【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト胃またはヒト
小脳由来の新規なＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、該
蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、該Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質の製造方法、該蛋白質及びＤ
ＮＡの用途に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel G protein-coupled receptor protein derived from human stomach or human cerebellum, DNA containing a DNA encoding the protein, a method for producing the G protein-coupled receptor protein, Protein and D
Regarding the use of NA.
【０００２】[0002]
【従来の技術】多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜
に存在する特異的なレセプター蛋白質を通じて生体の機
能を調節している。これらのレセプター蛋白質の多くは
共役している guanine nucleotide-binding protein
（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）の活性化を通
じて細胞内のシグナル伝達を行ない、また７個の膜貫通
領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇ蛋
白質共役型レセプター蛋白質あるいは７回膜貫通型レセ
プター蛋白質と総称される。Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、
それら生体の細胞や臓器の機能を調節する分子、例えば
ホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的と
して非常に重要な役割を担っている。2. Description of the Related Art Many hormones and neurotransmitters regulate the function of the living body through specific receptor proteins present in the cell membrane. Many of these receptor proteins are guanine nucleotide-binding proteins
(Hereinafter sometimes abbreviated as G protein) to signal intracellularly through activation and to have a common structure having seven transmembrane regions. Collectively referred to as transmembrane receptor proteins. G protein-coupled receptor proteins are present on the surface of various functional cells in living cells and organs,
They play a very important role as targets for molecules that regulate the functions of cells and organs of the living body, such as hormones, neurotransmitters, and physiologically active substances.
【０００３】胃や小腸などの消化器官では、多くのホル
モン・ホルモン様物質・神経伝達物質あるいは生理活性
物質などによる調節のもとで、種々の消化液が分泌さ
れ、食物の消化・吸収が行われている。これらの物質
は、胃や小腸などに存在する、それぞれに対応するレセ
プターによってその分泌が制御されていると考えられて
いる。特に、消化管ホルモンと呼ばれるセクレチン，ガ
ストリン，コレシストキニン，バソアクティブ・インテ
スティナル・ポリペプチド，モチリン，サブスタンス
Ｐ，ソマトスタチン，ニューロテンシンなどは、消化管
内腔からの物理的・化学的刺激あるいは神経性の刺激に
反応して分泌されるが、その真の生理作用は不明な点も
多い。また、モチリンはレセプター蛋白質ｃＤＮＡの構
造に関する知見は、これまでに報告されていない。さら
に、未知のレセプター蛋白質やレセプター蛋白質サブタ
イプが存在するかどうかについても分かっていなかっ
た。In the digestive organs such as the stomach and small intestine, various digestive juices are secreted under the control of many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or physiologically active substances to digest and absorb food. It is being appreciated. It is considered that the secretion of these substances is regulated by the corresponding receptors present in the stomach and small intestine. In particular, secretin called gastrointestinal hormone, gastrin, cholecystokinin, vasoactive intestinal polypeptide, motilin, substance P, somatostatin, neurotensin, etc. are physically or chemically stimulated from the gastrointestinal lumen or nerves. It is secreted in response to sexual stimulation, but its true physiological effect remains unclear. In addition, motilin has not been reported so far regarding the structure of the receptor protein cDNA. Furthermore, it was not known whether an unknown receptor protein or receptor protein subtype exists.
【０００４】胃や小腸の複雑な機能を調節する物質とそ
の特異的レセプターとの関係を明らかにすることは、医
薬品開発に非常に重要な手段である。そして胃や小腸の
機能を調節するためのレセプター蛋白質に対するアゴニ
スト／アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医
薬品を開発するためには、レセプター蛋白質の遺伝子の
機能を解明し、それらを適当な発現系で発現させること
が必要であった。近年、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質がその構造の一部にアミノ酸配列の類似性を示すこと
を利用して、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション
（Polymerase Chain Reaction：以下、ＰＣＲと略称す
る）法によって新規レセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａを探索する方法が行われるようになった。Clarifying the relationship between substances that regulate the complex functions of the stomach and small intestine and their specific receptors is a very important means for drug development. Then, in order to efficiently screen agonists / antagonists against receptor proteins for regulating the functions of the stomach and small intestine, and to develop pharmaceuticals, the functions of the genes for the receptor proteins should be elucidated and expressed in an appropriate expression system. Was necessary. In recent years, by utilizing the fact that G protein-coupled receptor proteins show similarity in amino acid sequence to a part of their structure, a novel receptor protein is obtained by the polymerase chain reaction (PCR) method. DN coding
The method of searching A came to be practiced.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒト胃また
はヒト小脳由来の新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質、該蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、該
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の製造方法、および該
蛋白質ならびにＤＮＡの用途を提供することを目的とす
る。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention provides a novel G protein-coupled receptor protein derived from human stomach or human cerebellum, DNA containing a DNA encoding the protein, a method for producing the G protein-coupled receptor protein, And to provide uses of the protein and DNA.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡをより効率的
に単離するための合成ＤＮＡプライマーを用いてヒト胃
またはヒト小脳由来のｃＤＮＡをＰＣＲ法により増幅す
ることに成功し、その解析を進めた。その結果、本発明
者らは、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
するヒト由来のｃＤＮＡを単離し、その構造を決定する
ことに成功した。そして、このｃＤＮＡは、公知のＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質とＤＮＡおよびアミノ酸配
列の部分的な相同性が認められたことから、ヒトの細胞
で発現機能している新規なＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質をコードしているＤＮＡであることを見いだした。
本発明者らは、これらの知見から、これらのＤＮＡを用
いれば、該レセプター蛋白質を製造することもできるこ
とを見いだした。さらに、本発明者らは、該Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡを適当な手
段で発現させた該レセプター蛋白質を用いれば、レセプ
ター結合実験または細胞内セカンドメッセンジャーの測
定等を指標に、生体内あるいは天然・非天然の化合物か
ら該レセプター蛋白質に対するリガンドをスクリーニン
グすることができ、さらには、リガンドとレセプター蛋
白質との結合を阻害するあるいは促進させる化合物のス
クリーニングを行なうこともできることを見いだした。Means for Solving the Problems The inventors of the present invention have conducted extensive studies in order to solve the above problems, and as a result, have been able to more efficiently isolate a DNA encoding a G protein-coupled receptor protein. We succeeded in amplifying cDNA derived from human stomach or human cerebellum by PCR method using synthetic DNA primers, and proceeded with its analysis. As a result, the present inventors succeeded in isolating a human-derived cDNA encoding a novel G protein-coupled receptor protein and determining its structure. Since this cDNA was partially homologous to a known G protein-coupled receptor protein in the DNA and amino acid sequences, it was confirmed that a novel G protein-coupled receptor protein that functions in human cells can be expressed. It was found to be the coding DNA.
The present inventors have found from these findings that the receptor protein can be produced by using these DNAs. Furthermore, when the present inventors used the receptor protein in which the cDNA encoding the G protein-coupled receptor protein was expressed by an appropriate means, the present inventors used the receptor binding experiment or the measurement of intracellular second messenger as an index. It has been found that a ligand for the receptor protein can be screened from compounds in the body or from natural / non-natural compounds, and further compounds can be screened for inhibiting or promoting the binding between the ligand and the receptor protein.
【０００７】これらの知見を基に、本発明者らはさらに
鋭意研究した結果、本発明を完成した。本発明は、 （１）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一も
しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質もしくはその塩、 （２）上記（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質の部分ペプチドもしくはその塩、 （３）上記（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質または上記（２）項記載の部分ペプチドをコードす
る塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、 （４）配列番号：２で表される塩基配列を有する上記
（３）項記載のＤＮＡ、 （５）上記（３）項記載のＤＮＡを含有する組換えベク
ター、 （６）上記（３）項記載のＤＮＡまたは上記（５）項記
載の組換えベクターを保持する形質転換体、 （７）上記（６）項記載の形質転換体を培養することを
特徴とする上記（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質またはその塩の製造法、 （８）上記（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質もしくはその塩または上記（２）項記載の部分ペプ
チドもしくはその塩と、試験化合物とを接触させること
を特徴とする上記（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質もしくはその塩に対するリガンドの決定方
法、 （９）（ｉ）上記（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質もしくはその塩または上記（２）項記載の部
分ペプチドもしくはその塩、およびリガンドを接触させ
た場合と（ii）上記（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質もしくはその塩または上記（２）項記載の
部分ペプチドもしくはその塩、リガンドおよび試験化合
物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする
リガンドと上記（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質もしくはその塩との結合性を変化させる化合物
もしくはその塩のスクリーニング方法、 （１０）上記（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質もしくはその塩または上記（２）項記載の部分ペ
プチドもしくはその塩を含有してなる、リガンドと上記
（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしく
はその塩との結合性を変化させる化合物もしくはその塩
のスクリーニング用キット、および （１１）上記（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質もしくはその塩または上記（２）項記載の部分ペ
プチドもしくはその塩に対する抗体である。Based on these findings, the inventors of the present invention have conducted further diligent research, and as a result, completed the present invention. The present invention includes (1) a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof which contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (2) the G described in the above item (1) Partial peptide of protein-coupled receptor protein or salt thereof, (3) DNA containing DNA having a nucleotide sequence encoding the G protein-coupled receptor protein described in (1) above or the partial peptide described in (2) above (4) DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, described in (3) above, (5) Recombinant vector containing the DNA described in (3) above, (6) Above (3) (7) A transformant carrying the DNA according to item (5) or the recombinant vector according to item (5) above, (7) The transformant according to item (6) above is cultured. (8) A method for producing the G protein-coupled receptor protein or a salt thereof, (8) the G protein-coupled receptor protein or a salt thereof according to (1) above, or the partial peptide or a salt thereof according to (2) above, and a test A method for determining a ligand for the G protein-coupled receptor protein or salt thereof according to the above item (1), which comprises contacting with a compound; (9) (i) the G protein coupled receptor according to the above item (1) A protein or a salt thereof, a partial peptide or a salt thereof described in (2) above, and a ligand, and (ii) a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof described in (1) above or (2) above And a partial peptide or a salt thereof, a ligand and a test compound are contacted with each other. And a method for screening a compound or a salt thereof that changes the binding property between the G protein-coupled receptor protein or the salt thereof according to the above item (1), (10) The G protein-coupled receptor protein according to the above item (1), or A compound or salt thereof, which comprises a salt thereof or a partial peptide or salt thereof described in (2) above, and which changes the binding property between the ligand and the G protein-coupled receptor protein or salt thereof described in (1) above. And (11) an antibody against the G protein-coupled receptor protein or a salt thereof described in (1) above or the partial peptide or a salt thereof described in (2) above.
【０００８】より具体的には、 （１２）蛋白質が、配列番号：１で表わされるアミノ酸
配列、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１個
または２個以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列に１個または２個
以上のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、また配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列中の１個または２個以
上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列
を含有する蛋白質である第（１）項記載のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質もしくはその塩、 （１３）標識したリガンドを第（１）項記載のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または第（２）
項記載の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合
と、標識したリガンドおよび試験化合物を第（１）項記
載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩ま
たは第（２）項記載の部分ペプチドまたはその塩に接触
させた場合における、標識したリガンドの第（１）項記
載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩ま
たは第（２）項記載の部分ペプチドもしくはその塩に対
する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガン
ドと第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
との結合を阻害する化合物もしくはその塩のスクリーニ
ング方法、 （１４）標識したリガンドを第（１）項記載のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場
合と、標識したリガンドおよび試験化合物を第（１）項
記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞
に接触させた場合における、標識したリガンドの該細胞
に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリ
ガンドと第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質との結合を阻害する化合物もしくはその塩のスクリ
ーニング方法、 （１５）標識したリガンドを第（１）項記載のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質を含有する細胞の膜画分に接触
させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を第
（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有
する細胞の膜画分に接触させた場合における、標識した
リガンドの該細胞の膜画分に対する結合量を測定し、比
較することを特徴とするリガンドと第（１）項記載のＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合を阻害する化合
物もしくはその塩のスクリーニング方法、More specifically, (12) the protein is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are deleted. , An amino acid sequence obtained by adding one or more amino acids to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 with other amino acids. A G protein-coupled receptor protein or a salt thereof according to item (1), which is a protein containing a substituted amino acid sequence, and (13) a labeled ligand as a G protein-coupled receptor protein according to item (1) or a salt thereof. Salt or second (2)
When contacted with the partial peptide or salt thereof according to item 1, the labeled ligand and the test compound are added to the G protein-coupled receptor protein or salt thereof according to item (1), or the partial peptide according to item (2) or its The amount of labeled ligand bound to the G protein-coupled receptor protein or salt thereof according to item (1) or the partial peptide or salt thereof according to item (2) when contacted with salt is measured and compared. A method for screening a compound or a salt thereof which inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein according to item (1), (14) the labeled ligand as the G protein according to item (1) The method of contacting a cell containing a conjugated receptor protein, the labeled ligand and the test compound as described in (1) above. The G protein-coupled type according to item (1), which is characterized in that the amount of labeled ligand bound to the cell is measured and compared when contacted with cells containing the G protein-coupled receptor protein. A method for screening a compound or its salt that inhibits binding to a receptor protein, (15) a case where a labeled ligand is brought into contact with a membrane fraction of a cell containing a G protein-coupled receptor protein according to (1), When the labeled ligand and the test compound are contacted with the membrane fraction of the cell containing the G protein-coupled receptor protein according to (1), the binding amount of the labeled ligand to the membrane fraction of the cell is A ligand characterized by being measured and compared with G described in the item (1).
A method for screening a compound or its salt that inhibits binding to a protein-coupled receptor protein,
【０００９】（１６）第（６）項記載の形質転換体の培
養によって該形質転換体の細胞膜に発現したＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質に標識したリガンドを接触させた
場合と、第（６）項記載の形質転換体の培養によって該
形質転換体の細胞膜に発現したＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質に標識したリガンドおよび試験化合物を接触さ
せた場合における、標識したリガンドの該Ｇ蛋白質共役
型レセプター蛋白質に対する結合量を測定し、比較する
ことを特徴とするリガンドと第（１）項記載のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質との結合を阻害する化合物また
はその塩のスクリーニング方法、 （１７）第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を含有する細胞に第（１）項記載のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質を活性化する化合物を接触させた場合
と、活性化する化合物および試験化合物を第（１）項記
載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に
第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を接
触させた場合における、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴
とするリガンドと第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質との結合を阻害するあるいは促進させる化
合物もしくはその塩のスクリーニング方法、 （１８）第（６）項記載の形質転換体の培養によって該
形質転換体の細胞膜に発現したＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質に第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質を活性化する化合物を接触させた場合と、第
（６）項記載の形質転換体の培養によって該形質転換体
の細胞膜に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に
第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を活
性化する化合物および試験化合物を接触させた場合にお
ける、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介する細胞刺
激活性を測定し、比較することを特徴とするリガンドと
第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との
結合を阻害する化合物もしくはその塩のスクリーニング
方法、(16) A case in which a labeled ligand is brought into contact with a G protein-coupled receptor protein expressed on the cell membrane of the transformant by culturing the transformant according to (6), and (6) Binding of the labeled ligand to the G protein-coupled receptor protein when the labeled protein and the test compound are contacted with the G protein-coupled receptor protein expressed on the cell membrane of the transformant by culturing the transformant described above. A method for screening a compound or a salt thereof which inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein according to item (1), which comprises measuring and comparing the amounts, (17) item (1) A compound which activates the G protein-coupled receptor protein according to (1) is added to cells containing the G protein-coupled receptor protein. When contacted, or when the activating compound and the test compound are contacted with cells containing the G protein-coupled receptor protein according to item (1), the G protein-coupled receptor protein according to item (1) A compound which inhibits or promotes the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein according to (1), which is characterized by measuring and comparing the cell stimulating activity mediated by the G protein-coupled receptor protein. Alternatively, a method for screening a salt thereof, (18) The G protein-coupled receptor protein according to item (1), wherein the G protein-coupled receptor protein is expressed in the cell membrane of the transformant by culturing the transformant according to item (6). When a compound that activates the receptor protein is brought into contact, and when it is expressed in the cell membrane of the transformant by the culture of the transformant described in (6). The cell stimulating activity mediated by the G protein-coupled receptor protein is measured when the compound for activating the G protein-coupled receptor protein according to (1) and a test compound are contacted with the G protein-coupled receptor protein. A screening method for a compound or a salt thereof which inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein according to (1),
【００１０】（１９）第（１）項記載のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質を含有する細胞を含有することを特徴
とする第（１０）項記載のスクリーニング用キット、
（２０）第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を含有する細胞の膜画分を含有することを特徴とす
る第（１０）項記載のスクリーニング用キット、および
（２１）第（１０）項、第（１９）項または第（２０）
項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる化合
物もしくはその塩を提供する。(19) A screening kit according to item (10), which comprises cells containing the G protein-coupled receptor protein according to item (1).
(20) The screening kit according to item (10), which comprises a membrane fraction of cells containing the G protein-coupled receptor protein according to item (1), and (21) item (10). ), (19) or (20)
There is provided a compound or a salt thereof obtained by using the screening kit according to the item.
【００１１】[0011]
【発明の実施の形態】本発明のＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質としては、温血動物（例えば、トリ、モルモッ
ト、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サ
ル、ヒトなど）のあらゆる組織（例えば、胃、下垂体、
膵臓、脳、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨
髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓など）
または細胞などに由来するＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質であって、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するものであれば
何なるものであってもよい。すなわち、本発明のＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質としては、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質などの他に、配
列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約８５〜９９.
９％の相同性、より好ましくは約９０〜９９.９％の相
同性を有するアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質
の活性を有する蛋白質などが挙げられる。実質的に同質
の活性としては、例えばリガンド結合活性、シグナル情
報伝達などが挙げられる。実質的に同質とは、リガンド
結合活性などが性質的に同質であることを示す。したが
って、リガンド結合活性の強さなどの強弱、レセプター
蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The G protein-coupled receptor protein of the present invention includes all tissues of warm-blooded animals (eg, avian, guinea pig, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, human, etc.). For example, stomach, pituitary gland,
(Pancreas, brain, kidney, liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract, blood vessel, heart, etc.)
Alternatively, any G protein-coupled receptor protein derived from cells or the like may be used as long as it contains an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. That is, as the G protein-coupled receptor protein of the present invention, in addition to the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and about 85-99.
A protein containing an amino acid sequence having 9% homology, more preferably about 90-99.9% homology, and having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. And so on. Examples of substantially the same activity include ligand binding activity and signal transduction. "Substantially the same quality" means that the ligand binding activity and the like are qualitatively the same. Therefore, strength and weakness such as strength of ligand binding activity and quantitative factors such as molecular weight of receptor protein may be different.
【００１２】より具体的には、本発明のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質としては、配列番号：１で表わされる
アミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質が挙げられる。また、本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質としては、配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列中の１個または２個以上（好ましくは、２個以上
２０個以下、より好ましくは２個以上１０個以下）のア
ミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１で表わさ
れるアミノ酸配列に１個または２個以上（好ましくは、
２個以上２０個以下、より好ましくは２個以上１０個以
下）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列中の１個または２個以上（好
ましくは、２個以上２０個以下、より好ましくは２個以
上１０個以下）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された
アミノ酸配列を含有する蛋白質なども挙げられる。さら
に、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質には、Ｎ
末端のMetが保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基
などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、Ｇ
ｌｕのＮ端側が生体内で切断され、該Ｇｌｕがピログル
タミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖が適当な保
護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6ア
シル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結
合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれ
る。本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の塩とし
ては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし
い。この様な塩としては、例えば無機酸（例えば、塩
酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機
酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マ
レイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸）との塩などが用いられる。More specifically, examples of the G protein-coupled receptor protein of the present invention include a G protein-coupled receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Further, the G protein-coupled receptor protein of the present invention includes one or two or more (preferably 2 or more and 20 or less, more preferably 2 or more and 10) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. 1 or 2 or more (preferably, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) in which the amino acid of
2 or more and 20 or less, more preferably 2 or more and 10 or less) amino acid sequence, SEQ ID NO: 1
A protein containing an amino acid sequence in which 1 or 2 or more (preferably 2 or more and 20 or less, more preferably 2 or more and 10 or less) amino acids in the amino acid sequence represented by are substituted with other amino acids. And so on. Furthermore, the G protein-coupled receptor protein of the present invention comprises N
The terminal Met is protected with a protecting group (for example, a C1-6 acyl group such as a formyl group and an acetyl group), G
N-terminal side of lu is cleaved in vivo and the Glu is pyroglutaminated, and the side chain of amino acid in the molecule is a suitable protecting group (for example, C1-6 acyl group such as formyl group and acetyl group) Those which are protected by, or complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound. The salt of the G protein-coupled receptor protein of the present invention is preferably a physiologically acceptable acid addition salt. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) And tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid and benzenesulfonic acid).
【００１３】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
またはその塩は、温血動物の組織または細胞から自体公
知の蛋白質の精製方法によって製造することもできる
し、後述するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
するＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっ
ても製造することができる。また、後述のペプチド合成
法に準じて製造することもできる。本発明のＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質の部分ペプチドとしては、例え
ば、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質分子のう
ち、細胞膜の外に露出している部位などが挙げられる。
具体的には、例えば第一膜貫通領域よりＮ末端側の部分
や、第七膜貫通領域よりＣ末端側の部分あるいはこれら
を除く第一から第七膜貫通領域までの部分などが用いら
れる。また、細胞膜の外に露出している部位などが用い
られる。さらに具体的には、Ｎ末端から１個〜４個のア
ミノ酸、Ｃ末端から１個〜３３個のアミノ酸や、疎水性
プロット解析において細胞外領域（親水性（Hydrophili
c）部位）であると分析された部分を含むペプチドであ
る。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含むペ
プチドも同様に用いることができる。個々のドメインを
個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同
時に含む部分のペプチドでも良い。The G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof can be produced from a tissue or cell of a warm-blooded animal by a method known per se for protein purification. It can also be produced by culturing a transformant containing the DNA. Further, it can also be produced according to the peptide synthesis method described later. The partial peptide of the G protein-coupled receptor protein of the present invention includes, for example, a portion of the G protein-coupled receptor protein molecule of the present invention that is exposed outside the cell membrane.
Specifically, for example, a portion on the N-terminal side of the first transmembrane region, a portion on the C-terminal side of the seventh transmembrane region, or a portion excluding these portions from the first to seventh transmembrane region is used. Further, a site exposed outside the cell membrane is used. More specifically, 1 to 4 amino acids from the N terminus, 1 to 33 amino acids from the C terminus, and the extracellular region (hydrophilic (Hydrophili
c) A peptide containing the part analyzed to be). Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
【００１４】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
の部分ペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容
される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例え
ば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）
との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピ
オン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、ク
エン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン
酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。The salt of the partial peptide of the G protein-coupled receptor protein of the present invention is preferably a physiologically acceptable acid addition salt. Examples of such salts include inorganic acids (for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid).
