【発明の詳細な説明】エピトープでタグを付したライブラリーを用いる薬理学的活性を有する作用剤の同定方法発明の分野 本発明は、薬理学的活性を有する作用剤の改良された同定方法に関する。発明の背景 過去１０年間において、例えば、細胞表面リセプター、酵素または抗体のごとき種々の細胞アクセプター分子のアゴニストまたはアンタゴニストのような薬理学的活性を有する作用剤の製造および同定に対する需要が増大してきた。種々の生物学的プロセスを有効に転調させうる新たな化学的部分の検索において、検索を行うための標準的方法は、以前から存在する種々の化学的部分、例えば、天然に存在する化合物または合成ライブラリーもしくはデータベースに存在する化合物をスクリーニングすることである。スクリーニングすべき化学的部分の特定の性質を試験するために設計されたアッセイ、例えば、化学的部分の特定リセプター部位への結合能を試験するリセプター結合アッセイに供することによって、以前から存在する化学的部分の生物学的活性が決定される。 生物学的活性について非常に多くのランダムに選択された化合物をスクリーニングすることに費やされる時間および経費を少なくする努力において、リード化合物（lead compounds）の発見のための化合物のライブラリーを提供するためにいくつかの開発が行われている。分子多様性を化学的に得ることは、新規リード構造の検索における主要な道具となっている。現在のところ、分子多様性のある多数の化合物を化学的に得るための知られている方法は、一般的には、固相合成の使用、詳細にはペプチドおよびペプチドライブラリーの合成および同定を包含する。例えば、一定量のペプチドを樹脂から遊離させて可溶性形態でアッセイし、その一方ではまだ樹脂に結合しているいくつかのペプチドを樹脂上で配列決定できるような、ペプチドと樹脂との間の選択的開裂可能リンカーを得るための方法論を開示しているLebl et al.,Int.J.Pept.Prot,Res.,41,p.210(1993)参照。さらに、ポリスチレンまたはポリアクリルアミド樹脂のごとき固体支持体上での直鎖状ペプチドの合成方法を開示しているLam et al.,Nature,354,p.82(1991)およびＷＯ９２／０００９１；９６ウェルのマイクロタイタープレートの配列に対応するようにブロック上に配列された誘導体ポリスチレンピン上でのペプチド合成を開示しているGeysen et al.,J.Immnol.Meth.,102,p.259(1987)；可溶性ペプチドのプールを含む抗体またはリセプター結合配列のデノボ決定のためのアプローチを開示しているHoughten et al.,Nature,354,p84(1991)およびＷＯ９２／０９３００も参照。 ペプチド模倣物のごとき非ペプチド性有機化合物は、しばしば、ある種の酵素のリセプターに対するアフィニティーにおいてはペプチドリガンドを上回ることがある。高アフィニティー生物学的リガンドおよび究極的には新しく重要な薬剤を迅速に同定するための有効な方法は、生物学的アクセプター（例えば、リセプターまたは酵素）との１またはそれ以上のタイプの相互作用（例えば、水素結合、塩結合、パイ−錯形成反応、疎水的効果等）を確立しうる種々の構造単位を含む非ペプチド構造の迅速な構築およびスクリーニングを必要とする。しかしながら、非ペプチド分子を含む合成試験化合物ライブラリーの形成およびスクリーニングについての仕事はまだ揺籃期にある。この領域の一例は、固体支持体上でのベンゾジアゼピン類の組み合わせ合成（combinatorial synthesis）に関するEllmanとBuninの仕事である（J.Am.Chem.Soc.114,10997,(1992)；Chemical and Engineering News,January 18,1993,33頁参照）。 歴史的には、薬理学的に活性のある作用剤の同定方法は、時間がかかり、労力を要し、不十分なものと特徴づけられており、通常には、１のスクリーニングにつき１の生物学的標的が関連している。さらに、方法の改善のための努力は、専ら１のスクリーニングあたりの作用剤の数の増大および質の向上に焦点が絞られて来た。現在まで、生物学的標的をスクリーニングアッセイに用いる効率を高めることを強調したものは、たとえあったとえも殆ど存在しない。 さらに、ヒト・ゲノムを完全に特徴づけるために努力が払われてきた。この先取的研究は、すでに数千の新規遺伝子配列を見いだしたが、その多くは機能が不明である。これらの遺伝子のいずれのものが薬理学的介在のための機会を提供するのかを確認することは、現在の方法論を用いれば多年にわたる勤勉な努力を要するであろう。薬理学的に活性のある作用剤を効率よく同定し、ヒト・ゲノムについての先取的研究から得られた情報をよりよく利用するための、改良された方法に対する必要性が現在のところ存在する。 本発明は、知られている方法の多くの不利な点ならびに満足されていない多くの必要な点を狙うものであり、以後より詳細に説明される本発明は、知られている方法に優る多くの利点を提供する。発明の概要 本発明は、個別にタグを付された複数の標的作用剤を同時発現させて標的ライブラリーを形成し、作用剤候補プールを調製し、次いで、所望特性を有する候補プールの作用剤を同定するアッセイにおいて標的ライブラリーおよび作用剤候補プールを試験することを特徴とする、薬理学的に活性のある作用剤の同定方法、ならびにかかる方法により同定される薬理学的に活性のある作用剤に関する。 また本発明は、個別にタグを付された複数の遺伝子を同時発現させて標的ライブラリーを形成する方法に関する。 また本発明は、個別にタグを付された複数の遺伝子産物を同時発現させて標的ライブラリーを形成する方法に関する。 また本発明は、個別にタグを付された複数の膜結合リセプターを同時発現させて標的ライブラリーを形成する方法に関する。 また本発明は、個別にタグを付された複数の発現した遺伝子を含んでなる標的ライブラリーに関する。 また本発明は、個別にタグを付された複数の発現した遺伝子産物を含んでなる標的ライブラリーに関する。 また本発明は、個別にタグを付された複数の発現した膜結合リセプターを含んでなる標的ライブラリーに関する。 また本発明は、空間的にコードされた標的ライブラリーに関する。 また本発明は、空間的にコードされた標的ライブラリーを用いる薬理学的活性のスクリーニング方法に関する。発明の詳細な説明 本明細書の用語「作用剤候補のプール」は、薬理学的活性について試験される個々の化合物、ペプチド、天然産物およびモノクローナル抗体の混合物のごとき化学的化合物からなる群より選択される１またはそれ以上の物質の源を意味する。組み合わせ化合物ライブラリー、組み合わせペプチドライブラリーまたはバリオマー（variomers）としてこれらの物質を試験してもよい。 本明細書の用語「標的ライブラリー」は、個別にタグを付された複数の発現した標的作用剤を意味する。 本明細書の用語「個別にタグを付された作用剤」は、個別にタグを付された遺伝子、個別にタグを付された遺伝子産物または個別にタグを付された膜結合リセプターを意味する。 本明細書の用語「遺伝子産物」は、遺伝子の発現により生じる蛋白を意味する。例えば、酵素、リセプターまたはＳＨ２ドメインのごときドッキング蛋白を意味する。 本明細書の用語「個別にタグを付された遺伝子」は、それぞれが標的ライブラリーを形成するであろう遺伝子であって、発現の前に、特定の抗体により認識されうる短いペプチド配列（以後、エピトープタグという）のごとき別々のマーカーで処理された遺伝子を意味する。該エピトープタグは多数製造することができる。さらに、いくつかの遺伝子を同じタグを用いてグループ分けすることができ、異なるタグの組み合わせを用いてサブグループに分けることもでき、あるいは直列タグを集合させて引き続き行う選択を可能にすることもできる。 本明細書の用語「個別にタグを付された遺伝子産物」は、それぞれが標的ライブラリーを形成するであろう遺伝子産物であって、発現の前に、特定の抗体により認識されうる短いペプチド配列（以後、エピトープタグという）のごとき別々のマーカーで処理された遺伝子産物を意味する。該エピトープタグは多数製造することができる。さらに、いくつかの遺伝子産物を同じタグを用いてグループ分けすることができ、異なるタグの組み合わせを用いてサブグループに分けることもでき、あるいは直列タグを集合させて引き続き行う選択を可能にすることもできる。 本明細書の用語「個別にタグを付された膜結合リセプター」は、それぞれが標的ライブラリーを形成するであろう膜結合リセプターであって、発現の前に、特定の抗体により認識されうる短いペプチド配列（以後、エピトープタグという）のごとき別々のマーカーで処理され、次いで、適当なレシピエント細胞中に取り込まれる膜結合リセプターを意味する。該エピトープタグは多数製造することができる。さらに、いくつかの膜結合リセプターを同じタグを用いてグループ分けすることができ、異なるタグの組み合わせを用いてサブグループに分けることもでき、あるいは直列タグを集合させて引き続き行う選択を可能にすることもできる。細胞１個につき１の標的リセプタータイプの取り込みが好ましく、このことは、異なる数の細胞を混合することにより標的ライブラリーの相対的成分の調節を可能にする。この例において、この細胞混合物は標的ライブラリーを構成するであろう。 多くのリセプターは、リガンドに対する正しい結合および機能的応答のために、細胞膜を必要とする（例、７つの膜内外Ｇ−蛋白に結合したリセプター）。本明細書の用語「正しい結合および機能的応答のための細胞膜を必要とする受容体、ならびに細胞中に取り込まれる受容体」は、「膜結合リセプター」という。一般的には、膜結合型リセプターへの標的ライブラリースクリーニングアプローチの適用を、本明細書に示されたようにして行うことができる。膜結合受容体をスクリーニングする好ましい方法は、作用剤候補のプールとして１種またはそれ以上の化学的化合物または組み合わせ化学ライブラリーを用い、化合物または組み合わせライブラリーの合成途中の鋳型に光活性化基を付与することである。かかる基の例は、アジ化アリールまたはベンゾフェノンである。さらに、好ましくは、ビオチンのごとき容易に検出可能なマーカーを鋳型中に取り入れる。かくして、好ましくは、各化合物は光活性化基および検出基の双方を有するものである。別法として、標的に対するリガンドが知られている場合には、光活性化タグおよび検出タグはリガンド中に取り込まれることだけを必要とし、競争により未標識化合物をスクリーニングすることができる。本発明のこの好ましい例において、化合物または組み合わせライブラリーを標的ライブラリーと混合し、放射線照射して光活性化基を活性化する。標的ライブラリーの細胞を溶解し、標的ライブラリーのエピトープタグに対して生起した空間的にコードされた抗体の配列に混合物を添加する。マーカーを検出するための試薬で抗体のマトリックスをプローブする（ビオチンを検出するにはストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いる）。一定の化合物または化合物の基と相互作用する標的のスペクトルを、検出マーカーとエピトープタグの特定の部分集合との結合により確認することができる。必要ならば、抗体マトリックス上での脱複雑化の前に検出マーカーの取り込みに関して標的ライブラリーをプレスクリーニングすることができる。 本明細書の用語「同時発現」とは、対象遺伝子、遺伝子産物または膜結合リセプターの同一性の維持を考慮せずに、多くの個別にタグを付された標的作用剤を一緒に発現させ、精製することを意味する。 本明細書の用語「アッセイ」、「スクリーニング」または「生物学的活性に関する試験」は、薬理学的に重要な活性に関するすべての形態の試験を包含する。 標的ライブラリーの調製に際して、管理可能な数の遺伝子、好ましくは１００未満の遺伝子から始めることができる。好ましくは、例えば、興味ある組織における発現により、または配列相同性に基づく共通のファミリー（キナーゼのごとき）における地位により、これらの遺伝子をグループ分けする。好ましくは、エピトープタグを用いて各遺伝子に個別にタグを付し、同時発現させる。 標的ライブラリーの調製に際して、管理可能な数の遺伝子産物、好ましくは１００未満の遺伝子産物から始めることができる。好ましくは、例えば、興味ある組織における発現により、または配列相同性に基づく共通のファミリー（ＳＨ２ドメインのごとき）における地位により、これらの遺伝子産物をグループ分けする。好ましくは、エピトープタグを用いて各遺伝子産物に個別にタグを付し、同時発現させる。 標的ライブラリーの調製に際して、管理可能な数のリセプター、好ましくは１００未満のリセプターから始めることができる。