【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト抗体の酵素免疫測
定法及びこの方法に使用する試薬に関する。本発明は、
特に検体中に存在することがあるリウマチ因子の影響を
受けることなく、検体中のヒト抗体を正確に且つ容易に
定量することを可能にするヒト抗体の酵素免疫測定法及
びこの方法に使用する試薬に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an enzyme immunoassay method for human antibodies and a reagent used in this method. The present invention
Particularly, an enzyme immunoassay method for a human antibody that enables accurate and easy quantification of a human antibody in a sample without being affected by a rheumatoid factor that may be present in the sample, and a reagent used in this method Regarding
【０００２】[0002]
【従来の技術】最近、幾つかのウイルスによる感染の有
無を調べるために、血液（血清又は血漿）などの被検液
中のウイルス特異抗原に対するヒト抗体（免疫グロブリ
ン）の酵素免疫測定法（エンザイムイムノアッセイ：Ｅ
ＩＡ）による測定が行われるようになっており、そのた
めの測定用キットが市販されている。たとえば、発熱、
リンパ節腫脹、咽頭痛、肝脾腫等の臨床症状を表わす伝
染性単核症は、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢウ
イルス）の感染により起こされるが、ＥＢウイルス以外
の病原体により類似の症状が起きることがあり、伝染性
単核症の診断の際にはＥＢウイルスの感染の有無を調べ
ることが必要になる。2. Description of the Related Art Recently, an enzyme immunoassay (enzyme immunoassay) for a human antibody (immunoglobulin) against a virus-specific antigen in a test liquid such as blood (serum or plasma) has been performed in order to examine the presence or absence of infection by several viruses. Immunoassay: E
Measurement by IA) has been carried out, and measurement kits therefor are commercially available. For example, fever,
Infectious mononucleosis, which indicates clinical symptoms such as lymphadenopathy, sore throat, and hepatosplenomegaly, is caused by infection with Epstein-Barr virus (EB virus), but similar symptoms may be caused by pathogens other than EB virus. Therefore, it is necessary to examine the presence or absence of EB virus infection when diagnosing infectious mononucleosis.
【０００３】ＥＢウイルス感染の検査は、一般にＥＢウ
イルス特異抗原に対するヒト抗体の血液中の含有量を測
定することによって行われる。ＥＢウイルス特異抗原と
しては、ＶＣＡ（Viral Capsid Antigens ）、ＥＡ（Ea
rly Antigens）、およびＥＢＮＡ（EBV associated Nuc
lear Antigens ）が知られており、それぞれの特異抗原
に対するＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体が存在するところ
から、これらの抗体の中から適宜選択した抗体（例え
ば、ＶＣＡ−ＩｇＭ抗体、ＶＣＡ−ＩｇＧ抗体、ＥＡ−
ＩｇＭ抗体、あるいはＥＢＮＡ−ＩｇＧ抗体）を対象と
して酵素免疫測定が行われている。Testing for EB virus infection is generally carried out by measuring the blood content of human antibodies against EB virus-specific antigens. EB virus-specific antigens include VCA (Viral Capsid Antigens), EA (Ea
rly Antigens) and EBNA (EBV associated Nuc)
Lear Antigens) are known and there are IgM antibodies and IgG antibodies against their respective specific antigens. Therefore, antibodies appropriately selected from these antibodies (eg, VCA-IgM antibody, VCA-IgG antibody, EA-
The enzyme immunoassay has been carried out for IgM antibody or EBNA-IgG antibody).
【０００４】なお、ＥＢウイルス特異抗原に対するＩｇ
Ｍ抗体は時間の経過と共に比較的短時間の内に消失する
が、ＥＢウイルス特異抗原に対するＩｇＧ抗体はＥＢウ
イルス感染後において長期にわたって残留することが知
られている。従って、この特性の相違を利用して、検体
中のＩｇＧ抗体とＩｇＭ抗体の両者を個別に測定するこ
とにより、ＥＢウイルス感染のステージを判定すること
が可能になる。Ig against EB virus-specific antigen
It is known that the M antibody disappears within a relatively short time with the passage of time, but the IgG antibody against the EB virus-specific antigen remains for a long time after infection with the EB virus. Therefore, it is possible to determine the stage of EB virus infection by separately measuring both the IgG antibody and the IgM antibody in the sample by utilizing this difference in characteristics.
【０００５】次に、血液中のウイルス特異抗原に対する
ヒト抗体の酵素免疫測定法の代表的な方法のひとつであ
る間接法ＥＩＡによる測定原理を添付する図面を参照し
て説明する。Next, the principle of measurement by the indirect method EIA, which is one of the typical methods for enzyme immunoassay of human antibodies against virus-specific antigens in blood, will be described with reference to the accompanying drawings.
【０００６】図１は検体中のＶＣＡ−ＩｇＧ抗体の測定
原理を示す模式図である。マイクロプレートに固相化さ
れたＶＣＡ抗原に、検体希釈液で希釈した検体を接触さ
せ反応させると、検体中にＶＣＡ−ＩｇＧ抗体が存在し
ていた場合には、そのＶＣＡ−ＩｇＧ抗体がＶＣＡ抗原
に結合する。この結合体を洗浄した後、標識酵素Ｌで標
識した酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体を接触させると、酵素
標識抗ヒトＩｇＧ抗体は、ＶＣＡ抗原に結合したＶＣＡ
−ＩｇＧ抗体と反応して免疫複合体が形成される。これ
を洗浄して未反応の酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体を除去し
た後、基質を含有する液を接触させて酵素反応を行わ
せ、吸光度を測定することにより、検体中のＶＣＡ−Ｉ
ｇＧ抗体（即ち、ＥＢウイルスに対するヒト抗体）が定
量される。FIG. 1 is a schematic diagram showing the principle of measurement of VCA-IgG antibody in a sample. When a sample diluted with a sample diluent is brought into contact with a VCA antigen immobilized on a microplate to react with the VCA-IgG antibody in the sample, the VCA-IgG antibody is used as the VCA antigen. Bind to. After washing the conjugate, contact with an enzyme-labeled anti-human IgG antibody labeled with a labeling enzyme L causes the enzyme-labeled anti-human IgG antibody to bind to the VCA antigen bound to VCA.
An immune complex is formed in reaction with the IgG antibody. After washing this to remove unreacted enzyme-labeled anti-human IgG antibody, a liquid containing a substrate is brought into contact with the solution to carry out an enzymatic reaction, and the absorbance is measured to obtain VCA-I in the sample.
GG antibody (ie, human antibody against EB virus) is quantified.
【０００７】次に、図２は検体中のＶＣＡ−ＩｇＭ抗体
の測定原理を示す模式図である。マイクロプレートに固
相化されたＶＣＡ抗原に、検体希釈液で希釈した検体を
接触させて反応させると、検体中にＶＣＡ−ＩｇＭ抗体
が存在していた場合には、そのＶＣＡ−ＩｇＭ抗体がＶ
ＣＡ抗原に結合する。この結合体を洗浄したのち、標識
酵素Ｌで標識した酵素標識抗ヒトＩｇＭ抗体を接触させ
ると、酵素標識抗ヒトＩｇＭ抗体はＶＣＡ抗原に結合し
たＶＣＡ−ＩｇＭ抗体と反応して免疫複合体が形成され
る。これを更に洗浄して未反応の酵素標識抗ヒトＩｇＭ
抗体を除去した後、基質を含有する液を接触させて酵素
反応を行わせ、吸光度を測定することによって、検体中
のＶＣＡ−ＩｇＭ抗体（即ち、ＥＢウイルスに対するヒ
ト抗体）が定量できる。Next, FIG. 2 is a schematic diagram showing the principle of measurement of VCA-IgM antibody in a sample. When a sample diluted with a sample diluent is brought into contact with a VCA antigen immobilized on a microplate and reacted, when the VCA-IgM antibody is present in the sample, the VCA-IgM antibody is converted to VCA-IgM antibody.
It binds to the CA antigen. After washing this conjugate, the enzyme-labeled anti-human IgM antibody labeled with the labeling enzyme L is contacted, and the enzyme-labeled anti-human IgM antibody reacts with the VCA-IgM antibody bound to the VCA antigen to form an immune complex. To be done. This was further washed to obtain unreacted enzyme-labeled anti-human IgM
After removing the antibody, a liquid containing a substrate is brought into contact with the solution to cause an enzymatic reaction, and the absorbance is measured, whereby the VCA-IgM antibody (that is, a human antibody against the EB virus) in the sample can be quantified.
