【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、生物由来の試料中
に存在する微量の異常プリオン蛋白質もしくはその部分
分解断片を、簡便な操作で感度よく検出する方法を提供
する。TECHNICAL FIELD The present invention provides a method for detecting a trace amount of abnormal prion protein or a partially degraded fragment thereof present in a sample derived from an organism with high sensitivity by a simple operation.
【０００２】[0002]
【従来の技術】近年、１９８０年代後半の英国での牛海
綿状脳症（ＢＳＥ）の大流行を境に、食品、医薬品、化
粧品などとして幅広く利用されている牛由来の製品の安
全性に対する社会的な混乱が起きている。さらに１９９
６年３月には、英国政府が、ヒトの伝達性海綿状脳症で
あるクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）について、
臨床経過、脳病変および発症年齢の面で従来のものとは
異なる新型のＣＪＤ（ｖＣＪＤ）が、ＢＳＥにより伝播
した可能性が考えられるとの発表を行ったため、伝達性
海綿状脳症に対する関心が非常に高まっている。しか
し、本疾患が、ウシなどの動物から種を越えてヒトにも
伝達するのか否か、そして伝達するとしたら如何なる経
路によるのか等の、伝達性海綿状脳症の感染・発病機構
については未だ解明されていない。よって、現在のとこ
ろ、ウシ由来の製品への危険因子の混入を防ぐことでＣ
ＪＤの罹患を予防することが第一に要求される。そのた
めには、製品中に異常プリオン蛋白質が存在しないよう
な生物材料の選択、および製品の検定システムの確立が
重要であると考えられる。2. Description of the Related Art In recent years, following the outbreak of bovine spongiform encephalopathy (BSE) in the United Kingdom in the late 1980's, social concerns regarding the safety of bovine-derived products widely used as foods, pharmaceuticals, cosmetics, etc. Confusion is occurring. Further 199
In March 2006, the UK government announced that Creutzfeldt-Jakob disease (CJD), a human transmissible spongiform encephalopathy,
Interest in transmissible spongiform encephalopathy is very high because a new type of CJD (vCJD), which differs from the conventional one in terms of clinical course, brain lesions and age of onset, may have been transmitted by BSE. Is growing. However, the mechanism of infection and pathogenesis of transmissible spongiform encephalopathy, such as whether this disease is transmitted from animals such as cattle to humans across species, and if so, how, is still elucidated. Not. Therefore, at present, it is possible to prevent C
Prevention of JD is primarily required. To this end, it is considered important to select biological materials that do not contain abnormal prion proteins in products and to establish a product assay system.
【０００３】伝達性海綿状脳症は、中枢神経系の海綿状
変性を主微とする伝達性疾患で、具体例としてヒトのＣ
ＪＤ、ヒツジのスクレイピー、ウシのＢＳＥ等が挙げら
れる。いずれも感染後、長期間の潜伏期間の後に発症
し、ほぼ神経系に限局した症状が現れ、進行性に増悪し
て死に至る。これらの疾患に共通な感染因子として通常
のウイルスは同定されておらず、未だ明らかにはなって
いないが、生理的、化学的、生物学的に異常な特性を示
すことが知られている（D．M．Asherら、Laboratory Sa
fety：Principles and Practices（B．M．Miller編），
pp．59-71，American Society for Microbiology，Wash
ington，DC（1986))。近年、本疾患に特異的なプリオン
蛋白質の存在が認められ、プリオンが病原体の構成物で
あるという「プリオン仮説」が有力であると考えられて
いる（S．B．Prusiner，Science，216：136-144（198
2））。[0003] Transmissible spongiform encephalopathy is a transmissible disease mainly caused by spongiform degeneration of the central nervous system.
JD, sheep scrapie, bovine BSE and the like. Both develop after a long incubation period after infection, with symptoms almost confined to the nervous system, progressively worsening and leading to death. The common virus has not been identified as a common infectious agent for these diseases and has not yet been elucidated, but is known to exhibit abnormal physiological, chemical, and biological properties ( D. M. Asher et al., Laboratory Sa
fety: Principles and Practices (edited by B.M. Miller),
pp. 59-71, American Society for Microbiology, Wash
tonington, DC (1986)). In recent years, the presence of a prion protein specific to this disease has been recognized, and the "prion hypothesis" that prions are a component of pathogens is considered to be powerful (SB Prusiner, Science, 216: 136). -144 (198
2)).
【０００４】プリオン蛋白質は細胞膜に存在する糖蛋白
質であり、アミノ酸配列は哺乳動物の間では非常によく
保存されている。ヒト、ヒツジ、ウシの間の相同性は約
90％以上であり（山内一也・立石潤編、スローウイルス
感染とプリオン、p．243-245，近代出版（1995））、最
近では真核細胞である酵母からもプリオン様の蛋白質が
見いだされている（R．B．Wickner，Science，264，566
-569（1994））。プリオン蛋白質の生体での機能につい
ては明らかになっていないが、正常なプリオン蛋白質
が、スクレイピー発病動物にみられるプリオン蛋白質
（以後、異常プリオン蛋白質と呼ぶ）に変化することに
より発病すると考えられている。しかしながら、正常プ
リオン蛋白質と異常プリオン蛋白質の間でアミノ酸配列
に違いはなく（N．Stahl，Biochemistry，32：1991-200
2（1993））、両者を区別する唯一の手段は、異常プリ
オン蛋白質が持つ、蛋白質分解酵素（プロテイナーゼ
Ｋ）に対する抵抗性を利用することのみである（D．C．
Bolton，Science，218：1309-1311（1982））。[0004] The prion protein is a glycoprotein present in the cell membrane, and its amino acid sequence is very well conserved among mammals. The homology between human, sheep and cattle is about
It is more than 90% (Kazuya Yamauchi and Jun Tateishi, Slow virus infection and prions, pp. 243-245, Modern Press (1995)), and recently prion-like proteins have been found in eukaryotic yeast. (RB Wickner, Science, 264, 566
-569 (1994)). Although the function of the prion protein in vivo has not been elucidated, it is thought that the disease occurs when normal prion protein changes into a prion protein found in animals with scrapie disease (hereinafter referred to as abnormal prion protein). . However, there is no difference in amino acid sequence between the normal prion protein and the abnormal prion protein (N. Stahl, Biochemistry, 32: 1991-200).
2 (1993)), the only means to distinguish between the two is to use the resistance of the abnormal prion protein to proteolytic enzymes (proteinase K) (D.C.
Bolton, Science, 218: 1309-1311 (1982)).
【０００５】これまで、異常プリオン蛋白質に対する特
異抗体を得ようとする試みが多数なされてきた（例え
ば、S．B．Prusiner，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，9
0，10608-10612（1993）を参照されたい）。しかし、プ
リオン蛋白質が異種動物においてかなり高い相同性をも
って存在すること、正常と異常のプリオン蛋白質の間の
アミノ酸配列が全く同じであることなどから、抗体の取
得は非常に困難であり、現在までに得られているプリオ
ン蛋白質抗体はすべて正常、異常プリオン蛋白質の両者
を認識する（R．A．Williamson，Proc．Natl．Acad．Sc
i.，USA，93，7279-7282（1996））。There have been many attempts to obtain specific antibodies against abnormal prion proteins (for example, SB Prusiner, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 9).