好ましくは、例えば、興味ある組織における発現により、または配列相同性に基づく共通のファミリー（７つの膜内外Ｇ−蛋白に結合した受容体のごとき）における地位により、これらの受容体をグループ分けする。好ましくは、エピトープタグを用いて各受容体に個別にタグを付し、同時発現させる。 標的ライブラリー中の標的の機能を混乱させる化合物を同定するためには、作用剤候補のプール、好ましくは、１種またはそれ以上の化学的化合物または組み合わせ化合物ライブラリーを、好ましくは、標準的方法により調製する。知られているアッセイ方法により、または標的ライブラリーに含まれる予想活性に基づいて選択工程に手を加えることにより（下記実施例記載のごとく）、活性作用剤を同定する。エピトープタグの手段により標的ライブラリーの単純化を行うことができるが、質量スペクトル法のごとき分析方法を作用剤候補のプールの分析に用いることもできる。かくして、活性作用剤の同定および個別にタグを付された標的作用剤の機能を並行して分析する。 上記方法により同定された薬理学的に活性のある作用剤を、興味ある機能についての細胞をベースにしたアッセイ、次いで、機能のスクリーニングまたは動物モデルにおいてスクリーニングしてもよい。本明細書開示の方法により同定された薬理学的に活性のある作用剤も本発明の範囲に包含される。罹病している特定の標的（遺伝子、遺伝子産物またはリセプター）を同定することは必ずしも必要でないが、毒性の問題が生じた場合にはこの情報は潜在的に有用であり、容易に遡及的に得ることができよう。さらに、細胞をベースにしたアッセイの組において同時に評価される複数の化合物に関して、２次スクリーニンにおいても並行性を維持する。 本発明の特に有利な態様は、発見プロセスの全局面、すなわち標的選択、発現および精製、化合物合成、１次および２次スクリーニングにおいて並行性を維持できることである。本発明のさらなる利点は：機能または疾病についての前知識なしに複数の標的を同時に評価できること、もともと備わっている選択性の特徴づけ、全く予期されない活性および疾病の徴候が明らかとなる機会が多いこと、より多くの薬剤候補を単位時間あたり用いることによる向上した効率を包含する。 上記並行アプローチの一般的骨格中において、標的ライブラリーをスクリーニングするための多くの方法論が可能である。１のかかる方法論を実施例１に記載する。すべてのかかる方法論は本明細書にて権利請求されている本発明の範囲内である。 本発明のさらなる態様において、発現された個別にタグを付された標的作用剤を用いる、標的ライブラリーのスクリーニングのための好ましい方法が提供され、該方法においては、タグ付けをするマーカーはエピトープタグであり、該標的ライブラリーは基材の別々の領域において空間的にコードされている(本明細書において、「空間的にコードされた標的ライブラリー」または「ＳＥＴＬ」という)。本発明において使用する空間的にコードされた標的ライブラリーをi）〜iii）により調製する： i）抗体の組を、好ましくはモザイクパターンとして列をなして基材上に沈着させること。それぞれの組は、標的ライブラリーの異なるエピトープタグおよび少なくとも１つの抗体の組に対応した標的ライブラリーの各エピトープタグに指向される。好ましくは、基材はポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜、ポリスチレン層またはシリコンウエハーである。 ii）不活性蛋白での膜の抗体領域のブロッキング、次いで iii）抗体領域への標的ライブラリーの曝露。 抗体の組は、それらが対応しているエピトープタグに選択的に結合し、そのことにより、個別にタグを付された作用剤の類似のグループが膜の特定の領域に局在化されるであろう。上記方法を繰り返し、複数の機能的に類似したＳＥＴＬｓを得る。 いずれかの手段、例えば、毛細管ピペットを用いて手動で膜にスポットすること、または前以て決定されている小さな沈着領域における「微小スポッティング」により自動化された方法（例えば、インクジェットプリンターに使用されるような印刷手法を用いることによる）によって膜への抗体の沈着を行うことができる。好ましくは、上記工程iiの前に固定化抗体を担持している膜を容器（例えば、Merrifield合成容器、フラスコ、または好ましくはマイクロタイター９６ウェルプレート）に結合させて、各容器が全抗体領域を含むようにする。 作用剤候補プールを他のアッセイ試薬とともに容器に分注する。検出工程後、膜を映像化して、標的ライブラリーの個別にタグを付された作用剤の活性および作用剤候補の効果を確認する。 後述の実施例２、３および４に示すように、有利には、リセプターまたは他の結合蛋白、例えばＳＨ２ドメインに関するスクリーニングアッセイを開発するためにＳＥＴＬアプローチを用いる。 さらなる苦労なしに、当業者は、上記説明を用いて本発明を最大限に利用できると確信する。それゆえ、以下の実施例は本発明の単なる説明であって、本発明の範囲を限定するものと解してはならない。アッセイの実施例実施例１：新規骨芽細胞キナーゼ 新たな骨の生産にかかわっている細胞タイプは骨芽細胞である。大規模配列決定法を骨芽細胞ｃＤＮＡライブラリーに適用した結果として、多くの新規な全長のキナーゼが同定された。骨芽細胞様細胞由来の多くの全長のキナーゼのそれぞれに、１またはそれ以上のエピトープタグを用いて個別にタグを付す。例えば、独自の同定タグを通常の精製タグと並べて結合させて精製工程を容易にすることができる。遺伝子にタグを付し、同時に受容可能宿主、例えばイー・コリ（E.coli）またはバキュロウイルスにて発現させる。混合物としてのキナーゼ標的ライブラリーのすべてのメンバーを同時に精製するためにタグを用い、独自のタグに対する抗体を用いるウェスタンブロットにより該ライブラリーを特徴づける。エピトープタグを介して標的ライブラリーの各メンバーを個別に固定化し、アイソトープ標識ＡＴＰとホスフェートアクセプターとの混合物を添加することにより適当な基材を同定する。ホスホリレーションされた基材を質量スペクトル法により同定する。 標準的方法により化合物の組み合わせライブラリーを合成する。標的ライブラリーは適当な基材に沿って空間的にコードされる（上述のごとく）。適当な基材を合成して、それらがホスフェートアクセプターおよびエピトープタグの両方を含み、それらが適切なキナーゼ標的とともに共局在化するようにする。試験化合物をアイソトープ標識されたＡＴＰとともに各配列に添加する。配列を映像化して、ホスフェートが取り込まれた領域を同定する。 実施例１で得た活性作用剤を、骨形成と相関関係があるオステオカルシン放出アッセイのごとき２次アッセイにおいてスクリーニングしてもよい。さらに、実施例１で得た活性作用剤を、骨形成と無関係な機能についての細胞に基づくアッセイの組み合わせにおいてスクリーニングする。好ましくは、該細胞に基づくアッセイはリポーター遺伝子法を用いるものであり、例えば米国特許第５,４０１,６２９号および第５,４３６,１２８号に記載されている。かかる方法は、リポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）に結合され、適当な細胞中にトランスフェクションされた興味ある種々の遺伝子（例えば、オステオカルシン）のプロモーター領域を用いるものである。これを多能細胞系、例えば胚の幹細胞において行う場合には、同じ細胞を異なるリポーター構築物とともに使用して種々の機能（以後、「アッセイライブラリー」という）について同時にアッセイすることができる。よって、本発明の並行アプローチは２次アッセイのためのすべての方法において維持され、効率が向上し、活性化合物の広範囲の特徴づけが可能となる。次いで、好ましくは、活性作用剤を動物モデルまたはインビトロ機能アッセイにおいて評価し、毒性についてスクリーニングする。実施例２：結合アッセイ ＳＥＴＬアプローチを用いて、リセプターまたは他の結合蛋白、例えばＳＨ２ドメインについてのスクリーニングアッセイを形成することができる。ＳＨ２ドメインに関するＳＥＴＬアッセイを形成するために、該ドメインをエピトープタグを付した融合蛋白として発現させる。タグに対する抗体を上記のごとく膜に沈着させる。タグを付したＳＨ２ドメインの混合物を各ウェルに入れ、対応抗体と結合させる。ビオチン化ホスホペプチドリガンド（各ＳＨ２標的に対するもの）の混合物を試験化合物とともに添加する。ストレプトアビジン−ビオチン複合体ならびに色、蛍光または増強された化学発光（ＥＣＬ）を検出する試薬の添加によりビオチン化ペプチドリガンドの結合を検出する。膜表面上の検出試薬の活性の映像化により個々のＳＨ２ドメインへのリガンド結合の測定が可能となる。かかる映像化を自動化することができる。 ヒト・ｓｒｃ ＳＨ２ドメインを融合蛋白として発現させることによりこのアッセイを実際に行った。 ヒト・ｓｒｃ ＳＨ２ドメインを含む融合蛋白を一般的配列：ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｓｒｃ ＳＨ２として発現させた。ＤＥＴ１、ＤＥＴ２、スペーサーおよびｅｋを以下に説明する。ＤＥＴ１（「定義されたエピトープタグ」）（配列番号：１）は、ヒト・免疫不全ウイルスタイプＩ（ＨＩＶ−１）エンベロープ蛋白ｇｐ１２０（またはｇｐ１６０）において見いだされる１１個のアミノ酸の配列である。ＨＩＶ−１のｇｐ１２０（またはｇｐ１６０）の種々のエピトープに対するモノクローナル抗体が当該分野において知られている（例えば、米国特許第５,１６６,０５０号参照）。１の好ましい例はモノクローナル抗体１７８.１（Thiriart et al.,J.Immunol.,143:1832-1836(1989)）であり、それを、酵母で発現されたＢＨ１０株由来のＨＩＶ−１のｇｐ１６０分子（Ratner et al.,Nature,313:277-284(1985)）でマウスを免疫することにより調製した。蛋白精製（アフィニティークロマトグラフィーによる）のために、そして１７８.１抗体を用いて融合蛋白を捕捉し固定化するアッセイを形成するために、このタグを発現の検出（ウェスタンブロットによる）に使用した。ＤＥＴ２はニッケル含有樹脂に結合するヘキサヒスチジン配列タグ（配列番号：２）であり、精製目的に使用した。スペーサー（配列番号：３）を用いて、構築物中の必要な位置においてＢａｍＨＩ制限部位を設計した。用語「−ｅｋ−」は、エンテロキナーゼプロテアーゼの認識配列（配列番号：４）をいい、それは、ｓｒｃ ＳＨ２ドメインからのタグの最適除去を可能にし、かくして外来アミノ酸を含まないｓｒｃ ＳＨ２ドメインが得られる。結晶像の研究には、外来アミノ酸を含まないｓｒｃ ＳＨ２ドメインのほうがタグを付した蛋白よりも好ましい。 必要な制限部位（ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ）がスペーサー−ｅｋ−ｓｒｃ ＳＨ２領域に隣接するようにし、そのことにより、別のスペーサー−ｅｋ−ＳＨ２構築物が下記手順２記載のベクターのいずれか１つの中に容易に置換されてＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ＳＨ２タグ付き蛋白を得ることができるように、ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｓｒｃ ＳＨ２のそれぞれをコードしているＤＮＡ配列を設計した。タグを付したＳＨ２ドメイン全体がＮｄｅＩ−ＸｂａＩフラグメントとして除去されて、E.coli転写および翻訳調節配列の下流に適当な間隔をおいて存在するＮｄｅＩ部位およびＸｂａＩに適合した下流のクローニング部位を有する発現ベクター中に挿入されるように、ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｓｒｃ ＳＨ２構築物をコードしているＤＮＡ配列も設計した。いずれの適当なベクター（例えば、pET-11a;Novagen,Inc.）も同様に結果を生じるであろうが、本実施例に使用したベクターはE.coli発現ベクターｐＥＡ１ＫｎＲＢＳ３であった。このベクターは、Shatzman,A.,Gross,M.およびRosenberg,M.,"Expression using vectors with phage lambda regulatory sequences"（Current Protocols in Molecular Biology（F.A.Ausbelら編）中16.3.1〜16.3.11頁）（Greene Publishing and Wiley-Interscience,N.Y.（１９９０年））（以後、Ausbelらという）に記載された一連のベクターの誘導体である。特別なベクターｐＥＡ１ＫｎＲＢＳ３は、Bergsma et al,1991,J.Biol.Chem.266:23204-23214に記載されている。 