｓｓｌ −ＢＨ−ＣＣＩＣ−８（約
５００００１）！１ｋ ）を含有すゐ同じリン酸緩衝液
（資）μｔを加え、試験管をポルテックス・々キサーで
損とり温和し、次に４１ｉｋ”ＣＫ２４時間保つ、た後
、同じリン酸緩衝液で希釈（１：２）したウサギの抗マ
ウスＩｇＧ Ｆａｂ抗体５０μｔを試験管に加え、混和
し、４°ＣＫ２４時間保った。その後ｓｏｏｏｒｐｍで試験液を５分間遠心分離した。上清をアスピレータ−で吸い取抄、沈澹物に同じりん酸
緩衝液を用いて全１１１１ニーＢＨ−ＣＣＫ結合率（Ｂ
／Ｂｏチ）を算出した。１ｖｒａｚ−ＢＨ−ＣＣＫ−８ト抗体とノ結合を５ｏ嘔
阻害するのに必要な種々のイブタイドのモル量唸次の通
りであった。グループ１では、ＣＣＫ −８は１．ｌｐｍｏｌで４７
りガストリンは２０．１ ｐｍｏｘであっ九。従ってム
ｂｒａｈａｍの方法で算出した交叉反応性は５．５−（
１，１／２０．Ｉ Ｘ １００ ）であった。インタガストリン、、−Ｄ−ＧＬを初免疫前に投すなわ
ち上記抗体を用いた場合５０１阻正に必要なＣＣＫ −
９％、、ｉｊ ｌ 、７ ｐｍｏｂであったが、 １０
．ＯＯＯＰｍｏｌのインタガストリンを用いても阻止は
認められなかった。インタガストリンはグループ３のマ
ウスで音生された抗体と実際に反応することができなか
った。上記の結果よ抄、ハンタガストリンｉｌｌ −”−ＧＬ
の投与によって得られたグループ３のマウスの抗体を使
う場合、共存するはンタガストリンの有童鍍な影譬を受
けないで、サンプル中のＣＣＫ−７３−Ｐを特異的に測
定することが出来ることがわかった。実施例８５ｊ！讃例６Ｋかいて用いたマウスに代えて家兎を用い
て同様の免疫操作を行なった。但し。１００、＃ｌＪＦの０ＯＫ−ｆＪ −Ｐ −ＫＴ、ｒＭ
１ｆ含む完全オ九は不完全フロインドアジュパントエｉ
ルジ曹ンと１０＃のペンタガストリン、、−Ｄ−ＧＬ
を含む生肩食塩水１０ｓ＋ｊを用い友。得られ九結果
はマウス使用の場合とおよそ同様であった。実施例９実施例６において用い九ペンタガストリン、。−Ｄ−ＧＬｉ（代えて、分子量ｘｉｓ、ｏｏｏのペンタ
ガストリン、、−１）−（）Ｌを用いる他は、同様の操
作を行なって、実施例６とおよそ同様の結果が得られた
。[No branch body production was observed.] Furthermore, it can be seen that in the second group pretreated with DHT-3-D-GL, the cross-reactivity with DHT was significantly reduced compared to the control group. Furthermore, when examining the results in Table 1 by plotting the relationship between antibody titer and antibody cross-reactivity for each mouse, it was found that there was no correlation between antibody titer and cross-reactivity. Generally speaking, when pretreated with DHT-3-'D-GL, the cross-reactivity with DHT decreased^4-1, and no correlation was observed between this and a decrease in antibody titer. In other words, there is no correlation between low cross-reactivity and low antibody titer. As is clear from these facts, if clones showing cross-reactivity with MT are removed by the pre-membrane island of DHT-3-D-GL, the next T-
Immunization with 3-4LH selectively enhances the generation of antibiotic-producing clones with higher specificity for testosterone. The selective production of antibodies with low cross-reactivity as described above is a practical advantage of the present invention. Example 2 Preparation of a low cross-reactive dihydrotestosterone-specific antibody in mice In this practical example 2, 5 groups of C57BL/6 female mice (5 to 7 mice, 8 weeks old) were used. The first group is the control group and is T-3.
-Initial immunization with DT (T times-3-KLH) without pretreatment with D-GL, second immunization 3 weeks after the first time, third immunization 5 weeks after the first time, and then every 2 weeks. The timing and method of immunization for the other groups of mice is the same as that for the control group.
The day before, 500 μm of T-D-GL was administered intraperitoneally to each mouse. The third group was another control group, each containing 500 μt of D
HT-3-D-GL 5QQμ2 to DHT-3-KL
The drug was administered intraperitoneally to each mouse 3' days before the first introductory performance in H. Each mouse in groups 4 and 5 was immunized with DHT-3-KLH for the first time, and 3 weeks later, the mice were immunized for the second time.
Three days before the immunization, 500 μt each of T-3-D-GL and DHT-3-D-GL were administered intraperitoneally. Blood was collected every 2 weeks from 7 weeks after the first immunization for the above 5 groups, and the antibody titer and cross-reactivity in the serum were examined. After first immunization 1
The results for week 3 are shown in Table 2. Table 2 Note) Both Hata 1 and *2 are the same as the footnotes in Table 1. The results in Table 2 are similar to those shown in Example 1.