【０００８】ところで、検体中にリウマチ因子（ＲＦ）
が存在すると、ＶＣＡ−ＩｇＭ抗体の測定に於いて図３
に示すような免疫複合体が形成される反応が生じる。す
なわち、ＲＦは遊離のＩｇＧとは反応しないが、抗原に
結合したＩｇＧと結合する性質を有する。従って、ＶＣ
Ａ−ＩｇＭ抗体測定用の検体中にＲＦとＶＣＡ−ＩｇＧ
抗体が共に存在していると、先ずＶＣＡ−ＩｇＧ抗体が
ＶＣＡ抗原に結合し、このＶＣＡ抗原に結合したＶＣＡ
−ＩｇＧ抗体にＲＦが結合する。ＲＦはＩｇＭ性の自己
抗体であるので、その後添加する酵素標識抗ヒトＩｇＭ
抗体はＶＣＡ−ＩｇＧ抗体に結合したＲＦとも反応して
図３に示す免疫複合体を形成する。By the way, rheumatoid factor (RF) is contained in the sample.
In the presence of H., in the measurement of the VCA-IgM antibody shown in FIG.
A reaction occurs in which an immune complex is formed as shown in. That is, RF does not react with free IgG, but has the property of binding to IgG bound to an antigen. Therefore, VC
RF and VCA-IgG in the sample for A-IgM antibody measurement
When the antibodies are present together, the VCA-IgG antibody first binds to the VCA antigen, and the VCA bound to this VCA antigen.
-RF binds to IgG antibody. Since RF is an IgM-type autoantibody, enzyme-labeled anti-human IgM to be added thereafter is used.
The antibody also reacts with RF bound to the VCA-IgG antibody to form the immune complex shown in FIG.
【０００９】すなわち、図２に示す測定原理によりＶＣ
Ａ−ＩｇＭ抗体を測定する際には、ＶＣＡ−ＩｇＭ抗体
に結合した酵素標識抗ヒトＩｇＭ抗体の量を測定するの
であるが、検体中にＲＦが含まれていると、測定される
酵素標識抗ヒトＩｇＭ抗体の量には、図３に示すように
ＶＣＡ抗原に結合したＶＣＡ−ＩｇＧ抗体と結合したＲ
Ｆに付いた酵素標識抗ヒトＩｇＭ抗体の量も含まれるこ
とになる。即ち、酵素標識抗ヒトＩｇＭ抗体の量の測定
値は、ＶＣＡ抗原に結合したＶＣＡ−ＩｇＭ抗体の量と
ＶＣＡ抗原に結合したＶＣＡ−ＩｇＧ抗体の量との合計
量に対応するものとなり、検体中のＶＣＡ−ＩｇＭ抗体
の量を正確に測定することができなくなる。That is, according to the measurement principle shown in FIG.
When measuring the A-IgM antibody, the amount of the enzyme-labeled anti-human IgM antibody bound to the VCA-IgM antibody is measured. However, when the sample contains RF, the measured enzyme-labeled anti-human IgM antibody is measured. As shown in FIG. 3, the amount of human IgM antibody was determined by the amount of R bound to VCA-IgG antibody bound to VCA antigen.
The amount of enzyme-labeled anti-human IgM antibody attached to F will also be included. That is, the measured value of the amount of the enzyme-labeled anti-human IgM antibody corresponds to the total amount of the amount of the VCA-IgM antibody bound to the VCA antigen and the amount of the VCA-IgG antibody bound to the VCA antigen. The amount of the VCA-IgM antibody cannot be accurately measured.
【００１０】従って、図２に示す測定原理により検体中
のＶＣＡ−ＩｇＭ抗体を正確に定量するためには、その
測定の際に、検体中に含まれているかもしれないＲＦの
量を考慮しなければならない。Therefore, in order to accurately quantify the VCA-IgM antibody in the sample according to the measurement principle shown in FIG. 2, the amount of RF which may be contained in the sample should be taken into consideration during the measurement. There must be.
【００１１】なお、上記説明した検体中に含まれるリウ
マチ因子の非特異反応による測定データへの影響の問題
は、ＶＣＡ−ＩｇＭ抗体の測定の場合に限定されるもの
では無く、ＥＢウイルス特異抗原に対するＶＣＡ−Ｉｇ
Ｇ抗体、ＥＡ−ＩｇＭ抗体、ＥＢＮＡ−ＩｇＧ抗体の測
定の場合は勿論、その他のウイルス特異抗原に対するＩ
ｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体を含むどのようなヒト抗体測
定の場合にも生じる問題である。The problem of the influence of the non-specific reaction of the rheumatoid factor contained in the sample on the measurement data described above is not limited to the case of the measurement of the VCA-IgM antibody, and it is against the EB virus-specific antigen. VCA-Ig
In the case of measuring G antibody, EA-IgM antibody, EBNA-IgG antibody, of course, I against other virus-specific antigens
This is a problem that arises with any human antibody assay, including gM and IgG antibodies.
【００１２】[0012]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、検体
中に含有されていることがあるリウマチ因子の影響を受
けることなく、検体中のヒト抗体（免疫グロブリン）の
量、特にＩｇＭの量、を正確に且つ容易に定量すること
が可能な酵素免疫測定法及びこの方法に使用する抗体の
酵素免疫測定用試薬を提供することにある。The object of the present invention is to obtain the amount of human antibody (immunoglobulin), particularly the amount of IgM, in a sample without being affected by the rheumatoid factor which may be contained in the sample. It is intended to provide an enzyme immunoassay method capable of accurately and easily quantifying, and a reagent for antibody enzyme immunoassay used in this method.
【００１３】[0013]
【課題を解決するための手段】本発明は、リウマチ因子
を含有する可能性があるヒト抗体含有検体の希釈溶液を
固相化抗原に接触させることにより、検体希釈溶液中の
当該抗原に対するヒト抗体を固相化抗原に結合させ、次
いで固相化抗原を洗浄して未結合抗体を除去した後、固
相化抗原に酵素標識抗ヒト抗体を作用させることによ
り、固相化抗原に結合したヒト抗体に酵素標識抗ヒト抗
体を結合させ、この結合した酵素標識抗ヒト抗体の酵素
活性を測定することによって検体中のヒト抗体を定量す
る酵素免疫測定法に於いて、固相化した抗原と接触させ
る前に、検体希釈溶液中にＩｇＧの変性物又はＩｇＧの
Ｆｃフラグメント（Ｆｃ分屑）の変性物を添加すること
を特徴とするヒト抗体の酵素免疫測定法にある。Means for Solving the Problems The present invention provides a human antibody against a human antibody containing a rheumatoid factor, which may contain a human antibody-containing sample, by contacting the diluted solution with the immobilized antigen. To the solid-phased antigen, and then washing the solid-phased antigen to remove unbound antibody, and then reacting the solid-phased antigen with an enzyme-labeled anti-human antibody to bind the human to the solid-phased antigen. In an enzyme-linked immunosorbent assay in which an enzyme-labeled anti-human antibody is bound to the antibody and the enzyme activity of the bound enzyme-labeled anti-human antibody is measured to determine the amount of human antibody in the sample, contact with the immobilized antigen is performed. The enzyme immunoassay method for human antibody is characterized in that a modified product of IgG or a modified product of Fc fragment (Fc fraction) of IgG is added to the diluted solution of the sample before the treatment.
【００１４】本発明はまた、検体中に含まれるヒト抗体
を定量する酵素免疫測定法に使用するための検体希釈用
試薬であって、ＩｇＧの変性物またはＩｇＧのＦｃフラ
グメントの変性物を含有することを特徴とする検体希釈
用試薬にもある。The present invention is also a reagent for diluting a sample for use in an enzyme immunoassay for quantifying human antibodies contained in a sample, which contains a modified product of IgG or a modified product of Fc fragment of IgG. There is also a reagent for diluting a specimen, which is characterized in that
【００１５】本発明はまた、それぞれ分離した状態で、
抗原固相化プレート、ＩｇＧの変性物またはＩｇＧのＦ
ｃフラグメントの変性物を含有する検体希釈用試薬、酵
素標識抗ヒト抗体、及び標識酵素の基質からなることを
特徴とするヒト抗体定量用の酵素免疫測定法に使用する
ための試薬キットにもある。The invention also provides, in separate states,
Antigen-immobilized plate, IgG modified product or IgG F
There is also a reagent kit for use in an enzyme immunoassay for quantifying human antibodies, which comprises a reagent for diluting a sample containing a modified product of c fragment, an enzyme-labeled anti-human antibody, and a substrate for a labeled enzyme. .
【００１６】本発明の好適な態様は下記の通りである。 （１）固定化抗原がエプスタイン・バールウイルス特異
抗原であって、ヒト抗体が該エプスタイン・バールウイ
ルス特異抗原に対する抗体である上記の酵素免疫測定
法。The preferred embodiments of the present invention are as follows. (1) The enzyme immunoassay method as described above, wherein the immobilized antigen is an Epstein-Barr virus-specific antigen and the human antibody is an antibody against the Epstein-Barr virus-specific antigen.
【００１７】（２）検体希釈用試薬が変性ヒト由来Ｉｇ
Ｇ含むものである。 （３）検体希釈用試薬が変性ヒト由来Ｆｃフラグメント
含むものである。(2) The specimen diluting reagent is denatured human-derived Ig
It includes G. (3) The sample diluting reagent contains a denatured human-derived Fc fragment.