下記手順は、ニワトリ・ｓｒｃおよびヒト・ｓｒｃ ＳＨ２ドメインの発現を説明する。まず、ニワトリ・ｓｒｃ ＳＨ２ドメインをＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２として発現させた。次いで、他方をニワトリ・ｓｒｃのかわりにこのベクター中に挿入して、下記手順１および２記載のごとくＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｓｒｃ ＳＨ２形態の蛋白を発現させた。手順１：タグＤＥＴ１およびＤＥＴ２を含むニワトリ・ｓｒｃ ＳＨ２ドメイン（ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２）のクローニングおよび発現 当業者によく知られた方法により下記プライマーを用いて、タグを付した蛋白ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２をコードしているＤＮＡ配列を、ニワトリ・ｓｒｃ遺伝子を含むｃＤＮＡクローン（p5H;Levy et al 1986.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:4228）からＰＣＲ増幅した。 下線を付した部位はＮｄｅＩ認識部位(５’)およびＢａｍＨＩ認識部位(３’)である。 下線を付した領域はＸｂａＩ認識部位である。 ＰＣＲ生成物をＮｄｅＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで、アガロースゲル上で消化フラグメントを単離した。前以てアガロースゲルで６.５ｋｂのフラグメントとして精製されているＮｄｅＩ−ＸｂａＩ消化ｐＥＡ１ＫｎＲＢＳ３ベクター（Bergsmaら,上記文献）中にフラグメントを連結した。連結反応物を用いてE.coli ＭＭ２９４ｃＩ+（F.A.Ausbelら,上記文献）に形質転換した。正しいフラグメント挿入を有するプラスミドを同定し、ＤＮＲ配列決定により確認した。得られたプラスミドは、ファージラムダＰLプロモーターおよび調節システムの制御下のＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２をコードしている。プラスミドＤＮＡをＭＭ２９４ｃＩ+から精製し、E.coli ＡＲ１２０株に形質転換した。この宿主株において、F.A.Ausbelらの上記文献記載のごとくナリジキシン酸を増殖中の培養に添加することによりファージプロモーターの発現を誘導することができる。このプラスミドを含むＡＲ１２０株のナリジキシン酸誘導、次いで、クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での細胞蛋白の分析（F.A.Ausbelら,上記文献）により、見かけの分子量１５０００の蛋白バンドが出現した。このバンドは、未誘導細胞またはＰＣＲ増幅フラグメント不含のｐＥＡ１ＫｎＲＢＳ３含有誘導細胞においては見られなかった。ウェスタンブロッティングにより、誘導蛋白バンドが抗−ＤＥＴ１モノクローナル抗体１７８.１と反応することが確認された。手順２：タグおよびエンテロキナーゼ蛋白分解開裂部位を有するヒト・ｓｒｃ ＳＨ２ドメイン（ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｓｒｃ ＳＨ２）のクローニング、発現および精製 下記プライマーを用いて、ヒト・ｓｒｃ遺伝子を含むｃＤＮＡクローン（Takeya,T.およびHanafusa,H,1983 Cell 32:881-890記載のものと同じｃ−ｓｒｃ ＳＨ２ ＤＮＡ配列）から、蛋白ｅｋ−ｓｒｃ ＳＨ２をコードしているＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅した。 下線部位はＢａｍＨＩ認識部位である。 下線領域はＸｂａＩ認識部位である。 ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで、アガロースゲル上で消化フラグメントを単離した。上記手順１に記載のタグを付したニワトリ・ｓｒｃ遺伝子ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ＳＨ２を含むＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ消化発現ベクターフ中にラグメントを連結した。そのベクターにおいて、ＢａｍＨＩ部位はＤＥＴ２およびＳＨ２コーディング領域間に存在し、ＸｂａＩ部位はＳＨ２コーディング領域の３’末端の後に存在している。連結反応物を用いてE.coli ＭＭ２９４ｃＩ+を形質転換した。構築物ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｓｒｃ ＳＨ２をＤＮＡ配列決定により確認し（配列番号：５）、上記手順１記載のごとくE.coli ＡＲ１２０株中で誘導した。クーマシーブルーで染色され、ウェスタンブロット陽性の、見かけの分子量１６０００の誘導蛋白バンドがナリジキシン酸誘導後に観察された。 リゾチーム存在下で超音波処理することにより、中性ｐＨにおいて細胞を溶解した。遠心分離後、可溶性抽出物をＮｉ+−ＮＴＡカラムによるクロマトグラフィーに供した。平衡化バッファー（０.５Ｍ ＮａＣｌ含有ＴｒｉｓバッファーｐＨ８）および１５ｍＭのイミダゾールを含有する同じバッファーでカラムを洗浄後、平衡化バッファー中２５ｍＭイミダゾールにより蛋白ＤＥＴ１−ＤＥＴ２−スペーサー−ｅｋ−ｓｒｃ ＳＨ２が高度に精製された形態で溶離した。 Ｍａｂ １７８.１をＰＶＤＦ膜に手動でスポットし、タグを付したｓｒｃ ＳＨ２ドメインを添加した後、ｓｒｃ ＳＨ２に対するビオチン化ホスホペプチドリガンド（配列番号：６）でプロービング、次いで、ＥＣＬまたは比色法による検出により明確なシグナルが示された。等量の無関係な抗体を用いた場合にはシグナルが見られなかった。ビオチン化ホスホペプチドの固定化ｓｒｃ ＳＨ２ドメインへの結合は、ビオチン化分子と同じアミノ酸配列の非ビオチン化ホスホペプチド競争体の添加により阻害された。実施例３：プロテアーゼアッセイ キナーゼアッセイと同様に、ＳＥＴＬスクリーニングを形成する前に、標的ライブラリー成分のための最適基材を同定する必要がある。これがわかれば、開裂部位の一の側面に適当なタグを有し、他方にはビオチンのごとき検出標識を有する基材を合成する。固定化したならば、標的部位からの標識の消失によりプロテアーゼ活性を同定することができる。実施例４：バイオパンニング法 ビーズをベースにした複数の標的を有する化合物ライブラリーのスクリーニング。 標的ライブラリーの各遺伝子を２つのエピトープタグを付して発現させる。それらは、共通タグＣ（すべての遺伝子について同じである）および個別タグＴ（各遺伝子で異なる）である。標準的方法により組み合わせライブラリーをビーズ上で合成する。ビーズとタグＣとの結合を測定することにより、標的ライブラリーを用いて組み合わせライブラリーをスクリーニングし、個々の陽性ビーズを手動または自動的方法のいずれかにより分離する。分離後、例えば低ｐＨでの洗浄により蛋白を各陽性ビーズから溶離し、次いで、空間的にコードされている個別タグＴに対する抗体の配列に結合させる。Ｃに対する抗体を用いてマトリックスをプロービングすることにより陽性ビーズからの蛋白のスペクトルの位置を決定（すなわち、同定）する。かかるプローブはビオチンのごとき容易に検出可能なマーカーで標識されており、その後読み出しを行う。さらに、陽性ビーズからの開裂により活性化合物を同定し、その後化学的／物理的に分析する。 本発明の好ましい具体例を上で説明したが、本発明はここに開示されたものに限定されるのではなく、下記請求の範囲の範囲内にあるすべての修飾に対して権利が保有されることが理解されるであろう。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTIONOf pharmacologically active agents using epitope-tagged librariesIdentification method Field of the invention The present invention relates to an improved method for identifying agents having pharmacological activity. Background of the Invention In the last decade, for example, by cell surface receptors, enzymes or antibodiesPharmacology such as agonists or antagonists of various cell acceptor moleculesThe demand for the production and identification of biologically active agents has increased. VariousSearch for new chemical moieties that can effectively modulate biological processesThe standard methods for doing this include various preexisting chemical moieties, such as naturalCompounds present in a compound or compound present in a synthetic library or databaseTo screen things. Specific chemical moieties to be screenedAssays designed to test properties, e.g., specific receptors for chemical moietiesBy subjecting it to a receptor binding assay to test its ability to bind toThe biological activity of the pre-existing chemical moiety is determined. Screening a large number of randomly selected compounds for biological activityLead in efforts to reduce the time and money spent onTo provide a library of compounds for discovery of lead compoundsSome development has been done. Acquiring molecular diversity chemically is a new leadIt is a major tool in structure search. At present, there is molecular diversityKnown methods for obtaining a large number of compounds chemically include, in general, solid-phase synthesis.Use, specifically the synthesis and identification of peptides and peptide librariesI do. For example, a certain amount of peptide is released from the resin and assayed in soluble form., While sequencing some peptides still bound to the resin on the resinsoMethod for obtaining a selectively cleavable linker between a peptide and a resinSee Lebl et al., Int. J. Pept. Prot, Res., 41, p. 210 (1993), which discloses the theory. SaIn addition, direct conversion on a solid support such as