- Due to pre-administration of GL, production of low cross-reactive anti-DHT antibodies was observed as shown in the second group. T-3-D-GII and DH'l' − after initial immunization
Anti-DHT in groups 4 and 5 treated with 3-D-GL
The spontaneous production of antibodies was widely criticized. After pretreatment with DHT-3-D-GL, DHT-3-KL
The cross-reactivity of anti-DHT antibodies produced in the Maki 3 group immunized with H with T was as high as in the control group. Furthermore, the antibody titer was similar to that in Group 2.3. This shows that when treated with T-3-D-GL, an anti-DHT antibody with low cross-reactivity with T can be obtained. Example 3 Preparation of anti-T-strapping anti-DHT antibody in rabbits (domestic rabbits) The actual case was 3kl in weight. DHT-3-KLH emulsified with 1 group of female rabbits (DH after each interval)
A second immunization was performed by subcutaneous injection of T-3-KLH (200 μf each) with incomplete Freund's adjuvant. Thereafter, every month, a third incubation with DHT-3-KLH (200 μf each) was performed, alternating between complete Freund's adjuvant and incomplete Freund's adjuvant.
, the fourth immunization was performed. The second group is the control group, T-3-
The first treatment with DHT-3-KLH without administration of D-GL
The animals were immunized in the same way as the other groups. Is the third group D? -3-KLHF)
Three days before the second (three weeks later) and third (X weeks later) immunization, 10 Wq of T-3-D-GL was intraperitoneally administered to the rabbits. The fourth group has 1019 DHT-3-D-GL each.
It was administered intraperitoneally to rabbits 3 days before the initial immunization with KLH. The fifth group is a control group in which DH'I'-3-D-GL was not administered. Immunization with -3-KLH was performed in the same manner as in the fourth group. Group 6 received 10 wq of DHT-3-D- each 3 days before the second (3 weeks after the first immunization) and third (7 weeks after the first immunization) immunization with 'l'-3-KLH. Administer GL intraperitoneally to each rabbit 1. Ta. Blood was collected 10 days after each immunization.
I went to As a result, no significant antibody production was observed in Groups 3 and 6 over the entire course. Anti-DHT antibodies from the second group, which is a control group, and the fifth group (
The cross-reactivity of the anti-testosterone antibody obtained from the control group) to testosterone was 100%, and the cross-reactivity of the anti-testosterone antibody of the 5 group to DHT was 95.2%.
Met. However, Groups 1 and 4 showed significantly -◆low reactivity to cross-reacting substances. That is, the first group of anti-DHT
The cross-over of the antibody to testosterone was 11.9, and the cross-over of the anti-testosterone antibody of group 4 to DHT was 22.01. Example 4 Rabbit anti-T specific antibody and anti-DH? Measurement of human blood T and DHT using specific antibodies]) Anti-T specific antibodies and anti-DHT specific antibodies with low cross-reactivity were obtained in the rabbits of groups 1 and 4 in the above example, respectively. In order to examine the practicality of the antibody for detecting T and DHT in human Jf11 serum, we added known amounts of testosterone and Dl(T) to human serum, and conducted a radioimmunoassay using the above antiserum. We investigated the relationship between the amounts of T and DHT measured in using serum) 1-T 1.2,4nf,
Or DHTQ, l, 0.2.0.3n? and 3H-DHT2 to determine the recovery rate in the extraction operation.
．． 000 apm was added and mixed. Hexane:ether (3:2) was added to each sample and shaken for 1 minute using a Vortex mixer. The damaged ridge test tube was immersed in a dry ice-acetone bath Klθ for seconds, and the organic solvent layer was transferred to another test tube. The organic solvent was removed using an evaporator, ethanol 2- was added to the residue and mixed, and the ethanol solution was transferred in an amount corresponding to the measurable range of the inhibition curve using each antiserum to a small test tube and evaporated to dryness. Hardened, DHT
It was measured by radioimmunoassay using t1+ low cross-reactive anti-T antibody obtained by -D-GL pretreatment. On the other hand, transfer #0.5 of the ethanol solution to a vial,
Ethanol was evaporated, a scintillator was added to the residue, the cant was measured, and the result was used to calculate the recovery rate in the extraction operation, and the value obtained by radioimmunoassay was corrected. In addition, when measuring blood DHT levels, DHT O12,0,5fif or T
3) 1-DHT2. Q
QQd, p, m. Alternatively, 2.000 tl, p, rn of 5H-T was added and mixed well. Hexane:ether (3:2) 3- was added to the mixture, extraction was performed in the same manner as above, ethanol of 2- was added to the extraction residue, a portion of this ethanol solution was transferred to a small test tube, and the amount was The inhibition curve of DHT by each antiserum was adjusted to be within the measurable range, evaporated to dryness, and measured by radioimmunoassay using a low cross-reactive antiserum obtained by treatment with testosterone-D-GL. . On the other hand, the ethanol solution was transferred to a 0.5-vial, the ethanol was evaporated, a scintillator was added to the residue, the count was measured, and the value obtained by radioimmunoassay was corrected to be used for calculating the recovery rate in the extraction process. The results showed that when 1.2.4nf of T was added to normal female serum using a low cross-reactive antiserum, the T titer of the normal serum before addition was 0.301111P; The corresponding T value after is 1.15 nr, 2.3
0 nf, 4.60 nf -1)7). In addition, similar experimental system [DHT was replaced with T at 0.1.0.