【００１８】本発明の酵素免疫測定法は、検体の希釈溶
液を固相化した抗原と接触させる前に、検体の希釈溶液
にＩｇＧの変性物またはＩｇＧのＦｃフラグメントの変
性物を含有させることの他は、従来利用されている間接
法によるヒト抗体の酵素免疫測定法と同様である。The enzyme immunoassay method of the present invention comprises adding a modified product of IgG or a modified product of Fc fragment of IgG to the diluted solution of the sample before contacting the diluted solution of the sample with the immobilized antigen. Others are the same as the enzyme immunoassay methods for human antibodies by the indirect method that have been conventionally used.
【００１９】すなわち、間接法によるヒト抗体の酵素免
疫測定法は、前記の図２に示す測定原理に従った測定法
であり、固相化した抗原に検体の希釈溶液を接触させて
検体中に含有されるヒト抗体をこの抗原に結合させ、未
反応物質を洗浄除去した後、酵素標識抗ヒト抗体を作用
させて抗原に結合したヒト抗体に結合させ、これに基質
を加えて酵素反応を行わせ、ヒト抗体に結合した酵素標
識抗ヒト抗体の酵素活性を測定することにより検体中に
含有されるヒト抗体を定量する測定法である。本発明に
於いては、この酵素免疫測定法に於いて、検体の希釈溶
液を固相化した抗原と接触させる前に、検体の希釈溶液
にＩｇＧの変性物またはＩｇＧのＦｃフラグメントの変
性物を添加して、混合することを特徴とするものであ
る。That is, the enzyme immunoassay method for human antibodies by the indirect method is a measurement method according to the measurement principle shown in FIG. 2 described above. The contained human antibody is bound to this antigen, the unreacted substances are washed off, and the enzyme-labeled anti-human antibody is allowed to act to bind to the human antibody bound to the antigen, and a substrate is added to this to carry out the enzymatic reaction. In this method, the human antibody contained in the sample is quantified by measuring the enzyme activity of the enzyme-labeled anti-human antibody bound to the human antibody. In the present invention, in this enzyme-linked immunosorbent assay, before the diluted solution of the sample is brought into contact with the solid-phased antigen, a modified product of IgG or a modified product of Fc fragment of IgG is added to the diluted solution of the sample. It is characterized by adding and mixing.
【００２０】本発明により、検体の希釈溶液を固相化し
た抗原と接触させる前に、検体の希釈溶液にＩｇＧの変
性物またはそのＩｇＧのＦｃフラグメントの変性物を添
加して含有させておくと、検体中にリウマチ因子（Ｒ
Ｆ）が存在している場合には、ＲＦは先ずこのＩｇＧの
変性物またはＩｇＧのＦｃフラグメントの変性物と結合
する。その結果、検体中には遊離のＲＦは存在しなくな
るので、酵素免疫測定法によるヒト抗体（特にＩｇＭ抗
体）の測定結果は、検体中に存在するＲＦの量の影響を
全く受けることがなく、従って検体中に存在するヒト抗
体（特にＩｇＭ抗体）の量を正確に示すことになる。According to the present invention, a modified product of IgG or a modified product of Fc fragment of IgG thereof is added and contained in the diluted solution of the sample before the diluted solution of the sample is contacted with the immobilized antigen. , Rheumatoid factor (R
If F) is present, the RF will first bind to this IgG modification or IgG Fc fragment modification. As a result, since free RF does not exist in the sample, the measurement result of the human antibody (particularly IgM antibody) by the enzyme immunoassay is not affected by the amount of RF existing in the sample at all. Therefore, it accurately indicates the amount of human antibody (particularly IgM antibody) present in the sample.
【００２１】即ち、従来の間接法によるヒト抗体の酵素
免疫測定法により検体中のＶＣＡ−ＩｇＭ抗体の含有量
を測定する場合には、酵素標識抗ヒト抗体として一般に
酵素標識抗ヒトＩｇＭ抗体を使用するが、図１〜図３に
よって説明したように、検体に含まれるＲＦが固相化Ｖ
ＣＡ抗原に結合したＶＣＡ−ＩｇＧ抗体と反応すること
により、反応した酵素標識抗ヒトＩｇＭ抗体の測定対象
は、検体中のＶＣＡ−ＩｇＭ抗体の量とＲＦと反応した
検体中のＶＣＡ−ＩｇＧ抗体の量との合計量となり、検
体中のＶＣＡ−ＩｇＭ抗体の含有量が正確に測定できな
くなる。That is, when the content of VCA-IgM antibody in a sample is measured by the conventional indirect method for enzyme immunoassay of human antibody, enzyme-labeled anti-human IgM antibody is generally used as the enzyme-labeled anti-human antibody. However, as described with reference to FIGS. 1 to 3, the RF contained in the sample is solidified V
By reacting with the VCA-IgG antibody bound to the CA antigen, the reaction target of the enzyme-labeled anti-human IgM antibody reacted is the amount of VCA-IgM antibody in the sample and the VCA-IgG antibody in the sample reacted with RF. The total amount of the VCA-IgM antibody cannot be accurately measured.
【００２２】これに対して、本発明に従って、固相化し
た抗原と接触させる前に、検体の希釈溶液にＩｇＧの変
性物またはＩｇＧのＦｃフラグメントの変性物を添加し
て含有させておくと、検体中のＲＦがこの添加したＩｇ
Ｇ変性物またはＩｇＧのＦｃフラグメント変性物と結合
する。その結果、検体中には遊離のＲＦの存在しなくな
り、図３に示すようなＶＣＡ抗原−ＶＣＡ−ＩｇＧ抗体
−ＲＦ（ＩｇＭ）の免疫複合体が生成することは無い。
そして、添加した酵素標識抗ヒトＩｇＭ抗体はＶＣＡ抗
原に結合したＶＣＡ−ＩｇＭ抗体とのみ結合し、図２に
示すような測定目的の複合体のみが生成する。そして、
次に洗浄により未反応の酵素標識抗ヒトＩｇＭ抗体を除
去した後、公知の方法で酵素活性を測定することにより
得られる酵素標識抗ヒトＩｇＭ抗体の量は、検体中に存
在するＶＣＡ−ＩｇＭ抗体の量を正確に示すことにな
り、検体中のＲＦの量の影響を受けることはない。On the other hand, according to the present invention, if a modified product of IgG or a modified product of Fc fragment of IgG is added and contained in the diluted solution of the specimen before contacting with the immobilized antigen, The RF in the sample is the added Ig
It binds to the G modified product or the Fc fragment modified product of IgG. As a result, free RF does not exist in the sample, and the VCA antigen-VCA-IgG antibody-RF (IgM) immune complex as shown in FIG. 3 is not formed.
Then, the added enzyme-labeled anti-human IgM antibody binds only to the VCA-IgM antibody bound to the VCA antigen, and only the complex for the purpose of measurement as shown in FIG. 2 is produced. And
Next, the unreacted enzyme-labeled anti-human IgM antibody is removed by washing, and the enzyme activity is measured by a known method. The amount of the enzyme-labeled anti-human IgM antibody is the VCA-IgM antibody present in the sample. Is accurately indicated and is not affected by the amount of RF in the sample.
【００２３】なお、酵素標識抗ヒトＩｇＭ抗体を添加す
る際に、反応系内にＲＦとＩｇＧ変性物及び／又はＩｇ
ＧのＦｃフラグメント変性物との結合体が残っている
と、添加した酵素標識抗ヒトＩｇＭ抗体はこの結合体と
も反応することになるが、酵素免疫測定法では固相化抗
原に検体を接触させ反応させた後、未反応物質を洗浄除
去する操作が行われ、その洗浄の際にＲＦとＩｇＧ変性
物および／またはＩｇＧのＦｃフラグメント変性物との
結合体は反応系外に排除されるので、ＶＣＡ−ＩｇＭ抗
体の量の測定結果に影響を及ぼすことはない。When an enzyme-labeled anti-human IgM antibody is added, RF and IgG modified products and / or Ig are added to the reaction system.
If a conjugate of G with a modified product of Fc fragment remains, the added enzyme-labeled anti-human IgM antibody will also react with this conjugate, but in the enzyme immunoassay, the sample is brought into contact with the immobilized antigen. After the reaction, an operation of removing the unreacted substance by washing is performed, and in the washing, the conjugate of RF and the modified product of IgG and / or the modified product of Fc fragment of IgG is excluded from the reaction system. It does not affect the measurement results of the amount of VCA-IgM antibody.