0, 10608-10612 (1993)). However, since the prion protein exists in a highly homologous animal in a heterologous animal and the amino acid sequence between the normal and abnormal prion proteins is exactly the same, obtaining an antibody is extremely difficult. All the prion protein antibodies obtained recognize both normal and abnormal prion proteins (RA Williamson, Proc. Natl. Acad. Sc.
i., USA, 93, 7279-7282 (1996)).
【０００６】異常プリオン蛋白質は脳に多量に蓄積する
ことから、例えば、ヒトのＣＪＤや、ヒツジのスクレイ
ピーの病理学的診断の場合、未固定脳１ｇを材料とした
ウエスタンブロット法が用いられている。本発明者らが
作製した抗体を用いたウエスタンブロット法では、異常
プリオン蛋白質の検出限界は３−６ｎｇであり（結果は
示さず）、これは高度に異常プリオン蛋白質が蓄積して
いる発症個体の脳については有効である。しかし、実際
に診断に応用する場合、脳よりも採取しやすい組織での
検出が望ましいが、脳以外の蓄積量の少ない部位での検
出にはより高感度な検出方法が要望される。Since abnormal prion proteins accumulate in the brain in large amounts, for example, in the pathological diagnosis of human CJD or sheep scrapie, Western blotting using 1 g of unfixed brain is used. . In the Western blot method using the antibody prepared by the present inventors, the detection limit of abnormal prion protein was 3 to 6 ng (the result is not shown), which indicates that the abnormal prion protein is highly accumulated in affected individuals. It works for the brain. However, when actually applied to diagnosis, it is desirable to detect in a tissue that is easier to collect than in the brain, but a detection method with higher sensitivity is required for detection in a site other than the brain where the amount of accumulation is small.
【０００７】一方、食品、医薬品、化粧品等に広く利用
されている生物由来の製品（例えば、ウシではゼラチ
ン、コラーゲン、牛乳等）については、感染実験で異常
プリオン蛋白質の蓄積がほとんどないと考えられている
部位を材料としているため、仮に存在したとしてもウエ
スタンブロット法の検出限界以下であることが予想され
る。したがって、これらの製品の安全性を検定する方法
は、現在のところマウスなどの動物への感染実験が主で
ある。On the other hand, biological products widely used in foods, pharmaceuticals, cosmetics, etc. (eg, gelatin, collagen, milk, etc. in cattle) are considered to have little accumulation of abnormal prion protein in infection experiments. Since such a site is used as a material, it is expected that even if present, it is below the detection limit of Western blotting. Therefore, the method of assaying the safety of these products is currently mainly based on experiments on infection of animals such as mice.
【０００８】[0008]
【発明が解決しようとする問題点】しかし、マウスの感
染実験では発症までの期間が約１年と長いこと、また接
種や飼育などの特別な施設および技術が必要であること
などの問題点があるため、より迅速かつ簡便で感度の高
い検出方法が望まれている。[Problems to be Solved by the Invention] However, in the experiment on infection of mice, there are problems such as a long period of time until onset of about one year, and special facilities and techniques such as inoculation and breeding are required. Therefore, a quicker, simpler and more sensitive detection method is desired.
【０００９】今日、生体試料等からの特定蛋白質の検出
には、簡便で迅速な方法の一つである、特異抗体を用い
たＥＬＩＳＡ法が汎用されている。しかし、プリオン蛋
白質については、D．Serbanら（Nurology，40，110-117
（1990））およびR．J．Kascsakら（Journal of Virolo
gy，61，3688-3693（1987））のように、ＥＬＩＳＡ法
を抗体のスクリーニングに使用する例はあるが、生物試
料中のプリオン蛋白質の検出のためにＥＬＩＳＡ法を用
いた報告はない。[0009] Today, an ELISA method using a specific antibody, which is one of simple and rapid methods, is widely used for detecting a specific protein from a biological sample or the like. However, regarding the prion protein, D.A. Serban et al. (Nurology, 40, 110-117)
(1990)) and R.S. J. Kascsak et al. (Journal of Virolo
gy, 61, 3688-3693 (1987)), there is an example in which an ELISA method is used for antibody screening, but there is no report using the ELISA method for detecting a prion protein in a biological sample.
【００１０】[0010]
【問題点を解決するための手段】そこで、本発明者らは
上記課題を解決する目的で、抗プリオン蛋白質抗体を用
いた高感度検出法として、ＥＬＩＳＡ法を応用したイム
ノＰＣＲ法（Sanoら、Science，258，120-122（199
3））に着目した。ＥＬＩＳＡ法は抗体を酵素標識して
酵素の特異的反応を指標に抗体を検出するのに対して、
イムノＰＣＲ法は抗体を任意のＤＮＡ断片で標識して当
該ＤＮＡ断片をＰＣＲにより検出する。Means for Solving the Problems In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have developed an immuno-PCR method (Sano et al., Using ELISA) as a highly sensitive detection method using an anti-prion protein antibody. Science, 258, 120-122 (199
3)). In the ELISA method, an antibody is labeled with an enzyme and the antibody is detected based on the specific reaction of the enzyme.
In the immuno-PCR method, an antibody is labeled with an arbitrary DNA fragment, and the DNA fragment is detected by PCR.
【００１１】即ち、本発明は、抗プリオン蛋白質抗体を
用いた異常プリオン蛋白質の高感度検出に関し、より特
定すれば、抗プリオン蛋白質抗体を用いたイムノＰＣＲ
法により異常プリオン蛋白質を高感度で検出することに
関する。That is, the present invention relates to high-sensitivity detection of abnormal prion protein using an anti-prion protein antibody, and more particularly, to immuno-PCR using an anti-prion protein antibody.
And method for detecting abnormal prion protein with high sensitivity.
【００１２】本発明は、生物材料由来の製品の異常プリ
オン蛋白質による汚染の検定のみならず、ヒトおよび原
材料となる家畜の早期診断などへ応用することもでき
る。The present invention can be applied not only to the examination of contamination of products derived from biological materials with abnormal prion proteins, but also to the early diagnosis of humans and livestock as raw materials.
【００１３】以下、本発明の方法を実施するための手順
を順を追って説明するが、当業者の常識の範囲内で追加
および変更等の修正がなされてよいことは、認識される
べきである。Hereinafter, the procedure for carrying out the method of the present invention will be described step by step. However, it should be recognized that additions, changes, and other modifications may be made without departing from the common sense of those skilled in the art. .
