【発明の詳細な説明】 安定な脂質／核酸複合体を含む送達ビヒクル関連出願 本出願は、1995年5月26日に出願された米国特許出願番号第08/450,142号の一部継続出願である。 1.0．序論 本発明は生化学の分野である。特に、ポリヌクレオチドまたは他の生物活性物質を細胞に効率的に送達する新規の組成物が報告される。 2.0．背景 本発明は、新規のポリヌクレオチド送達ビヒクル、およびそれを製造するための新規の方法に関する。 分子生物学の分野が成熟するにつれて、研究者らがポリヌクレオチドを操作することを可能にする、広範な種々の方法および技法が開発されてきた。ポリヌクレオチドは、代表的には、細胞内で特定の機能を行う目的で操作される。不運にも、ポリヌクレオチドポリマーは、（リン酸骨格のために）高度に荷電した分子であり、そして細胞膜を容易に透過しない。このように、遺伝子工学で得られる進歩とともに、研究者らが遺伝子操作された物質を細胞中に導入し得る方法における進歩もまた、得られている。 遺伝子操作されたポリヌクレオチドを細胞に送達するために開発された方法の１つは、リポソームの使用を包含する。リポソームのリン脂質二重層は、代表的には、細胞膜の成分と類似の物質から製造される。したがって、リポソームと（外部または内部のいずれかで）会合したポリヌクレオチドは、リポソームの包膜が細胞膜と融合するとき、細胞に送達され得る。より代表的には、リポソームは細胞中にエンドサイトーシスされる。インターナリゼーションの後、エンドサイトーシス小胞の内部pHは実質的に低下し得、そして／または小胞はリソソームを含む他の細胞内小胞と融合し得る。小胞融合のプロセス中またはその後、エンドソームの内部含有物は細胞中に放出され得る。 リポソームは、ポリヌクレオチド送達ビヒクルとしてリポソームの比較的少ない内部容量により限定される。したがって、リポソーム処方物内に高濃度のポリヌクレオチドを効果的に捕らえることは困難である。 研究者らは、リポソーム処方物に正の電荷を有する両親媒性の脂質部分を添加するか、または使用することによって、上記の無効果を補うことを試みた。原則的には、両親媒性脂質の正の電荷を有する基は、負の電荷を有するポリヌクレオチドとイオン対を形成し、そしてポリヌクレオチドと脂質粒子との間の会合の程度を増加させ、これはおそらく細胞膜への核酸の結合を促進する。例えば、いくつかのカチオン性脂質産物が現在入手可能であり、核酸の細胞中への導入に有用である。特に重要なものは、LIPOFECTINTM（DOTMA）、これはジアシルグリセロールに付着した１価カチオン性コリン頭部基からなる（一般的に、Epsteinらの米国特許第5,208,036号を参照のこと）；TRANSFECTAMTM（DOGS）、リポスペルミン頭部基を有する合成カチオン性脂質（Promega、Madison、Wisconsin）；DMRIEおよびDMRIE・HP（Vical、La Jolla、CA）；DOTAPTM（Boehringer Mannheim、Indianapolis、Indiana）、ならびにLipofectamine（DOSPA）（Life Technology, Inc.、Gaithersburg、Maryland）である。 適切に用いられると、上記の化合物は、インビトロで培養された細胞への核酸の透過性を増強する。したがって、リポフェクションのプロセスは細胞生物学の重要な手段になっている。代表的には、カチオン性脂質を含む処方物は送達されるポリヌクレオチドと内部混合され、次いで標的細胞に適用される。リポフェクション効率が２、３時間後に著しく低下するので、カチオン性脂質−ポリヌクレオチド複合体は、一般的に、混合後比較的すぐに使用されなければならない。この観察から、少なくともリポフェクション効率に関して、カチオン性脂質−ポリヌクレオチド複合体はむしろ不安定であると推測し得る。 研究の展望から、上記の複合体はかなり調製し易い。したがって、調製された複合体の比較的短い活性寿命は、インビトロ適用が関係する場合問題ではない。しかし、カチオン性脂質を含むポリヌクレオチド送達ビヒクルの医学的使用またはインビボ使用が意図される場合、所定の臨床医が、必然的に、活性処方物を確実に調製し、続いて最適活性のかなり狭い領域(window)内でその処方物を使用し得ることを想定し得ない。したがって、特に臨床的使用が意図される場合、より安定なポリヌクレオチド送達システムが好ましい。 現在入手可能な化合物の別の欠点は、それぞれの脂質およびカチオン性成分が生分解性化学結合によって連結されないことである。このように、標的細胞が合成脂質を代謝し得ないので、現在入手可能な合成カチオン性脂質のほとんどはかなり毒性である。 所定のレベルの細胞毒性は有害であり得るが、ポリヌクレオチドを送達するためのカチオン性脂質のインビトロ使用または研究の使用が意図される場合は受容可能であり得る；しかし、このような毒性は、一般的に、カチオン性脂質のインビボ使用が意図される場合は受容可能ではない。したがって、必須ではないが、インビボでの使用のためのカチオン性脂質−ポリヌクレオチド送達ビヒクルの調製について、生体適合性、生分解性、または代謝可能な成分を含むカチオン性脂質が好ましい。あるいは、実質的に低減された毒性のカチオン性脂質−ポリヌクレオチド送達ビヒクルが用いられ得る。 最後に、細胞をトランスフェクトするために合成カチオン性脂質を使用するための現在利用可能な方法はすべて、比較的低濃度の血清によって迅速に不活性化される脂質／DNA複合体を生成する。血清感受性は、無血清培地中でトランスフェクション手順の開始部分を行うことによって、インビトロ適用において容易に回避され得る。しかし、血清感受性は、インビボでのカチオン性脂質媒介DNA送達の広範な使用に対する、主な障害のままである。 3.0発明の要旨 本発明は、形成／合成後少なくとも48時間、トランスフェクション効率を保持する、新規の安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを意図する。 したがって、本発明はまた、安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを製造する方法を主張し、この方法は、界面活性剤の存在下で送達されるポリヌクレオチドを両親媒性のカチオン性脂質結合体と接触させる工程；およびこの界面活性剤を除去する工程であって、これによって実質的にサイズ安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルが形成され、この送達ビヒクルはまた、トランスフェクション効率に関して実質的に安定である工程を包含する。 本発明の別の実施態様は、核酸が界面活性剤の添加前にまたは同時にカチオンと複合され、そしてこの界面活性剤がカチオンの除去前に除去される、追加の特徴を有する、上記のように生成された安定な複合体である。 本発明の別の局面は、安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを製造するためのプロセスであって、このプロセスは、界面活性剤の存在下でポリヌクレオチドをカチオン性脂質と接触させる工程、このポリヌクレオチドをこのカチオン性脂質に複合体化させるためにこの界面活性剤を除去する工程、および得られる送達ビヒクルを単離する工程を包含する。 単離された送達ビヒクルは、最初に形成された容量よりも少ない容量に再懸濁され得る。その結果、送達ビヒクルを含む濃縮された組成物が形成される。したがって、本発明の別の局面は、一般的に、少なくとも約0.5mg/ml、および好ましくは少なくとも約1.0mg/mlのDNA濃度を含む安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルである。 安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルの単離の間、得られる組成物の毒性は劇的に低減され得る。したがって、本発明のさらに別の実施態様は、実質的に低減された毒性の安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルである。 本発明はさらに、非カチオン性脂質または他の脂質部分とさらに複合体化される両親媒性のカチオン性脂質結合体を含む、安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを意図する。 本発明のさらなる実施態様は、生体適合性カチオン性脂質結合体を含む安定なポリヌクレオチド送達ビヒクル、およびその生成および使用方法である。 このように、本発明はまた、生分解性脂質部分を含む生体適合性の両親媒性のカチオン性脂質結合体を意図し、この生分解性脂質部分は、これもまた生体適合性であるpH感受性化学結合による生体適合性カチオン性または多価カチオン性部分に共有結合される。 したがって、本発明のさらなる実施態様は、以下の一般式を有する生体適合性の両親媒性のカチオン性脂質結合体を包含する： Ｒ1−Ｘ−Ｒ2ここで、Ｒ1は、生分解性脂質部分であり；Ｒ2は、生体適合性のカチオン性部分または多価カチオン性部分であり；そしてＸは、生体適合性の生分解性共有結合リンカーまたは他の不安定な共有結合リンカーである。 本発明で意図されるポリヌクレオチド送達ビヒクルの安定性のため、標的化基はさらにビヒクル中に組み込まれ得、これによって送達されるポリヌクレオチドは、特定の細胞型および／または細胞の場所（例えば、核）に標的化され得る。 本発明の別の実施態様は、目的の１つまたは複数のポリヌクレオチドを細胞に送達するための、上記の安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルの使用を意図する。関連の局面では、安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルは、個体に治療的利益を提供するために使用され得る。 本発明のさらに他の局面は、安定な複合体を結合し得る特性を有する標的化剤と複合体とを会合させることによって、特定の細胞および組織に安定な複合体（または送達ビヒクル）を標的化する方法である。 4.0図面の説明 図1aおよび1b。本発明の新規の代謝可能な／生分解性のカチオン性脂質のいくつかの例を示す。詳細には、ヘキサミン、スペルミン、スペルミジン、ペンタエチレンヘキサミン（PEHA）に（ホスホジエステル結合によって）結合したN-グルタリル-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン；（ホスホジエステル結合によって）ペンタエチレンヘキサミンに結合したN-スクシニル-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン；（エステル結合によって）ペンタエチレンヘキサミンに結合した1,2-ジオレイル-sn-グリセロ-3-スクシネート（DOSG）の例である。 図２。pH不安定リンカー分子を組み込む、本発明によって意図される新規の生分解性のカチオン性脂質の例を示す。この分子を合成するための反応スキームも提供される。 図３。本発明で利用可能ないくつかのカチオン性脂質のカチオン性基が、どのように、およびどこでアシル鎖に付着されるかを示す。詳細には、１価カチオン性合成脂質DOTMA、DMRIE、DORIE、およびDMRIE・HP；ならびに多価カチオン性合成脂質DOGS（TransfectamTM）およびDOSPA（Lipofectamine）が示される。 図４。いくつかの異なる時点での一過性のリポソーム−DNA複合体のサイズ分布における変化を示す。 図５。いくつかの異なる時点での安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルのサイズ分布における変化を示す。 図６。脂質／DNAリン酸比および複合体／ビヒクルを形成するために使用される投入DNA量の関数としての、一過性のリポソーム−DNA複合体、および安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルの（β-ガラクトシダーゼ活性によって測定される）相対的なトランスフェクション効率を示す。 図７。複合体／ビヒクルを形成するために使用される投入DNA量の関数としての、一過性のリポソーム−DNA複合体、および安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルの（β-ガラクトシダーゼ活性によって測定される）相対的なトランスフェクション効率のより識別力のある分析を示す。 図８。図８(a)は、保存時間の関数として、一過性のリポソーム−DNA複合体、および安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルの（トランスフェクション効率／β-ガラクトシダーゼ活性の低下により測定される）相対的な安定性を示す。図８(b)は、種々の保存条件下での安定な複合体および一過性の複合体の相対的な安定性を示す。安定なカチオン性脂質／DNA複合体を、５％デキストロースとともに−20℃で（黒四角）、デキストロースなしで−20℃で（白四角）、４℃で（白丸）、室温で（黒三角）、および37℃で（白三角）保存した。一過性の複合体を４℃で（黒丸）保存した。 図９。血清濃度の割合の関数として、一過性のリポソーム−DNA複合体、および安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルの（トランスフェクション効率／β-ガラクトシダーゼ活性の低下により測定される）相対的な安定性を示す。 図１０。複合体化していない脂質から分離後の安定なカチオン性脂質／DNA複合体の遺伝子導入活性を示す。安定なカチオン性脂質／DNA複合体を、3.3:1、6.6:1、および16.5:1のDOSPA/DNAリン酸比で調製した。懸濁液を遠心分離し、そしてペレット（無地の黒のボックス）、上清（白ボックス）、および元の遠心分離していない懸濁液（斜線のボックス）を、遺伝子導入活性についてアッセイした。元の懸濁液からの約0.2μg DNAを、105NIH 3T3細胞に添加した。遠心分離前の元の懸濁液の等容量を提供することに基づいて、ペレットおよび上清の対応する量を、細胞に添加した。 図１１。β-gal活性および総細胞タンパク質の両方の関数として、細胞をトランスフェクトするために使用されるDNA用量のグラフである。 図１２。いくつかの異なるスペルミン／DNAリン酸比で、および脂質と会合したリガンド／総脂質のいくつかの異なるモルパーセントで、一過性のまたは安定な脂質／DNA複合体のいずれかに組み込まれた、RGDペプチドと会合した脂質を使用する標的化研究において得られる発現の比較レベルを示す。 図１３。カチオンの存在下で生成された安定な合成DNA送達ビヒクルを使用するインビボ遺伝子導入および生体分布におけるDOSPA/DNAリン酸比の効果を示す（MnSV101）。 図１４。1:1のDOSPA/DNAヌクレオチド比での（アルカリホスファターゼ活性により測定される）MnSV101の生体分布についての用量応答曲線を示す。 図１５。1/1のDOSPA/DNAヌクレオチド比で調製されたMnSV101によるインビボ遺伝子導入および発現についての時間経過を示す。各組織についてのアルカリホスファターゼ発現を免疫捕獲により所定の日にアッセイした。 図１６。遺伝子導入の生体分布および効率に関して、MnSV101と（Mnの代わりにカチオンNaの存在下で形成された）NaSV101との間の比較を示す。DOSPA/DNAヌクレオチド比を1/1に保ち、注入容量は0.25mlであり、そして使用したDNA用量は80ugであった。各組織についてのアルカリホスファターゼ発現を免疫捕獲によってアッセイした。MnSV101およびNaSV101を、第２の透析工程でデキストロースに対して、または注入の前に生理食塩水（0.15M NaCl）に対してのいずれかで透析した。 5.0発明の詳細な説明 本発明の生分解性の両親媒性のカチオン性脂質は、目的の１つまたは複数のポリヌクレオチドと接触（イオン対形成）され得、その結果、カチオン性脂質の正電荷が負の電荷を有するポリヌクレオチドと静電的に相互作用する。カチオン部分とポリヌクレオチドとの間の静電的相互作用は、ポリヌクレオチド中の電荷の反発をおそらく低下させ、そしてポリヌクレオチドを（ゲルシフトアッセイで見られるような）より小型の配置中に凝縮させる。 凝縮されたカチオン性脂質／ポリヌクレオチド複合体は、続いてポリヌクレオチド送達ビヒクルのアセンブリのための骨格または核として作用する。構造の必須部分として凝縮されたポリヌクレオチドを物理的に組み込むことによって、本明細書に記載されるポリヌクレオチド送達ビヒクルは、代表的には先の処方物／方法を使用して得られたものと比較してより有意な割合のポリヌクレオチドを安定に含み得る。例えば、本明細書に開示された方法を使用して、少なくとも約80パーセントの投入ポリヌクレオチドは、複合体形成後48時間に測定した場合、別々のサイズ範囲の送達ビヒクルと安定に会合したままである。 好ましくは、本発明の生分解性の両親媒性のカチオン性脂質結合体は、生分解性成分を含む。このように、脂質部分は、脂質が生分解性または生体適合性である限り、約３から約26の間の、そして好ましくは約12から約24の間の炭素原子、コレステロール、ならびにその誘導体および改変体を含む炭化水素鎖を一般的に有する多くの脂肪酸鎖（飽和またはシス／トランス不飽和）のいずれかを含み得る。 本発明のカチオン性成分は、１価、２価、または好ましくは多価（すなわち、多価カチオン性）であり得る。カチオン性部分は、好ましくは生体適合性であり、そして中性pHまたはその付近のpHで正電荷を保持する種々の化学基のいずれかを含み得、これらには、アミノ基、アミド基、アミジン基、正の電荷を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジン）、スペルミン、スペルミジン、イミダゾール基、グアニジニウム基、またはそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。 カチオン性成分は、一般的に、所定の適用のために最適化したカチオン／リン酸比でポリヌクレオチドと組み合わせられる。通常、カチオン／リン酸比は、約１と約20との間、しばしば約５と約17との間、および好ましくは約６と約15との間である。従って、電荷比は、カチオン上に含まれる正の電荷を有する基の数、およびポリヌクレオチドのサイズに依存して変化する。 代表的には、本発明の生分解性の両親媒性のカチオン性脂質結合体のカチオン性成分および脂質成分は以下に記載され、または以下を含むがこれらに限定されない種々の供給源のいずれかから得られ得る：Merck Indexの1995版、Budavariら編、Merck and Company，Inc.、Rahway、N.J.、1995 SIGMA chemical company catalogue、St．Louis、MO.、1995 Aldrich Biochemicals Catalogue、または1995 Ofatlz and Bauer catalogue。 カチオン性基は、好ましくはエステル結合またはホスホジエステル結合により脂質成分に付着され得、これはリパーゼまたはホスホリパーゼなどのような天然の酵素の作用によりカチオン性基から脂肪酸を分離可能にする（図１を参照のこと）。このような結合は、おそらく現在利用可能なカチオン性脂質と関連する細胞傷害性に寄与しているエーテル結合を使用して脂質に付着する、現在利用可能な合成カチオン性脂質の改良を示す。 例えば、図１は、グルタリルリンカーを使用してジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）に共有結合したポリアミンの化学構造を示す。DOPEは、ホスホリパーゼＡ1、Ａ2、Ｃ、およびＤによって分解され得る。これはアシル鎖を付着するためにエーテル結合を使用する、現存する合成カチオン性脂質の利点を提供する。エーテル結合はホスホリパーゼによって分解され得ず、従ってエーテル結合したアシル基は細胞膜に蓄積する。 DOSPA（リポフェクタミン（Life Technology Inc.，Gaithersburg，MD）中のカチオン性脂質）、およびDOGS（トランスフェクタム（Promega）のカチオン性脂質）は、ジアシルエーテル結合したグリセロールに付着したスペルミンを含む。DOSPAおよびDOGSは、ペプチド結合を含むので理論的には生分解性である；しかし、この概念を支持する文献には確証的なデータは存在していない。さらに、限定された加水分解が起こった場合でさえ、得られる分解産物はなお、エーテル結合したジアシルグリセロールである。 本明細書に開示される生分解性の両親媒性脂質の他の利点は、ポリアミンを脂質に付着させる方法である。DOSPAおよびDOGSのジアシルエーテル結合したグリセロールは、スペルミンの中央に付着する。新しい分子はアミド結合により分子の末端で付着する。図３は、現在入手可能な１価カチオンおよび４価カチオンの脂質の多くについての一般式を示す。 特に好ましい実施態様では、本発明の生分解性の両親媒性のカチオン性脂質結合体の、カチオン性部分および脂質部分は、不安定な（例えば、生分解性またはpH不安定）リンカー基により共有結合される。不安定なリンカーは、細胞の内在化および／またはエンドソーム融合後に脂質部分およびカチオン部分を解離するカチオン性脂質を含むポリヌクレオチド送達ビヒクルの製造を可能にする。 脂質産物がエンドソーム膜を脱安定化または破壊し得、カチオン／ヌクレオチド複合体の細胞質中への放出を容易にするために、脂質アナログは操作され得る。脂質加水分解産物は、ジアシルグリセロール、lys-ホスホリル、またはホスファチジルエタノールアミン、モノアシルグリセロール、トリグリセリドなどであり得る。 本発明の１つの実施態様は、pH不安定リンカー分子である。この結合は、アミノ基との反応の際に酸不安定結合を形成する無水2-メチルマレイン酸に基づく。このように、上記のように改変されたpH不安定結合は、本発明のpH感受性／不安定性共有結合リンカー部分（エステル結合も含み得る）の実際の例示として用いられる。 本発明の目的のために、用語「両親媒性」とは、少なくとも１つの実質的に極性（すなわち、水性溶媒で自由に混和可能）な領域、および少なくとも１つの実質的に非極性（すなわち、有機溶媒に自由に混和可能）な領域を含む、分子または化合物をいう。用語「生分解性のカチオン性脂質」とは、細胞中に入る際に、カチオン性脂質が、両親媒性分子からその別々の親水性成分および疎水性成分（およびその代謝副産物）に変換されること、あるいはさもなければ細胞の異化代謝プロセスまたは代謝プロセスに関与し得ることをいう。用語「生体適合性」とは、化合物が意図された用量で顕著な毒性または有害な免疫学的効果を示さないことを意味する。用語「pH感受性」とは、分子中の少なくとも１つの共有結合が、エンドソーム融合後に生じるpHに一般的に接近するpHの変化によって破壊され得ることを意味する。用語「実質的に毒性」とは、治療的用量で、所定の薬剤が、結局、薬剤の意図した治療的利益を明らかに越える有害な結果を生じることを意味する。 スペルミンまたは他のカチオンを脂質に生分解的に結合する他の方法は、リソソームプロテアーゼ（チオプロテアーゼまたはカテプシンを含むがこれらに限定されない）によってタンパク質分解切断を受けやすいジペプチドリンカーを使用することを包含する。 本発明の他の実施態様は、種々の保存および使用条件下で、上記の生分解性の両親媒性のカチオン性脂質結合体、または現在入手可能なカチオン性脂質結合体（例えば、リポフェクチン、リポフェクタミンなど）を使用して、（サイズおよびトランスフェクション効率を維持することによって）安定なままであるポリヌクレオチド送達ビヒクルをアセンブリする、新規な方法である。 上記および下記の安定な合成ポリヌクレオチド送達ビヒクル（SPDV）は、SPDVの構造成分として送達されるポリヌクレオチドを物理的に組み込む。このように、ポリヌクレオチドの構造はSPDVの構造的特徴に寄与する。代表的には、ポリヌクレオチドがプラスミドの形態である場合、DNAは一般的に超らせん形成した環または弛緩した環のいずれか、あるいはその混合物を含む。特定の形態が所定の適用に好適であり得る程度まで、DNAジャイレース、リガーゼ、およびトポイソメラーゼのような酵素は必要と考えられるようにプラスミドの構造を変化するために使用され得る。直線状ポリヌクレオチドが好ましく、プラスミドは直線状にされ得、そして必要に応じて複合体形成の前にコンカテマー化（concatamerized）される。 一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドはまた、ウイルスタンパク質、一本鎖結合タンパク質、ヒストンタンパク質などのような適切なポリヌクレオチド結合タンパク質の添加による脂質複合体形成の前に、「予めパッケージされ」得る。 本発明の送達ビヒクルを使用して送達され得る目的のポリヌクレオチドには、DNA、RNA、原核生物および真核生物ウイルス粒子に随伴するポリヌクレオチド（例えば、レトロウイルスコア粒子、バクテリオファージ粒子、アデノウイルス粒子、アデノ随伴ウイルスコア粒子など）、タンパク質／DNA複合体、すなわち、遺伝子導入および発現などを容易にするための組込み、エンドソーム破壊のためのタンパク質；RNA/DNA複合体、ならびに上記の任意およびすべての誘導体および改変体が挙げられるが、これらに限定されない。DNA分子が送達されるべき場合には、代表的には、これは目的の遺伝子またはその一部を含み、目的のDNAの発現を最適にするために空間的に編成される調節配列に隣接する。 好ましくは、本明細書に記載されるSPDVを使用して送達されるべきポリヌクレオチドは、実質的に純粋である（すなわち、混入しているタンパク質、脂質、多糖類、および核酸を実質的に含まない）。例えば、プラスミドDNAが使用される場合、調製物は、一般的に、フェノール、またはフェノール：クロロホルム、抽出、および同密度遠心分離（CsClなどを使用して）を含むプロセス、またはその機能等価物によって調製される。好ましくは、DNA調製物はまた、RNaseで処理され、そして複数回の抽出および少なくとも２回の超遠心分離にかける。代表的には、実質的に純粋な核酸の調製物は、全核酸の少なくとも約80パーセント、一般的には少なくとも約90パーセント、および好ましくは少なくとも約95パーセントが所望の核酸から構成される調製物である。 特に、目的の遺伝子は、広範な発現ベクターに挿入され得、続いて本明細書に開示した方法を使用して送達され得る。本明細書に開示した方法および組成物を使用して送達され得る適切なベクターには、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、仮性狂犬病ウイルス、α-ヘルペスウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクター、特に非複製細胞を改変するために適切なウイルスベクターの詳細な総説、および目的のポリヌクレオチドの発現に関連してこのようなベクターを使用する方法は、Viral Vectors: Gene Therapy andNeuroscience Applications CaplittおよびLoewy編、Academic Press、San Diego(1995)の本に見いだされ得る。本発明の方法および組成物が、目的の核酸をコードするかまたは含む、ベクター核酸、または適応可能である場合は、ウイルスまたはサブウイルス粒子を直接送達するために使用され得ることが意図される。 本明細書で用いられる場合、用語「発現」とは、目的のDNAの転写、ならびに対応するmRNA転写物のスプライシング、プロセシング、安定化、および必要に応じて、翻訳をいう。送達されるDNA分子の構造に依存して、発現は一過性または連続的であり得る。 多くの転写プロモーターおよびエンハンサーは、目的のDNAで使用され得、これらには単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、SV40プロモーター、およびレトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター／エンハンサーなど、ならびにそれらの任意の置換および改変体が挙げられるがこれらに限定されず、十分確立された分子生物学技法を使用して産生され得る（一般的に、Sambrookら、（1989）Molecular Cloning I-III巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、ならびにCurrent Protocols in Molecular Biology（1989）John Wiley & Sons、全巻およびその定期的最新巻を参照のこと、これらは参考として本明細書中に援用される）。プロモーター／エンハンサー領域はまた、組織特異的発現を提供するために選択され得る。 特定の目的のDNAには、以下をコードする配列が挙げられるが、これらに限定されない：種々のタンパク質、サイトカインおよび成長因子（例えば、G-CSF、GM-CSF、神経成長因子(NGF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、インターロイキン１〜２および４〜14、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、αまたはγインターフェロン、エリスロポイエチンなど）、嚢胞性線維症膜貫通型調節タンパク質(CFTR)、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、D-アミノ酸デカルボキシラーゼ、GTPシクロヒドロラーゼ、レプチン、レプチンレセプター、第VIII因子および第IX因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)。 さらに、アンチセンス、抗原、またはアプトメリックオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されたSPDVを使用して送達され得る。リボザイム、RNA-DNAハイブリッド、ポリヌクレオチドペプチド結合したオリゴ(PNA)、環状または直線状RNA、環状一本鎖DNA。 目的のRNAには、自己複製RNA、細胞質内で直接翻訳され得る上記遺伝子のいずれかに対応するmRNA転写物、または触媒性RNA、例えば「ハンマーヘッド」ヘアピン、肝炎δウイルス、特定のRNA配列をインビボで特異的に標的化および／または切断し得るグループＩイントロンが含まれる。触媒性RNAによって標的化するための特定の目的のものは、RNAウイルス、ならびに細胞およびウイルスの両方の転写物である。 あるいは、RNA、DNA、または両方の混合物のアンチセンス形態は、細胞内の目的の特定の遺伝子の発現を阻害するために、または点変異または他の変異（ノンセンスまたはミスセンスなど）を修正するために、細胞に送達され得る。 本発明のさらなる実施態様は、より大きなポリヌクレオチドとともにSPDVに組み込まれているオリゴマーヌクレオチドの送達を意図する。このような「キャリア」ポリヌクレオチドは、一本鎖（直線状または環状）または実質的に二本鎖であり得、そして送達されるべきオリゴマーヌクレオチドに実質的に相同または相補的である１つ以上の領域をさらに含み得る。 所望である場合、目的のDNAは、送達ビヒクルによって既に送達された目的のDNAを隠すおよび発現する細胞の根絶の制御を可能にする自殺シグナルをさらに組み込み得る。例えば、チミジンキナーゼ(tk)遺伝子は、送達されたDNAに組み込まれ得る。この結果、正確な量のアシクロビル、ガンシクロビル、またはそれらの概念上のもしくは機能的等価物を投与することによって、医師がtk遺伝子を発現する細胞を殺すことが可能になる。 安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを製造する本発明の方法は、目的のポリヌクレオチドが両親媒性のカチオン性脂質結合体と接触し、その結果、カチオン性部分とポリヌクレオチドとの間のイオン対形成によりポリヌクレオチドが凝縮することが可能である。代表的には、接触は、脂質ミセルを形成するために、適切な界面活性剤中に脂質構成成分を最初に溶解することによって達成される。脂質の溶解に適切な界面活性剤には、コール酸、デオキシコール酸、ラウロイルサルコシン、オクタノイルスクロース、CHAPS(3-［(3-コラミドプロピル)-ジ-メチルアミン］-2-ヒドロキシル-1-プロパン)、新規β-D-グルコピラノシド、ラウリルジメチルアミンオキシド、オクチルグルコシドなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、界面活性剤は非イオン性であり、そして高い臨界ミセル濃度（CMC）を有する。ポリヌクレオチドがミセル化した両親媒性のカチオン性脂質結合体に添加されると、イオン対形成が起こり、そしてポリヌクレオチドは両親媒性のカチオン性脂質結合体との複合体として凝縮する。 イオン対形成が安定な脂質／ポリヌクレオチド複合体の形成に役割を果たすとすれば、複合体形成中のpHは、特定の成分の相互作用を最適化または安定化にするために変化され得る。例えば、非pH感受性カチオン性脂質が使用される場合は、約４の低いpHが、ポリヌクレオチドと同時に組み込まれ得る所定のポリヌクレオチド（例えば、RNA）または他の化学薬剤を複合体化するために、好適であり得る。さらに、ポリヌクレオチド（例えば、DNA）が塩基加水分解に実質的に感受性ではない場合、情況は、約10までのpHを複合体形成中に使用することを指図し得る。一般的に、約５から約９までの範囲内のpHは、複合体形成およびトランスフェクションの間使用される。 代表的には、多くのカチオン性凝縮剤（例えば、スペルミンまたはスペルミジン）は、ポリヌクレオチドを沈殿させる。しかし、凝縮カチオンを、ポリヌクレオチドへ注意深く制御して添加（注入ポンプなどを使用して）することにより、比較的高い濃度（例えば、約0.5mg/ml）のポリヌクレオチドが凝縮剤と複合体化することが可能になる。このように、ミセル化したカチオン性脂質凝縮剤へのポリヌクレオチド添加を注意深く制御することによって、カチオン性凝縮剤による比較的高い濃度のポリヌクレオチドを複合体化することが可能になる。 最初の複合体形成の後、界面活性剤をゆっくり除去（すなわち、大規模な透析による）することにより、安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルのアセンブリおよび形成が可能になる。ゆっくりした透析は界面活性剤除去の好ましい方法のままであるが、透析緩衝液の相対量を増加することによって、または、透析物緩衝溶液から、界面活性剤と結合しそしてこれを除去する緩衝液に試薬を添加することによって、界面活性剤の除去が促進され得る。 あるいは、ポリヌクレオチドを、カチオン性脂質および界面活性剤を添加する前に適切なカチオンを含む溶液に溶解し得る。。界面活性剤が添加された後、これはカチオンの存在下で透析によって除去され、そして続いてカチオンが透析によって除去され得る。適切なカチオンには、正電荷を有するあらゆるエレメントが含まれる。カチオンは、１価、２価、または多価であり得る。適切なカチオンの代表的な例には、マンガン、マグネシウム、ナトリウム、カルシウム、ルビジウム、亜鉛、モリブデン、ニッケル、鉄などが挙げられるが、これらに限定されない。一般的には、カチオンは、脂質とポリヌクレオチドの複合体化の間の凝集形成を妨げるに十分な量で、および所定のカチオン性化合物のほとんど最大の溶解性の濃度まで添加される。好ましくは、ナトリウム（例えば、塩化ナトリウム）の濃度は、約0.1モル濃度と約５モル濃度との間であり、マグネシウム（例えば、塩化マグネシウム）の濃度は約0.5モル濃度と約５モル濃度との間であり；そしてマンガン（例えば、塩化マンガン）の濃度は約0.1モル濃度と約４モル濃度との間である。 さらに、カチオンのタイプおよび濃度がSPDVをアセンブリするために使用される界面活性剤またはカチオン性脂質のタイプに依存して調節されるべきであり得ることは、当業者に理解される。 ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドがSPDVのアセンブリの間にカチオンと複合体化されるべき場合、カチオン性脂質および／または界面活性剤は、カチオンの添加の前に、同時に、またはその後に添加され得る。一般的には、カチオン性脂質は、約0.1:1と約16.1:1との間、そして好ましくは約0.5:1と約7:1との間、より好ましくは約0.7:1と約2:1との間、そして特定すると約1:1の、カチオン性脂質対ポリヌクレオチドリン酸比で、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに添加される。上記の比は、限定ではなく例示として提供され、そしてSPDVをアセンブリするために使用されるカチオン性脂質の特性に依存して改変され得る。また、任意の比はDNA濃度に依存している。 カチオン、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、カチオン性（または他の）脂質、および界面活性剤が環境中に存在した後、界面活性剤は、好ましくはカチオン含有緩衝液中での透析によって除去される。界面活性剤が除去された後、カチオンは、続いて透析または機能的等価物によって実質的に除去され得る。好ましくは、透析は、一般的に、約４℃と約30℃との間の温度で行われ、そしてSPDVの意図する使用に有害でない最終カチオン濃度になる。例えば、カチオンは、例えば非経口投与に適切である緩衝化溶液での透析によって、実質的に除去され得る。 カチオンの実質的な除去の後、得られるSPDVは、一般的に、約４℃で保存した場合、少なくとも２週間安定なままである（すなわち、形質導入活性を保持する）。 ポリヌクレオチドがカチオン性脂質の添加の前にまたは同時に、カチオンと複合体化される（または他の予め凝縮される）場合、安定な複合体は、比較的低い脂質：核酸リン酸比で（界面活性剤の存在下で）形成され得る。より低い比の脂質を使用することによって、より高い比の脂質が複合体に組み込まれ、これにより最終産物中に組み込まれなかった脂質がより少なくなる。この特徴は、このような脂質の組み込まれていない形態が実質的に標的細胞に対して毒性であるため、非生分解性脂質が使用される場合には、望ましい。従って、本発明の他の実施態様は、低減した毒性を含む本質的に上記のように製造されたSPDVである。本発明の開示の目的で、毒性の低減は、少なくとも約10μgのDNAを含むSPDVが動物が危険な毒性的影響を被ることなしに動物に注入され得ることを意味する。 核酸をカチオンと複合体化するかまたは予め凝縮することのさらなる特徴は、より高い濃度のDNAがSPDVを形成するために使用され得るということである。例えば、0.1モル濃度でMnCl2の存在は、約0.05mg/mlの濃度のDNAでSPDV形成を可能にする。同様に、カチオンの濃度を上昇させることによって、対応する量によってSPDVをアセンブリするために使用されるDNAの濃度を上昇させ得る（すなわち、２モル濃度のMnCl2は約1mg/mlのDNAの濃度でSPDV形成を可能にし得る）。適用可能なカチオンが比較的高い溶解性（すなわち、NaClは約5.5モル濃度で飽和する）ならば、本発明の方法が、少なくとも約10mg/mlの濃度のDNA（または他のポリヌクレオチド）のSPDVの形成を可能にすることは明らかである。従って、本発明の別の実施態様は、上記のように処方されているSPDVの調製物であり、そしてこれは、一般的には約0.05mg/mlと約10mg/mlとの間、好ましくは約0.25mg/mlと約10mg/mlとの間、より好ましくは約0.5mg/mlと約1.5mg/mlとの間、そして特定すると約0.8mg/mlと1.2mg/mlとの間の濃度のDNA（または他のヌクレオチド）を含む。従って、本発明の別の実施態様は、高濃度の核酸（すなわち、＞0.25mg/ml核酸）を含むSPDV組成物である。 本発明の方法により製造されるポリヌクレオチド送達ビヒクルの本来の安定性のため、標的化剤は、特定の細胞および／または組織にビヒクルを向けるためにビヒクル中に安定に組み込まれ得る。従って、界面活性剤の除去の前またはその間に、任意の種々の標的化剤はまた、送達ビヒクル中に組み込まれ得る。 本発明の開示の目的で、用語「標的化剤」とは、送達ビヒクルに組み込まれ得る任意のまたはすべてのリガンドまたはリガンドレセプターをいう。このようなリガンドには、IgM、IgG、IgA、IgDなどのような抗体、あるいはその任意の部分またはサブセット、細胞因子、細胞表面レセプター、MHCまたはHLAマーカー、ウイルスエンベロープタンパク質、ペプチドまたは小器官リガンド、それらの誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。 必要であれば、リガンドは、ポリヌクレオチド送達ビヒクルへの組み込み前に適切な脂質部分に誘導体化され得る。例えば、標的化剤（例えば、免疫グロブリン）は、最初に、脱離基を、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDAC）、またはそのメチオジド、（EDCメチオジド）、および標的化分子上の遊離アミノ基を使用してカルボキシル基に誘導体化することによって、両親媒性脂質の極性領域の遊離のカルボキシル基にN-結合され得る。あるいは、標的化剤は適切な条件にある送達ビヒクル／脂質に（チオ酢酸、ヒドロキシルアミン、およびEDTAを使用して）ジスルフィド結合され得るか、またはスクシンイミジルアセチルチオアセテートは脂肪酸（例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、DOPE）とともに使用されて、DOPE-チオアセテート（ATA）を形成し得、これはヒドロキシルアミンで処理され得、還元された分子（DOPE-アセチル-SH）を生成する。標的化剤の遊離アミノ基は、スクシンイミジルマレイミドフェニルブチレート（SMPB）と反応して、ペプチド結合によってマレイミドフェニルブチレート（MPB）に結合される標的を生成する。誘導体化した脂肪酸は、続いて、標的-MPB複合体と組み合わせて、脂肪酸に架橋されている標的化剤を生成する。 