When 2 and 0.3 nl were added and the effect of DHT on the measured testosterone level was examined, it was found that the level was almost the same as that of serum without additives, and there was no significant effect. On the other hand, normal female serum [DHT was 0.2 O and 0.5 N]
Add f to DHT in serum t to low cross-reactivity pile DH?
The results measured using antibodies show that normal serum before addition has DH.
T O,21 nt was measured, whereas each D
After adding HT, 0.41 and (1,72 tll) of DHT were measured;
``Ichikinshi9''. In addition, a similar experimental system K DHT (7
) Instead, when we added 0.2.0.51F of KT and looked at the effect of T on the measured DHT level, it was almost the same as the level of serum without additives, indicating that there was no significant effect. Wow★. 1. This result indicates that using the low cross-reactive antiseptic of Example 3, T or DH in the serum? Indicates that the level is accurately measured.゛Using a low cross-reactive heron anti-DHT antibody to detect DHT in human blood
Measure HT. Add the amounts of DHT and T (5nf, 1Onf), (10or. Ta. As a result, the DH measured even if the sample contains various amounts of the cross-reactive antigen 〒.
The amount of T is 5.67nf in each case, 1
It was 0.17 HP and 9.20 nf. This revealed that the low cross-reactive anti-DHT antibody obtained in Example 3 can accurately detect DHT even if it contains a large amount of T, a cross-reactive antigen. Table 3 Similarly, testosterone and DH'r were added to serum 0.1- as shown in Table 4 (snt, 1onr) and (xo
nf, s nti ), and (10nf, 10nf
) and the amount of testosterone was measured using a low cross-reactive heron anti-testosterone antibody.
The testosterone titer was 59 np. In this way, in the case of low cross-reactive anti-testosterone antibodies [
4. Testosterone can be accurately measured in the presence of the cross-reactive antigen DI'iT. Table 4 3) Measurement of actual human specimens (direct method) Refers to the direct method and the method of analysis without performing any operation to separate FiT and DHT in advance. On the other hand, for comparison, the conventional method, that is, after separating T and DHT respectively by perchromatography, + 1 beak tsuji fr X fill in rat.
1) Measurement of T in serum a) Common treatment Take a 0.1- or 0.5-value female serum sample into a test tube and measure 'H-T wo3. ,0
00 +1. I) and m were added and mixed well for the purpose of measuring the recovery rate in the extraction process or in the four Madograph fractions. Add 0.5 - of pure water to the serum sample of a busy man. 3-addition of hexane:ether (3:2), VOrt6
! It was shaken with a mixer for 1 minute. Dip the test tube into a dry ice-acetone bath for 10 seconds to freeze the serum portion.
The organic solvent layer was transferred to another test tube, and the organic solvent was removed using an evaporator. 0.4 ethanol was added to each residue of the direct method male self-extinguishing sample and mixed. In order to put this ethanol solution in the range of ~400T)f, the normal range is 100μt, and in the case of high testosterone serum such as items 1 and 2.3 of Table 5, the related μt is set for each small test. Transferred to tube. To measure the recovery rate during the extraction process, 100 μt was transferred to a vial.
After evaporation to dryness, a 11fK scintillator was added and counted. For the female serum sample, 0.7% of ethanol was added to the hexane-ether extraction residue. - was added, and 0.5 - of the solution was transferred to a small test tube. 100 μt for measuring the recovery rate of extraction species
Transfer to a vial, evaporate to dryness, and apply a scintillator to the residue.
was added and counted. The ethanol in the ethanol solution, both of which was transferred to a small test tube, was removed by evaporation under a stream of nitrogen gas, and the residue was used for radioimmunoassay. 3) Baper chromatography method Chloroform was added 5X+ttt to the hexane-ether extraction residue obtained in the same manner as the above-mentioned direct method, and the mixture was coated on paper. This operation was performed a total of three times. Testosterone 1O was used as a standard marker for similar patients.
μt was applied. The R-par was placed in a chromatography tank containing a solvent of BushA (cyclohexane; methanol:water = 10:12). After 2 hours, BushA
Add the top layer and let it develop for 16 hours. After development, the spot of testosterone as a single marker was detected at 254 nm UJ.