【００１４】試料のプロテイナーゼＫによる分解 異常プリオン蛋白質は、正常プリオン蛋白質とアミノ酸
配列上の違いはないが、翻訳後の修飾により立体構造が
変化し、蛋白質分解酵素であるプロテイナーゼＫに対す
る抵抗性を得ると考えられている（B．Caughey，Journa
l of Biological Chemistry，266，18217-18226（199
1））。現在までに得られているプリオン蛋白質抗体は
いずれも正常と異常の両者に反応することから、試料を
プロテイナーゼＫにより前処理することにより、正常プ
リオン蛋白質のみを消化する。これにより処理前には同
等であった抗体との反応性が、異常プリオン蛋白質につ
いてのみ上昇する。この抗体との反応性の差違を利用し
て、正常と異常プリオン蛋白質の識別を行う。The abnormal prion proteindegraded by proteinase K in the sample has no difference in amino acid sequence from the normal prion protein, but its tertiary structure is changed by post-translational modification, and resistance to proteinase K, which is a protease, is obtained. (B. Caughey, Journa
l of Biological Chemistry, 266, 18217-18226 (199
1)). Since all prion protein antibodies obtained to date react with both normal and abnormal, pretreating the sample with proteinase K digests only normal prion protein. This increases the reactivity with antibodies that were equivalent before treatment only for abnormal prion proteins. Using the difference in reactivity with the antibody, normal and abnormal prion proteins are distinguished.
【００１５】スクレイピー帯広株感染・非感染のＣ５７
ＢＬ／６マウスの脳に、３mM PMSFおよび１％アプロチ
ニンを含むＲＩＰＡバッファー（５mMトリス塩酸バッフ
ァー（pH7.6）、150mM塩化ナトリウム、５mM EDTA、0.5
％ トライトンX-100、0.5％デオキシコール酸ナトリウ
ム）を加え、ホモジナイザーを用いて10％脳乳剤を調製
する。これを、11,900×ｇにて60分間遠心分離した上清
をマウス脳ホモジネートとする。これについて、市販の
蛋白質定量試薬、例えばＢＣＡプロテインアッセイ試薬
（PIERCE社）を用いて総蛋白質量の定量を行う。C57 infected with or without scrapie obi strain
In the brain of BL / 6 mice, a RIPA buffer containing 3 mM PMSF and 1% aprotinin (5 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6), 150 mM sodium chloride, 5 mM EDTA, 0.5 mM
% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate) and prepare a 10% brain emulsion using a homogenizer. This is centrifuged at 11,900 × g for 60 minutes to obtain a mouse brain homogenate. For this, the total protein amount is quantified using a commercially available protein quantification reagent, for example, a BCA protein assay reagent (PIERCE).
【００１６】総蛋白質量１μgに対し、２ngプロテイナ
ーゼＫを加え、37℃で２時間反応させた後、終濃度２％
となるように10％ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）を加
え、95℃、10分間煮沸して試料とする。尚、マウス脳の
試料調製法を記載したが、伝達性海綿状脳症の疑いのあ
る生物の組織、あるいは疑いのある生物由来の加工品、
例えばゼラチンやコラーゲンなども同様の方法により試
料とすることが出来る。After adding 2 ng of proteinase K to 1 μg of the total protein and reacting at 37 ° C. for 2 hours, the final concentration was 2%.
Add 10% sodium lauryl sulfate (SDS) and boil at 95 ° C for 10 minutes to obtain a sample. In addition, although the method for preparing a sample of the mouse brain is described, a tissue of an organism suspected of transmissible spongiform encephalopathy, or a processed product derived from the suspected organism,
For example, gelatin or collagen can be used as a sample by the same method.
【００１７】イムノＰＣＲによる検出 プリオン蛋白質に対して特異的なポリクローナル抗体
は、公知の方法により調製される。例えば“Current pr
otocols in immunology: J．E．Coliganら、Green Publ
ishing Associates and Wiley-lnterscience”（1990）
を参照されたい。正常プリオン蛋白質は、中枢神経系の
細胞表面に多く存在することから、正常な野生型マウス
（prn+/+）の脳乳剤をプリオン蛋白質遺伝子欠損マウス
（prn-/-）に免疫することにより抗プリオン蛋白質抗体
を得ることができる。抗プリオン蛋白質抗体はビチオン
化することにより、イムノＰＣＲに用いることができ
る。Detection by immunoPCR A polyclonal antibody specific to a prion protein is prepared by a known method. For example, “Current pr
otocols in immunology: J. E. Coligan et al., Green Publ
ishing Associates and Wiley-lnterscience ”(1990)
Please refer to. Since normal prion protein is abundant on the cell surface of the central nervous system, immunization of a prion protein gene-deficient mouse (prn-/-) with a brain emulsion of normal wild-type mouse (prn + / +) A protein antibody can be obtained. The anti-prion protein antibody can be used for immunoPCR by converting it to a biotin.
【００１８】尚、一般に、抗体は蛋白質の特定の分解断
片を用いても作成可能なことは当業者には周知であるこ
とから、異常プリオン蛋白質の特定の部分断片をペプチ
ド合成機等により得て、これを用いて抗体を作成しても
よい。In general, it is well known to those skilled in the art that an antibody can be prepared using a specific degraded fragment of a protein. Therefore, a specific partial fragment of an abnormal prion protein is obtained by a peptide synthesizer or the like. , May be used to prepare an antibody.
【００１９】マイクロタイタープレート等に固相化した
抗原に対し、ビオチン化した抗体プリオン蛋白質抗体と
ストレプトアビジン、ビオチン化ＤＮＡが連結した抗体
−ＤＮＡの複合体を結合させる。ビオチン化ＤＮＡに
は、試料に含まれる可能性のあるウシのＤＮＡと系統的
に離れている如何なるＤＮＡ、例えば大腸菌由来のプラ
スミドＤＮＡを使用できるが、これに限定されない。使
用されるＤＮＡの長さは、50-1500bp程度が好ましい。
また、抗体−ＤＮＡ複合体の形成には、Sanoら（Scienc
e，258，120-122（1993））のように、抗体、プロテイ
ンＡ−ストレプトアビジン・キメラ蛋白質、ビオチン化
ＤＮＡを用いてもよいし、Ruzickaら（Science，260，6
98-699（1993））のように、抗原特異抗体を特定の動物
例えばマウスで作製し、これにビオチン化抗マウスＩｇ
抗体、ストレプトアビジン、ビオチン化ＤＮＡを連結さ
せてもよい。あるいは、抗体とアビジンのコンジュゲー
トを作製してビオチン化ＤＮＡと連結させることも可能
である。固相化マイクロタイタープレートを複数回洗浄
した後、各ウエルにＰＣＲ反応液を注ぎ、ＰＣＲを行っ
て増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動後、エチ
ジウムブロマイド染色によって検出する。また、電気泳
動後のアガロースゲルからＤＮＡをニトロセルロース膜
に吸着させ、標識プローブとのハイブリッド形成をオー
トラジオグラムによって検出するサザンブロット法を用
いれば、エチジウムブロマイド染色よりもさらに高い検
出感度を得ることができる。An antigen immobilized on a microtiter plate or the like is combined with an antibody-DNA complex in which a biotinylated antibody prion protein antibody is linked to streptavidin and biotinylated DNA. As the biotinylated DNA, any DNA that is systematically separated from bovine DNA that may be contained in the sample, for example, plasmid DNA derived from Escherichia coli can be used, but is not limited thereto. The length of the DNA used is preferably about 50-1500 bp.
