【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、ウサギ胃幽門部平滑筋
由来の新規なＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、該蛋白
質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、該Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質の製造方法、および該蛋白質なら
びにＤＮＡの用途に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel G protein-coupled receptor protein derived from rabbit gastric pyloric smooth muscle, DNA containing a DNA encoding the protein, a method for producing the G protein-coupled receptor protein, And the use of the protein and DNA.
【０００２】[0002]
【従来の技術】多くのホルモンや神経伝達物質は細胞膜
に存在する特異的なレセプター蛋白質を通じて生体の機
能を調節している。これらのレセプター蛋白質の多くは
共役している guanine nucleotide-binding protein
（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）の活性化を通
じて細胞内のシグナル伝達を行ない、また７個の膜貫通
領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇ蛋
白質共役型レセプター蛋白質あるいは７回膜貫通型レセ
プター蛋白質と総称される。Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、
それら生体の細胞や臓器の機能を調節する分子、例えば
ホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的と
して非常に重要な役割を担っている。2. Description of the Related Art Many hormones and neurotransmitters regulate the function of the living body through specific receptor proteins present in the cell membrane. Many of these receptor proteins are guanine nucleotide-binding proteins
Intracellular signal transduction is carried out through activation of (hereinafter sometimes abbreviated as G protein), and since it has a common structure having 7 transmembrane regions, it is a G protein-coupled receptor protein or 7 times It is collectively called a transmembrane receptor protein. G protein-coupled receptor protein exists on the surface of each functional cell of living cells and organs,
It plays a very important role as a target for molecules that regulate the functions of cells and organs of the living body, such as hormones, neurotransmitters and physiologically active substances.
【０００３】胃や小腸などの消化器官では、多くのホル
モン・ホルモン様物質・神経伝達物質あるいは生理活性
物質などによる調節のもとで、種々の消化液が分泌さ
れ、食物の消化・吸収が行われている。これらの物質
は、胃や小腸などに存在する、それぞれに対応するレセ
プターによってその分泌が制御されていると考えられて
いる。特に、消化管ホルモンと呼ばれるセクレチン，ガ
ストリン，コレシストキニン，バソアクティブ・インテ
スティナル・ポリペプチド，モチリン，サブスタンス
Ｐ，ソマトスタチン，ニューロテンシンなどは、消化管
内腔からの物理的・化学的刺激あるいは神経性の刺激に
反応して分泌されるが、その真の生理作用は不明な点も
多い。また、モチリンはレセプター蛋白質ｃＤＮＡの構
造に関する知見は、これまでに報告されていない。さら
に、未知のレセプター蛋白質やレセプター蛋白質サブタ
イプが存在するかどうかについても分かっていなかっ
た。In the digestive organs such as the stomach and small intestine, various digestive juices are secreted under the control of many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or physiologically active substances to digest and absorb food. It is being appreciated. It is considered that the secretion of these substances is regulated by the corresponding receptors present in the stomach and small intestine. In particular, secretin called gastrointestinal hormone, gastrin, cholecystokinin, vasoactive intestinal polypeptide, motilin, substance P, somatostatin, neurotensin, etc. are physically or chemically stimulated from the gastrointestinal lumen or nerves. It is secreted in response to sexual stimulation, but its true physiological effect remains unclear. In addition, motilin has not been reported so far regarding the structure of the receptor protein cDNA. Furthermore, it was not known whether an unknown receptor protein or receptor protein subtype exists.