Detected by absorption. The length of the sample paper corresponding to the spot of this standard marker was cut three times and extracted with ethanol. Ethanol was removed by evaporation under a nitrogen stream. Then, proceed in the same manner as the direct method and use it for radioimmunoassay*. 2) To create a radioimmunoassay T standard curve, prepare a T ethanol solution (0.20150.100.200, or 400 M
) were placed in test tubes. 1 opt of H-T ethanol solution (20,000 (lI) nl/10 μt) was added to each of these small test tubes and the small test tube containing the sample, and the ethanol was removed by evaporation. Rabbit anti-T antiserum was added to l'H-T at 20,000 clpm (4 as T).
5'E) f) t60 concentration that can bind (BO=ω
9g) K, 0.05M) Lys buffer (T)
)18.0.0.051 BsA (bovine serum albumin), 0.1% BGG (bovine serum r-gutetrapurine)
KO12- in each small test tube, and
It was mixed with OrtlX ff1iX@r. Separately %'H
-'1'20.000+11) Add 0.2- each of Tris buffer to two small test tubes containing only 1 m, mix, and B□
= e100 for vomiting. Each solution was left at room temperature for 2 hours,
0.2-liter of saturated ammonium sulfate aqueous solution was added and mixed. 3,000
Centrifuge for 10 minutes at rTlm, transfer the supernatant 0.2- to a vial, and scintillator-27! was added and counted. The measured counts were then converted to B/Bo (*). 3.2) 1) Measurement of 11T in female serum The amount of serum sample, extraction, and separation of DHT and T by perchromatography were performed in the same manner as those used for the measurement of T in female serum samples. Detection of DH'r is carried out by spraying a mixed solution of equal volumes of 1-thim-dinitrobenzene in ethanol and 2.5N sodium hydroxide in ethanol. DHT radioimmunoassay uses DIIT/ethanol standard solution and H-DIIT/ethanol solution (40eO0
(0dpm/104t) in the same manner as the tenorioimmunoassay method. The values obtained by radioimmunoassay were corrected by the recovery rate for both the direct method and conventional Eper chromatography. In the case of the direct method, the recovery rate of T or I) IT is 5 to 100.
Since there was no variation in the KIh selection and measured values within the range of excellent, is it 3H-T or 3H-DH? Recovery rate correction by addition is considered unnecessary in normal cases. The results are in Table 5, No. 61! Shown below. Results and Analysis Table 5 It is clear from the above table that the measured values of both measurement methods clearly agree with each other. Table 6 (Female Serum) As is clear from the above table, the measured values of both measurement methods are in good agreement. As is clear from the above experimental facts, the target substance can be easily and accurately measured even in the presence of cross-reactive antigens by the direct method using the low cross-reactive antibodies provided by the present invention. Conventional methods, such as perchromatography, do not require pre-separation of cross-reactive antigens and can easily measure the target substance. According to the present invention, pre-treatment of animals with conjugates of cross-reactive antigens and D-GL thereby induces immune unresponsiveness to the cross-reactive antigens, resulting in specific antibodies and Clones capable of producing antibodies can be obtained. This method? -3
-D-GL +DH? Although the present invention is not limited to the above-mentioned example using -3-D-GL, it can be applied to other examples as shown in the following Example 5. In other words, in Actual Example 5, the binding sites of the carrier with T and DHT are changed, but in this case [4, substantially the same results are obtained. In this example,! and DHT were again used as model antigens, and the binding site between them and the carrier was changed from position 3 to position 15, thereby changing the structure of the hapten exposed on the surface of the carrier molecule. Example 5 15β-carboxyethylmercaptotestosterone (
(hereinafter abbreviated as 15β-C11iM-T) and 15β-carboxyethylmercapto-5α-dihydrotestosterone (hereinafter abbreviated as 15β-CEM-5α-DI (abbreviated as 'r) and KLi[i or D-GI, Regarding the properties of antiserum obtained using the conjugate, 15β-CEM-T was evaluated by Rao%P, NanlP
, H. Moors Jr. Nysteroid Fort (1976)
P 101.15β-C1! ! N-5α-DHT is R
ao, P, N, , A, H, Khan atol P
, H. Moors, Jr.: Steroid)” 29 (1
977) I', Turtle synthesized by the methods described in 17, respectively, were used. Method for binding 15β-CICM-T to D-GL or KL)I and 15β-ClfiM −
The bond between 5α-DHT and D-GL or KLH is the above-mentioned DHT-3-CMO or ? -3-CMO and D
-G1 or KLH in the same manner as in the case of 9. The resulting conjugates are T-15-D-GL,! -15-K
LH, DHT -15-D -GL, MT -15-
It is abbreviated as 4LH. In this example, six groups of C57BII/6 i1-mice (8-10 weeks), 7 mice per group, were used. The second group is DHT-15-D-GL at 500μ? / 3 days before the first deafness immunization (intraperitoneally administered to v mice. The first group is a control group, in which physiological saline not containing DHT-15-D-GL is similarly administered. The second immunization was followed by booster immunizations every two weeks after the second immunization. Groups 4, 5, and 6 were immunized with DHT-35-KLH and administered intravenously. Group 5 and Similarly, physiological saline was administered to mice in the @4 group (control group) instead of T-15-D-GL. From then on, blood was collected every two weeks, and the antibody titer and cross-reactivity in the serum were measured. The results for the antiserum obtained 13 weeks after the primary immunization with the highest antibody titer showed that 8H-!45m)f, expressed as the reciprocal of the dilution factor of the antiserum capable of binding 501, was 8H-!45m) f for the control group. The antibody titer of (group 1) is between 1.600 and 9.0000, and the antibody titer of group 2 is between 1,000 and 3,500.