Or a salt with an organic acid (for example, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) Are used.
【００１５】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの
合成法に従って、あるいは本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによ
って製造することができる。ペプチドの合成法として
は、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても
良い。すなわち、本発明の蛋白質を構成し得る部分ペプ
チドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物
が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目
的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法
や保護基の脱離としてはたとえば、以下の〜に記載
された方法が挙げられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明のタンパク質を精
製単離することができる。上記方法で得られる蛋白質が
遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変
換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知
の方法によって遊離体に変換することができる。The partial peptide of the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof is produced by a peptide synthesis method known per se or by cleaving the G protein-coupled receptor protein of the present invention with an appropriate peptidase. be able to. The peptide synthesis method may be either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the protein of the present invention with the remaining portion and, when the product has a protecting group, removing the protecting group. Examples of known condensation methods and elimination of protective groups include the methods described in the following (1) to (3). M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publisher
s, New York (1966) Schroeder and Luebke, The Peptide,
Academic Press, New York (1965) Nobuo Izumiya et al., Fundamentals and experiments of peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd.
(1975) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory for Biochemistry 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977) Supervised by Haruaki Yajima, Development of Pharmaceuticals Volume 14 Peptide Synthesis Hirokawa Shoten The protein of the present invention can be purified and isolated by a combination of purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like. When the protein obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method, and conversely, when it is obtained with a salt, it can be converted into a free form by a known method. it can.
【００１６】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
をコードするＤＮＡとしては、本発明の配列番号：１の
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする塩基配列
を含有するものであればいかなるものであってもよい。
また、ヒトゲノムＤＮＡ、ヒトゲノムＤＮＡライブラリ
ー、ヒト組織・細胞由来のｃＤＮＡ、ヒト組織・細胞由
来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよ
い。ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファ
ージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれ
であってもよい。また、組織・細胞よりｍＲＮＡ画分を
調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Poly
merase Chain Reaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称す
る。）によって増幅することもできる。より具体的に
は、配列番号：１のアミノ酸配列を含有するＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配
列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが
用いられる。The DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention is a base encoding a G protein-coupled receptor protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention. It may be any as long as it contains the sequence.
Further, it may be any of human genomic DNA, human genomic DNA library, human tissue / cell-derived cDNA, human tissue / cell-derived cDNA library, and synthetic DNA. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. In addition, using the mRNA fraction prepared from tissues / cells, the reverse transcriptase poly
It can also be amplified by a merase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method). More specifically, as the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the like is used.
【００１７】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段として
は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分塩基配列を
有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって
増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡ
をヒトＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の一部あるいは
全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて
標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別
する。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば Molec
ular Cloning ２nd（ed.；J. Sambrook et al., Cold S
pring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに
従って行われる。また、市販のライブラリーを使用する
場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行う。ク
ローン化されたＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により
制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用
することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開
始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻
訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有
していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コ
ドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加する
こともできる。As a means for cloning the DNA which completely encodes the G protein-coupled receptor protein of the present invention, it is amplified by PCR using a synthetic DNA primer having a partial base sequence of the G protein-coupled receptor protein, or Alternatively, the DNA incorporated into an appropriate vector
Are selected by hybridization with a DNA fragment having a part or whole region of human G protein-coupled receptor protein or labeled with a synthetic DNA. Hybridization methods are described, for example, in Molec
ular Cloning 2nd (ed .; J. Sambrook et al., Cold S
pring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, the procedure is performed according to the method described in the attached instruction manual. The cloned DNA encoding the G protein-coupled receptor protein can be used as it is, or if desired after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker, depending on the purpose. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using a suitable synthetic DNA adapter.
【００１８】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現ベ
クターは、例えば、（イ）本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ
断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベク
ター中のプロモーターの下流に連結することにより製造
することができる。ベクターとしては、大腸菌由来のプ
ラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１
１８，ｐＵＣ１１９）、枯草菌由来のプラスミド（例、
ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラ
スミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージな
どのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニア
ウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが
用いられる。本発明で用いられるプロモーターとして
は、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモ
ーターであればいかなるものでもよい。The G protein-coupled receptor protein expression vector may be, for example, (a) a DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention to a target DNA.
It can be produced by cutting out the fragment and (ii) ligating the DNA fragment downstream of the promoter in an appropriate expression vector. As the vector, a plasmid derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC1
18, pUC119), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg,
pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmid (eg, pSH19, pSH15), bacteriophage such as λ phage, animal virus such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus and the like are used. The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
【００１９】形質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌
である場合は、trp プロモーター、lac プロモーター、
recＡプロモーター、λＰＬプロモーター、lpp プロモ
ーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰ
Ｏ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、penＰプロ
モーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロ
モーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、
ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が動物細胞で
ある場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウ
イルスのプロモーター、メタロチオネインプロモータ
ー、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイル
スプロモーター、ＳＲαプロモーターなどがそれぞれ利
用できる。なお、発現にエンハンサーの利用も効果的で
ある。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列
を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のＮ端末側に付加
する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、アルカリ
フォスファターゼ・シグナル配列、ＯmpＡ・シグナル配
列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミ
ラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列な
どが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクタ
ーα・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列な
ど、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリ
ン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配
列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用でき
る。このようにして構築されたＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用い
て、形質転換体を製造する。When the host to be transformed is Escherichia, trp promoter, lac promoter,
recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, etc., when the host is Bacillus, SP
When the host is yeast such as O1 promoter, SPO2 promoter and penP promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter,
The ADH promoter and the like are preferable. When the host is an animal cell, an SV40-derived promoter, a retrovirus promoter, a metallothionein promoter, a heat shock promoter, a cytomegalovirus promoter, an SRα promoter, and the like can be used. The use of enhancers for expression is also effective. In addition, if necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the G protein-coupled receptor protein. When the host is a bacterium of the genus Escherichia, alkaline phosphatase signal sequence, OmpA signal sequence, etc., when the host is a bacterium of the genus Bacillus, α-amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc., the host is yeast When the host is an animal cell, for example, an insulin signal sequence, an α-interferon signal sequence, an antibody molecule / signal sequence, etc., respectively. Available. A transformant is produced using the vector containing the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein thus constructed.
【００２０】宿主としては、たとえばエシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫、動物細胞などが用いら
れる。エシェリヒア属菌、バチルス属菌の具体例として
は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・
ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエス
エー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１
６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッ
ズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３
０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー（Journal ofMolecular Biol
ogy）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４
１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティック
ス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用
いられる。バチルス属菌としては、たとえばバチルス・
サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，
２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemis
try），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。As the host, for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insects, animal cells and the like are used. Specific examples of the genus Escherichia and the genus Bacillus include Escherichia coli K12.
DH1 [Processings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 1
60 (1968)], JM103 [Nukuilec Acids Research, (Nucleic Acids Research), 9, 3
09 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biol.
ogy)], 120, 517 (1978)], HB101
[Journal of Molecular Biology, 4
1, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] and the like. Bacillus spp.
Bacillus subtilis MI114 [Gene,
24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemis
try), 95, 87 (1984)].
【００２１】酵母としては、たとえばサッカロマイセス
セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae)ＡＨ２２，Ａ
Ｈ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ
−１２などが用いられる。昆虫としては、例えばカイコ
の幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Natur
e），３１５巻，５９２(１９８５)〕。動物細胞として
は、たとえばサル細胞ＣＯＳ−７，Ｖero，チャイニー
ズハムスター細胞ＣＨＯ，ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-ＣＨＯ細胞），
マウスＬ細胞，マウスミエローマ細胞，ヒトＦＬ細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換するに
は、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユー
エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９
巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１
０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なわれる。
バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecula
r ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７
９)などに記載の方法に従って行われる。酵母を形質転
換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・
ザ・ユーエスエー（Proc. Natl.Acad. Sci. ＵＳＡ），
７５巻，１９２９(１９７８)に記載の方法に従って行な
われる。昆虫細胞を形質転換するには、たとえばバイオ
／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）
などに記載の方法に従って行なわれる。動物細胞を形質
転換するには、たとえばヴィロロジー（Virology），５
２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なわれ
る。このようにして、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質
をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換
された形質転換体が得られる。As the yeast, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, A
H22R -, NA87-11A, DKD-5D , 20B
-12 or the like is used. As insects, for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature (Natur
e), 315, 592 (1985)]. Examples of animal cells include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO, DHFR gene-deficient Chinese hamster cells CHO (dhfr- CHO cells),
Mouse L cells, mouse myeloma cells, human FL cells and the like are used. To transform Escherichia, for example, Procagings of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69
Volume, 2110 (1972) and Gene, Volume 17, 1
07 (1982).
For transformation of Bacillus sp., For example, Molecular and General Genetics (Molecula
r & General Genetics), 168, 111 (197)
It is performed according to the method described in 9) or the like. To transform yeast, for example, the Procesings of the National Academy of Sciences of Science
The USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA),
75, 1929 (1978). In order to transform insect cells, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988))
And the like. To transform animal cells, for example, Virology, 5
2, 456 (1973). Thus, a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein is obtained.
【００２２】宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナト
リウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵
母、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。
培地のｐＨは約５〜８が望ましい。When culturing a transformant whose host is a bacterium of the genus Escherichia or a bacterium of the genus Bacillus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culture, and among them, a liquid medium is necessary, which is necessary for the growth of the transformant. A carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, etc. are contained. Examples of carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose. Examples of nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract, and the like. Alternatively, examples of the organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
The pH of the medium is preferably about 5-8.
【００２３】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリル
アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主が
エシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で
約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加える
こともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常
約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通
気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質
転換体を培養する際、培地としては、たとえばバークホ
ールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L.
ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５
０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ
培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・
オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. Ｕ
ＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられ
る。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培
養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必
要に応じて通気や撹拌を加える。As a medium for culturing the genus Escherichia, for example, M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics (Journa)
l of Experiments in Molecular Genetics), 431-
433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1
972] is preferred. If necessary, in order to make the promoter work efficiently, for example, 3β-indolyl is used.
An agent such as acrylic acid can be added. When the host is a bacterium of the genus Escherichia, the culture is usually performed at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added. When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added. When culturing a transformant in which the host is yeast, the medium may be, for example, a Burkholder minimum medium [Bostian, KL
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 45, Proc. Of the National Academy of Sciences of the USA.
05 (1980)] or SD containing 0.5% casamino acid.
Medium [Bitter, GA, et al., "The Prossings of
The National Academy of Sciences
Of the USA (Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA), 81, 5330 (1984)]. Preferably, the pH of the medium is adjusted to about 5-8. The cultivation is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
【００２４】宿主が昆虫である形質転換体を培養する
際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.
C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化
した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが
用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整する
のが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行
い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞
である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえ
ば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエ
ンス（Seience），１２２巻，５０１(１９５２)〕，Ｄ
ＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６
(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・
オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション
（The Jounal of the American Medical Association）
１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシー
ジング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオ
ロジカル・メディスン（Proceeding of the Society fo
r the Biological Medicine），７３巻，１(１９５
０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好
ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時
間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。When culturing a transformant whose host is an insect, Grace's Insect Medium (Grace, T .;
CC, Nature, 195, 788 (1962)) to which an additive such as immobilized 10% bovine serum is appropriately added is used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The cultivation is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and if necessary, aeration and / or agitation are added. When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Seience, Vol. 122, 501 (1952)], D
MEM medium [Virology, 8, 396
(1959)], RPMI 1640 medium [Journal
The Jounal of the American Medical Association
199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the biological medicine (Proceeding of the Society for the biological medicine)]
r the Biological Medicine), 73, 1 (195
0)] is used. Preferably, the pH is between about 6-8. The cultivation is usually carried out at about 30 ° C. to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration or stirring is added.
【００２５】より具体的には、後述の実施例６で得られ
る本発明のヒト型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコ
ードするＤＮＡを含有するプラスミドｈＢＬ５を、Ｅ．
ｃｏｌｉＪＭ１０９に導入して形質転換体Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐｈＢＬ５を得
る。得られたE. coli ＪＭ１０９／ｐｈＢＬ５をＬＢ培
地（トリプトン １％，イーストエキストラクト ０.５
％，ＮａＣl ０.５％）にアンピシリン ５０μg/mlを添
加した培地に懸濁し、３７℃で１０〜２０時間培養する
ことにより、ヒト型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
産生させる。More specifically, the plasmid hBL5 containing the DNA encoding the human G protein-coupled receptor protein of the present invention obtained in Example 6 described below was transformed with E.
Escherichia coli transformed with Escherichia coli
Richia coli JM109 / phBL5 is obtained. The obtained E. coli JM109 / phBL5 was mixed with LB medium (tryptone 1%, yeast extract 0.5).
%, NaCl 0.5%) and ampicillin 50 μg / ml are suspended in the medium, and cultured at 37 ° C. for 10 to 20 hours to produce human G protein-coupled receptor protein.
【００２６】上記培養物からＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質を分離精製するには、例えば下記の方法により行
なうことができる。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養
後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当
な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または
凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したの
ち、遠心分離やろ過によりＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液
の中に尿素や塩酸グアニジンなどのたんぱく変性剤や、
トリトンＸ−１００（登録商標。以下、ＴＭと省略する
ことがある。）などの界面活性剤が含まれていてもよ
い。培養液中にＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質が分泌
される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌
体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。この
ようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含ま
れるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の精製は、自体公
知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことがで
きる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶
媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ
過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方
法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利
用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの
特異的新和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気
泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられ
る。The G protein-coupled receptor protein can be separated and purified from the culture described above, for example, by the following method. When the G protein-coupled receptor protein is extracted from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, and the cells or cells are suspended in an appropriate buffer solution and subjected to ultrasonic wave, lysozyme and / or freezing. A method of obtaining a crude extract of G protein-coupled receptor protein by disrupting cells or cells by thawing and then centrifuging or filtering can be appropriately used. In the buffer solution, protein denaturants such as urea and guanidine hydrochloride,
A surfactant such as Triton X-100 (registered trademark; hereinafter, sometimes abbreviated as TM) may be included. When the G protein-coupled receptor protein is secreted into the culture medium, after completion of the culture, the cells or cells are separated from the supernatant by a method known per se, and the supernatant is collected. Purification of the G protein-coupled receptor protein contained in the thus obtained culture supernatant or the extract can be carried out by appropriately combining separation / purification methods known per se. These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and the like. Method using difference in charge, method using charge difference such as ion exchange chromatography, method using specific novelty such as affinity chromatography, use of difference in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography And a method utilizing the difference in isoelectric points such as isoelectric focusing.
【００２７】かくして得られるＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法
あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することが
でき、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるい
はそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換
することができる。なお、組換え体が産生するＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質を、精製前または精製後に適当
な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を
加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもでき
る。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモ
トリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテイ
ンキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かくし
て生成するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の活性は標
識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエ
ンザイムイムノアッセイなどにより測定することができ
る。When the G protein-coupled receptor protein thus obtained is obtained as a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained as a salt. The free form or other salt can be converted by a method known per se or a method analogous thereto. The G protein-coupled receptor protein produced by the recombinant can be optionally modified or partially removed by reacting it with an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification. . Examples of the protein-modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like. The activity of the G protein-coupled receptor protein thus produced can be measured by a binding experiment with a labeled ligand, an enzyme immunoassay using a specific antibody, or the like.
【００２８】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
をコードするＤＮＡおよびＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質は、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に
対するリガンドの決定方法、抗体および抗血清の入
手、組換え型レセプター蛋白質の発現系の構築、同
発現系を用いたレセプター結合アッセイ系の開発と医薬
品候補化合物のスクリーニング、構造的に類似したリ
ガンド・レセプターとの比較にもとづいたドラッグデザ
インの実施、遺伝子診断におけるプローブ、ＰＣＲプ
ライマーの作成等における試薬として用いることがで
き、また、遺伝子治療等の薬物として用いることがで
きる。特に、本発明の組換替え型Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質の発現系を用いたレセプター結合アッセイ系
によって、ヒトなどの温血動物に特異的なＧ蛋白質共役
型レセプターアゴニストまたはアンタゴニストをスクリ
ーニングすることができ、該アゴニストまたはアンタゴ
ニストを各種疾病の予防・治療剤などとして使用するこ
とができる。本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質、部分ペプチド、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
コードするＤＮＡおよび抗体の用途について、以下によ
り具体的に説明する。The DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention and the G protein-coupled receptor protein are the method for determining a ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention, the acquisition of antibodies and antisera, and the recombinant type. Construction of receptor protein expression system, development of receptor binding assay system using the expression system, screening of drug candidate compounds, drug design based on comparison with structurally similar ligand / receptor, probe in gene diagnosis , Can be used as a reagent in the preparation of PCR primers, etc., and can be used as a drug for gene therapy and the like. In particular, it is possible to screen for G protein-coupled receptor agonists or antagonists specific to warm-blooded animals such as humans by a receptor binding assay system using the expression system of the recombinant G protein-coupled receptor protein of the present invention. In addition, the agonist or antagonist can be used as a prophylactic / therapeutic agent for various diseases. The use of the G protein-coupled receptor protein, partial peptide, DNA encoding the G protein-coupled receptor protein and antibody of the present invention will be described more specifically below.
【００２９】（１）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質に対するリガンドの決定方法 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその
塩または本発明の部分ペプチドもしくはその塩は、本発
明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンド
を探索しまたは決定するための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、本発明のＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質もしくはその塩または本発明の部分ペプチドも
しくはその塩と、試験化合物とを接触させることを特徴
とする本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対す
るリガンドの決定方法を提供する。試験化合物として
は、公知のリガンド（例えば、アンギオテンシン、ボン
ベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミ
ン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オ
ピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、Ｖ
ＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アンド リ
レイテッド ペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミ
ン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カ
ルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、アドレノ
メジュリン、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プ
ロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アド
レナリン、αおよびβ−chemokine（ＩＬ−８、ＧＲＯ
α、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、
ＰＦ４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１
４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ−１
β、ＲＡＮＴＥＳなど）、エンドセリン、エンテロガス
トリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パン
クレアティックポリペプタイド、ガラニンなど）の他
に、例えば温血動物（例えば、トリ、マウス、ラット、
ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物、
細胞培養上清などが用いられる。例えば、該組織抽出
物、細胞培養上清などを本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質に添加し、細胞刺激活性などを測定しながら
分画し、最終的に単一のリガンドを得ることができる。(1) Method for determining ligand for G protein-coupled receptor protein of the present invention The G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof or the partial peptide of the present invention or a salt thereof is a G protein-coupled type of the present invention. It is useful as a reagent for searching or determining a ligand for a receptor protein.
That is, the present invention relates to the G protein-coupled receptor protein of the present invention, which comprises contacting a test compound with the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof or the partial peptide of the present invention or a salt thereof. A method for determining a ligand is provided. As the test compound, known ligands (eg, angiotensin, bombesin, cannabinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, V
IP (vasoactive intestinal and related peptide), somatostatin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene relayed peptide), adrenomedullin, leukotriene, pancreatatin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, Adrenaline, α and β-chemokine (IL-8, GRO
α, GROβ, GROγ, NAP-2, ENA-78,
PF4, IP10, GCP-2, MCP-1, HC1
4, MCP-3, I-309, MIP1α, MIP-1
β, RANTES, etc.), endothelin, enterogastrin, histamine, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptide, galanin, etc.) and, for example, warm-blooded animals (eg, birds, mice, rats,
Tissue extracts of pigs, cows, sheep, monkeys, humans, etc.,
Cell culture supernatant or the like is used. For example, the tissue extract, cell culture supernatant, etc. may be added to the G protein-coupled receptor protein of the present invention and fractionated while measuring the cell stimulating activity and the like to finally obtain a single ligand. .
【００３０】具体的には、本発明のリガンド決定方法
は、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは
その塩、または本発明の部分ペプチドもしくはその塩を
用いるか、または組換え型レセプター蛋白質の発現系を
構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を
用いることによって、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質
に結合して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、
アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭ
Ｐ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産
生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆ
ｏｓ活性化、ｐＨの低下、Ｇ蛋白質の活性化、細胞増殖
などを促進する活性または抑制する活性）を有する化合
物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、
合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を決定する
方法である。本発明のリガンド決定方法においては、本
発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質または本発明の
部分ペプチドと試験化合物とを接触させた場合の、例え
ば該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質または該部分ペプ
チドに対する試験化合物の結合量、細胞刺激活性などを
測定することを特徴とする。Specifically, the ligand determination method of the present invention uses the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof, or the partial peptide of the present invention or a salt thereof, or expresses a recombinant receptor protein. By constructing a system and using a receptor binding assay system using the expression system, a cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release, binding to a G protein-coupled receptor protein,
Acetylcholine release, intracellular Ca2+ release, intracellular cAM
P production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, cf
os activation, pH decrease, G protein activation, activity to promote or suppress cell proliferation, etc. (eg, peptide, protein, non-peptide compound,
Synthetic compounds, fermentation products, etc.) or salts thereof. In the method for determining a ligand of the present invention, when the test compound is contacted with the G protein-coupled receptor protein of the present invention or the partial peptide of the present invention, for example, a test compound for the G protein-coupled receptor protein or the partial peptide It is characterized by measuring the amount of binding of the, the cell stimulating activity and the like.