さらに、標的化剤は、上記のような生分解性結合によって脂質に結合され得る（ペプチドまたはジペプチドリンカー、pH加水分解可能なリンカーなど）。 あるいは、標的化剤はまた、安定な複合体と「標的化された」細胞または組織との間の架橋として作用し得る。例えば、標的化剤が単に複合体と会合する場合、この薬剤は複合体形成後または単離後に複合体に添加され得る。標的化剤がまた細胞表面上の分子によって認識し得るかまたは認識され得る程度まで、この薬剤は効果的に複合体を細胞表面との親密な接触させる架橋分子として作用し得る。 特に、肝細胞が脂質が向かうトランスフェクションの好適な標的である場合、フェチュインのような分子は有用であることが示され得る。肝細胞はガラクトースレセプターを含む。ノイラミニダーゼでの処理後、フェチュインは、その表面上に多くのガラクトース残基を提示するアシアロフェチュインに変換される。さらに、フェチュインとアシアロフェチュインの両方とも、安定な脂質／DNA複合体と会合することが公知である。 酸性アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）に富む分子として、アシアロフェチュインは、おそらく脂質複合体のカチオン性頭部基と会合する。結果として、アシアロフェチュイン会合複合体は、タンパク質において露出したガラクトース残基によって肝細胞へ標的化される。 アシアロフェチュインが安定な複合体と会合するという観察はまた、はるかに到達する可能性を有する。例えば、アシアロフェチュインは、多くの従来の化学的方法のいずれかを使用して、広範な数の標的化リガンドのいずれかと誘導体化され得る。例えば、過ヨウ素酸塩は、ガラクトースのヒドロキシル基の少なくとも一部をアルデヒドに変換するために使用され得、このアルデヒドは１級アミノ基と反応してシッフ塩基を形成し、これは続いて（標的化リガンドを添加するために）水素化アルミニウムリチウムで還元され得る。あるいは、このアルデヒドは、ヒドラジドと反応して ヘテロ二官能性架橋化試薬を付着し得る（これは適切な標的化リガンドである）。上記のストラテジーは両方とも、アシアロフェチュインが実際に任意の標的化リガンドで誘導体化され得る多くの可能性のある方法の単なる例証であり、そして本発明をいかなるようにも限定すると解釈されるべきでない。 リガンド会合後、誘導体化したアシアロフェチュインは、上記のように安定な複合体と会合され得る。事実上、任意のリガンドがアシアロフェチュインに付着され得、そして事実上任意のDNAが安定な複合体中にパッケージングされ得る。従って、適切に誘導体化したアシアロフェチュインを適切な安定な複合体と注意深く適合させることによって、事実上いずれの細胞が、事実上いずれの遺伝子をも発現するために標的され得る。 さらに、アシアロフェチュイン、またはその機能的等価物（対面結合（vis-a-vis binding））は、N-ヒドロキシ-スクシンイミジル-オレエートと反応して、１つアシル化したまたは複数アシル化したアシアロフェチュイン誘導体を生成し得、これは脂質複合体に直接組み込まれ得る。さらに、広範な脂肪酸鎖のいずれもがまた、この方法論を使用してASFに連結され得る。代表的には、複合体当たり少なくとも約１から約20のアシル化したアシアロフェチュイン分子が組み込まれ、そして好ましくは約５から約12分子が組み込まれる。 さらに、安定なカチオン性脂質／核酸複合体との会合もし得る他のタンパク質が同定されまたは開発されそうである。アシアロフェチュインのように、安定な複合体と会合するタンパク質は、標的化リガンドで適切に誘導体化され、そして安定な複合体を特定の細胞および組織に指向させるために使用され得る。このように、任意の種々の細胞は、例えば、内皮細胞、系統細胞（line cell）、上皮細胞、島細胞、ニューロンまたは神経組織、中皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、造血細胞、免疫細胞、主要な腺または器官（例えば、肺、心臓、胃、膵臓、腎臓、皮膚など）の細胞、外分泌および／または内分泌細胞などである。 種々の細胞表面マーカーおよびレセプターをコードするタンパク質は特定の目的のものである。このようなタンパク質の例である簡単なリストには、以下のものが挙げられる：CDl(a-c)、CD4、CD8-11(a-c)、CD15、CDw17、CD18、CD21-25、CD27、CD30-45(R(O、A、およびB))、CD46-48、CDw49(b,d,f)、CDw50、CD51、CD53-54、CDw60、CD61-64、CDw65、CD66-69、CDw70、CD71、CD73-74、CDw75、CD76-77、LAMP-1およびLAMP-2、ならびにＴ細胞レセプター、インテグリンレセプター、増殖性内皮のエンドグリン、またはこれらに対する抗体。 本発明の開示の目的で、「安定な」ポリヌクレオチド送達ビヒクルは、一般的に、48時間の保存後に新鮮に調製した産物のポリヌクレオチドトランスフェクション効率の少なくとも約20パーセントのトランスフェクション効率を保持し、そして好ましくは48時間後に少なくとも約35パーセントのトランスフェクション効率を保持し、そして特に好ましい実施態様では、48時間後に少なくとも約50パーセントのトランスフェクション効率を保持する。 あるいは、本明細書に記載された安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルは、サイズ安定性のままであり、そして一般的に、少なくとも48時間液体状態で保持した後、約30と約200nmとの間、好ましくは約50と約150nmとの間、および好ましくは約70と約115nmとの間の平均粒子サイズ（Gaussian分布による）の離散サイズ範囲（discrete size range）を保持する。 血清での安定性に関する場合、本発明の安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルは、それらが、約15パーセントまでの血清濃度に曝される場合に、先行技術によって教示される方法／合成カチオン性脂質を使用して製造されるリポソーム処方物よりも、一般的に少なくとも約２倍安定であり、そして好ましくは少なくとも約１桁の程度安定である点で、血清安定性である。 本明細書に記載されるSPDVの安定性は、適切な保存条件によって増大され得る。例えば、SPDVは凍結されて、無期限に保存され得る。迅速なまたは緩慢な（約４℃で）融解の後、代表的には、SPDVは、新鮮に製造された試料のトランスフェクション効率の、すべてではないとしても、実質的な部分を保持する。さらに、本発明のSPDVはまた、凍結乾燥および再構成後に、その元のトランスフェクション効率の実質的な量（すなわち、少なくとも約50パーセント）を保持する。 SPDVを凍結することまたは凍結乾燥することによって長期安定性を増大させようとする場合、適切な賦形剤が凍結の前にSPDV調製物に添加され得る。このような安定化賦形剤の例には、単糖類または二糖類（例えば、グルコース、スクロースなど）、多糖類、または種々の周知の薬剤のいずれも（例えば、グリセロール、ゴム、デキストランなど）が挙げられる。 安定な脂質／DNA複合体は凝集し得る。特に、約0.5、一般的には約1.0を越える、そして好ましくは少なくとも約3.0から約25までよりも大きな脂質対DNA比で形成される安定な複合体は、室温から約０℃の間、一般的には約15℃と約１℃との間、および好ましくは約４℃の温度で保持される場合、ゆるい凝集体を形成し得る。この開示の目的で、ゆるい凝集体は、懸濁液中に容易に分散可能な凝集体として定義される。必要に応じて、このような凝集は、融解が後に続く凍結保存（約−20℃以下で）の期間後に生じ得る。凝集が所望であるならは、凝集のレベルは、温度を調整することに加えて任意の多くの手段によって調節され得る。例えば、緩衝液／塩濃度は、凝集の量を増加させるために調整され得る。さらに、共沈殿物が添加され得、これは安定な複合体と複合体形成し、そしてさらに沈殿の程度速度を増加させる。凝集はまた、促進化剤の添加によって増加され得る。例えば、標的化剤またはレセプターが複合体に組み込まれる場合、適切なレクチン、リガンド、または抗体が添加されて、複合体を架橋し得、そして凝集または沈殿の速度および程度を増加させる。 必要に応じて、適切なリガンドまたは抗体、あるいはその混合物は、適切な固体支持体（すなわち、ラテックスビーズ、マイクロキャリアビーズ、膜またはフィルターなど）に固定され得、そして溶液から標的化レセプターまたはリガンドを組み込む複合体を選択的に結合するために使用され得る。従って、安定な複合体はまた、この方法を使用して溶液から選択的に除去され得る。 あるいは、透析前に過剰の会合していない脂質を除去するための工程を行うことによって、非生分解性カチオン性脂質で作製される複合体を、実質的に解毒し得る。例えば、複合体化されていない脂質は、一般的に、界面活性剤溶液中に脂質ミセルとして存在する。このように、界面活性剤の存在下で、サイズ排除クロマトグラフィーは、より大きな安定な複合体（これは、おそらくボイド用量で溶出する）から複合体化していない脂質（すなわち、毒性成分）を分離するために使用され得る。 凝集した安定な脂質／DNA複合体は、最適にトランスフェクション活性を保持する。さらに、凝集した複合体は、遠心分離（これらが効果的に沈殿を形成する場合）および／または真空もしくは単純エバポレーション、限外濾過、クロマトフォーカシング、電気泳動、カラムクロマトグラフィーなどを含むがこれらに限定されない、種々の標準的技法によって濃縮され得る。単離後、凝集した複合体の濃度は、適切な緩衝液で複合体を穏やかに再懸濁または希釈することによって調整され得る。濃縮した安定な複合体のインビボ使用が意図される場合、緩衝液はインビボ投与に適切となる。 単離および再懸濁の正味の結果として、両方がDNAトランスフェクション活性を保持する、安定な複合体が得られ得、そして従来通りに製造された脂質／DNA複合体に通常ロードされ得るDNA量をはるかに越えるDNA濃度を含む。現在、同様に高いDNA／脂質濃度で製造される一過性および安定な複合体は、測定可能なトランスフェクション活性を（高い毒性のために）欠いている。 この限定の正味の効果は、代表的には従来通りに製造された脂質に基づくトランスフェクション方法によって導入され得る比較的少量の核酸が、一般的により広範な技術の適用および使用をブロックしていることである。従って、本明細書で実証した安定な複合体を濃縮する能力は、本発明のさらに別の新規な局面を示す。従って、本発明のさらなる実施態様は、測定可能なトランスフェクション活性を保持し、そして約10mg/mlまでの少なくとも1ml当たり約10μgの核酸を含む、安定な脂質／核酸複合体を製造する方法である。 遺伝子物質の高い濃度の使用および送達を可能にすることに加えて、凝集はまた、核酸の細胞への送達のための伝統的な脂質媒介性方法の固有の特徴である、毒性の劇的な低減を生じる。代表的にはリポフェクションで使用される非生分解性カチオン性脂質は、細胞に対して比較的毒性である。従って、標的細胞は、カチオン性脂質の限定された濃度に対してのみ寛容し得る。カチオン性脂質／DNA複合体形成の間、投入カチオン性脂質の有意な部分は、DNA複合体中に会合しない（すなわち、DNAトランスフェクションを促進しない）。複合体形成が脂質／DNAの比較的固定された比に関連するならば、必然的に、対応して固定された割合の組み込まれていない脂質が、脂質／DNA複合体のいかなる試料中にも存在することになる。細胞に提供されたDNAの量を増加させることもまた、（毒性の）脂質の正味の量を増加させるので、組み込まれていない脂質の存在は、標的細胞に提供され得る遺伝子物質の量を厳しく制限する。従って、遊離の会合していない脂質からトランスフェクション活性（すなわち、脂質／DNA複合体）を分離する行為は、標的細胞に提供され得る核酸の正味の量を本質的に増加させる。 凝集したそして再懸濁した安定な複合体を使用する毒性研究は、毒性活性の非常に大部分が上清中に残存することを示す。逆に、再懸濁した凝集体は、高いレベルのトランスフェクション活性を保持するが、対応する脂質／DNA比で形成される一過性の複合体よりもはるかに低い毒性を示す。従って、懸濁液から安定な複合体を除去することによって、細胞毒性の主要な供給源からトランスフェクション活性を効果的に単離し得る。従って、本発明の他の実施態様は、単離された安定なカチオン性脂質／核酸複合体であり、これは、同様の脂質／核酸比および／または脂質／核酸濃度で形成されている一過性または安定な複合体に対して実質的に低減された毒性を有する。 同様に、本発明の別の実施態様は、実質的に低減された毒性の安定なカチオン性脂質／核酸複合体を製造する方法である。この開示の目的で、用語「実質的に低減された毒性」とは、薬剤の毒性が、一般的に、未処理の薬剤に対して少なくとも約25パーセント、好ましくは少なくとも約50パーセント低減され、そして最適には少なくとも約100パーセントの低減が達成されることを意味する。毒性はまた、試験被験体の50パーセントに致命的である用量を決定することによって測定され得る。一般的に、記載される実質的に低減した毒性の安定なポリヌクレオチドビヒクルは、類似のカチオン性脂質／リン酸比で形成された単離されていない安定な複合体の２倍の致死用量（すなわちLD50）を有し、そして最適に低減された毒性のビヒクルは、対応する単離されていないカチオン性脂質／ポリヌクレオチド混合物よりも少なくとも約１桁高い程度のLD50を有する。 上記の新規製造方法のもとで、本発明のさらに別の実施態様は、両親媒性のカチオン性脂質結合体および／または上記の生分解性カチオン性脂質結合体を含む安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを記載する。適切であれば、任意のまたは種々の（すなわち、混合物）の他の「ヘルパー」脂質部分がまた、安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルに添加されて、ビヒクルの化学的特徴を変化させ得る。このように、任意の多くの周知のリン脂質が添加され得、これには、ジステロイルホスファチジル-グリセロール（DSPG）、硬化ダイズ油（hydrogenated soy）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、モノ、ジ、およびトリグリセロール、セラミド、セレブロシド、ホスファチジルグリセロール（HSPG）、ジオレオイル-ホスファチジルコリン（DOPC）、カルジオリピンなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる脂質部分には、コレステロール、コレステロールエステル、およびそれらの他の誘導体が挙げられる。適切な場合、さらなる脂質およびリン脂質が正または負に荷電されていることが好適であり得、そして種々の脂質部分の比は、最適な電荷比をもたらすように変化され得る。 さらに、種々の安定化剤のいずれもが、記載されたビヒクルとともに利用され得る。種々の成分の酸化は、窒素のような不活性雰囲気下で、本発明に従って処方物を調製することによって実質的に減少され得るが、これは幾分不便であり、そして費用がかかるプロセスであり、そしてそのため化学的抗酸化剤を添加することがしばしば好適である。適切な薬学的に受容可能な抗酸化剤としては、没食子酸プロピル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、アスコルビン酸またはアスコルビン酸ナトリウム、DL-またはD-αトコフェロールおよびDL-またはD-α酢酸トコフェリルが挙げられる。存在する場合、抗酸化剤は、例えば、0.1％(w/v)まで、好ましくは0.0001〜0.05％の量で、ビヒクルの組み立ての前、間、または後のいずれかに、単独でまたはポリヌクレオチド送達ビヒクルと組み合わせて添加され得る。 医者または患者の面から、所望されない徴候（例えば、疾患に関連する徴候、環境または因子への感受性、正常な老化など）の任意の緩和または防止が所望されることが、当業者には理解される。従って、本出願の目的では、本明細書で使用される用語「処置」、「治療的使用」、または「医学的使用」は、本発明の組成物の任意のおよびすべての使用をいい、この組成物は、疾患の状態または徴候を治療し、またはさもなければ、いかなるようにも、疾患または他の所望されない徴候を防止し、妨げ、遅延させ、または逆転させる。 疾患の治療的処置に使用される場合、安定なポリヌクレオチド送達ビヒクル（SPDV）またはその誘導体の適切な投与量は、任意のいくつかの十分に確立された方法論によって決定され得る。例えば、動物研究が、１キログラム体重当たりの生物活性薬剤の最大許容用量、またはMTDを決定するために通常使用される。一般的に、試験される少なくとも１つの動物種は哺乳動物である。当業者は、ヒトを含む他の種に対する効能および毒性の回避のための用量を適切に外挿する。効能のヒト研究が行われる前に、正常被験体における第Ｉ相臨床試験が安全用量を確立するに役立つ。 特にインビボ使用が意図される場合、本発明の種々の生化学的成分は、好ましくは高純度であり、そして潜在的に有害な夾雑物を実質的に含まない（例えば、少なくとも国民食品（National Food）（NF）クレード、一般的には少なくとも分析グレード、および好ましくは少なくとも医用グレード）。所定の化合物が使用前に合成されなければならないならば、このような合成または続いての精製は、合成または精製手順の間に使用され得たいかなる潜在的に毒性の薬剤を実質的に含まない産物を、好ましくは生じる。 さらに、安定なポリヌクレオチド送達ビヒクル（SPDV）はまた、確立された方法によって、インビボ安定性および任意の種々の薬理学的特性を増強するように改変され得る（例えば、インビボ半減期を増加する、毒性を低減する［インビボ毒性はDMRIE/DOPE（1:1、mol:mol）、DOSPA/DOPE（4:1）、またはPC-コレステロール（chol）／DOPE（1:1）については観察されていないが］など）。例えば、ジステロイルホスファチジルコリン（DSPC）／chol（2:1）またはスフィンゴミエリン／chol（1:1）のような単純長循環脂質組成物を使用して、半減期／毒性を試験し得る。あるいは、合成ポリエチレンPC-chol/DOPE（1:1）リン脂質またはGM1のようなガングリオシドを含むことは、循環半減期を増加させるために使用され得る。毒性は、カチオン性部分にアシル鎖を接合するエステルまたはセラミドのような生分解性結合、あるいはカチオン性基にアシル鎖を接合するためのカルバメート、ヒドラジド、または無水物結合を有するカチオン性脂質を使用することによって、さらに低減され得る。 SPDVまたはその誘導体の診断的、治療的、または医学的使用が意図される場合、SPDVは滅菌条件下で調製および維持され得、従って微生物の夾雑を避け得る。SPDVの比較的小さいサイズおよび固有の安定性のため、SPDVを含む組成物はまた、使用前に濾過滅菌され得る。滅菌調製および濾過滅菌の上記の方法に加えて、抗菌剤もまた添加され得る。抗菌剤（これは、一般的に、総処方物の約３％w/vまで、好ましくは約0.5〜2.5％の量で使用され得る）には、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、フェノール、デヒドロ酢酸、フェニルエチルアルコール、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、チモール、チメロサール、デヒドロ酢酸ナトリウム、ベンジルアルコール、クレゾール、p-クロロ-m-クレゾール、クロロブタノール、酢酸フェニル水銀、ホウ酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、および塩化ベンジルアルコニウムが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、抗菌添加剤は、SPDVの生化学的特性を増強するか、またはSPDV活性について不活性であるかのいずれかである。所定の抗菌剤がSPDV活性に対して有害であると判明すれば、より低い程度にSPDV機能をもたらす別の薬剤に置換され得る。 有効成分としてSPDVを含む組成物は、任意の多くの確立された方法によってインビボで導入され得る。例えば、薬剤は吸入によって；皮下（sub-q）注射によって、静脈内（I.V.）注射によって、腹腔内（I.P.）注射によって、または筋肉内（I.M.）注射によって；直腸内に、局所適用薬剤（経皮パッチ、軟膏（ointment）、クリーム、軟膏（salve）、点眼剤など）として投与され得、あるいは、腫瘍または他の器官のような組織に、または内臓内もしくは周囲に、直接注入され得る。 本発明の別の実施態様は、遺伝子治療を行うためのSPDVの使用を包含する。このような遺伝子治療は、冒されている個体のゲノム中の遺伝子欠損を償うことを意図し、そしてエクスビボ体細胞遺伝子治療によってもたらされ得、それによって、宿主細胞は体から取り出され、そして欠損遺伝子を発現するように形質導入されて、宿主に再移植される。あるいは、体細胞遺伝子治療は、所望の遺伝子を有するベクターを個体にインビボで直接注入することによって行われ得、それによって、遺伝子は送達され、そして宿主組織によって発現される。 上記のポリヌクレオチド送達ビヒクルは、主としてポリヌクレオチドを細胞に提供することが意図されるが、本発明のさらなる実施態様は、ポリヌクレオチドに加えて任意の種々の適切な生物活性薬剤のパッケージングおよび送達を意図する。例えば、目的の生物活性薬剤（例えば、任意のタンパク質、ペプチド、有機低分子など）が正味の負の電荷を含むかまたは実質的な量の負に荷電した特徴を含むならば、確立されたリポソーム処方物または脂質エマルジョンあるいは本明細書に開示されたと実質的に類似の方法によって構築される送達ビヒクル中に組み込まれた生分解性の両親媒性脂質を使用して、このような薬剤を送達するために有用であると判明し得る。 さらに、目的の所定の薬剤がポリヌクレオチド（例えば、DNAおよび／またはRNA結合活性を有するタンパク質または他の分子）と会合し得るならば、薬剤をポリヌクレオチド送達ビヒクル中に最初に組み込むことによって、薬剤を体に送達するために有用であると判明し得る。 さらに、リポソームおよび脂質エマルジョンまたはマイクロエマルジョンが薬物送達ツールとしてまたは化粧品の成分として有用であると判明したならば、本明細書で開示された新規な生分解性の両親媒性脂質はまた、脂質構造、膜、またはエマルジョンの安定化、構造的、または結合成分として有用であると判明し得る。代表的には、生分解性の両親媒性脂質は、添加されるかまたは既存の処方物の脂質成分と交換されるかのいずれかであり、または両親媒性脂質の荷電した基をさらに利用する新規処方物が構築され得る。 所望であれば、１つ以上の安定化剤および／または可塑剤が、より高い保存安定性のために、エマルジョンおよびリポソーム処方物に添加され得る。マイクロエマルジョンは通常の条件下で静置した際に分離しない傾向にあるが、より大きな程度の安定性はいくつかの状況下で有用であり得る。安定化剤および／または可塑剤として有用な物質としては単純炭化水素が挙げられ、これには、グルコース、ガラクトース、スクロース、またはラクトース、デキストリン、アカシア、カルボキシポリメチレン、およびコロイド状水酸化アルミニウムが挙げられるがこれらに限定されない。安定化剤／可塑剤が添加される場合、これらは全調製物の約10％(w/v)、好ましくは約0.5から6.5％までの量で組み込まれ得る。 開示された生分解性の両親媒性のカチオン性脂質を含む脂質処方物（例えば、エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、または送達ビヒクル）はまた、カプセル化した生物活性薬剤を消化プロセスから顕著に保護し得る。このように、処方物はまた、生物活性薬剤の経口投与に有用であるとを判明し得る。 さらなる腸の保護が所望されるならば、さらなる保護のために、腸溶性のまたはそうでなければ他の保護された形態で、本発明に従って固体または液体処方物を処方することが可能である。液体処方物の場合には、これらは、中間鎖トリグリセリドの液体混合物のような保護剤と混合され得るかまたは単に同時投与され得るかのいずれかであり、あるいはこれらは腸溶性カプセル（例えば、軟または硬ゼラチンの、これらはそれ自体が必用に応じてさらに腸溶性にされる）中に充填され得る。あるいは、固体処方物はより可撓的に処理され得る。これらは、錠剤を形成するために腸性物質でコートされ得るか、または腸性カプセル中に充填され得るかのいずれかである。 錠剤またはカプセル剤上の腸性コーティングの厚さは、例えば、0.5〜４ミクロンの厚さであり得るが、正確な厚さは処方の当業者によって決定される。腸溶性顆粒（その粒子サイズは、例えば、0.5〜２mmであり得る）は、コーティングのために錠剤中に混合されることなく、それ自体がコートされ得る。同様に、マイクロカプセルは腸溶性にされ得る。腸性コーティングは、経口投与可能な薬学的処方物に従来から利用される腸性物質のいずれかを含み得る。適切な腸性コーティングは、例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第15版、1614-1615頁(1975)；第２版、116-117頁、371-374頁(1976)；および「Hagars Handbuch der Pharmazeutischen Praxie」、第４版、第7a巻（Springer Verlag 1971)、739-742頁および776-778頁から公知である。 適切な腸溶性物質の例としては、セルロースアセチルフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（HPMC-P）、サリチル酸ベンゾフェニル、セルロースアセトスクシネート、スチレンおよびマレイン酸のコポリマー、処方されたゼラチン（formulated gelatin）、ケラチン、ステアリン酸、ミリスチン酸、ポリエチレングリコール、シェラック、グルテン、アクリル酸およびメタクリル酸樹脂、ならびにマレイン酸およびフタル酸誘導体のコポリマーが挙げられる。腸溶性物質（単数または複数）は、ジクロロメタン、エタノールおよび水、セルロースフタレート、またはポリビニルアセテートフタレートのような溶媒に溶解され得る。腸性コーティングとしてHPMC-P、ポリエチレングリコール6000、またはシェラックを利用することが好ましい。pH5.5での分解または消失（これは、ヒト幽門で遭遇される）を目的とするHPMC-Pの専売調製物は、商標HP5-5で入手可能であり、そしてこれが特に好ましい。 用語「生物学的活性物質」には、特に、薬学的に活性なタンパク質性物質、および薬学的に活性な有機分子が含まれる。タンパク質性物質は、純粋なタンパク質であり得るか、または、糖タンパク質がタンパク質と糖残基との両方を含むように、タンパク質を含み得る。この物質は疾患またはその徴候の処置または予防のいずれかによって、ヒト医学または獣医学で有用であり得、あるいは化粧品的または診断的に有用であり得る。本発明に従って使用され得るタンパク質性生物学的物質の例としては、インスリン、カルシトニン、および成長ホルモンのようなタンパク質ホルモン（ヒトまたは動物由来あるいは半合成または全合成によって調製されるのいずれにしても）、エリスロポエチン、プラスミノーゲンアクチベーターおよびそれらの前駆体（例えば、tPA、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、およびストレプトキナーゼ）、ヒトインターフェロンαを含むインターフェロン、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、およびIL-12を含むインターロイキン、ならびに第VIII因子を含む血液因子が挙げられるが、これらに限定されない。 いずれにせよ、これらが生分解性である場合、本発明で開示された生分解性の両親媒性のカチオン性脂質、およびそれとともに製造されるポリヌクレオチド送達ビヒクルは、細胞への現在入手可能な合成カチオン性脂質対面ポリヌクレオチド送達に対して顕著な改良を示す。なぜなら、分解反応の副産物が実質的に非毒性であるか、または本来生体適合性であるからである。このように、本発明で開示された生分解性の両親媒性のカチオン性脂質は、インビトロならびにインビボでの細胞へのポリヌクレオチドの送達に有用である。 本発明の別の実施態様は、本明細書で開示されたカチオン性基の代わりに、他の生体適合性または基を脂質部分に付着するための、両親媒性カチオン性脂質分子の生体適合性のpH感受性のまたはさもなければ生分解性のリンカー部分の使用である。例えば、上記の標的化または生物活性タンパク質は、脂質に機能的に誘導体化され、そしてエンドサイトーシスの後に細胞中に放出され得る。あるいは、生体適合性アニオン性基はまた、正に荷電した生物活性薬剤またはポリマーの脂質性構造中への複合体化またはカプセル化を容易にするために、脂質に付着され得る。 以下の実施例は、本発明を説明するために提供される。当業者のレベルであれば、本発明の具体的に記載された特徴から実質的でない差を生じるように、上記または以下の開示のいずれもを改変することを予測し得る。このように、以下の実施例は、例示によって提供され、そして本発明を限定する目的のために含まれない。 6.0．実施例 6.1．生分解性カチオン性脂質結合体の作製方法 図１（ａ）に示される生分解性カチオン性脂質を以下のように合成した：クロロホルム中10μmolのN-グルタリル-DOPE（Avanti Polar Lipids、AL）を試験管に添加した。窒素下のエバポレーションによりクロロホルムを除去し、脂質膜を得た。残留クロロホルムを減圧により除去した。この膜を水中で水和し、そして超音波処理して直径約80nmのリポソームを形成した。50mM MES（pH6.2）中の５倍モル過剰量のN-ヒドロキシスクシンイミドおよび50mM MES（pH6.2）中の４モル過剰量のEDCをN-G-DOPEに添加し、そして室温で20分間インキュベートした。脂質混合物の抽出後、クロロホルム／メタノール／水（65/25/4）を用いた薄層クロマトグラフィー分析を行った。これは、これらの条件下でN-G-DOPEのすべてがＮ-ヒドロキシスクシンイミド-N-G-DOPEに転換することを示した。反応混合物を、10mM Hepes（pH8.5）で平衡化したSephadexG-25スーパーファインを含有する３mlスピンカラムに加えることにより、未反応EDC、NHS、およびMESを除去した。リポソームを１％オクチルグルコシド中に溶解し、そしてポリアミンを５倍モル過剰量まで脂質に添加して全てのNHS-N-G-DOPEを消費した。反応を４℃で一晩行った。脂質生成物を水に対して透析し、界面活性剤、緩衝液および未反応ポリアミンを除去した。次いで、この脂質生成物を１％オクチルグルコシド中に溶解し、そして以下のリポフェクタミン/DNA複合体形成に用いたものと本質的に同じプロトコルを用いてDNAに添加し得る。 図１（ｂ）に示される生分解性脂質（アミド結合によりN-スクシニル-DOPE（NS-DOPE）もしくはN-グルタリル-DOPE（NG-DOPE）に結合したペンタエチレンヘキサミン（PEHA）、またはアミド結合によりDOSGに結合したPEHA）を、pH6.5〜約8.5で120分間室温でNS-DOPE、NG-DOPE、またはDOSG（EDCでの処理により調製）のいずれかのN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルとPEHAを反応させることにより調製した。 あるいは、スペルミンを、以下のように、ヘテロ二官能性架橋剤によりDOPEに結合し得る。DOPEをSMBPで誘導体化して頭部基（DOPE-MPB）に末端マレイミドを生じさせる。スペルミンをスクシンイミジル-アセチル-チオアセテートと反応させ、保護チオールを有するスペルミンを生じさせる。その後、保護基をヒドロキシルアミンにより除去し、DOPE-MOBをスペルミンのチオール基と反応させてDOPE-BPM-S-スペルミンを生じさせる。このスキームを用いることにより、DOPE基はホスホリパーゼ加水分解に対して感受性を留め、それゆえDNAから脂質を放出する。 別のアプローチは、SPDP（スクシンイミジル-ピリジルジチオプロピオンネート(pyridylyldithiopropionate)）をDOPEと反応させてDOPE-PDPを生じさせることを含む。DOPE-PDPをDTTで還元後、露呈したチオール基が生じる。その後、DOPEのチオール基を上述した改変スペルミン分子の遊離チオール基と反応させてDOPE-S-S-スペルミン（ジスフィルド結合によりスペルミンに結合したDOPE）を生じさせ得る。ジスフィルド結合は、脂質からのDNAの放出を効果的に生じる標的細胞による還元に対して感受性である。 図２は、pH不安定カチオン性脂質を合成するための３つのストラテジーを示す。合成１に関して、Blattler,W.A.ら、酸不安定結合を形成する新しいヘテロ二官能性タンパク質架橋試薬、Biochemistry 1985、24、1517-1524を参照し、合成３に関しては、Behr、J.P.ら、リポポリアミンコートDNAによる哺乳動物の初期内分泌細胞への効果的な遺伝子導入、Proceedings from the National Academy of Sciences(USA)、1989、86、6982-6986を参照する。これらの開示は、本明細書中で参考として援用される。 さらに、DOPEは、イミノチオランと反応させてチオレート化脂質を生じさせ得る。スペルミンのようなポリアミンも同様にイミノチオランと反応させ得る。ヨウ素の存在下で誘導体化スペルミンおよび脂質を共に添加することにより、ジスフィルドにより結合されたポリアミン脂質が得られる。 6.2．安定な送達ビヒクルの作製方法 6.2.1．試薬 リポフェクタミンを、Life Technology Inc、Gaithersburg、MDより購入した。オクチルグルコシドを、SIGMA Chemical Co.、St．Louis、MOより購入した。β-ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する7.3キロベースの二本鎖閉環状DNA（pCMVβ、Clontech、Palo Alto、Californiaより購入）を細菌中で増殖させ、Quiagen MaxiPrep Isolationキットを用いて単離した。BioRad、Sunnyvale、CAより購入したポリミキシンBアガロースカラムを用いて吸着によりLPSを除去した。 6.2.2．安定なDNA/脂質複合体の処方物のためのプロトコル 以下に示す量のリポフェクタミン（DOSPA）を１％オクチルグルコシド、10mM TRIS（pH7.4）中に可溶化し、総容量0.5ml中の５μgのDNA（pCMVβ）に添加した：4.5μl、9μl、22.5μl、45μlおよび90μl。サンプルを、４℃で、５％グルコース、10mM TRIS（pH7.5）に対して透析した。透析緩衝液を48時間にわたって５回交換した。得られたポリヌクレオチド送達ビヒクルを、以下に述べるように、粒子サイズおよびトランスフェクション効率について試験した。 同様の方法を用いて、カチオン性脂質DOTAPおよびDC-CHOL（3-β-(n-(N',N'-ジメチルアミノエタン)カルバモイル)コレステロール）を有する安定な複合体を得た。 6.3．粒子サイズの分析 粒子サイズの分析が、LeedsおよびNorthropレーザー動的光散乱器(laser dynamic light scattering instrument)を用いることで得られた。リポフェクタミンを有する一過性の（例えば、先行技術）脂質/DNA複合体の特徴付けにより、リポソームの出発サイズは直径約50nmであることが示された。DNAの添加により、サイズは100nmに増大した。図４に示すように、経時的なこれらの複合体の保存は、100nm粒子の減少およびさらに大きな粒子（d＞1μm）の増加を示した。一過性の脂質/DNA複合体の保存により、遺伝子発現の減少が生じた。 これとは逆に、本明細書で開示した安定な脂質/DNA複合体の粒子サイズ分析は、約100nmの非常に厳密な粒子集団を示した。この同じサイズの粒子は生成の48時間後に優勢に観察された。14日後、粒子分析は、優勢な粒子サイズが100nm粒子であることと共に、より大きな粒子（約１μm）の割合が低いことを示した（図５参照）。 遺伝子発現の減少率と相関する粒子サイズの増加率の事実は、２つのパラメーター間の直接的関係を強く示唆する。 6.4．安定なDNA/脂質複合体による細胞トランスフェクション リポフェクタミンはDOSPAで省略されるカチオン性脂質を含む。この脂質はジアルキルエーテルで誘導体化されたスペルミンからなる。トランスフェクションを、DOSPAとDNAリン酸との比に関して試験した。安定な脂質複合体を無血清培地、DMEMに添加し、そしてNIH-3T3細胞に添加した。細胞を脂質/DNA複合体と共に３時間インキュベートした。この培地を取り除き、そして完全培地で置き換えた。インキュベーションを48時間継続した。細胞を0.1mlの溶解緩衝液（0.1％TX-100）中で回収し、そして0.040mlの細胞溶解物を0.05mlの2倍濃度のβ-ガラクトシダーゼ基質と混合して酵素活性を測定した。β-ガラクトシダーゼ発現のレベルを安定な複合体および一過性の複合体の両方について測定した。以下の実験を行った。 6.4.1．遺伝子発現 DOSPAはジアシルエーテルで誘導体化されたスペルミンからなる。トランスフェクション効率を測定している間、スペルミンとDNAリン酸との比は、0.5:1〜10:1（mol/mol）で変化した。細胞に添加する直前に、安定な複合体のDNAトランスフェクションを、脂質およびDNAを一緒に添加することから構成される一過性の複合体のそれと比較した。NIH-3T3細胞を、無血清培地において、37℃で、3〜4時間、細胞と共にインキュベートした。培地を完全培地と交換し、そしてインキュベーションを24時間継続した。細胞を回収し、そしてβ-ガラクトシダーゼ活性について溶解物を分析した。結果が図６に示され、これは安定な複合体（実線、左パネル）が一過性の複合体（実線、右パネル）と同レベルの遺伝子発現であることを示す。第二に、スペルミンとDNAリン酸との最適比は両方の複合体で同じであった（約2.5）。毒性が、DNAリン酸に対するスペルミンのより高い比（5〜10:1）において、安定な複合体および一過性の複合体の両方について観察された。このため、DNAをウェル当たり0.2μgに減少し、そして同じ比で試験した。これにより、細胞に添加された脂質の量の減少が生じた。 供されたDNAの量の減少により、スペルミンとDNAリン酸との最適比は両方の処方物について2.5〜10に増大し、確認された毒性レベル（細胞形態により決定）は実質的に減少した。顕著な差異は、遺伝子発現のレベルが安定な複合体で変化しない（図６、点線、左パネル）のに対して、一過性の複合体による発現は５分の１に減少した（図６、点線、右パネル）ことである。上記の結果は、スペルミンとDNAリン酸との比を10に維持し、そして複合体形成に用いたDNAの量を変化させることにより拡大された。結果を図７に示す。 図７において、β-ガラクトシダーゼ活性をＹ軸に対数スケールで示し、そしてDNA投入量をＸ軸に示す。使用した最低用量のDNAは、安定な複合体のみが遺伝子発現を示した。それ以上の用量は、安定な複合体が一過性の複合体に比べて５〜10倍高いレベルの遺伝子発現（およびトランスフェクション効率）をもたらすことを示した。 6.4.2．安定性試験 一過性の複合体以上の安定な複合体の利点を、遺伝子トランスフェクションの効率を４℃での保存時間と相関させる比較試験においてさらに示した。これらの複合体を同じ時間で調製し、上記と同じ細胞トランスフェクションプロトコルを用いてNIH-3T3細胞のトランスフェクションについてＸ軸で示した時間で試験した。結果を図８（ａ）に示す。一過性の複合体は24時間後にβ-ガラクトシダーゼ活性の劇的な低下を示し、そして48時間後に発現は観察されなかった。これとは逆に、安定な複合体は新たに生成された一過性の複合体を用いて観察される活性レベルと等価である48時間後の活性レベルを示し（安定な複合体を形成するには48時間の透析を要するため、最初の時点は48時間である）、14日の保存後に約50％の最大トランスフェクション効率をなお維持した。これらのデータは、DNAトランスフェクション効率の喪失を最小限にする保存条件を最適化する労力なしに集められた。従って、結果は、一過性の複合体と比較してSPDVを用いて得られ得る安定性増大の最小レベルを表す。 長期安定性試験を、6.6のDOSPA/DNA比からなる安定な複合体を用いて行った。安定な複合体のアリコートを20℃で、５％デキストロースの存在下または非存在下に-20℃で、４℃で、室温で、および37℃で90日まで保存した。安定性を、複合体のトランスフェクション効率をアッセイすることにより評価した。結果を図８（ｂ）に示す。図８（ｂ）は、４℃および５％デキストロースの存在下に-20℃で保存した安定な複合体の両方が、少なくとも90日間、または凍結保存の場合は少なくとも270日間、実質的に100％の初期トランスフェクション活性を保持したことを示す。デキストロースの非存在下に-20℃で保存した安定な複合体は、時間の経過と共に継続的に活性が失われるトランスフェクション活性が初期の５分の１に減少し、そして37℃で保存した安定な複合体は14日後に本質的に全てのトランスフェクション活性を失った。これとは逆に、一過性の複合体はわずか24時間後に本質的に全ての活性を失った。５％デキストロース保存条件の凍結乾燥は、最初の容量の0.1倍〜１倍の容量で再懸濁した場合に活性の完全な保持が生じた（すなわち、少なくとも10倍まで濃縮し得る）。 6.4.3．血清安定性の証明 一過性のカチオン性脂質/DNA複合体と関連するさらなる問題は、血清成分による不活性化である。血清不活性化を回避するためには、トランスフェクションの現行の方法ではカチオン性脂質/DNA複合体を無血清培地中の細胞でインキュベートすることが必要である。これはインビボでの一過性のカチオン性脂質/DNA複合体の使用を大きく妨げる問題である。このため、トランスフェクションに関する血清安定性を試験した。