【０００４】胃や小腸の複雑な機能を調節する物質とそ
の特異的レセプターとの関係を明らかにすることは、医
薬品開発に非常に重要な手段である。そして胃や小腸の
機能を調節するためのレセプター蛋白質に対するアゴニ
スト／アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医
薬品を開発するためには、レセプター蛋白質の遺伝子の
機能を解明し、それらを適当な発現系で発現させること
が必要であった。近年、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質がその構造の一部にアミノ酸配列の類似性を示すこと
を利用して、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション
（Polymerase Chain Reaction：以下、ＰＣＲと略称す
る）法によって新規レセプター蛋白質をコードするＤＮ
Ａを探索する方法が行われるようになった。Clarifying the relationship between substances that regulate the complex functions of the stomach and small intestine and their specific receptors is a very important means for drug development. Then, in order to efficiently screen agonists / antagonists against receptor proteins for regulating the functions of the stomach and small intestine, and to develop pharmaceuticals, the functions of the genes for the receptor proteins should be elucidated and expressed in an appropriate expression system. Was necessary. In recent years, by utilizing the fact that G protein-coupled receptor proteins show similarity in amino acid sequence to a part of their structure, a novel receptor protein is obtained by the polymerase chain reaction (PCR) method. DN coding
The method of searching A came to be practiced.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ウサギ胃幽
門部平滑筋由来の新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質、該蛋白質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、該
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の製造方法、および該
蛋白質ならびにＤＮＡの用途を提供することを目的とす
る。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention relates to a novel G protein-coupled receptor protein derived from rabbit gastric pyloric smooth muscle, DNA containing a DNA encoding the protein, and a method for producing the G protein-coupled receptor protein. , And the use of the protein and DNA.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡをより効率的
に単離するための合成ＤＮＡプライマーを用いてウサギ
胃幽門部平滑筋由来のｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅する
ことに成功し、その解析を進めた。その結果、本発明者
らは、新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードす
るウサギ由来のｃＤＮＡを単離し、その部分的な構造を
決定することに成功した。そして、このｃＤＮＡは、公
知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質とＤＮＡおよびア
ミノ酸配列の相同性が認められたことから、ウサギの胃
で発現機能している新規なＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質をコードしているＤＮＡであることを見いだした。Means for Solving the Problems The inventors of the present invention have conducted extensive studies in order to solve the above problems, and as a result, have been able to more efficiently isolate a DNA encoding a G protein-coupled receptor protein. We succeeded in amplifying cDNA derived from rabbit gastric antrum smooth muscle by PCR using a synthetic DNA primer, and proceeded with its analysis. As a result, the present inventors succeeded in isolating a rabbit-derived cDNA encoding a novel G protein-coupled receptor protein and determining the partial structure thereof. Since this cDNA was found to have DNA and amino acid sequence homology with a known G protein-coupled receptor protein, it encodes a novel G protein-coupled receptor protein which is expressed and expressed in the stomach of rabbits. It was found that the DNA contained DNA.
【０００７】本発明者らは、これらの知見から、これら
のＤＮＡを用いれば、完全長の翻訳枠を持つｃＤＮＡを
入手することができ、該レセプター蛋白質を製造するこ
ともできることを見いだした。さらに、本発明者らは、
該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードするｃＤＮ
Ａを適当な手段で発現させた該レセプター蛋白質を用い
れば、レセプター結合実験または細胞内セカンドメッセ
ンジャーの測定等を指標に、生体内あるいは天然・非天
然の化合物から該レセプター蛋白質に対するリガンドを
スクリーニングすることができ、さらには、リガンドと
レセプター蛋白質との結合を阻害する化合物のスクリー
ニングを行なうこともできることを見いだした。From these findings, the present inventors have found that using these DNAs, a cDNA having a full-length translation frame can be obtained and the receptor protein can be produced. Furthermore, the inventors
CDNA encoding the G protein-coupled receptor protein
By using the receptor protein expressing A by an appropriate means, it is possible to screen a ligand for the receptor protein from an in vivo compound or a natural or non-natural compound using a receptor binding experiment or measurement of intracellular second messenger as an index. It has been found that a compound that inhibits the binding between the ligand and the receptor protein can be screened.
【０００８】より具体的には、本発明者らは、〔図１〕
に示すウサギ胃幽門部平滑筋由来の新規なｃＤＮＡ断片
をＰＣＲ法によって増幅し、プラスミドベクターにサブ
クローニングした（ｐＭＪ１０）。その部分配列の解析
から、該ｃＤＮＡが新規レセプター蛋白質をコードして
いることを明らかになった。この配列をアミノ酸配列に
翻訳したところ〔図１〕、第４、第５および第６膜貫通
領域が疎水性プロット上で確認された〔図２〕。また、
増幅されたｃＤＮＡのサイズも、公知のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質の第３膜貫通領域直後と第６膜貫通領
域の間の塩基数と比較して同程度の約４００ｂｐであっ
た。More specifically, the present inventors have shown in FIG.
The novel cDNA fragment derived from rabbit gastric pyloric smooth muscle shown in (3) was amplified by PCR and subcloned into a plasmid vector (pMJ10). Analysis of the partial sequence revealed that the cDNA encodes a novel receptor protein. When this sequence was translated into an amino acid sequence [Fig. 1], the fourth, fifth, and sixth transmembrane regions were confirmed on the hydrophobicity plot [Fig. 2]. Also,
The size of the amplified cDNA was also about 400 bp, which was about the same as the number of bases immediately after the third transmembrane region and between the sixth transmembrane region of the known G protein-coupled receptor protein.