【００３１】より具体的には、本発明は、 標識した試験化合物を、本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質もしくはその塩または本発明の部分ペプチ
ドもしくはその塩に接触させた場合における、標識した
試験化合物の該蛋白質もしくはその塩、または該部分ペ
プチドもしくはその塩に対する結合量を測定することを
特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリ
ガンドの決定方法、 標識した試験化合物を、本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接
触させた場合における、標識した試験化合物の該細胞ま
たは該膜画分に対する結合量を測定することを特徴とす
るＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの
決定方法、 標識した試験化合物を、本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体
を培養することによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質に接触させた場合における、標識
した試験化合物の該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に
対する結合量を測定しすることを特徴とするＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方法、More specifically, the present invention provides a labeled test in which a labeled test compound is contacted with the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof or a partial peptide of the present invention or a salt thereof. A method for determining a ligand for a G protein-coupled receptor protein, which comprises measuring a binding amount of a compound to the protein or a salt thereof, or the partial peptide or a salt thereof. G protein-coupled receptor protein characterized by measuring the amount of labeled test compound bound to the cell or the membrane fraction when contacted with the cell containing the receptor protein or the membrane fraction of the cell The method for determining a ligand for the G protein-coupled receptor of the present invention is the labeled test compound. The amount of binding of the labeled test compound to the G protein-coupled receptor protein in the case of contacting the G protein-coupled receptor protein expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the protein A method for determining a ligand for a G protein-coupled receptor protein, which comprises measuring
【００３２】試験化合物を、本発明のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合にお
ける、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介した細胞刺
激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃ
ＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐ
Ｈの低下、Ｇ蛋白質の活性化、細胞増殖などを促進する
活性または抑制する活性など）を測定することを特徴と
するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンド
の決定方法、および試験化合物を、本発明のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する
形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合にお
ける、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介する細胞刺
激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃ
ＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐ
Ｈの低下、Ｇ蛋白質の活性化などを促進する活性または
抑制する活性など）を測定することを特徴とするＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方法
を提供する。When the test compound is brought into contact with cells containing the G protein-coupled receptor protein of the present invention, cell-stimulating activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, cells) mediated by the G protein-coupled receptor protein. Intracellular Ca2+ release, intracellular cAMP production, intracellular c
GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, p
A method for determining a ligand for a G protein-coupled receptor protein, and a test compound according to the present invention, characterized by measuring H reduction, G protein activation, activity promoting or suppressing cell proliferation, etc.). Stimulation of cells mediated by the G protein-coupled receptor protein in the case of contacting the G protein-coupled receptor protein expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of Activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2+ release, intracellular cAMP production, intracellular c
GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, p
The method for determining a ligand for a G protein-coupled receptor protein is provided by measuring H activity reduction activity, G protein activation promotion activity, or G protein activation activity or the like).
【００３３】本発明のリガンド決定方法の具体的な説明
を以下にする。まず、リガンド決定方法に用いるＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質としては、本発明のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質または本発明のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質の部分ペプチドを含有するものであれ
ば何れのものであってもよいが、動物細胞を用いて大量
発現させたＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質が適してい
る。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を製造するには、
前述の方法が用いられるが、該蛋白質をコードするＤＮ
Ａを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することにより行う
ことができる。目的部分をコードするＤＮＡ断片には相
補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるも
のではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いて
もよい。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする
ＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく
発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とする
バキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclea
r polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモ
ーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルス
のプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒト
ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプ
ロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込む
のが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査はそ
れ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献
〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜19
559頁,1992年〕に記載の方法に従って行うことができ
る。A specific description of the ligand determination method of the present invention will be given below. First, any G protein-coupled receptor protein used in the method for determining a ligand may be used as long as it contains the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein of the present invention. However, a G protein-coupled receptor protein expressed in large quantities using animal cells is suitable. To produce a G protein-coupled receptor protein,
The above-mentioned method can be used, but DN encoding the protein is used.
It can be carried out by expressing A in mammalian cells or insect cells. Although complementary DNA is used as the DNA fragment encoding the target portion, it is not necessarily limited thereto. For example, a gene fragment or a synthetic DNA may be used. To introduce DNA fragments encoding G protein-coupled receptor proteins into host animal cells and to express them efficiently, in order to efficiently express them, a nuclear polyhedrosis virus (nuclea) belonging to a baculovirus using insects as a host (nuclea
r polyhedrosis virus (NPV) polyhedrin promoter, SV40-derived promoter, retrovirus promoter, metallothionein promoter, human heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, SRα promoter and the like are preferably incorporated downstream. The amount and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, the literature [Nambi, P .; Et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), Vol. 267, 19555-19.
559, 1992].
【００３４】したがって、本発明のリガンド決定方法に
おいて、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドを含有するも
のとしては、それ自体公知の方法に従って精製したＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質または該Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質の部分ペプチドであってもよいし、該蛋
白質を含有する細胞を用いてもよく、また該蛋白質を含
有する細胞の膜画分を用いてもよい。本発明のリガンド
決定方法において、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒ
ド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は
それ自体公知の方法に従って行うことができる。Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞としては、Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現した宿主細胞をい
うが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆
虫細胞、動物細胞などが挙げられる。Therefore, in the method for determining a ligand of the present invention, the G protein-coupled receptor protein or the partial peptide of the G protein-coupled receptor protein is a G protein-coupled receptor protein purified by a method known per se. Alternatively, it may be a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein, cells containing the protein may be used, or a membrane fraction of cells containing the protein may be used. When a cell containing a G protein-coupled receptor protein is used in the ligand determination method of the present invention, the cell may be immobilized with glutaraldehyde, formalin or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se. The cells containing the G protein-coupled receptor protein include G
The host cell expressing the protein-coupled receptor protein includes Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells and the like.
【００３５】細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、
それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画
分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−El
vehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリ
ングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による
破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧し
ながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕
などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法
や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主と
して用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒ
ｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０
分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３
００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られ
る沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜
蛋白質などの膜成分が多く含まれる。該Ｇ蛋白質共役型
レセプター蛋白質を含有する細胞や膜画分中のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質の量は、１細胞当たり１０3〜
１０8分子であるのが好ましく、１０5〜１０7分子であ
るのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当た
りのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度な
スクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同
一ロットで大量の試料を測定できるようになる。As the cell membrane fraction, after crushing the cells,
It refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a method known per se. As a cell disruption method, Potter-El
Examples of the method include crushing cells with a vehjem homogenizer, crushing with a Waring blender or Polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, and crushing by ejecting cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force, such as fractionation centrifugation and density gradient centrifugation, is mainly used. For example, the cell lysate should be slow (500r
pm to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes)
Centrifuge, and the supernatant is spun at a higher speed (15000 rpm to 3
It is usually centrifuged at 0000 rpm) for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as a membrane fraction. The membrane fraction is rich in expressed G protein-coupled receptor protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins. The amount of the G protein-coupled receptor protein in the cell or the membrane fraction containing the G protein-coupled receptor protein is 103 to 1 cell per cell.
It is preferably 108 molecules, and more preferably 105 to 107 molecules. The higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, which makes it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large number of samples in the same lot. .
【００３６】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合す
るリガンドを決定する前記の〜の方法を実施するた
めには、適当なＧ蛋白質共役型レセプター画分と、標識
した試験化合物が必要である。Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー画分としては、天然型のＧ蛋白質共役型レセプター画
分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型Ｇ蛋白
質共役型レセプター画分などが望ましい。ここで、同等
の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識
した試験化合物としては、〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、
〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識したアンギオテンシン、
ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタ
ミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、
オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、
ＶＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アンド
リレイテッド ペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミ
ン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カ
ルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、アドレノ
メジュリン、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プ
ロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アド
レナリン、αおよびβ−chemokine（ＩＬ−８、ＧＲＯ
α、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、
ＰＦ４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１
４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ−１
β、ＲＡＮＴＥＳなど）、エンドセリン、エンテロガス
トリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パン
クレアティックポリペプタイド、ガラニンなどが好適で
ある。In order to carry out the above-mentioned methods (1) to (3) for determining a ligand that binds to a G protein-coupled receptor protein, an appropriate G protein-coupled receptor fraction and a labeled test compound are required. As the G protein-coupled receptor fraction, a natural G protein-coupled receptor fraction or a recombinant G protein-coupled receptor fraction having an activity equivalent to that is desirable. Here, the equivalent activity refers to equivalent ligand binding activity and the like. The labeled test compounds include [3 H], [125 I],
Angiotensin labeled with [14 C], [35 S], etc.,
Bombesin, cannabinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y,
Opioid, purine, vasopressin, oxytocin,
VIP (Vasoactive Intestinal and
(Related peptide), somatostatin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene relayed peptide), adrenomedullin, leukotriene, pancreatatin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, adrenaline, α and β-chemokine ( IL-8, GRO
α, GROβ, GROγ, NAP-2, ENA-78,
PF4, IP10, GCP-2, MCP-1, HC1
4, MCP-3, I-309, MIP1α, MIP-1
β, RANTES, etc.), endothelin, enterogastrin, histamine, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptide, galanin and the like are preferable.
【００３７】具体的には、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質に結合するリガンドの決定方法を行うには、まずＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞または細
胞の膜画分を、決定方法に適したバッファーに懸濁する
ことによりレセプター標品を調製する。バッファーに
は、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バ
ッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレ
セプターとの結合を阻害しないバッファーであればいず
れでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、
ＣＨＡＰＳ（３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチル
アンモニオ〕−１−プロパンスルホン酸）、Ｔｗｅｅｎ
−８０TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシ
コレートなどの界面活性剤やウシ血清アルブミンやゼラ
チンなどの各種蛋白質をバッファーに加えることもでき
る。さらに、プロテアーゼによるリセプターやリガンド
の分解を抑える目的でＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホ
ニルフルオリド）、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド
研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を
添加することもできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍlの該レセ
プター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００
ｃｐｍ）の〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕な
どで標識した試験化合物を共存させる。非特異的結合量
（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の試験化合物を
加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０
℃、望ましくは４℃から３７℃で２０分から２４時間、
望ましくは３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維
濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガ
ラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーショ
ンカウンターあるいはγ−カウンターで計測する。全結
合量（Ｂ）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウ
ント（Ｂ−ＮＳＢ）が０ｃｐｍを越える試験化合物を本
発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガン
ドとして選択することができる。Specifically, in order to carry out a method for determining a ligand that binds to a G protein-coupled receptor protein, first, G
A receptor preparation is prepared by suspending cells or a membrane fraction of cells containing a protein-coupled receptor protein in a buffer suitable for the determination method. Any buffer may be used as long as it does not inhibit the binding between the ligand and the receptor, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably a pH of 6 to 8) and a Tris-hydrochloric acid buffer. In addition, for the purpose of reducing non-specific binding,
CHAPS (3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonic acid), Tween
Surfactants such as −80™ (Kao-Atlas), digitonin and deoxycholate, and various proteins such as bovine serum albumin and gelatin can be added to the buffer. Further, a protease inhibitor such as PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride), leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Laboratories), pepstatin or the like can be added for the purpose of suppressing the decomposition of the receptor and the ligand by the protease. A fixed amount (5000 cpm-500000) was added to 0.01 ml-10 ml of the receptor solution.
cpm) coexist with a test compound labeled with [3 H], [125 I], [14 C], [35 S] or the like. A reaction tube containing a large excess of unlabeled test compound is also prepared in order to know the amount of nonspecific binding (NSB). The reaction is performed at 0 ° C to 50
C., preferably 4 to 37.degree. C. for 20 minutes to 24 hours,
Desirably, it is carried out for 30 minutes to 3 hours. After the reaction, the mixture is filtered through a glass fiber filter paper or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter paper is measured with a liquid scintillation counter or a γ-counter. A test compound having a count (B-NSB) obtained by subtracting the nonspecific binding amount (NSB) from the total binding amount (B) exceeding 0 cpm can be selected as a ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention.
【００３８】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合す
るリガンドを決定する前記の〜の方法を実施するた
めには、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介する細胞
刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内
ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐ
Ｈの低下などを促進する活性または抑制する活性など）
を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定す
ることができる。具体的には、まず、Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質を含有する細胞をマルチウェルプレート
等に培養する。リガンド決定を行なうにあたっては前も
って新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバ
ッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間
インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回
収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量す
る。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキド
ン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって
検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加し
てアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制
などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基
礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作
用として検出することができる。In order to carry out the above-mentioned methods (1) to (3) for determining a ligand that binds to a G protein-coupled receptor protein, a cell stimulating activity mediated by the G protein-coupled receptor protein (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, cell Intracellular Ca2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, p
Activity that promotes or suppresses reduction of H, etc.)
Can be measured using a known method or a commercially available measurement kit. Specifically, first, cells containing the G protein-coupled receptor protein are cultured in a multiwell plate or the like. Prior to ligand determination, replace the medium with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and then extract cells or collect supernatant to generate The quantified product is quantified according to each method. When the production of a substance that serves as an index of cell stimulating activity (for example, arachidonic acid) is difficult to assay with a degrading enzyme contained in cells, an inhibitor for the degrading enzyme may be added to the assay. Further, the activity of suppressing cAMP production and the like can be detected as a production suppressing action on cells in which the basic production amount of cells has been increased by forskolin or the like.
【００３９】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
に結合するリガンド決定用キットは、本発明のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質またはその塩、本発明のＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその
塩、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有す
る細胞、あるいは本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を含有する細胞の膜画分を含有するものである。本
発明のリガンド決定用キットの例としては、次のものが
挙げられる。 １．リガンド決定用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質標品 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細
胞を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３
７℃、５％ＣＯ2９５％ａｉｒで２日間培養したもの。The kit for determining a ligand that binds to the G protein-coupled receptor protein of the present invention comprises a G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof, a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof, It contains a membrane fraction of cells containing the G protein-coupled receptor protein of the present invention or cells containing the G protein-coupled receptor protein of the present invention. Examples of the ligand determination kit of the present invention include the following. 1. Ligand determination reagent Measurement buffer and washing buffer Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by Gibco) was added with 0.
One containing 05% bovine serum albumin (manufactured by Sigma). Sterilized by filtration through a 0.45 μm filter, 4 ° C
Or may be prepared at the time of use. G protein-coupled receptor protein preparation CHO cells expressing the G protein-coupled receptor protein were subcultured on a 12-well plate at 5 × 105 cells / well and 3
One cultured for 2 days at 7 ° C. and 5% CO2 95% air.
【００４０】標識試験化合物 市販の〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで
標識した化合物、または適当な方法で標識化したもの水
溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、
用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。水に難溶性
を示す試験化合物については、ジメチルホルムアミド、
ＤＭＳＯ、メタノール等に溶解する。 非標識試験化合物 標識化合物を同じものを１００〜１０００倍濃い濃度に
調製する。 ２．測定法 １２穴組織培養用プレートにて培養したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を、測定用
緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩
衝液を各穴に加える。 標識試験化合物を５μｌ加え、室温にて１時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには非標識試験化合物
を５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識試験化合物を０.２Ｎ ＮａＯ
Ｈ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーター
Ａ（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定する。Labeled Test Compound Commercially available compound labeled with [3 H], [125 I], [14 C], [35 S] or the like, or labeled with an appropriate method in an aqueous solution at 4 ° C. Alternatively, store at -20 ° C,
When used, dilute to 1 μM with the measurement buffer. For test compounds that are poorly soluble in water, dimethylformamide,
Dissolve in DMSO, methanol, etc. Unlabeled test compound The same labeled compound is prepared at a concentration of 100 to 1000 times higher. 2. Assay method G-protein coupled receptor protein-expressing CHO cells cultured in a 12-well tissue culture plate are washed twice with 1 ml of assay buffer, and then 490 μl of assay buffer is added to each well. 5 μl of the labeled test compound is added, and the mixture is reacted at room temperature for 1 hour. To know the amount of non-specific binding, 5 μl of unlabeled test compound is added. Remove the reaction solution and wash 3 times with 1 ml of washing buffer. The labeled test compound bound to the cells was treated with 0.2 N NaO.
It is dissolved in H-1% SDS and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries). Liquid scintillation counter (Beckman)
Is used to measure the radioactivity.
【００４１】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
に結合することができるリガンドとしては、例えば脳、
下垂体、膵臓などに特異的に存在する物質などが挙げら
れ、具体的にはアンギオテンシン、ボンベシン、カナビ
ノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、
メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリ
ン、バソプレッシン、オキシトシン、ＶＩＰ（バソアク
ティブ インテスティナル アンド リレイテッド ペ
プチド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、ア
ミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーン
リレーティッドペプチド）、アドレノメジュリン、ロイ
コトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジ
ン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、αお
よびβ−chemokine（ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、
ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１
０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、
Ｉ−３０９、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ
など）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミ
ン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポ
リペプタイド、ガラニンなどが挙げられる。As the ligand capable of binding to the G protein-coupled receptor protein of the present invention, for example, brain,
Examples include substances specifically present in the pituitary gland, the pancreas, and the like. Specifically, angiotensin, bombesin, cannabinoids, cholecystokinin, glutamine, serotonin,
Melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, VIP (vasoactive intestinal and related peptide), somatostatin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene relayed peptide), adrenomedullin, leukotriene. , Pancreatatin, prostaglandins, thromboxane, adenosine, adrenaline, α and β-chemokine (IL-8, GROα, GROβ,
GROγ, NAP-2, ENA-78, PF4, IP1
0, GCP-2, MCP-1, HC14, MCP-3,
I-309, MIP1α, MIP-1β, RANTES
Etc.), endothelin, enterogastrin, histamine, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptide, galanin and the like.
【００４２】（２）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質欠乏症の予防・治療剤 上記（１）の方法において、本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質に体するリガンドが明らかになれば、該
リガンドが有する作用に応じて、本発明のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡをＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質欠乏症の予防・治療剤として使用す
ることができる。例えば、生体内において本発明のＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質が減少しているためにリガ
ンドの生理作用が期待できない患者がいる場合に、
（イ）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによっ
て、あるいは（ロ）脳細胞などに本発明のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを挿入し発現さ
せた後に、該脳細胞を該患者に移植することなどによっ
て、該患者の脳細胞におけるＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質の量を増加させ、リガンドの作用を充分に発揮さ
せることができる。したがって、本発明のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡは、安全で低毒
性な本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質欠乏症の
予防・治療剤などとして用いることができる。(2) Preventive / Therapeutic Agent for G Protein-Coupled Receptor Protein Deficiency of the Present Invention In the method of (1) above, if the ligand that is associated with the G protein-coupled receptor protein of the present invention is clarified The DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention can be used as a prophylactic / therapeutic agent for G protein-coupled receptor protein deficiency depending on the action of the protein. For example, when there is a patient in whom the physiological action of the ligand cannot be expected because the G protein-coupled receptor protein of the present invention is reduced in vivo,
(A) The DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention is administered to the patient for expression, or (b) the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention is inserted into a brain cell or the like. Then, by transplanting the brain cells into the patient, the amount of G protein-coupled receptor protein in the brain cells of the patient can be increased and the action of the ligand can be sufficiently exerted. Therefore, the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention can be used as a safe and low toxic preventive / therapeutic agent for the G protein-coupled receptor protein deficiency of the present invention.
【００４３】本発明のＤＮＡを上記治療剤として使用す
る場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベク
ター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシ
エーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿
入した後、常套手段に従って実施することができる。例
えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エ
リキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、
あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液と
の無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経
口的に使用できる。例えば、本発明のＤＮＡを生理学的
に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐
剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤
実施に要求される単位用量形態で混和することによって
製造することができる。これら製剤における有効成分量
は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするも
のである。錠剤、カプセル剤などに混和することができ
る添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、
トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セル
ロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、ア
ルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウ
ムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのよ
うな甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリー
のような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプ
セルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂の
ような液状担体を含有することができる。注射のための
無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、
胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解
または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処
方することができる。When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic agent, the DNA is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector or an adenovirus associated virus vector, and then the procedure is carried out by a conventional method. can do. For example, orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules and the like, which are optionally sugar-coated,
Alternatively, it can be used parenterally in the form of an injectable solution such as a sterile solution or suspension with water or other pharmaceutically acceptable liquid. For example, the DNA of the present invention is admixed with physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders and the like in a unit dose form generally required for the implementation of the formulation. Can be manufactured by. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained. Examples of additives that can be mixed with tablets, capsules, etc. include gelatin, corn starch,
Binders such as tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, swelling agents such as corn starch, gelatin, alginic acid, lubricants such as magnesium stearate, such as sucrose, lactose or saccharin Sweetening agents, peppermint, red oil or flavoring agents such as cherry are used. When the preparation unit form is a capsule, a liquid carrier such as oil and fat can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection consist of the active substance in a vehicle such as water for injection,
It can be formulated according to usual pharmaceutical practice such as dissolving or suspending naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
【００４４】注射用の水性液としては、例えば、生理食
塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例え
ば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリ
ウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえ
ばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール
（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコ
ール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベー
ト８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよ
い。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶
解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。 また、緩衝剤（例えば、リン
酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例え
ば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安
定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリ
コールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、
フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
調整された注射液は通常、適当なアンプルに充填され
る。このようにして得られる製剤は安全で低毒性である
ので、例えば温血哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、
ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなど）に
対して投与することができる。該ＤＮＡの投与量は、症
状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に
成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.
１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１.０〜５０ｍｇ、
より好ましくは約１.０〜２０ｍｇである。非経口的に
投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓
器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば
注射剤の形では通常成人（６０ｋｇとして）において
は、一日につき約０.０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは
約０.１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０.１〜１０
ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。
他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与
することができる。Examples of the aqueous solution for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride etc.) and the like. You may use together with a solubilizing agent, for example, alcohol (for example, ethanol), polyalcohol (for example, propylene glycol, polyethylene glycol), a nonionic surfactant (for example, Polysorbate 80 (TM), HCO-50) and the like. Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol. In addition, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservation Agents (eg, benzyl alcohol,
Phenol, etc.), antioxidants and the like.
The prepared injection is usually filled in a suitable ampoule. Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, warm-blooded mammals (for example, rat, rabbit,
Sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, humans, etc.). Although the dose of the DNA varies depending on the symptoms and the like, in the case of oral administration, it is generally about 0.
1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg,
More preferably, it is about 1.0-20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc., but in the case of an injection, for example, in an adult (60 kg), the daily dose is about 1 day. About 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg
It is convenient to administer about mg by intravenous injection.
In the case of other animals, the dose converted per 60 kg can be administered.
【００４５】（３）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質に対するリガンドの定量法 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその
塩、または本発明の部分ペプチドまたはその塩は、リガ
ンドに対して結合性を有しているので、生体内における
リガンド濃度を感度良く定量することができる。本発明
の定量法は、例えば競合法と組み合わせることによって
用いることができる。すなわち、被検体を本発明のＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩、またはＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドもしくは
その塩と接触させることによって被検体中のリガンド濃
度を測定することができる。具体的には、例えば、以下
のまたはなどに記載の方法あるいはそれに準じる方
法に従って用いることができる。 入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４
９年発行） 入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和
５４年発行）(3) Method for Quantifying Ligand for G Protein-Coupled Receptor Protein of the Present Invention The G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof, or the partial peptide of the present invention or a salt thereof is capable of binding to a ligand. Since it has, the ligand concentration in the living body can be quantified with high sensitivity. The quantification method of the present invention can be used, for example, by combining it with a competition method. That is, the subject is a G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof, or G
The ligand concentration in the test sample can be measured by bringing it into contact with a partial peptide of the protein-coupled receptor protein or a salt thereof. Specifically, for example, it can be used according to the method described below or the like or a method analogous thereto. Edited by Hiro Irie "Radio Immunoassay" (Kodansha, Showa 4)
(Published in 1997) edited by Hiroshi Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1979)
【００４６】（４）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質とリガンドの結合を阻害する化合物のスクリーニ
ング方法 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその
塩、または本発明の部分ペプチドもしくはその塩を用い
るか、または組換え型レセプター蛋白質の発現系を構築
し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用い
ることによって、リガンドとＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質との結合を変化させる（例、阻害する、促進させ
る）化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性
化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を
スクリーニングすることができる。このような化合物に
は、Ｇ蛋白質共役型レセプターを介して細胞刺激活性
（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細
胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ
生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞
内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低
下、Ｇ蛋白質の活性化、細胞増殖などを促進する活性ま
たは抑制する活性など）を有する化合物（いわゆる、本
発明のＧ蛋白質共役型レセプターアゴニスト）と該細胞
刺激活性を有しない化合物（いわゆる、本発明のＧ蛋白
質共役型レセプターアンタゴニスト）などが含まれる。(4) Method for screening compound for inhibiting binding between ligand of G protein-coupled receptor protein of the present invention and G protein-coupled receptor protein of the present invention or salt thereof, or partial peptide of the present invention or salt thereof Or by constructing an expression system for a recombinant receptor protein and using a receptor binding assay system using the expression system to change the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein (eg, inhibit, Compounds (for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.) or salts thereof can be screened. Such compounds include cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP) via G protein-coupled receptors.