血清を安定な複合体および一過性の複合体の両方について０〜15％で試験した。これらの試験のため、0.2μgのDNAを使用し、スペルミンとDNAリン酸との比を10:1に維持した。結果を図９に示す。一過性の複合体は２％血清で活性の顕著な低下を示したが、安定な複合体のトランスフェクション効率は使用した全ての血清濃度でほとんど低下しなかった。その後のX-gal染色試験は、約10％の露呈細胞が試験範囲の血清濃度でβ-galを発現することを示した。 上記のデータにより、１）少なくとも14日間安定のままであるDNA/カチオン性脂質複合体の形成、２）安定な複合体のトランスフェクション効率は現在知られている一過性の複合体のトランスフェクション効率よりも大きいこと（遺伝子発現により測定）、および３）安定な複合体は一過性の複合体よりも血清成分不活性化に対して感受性が低いことが示される。 6.5．安定なカチオン性脂質/DNA複合体の単離および濃縮 安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを、上述したように、3.3、6.6、および16.5のDNAリン酸に対する脂質の比を用いて形成した。複合体はDOSPAおよび特にサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター（pCMVβ）の転写制御下のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子をコードする7.3kbプラスミドコードを含む。 ビヒクル/複合体をデキストロース（５％）の存在下に-20℃で、および４℃で保存した。90日の保存後、全てのサンプルは本質的に全ての初期トランスフェクション効率を保持した。保存の間、４℃で維持したサンプルは沈殿物を蓄積した。この沈殿物を４℃で15分間、3,000gでの遠心分離により溶液から分離し、ペレットを10mM Tris中に再懸濁した。その後、再懸濁沈殿物、上清、および出発混合物を3T3細胞におけるトランスフェクション活性について試験した。 トランスフェクション実験の結果を図10に示す。図10は、大部分のトランスフェクション活性が、3.3のDOSPA/DNA比で複合体を形成した場合、上清に留まり；そして約90％のトランスフェクション活性が、6.6および16.5のDOSPA/DNA比で作製したサンプルのペレットに配分したことを示す。6.6および16.5の比の脂質分析は、DOSPA/DOPE比においてわずかの差異を示し、そして総脂質の約10％はペレットに留まるが、投入脂質の90％は上清に留まることを示した。さらに、上清および濃縮複合体を薄層クロマトグラフィー（TLC）を用いてさらに分析すると、上清およびペレット（複合体）の両方は、同一のDOPEするDOSPA比を含んだ。これらのデータにより、大部分の脂質が上清に留まることがさらに確認された。 約６よりも高い脂質/DNAリン酸比を有する処方物から生じるペレットを元の容量の50分の１で再懸濁すると、濃縮組成物は対応する未濃縮処方物よりも実質的に高い（数倍まで）トランスフェクション効率を示した。より高いレベルのトランスフェクションの理由は、おそらく、未複合体化脂質の除去による。図10に示すように、非複合体化脂質は、非生分解性カチオン性脂質にしばしば関連する観察された毒性の大きな原因である。従って、毒性成分から活性成分を単離することにより、さらにDNAを標的細胞に添加し得、これは、結果として遺伝子導入の量を増大させる。 この観察の重要性は、濃縮サンプルに含まれるDNA濃縮物とほぼ等しいDNA濃縮物を用いて作製される未濃縮複合体は実際にトランスフェクション活性を示さないということである。DNAに対する脂質の最適比は相対的に一定であるので、DNA濃度を増大させるには、脂質の濃度を比例した量で増大させることが必要である。しかし、非生分解性カチオン性脂質は、しばしば、細胞に対して高度に毒性であるので、トランスフェクションの間、限られた量の毒性脂質のみを細胞に与え得る。従って、脂質/DNA複合体を形成する以前の方法を用いた場合、脂質の毒性は、一般的に、標的細胞に与えられる得るDNAの量を制限した。同様に、細胞に与え得る少量のDNAは、脂質ベースのDNA送達系のトランスフェクション効率をさらに制限した。 6.6．単離された安定なカチオン性脂質/DNA複合体は低い毒性を示す。 濃縮複合体は何倍にも増大したDNAの量を含むが、それらは対応する毒性の増大を示さなかった。事実、15.625の脂質/DNAリン酸比で作製された濃縮複合体は、6.25のDOSPA/DNA比で作製された濃縮および単離複合体より４倍を高いトランスフェクション活性を生じ、細胞毒性はほとんどまたは全く確認されなかった。これとは逆に、15.625の比で作製された未濃縮複合体は、細胞トランスフェクションについて機能的に不活性である。なぜなら、増大した脂質濃度に関連する細胞毒性が高いレベルであるからである。 一般的に、一過性の複合体または安定な複合体のいずれかで処理された細胞の生存力は、細胞に添加されたDNAの濃度が１μg/mlまで増大された場合、減少した。この量は、本質的に処理細胞の全てを死滅させた。これとは逆に、単離および再懸濁複合体は、１μg/mlのDNAを送達するために用いた場合にはほとんど毒性を引き起こさず、そして10μg/mlのDNA濃度ではわずかな毒性のみであった。 明らかに、安定な複合体を単離および濃縮すること、細胞に与えられ得るDNAの正味量を増大すること、および細胞毒性の主要源から活性複合体を分離することの両方によってトランスフェクション効率が増大される。上清および濃縮複合体のその後の毒性プロフィールは、毒性の大部分が上清に留まることを示した。 さらに、種々の画分のLD50を比較する細胞毒性試験を行った場合、単離複合体（例えば、ペレット）の予測される致死用量は、出発混合物または上清のいずれかよりもある程度高いことが見出された。 濃縮複合体におけるDNAに対する脂質の比を測定した場合、複合体における脂質の割合は、DNAに対する脂質の比が約10以上に増大した後に、実質的に増大しなかった。従って、試験に用いた7.3kbプラスミドは、約10の脂質/DNA比で脂質と会合して飽和されると結論され得る。この測定データは、他の核酸に一般に適用可能であることを証明し得、そしてこのようなデータの考察は、脂質/DNA複合体を実質的に脱毒化する開示された方法をさらに容易し得る。 6.7．インビボでのポリヌクレオチド送達ビヒクルの使用 SPDVを５モル％ラクトシルセレブロシドの存在下に処方し、そしてマウスに静脈内注射した。注射の48時間後に、全細胞DNAを種々の組織から取り出し、そしてサザン分析を用いて宿主組織に送達されているプラスミドDNAについてスクリーニングした。データにより、SPDVと複合体化したポリヌクレオチドが細胞に送達され、そして検出されたDNAの量が、DOSPA/DNAリン酸の比が増大（20:1まで）するとともに増大したことが示される。 さらに、βガラクトシダーゼをコードするDNA含むSPDVを生きたマウスの脳に注射した。注射の72時間後に行ったその後の組織学的試験により、針路に沿ってβガラクトシダーゼ活性が検出された（コントロール注射の針路に沿ってβガラクトシダーゼ活性は検出されなかった）。これらのデータは、SPDVが実際に複合体化DNAを脳組織に送達し、その後インビボで発現されるという結論と一致する。6.8．安定な脂質/DNA複合体および一過性の脂質/DNA複合体のDNA導入活性の比較 安定な複合体および一過性の複合体を、0.3〜15のDNAリン酸に対するDOSPA（mol/mol）の比、ならびに0.1μg/ウェル（図11Aおよび11E）、0.2μg/ウェル（図11Bおよび11F）、0.4μg/ウェル（図11Cおよび11G）、および0.8μg/ウェル（図11Dおよび11H）の異なるDNA濃度で、上記したように本質的に形成した。β-ガラクトシダーゼ活性（黒丸）を左のｙ軸にプロットし、そして細胞溶解物から回収した総細胞タンパク質（白丸）と比較して右のｙ軸にプロットした。 特に、図11は、一過性の複合体および安定な複合体の両方でDNA濃度が増大された場合に、一般に、β-gal発現が増大したことを示す。6.9．ペプチドリガンドを用いたヒト内皮細胞への安定なカチオン性脂質/DNA送達ビヒクルのインビトロ標的化 標的化リガンドは次の配列を有する環状RGDペプチドであった： このRGDペプチドは、特にαvβδインテグリンレセプターに結合する。このインテグリンは内皮細胞上で発現され、そしてビトロネクチンに結合することが可能である。ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）をインビトロ組織培養アッセイ系として用いた。これらの細胞はビトロネクチンレセプターを発現するだけではなく、通常のDNAトランスフェクション技法に対してきわめて耐性である。このため、非特異的標的化による発現は低く、従って雑音(noise)比に対するシグナルを増大する。DNAトランスフェクションビヒクルを次のようにアセンブリした。 標的化リガンドでSV101を誘導するためのストラテジーには第一に、リガンドを脂質に付着させ、次いでDNAの添加前に界面活性剤/カチオン性脂質混合ミセルに組み込むことが必要である。これを達成するために、Avanti Polar Lipid、Birmingham、ALより購入したN-グルタリルジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（G-DOPE）の末端カルボキシル基を、モル過剰の1,エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）と脂質とを反応させることにより、N-ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルに変換した。この反応は、最初に10μmolのG-DOPEをCHCl3を含む試験管に添加することにより行った。溶媒は脂質膜を形成するN2下でエバポレーションにより除去し、そして残留溶媒は乾燥により除去した。 脂質膜を水中で水和し、懸濁液にボルテックスし、そして強浴（strong bath）超音波処理器で10分間、超音波処理した。５倍過剰のEDCおよびNHSを、50mM MES、pH6.0中のリポソームに添加した。反応物を室温で20分間インキュベートした。反応物を10mM Hepes、pH8.5で平衡化した5mlのSephadex G-25スピンカラムに加え、2,000RPMで３分間遠心分離した。NHS-G-DOPEを溶出液中で採集し、２μmolの脂質を1.0％オクチルグルコシド中で溶解した。５倍モル過剰のRGBペプチドを溶解脂質に添加し、そして反応物を４℃で一晩インキュベートした。 脂質/リガンド反応混合物を、LTI、Gaithersburg、MDより購入したリポフェクタミンに総脂質の５、10、20モル％で添加した。オクチルグルコシドを添加し、最終オクチルグルコシド濃度を１％とした。DNAを、１、2.5、５、10、15、および20のDOSPA/DNAリン酸比で溶解脂質混合物に添加した。脂質/DNA混合物を28ウェルGIBCO透析フローチャンバーに配置し、そして４リットルの５％デキストロース、10mM Tris、pH7.2に対して48時間透析した。 HUVECをDNAの添加24時間前に35mmディッシュ中にウェル当たり1.5×105細胞の密度でプレートした。１μgのDNAを無血清培地の各ウェルに添加し、そして37℃で４時間、細胞とともにインキュベートした。脂質/DNA複合体を吸引により除去し、そして完全培地と交換した。100μlの溶解緩衝液（0.1％Triton X-100および250mM Tris、pH8.0）の添加の24時間後に細胞を回収した。50μlの細胞溶解物を50μlのβ-ガラクトシダーゼ基質（ONPG）と混合し、そしてβ-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。結果を図12に示す。 図12のＹ軸は観察された発現のレベル（β-ガラクトシダーゼ活性により測定された）を示し、そしてＸ軸はDNAに対するスペルミンの比を示す。DOSPAはスペルミンに誘導されたジアクリルグリセロールからなる。従って、DNAリン酸とスペルミンの比はDNAリン酸に対するDOSPAの比を表す。それぞれの線は、脂質誘導ペプチド（脂質会合リガンド）のモル％の増大を表す。白丸は無血清培地のリポフェクタミンにDNAを添加することにより形成される一過性の複合体であり、続いて、直ちに一過性の複合体は細胞に適用される。試験したDNAリン酸に対するスペルミンのいずれの比でもβ-ガラクトシダーゼ活性は確認されなかった。 黒ダイアモンドは、10の比で多少の遺伝子発現を示すが、発現のレベルは低く、２ミリ単位よりわずかに低いことを示した安定なカチオン性脂質/DNA複合体を表す。５および10モル％（標的化ペプチド結合脂質／総脂質）は、それぞれ黒逆三角形と黒四角（box）とで表される。いずれも同じスペルミン/リン酸比、10で同じレベルの発現を示し、これは非ペプチド処方物よりも２倍高かった。20モル％グラフを上向き黒三角形で表す。この処方物は、10のスペルミン/リン酸比で10ミリ単位であった最大レベルの遺伝子発現を示す。これらの結果は、遺伝子発現の増大レベルと複合体における脂質会合リガンドのモル％の増大との間の強い相関を明らかに示し、これは効果的な標的化が達成されていることを示唆する。 6.10．ラクトシルセレブロシドおよびフェチュインを用いた標的試験 上述したように、本発明で開示した脂質/DNA複合体に固有の安定性により、標的化剤を複合体に会合するためにしばしば、必要とされる操作が可能となる。例えば、10モル％のラクトシルセレブロシドを含む安定な複合体が形成された。これにより、ガラクトース残基を示す複合体が得られた。複合体の表面上のガラクトースの存在は、肝細胞（肝細胞はガラクトースの表面レセプターを発現する）標的化することが要求される場合に望ましい。 あるいは、タンパク質フェチュインを用いることができる。ノイラミニダーゼ（シアル酸を分割する）による処理後、アシアロフェチュインが得られる。アシアロフェチュインは肝細胞ガラクトースレセプターと会合することが知られている。0.5ml中の125μgアシアロフェチュインと0.2μg DNAを含む、安定な複合体とアシアロフェチュイン（沈降および濃縮された安定な複合体）とを４℃で18時間、共にインキュベートすることにより、アシアロフェチュインで予めインキュベートしなかった安定な複合体に対して、肝細胞トランスフェクションが15倍増大した。 6.11．濃縮脂質/DNA複合体でトランスフェクトされた遺伝子のインビボ発現 約10μgのDNAを含む濃縮および脱毒性化された安定脂質/DNA複合体を用いて、インビボでマウスにβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した。複合体の静脈内（または筋注）投与後、マウスは依然として生存可能であり、屠殺されそしてインビボ遺伝子発現について分析される時まで、明らかに健康であった。これとは逆に、一過性の複合体中に10μgのDNAを注射したマウスは、一般的に内臓に重大な損傷をうけ、ほとんど生存不可能であった。 上記の明細書で述べた全ての刊行物および特許は本明細書中で参考として援用される。本発明の記載された方法およびシステムのさまざまな改変および変更は、本発明の範囲および精神から離れることなく当業者にとって明らかである。本発明は特に好ましい実施態様と共に述べられているが、請求の範囲に記載されているような本発明はこのような特別の実施態様に過度に限定されるべきではないと理解するべきである。もちろん、分子生物学の分野または関連分野における当業者に自明である本発明を実施するための上述した態様のさまざまな改変は、以下の請求の範囲内にあることが意図される。 6.12．低減された毒性の安定なSPDVを形成するための別の方法 プラスミドSSV9-MD2-APM（図13参照）を、0.5mg/mlのDNA、1 M MgCl2、および２％オクチルグルコシドを含む2ml容量中のDOSPA/DOPE（１:1 mol/mol）と複合体化した。カチオン性脂質（DOSPA）を、DOSPA:DNAリン酸比、0.6:1、1:1、および1.6:1で添加した。48時間にわたって合計８リットルの１モルMnCl2に４℃で透析することにより界面活性剤を除去した。カチオンのその後の除去および実質的な除去を合計８リットルの５％デキストロース、10mM Trisに透析することにより達成し、これにより約50〜約150nmの間の平均直径を有する粒子の濁った分散体が得られた。こうして得られた安定な複合体は、４℃で保存される場合、完全なトランスフェクション活性を少なくとも２週間維持する。 6.13．低減された毒性の安定なSPDVを用いたインビボ発現試験 80μgのDNA（SSV9-pMD-AP）を用いて、本質的に6.12節で述べたようにSPDVを形成し、容量0.25mlでBalb Cマウス（約25gm）の尾部静脈内に注射した。MnSV101はMnCl2透析した脂質/DNA複合体を指す。標準プラスミド単離法およびCsCl上の二重バンドにより調製されていたSSV9-pMD-APを有する複合体を調製した。DNAに対するDOSPAの比を約0.66〜約1.65で変化させた。１群当たり５匹のマウスに注射した。投与後24時間に組織サンプルを回収し、そして正味濃度100mg/mlの緩衝液でホモジナイズした。ホモジネートを30分間65℃に加熱し、内因性アルカリホスファターゼを不活化した。二次抗体を96ウェルプレートに吸着させたの後、抗ヒト胎盤アルカリホスファターゼポリクロナール抗体を添加することからなる免疫捕獲アッセイを用いてホモジネートを分析した。0.2mlのホモジネートを各ウェルに添加し、そして４℃で一晩インキュベートした。20ミリ単位〜0.1ミリ単位の範囲のアルカリホスファターゼ（AP）の標準曲線も含む。プレートを洗浄し、追加の200μlアリコートをウェル内で２時間インキュベートしてシグナルを増大させるか、またはウェルを洗浄してアルカリホスファターゼ基質を添加する。各ウェルのVmaxを測定することができるMolecular Devicesプレートリーダを用いてプレートを読み取った。VmaxをAPのミリ単位に変換し、そしてデータを組織100mg当たりに標準化した。 図14は、MnSV101により、血液を除く試験した全組織（すなわち、肝臓、脾臓、肺、心臓、および腎臓）においてインビボでの発現の有意なレベルが生じたことを示す。1.65:1のDOSPA/DNAリン酸比で調製されたMNSV101は最高の発現レベルを示したが、毒性効果は理想的な比がおそらく1:1と1.65:1との間の範囲であることを示唆する。 図15は、1:1のDOSPA:DNAリン酸比で調製されたMnSV101について、試験した80μg用量のDNAは、一般的に低いDNA濃度よりも優れたインビボ発現を提供したこと示す。 図16は、（1:1のDOSPA:DNAリン酸比で生成される）MnSV101を用いた遺伝子導入は、送達されたDNAの一過性のインビボ発現を明らかに導くことを示す。 図17は、本質的に6.12節に述べたように生成される安定な合成送達ビヒクル（1:1のDOSPA:DNAリン酸比）はまた、二価Mnカチオンを用いた場合に用いられる濃度と同様の濃度で、一価カチオンNa（NaCl、すなわち、NaSV101、またはNaCl-SV101を使用）を用いて生成され得る。図17のデータは、実質的に除去するのとは対照的に、第２の透析工程間に複合体中のカチオン濃度を単純に減少させることは、ナトリウムを使用してSPDVを形成するのを助ける場合、発現レベルを増強し得ることをさらに示す。図17はまた、MnSV101およびNaSV101がいずれも、後にインビボで遺伝子を発現することができる筋組織への遺伝子の送達が可能であることを示す。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Delivery vehicles containing stable lipid / nucleic acid complexes Related application This application is related to U.S. Patent Application No. 08 / 450,142 filed May 26, 1995.This is a division continuation application. 1.0.Introduction The present invention is in the field of biochemistry. In particular, polynucleotides or other biologically active substancesNovel compositions are reported that efficiently deliver quality to cells. 2.0.background The present invention relates to novel polynucleotide delivery vehicles, and to produce them.A new method. As the field of molecular biology matures, researchers manipulate polynucleotides.A wide variety of methods and techniques have been developed that allow for PolynukReotide is typically engineered to perform a specific function within a cell. UnfortunatelyPolynucleotide polymers are also highly charged molecules (due to the phosphate backbone)And does not readily penetrate cell membranes. Thus, obtained by genetic engineeringWith progress, researchers have developed ways to introduce genetically engineered substances into cells.Progress has also been made. Methods developed for delivering genetically engineered polynucleotides to cellsOne involves the use of liposomes. Liposomal phospholipid bilayers are typicalAre produced from substances similar to the components of the cell membrane. Therefore, liposomes and (The associated polynucleotide (either externally or internally) is deposited on the liposome envelope.Can be delivered to the cell when it fuses with the cell membrane. More typically, liposomesEndocytosis in cells. After internalization,The internal pH of tosis vesicles can be substantially reduced and / or the vesiclesCan be fused with other intracellular vesicles, including During or after the vesicle fusion process,The internal contents of the dosome can be released into the cell. Liposomes use the relatively small number of liposomes as polynucleotide delivery vehicles.Limited by the internal capacity. Therefore, high concentrations of polyIt is difficult to capture nucleotides effectively. Researchers add a positively charged amphiphilic lipid moiety to liposome formulationsAttempts to make up for the above inefficiencies by doing or using. principleTypically, the positively charged group of an amphipathic lipid is a negatively charged polynucleotide.Form an ion pair with the peptide, and reduce the degree of association between the polynucleotide and the lipid particle.Increasing the degree, which probably promotes binding of the nucleic acid to the cell membrane. For example, goSeveral cationic lipid products are currently available and are useful for introducing nucleic acids into cellsIt is. Of particular importance is LIPOFECTINTM(DOTMA), which is diacylglyceroConsisting of a monovalent cationic choline head group attached to a protein (generally described by Epstein et al.See US Pat. No. 5,208,036); TRANSFECTAMTM(DOGS), lipospermiSynthetic Cationic Lipids with Proton Head Groups (Promega, Madison, Wisconsin); DMRIEAnd DMRIE-HP (Vical, La Jolla, CA); DOTAPTM(Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana), and Lipofectamine (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). When used properly, the above-described compounds provide nucleic acids to cells cultured in vitro.To increase the permeability of Therefore, the lipofection process isIt has become an important tool. Typically, formulations containing cationic lipids are deliveredMixed internally with the polynucleotide, and then applied to the target cells. LipofekThe efficiency of the cationic lipid-polynucleic acid significantly decreases after a few hours.Otide complexes generally must be used relatively soon after mixing. ThisObservations indicate that at least with respect to lipofection efficiency, cationic lipid-polyIt can be assumed that the nucleotide complex is rather unstable. From a research perspective, the above conjugate is fairly easy to prepare. Therefore, preparedThe relatively short active life of the conjugate is not a problem when in vitro applications are involved.However, medical use of polynucleotide delivery vehicles containing cationic lipids orIf intended for in vivo use, a given clinician will necessarily confirm the active formulation.Indeed, then use the formulation within a fairly narrow window of optimal activity.I can't imagine getting it. Therefore, especially when intended for clinical use,A stable polynucleotide delivery system is preferred. Another disadvantage of currently available compounds is that each lipid and cationic componentLinked by biodegradable chemical bondsNotThat is. Thus, if the target cellsMost of the currently available synthetic cationic lipids do not metabolize synthetic lipids.It is toxic. Certain levels of cytotoxicity can be detrimental, but onlyAccept if in vitro or research use of cationic lipids forIt may be possible; however, such toxicity is generally due to the incorporation of cationic lipids.It is unacceptable if intended for in vivo use. Therefore, although not required,Preparation of Cationic Lipid-Polynucleotide Delivery Vehicle for In Vivo UseMade from biocompatible, biodegradable or cationic fats containing metabolizable componentsQuality is preferred. Alternatively, cationic lipid-polynuc with substantially reduced toxicityA reotide delivery vehicle can be used. Finally, the use of synthetic cationic lipids to transfect cellsAll currently available methods for rapid inactivation by relatively low concentrations of serumTo produce a lipid / DNA complex. Serum sensitivity was determined by transfection in serum-free medium.Facilitates in vitro applications by performing the start of the injection procedureCan be avoided. However, serum sensitivity does not affect cationic lipid-mediated DNA delivery in vivo.Remains a major obstacle to their widespread use. 3.0Summary of the Invention The invention maintains transfection efficiency for at least 48 hours after formation / synthesisA new stable polynucleotide delivery vehicle is contemplated. Thus, the present invention also produces stable polynucleotide delivery vehicles.Claims: A method comprising delivering a polynucleotide in the presence of a surfactant.Contacting the surfactant with an amphipathic cationic lipid conjugate; andRemoving, thereby providing substantially size-stable polynucleotide delivery.A delivery vehicle is formed and this delivery vehicle also increases transfection efficiency.A process that is substantially stable with respect to Another embodiment of the present invention provides that the nucleic acid is cationic before or simultaneously with the addition of the detergent.And the surfactant is removed prior to removal of the cations.A stable complex produced as described above, having features. Another aspect of the invention is a method for producing a stable polynucleotide delivery vehicle.Process, wherein the polynucleotide is synthesized in the presence of a detergent.Contacting the cationic lipid with the cationic lipid;Removing this surfactant to complex it with the resulting delivery vial.Isolating the vehicle. The isolated delivery vehicle is resuspended in a smaller volume than originally formedCan be done. As a result, a concentrated composition comprising the delivery vehicle is formed. didThus, another aspect of the invention generally involves at least about 0.5 mg / ml, and preferablyOr stable polynucleotide delivery vehicle containing a DNA concentration of at least about 1.0 mg / ml.It is. During isolation of a stable polynucleotide delivery vehicle, the toxicity of the resulting composition is severe.Can be reduced. Thus, yet another embodiment of the present invention provides a substantially reducedToxic stable polynucleotide delivery vehicles. The present invention may further be further complexed with a non-cationic lipid or other lipid moiety.Stable polynucleotide delivery vehicles containing amphiphilic cationic lipid conjugatesIntention. A further embodiment of the present invention provides a method for preparing a stable lipid comprising a biocompatible cationic lipid conjugate.Polynucleotide delivery vehicles, and methods for their production and use. Thus, the present invention also provides a biocompatible amphiphilic comprising a biodegradable lipid moiety.Intended for cationic lipid conjugates, this biodegradable lipid moiety is also biocompatibleBiocompatible Cationic or Multivalent Cationic Moieties Due to Insoluble pH-Sensitive Chemical BondsCovalently bonded in minutes. Accordingly, a further embodiment of the present invention provides a biocompatible material having the general formulaIncluding an amphiphilic cationic lipid conjugate of: R1-X-RTwoWhere R1Is a biodegradable lipid moiety; RTwoIs the biocompatible cationic moietyOr X is a multivalent cationic moiety; and X is a biocompatible biodegradable covalent bond.A linker or other labile covalent linker. For stability of the polynucleotide delivery vehicle contemplated by the present invention, targeting groupsCan be further incorporated into the vehicle, thereby delivering the polynucleotideCan be targeted to a particular cell type and / or cell location (eg, nucleus). Another embodiment of the present invention provides a method for administering one or more polynucleotides of interest to a cell.Contemplates use of a stable polynucleotide delivery vehicle as described above for delivery. In a related aspect, a stable polynucleotide delivery vehicle provides a therapeutic benefit to an individual.Can be used to provide Yet another aspect of the present invention is a targeting agent having a property capable of binding a stable complex.By associating the complex with a complex, which is stable to specific cells and tissues (Or delivery vehicles). 