In addition, for the formation of the antibody-DNA complex, Sano et al.
e, 258, 120-122 (1993)), an antibody, protein A-streptavidin chimeric protein, biotinylated DNA may be used, or Ruzicka et al. (Science, 260, 6).
98-699 (1993)), an antigen-specific antibody was prepared in a specific animal, for example, a mouse, and this was added to a biotinylated anti-mouse Ig.
An antibody, streptavidin, and biotinylated DNA may be linked. Alternatively, a conjugate of an antibody and avidin can be prepared and ligated to biotinylated DNA. After washing the solid-phased microtiter plate several times, a PCR reaction solution is poured into each well, DNA amplified by PCR is subjected to agarose gel electrophoresis, and then detected by ethidium bromide staining. In addition, the use of Southern blotting, in which DNA is adsorbed to a nitrocellulose membrane from an agarose gel after electrophoresis and hybridization with a labeled probe is detected by autoradiogram, provides higher detection sensitivity than ethidium bromide staining. Can be.
【００２０】以下、実施例により本発明の方法を具体的
に説明するが、これらの実施例は好ましい態様の例示で
あり、本発明を限定することを意図しない。Hereinafter, the method of the present invention will be specifically described with reference to examples. However, these examples are exemplifications of preferred embodiments, and are not intended to limit the present invention.
【００２１】[0021]
【実施例】実施例１ 抗血清（マウス）の作製 非感染マウス脳（Ｃ５７ＢＬ／６）を10％脳乳剤となる
ようにRPMI1640培地（GIBCO BRL社）を加え、ホモジナ
イズした。遠心分離（3000rpm、30分間）後の上清を等
量のフロイント完全アジュバントによりエマルジョン化
して免疫原とした。このエマルジョン0.5mlをプリオン
蛋白質遺伝子欠損マウスに腹腔内注射した。追加免疫
は、２〜３週間の間隔で上記ホモジネートをフロイント
不完全アジュバントとして行った。最終免疫から14日後
に試験採血して、ＥＬＩＳＡ法により抗体価を測定し
た。Example 1 Preparation of Antiserum (Mouse) Non-infected mouse brain (C57BL / 6) was homogenized by adding RPMI1640 medium (GIBCO BRL) so as to form a 10% brain emulsion. The supernatant after centrifugation (3000 rpm, 30 minutes) was emulsified with an equal volume of Freund's complete adjuvant to obtain an immunogen. 0.5 ml of this emulsion was injected intraperitoneally into mice lacking the prion protein gene. Booster immunizations were performed at 2-3 week intervals with the homogenate as Freund's incomplete adjuvant. Test blood was collected 14 days after the final immunization, and the antibody titer was measured by ELISA.
【００２２】ＥＬＩＳＡは公知の方法により行った（例
えば、"Current protocols in immunology：J．E．Coli
ganら、Green Publishing Associates and Wiley-Inter
science"（1990）を参照されたい）。十分に抗体価の上
がった抗血清をMAb Trap Gllキット（ファルマシア社）
を用いてＩｇＧ精製し、以下の試験に用いた。The ELISA was performed by a known method (for example, "Current protocols in immunology: JE. Coli").
gan et al., Green Publishing Associates and Wiley-Inter
science "(1990). MAb Trap Gll kit (Pharmacia)
Was purified using IgG and used for the following tests.
【００２３】実施例２ 抗体のビオチン修飾 精製した抗プリオン抗体１ｇＧを、蛋白質ビオチン化シ
ステム（GIBCO BRL社）によりビオチン標識した。Example 2 Biotin Modification of Antibody Purified anti-prion antibody 1 gG was labeled with biotin using a protein biotinylation system (GIBCO BRL).
【００２４】実施例３ ビオチン化ＤＮＡの作製 大腸菌プラスミドpBR322のＤＮＡを公知の方法（Molecu
lar Cloning：J．Sambrookら、Cold Spring Harbor Lab
oratory Press（1989)）により精製した。pBR322（約4.
3kbp）のPstI部位（ヌクレオチド第3609番）からSalI部
位（ヌクレオチド第651番）を含むような約1.5kbpのＤ
ＮＡ断片について、pBR322PstIプライマー（配列番号
１）およびpBR322SalIプライマー（配列番号２）をビ
オチン化してそれぞれフォワードプライマーおよびリバ
ースプライマーとしてＰＣＲ増幅を行った。反応液50μ
l中の組成は、10×ＰＣＲバッファーll（パーキンエル
マー社）５μl、1.5mM MgCl2、0.2mM dNTP、配列番号１
および２の合成ビオチン化プライマー各５pmol、250pg
pBR322、Taq DNAポリメラーゼ（パーキンエルマー社）
1.25Ｕで、Program Temp Control Syster PC-800（アス
テック社）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は表
１のとおりである。フォワードプライマー：5'-AGT CAT
GCC CCG CGC-3'（配列番号１）リバースプライマー：
5'-GCT AGA GTA AGT AGT T-3'（配列番号２）Example 3 Preparation of Biotinylated DNA The DNA of Escherichia coli plasmid pBR322 was prepared by a known method (Molecu
lar Cloning: J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab
oratory Press (1989)). pBR322 (about 4.
3 kbp) from about 1.5 kbp D to include aPst I site (nucleotide 3609) to aSal I site (nucleotide 651).
With respect to the NA fragment, the pBR322Pst I primer (SEQ ID NO: 1) and the pBR322Sal I primer (SEQ ID NO: 2) were biotinylated and subjected to PCR amplification as a forward primer and a reverse primer, respectively. Reaction liquid 50μ
The composition in l is 5 μl of 10 × PCR buffer II (Perkin Elmer), 1.5 mM MgCl2 , 0.2 mM dNTP, SEQ ID NO: 1.
5 pmol, 250 pg each of synthetic biotinylated primers of 2 and 2
pBR322, Taq DNA polymerase (PerkinElmer)
PCR was performed at 1.25 U using Program Temp Control Syster PC-800 (Astec). Table 1 shows the PCR conditions. Forward primer: 5'-AGT CAT
GCC CCG CGC-3 '(SEQ ID NO: 1) reverse primer:
5'-GCT AGA GTA AGT AGT T-3 '(SEQ ID NO: 2)
【００２５】[0025]
【表１】表１ プレインキュベーション ９４℃ ７分 変性 ９４℃ １.５分 アニーリング ５２℃ １分 伸長合成 ７２℃ ２分 サイクル：２５回 増幅産物は、アガロースゲル電気泳動後、Sephaglas Ba
ndPrep Kit（ファルマシア社）により精製した。Table 1 Pre-incubation 94 ° C for 7 minutes Denaturation 94 ° C for 1.5 minutes Annealing 52 ° C for 1 minute Extension synthesis 72 ° C for 2 minutes Cycle: 25 times The amplification product was separated by agarose gel electrophoresis and then separated by Sephaglas Ba.
Purification was performed using ndPrep Kit (Pharmacia).