【０００９】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質はそのア
ミノ酸配列にある程度の共通性を示し、一つの蛋白質フ
ァミリーを形成している。そこで、本件の新規レセプタ
ー蛋白質ＤＮＡ（ｐＭＪ１０に含まれるｃＤＮＡ）によ
ってコードされるアミノ酸配列を鋳型としてデーターベ
ース検索を行なったところ、公知のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質であるヒトリガンド不明レセプター蛋白質
（Ｂ４２００９）、ヒトＮ-フォルミルペプチドレセプ
ター蛋白質（ＪＣ２０１４）、ウサギＮ-フォルミルペ
プチドレセプター蛋白質（Ａ４０５２０）、マウスＣ５
ａアナフィラトキシンレセプター蛋白質（Ａ４６５２
５）およびウシニューロペプチドＹレセプター蛋白質
（Ｓ２８７８７）とアミノ酸でそれぞれ３２％、３２
％、３０％、２７％および２７％のホモロジーが認めら
れた〔図３〕。このことから、本発明の新規レセプター
蛋白質がＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ファミリーに
属するものであることがわかる。上記の（ ）内の略語
は、NBRF-PIRにデータとして登録される際の整理番号で
あり、通常Accession Numberと呼ばれるものである。G protein-coupled receptor proteins show some degree of commonality in their amino acid sequences and form one protein family. Then, a database search was carried out using the amino acid sequence encoded by the novel receptor protein DNA (cDNA contained in pMJ10) of the present invention as a template. , Human N-formyl peptide receptor protein (JC2014), rabbit N-formyl peptide receptor protein (A40520), mouse C5
a Anaphylatoxin receptor protein (A4652
5) and bovine neuropeptide Y receptor protein (S28787) and amino acids 32% and 32, respectively.
Homology of%, 30%, 27% and 27% was observed [Fig. 3]. From this, it is understood that the novel receptor protein of the present invention belongs to the G protein-coupled receptor protein family. The abbreviations in parentheses above are reference numbers when registered as data in NBRF-PIR, and are usually called Accession Numbers.
【００１０】すなわち、本発明は、（１）配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配
列を含有することを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質またはその塩、（２）第（１）項記載のいずれ
かのＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドま
たはその塩、（３）第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを
含有するＤＮＡ、（４）配列番号：２で表わされる塩基
配列で表される塩基配列を有する第（３）項記載のＤＮ
Ａ、（５）第（３）項記載のいずれかのＤＮＡを含有す
ることを特徴とするベクター、That is, the present invention provides (1) SEQ ID NO: 1.
A G protein-coupled receptor protein or a salt thereof comprising an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by: (2) any of the G protein-coupled receptor proteins according to (1) Partial peptide or a salt thereof, (3) a DNA containing a DNA having a nucleotide sequence encoding the G protein-coupled receptor protein according to (1), (4) represented by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 The DN according to item (3), which has a nucleotide sequence
A, a vector containing any of the DNAs described in (5) (3) above,
【００１１】（６）第（５）項記載のベクターを保持す
る形質転換体、（７）第（６）項記載の形質転換体を培
養し、形質転換体の細胞膜にＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質を生成せしめることを特徴とする第（１）項記載
のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩の製造
方法、（８）第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質もしくはその塩または第（２）項記載の部分ペ
プチドもしくはその塩と、試験化合物とを接触させるこ
とを特徴とする特徴とする第（１）項記載のＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質に対するリガンドの決定方法、(6) A transformant carrying the vector according to item (5) and a transformant according to (7) (6) are cultured, and the G protein-coupled receptor protein is present on the cell membrane of the transformant. Producing a G protein-coupled receptor protein or salt thereof according to item (1), (8) G protein-coupled receptor protein or salt thereof according to item (1), or ( 2) A method for determining a ligand for a G protein-coupled receptor protein according to item (1), characterized in that the partial peptide or salt thereof according to item 2 is contacted with a test compound.