4.0Description of the drawings Figures 1a and 1b. Summary of the novel metabolizable / biodegradable cationic lipids of the present inventionHere are some examples. Specifically, hexamine, spermine, spermidine, pentaeN-glu (linked by phosphodiester bond) to Tylenehexamine (PEHA)Taryl-dioleoylphosphatidylethanolamine; (phosphodiester bondN-succinyl-dioleoyl bound to pentaethylenehexaminePhosphatidylethanolamine; to pentaethylene (by ester bond)Example of 1,2-dioleyl-sn-glycero-3-succinate (DOSG) bound to oxamineIt is. FIG. Novel products contemplated by the present invention incorporating pH labile linker moleculesAn example of a degradable cationic lipid is shown. The reaction scheme for synthesizing this molecule is alsoProvided. FIG. The cationic groups of some cationic lipids available in the present inventionAnd where attached to the acyl chain. Specifically, monovalent cationsSynthetic lipids DOTMA, DMRIE, DORIE, and DMRIE HP; and polyvalent cationic compoundsDOGS (Transfectam)TM) And DOSPA (Lipofectamine) are indicated. FIG. The size fraction of the transient liposome-DNA complex at several different time points3 shows changes in the fabric. FIG. The size of the stable polynucleotide delivery vehicle at several different time points3 shows changes in the size distribution. FIG. Used to form lipid / DNA phosphate ratio and complex / vehicleTransient liposome-DNA complexes and stable(As measured by β-galactosidase activity of the nucleotide delivery vehicle)) Shows relative transfection efficiency. FIG. As a function of the amount of input DNA used to form the complex / vehicleTransient liposome-DNA complexes, and stable polynucleotide deliveryRelative transfer (as measured by β-galactosidase activity)2 shows a more discriminatory analysis of the action efficiency. FIG. FIG. 8 (a) shows that transient liposome-DNA complexes, as a function of storage time,And stable polynucleotide delivery vehicle (transfection efficiency / β-Indicates relative stability (as measured by reduced galactosidase activity). FIG.b) shows the relative stability of stable and transient complexes under various storage conditionsShows sex. Stable cationic lipid / DNA complex with 5% dextroseAt −20 ° C. (closed squares), at −20 ° C. without dextrose (open squares), at 4 ° C. (open circles)), Stored at room temperature (closed triangles) and at 37 ° C. (open triangles). 4 transient complexesStored at 0 ° C. (closed circles). FIG. As a function of the percentage of serum concentration, the transient liposome-DNA complex, andAnd stable polynucleotide delivery vehicle (transfection efficiency / β-Relative stability (as measured by reduced lactosidase activity). FIG. Stable cationic lipid / DNA complexes after separation from uncomplexed lipidsFig. 4 shows the gene transfer activity of the union. 3.3: 1, 6.Prepared with DOSPA / DNA phosphate ratios of 6: 1 and 16.5: 1. Centrifuge the suspension andPellet (solid black box), supernatant (white box), and original centrifugeUnsuspended suspensions (hatched boxes) were assayed for gene transfer activity. About 0.2 μg DNA from the original suspension, 10FiveAdded to NIH 3T3 cells. Before centrifugationCorresponding pellet and supernatant based on providing an equal volume of the original suspensionThe amount was added to the cells. FIG. Tracing cells as a function of both β-gal activity and total cellular protein4 is a graph of the DNA dose used to transfect. FIG. Associates with several different spermine / DNA phosphate ratios and with lipidsTransient or stable at several different mole percentages of ligand / total lipidUsing lipids associated with RGD peptides incorporated into any of the various lipid / DNA complexes2 shows the comparative levels of expression obtained in the targeted studies used. FIG. Uses a stable synthetic DNA delivery vehicle generated in the presence of cationsShows the effect of DOSPA / DNA phosphate ratio on in vivo gene transfer and biodistribution(MnSV101). Figure 14. (Alkaline phosphatase activity at a DOSPA / DNA nucleotide ratio of 1: 1.Figure 4 shows a dose response curve for the biodistribution of MnSV101 (measured from). Figure 15. In vivo with MnSV101 prepared at a DOSPA / DNA nucleotide ratio of 1/1.The time course for gene transfer and expression is shown. Alkaline filters for each tissueSphatase expression was assayed on selected days by immunocapture. FIG. For biodistribution and efficiency of gene transfer, MnSV101 and (instead of Mn)Shows a comparison with NaSV101 (formed in the presence of cationic Na). DOSPA / DNAKeeping the nucleotide ratio 1/1, the injection volume is 0.25 ml, and the DNA dose used wasIt was 80ug. Alkaline phosphatase expression for each tissue was determined by immunocapture.Assayed. MnSV101 and NaSV101 are converted to dextrose in a second dialysis stepDialysis against saline or against saline (0.15 M NaCl) prior to infusiondid. 5.0Detailed description of the invention The biodegradable amphiphilic cationic lipids of the present invention comprise one or more polymorphs of interest.Can be contacted (ion-paired) with the oligonucleotide, resulting in a positive change in cationic lipids.The charge interacts electrostatically with the negatively charged polynucleotide. Cation partElectrostatic interaction between the polynucleotide and the polynucleotideThe repulsion is likely to be reduced, and the polynucleotide (as seen in gel shift assays)Condenses into a smaller arrangement. The condensed cationic lipid / polynucleotide complex is subsequently treated with a polynucleotide.Acts as a scaffold or nucleus for assembly of the tide delivery vehicle. Must of structureBy physically incorporating the condensed polynucleotide as a subunit,The polynucleotide delivery vehicles described herein typically comprise the formulation /A more significant percentage of polynucleotides as compared to those obtained using the method.May be included. For example, using the methods disclosed herein, at least about 80The percentage of input polynucleotide is different when measured 48 hours after complex formation.It remains stably associated with delivery vehicles in various size ranges. Preferably, the biodegradable amphiphilic cationic lipid conjugate of the invention is biodegradable.Contains sexual components. Thus, the lipid moiety is where the lipid is biodegradable or biocompatible.Between about 3 and about 26, and preferably between about 12 and about 24 carbon atoms,Generally, hydrocarbon chains containing cholesterol and its derivatives and variantsMay contain any of a number of fatty acid chains (saturated or cis / trans unsaturated)You. The cationic component of the present invention may be monovalent, divalent, or preferably multivalent (ie,Polycationic). The cationic moiety is preferably biocompatible, And any of a variety of chemical groups that retain a positive charge at or near neutral pHWhich include amino groups, amide groups, amidine groups, positively chargedAmino acids (eg, lysine, arginine, and histidine), spermine,Lumidine, imidazole group, guanidinium group, or their derivativesHowever, the present invention is not limited to these. The cationic component generally comprises a cationic / phosphorus optimized for a given application.Combined with the polynucleotide at an acid ratio. Usually, the cation / phosphate ratio is aboutBetween 1 and about 20, often between about 5 and about 17, and preferably between about 6 and about 15Between. Thus, the charge ratio is determined by the number of positively charged groups contained on the cation,And depending on the size of the polynucleotide. Typically, the cation of the biodegradable amphiphilic cationic lipid conjugate of the inventionThe sexual and lipid components are described below or include, but are not limited to:Can be obtained from any of a variety of sources: 1995 edition of the Merck Index, BudavariEd., Merck and Company, Inc., Rahway, N.J., 1995 SIGMA chemical company catalogue, St. Louis, MO., 1995 Aldrich Biochemicals Catalog, or 1995 Ofatlz and Bauer catalogue. The cationic group is preferably formed by an ester bond or a phosphodiester bond.Can be attached to a lipid component, such as a lipase or phospholipase, etc.Fatty acids can be separated from cationic groups by the action of the enzyme (see FIG. 1).When). Such binding is likely to be associated with the currently available cationic lipids.Available now, attaches to lipids using ether linkages that contribute to vesicle damage2 shows an improvement of a synthetic cationic lipid. For example, FIG. 1 illustrates dioleoylphosphatidyl using a glutaryl linker.1 shows the chemical structure of a polyamine covalently linked to ethanolamine (DOPE). DOPE, Phospholipase A1, ATwo, C, and D. This is an acylThe use of existing synthetic cationic lipids that use ether linkages to attach the chainsProvide points. Ether bonds cannot be broken down by phospholipases and thereforeThe ether-linked acyl group accumulates in the cell membrane. DOSPA (Lipofectamine (Life Technology Inc., Gaithersburg, MD))Cationic lipids) and the cationic nature of DOGS (Transfectam (Promega))Lipid) contains spermine attached to diacyl ether linked glycerol. DOSPA and DOGS are theoretically biodegradable because they contain peptide bonds;However, no definitive data exists in the literature supporting this concept. further,Even when limited hydrolysis occurs, the resulting degradation products are still etherBound diacylglycerol. Another advantage of the biodegradable amphipathic lipids disclosed herein is that polyaminesIt is a method of attaching to the quality. Glycol linked to diacyl ether of DOSPA and DOGSSerol attaches to the center of spermine. New molecules are molecules by amide bondsAttach at the end of FIG. 3 shows the currently available monovalent and tetravalent cations.The general formula for many of the lipids is shown. In a particularly preferred embodiment, the biodegradable amphiphilic cationic lipid binders of the invention are used.The cationic and lipid portions of the coalescence are unstable (eg, biodegradable orpH-labile) covalently linked by a linker group. Unstable linkers are internal to cellsDissociates the lipid and cation moieties after immobilization and / or endosomal fusionEnables the production of a polynucleotide delivery vehicle comprising a cationic lipid. Lipid products can destabilize or disrupt endosomal membranes, resulting in cation / nucleotideLipid analogs can be manipulated to facilitate release of the metal complex into the cytoplasm. Lipid hydrolysates can be diacylglycerol, lys-phosphoryl, orAtidylethanolamine, monoacylglycerol, triglyceride, etc.Can get. One embodiment of the present invention is a pH labile linker molecule. This bond isBased on 2-methylmaleic anhydride, which forms an acid labile bond upon reaction with the amino group.Thus, the pH labile linkages modified as described above may be of the present invention pH sensitive / unstable.Used as a practical example of a qualitative covalent linker moiety (which may also include an ester bond)Can be For the purposes of the present invention, the term “amphiphilic” refers to at least one substantially polarRegion (ie, freely miscible with an aqueous solvent) and at least one fruitMolecules or molecules containing regions that are qualitatively nonpolar (ie, freely miscible in organic solvents)Refers to a compound. The term "biodegradable cationic lipid" refers toCationic lipids separate their amphiphilic molecules from their separate hydrophilic and hydrophobic components (And its metabolic by-products) or otherwise catabolic catabolismRefers to being able to participate in the metabolic or metabolic processes. The term "biocompatible"Does not show significant toxic or detrimental immunological effects at the intended doseMeans that. The term “pH sensitive” means that at least one covalent bond in a molecule isDestroyed by pH changes that are generally close to the pH that occurs after endosomal fusionMeans to get. The term "substantially toxic" refers to the therapeutic dosage of a given drug.May have adverse consequences that clearly exceed the intended therapeutic benefit of the drugMeans Other methods of biodegrading spermine or other cations to lipids are described inSomal proteases (including but not limited to thioproteases or cathepsins)Use a dipeptide linker that is susceptible to proteolytic cleavageIt includes doing. Another embodiment of the present invention relates to the above biodegradable under various storage and use conditions.Amphiphilic cationic lipid conjugates or currently available cationic lipid conjugates(E.g., lipofectin, lipofectamine, etc.)Remains stable (by maintaining transfection efficiency)A novel method of assembling a nucleotide delivery vehicle. The stable and synthetic polynucleotide delivery vehicles (SPDV) described above and below are SPDVThe polynucleotide delivered as a structural component of is physically incorporated. in this wayIn turn, the structure of the polynucleotide contributes to the structural features of SPDV. Typically, polynuWhen nucleotides are in the form of a plasmid, the DNA is generally a supercoiled loop.Or any of the relaxed rings, or mixtures thereof. The specific form isDNA gyrase, ligase, and topoiso to an extent that may be suitable for the applicationEnzymes such as merase alter the structure of the plasmid as deemed necessary.Can be used for Linear polynucleotides are preferred, and plasmids are linear.And optionally concatamerized prior to complex formation.) Is done. Single- and double-stranded polynucleotides also contain viral proteins, single-strandedSuitable polynucleotide binding proteins such as synthetic proteins, histone proteins, etc.It can be "pre-packaged" prior to lipid complex formation by the addition of protein. Polynucleotides of interest that can be delivered using the delivery vehicles of the present invention include:Polynucleotides associated with DNA, RNA, prokaryotic and eukaryotic virions (For example, retrovirus core particles, bacteriophage particles, adenovirus particlesOffspring, adeno-associated virus core particles), protein / DNA complexes,Integration for easy gene transfer and expression, for endosomal disruptionProteins; RNA / DNA complexes, and any and all derivatives andAnd variants, but are not limited thereto. Where DNA molecules should be deliveredTypically, this will include the gene of interest or a portion thereof, andFlanked by regulatory sequences that are spatially organized to optimize expression. Preferably, the polynucleotide to be delivered using the SPDV described hereinOtides are substantially pure (ie, contaminating proteins, lipids,Substantially free of saccharides and nucleic acids). For example, plasmid DNA is usedIf the preparation is generally phenol, or phenol: chloroform,Or a process that involves centrifugation (using CsCl etc.)Prepared by functional equivalent. Preferably, the DNA preparation is also treated with RNase.And subjected to multiple extractions and at least two ultracentrifugations. TypicallyA preparation of substantially pure nucleic acid will have at least about 80 percent of total nucleic acid,Typically at least about 90 percent, and preferably at least about 95 percentIs a preparation composed of the desired nucleic acid. In particular, the gene of interest can be inserted into a wide range of expression vectors, which are subsequently described herein.It can be delivered using the disclosed methods. The methods and compositions disclosed hereinSuitable vectors that can be used for delivery include herpes simplex virus vectors,Denovirus vector, adeno-associated virus vector, retrovirus vector, Pseudorabies virus, α-herpesvirus vector, etc.It is not limited to these. Suitable for modifying viral vectors, especially non-replicating cellsDetailed review of various viral vectors and related to expression of the polynucleotide of interestAnd how to use such vectors,Viral Vectors: Gene Therapy andNeuroscience Applications Caplitt and Loewy eds., Academic Press, San Diego (1995) can be found in the book. The methods and compositions of the present invention provideVector nucleic acids, or viruses, if applicableOr it is contemplated that it can be used to deliver subviral particles directly. As used herein, the term "expression" refers to transcription of a DNA of interest, as well asSplicing, processing, stabilization and, where appropriate, the corresponding mRNA transcriptMeaning, translation. Depending on the structure of the DNA molecule being delivered, expression may be transient orIt can be continuous. Many transcription promoters and enhancers can be used in the DNA of interest.These include the herpes simplex thymidine kinase promoter, the cytomegalovirusMotor / enhancer, SV40 promoter, and retroviral terminal repeatsSequence (LTR) promoter / enhancer, etc., and anyAnd variants, including but not limited to well-established molecular biology techniques.