Production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH decrease, G protein activation, activity to promote or suppress cell proliferation, etc.) The compound (so-called G protein-coupled receptor agonist of the present invention) and the compound having no cell stimulating activity (so-called G protein-coupled receptor antagonist of the present invention) are included.
【００４７】すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または本発
明の部分ペプチドもしくはその塩に、該Ｇ蛋白質共役型
レセプター蛋白質に対するリガンドを接触させた場合と
（ii）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしく
はその塩または本発明の部分ペプチドもしくはその塩
に、該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガン
ドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なう
ことを特徴とするリガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩
のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニ
ング方法においては、（ｉ）本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質または本発明の部分ペプチドに、リガン
ドを接触させた場合と（ii）本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質または本発明の部分ペプチドに、リガン
ドおよび試験化合物を接触させた場合における、例えば
該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質または該部分ペプチ
ドに対するリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定
して、比較することを特徴とする。That is, the present invention relates to (i) the case where a ligand for the G protein-coupled receptor protein is brought into contact with the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof or the partial peptide of the present invention or a salt thereof. (Ii) The G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof or the partial peptide of the present invention or a salt thereof is contacted with a ligand for the G protein-coupled receptor protein and a test compound. Provided is a screening method for a compound or a salt thereof which inhibits the binding between the characteristic ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention. In the screening method of the present invention, (i) a case where a ligand is contacted with the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a partial peptide of the present invention, and (ii) a G protein-coupled receptor protein of the present invention or the present invention When the ligand and the test compound are contacted with the partial peptide of, the binding amount of the ligand to the G protein-coupled receptor protein or the partial peptide, the cell stimulating activity, etc. are measured and compared. .
【００４８】より具体的には、本発明は、 標識したリガンドを、本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質もしくはその塩または本発明のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩に接触
させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本
発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩
または本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分
ペプチドもしくはその塩に接触させた場合における、標
識したリガンドの該蛋白質もしくはその塩、または該部
分ペプチドもしくはその塩に対する結合量を測定し、比
較することを特徴とするリガンドと本発明のＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質との結合を阻害する化合物または
その塩のスクリーニング方法 、標識したリガンドを、本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接
触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を
本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細
胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標
識したリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量
を測定し、比較することを特徴とするリガンドと本発明
のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合を阻害する
化合物またはその塩のスクリーニング方法、More specifically, in the present invention, the labeled ligand is brought into contact with the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof or a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof. And a labeled ligand and a test compound are contacted with the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof or a partial peptide of the G protein coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof, A method for screening a compound or a salt thereof which inhibits the binding between a ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention, which comprises measuring and comparing the amount of binding to a protein or a salt thereof, or the partial peptide or a salt thereof. The labeled ligand is used as the G protein-coupled receptor of the present invention. When the cells containing the protein or the membrane fraction of the cells were contacted, and the labeled ligand and the test compound were contacted with the cells containing the G protein-coupled receptor protein of the present invention or the membrane fraction of the cells. In this case, the binding amount of the labeled ligand to the cell or the membrane fraction is measured and compared, and a compound or a salt thereof which inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention Screening method,
【００４９】標識したリガンドを、本発明のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する
形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合と、
標識したリガンドおよび試験化合物を本発明のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する
形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合にお
ける、標識したリガンドの該Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質に対する結合量を測定し、比較することを特徴と
するリガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質との結合を阻害する化合物またはその塩のスクリーニ
ング方法、 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を活性化す
る化合物（例えば、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質に対するリガンドなど）を本発明のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合
と、本発明のＧ蛋白質共役型レセプターを活性化する化
合物および試験化合物を本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、
Ｇ蛋白質共役型レセプターを介した細胞刺激活性（例え
ば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃ
ａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、
イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白
質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、Ｇ蛋
白質の活性化、細胞増殖などを促進する活性または抑制
する活性など）を測定し、比較することを特徴とするリ
ガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との
結合を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方
法、およびWhen the labeled ligand is brought into contact with the G protein-coupled receptor protein expressed on the cell membrane by culturing the transformant containing the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention,
Labeling when a labeled ligand and a test compound are contacted with a G protein-coupled receptor protein expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing a DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention And a method for screening a compound or a salt thereof, which inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention, which comprises measuring and comparing the amount of binding of the ligand to the G protein-coupled receptor protein. When a compound that activates the G protein-coupled receptor protein of the invention (for example, a ligand for the G protein-coupled receptor protein of the invention) is contacted with a cell containing the G protein-coupled receptor protein of the invention, A compound that activates the G protein-coupled receptor of the present invention, and When the test compound is brought into contact with cells containing the G protein-coupled receptor protein of the present invention,
Cell stimulating activity via G protein-coupled receptors (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular C
a2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production,
Inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, pH decrease, G protein activation, activity promoting or suppressing cell proliferation, etc.), A method for screening a compound or a salt thereof which inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention, which is characterized by comparison, and
【００５０】本発明のＧ蛋白質共役型レセプターを活
性化する化合物（例えば、本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質に対するリガンドなど）を本発明のＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有す
る形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現し
たＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合
と、本発明のＧ蛋白質共役型レセプターを活性化する化
合物および試験化合物を本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を
培養することによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質に接触させた場合における、Ｇ蛋白
質共役型レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、ア
ラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、Ｇ蛋白質の
活性化、細胞増殖などを促進する活性または抑制する活
性など）を測定し、比較することを特徴とするリガンド
と本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合を
阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提
供する。A compound containing a DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention is a compound which activates the G protein-coupled receptor protein of the present invention (for example, a ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention). When the transformant is brought into contact with the G protein-coupled receptor protein expressed on the cell membrane by culturing, the compound that activates the G protein-coupled receptor of the present invention and the test compound are the G protein-coupled receptor of the present invention. Cell-stimulating activity mediated by G protein-coupled receptors (eg, arachidonic acid release) when contacted with G protein-coupled receptor proteins expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding a protein , acetylcholine release, intracellular Ca2+ release, intracellular cAMP production , Intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH decrease, G protein activation, activity promoting or suppressing cell growth, etc. Etc.), and a method for screening a compound or a salt thereof that inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention.
【００５１】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
が得られる以前は、Ｇ蛋白質共役型レセプターアゴニス
トまたはアンタゴニストをスクリーニングする場合、ま
ずラットなどのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含む
細胞、組織またはその細胞膜画分を用いて候補化合物を
得て（一次スクリーニング）、その後に該候補化合物が
実際にヒトのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質とリガン
ドとの結合を阻害するか否かを確認する試験（二次スク
リーニング）が必要であった。細胞、組織または細胞膜
画分をそのまま用いれば他のレセプター蛋白質も混在す
るために、目的とするレセプター蛋白質に対するアゴニ
ストまたはアンタゴニストを実際にスクリーニングする
ことは困難であった。しかしながら、本発明のヒト由来
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を用いることによっ
て、一次スクリーニングの必要がなくなり、リガンドと
Ｇ蛋白質共役型レセプターとの結合を阻害する化合物を
効率良くスクリーニングすることができる。さらに、ス
クリーニングされた化合物がＧ蛋白質共役型レセプター
アゴニストかＧ蛋白質共役型レセプターアンタゴニスト
かを評価することができる。本発明のスクリーニング方
法の具体的な説明を以下にする。まず、本発明のスクリ
ーニング方法に用いるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
としては、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ま
たはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドを
含有するものであれば何れのものであってもよいが、温
血動物の臓器の膜画分が好適である。しかし、特にヒト
由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニ
ングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量
発現させたＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質が適してい
る。Before the G protein-coupled receptor protein of the present invention was obtained, when a G protein-coupled receptor agonist or antagonist was screened, cells, tissues, or cell membranes thereof containing the G protein-coupled receptor protein, such as rat, were first prepared. To obtain a candidate compound (primary screening), and then confirm whether or not the candidate compound actually inhibits the binding of the human G protein-coupled receptor protein to the ligand (secondary screening) Was needed. If the cell, tissue or cell membrane fraction is used as it is, other receptor proteins will be mixed, and it has been difficult to actually screen for an agonist or antagonist for the target receptor protein. However, by using the human-derived G protein-coupled receptor protein of the present invention, the need for primary screening is eliminated, and a compound that inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor can be efficiently screened. Furthermore, it is possible to evaluate whether the screened compound is a G protein coupled receptor agonist or a G protein coupled receptor antagonist. The specific description of the screening method of the present invention is as follows. First, any G protein-coupled receptor protein used in the screening method of the present invention may be used as long as it contains the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein. However, a membrane fraction of an organ of a warm-blooded animal is preferable. However, since human-derived organs are extremely difficult to obtain, a G protein-coupled receptor protein expressed in large amounts using a recombinant is suitable for use in screening.
【００５２】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を製造す
るには、前述の方法が用いられるが、該蛋白質をコード
するＤＮＡを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することに
より行うことができる。目的部分をコードするＤＮＡ断
片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約
されるものではない。例えば遺伝子断片や合成ＤＮＡを
用いてもよい。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効
率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主
とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス
（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリ
ンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロ
ウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモータ
ー、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウ
イルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に
組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の
検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例え
ば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,1
9555〜19559頁,1992年〕に記載の方法に従って行うこと
ができる。したがって、本発明のスクリーニング方法に
おいて、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドを含有するも
のとしては、それ自体公知の方法に従って精製したＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質または該Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質の部分ペプチドであってもよいし、該蛋
白質を含有する細胞を用いてもよく、また該蛋白質を含
有する細胞の膜画分を用いてもよい。The above-mentioned method is used for producing the G protein-coupled receptor protein, which can be carried out by expressing the DNA encoding the protein in mammalian cells or insect cells. Although complementary DNA is used as the DNA fragment encoding the target portion, it is not necessarily limited thereto. For example, a gene fragment or synthetic DNA may be used. To introduce a DNA fragment encoding a G protein-coupled receptor protein into a host animal cell and express them efficiently, in order to efficiently express them, a nuclear polyhedrosis virus (nuclear polyhedrosis virus) belonging to a baculovirus in which an insect is used as a host is used. virus; NPV) polyhedrin promoter, SV40-derived promoter, retrovirus promoter, metallothionein promoter, human heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, SRα promoter and the like are preferably incorporated downstream. The amount and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, the literature [Nambi, P .; Et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, 1
9555-19559, 1992]. Therefore, in the screening method of the present invention, a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide of a G protein-coupled receptor protein is a G protein-coupled receptor protein purified by a method known per se or the G protein. It may be a partial peptide of the coupled receptor protein, a cell containing the protein may be used, or a membrane fraction of cells containing the protein may be used.
【００５３】本発明のスクリーニング方法において、Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞を用いる
場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで
固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に
従って行うことができる。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を含有する細胞としては、Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞とし
ては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞など
が挙げられる。膜画分としては、細胞を破砕した後、そ
れ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分
のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elve
hjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリン
グブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破
砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しな
がら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕な
どが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や
密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主とし
て用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐ
ｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０
分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３
００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られ
る沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜
蛋白質などの膜成分が多く含まれる。該Ｇ蛋白質共役型
レセプター蛋白質を含有する細胞や膜画分中のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質の量は、１細胞当たり１０3〜
１０8分子であるのが好ましく、１０5〜１０7分子であ
るのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当た
りのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度な
スクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同
一ロットで大量の試料を測定できるようになる。In the screening method of the present invention, G
When a cell containing a protein-coupled receptor protein is used, the cell may be immobilized with glutaraldehyde, formalin or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se. The cell containing the G protein-coupled receptor protein refers to a host cell expressing the G protein-coupled receptor protein, and examples of the host cell include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells and the like. . The membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a method known per se after crushing cells. As a cell disruption method, Potter-Elve
The method includes crushing cells with an hjem homogenizer, crushing with a Waring blender or Polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, crushing by ejecting cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press, etc. For fractionation of cell membranes, fractionation by centrifugal force, such as fractionation centrifugation and density gradient centrifugation, is mainly used. For example, the cell lysate should be slow (500 rp).
m to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes)
Centrifuge, and the supernatant is spun at a higher speed (15000 rpm to 3
It is usually centrifuged at 0000 rpm) for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as a membrane fraction. The membrane fraction is rich in expressed G protein-coupled receptor protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins. The amount of the G protein-coupled receptor protein in the cell or the membrane fraction containing the G protein-coupled receptor protein is 103 to 1 cell per cell.
It is preferably 108 molecules, and more preferably 105 to 107 molecules. The higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, which makes it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large number of samples in the same lot. .
【００５４】リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ターとの結合を阻害する化合物をスクリーニングする前
記の〜を実施するためには、適当なＧ蛋白質共役型
レセプター画分と、標識したリガンドが必要である。Ｇ
蛋白質共役型レセプター画分としては、天然型のＧ蛋白
質共役型レセプター画分か、またはそれと同等の活性を
有する組換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター画分などが望
ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合
活性などを示す。標識したリガンドとしては、標識した
リガンド、標識したリガンドアナログ化合物などが用い
られる。例えば〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、
〔35Ｓ〕などで標識されたリガンドなどを利用すること
ができる。具体的には、リガンドとＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質との結合を阻害する化合物のスクリーニン
グを行うには、まずＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに
適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品
を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましく
はｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッ
ファーなどのリガンドＸとレセプターとの結合を阻害し
ないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異
的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−
８０TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコ
レートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもで
きる。In order to carry out (1) to (3) above for screening a compound that inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor of the present invention, an appropriate G protein-coupled receptor fraction and a labeled ligand are required. is there. G
As the protein-coupled receptor fraction, a natural G protein-coupled receptor fraction or a recombinant G protein-coupled receptor fraction having an activity equivalent to that is desirable. Here, the equivalent activity refers to equivalent ligand binding activity and the like. As the labeled ligand, a labeled ligand, a labeled ligand analog compound, or the like is used. For example, [3 H], [125 I], [14 C],
A ligand labeled with [35 S] or the like can be used. Specifically, to screen a compound that inhibits the binding between a ligand and a G protein-coupled receptor protein, first, a cell containing the G protein-coupled receptor protein or a membrane fraction of the cell is suitable for screening. Prepare the receptor preparation by suspending it in a buffer. Any buffer may be used as long as it does not inhibit the binding between the ligand X and the receptor, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably a pH of 6 to 8) and a Tris-hydrochloric acid buffer. Moreover, in order to reduce non-specific binding, CHAPS, Tween-
Surfactants such as 80™ (Kao-Atlas), digitonin and deoxycholate may be added to the buffer.
【００５５】さらに、プロテアーゼによるレセプターや
リガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチ
ン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなど
のプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０
１ml〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５００
０ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識したリガンドを
添加し、同時に１０-4Ｍ〜１０-10 Ｍの試験化合物を共
存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過
剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意す
る。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃
で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時間行
う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッ
ファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活
性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウン
ターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント
(Ｂ0）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント
（Ｂ0−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量
（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を
拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができ
る。Further, a protease inhibitor such as PMSF, leupeptin, E-64 (manufactured by Peptide Laboratories), pepstatin or the like can be added for the purpose of suppressing the decomposition of the receptor or ligand by the protease. 0.0
To 1 to 10 ml of the receptor solution, add a certain amount (500
(0 cpm to 500,000 cpm) of the labeled ligand is added, and at the same time, 10−4 M to10 −10 M test compound is allowed to coexist. A reaction tube containing a large excess of unlabeled ligand is also prepared in order to know the amount of non-specific binding (NSB). The reaction is 0 ° C to 50 ° C, preferably 4 ° C to 37 ° C
For 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours. After the reaction, the mixture is filtered through a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or a γ-counter. Count when there is no antagonist
(B0) when the amount of non-specific binding count obtained by subtracting the (NSB) (B0 -NSB) was 100%, antagonize specific binding (B-NSB) of, for example, the test compound giving 50% or less It can be selected as a candidate substance having inhibitory ability.
【００５６】リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質との結合を阻害する化合物スクリーニングす
る前記の〜の方法を実施するためには、Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、
アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、Ｇ蛋白質の
活性化、細胞増殖などを促進する活性または抑制する活
性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用い
て測定することができる。具体的には、まず、Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質を含有する細胞をマルチウェル
プレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあた
っては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さな
い適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加し
て一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは
上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従
って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例え
ば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解
酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻
害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡ
ＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンな
どで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対す
る産生抑制作用として検出することができる。細胞刺激
活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現した細胞が必要で
ある。本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現
した細胞としては、天然型の本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質を有する細胞株（例えば、マウス膵臓β
細胞株ＭＩＮ６など）、前述の組換え型Ｇ蛋白質共役型
レセプター蛋白質発現細胞株などが望ましい。試験化合
物としては、例えばペプチド、タンパク、非ペプチド性
化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽
出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は
新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であって
もよい。In order to carry out the above-described methods (1) to (3) for screening a compound that inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention, the cell stimulating activity mediated by the G protein-coupled receptor protein (eg,
Arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH decrease, G (Activation of protein, activity of promoting or suppressing cell proliferation, etc.) can be measured using a known method or a commercially available measurement kit. Specifically, first, cells containing the G protein-coupled receptor protein are cultured in a multiwell plate or the like. For screening, the medium was exchanged with a fresh medium or an appropriate buffer that did not show toxicity to cells in advance, and after adding a test compound or the like and incubating for a certain period of time, cells were extracted or supernatant was collected to generate The product is quantified according to the respective method. When the production of a substance that serves as an index of cell stimulating activity (for example, arachidonic acid) is difficult to assay with a degrading enzyme contained in cells, an inhibitor for the degrading enzyme may be added to the assay. Also, cA
The activity such as MP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production amount has been increased by forskolin or the like. To measure cell-stimulating activity and perform screening, use an appropriate G
A cell that expresses a protein-coupled receptor protein is required. Cells expressing the G protein-coupled receptor protein of the present invention include cell lines having a natural G protein-coupled receptor protein of the present invention (for example, mouse pancreas β
Cell lines such as MIN6) and the above-mentioned recombinant G protein-coupled receptor protein-expressing cell lines are preferable. Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like, and these compounds may be novel compounds. Alternatively, a known compound may be used.
【００５７】リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩のス
クリーニング用キットは、本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質またはその塩、本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、本発明の
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞、ある
いは本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有す
る細胞の膜画分を含有するものである。本発明のスクリ
ーニング用キットの例としては、次のものが挙げられ
る。 １．スクリーニング用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。The screening kit for a compound or a salt thereof that inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention is a G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof, and a G protein-coupled type of the present invention. It comprises a partial peptide of a receptor protein or a salt thereof, a cell containing the G protein-coupled receptor protein of the present invention, or a membrane fraction of a cell containing the G protein-coupled receptor protein of the present invention. Examples of the screening kit of the present invention include the following. 1. Screening reagent Measurement buffer and washing buffer Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by Gibco)
One containing 05% bovine serum albumin (manufactured by Sigma). Sterilized by filtration through a 0.45 μm filter, 4 ° C
Or may be prepared at the time of use.
【００５８】Ｇ蛋白質共役型レセプター標品 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細
胞を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３
７℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したも
の。 標識リガンド 市販の〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで
標識したリガンド水溶液の状態のものを４℃あるいは−
２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希
釈する。 リガンド標準液 リガンドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）
を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で
保存する。G protein-coupled receptor preparation CHO cells expressing the G protein-coupled receptor protein were subcultured on a 12-well plate at 5 × 105 cells / well and 3
One cultured at 7 ° C., 5% CO2 , 95% air for 2 days. Labeled ligand A commercially available ligand labeled with [3 H], [125 I], [14 C], [35 S] or the like in an aqueous solution is used at 4 ° C or-
Store at 20 ° C. and dilute to 1 μM with measurement buffer before use. Ligand standard solution 0.1% bovine serum albumin (Sigma)
And dissolved at 1 mM in PBS, and stored at -20 ° C.
【００５９】２．測定法 １２穴組織培養用プレートにて培養したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を、測定用
緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩
衝液を各穴に加える。 １０-3〜１０-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた
後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには試験化合物のかわ
りに１０-3Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識リガンドを０.２Ｎ ＮａＯＨ
−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ
（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定し、Percent of Maximum Bindi
ng（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。2. Assay method G-protein coupled receptor protein-expressing CHO cells cultured in a 12-well tissue culture plate are washed twice with 1 ml of assay buffer, and then 490 μl of assay buffer is added to each well. After adding 5 μl of a test compound solution of 10−3 to 10−10 M, 5 μl of a labeled ligand is added, and the mixture is reacted at room temperature for 1 hour. In order to know the amount of non-specific binding, 5 μl of 10−3 M ligand was added in place of the test compound. Remove the reaction solution and wash 3 times with 1 ml of washing buffer. Labeled ligand bound to cells is 0.2N NaOH
1% SDS, 4 ml of liquid scintillator A
(Made by Wako Pure Chemical Industries). Liquid scintillation counter (Beckman)
Measure the radioactivity using the
ng (PMB) is obtained by the following equation (Equation 1).