【００２６】実施例４ 抗原の作製 本発明の方法によって検出する抗原は、前述のマウス脳
ホモジネートに加え、プリオン蛋白質が凝集したものと
考えられているscrapie associated fibril（ＳＡＦ）
を使用した。ＳＡＦは下記のようにして調製した。Example 4 Preparation of Antigen In addition to the mouse brain homogenate described above, the antigen to be detected by the method of the present invention was scrapie associated fibril (SAF), which is considered to be an aggregate of prion protein.
It was used. SAF was prepared as follows.
【００２７】スクレイピー感染マウス（Ｃ５７ＢＬ／
６）脳を、10％ザルコシル（WAKO社）を含む10mMトリス
塩酸バッファー（pH7.4）中でホモジナイズし、10％乳
剤を調製した。これを、70000×ｇにて10分間遠心分離
して上清を再度70000×ｇにて25分間遠心分離し、沈殿
を１％ザルコシル、10％ NaClを含む10mMトリス塩酸バ
ッファー（pH7.4）で洗浄後、100000×ｇにて25分間遠
心分離して沈殿を回収した。沈殿を適量の同バッファー
に懸濁し、脳１ｇに対して１μgのプロテイナーゼＫ（W
AKO社製）を加え、37℃、１時間インキュベートした。
再び、100000×ｇにて10分間遠心分離し、沈殿を20mMト
リス塩酸バッファー（pH7.4）で洗浄後、同条件の遠心
分離で沈殿を回収し、適量の同バッファーに懸濁した。
得られたＳＡＦはSDS-PAGEにより約80％以上の精製度で
あることを確認した。Scrapie-infected mice (C57BL /
6) The brain was homogenized in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 10% Sarkosyl (WAKO) to prepare a 10% emulsion. This was centrifuged at 70,000 × g for 10 minutes, the supernatant was again centrifuged at 70,000 × g for 25 minutes, and the precipitate was washed with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 1% sarkosyl and 10% NaCl. After washing, the precipitate was collected by centrifugation at 100,000 × g for 25 minutes. The precipitate was suspended in an appropriate amount of the same buffer, and 1 μg of proteinase K (W
(AKO) was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour.
Again, the mixture was centrifuged again at 100,000 × g for 10 minutes, and the precipitate was washed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4). The precipitate was recovered by centrifugation under the same conditions, and suspended in an appropriate amount of the same buffer.
The obtained SAF was confirmed to have a purity of about 80% or more by SDS-PAGE.
【００２８】実施例５ ＳＡＦのイムノＰＣＲによる検出 ２％ SDS存在下で熱変性させたＳＡＦを0.2％アジ化ナ
トリウムを含む20mMトリス塩酸バッファー（pH9.5）
で、60ng/mlから10倍段階希釈した。希釈液100μlをマ
イクロタイタープレート（96穴）に固相化後、１mg/ml
サケ精子ＤＮＡおよび4.5％スキムミルクを含むTETBS
（150mM塩化ナトリウム、20mMトリス塩酸（pH7.5）、0.
02％アジ化ナトリウム、0.1mM EDTA、0.1％トウィーン2
0）120μlで37℃、80分間ブロッキングした。250μlのT
ETBSを加え５分間放置後、液を除く洗浄操作を３回繰り
返し、余分な蛋白質を除去した後、0.1mg/mlサケ精子Ｄ
ＮＡおよび0.45％スキムミルクを含むTETBS 100μlに、
10-14molビチオン化ＤＮＡ、500倍希釈のビチオン化抗
プリオン蛋白質抗体、0.1μg/mlストレプトアビジンを
混合した溶液をウエルに注ぎ、室温で４５分間反応を行
った。ブロッキング後と同様に、TETBS 250μlで５分間
12回洗浄し、次いで0.02％アジ化ナトリウムを除いたト
リス塩酸バッファー（pH7.4）250μlで５分間３回洗浄
した。Example 5 Detection of SAF by ImmunoPCR SAF heat-denatured in the presence of 2% SDS was added to 20 mM Tris-HCl buffer (pH 9.5) containing 0.2% sodium azide.
, And serially diluted 10-fold from 60 ng / ml. After immobilizing 100 μl of the diluted solution on a microtiter plate (96 wells), 1 mg / ml
TETBS containing salmon sperm DNA and 4.5% skim milk
(150 mM sodium chloride, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1
02% sodium azide, 0.1 mM EDTA, 0.1% Tween 2
0) Blocking was carried out at 37 ° C. for 80 minutes with 120 μl. 250 μl T
After adding ETBS and allowing to stand for 5 minutes, the washing operation of removing the liquid was repeated three times to remove excess protein, and then 0.1 mg / ml salmon sperm D
In 100 μl of TETBS containing NA and 0.45% skim milk,
A solution in which 10-14 mol of biotinylated DNA, 500-fold diluted biotinylated anti-prion protein antibody, and 0.1 μg / ml streptavidin were mixed was poured into the wells, and the mixture was reacted at room temperature for 45 minutes. 5 minutes with 250 µl of TETBS as after blocking
The plate was washed 12 times, and then washed 3 times for 5 minutes with 250 μl of Tris-HCl buffer (pH 7.4) from which 0.02% sodium azide had been removed.
【００２９】各ウエルに10×ＰＣＲバッファーll（パー
キンエルマー社）2.5μl、1.5mM MgCl2、0.2mM dNTP、
配列番号３および４の合成プライマー各10pmol、Taq DN
Aポリメラーゼ（パーキンエルマー社）0.625Ｕを含む反
応液25μlを加え、表２の条件でＰＣＲを行った。ＰＣ
Ｒプライマーは実施例３の約1.5kbp断片中から選択され
るが、本実施例で用いたフォワードプライマーおよびリ
バースプライマー（配列番号３および４）およびＰＣＲ
の反応条件は、プライマー設計ソフトＯＬＩＧＯ（Wojc
iech Rychiek社）によって決定した。配列番号３および
４は、pBR322（約4.3kbp）中、それぞれヌクレオチド第
315-334番およびヌクレオチド第3632-3651番に相当す
る。 フォワードプライマー：5'-TCC AAG TAG CGA AGC GAG CA-3'（配列番号３） リバースプライマー：5'-TCG TCG TTT GGT ATG GCT TC-3'（配列番号４）In each well, 2.5 μl of 10 × PCR buffer II (Perkin Elmer), 1.5 mM MgCl2 , 0.2 mM dNTP,
10 pmol of each of the synthetic primers of SEQ ID NOs: 3 and 4, Taq DN
25 μl of a reaction solution containing 0.625 U of A polymerase (Perkin Elmer) was added, and PCR was performed under the conditions shown in Table 2. PC
The R primer is selected from the about 1.5 kbp fragment of Example 3, but the forward and reverse primers (SEQ ID NOs: 3 and 4) and PCR used in this Example were used.
The reaction conditions of the primer design software OLIGO (Wojc
iech Rychiek). SEQ ID NOs: 3 and 4 correspond to nucleotides in pBR322 (about 4.3 kbp), respectively.