【００２４】検体中のＶＣＡ−ＩｇＧ抗体の量を測定す
る場合にも、上記と同様にして検体中に含まれているＲ
Ｆの量の影響を除くことができる。すなわち、リウマチ
因子（ＲＦ）にはＩｇＧ型のものもあり、そのようなタ
イプのＲＦは、ＩｇＧの測定に影響を与える。このよう
な場合の操作でも、酵素標識抗ヒト抗体として酵素標識
抗ヒトＩｇＧ抗体を使用し、固相化ＶＣＡ抗原に結合し
たＶＣＡ−ＩｇＧ抗体に結合した酵素標識抗ヒトＩｇＧ
抗体の量を、酵素活性の測定により定量して、検体中に
含まれるＶＣＡ−ＩｇＧ抗体の定量を行う。すなわち、
検体中にＩｇＧ型のＲＦが含まれていると、そのＲＦ
が、固相化ＶＣＡ抗原に結合したＶＣＡ−ＩｇＧ抗体に
結合し、この固相化ＶＣＡ抗原に結合したＶＣＡ−Ｉｇ
Ｇ抗体に結合したＲＦ対しても酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗
体が結合する。その結果、反応した酵素標識抗ヒトＩｇ
Ｇ抗体の酵素活性の測定値には、固相化ＶＣＡ抗原に結
合したＶＣＡ−ＩｇＧ抗体の量に加えて、それに結合し
たＲＦの量も含まれることになり、検体中に含まれるＶ
ＣＡ−ＩｇＧ抗体の含有量の測定値に誤差を生じること
になる。When measuring the amount of VCA-IgG antibody in the sample, R contained in the sample is measured in the same manner as above.
The effect of the amount of F can be eliminated. That is, there is also an IgG type of rheumatoid factor (RF), and such type of RF affects the measurement of IgG. Also in the operation in such a case, the enzyme-labeled anti-human IgG antibody is used as the enzyme-labeled anti-human antibody, and the enzyme-labeled anti-human IgG bound to the VCA-IgG antibody bound to the immobilized VCA antigen is used.
The amount of the antibody is quantified by measuring the enzyme activity to quantify the VCA-IgG antibody contained in the sample. That is,
When IgG type RF is contained in the sample, the RF
Bind to the VCA-IgG antibody bound to the solid-phased VCA antigen and bind to the solid-phased VCA-antigen VCA-Ig.
The enzyme-labeled anti-human IgG antibody also binds to the RF bound to the G antibody. As a result, the reacted enzyme-labeled anti-human Ig
The measured value of the enzyme activity of the G antibody includes not only the amount of the VCA-IgG antibody bound to the immobilized VCA antigen, but also the amount of RF bound to the VCA-IgG antibody.
An error will occur in the measured value of the content of the CA-IgG antibody.
【００２５】しかしながら、本発明の方法により検体の
希釈溶液を固相化した抗原と接触させる前に、検体の希
釈溶液にＩｇＧの変性物またはＩｇＧのＦｃフラグメン
トの変性物を含有させておくと、検体中のＲＦ（ＩｇＧ
型）がこの含有させたＩｇＧ変性物またはＩｇＧのＦｃ
フラグメント変性物と結合し、前記と同様にして未反応
物質の洗浄除去操作の際に系外に除去されるので、検体
中に含まれるＲＦ（ＩｇＧ型）の量の影響を受けること
なく、検体中に存在するＶＣＡ−ＩｇＧの量を正確に測
定することができる。リウマチ因子中でＩｇＧ型のもの
含有量はＩｇＭ型のものの含有量に比較して少ないの
で、酵素免疫測定法によるＶＣＡ−ＩｇＧ抗体の測定値
に対しては、ＶＣＡ−ＩｇＭ抗体の測定値に比べてＲＦ
による影響は小さいが、検体中のＲＦによる誤差を除去
することが望ましいことは言うまでもない。However, before the diluted solution of the sample is brought into contact with the immobilized antigen by the method of the present invention, if the diluted solution of the sample contains a modified product of IgG or a modified product of Fc fragment of IgG, RF (IgG
Type) IgG modified product or Fc of IgG contained in this
Since it binds to the fragment-denatured product and is removed to the outside of the system during the washing and removal operation of the unreacted substance in the same manner as described above, the sample is not affected by the amount of RF (IgG type) contained in the sample. The amount of VCA-IgG present in it can be accurately measured. Since the content of IgG type rheumatoid factor is lower than that of IgM type, the measured value of VCA-IgG antibody by enzyme immunoassay is lower than that of VCA-IgM antibody. RF
Although there is little effect due to, it is needless to say that it is desirable to eliminate the error due to RF in the sample.
【００２６】なお、測定すべきヒト抗体として、ＶＣＡ
−ＩｇＭ抗体及びＶＣＡ−ＩｇＧ抗体を例として説明し
たが、本発明の酵素免疫測定法により測定することがで
きるヒト抗体はこれらに限定されるものではなく、例え
ば、ＥＢウイルス特異抗原に対するＶＣＡ−ＩｇＧ抗
体、ＥＡ−ＩｇＭ抗体、ＥＢＮＡ−ＩｇＧ抗体の測定の
場合は勿論、その他の広範囲の種々のウイルス特異抗原
に対するＩｇＭ抗体およびＩｇＧ抗体を含むどのような
ヒト抗体であってもよい。The human antibody to be measured is VCA.
-IgM antibody and VCA-IgG antibody have been described as examples, but human antibodies that can be measured by the enzyme immunoassay method of the present invention are not limited to these, and for example, VCA-IgG against EB virus-specific antigen. In the case of measuring antibody, EA-IgM antibody, EBNA-IgG antibody, it may be any human antibody including IgM antibody and IgG antibody against various other virus-specific antigens.
【００２７】上記の説明から明らかなように、本発明の
酵素免疫測定法は、検体の希釈溶液を固相化した抗原と
接触させる前に、検体の希釈溶液にＩｇＧの変性物また
はＩｇＧのＦｃフラグメントの変性物を添加することの
以外は、従来使用されている間接法による抗体の酵素免
疫測定法を実質的に変えるものではない。従って、本発
明の酵素免疫測定法に於いて、例えば、抗原の固相化に
使用する材料及び調製条件、検体の希釈溶液の調製条
件、抗ヒト抗体を標識するための酵素（例えば、ペルオ
キシダーゼ（ＰＯＤ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ
Ｄ）等）、酵素標識抗ヒト抗体の調製条件及び使用量、
酵素活性の測定方法、酵素免疫測定の操作条件等々は従
来の間接法による抗体の酵素免疫測定法に於けるものと
同様であってよい。As is apparent from the above description, in the enzyme immunoassay method of the present invention, before the diluted solution of the sample is brought into contact with the solid-phased antigen, the diluted solution of the sample is modified with IgG or Fc of IgG. Other than the addition of a modified product of the fragment, it does not substantially change the conventionally used indirect method enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies. Therefore, in the enzyme immunoassay method of the present invention, for example, materials and preparation conditions used for immobilizing an antigen, preparation conditions of a diluted solution of a sample, an enzyme for labeling an anti-human antibody (for example, peroxidase ( POD), glucose oxidase (GO
D) etc.), preparation conditions and amount of enzyme-labeled anti-human antibody,
The method for measuring the enzyme activity, the operating conditions for the enzyme immunoassay, and the like may be the same as those used in the conventional enzyme immunoassay for antibodies by the indirect method.
【００２８】本発明の酵素免疫測定法に於いて、検体の
希釈溶液中に含有させるＩｇＧの変性物及びＩｇＧのＦ
ｃフラグメントの変性物はどのような由来のものであっ
てもよいが、ヒト、ウサギ、ヤギ、ブタ、マウス、ある
いはヒツジに由来するものであることが好ましい。検体
の希釈溶液中に含有させるＩｇＧは、純粋であることは
必ずしも必要ではなく、ＩｇＧを含む混合物として用い
ることができる。好ましいＩｇＧ源としては、例えば、
γ−グロブリン、ＤＥＡＥ分画ＩｇＧフラクション、硫
安分画ＩｇＧフラクション、プロテインＡ精製ＩｇＧフ
ラクション、プロテインＧ精製ＩｇＧフラクションなど
を挙げることができる。この内で特に好ましいものは、
ＤＥＡＥ分画ＩｇＧフラクション、プロテインＡ精製Ｉ
ｇＧフラクション、プロテインＧ精製ＩｇＧフラクショ
ンである。また、検体の希釈溶液中に含有させる変性Ｉ
ｇＧ（ＩｇＧの変性物）は熱によって変性させたもので
あることが好ましい。すなわち、添加する変性ＩｇＧ中
に測定抗原に対する特異ＩｇＧが含まれていたり、非特
異反応をできるだけ抑制するという理由から、上記のよ
うなＩｇＧのＦｃフラグメントを熱で変性させたものを
用いることが特に好ましい。In the enzyme immunoassay of the present invention, a modified product of IgG and F of IgG contained in a diluted solution of a sample
The modified c fragment may be derived from any origin, but is preferably derived from human, rabbit, goat, pig, mouse, or sheep. The IgG contained in the diluted solution of the specimen does not necessarily need to be pure, and can be used as a mixture containing IgG. As a preferable IgG source, for example,
Examples include γ-globulin, DEAE fraction IgG fraction, ammonium sulfate fraction IgG fraction, protein A purified IgG fraction, protein G purified IgG fraction, and the like. Of these, particularly preferred are
DEAE Fractionated IgG Fraction, Protein A Purified I
gG fraction, protein G purified IgG fraction. In addition, the denaturation I contained in the diluted solution of the sample
It is preferable that gG (denatured product of IgG) is denatured by heat. That is, it is particularly preferable to use the above-mentioned Fc fragment of IgG denatured with heat, because the denatured IgG to be added contains specific IgG against the measurement antigen or suppresses nonspecific reaction as much as possible. preferable.