【００１２】（９）（ｉ）第（１）項記載のＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質もしくはその塩または第（２）項
記載の部分ペプチドもしくはその塩に、リガンドを接触
させた場合と（ii）第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質もしくはその塩または第（２）項記載の
部分ペプチドもしくはその塩に、リガンドおよび試験化
合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とす
るリガンドと第（１）項記載のいずれかのＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質との結合を阻害する化合物またはそ
の塩をスクリーニングする方法、（１０）第（１）項記
載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩ま
たは第（２）項記載の部分ペプチドもしくはその塩を含
有することを特徴とするリガンドと第（１）項記載のＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合を阻害する化合
物またはその塩のスクリーニング用キット、および（１
１）第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
もしくはその塩または第（２）項記載の部分ペプチドも
しくはその塩に対する抗体を提供する。(9) (i) When a ligand is contacted with the G protein-coupled receptor protein or salt thereof described in (1) or the partial peptide or salt thereof described in (2), and (ii) It is characterized in that the G protein-coupled receptor protein or salt thereof according to item (1) or the partial peptide or salt thereof according to item (2) is contacted with a ligand and a test compound. A method for screening a compound or a salt thereof which inhibits the binding between a ligand and any of the G protein-coupled receptor proteins according to item (1), (10) the G protein-coupled receptor protein according to item (1), or A ligand comprising a salt thereof, the partial peptide according to item (2) or a salt thereof, and G according to item (1).
A kit for screening a compound or its salt that inhibits binding to a protein-coupled receptor protein, and (1
1) An antibody against the G protein-coupled receptor protein or salt thereof according to item (1) or the partial peptide or salt thereof according to item (2) is provided.
【００１３】より具体的には、（１２）蛋白質が、配列
番号：１で表わされるアミノ酸配列、配列番号：１で表
わされるアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸
が欠失したアミノ酸配列、配列番号：１で表わされるア
ミノ酸配列に１または２個以上のアミノ酸が付加したア
ミノ酸配列、あるいは配列番号：１で表わされるアミノ
酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が他のアミノ酸
で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白質である第
（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質または
その塩。More specifically, (12) the protein has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are deleted, An amino acid sequence in which 1 or 2 or more amino acids are added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or 1 or 2 or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are substituted with other amino acids The G protein-coupled receptor protein or salt thereof according to item (1), which is a protein containing an amino acid sequence.
【００１４】（１３）リガンドがアンギオテンシン、モ
ンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミ
ン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オ
ピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、Ｖ
ＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アンド リ
レイテッド ペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミ
ン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カ
ルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、ロイコト
リエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、ト
ロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、αおよびβ
−chemokine（ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯ
γ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１０、Ｇ
ＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３
０９、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳな
ど）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミ
ン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポ
リペプタイドまたはガラニンである第（８）項記載のリ
ガンドの決定方法、(13) The ligand is angiotensin, montbesin, cannabinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, V
IP (vasoactive intestinal and related peptide), somatostatin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene relayed peptide), leukotriene, pancreatin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, adrenaline, α and β
-Chemokine (IL-8, GROα, GROβ, GRO
γ, NAP-2, ENA-78, PF4, IP10, G
CP-2, MCP-1, HC14, MCP-3, I-3
09, MIP1α, MIP-1β, RANTES, etc.), endothelin, enterogastrin, histamine, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptide or galanin, and the method for determining a ligand according to the item (8),
【００１５】（１４）標識したリガンドを第（１）項記
載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩ま
たは第（２）項記載の部分ペプチドもしくはその塩に接
触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を
第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もし
くはその塩または第（２）項記載の部分ペプチドまたは
その塩に接触させた場合における、標識したリガンドの
第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もし
くはその塩または第（２）項記載の部分ペプチドもしく
はその塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴
とするリガンドと第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩の
スクリーニング方法、(14) The case where the labeled ligand is contacted with the G protein-coupled receptor protein or its salt described in (1) or the partial peptide or its salt described in (2), and the labeled ligand and The labeled ligand according to item (1) when the test compound is contacted with the G protein-coupled receptor protein according to item (1) or a salt thereof or the partial peptide according to item (2) or a salt thereof. A ligand characterized by measuring and comparing the amount of binding to a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof, or the partial peptide or a salt thereof described in (2), and the G protein-coupled receptor described in (1). A method for screening a compound or its salt that inhibits binding to a protein,
【００１６】（１５）標識したリガンドを第（１）項記
載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に
接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物
