JPH09510357A - Recombinant adenovirus encoding acidic fibroblast growth factor (aFGF) - Google Patents

Abstract

Translated fromJapanese

(57)【要約】酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）をコードする異種ＤＮＡ配列を含む組み換えアデノウィルス、それらの製造、ならびに変性神経疾患の処置及び／又は予防のためのそれらの利用。(57) Summary Recombinant adenoviruses containing heterologous DNA sequences encoding acidic fibroblast growth factor (aFGF), their production and their use for the treatment and / or prevention of degenerative neurological diseases.

Description

Translated fromJapanese

【発明の詳細な説明】酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）をコードする組み換えアデノウィルス 本発明はウィルス起源の組み換えベクター及び神経変性疾患の処置及び／又は予防におけるそれらの利用に関する。さらに特定的に本発明は、酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ、酸性繊維芽細胞成長因子）をコードするＤＮＡ配列を含む組み換えアデノウィルスに関する。本発明は又、これらのベクターの製造、それらを含む製薬学的組成物及び特に遺伝子療法におけるそれらの治療的利用に関する。 神経変性疾患は人口の老化の結果としてますます増加しつつある西欧諸国における健康の消耗（ｈｅａｌｔｈ ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅ）の実質的部分となっている。これらの状態の例として特にアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症などを挙げることができる。これらの疾患の病理学的兆候及び病因は全く異なっているが、それらはすべて中枢神経系におけるニューロン細胞が徐々に失われることから生じ、いくつかの場合にはパーキンソン病における黒物質（ｂｌａｃｋ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）などの高度に局所的な構造を生ずる。いくつかの待期的処置がすでに利用できるが、それらの効果は比較的限られている。本発明はこれらの疾患の処置のための新規な、特に有利な治療的方法につき記載する。さらに特定的に本発明はある種の栄養因子の有効で局所的な発現により、これらの病理学に含まれるニューロン細胞の残存を直接促進することを可能にするベクターにつき記載する。 栄養因子は神経成長又は神経細胞の残存を刺激するための性質を有する種類の分子である。神経栄養性を有する第１の因子、ＮＧＦ（神経成長因子）は約４０年前に特性化された（再調査のためにＬｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ ａｎｄ Ａｎｇｅｌｌｅｔｉ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．４８（１９６８）５３４を参照されたい）。他の神経栄養因子、特に脳−誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｔｈｅｏｎｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ＮｅｕｒｏＳｃｉ．１４（１９９１）１６５）、ＣＮＴＦなどが同定されたのは最近になって初めてであった。出願人は酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）に特に興味を持った。ａＦＧＦは形態に依存して約１３４〜１５５アミノ酸及び１５〜１７ｋＤの分子量のタンパク質である。ａＦＧＦは最初にその繊維芽細胞成長性に関して記載され、それは特に瘢痕形成などのある種の病状の処置においてそれを有用なものとした。近年、ａＦＧＦがいくつかの神経集団においてその黒質線状体の逆方向輸送に供され（Ｆｅｒｇｕｓｓｏｎ ｅｔ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３１３（１９９１）６９３）、試験管内において中脳のドパミン作用性ニューロンの残存を可能にできることが（１９９０）５５８）。しかし、その性質は有利であるがａＦＧＦの治療的適用は種々の障害と直面している。特にａＦＧＦの生物利用性の不在がいずれの治療的利用も制限している。さらにａＦＧＦを体のある所望の領域に持続的で局所的方法で送達できるようにする有効な手段がない。最後に、送達されるａＦＧＦが活性であり、生体内において治療的活性を働かせることができることが必須である。 本発明はこれらの問題に特に有利な解答を与える。実際に本発明は生体内において、及び局所的に治療的活性量のａＦＧＦを送達するための特に有効なベクターの開発にある。同時係属出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２５１９において、生体内において遺伝子を神経系中に転移させるためにアデノウィルスを用いることができることが示された。本発明は、神経系中に特定の遺伝子を転移させるために特に適応させられ、有効である新規な構築物に関する。さらに特定的に本発明は、酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）をコードするＤＮＡ配列を含む組み換えアデノウィルス、その製造、ならびに神経変性疾患の処置及び／又は予防のためのその利用に関する。 今回出願人は、ａＦＧＦをコードする配列を含む組み換えアデノウィルスを構築し、これらの組み換えアデノウィルスを生体内において投与することが可能であること、ならびにこの投与が生体内において、特に神経系において、細胞病理学的影響なく、治療的活性量のａＦＧＦの安定で局所的発現を可能にすることを示した。本発明のベクターの特に有利な性質は、特に用いられる構築物（あるウィルス領域が欠失した欠失アデノウィルス）、ａＦＧＦをコードする配列の発現のために用いられるプロモーター（好ましくはウィルス又は組織−特異的プロモーター）、ならびに該ベクターの投与のための方法に由来し、ａＦＧＦの有効な、及び適した組織における発現を可能にしている。かくして本発明は遺伝子療法において直接用いることができるウィルスベクターを提供し、それは特に生体内におけるａＦＧＦの発現を方向付けるために適応させられ、有効である。かくして本発明は神経変性疾患の処置及び／又は予防のための特に有利な新規な方法を提供する。 従って本発明の第１の主題は酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）又はそれらの誘導体をコードするＤＮＡ配列を含む欠失組み換えアデノウィルスにある。 本発明の主題は神経変性疾患の処置又は予防を目的とする製薬学的組成物の製造のためのそのような欠失組み換えアデノウィルスの利用でもある。 本発明の枠内で生産される酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）はヒトａＦＧＦ又は動物のａＦＧＦであることができる。特にヒトａＦＧＦをコードするＤＮＡ配列はクローニングされ、配列決定されている（Ｊａｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３（１９８６）５４１）。本発明のアデノウィルスベクターへのそれらの挿入の前に、これらの配列は、例えば部位特異的突然変異誘発により、特に適した制限部位の挿入のために有利に改変される。先行技術において記載されている配列は実際に本発明で用いるために構築されてはおらず、実質的発現を得るためにはあらかじめ適応させることが必要であることが証明され得る（実施例１．２を参照されたい）。本発明の枠内において、ヒト酸性繊維芽細胞成長因子（ｈａＦＧＦ）をコードするＤＮＡ配列を用いるのが好ましい。さらに上記の通り、ａＦＧＦの誘導体、特にヒトａＦＧＦの誘導体をコードする構築物を用いることもできる。そのような誘導体は例えば本来の配列と比較して突然変異、欠失及び／又は付加により得られ、ａＦＧＦの生物学的性質（栄養的及び／又は確認剤（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｏｒ）効果）の少なくとも１つを保存している産物をコードするいずれかの配列を含む。これらの改変は当該技術分野における熟練者に既知の方法により行うことができる（下記の一般的分子生物学法及び実施例２を参照されたい）。かくして得られる誘導体の生物学的活性を実施例３において特に示される通り、次いで容易に決定することができる。本発明の誘導体は、プローブとして本来の配列又はそのフラグメントを用いた核酸ライブラリからのハイブリッド形成により得ることもできる。 これらの誘導体は特に、それらの結合部位に関するより高い親和力を有する分子、生体内における発現を強化させる配列、プロテアーゼに対するより大きな抵抗性を有する分子、より大きな治療的有効性又はより少ない副作用、あるいは新規な生物学的性質の可能性を有する分子である。 好ましい誘導体の中でさらに特定的にａＦＧＦの自然の変異体を挙げることができる。かくして米国特許第４，８６８，１１３号に記載されている通り、種々の形態、特に１５４アミノ酸を含む形態、１４０アミノ酸を含む形態、及び１３４アミノ酸を含む形態のａＦＧＦが存在する。ａＦＧＦという用語はこれらの種々の形態を含むと理解される。他の好ましい誘導体は特に、１つ又はそれ以上の残基が置換された分子、考慮されている結合部位との相互作用に含まれない、又はほとんど含まれない、あるいは望ましくない活性を発現する領域の欠失により得られる誘導体、本来の配列と比較して例えば分泌シグナル及び／又は結合ペプチドなどの付加的残基を含む誘導体である。 特に有利な方法の場合、本発明の枠内で用いられる配列は、合成されるａＦＧＦが細胞外区画においてより有効に放出され、そのレセプターを活性化できるように、合成されるａＦＧＦを感染細胞の分泌経路において方向付けることを可能にする分泌シグナルも含む。用いられる分泌シグナルは異種であることも、人工分泌シグナルであることさえできる。神経細胞において機能性である分泌シグナル、例えばサイトカインのための分泌シグナルを用いるのが有利である。例としてａＦＧＦの高い分泌を可能にするヒト繊維芽細胞インターフェロンのための分泌シグナルを挙げることができる。 本発明の枠内で用いられる酸性繊維芽細胞成長因子をコードするＤＮＡ配列はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、あるいは例えば１つ又はそれ以上のイントロンが挿入されていることができるｃＤＮＡを含むハイブリッド構築物であることができる。これは又、合成又は半合成配列であることもできる。特に有利な方法の場合、ｃＤＮＡ又はｇＤＮＡが用いられる。特にｇＤＮＡの使用はヒト細胞における発現を強化させることができる。 従って本発明の最初の実施態様の場合、アデノウィルスは酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）をコードするｃＤＮＡ配列を含む。本発明の他の好ましい実施態様の場合、アデノウィルスは酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）をコードするｇＤＮＡ配列を含む。ａＦＧＦをコードするＤＮＡ配列の前に、神経細胞において機能性である異種分泌シグナルがあるのが有利である。 ａＦＧＦをコードする配列は神経細胞におけるその発現を可能にするシグナルの調節下に置かれるのが有利である。それらは異種発現シグナル、すなわちａＦＧＦの発現を自然に担っているシグナルと異なるシグナルであるのが好ましい。それらは特に他のタンパク質又は合成配列の発現を担う配列であることができる。特にそれらは真核又はウィルス遺伝子のプロモーター配列であることができる。例えばそれらは感染することが望まれている細胞のゲノムから誘導されるプロモーター配列であることができる。同様にそれらは、用いられるアデノウィルスを含むウィルスのゲノムから誘導されるプロモーター配列であることができる。これに関し、例えばＥｌＡ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターなどを挙げることができる。さらにこれらの発現配列は、活性化又は調節配列、あるいは組織−特異的発現を可能にする配列の付加により改変することができる。事実、神経細胞において特異的に、又は優先的に活性である発現シグナルを用い、ウィルスが実際に神経細胞に感染した場合のみにＤＮＡ配列が発現され、その効果を生み出すようにするのが特に有利であり得る。これに関し、例えばニューロン−特異的エノラーゼプロモーター、ＧＦＡＰプロモーターなどを挙げることができる。 第１の特定の実施態様において、本発明はＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターの調節下にヒト酸性繊維芽細胞成長因子（ｈａＦＧＦ）をコードするｃＤＮＡ配列を含む欠失組み換えアデノウィルスに関する。 他の特定の実施態様において、本発明はＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターの調節下にヒト酸性繊維芽細胞成長因子（ｈａＦＧＦ）をコードするｇＤＮＡ配列を含む欠失組み換えアデノウィルスに関する。 実際に出願人は、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターが神経、特に中枢神経系の細胞におけるａＦＧＦの持続的及び実質的発現を可能にすることを示した。 さらに好ましい実施態様において、本発明は神経系における優先的発現を可能にするプロモーターの調節下にヒト酸性繊維芽細胞成長因子（ｈａＦＧＦ）をコードするＤＮＡ配列を有する欠失組み換えアデノウィルスに関する。 本発明の特に好ましい実施態様は、ＩＴＲ配列、包膜を可能にする配列、酸性繊維芽細胞成長因子（ｈａＦＧＦ）又はそれらの誘導体を、神経系における優先的発現を可能にするプロモーターの調節下に含み、Ｅ１遺伝子、ならびにＥ２、Ｅ４及びＬ１〜Ｌ５遺伝子の少なくとも１つが非−機能性である欠失組み換えアデノウィルスにある。 本発明の欠失アデノウィルスは、標的細胞において自律的に複製することができないアデノウィルスである。従って一般に本発明の枠内で用いられる欠失アデノウィルスのゲノムは、少なくとも感染細胞における該ウィルスの複製に必要な配列が欠けている。これらの領域は除去されるか（完全に、又は部分的に）、又は非−機能性とされるか、あるいは他の配列により、特にａＦＧＦをコードするＤＮＡにより置換されることができる。 本発明の欠失ウィルスはウィルス粒子の包膜に必要な配列をそのゲノムに保存しているのが好ましい。さらに好ましくは、上記の通り、本発明の欠失組み換えアデノウィルスのゲノムはＩＴＲ配列、包膜を可能にする配列、非−機能性Ｅ１遺伝子、及び少なくとも１つの非−機能性Ｅ２、Ｅ４又はＬ１〜Ｌ５遺伝子を含む。 構造及び性質がいくらか異なる種々のアデノウィルス血清型が存在する。これらの血清型の中で、２又は５型ヒトアデノウィルス（Ａｄ２又はＡｄ５）、あるいは動物起源（出願ＦＲ９３ ０５９５４を参照されたい）のアデノウィルスの利用が本発明の枠内で好ましい。本発明の枠内で用いることができる動物起源のアデノウィルスの中で、イヌ、ウシ、ネズミ（例えばＭａｖ１：Ｍａｖ１，Ｂｅａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブタ、トリ又は別の場合サル（例えば：ＳＡＶ）起源のアデノウィルスを挙げることができる。動物起源のアデノウィルスはイヌアデノウィルスが好ましく、又はＣＡＶ２アデノウィルスがさらに好ましい［例えばＭａｎｈａｔｔａｎ株又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）］。好ましくは本発明の枠内でヒト又はイヌ、あるいは混合起源のアデノウィルスが用いられる。 本発明の欠失組み換えアデノウィルスは当該技術分野における熟練者に既知のいずれの方法によっても製造することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０１（１９９１）１９５，ＥＰ １８５ ５７３；Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４）２９１７）。特にそれらはアデノウィルス及び、中でもａＦＧＦをコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドの間の相同的組み換えにより製造することができる。相同的組み換えは適した細胞系中に該アデノウィルス及びプラスミドをコトランスフェクションした後に起こる。用いられる細胞系は好ましくは（ｉ）該要素により形質転換可能でなくてはならず、（ｉｉ）アデノウィルスゲノムのゲノムの欠失部分を補足できる配列を、組み換えの危険を避けるために好ましくは組み込まれた形態で含まなければならない。細胞系の例としてヒト胚腎臓系２９３（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）を挙げることができ、それは特にＡｄ５アデノウィルスのゲノムの左部分（１２％）をそのゲノムに組み込んで含む。アデノウィルスから誘導されるベクターの構築のための戦術も出願番号ＦＲ９３ ０５９５４及びＦＲ９３０８５９６に記載されており、それらは引用することにより本明細書の内容となる。 次に増殖したアデノウィルスを回収し、実施例に記載の従来の分子生物学法に従って精製する。 上記の通り、本発明は神経変性疾患の処置及び／又は予防を目的とする製薬学的組成物の製造のための、上記のアデノウィルスの利用にも関する。さらに特定的に本発明はパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンティングトン舞踏病、てんかん及び血管性痴呆の処置及び／又は予防を目的とする製薬学的組成物の製造のためのこれらのアデノウィルスの利用に関する。 本発明は１種又はそれ以上の上記の欠失組み換えアデノウィルスを含む製薬学的組成物にも関する。これらの製薬学的組成物は局所的、経口的、非経口的、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内又は経皮的投与などのために調製することができる。本発明の製薬学的組成物は注入用調剤のための、特に患者の神経系に直接注入するための製薬学的に許容され得るビヒクルを含むのが好ましい。これは特に等張無菌溶液、あるいは場合に依存して無菌水又は生理食塩水を添加すると注入用溶液を調製できる乾燥、特に凍結乾燥組成物であることができる。患者の神経系中への直接の注入は、冒された組織のレベルに治療効果を集中させることを可能にするので有利である。患者の中枢神経系中への直接の注入は、定位的注入装置を用いて行うのが有利である。そのような装置の使用により実際に、注入部位を非常に正確に狙うことができるようになる。 これに関し、本発明は上記で定義された組み換えアデノウィルスを患者に投与することを含む、神経変性疾患の処置のための方法にも関する。さらに特定的に、本発明は上記で定義された組み換えアデノウィルスの定位的投与を含む神経変性疾患の処置のための方法に関する。 注入のために用いられる欠失組み換えアデノウィルスの投薬量は種々のパラメーターに従って、特に用いられる投与様式、関連する病理学、あるいは別の場合処置の所望の持続期間に従って調節することができる。一般に本発明の組み換えアデノウィルスは１０⁴〜１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの投薬量の形態で調製され、投与される。ｐｆｕ（プラーク形成単位）という用語はウィルス溶液の感染力に対応し、適した細胞培養に感染させ、次いで一般に４８時間後に感染細胞のプラークの数を測定することにより決定される。ウィルス溶液のｐｆｕ力価の決定のための方法は文献において十分に例証されている。 本発明の他の主題は、１種又はそれ以上の上記の欠失組み換えアデノウィルスに感染した哺乳類細胞に関する。さらに特定的に本発明は、これらのアデノウィルスに感染したヒト細胞集団に関する。それらは特に繊維芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、表皮細胞、内皮細胞、神経膠細胞などであることができる。 本発明の細胞は一次培養から得ることができる。