【００２９】上記検体の希釈溶液中のＩｇＧの変性物ま
たはＩｇＧのＦｃフラグメントの変性物添加量は、検体
中に存在するＲＦの量の当量以上であることが好まし
い。検体中のＲＦの含有量は検体により異なるが、経験
的に検体希釈液中の検体に対してＩｇＧ変性物が０．０
５重量％以上、特に０．２重量％以上となる割合である
ことが好ましい。ＩｇＧのＦｃフラグメントの変性物の
添加量はＩｇＧの含有量に相当するものである。The addition amount of the modified product of IgG or the modified product of Fc fragment of IgG in the diluted solution of the sample is preferably equal to or more than the amount of RF present in the sample. The content of RF in the sample differs depending on the sample, but empirically, the amount of the IgG modified product was 0.0 with respect to the sample in the sample diluent.
It is preferably 5% by weight or more, and particularly preferably 0.2% by weight or more. The added amount of the modified product of the Fc fragment of IgG corresponds to the content of IgG.
【００３０】従来の抗体の酵素免疫測定法に於いて、検
体は検体希釈用試薬に希釈した溶液として抗原と接触す
るようにされる。従って、本発明に於いて検体の希釈溶
液中に含有させるＩｇＧ変性物またはＩｇＧのＦｃフラ
グメント変性物は検体希釈用試薬に予め添加し、溶解さ
せておくことが好ましい。検体希釈用試薬中のＩｇＧ変
性物またはＩｇＧのＦｃフラグメントの変性物の含有量
は、検体の希釈倍率に合わせて、検体を希釈した後の検
体溶液中のＩｇＧ変性物またＩｇＧのＦｃフラグメント
の変性物の含有量が上記の値になるように調節すればよ
い。例えば、検体を５０容量倍に希釈する場合は、検体
の希釈溶液中の検体に対してＩｇＧ変性物を０．０５重
量％以上にするとき、検体希釈用試薬中のＩｇＧ変性物
の含有量を０．００１重量％以上にする。In the conventional enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies, the sample is brought into contact with the antigen as a solution diluted with a sample dilution reagent. Therefore, in the present invention, it is preferable to add the IgG modified product or IgG Fc fragment modified product to be contained in the diluted solution of the sample to the sample dilution reagent in advance and to dissolve it. The content of the IgG modified product or the IgG Fc fragment modified product in the sample diluting reagent depends on the dilution ratio of the sample and the IgG modified product or IgG Fc fragment modified in the sample solution after the sample is diluted. The content of the product may be adjusted to the above value. For example, in the case of diluting a sample by 50 volumes, when the IgG denatured product is 0.05% by weight or more with respect to the sample in the diluted solution of the sample, the content of the IgG denatured product in the sample dilution reagent should be It is made 0.001% by weight or more.
【００３１】前記のように、本発明のヒト抗体の酵素免
疫測定法は、抗原、ヒト抗体及び酵素標識抗ヒトＩｇＭ
抗体の免疫複合体の生成を利用する全ての間接法による
抗体の酵素免疫測定法に適用できる抗体の測定法である
ので、上記のＩｇＧ変性物またはＩｇＧのＦｃフラグメ
ント変性物を含有する検体希釈用試薬は、全ての間接法
によるヒト抗体の酵素免疫測定法に於いて検体を希釈す
るために使用する試薬として有用である。As described above, the enzyme immunoassay method for human antibodies of the present invention is performed by using the antigen, human antibody and enzyme-labeled anti-human IgM.
Since it is an antibody measurement method applicable to enzyme immunoassays for antibodies by all indirect methods that utilize the formation of immune complexes of antibodies, it can be used for dilution of a specimen containing the above IgG modified product or IgG Fc fragment modified product. The reagent is useful as a reagent used for diluting a sample in all indirect enzyme-linked immunosorbent assays for human antibodies.
【００３２】また、本発明により、それぞれ分離した状
態で、抗原固相化プレート、ＩｇＧ変性物またはＩｇＧ
のＦｃフラグメント変性物を含有する検体希釈用試薬、
酵素標識抗ヒト抗体、及び標識酵素の基質からなること
を特徴とする、本発明のヒト抗体の酵素免疫測定法に使
用するための試薬キットが提供される。In addition, according to the present invention, the antigen-immobilized plate, the modified IgG product or the IgG product is separated from each other.
A reagent for diluting a sample containing a modified product of Fc fragment of
A reagent kit for use in an enzyme immunoassay method for a human antibody of the present invention, which comprises an enzyme-labeled anti-human antibody and a substrate for a labeled enzyme.
【００３３】前記の説明から明らかなように、本発明の
試薬キットに於いて、検体希釈用試薬が前記のようなＩ
ｇＧ変性物またはＩｇＧのＦｃフラグメント変性物を含
有するものである以外は従来の抗体の酵素免疫測定用試
薬キットと同様であり、例えば、抗原固相化プレート、
酵素標識抗ヒト抗体、標識酵素の基質等は従来公知のも
のをそのまま使用することができる。従来、抗体を測定
対象とする酵素免疫測定法による試薬キットとして種々
のものが知られており（例えば、ＥＢウイルス抗体測定
用、クラミジア抗体測定用、その他「検査と技術」、vo
l.17、No.6、1989年、増刊号、725 頁の表９に記載のも
の等）、これらの試薬キットの基本的構成を本発明に利
用することができる。即ち、これらの試薬キットの検体
希釈用試薬にＩｇＧ変性物またはＩｇＧのＦｃフラグメ
ント変性物を含有させた形態のものが、本発明の抗体の
酵素免疫測定法に使用するための試薬キットとなる。As is clear from the above description, in the reagent kit of the present invention, the reagent for diluting the sample is I as described above.
It is the same as a conventional reagent kit for enzyme immunoassay of an antibody except that it contains a modified product of gG or a modified product of Fc fragment of IgG, for example, an antigen-immobilized plate,
As the enzyme-labeled anti-human antibody, the substrate for the labeling enzyme, etc., conventionally known ones can be used as they are. Conventionally, various types of reagent kits have been known as enzyme immunoassays for measuring antibodies (for example, for EB virus antibody measurement, chlamydia antibody measurement, and other "tests and techniques", vo
No. 6, No. 6, 1989, special issue, those described in Table 9 on page 725), and the basic constitution of these reagent kits can be used in the present invention. That is, a reagent kit for use in the enzyme immunoassay method of the antibody of the present invention has a form in which the reagent for diluting a sample of these reagent kits contains an IgG modified product or an IgG Fc fragment modified product.
【００３４】[0034]
【実施例】次に、実施例及び比較例により本発明を更に
詳細に説明する。EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Comparative Examples.
【００３５】［実施例１］ 試薬 （Ａ）ＥＢウイルスＶＣＡ抗原固相化プレート （Ｂ）検体希釈用試薬： ０．１６重量％ 変性γ−グロブリン １０ｍＭ リン酸二水素カリウム ０．８５重量％ 塩化ナトリウム ０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０（非イオン界面活性
剤） （Ｃ）ＧＯＤ（グルコースオキシダーゼ）標識抗ヒトＩ
ｇＭ抗体 （Ｄ）発色剤液： ２００ｍＭ クエン酸 ０．２６ｍＭ テトラメチルベンチジン塩酸塩（ＴＭＢ
Ｚ） １００ｍＭ グルコース ５単位／ｍＬ パーオキシダーゼ（ＰＯＤ） （Ｅ）洗浄液： １０ｍＭ リン酸二水素カリウム ０．８５重量％ 塩化ナトリウム ０．０５重量％ Ｔｗｅｅｎ２０ （Ｆ）反応停止液：２Ｎ−硫酸[Example 1] Reagent (A) EB virus VCA antigen-immobilized plate (B) Reagent for sample dilution: 0.16% by weight denatured γ-globulin 10 mM potassium dihydrogen phosphate 0.85% by weight sodium chloride 0.1% by weight Tween 20 (nonionic surfactant) (C) GOD (glucose oxidase) labeled anti-human I
gM antibody (D) color developer solution: 200 mM citric acid 0.26 mM tetramethylbenzidine hydrochloride (TMB)
Z) 100 mM glucose 5 units / mL Peroxidase (POD) (E) Washing solution: 10 mM Potassium dihydrogen phosphate 0.85% by weight Sodium chloride 0.05% by weight Tween 20 (F) Stop solution: 2N-sulfuric acid
【００３６】検体希釈溶液の調製 検体希釈溶液１Ａ：抗ＶＣＡ抗原ＩｇＧ陽性血清（Ｉｇ
Ｇ抗体を含有、ＲＦ濃度＝０Ｕ／ｍＬ）を、上記の検体
希釈用試薬で５０倍に希釈して調製した。 検体希釈溶液１Ｂ：上記の血清にＲＦを５００Ｕ／ｍＬ
の濃度になるように添加し、次いでこれを上記の検体希
釈用試薬で５０倍に希釈して調製した。 なお、ＲＦの活性単位はＷＨＯの国際単位に準じた単位
で表わす。Preparation of Sample Dilution Solution Sample Dilution Solution 1A: Anti-VCA antigen IgG positive serum (Ig
G antibody was contained therein and RF concentration = 0 U / mL) was prepared by diluting 50 times with the above-mentioned reagent for sample dilution. Specimen dilution solution 1B: 500 U / mL of RF in the above serum
Was added so that the concentration would become, and then this was diluted 50 times with the above-mentioned sample diluting reagent to prepare. The RF activity unit is expressed in units similar to the WHO international unit.