を第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
含有する細胞に接触させた場合における、標識したリガ
ンドの該細胞に対する結合量を測定し、比較することを
特徴とするリガンドと第（１）項記載のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質との結合を阻害する化合物またはその
塩のスクリーニング方法、（１６）標識したリガンドを
第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含
有する細胞の膜画分に接触させた場合と、標識したリガ
ンドおよび試験化合物を第（１）項記載のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を含有する細胞の膜画分に接触させ
た場合における、標識したリガンドの該細胞の膜画分に
対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガ
ンドと第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質との結合を阻害する化合物またはその塩のスクリーニ
ング方法、(15) The case where the labeled ligand is brought into contact with cells containing the G protein-coupled receptor protein according to item (1), and the labeled ligand and the test compound are added to the G protein according to item (1). The G protein-coupled receptor protein according to item (1), which is characterized by measuring and comparing the amount of labeled ligand bound to the cell when brought into contact with cells containing the coupled receptor protein. (16) A method for screening a compound or a salt thereof that inhibits the binding with, a case where a labeled ligand is brought into contact with a membrane fraction of a cell containing the G protein-coupled receptor protein according to (1), and When the ligand and the test compound are brought into contact with the membrane fraction of cells containing the G protein-coupled receptor protein according to (1), The binding amount of the identified ligand to the membrane fraction of the cell is measured and compared, and a compound or a salt thereof which inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein according to (1) Screening method,
【００１７】（１７）標識したリガンドを第（６）項記
載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の
細胞膜に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接
触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を
第（６）項記載の形質転換体を培養することによって該
形質転換体の細胞膜に発現したＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質に接触させた場合における、標識したリガンド
の該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する結合量を
測定し、比較することを特徴とするリガンドと第（１）
項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合を阻
害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、（１
８）第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
を活性化する化合物を第（１）項記載のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と、
第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を活
性化する化合物および試験化合物を第（１）項記載のＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触さ
せた場合における、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とす
るリガンドと第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩のスク
リーニング方法、(17) A case where the labeled ligand is brought into contact with a G protein-coupled receptor protein expressed on the cell membrane of the transformant by culturing the transformant described in (6), and the labeled ligand And a test compound, which is brought into contact with a G protein-coupled receptor protein expressed on the cell membrane of the transformant by culturing the transformant according to (6), the labeled ligand of the G protein-coupled form A ligand characterized by measuring and comparing the amount of binding to a receptor protein and the first (1)
Item 1. A method for screening a compound or a salt thereof, which inhibits binding to a G protein-coupled receptor protein according to item 1,
8) A case where a compound that activates the G protein-coupled receptor protein according to item (1) is contacted with a cell containing the G protein-coupled receptor protein according to item (1),
The compound and test compound which activate the G protein-coupled receptor protein according to item (1) are the compounds according to item (1).
The ligand and the G protein according to item (1), which are characterized by measuring and comparing the cell stimulating activity mediated by the G protein-coupled receptor protein when brought into contact with cells containing the protein-coupled receptor protein. A method for screening a compound or a salt thereof that inhibits binding to a conjugated receptor protein,
【００１８】（１９）第（１）項記載のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質を活性化する化合物を第（６）項記載
の形質転換体を培養することによって該形質転換体の細
胞膜に発現したＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触
させた場合と、第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質を活性化する化合物および試験化合物を第
（６）項記載の形質転換体を培養することによって該形
質転換体の細胞膜に発現したＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質に接触させた場合における、Ｇ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質を介する細胞刺激活性を測定し、比較する
ことを特徴とするリガンドと第（１）項記載のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質との結合を阻害する化合物また
はその塩のスクリーニング方法、(19) A compound which activates the G protein-coupled receptor protein according to item (1) is cultivated in the transformant according to item (6) to express G expressed on the cell membrane of the transformant. The method of contacting a protein-coupled receptor protein, and culturing the transformant according to item (6) with a compound that activates the G protein-coupled receptor protein according to item (1) and a test compound, A ligand characterized by measuring and comparing the cell stimulating activity mediated by the G protein-coupled receptor protein when contacted with the G protein-coupled receptor protein expressed on the cell membrane of the transformant and the term (1). A method for screening a compound or a salt thereof which inhibits the binding to the G protein-coupled receptor protein according to the description,
【００１９】（２０）第（１）項記載のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質を活性化する化合物がアンギオテンシ