【００６０】[0060]
【数１】ＰＭＢ：Percent of Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ0 ：最大結合量[Equation 1] PMB: Percent of Maximum Binding B: Value when a sample is added NSB: Non-specific Binding B0 : Maximum binding amount
【００６１】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レセプターとの
結合を阻害する化合物であり、具体的にはＧ蛋白質共役
型レセプターを介して細胞刺激活性を有する化合物また
はその塩（いわゆるＧ蛋白質共役型レセプターアゴニス
ト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物（いわゆる
Ｇ蛋白質共役型レセプターアンタゴニスト）である。該
化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化
合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら
化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物
であってもよい。該Ｇ蛋白質共役型レセプターアゴニス
トは、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対す
るリガンドが有する生理活性と同様の作用を有している
ので、該リガンド活性に応じて安全で低毒性な医薬組成
物として有用である。逆に、Ｇ蛋白質共役型レセプター
アンタゴニストは、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質に対するリガンドが有する生理活性を抑制するこ
とができるので、該リガンド活性を抑制する安全で低毒
性な医薬組成物として有用である。本発明のスクリーニ
ング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ
る化合物またはその塩は、例えば、アルツハイマー病、
痴呆症、一般不安障害、不眠症、重症鬱病、軽症鬱病、
気分変調証、脅迫神経症、骨関節炎、骨粗鬆症、易恐怖
性障害、消化性潰瘍、リウマチ関節炎、精神分裂症、社
会恐怖症、潰瘍性大腸炎、不安定狭心症、急性膵炎、狭
心症、喘息、動脈硬化症、慢性膵炎、糖尿病性腎症、嘔
吐、胃炎、インシュリン依存性糖尿病、アレルギー性鼻
炎、腎炎、痛み、精神分裂症などの症状の治療・予防薬
として、医薬組成物に成型し用いることができる。The compound or its salt obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound that inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor of the present invention, and specifically, it is G protein-coupled. A compound or a salt thereof having a cell stimulating activity via a receptor (so-called G protein-coupled receptor agonist), or a compound having no such stimulating activity (a so-called G protein-coupled receptor antagonist). Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc. These compounds may be novel compounds or known compounds. The G protein-coupled receptor agonist has the same physiological activity as that of the ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention, and therefore, as a safe and low-toxic pharmaceutical composition depending on the ligand activity. It is useful. On the contrary, since the G protein-coupled receptor antagonist can suppress the physiological activity of the ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic pharmaceutical composition for suppressing the ligand activity. Is. Compounds or salts thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention, for example, Alzheimer's disease,
Dementia, general anxiety disorder, insomnia, severe depression, mild depression,
Dysthymia, threatening neurosis, osteoarthritis, osteoporosis, phobia, peptic ulcer, rheumatoid arthritis, schizophrenia, social phobia, ulcerative colitis, unstable angina, acute pancreatitis, angina Molded into a pharmaceutical composition as a therapeutic / preventive drug for symptoms such as asthma, asthma, arteriosclerosis, chronic pancreatitis, diabetic nephropathy, vomiting, gastritis, insulin-dependent diabetes mellitus, allergic rhinitis, nephritis, pain and schizophrenia Can be used.
【００６２】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
を上述の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従
って実施することができる。例えば、必要に応じて糖衣
を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカ
プセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ
以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸
濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例え
ば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担
体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合
剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される
単位用量形態で混和することによって製造することがで
きる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲
の適当な容量が得られるようにするものである。錠剤、
カプセル剤などに混和することができる添加剤として
は、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガント、ア
ラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような
賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などの
ような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑
剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペ
パーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤
などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合
には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体
を含有することができる。注射のための無菌組成物は注
射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油
などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させ
るなどの通常の製剤実施にしたがって処方することがで
きる。When the compound or its salt obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it can be carried out according to a conventional method. For example, orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., optionally sugar-coated, or aseptic solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or suspension It can be used parenterally in the form of injections such as. For example, the compound or salt thereof is admixed with a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder and the like in a unit dosage form generally required for pharmaceutical practice. It can be manufactured by The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained. tablet,
Examples of additives that can be mixed with capsules include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, swelling agents such as corn starch, gelatin, alginic acid, and the like. And lubricating agents such as magnesium stearate, sweetening agents such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry. When the preparation unit form is a capsule, a liquid carrier such as oil and fat can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practices such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, etc. .
【００６３】注射用の水性液としては、例えば、生理食
塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例え
ば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリ
ウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例え
ば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコー
ル（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリ
コール）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベ
ート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよ
い。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶
解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール
などと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸
塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例え
ば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安
定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリ
コールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、
フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
調整された注射液は通常、適当なアンプルに充填され
る。このようにして得られる製剤は安全で低毒性である
ので、例えば温血哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、
ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなど）に
対して投与することができる。該化合物またはその塩の
投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場
合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日
につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１.０〜５０
ｍｇ、より好ましくは約１.０〜２０ｍｇである。非経
口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対
象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例え
ば、注射剤の形では通常成人（６０ｋｇとして）におい
ては、一日につき約０.０１〜３０ｍｇ程度、好ましく
は約０.１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０.１〜１
０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であ
る。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を
投与することができる。Examples of the aqueous solution for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride etc.) and the like. Also used in combination with a solubilizing agent such as alcohol (eg ethanol), polyalcohol (eg propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg Polysorbate 80 (TM), HCO-50) and the like. Good. Examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol. In addition, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservation Agents (eg, benzyl alcohol,
Phenol, etc.), antioxidants and the like.
The prepared injection is usually filled in a suitable ampoule. Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, for example, warm-blooded mammals (for example, rat, rabbit,
Sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, humans, etc.). The dose of the compound or its salt varies depending on the symptoms, etc., but in the case of oral administration, it is generally about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 mg per day for an adult (60 kg). ~ 50
mg, more preferably about 1.0-20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method, etc. About 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1
It is convenient to administer about 0 mg intravenously. In the case of other animals, the dose converted per 60 kg can be administered.
【００６４】（５）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質もしくはその塩または本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩に対する
抗体または抗血清の製造 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその
塩または本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部
分ペプチドもしくはその塩に対する抗体（例えば、ポリ
クローナル抗体、モノクローナル抗体）または抗血清
は、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは
その塩または本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
の部分ペプチドもしくはその塩を抗原として用い、自体
公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造すること
ができる。例えば、モノクローナル抗体は、後述の方法
に従って製造することができる。 〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその
塩または本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部
分ペプチドもしくはその塩（以下、Ｇ蛋白質共役型レセ
プターと略称する場合がある）は、温血動物に対して投
与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担
体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生
能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全
フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常
２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用
いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イ
ヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワ
トリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用
いられる。(5) Production of antibody or antiserum against G protein-coupled receptor protein of the present invention or salt thereof or partial peptide of G protein-coupled receptor protein of the present invention or salt thereof G protein-coupled receptor protein of the present invention Alternatively, an antibody (for example, a polyclonal antibody, a monoclonal antibody) or an antiserum against a salt thereof, a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof is a G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof or the present invention. Can be produced according to a method for producing an antibody or antiserum known per se using a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein or the salt thereof as an antigen. For example, a monoclonal antibody can be produced according to the method described below. [Preparation of Monoclonal Antibody] (a) Preparation of Monoclonal Antibody-Producing Cell G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof, or partial peptide of G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof (hereinafter referred to as G protein conjugate) (Sometimes abbreviated as "type receptor") is administered to warm-blooded animals at a site where antibody can be produced by administration, or itself or with a carrier or diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, about 2 to 10 times in total. Examples of warm-blooded animals used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
【００６５】モノクローナル抗体産生細胞の作製に際し
ては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから
抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後
に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体
産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができ
る。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化
Ｇ蛋白質共役型レセプターと抗血清とを反応させたの
ち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより
なされる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーと
ミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495
(1975)〕に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが
挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫
細胞としては例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／
０、ＡＰ−１などがあげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく
用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と
骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度
であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６
０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜
４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキ
ュベートすることにより効率よく細胞融合を実施でき
る。In the preparation of monoclonal antibody-producing cells, warm-blooded animals immunized with an antigen, for example, an individual with an antibody titer was selected from mice, and spleens or lymph nodes were collected 2 to 5 days after the final immunization. By fusing the antibody-producing cells contained therein with myeloma cells, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared. The antibody titer in the antiserum is measured, for example, by reacting the labeled G protein-coupled receptor described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. The fusion operation is performed by known methods, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495].
(1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used. Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 /
0, AP-1, etc. are mentioned, but P3U1 is preferably used. A preferable ratio of the number of antibody-producing cells (spleen cells) to the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6) is used.
000) is added at a concentration of about 10 to 80%,
Cell fusion can be efficiently performed by incubating at 40 ° C., preferably 30 to 37 ° C. for 1 to 10 minutes.
【００６６】抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体産生ハイ
ブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用でき
るが、例えば、Ｇ蛋白質共役型レセプター抗原を直接あ
るいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレ
ート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性
物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞
融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グ
ロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加
え、固相に結合した抗Ｇ蛋白質共役型レセプターモノク
ローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体ま
たはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培
養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したＧ蛋
白質共役型レセプターを加え、固相に結合した抗Ｇ蛋白
質共役型レセプターモノクローナル抗体を検出する方法
などがあげられる。抗Ｇ蛋白質共役型レセプターモノク
ローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる
方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキ
サンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物
細胞用培地で行なわれる。選別および育種用培地として
は、ハイビリドーマが生育できるものならばどのような
培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは
１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培
地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純
薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培
地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いるこ
とができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましく
は約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好
ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸
ガス下で行なわれる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価
は、上記の抗血清中の抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体
価の測定と同様にして測定できる。Various methods can be used for screening anti-G protein-coupled receptor antibody-producing hybridomas. For example, hybridomas can be directly or on a solid phase (eg, a microplate) on which a G protein-coupled receptor antigen is adsorbed. Culture supernatant is added, then anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or enzyme (if mouse cells used for cell fusion is mouse, anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A is added, and solid phase is added. For detecting an anti-G protein-coupled receptor monoclonal antibody bound to A, hybridoma culture supernatant is added to a solid phase on which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, and a G protein-coupled type labeled with a radioactive substance or an enzyme Anti-G protein-coupled receptor bound to solid phase by adding receptor Such as a method of detecting a monoclonal antibody, and the like. The anti-G protein-coupled receptor monoclonal antibody can be selected by a method known per se or a method analogous thereto. It is usually carried out in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as hybridomas can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1-10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or serum-free for hybridoma culture A medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used. The culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. Cultivation time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. Culturing is usually performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the above-described measurement of the anti-G protein-coupled receptor antibody titer in the antiserum.
【００６７】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 抗Ｇ蛋白質共役型レセプターモノクローナル抗体の分離
精製は通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免
疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈
殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、
ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗
原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧ
などの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離
させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行われる。以
上の（１）および（２）の方法に従って製造させる本発
明のＧ蛋白質共役型レセプター抗体は、Ｇ蛋白質共役型
レセプターを特異的に認識することができるので、被検
液中のＧ蛋白質共役型レセプターの定量、特にサンドイ
ッチ免疫測定法による定量などに使用することができ
る。すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）本発明のＧ蛋
白質共役型レセプターに反応する抗体と、被検液および
標識化Ｇ蛋白質共役型レセプターとを競合的に反応さ
せ、該抗体に結合した標識化Ｇ蛋白質共役型レセプター
の割合を測定することを特徴とする被検液中のＧ蛋白質
共役型レセプターの定量法、（２）被検液と担体上に不
溶化した抗体および標識化された抗体とを同時あるいは
連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性
を測定することを特徴とする被検液中のＧ蛋白質共役型
レセプターの定量法において、一方の抗体がＧ蛋白質共
役型レセプターのＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体
がＧ蛋白質共役型レセプターのＣ端部に反応する抗体で
あることを特徴とする被検液中のＧ蛋白質共役型レセプ
ターの定量法を提供する。(B) Purification of monoclonal antibody The isolation and purification of the anti-G protein-coupled receptor monoclonal antibody is carried out by the same method as the isolation and purification of a normal polyclonal antibody [eg, salting out method, alcohol precipitation method, etc.]. Isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchanger (eg,
DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or protein A or protein G
Specific purification method in which only the antibody is collected by an active adsorbent such as, and the bond is dissociated to obtain the antibody]. The G protein-coupled receptor antibody of the present invention produced according to the above methods (1) and (2) can specifically recognize the G protein-coupled receptor. It can be used for quantification of a receptor, particularly by a sandwich immunoassay. That is, the present invention provides, for example, (i) a label bound to the antibody that competitively reacts with an antibody that reacts with the G protein-coupled receptor of the present invention, a test solution and a labeled G protein-coupled receptor. Method for quantifying G protein-coupled receptor in a test solution, which comprises measuring the ratio of a modified G protein-coupled receptor, (2) an insolubilized antibody and a labeled antibody on a test solution and a carrier In a method for quantifying a G protein-coupled receptor in a test solution, the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier is measured after reacting simultaneously or continuously with one antibody Provided is a method for quantifying a G protein-coupled receptor in a test solution, which is an antibody that recognizes the N-terminal portion of the receptor and the other antibody reacts with the C-terminal portion of the G protein-coupled receptor. Do
【００６８】本発明のＧ蛋白質共役型レセプターを認識
するモノクローナル抗体（以下、抗Ｇ蛋白質共役型レセ
プター抗体と称する場合がある）を用いてＧ蛋白質共役
型レセプターの測定を行なえるほか、組織染色等による
検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分
子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａ
ｂ')2 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよ
い。本発明の抗体を用いる測定法は、 特に制限される
べきものではなく、被測定液中の抗原量（例えばＧ蛋白
質共役型レセプター量）に対応した抗体、抗原もしくは
抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により
検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製
した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測
定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合
法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に
用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイ
ッチ法を用いるのが特に好ましい。標識物質を用いる測
定法に用いられる標識剤としては、放射性同位元素、酵
素、蛍光物質、発光物質などが挙げられる。放射性同位
元素としては、例えば〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、
〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕などが、上記酵素としては、安定で
比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシ
ダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が、蛍光
物質としては、フルオレスカミン、フルオレッセンイソ
チオシアネートなどが、発光物質としては、ルミノー
ル、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど
がそれぞれ挙げられる。さらに、抗体あるいは抗原と標
識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもで
きる。The G protein-coupled receptor can be measured using the monoclonal antibody of the present invention which recognizes the G protein-coupled receptor (hereinafter sometimes referred to as anti-G protein-coupled receptor antibody), and tissue staining and the like. Can also be detected. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or the F (a
b ′)2 , Fab ′, or Fab fraction may be used. The assay method using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the amount of the antibody, the antigen or the antibody-antigen complex corresponding to the amount of the antigen (eg, the amount of G protein-coupled receptor) in the liquid to be measured can be determined. Any measuring method may be used as long as it is detected by chemical or physical means and is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephelometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are suitably used, but in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later. Examples of the labeling agent used in the measurement method using a labeling substance include radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances and the like. Examples of radioisotopes include [125 I], [131 I],
[3 H], [14 C] and the like are preferable as the above-mentioned enzymes, which are stable and have a large specific activity. Examples of the fluorescent substance include fluorescamine and fluorescein isothiocyanate, and examples of the luminescent substance include luminol, a luminol derivative, luciferin, and lucigenin. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
【００６９】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等
を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる
方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラ
ン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポ
リアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガ
ラス等が挙げられる。サンドイッチ法においては不溶化
した抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体に被検液を反応さ
せ（１次反応）、さらに標識化抗Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上
の標識剤の活性を測定することにより被検液中のＧ蛋白
質共役型レセプター量を定量することができる。１次反
応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行な
ってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤
および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができ
る。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、
固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず
しも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等
の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本
発明のサンドイッチ法によるＧ蛋白質共役型レセプター
の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる
抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体はＧ蛋白質共役型レセ
プターの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いら
れる。即ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体
は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、Ｇ蛋白質共
役型レセプターのＣ端部を認識する場合、１次反応で用
いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部
を認識する抗体が用いられる。For the insolubilization of an antigen or an antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond which is usually used for insolubilizing or immobilizing proteins or enzymes. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass. In the sandwich method, an insolubilized anti-G protein-coupled receptor antibody is reacted with a test solution (first reaction), and further a labeled anti-G protein-coupled receptor antibody is reacted (second reaction), and then on an insolubilized carrier. The amount of the G protein-coupled receptor in the test solution can be quantified by measuring the activity of the labeling agent. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times. The labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above. In addition, in the immunoassay by the sandwich method,
The antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies may be used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. In the method for measuring a G protein-coupled receptor according to the sandwich method of the present invention, the anti-G protein-coupled receptor antibodies used in the primary reaction and the secondary reaction are preferably antibodies having different binding sites for the G protein-coupled receptor. Used. That is, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal portion of the G protein-coupled receptor, the antibody used in the primary reaction is preferably the antibody used in the primary reaction. An antibody that recognizes an N-terminal other than the C-terminal is used.
【００７０】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター抗体を
サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、
イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用い
ることができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗
原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の
標識抗原と(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを
分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定
し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体
として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレング
リコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相
法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あ
るいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として
固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメ
トリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定
量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を
分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識
化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標
識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離す
る。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗
原量を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あ
るいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降
物の量を測定する。被検液中の抗原量僅かであり、少量
の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用
するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。The G protein-coupled receptor antibody of the present invention may be assayed by a measuring system other than the sandwich method, such as the competitive method,
It can be used for immunometric method or nephrometry. In the competition method, an antigen in a test solution and a labeled antigen are allowed to competitively react with an antibody, and then the unreacted labeled antigen is separated from (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody. (B / F separation), the amount of any of B and F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as the antibody, a liquid phase method using polyethylene glycol, a second antibody against the antibody is used for B / F separation, and a solid phase antibody is used as the first antibody, or The first antibody is soluble and the second antibody is a solid-phased antibody. In the immunometric method, an antigen in a test solution and a solid-phased antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of a labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Is reacted with an excess amount of the labeled antibody, and then the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the labeled amount of either phase is measured to quantify the amount of antigen in the test liquid. In nephelometry, the amount of insoluble precipitates generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephelometry utilizing laser scattering is preferably used.
【００７１】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＧ蛋
白質共役型レセプターの測定系を構築すればよい。これ
らの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書な
どを参照することができる〔例えば、入江 寛編「ラジ
オイムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江
寛編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４
年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書
院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定
法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄
治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和
６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Imm
unochemical Techniques(Part A))、同書 Vol. 73(Immu
nochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immu
nochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immu
nochemical Techniques(PartD:Selected Immunoassay
s))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part
E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Me
thods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques
(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibo
dies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のように、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター抗体
を用いることによって、Ｇ蛋白質共役型レセプターを感
度良く定量することができる。In applying these individual immunological assay methods to the assay method of the present invention, it is not necessary to set special conditions, operations and the like. The measurement system for the G protein-coupled receptor may be constructed by adding ordinary technical consideration to those skilled in the art to ordinary conditions and operating methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, books, etc. [for example, Hiroshi Irie "Radioimmunoassay" (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie "Sequel Radioimmunoassay"). (Kodansha, Showa 54
Issue), Eiji Ishikawa et al. “Enzyme Immunoassay” (medical booklet, published in 1978), Eiji Ishikawa et al. “Enzyme Immunoassay” (second edition) (medical booklet, published in 1982), Ishikawa Eiji et al., “Enzyme Immunoassay” (3rd edition) (Medical Shoin, published in 1987), “Methods in ENZYMOLOGY” Vol. 70 (Imm
unochemical Techniques (Part A)), ibid Vol. 73 (Immu
nochemical Techniques (Part B)), ibid Vol. 74 (Immu
nochemical Techniques (Part C)), ibid Vol. 84 (Immu
nochemical Techniques (PartD: Selected Immunoassay
s)), Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part
E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Me
thods)), ibid. Vol. 121 (Immunochemical Techniques)
(Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibo
dies)) (above, issued by Academic Press) etc.).
As described above, by using the G protein-coupled receptor antibody of the present invention, the G protein-coupled receptor can be quantified with high sensitivity.
【００７２】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸In this specification and the drawings, when an abbreviation is used for a base or amino acid, IUPAC-IUB is used.
Abbreviations based on Commision on Biochemical Nomenclature or common abbreviations in the field,
An example is given below. When an amino acid can have an optical isomer, the L-form is indicated unless otherwise specified. DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine RNA: ribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid dATP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine Phosphoric acid dCTP: Deoxycytidine triphosphate ATP: Adenosine triphosphate
【００７３】 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイ Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸[0073] EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid SDS: sodium dodecyl sulfate EIA: enzyme immunoassay Gly: glycine Ala: alanine Val: valine Leu: leucine Ile: isoleucine Ser: serine Thr: threonine Cys: cysteine Met: methionine Glu: glutamic acid Asp: aspartic acid
【００７４】 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキ
サミド基 ｄＮＴＰ ：デオキシリボヌクレオシド ５'−
トリフォスフェート ＩＰＴＧ ：イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラ
クトピラノシド Ｘ−ｇａｌ ：５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−Ｄ−ガラクトシドLys: lysine Arg: arginine His: histidine Phe: phenylalanine Tyr: tyrosine Trp: tryptophan Pro: proline Asn: asparagine Gln: glutamine pGlu: pyroglutamic acid Me: phenyl group: B: phenyl group Et: methyl group Et: TC: thiazolidine-4 (R) -carboxamide group dNTP: deoxyribonucleoside 5'-
Triphosphate IPTG: Isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside X-gal: 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside
【００７５】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号：１〕本発明のヒト型Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質の全アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２〕本発明のヒト型Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質をコードする塩基配列を示す 。〔配列番号：３〕実施例２で用いたプライマーｒｏ−
５ｉＦ３の配列を示す。 〔配列番号：４〕実施例２で用いたプライマーｒｏ−５
ｉＲの配列を示す。 〔配列番号：５〕実施例４で用いたプライマーｒｏ−５
ｉＲ２の配列を示す。 〔配列番号：６〕実施例４で用いたプライマーｒｏ−５
ｉＲ４の配列を示す。 〔配列番号：７〕実施例５で用いたプライマーＥＭ−Ｌ
Ｉの配列を示す。 〔配列番号：８〕実施例５で用いたプライマーｒｏ−５
ｉＦ５の配列を示す。 〔配列番号：９〕実施例５で用いたプライマーｒｏ−５
ｉＦ６の配列を示す。 〔配列番号：１０〕実施例６で用いたプライマーＢＬ５
−５Ａの配列を示す。 〔配列番号：１１〕実施例６で用いたプライマーＢＬ５
−Ａの配列を示す。 〔配列番号：１２〕参考例４で得られたｐｕＤ−ＢＬ５
に含まれるウサギ胃幽門部平滑筋由来Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードされるウサギ胃幽
門部平滑筋由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分
アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：１３〕参考例４で得られたｐｕＤ−ＢＬ５
に含まれるウサギ胃幽門部平滑筋由来Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列を示す。 〔配列番号：１４〕参考例１において用いられた、ウサ
ギ型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤ
ＮＡのクローニングに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を
示す。 〔配列番号：１５〕参考例１において用いられた、ウサ
ギ型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤ
ＮＡのクローニングに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を
示す。後述の実施例６で得られた形質転換体エシェリヒ
ア コリ（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐｈＢＬ５
は、平成８年２月１３日から通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−５３９２として寄託されている。The sequence numbers in the sequence listing in the present specification show the following sequences. [SEQ ID NO: 1] This shows the entire amino acid sequence of the human G protein-coupled receptor protein of the present invention. [SEQ ID NO: 2] This shows the base sequence encoding the human G protein-coupled receptor protein of the present invention. [SEQ ID NO: 3] Primer ro- used in Example 2
The sequence of 5iF3 is shown. [SEQ ID NO: 4] Primer ro-5 used in Example 2
The sequence of iR is shown. [SEQ ID NO: 5] Primer ro-5 used in Example 4
The sequence of iR2 is shown. [SEQ ID NO: 6] Primer ro-5 used in Example 4
The sequence of iR4 is shown. [SEQ ID NO: 7] Primer EM-L used in Example 5
The sequence of I is shown. [SEQ ID NO: 8] Primer ro-5 used in Example 5
The sequence of iF5 is shown. [SEQ ID NO: 9] Primer ro-5 used in Example 5
The sequence of iF6 is shown. [SEQ ID NO: 10] Primer BL5 used in Example 6
The sequence of -5A is shown. [SEQ ID NO: 11] Primer BL5 used in Example 6
-A shows the sequence. [SEQ ID NO: 12] puD-BL5 obtained in Reference Example 4
2 shows a partial amino acid sequence of the rabbit gastric pyloric smooth muscle-derived G protein-coupled receptor protein encoded by the rabbit gastric pyloric smooth muscle-derived G protein-coupled receptor protein cDNA fragment contained in FIG. [SEQ ID NO: 13] puD-BL5 obtained in Reference Example 4
2 shows the nucleotide sequence of the rabbit gastric pyloric smooth muscle-derived G protein-coupled receptor protein cDNA fragment contained in FIG. [SEQ ID NO: 14] cD encoding a rabbit G protein-coupled receptor protein used in Reference Example 1
The base sequence of the synthetic DNA used for the cloning of NA is shown. [SEQ ID NO: 15] cD encoding the rabbit G protein-coupled receptor protein used in Reference Example 1
The base sequence of the synthetic DNA used for the cloning of NA is shown. The transformant Escherichia coli JM109 / phBL5 obtained in Example 6 described later.