polystyrene or polyacrylamide resinLam et al., Nature, 354, p. 82 (1991) andAnd WO92 / 00091; compatible with 96-well microtiter plate arraysSynthesis on Derivative Polystyrene Pins Arranged on Blocks to PreserveGeysen et al., J. Immunol. Meth., 102, p. 259 (1987);For de novo determination of antibodies or receptor binding sequences, including pools of antibodiesHoughten et al., Nature, 354, p84 (1991) and WO 92/09, which discloseSee also 300. Non-peptidic organic compounds, such as peptidomimetics, often contain certain enzymesOutperforms peptide ligands in its affinity for receptorsThere is. High affinity biological ligands and ultimately new important drugsEffective methods for the rapid identification of biologically acceptable receptors (eg, receptors)One or more types of interactions (eg, hydrogen bonding, Salt bonds, pi-complex formation reactions, hydrophobic effects, etc.).Rapid construction and screening of non-peptide structures. ButEt al., Forming and screening synthetic test compound libraries containing non-peptide molecules.Work on ling is still in its infancy. One example of this area is on a solid support.Ell for combinatorial synthesis of benzodiazepinesIt is the work of man and Bunin (J. Am. Chem. Soc. 114, 10997, (1992); Chemical and Engineering News, January 18, 1993, p. 33). Historically, identifying pharmacologically active agents has been time consuming and labor intensive.Required, and was characterized as inadequate.One per biological target is involved. In addition, efforts to improve the methodFocus on increasing the number and quality of agents per screeningI came. To date, increasing the efficiency of using biological targets in screening assaysThere is little, if any, emphasis on that. In addition, efforts have been made to fully characterize the human genome. AheadPreliminary studies have already found thousands of novel gene sequences, many of which have no function.It is clear. Any of these genes provide opportunities for pharmacological interventionIs that it takes years of hard work using current methodologies.Will do. Efficiently identify pharmacologically active agents and integrate them into the human genomeImproved ways to better utilize information obtained from proactive research onThere is currently a need for law. The present invention provides many disadvantages of the known methods as well as many unsatisfactoryThe present invention, which is described in more detail hereinafter, is known in the art.It offers many advantages over the method. Summary of the Invention The present invention provides a target line by simultaneously expressing a plurality of individually tagged target agents.Forming a library, preparing a pool of agent candidates, and then selecting candidates with desired propertiesTarget libraries and candidate agents in assays to identify agents in the poolA method for identifying a pharmacologically active agent, comprising testing the pool;And pharmacologically active agents identified by such methods. The present invention also provides a target line by simultaneously expressing a plurality of individually tagged genes.A method for forming a library. Also, the present invention provides a method for simultaneously expressing a plurality of individually tagged gene products by targetingA method of forming a library. The present invention also provides for the simultaneous expression of a plurality of individually tagged membrane-bound receptors.To form a target library. The present invention also provides a target comprising a plurality of expressed genes individually tagged.Regarding the library. The invention also comprises a plurality of individually expressed gene products that have been tagged.Regarding the target library. The invention also includes a plurality of expressed membrane-bound receptors individually tagged.For a target library consisting of The invention also relates to a spatially encoded target library. The invention also provides pharmacological activity using a spatially encoded target library.A screening method. Detailed description of the invention The term "pool of candidate agents" herein is tested for pharmacological activityMixtures of individual compounds, peptides, natural products and monoclonal antibodiesMeans the source of one or more substances selected from the group consisting of chemical compounds. Combination compound library, combination peptide library or burrThese substances may be tested as omers. As used herein, the term "target library" refers to a plurality of individually tagged expression libraries.Mean targeted agent. As used herein, the term “individually-tagged agent” refers to individually tagged residues.Genes, individually tagged gene products or individually tagged membrane-boundMeans putter. As used herein, the term "gene product" refers to a protein that results from the expression of a gene.. For example, a docking protein such as an enzyme, receptor or SH2 domain.To taste. As used herein, the term "individually tagged genes" refers to each target library.Genes that will be recognized by certain antibodies before expression.Separate markers such as short peptide sequences (hereinafter referred to as epitope tags)Means the gene treated with The epitope tag can be manufactured in large numbersYou. In addition, several genes can be grouped using the same tag., You can subdivide into subgroups using different tag combinations, orThe serial tags can be aggregated to allow for subsequent choices. As used herein, the term “individually tagged gene