315-334 and nucleotides 3632-3651. Forward primer: 5'-TCC AAG TAG CGA AGC GAG CA-3 '(SEQ ID NO: 3) Reverse primer: 5'-TCG TCG TTT GGT ATG GCT TC-3' (SEQ ID NO: 4)
【００３０】[0030]
【表２】表２ プレインキュベーション ９４℃ ２分 変性 ９４℃ １分 アニーリング ５８℃ １分 伸長合成 ７２℃ ２分 サイクル：４０回 得られた反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離した
ところ、固相化した抗原の量に相関して、理論値と一致
した１kbpの明瞭なバンドが一本観察された。この結果
を図１に示す。Table 2 Pre-incubation 94 ° C for 2 minutes Denaturation 94 ° C for 1 minute Annealing 58 ° C for 1 minute Extension synthesis 72 ° C for 2 minutes Cycle: 40 times The obtained reaction products were separated by agarose gel electrophoresis and immobilized. One clear band of 1 kbp, which was consistent with the theoretical value, was observed in correlation with the amount of the antigen thus obtained. The result is shown in FIG.
【００３１】前記のとおり、本発明者による同一抗体を
用いたウエスタンブロットの検出限界は３−６ngであ
り、ＥＬＩＳＡ法では60pgであったことから（結果は示
さず）、本発明の検出限界は従来法に比して約103倍の
検出感度を有することが理解される。As described above, the detection limit of the Western blot using the same antibody by the present inventors was 3 to 6 ng, and the ELISA detection method was 60 pg (the results are not shown). to have a sensitivity of about103-fold compared to conventional methods is understood.
【００３２】実施例６ マウス脳ホモジネート中のプリオン蛋白質のイムノＰＣ
Ｒによる検出 上記方法に従って、スクレイピー感染マウス、非感染マ
ウス、およびプリオン蛋白質遺伝子欠損マウスの脳乳剤
をプロテイナーゼ処理後、終濃度２％のSDSを加えて95
℃にて熱失活した。これらを、0.02％アジ化ナトリウム
を含む20mMトリス塩酸バッファー（pH9.5）にて、200倍
から５倍段階希釈し、100μlずつマイクロタイタープレ
ート（96穴）に固相化した。後の方法は実施例５に従っ
た。得られた反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離
したところ、固相化した抗原の量に相関して、明瞭なバ
ンド（１kbp）が一本観察された。この結果を図２に示
す。Example 6 Immuno-PC of prion protein in mouse brain homogenate
R Detection According to the method described above, the brain emulsions of scrapie-infected mice, uninfected mice, and prion protein gene-deficient mice were treated with proteinase, and added with 2% SDS at a final concentration of 95%.
Heat inactivated at ℃. These were serially diluted 200- to 5-fold with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 9.5) containing 0.02% sodium azide, and immobilized on a microtiter plate (96 wells) by 100 μl each. The subsequent method followed Example 5. When the obtained reaction products were separated by agarose gel electrophoresis, one clear band (1 kbp) was observed in correlation with the amount of the immobilized antigen. The result is shown in FIG.
【００３３】プリオン蛋白質遺伝子欠損マウスの脳ホモ
ジネートでは、どの希釈倍率においてもバンドは検出さ
れなかったことから、この系が非特異的な反応によるも
のでないことは明らかである。感染、非感染マウスの脳
ホモジネートを試料としたＰＣＲ反応産物の量比から、
希釈倍率1000倍から5000倍の試料について、異常プリオ
ン蛋白質を検出することができた。In the brain homogenate of the prion protein gene-deficient mouse, no band was detected at any dilution ratio, and it is clear that this system was not caused by a non-specific reaction. From the ratio of PCR reaction products using brain homogenate of infected and uninfected mice as a sample,
Abnormal prion proteins could be detected in samples with a dilution ratio of 1000 to 5000 times.
【００３４】[0034]
【発明の実施の形態】本発明により、試料中の微量の異
常プリオン蛋白質またはその部分分解断片を、簡便な方
法で高感度に検出することができる。また、感染動物と
非感染動物では反応産物のバンド強度に明らかな違いが
見られ、より強いバンドが得られる動物に異常プリオン
蛋白質が蓄積していること、即ち感染の可能性があるこ
とを検出できる。さらに、本発明は、夾雑蛋白質が多量
に混在する試料についても、非特異的反応を起こすこと
なく、効果的に異常プリオン蛋白質を検出することがで
きる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION According to the present invention, a trace amount of abnormal prion protein or a partially degraded fragment thereof in a sample can be detected with high sensitivity by a simple method. In addition, there is a clear difference in the band intensity of the reaction product between infected and non-infected animals, and it is detected that abnormal prion protein is accumulated in animals that produce stronger bands, that is, that there is a possibility of infection. it can. Furthermore, the present invention can effectively detect an abnormal prion protein even in a sample containing a large amount of contaminating proteins without causing a nonspecific reaction.
【００３５】以上のことから、大量試料中の微量な異常
プリオン蛋白質の検出や、伝達性海綿状脳症の疑いのあ
る動物またはヒト患者の診断などに応用することができ
る。As described above, the present invention can be applied to detection of a trace amount of abnormal prion protein in a large amount of sample, diagnosis of an animal or human patient suspected of having transmissible spongiform encephalopathy, and the like.
【００３６】[0036]
【００３７】配列番号：１ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 AGTCATGCCC CGCGC 15SEQ ID NO: 1 Sequence length: 15 Sequence type: Number of nucleic acid chains: Single strand Topology: Linear Sequence type: Genomic DNA sequence AGTCATGCCC CGCGC 15
【００３８】配列番号：２ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 GCTAGAGTAA GTAGTT 16SEQ ID NO: 2 Sequence length: 16 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Genomic DNA sequence GCTAGAGTAA GTAGTT 16
【００３９】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 TCCAAGTAGC GAAGCGAGCA 20SEQ ID NO: 3 Sequence length: 20 Sequence type: number of nucleic acid strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: Genomic DNA sequence TCCAAGTAGC GAAGCGAGCA 20
【００４０】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 TCGTCGTTTG GTATGGCTTC 20SEQ ID NO: 4 Sequence length: 20 Sequence type: number of nucleic acid strands: single strand Topology: linear Sequence type: Genomic DNA sequence TCGTCGTTTG GTATGGCTTC 20
【図１】図１は、イムノＰＣＲによるＳＡＦの検出限界
を示すアガロースゲル電気泳動写真である。FIG. 1 is an agarose gel electrophoresis photograph showing the detection limit of SAF by immunoPCR.
【図２】図２は、イムノＰＣＲによるマウス脳ホモジネ
ート中のプリオン蛋白質の検出を示すアガロースゲル電
気泳動写真である。FIG. 2 is an agarose gel electrophoresis photograph showing the detection of a prion protein in a mouse brain homogenate by immuno-PCR.