No antibody production was observed in the light group 3 in which 0-15-D-GL, which was between 0 and 0, was administered. On the other hand, the cross-reactivity of the antisera from mice in the first group to DHT was in the range of 4.1 to 8.2, as determined by the method of Mubraham (mentioned above).
The cross-reactivity of group 2 mouse antisera treated with D-GL was in the range H from 0.27 to 0.941. This number is better than the value of cross-reactivity with DHT of anti-testosterone antiserum reported in the Imaichi literature. Therefore, the cross-reactivity value of the antiserum according to the invention with DHT may be practically negligible.The lowest value of cross-reactivity with DHT of anti-T antiserum previously reported is 1811G. The ninth step to get this number [Rao
etc. used 15β-C11fM-Qi B8A (P, N
, Rao and P, HoMoore: fr, xte4ide 2B (1976) 15β-〇IlfM-Tμ is also used in this actual weaving example. The cross-reactivity obtained from the first group of this example is approximately equal to the minimum value mentioned above. The results of the anti-DH'l' antiserum obtained from Groups 4, 5, and 6 were as follows. 'u-put-4-! -fPprt501-binding LII anti-DH of group 4 (control group) when expressed as the reciprocal of the dilution factor of antiserum O? Antibody titer ranges from 1,500 to 5.600 WA
There is K. The corresponding antibody titer of the 4L*@5 group administered with T-35-D-GL was in the range of 1,000 to 7.600. No antibody production was observed in the 6th group to which DHT-35-D-GL was administered. ? The cross-reactivity with testosterone of the fifth group treated with -15-D-GL was 6.5-19 according to the Apraham method.
．． However, the cross-reactivity of the control group (group 4) was in the range of 48.3 to 68.5 Kb. This result shows that 'j-15-D-GL treatment (administration) K significantly suppressed cross-reactivity with testosterone. Also, the reason why no antibody production was observed in the Kusho 6 group after administering DHT-D-GL is DH? It is thought that this is because the lichen, which has the ability to generate antibody, was specifically rendered inactive by the administration of I) IT-D-GL. The reagents and analytical methods used in Example 6-9 ('-?detide example) below are as follows. (Synthesis of 11 hapten-D-GL Preparation of pentagastrin-D-GL crystals by the method of Liu et al. (Bio-ahsmistry)
), Vol. 18, p. 690 (1979)). (ac@tyl m@roapto -auaciny
'l) -D -GL (hereinafter Mu a-8-D-GL
Synthesis of GL (molecular weight 49,000) 40q
(1,166 μmo1) to 900 μt of 0.125 M
Dissolved in phosphate buffer (pH 7,2) and 1N NaO
Adjust the pH to 7.2. Add 8-acetyl-catetosuccinic anhydride to this solution and add methylformhydride (hereinafter abbreviated as DMF) solution (acid anhydride 200 μm to 1-DMI
Add 50 µt (57° 4 µmol) of FK (dissolved) and stir for 1 minute at room temperature. The material was separated into the unreacted reagent. 44 is also a solution containing this reaction product・100μ
talc O,5MN-4Yadtsia ty (pH
7,3) 100 μj (50 μmol) of an aqueous solution was added and incubated at 37°C for 1 minute. Elman (
II! l1man) et al.
, B10ph7e. No. Hanaki p70 (1959)) D-GIIK from K
It was introduced. Namely 1. This reaction solution (source) μtK deoxygenated O, OIM (5,5'-lithiobis(2-ditop
Add 0.1 m of methanol solution of benzoic acid) and
React for m minutes in H8,0 Tris buffer J's+/ and then measure the absorbance at 412 nm. S-aceto-succinyl-D-GL introduced per D-GLI molecule was converted into Ac-B, -I)-Gl. ) The recovery rate is approximately 77 mo. D-GL is 2
Since it has no absorption at 80 nm, the recovery rate of the fraction containing the D-GL derivative cannot be determined by absorbance measurement. Therefore, N-saccharyl-3-(4-hydroxyphenyl)zorobio$-)toD-GL was reacted, and this reaction product was used as a monitor to flow through a Sephadex G-25 column. ) was determined to determine the recovery rate. (b) m-maleidobenzoyl is the creator voice of ntagastrin (hereinafter abbreviated as UB--S ntagastrin) R ntagastrin 11 W (16,x/mox)
tO0IM phosphate buffer (pH 8,0) @9.5sfK
Dissolve and add m-malley tp benzoyl and pa
Xisuccini tr ester (hereinafter abbreviated as Mn2)
Add 25.311F (1-9 bottles dissolved in 80.5 #mO1, l- of DMP) and stir. Thin layer chromatography [developing solvent cyclohexane: ethyl vinegar (1:J
5 minutes after the start of the reaction, add dichlorometh/3 to the reaction solution.