product” refers to each target line.A gene product that will form a library that, before expression,Separate, such as short peptide sequences that can be recognizedMeans the gene product treated with the marker. The epitope tag is produced in large numbers.Can be In addition, several gene products can be grouped using the same tag.Subgroups using different combinations of tagsOr you can aggregate serial tags to allow for subsequent choices.Wear. As used herein, the term "individually tagged membrane-bound receptor" is aMembrane-bound receptors that will form a functional library, prior to expression,Short peptide sequence that can be recognized by certain antibodies (hereinafter referred to as epitope tag)Treated with separate markers such asMeans the membrane-bound receptor to be incorporated. The epitope tag can be produced in large numbers.it can. In addition, several membrane-bound receptors are grouped using the same tagCan be divided into subgroups using different tag combinations.Or you can aggregate serial tags to allow for subsequent choices.You. Uptake of one target receptor type per cell is preferred,Regulates the relative components of the target library by mixing different numbers of cellsEnable. In this example, this cell mixture constitutes the target libraryWill. Many receptors are required for correct binding and functional response to ligandRequires cell membranes (eg, receptors bound to seven transmembrane G-proteins). BookThe term "receptors that require cell membranes for correct binding and functional response", As well as receptors that are taken up into cells "are referred to as" membrane-bound receptors. " oneGenerally, target library screening approaches to membrane-bound receptorsCan be performed as indicated herein. Membrane-bound receptorThe preferred method of cleaning is one or more as a pool of potential agents.Using the above chemical compound or combination chemical library, the compound or combinationThis is to add a photoactivating group to the template in the course of the synthesis of the combined library. HeelExamples of such groups are aryl azides or benzophenones. Furthermore, preferably,An easily detectable marker, such as biotin, is incorporated into the template. Thus,Preferably, each compound has both a photoactivating group and a detecting group. AnotherAlternatively, if a ligand for the target is known, a photoactivated tag andThe detection tag only needs to be incorporated into the ligand and is unlabeled due to competitionCompounds can be screened. In this preferred embodiment of the invention,Mix the compound or combination library with the target library and irradiateTo activate the photoactivating group. Lyse the cells in the target libraryA mixture of spatially encoded antibody sequences raised against theIs added. Probe the antibody matrix with a reagent to detect the marker(Use streptavidin-peroxidase to detect biotin). The spectrum of a target that interacts with a compound or group of compoundsIt can be confirmed by binding of Kerr to a specific subset of epitope tags.If necessary, incorporate detection markers prior to decomplication on the antibody matrix.The target library can be prescreened for. As used herein, the term “co-expression” refers to a gene of interest, gene product or membrane-boundMany individually-tagged targeted agents can be used without concern for maintaining the identity of theCo-expressed and purified. As used herein, the terms "assay," "screening," or "biological activity.""Tests that include" include all forms of testing for pharmacologically important activities. In preparing the target library, a manageable number of genes, preferably 100You can start with fewer genes. Preferably, for example,Common families (such as kinases) based on expression inThese genes are grouped according to their status in (g). Preferably, dEach gene is individually tagged with a pitope tag and co-expressed. In preparing the target library, a manageable number of gene products, preferably 1One can start with less than 00 gene products. Preferably, for example, interestedA common family based on expression in tissues or based on sequence homology (SH2Domain products).Divide. Preferably, each gene product is individually tagged with an epitope tag.And co-express. In preparing the target library, a manageable number of receptors, preferably 1You can start with less than 00 receptors. Preferably, for example, interestedA common family based on expression in tissues or based on sequence homology (7Depending on their position at the receptor (such as a receptor bound to a transmembrane G-protein),Group your body. Preferably, for each receptor individually using an epitope tagTag and co-express. To identify compounds that disrupt the function of the target in the target library,Pool of drug candidates, preferably one or more chemical compounds or combinationsA combined compound library is preferably prepared by standard methods. KnownDepending on the assay method used or based on the expected activity contained in the target library.The active agent by modifying the selection process (as described in the examples below).Is identified. Simplify target libraries by means of epitope tagsHowever, analysis methods such as mass spectrometry can be used to analyze pools of active agent candidates.It can also be used. Thus, active agent identification and individually taggedThe function of the targeted agent is analyzed in parallel. The pharmacologically active agent identified by the above method isCell-based assays followed