ン、モンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グ
ルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチド
Ｙ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシ
ン、ＶＩＰ（バソアクティブ インテスティナル アン
ド リレイテッド ペプチド）、ソマトスタチン、ドー
パミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ
（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、ロイ
コトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジ
ン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、αお
よびβ−chemokine（ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、
ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１
０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、
Ｉ−３０９、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ
など）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミ
ン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポ
リペプタイドまたはガラニンである第（１８）項または
第（１９）項記載のスクリーニング方法、(20) The compound which activates the G protein-coupled receptor protein according to item (1) is angiotensin, monbesin, cannabinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin. , Oxytocin, VIP (vasoactive intestinal and related peptide), somatostatin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP
(Calcitonin gene relayed peptide), leukotriene, pancreatatin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, adrenaline, α and β-chemokine (IL-8, GROα, GROβ,
GROγ, NAP-2, ENA-78, PF4, IP1
0, GCP-2, MCP-1, HC14, MCP-3,
I-309, MIP1α, MIP-1β, RANTES
Etc.), endothelin, enterogastrin, histamine, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptide or galanin, the screening method according to item (18) or (19),
【００２０】（２１）第（９）項、第（１４）項〜第
（２０）項記載のスクリーニング方法で得られる化合物
またはその塩、（２２）第（２１）項記載の化合物また
はその塩を含有することを特徴とする医薬組成物、（２
３）第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
を含有する細胞を含有することを特徴とする第（１０）
項記載のスクリーニング用キット、（２４）第（１）項
記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞
の膜画分を含有することを特徴とする第（１０）項記載
のスクリーニング用キット、(21) A compound or a salt thereof obtained by the screening method described in (9) or (14) to (20), or (22) a compound or salt thereof described in (21). A pharmaceutical composition characterized by containing (2
3) A cell containing the G protein-coupled receptor protein according to the item (1), which is characterized in that the cell (10)
(24) The screening kit according to item (10), which comprises a membrane fraction of cells containing the G protein-coupled receptor protein according to item (1),
【００２１】（２５）第（１０）項、第（２３）項また
は第（２４）項記載のスクリーニング用キットを用いて
得られる化合物またはその塩、（２６）第（２５）項記
載の化合物またはその塩を含有することを特徴とする医
薬組成物、および（２７）第（１１）項記載の抗体と、
第（１）項記載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もし
くはその塩または第（２）項記載の部分ペプチドもしく
はその塩とを接触させることを特徴とする第（１）項記
載のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩ま
たは第（２）項記載の部分ペプチドもしくはその塩の定
量法を提供する。(25) A compound or a salt thereof obtained by using the screening kit according to item (10), (23) or (24), (26) a compound according to item (25), or A pharmaceutical composition comprising a salt thereof, and (27) the antibody according to (11),
The G protein-coupled receptor according to item (1), which is brought into contact with the G protein-coupled receptor protein according to item (1) or a salt thereof, or the partial peptide according to item (2) or a salt thereof. A method for quantifying a protein or a salt thereof or a partial peptide or a salt thereof according to the item (2) is provided.
【００２２】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
としては、温血動物（例えば、モルモット、ラット、マ
ウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、ヒトなど）
のあらゆる組織（例えば、胃、下垂体、膵臓、脳、腎
臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮
膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓など）または細胞な
どに由来するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質であっ
て、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に
同一のアミノ酸配列を含有するものであれば何なるもの
であってもよい。すなわち、本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質としては、配列番号：１で表わされるア
ミノ酸配列を含有する蛋白質などの他に、配列番号：１
で表わされるアミノ酸配列と約９０〜９９．９％の相同
性を有するアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表わ
されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の
活性を有する蛋白質などが挙げられる。実質的に同質の
活性としては、例えばリガンド結合活性、シグナル情報
伝達などが挙げられる。実質的に同質とは、リガンド結
合活性などが性質的に同質であることを示す。したがっ
て、リガンド結合活性の強さなどの強弱、レセプター蛋
白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。The G protein-coupled receptor protein of the present invention includes warm-blooded animals (eg, guinea pig, rat, mouse, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, human).
G derived from any tissue (eg, stomach, pituitary, pancreas, brain, kidney, liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, digestive tract, blood vessel, heart, etc.) or cells Any protein-coupled receptor protein may be used as long as it contains an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. That is, as the G protein-coupled receptor protein of the present invention, in addition to the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the like, SEQ ID NO: 1
And a protein containing an amino acid sequence having a homology of about 90 to 99.9% with the amino acid sequence represented by, and having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. To be Examples of substantially the same activity include ligand binding activity and signal transduction. "Substantially the same quality" means that the ligand binding activity and the like are qualitatively the same. Therefore, strength and weakness such as strength of ligand binding activity and quantitative factors such as molecular weight of receptor protein may be different.