それらを当該技術分野における熟練者に既知の方法により集め、次いでそれらの増殖を可能にする条件下で培養することができる。さらに特定的に繊維芽細胞に関しては、これらを例えばＨａｍ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１ａ（１９８０）２５５］により記載の方法に従って生検から容易に得ることができる。これらの細胞をアデノウィルスによる感染に直接用いることができ、あるいは後の使用のためのオートロガスライブラリの確立のために例えば凍結により保存することができる。本発明の細胞は例えばあらかじめ確立されたライブラリから得られる二次培養であることもできる。 次いで培養細胞を組み換えアデノウィルスに感染させ、それらにａＦＧＦを生産する能力を与えるようにする。感染は当該技術分野における熟練者に既知の方法に従って試験管内において行われる。特に用いられる細胞の型及び細胞当たりのウィルスコピーの所望の数に従い、当該技術分野における熟練者は感染多重度、及び場合により、行われる感染のサイクルの数を調節することができる。これらの段階は、細胞が生体内投与を目的とされている場合は適した無菌条件下で行われるべきであることは明らかに理解される。細胞の感染のために用いられる組み換えアデノウィルス投薬量は、所望の目的に従って当該技術分野における熟練者が調節することができる。生体内投与のための上記の条件は、試験管内における感染にも適用され得る。 本発明の他の主題は１種又はそれ以上の上記の欠失組み換えアデノウィルスに感染した哺乳類細胞及び細胞外マトリックスを含む体内埋植物に関する。本発明の体内埋植物は１０⁵〜１０¹⁰個の細胞を含むのが好ましい。それらは１０⁶〜１０⁸個を含むのがより好ましい。 さらに特定的に、本発明の体内埋植物において、細胞外マトリックスはゲル化化合物及び場合により細胞の固定を可能にする担体を含む。 本発明の体内埋植物の製造のために種々の型のゲル化剤を用いることができる。ゲル化剤はゲルの構造を有するマトリックスに細胞を含み、適宜、担体上への細胞の固定を強化するために用いられる。従って種々の細胞接着剤、特にコラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン類、フィブロネクチン、レクチン類などをゲル化剤として用いることができる。本発明の枠内ではコラーゲンを用いるのが好ましい。これはヒト、ウシ又はネズミ起源のコラーゲンであることができる。さらに特定的には、Ｉ型コラーゲンが用いられる。 上記の通り、本発明の組成物は細胞の固定を可能にすることにより担体を含むのが好ましい。固定という用語は、担体上への細胞の接着及び／又は結合を生ずるいずれの形態の生物学的及び／又は化学的及び／又は物理的相互作用をも称する。さらに細胞は用いられる担体を覆うか、又はこの担体の内部に浸透する、あるいは両方であることができる。固体の無毒性及び／又は生物適合性担体の使用が本発明の枠内で好ましい。特にポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）繊維又は生物起源の担体を用いることができる。 本発明の体内埋植物は体における種々の部位において体内埋植することができる。特に体内埋植は腹腔において、皮下組織（恥骨上領域、腸骨窩及び猟径窩など）において、臓器、筋肉、腫瘍、中枢神経系において、又は別の場合粘膜下において行うことができる。本発明の体内埋植は、それらが体における治療的産物の放出を制御することを可能にするという意味で特に有利である：この放出は第１に感染の多重度により、及び感染細胞の数により決定される。次に放出は処置を永久に停止する体内埋植物の除去により制御されるか、あるいは治療的遺伝子の発現を誘導又は抑制することを可能にする調節可能な発現系の使用により制御される。 かくして本発明は神経変性疾患の処置又は予防のために非常に有効な手段を提供する。それは最も特定的にはアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン舞踏病又はＡＬＳ疾患の処置に適応させられる。さらに本発明のアデノウィルスベクターは、特に神経細胞の感染の非常に高いそれらの効率と結び付いた実質的利点を有し、それは小容積のウィルス懸濁液を用いて感染を行うことを可能にする。さらに本発明のアデノウィルスによる感染は注入の部位に高度に局在化しており、それは隣接する脳構造への拡散の危険を避ける。 さらに、この処置はヒト、ならびにヒツジ、ウシ、家畜（イヌ、ネコなど）、ウマ、サカナなどのいずれの動物にも適用することができる。 本発明を以下の実施例によりさらに完全に説明するが、それは例示であり制限ではないと考えられるべきである。図面の説明図１：ベクターｐＸＬ２２４４の図図２：ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ａＦＧＦの図一般的分子生物学法 分子生物学において従来用いられる方法、例えばプラスミドＤＮＡの調製的（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）抽出、塩化セシウム勾配におけるプラスミドＤＮＡの遠心、アガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるＤＮＡフラグメントの精製、タンパク質のフェノール又はフェノール−クロロホルム抽出、食塩水媒体中のＤＮＡのエタノール又はイソプロパノール沈降、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における形質転換などは当該技術分野における熟練者に周知であり、文献に広く記載されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＭａｎｕａｌＦ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８２；Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙＦ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７］。 ｐＢＲ３２２−及びｐＵＣ型プラスミド及びＭ１３系列のファージは市販のものである（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。 連結のために、ＤＮＡフラグメントをアガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動によりそれらの寸法に従って分離し、フェノールを用いて、又はフェノール／クロロホルム混合物を用いて抽出し、エタノールを用いて沈降させ、次いで供給者の勧告に従ってファージＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でインキュベートすることができる。 突出５’末端の充填は、供給者の規格に従ってＥ．コリ ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて行うことができる。突出３’末端の破壊はファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、それを製造者の勧告に従って用いて行われる。突出５’末端の破壊はＳ１ヌクレアーゼを用いた、制御された処理により行われる。 合成オリゴデオキシヌクレオチドによる試験管内における部位特異的突然変異誘発は、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４］により開発された方法に従い、Ａｍｅｒｓｈａｍにより販売されるキットを用いて行うことができる。 いわゆるＰＣＲ法［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｌｅｎｃｅ２３０（１９８５）１３５０−１３５４；Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．ａｎｄ Ｆａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５０］によるＤＮＡフラグメントの酵素的増幅は、ＤＮＡサーマルサイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用い、製造者の規格に従って行うことができる。 ヌクレオチド配列の確認はＳａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４６３−５４６７］により開発された方法により、Ａｍｅｒｓｈａｍにより販売されるキットを用いて行うことができる。実施例実施例１：ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ａＦＧＦの構築 この実施例はラウス肉腫ウィルスＬＴＲ（ＲＳＶ−ＬＴＲ）を含むプロモーターの調節下で、異種分泌配列に先行されるａＦＧＦをコードするＤＮＡ配列を含むベクターの構築を記載する。 １．１．出発ベクター（ｐＸＬ２２４４）：プラスミドｐＸＬ２２４４はＲＳＶウィルスＬＴＲプロモーターの調節下におけるＡｐｏＡＩｃＤＮＡ、及びＡｄ５アデノウィルス配列を含む（図１）。それはプレプロＡｐｏＡＩをコードするｃＤＮＡを含むＣｌａＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを、同じ酵素で消化されたベクターｐＬＴＲ ＲＳＶ−βｇａｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０（１９９２）６２６）中に挿入することにより構築された。 １．２．ａＦＧＦをコードするｃＤＮＡ配列の構築 本発明のベクターの構築を可能にするために、ヒトａＦＧＦをコードするｃＤＮＡ配列を以下の通りに構築した： −１３４アミノ酸を含むヒトａＦＧＦ（ａＦＧＦ₁₃₄）をコードするｃＤＮＡ配列をプラスミドｐＭＪ２６（Ｊａｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１９８７）１６６１２）から単離した。プラスミドｐＭＪ２６はＥｃｏＲＩ制限部位の配列に先行されるヒトａＦＧＦをコードするｃＤＮＡ配列を含む。プラスミドのこの領域の配列は以下である（ＥｃｏＲＩ部位に下線、及び開始コドンは太文字）：．．．ＧＡＡＴＴＣＡＴＧ．．． ＥｃｏＲＩ酵素で消化した後、制限部位の末端を大豆ヌクレアーゼを用いた処理により平滑化した。得られるフラグメントは以下の末端を有する（開始コドンは太文字）：．．．ＧＡＡＴＴＣＡＴＧ．．．（ｐＭＪ２６）．．．Ｇ ＣＡＴＧ．．．（ＥｃｏＲＩ＋大豆フクレアーゼ） 次いでこの配列を分泌配列の挿入により改変した。この配列の導入は、本発明のベクターに感染した細胞により合成されるａＦＧＦの、より有効な細胞外放出を可能にするので特に有利である。さらに特定的に、上記で得られる配列は５’末端における、及びａＦＧＦを有する相における、ヒト繊維芽細胞インターフェロンのための分泌配列に対応する２本鎖合成オリゴヌクレオチドの挿入により改変される（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０（１９８０）１１）。このオリゴヌクレオチドの各鎖を核酸合成機を用いて化学的に合成し、次いでハイブリッド形成させて２本鎖ＤＮＡを構築した。用いられる配列は以下の７０ｂｐ鎖を含む（配列番号１）： このオリゴヌクレオチドは分泌配列の５’末端にＸｈｏＩ部位（上記の配列において下線）を含む。この２本鎖オリゴヌクレオチドを、上記の通りＥｃｏＲＩ及び大豆ヌクレアーゼを用いて消化されたａＦＧＦ−コード配列に連結した。次いで正しい配向で挿入片を有するクローンを単離し、配列決定により調べた。このクローンに存在する、分泌配列により先行されるａＦＧＦ−コード配列を含む完全フラグメントを、次いでＸｈｏＩ及びＢｇｌＩＩ酵素（ＢｇｌＩＩ部位は停止コドンの後に位置する）を用いて消化することにより単離し、次いであらかじめ同じ酵素で開裂されたベクターｐ２６７（Ｊａｙｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．７（１９８８）９６３）に連結する。得られるベクターをｐＭＪ３５と称した。 上記で製造された配列を次いでＰＣＲ法により、以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて改変した： プラスミドｐＭＪ３５に対するＰＣＲによる増幅段階は、キメラ配列「分泌／ａＦＧＦ配列」の両側に適した制限部位を導入することを可能にする。さらに特定的に、これらの段階は５’末端におけるＣｌａＩ部位（５’オリゴヌクレオチドにおいて１本線で下線を引かれ、２本線で下線を引かれた開始コドンに対するこの位置が示されている配列）、ならびに３’末端におけるＫｐｎＩ部位（３’オリゴヌクレオチドにおいて１本線で下線が引かれている）の挿入を可能にする。作られた部位は発現条件下における配列を本発明のベクター中に挿入することを可能にする。 １．３．ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ａＦＧＦの構築 この実施例はＲＳＶウィルスＬＴＲの調節下で分泌配列に先行されるａＦＧＦをコードする配列、ならびに生体内における組み換えを可能にするＡｄ５アデノウィルス配列を含むベクターｐＳｈ−Ａｄ−ａＦＧＦの構築を記載する。 実施例１．２．で製造されたＰＣＲフラグメントを酵素ＣｌａＩ及びＫｐｎＩで消化し、得られる、ヒト繊維芽細胞インターフェロンのための分泌シグナルにより先行されるａＦＧＦをコードする配列を含む０．５ｋｂのフラグメントを次いで単離し、ＬＭＰ（低融点）アガロースゲル電気泳動により精製した。平行して、ベクターｐＸＬ２２４４を同じＣｌａＩ及びＫｐｎＩ制限酵素を用いて消化し、次いで後者の不活性化の後に沈降させた。あらかじめ単離され、アガロースゲル電気泳動により精製された、得られる線状ベクター及び０．５ｋｂのフラグメントを次いで連結し、ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ａＦＧＦを生成した（図２）。ａＦＧＦ挿入片の全ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド配列決定により調べた。実施例２．ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ａＦＧＦの機能性 細胞培養において生物学的に活性な形態のａＦＧＦを発現する、ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ａＦＧＦの能力をＣＯＳＩ細胞の過渡的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）トランスフェクションにより示した。そのために、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍの存在下で細胞（直径が１０ｃｍの皿当たりに２ｘ１０⁶個の細胞）をトランスフェクトした（８μｇのベクター）。４８時間後、細胞培養上澄み液を収穫した。次いでこの上澄み液の系列希釈液（１／２００及び１／５０）をＮＩＨ ３Ｔ３細胞培養に加えた。これらの培養への栄養的効果を放射標識チミジンの挿入により観察した。平行して、トランスフェクトされた細胞によりａＦＧＦの生産を免疫検出によっても示した。実施例３．ａＦＧＦをコードする配列を含む組み換えアデノウィルスＡｄ−ａＦＧＦの構築 ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ａＦＧＦを線状化し、欠失アデノウィルスベクターと共に、アデノウィルスＥ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）によりコードされる機能をトランスにおいて与えるヘルパー細胞（系２９３）中にコトランスフェクトした。 さらに特定的に、アデノウィルスＡｄ−ａＦＧＦを突然変異体アデノウィルスＡｄ−ｄ１１３２４（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３１（１９８２）５４３）及びベクターｐＳｈ−Ａｄ−ａＦＧＦの間の生体内における相同的組み換えにより、以下の方法に従って得た：酵素ＣｌａＩを用いて線状化されたプラスミドｐＳｈ−Ａｄ−ａＦＧＦ及びアデノウィルスＡｄ−ｄ１１３２４をリン酸カルシウムの存在下で系２９３中にコトランスフェクトし、相同的組み換えをさせた。かくして生成された組み換えアデノウィルスをプラーク精製により選択した。単離の後、組み換えアデノウィルスＤＮＡを細胞系２９３において増幅し、それは約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの力価を有する非精製組み換え欠失アデノウィルスを含む培養上澄み液を与える。 次いでウィルス粒子を既知の方法に従って塩化セシウム勾配遠心により精製した（特にＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（１９７３）４５６を参照されたい）。アデノウィルスＡｄ−ａＦＧＦは２０％グリセロール中で−８０℃において保存することができる。実施例４．アデノウィルスＡｄ−ａＦＧＦの機能性 培養細胞に感染し、培地において生物学的に活性な形態のａＦＧＦを発現する、アデノウィルスＡｄ−ａＦＧＦの能力を、ヒト２９３及びラットＰＣ１２系に感染させることにより示す。次いで培養上澄み液における活性ａＦＧＦの存在を実施例２と同じ条件下で決定した。 これらの研究は、アデノウィルスが実際に生物学的に活性な形態のａＦＧＦを細胞培養において発現することを示すことを可能にする。実施例５：脳弓采（ｆｉｍｂｒｉａ−ｆｏｒｎｉｘ）の外傷を有するラットへの、組み換えアデノウィルスによるａＦＧＦ遺伝子の生体内における転移 この実施例は本発明のアデノウィルスベクターを用いた、生体内におけるａＦＧＦ遺伝子の転移を記載する。それは、脳弓采の外傷の動物モデルに関し、本発明のベクターが治療的量のａＦＧＦの生体内における発現の誘導を可能にすることを示す。 あらかじめ麻酔されたラットにおいて、中隔−海馬ルート（脳弓采）を左の半球のレベルにおいて切開した。この機械的外傷は、伸縮自在（ｒｅｔｒａｃｔａｂｌｅ）手術用ナイフを用いて形成した。この効果のために用いられる定位座標はブレグマに対して：ＡＰ：−１．７；ＭＬ：＋１．５；Ｖ：−５．５〜−０．５である。 ａＦＧＦ組み換えアデノウィルスを外傷の直後に中隔の中核（ｍｅｄｉａｎ ｎｕｃｌｅｕｓ）中、及び求心路遮断された海馬（外傷側の海馬）の背部中に注入した。さらに特定的に、注入されるアデノウィルスは実施例３．１．で製造されたアデノウィルスＡｄ−ａＦＧＦであり、リン酸塩緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）中において精製形態（３．５ｘ１０⁶ｐｆｕ／μｌ）で用いられる。 注入はポンプに接続されたカニューラ（外径２８０μｍ）を用いて行われる。注入の速度は０．５μｌ／分に固定され、その後カニューラを引き出す前にその場所にさらに４分間残す。海馬及び中隔中への注入の容積はそれぞれ３μｌ及び２μｌである。注入されるアデノウィルス濃度は３．５ｘ１０⁶ｐｆｕ／μｌである。 海馬中への注入の場合、定位座標は以下の通りである：ＡＰ＝−４；ＭＬ＝３．５；Ｖ＝−３．１（ＡＰ及びＭＬ座標はブレグマに対して決定され、Ｖ座標はブレグマのレベルにおける頭蓋骨の表面に対する。 中隔中への注入の場合、定位座標は以下の通りである：ＡＰ＝１；ＭＬ＝１；Ｖ＝−６（ＡＰ及びＭＬ座標はブレグマに対して決定され、Ｖ座標はブレグマのレベルにおける頭蓋骨の表面に対する。この条件下でカニューラは、中静脈洞を避けるために垂直に対して９度の角度にある（中外側方向）。 本発明のアデノウィルスの投与の治療的効果を３種類の分析：組織学的及び免疫組織化学的分析、定量的分析、ならびに挙動的分析により示した。組織学的免疫組織化学的分析 脳弓采の機械的外傷は中隔におけるコリン作用性ニューロン（抗−コリンアセチルトランスフェラーゼ、ＣｈａＴ抗体により免疫組織学において視覚化）の損失、ならびに海馬におけるコリン作用性脱神経（アセチルコリンエステラーゼ、ＡＣｈＥ活性により組織化学において検出）を誘導する。 注入された脳の組織学的分析はアデノウィルスＡｄ−ａＦＧＦの脳内注入の３週間後に行う。そのために、動物を麻酔下で４％のパラホルムアルデヒドの心臓内輸液により犠牲にする。除去、後固定及び凍結保護の後、脳をクリオマット（ｃｒｙｏｍａｔ）を用い、前頭面に沿って切開する：中隔の全長にわたって、ならびに海馬の前、中及び後部において３０μｍの厚さの冠状系列切片（ｃｏｒｏｎａｌ ｓｅｒｉａｌ ｓｅｃｔｉｏｎｓ）を作る。中隔の場合、１８０μｍ離れた切片（６切片の中の１切片）をクレシルバイオレットで染色し（ニューロン密度を評価するため）、抗−ＣｈＡＴ抗体（Ｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて免疫標識する（コリン作用性ニューロンの同定のため）。