by functional screening or animalIt may be screened in the model. Identified by the method disclosed herein.Pharmacologically active agents are also included in the scope of the present invention. Identification of diseaseIdentification of a target (gene, gene product or receptor) is not always necessaryHowever, this information is potentially useful in the event of a toxicity problem,It could be obtained retrospectively. In addition, a set of cell-based assaysParallelism in secondary screening for multiple compounds evaluated simultaneouslyTo maintain. A particularly advantageous embodiment of the invention is that all aspects of the discovery process, namely target selection, expressionAnd parallelism in purification, compound synthesis, primary and secondary screeningWhat you can do. A further advantage of the present invention is: prior knowledge of function or diseaseSimultaneous evaluation of multiple targets without the need for inherent selectivityIn addition, there are many opportunities to reveal signs of totally unexpected activity and disease,Includes improved efficiency by using more drug candidates per unit time. Screen the target library in the general framework of the parallel approach described above.There are many possible methodologies for doing so. Example 1 describes such a methodology.I do. All such methodologies are within the scope of the invention as claimed herein.It is. In a further aspect of the invention, an individually tagged target agent expressedPreferred methods for screening a target library usingIn the method, the tagging marker is an epitope tag, and the targetLibraries are spatially encoded in separate areas of the substrate (as used herein.Referred to as a "spatially encoded target library" or "SETL"). The spatially encoded target library used in the present invention is identified as i) -iiiPrepared by: i) depositing sets of antibodies on a substrate, preferably in rows in a mosaic patternLet it be. Each set contains a different epitope tag from the target library andEach epitope tag in the target library corresponding to at least one antibody setTurned Preferably, the substrate is a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane,It is a trocellulose membrane, a polystyrene layer or a silicon wafer. ii) blocking the antibody region of the membrane with an inactive protein, then iii) Exposure of the target library to the antibody region. The set of antibodies selectively binds to the epitope tag to which they correspond, andAllows a similar group of individually tagged agents to be localized to a particular area of the membraneWill be localized. Repeat the above method to find multiple functionally similar SETLsGet. Spot the membrane manually by any means, for example using a capillary pipette.Or "small spotting" in a predetermined small deposition area"Automated methods (such as used in inkjet printers)Of the antibody on the membrane can be performed by using a simple printing technique).. Preferably, prior to the step ii, the membrane supporting the immobilized antibody is placed in a container (for example,Merrifield synthesis vessels, flasks, or preferably microtiter 96 wellsPlate) so that each container contains the entire antibody region. Dispense the pool of candidate agents with the other assay reagents into containers. After the detection step,Visualize the membrane to determine the activity and activity of individually tagged agents in the target libraryConfirm the effect of the active agent candidate. Advantageously, as shown in Examples 2, 3 and 4 below, the receptor or otherTo develop screening assays for binding proteins, eg, the SH2 domainThe SETL approach is used for this. Without further elaboration, one skilled in the art can, using the preceding description, utilize the present invention to its fullest extent.I'm convinced. Therefore, the following examples are merely illustrative of the present invention andShould not be construed as limiting the scope ofAssay ExamplesExample 1: Novel osteoblast kinase The cell type involved in new bone production is osteoblasts. Large-scale sequencingAs a result of applying conventional methods to osteoblast cDNA libraries, many new full-lengthKinases were identified. Each of many full-length kinases from osteoblast-like cellsIn addition, they are individually tagged with one or more epitope tags. For example,Combine unique identification tags alongside regular purification tags to facilitate the purification processCan be. Tags genes and simultaneously accepts hosts, such as E. colili) or expressed in baculovirus. Kinase target line as a mixtureUse tags to simultaneously purify all members of the library and create unique tagsThe library is characterized by Western blot using the corresponding antibodies. DIndividual members of the target library are individually immobilized via pitope tags andAdding a mixture of tope-labeled ATP and a phosphate acceptorTo identify a suitable substrate. Mass spectra of phosphorylated substratesIdentify by method. A combinatorial library of compounds is synthesized by standard methods. Target libraryThe leads are spatially coded along a suitable substrate (as described above). Suitable substrateAnd they combine both a phosphate acceptor and an epitope tag.And so that they co-localize with the appropriate kinase target. Test compoundThe product is added to each sequence along with the isotope-labeled ATP. Visualize the arrayThus, the region in which the phosphate has been incorporated is identified. Applying the active agent