(Generally, Sambrook et al., (1989)Molecular Cloning Volume I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, andCurrent Protocols in Molecular Biology(1989) John Wiley & Sons, all volumes and their regularly updated volumes, which are incorporated herein by reference.Incorporated in). The promoter / enhancer region also enhances tissue-specific expression.Can be selected to provide. Specific DNAs of interest include, but are not limited to, sequences encoding:Not: various proteins, cytokines and growth factors (eg, G-CSF, GM-CSF, nerve growth factor (NGF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), interleukins 1-2 and 4-14, tumor necrosis factor-α (TNF-α), αOr γ-interferon, erythropoietin, etc.), cystic fibrosis transmembrane toneNodal protein (CFTR), tyrosine hydroxylase (TH), D-amino acid decarboxyLase, GTP cyclohydrolase, leptin, leptin receptor, factor VIIIAnd factor IX, tissue plasminogen activator (tPA). In addition, antisense, antigen, or aptomeric oligonucleotidesIt can be delivered using the SPDV described herein. Ribozyme, RNA-DNA highBrid, polynucleotide peptide-linked oligo (PNA), cyclic or linear RNA, circular single-stranded DNA. RNA of interest includes self-replicating RNA and the above genes that can be translated directly in the cytoplasm.The corresponding mRNA transcript, or catalytic RNA, such as "hammerhead" hairPins, hepatitis delta virus, and specific RNA sequences specifically in vivo and / orOr cleavable Group I introns. Targeting by catalytic RNASpecific objectives for RNA viruses and both cells and virusesTranscript. Alternatively, the antisense form of RNA, DNA, or a mixture of both,To inhibit the expression of a specific gene of interest, or a point mutation or other mutation (non-(Such as sense or missense) can be delivered to cells. A further embodiment of the present invention is a combination of SPDV with a larger polynucleotide.It is intended for the delivery of intercalated oligomeric nucleotides. Such a "carryA) The polynucleotide may be single-stranded (linear or circular) or substantially double-stranded.Possible and substantially homologous or in phase with the oligomeric nucleotide to be deliveredIt may further include one or more regions that are complementary. If desired, the DNA of interest is the D of interest already delivered by the delivery vehicle.Addition of suicide signal to enable control of eradication of cells that hide and express NAI can see it. For example, the thymidine kinase (tk) gene integrates into the delivered DNACan be rare. As a result, the exact amount of acyclovir, ganciclovir, orPhysician releases the tk gene by administering a conceptual or functional equivalent ofThe appearing cells can be killed. The method of the present invention for producing a stable polynucleotide delivery vehicle includesThe nucleotide contacts the amphiphilic cationic lipid conjugate, resulting in a cationicPolynucleotides are condensed by ion-pairing between the active moiety and the polynucleotideIt is possible to Typically, contact is appropriate to form lipid micelles.This is achieved by first dissolving the lipid components in a clean detergent. FatSuitable surfactants for dissolving the substance include cholic acid, deoxycholic acid, lauroylsaLucosine, octanoyl sucrose, CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl) -di-methylLamine] -2-hydroxyl-1-propane), novel β-D-glucopyranoside, lauriDimethylamine oxide, octyl glucoside, etc.Not limited. Preferably, the surfactant is non-ionic and has a high critical density.Has cell concentration (CMC). Polynucleotide micellar amphiphilic cationWhen added to a functional lipid conjugate, ion pairing occurs and polynucleotidesThe compound condenses as a complex with the amphiphilic cationic lipid conjugate. Ion-pair formation plays a role in the formation of stable lipid / polynucleotide complexesThe pH during complex formation then optimizes or stabilizes the interaction of certain components.Can be changed to For example, if a non-pH sensitive cationic lipid is used, A low pH of about 4 can be incorporated simultaneously with the polynucleotide.Suitable for conjugating otides (eg, RNA) or other chemical agentsobtain. In addition, polynucleotides (eg, DNA) are substantially susceptible to base hydrolysis.If not, the situation dictates that a pH of up to about 10 be used during complex formationI can do it. Generally, a pH in the range of about 5 to about 9 will result in complex formation and translocation.Used during sfection. Typically, many cationic condensing agents (eg, spermine or spermidine)) Precipitates the polynucleotide. However, condensation cationsBy carefully controlled addition to the otide (using an infusion pump, etc.)Higher concentrations of polynucleotide (eg, about 0.5 mg / ml) complex with condensing agentsIt becomes possible to do. In this way, the micelle-based cationic lipid condensing agentBy carefully controlling the addition of renucleotides, a cationic condensing agentA relatively high concentration of the polynucleotide can be complexed. After the initial complex formation, the detergent is slowly removed (ie, extensive dialysis) To assemble a stable polynucleotide delivery vehicle.And formation is possible. Slow dialysis remains the preferred method of detergent removal.But by increasing the relative volume of dialysis buffer, orFrom the solution, add the reagent to the buffer that binds and removes the detergent.This may facilitate removal of the surfactant. Alternatively, the polynucleotide is added with a cationic lipid and a surfactantIt can be previously dissolved in a solution containing the appropriate cation. . After the surfactant has been added,It is removed by dialysis in the presence of cations, and subsequently the cations areThus it can be removed. Suitable cations include any positively charged elementIs included. Cations can be monovalent, divalent, or multivalent. Suitable cationTypical examples of manganese, magnesium, sodium, calcium, rubidium, Zinc, molybdenum, nickel, iron, and the like.Absent. In general, cations aggregate during lipid and polynucleotide complexation.In an amount sufficient to prevent formation and almost maximum solubility of a given cationic compound.It is added to a concentration of degradable. Preferably, sodium (eg, sodium chloride) Is between about 0.1 molar and about 5 molar, and magnesium (eg,(Eg, magnesium chloride) concentration is between about 0.5 molar and about 5 molar;The concentration of manganese (eg, manganese chloride) is about 0.1 molar and about 4 molar.Between degrees. In addition, cation types and concentrations are used to assemble SPDVShould be adjusted depending on the type of surfactant or cationic lipidIt will be understood by those skilled in the art. The polynucleotide or oligonucleotide is notWhen complexed with a cationic lipid, the cationic lipid and / or surfactantIt may be added before, simultaneously with, or after the addition of thione. Generally, clickThe on lipid is between about 0.1: 1 and about 16.1: 1 and preferably between about 0.5: 1 and about 7: 1.Between about 0.7: 1 and about 2: 1 and, more particularly, about 1: 1.Polynucleotides or oligonucleotides with an on lipid-to-polynucleotide phosphate ratioAdded to leotide. The above ratios are provided by way of illustration and not limitation, andModified depending on the properties of the cationic lipid used to assemble SPDVCan be Also, any ratio depends on the DNA concentration. Cationic, polynucleotide or oligonucleotide, cationic (orAfter the other) lipids and surfactants are present in the environment, the surfactants are preferablyIs removed by dialysis in a cation-containing buffer. Surfactant removedLater, the cations can be subsequently removed by dialysis or functional equivalents. Preferably, dialysis is generally performed at a temperature between about 4 ° C and about 30 ° C, andTo a final cation concentration that is not detrimental to the intended use of the SPDV. For example, cationIs substantially removed, for example, by dialysis against a buffered solution suitable for parenteral administration.Can be done. After substantial removal of cations, the resulting SPDV was generally stored at about 4 ° C.If it remains stable for at least 2 weeks (ie retains transducing activity)). The polynucleotide may be complexed with the cation before or simultaneously with the addition of the cationic lipid.When coalesced (or otherwise pre-condensed), stable complexes are relatively lowA lipid: nucleic acid phosphate ratio can be formed (in the presence of a surfactant). Lower ratio fatThe use of a lipid allows a higher ratio of lipids to be incorporated into the complex,Less lipid is not incorporated into the final product. This feature isSuch non-lipid-incorporated forms are substantially toxic to target cellsIt is desirable if non-biodegradable lipids are used. Therefore, other implementations of the present inventionAn embodiment is an SPDV produced essentially as described above with reduced toxicity. DepartureFor the purposes of the present disclosure, reduction in toxicity means that SPDV containing at least about 10 μg DNA isIt means that it can be injected into animals without suffering dangerous toxic effects. An additional feature of complexing or pre-condensing nucleic acids with cations is thatThat is, higher concentrations of DNA can be used to form SPDV. An exampleFor example, 0.1 molar concentration of MnClTwoPresence of SPDV can be formed with DNA at a concentration of about 0.05 mg / mlTo Similarly, by increasing the concentration of the cation, the corresponding amountCan increase the concentration of DNA used to assemble SPDV (ie,2 molar MnClTwoMay allow SPDV formation at a concentration of about 1 mg / ml DNA). ApplyThe possible cations have relatively high solubility (ie NaCl saturates at about 5.5 molar)If the method of the present invention is carried out, the DNA (or otherIt is clear that this allows the formation of SPDV (renucleotide). Therefore,Another embodiment of the present invention is a preparation of SPDV formulated as described above, andThis is generally between about 0.05 mg / ml and about 10 mg / ml, preferably about 0.25 mg / ml.Between about 10 mg / ml, more preferably between about 0.5 mg / ml and about 1.5 mg / ml, and specificThen a DNA (or other nucleotide) at a concentration between about 0.8 mg / ml and 1.2 mg / mlIncluding. Thus, another embodiment of the present invention is directed to high concentrations of nucleic acids (ie,> 0.25 mg / ml nucleic acids). Intrinsic Stability of Polynucleotide Delivery Vehicle Produced by the Method of the InventionTherefore, targeting agents are used to direct the vehicle to specific cells and / or tissues.It can be stably incorporated into the vehicle. Therefore, before the removal of the surfactant or itsIn the interim, any of a variety of targeting agents may also be incorporated into the delivery vehicle. For purposes of the present disclosure, the term "targeting agent" may be incorporated into a delivery vehicle.Any or all ligands or ligand receptors. like thisLigands include antibodies such as IgM, IgG, IgA, IgD, or any portion thereofOr subsets, cellular factors, cell surface receptors, MHC or HLA markers,Ils envelope proteins, peptides or organelle ligands, their inductionBody, but are not limited thereto. If necessary, the ligand can be added prior to incorporation into the polynucleotide delivery vehicle.It can be derivatized to a suitable lipid moiety. For example, targeting agents (eg, immunoglobulin) First converts the leaving group to N-hydroxysuccinimide (NHS) and 1-ethyl3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC) or its thioThe use of zide, (EDC methiodide), and free amino groups on the targeting moleculeBy derivatization to a boxyl group, the free radical in the polar region of the amphipathic lipid isIt can be N-linked to the boxyl group. Alternatively, the targeting agent can be a delivery vehicle in appropriate conditions.Disul (using thioacetic acid, hydroxylamine, and EDTA)Can be sulfide-bonded or succinimidyl acetylthioacetateUsed with acids (eg, dioleyl phosphatidylethanolamine, DOPE)To form DOPE-thioacetate (ATA), which is hydroxylamineIt can be processed to produce a reduced molecule (DOPE-acetyl-SH). Release of targeting agentThe amino group reacts with succinimidylmaleimidophenylbutyrate (SMPB)Is bound to maleimidophenylbutyrate (MPB) by a peptide bondGenerate a target. The derivatized fatty acid is then combined with the target-MPB complexTo produce a targeting agent that is cross-linked to the fatty acid. Further, the targeting agent can be attached to the lipid by a biodegradable linkage as described above.(Peptide or dipeptide linkers, pH hydrolysable linkers, etc.). Alternatively, the targeting agent may also comprise a stable complex and a "targeted" cell or tissue.Can act as a bridge between For example, if the targeting agent simply associates with the complexThe agent can be added to the complex after complex formation or after isolation. Targeting agentTo the extent that it can or will be recognized by molecules on the cell surfaceAgent can effectively act as a bridging molecule that brings the complex into intimate contact with the cell surface. In particular, when hepatocytes are a suitable target for transfection where lipids are directed,Molecules such as fetuin can be shown to be useful. Hepatocytes are galactoAnd receptors. After treatment with neuraminidase, the fetuin has its surfaceIt is converted to asialofetuin, which presents many galactose residues above. SaFurthermore, both fetuin and asialofetuin are stable lipid / DNA complexesIt is known to associate with the body. As a molecule rich in acidic amino acids (aspartic acid and glutamic acid),Allofetuin probably associates with the cationic head group of the lipid complex. resultAsialofetuin-associated complex isTargeted to hepatocytes by the ketose residue. The observation that asialofetuin associates with a stable complex is also much moreHas the potential to reach. For example, asialofetuin is a drug of many conventional chemistryDerivatization with any of a wide variety of targeting ligands using any of the statistical methodsCan be done. For example, periodate contains at least the hydroxyl groups of galactose.Can also be used to convert some of the aldehydes to aldehydes,Reacts with a group to form a Schiff base, which is subsequently reacted with the addition of a targeting ligand.Can) be reduced with lithium aluminum hydride. Or this aldehydeCan react with hydrazide to attach a heterobifunctional cross-linking reagent (this isIs a sensitive targeting ligand). Both of the above strategies are asialofetiMany potential ways in which Winwin can be derivatized with virtually any targeting ligandIt is merely illustrative of the law and is intended to limit the invention in any wayShould not be. After ligand association, the derivatized asialofetuin is stable as described above.It can be associated with the complex. Virtually any ligand attached to asialofetuinAnd virtually any DNA can be packaged in a stable complex.Therefore, appropriately derivatized asialofetuin should be considered as a suitable stable complex.By making a deep fit, virtually any cell can copy virtually any gene.Can also be targeted for expression. Further, asialofetuin, or a functional equivalent thereof (vis-a-vis binding)) reacts with N-hydroxy-succinimidyl-oleate,Producing single or multiple acylated asialofetuin derivativesThis can be incorporated directly into the lipid complex. In addition, any of a wide range of fatty acid chainsCan also be linked to the ASF using this methodology. Typically, the complexAt least about 1 to about 20 acylated asialofetuin molecules are incorporatedAnd preferably incorporates from about 5 to about 12 molecules. In addition, other proteins that can also associate with stable cationic lipid / nucleic acid complexesAre likely to be identified or developed. Like asialofetuin, stableThe protein associated with the complex is appropriately derivatized with a targeting ligand, andIt can be used to direct stable complexes to specific cells and tissues. ThisThus, any of a variety of cells can be, for example, endothelial cells, line cells, epithelia,Cells, islet cells, neurons or neural tissue, mesothelial cells, osteocytes, chondrocytes, hematopoiesisCells, immune cells, major glands or organs (eg, lung, heart, stomach, pancreas, kidney, skinSkin cells), exocrine and / or endocrine cells. Proteins encoding various cell surface markers and receptors are of particular interestIt is a target. A brief list of examples of such proteins includes:Examples include: CDl (a-c), CD4, CD8-11 (a-c), CD15, CDw17, CD18, CD21-25,CD27, CD30-45 (R (O, A, and B)), CD46-48, CDw49 (b, d, f), CDw50, CD51, CD53-54, CDw60, CD61-64, CDw65, CD66-69, CDw70, CD71, CD73-74, CDw75, CD76-77, LAMP-1 and LAMP-2, and T cell receptor, integrin receptorProliferating endothelial endoglin, or antibodies thereto. For the purposes of this disclosure, a “stable” polynucleotide delivery vehicle will generally beThe polynucleotide transfection of the freshly prepared product after storage for 48 hoursAnd maintain a transfection efficiency of at least about 20% of the transfection efficiency.And preferably at least about 35% transfection efficiency after 48 hours.And in a particularly preferred embodiment, at least about 50 parts after 48 hours.Maintain cent transfection efficiency. Alternatively, the stable polynucleotide delivery vehicles described herein can beRemains stable and generally held in a liquid state for at least 48 hours.Between about 30 and about 200 nm, preferably between about 50 and about 150 nm, and preferablyIs the discrete size of the average particle size (according to Gaussian distribution) between about 70 and about 115 nmMaintain a range (discrete size range). Stable polynucleotide delivery vehicles of the present invention when it comes to stability in serumAccording to the prior art when they are exposed to serum concentrations of up to about 15 percent.Liposome formulations produced using synthetic cationic lipidsAre generally at least about two times more stable thanSerum stability in that it is about an order of magnitude more stable. The stability of the SPDV described herein can be increased by appropriate storage conditions. For example, SPDV can be frozen and stored indefinitely. Quick or slow (aboutAfter melting (at 4 ° C.), typically, SPDV is the transfer of freshly prepared samples.Retains a substantial, if not all, of the transaction efficiency. further,The SPDVs of the present invention also exhibit their original transfection after lyophilization and reconstitution.A substantial amount of efficiency (ie, at least about 50 percent). Increase long-term stability by freezing or lyophilizing SPDVIf so, suitable excipients can be added to the SPDV preparation before freezing. like thisExamples of suitable stabilizing excipients include monosaccharides or disaccharides (eg, glucose, sucrose).Polysaccharides, or any of a variety of well-known agents (eg, glycerol)., Rubber, dextran, etc.). Stable lipid / DNA complexes can aggregate. In particular, about 0.5, generally more than about 1.0And preferably with a lipid to DNA ratio of at least greater than about 3.0 to about 25.The stable complex formed is between room temperature and about 0 ° C, typically between about 15 ° C and about 1 ° C.And when held at a temperature of preferably about 4 ° C., forms loose aggregatesobtain. For the purposes of this disclosure, loose aggregates are aggregates that are easily dispersible in suspension.Is defined as If necessary, such aggregation can be performed by cryopreservation followed by thawing.