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【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成９年４月２５日[Submission date] April 25, 1997
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】０００３[Correction target item name] 0003
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【０００３】伝達性海綿状脳症は、中枢神経系の海綿状
変性を主徴とする伝達性疾患で、具体例としてヒトのＣ
ＪＤ、ヒツジのスクレイピー、ウシのＢＳＥ等が挙げら
れる。いずれも感染後、長期間の潜伏期間の後に発症
し、ほぼ神経系に限局した症状が現れ、進行性に増悪し
て死に至る。これらの疾患に共通な感染因子として通常
のウイルスは同定されておらず、未だ明らかにはなって
いないが、生理的、化学的、生物学的に異常な特性を示
すことが知られている（D．M．Asherら、Laboratory Sa
fety：Principles and Practices（B．M．Miller編），
pp．59-71，American Society for Microbiology，Wash
ington，DC（1986))。近年、本疾患に特異的なプリオン
蛋白質の存在が認められ、プリオンが病原体の構成物で
あるという「プリオン仮説」が有力であると考えられて
いる（S．B．Prusiner，Science，216：136-144（198
2））。[0003] Transmissible spongiform encephalopathy is a transmissible diseasecharacterized by spongiform degeneration of the central nervous system.
JD, sheep scrapie, bovine BSE and the like. Both develop after a long incubation period after infection, with symptoms almost confined to the nervous system, progressively worsening and leading to death. The common virus has not been identified as a common infectious agent for these diseases and has not yet been elucidated, but is known to exhibit abnormal physiological, chemical, and biological properties ( D. M. Asher et al., Laboratory Sa
fety: Principles and Practices (edited by B.M. Miller),
pp. 59-71, American Society for Microbiology, Wash
tonington, DC (1986)). In recent years, the presence of a prion protein specific to this disease has been recognized, and the "prion hypothesis" that prions are a component of pathogens is considered to be powerful (SB Prusiner, Science, 216: 136). -144 (198
2)).
【手続補正２】[Procedure amendment 2]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】０００９[Correction target item name] 0009
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【０００９】今日、生体試料等からの特定蛋白質の検出
には、簡便で迅速な方法の一つである、特異抗体を用い
たＥＬＩＳＡ法が汎用されている。しかし、プリオン蛋
白質については、D．Serbanら（Neurology，40，110-11
7（1990））およびR．J．Kascsakら（Journal of Virol
ogy，61，3688-3693（1987））のように、ＥＬＩＳＡ法
を抗体のスクリーニングに使用する例はあるが、生物試
料中のプリオン蛋白質の検出のためにＥＬＩＳＡ法を用
いた報告はない。[0009] Today, an ELISA method using a specific antibody, which is one of simple and rapid methods, is widely used for detecting a specific protein from a biological sample or the like. However, regarding the prion protein, D.A. Serban et al. (Neurology , 40, 110-11
7 (1990)) and R.S. J. Kascsak et al. (Journal of Virol
ogy, 61, 3688-3693 (1987)), there is an example in which the ELISA method is used for antibody screening, but there is no report using the ELISA method for detecting a prion protein in a biological sample.
【手続補正３】[Procedure amendment 3]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００１４[Correction target item name] 0014
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【００１４】試料のプロテイナーゼＫによる分解 異常プリオン蛋白質は、正常プリオン蛋白質とアミノ酸
配列上の違いはないが、翻訳後の修飾により立体構造が
変化し、蛋白質分解酵素であるプロテイナーゼＫに対す
る抵抗性を得ると考えられている（B．Caughey，Journa
l of Biological Chemistry，266，18217-18226（199
1））。現在までに得られているプリオン蛋白質抗体は
いずれも正常と異常の両者に反応することから、試料を
プロテイナーゼＫにより前処理することにより、正常プ
リオン蛋白質のみを消化する。これにより処理前には同
等であった抗体との反応性が、見かけ上、異常プリオン
蛋白質についてのみ上昇する。この抗体との反応性の差
違を利用して、正常と異常プリオン蛋白質の識別を行
う。The abnormal prion proteindegraded by proteinase K in the sample has no difference in amino acid sequence from the normal prion protein, but its tertiary structure is changed by post-translational modification, and resistance to proteinase K, which is a protease, is obtained. (B. Caughey, Journa
l of Biological Chemistry, 266, 18217-18226 (199
1)). Since all prion protein antibodies obtained to date react with both normal and abnormal, pretreating the sample with proteinase K digests only normal prion protein. Thereby, the reactivity with the antibody which was equivalent before the treatment isapparently increased only for the abnormal prion protein. Using the difference in reactivity with the antibody, normal and abnormal prion proteins are distinguished.
【手続補正４】[Procedure amendment 4]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００１９[Correction target item name] 0019
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【００１９】マイクロタイタープレート等に固相化した
抗原に対し、ビオチン化した抗プリオン蛋白質抗体とス
トレプトアビジン、ビオチン化ＤＮＡが連結した抗体−
ＤＮＡの複合体を結合させる。ビオチン化ＤＮＡには、
試料に含まれる可能性のあるウシのＤＮＡと系統的に離
れている如何なるＤＮＡ、例えば大腸菌由来のプラスミ
ドＤＮＡを使用できるが、これに限定されない。使用さ
れるＤＮＡの長さは、500-1500bp程度が好ましい。ま
た、抗体−ＤＮＡ複合体の形成には、Sanoら（Scienc
e，258，120-122（1993））のように、抗体、プロテイ
ンＡ−ストレプトアビジン・キメラ蛋白質、ビオチン化
ＤＮＡを用いてもよいし、Ruzickaら（Science，260，6
98-699（1993））のように、抗原特異抗体を特定の動物
例えばマウスで作製し、これにビオチン化抗マウスＩｇ
抗体、ストレプトアビジン、ビオチン化ＤＮＡを連結さ
せてもよい。あるいは、抗体とアビジンのコンジュゲー
トを作製してビオチン化ＤＮＡと連結させることも可能
である。固相化マイクロタイタープレートを複数回洗浄
した後、各ウエルにＰＣＲ反応液を注ぎ、ＰＣＲを行っ
て増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動後、エチ
ジウムブロマイド染色によって検出する。また、電気泳
動後のアガロースゲルからＤＮＡをニトロセルロース膜
に吸着させ、標識プローブとのハイブリッド形成をオー
トラジオグラムによって検出するサザンブロット法を用
いれば、エチジウムブロマイド染色よりもさらに高い検
出感度を得ることができる。[0019] Microtiter plates such as immobilized antigen to anantibody Kopu biotinylated Rion protein antibody and streptavidin, biotinylated DNA was ligated -
The DNA complex is allowed to bind. Biotinylated DNA includes
Any DNA that is systematically separated from bovine DNA that may be included in the sample, such as, but not limited to, plasmid DNA from E. coli can be used. The length of DNA to be used is preferably about500 -1500bp. In addition, for the formation of the antibody-DNA complex, Sano et al.
e, 258, 120-122 (1993)), an antibody, protein A-streptavidin chimeric protein, biotinylated DNA may be used, or Ruzicka et al. (Science, 260, 6).
98-699 (1993)), an antigen-specific antibody was prepared in a specific animal, for example, a mouse, and this was added to a biotinylated anti-mouse Ig.