【００２３】より具体的には、本発明のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質としては、配列番号：１で表わされる
アミノ酸配列を含有するウサギ胃幽門部平滑筋由来のＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質などが挙げられる。ま
た、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質として
は、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１また
は２個以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上の
アミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：１で表わ
されるアミノ酸配列中の１または２個以上のアミノ酸が
他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白
質なども挙げられる。さらに、本発明のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質には、Ｎ末端のMetが保護基（例え
ば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アシル基な
ど）で保護されているもの、ＧｌｕのＮ端側が生体内で
切断され、該Ｇｌｕがピログルタミン化したもの、分子
内のアミノ酸の側鎖が適当な保護基（例えば、ホルミル
基、アセチル基などのＣ1-6アシル基など）で保護され
ているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質
などの複合蛋白質なども含まれる。More specifically, the G protein-coupled receptor protein of the present invention is a G derived from rabbit gastric pyloric smooth muscle containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
Examples thereof include protein-coupled receptor proteins. Further, the G protein-coupled receptor protein of the present invention has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in which one or more amino acids are deleted, or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Alternatively, an amino acid sequence in which two or more amino acids are added, a protein containing an amino acid sequence in which one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are replaced with other amino acids, and the like are also included. Furthermore, in the G protein-coupled receptor protein of the present invention, the N-terminal Met is protected by a protecting group (eg, C1-6 acyl group such as formyl group and acetyl group), the N-terminal of Glu. The side is cleaved in vivo and the Glu is pyroglutaminated, and the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group (eg, formyl group, C1-6 acyl group such as acetyl group). Those that are present, or complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound are also included.
【００２４】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
の塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩
が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例え
ば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるい
は有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル
酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ
酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスル
ホン酸）との塩などが用いられる。本発明のＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質またはその塩は、温血動物の組織
または細胞から自体公知の蛋白質の精製方法によって製
造することもできるし、後述するＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を
培養することによっても製造することができる。また、
後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。The salt of the G protein-coupled receptor protein of the present invention is preferably a physiologically acceptable acid addition salt. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). , Tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like. The G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof can be produced from a tissue or cell of a warm-blooded animal by a method known per se for protein purification. It can also be produced by culturing the transformant containing it. Also,
It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
【００２５】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
の部分ペプチドとしては、例えば、本発明のＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出し
ている部位などが用いられる。具体的には、〔図２〕で
示される本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の疎
水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Hydrop
hilic）部位）であると分析された部分を含むペプチド
である。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含
むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメイ
ンを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメイン
を同時に含む部分のペプチドでも良い。本発明のＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドの塩として
は、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし
い。この様な塩としては、例えば無機酸（例えば、塩
酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機
酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マ
レイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚
酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸）との塩などが用いられる。As the partial peptide of the G protein-coupled receptor protein of the present invention, for example, a portion of the G protein-coupled receptor protein molecule of the present invention which is exposed outside the cell membrane is used. Specifically, in the hydrophobicity plot analysis of the G protein-coupled receptor protein of the present invention shown in FIG. 2, the extracellular region (hydrophilicity (Hydrop
hilic) site) is a peptide containing the analyzed portion. Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing each domain individually may be used, but a peptide of a part containing a plurality of domains at the same time may be used. As the salt of the partial peptide of the G protein-coupled receptor protein of the present invention, a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). , Tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
【００２６】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの
合成法に従って、あるいは本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによ
って製造することができる。ペプチドの合成法として
は、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても
良い。すなわち、本発明の蛋白質を構成し得る部分ペプ
チドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物
が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目
的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法
や保護基の脱離としてはたとえば、以下の〜に記載
された方法が挙げられる。The partial peptide of the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof is produced by a peptide synthesis method known per se or by cleaving the G protein-coupled receptor protein of the present invention with an appropriate peptidase. be able to. The peptide synthesis method may be either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid that can form the protein of the present invention with the remaining portion and removing the protecting group when the product has a protecting group. Examples of known condensation methods and elimination of protective groups include the methods described in the following (1) to (3).
【００２７】M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペ
プチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscienc
e Publishers, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成
広川書店 また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸
留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィ
ー・再結晶などを組み合わせて本発明のタンパク質を精
製単離することができる。上記方法で得られる蛋白質が
遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変
換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知
の方法によって遊離体に変換することができる。M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscienc
e Publishers, New York (1966) Schroeder and Luebke, The Peptide,
Academic Press, New York (1965) Nobuo Izumiya et al., Fundamentals and experiments of peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd.
(1975) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Laboratory for Biochemistry 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977) Supervised by Haruaki Yajima, Development of Pharmaceuticals Volume 14 Peptide Synthesis Hirokawa Shoten The protein of the present invention can be purified and isolated by a combination of purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like. When the protein obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method, and conversely, when it is obtained with a salt, it can be converted into a free form by a known method. it can.