【００３７】測定方法 （１）ＥＢウイルスＶＣＡ抗原固相化プレート（２％ウ
シ血清アルブミンによりブロッキングされている）のウ
エルに、検体希釈溶液０．１ｍＬを分注し、３７℃で１
時間反応させる。 （２）その後プレートを上記洗浄液で４回洗浄する。 （３）ＧＯＤ標識抗ヒトＩｇＭ抗体０．１ｍＬをウエル
に分注し、３７℃で１時間反応させる。 （４）プレートを上記洗浄液で４回洗浄する。 （５）上記発色剤液０．１ｍＬをウエルに分注し、３７
℃で１０分間反応させた後、反応停止液０．１ｍＬを加
えて反応を停止させる。 （６）反応停止後１０分以内にマイクロプレートリーダ
を用いて波長４５０ｎｍに於ける吸光度を測定する。 この方法により、検体血清中のＶＣＡ−ＩｇＭ抗体の量
を測定することができる。Measurement method (1) 0.1 mL of the sample dilution solution was dispensed into the wells of the EB virus VCA antigen-immobilized plate (blocked with 2% bovine serum albumin), and the mixture was placed at 37 ° C. for 1 hour.
React for hours. (2) After that, the plate is washed with the above washing solution four times. (3) 0.1 mL of GOD-labeled anti-human IgM antibody is dispensed into the wells and reacted at 37 ° C. for 1 hour. (4) Wash the plate 4 times with the above washing solution. (5) Dispense 0.1 mL of the above color-developing agent solution into a well,
After reacting at 0 ° C. for 10 minutes, 0.1 mL of a reaction stop solution is added to stop the reaction. (6) Within 10 minutes after stopping the reaction, the absorbance at a wavelength of 450 nm is measured using a microplate reader. By this method, the amount of VCA-IgM antibody in the sample serum can be measured.
【００３８】上記の検体希釈溶液１Ａ及び１Ｂを使用し
て、上記の測定方法により得られた吸光度を表１に示
す。Table 1 shows the absorbances obtained by the above-mentioned measuring method using the above-mentioned specimen diluting solutions 1A and 1B.
【００３９】対照のために、下記のようにして対照検体
希釈溶液を調製した。 対照検体希釈用試薬： １０ｍＭ リン酸二水素カリウム ０．８５重量％ 塩化ナトリウム ０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０（非イオン界面活性
剤） 対照検体希釈溶液１ａ：検体希釈溶液１Ａの調製に用い
た血清を、上記の対照検体希釈用試薬で５０倍に希釈し
て調製した。 対照検体希釈溶液１ｂ：上記の血清にＲＦを５００Ｕ／
ｍＬの濃度になるように添加し、次いでこれを上記の対
照検体希釈用試薬で５０倍に希釈することにより調製し
た。As a control, a control sample dilution solution was prepared as follows. Control sample diluting reagent: 10 mM potassium dihydrogen phosphate 0.85% by weight sodium chloride 0.1% by weight Tween 20 (nonionic surfactant) Control sample diluting solution 1a: The serum used for preparing the sample diluting solution 1A, It was prepared by diluting 50 times with the above-mentioned control sample diluting reagent. Control sample dilution solution 1b: 500 U / RF of the above serum
It was prepared by adding to a concentration of mL, and then diluting this 50 times with the above-mentioned control specimen diluting reagent.
【００４０】上記対照検体希釈溶液１ａ及び１ｂを使用
して、前記の測定方法により得られた吸光度を表１に示
す。Table 1 shows the absorbances obtained by the above-mentioned measuring method using the above-mentioned control sample diluted solutions 1a and 1b.
【００４１】[0041]
【表１】 表１ ──────────────────────────────── 検体溶液 検体中のＲＦ含有量 吸光度 ──────────────────────────────── 検体希釈溶液１Ａ ０ Ｕ／ｍＬ ０．０１９Ａｂｓ 検体希釈溶液１Ｂ ５００ Ｕ／ｍＬ ０．０２５Ａｂｓ ──────────────────────────────── 対照検体希釈溶液１ａ ０ Ｕ／ｍＬ ０．００９Ａｂｓ 対照検体希釈溶液１ｂ ５００ Ｕ／ｍＬ ０．６６８Ａｂｓ ────────────────────────────────[Table 1] Table 1 ──────────────────────────────── Sample solution RF content in sample Absorbance ─── ───────────────────────────── Sample diluted solution 1A 0 U / mL 0.019Abs Sample diluted solution 1B 500 U / mL 0. 025Abs ───────────────────────────────── Control Sample Dilution Solution 1a 0 U / mL 0.009Abs Control Sample Dilution Solution 1b 500 U / mL 0.668 Abs ────────────────────────────────
【００４２】表１の結果から、ＲＦを含有しない検体の
場合は、従来の対照検体希釈用試薬を使用して希釈した
対照検体希釈溶液１ａと本発明の変性γ−グロブリン
（変性ＩｇＧ）を含有する検体希釈用試薬を使用して希
釈した検体希釈溶液１Ａとで、吸光度に殆ど差はない
が、ＲＦを５００Ｕ／ｍＬ含有する検体の場合は、従来
法により調製した対照検体希釈溶液１ｂが対照検体希釈
溶液１ａに比べて著しく大きい吸光度を示すのに対し
て、本発明に従って調製した検体希釈溶液１Ｂは検体希
釈溶液１Ａと比べて吸光度に実質的に差がないことが分
かる。このことから、本発明の抗体の酵素免疫測定法に
よれば、検体中のＲＦの含有量に影響されることなく検
体中の抗体を正確に測定することができることが明らか
である。From the results shown in Table 1, in the case of the sample containing no RF, the control sample dilution solution 1a diluted with the conventional control sample dilution reagent and the modified γ-globulin (modified IgG) of the present invention were contained. There is almost no difference in absorbance with the sample dilution solution 1A diluted with the sample dilution reagent, but in the case of a sample containing 500 U / mL RF, the control sample dilution solution 1b prepared by the conventional method is used as a control. It can be seen that the sample diluted solution 1B prepared according to the present invention has substantially no difference in the absorbance as compared with the sample diluted solution 1A, while the sample diluted solution 1a exhibits a significantly higher absorbance than the sample diluted solution 1a. From this, it is clear that the antibody in the sample of the present invention can be accurately measured without being affected by the RF content in the sample.
【００４３】［実施例２］検体希釈用試薬中のγ−グロ
ブリンの濃度の変化による影響を示す。[Example 2] The influence of changes in the concentration of γ-globulin in the reagent for diluting the sample is shown.
【００４４】検体希釈用試薬として、変性γ−グロブリ
ンの濃度が０．０１重量％、０．１重量％又は１．０重
量％である検体希釈用試薬を使用して、ＲＦ含有量が０
Ｕ／ｍＬである検体を希釈してそれぞれ検体希釈溶液２
Ａ、２Ｂ及び２Ｃを調製し、ＲＦ含有量が５００Ｕ／ｍ
Ｌである検体を希釈してそれぞれ検体希釈溶液２Ｄ、２
Ｅ及び２Ｆを調製した他は、実施例１に於けると同様に
して、検体血清中のＶＣＡ−ＩｇＭ抗体の量を測定し
た。得られた吸光度を表２に示す。As a sample diluting reagent, a sample diluting reagent having a modified γ-globulin concentration of 0.01% by weight, 0.1% by weight or 1.0% by weight was used, and the RF content was 0.
U / mL sample is diluted to dilute sample 2
A, 2B and 2C were prepared and the RF content was 500 U / m
The sample that is L is diluted to dilute the sample solution 2D, 2
The amount of VCA-IgM antibody in the sample serum was measured in the same manner as in Example 1 except that E and 2F were prepared. The obtained absorbance is shown in Table 2.