Has been depositing with the deposit number FERM on February 13, 1996 at the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology (NIBH), Ministry of International Trade and Industry.
Deposited as BP-5392.
【００７６】[0076]
【実施例】以下に参考例および実施例を示して、本発明
をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定
するものではない。The present invention will be described in more detail with reference to Reference Examples and Examples below, but these do not limit the scope of the present invention.
【００７７】[0077]
【参考例１】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
するＤＮＡを増幅させるための合成ＤＮＡプライマーの
製造 公知のヒト由来ガラニンレセプター（ＨＵＭＧＡＬＡＲ
ＥＣ）、ラット由来α−１Ｂ−アドレナジックレセプタ
ー（ＲＡＴＡＤＲ１Ｂ）、ヒト由来β−１−アドレナジ
ックレセプター（ＨＵＭＡＤＲＢ１）、ウサギ由来ＩＬ
−８レセプター（ＲＡＢＩＬ８ＲＳＢ）、ヒト由来オピ
オイドレセプター（ＨＵＭＯＰＩＯＤＲＥ）、ウシ由来
サブスタンスＫレセプター（ＢＴＳＫＲ）、ヒト由来ソ
マトスタチンレセプター−２（ＨＵＭＳＲＩ２Ａ）、ヒ
ト由来ソマトスタチンレセプター−３（ＨＵＭＳＳＴＲ
３Ｙ）、ヒト由来ガストリンレセプター（ＨＵＭＧＡＲ
Ｅ）、ヒト由来コレシストキニンＡレセプター（ＨＵＭ
ＣＣＫＡＲ）、ヒト由来ドパミンレセプター−Ｄ５（Ｈ
ＵＭＤ１Ｂ）、ヒト由来セロトニンレセプター５ＨＴ１
Ｅ（ＨＵＭ５ＨＴ１Ｅ）、ヒト由来ドパミンレセプター
Ｄ４（ＨＵＭＤ４Ｃ）、マウス由来セロトニンレセプタ
ー−２（ＭＭＳＥＲＯ）、ラット由来α−１Ａ−アドレ
ナジックレセプター（ＲＡＴＡＤＲＡ１Ａ）およびラッ
ト由来ヒスタミンＨ２レセプター（Ｓ５７５６５）の第
２膜貫通領域付近のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ
の塩基配列を比較し、類似性の高い部分を見いだした。Reference Example 1 Production of Synthetic DNA Primer for Amplifying DNA Encoding G Protein-Coupled Receptor Protein Known human galanin receptor (HUMGALAR)
EC), rat-derived α-1B-adrenergic receptor (RATADR1B), human-derived β-1-adrenergic receptor (HUMADRB1), rabbit-derived IL
-8 receptor (RABIL8RSB), human-derived opioid receptor (HUMOPIODRE), bovine-derived substance K receptor (BTSR), human-derived somatostatin receptor-2 (HUMSRI2A), human-derived somatostatin receptor-3 (HUMSSTR)
3Y), human-derived gastrin receptor (HUMGAR
E), human-derived cholecystokinin A receptor (HUM
CCKAR), human-derived dopamine receptor-D5 (H
UMD1B), human serotonin receptor 5HT1
E (HUM5HT1E), human-derived dopamine receptor D4 (HUMD4C), mouse-derived serotonin receptor-2 (MMSERO), rat-derived α-1A-adrenergic receptor (RATADRA1A) and rat-derived histamine H2 receptor (S57565) second transmembrane. CDNA encoding the amino acid sequence near the region
By comparing the nucleotide sequences of the above, a highly similar portion was found.
【００７８】また、公知のヒト由来ガラニンレセプター
（ＨＵＭＧＡＬＡＲＥＣ）、ラット由来Ａ１アデノシン
レセプター（ＲＡＴ１ＡＤＲＥＣ）、ブタ由来アンジオ
テンシンレセプター（ＰＩＧＡ２Ｒ）、ラット由来セロ
トニンレセプター（ＲＡＴ５ＨＴＲＴＣ）、ヒト由来ド
パミンレセプター（Ｓ５８５４１）、ヒト由来ガストリ
ンリリーシングペプチドレセプター（ＨＵＭＧＲＰ
Ｒ）、マウス由来ＧＲＰ／ボンベシンレセプター（ＭＵ
ＳＧＲＰＢＯＭ）、ラット由来バスキュラータイプ１ア
ンジオテンシンレセプター（ＲＲＶＴ１ＡＩＩＲ）、ヒ
ト由来ムスカリニックアセチルコリンレセプター（ＨＳ
ＨＭ４）、ヒト由来β−１アドレナジックレセプター
（ＨＵＭＤＲＢ１）、ヒト由来ガストリンレセプター
（ＨＵＭＧＡＲＥ）、ラット由来コレシストキニンレセ
プター（ＲＡＴＣＣＫＡＲ）、ラット由来リガンド不明
レセプター（Ｓ５９７４８）、ヒト由来ソマトスタチン
レセプター（ＨＵＭＳＳＴ２８Ａ）、ラット由来リガン
ド不明レセプター（ＲＮＧＰＲＯＣＲ）、マウス由来ソ
マトスタチンレセプター１（ＭＵＳＳＲＩ１Ａ）、ヒト
由来α−Ａ１−アドレナジックレセプター（ＨＵＭＡ１
ＡＡＤＲ）、マウス由来デルタオピオイドレセプター
（Ｓ６６１８１）およびヒト由来ソマトスタチンレセプ
ター−３（ＨＵＭＳＳＴＲ３Ｙ）の第７膜貫通領域付近
のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を比較
し、類似性の高い部分を見いだした。Known human-derived galanin receptor (HUMGALAREC), rat-derived A1 adenosine receptor (RAT1ADREC), porcine-derived angiotensin receptor (PIGA2R), rat-derived serotonin receptor (RAT5HTRTC), human-derived dopamine receptor (S58541), human-derived Gastrin releasing peptide receptor (HUMGRP
R), mouse-derived GRP / Bombesin receptor (MU
SGRPBOM), rat-derived vascular type 1 angiotensin receptor (RRVT1AIIR), human-derived musculinic acetylcholine receptor (HS
HM4), human-derived β-1 adrenergic receptor (HUMDRB1), human-derived gastrin receptor (HUMGARE), rat-derived cholecystokinin receptor (RATCCKAR), rat-derived ligand unknown receptor (S59748), human-derived somatostatin receptor (HUMSST28A), Rat-derived ligand unknown receptor (RNGPROCR), mouse-derived somatostatin receptor 1 (MUSSRI1A), human-derived α-A1-adrenergic receptor (HUMA1)
AADR), mouse-derived delta opioid receptor (S66181), and human-derived somatostatin receptor-3 (HUMSSTR3Y) were compared to find the highly similar portion by comparing the nucleotide sequences of cDNAs encoding the amino acid sequences near the seventh transmembrane region. .
【００７９】上記の（ ）内の略語はDNASIS Gene/Prot
einシークエンスデータベース（ＣＤ０１９、日立ソフ
トウエアエンジニアリング）を用いて GenBank/EMBL Da
ta Bank を検索した際に示される整理番号であり、通常
エントリーネームと呼ばれるものである。特に、多くの
レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡで一致する塩基
部分を基準とし、その他の部分においてもなるべく多く
のレセプターｃＤＮＡと配列の一致性を高めるために混
合塩基の導入を計画した。この配列をもとに、共通する
塩基配列に相補的である配列番号：１４または配列番
号：１５で表わされる塩基配列を有する合成ＤＮＡ２本
を作成した。 ５'−ＧＹＣＡＣＣＡＡＣＮＷＳＴＴＣＡＴＣＣＴＳＷＮＨＣＴＧ−３' 〔ＳはＧまたはＣを示し、ＹはＣまたはＴを示し、ＷはＡまたはＴを示し、Ｈは Ａ、ＣまたはＴを示し、ＮはＩを示す。〕 （配列番号：１４） ５'−ＡＳＮＳＡＮＲＡＡＧＳＡＲＴＡＧＡＮＧＡＮＲＧＧＲＴＴ−３' 〔ＲはＡまたはＧを示し、ＳはＧまたはＣを示し、ＮはＩを示す。〕 （配列番号：１５） Ｓ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、ＲおよびＳは、合成時に複数の塩基に
混合して合成する。The abbreviations in parentheses above are DNASIS Gene / Prot
GenBank / EMBL Da using the ein sequence database (CD019, Hitachi Software Engineering)
This is the reference number shown when you search for ta Bank, which is usually called the entry name. In particular, the introduction of mixed bases was planned in order to increase the conformity of the sequence with as many receptor cDNAs as possible in the other portions, with the base portion corresponding to the cDNAs encoding many receptor proteins as a reference. Based on this sequence, two synthetic DNAs having a base sequence represented by SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 which is complementary to the common base sequence were prepared. 5′-GYCACCAACNWSTTCATCATCTSWNHCTG-3 ′ [S represents G or C, Y represents C or T, W represents A or T, H represents A, C or T, and N represents I. ] (SEQ ID NO: 14) 5'-ASNSANRAAGSARTAGANGANRGGRTT-3 '[R represents A or G, S represents G or C, and N represents I]. (SEQ ID NO: 15) S, Y, W, H, R and S are synthesized by mixing with a plurality of bases at the time of synthesis.
【００８０】[0080]
【参考例２】ウサギ胃幽門部平滑筋からのpoly(Ａ)+Ｒ
ＮＡ画分の調製およびｃＤＮＡの合成 ウサギ胃幽門部平滑筋よりグアニジンイソチオシアネー
ト法により Total ＲＮＡを調製後（Kaplan B.B. et a
l., Biochem. J. 183, 181-184 (1979)）、ｍＲＮＡ精
製キット（ファルマシア社）を用いて、poly(Ａ)+ＲＮ
Ａ画分を調製した。次に、poly(Ａ)+ＲＮＡ画分５μｇ
にプライマーとしてランダムＤＮＡヘキサマー（ＢＲＬ
社）を加え、モロニイマウス白血病ウイルスの逆転写酵
素（ＢＲＬ社）により、添付バッファーを用いて相補Ｄ
ＮＡを合成した。反応後の産物はフェノール：クロロホ
ルム（１：１）で抽出し、エタノール沈殿を行なった
後、３０μｌのＴＥに溶解した。[Reference Example 2] poly (A)+ R from smooth muscle of rabbit gastric pylorus
Preparation of NA Fraction and Synthesis of cDNA After total RNA was prepared from rabbit gastric pyloric smooth muscle by the guanidine isothiocyanate method (Kaplan BB et a
l., Biochem. J. 183, 181-184 (1979)), mRNA purification kit (Pharmacia), using poly (A)+ RN.
Fraction A was prepared. Next, 5 μg of poly (A)+ RNA fraction
Random DNA hexamer (BRL
), And complemented with Moronii murine leukemia virus reverse transcriptase (BRL) using the attached buffer.
NA was synthesized. The product after the reaction was extracted with phenol: chloroform (1: 1), precipitated with ethanol, and then dissolved in 30 μl of TE.
【００８１】[0081]
【参考例３】ウサギ胃幽門部平滑筋由来ｃＤＮＡを用い
たＰＣＲ法による受容体ｃＤＮＡの増幅と塩基配列の決
定 参考例２でウサギ胃幽門部平滑筋より調製したｃＤＮＡ
１μｌを鋳型として使用し、参考例１で合成したＤＮ
Ａプライマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行なった。
反応液の組成は、合成ＤＮＡプライマー（５'プライマ
ー配列および３'プライマー配列）各１００ｐＭ、０.２
５mM ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ ＤＮＡ polymerase １μｌ
および酵素に付属のバッファー１０μｌで、総反応溶液
量は１００μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマ
ルサイクラー（パーキン・エルマー社）を用い、９６℃
・３０秒、４５℃・１分、６０℃・３分のサイクルを２
５回繰り返した。増幅産物の確認は１.２％アガロース
ゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色によって行
なった。[Reference Example 3] Amplification of receptor cDNA by PCR method using rabbit stomach pyloric smooth muscle-derived cDNA and determination of nucleotide sequence cDNA prepared from rabbit gastric pyloric smooth muscle in Reference Example 2
DN synthesized in Reference Example 1 using 1 μl as a template
Amplification was performed by the PCR method using the A primer.
The composition of the reaction solution was 100 pM for each synthetic DNA primer (5 'primer sequence and 3'primer sequence), 0.2
5 mM dNTPs, Taq DNA polymerase 1 μl
The total reaction solution volume was 100 μl with 10 μl of the buffer attached to the enzyme. The cycle for amplification uses a thermal cycler (Perkin Elmer) at 96 ° C.
・ 2 cycles of 30 seconds, 45 ° C / 1 minute, 60 ° C / 3 minutes
Repeated 5 times. The amplification product was confirmed by 1.2% agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining.
【００８２】[0082]
【参考例４】ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブ
クローニングおよび挿入ｃＤＮＡ部分の塩基配列の解読
による新規レセプター候補クローンの選択 参考例３で行なったＰＣＲ後の反応産物は１.４％のア
ガロースゲルを用いて分離し、バンドの部分をカミソリ
で切り出した後、エレクトロエリューション、フェノー
ル抽出、エタノール沈殿を行ってＤＮＡを回収した。Ｔ
Ａクローニングキット（インビトロゲン社）の処方に従
い、回収したＤＮＡをプラスミドベクターｐＣＲTMIIへ
サブクローニングした。これを大腸菌ＪＭ１０９ compe
tent cell（宝酒造株式会社）に導入して形質転換した
のち、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリ
ン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地中で
選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌した爪楊枝を
用いて分離し、形質転換体を複数得た。個々のクローン
をアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、自動プラ
スミド抽出装置ＰＩ−１００（クラボウ社）を用いてプ
ラスミドＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡの一部を用
いてＥｃｏＲＩによる切断を行い、挿入されているｃＤ
ＮＡ断片の大きさを確認した。残りのＤＮＡの一部をさ
らにＲＮａｓｅ処理、フェノール・クロロフォルム抽出
し、エタノール沈殿によって濃縮した。[Reference Example 4] Subcloning of PCR product into a plasmid vector and selection of a novel receptor candidate clone by decoding the nucleotide sequence of the inserted cDNA portion The reaction product after PCR performed in Reference Example 3 uses 1.4% agarose gel. After separation, the band portion was cut out with a razor, and then electroelution, phenol extraction, and ethanol precipitation were performed to recover the DNA. T
The recovered DNA was subcloned into the plasmid vector pCR™ II according to the prescription of A cloning kit (Invitrogen). E. coli JM109 compe
After introduction into a tent cell (Takara Shuzo Co., Ltd.) and transformation, a clone having a cDNA insert is selected in LB agar medium containing ampicillin, IPTG and X-gal, and only a white-colored clone is sterilized with a toothpick. It isolate | separated using and the several transformant was obtained. Individual clones were cultured overnight in LB medium containing ampicillin, and plasmid DNA was prepared using an automatic plasmid extractor PI-100 (Kurabo). A portion of the prepared DNA is digested with EcoRI, and the inserted cD
The size of the NA fragment was confirmed. A part of the remaining DNA was further treated with RNase, extracted with phenol / chloroform, and concentrated by ethanol precipitation.
【００８３】塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy
Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用い
て行い、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した。得
られた塩基配列を基に、ＤＮＡＳＩＳ（日立システムエ
ンジニアリング社）を用いてホモロジー検索を行なった
結果、サブスタンスＫレセプター蛋白質をコードするク
ローンが全体の約６割存在することが判明した。そこ
で、高頻度にクローニングされてくるサブスタンスＫレ
セプター蛋白質のクローンを除くため、参考例３で得ら
れたＰＣＲ産物を、制限酵素ＡｐａＩまたはＢｂｓＩで
消化した。ＡｐａＩおよびＢｂｓＩは、ウサギサブスタ
ンスＫレセプター蛋白質をコードするＤＮＡを切断する
ので該ＤＮＡを断片化させることができる。このように
してサブスタンスＫレセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａを除去した後、残ったＰＣＲ産物を上記の方法でクロ
ーニングし、塩基配列を決定した。これらを基に、上記
の方法でホモロジー検索を行った結果、形質転換体エシ
ェリヒア コリ（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐｕ
Ｄ−ＢＬ５の保有するプラスミドに挿入されたｃＤＮＡ
断片が新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードす
ることが分かった。該ｃＤＮＡ断片の塩基配列を〔図
４〕に示した。さらに確認するために、ＤＮＡＳＩＳ
（日立システムエンジニアリング社）を用い、塩基配列
をアミノ酸配列に変換した後〔図４〕、疎水性プロット
〔図５〕を行なった結果、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質であることを示す疎水性ドメインが存在することが
確認された。また、アミノ酸配列に基づくホモロジー検
索を行なった結果、例えば、ヒト由来ヒスタミンＨ2レ
セプター蛋白質（ＪＨ０４４９）と３２．６％、マウス
由来β2−アドレナリンレセプター蛋白質（Ｓ００２６
０）と２７．７％、ラット由来ドーパミンＤ1レセプタ
ー蛋白質（Ｓ１１３７８）と，２８．８％、ヒト由来α
１Ｃ−アドレナリンレセプター蛋白質（ＪＮ０７６５）
と２７．９％、マウス由来サブスタンスＫレセプター蛋
白質（Ｓ２０３０３）と２２．４％、ヒト由来μタイプ
オピオイドレセプター蛋白質（Ｓ４１０７５）と２４．
４％のホモロジーを有する新規なレセプター蛋白質であ
ることが判明した。上記の（ ）内の略語は、ＮＢＲＦ
−ＰＩＲ（National Biochemical Research Foundation
- Protein Information Resource）にデータとして登
録される際の整理番号であり、通常 Accession Number
と呼ばれるものである。The reaction for determining the nucleotide sequence is DyeDeoxy
The analysis was performed using the Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI), and the reading was performed using a fluorescent automatic sequencer. As a result of a homology search using DNASIS (Hitachi System Engineering Co., Ltd.) based on the obtained nucleotide sequence, it was found that about 60% of the clones encoding the substance K receptor protein were present. Therefore, the PCR product obtained in Reference Example 3 was digested with a restriction enzyme ApaI or BbsI in order to remove a clone of the substance K receptor protein that was frequently cloned. ApaI and BbsI cleave the DNA encoding the rabbit substance K receptor protein, so that the DNA can be fragmented. Thus, the DN encoding the substance K receptor protein
After removing A, the remaining PCR product was cloned by the above method and the nucleotide sequence was determined. Based on these, a homology search was conducted by the above method, and as a result, the transformant Escherichia coli JM109 / pu was obtained.
CDNA inserted in a plasmid possessed by D-BL5
The fragment was found to encode a novel G protein-coupled receptor protein. The nucleotide sequence of the cDNA fragment is shown in [Fig. 4]. To further confirm, DNASIS
(Hitachi System Engineering Co., Ltd.) was used to convert the nucleotide sequence into an amino acid sequence [FIG. 4], and then a hydrophobicity plot [FIG. 5] was performed. It was confirmed to exist. As a result of homology search based on the amino acid sequence, for example, human-derived histamine H2 receptor protein (JH0449) and 32.6%, mouse-derived β2 -adrenergic receptor protein (S0026
0) and 27.7%, rat-derived dopamine D1 receptor protein (S11378), 28.8%, human-derived α
1C-adrenergic receptor protein (JN0765)
And 27.9%, mouse-derived substance K receptor protein (S20303) and 22.4%, human-derived μ type opioid receptor protein (S41075) and 24.
It was found to be a novel receptor protein with a homology of 4%. Abbreviations in () above are NBRF
-PIR (National Biochemical Research Foundation)
-Accession Number, which is a reference number when registered as data in Protein Information Resource)
It is called.
【００８４】実施例１ ヒト胃 poly(Ａ)+ＲＮＡからのヒト胃由来ｃＤＮＡの合
成：ヒト胃 poly(Ａ)+ＲＮＡ（ニッポンジーン社）５μ
ｇにプライマーとしてランダムＤＮＡヘキサマー（ＢＲ
Ｌ社、米国）を加え、モロニイマウス白血病ウイルスの
逆転写酵素（ＢＲＬ社）によりヒト胃由来ｃＤＮＡを合
成した。得られたヒト胃由来ｃＤＮＡをフェノール：ク
ロロホルム（１：１）で抽出し、エタノール沈殿に付し
た後、５０μｌの蒸留水に溶解した。[0084] Synthesis of human gastric derived cDNA from Example 1 human gastric poly (A)+ RNA: human gastric poly (A)+ RNA (Nippon Gene) 5 [mu]
Random DNA hexamer (BR
L company, USA) was added, and human stomach-derived cDNA was synthesized by Moronii mouse leukemia virus reverse transcriptase (BRL). The obtained human stomach-derived cDNA was extracted with phenol: chloroform (1: 1), subjected to ethanol precipitation, and then dissolved in 50 μl of distilled water.