obtained in Example 1 to osteocalcin release correlated with bone formationScreening may be performed in a secondary assay, such as an assay. In addition,The active agent obtained in Example 1 is applied to a cell-based update for a function unrelated to bone formation.Screen in Say combinations. Preferably, the cell-basedAssay uses the reporter gene method and is described, for example, in US Pat. No. 5,401,No. 629 and 5,436,128. Such a method isTransfer gene into a suitable gene (eg, luciferase).Of various genes of interest (eg, osteocalcin)Data area. In a pluripotent cell line, such as embryonic stem cellsWhen used, the same cells can be used with different reporter constructs to(Hereinafter referred to as “assay library”)it can. Thus, the parallel approach of the present invention provides a method for all secondary assays.And improved efficiency, allowing extensive characterization of active compounds. The active agent is then preferably added to an animal model or in vitro functional assay.And screen for toxicity.Example 2: Binding assay Using the SETL approach, receptors or other binding proteins such as SH2Screening assays for domains can be formed. SH2 doTo form a SETL assay for the main, the domainAnd expressed as a tagged fusion protein. Antibody to the tag is deposited on the membrane as described above.To wear. A mixture of tagged SH2 domains is placed in each well and the corresponding antibodyJoin. Biotinylated phosphopeptide ligand (for each SH2 target)Is added together with the test compound. Streptavidin-biotin complexAnd for the addition of reagents to detect color, fluorescence or enhanced chemiluminescence (ECL)The binding of the biotinylated peptide ligand is detected more. Activity of detection reagent on membrane surfaceAllows measurement of ligand binding to individual SH2 domains. OrSuch visualization can be automated. By expressing the human src SH2 domain as a fusion protein,I actually went to essay. The fusion protein containing the human src SH2 domain is represented by the general sequence: DET1-DEIt was expressed as T2-spacer-ek-src SH2. DET1, DET2, spacer and ek are described below. DET1 ("Epito definedTag)) (SEQ ID NO: 1) is a human immunodeficiency virus type I (HIV-1) 11 found in the envelope protein gp120 (or gp160)Amino acid sequence. Species of gp120 (or gp160) of HIV-1Monoclonal antibodies against various epitopes are known in the art (See, for example, U.S. Pat. No. 5,166,050). One preferred example is a monochromatorAntibody 178.1 (Thiriart et al., J. Immunol., 143: 1832-1836 (1989)).Gp160 molecule of HIV-1 from strain BH10 expressed in yeast (Ratner et al., Nature, 313: 277-284 (1985)).Was. For protein purification (by affinity chromatography) and 1To form an assay that captures and immobilizes the fusion protein using the 78.1 antibody,This tag was used for detection of expression (by Western blot). DET2 is DA hexahistidine sequence tag (SEQ ID NO: 2) that binds to the nickel-containing resin;Used for purification purposes. Using a spacer (SEQ ID NO: 3), the necessaryA BamHI restriction site was designed at the location. The term "-ek-" isRefers to the recognition sequence of the protease (SEQ ID NO: 4),enables optimal removal of the tag from the src SH2 domain, andAn acid free src SH2 domain is obtained. In order to study crystal morphology,Src SH2 domain without noic acid is preferred over tagged proteinNo. The necessary restriction sites (BamHI and XbaI) are the spacer-ek-srcAdjacent to the SH2 region, so that another spacer-ek-SH2 construct is readily substituted into any one of the vectors described in Procedure 2 below,ET1-DET2-spacer-ek-SH2 tagged protein can be obtainedThus, each of DET1-DET2-spacer-ek-src SH2The coding DNA sequence was designed. The entire tagged SH2 domain is NdE. coli transcription and translation regulatory sequences, removed as an eI-XbaI fragmentNdeI site located at an appropriate distance downstream ofDETl- so as to be inserted into an expression vector with a cloning siteDNA sequence encoding DET2-spacer-ek-src SH2 constructThe columns were also designed. Any suitable vector (eg, pET-11a; Novagen, Inc.)In this case, the vector used in this example is an E. coli expression vector.-PEA1KnRBS3. This vector is based on Shatzman, A., Gross, M. andAnd Rosenberg, M., "Expression using vectors with phage lambda regulatory sequences "(Current Protocols in Molecular Biology (ed. by F.A. Ausbel et al.) 16.3.1 to 16.3.11) (Greene Publishing and Wiley-Interscience, N.Y. (1990)Year)) (hereinafter referred to as Ausbel et al.).The special vector pEA1KnRBS3 is described in Bergsma et al, 1991, J. Biol.: 23204-23214. The procedure below describes the expression of the chicken src and human src SH2 domains.explain. First, the chicken src SH2 domain was added to the DET1-DET2-Expressed as pacer-SH2. Next, instead of chicken and srcInto DET1-DE as described in Procedures 1 and 2 below.The T2-spacer-ek-src SH2 form of the protein was expressed.Step 1: Chicken src SH2 domain containing tags DET1 and DET2Cloning and expression of (DET1-DET2-spacer-SH2) Using the following primers by a method well known to those skilled in the art,The DNA sequence encoding DET1-DET2-spacer-SH2 was replaced with chickenA cDNA clone containing the avian src gene (p5H; Levy et al 1986. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 83: 4228). The underlined sites are the NdeI recognition site (5 ') and the BamHI recognition site (3').It is. The underlined region is the XbaI recognition site. The PCR product is digested with NdeI and XbaI and then on an agarose gelThe digestion fragment was isolated. 