免疫組織化学的方法は、ＤＡＢを用いて視覚化されるストレプタビジン−ビオチンパーオキシダーゼの方法である。海馬の場合、１８０μｍ離れた切片を、コリン作用性脱神経の検出のためにＡＣｈＥ（アセチルコリンエステラーゼ）のための組織化学的方法に従って染色する。切片はガラススライド上に固定する。定量的分析 中隔におけるコリン作用性ニューロン（ＣｈＡＴ−陽性）の数は、アデノウィルスＡｄ−ａＦＧＦの効果の評価のためのパラメーターである。試料（中隔の全長に及ぶ６切片中の１切片）につき計数を行う。各切片に関し、中隔の両側につき別々にＣｈＡＴ−陽性ニューロンを計数する。すべての切片に関する累積の結果を、損傷側のＣｈＡＴ−陽性ニューロンの数対非損傷側のＣｈＡＴ−陽性ニューロンの数の比率により表す。挙動的分析 中隔−海馬ルートの両側の外傷は記憶欠損に導く。この型の外傷へのアデノウィルスＡｄ−ａＦＧＦの注入の保護機能的効果は、２つの挙動試験：Ｍｏｒｒｉｓの水泳試験（視覚空間的参照記憶（ｖｉｓｕｏｓｐａｔｉａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｍｏｒｙ））及びＴＭＴＴ試験（２回−試験記憶仕事（ｔｗｏ−ｔｒｉａｌｓ ｍｅｍｏｒｙ ｔａｓｋ）；「新環境の短期間記憶」）の間に動物の記憶性能の分析により検出された。実施例６：黒質線状体ルートの外傷を有するラットへの、組み換えアデノウィルスによるａＦＧＦ遺伝子の生体内における転移 この実施例は、本発明のアデノウィルスベクターを用いた生体内におけるａＦＧＦ遺伝子の転移を記載する。それは黒質線状体ルートの外傷の動物モデルにおいて、本発明のベクターが治療的量のａＦＧＦの生体内における発現の誘導を可能にすることを示す。 あらかじめ麻酔されたラットにおいて、毒素６−ヒドロキシドパミン（６０Ｈ−ＤＡ）の注入により、黒質線状体ルートを中脳束（ＭＦＢ）のレベルで傷付けた。注入によるこの化学的外傷は、以下の定位座標に沿って片側性であった：ＡＰ：０及び−１；ＭＬ：＋１．６；Ｖ：−８．６及び−９（ＡＰ及びＭＬ座標はブレグマに対して、Ｖ座標は硬膜に対して決定される）。切断バーは＋５ｍｍのレベルに固定する。 組み換えアデノウィルスａＦＧＦを外傷の直後に、外傷の側において黒物質及び線条中に注入した。さらに特定的に、注入されるアデノウィルスは実施例３．１．で製造されたアデノウィルスＡｄ−ａＦＧＦであり、リン酸塩緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）中において精製形態（３．５ｘ１０⁶ｐｆｕ／μｌ）で用いる。 注入はポンプに接続されたカニューラ（外径２８０μｍ）を用いて行われる。注入の速度は０．５μｌ／分に固定され、その後カニューラを引き出す前にその場所にさらに４分間残す。線条及び黒物質中への注入容積はそれぞれ２ｘ３μｌ及び２μｌである。注入されるアデノウィルス濃度は３．５ｘ１０⁶ｐｆｕ／μｌである。 黒物質中への注入の場合、定位座標は以下の通りである：ＡＰ＝−５．８；ＭＬ＝＋２；Ｖ＝−７．５（ＡＰ及びＭＬ座標はブレグマに対して、Ｖ座標は硬膜に対して決定される）。 線条中への注入の場合、定位座標は以下の通りである：ＡＰ＝＋０．５及び−０．５；ＭＬ＝３；Ｖ＝−５．５（ＡＰ及びＭＬ座標はブレグマに対して、Ｖ座標は硬膜に対して決定される）。 本発明のアデノウィルスの投与の治療的効果を３種類の分析：組織学的及び免疫組織学的分析、定量的分析、ならびに挙動的分析により示した。組織学的及び免疫組織化学的分析 黒質線状体ルートの化学的外傷は黒物質におけるニューロン損失、ならびに線条におけるドパミン作用性脱神経（抗−チロシンヒドロキシラーゼ、ＴＨ抗体による免疫組織学において視覚化）を誘導する。 注入された脳の組織学的分析は、実施例６に記載の条件下でアデノウィルスＡｄ−ａＦＧＦの脳内注入の３週間後に行う。黒物質及び線条において３０μｍの厚さの冠状系列切片を作る。１８０μｍ離れた切片（６切片の中の１切片）をクレシルバイオレットで染色し（ニューロン密度を評価するため）、抗−チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）抗体を用いて免疫標識する（黒物質におけるドパミン作用性ニューロン及び線条におけるそれらの脱神経を検出するため）。定量的分析 黒物質におけるドパミン作用性ニューロン（ＴＨ−陽性）の数は、アデノウィルスＡｄ−ａＦＧＦの効果の評価のためのパラメーターである。試料（黒物質の全長に及ぶ６切片中の１切片）につき計数を行う。各切片に関し、黒物質の両側につき別々にＴＨ−陽性ニューロンを計数する。すべての切片に関する累積の結果を：損傷側のＴＨ−陽性ニューロンの数対非損傷側のＴＨ−陽性ニューロンの数の割合として表す。挙動的分析 黒質線状体ルートの外傷へのアデノウィルスＡｄ−ａＦＧＦの注入の保護機能的効果は、２つの挙動試験：ドパミン作用性作用薬（アポモルフィン、アンフェタミン及びレボドパ）により誘導される回転の試験、及び捕捉（手−到達）試験における動物の感覚運動性能の分析により検出された。実施例７：穿孔ルート（ｐｅｒｆｏｒａｔｉｎｇ ｒｏｕｔｅ）の外傷を有するラットへの、組み換えアデノウィルスによるａＦＧＦ遺伝子の生体内における転移 この実施例は、本発明のアデノウィルスベクターを用いた生体内におけるａＦＧＦ遺伝子の転移を記載する。それは穿孔ルートの外傷の動物モデルにおいて、本発明のベクターが治療的量のａＦＧＦの生体内における発現の誘導を可能にすることを示す。 あらかじめ麻酔されたラットにおいて、外科用ナイフを用いて内鼻海馬ルート（ｅｎｔｏｒｈｉｎｏｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｒｏｕｔｅ）（穿孔ルート）を片側的に切開した。この目的に用いられる定位座標は、ラムダに対して：ＡＰ：＋０．７５；ＭＬ：＋４．１〜６．６；Ｖ：−７．７（Ｖ座標は硬膜に対して決定される）である。 組み換えアデノウィルスａＦＧＦを外傷の直後に、外傷のレベルにおいて、又は海馬及び内鼻皮質のレベルにおいて注入した。さらに特定的に、注入されるアデノウィルスは実施例３．１．で製造されたアデノウィルスＡｄ−ａＦＧＦであり、リン酸塩緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）中において精製形態（３．５ｘ１０⁶ｐｆｕ／μｌ）で用いる。 注入はポンプに接続されたカニューラ（外径２８０μｍ）を用いて行われる。注入の速度は０．５μｌ／分に固定され、その後カニューラを引き出す前にその場所にさらに４分間残す。海馬、内鼻皮質及び穿孔ルートの外傷部位中への注入容積はそれぞれ３μｌ、２μｌ及び２μｌである。注入されるアデノウィルス濃度は３．５ｘ１０⁶ｐｆｕ／μｌである。 本発明のアデノウィルスの投与の治療的効果は、実施例５の条件下における挙動分析により検出することができる。Detailed Description of the InventionRecombinant adenovirus encoding acidic fibroblast growth factor (aFGF)  The present invention is directed to recombinant vectors of viral origin and to the treatment and / or treatment of neurodegenerative diseases.Regarding their use in prevention. More specifically, the present invention relates to acidic fibroblasts.Contains a DNA sequence encoding a growth factor (aFGF, acidic fibroblast growth factor)Recombinant adenovirus. The invention also relates to the production of these vectors,To pharmaceutical compositions containing them and especially their therapeutic use in gene therapyYou.  Neurodegenerative diseases are becoming more common in Western Europe, where populations are increasing as a result of population aging.Becomes a substantial part of the health expenditureing. Examples of these conditions include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, HanExamples include Tington's chorea and amyotrophic lateral sclerosis. theseAlthough the pathological signs and etiology of the disease are quite different, they are all central nervous systemResulting from the gradual loss of neuronal cells in-To a high degree, such as black substance (black substance) in Kinson's diseaseIt produces a local structure. Some palliative treatments are already available, but thoseThe effect is relatively limited. The present invention provides new, especially for the treatment of these diseases.Advantageous therapeutic methods are described. More specifically, the present invention relates to certain trophic factorsEfficient and local expression allows survival of neuronal cells involved in these pathologiesFor vectors that allow direct promotionTo be described.  Trophic factors are a class of substances with properties for stimulating nerve growth or nerve cell survival.Is a molecule. The first neurotrophic factor, NGF (nerve growth factor), is about 40Characterized a year ago (for review, Levi-Montalcini and  Angelleti, Physiol. Rev .. See 48 (1968) 534Want to be illuminated). Other neurotrophic factors, especially brain-induced neurotrophic factor (BDNF) (Theonen, Trends in NeuroSci. 14 (1991) 165), CNTF and the like were identified only recently. Applicant is acidI was particularly interested in sex fibroblast growth factor (aFGF). aFGF is morphologically dependentAnd is a protein of about 134 to 155 amino acids and a molecular weight of 15 to 17 kD.. aFGF was first described in terms of its fibroblast growth potential, which was particularly scarring.It has been useful in the treatment of certain medical conditions such as adulthood. In recent years, aFGFAre subject to retrograde transport of their nigrostriatum in several neuronal populations (Fergusson et Johnson, J. et al. Comp. Neurol. 313 (1991) 693), the survival of dopaminergic neurons in the midbrain in vitro.What you can do(1990) 558). However, although its properties are advantageous, the therapeutic application of aFGFFace various obstacles. Any treatment especially due to the lack of bioavailability of aFGFIt also restricts specific use. Furthermore, the aFGF is continuously and locally applied to a desired region of the body.There is no effective means to allow delivery by method. Finally, the delivered aFGFIt is essential that it is active and able to exert its therapeutic activity in vivo.You.  The present invention provides a particularly advantageous solution to these problems. In fact, the present inventionAnd particularly effective vector for delivering therapeutically active amounts of aFGFIs in development. Co-pending application number PCT / EP93 / 02519Using adenovirus to transfer genes into the nervous system in the bodyIt was shown that The present invention is for transferring specific genes into the nervous system.To new constructs that are particularly adapted and effective in. More specifically the present inventionIs a recombinant containing a DNA sequence encoding acidic fibroblast growth factor (aFGF)Adenovirus, its production, and treatment and / or prevention of neurodegenerative diseasesRegarding its use.  This time, the applicant constructed a recombinant adenovirus containing a sequence encoding aFGF.It is possible to construct and administer these recombinant adenoviruses in vivo.And the administration of this pathology in vivo, especially in the nervous system.To enable stable and local expression of therapeutically active amounts of aFGF without biological impactIndicated. A particularly advantageous property of the vectors of the invention is that the constructs (e.g.Adenovirus lacking the virus region) and expression of aFGF-encoding sequencePromoters used for (preferably viral or tissue-specific promotersAnd a method for the administration of said vector,, And in suitable tissues. Thus, the present invention is a gene therapyVirus vector that can be used directly inIs adapted and effective to direct the expression of aFGF in. HideThe present invention provides a particularly advantageous new method for the treatment and / or prevention of neurodegenerative diseases.provide.  Accordingly, the first subject of the present invention is acidic fibroblast growth factor (aFGF) orA deleted recombinant adenovirus containing a DNA sequence encoding a derivative of  The subject of the invention is the manufacture of a pharmaceutical composition intended for the treatment or prevention of neurodegenerative diseases.It is also the use of such a deleted recombinant adenovirus for construction.  