-, shake thoroughly, and centrifuge. Transfer the upper buffer solution to another test tube. Add a small amount of phosphate buffer to the lower dichloromethane layer, shake it, centrifuge, and then add the upper layer to the previous solution. The extraction was confirmed by zeta thin layer chromatography in which almost completely unreacted Mn2 was removed from the buffer solution containing MBil--Zntagasterino. On the other hand, the above M
After adding μt of a buffer solution containing Strine on B-R, and reacting for m minutes at room temperature, the number of moles of 2-mercaptoethanol consumed was determined by Ellman's method. This number of moles corresponds to the maleimidopendiyl group introduced into intergastrin. The maleimidopendiyl group (M, B) introduced per molecule of futagastrif was 0.9. (Hereinafter, this compound will be expressed as 9g intergastrin.) (c) Preparation of intergastrin-D-GI, conjugate Mu-a-81s-D-GL bath solution prepared in the above (a)
9MB0. . - The intergastrin solutions were mixed and reacted for the following duration. After sufficient deoxidation under a nitrogen stream, 5M hydroxyl-containing nonaqueous solution 1) H7, 3)
500 μt was added to the mixture and stirring continued at room temperature. After 1 hour, a portion of the reaction solution was taken and checked by Ellman's method, and no unreacted 8H group was present. This is MB--! ! The 8H groups on D-GL are all 8H groups on D-GL, which gives a blue tint that the 1MB-ta has reacted with the strine. Two hours after the addition of the hydroxylamine aqueous solution, 2-mercaptoethanol (final concentration 1 mM) was added and the mixture was further stirred in portions. Using a dialysis membrane (cellophane membrane), this reaction solution was
The mixture was dialyzed against M phosphate buffer (pH 7.2) for about an hour. (The solution obtained after dialysis was used directly or diluted.) The printer prepared under such pressure was String-D-GL.
The molar ratio of pentagatri/to D-GLK in the crystal was 15:1. (Hereinafter referred to as intergastrin 0.-D-GL.) (abbreviated as mu c-B-KLH) was prepared in the same manner as the production of mu a-B-D-GL described in (1) (a) above. Prior to synthesis, KLH70''IP was .4-1qA
K, dissolved in CoS solution and dialyzed against 0.125 M phosphate buffer (pH 7,2). The amount of KLH was calculated by measuring the absorbance of this solution at 280 nm. KLH solution with 0.7 d (KI, I! as 26.
Assuming that the molecular weight of 060 Misaki is approximately 100,000, 6.5 μmol of -n 1nO1 hydride was added and synthesis was carried out in the same manner as in section (a). Fi 6.8 was obtained for 1 molecule of KLH. (Hereinafter referred to as acetyl- 8a, expressed as 5-KLH-.) (ol m -malei i dobe7zoyl-CCK -f
3-P (hereinafter abbreviated as MB-CCK-8-P) M1
It was prepared in the same manner as for the preparation of 3-hantagastrin. 0,42wq (38
5 n mol) of CCK-f3-P was dissolved in 0.2 M phosphate buffer, 600 #f (1,9
μmob) was reacted with MB8. 1.2q for reaction
An MBEI solution of MB8 dissolved in 100 μt of DMIF was used. The ratio of CCK-8-1):MB of the obtained product was 1:
It was 1.0. (hereinafter referred to as MB,... -CCK -B-
Display as P. ) (c) CCK -g -P -LLH Acetyl-86,a-KIJH solution obtained in section (2) (a) above 2.
3 wt (75,9 amol) and MBl obtained in the above (21 mm) section. -mix the CCK-g-P solution,
0. sMNH, oHO, 3CC (0.15 mmol)
and repeated the same operation as in section 11) (c). The ratio of the obtained CCK-8-P to KL1'l was approximately 5=
It was 1. (3) CCK-8-P-bovine serum album f y (
Preparation of 8A 25w5y (351 nmol) and 1.5 ml of 8-acetyl ester captosaccharinic acid hydraly.
Using (s, g#mo1), the ratio was 7.6:1 in the same manner as in section (1) (a). (o) Creation of MB-CCK-8-P ccK-8
-PO,5* (457nmox) to 0.5-0
．． Dissolve 1M 9-phosphate buffer pH 8, OK and add to 70%
React with 82.29 μmol of MB at 0 μf. Reaction KdMB day 1.4q was dissolved in 100 μt of DMIF K and synthesized using a large solution of KdMB in the same manner as in section (1) 10). The ratio of MB:CCK-8-P was 1.0:1. (Hereinafter referred to as MB, o-CCK-8-P.) (c) Creation of CCK-3-P-BB 1.9 yd (34n mob) of the solution in (3) (a) above and (3 )
Mix the liquid obtained in section (b) and add Q, 5 M NHlO
HO, 35CC (175a mol) t 7J1
fi-1mH]lN and mf) 8 works were performed. The resulting CCK-g-P:B8 ratio is approximately 5=1
Met. Hereinafter, they will be expressed as CCK-g-P, -BSA. (4) Creating a string-bem (a) uB
-The creation of hanta gastrin is 0.511
MB81.