6.5 kb fragment on agarose gelNbaI-XbaI digested pEA1KnRBS3 vector purified as a(Bergsma et al., Supra). E. Using ligation reactantscoli MM294cI+(F.A. Ausbel et al., Supra). Right hulaA plasmid with a fragment insertion was identified and confirmed by DNR sequencing. ProfitThe plasmid obtained was phage lambda PLControl of promoters and regulatory systemsIt encodes the underlying DET1-DET2-spacer-SH2. PlasmidDNA was transferred to MM294cI+And transformed into E. coli AR120 strain. ThisGrows nalidixic acid as described in the above-mentioned document by F.A.Ausbel et al.Can induce phage promoter expression when added to medium culturesit can. Nalidixic acid induction of strain AR120 containing this plasmid, followed by-Cellular analysis on SDS-polyacrylamide gelsA. Ausbel et al., Supra) reveals a protein band with an apparent molecular weight of 15,000.did. This band is pEA1 without uninduced cells or PCR amplified fragments.It was not found in the induced cells containing KnRBS3. Western BlottinInduced protein band reacts with anti-DET1 monoclonal antibody 178.1It was confirmed that.Step 2: Human src having tag and enterokinase proteolytic cleavage siteSH2 domain (DET1-DET2-spacer-ek-src SH2)Cloning, expression and purification Using the following primers, a cDNA clone containing the human src gene (TakeThe same c-src S as described in ya, T. and Hanafusa, H, 1983 Cell 32: 881-890.H2 DNA sequence), the DNA sequence encoding the protein ek-src SH2Was PCR amplified. The underlined site is the BamHI recognition site. The underlined region is the XbaI recognition site. The PCR product was digested with BamHI and XbaI and then agarose gelThe digestion fragment was isolated above. Chickens with tags as described in step 1 aboveBamHI-Xb containing src gene DET1-DET2-spacer-SH2The fragment was ligated into the aI digestion expression vector. In that vector, BAn amHI site exists between the DET2 and SH2 coding regions,The site is located after the 3 'end of the SH2 coding region. Use ligation reactantsAnd E.coli MM294cI+Was transformed. Construct DET1-DET2-spec-Ek-src SH2 was confirmed by DNA sequencing (SEQ ID NO: 5).And in E. coli AR120 strain as described in Procedure 1 above. Coomassie bullInduced protein with an apparent molecular weight of 16,000 stained withA white band was observed after nalidixic acid induction. Lysis cells at neutral pH by sonication in the presence of lysozymedid. After centrifugation, the soluble extract was+-Chromatography with NTA columnI was served. Equilibration buffer (Tris buffer p containing 0.5 M NaCl)H8) and wash the column with the same buffer containing 15 mM imidazoleThe protein DET1-DET2- was then added with 25 mM imidazole in the equilibration buffer.Spacer-ek-src SH2 eluted in highly purified form. Mab 178.1 was manually spotted on PVDF membrane and tagged src SAfter addition of the H2 domain, a biotinylated phosphopeptide against src SH2Probing with ligand (SEQ ID NO: 6) followed by ECL or colorimetryDetection showed a clear signal. If equal amounts of irrelevant antibodies are used,No Gunnar was seen. Immobilized src SH2 domain of biotinylated phosphopeptideThe bond to the main is a non-biotinylated phosphope of the same amino acid sequence as the biotinylated molecule.Inhibited by addition of peptide competitor.Example 3: Protease assay As with the kinase assay, the target library must beThere is a need to identify optimal substrates for the library components. If you know this, it will be cleavedHas an appropriate tag on one side of the site and a detectable label, such as biotin, on the otherA base material is synthesized. Once immobilized, the protein is lost due to the loss of label from the target site.The ase activity can be identified.Example 4: Biopanning method Screening of compound libraries with multiple targets based on beadsG Each gene in the target library is expressed with two epitope tags. SoThey consist of a common tag C (same for all genes) and an individual tag T (Is different for each gene). Bead a combinatorial library by standard methodsCombine above. By measuring the binding between beads and tag C, the target libraryScreen the combinatorial library usingSeparation by either moving or automatic methods. After separation, eg washing at low pHElutes proteins from each positive bead, then separates the spatially encodedIt is bound to the sequence of the antibody against tag T. Matrix using antibodies to CThe location of protein spectra from positive beads by probing(Ie, identify). Such probes are easily detectable, such as biotinIt is labeled with a marker and then read out. In addition, from positive beadsThe active compound is identified by cleavage and then analyzed chemically / physically. While the preferred embodiments of the invention have been described above, the invention is not limited to those disclosed herein.Without limitation, it is intended that all modifications falling within the scope of the following claims be qualifiedIt will be appreciated that interest is retained.
─────────────────────────────────────────────────────フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ０８／４９７，３５７(32)優先日 1995年６月30日(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl.6 Identification symbol FI (C12P 21/00 C12R 1:19) (31) Priority claim number 08 / 497,357 (32) Priority date June 30, 1995 (33) Countries claiming priority United States (US) (81) Designated States EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), JP, US