Acidic fibroblast growth factor (aFGF) produced within the framework of the present invention is human aFGIt can be F or animal aFGF. DN in particular encoding human aFGFThe A sequence has been cloned and sequenced (Jaye et al., S.science 273 (1986) 541). Adenovirus vector of the present inventionPrior to their insertion into the sequence, these sequences were modified, for example by site-directed mutagenesis.And is advantageously modified for the insertion of particularly suitable restriction sites. Described in the prior artThe listed sequences are not actually constructed for use in the present invention and have substantialIt may prove necessary to adapt in advance in order to get the actual (See Example 1.2). Within the framework of the present invention, human acidic fibroblast cellIt is preferred to use a DNA sequence encoding the long factor (haFGF). Further upAs described above, a construct encoding a derivative of aFGF, particularly a derivative of human aFGF, was constructed.It can also be used. Such a derivative may, for example, be mutated compared to the original sequence., A deletion and / or addition of the biological properties of aFGF (nutritional and / orStore at least one of the confirming agents (differentiator effect)Containing any sequence that encodes the product These modifications are within the skill of the art.Can be carried out by a method known to a person skilled in the art (see the general molecular biology method andAndSee Example 2). The biological activity of the derivative thus obtained was determined in Example 3.Can be readily determined, as specifically indicated in. Induction of the inventionThe body is a nucleic acid library using the original sequence or its fragment as a probe.Can also be obtained by hybridization from  These derivatives are especially those that have a higher affinity for their binding site.Offspring, sequences that enhance expression in vivo, and greater resistance to proteases.Molecules with anti-resistance, greater therapeutic efficacy or fewer side effects, or newIt is a molecule with potential biological properties.  Among the preferred derivatives, more particularly mention may be made of natural variants of aFGF.it can. Thus, as described in US Pat. No. 4,868,113, variousOf the above, especially containing 154 amino acids, containing 140 amino acids, and 13There is a form of aFGF containing 4 amino acids. The term aFGF refers to these speciesIt is understood to include various forms. Other preferred derivatives are especially one or moreThe molecule in which the residue has been replaced, is not involved in the interaction with the binding site under consideration, orAre rarely included, or due to deletion of regions that express undesirable activityThe resulting derivative, for example a secretory signal and / or a binding peptide compared to the original sequenceDerivatives containing additional residues such as tide.  In a particularly advantageous manner, the sequences used within the framework of the invention are the aFG to be synthesized.F can be released more effectively in the extracellular compartment and activate its receptorAs such, it is possible to direct the synthesized aFGF in the secretory pathway of infected cellsIt also contains a secretory signal that Secretion usedThe signal can be heterologous or even an artificial secretion signal. NervousnessSecretory signals that are functional in vesicles, such as secretory signals for cytokinesIt is advantageous to use As an example, human fiber enabling high secretion of aFGFMention may be made of secretory signals for blast interferon.  The DNA sequence encoding acidic fibroblast growth factor used within the framework of the present invention iscDNA, genomic DNA (gDNA), or, for example, one or moreA hybrid construct containing a cDNA in which a tron can be insertedbe able to. It can also be a synthetic or semi-synthetic sequence. Particularly advantageousFor the method, cDNA or gDNA is used. In particular, the use of gDNA isExpression in cells can be enhanced.  Therefore, in a first embodiment of the invention, the adenovirus is acidic fibroblast growth.It contains a cDNA sequence encoding the factor (aFGF). Other preferred implementations of the inventionIn an embodiment, the adenovirus encodes acidic fibroblast growth factor (aFGF).GDNA sequence. Before the DNA sequence encoding aFGF,Advantageously, there is a heterologous secretion signal that is functional and functional.  The sequence encoding aFGF is a signal that enables its expression in neuronal cellsAdvantageously, it is placed under control. They are heterologous expression signals, ie aFIt is preferred that the signal is different from the signal naturally responsible for the expression of GF.They can in particular be sequences responsible for the expression of other proteins or synthetic sequences. In particular they can be promoter sequences for eukaryotic or viral genes. For example they get infectedIs a promoter sequence derived from the desired cell genomeit can. Similarly, are they the genomes of the viruses, including the adenovirus used?Can be derived from a promoter sequence. In this regard, for example, ElA, MLP, CMV, RSV-LTR promoter and the like. SaIn addition, these expression sequences are capable of activating or regulatory sequences, or tissue-specific expression.It can be modified by the addition of an enabling sequence. In fact, unique in nerve cellsThe virus is actually or preferentially active,DNA sequences are only expressed and produce their effects when infected withCan be particularly advantageous. In this regard, for example, neuron-specific enolase proA motor, a GFAP promoter, etc. can be mentioned.  In a first particular embodiment, the invention provides regulation of the RSV-LTR promoter.Below is a cDNA sequence encoding human acidic fibroblast growth factor (haFGF).And a deletion recombinant adenovirus.  In another particular embodiment, the invention is under the control of the RSV-LTR promoter.Contains a gDNA sequence encoding human acidic fibroblast growth factor (haFGF)Deletion recombinant adenovirus.  In fact, Applicants have found that the Rous sarcoma virus (RSV) LTR promoter isIn particular, to enable continuous and substantial expression of aFGF in cells of the central nervous systemWas shown.  In a further preferred embodiment, the invention allows preferential expression in the nervous system.Human acidic fibroblast growth factor (haFGF) under the control of a promoterDeficient recombinant adenovirus having an encoded DNA sequence.  Particularly preferred embodiments of the invention include ITR sequences, sequences that allow encapsidation, acidic sequences.Prioritize fibroblast growth factor (haFGF) or its derivatives in the nervous systemE1 gene, and E2, which are included under the control of a promoter that enables dynamic expression,A deletion recombinant gene in which at least one of the E4 and L1-L5 genes is non-functionalIt's in Denovirus.  The deleted adenoviruses of the invention are capable of autonomous replication in target cells.It is an adenovirus that does not work. Therefore, the deletion addenda commonly used within the framework of the present inventionThe novirus genome is at least required for replication of the virus in infected cells.The array is missing. These areas are either removed (completely or partially), orIs non-functional or by other sequences encodes in particular aFGFIt can be replaced by DNA.  The deletion virus of the present invention preserves the sequence required for the envelope of virus particles in its genome.Preferably. More preferably, as described above, the deletion recombinant of the present inventionThe adenovirus genome has an ITR sequence, a sequence enabling envelope, non-functional E1.Gene, and at least one non-functional E2, E4 or L1-L5 gene.No.  There are various adenovirus serotypes that differ somewhat in structure and properties. thisAmong these serotypes, human adenovirus type 2 or 5 (Ad2 or Ad5),Of an adenovirus of animal origin (see application FR93 05954)Use is preferred within the framework of the invention. Of animal origin which can be used within the framework of the inventionAmong adenoviruses, dogs, cows, mice (eg Mav1: Mav1, Beard et al. , Virology 75 (1990) 81), sheep,Pig, bird or anotherAn example is an adenovirus of monkey (eg: SAV) origin. animalThe adenovirus of origin is preferably canine adenovirus, or CAV2 adenovirus.Is more preferred [eg Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR-800)]. Preferably within the framework of the invention a human or dog, or a mixedSynthetic adenoviruses are used.  The deletion recombinant adenovirus of the present invention is known to those skilled in the art.It can be produced by any method (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham., EMBO J .; 3 (1984) 2917). In particular they are adenoviruses and, A homologous assembly between plasmids having a DNA sequence encoding aFGF, among othersIt can be manufactured by replacement. Homologous recombination is carried out in a suitable cell line.It occurs after co-transfection of virus and plasmid. UsedThe cell line preferably must (i) be transformable by the element, (ii)) A sequence that can complement the deleted part of the genome of the adenovirus genome is used as a risk of recombination.It should preferably be included in integrated form to avoid ruggedness. Cell lineAs an example of human embryonic kidney system 293 (Graham et al., J. Gen. V.irol. 36 (1977) 59), which is especially Ad5It contains the left part (12%) of the novirus genome integrated into its genome. AdenoThe tactics for the construction of the vectors derived from the virus are also application number FR 9305954 and FR93085596, which are incorporated by reference.This is the content of this specification.  