For the 0 reaction reacted with 05■ (3.3 μmol), M
The same operation as in the above (2) (b) was performed using a solution μt obtained by dissolving B82,1 wq in 100 μt of DMIF K. 1 (The ratio of 33 ni < ntagastrin is 1.0:1. Hereinafter expressed as MB,, o-/-? ntagastrin. 1 sip)/-? 2.54 m (112 nmol) of solution obtained in the same manner as in section (3) (a)
Mix the solutions 1) and (4) (a) and add 0.5MN% OH (
Add D O,4Cc (200p !EIOI), (
1) The same operation as in section (c) was performed. The ratio of Rntagastrin:Bsm in the obtained Ntagasterin-B8m was approximately 5:1. The following is indicated as ntagastrin, -BAA. (5) In the above (paragraph 11), D with a molecular weight of 34,300
- Using D-GL with a molecular weight of 115,000 instead of GLK,
The same operation as in section (1) was carried out using the same diluted reaction amount to obtain hantagastrin♂, -D-GL. on the molecular surface of this thing! - The density of antigenic determinants (bentagast 11) bound to GIJ was similar. Example 6 (a) Immunization schedule and disintegration collection from each Darusoro mouse (C57BIJ/6JXDBA/
2)? , immunized mice. Each mouse in all groups was treated with 10 μf of CCK-g-P-KLH.
(each 0.2 - complete Freund's adjuvant emulsion) and 3 weeks later, each 10 μV CCK-9-P
- ICLH (0.2- each incomplete allupant emulsion) was further immunized. Two weeks after the second immunization, each lOμt of CCK-Q-P
Booster immunization was carried out with -KLH adsorbed with aluminum hydroxide (aluminum 2). 2 and 4 weeks after boosting, 1 OJlft each)
Further immunization was performed with 0.2-normal saline containing CCK-J-P-Ill. All immunizations were administered intraperitoneally. All mice in the second group were treated with 300 μt of ntagastrin□, -D-CkXs per mouse 3 days before the first immunization.
of physiological saline was administered intraperitoneally. Each mouse in the first group (':1 control) received only 0.5 mg of physiological saline (without bantagastrin, -D-GL). Group 3 mice received 300 μt of vontagastrin each 3 days before the second immunization and 3 days before the third immunization.
, -D-GL in 0.50c of physiological saline solution was administered intraperitoneally. Serum from each immunized individual was collected from the retroorbital venous plexus. (b) Measurement of antibody titer Antibody titer was measured by radioimmunoassay method. Antigen (CCIC-f3-P-B8) was added to each well of a polyvinyl round bottom microplate for solid-phase radioimmunoassay.
0.01M phosphate buffer (pH 7.2, 0.15
The antigen is bound to the surface of the polyvinyl board by adding 100 μt of NaCA (containing NaCA) and incubating for 2 hours at room temperature. After this, the solution in each well is discarded and the wells are rinsed thoroughly with tap water four times. Thereafter, the water was thoroughly drained, and 200 μt of physiological saline containing 1% BSA was added to each well and left at 4° C. overnight to completely mask the protein binding ability of polyvinyl with BSA. Thereafter, the solution in each well was discarded, the wells were thoroughly rinsed four times with tap water, the water was thoroughly drained, and the wells were then used for immunoassay. Each antiserum is diluted in l4B11-PB8 and 0.1- is added to the wells of the plate described above. After leaving it at 4°C overnight, rinse thoroughly with tap water 3 times.
Wash 6 times with M NaCt-PB8, and finally with tap water, and drain thoroughly. Rabbit anti-mouse L-G antibody Θ-1, which had been specifically purified using an immunoadsorbent labeled with 1"-1, was diluted with 14-BH-PB8, and 0.1-1 was added to each well, and the device was incubated overnight. By the operation, if there is an antibody that reacts with the antigen on the polyvinyl, it binds to it, and this antibody can be determined by the degree of binding of the 1''8 rabbit anti-mouse fG antibody. After removing the Eintode solution from each well with a piston and thoroughly washing each well with water, each well was sectioned with a hot nichrome wire, and the radioactivity of each well was measured. (c) Results The amount of antibodies in the sol serum was measured for each group at each sampling time, and the amount of antibodies at 11 weeks after the first immunization, where the amount of antibodies was highest, was further measured. The results obtained are shown in FIG. The standard serum used was Zoll antiserum from Group 1, which was obtained 7 weeks after the first immunization. The amount of antibody in mensol obtained from each mouse after the 11th week was expressed as a ratio, with the amount of antibody contained in the standard antiserum being set as 1. The sol antiserum used as a standard had the following titer. This pooled antiserum at a 600-fold dilution in the liquid phase radioimmunoΔ assay system using CCX-8 described below was 0.001511 of cholecystokinin (CCK-33).