【００８５】実施例２ ヒト胃由来ｃＤＮＡからＰＣＲ法によるヒト型Ｇ蛋白質
共役型レセプターｃＤＮＡ断片の増幅：実施例１で製造
したヒト胃ｃＤＮＡ ０.５μｌを鋳型とし、参考例４で
得られたウサギ型Ｇ蛋白質共役型レセプターｃＤＮＡ配
列（プラスミドｐＤｕ-ＢＬ５に組込まれたＤＮＡ）の
内の第２膜貫通領域付近と第５膜貫通領域付近の配列を
参照して合成したプライマーｒｏ-５ｉＦ３（配列：
５’−ＴＣＣＴＣＣＴＧＧＧＡＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ
ＧＣ−３’、配列番号：３）およびプライマーｒｏ-５
ｉＲ（配列：５’−ＡＡＴＣＣＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡ
ＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧＴＧＡＡＧＡ−３’、配列番号：
４）を反応液中でそれぞれ２００ｎＭとなるよう用い
て、ＰＣＲ反応を行なった。該ＰＣＲ反応においては、
反応液はＤＮＡpolymerase ＥＸＴaq（宝酒造）を用
い、これに添付のバッファー２.５μｌとｄＮＴＰ ２０
０μＭを加え水で２５μｌとして調製した。該ＰＣＲ反
応においてはサーマルサイクラーは GeneAmp9600（パー
キンエルマー社）を用い、９６℃・１分後、９４℃・３
０秒、６８℃・２分のサイクルを３１回繰り返した。得
られた増幅産物を１.２％アガロース電気泳動に付し、
エチジウムブロマイド染色し約４１０ｂｐ のバンドを
切り出し、遠心濾過チューブ（ミリポア社）で遠心濾過
し、フェノール抽出次いでエタノール沈殿を行なってＤ
ＮＡを回収した。回収したＤＮＡをＴＡクローニングキ
ット（Invitrogen社）のマニュアルに従い、プラスミド
ベクターｐＣＲTMIIへサブクローニングし、大腸菌ＪＭ
１０９に導入し、得られた形質転換体をアンピシリンを
含むＬＢ培地で培養後、自動プラスミド抽出器（クラボ
ウ社）でプラスミドを得た。このプラスミドをDye Term
inator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用い、マ
ニュアルに従い反応させ、塩基配列を蛍光自動ＤＮＡシ
ーケンサー（ＡＢＩ社）により解読した。解読した塩基
配列を〔図３〕の上段に示す。また、ウサギ型Ｇ蛋白質
共役型レセプターｃＤＮＡ配列を〔図３〕の下段に示
す。〔図３〕から、本発明のヒト型Ｇ蛋白質共役型レセ
プターｃＤＮＡ配列は、ウサギ型Ｇ蛋白質共役型レセプ
ターｃＤＮＡ配列の対応する部分と９０％の相同性を有
していることが分かった。Example 2 Amplification of human G protein-coupled receptor cDNA fragment by PCR from human stomach-derived cDNA: Rabbit obtained in Reference Example 4 using 0.5 μl of human stomach cDNA prepared in Example 1 as a template Primer ro-5iF3 (sequence: in the vicinity of the second transmembrane region and the fifth transmembrane region of the type G protein-coupled receptor cDNA sequence (DNA integrated in plasmid pDu-BL5))
5'-TCCTCCTGGGACTCATCATCAT
GC-3 ′, SEQ ID NO: 3) and primer ro-5
iR (sequence: 5'-AATCCCCACCCATCACA
GACCCAGGAGTGAAGA-3 ', SEQ ID NO:
A PCR reaction was carried out using 4) so that each of the concentrations was 200 nM in the reaction solution. In the PCR reaction,
As a reaction solution, DNA polymerase EXTaq (Takara Shuzo) was used, and 2.5 μl of the attached buffer and dNTP 20
It was prepared by adding 0 μM to 25 μl with water. In the PCR reaction, GeneAmp 9600 (Perkin Elmer) was used as the thermal cycler, and after 96 ° C for 1 minute, 94 ° C for 3 minutes.
The cycle of 0 second and 68 ° C. for 2 minutes was repeated 31 times. The obtained amplification product was subjected to 1.2% agarose electrophoresis,
A band of about 410 bp was cut out by staining with ethidium bromide, centrifugally filtered with a centrifugal filtration tube (Millipore), phenol extracted and then ethanol precipitated to obtain D.
NA was recovered. The recovered DNA was subcloned into a plasmid vector pCR™ II according to the manual of TA Cloning Kit (Invitrogen), and E. coli JM
The resulting transformant was cultivated in LB medium containing ampicillin, and a plasmid was obtained by an automatic plasmid extractor (Kurabo). This plasmid is Dye Term
Using the inator Cycle Sequencing Kit (ABI), the reaction was performed according to the manual, and the nucleotide sequence was decoded by a fluorescent automatic DNA sequencer (ABI). The decoded base sequence is shown in the upper part of FIG. The rabbit G protein-coupled receptor cDNA sequence is shown in the lower part of FIG. From FIG. 3, it was found that the human G protein-coupled receptor cDNA sequence of the present invention has 90% homology with the corresponding portion of the rabbit G protein-coupled receptor cDNA sequence.
【００８６】実施例３ ヒト小脳 poly(Ａ)+ＲＮＡ画分
からのｃＤＮＡの合成：ヒト小脳 poly(Ａ)+ＲＮＡ（ニ
ッポンジーン社）１μｇから Marathon cDNAamplificat
ion kit（Clontech社）により、マニュアルにしたがっ
て二本鎖のｃＤＮＡを合成し、トリシン-ＥＤＴＡバッ
ファー１０μｌに溶解した。このうち１μｌをさらにト
リシン-ＥＤＴＡバッファーで５０倍に希釈した。Example 3 Synthesis of cDNA from human cerebellar poly (A)+ RNA fraction: Marathon cDNAamplificat from 1 μg of human cerebellar poly (A)+ RNA (Nippon Gene)
Double-stranded cDNA was synthesized by an ion kit (Clontech) according to the manual and dissolved in 10 μl of Tricine-EDTA buffer. Of this, 1 μl was further diluted 50 times with tricine-EDTA buffer.
【００８７】実施例４ ヒト小脳ｃＤＮＡからの５'側配列の増幅：まず５'側の
配列を増幅するために、実施例２で明らかとなった塩基
配列を利用して第５膜貫通領域付近にプライマーｒｏ-
５ｉＲ２（配列：５’−ＡＡＣＣＴＧＣＣＡＴＡＡＡＣ
ＡＡＧＧＴＧＧＴＣＣ−３’、配列番号：５）、プライ
マーｒｏ-５ｉＲ４（配列：５’−ＡＴＴＣＣＡＴＣＴ
ＧＣＡＴＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧ−３’、配列番号：
６）を合成した。実施例３において Marathon cDNA amp
lification kit により製造した５０倍希釈のｃＤＮＡ
溶液５μｌを鋳型とし、プライマーにはｒｏ-５ｉＲ２
とキット付属のアダプタープライマーＡＰ１とを反応液
中でそれぞれ２００ｎＭとなるように用いて、ＰＣＲ反
応を行なった。なお、反応液はＤＮＡ polymerase とし
てＥＸＴaq（宝酒造）を用い、 Marathon cDNA amplifi
cation kit に添付のバッファー５μｌを加え，ｄＮＴ
Ｐを２００μＭとなるように加え、水で５０μｌとなる
ように加え調製した。ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラ
ー（パーキンエルマー社）を用い、９４℃・１分後、９
４℃・３０秒、７２℃・４分のサイクルを５回、９４℃
・３０秒、７０℃・４分のサイクルを５回、９４℃・３
０秒、６８℃・４分のサイクルを２５回繰り返した。さ
らにこの反応液をトリシン-ＥＤＴＡバッファーで５０
倍に希釈したもの５μｌを鋳型として、プライマーをＡ
Ｐ２（キット付属のアダプタープライマー）とｒｏ-５
ｉＲ４の組み合わせに換え、９４℃・１分後、９４℃・
３０秒、６８℃・３分のサイクルを２８回繰り返した。
増幅産物に酢酸アンモニアを加えてエタノール沈殿した
ものを鋳型として、DyeTerminator Cycle Sequencing K
it（ＡＢＩ社）を用い、マニュアルに従い反応させ、蛍
光自動ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社）により解読し
た。その結果、得られたＤＮＡは、実施例２で明らかと
なった塩基配列の５'上流域に約３４０ｂｐにわたって
新たな配列を有していることが分かった。Example 4 Amplification of 5′-side sequence from human cerebellum cDNA: First, in order to amplify the 5′-side sequence, the nucleotide sequence revealed in Example 2 was used to make the vicinity of the fifth transmembrane region. To the primer ro-
5iR2 (sequence: 5'-AACCTGCCATAAAAC
AAGGTGGTCC-3 ′, SEQ ID NO: 5), primer ro-5iR4 (sequence: 5′-ATTCCATCT)
GCATAGGCCTCTGAG-3 ′, SEQ ID NO:
6) was synthesized. In Example 3 Marathon cDNA amp
50-fold diluted cDNA produced by the lification kit
5 μl of the solution was used as a template and ro-5iR2 was used as a primer.
And PCR were carried out using the adapter primer AP1 included in the kit and each of them in the reaction solution at 200 nM. The reaction solution used was EXTaq (Takara Shuzo) as the DNA polymerase, and Marathon cDNA amplifi was used.
Add 5 μl of the supplied buffer to the cation kit and dNT
P was added to 200 μM, and water was added to 50 μl for preparation. The PCR reaction was carried out using a thermal cycler (Perkin Elmer Co.) at 94 ° C for 1 minute, then 9
5 cycles of 4 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 4 minutes, 94 ° C
・ 30 seconds, 70 ℃ ・ 4 minutes cycle 5 times, 94 ℃ ・ 3
The cycle of 0 second and 68 ° C. for 4 minutes was repeated 25 times. Furthermore, this reaction solution is diluted with Tricine-EDTA buffer to 50
Primer A was prepared by using 5 μl of double-diluted product as a template.
P2 (adapter primer included in the kit) and ro-5
Change to the combination of iR4, 94 ℃ ・ 1 minute later, 94 ℃ ・
A cycle of 68 seconds at 68 ° C. for 30 seconds was repeated 28 times.
Dye Terminator Cycle Sequencing K was used as a template by adding ethanol acetate to the amplified product and precipitating with ethanol.
Using it (ABI), the reaction was carried out according to the manual, and it was read by a fluorescent automatic DNA sequencer (ABI). As a result, it was found that the obtained DNA had a new sequence over about 340 bp in the 5'upstream region of the nucleotide sequence revealed in Example 2.
【００８８】実施例５ ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ法を用いた受容体ＤＮＡの
３'側の配列の取得：ヒトゲノムライブラリー（クロー
ンテック社），ＥＭＢＬ３ゲノミックライブラリー（ク
ローンテック社）から次の手法で、ヒト型全長を取得し
た。まずＥＭＢＬ３ベクターのレフトアームに特異的な
プライマーＥＭ-Ｌ１（配列：５’−ＧＧＴＧＴＣＣＧ
ＡＣＴＴＡＴＧＣＣＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＡＧＣ
ＡＡ−３’、配列番号：７）および３'側の増幅のため
にｒｏ-５ｉＦ５（配列：５’−ＧＴＡＴＧＡＴＣＡＧ
ＡＴＣＧＧＴＧＧＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧ−３’、配列
番号：８）およびｒｏ-５ｉＦ６（配列：５’−ＴＣＴ
ＡＴＧＴＴＧＧＴＣＧＧＴＣＣＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴ
Ｇ−３’、配列番号：９）を合成した。これらおよび G
eneAmp9600（パーキンエルマー社）を用いてＰＣＲ反応
を行った。なお、鋳型となるファージ液は９９℃で１５
分間熱変性を行った後に遠心した上清を各反応チューブ
あたり１μｌ用いた。ＰＣＲ反応の反応液は GeneAmp96
00に添付のバッファー２.５μｌ，ｄＮＴＰを２００μ
Ｍとなるように加え、プライマーを２００ｎＭとなるよ
うに加え、水で２５μｌとして調製した。３'側の増幅
は、プライマーにはｒｏ-５ｉＦ５とＥＭ-Ｌ１を用い、
温度条件９４℃・１分後、９８℃・１０秒、６８℃・１
５分のサイクルを３０回繰り返した。この反応液をＴＥ
バッファーで１００倍に希釈したもの２.５μｌを鋳型
として、プライマーをｒｏ-５ｉＦ６とＥＭ-Ｌ１との組
み合わせに換え、温度条件９４℃・１分後、９８℃・１
０秒、６８℃・１５分のサイクルを２４回繰り返した。
得られた増幅産物を１.２％アガロース電気泳動、エチ
ジウムブロマイド染色し約２２００ｂｐのバンドを切り
出した。ＤＮＡを実施例２と同様の方法で回収し、プラ
スミドベクターｐＣＲTMIIへサブクローニングし、Dye
Terminator Cycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）でマニ
ュアルに従い反応し、蛍光自動ＤＮＡシーケンサー（Ａ
ＢＩ社）により解読した。ここにおいて、実施例４の
５'側配列とあわせてヒト型Ｇ蛋白質共役型レセプター
の全アミノ酸配列（配列番号：１）の全コード領域を含
むと考えられるゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ由来の配列
（配列番号：２）が得られた。塩基配列とそれがコード
するアミノ酸配列を〔図１〕に示す。疎水性プロットを
行なったところ、ＴＭ１〜ＴＭ７で示す疎水性ドメイン
が存在することが確認された〔図２〕。Example 5 Obtainment of 3 ′ Sequence of Receptor DNA from Human Genomic DNA by PCR Method: Human Genome Library (Clontech), EMBL3 Genomic Library (Clontech) Human type full length was obtained. First, a primer EM-L1 (sequence: 5′-GGTGTCCG) specific to the left arm of the EMBL3 vector.
ACTTATGCCCGAGAAGATGTTTGAGC
AA-3 ', SEQ ID NO: 7) and ro-5iF5 (sequence: 5'-GTATGATCAG for amplification on the 3'side.
ATCGGTGGAGAAACTGCTGGG-3 ', SEQ ID NO: 8) and ro-5iF6 (SEQ ID NO: 5'-TCT)
ATGTTGGTCGGTCCCTGGAGCATTT
G-3 ', SEQ ID NO: 9) was synthesized. These and G
PCR reaction was performed using eneAmp9600 (Perkin Elmer). The phage solution used as the template was 15 ° C at 15 ° C.
After performing heat denaturation for 1 minute, 1 μl of the supernatant obtained by centrifugation was used for each reaction tube. The reaction solution for PCR reaction is GeneAmp96
2.5μl of buffer attached to 00, 200μ of dNTP
M was added to the solution, and the primer was added to 200 nM to prepare 25 μl of water. For amplification on the 3 ′ side, ro-5iF5 and EM-L1 were used as primers,
Temperature condition 94 ℃ ・ 1 minute later, 98 ℃ ・ 10 seconds, 68 ℃ ・ 1
The 5 minute cycle was repeated 30 times. This reaction solution is TE
2.5 μl of 100-fold diluted with buffer was used as a template, and the primer was changed to a combination of ro-5iF6 and EM-L1.
The cycle of 0 second and 68 ° C. for 15 minutes was repeated 24 times.
The obtained amplification product was subjected to 1.2% agarose electrophoresis and ethidium bromide staining, and a band of about 2200 bp was cut out. The DNA was recovered in the same manner as in Example 2, subcloned into the plasmid vector pCR™ II, and
React with a Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI) according to the manual, and use a fluorescent automatic DNA sequencer (A
BI company). Here, in addition to the 5′-side sequence of Example 4, a sequence derived from genomic DNA and cDNA that is considered to include the entire coding region of the entire human G protein-coupled receptor amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: : 2) was obtained. The base sequence and the amino acid sequence encoded by it are shown in FIG. When the hydrophobicity plot was performed, it was confirmed that the hydrophobic domains TM1 to TM7 were present [FIG. 2].
【００８９】実施例６ ヒト小脳由来ｃＤＮＡからＰＣＲ法を用いたｃＤＮＡの
全コード領域を含むＤＮＡ断片の増幅：実施例４で製造
したヒト小脳ｃＤＮＡを鋳型として、ヒト小脳由来Ｇ蛋
白質共役型レセプター蛋白質の全アミノ酸配列をコード
するｃＤＮＡ断片の増幅を行った。まず実施例３で明ら
かとなったｃＤＮＡの配列を基に、プライマーＢＬ５-
５Ａ（配列：５’−ＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＧＴＧＴＣＣ
ＧＡＧＴＧＧＣＴＡＴＧＴＡＴ−３’配列番号：１０）
およびプライマーＢＬ５-Ａ（配列：５’−ＧＣＣＴＡ
ＣＴＣＡＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣ−３’配列番号：１
１）を合成した。上記ＢＬ５-５Ａは受容体ｃＤＮＡの
スタートコドンを含み、制限酵素ＸｈｏＩ部位を付加し
た−１５〜＋６（スタートコドンＡＴＧのＡを＋１とす
る）に対応するセンス配列で、ＢＬ５-Ａは受容体ｃＤ
ＮＡのストップコドンを含む＋８４９〜＋８６９に対応
するアンチセンス配列である。ＰＣＲ反応は、実施例１
において Marathon cDNA amplification kit により調
製したｃＤＮＡをトリシン-ＥＤＴＡバッファーで１０
０倍に希釈したもの２.５μｌを鋳型として、実施例２
と同様の方法で反応液を調製し、９４℃・１分、９８℃
・１０秒、５２℃・２０秒、６８℃・１分のサイクルを
３４回繰り返した。 増幅産物を２％アガロース電気泳
動に付し、エチジウムブロマイド染色し、約９００ｂｐ
のバンドを切り出し、実施例３と同様の方法でＤＮＡを
回収し、プラスミドベクターｐＣＲTMIIへサブクローニ
ングし、プラスミドｐｈＢＬ５を得た。これを大腸菌Ｊ
Ｍ１０９に導入し、Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐ
ｈＢＬ５を製造した。得られた形質転換体に挿入された
ｃＤＮＡ断片の配列を解析した。その結果、このＤＮＡ
断片はヒト型Ｇ蛋白質共役型レセプターｃＤＮＡの全コ
ード領域（配列番号：１）を含む断片であることが分か
った。Example 6 Amplification of DNA fragment containing the entire coding region of cDNA from human cerebellum-derived cDNA by PCR method: Human cerebellum-derived G protein-coupled receptor protein using the human cerebellum cDNA produced in Example 4 as a template A cDNA fragment encoding the entire amino acid sequence of was amplified. First, based on the sequence of cDNA revealed in Example 3, primer BL5-
5A (sequence: 5'-AGATCTCGAGGTGTCC
GAGTGGCTATGTAT-3 ′ SEQ ID NO: 10)
And primer BL5-A (sequence: 5'-GCCTA
CTCACTTTCTTTTTGC-3 'SEQ ID NO: 1
1) was synthesized. BL5-5A is a sense sequence containing the start codon of the receptor cDNA and corresponding to -15 to +6 (A of the start codon ATG is +1) to which a restriction enzyme XhoI site was added. BL5-A is the receptor cD.
It is an antisense sequence corresponding to +849 to +869 including the NA stop codon. The PCR reaction was performed in Example 1
CDNA prepared by Marathon cDNA amplification kit in Tricine-EDTA buffer
Example 2 using 2.5 μl of 0-fold diluted sample as a template
Prepare a reaction solution in the same manner as above, and 94 ℃ for 1 minute, 98 ℃
The cycle of 10 seconds, 52 ° C, 20 seconds, 68 ° C, 1 minute was repeated 34 times. The amplified product was subjected to 2% agarose electrophoresis, stained with ethidium bromide, and then about 900 bp.
Band was cut out, DNA was recovered by the same method as in Example 3, and subcloned into plasmid vector pCR™ II to obtain plasmid phBL5. E. coli J
Introduced into M109, Escherichia coli JM109 / p
hBL5 was produced. The sequence of the cDNA fragment inserted into the obtained transformant was analyzed. As a result, this DNA
The fragment was found to be a fragment containing the entire coding region of human G protein-coupled receptor cDNA (SEQ ID NO: 1).
【００９０】[0090]
【発明の効果】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質および該蛋白質をコードするＤＮＡは、リガンドの
決定、抗体および抗血清の入手、組み替え型レセプ
ター蛋白質の発現系の構築、同発現系を用いたレセプ
ター結合アッセイ系の開発と医薬品候補化合物のスクリ
ーニング、構造的に類似したリガンド・レセプターと
の比較にもとづいたドラッグデザインの実施、遺伝子
診断におけるプローブ、ＰＣＲプライマーの作成、遺
伝子治療等に用いることができる。特に、Ｇ蛋白質共役
型のレセプターの構造・性質の解明はこれらの系に作用
するユニークな医薬品の開発につながる。INDUSTRIAL APPLICABILITY The G protein-coupled receptor protein of the present invention and the DNA encoding the protein are used to determine the ligand, obtain antibodies and antisera, construct a recombinant receptor protein expression system, and use the same expression system. It can be used for development of receptor binding assay system, screening of drug candidate compounds, drug design based on comparison with structurally similar ligands / receptors, probe for gene diagnosis, preparation of PCR primer, gene therapy, etc. . In particular, elucidation of the structure and properties of G protein-coupled receptors will lead to the development of unique drugs that act on these systems.