The propagated adenovirus is then recovered and subjected to conventional molecular biology methods described in the examples.Therefore, purify.  As described above, the present invention provides a pharmaceutical preparation for treating and / or preventing a neurodegenerative disease.It also relates to the use of the above-mentioned adenovirus for the manufacture of a pharmaceutical composition. More specificSpecifically, the present invention relates to Parkinson's disease, Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS).), The treatment and / or prevention of Huntington's chorea, epilepsy and vascular dementiaIt relates to the use of these adenoviruses for the manufacture of the desired pharmaceutical composition.You.  The present invention provides a pharmaceutical composition comprising one or more deletion recombinant adenoviruses as described above.Composition. These pharmaceutical compositions may be topical, oral, parenteral, nasalIt can be prepared for internal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular or transdermal administration, etc.Wear. The pharmaceutical compositions of the present invention are suitable for injectable preparations, especially directly on the patient's nervous system.It preferably comprises a pharmaceutically acceptable vehicle for injection. This is specialNote that adding isotonic sterile solution, or sterile water or saline depending on the case, toIt can be a dry, especially freeze-dried composition, from which the input solution can be prepared. Patient godDirect injection into the meridian system focuses the therapeutic effect on the level of the affected tissue.This is advantageous because it enables it. Direct injection into the patient's central nervous system is stereotactic injectionPreference is given to using the device. In fact, by using such a device, the injection partYou will be able to target the position very accurately.  In this regard, the present invention provides a patient with a recombinant adenovirus as defined above.To a method for the treatment of a neurodegenerative disease, which comprises More specificallyThe present invention relates to neurodegeneration involving stereotaxic administration of recombinant adenovirus as defined above.A method for the treatment of sexual disorders.  The dosage of deleted recombinant adenovirus used for infusion varies depending on the parameters.The particular mode of administration used, the associated pathology, or otherwiseIt can be adjusted according to the desired duration of treatment. Generally the recombinant of the present invention10 adenoviruses^Four-10¹⁴pfu / ml, preferably 10⁶-10^Tenpfu/ Ml dosage form is prepared and administered. pfu (plaque forming unit)The term corresponds to the infectivity of the viral solution, infecting a suitable cell culture, thenIt is generally determined after 48 hours by measuring the number of plaques on infected cells.Methods for the determination of pfu titers of viral solutions are well illustrated in the literatureI have.  Another subject of the invention is one or more of the above-mentioned deletion recombinant adenoviruses.Mammalian cells infected with. More specifically, the present invention relates to these adenoviruses.Rus infected human cell population. They are especially fibroblasts, myoblasts, liverIt can be a cell, epidermal cell, endothelial cell, glial cell and the like.  The cells of the present invention can be obtained from primary culture. Put them in the fieldBy methods known to those skilled in the art and then grown under conditions that allow their growth.Can be nourished. More specifically for fibroblasts, these are eg Ham [Methods Cell. Biol. 21a (1980) 255].It can be easily obtained from a biopsy according to the method described above. Adeno these cellsCan be used directly for infection by viruses, or auto for later useIt can be preserved, for example by freezing, for the establishment of a logas library. DepartureLight cells are, for example, subcultures obtained from pre-established librariesThisCan also be.  Then, the cultured cells were infected with the recombinant adenovirus to produce them aFGF.Try to give the ability to give birth. Infection known to those of ordinary skill in the artIt is performed in a test tube according to the law. Type of cell used and per cellDepending on the desired number of viral copies of, And optionally, the number of cycles of infection performed can be controlled. thisThese steps should be performed under sterile conditions suitable for the cells intended for in vivo administration.It is clearly understood that it should be done. Set used for infection of cellsThe modified adenovirus dosage can be determined by those skilled in the art according to the desired purpose.Can be adjusted by the person. The above conditions for in vivo administration should be in vitro.It can also be applied to other infections.  Another subject of the invention is one or more of the above deletion recombinant adenoviruses.Implants containing infected mammalian cells and extracellular matrix. The present invention10 embedded plants^Five-10^TenPreferably, it comprises individual cells. They are 10⁶~ 10⁸It is more preferable to include the number.  More specifically, in the implant of the present invention, the extracellular matrix gels.It includes a compound and optionally a carrier that allows the fixation of cells.  Various types of gelling agents can be used for the production of the implants of the invention. The gelling agent contains cells in a matrix having a gel structure, and is appropriately placed on a carrier.Used to enhance cell fixation. Therefore, various cell adhesives, especially colorGen, gelatin, glycosaminoglycans, fibronectin, lectins, etc.Can be used as a gelling agent. Collagen is used within the framework of the present invention.Is preferred. This is human,It can be collagen of bovine or murine origin. More specifically, type ICollagen is used.  As mentioned above, the composition of the invention comprises a carrier by allowing the fixation of cells.Is preferred. The term fixation does not result in the adhesion and / or attachment of cells on the carrier.Refers to any form of biological and / or chemical and / or physical interactionYou. Furthermore, the cells cover the carrier used or penetrate into the interior of this carrier.Rui can be both. Use of solid non-toxic and / or biocompatible carriersAre preferred within the framework of the invention. Especially polytetrafluoroethylene (PTFE) fiberAlternatively, a biogenic carrier can be used.  The implantable plant of the present invention can be implanted in various parts of the bodyYou. In particular, the implant is made in the abdominal cavity of the subcutaneous tissue (suprapubic region, iliac fossa, and pit).Etc.) in organs, muscles, tumors, central nervous system, or otherwise submucosallyYou can do it later. The implants of the present invention are those where they are therapeutic products in the body.Is particularly advantageous in that it makes it possible to control the release of1 by the multiplicity of infection and by the number of infected cells. Then the release is a treatmentGenes that are controlled by the removal of embedded plants that permanently stopRegulated by the use of a regulatable expression system that allows inducing or suppressing the expression ofIs done.  The present invention thus provides a very effective means for the treatment or prevention of neurodegenerative diseases.Offer. It is most specifically Alzheimer's disease, Parkinson's disease, HuntingIt is indicated for the treatment of Gutton's disease or ALS disease. Furthermore, the adenows of the present inventionVirus vectors are especially useful for the infection of nerve cells.Has a substantial advantage associated with their high efficiency, whichIt makes it possible to carry out the infection with the suspension. Further, according to the adenovirus of the present invention,Infections are highly localized at the site of injection, which is a spread of spread to adjacent brain structures.Avoid danger.  In addition, this treatment is for humans as well as sheep, cattle, livestock (dogs, cats, etc.),It can be applied to any animal such as horse and fish.  The invention will be more fully described by the following examples, which are exemplary and limiting.Should not be considered.Description of the drawingsFigure 1: Diagram of vector pXL2244Figure 2: Diagram of the vector pSh-Ad-aFGF.General molecular biology method  Methods conventionally used in molecular biology, such as preparative (preparative) extraction of plasmid DNA in a cesium chloride gradientDNA fragmentation by centrifugation, agarose or acrylamide gel electrophoresis, electroelutionPurification of proteins, phenol or phenol-chloroform extraction of proteins,Ethanol or isopropanol precipitation of DNA in saline medium, EscherichiaTransformation and the like in Escherichia coli can be obtained by the technique described above.Well-known to those skilled in the field and widely described in the literature [Maniatis  T. et al. , “Molecular Cloning, a Labor”atory ManualF, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.M. Y. , 1982Ausubel F .; M. et al. (Eds),"Current Protocols in Molecular BiolodyF, John Wiley & Sons, New York, 1987].  