It was possible to combine mol. Hantagastrin,. - Antibodies obtained from mice administered with and without D-GL (groups 2 and 3. In Figure 1,
It was found that the titers of antibodies cross-reacting with bantagastrino were found to be very low (indicated by mu and - marks, respectively). % Niba/Yuuga String 0. -D-() After initial immunization with L (
Based on the above results from the mice of group 3 administered K (3 days before the second immunization and 38 days before the third immunization), according to the present invention, it was found that CCK-8-A had a 411-different IT amino acid sequence. In other words, it turned out that it was. Example 7 Using a liquid-phase immunoassay system in which CCK-8 and ntagastrin coexist, the cross-reactivity of the antibody obtained by the above method was measured in the following dialysis laboratory. 1111 using BOltOn-H1lnt@r reagent
CCK-8-F was labeled with 1 ((II, aa
nkara et al., J. Biol. Ch@w, Volume 254, Pages 9349-9351, 1
979). Hereinafter, this labeled compound will be referred to as 1181-BH-CCK.
It is abbreviated as -8. ]. Each small test tube K O, 02M phosphate buffer (pH 8, 0, 0, 1 containing chlorine) 50 each
In the UTF solution, various amounts of Hantagast 1) were added to each test tube.
Kxssl -BH-CCIC-8 (approximately 500001)! Add μt of the same phosphate buffer containing 1k), warm the test tube with Portex-Nexar, then keep for 24 hours, then dilute with the same phosphate buffer (41ik”CK). 50 μt of rabbit anti-mouse IgG Fab antibody (1:2) was added to the test tube, mixed, and kept at 4°C for 24 hours.Then, the test solution was centrifuged at SOOORPM for 5 minutes.The supernatant was sucked off with an aspirator. , the total 1111 nee BH-CCK binding rate (B
/Bochi) was calculated. The molar amounts of various ibutide required to inhibit binding to the 1vraz-BH-CCK-8 antibody were as follows. In group 1, CCK-8 is 1. 47 in lpmol
gastrin was 20.1 pmox. Therefore, the cross-reactivity calculated by Abraham's method is 5.5-(
1, 1/20. I x 100). Intagastrin, -D-GL is administered before the first immunization, i.e., when the above antibody is used, CCK - required for 501 inhibition.
9%, ij l, 7 pmob, but 10
．． No inhibition was observed using OOOPmol of intergastrin. Intergastrin was actually unable to react with the raised antibodies in group 3 mice. A summary of the above results, Huntergastrinill -”-GL
When using antibodies from Group 3 mice obtained by administration of CCK-73-P in samples, it is possible to specifically measure CCK-73-P in samples without the undesirable effects of coexisting ntagastrin. I understand. Example 8 5j! Similar immunization procedures were performed using domestic rabbits instead of the mice used in Example 6K. however. 100, #lJF's 0OK-fJ -P -KT, rM
Complete O9 including 1f is incomplete Freund's adjuvant A
Luzi carbon and 10# pentagastrin, -D-GL
A friend using fresh shoulder saline solution 10s+j containing. The results obtained were approximately similar to those obtained using mice. Example 9 Nine pentagastrins used in Example 6. -D-GLi (replaced with pentagastrin having a molecular weight of xis, ooo, -1)-()L was used, and the same operation was carried out to obtain approximately the same results as in Example 6.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]図面は本発明による抗体が低交叉性であることを示す図
で、横軸はペンタガストリンと反応する抗体量を慶わし
、縦軸は００Ｋ −５１−Ｐと反応する抗体量を褒わす
。０印は、ペンタガストリン、、−Ｄ−ＧＬを投与しなか
つえマウス（第１群）より得九抗体を表わす。ム印は、初回免疫前にペンタガストリン１．、−Ｄ−Ｇ
Ｌを投与したマウス（第１１より得九抗体を表わす。・印は、初回免疫後にペンタガス）ｌＪｙ、、−］）−
Ｇｌ−を投与したマウス（第３群）よ勤得九抗体を表わ
す。それぞれの単位はグループ１のマウスの初回免疫後１週
後のプール血清中Ｋｔｌれるそれぞれの抗体量を便宜的
Ｋ１．＠とした時の抗体含量の比率を嵌わす。The figure shows that the antibody according to the present invention has low cross-reactivity, where the horizontal axis represents the amount of antibody that reacts with pentagastrin, and the vertical axis represents the amount of antibody that reacts with 00K-51-P. The 0 mark represents nine antibodies obtained from mice (group 1) without administration of pentagastrin, -D-GL. The mark indicates pentagastrin 1.0 mg before the first immunization. , -D-G
Mice administered with L (indicates the 9th antibody obtained from No. 11. ・Marks indicate pentagas)lJy,,-])- after the first immunization.
Mice administered Gl- (group 3) show the highest levels of antibodies. Each unit is a convenient K1. Insert the ratio of antibody content when @.