An antibody, streptavidin, and biotinylated DNA may be linked. Alternatively, a conjugate of an antibody and avidin can be prepared and ligated to biotinylated DNA. After washing the solid-phased microtiter plate several times, a PCR reaction solution is poured into each well, DNA amplified by PCR is subjected to agarose gel electrophoresis, and then detected by ethidium bromide staining. In addition, the use of Southern blotting, in which DNA is adsorbed to a nitrocellulose membrane from an agarose gel after electrophoresis and hybridization with a labeled probe is detected by autoradiogram, provides higher detection sensitivity than ethidium bromide staining. Can be.
【手続補正５】[Procedure amendment 5]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００２３[Correction target item name] 0023
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【００２３】実施例２ 抗体のビオチン修飾 精製した抗プリオン抗体ＩｇＧを、蛋白質ビオチン化シ
ステム（GIBCO BRL社）によりビオチン標識した。Example 2 Biotin Modification of Antibody Purified anti-prion antibodyIgG was labeled with biotin using a protein biotinylation system (GIBCO BRL).
【手続補正６】[Procedure amendment 6]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００２４[Correction target item name] 0024
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【００２４】実施例３ ビオチン化ＤＮＡの作製 大腸菌プラスミドpBR322のＤＮＡを公知の方法（Molecu
lar Cloning：J．Sambrookら、Cold Spring Harbor Lab
oratory Press（1989)）により精製した。pBR322（約4.
3kbp）のPstI部位（ヌクレオチド第3609番）からSalI部
位（ヌクレオチド第651番）を含むような約1.5kbpのＤ
ＮＡ断片について、pBR322PstIプライマー（配列番号
１）およびpBR322SalIプライマー（配列番号２）をビ
オチン化してそれぞれフォワードプライマーおよびリバ
ースプライマーとしてＰＣＲ増幅を行った。反応液50μ
l中の組成は、10×ＰＣＲバッファーll（パーキンエル
マー社）５μl、1.5mM MgCl2、0.2mM dNTP、配列番号１
および２の合成ビオチン化プライマー各５pmol、250pg
pBR322、Taq DNAポリメラーゼ（パーキンエルマー社）
1.25Ｕで、Program Temp ControlSystem PC-800（アス
テック社）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は表
１のとおりである。Example 3 Preparation of Biotinylated DNA The DNA of Escherichia coli plasmid pBR322 was prepared by a known method (Molecu
lar Cloning: J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab
oratory Press (1989)). pBR322 (about 4.
3 kbp) from about 1.5 kbp D to include aPst I site (nucleotide 3609) to aSal I site (nucleotide 651).
With respect to the NA fragment, the pBR322Pst I primer (SEQ ID NO: 1) and the pBR322Sal I primer (SEQ ID NO: 2) were biotinylated and subjected to PCR amplification as a forward primer and a reverse primer, respectively. Reaction liquid 50μ
The composition in l is 5 μl of 10 × PCR buffer II (Perkin Elmer), 1.5 mM MgCl2 , 0.2 mM dNTP, SEQ ID NO: 1.
5 pmol, 250 pg each of synthetic biotinylated primers of 2 and 2
pBR322, Taq DNA polymerase (PerkinElmer)
PCR was performed at 1.25 U using Program Temp ControlSystem PC-800 (Astec). Table 1 shows the PCR conditions.
【手続補正７】[Procedure amendment 7]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００２８[Correction target item name] 0028
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【００２８】実施例５ ＳＡＦのイムノＰＣＲによる検出 ２％ SDS存在下で熱変性させたＳＡＦを0.02％アジ化ナ
トリウムを含む20mMトリス塩酸バッファー（pH9.5）
で、60ng/mlから10倍段階希釈した。希釈液100μlをマ
イクロタイタープレート（96穴）に固相化後、１mg/ml
サケ精子ＤＮＡおよび4.5％スキムミルクを含むTETBS
（150mM塩化ナトリウム、20mMトリス塩酸（pH7.5）、0.
02％アジ化ナトリウム、0.1mM EDTA、0.1％トウィーン2
0）120μlで37℃、80分間ブロッキングした。250μlのT
ETBSを加え５分間放置後、液を除く洗浄操作を３回繰り
返し、余分な蛋白質を除去した後、0.1mg/mlサケ精子Ｄ
ＮＡおよび0.45％スキムミルクを含むTETBS 100μlに、
10-14molビチオン化ＤＮＡ、500倍希釈のビチオン化抗
プリオン蛋白質抗体、0.1μg/mlストレプトアビジンを
混合した溶液をウエルに注ぎ、室温で４５分間反応を行
った。ブロッキング後と同様に、TETBS 250μlで５分間
12回洗浄し、次いで0.02％アジ化ナトリウムを除いたト
リス塩酸バッファー（pH7.4）250μlで５分間３回洗浄
した。Example 5 Detection of SAF byImmunoPCR SAF heat-denatured in the presence of 2% SDS was treated with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 9.5) containing0.02 % sodium azide.
, And serially diluted 10-fold from 60 ng / ml. After immobilizing 100 μl of the diluted solution on a microtiter plate (96 wells), 1 mg / ml
TETBS containing salmon sperm DNA and 4.5% skim milk
(150 mM sodium chloride, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1
02% sodium azide, 0.1 mM EDTA, 0.1% Tween 2
0) Blocking was carried out at 37 ° C. for 80 minutes with 120 μl. 250 μl T
After adding ETBS and allowing to stand for 5 minutes, the washing operation of removing the liquid was repeated three times to remove excess protein, and then 0.1 mg / ml salmon sperm D
In 100 μl of TETBS containing NA and 0.45% skim milk,
A solution in which 10-14 mol of biotinylated DNA, 500-fold diluted bitionized anti-prion protein antibody, and 0.1 μg / ml streptavidin were mixed was poured into the wells, and reacted at room temperature for 45 minutes. 5 minutes with 250 µl of TETBS as after blocking
The plate was washed 12 times, and then washed 3 times for 5 minutes with 250 μl of Tris-HCl buffer (pH 7.4) from which 0.02% sodium azide had been removed.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 村上 賢二 茨城県つくば市観音台３−１−１ 農林水 産省家畜衛生試験場内 (72)発明者 入江 伸吉 東京都足立区千住緑町１−１−１ 株式会 社ニッピバイオマトリックス研究所内 (72)発明者 小山 洋一 東京都足立区千住緑町１−１−１ 株式会 社ニッピバイオマトリックス研究所内 (72)発明者 牛木 祐子 東京都足立区千住緑町１−１−１ 株式会 社ニッピバイオマトリックス研究所内 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing on the front page (72) Kenji Murakami, 3-1-1 Kannondai, Tsukuba, Ibaraki Pref. Livestock Hygiene Laboratory, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries (72) Inventor, Shinkichi Irie 1-1, Senju Midoricho, Adachi-ku, Tokyo 1 Nippi Biomatrix Research Laboratories Co., Ltd. (72) Inventor Yoichi Koyama 1-1-1 Senju Midoricho, Adachi-ku, Tokyo (72) Inventor Yuko Ushiki 1 Sensenryokucho, Adachi-ku, Tokyo -1-1 Inside Nippi Biomatrix Research Laboratories
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