pBR322- and pUC type plasmids and M13 series phages are commercially available.Noh (Bethesda Research Laboratories).  The DNA fragments were electrophoresed on an agarose or acrylamide gel for ligation.Separation according to their dimensions by electrophoresis, with or without phenol/ Chloroform mixture, extracted with ethanol and then precipitated.In the presence of phage T4 DNA ligase (Biolabs) according to the supplier's recommendationsCan be incubated.  The filling of the overhanging 5'end is done by E.I. E. coli DNA polymeraseThis can be done using the Klenow fragment of I (Biolabs). ProtrusionDisruption of the 3'end was performed in the presence of phage T4 DNA polymerase andUsed in accordance with the recommendations of. S1 nuclease was used to destroy the protruding 5'end.Moreover, it is performed by a controlled process.  Site-directed mutagenesis in vitro by synthetic oligodeoxynucleotides.Induction was carried out according to Taylor et al. [Nucleic Acids Res.13(1985) 8749-8764] according to the method developed by Amer.This can be done using the kit sold by sham.  The so-called PCR method [Polymase-catalyzedChain  Raction, Saiki R. et al. K. et al. , Science230(1985) 1350-1354; Mullis.  K. B. and Falloona F. A. , Meth. Enzym.155(1987) 335-350].A thermal cycler (Perkin El)mer Cetus) according to the manufacturer's standard.  Confirmation of the nucleotide sequence can be found in Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,74(1977) 5463-5467].Depending on the method published, this may be done using the kit sold by Amersham.Can be.ExampleExample 1: Construction of vector pSh-Ad-aFGF  This example shows a promoter containing the Rous sarcoma virus LTR (RSV-LTR).DNA sequence encoding aFGF preceded by a heterologous secretory sequence under the control ofThe construction of the vector is described.  1.1. Starting vector (pXL2244): Plasmid pXL2244 is RSApoAI cDNA and Ad under the control of V virus LTR promoterIncludes 5 adenovirus sequences (Figure 1). It encodes the prepro ApoAIThe ClaI-EcoRV fragment containing the cDNA was digested with the same enzymes.Kector pLTR RSV-βgal (Stratford-Perricaudet et al. J. Clin. Invest. 90 (1992) 626)Constructed by inserting inside.  1.2. Construction of cDNA sequence encoding aFGF  To enable the construction of the vector of the present invention, it encodes human aFGFWas constructed as follows:  Human aFGF containing -134 amino acids (aFGF₁₃₄) -Encoding cDNAThe sequence is shown in plasmid pMJ26 (Jaye et al., J. Biol. Che.m. 262 (1987) 16612). The plasmid pMJ26 is EThe cDNA sequence encoding human aFGF preceded by the sequence of the coRI restriction siteIncluding. The sequence of this region of the plasmid is as follows (EcoRI site underlined, andThe start codon is in bold):. . .GAATTCATG. . .  After digestion with EcoRI enzyme, the ends of the restriction sites were treated with soybean nuclease.It smoothed by reason. The resulting fragment has the following ends (start codonIs bold):. . .GAATTCATG. . . (PMJ26). . . G CATG. . . (EcoRI + Soybean Fruase)  This sequence was then modified by inserting a secretory sequence. Introduction of this sequence is notMore effective extracellular release of aFGF synthesized by cells infected with the vectorIs particularly advantageous because it enables More specifically, the sequence obtained above is 5 'Human fibroblast interface at the termini and in the phase with aFGFModified by inserting a double-stranded synthetic oligonucleotide corresponding to the secretory sequence for Ron.(Taniguchi et al., Gene 10 (1980) 11). Each strand of this oligonucleotide was chemically synthesized using a nucleic acid synthesizer,And hybridized to construct a double-stranded DNA. The sequence used isContains a 70 bp chain (SEQ ID NO: 1):  This oligonucleotide has an XhoI site (at the above sequenceUnderscore). This double-stranded oligonucleotide was labeled with EcoRI as described above.And ligated to the aFGF-coding sequence digested with soybean nuclease. NextClones with inserts in the correct orientation were isolated and examined by sequencing. ThisContaining an aFGF-coding sequence preceded by a secretory sequence present inThe complete fragment was then digested with the XhoI and BglII enzymes (BglII siteLocated after the stop codon) and then digested withVector p267 cleaved with the same enzyme (Jaye et al., EMBO)  J. 7 (1988) 963). The resulting vector is called pMJ35did.  Next, the following oligonucleotide was added to the sequence produced above by PCR method.Modified using as a primer:  The amplification step by PCR for the plasmid pMJ35 was carried out by the chimeric sequence "secretion /It is possible to introduce suitable restriction sites on both sides of "aFGF sequence"To More specifically, these steps include the ClaI site (5 'at the 5'end.The oligonucleotide is underlined with one line and underlined with two lines.This position relative to the start codon), as well as K at the 3'endpnI site (single line underlined in 3'oligonucleotide)Allows insertion. The site created is the sequence of the vector of the invention under expression conditions.Allows to be inserted inside.  1.3. Construction of vector pSh-Ad-aFGF  This example shows that aFGF preceded by a secretory sequence under the control of the RSV virus LTR.Coding sequence and Ad5 adeno enabling recombination in vivoThe construction of the vector pSh-Ad-aFGF containing viral sequences is described.  Example 1.2. The PCR fragment prepared inInto a secretory signal for human fibroblast interferon, obtained by digestion withA 0.5 kb fragment containing the sequence preceding aFGF is preceded byAnd purified by LMP (low melting point) agarose gel electrophoresis. ParallelDigest the vector pXL2244 with the same ClaI and KpnI restriction enzymes.And then allowed to settle after the latter inactivation. Pre-isolated agaroseThe resulting linear vector and 0.5 kb flag purified by gel electrophoresis.Ment was then ligated to generate the vector pSh-Ad-aFGF (Figure 2).The entire nucleotide sequence of the aFGF insert was determined by dideoxynucleotide sequencing.Examined.Example 2. Functionality of vector pSh-Ad-aFGF  Vector pS expressing a biologically active form of aFGF in cell cultureThe ability of h-Ad-aFGF to transduce COSI cell transients.It was shown by transfection. Therefore, in the presence of TransfectamCells (2 x 10 per 10 cm diameter dish)⁶Individual cells)(8 μg vector). After 48 hours, the cell culture supernatant was harvested. ThenSerial dilutions (1/200 and 1/50) of this supernatant were used for NIH 3T3 cell culture.Added to nutrition. Observing nutritional effects on these cultures by inserting radiolabeled thymidinedid. In parallel, immunodetection of aFGF production by transfected cellsAlso showed by.Example 3. Recombinant adenovirus Ad-aF containing sequence encoding aFGFConstruction of GF  The vector pSh-Ad-aFGF was linearized with the deleted adenovirus vector.Together, the functions encoded by the adenovirus E1 region (E1A and E1B)Cotransfected into helper cells (line 293) feeding in trans.  More specifically, the adenovirus Ad-aFGF is a mutant adenovirus.Ad-d11324 (Thimmappaya et al., Cell 31.(1982) 543) and the vector pSh-Ad-aFGF in vivo.Was obtained according to the following method by homologous recombination: linear with the enzyme ClaI.Plasmid pSh-Ad-aFGF and adenovirus Ad-d11324 was cotransfected into line 293 in the presence of calcium phosphate and was homologous.Recombined. Plaque purification of the recombinant adenovirus thus generatedSelected bydid. After isolation, recombinant adenovirus DNA was amplified in cell line 293., It's about 10^TenUnpurified recombinant deleted adenowill with titer of pfu / mlA culture supernatant containing broth is given.  The virus particles were then purified by cesium chloride gradient centrifugation according to known methods.(Especially Graham et al., Virology 52 (1973) 456). Adenovirus Ad-aFGF in 20% glycerolCan be stored at -80 ° C.Example 4. Functionality of adenovirus Ad-aFGF  Infects cultured cells and expresses a biologically active form of aFGF in culture, Adenovirus Ad-aFGF capacity in human 293 and rat PC12 linesShown by infecting. Then the presence of active aFGF in the culture supernatantDetermined under the same conditions as in Example 2.  These studies show that adenovirus actually produces a biologically active form of aFGF.It is possible to show that it is expressed in cell culture.Example 5: To rats with fimbria-fornix traumaIn vivo transfer of aFGF gene by recombinant adenovirus  This example shows aF in vivo using the adenovirus vector of the present invention.The transfer of the GF gene is described. It relates to an animal model of fornix burn trauma.The clear vector allows inducible expression of a therapeutic amount of aFGF in vivo.And  In the pre-anesthetized rat, the septum-hippocampus route (fornix fimbria) is placed in the left half.An incision was made at the level of the sphere. This mechanical trauma is retractable.ble) formed using a surgical knife. This effectThe stereotactic coordinates used for bregma are: AP: -1.7; ML: +1.5V: -5.5 to -0.5.  