(After about −20 ° C. or less). If aggregation is desired, the level of aggregationThe temperature can be adjusted by any of a number of means in addition to adjusting the temperature. An exampleFor example, the buffer / salt concentration can be adjusted to increase the amount of aggregation. further,A co-precipitate may be added, which forms a complex with the stable complex and further precipitatesIncrease the speed of the degree. Agglomeration can also be increased by the addition of a promoter.For example, if a targeting agent or receptor is incorporated into the complex, the appropriate lectinA ligand, ligand, or antibody can be added to crosslink the complex andIncrease the rate and extent of precipitation. If necessary, appropriate ligands or antibodies, or mixtures thereof,Support (ie, latex beads, microcarrier beads, membranes orFilter or a targeting receptor or ligand from solution.Can be used to selectively bind complexes incorporating Therefore, a stable compositeThe body can also be selectively removed from solution using this method. Alternatively, steps may be taken to remove excess unassociated lipid prior to dialysis.And thereby substantially detoxify the complex made with the non-biodegradable cationic lipid.obtain. For example, uncomplexed lipids are generally incorporated into surfactant solutions.Exists as a quality micelle. Thus, in the presence of surfactant, size exclusion chromatographyMatography shows that the larger stable complex (which probably dissolves at the void dose)To separate uncomplexed lipids (ie, toxic components) fromCan be used. Aggregated stable lipid / DNA complexes retain optimal transfection activityI do. In addition, the aggregated complexes are separated by centrifugation, which effectively forms a precipitate.And / or vacuum or simple evaporation, ultrafiltration, chromatographyIncluding but not limited to focusing, electrophoresis, column chromatography, etc.It can be concentrated by various standard techniques that are not specified. Aggregated complex after isolationConcentration by gently resuspending or diluting the complex in a suitable buffer.Can be adjusted. If the concentrated stable conjugate is intended for in vivo use, bufferWill be suitable for in vivo administration. Both net transfection activities as a net result of isolation and resuspensionA stable complex can be obtained that retains and conventionally produced lipid / DNAIncludes DNA concentrations that far exceed the amount of DNA that can normally be loaded into the complex. Currently, the sameTransient and stable complexes produced at very high DNA / lipid concentrations provide measurableLack transfection activity (due to high toxicity). The net effect of this limitation is that lipid-based trucks are typically manufactured conventionally.The relatively small amount of nucleic acid that can be introduced by theBlocking the application and use of a wide range of technologies. Therefore, this specificationThe ability to concentrate stable conjugates, as demonstrated in, represents yet another novel aspect of the present invention.You. Thus, a further embodiment of the present invention provides a measurable transfection activity.And contains at least about 10 μg of nucleic acid per ml up to about 10 mg / mlAnd a method for producing a stable lipid / nucleic acid complex. In addition to allowing the use and delivery of high concentrations of genetic material, aggregationAlso, are unique features of traditional lipid-mediated methods for delivery of nucleic acids to cells,This results in a dramatic reduction in toxicity. Non-biodegradable typically used in lipofectionSex cationic lipids are relatively toxic to cells. Therefore, the target cellsIt can tolerate only a limited concentration of thiogenic lipids. Cationic lipid / DNADuring complex formation, a significant portion of the input cationic lipid does not associate into the DNA complex.(Ie, does not promote DNA transfection). Complex formation is lipid / DIf related to a relatively fixed ratio of NA, a correspondingly fixed proportionUnincorporated lipids are present in any sample of lipid / DNA complexWill be. Increasing the amount of DNA provided to cells can also be caused by (toxic) lipids.The presence of unincorporated lipids increases the net quantity ofStrictly limit the amount of genetic material that can be provided. Thus, free associationSeparation of transfection activity (ie, lipid / DNA complex) from lipidsThe act essentially increases the net amount of nucleic acid that can be provided to the target cell. Toxicity studies using aggregated and resuspended stable complexes have shownIt shows that the majority always remains in the supernatant. Conversely, the resuspended aggregatesRetains the transfection activity of the bell, but forms at the corresponding lipid / DNA ratio.It exhibits much lower toxicity than the transient conjugate. Therefore, stable from suspensionRemoval of the complex allows transfection from a major source of cytotoxicity.Can be effectively isolated. Thus, another embodiment of the present invention relates to an isolatedA stable cationic lipid / nucleic acid complex that has similar lipid / nucleic acid ratios andAnd / or against transient or stable complexes formed at lipid / nucleic acid concentrations.It has qualitatively reduced toxicity. Similarly, another embodiment of the present invention provides a stable cation having substantially reduced toxicity.This is a method for producing a complex lipid / nucleic acid complex. For the purposes of this disclosure, the term "substantially"Reduced toxicity" generally means that the toxicity of the drug is less than that of the untreated drug.At least about 25 percent, preferably at least about 50 percent, andSuitably, a reduction of at least about 100 percent is achieved. ToxicityIt is also determined by determining the dose that is lethal to 50 percent of test subjects.Can be determined. Generally, the described substantially reduced toxicity stable polynucleotidesTide vehicles were isolated from similar cationic lipid / phosphate ratios.Twice the lethal dose of the stable complex (ie, LD50), And optimally reducedThe toxic vehicle is the corresponding non-isolated cationic lipid / polynucleotide.LD at least about one order of magnitude higher than otide mixtures50Having. Under the novel process described above, yet another embodiment of the present invention provides an amphiphilicIncluding a thionic lipid conjugate and / or a biodegradable cationic lipid conjugate as described aboveA stable polynucleotide delivery vehicle is described. Any or as appropriateVarious (ie, mixtures) other "helper" lipid moieties may also beIt can be added to a nucleotide delivery vehicle to change the chemical characteristics of the vehicle.Thus, any of a number of well-known phospholipids can be added, includingLuphosphatidyl-glycerol (DSPG), hydrogenated soybean oil (hydrogenated soy), Phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol, phosphatidic acid, eSphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylethanolAmines, sphingomyelin, mono, di, and triglycerol, ceramide,Cerebroside, phosphatidylglycerol (HSPG), dioleoyl-phosphaBut not limited to tidylcholine (DOPC), cardiolipin, etc.Absent. Additional lipid moieties include cholesterol, cholesterol esters, andAnd their other derivatives. Where appropriate, additional lipids and phospholipidsMay be positively or negatively charged, and the ratio of the various lipid moietiesCan be varied to provide an optimal charge ratio. In addition, any of a variety of stabilizers may be utilized with the described vehicle.obtain. The oxidation of the various components is carried out in accordance with the invention under an inert atmosphere such as nitrogen.Although it can be substantially reduced by preparing the ingredients, this is somewhat inconvenient,And is an expensive process, and therefore adds chemical antioxidantsIt is often preferred. Suitable pharmaceutically acceptable antioxidants include gallicPropyl citrate, butylated hydroxyanisole, butylated hydroxytoluene,Ascorbic acid or sodium ascorbate, DL- or D-α tocopherolAnd DL- or D-α tocopheryl acetate. If present, antioxidantThe agent may be present in the vehicle, for example, in an amount up to 0.1% (w / v), preferably 0.0001-0.05%.Alone or polynucleotide delivery, either before, during or after assemblyIt can be added in combination with a vehicle. From the point of view of the physician or the patient, undesired signs (eg signs related to the disease,Any mitigation or prevention of environmental or factor sensitivity, normal aging, etc. is desiredIt will be understood by those skilled in the art that Therefore, for the purposes of this application, it is used herein.The terms "treatment," "therapeutic use," or "medical use" as used herein are defined by the present invention.Refers to any and all uses of the composition, the composition of which is a disease state or indicationTo treat or otherwise treat the disease or other undesiredTo prevent, block, delay or reverse symptoms. When used for therapeutic treatment of disease, stable polynucleotide delivery vehicles (The appropriate dosage of SPDV) or its derivatives is any of several well-establishedCan be determined by methodology. For example, animal studies haveIt is commonly used to determine the maximum tolerated dose of a bioactive agent, or MTD. oneGenerally, at least one animal species tested is a mammal. Those skilled in the artAppropriately extrapolate dose for efficacy and avoidance of toxicity to other species, including. EffectPhase I trials in normal subjects will determine safe doses before humanHelp establish. The various biochemical components of the present invention are particularly preferred for in vivo use.Or highly pure and substantially free of potentially harmful contaminants (eg,At least the National Food (NF) clade, generally at leastAnalytical grade, and preferably at least medical grade). The specified compound is used.Such synthesis or subsequent purification should be performed if it must be synthesized before use.Substantially eliminate any potentially toxic drugs that could be used during synthesis or purification proceduresAre preferably produced. In addition, stable polynucleotide delivery vehicles (SPDVs) are alsoMethod to enhance in vivo stability and any of a variety of pharmacological propertiesCan be modified (eg, increase in vivo half-life, reduce toxicity [in vivoToxicity is DMRIE / DOPE (1: 1, mol: mol), DOSPA / DOPE (4: 1), or PC-cholesterolChol / DOPE (1: 1) has not been observed]). For example,Disteroylphosphatidylcholine (DSPC) / chol (2: 1) or sphingomHalf-life / toxicity using a simple long-circulating lipid composition such as Erin / chol (1: 1)Can be tested. Alternatively, synthetic polyethylene PC-chol / DOPE (1: 1) phospholipid orIs GM1Inclusion of gangliosides such asCan be used. Toxicity is due to the ester or sera binding the acyl chain to the cationic moiety.For joining an acyl chain to a biodegradable bond such as a mid or a cationic groupUse cationic lipids with carbamate, hydrazide, or anhydride linkagesBy doing so, it can be further reduced. When SPDV or its derivatives are intended for diagnostic, therapeutic or medical use, SPDV can be prepared and maintained under sterile conditions, thus avoiding microbial contamination.Due to the relatively small size and inherent stability of SPDV, compositions containing SPDV also, Can be filter sterilized before use. In addition to the above methods of sterile preparation and filter sterilization,Antimicrobial agents can also be added. Antimicrobial agents (this is typically about 3% w / v of total formulation, Preferably in an amount of about 0.5-2.5%) includes methyl paraben,Tylparaben, propylparaben, butylparaben, phenol, dehydroacetic acid, Phenylethyl alcohol, sodium benzoate, sorbic acid, thymol,Merosal, sodium dehydroacetate, benzyl alcohol, cresol, p-cLoro-m-cresol, chlorobutanol, phenylmercuric acetate, phenylborate waterSilver, phenylmercuric nitrate, and benzylalkonium chloride;It is not limited to them. Preferably, the antimicrobial additive enhances the biochemical properties of SPDVOrOr is inactive for SPDV activity. Prescribed antibacterial agent is SPDVIf it turns out to be detrimental to the activity, anotherCan be replaced by drugs. Compositions containing SPDV as an active ingredient can be prepared by any of a number of established methods.It can be introduced ex vivo. For example, the drug is by inhalation; by subcutaneous (sub-q) injectionBy intravenous (I.V.) injection, intraperitoneal (I.P.) injection, or muscleBy intra-oral (I.M.) injection; intra-rectally, topically applied drugs (transdermal patches, ointments (ointment), creams, ointments (salve), eye drops, etc.), orInjected directly into tissues such as tumors or other organs, or in or around internal organsCan be Another embodiment of the present invention involves the use of SPDV to perform gene therapy. ThisGene therapy, such as that, compensates for genetic deficiencies in the genome of the affected individual.Intended and can be brought about by ex vivo somatic gene therapy, therebyHost cells are removed from the body and transduced to express the defective gene.And re-implanted into the host. Alternatively, somatic gene therapy involvesBy injecting the vector directly into the individual in vivo,Thus, the gene is delivered and expressed by the host tissue. The polynucleotide delivery vehicles described above primarily deliver polynucleotides to cells.While intended to provide, a further embodiment of the present invention provides a polynucleotideIn addition to packaging and delivery of any of a variety of suitable bioactive agents.You. For example, a bioactive agent of interest (eg, any protein, peptide, organicSmall molecules) have a net negative charge or a substantial amount of negatively charged features.If present, use an established liposome formulation or lipid emulsion orThe assembly in a delivery vehicle constructed by a method substantially similar to that disclosed in the specification.To deliver such agents using embedded biodegradable amphiphilic lipidsMay prove useful. Further, the predetermined agent of interest may be a polynucleotide (eg, DNA and / or RDrug, if it can associate with a protein or other molecule with NA binding activity).Delivers drug to the body by first incorporating it into a renucleotide delivery vehicleMay be found useful. In addition, liposomes and lipid emulsions or microemulsionsIf found useful as a product delivery tool or as a cosmetic ingredient,The novel biodegradable amphiphilic lipids disclosed herein also provide lipid structures, membranes, andMay prove useful as emulsion stabilization, structural, or binding componentsYou. Typically, the biodegradable amphipathic lipid is added or added to an existing formulation.Charged component of the amphipathic lipid, which is either exchanged for the lipid component ofNew formulations can be constructed that further utilize If desired, one or more stabilizers and / or plasticizers may be used to increase storage stability.For qualification, it can be added to emulsion and liposome formulations. microEmulsions tend not to separate when allowed to stand under normal conditions, butSome degree of stability may be useful under some circumstances. Stabilizer and / orMaterials useful as plasticizers include simple hydrocarbons, including glucose., Galactose, sucrose, or lactose, dextrin, acacia,Carboxypolymethylene, and colloidal aluminum hydroxideIt is not limited to these. If stabilizers / plasticizers are added, these are all preparationsAbout 10% (w / v), preferably about 0.5 to 6.5%. Lipid formulations comprising the disclosed biodegradable amphiphilic cationic lipids (eg,Emulsions, microemulsions, liposomes, or delivery vehicles)Also, the encapsulated bioactive agent can be significantly protected from the digestive process. ThisAs such, the formulation may also prove useful for oral administration of a bioactive agent. If further protection of the intestine is desired, entericIs a solid or liquid formulation according to the invention, otherwise in other protected formIt is possible to prescribe For liquid formulations, these are medium chain trigs.Can be mixed with a protective agent, such as a liquid mixture ofOr these are enteric coated capsules (eg, soft orOf hard gelatin, these are themselves made more enteric if necessary).Can be packed. Alternatively, solid formulations can be processed more flexibly. These are tabletsCan be coated with enteric material to form an agent or filled into enteric capsulesCan be either. The thickness of the enteric coating on tablets or capsules is, for example, 0.5-4The exact thickness can be determined by one skilled in the art of formulation, although it can be as thick as RON. EntericGranules (the particle size of which can be, for example, 0.5-2 mm) are coatedCan be coated on their own without being mixed into tablets. Similarly,Microcapsules can be made enteric. Enteric coating is an orally administrable pharmaceuticalA typical formulation may include any of the enteric agents conventionally utilized. Proper enteric coatingIs described, for example, in "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15th edition, 161.4-1615 (1975); 2nd edition, pages 116-117, 371-374 (1976); and "Hagars Handbuch der Pharmazeutischen Praxie ", 4th edition, volume 7a (Springer Verlag 1971), Pages 739-742 and 776-778. Examples of suitable enteric substances include cellulose acetyl phthalate, hydroxyPropyl methylcellulose phthalate (HPMC-P), benzophenyl salicylate,Cellulose acetosuccinate, styrene and maleic acid copolymer, formulationGelatin (formulated gelatin), keratin, stearic acid, myristinAcid, polyethylene glycol, shellac, gluten, acrylic acid and methacrylateLylic acid resins and copolymers of maleic and phthalic acid derivativesYou. Enteric substance (s) include dichloromethane, ethanol and water,Solvents such as cellulose phthalate or polyvinyl acetate phthalateCan be dissolved. HPMC-P, polyethylene glycol 6000 as enteric coating,Alternatively, it is preferable to use shellac. Decomposition or disappearance at pH 5.5 (thisIs a proprietary preparation of HPMC-P, which is encountered at the human pylorus under the trademark HP5-5It is available and this is particularly preferred. The term "biologically active substance" includes, in particular, pharmaceutically active proteinaceous substances,And pharmaceutically active organic molecules. Protein substances are pure proteinsOr glycoproteins contain both proteins and sugar residues.As such, it may include proteins. This substance is used to treat or prevent a disease or its symptoms.May be useful in human or veterinary medicine, or cosmeticallyOr it may be diagnostically useful. Proteinaceous organisms that can be used according to the present inventionExamples of biologicals include insulin, calcitonin, and growth hormone.Protein hormones (of human or animal origin or semi-synthetic or total synthetic)Erythropoietin, plasminogen activatorBeta and their precursors (eg, tPA, urokinase, prourokinase)And interferon containing human interferon alphaIncluding IL-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, and IL-12-Leukin, and blood factors including factor VIII, but not limited toNot done. In any case, if they are biodegradable, the biodegradable disclosed in the present inventionAmphiphilic cationic lipids and polynucleotides produced therewithVehicle is a synthetic cationic lipid facing polynucleotide currently available for cells.It shows a significant improvement over code delivery. Because the by-products of the decomposition reaction are virtually non-toxicOr biocompatible in nature. As described above, the present invention is developed.The indicated biodegradable amphiphilic cationic lipids are used in vitro as well as in vivo.Useful for delivery of polynucleotides to cells at the same time. Another embodiment of the present invention is directed to a method for replacing the cationic groups disclosed herein with otherAmphiphilic cationic lipid component for attaching biocompatible or groups to the lipid moietyUse of pH-sensitive or otherwise biodegradable linker moieties compatible with offspringIt is. For example, the targeted or bioactive proteins described above can be functionally attracted to lipids.It can be conducted and released into cells after endocytosis. Or, A biocompatible anionic group can also be added to a positively charged bioactive agent or polymer.Attached to lipids to facilitate complexation or encapsulation in lipidic structuresCan be The following examples are provided to illustrate the invention. At the level of those skilled in the artIf so, it may cause insubstantial differences from the specifically described features of the invention.Alternatively, one can expect to modify any of the following disclosures. Thus, the followingThe examples are provided by way of illustration and are included for purposes of limiting the invention.Absent. 