【００９１】[0091]
【配列番号：１】 配列の長さ：３０６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Tyr Ser Phe Met Ala Gly Ser Ile Phe Ile Thr Ile Phe Gly Asn 1 5 10 15 Leu Ala Met Ile Ile Ser Ile Ser Tyr Phe Lys Gln Leu His Thr Pro 20 25 30 Thr Asn Phe Leu Ile Leu Ser Met Ala Ile Thr Asp Phe Leu Leu Gly 35 40 45 Phe Thr Ile Met Pro Tyr Ser Met Ile Arg Ser Val Glu Asn Cys Trp 50 55 60 Tyr Phe Gly Leu Thr Phe Cys Lys Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp Leu Met 65 70 75 80 Leu Ser Ile Thr Ser Ile Phe His Leu Cys Ser Val Ala Ile Asp Arg 85 90 95 Phe Tyr Ala Ile Cys Tyr Pro Leu Leu Tyr Ser Thr Lys Ile Thr Ile 100 105 110 Pro Val Ile Lys Arg Leu Leu Leu Leu Cys Trp Ser Val Pro Gly Ala 115 120 125 Phe Ala Phe Gly Val Val Phe Ser Glu Ala Tyr Ala Asp Gly Ile Glu 130 135 140 Gly Tyr Asp Ile Leu Val Ala Cys Ser Ser Ser Cys Pro Val Met Phe 145 150 155 160 Asn Lys Leu Trp Gly Thr Thr Leu Phe Met Ala Gly Phe Phe Thr Pro 165 170 175 Gly Ser Met Met Val Gly Ile Tyr Gly Lys Ile Phe Ala Val Ser Arg 180 185 190 Lys His Ala His Ala Ile Asn Asn Leu Arg Glu Asn Gln Asn Asn Gln 195 200 205 Val Lys Lys Asp Lys Lys Ala Ala Lys Thr Leu Gly Ile Val Ile Gly 210 215 220 Val Phe Leu Leu Cys Trp Phe Pro Cys Phe Phe Thr Ile Leu Leu Asp 225 230 235 240 Pro Phe Leu Asn Phe Ser Thr Pro Val Val Leu Phe Asp Ala Leu Thr 245 250 255 Trp Phe Gly Tyr Phe Asn Ser Thr Cys Asn Pro Leu Ile Tyr Gly Phe 260 265 270 Phe Tyr Pro Trp Phe Arg Arg Ala Leu Lys Tyr Ile Leu Leu Gly Lys 275 280 285 Ile Phe Ser Ser Cys Phe His Asn Thr Ile Leu Cys Met Gln Lys Glu 290 295 300 Ser Glu 305[SEQ ID NO: 1] Sequence length: 306 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide sequence Met Tyr Ser Phe Met Ala Gly Ser Ile Phe Ile Thr Ile Phe Gly Asn 1 5 10 15 Leu Ala Met Ile Ile Ser Ile Ser Tyr Phe Lys Gln Leu His Thr Pro 20 25 30 Thr Asn Phe Leu Ile Leu Ser Met Ala Ile Thr Asp Phe Leu Leu Gly 35 40 45 Phe Thr Ile Met Pro Tyr Ser Met Ile Arg Ser Val Glu Asn Cys Trp 50 55 60 Tyr Phe Gly Leu Thr Phe Cys Lys Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp Leu Met 65 70 75 80 Leu Ser Ile Thr Ser Ile Phe His Leu Cys Ser Val Ala Ile Asp Arg 85 90 95 Phe Tyr Ala Ile Cys Tyr Pro Leu Leu Tyr Ser Thr Lys Ile Thr Ile 100 105 110 Pro Val Ile Lys Arg Leu Leu Leu Leu Cys Trp Ser Val Pro Gly Ala 115 120 125 Phe Ala Phe Gly Val Val Phe Ser Glu Ala Tyr Ala Asp Gly Ile Glu 130 135 140 Gly Tyr Asp Ile Leu Val Ala Cys Ser Ser Ser Cys Pro Val Met Phe 145 150 155 160 Asn Lys Leu Trp Gly Thr Thr Leu Phe Met Ala Gly Phe Phe Thr Pro 165 170 175 Gly Ser Met Met Val Gly Il e Tyr Gly Lys Ile Phe Ala Val Ser Arg 180 185 190 Lys His Ala His Ala Ile Asn Asn Leu Arg Glu Asn Gln Asn Asn Gln 195 200 205 Val Lys Lys Asp Lys Lys Ala Ala Lys Thr Leu Gly Ile Val Ile Gly 210 215 220 Val Phe Leu Leu Cys Trp Phe Pro Cys Phe Phe Thr Ile Leu Leu Asp 225 230 235 240 Pro Phe Leu Asn Phe Ser Thr Pro Val Val Leu Phe Asp Ala Leu Thr 245 250 255 Trp Phe Gly Tyr Phe Asn Ser Thr Cys Asn Pro Leu Ile Tyr Gly Phe 260 265 270 Phe Tyr Pro Trp Phe Arg Arg Ala Leu Lys Tyr Ile Leu Leu Gly Lys 275 280 285 Ile Phe Ser Ser Cys Phe His Asn Thr Ile Leu Cys Met Gln Lys Glu 290 295 300 Ser Glu 305
【００９２】[0092]
【配列番号：２】 配列の長さ：９１８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATGTATTCAT TTATGGCAGG ATCCATATTC ATCACAATAT TTGGCAATCT TGCCATGATA 60 ATTTCCATTT CCTACTTCAA GCAGCTTCAC ACACCAACCA ACTTCCTCAT CCTCTCCATG 120 GCCATCACTG ATTTCCTCCT GGGATTCACC ATCATGCCAT ATAGTATGAT CAGATCGGTG 180 GAGAACTGCT GGTATTTTGG GCTTACATTT TGCAAGATTT ATTATAGTTT TGACCTGATG 240 CTTAGCATAA CATCCATTTT TCATCTTTGC TCAGTGGCCA TTGATAGATT TTATGCTATA 300 TGTTACCCAT TACTTTATTC CACCAAAATA ACTATTCCAG TCATTAAAAG ATTGCTACTT 360 CTATGTTGGT CGGTCCCTGG AGCATTTGCC TTCGGGGTGG TCTTCTCAGA GGCCTATGCA 420 GATGGAATAG AGGGCTATGA CATCTTGGTT GCTTGTTCCA GTTCCTGCCC AGTGATGTTC 480 AACAAGCTAT GGGGGACCAC CTTGTTTATG GCAGGTTTCT TCACTCCTGG GTCTATGATG 540 GTGGGGATTT ATGGCAAAAT TTTTGCAGTA TCCAGAAAAC ATGCTCATGC CATCAATAAC 600 TTGCGAGAAA ATCAAAATAA TCAAGTGAAG AAAGACAAAA AAGCTGCCAA AACTTTAGGA 660 ATAGTGATAG GAGTTTTCTT ATTATGTTGG TTTCCTTGTT TCTTCACAAT TTTATTGGAT 720 CCCTTTTTGA ACTTCTCTAC TCCTGTAGTT TTGTTTGATG CCTTGACATG GTTTGGCTAT 780 TTTAACTCCA CATGTAATCC GTTAATATAT GGTTTCTTCT ATCCCTGGTT TCGCAGAGCA 840 CTGAAGTACA TTTTGCTAGG TAAAATTTTC AGCTCATGTT TCCATAATAC TATTTTGTGT 900 ATGCAAAAAG AAAGTGAG 918[SEQ ID NO: 2] Sequence length: 918 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Linear Sequence type: cDNA Characterization method: S sequence ATGTATTCAT TTATGGCAGG ATCCATATTC ATCACAATAT TTGGCAATCT TGCCATGATA 60 ATTTCCATTT CCTACTTCAA GCAGCTTCAC ACACCAACCA ACTTCCTCAT CCTCTCCATG 120 GCCATCACTG ATTTCCTCCT GGGATTCACC ATCATGCCAT ATAGTATGAT CAGATCGGTG 180 GAGAACTGCT GGTATTTTGG GCTTACATTT TGCAAGATTT ATTATAGTTT TGACCTGATG 240 CTTAGCATAA CATCCATTTT TCATCTTTGC TCAGTGGCCA TTGATAGATT TTATGCTATA 300 TGTTACCCAT TACTTTATTC CACCAAAATA ACTATTCCAG TCATTAAAAG ATTGCTACTT 360 CTATGTTGGT CGGTCCCTGG AGCATTTGCC TTCGGGGTGG TCTTCTCAGA GGCCTATGCA 420 GATGGAATAG AGGGCTATGA CATCTTGGTT GCTTGTTCCA GTTCCTGCCC AGTGATGTTC 480 AACAAGCTAT GGGGGACCAC CTTGTTTATG GCAGGTTTCT TCACTCCTGG GTCTATGATG 540 GTGGGGATTT ATGGCAAAAT TTTTGCAGTA TCCAGAAAAC ATGCTCATGC CATCAATAAC 600 TTGCGAGAAA ATCAAAATAA TCAAGTGAAG AAAGACAAAA AAGCTGCCAA AACTTTAGGA 660 ATAGTGATAG GATTTTTC TTCCTTGTT TCTTCACAAT TTTATTGGAT 720 CCCTTTTTGA ACTTCTCTAC TCCTGTAGTT TTGTTTGATG CCTTGACATG GTTTGGCTAT 780 TTTAACTCCA CATGTAATCC GTTAATATAT GGTTTCTTCTATCCTTATTTTGATCATTTTTTGCCATAGAGTT TCGCAGAGTA 840 CTGAAGTACA TTTTCCATAGAG
【００９３】[0093]
【配列番号：３】 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＴＣＣＴＣＣＴＧＧＧ ＡＣＴＣＡＴＣＡＴＣ ＡＴＧ
Ｃ ２４[SEQ ID NO: 3] Sequence length: 24 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence TCCTCCTGGG ACTCATCATC ATG
C 24
【００９４】[0094]
【配列番号：４】 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＡＴＣＣＣＣＡＣＣ ＡＴＣＡＣＡＧＡＣＣ ＣＡＧ
ＧＡＧＴＧＡＡ ＧＡ ３２[SEQ ID NO: 4] Sequence length: 32 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence AATCCCCACC ATCACAGACC CAG
GAGTGAA GA 32
【配列番号：５】 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AACCTGCCAT AAACAAGGTG GTCC 24[SEQ ID NO: 5] Sequence length: 24 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence AACCTGCCAT AAACAAGGTG GTCC 24
【００９６】[0096]
【配列番号：６】 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATTCCATCTG CATAGGCCTC TGAG 24[SEQ ID NO: 6] Sequence length: 24 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence ATTCCATCTG CATAGGCCTC TGAG 24
【００９７】[0097]
【配列番号：７】 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGTGTCCGAC TTATGCCCGA GAAGATGTTG AGCAA 35[SEQ ID NO: 7] Sequence length: 35 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence GGTGTCCGAC TTATGCCCGA GAAGATGTTG AGCAA 35
【００９８】[0098]
【配列番号：８】 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTATGATCAG ATCGGTGGAG AACTGCTGG 29[SEQ ID NO: 8] Sequence length: 29 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence GTATGATCAG ATCGGTGGAG AACTGCTGG 29
【００９９】[0099]
【配列番号：９】 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCTATGTTGG TCGGTCCCTG GAGCATTTG 29[SEQ ID NO: 9] Sequence length: 29 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence TCTATGTTGG TCGGTCCCTG GAGCATTTG 29
【０１００】[0100]
【配列番号：１０】 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGATCTCGAG GTGTCCGAGT GGCTATGTAT 30[SEQ ID NO: 10] Sequence length: 30 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence AGATCTCGAG GTGTCCGAGT GGCTATGTAT 30
【０１０１】[0101]
【配列番号：１１】 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCCTACTCAC TTTCTTTTTG C 21[SEQ ID NO: 11] Sequence length: 21 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence GCCTACTCAC TTTCTTTTTG C 21
【０１０２】[0102]
【配列番号：１２】 配列の長さ：２２５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Val Thr Asp Phe Leu Leu Gly Leu Ile Ile Met Pro Tyr Ser Met 1 5 10 15 Val Arg Ser Val Glu Asn Cys Trp Tyr Phe Gly Leu Ala Phe Cys Lys 20 25 30 Ile His Tyr Ser Phe Asp Leu Met Leu Ser Ile Thr Ser Ile Phe His 35 40 45 Leu Cys Ser Val Ala Ile Asp Arg Phe Tyr Ala Ile Cys Tyr Pro Leu 50 55 60 Arg Tyr Ser Thr Lys Met Thr Ile Pro Val Ile Lys Arg Leu Val Phe 65 70 75 80 Leu Cys Trp Ser Val Pro Gly Ala Phe Ala Phe Gly Val Val Phe Ser 85 90 95 Glu Ala Tyr Ala Asp Gly Ile Glu Gly Tyr Asp Thr Leu Val Ala Cys 100 105 110 Ser Ser Ser Cys Pro Val Thr Phe Asn Lys Leu Trp Gly Thr Thr Leu 115 120 125 Phe Met Ala Gly Phe Phe Thr Pro Gly Ser Val Met Val Gly Ile Tyr 130 135 140 Gly Lys Ile Phe Ala Val Ser Arg Lys His Ala Leu Ala Ile Asn Asn 145 150 155 160 Thr Ser Glu Asn Gln Asn Thr Gln Met Lys Lys Asp Thr Lys Ala Ala 165 170 175 Lys Thr Leu Gly Ile Val Met Gly Val Phe Leu Leu Cys Trp Phe Pro 180 185 190 Cys Phe Phe Thr Ile Leu Leu Asp Pro Phe Leu Asn Phe Ser Thr Pro 195 200 205 Ala Val Leu Phe Asp Ala Leu Thr Trp Phe Gly Tyr Phe Asn Ser Thr 210 215 220 Cys[SEQ ID NO: 12] Sequence length: 225 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide sequence Ala Val Thr Asp Phe Leu Leu Gly Leu Ile Ile Met Pro Tyr Ser Met 1 5 10 15 Val Arg Ser Val Glu Asn Cys Trp Tyr Phe Gly Leu Ala Phe Cys Lys 20 25 30 Ile His Tyr Ser Phe Asp Leu Met Leu Ser Ile Thr Ser Ile Phe His 35 40 45 Leu Cys Ser Val Ala Ile Asp Arg Phe Tyr Ala Ile Cys Tyr Pro Leu 50 55 60 Arg Tyr Ser Thr Lys Met Thr Ile Pro Val Ile Lys Arg Leu Val Phe 65 70 75 80 Leu Cys Trp Ser Val Pro Gly Ala Phe Ala Phe Gly Val Val Phe Ser 85 90 95 Glu Ala Tyr Ala Asp Gly Ile Glu Gly Tyr Asp Thr Leu Val Ala Cys 100 105 110 Ser Ser Ser Cys Pro Val Thr Phe Asn Lys Leu Trp Gly Thr Thr Leu 115 120 125 Phe Met Ala Gly Phe Phe Thr Pro Gly Ser Val Met Val Gly Ile Tyr 130 135 140 Gly Lys Ile Phe Ala Val Ser Arg Lys His Ala Leu Ala Ile Asn Asn 145 150 155 160 Thr Ser Glu Asn Gln Asn Thr Gln Met Lys Lys Asp Thr Lys Ala Ala 165 170 175 Lys Thr Leu Gly Ile Val Met Gly Val Phe Leu Leu Cys Trp Phe Pro 180 185 190 Cys Phe Phe Thr Ile Leu Leu Asp Pro Phe Leu Asn Phe Ser Thr Pro 195 200 205 Ala Val Leu Phe Asp Ala Leu Thr Trp Phe Gly Tyr Phe Asn Ser Thr 210 215 220 Cys
【０１０３】[0103]
【配列番号：１３】 配列の長さ：６７５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GCAGTCACCG ACTTCCTCCT GGGACTCATC ATCATGCCAT ACAGTATGGT CAGATCAGTG 60 GAGAACTGCT GGTATTTTGG CCTTGCATTC TGCAAGATTC ATTATAGTTT TGACTTGATG 120 CTTAGCATAA CATCCATTTT CCATCTTTGC TCAGTGGCCA TTGATAGATT TTATGCTATC 180 TGTTACCCTT TAAGATATTC CACCAAAATG ACGATCCCAG TGATTAAACG GTTGGTTTTT 240 CTCTGCTGGT CAGTCCCTGG AGCCTTTGCA TTTGGCGTGG TTTTCTCGGA AGCCTATGCA 300 GATGGAATAG AAGGCTATGA TACTTTGGTT GCTTGTTCCA GCTCCTGCCC AGTGACGTTC 360 AACAAGCTCT GGGGGACCAC CTTGTTTATG GCAGGTTTCT TCACTCCTGG GTCTGTGATG 420 GTGGGGATTT ATGGCAAAAT TTTTGCTGTA TCCAGAAAAC ATGCTCTTGC AATTAACAAC 480 ACATCAGAAA ACCAAAATAC TCAAATGAAG AAAGACACAA AAGCAGCCAA AACTTTAGGA 540 ATAGTGATGG GCGTTTTTTT ATTATGTTGG TTTCCCTGTT TCTTCACGAT TTTGTTGGAT 600 CCCTTTTTGA ACTTCTCAAC CCCTGCAGTT TTATTTGATG CCTTGACATG GTTTGGCTAT 660 TTTAACTCCA CATGT 675[SEQ ID NO: 13] Sequence length: 675 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Linear Sequence type: cDNA Characterization method: S sequence GCAGTCACCG ACTTCCTCCT GGGACTCATC ATCATGCCAT ACAGTATGGT CAGATCAGTG 60 GAGAACTGCT GGTATTTTGG CCTTGCATTC TGCAAGATTC ATTATAGTTT TGACTTGATG 120 CTTAGCATAA CATCCATTTT CCATCTTTGC TCAGTGGCCA TTGATAGATT TTATGCTATC 180 TGTTACCCTT TAAGATATTC CACCAAAATG ACGATCCCAG TGATTAAACG GTTGGTTTTT 240 CTCTGCTGGT CAGTCCCTGG AGCCTTTGCA TTTGGCGTGG TTTTCTCGGA AGCCTATGCA 300 GATGGAATAG AAGGCTATGA TACTTTGGTT GCTTGTTCCA GCTCCTGCCC AGTGACGTTC 360 AACAAGCTCT GGGGGACCAC CTTGTTTATG GCAGGTTTCT TCACTCCTGG GTCTGTGATG 420 GTGGGGATTT ATGGCAAAAT TTTTGCTGTA TCCAGAAAAC ATGCTCTTGC AATTAACAAC 480 ACATCAGAAA ACCAAAATAC TCAAATGAAG AAAGACACAA AAGCAGCCAA AACTTTAGGA 540 ATAGTGATGG GCGTTTTTTT ATTATGTTGG TTTCCCTGTT TCTTCACGAT TTTGTTGGAT 600 CCCTTTTTGA ACTTCTCAAC CCCTGCAGTT TTATTTGATG CCTTGACATG GTTTGGCTAT 660 TTTA675CCCAT
【０１０４】[0104]
【配列番号：１４】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＳはＧまたはＣを示し、ＹはＣまたはＴを
示し、ＷはＡまたはＴを示し、ＨはＡ、ＣまたはＴを示
し、ＮはＩを示す。 配列 GYCACCAACN WSTTCATCCT SWNHCTG 27[SEQ ID NO: 14] Sequence length: 27 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence characteristics: S indicates G or C, Y represents C or T, W represents A or T, H represents A, C or T, and N represents I. Sequence GYCACCAACN WSTTCATCCT SWNHCTG 27
【０１０５】[0105]
【配列番号：１５】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＲはＡまたはＧを示し、ＳはＧまたはＣを
示し、ＮはＩを示す。 配列 ASNSANRAAG SARTAGANGA NRGGRTT 27[SEQ ID NO: 15] Sequence length: 27 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence characteristics: R represents A or G, S represents G or C, and N represents I. Array ASNSANRAAG SARTAGANGA NRGGRTT 27
〔図１〕実施例６で得られた、本発明のヒト型Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質のアミノ酸配列と、それをコー
ドするＤＮＡの塩基配列を示す。 〔図２〕実施例６で得られた、本発明のヒト型Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質の疎水性プロットを示す。 〔図３〕実施例６で得られた、本発明のヒト型Ｇ蛋白質
共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡ断片の塩
基配列（上段に示す）と、参考例４で得られたウサギ胃
腸幽門部平滑筋由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃ
ＤＮＡ断片の塩基配列（下段に示す）とを示す。星印は
両者が同じ塩基配列である場合を示す。 〔図４〕参考例４で得られた、ウサギ胃幽門部平滑筋よ
りＰＣＲ増幅によって得た新規レセプター蛋白質ｃＤＮ
ＡクローンｐｕＤ−ＢＬ５に含まれるウサギ胃幽門部平
滑筋由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片
の塩基配列およびそれにコードされるアミノ酸配列を示
す。ＰＣＲ増幅に用いた合成プライマーに相当する部分
は除かれている。 〔図５〕参考例４で得られた、図４に示したアミノ酸配
列をもとに作成した、ｐｕＤ−ＢＬ５に含まれるウサギ
胃幽門部平滑筋由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃ
ＤＮＡ断片にコードされる蛋白質の疎水性プロットを示
す。この図からＴＭ２〜ＴＭ７で示す疎水性ドメインの
存在が示唆される。FIG. 1 shows the amino acid sequence of the human G protein-coupled receptor protein of the present invention obtained in Example 6 and the nucleotide sequence of DNA encoding the same. FIG. 2 shows a hydrophobicity plot of the human G protein-coupled receptor protein of the present invention obtained in Example 6. [Fig. 3] Nucleotide sequence of the cDNA fragment encoding the human G protein-coupled receptor protein of the present invention (shown in the upper row) obtained in Example 6 and the rabbit gastrointestinal pyloric smoothness obtained in Reference Example 4 Muscle-derived G protein-coupled receptor protein c
And the base sequence of the DNA fragment (shown in the lower row). The asterisk indicates the case where both have the same base sequence. [FIG. 4] Novel receptor protein cdN obtained by PCR amplification from rabbit gastric antrum smooth muscle obtained in Reference Example 4
1 shows the nucleotide sequence of a rabbit gastric pyloric smooth muscle-derived G protein-coupled receptor protein cDNA fragment contained in A clone puD-BL5 and the amino acid sequence encoded thereby. The portion corresponding to the synthetic primer used for PCR amplification is removed. [FIG. 5] Rabbit gastric pyloric smooth muscle-derived G protein-coupled receptor protein c contained in puD-BL5 prepared based on the amino acid sequence shown in FIG. 4 obtained in Reference Example 4
1 shows a hydrophobicity plot of a protein encoded by a DNA fragment. This figure suggests the existence of the hydrophobic domains TM2 to TM7.
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/02 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 // Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）Continuation of front page (51) Int.Cl.6 Identification number Office reference number FI Technical display location C12P 21/08 C12P 21/08 C12Q 1/02 7823-4B C12Q 1/02 G01N 33/566 G01N 33/566 / / A61K 39/395 A61K 39/395 D (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (C12P 21/08 C12R 1:91)
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP8050678AJPH09238686A (en) | 1996-03-07 | 1996-03-07 | New g-protein conjugated type receptor protein, its production and use |
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| JPH09238686Atrue JPH09238686A (en) | 1997-09-16 |
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| JP8050678AWithdrawnJPH09238686A (en) | 1996-03-07 | 1996-03-07 | New g-protein conjugated type receptor protein, its production and use |
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