The aFGF recombinant adenovirus was applied to the median septum (median) immediately after trauma.nucleus) and into the back of deafferented hippocampus (traumatic hippocampus)I entered. More specifically, the adenovirus injected is as described in Example 3.1. Manufactured inAdenovirus Ad-aFGF which was isolated in phosphate buffered saline (PBS)In purified form (3.5 x 10⁶pfu / μl).  The injection is carried out using a cannula (outer diameter 280 μm) connected to a pump.The rate of infusion was fixed at 0.5 μl / min, after which the cannula was withdrawn before withdrawal.Leave in place for another 4 minutes. The volume of injection into the hippocampus and septum was 3 μl and2 μl. Adenovirus concentration injected is 3.5 x 10⁶in pfu / μlis there.  For injection into the hippocampus, the stereotactic coordinates are as follows: AP = -4; ML = 3.. 5; V = -3.1 (AP and ML coordinates are determined for bregma, V coordinates areTo the surface of the skull at the level of bregma.  For injection into the septum, stereotactic coordinates are as follows: AP = 1; ML = 1;V = -6 (AP and ML coordinates are determined for bregma, V coordinates areTo the surface of the skull at the level. Under these conditions, the cannulaIt is at an angle of 9 degrees to the vertical to avoid (medium lateral direction).  Analysis of three therapeutic effects of administration of adenovirus of the present invention: histological and immuneIt was shown by epidemiologic histochemical analysis, quantitative analysis, and behavioral analysis.Histological immunohistochemical analysis  Mechanical trauma of the fornix is associated with cholinergic neurons in the septum (anti-choline acetate).Loss in visualization in immunohistology by chill transferase, ChaT antibody)Loss, and cholinergic denervation in the hippocampus (acetylcholinesterase,AChE activity induces detection in histochemistry).  Histological analysis of the infused brain showed 3 of intracerebral infusion of adenovirus Ad-aFGF.Perform after a week. To this end, the animals were anesthetized with 4% paraformaldehyde in the heart.Sacrifice by infusion. After removal, post-fixation and cryoprotection, the brain is cryomat (Cryomat) is used to make an incision along the frontal plane: over the entire length of the septum.30 μm thick coronal serial sections (rob) in the anterior, middle and posterior part of the Rabbin hippocampusnal serial sections). If the septum is 180 μm apartStained sections (1 of 6 sections) were stained with cresyl violet (neuronsImmunolabeling with anti-ChAT antibody (Biochem) to assess density)Yes (to identify cholinergic neurons). Immunohistochemical method, DABIs a method of streptavidin-biotin peroxidase visualized usingYou. In the case of hippocampus, slices 180 μm apart were used for the detection of cholinergic denervation.Staining according to histochemical method for AChE (acetylcholinesterase)I do. Sections are fixed on glass slides.Quantitative analysis  The number of cholinergic neurons (ChAT-positive) in the septum was determined byThis is a parameter for evaluation of the effect of Ruth Ad-aFGF.Counts are made per sample (1 out of 6 sections spanning the entire length of the septum). For each section,ChAT-positive neurons are counted separately on each side of the septum. For all sectionsThe cumulative results for the number of ChAT-positive neurons on the injured side versus Ch on the uninjured sideIt is represented by the ratio of the number of AT-positive neurons.Behavioral analysis  Trauma on both sides of the septal-hippocampal route leads to memory loss. Adenows to this type of traumaThe protective functional effect of infusion of virus Ad-aFGF was demonstrated by two behavioral tests: Morri.s swimming test (visual spatial reference memory)nce memory) and TMTT test (twice-test memory work (two-t)animals during the “reals memory task”; “short-term memory of the new environment”)Was detected by analysis of the memory performance of.Example 6 Recombinant Adenowill to Rats with Nigrostriatal Root TraumaTransfer of aFGF gene in vivo  This example shows in vivo aF using the adenovirus vector of the present invention.The transfer of the GF gene is described. It is used in animal models of trauma of the substantia nigra routeTherefore, the vector of the present invention is capable of inducing in vivo expression of a therapeutic amount of aFGF.It indicates that it is Noh.  In pre-anesthetized rats, the toxin 6-hydroxydopamine (60H-DA) injuries the nigrostriatal root at the level of the midbrain bundle (MFB)Was. This chemical trauma by injection was unilateral along the following stereotactic coordinates: AP: 0 and -1; ML: +1.6; V: -8.6 and -9 (AP and ML coordinates areFor bregma, the V coordinate is determined for the dura). The cutting bar is + 5mmFixed to level.  Immediately after the trauma of the recombinant adenovirus aFGF, black matter andAnd injected into the filament. More specifically, the adenovirus injected is from Example 3.1. Adenovirus Ad-aFGF manufactured byPurified form (3.5 x 10 in PBS)⁶pfu / μl).  The injection is carried out using a cannula (outer diameter 280 μm) connected to a pump.The rate of infusion was fixed at 0.5 μl / min, after which the cannula was withdrawn before withdrawal.Leave in place for another 4 minutes. Injection volume into the filament and the black substance is 2 x 3 μl eachAnd 2 μl. Adenovirus concentration injected is 3.5 x 10⁶pfu / μIt is l.  For injection into black material the stereotactic coordinates are: AP = -5.8; ML = + 2; V = -7.5 (AP and ML coordinates are for bregma, V coordinates are dura)Determined).  For injection into the striatum, the stereotactic coordinates are as follows: AP = + 0.5 and-0.5; ML = 3; V = -5.5 (AP and ML coordinates are for VThe mark is determined for the dura).  Analysis of three therapeutic effects of administration of adenovirus of the present invention: histological and immuneIt was shown by epidemiologic, quantitative, and behavioral analysis.Histological and immunohistochemical analysis  Nitrogen striatal root chemical trauma causes neuronal loss in the black matter, as well as striaeDopaminergic denervation (in anti-tyrosine hydroxylase, TH antibodyIn immunohistology).  Histological analysis of the infused brains revealed that adenovirus under the conditions described in Example 6.3 weeks after intracerebral injection of Rus Ad-aFGF. 30 in black matter and filamentsMake coronal serial sections of μm thickness. Sections separated by 180 μm (1 section out of 6 sections)) Was stained with cresyl violet (to assess neuronal density)Immunolabeling with rosin hydroxylase (TH) antibodyTo detect paminergic neurons and their denervation in the striatum).Quantitative analysis  The number of dopaminergic neurons (TH-positive) in black matter wasThis is a parameter for evaluation of the effect of Ruth Ad-aFGF. Sample (of black matterCount per 1 section out of 6 sections over the entire length). Both sides of the black material for each sectionTH-positive neurons are counted separately for each. Cumulative results for all interceptsResult: number of TH-positive neurons on the injured side vs. TH-positive neurons on the uninjured sideExpressed as a percentage of numbers.Behavioral analysis  Protective function of injecting adenovirus Ad-aFGF into traumatic nigrostriatal lesionsEffects are assessed in two behavioral tests: dopaminergic agonists (apomorphine, amphetamine).Tamin and levodopa) induced rotation test and capture (hand-reaching) testWere detected by analysis of the sensorimotor performance of the animals.Example 7: Having a perforating route traumaIn vivo transfer of aFGF gene by recombinant adenovirus to ratTransfer  This example shows in vivo aF using the adenovirus vector of the present invention.The transfer of the GF gene is described. It is a traumatic animal with a piercing routeIn a model, the vector of the present invention expresses a therapeutic amount of aFGF in vivo.It is shown that the induction of  Endonasal hippocampal route using a surgical knife in pre-anesthetized rats(Entorinohippocampal route) (drilling route)A unilateral incision was made. The stereotactic coordinates used for this purpose are for Lambda: AP:+0.75; ML: +4.1 to 6.6; V: -7.7 (V coordinate is determined for dura.Is determined).  Recombinant adenovirus aFGF was administered immediately after trauma, at the level of trauma, andWere injected at the level of hippocampus and inner nasal cortex. More specifically,Denovirus was prepared according to Example 3.1. Adenovirus Ad-aFGF manufactured byAnd purified form (3.5 × 10 5) in phosphate buffered saline (PBS).⁶pfu / μl).  The injection is carried out using a cannula (outer diameter 280 μm) connected to a pump.The rate of infusion was fixed at 0.5 μl / min, after which the cannula was withdrawn before withdrawal.Leave in place for another 4 minutes. Injection into the trauma site of the hippocampus, the inner nasal cortex and the perforation routeThe volumes are 3 μl, 2 μl and 2 μl respectively. Adenovirus concentrate injectedDegree is 3.5x10⁶pfu / μl.  The therapeutic effect of administration of the adenovirus of the present invention was improved under the conditions of Example 5.It can be detected by dynamic analysis.