【００４５】実施例１で使用した対照検体希釈用試薬を
使用して、ＲＦ含有量が０Ｕ／ｍＬである検体を希釈し
て対照検体希釈溶液２ａを調製し、ＲＦ含有量が５００
Ｕ／ｍＬである検体を希釈して検体希釈溶液２ｂを調製
した他は、実施例１に於けると同様にして、検体血清中
のＶＣＡ−ＩｇＭ抗体の量を測定した。得られた吸光度
を表２に示す。A control sample dilution solution 2a was prepared by diluting a sample having an RF content of 0 U / mL using the control sample dilution reagent used in Example 1, and the RF content was 500.
The amount of VCA-IgM antibody in the sample serum was measured in the same manner as in Example 1 except that the sample diluted solution 2b was prepared by diluting the sample of U / mL. The obtained absorbance is shown in Table 2.
【００４６】[0046]
【表２】 表２ ──────────────────────────────── 検体溶液 検体中のＲＦ含有量 吸光度 ──────────────────────────────── 検体希釈溶液２Ａ ０ Ｕ／ｍＬ ０．０２２Ａｂｓ 検体希釈溶液２Ｂ ０ Ｕ／ｍＬ ０．０２５Ａｂｓ 検体希釈溶液２Ｃ ０ Ｕ／ｍＬ ０．０２７Ａｂｓ 検体希釈溶液２Ｄ ５００ Ｕ／ｍＬ ０．０２０Ａｂｓ 検体希釈溶液２Ｅ ５００ Ｕ／ｍＬ ０．０２８Ａｂｓ 検体希釈溶液２Ｆ ５００ Ｕ／ｍＬ ０．０２６Ａｂｓ ──────────────────────────────── 対照検体希釈溶液２ａ ０ Ｕ／ｍＬ ０．０１８Ａｂｓ 対照検体希釈溶液２ｂ ５００ Ｕ／ｍＬ ０．６８２Ａｂｓ ────────────────────────────────[Table 2] Table 2 ──────────────────────────────── Sample solution RF content in sample Absorbance ─── ───────────────────────────── Sample diluted solution 2A 0 U / mL 0.022 Abs Sample diluted solution 2B 0 U / mL 0. 025 Abs Specimen Diluted Solution 2C 0 U / mL 0.027 Abs Specimen Diluted Solution 2D 500 U / mL 0.020 Abs Specimen Diluted Solution 2E 500 U / mL 0.028 Abs Specimen Diluted Solution 2F 500 U / mL 0.026 Abs ──── ──────────────────────────── Control sample diluted solution 2a 0 U / mL 0.018 Abs Control sample diluted solution 2b 500 U / mL 0. 682Abs ────────────────────── ──────────
【００４７】表２の結果から、検体希釈用試薬中のγ−
グロブリンの量を変化させても、得られた吸光度に実質
的な差はなく、検体中のＲＦの含有量が５００ Ｕ／ｍ
Ｌであるとき、検体を５０倍に希釈する場合検体希釈用
試薬中のγ−グロブリンの含有量は０．０１重量％で十
分であることが分かる。From the results in Table 2, γ-in the sample diluting reagent
Even if the amount of globulin was changed, there was no substantial difference in the obtained absorbance, and the RF content in the sample was 500 U / m.
When L is L, it can be seen that when the sample is diluted 50 times, the content of γ-globulin in the sample dilution reagent is 0.01% by weight.
【００４８】［実施例３］表３に示す種々のＲＦ含有量
を有する実検体（ＥＢ−ＶＣＡ陽性かつＩｇＭ陰性及び
陽性の検体）を使用し、検体希釈用試薬として実施例１
で使用した検体希釈用試薬を使用して検体希釈溶液を調
製した他は実施例１と同様にして、検体血清中のＶＣＡ
−ＩｇＭ抗体の量を測定した。なお、実検体中のＲＦの
含有量は株式会社日本凍結乾燥研究所製ＲＦ測定試薬に
より測定した。得られた吸光度を表３に示す。Example 3 Using actual samples (EB-VCA positive and IgM negative and positive samples) having various RF contents shown in Table 3, Example 1 was used as a reagent for sample dilution.
VCA in sample serum was prepared in the same manner as in Example 1 except that a sample dilution solution was prepared using the sample dilution reagent used in
-The amount of IgM antibody was measured. In addition, the content of RF in the actual sample was measured by an RF measuring reagent manufactured by Japan Freeze Drying Laboratory Co., Ltd. The obtained absorbance is shown in Table 3.
【００４９】上記と同じ実検体を使用し、対照検体希釈
用試薬として実施例１で使用した対照検体希釈用試薬を
使用して対照検体希釈溶液を調製した他は実施例１に於
けると同様にして、検体血清中のＶＣＡ−ＩｇＭ抗体の
量を測定した。得られた吸光度を表３に示す。Same as in Example 1 except that the same actual sample as above was used and a control sample dilution solution was prepared using the control sample dilution reagent used in Example 1 as the control sample dilution reagent. Then, the amount of VCA-IgM antibody in the sample serum was measured. The obtained absorbance is shown in Table 3.
【００５０】[0050]
【表３】 表３ ──────────────────────────────────── 検体番号 ＲＦ含有量 吸光度（Ａｂｓ） （Ｕ／ｍＬ） 本発明検体希釈用試薬 対照検体希釈用試薬 ──────────────────────────────────── １ ０．８ ０．０３５ ０．０３０ ２ ３６６．９ ０．０２０ ０．８６１ ３ ３．２ ０．５３９ ０．５１０ ４ ４．３ ０．０４０ ０．０４５ ５ ４０１．２ ０．４９１ １．３５２ ６ １６７．９ ０．０１９ ０．３１５ ７ １３．６ ０．０５２ ０．０５５ ８ ３．７ ０．０１９ ０．０２２ ────────────────────────────────────[Table 3] Table 3 ──────────────────────────────────── Sample number RF contentAbsorbance (Abs ) (U / mL) Reagent for diluting sample of the present invention Reagent for diluting control sample ────────────────────────────────── ─── 1 0.8 0.035 0.030 2 366.9 0.020 0.861 3 3.2 0.539 0.510 4 4.3 4.3 0.040 0.045 5 401.2 0.491 1.352 6 167.9 0.019 0.315 7 13.6 0.052 0.055 8 3.7 0.019 0.022 ────────────────── ────────────────────
【００５１】なお、表３の検体の全ては、ＶＣＡ−Ｉｇ
Ｇについて陽性であり、その内で、検体番号１、２、
４、６、７そして８はＶＣＡ−ＩｇＭについて陰性で、
検体番号３と５は陽性である。All the samples shown in Table 3 are VCA-Ig.
Positive for G, of which sample numbers 1, 2,
4, 6, 7 and 8 are negative for VCA-IgM,
Specimen numbers 3 and 5 are positive.
【００５２】表４に示されたデータは、検体中のＲＦの
含有量が小さい試料（検体番号１、３、４、７及び８）
では、本発明検体希釈用試薬を使用した場合と対照検体
希釈用試薬を使用した場合とで吸光度がほぼ一致してい
るが、検体中のＲＦの含有量が大きい試料（検体番号
２、５及び６）では、本発明検体希釈用試薬を使用した
場合に比べて、対照検体希釈用試薬を使用した場合の吸
光度が非常に大きいことを示している。これらのことか
ら、検体中のＶＣＡ−ＩｇＭ抗体の測定に際し、対照検
体希釈用試薬を使用した場合には検体中のＲＦ含有量に
より大きく影響されるのに対し、本発明の検体希釈用試
薬を使用した場合には検体中のＲＦ含有量により殆ど影
響されないことが明らかである。The data shown in Table 4 are for the samples with a small RF content in the samples (sample numbers 1, 3, 4, 7 and 8).
The absorbances of the sample dilution reagent of the present invention and those of the control sample dilution reagent are almost the same, but the samples containing a large amount of RF in the sample (sample numbers 2, 5 and In 6), it is shown that the absorbance when the control sample diluting reagent is used is much higher than that when the sample diluting reagent of the present invention is used. From these facts, when the VCA-IgM antibody in the sample is measured, when the control sample diluting reagent is used, it is greatly affected by the RF content in the sample, whereas the sample diluting reagent of the present invention is used. It is clear that when used, it is hardly affected by the RF content in the sample.