6.0.Example 6.1.Method for producing biodegradable cationic lipid conjugate The biodegradable cationic lipid shown in FIG. 1 (a) was synthesized as follows:Test tube with 10 μmol of N-glutaryl-DOPE (Avanti Polar Lipids, AL) in loformWas added. Chloroform is removed by evaporation under nitrogen, and the lipid membrane is removed.Obtained. Residual chloroform was removed by reduced pressure. Hydrate this membrane in water, andSonicate to form liposomes about 80 nm in diameter. 5 in 50 mM MES (pH 6.2)4-fold molar excess of N-hydroxysuccinimide and 50 mM MES (pH 6.2)An excess of EDC was added to NG-DOPE and incubated at room temperature for 20 minutes.After extraction of the lipid mixture, a thin layer using chloroform / methanol / water (65/25/4)Chromatographic analysis was performed. This is all about N-G-DOPE under these conditions.Convert to N-hydroxysuccinimide-NG-DOPE. Reaction mixtureContains Sephadex G-25 superfine equilibrated with 10 mM Hepes (pH 8.5).Unreacted EDC, NHS, and MES are removed by adding to a 3 ml spin column.Was. Dissolve liposomes in 1% octyl glucoside and 5 times polyamineAll NHS-N-G-DOPE was consumed by addition to lipids to molar excess. Reaction at 4 ° CI went there in the evening. The lipid product is dialyzed against water, detergent, buffer and unreactedThe lamine was removed. This lipid product is then dissolved in 1% octyl glucoside.And essentially the same as those used for lipofectamine / DNA complex formation below.Can be added to the DNA using the same protocol. A biodegradable lipid (N-succinyl-DOPE (NPentaethylene hex bonded to S-DOPE) or N-glutaryl-DOPE (NG-DOPE)Samin (PEHA), or PEHA bound to DOSG via an amide bond) at pH 6.5 to about 8NS-DOPE, NG-DOPE, or DOSG (prepared by treatment with EDC) at room temperature for 120 min.By reacting any N-hydroxysuccinimidyl ester with PEHAPrepared. Alternatively, spermine can be coupled to DOPE with a heterobifunctional crosslinker as follows:Can be combined. DOPE is derivatized with SMBP and terminal maleimide is added to the head group (DOPE-MPB).Cause. Reacts spermine with succinimidyl-acetyl-thioacetateTo give spermine with a protected thiol. Thereafter, the protecting group isDOPE-MOB is reacted with the thiol group of spermine to remove DOPE-MOB.-Produces BPM-S-spermine. By using this scheme, the DOPE group becomesRemains sensitive to phospholipase hydrolysis, thus releasing lipids from DNAYou. Another approach is to use SPDP (succinimidyl-pyridyldithiopropione).(Pyridylyldithiopropionate)) with DOPE to form DOPE-PDP.And After reduction of DOPE-PDP with DTT, an exposed thiol group is formed. Then DOPThe thiol group of E is reacted with the free thiol group of the modified spermine molecule described above to form DOP.Produces E-S-S-spermine (DOPE bound to spermine by disulfide bond)I can make it. Disulfide binding is a target molecule that effectively releases DNA from lipids.Sensitive to reduction by vesicles. FIG. 2 shows three strategies for synthesizing pH-labile cationic lipids. With regard to Synthesis 1, Blattler, W.A. et al.Synthetic, referring to Functional Protein Crosslinking Reagent, Biochemistry 1985, 24, 1517-1524With respect to 3, early in mammals with lipopolyamine-coated DNA, Behr, J.P. et al.Effective gene transfer to endocrine cells, Proceedings from the National Academyof Sciences (USA), 1989, 86, 6982-6986. These disclosures are incorporated herein by reference.Incorporated as a reference in the book. In addition, DOPE can be reacted with iminothiolane to produce thiolated lipids.You. Polyamines such as spermine can be reacted with iminothiolane as well. YoBy adding the derivatized spermine and lipid together in the presence of iodine,A polyamine lipid bound by the field is obtained. 6.2.Method of making a stable delivery vehicle 6.2.1.reagent Lipofectamine purchased from Life Technology Inc, Gaithersburg, MD.Octyl glucoside was purchased from SIGMA Chemical Co., St. Louis, purchased from MO. β-7.3 kilobase double-stranded closed circular DNA containing the galactosidase gene (pCMVβ,Clontech, Palo Alto, California), grown in bacteria and Quiagen MaxIsolated using the iPrep Isolation kit. Purchased from BioRad, Sunnyvale, CALPS was removed by adsorption using a polymyxin B agarose column. 6.2.2.Protocol for the formulation of stable DNA / lipid complexes The following amount of lipofectamine (DOSPA) was added to 1% octyl glucoside, 10 mMSolubilized in TRIS (pH 7.4) and added to 5 μg DNA (pCMVβ) in a total volume of 0.5 ml: 4.5 μl, 9 μl, 22.5 μl, 45 μl and 90 μl. Sample at 4 ° C with 5% glueThe course was dialyzed against 10 mM TRIS (pH 7.5). Dialysis buffer over 48 hoursReplaced five times. The resulting polynucleotide delivery vehicle can be used as described below., Particle size and transfection efficiency. Using a similar method, the cationic lipids DOTAP and DC-CHOL (3-β- (n- (N ′, N′-Dimethylaminoethane) carbamoyl) cholesterol)Obtained. 6.3.Particle size analysis Particle size analysis was performed using a Leeds and Northrop laser dynamic light scatterer (laser dynamic light scattering instrument). LipofectamineHavingTransientCharacterization of lipid / DNA complexes (eg, prior art)The starting size of the soma was shown to be about 50 nm in diameter. By adding DNA,The noise increased to 100 nm. As shown in FIG. 4, storage of these complexes over time, A decrease in 100 nm particles and an increase in larger particles (d> 1 μm).TransientofPreservation of the lipid / DNA complex resulted in reduced gene expression. To the contrary, disclosed hereinStableParticle size analysis of lipid / DNA complexShowed a very exact population of particles of about 100 nm. This same size particle produces 48Observed predominantly after hours. 14 days later, particle analysis showed that the dominant particle size was 100 nmAs well as a low proportion of larger particles (about 1 μm).Figure5). The fact that the rate of increase in particle size correlates with the rate of decrease in gene expression is two parameters.Strongly suggest a direct relationship between 6.4.Cell transfection with stable DNA / lipid complexes Lipofectamine includes cationic lipids abbreviated in DOSPA. This lipid isConsists of spermine derivatized with an alkyl ether. TransfectionWere tested for the ratio of DOSPA to DNA phosphate. Stable lipid complex in serum-free medium, DMEM, and NIH-3T3 cells. Cells with lipid / DNA complexIncubated for 3 hours. This medium was removed and replaced with complete medium. Incubation was continued for 48 hours. Cells are lysed in 0.1 ml lysis buffer (0.1% TX-1).00) and 0.040 ml of cell lysate was added to 0.05 ml of 2 times concentration of β-galactoEnzyme activity was measured by mixing with a sidase substrate. Level of β-galactosidase expressionWas measured for both stable and transient complexes. The following experimentwent. 6.4.1.Gene expression DOSPA consists of spermine derivatized with a diacyl ether. TroffDuring the measurement of injection efficiency, the ratio of spermine to DNA phosphate is between 0.5: 1 and 10: 1 (mol / mol). Immediately before addition to the cells, a stable complex of DNATransfections consist of a transient addition consisting of adding lipid and DNA together.Compared to that of the complex. NIH-3T3 cells were cultured in serum-free medium at 37 ° C for 3-4Incubated with cells for hours. Replace the medium with complete medium and inkThe incubation lasted 24 hours. Harvest cells and use β-galactosidase activityLysates were analyzed for sex. The results are shown in FIG. 6, which shows that the stable complex (solid line), Left panel) has the same level of gene expression as the transient complex (solid line, right panel).Indicates that Second, the optimal ratio of spermine to DNA phosphate is the same for both complexes.(About 2.5). Toxicity is higher at higher ratios of spermine to DNA phosphate (5~ 10: 1) for both stable and transient complexesWas done. For this reason, DNA was reduced to 0.2 μg per well and tested at the same ratio.Was. This resulted in a decrease in the amount of lipid added to the cells. Due to the reduction in the amount of DNA provided, the optimal ratio of spermine to DNA phosphate is in both cases.Toxicity level increased to 2.5 to 10 for composts (determined by cell morphology)Has substantially decreased. The notable difference is that the level of gene expression changes in stable complexesNo (FIG. 6, dotted line, left panel), whereas transient complex expression was 5 min(FIG. 6, dotted line, right panel). The above resultsThe ratio of protein to DNA phosphate was maintained at 10 and the amount of DNA used for complex formation was varied.Enlarged by FIG. 7 shows the results. In FIG. 7, β-galactosidase activity is shown on a log scale on the Y axis, andThe DNA input is shown on the X-axis. The lowest dose of DNA used is only inherited by the stable complexShowed offspring expression. For higher doses, the stable complex may be 5 times less than the transient complex.Produces ~ 10 times higher levels of gene expression (and transfection efficiency)That was shown. 6.4.2.Stability test The advantages of a stable complex over a transient complexEfficiency was further demonstrated in comparative studies correlating efficiency with storage time at 4 ° C. thesePrepare the complex at the same time and use the same cell transfection protocol as above.For transfection of NIH-3T3 cells at the times indicated on the X-axis.Was. The results are shown in FIG. Transient complexes are converted to β-galactosidase after 24 hoursA dramatic decrease in the activity was observed, and no expression was observed after 48 hours. This andConversely, the stable complex is the activity observed with the newly generated transient complex.Shows a level of activity after 48 hours that is equivalent to the sex level (to form a stable complexRequires 48 hours of dialysis, so the first time point is 48 hours), after storage for 14 daysA maximum transfection efficiency of 50% was still maintained. These data areNo effort to optimize storage conditions to minimize loss of transfection efficiencyCollected in. Therefore, results are obtained with SPDV compared to transient complexes.Represents the minimum level of stability gain obtained. Long-term stability studies were performed using a stable complex consisting of a DOSPA / DNA ratio of 6.6.Aliquots of stable complex at 20 ° C in the presence or absence of 5% dextroseStored below at -20 ° C, at 4 ° C, at room temperature, and at 37 ° C for up to 90 days. StabilityThe transfection efficiency of the coalescence was assessed by assaying. Figure the result8 (b). FIG. 8 (b) shows -20 ° C. in the presence of 4 ° C. and 5% dextrose.Both stable complexes stored at ℃ C for at least 90 days or when stored frozenRetains substantially 100% initial transfection activity for at least 270 daysIndicates that A stable complex stored at -20 ° C in the absence of dextrose,The transfection activity, which loses activity continuously with the passage of time, is the initial 5The stable conjugate, which was reduced by a factor of 1 and stored at 37 ° C., was essentially all after 14 days.Loss transfection activity. Conversely, only 24 transient complexesAfter time essentially all activity has been lost. Lyophilization under 5% dextrose storage conditionsComplete retention of activity when resuspended in a volume 0.1 to 1 times the initial volume.(Ie, can be concentrated at least 10-fold). 6.4.3.Proof of serum stability An additional problem associated with transient cationic lipid / DNA complexes is due to serum components.Inactivation. To avoid serum inactivation, transfectionCurrent methods involve incubating cationic lipid / DNA complexes in cells in serum-free medium.It is necessary to This is a transient cationic lipid / DNA complex in vivoIt is a problem that greatly hinders the use of the body. Because of this, transfectionSerum stability was tested. Serum to both stable and transient complexesTested at 0-15%. For these tests, 0.2 μg DNA was used and spermThe ratio of protein to DNA phosphate was maintained at 10: 1. FIG. 9 shows the results. Transient complexes areTransfection of stable conjugate with marked decrease in activity at 2% serumEfficiency hardly decreased at all serum concentrations used. Subsequent X-gal stainingStudies show that about 10% of exposed cells express β-gal at serum concentrations in the test rangeWas. From the above data, 1) DNA / cationic that remains stable for at least 14 daysFormation of lipid complexes, 2) Transfection efficiency of stable complexes is currently unknown.Greater than the transfection efficiency of the transient complex3) Stable complexes are more inactive in serum components than transient complexesIt is less sensitive to sexual development. 6.5.Isolation and enrichment of stable cationic lipid / DNA complexes Stable polynucleotide delivery vehicles are described above at 3.3, 6.6, andIt was formed using a ratio of lipid to DNA phosphate of 16.5. The complex is DOSPA and especiallyΒ-galact under transcriptional control of cytomegalovirus (CMV) promoter (pCMVβ)Includes a 7.3 kb plasmid code encoding the tosidase gene. Vehicle / complex at -20 ° C and 4 ° C in the presence of dextrose (5%)saved. After 90 days of storage, all samples are essentially all initial transfections.The efficiency of the application was maintained. Samples kept at 4 ° C. during storage accumulated sediment. The precipitate was separated from the solution by centrifugation at 3,000 g for 15 minutes at 4 ° C.The pellet was resuspended in 10 mM Tris. The resuspended precipitate, supernatant, and starting mixThe compound was tested for transfection activity in 3T3 cells. FIG. 10 shows the results of the transfection experiment. Figure 10 shows that most transformersIf the protein forms a complex with a DOSPA / DNA ratio of 3.3, it remains in the supernatant;Approximately 90% transfection activity was achieved at DOSPA / DNA ratios of 6.6 and 16.5.Indicates that the sample was distributed to the pellets. Lipid content in the ratio of 6.6 and 16.5The analysis showed a slight difference in the DOSPA / DOPE ratio and about 10% of the total lipidsHowever, 90% of the input lipid remained in the supernatant. In addition, the supernatant andFurther analysis of the enriched conjugate using thin layer chromatography (TLC)Both the supernatant and the pellet (complex) contained the same DOPE to DOSPA ratio. ThisThese data further confirmed that most lipids remained in the supernatant. The pellet resulting from the formulation having a lipid / DNA phosphate ratio of greater than about 6 is converted to the original volume.When resuspended in 1 / 50th the volume, the concentrated composition is substantially more effective than the corresponding unconcentrated formulationShowed high (up to several times) transfection efficiency. Higher level tigerThe reason for the transfection is probably due to the removal of uncomplexed lipids. Shown in FIG.As such, uncomplexed lipids are often associated with non-biodegradable cationic lipids.It is a major cause of the observed toxicity. Therefore, isolation of active ingredients from toxic ingredientsWith this, additional DNA can be added to the target cells, which results in gene transfer.Increase volume. The importance of this observation is that DNA enrichment is approximately equal to the DNAUnconcentrated complex made with the product does not actually show transfection activity.That is. Since the optimal ratio of lipid to DNA is relatively constant, DNAIncreasing concentrations requires increasing lipid concentrations in proportionate amounts. However, non-biodegradable cationic lipids are often highly toxic to cells.During transfection, cells are given only a limited amount of toxic lipids.obtain. Therefore, using the previous method of forming lipid / DNA complexes,Generally limited the amount of DNA that could be given to target cells. Similarly, cellsThe small amount of DNA that can be provided increases the transfection efficiency of lipid-based DNA delivery systems.Restricted. 