─────────────────────────────────────────────────────フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 47/36 7433−4Ｃ Ａ６１Ｋ 47/42 Ｃ 47/42 9051−4Ｃ 48/00 ＡＡＭ 48/00 ＡＡＭ 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｈ 21/04 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/50 // Ｃ０７Ｋ 14/50 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/36 ＡＡＢ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ(72)発明者 ペリコーデ， ミシエル フランス・エフ−28320エクロスヌ・リユ ドシヤルトル31(72)発明者 プラデイエ， ローラン フランス・エフ−75014パリ・リユダレジ ア５ビス(72)発明者 ビニユ， エマニユエル フランス・エフ−94200イブリ−シユール −セーヌ・リユジヤン−ルガルー60─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl.⁶ Identification number Internal reference number FI A61K 47/36 7433-4C A61K 47/42 C 47/42 9051-4C 48/00 AAM 48/00 AAM 8615- 4C C07H 21/04 B C07H 21/04 9282-4B C12N 7/00 C12N 7/00 9637-4B C12P 21/02 H C12P 21/02 9356-4H C07K 14/50 // C07K 14/50 9051-4C A61K 37/36 AAB (C12P 21/02 C12R 1:92) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG), A , AU, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CZ, EE, FI, GE, HU, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SD, SI, SK, TJ, TT, UA, US, UZ, VN (72) Inventor Pericode, Michel France F-28320 Dossartre 31 (72) Inventor Pradeier, Laurent France EF-75014 Paris Liyudalezia 5bis (72) Inventor Vinille, Emanyuelle France EF-94200 Ivry-Syur-Seine-Lieujyan-Legaroo 60

Claims (1)

Translated fromJapanese

【特許請求の範囲】 １．酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）又はそれらの誘導体をコードするＤＮＡ配列を含む欠失組み換えアデノウィルス。 ２．ＤＮＡ配列が５’において、及びａＦＧＦをコードする配列の読み枠（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）において分泌配列を含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のアデノウィルス。 ３．分泌配列が好ましくサイトカインから得られる、神経細胞において機能性である分泌配列から選ばれることを特徴とする請求の範囲第２項に記載のアデノウィルス。 ４．ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列であることを特徴とする請求の範囲第１〜３項に記載のアデノウィルス。 ５．ＤＮＡ配列がｇＤＮＡ配列であることを特徴とする請求の範囲第１〜３項に記載のアデノウィルス。 ６．ＤＮＡ配列が１５４、１４０又は１３４アミノ酸、好ましくは１３４形態のヒトａＦＧＦをコードすることを特徴とする請求の範囲第１〜５項の１つに記載のアデノウィルス。 ７．ＤＮＡ配列が神経細胞におけるその発現を可能にするシグナルの調節下におかれることを特徴とする請求の範囲第１〜６項の１つに記載のアデノウィルス。 ８．発現シグナルがウィルスプロモーター、好ましくはＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ及びＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターから選ばれることを特徴とする請求の範囲第７項に記載のアデノウィルス。 ９．ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターの調節下で分泌配列により先行されるヒトａＦＧＦをコードするｃＤＮＡ配列を含む欠失組み換えアデノウィルス。 １０．ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターの調節下で分泌配列により先行されるヒトａＦＧＦをコードするｇＤＮＡ配列を含む欠失組み換えアデノウィルス。 １１．神経細胞における優先的発現を可能にするプロモーターの調節下でヒトａＦＧＦ又はそれらの誘導体をコードするＤＮＡ配列を含む欠失組み換えアデノウィルス。 １２．プロモーターがニューロン−特異的エノラーゼプロモーター及びＧＦＡＰプロモーターから選ばれることを特徴とする請求の範囲第１１項に記載の欠失組み換えアデノウィルス。 １３．標的細胞におけるその複製のために必要なそのゲノムの領域が欠けていることを特徴とする請求の範囲第１〜１２項の１つに記載のアデノウィルス。 １４．ＩＴＲ及び包膜を可能にする配列を含み、Ｅ１遺伝子及びＥ２、Ｅ４又はＬ１〜Ｌ５遺伝子の少なくとも１つが非機能性であることを特徴とする請求の範囲第１３項に記載のアデノウィルス。 １５．Ａｄ２又はＡｄ５型ヒトアデノウィルス、あるいはＣＡＶ−２型イヌアデノウィルスであることを特徴とする請求の範囲第１３又は１４項に記載のアデノウィルス。 １６．神経変性疾患の処置及び／又は予防を目的とする製薬学的組成物の製造のための請求の範囲第１〜１５項の１つに記載のアデノウィルスの利用。 １７．パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン舞踏病又はＡＬＳ疾患の処置及び／又は予防を目的とする製薬学的組成物の製造のための請求の範囲第１６項に記載の利用。 １８．１種又はそれ以上の請求の範囲第１〜１５項の１つに記載の欠失組み換えアデノウィルスを含む製薬学的組成物。 １９．注入可能な形態であることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の製薬学的組成物。 ２０．１０⁴〜１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの欠失組み換えアデノウィルスを含むことを特徴とする請求の範囲第１８又は１９項に記載の製薬学的組成物。 ２１．１種又はそれ以上の請求の範囲第１〜１５項の１つに記載の欠失組み換えアデノウィルスに感染した哺乳類細胞。 ２２．好ましくは繊維芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、内皮細胞、神経膠細胞及び表皮細胞から選ばれるヒト細胞であることを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の細胞。 ２３．請求の範囲第２１〜２２項に記載の感染細胞及び細胞外マトリックスを含む体内埋植物。 ２４．細胞外マトリックスが好ましくはコラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン類、フィブロネクチン及びレクチン類から選ばれるゲル化化合物を含むことを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の体内埋植物。 ２５．細胞外マトリックスが感染細胞の固定を可能にする担体も含むことを特徴とする請求の範囲第２３又は２４項に記載の体内埋植物。 ２６．担体が好ましくはポリテトラフルオロエチレン繊維から成ることを特徴とする請求の範囲第２５項に記載の体内埋植物。[Claims] 1. A deletion recombinant adenovirus comprising a DNA sequence encoding acidic fibroblast growth factor (aFGF) or a derivative thereof. 2. Adenovirus according to claim 1, characterized in that the DNA sequence comprises a secretory sequence in the 5'and in the reading phase of the sequence coding for aFGF. 3. Adenovirus according to claim 2, characterized in that the secretory sequence is selected from secretory sequences which are functional in neuronal cells, preferably derived from cytokines. 4. The adenovirus according to any one of claims 1 to 3, wherein the DNA sequence is a cDNA sequence. 5. The adenovirus according to any one of claims 1 to 3, wherein the DNA sequence is a gDNA sequence. 6. Adenovirus according to one of claims 1 to 5, characterized in that the DNA sequence codes for 154, 140 or 134 amino acids, preferably the form 134 of human aFGF. 7. Adenovirus according to one of claims 1 to 6, characterized in that the DNA sequence is under the control of signals which enable its expression in neural cells. 8. Adenovirus according to claim 7, characterized in that the expression signal is selected from viral promoters, preferably E1A, MLP, CMV and RSV-LTR promoters. 9. A deletion recombinant adenovirus comprising a cDNA sequence encoding human aFGF preceded by a secretory sequence under the control of the RSV-LTR promoter. 10. A deleted recombinant adenovirus comprising a gDNA sequence encoding human aFGF preceded by a secretory sequence under the control of the RSV-LTR promoter. 11. A deletion recombinant adenovirus comprising a DNA sequence coding for human aFGF or a derivative thereof under the control of a promoter allowing preferential expression in neurons. 12. The deletion recombinant adenovirus according to claim 11, characterized in that the promoter is selected from a neuron-specific enolase promoter and a GCAP promoter. 13. Adenovirus according to one of claims 1 to 12, characterized in that it lacks the region of its genome necessary for its replication in target cells. 14． The adenovirus according to claim 13, wherein the adenovirus comprises an ITR and a sequence enabling envelope, and at least one of the E1 gene and the E2, E4 or L1 to L5 genes is non-functional. 15. 15. The adenovirus according to claim 13 or 14, which is Ad2 or Ad5 human adenovirus or CAV-2 canine adenovirus. 16. Use of an adenovirus according to one of claims 1 to 15 for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of neurodegenerative diseases. 17． Use according to claim 16 for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's chorea or ALS disease. 18. A pharmaceutical composition comprising one or more deletion recombinant adenoviruses according to one of claims 1-15. 19. The pharmaceutical composition according to claim 18, characterized in that it is in injectable form. 20. A pharmaceutical composition according to claim 18 or 19, characterized in that it contains 10⁴ to 10¹⁴ pfu / ml of deleted recombinant adenovirus, preferably 10⁶ to 10¹⁰ pfu / ml. 21.1 Mammalian cells infected with the deletion recombinant adenovirus according to one of claims 1 to 15 or more. 22. The cell according to claim 21, which is preferably a human cell selected from fibroblasts, myoblasts, hepatocytes, endothelial cells, glial cells and epidermal cells. 23. An implant plant comprising the infected cells according to claims 21 to 22 and an extracellular matrix. 24. The implant according to claim 23, wherein the extracellular matrix preferably contains a gelling compound selected from collagen, gelatin, glycosaminoglycans, fibronectin and lectins. 25. The implant according to claim 23 or 24, characterized in that the extracellular matrix also comprises a carrier that enables the fixing of infected cells. 26. 26. Implants according to claim 25, characterized in that the carrier preferably consists of polytetrafluoroethylene fibers.