【００５３】［実施例４］ 試薬 （Ａ）ＥＢウイルスＶＣＡ抗原固相化プレート （Ｂ）検体希釈用試薬： ０．１重量％ 変性ヒトＩｇＧのＦｃフラグメント １０ｍＭ リン酸二水素カリウム ０．８５重量％ 塩化ナトリウム ０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０ （Ｃ）ＰＯＤ（ペルオキシダーゼ）標識抗ヒトＩｇＭ抗
体 （Ｄ）発色剤液： ２００ｍＭ クエン酸 ０．２６ｍＭ テトラメチルベンチジン塩酸塩（ＴＭＢ
Ｚ） ０．１５％ 過酸化水素 （Ｅ）洗浄液： １０ｍＭ リン酸二水素カリウム ０．８５重量％ 塩化ナトリウム ０．０５重量％ Ｔｗｅｅｎ２０ （Ｆ）反応停止液：２Ｎ−硫酸[Example 4] Reagent (A) EB virus VCA antigen-immobilized plate (B) Specimen dilution reagent: 0.1 wt% denatured human IgG Fc fragment 10 mM potassium dihydrogen phosphate 0.85 wt% Sodium chloride 0.1% by weight Tween20 (C) POD (peroxidase) -labeled anti-human IgM antibody (D) Color developer solution: 200 mM citric acid 0.26 mM tetramethylbenzidine hydrochloride (TMB)
Z) 0.15% hydrogen peroxide (E) cleaning solution: 10 mM potassium dihydrogen phosphate 0.85% by weight sodium chloride 0.05% by weight Tween 20 (F) reaction stop solution: 2N-sulfuric acid
【００５４】検体希釈溶液の調製 検体希釈溶液４Ａ：抗ＶＣＡ抗原ＩｇＧ陽性血清（Ｉｇ
Ｇ抗体を含有、ＲＦ濃度＝０Ｕ／ｍＬ）を、上記の検体
希釈用試薬で５０倍に希釈して調製した。 検体希釈溶液４Ｂ：上記の血清にＲＦを５００Ｕ／ｍＬ
の濃度になるように添加し、次いでこれを上記の検体希
釈用試薬で５０倍に希釈して調製した。Preparation of Sample Dilution Solution Sample Dilution Solution 4A: Anti-VCA antigen IgG positive serum (Ig
G antibody was contained therein and RF concentration = 0 U / mL) was prepared by diluting 50 times with the above-mentioned reagent for sample dilution. Specimen diluting solution 4B: 500 U / mL of RF in the above serum
Was added so that the concentration would become, and then this was diluted 50 times with the above-mentioned sample diluting reagent to prepare.
【００５５】測定方法 （１）ＥＢウイルスＶＣＡ抗原固相化プレート（２％ウ
シ血清アルブミンによりブロッキングされている）のウ
エルに、検体希釈溶液０．１ｍＬを分注し、３７℃で１
時間反応させる。 （２）その後プレートを上記洗浄液で４回洗浄する。 （３）ＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＭ抗体０．１ｍＬをウエル
に分注し、３７℃で１時間反応させる。 （４）プレートを上記洗浄液で４回洗浄する。 （５）上記発色剤液０．１ｍＬをウエルに分注し、３７
℃で１０分間反応させた後、反応停止液０．１ｍＬを加
えて反応を停止させる。 （６）反応停止後１０分以内にマイクロプレートリーダ
を用いて波長４５０ｎｍに於ける吸光度を測定する。 この方法により、検体血清中のＶＣＡ−ＩｇＭ抗体の量
を測定することができる。Assay method (1) 0.1 mL of the sample dilution solution was dispensed into the wells of the EB virus VCA antigen-immobilized plate (blocked with 2% bovine serum albumin), and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
React for hours. (2) After that, the plate is washed with the above washing solution four times. (3) POD-labeled anti-human IgM antibody (0.1 mL) is dispensed into the wells and reacted at 37 ° C. for 1 hour. (4) Wash the plate 4 times with the above washing solution. (5) Dispense 0.1 mL of the above color-developing agent solution into a well,
After reacting at 0 ° C. for 10 minutes, 0.1 mL of a reaction stop solution is added to stop the reaction. (6) Within 10 minutes after stopping the reaction, the absorbance at a wavelength of 450 nm is measured using a microplate reader. By this method, the amount of VCA-IgM antibody in the sample serum can be measured.
【００５６】上記検体希釈溶液４Ａ及び４Ｂを使用し
て、上記の測定方法により得られた吸光度を表４に示
す。Table 4 shows the absorbances obtained by the above-mentioned measuring method using the above-mentioned sample diluted solutions 4A and 4B.
【００５７】実施例１で使用した対照検体希釈用試薬を
使用して、ＲＦ含有量が０Ｕ／ｍＬの検体を希釈して対
照検体希釈溶液４ａを調製し、ＲＦ含有量が５００Ｕ／
ｍＬの検体を希釈して検体希釈溶液４ｂを調製した他
は、上記の測定方法により検体血清中のＶＣＡ−ＩｇＭ
抗体の量を測定した。得られた吸光度を表４に示す。A control sample dilution solution 4a was prepared by diluting a sample having an RF content of 0 U / mL with the reagent for diluting the control sample used in Example 1, and the RF content was 500 U / mL.
VCA-IgM in the sample serum was measured by the above-mentioned measurement method except that the sample diluted solution 4b was prepared by diluting the sample in mL.
The amount of antibody was measured. The obtained absorbance is shown in Table 4.
【００５８】[0058]
【表４】 表４ ──────────────────────────────── 検体溶液 検体中のＲＦ含有量 吸光度 ──────────────────────────────── 検体希釈溶液４Ａ ０ Ｕ／ｍＬ ０．０１０Ａｂｓ 検体希釈溶液４Ｂ ５００ Ｕ／ｍＬ ０．０１２Ａｂｓ ──────────────────────────────── 対照検体希釈溶液４ａ ０ Ｕ／ｍＬ ０．００８Ａｂｓ 対照検体希釈溶液４ｂ ５００ Ｕ／ｍＬ ０．９８９Ａｂｓ ────────────────────────────────[Table 4] Table 4 ──────────────────────────────── Sample solution RF content in sample Absorbance ─── ───────────────────────────── Sample diluted solution 4A 0 U / mL 0.010 Abs Sample diluted solution 4B 500 U / mL 0. 012Abs ──────────────────────────────── Control Sample Dilution Solution 4a 0 U / mL 0.008Abs Control Sample Dilution Solution 4b 500 U / mL 0.989 Abs ────────────────────────────────
【００５９】表４の結果から、実施例１に於けると同様
に、本発明の免疫酵素測定法によれば検体中のＲＦの含
有量に影響を受けることなく、検体中のヒト抗体を正確
に測定することができることがわかる。From the results in Table 4, as in Example 1, according to the immunoenzyme assay method of the present invention, the human antibody in the sample was accurately determined without being affected by the RF content in the sample. It turns out that it can be measured.
【００６０】[0060]
【発明の効果】本発明の抗体の酵素免疫測定法は、検体
中に含有されていることがあるリウマチ因子の影響を受
けることなく、検体中の抗体を正確に且つ安易に定量す
ることが可能であるという顕著な効果を奏する測定法で
ある。また、ＩｇＧの変性物またＩｇＧのＦｃフラグメ
ントの変性物を含有する検体希釈用試薬及びこれを含む
試薬キットは、本発明の酵素免疫測定法に使用すること
ができる有用な試薬である。INDUSTRIAL APPLICABILITY The enzyme immunoassay method for an antibody of the present invention can accurately and easily quantify an antibody in a sample without being affected by a rheumatoid factor which may be contained in the sample. This is a measurement method that has the remarkable effect of being A reagent for diluting a specimen containing a modified product of IgG or a modified product of Fc fragment of IgG and a reagent kit containing the same are useful reagents that can be used in the enzyme immunoassay method of the present invention.
【図１】図１は検体中のＶＣＡ−ＩｇＧ抗体の測定原理
を示す模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing the measurement principle of VCA-IgG antibody in a sample.
【図２】図２は検体中のＶＣＡ−ＩｇＭ抗体の測定原理
を示す模式図である。FIG. 2 is a schematic diagram showing the measurement principle of VCA-IgM antibody in a sample.
【図３】図３はＲＦが含有されている検体中のＶＣＡ−
ＩｇＭ抗体を測定する場合の、ＲＦにより生じる副反応
を示す模式図である。FIG. 3 shows VCA- in a sample containing RF.
It is a schematic diagram which shows the side reaction produced by RF when measuring an IgM antibody.
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24230894AJPH0875738A (en) | 1994-09-09 | 1994-09-09 | Enzyme immunoassay of human antibody and reagent used therein |
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24230894AJPH0875738A (en) | 1994-09-09 | 1994-09-09 | Enzyme immunoassay of human antibody and reagent used therein |
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0875738Atrue JPH0875738A (en) | 1996-03-22 |
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24230894AWithdrawnJPH0875738A (en) | 1994-09-09 | 1994-09-09 | Enzyme immunoassay of human antibody and reagent used therein |
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0875738A (en) |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115825445A (en)* | 2022-09-27 | 2023-03-21 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | A kind of complement C1q detection kit and preparation method thereof |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115825445A (en)* | 2022-09-27 | 2023-03-21 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | A kind of complement C1q detection kit and preparation method thereof |
| CN115825445B (en)* | 2022-09-27 | 2024-11-26 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | A complement C1q detection kit and preparation method thereof |
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