6.6.The isolated stable cationic lipid / DNA complex shows low toxicity. Although the enriched complexes contain many-fold increased amounts of DNA, they have a corresponding increase in toxicity.Did not show large. In fact, the enriched complex made with a lipid / DNA phosphate ratio of 15.625, 4 times higher than enriched and isolated complexes made with a DOSPA / DNA ratio of 6.25Sfection activity occurred and little or no cytotoxicity was identified.Conversely, unconcentrated conjugates made at a ratio of 15.625 willFunctionally inactive. Because of the details associated with increased lipid concentrationsThis is because the vesicle toxicity is at a high level. Generally, cells treated with either a transient or stable complexViability decreases when the concentration of DNA added to the cells is increased to 1 μg / ml.Was. This amount killed essentially all of the treated cells. Conversely, isolation andAnd resuspension complexes are almost toxic when used to deliver 1 μg / ml DNA.It did not cause sex and at the DNA concentration of 10 μg / ml there was only slight toxicity. Obviously, isolating and concentrating a stable complex, DNA that can be given to cellsIncrease the net amount of the active complex and to separate the active complex from major sources of cytotoxicity.Both increase transfection efficiency. Supernatant and concentration complexSubsequent toxicity profiles of the body indicated that most of the toxicity remained in the supernatant. Furthermore, LD of various fractions50If a cytotoxicity test was performed to compare theThe expected lethal dose of (eg, the pellet) will be either starting mixture or supernatant.Was found to be somewhat higher than When the ratio of lipid to DNA in the concentrated complex was measured,The quality ratio increases substantially after the lipid to DNA ratio increases to about 10 or more.Did not. Therefore, the 7.3 kb plasmid used in the test had a lipid / DNA ratio of about 10And it can be concluded that it is saturated. This measurement data is generally suitable for other nucleic acids.And the consideration of such data implies that lipid / DNA complexThe disclosed method of substantially detoxifying the body may be further facilitated. 6.7.Use of polynucleotide delivery vehicles in vivo SPDV was formulated in the presence of 5 mol% lactosyl cerebroside and was administered to mice statically.Intravenous injection. 48 hours after injection, total cellular DNA was removed from various tissues andScreen for plasmid DNA being delivered to host tissue using Southern analysis.Learning. The data shows that the polynucleotide complexed with SPDV is sent to the cell.Amount of DNA reached and detected, increasing the DOSPA / DNA phosphate ratio (up to 20: 1)It is shown that it increased with the time. Furthermore, SPDV containing DNA encoding β-galactosidase was added to the brain of a living mouse.Injected. Subsequent histological examination performed 72 hours after injection showed thatβ-galactosidase activity was detected (β-galactosidase was detected along the course of the control injection).Cuctosidase activity was not detected). These data are what SPDV actually combinesConsistent with the conclusion that the integrated DNA is delivered to brain tissue and then expressed in vivo.6.8.Comparison of DNA transduction activity of stable and transient lipid / DNA complexes Stable and transient complexes were converted to DOSPA (mol / mol) and 0.1 μg / well (FIGS. 11A and 11E), 0.2 μg / well (FIG.11B and 11F), 0.4 μg / well (FIGS. 11C and 11G), and 0.8 μg / well (FIG.Different DNA concentrations of 11D and 11H) formed essentially as described above. β-galaCustosidase activity (filled circles) is plotted on the left y-axis and recovered from cell lysatesAnd plotted on the right y-axis as compared to total cell protein (open circles). In particular, FIG. 11 shows that DNA concentration was increased in both transient and stable complexes., Generally indicates increased β-gal expression.6.9.Stable cationic lipid / DNA delivery to human endothelial cells using peptide ligandsVitro targeting of delivery vehicles The targeting ligand was a cyclic RGD peptide having the following sequence: This RGD peptide has, in particular, αvβδBinds to integrin receptor. ThisIntegrins are expressed on endothelial cells and are capable of binding vitronectin.Noh. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) as in vitro tissue culture assay systemUsed. These cells not only express the vitronectin receptor,Extremely resistant to standard DNA transfection techniques. For this reason,Expression by non-specific targeting is low, thus increasing the signal to noise ratioGreat. The DNA transfection vehicle was assembled as follows. Strategies for inducing SV101 with targeting ligands include first ligandTo the lipids and then the surfactant / cationic lipid mixed micelles before adding DNA.It is necessary to incorporate into. To achieve this, Avanti Polar Lipid, BiN-glutaryldioleoylphosphatidylethanol purchased from rmingham, ALThe terminal carboxyl group of the amine (G-DOPE) is replaced with a molar excess of 1, ethyl-3- (3-dimethylAminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHBy reacting S) with lipids, N-hydroxysuccinimide-activatedConverted to tell. In this reaction, 10 μmol of G-DOPE was first added to CHClThreeA test tube containingWas performed. Solvent is N to form lipid membraneTwoBy evaporation belowAnd the residual solvent was removed by drying. The lipid membrane is hydrated in water, vortexed into a suspension, and placed in a strong bath.) Ultrasonicated for 10 minutes in an ultrasonicator. A 5-fold excess of EDC and NHS was added to 50 mMAdded to liposomes in ES, pH 6.0. Incubate the reaction at room temperature for 20 minutesWas. 5 ml Sephadex G-25 spin column equilibrated with 10 mM Hepes, pH 8.5And centrifuged at 2,000 RPM for 3 minutes. Collect NHS-G-DOPE in the eluate, 2μmol lipids were dissolved in 1.0% octyl glucoside. 5 times molar excess of RGB peptiWas added to the dissolved lipids and the reaction was incubated at 4 ° C. overnight. Lipid / ligand reaction mixture was purchased from LTI, Gaithersburg, MD.Tamine was added at 5, 10, and 20 mole percent of total lipids. Add octyl glucoside,The final octyl glucoside concentration was 1%. DNA was added to 1, 2.5, 5, 10, 15, andAnd a DOSPA / DNA phosphate ratio of 20 and 20 were added to the dissolved lipid mixture. 28% lipid / DNA mixturePlace in the GIBCO dialysis flow chamber and 4 liters of 5% dextroDialysis was performed for 48 hours against glucose, 10 mM Tris, pH 7.2. HUVECs 1.5 × 10 per well in 35 mm dishes 24 hours before DNA additionFiveCellularPlated at density. 1 μg of DNA was added to each well of serum-free medium and incubated at 37 ° C.For 4 hours with the cells. Remove lipid / DNA complex by suctionAnd replaced with complete medium. 100 μl lysis buffer (0.1% Triton X-100 andTwenty-four hours after the addition of 250 mM Tris, pH 8.0), the cells were harvested. 50 μl cell lysateIs mixed with 50 μl of β-galactosidase substrate (ONPG) andAssayed for protease activity. The results are shown in FIG. The Y-axis in FIG. 12 is the level of expression observed (measured by β-galactosidase activity).) And the X-axis shows the ratio of spermine to DNA. DOSPA is notConsists of diamine glycerol derived from lumines. Therefore, DNA phosphate andThe ratio of permin represents the ratio of DOSPA to DNA phosphate. Each line is lipid-derivedRepresents the mole% increase of peptide (lipid associated ligand). Open circles indicate liposome in serum-free mediumA transient complex formed by adding DNA to pectamine,And the transient complex is immediately applied to the cells. Against the tested DNA phosphateNo β-galactosidase activity was observed at any spermine ratio. Black diamonds show some gene expression at a ratio of 10, but low levels of expressionA stable cationic lipid / DNA complex that was shown to be slightly less than 2 millimetersRepresent. 5 and 10 mol% (targeted peptide-bound lipid / total lipid) are black invertedIt is represented by a triangle and a black square (box). All have the same spermine / phosphate ratio, 10It showed the same level of expression, which was twice as high as the non-peptide formulation. 20 molThe% graph is represented by an upward black triangle. This formulation contains 1 at a spermine / phosphate ratio of 10The maximum level of gene expression, which was 0 millimeters, is shown. These results areStrong between current increase level and increase in mole% of lipid associated ligand in complexThe correlation is clearly shown, suggesting that effective targeting has been achieved. 6.10.Targeted test with lactosyl cerebroside and fetuin As noted above, the inherent stability of the lipid / DNA complexes disclosed in the present invention allows forOften, the manipulation required to associate the targeting agent with the complex is possible. An exampleFor example, a stable complex containing 10 mol% lactosyl cerebroside was formed. ThisAs a result, a complex showing a galactose residue was obtained. Garak on the surface of the complexThe presence of toose is in hepatocytes (hepatocytes express the galactose surface receptor)Desirable when targeting is required. Alternatively, protein fetuin can be used. NeuraminidaseAfter treatment with (resolving sialic acid), asialofetuin is obtained. ReedAllofetuin is known to associate with hepatocyte galactose receptorYou. Stable complex containing 125 μg asialofetuin and 0.2 μg DNA in 0.5 mlAnd asialofetuin (precipitated and concentrated stable complex) at 4 ° C for 18 hoursWhile incubating together, pre-incubate with asialofetuin.15-fold increase in hepatocyte transfection relative to stable unconjugated complexGreat. 6.11.In vivo expression of genes transfected with concentrated lipid / DNA complexes Using a concentrated and detoxified stable lipid / DNA complex containing about 10 μg of DNA,The β-galactosidase gene was introduced into mice in vivo. Complex intravenous (Or intramuscularly) after administration, the mice are still viable, are sacrificed andBy the time it was analyzed for in vivo gene expression, it was clearly healthy. The oppositeIn addition, mice injected with 10 μg of DNA in transient complexes generally have significant internal organsDamaged and almost non-viable. All publications and patents mentioned in the above specification are herein incorporated by reference.Is done. Various modifications and alterations of the described method and system of the present inventionWill be apparent to those skilled in the art without departing from the scope and spirit of the invention. BookThe invention has been described with particularly preferred embodiments, butThe invention as described should not be unduly limited to such specific embodiments.Should be understood. Of course, in the field of molecular biology or related fields,Various modifications of the above described modes for carrying out the invention which are obvious to those skilled in the art are set forth below.It is intended to be within the scope of the following claims. 6.12.Alternative methods for forming stable SPDV with reduced toxicity Plasmid SSV9-MD2-APM (see FIG. 13) was replaced with 0.5 mg / ml DNA, 1 M MgClTwo,andComplex with DOSPA / DOPE (1: 1 mol / mol) in 2 ml volume containing 2% octyl glucosideEmbodied. Cationic lipids (DOSPA) can be used at DOSPA: DNA phosphate ratios of 0.6: 1, 1: 1 andAnd 1.6: 1. 8 liters total of 1 M MnCl over 48 hoursTwoAt 4 ° CThe surfactant was removed by precipitation. Subsequent removal of cations and substantialDialysis against a total of 8 liters of 5% dextrose, 10 mM Tris.Turbid dispersion of particles having an average diameter between about 50 and about 150 nm.The body is obtained. The stable complex thus obtained is completely stored when stored at 4 ° C.Maintain good transfection activity for at least 2 weeks. 6.13.In vivo expression studies using stable SPDV with reduced toxicity Using 80 μg of DNA (SSV9-pMD-AP), SPDV was purified essentially as described in section 6.12.It was formed and injected into the tail vein of Balb C mice (about 25 gm) in a volume of 0.25 ml. MnSV101 is MnClTwoRefers to a dialysed lipid / DNA complex. Standard plasmid isolation method and on CsClA complex with SSV9-pMD-AP, which had been prepared by a double band, was prepared. To DNAThe ratio of DOSPA to DOSPA was varied from about 0.66 to about 1.65. Inject 5 mice per groupFired. Tissue samples are collected 24 hours after dosing and buffered to a net concentration of 100 mg / ml.The solution was homogenized. The homogenate is heated to 65 ° C for 30 minutes,The phosphatase was inactivated. After adsorbing the secondary antibody to the 96-well plate,Immunization consisting of adding human placental alkaline phosphatase polyclonal antibodyThe homogenate was analyzed using an epidemic capture assay. 0.2 ml of homogenateTo the wells and incubated overnight at 4 ° C. 20 mm unit to 0.1 mm unitA standard curve for alkaline phosphatase (AP) in the range is also included. Wash the plateIncubate an additional 200 μl aliquot in the well for 2 hours to increase signalIncrease or wash wells and add alkaline phosphatase substrate.V for each wellmaxUses a Molecular Devices plate reader that can measureAnd read the plate. VmaxTo AP millimeters and organize the dataStandardized per 100 mg. FIG. 14 shows that all tissues tested (ie, liver, spleen,, Lung, heart, and kidney) have produced significant levels of expression in vivo.And Highest expression level of MNSV101 prepared at 1.65: 1 DOSPA / DNA phosphate ratioBut the toxic effects are ideal ratios probably in the range between 1: 1 and 1.65: 1Suggest that. FIG. 15 shows 80 tested MnSV101 prepared at a DOSPA: DNA phosphate ratio of 1: 1.μg doses of DNA generally provided better in vivo expression than lower DNA concentrations.Is shown. Figure 16 shows gene transfer using MnSV101 (produced with a 1: 1 DOSPA: DNA phosphate ratio).Shows that the transduction clearly leads to transient in vivo expression of the delivered DNA. FIG. 17 shows a stable synthetic delivery vehicle generated essentially as described in Section 6.12 (The DOSPA: DNA phosphate ratio of 1: 1) is also the concentration used when divalent Mn cations are used.At the same concentration as the monovalent cation Na (NaCl, ie, NaSV101, or NaCl-(Using SV101). The data in FIG. 17 is substantially removed.In contrast, simply reducing the cation concentration in the complex during the second dialysis stepEnhances expression levels when using sodium to help form SPDVWe show further what we can do. FIG. 17 also shows that both MnSV101 and NaSV101Enables gene delivery to muscle tissue capable of expressing the gene in vivoIndicates that
【手続補正書】【提出日】１９９８年６月３０日【補正内容】 （１）明細書４頁15〜16行に「ビヒクル」とあるのを「ビヒクル組成物」に補正する。 （２）明細書７頁11行の「示す。」の後に、「図13はプラスミドSSV9-MD2-APMのマップを示す。」を加える。 （３）明細書７頁12行に「図13」とあるのを「図14」に補正する。 （４）明細書７頁15行に「図14」とあるのを「図15」に補正する。 （５）明細書７頁17行に「図15」とあるのを「図16」に補正する。 （６）明細書７頁20行に「図16」とあるのを「図17」に補正する。 （７）明細書17頁８行の「低減した」の前に「一過性リポソーム/DNA複合体と比較して」を加える。 （８）明細書17頁８行に「含む」とあるのを「有する」に補正する。 （９）明細書19頁19行に「である」とあるのを「に連結されている」に補正する。 （10）明細書20頁12行に「系統細胞(line cell)」とあるのを「細胞株」に補正する。 （11）明細書22頁２行に「程度速度」とあるのを「程度または速度」に補正する。 （12）明細書22頁28行に「現在」とあるのを「脂質/DNA複合体の単離を伴うことなく」に補正する。 （13）明細書25頁13行の「または」を削除する。 （14）明細書30頁17行の「または」を削除する。 （15）明細書31頁８行に「MES」とあるのを「MES（4-モルフォリンエタンスルホン酸）」に補正する。 （16）明細書31頁29行に「SMBP」とあるのを「SMPB」に補正する。 （17）明細書32頁３行に「DOPE-MOB」とあるのを「DOPE-MPB」に補正する。 （18）明細書32頁３〜４行に「DOPE-BPM-S-スペルミン」とあるのを「DOPE-MPB-S-スペルミン」に補正する。 （19）明細書32頁14行の「３つの」を削除する。 （20）明細書32頁15行の「酸不安定結合」の前に「「」を加える。 （21）明細書32頁16行の「試薬」の後に「」」を加える。 （22）明細書32頁17行の「リポポリアミン」の前に「「」を加える。 （23）明細書32頁18行の「導入」の後に「」」を加える。 （24）明細書33頁５行に「LPS」とあるのを「リポ多糖（LPS）」に補正する。 （25）明細書33頁25行の「生じた。」の後に、「節6.9において以下に記載するように、先行技術の一過性複合体は、DNAをカチオン性脂質に添加することにより形成され、そして一般的に、一過性複合体は直ぐに使用される。」を加える。 （26）明細書34頁９行に「DMEM」とあるのを「DMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）」に補正する。 （27）明細書36頁12行に「保存条件の」とあるのを「を用いて-20℃で保存された複合体の」に補正する。 （28）明細書40頁17行に「αvβδ」とあるのを「αvβ3」に補正する。 （29）明細書40頁18行に「インテグリン」とあるのを「インテグリンレセプター」に補正する。 （30）明細書40頁28行に「G-DOPE」とあるのを「N-G-DOPE」に補正する。 （31）明細書41頁２行に「G-DOPE」とあるのを「N-G-DOPE」に補正する。[Procedure for Amendment] [Date of Submission] June 30, 1998 [Content of Amendment] (1) Amendment of “Vehicle” on page 4, lines 15 to 16 of the specification to “Vehicle Composition”. (2) After “show” on page 7, line 11 of the specification, “FIG. 13 shows a map of plasmid SSV9-MD2-APM” is added. (3) The description of “FIG. 13” on page 7, line 12 of the specification is corrected to “FIG. 14”. (4) The description of “FIG. 14” on page 7, line 15 of the specification is corrected to “FIG. 15”. (5) The description of “FIG. 15” on page 7, line 17 of the specification is corrected to “FIG. 16”. (6) The description of “FIG. 16” on page 7, line 20 of the specification is corrected to “FIG. 17”. (7) Add “compared to transient liposome / DNA complex” before “reduced” on page 17, line 8 of the specification. (8) The word “include” on page 17, line 8 of the specification is corrected to “have”. (9) Correct “is” on page 19, line 19 of the specification to “is linked to”. (10) The description of “line cell” on page 20, line 12 of the specification is corrected to “cell line”. (11) The description of “degree speed” on page 22, line 2 of the specification is corrected to “degree or speed”. (12) The word “present” on page 22, line 28 of the specification is corrected to “without isolation of the lipid / DNA complex”. (13) Delete “or” on page 25, line 13 of the specification. (14) Delete "or" on page 30, line 17 of the specification. (15) The description “MES” on page 31, line 8 of the specification is corrected to “MES (4-morpholineethanesulfonic acid)”. (16) “SMBP” on page 31, line 29 of the specification is corrected to “SMPB”. (17) Correct “DOPE-MOB” on page 32, line 3 of the specification to “DOPE-MPB”. (18) The description "DOPE-BPM-S-spermine" on page 32, lines 3-4 is corrected to "DOPE-MPBS-spermine". (19) Delete “three” on page 32, line 14 of the specification. (20) Add "" before the "acid labile bond" on page 32, line 15 of the specification. (21) Add "" after "Reagent" on page 32, line 16 of the specification. (22) Add "" before "lipopolyamine" on page 32, line 17 of the specification. (23) Add "" after "Introduction" on page 32, line 18 of the specification. (24) The description “LPS” on page 33, line 5, is corrected to “lipopolysaccharide (LPS)”. (25) After "occurred" on page 33, line 25 of the specification, "as described below in Section 6.9, a transient complex of the prior art is formed by adding DNA to a cationic lipid. And generally, the transient complex is used immediately. " (26) Correct "DMEM"(Dulbecco's Modified Eagle Medium) from "DMEM" on page 34, line 9 of the specification. (27) The description "of storage conditions" on page 36, line 12 of the specification is corrected to "of the complex stored at -20 ° C using". (28) Correct “αv βδ ” on page 40, line 17 of the specification to “αv β3 ”. (29) The description of “integrin” on page 40, line 18 in the specification is corrected to “integrin receptor”. (30) Correct "G-DOPE" on page 40, line 28 to "NG-DOPE". (31) Correct "G-DOPE" on page 41, line 2 of the specification to "NG-DOPE".