【００２８】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
をコードするＤＮＡとしては、本発明の配列番号：１の
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする塩基配列
を含有するものであればいかなるものであってもよい。
また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、組織
・細胞由来のｃＤＮＡ、組織・細胞由来のｃＤＮＡライ
ブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリー
に使用するベクターはバクテリオファージ、プラスミ
ド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよ
い。また、組織・細胞よりｍＲＮＡ画分を調製したもの
を用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する。）によっ
て増幅することもできる。より具体的には、配列番号：
１のアミノ酸配列を含有するウサギ胃平滑筋由来のＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡとして
は、配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ
などが用いられる。The DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention includes a base encoding a G protein-coupled receptor protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention. It may be any as long as it contains the sequence.
It may be any of genomic DNA, genomic DNA library, tissue / cell-derived cDNA, tissue / cell-derived cDNA library, and synthetic DNA. The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. In addition, using the mRNA fraction prepared from tissues / cells, the reverse transcriptase polymerase chain was directly used.
It can also be amplified by a reaction (hereinafter, abbreviated as RT-PCR method). More specifically, SEQ ID NO:
The DNA encoding the G protein-coupled receptor protein derived from rabbit gastric smooth muscle containing the amino acid sequence of 1 is a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
Are used.
【００２９】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段として
は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分塩基配列を
有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって
増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡ
をヒトＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の一部あるいは
全領域を有するＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて
標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別
する。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば Molec
ular Cloning ２nd（ed.；J. Sambrook et al., Cold S
pring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに
従って行われる。また、市販のライブラリーを使用する
場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行う。ク
ローン化されたＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により
制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用
することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開
始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻
訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有
していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コ
ドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加する
こともできる。As a means for cloning the DNA completely encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention, a synthetic DNA primer having a partial base sequence of the G protein-coupled receptor protein is used for amplification by the PCR method, or Alternatively, the DNA incorporated into an appropriate vector
Are selected by hybridization with a DNA fragment having a part or whole region of human G protein-coupled receptor protein or labeled with a synthetic DNA. Hybridization methods include, for example, Molec
ular Cloning 2nd (ed .; J. Sambrook et al., Cold S
pring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, the method described in the attached instruction manual is used. The cloned DNA encoding the G protein-coupled receptor protein can be used as it is, or if desired after digestion with a restriction enzyme or addition of a linker, depending on the purpose. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5′-terminal side and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3′-terminal side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adaptor.
【００３０】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現ベ
クターは、例えば、（イ）本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ
断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベク
ター中のプロモーターの下流に連結することにより製造
することができる。ベクターとしては、大腸菌由来のプ
ラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１
２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵ
Ｂ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミ
ド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどの
バクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイ
ルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用い
られる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺
伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーター
であればいかなるものでもよい。The expression vector of the G protein-coupled receptor protein may be, for example, (a) a DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention
It can be produced by cutting out a fragment and (b) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. As the vector, a plasmid derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC1
2, pUC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pU
B110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), bacteriophage such as λ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc. are used. The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
【００３１】形質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌
である場合は、trp プロモーター、lac プロモーター、
recＡプロモーター、λＰＬプロモーター、lpp プロモ
ーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰ
Ｏ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、penＰプロ
モーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロ
モーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、
ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が動物細胞で
ある場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウ
イルスのプロモーター、メタロチオネインプロモータ
ー、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイル
スプロモーター、ＳＲαプロモーターなどがそれぞれ利
用できる。なお、発現にエンハンサーの利用も効果的で
ある。When the host for transformation is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the trp promoter, the lac promoter,
recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, etc., when the host is Bacillus, SP
When the host is yeast such as O1 promoter, SPO2 promoter and penP promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter,
The ADH promoter and the like are preferable. When the host is an animal cell, SV40-derived promoter, retrovirus promoter, metallothionein promoter, heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, SRα promoter and the like can be used. The use of enhancers for expression is also effective.
【００３２】また、必要に応じて、宿主に合ったシグナ
ル配列を、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のＮ端末側
に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ア
ルカリフォスファターゼ・シグナル配列、ＯmpＡ・シグ
ナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α
−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル
配列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングフ
ァクターα・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル
配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばイン
シュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグ
ナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用
できる。If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the G protein-coupled receptor protein. When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, alkaline phosphatase signal sequence, OmpA signal sequence, etc., and when the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, α
-Amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc., when the host is yeast, mating factor α-signal sequence, invertase signal sequence, etc., when the host is an animal cell, for example, insulin signal sequence , Α-interferon / signal sequence, antibody molecule / signal sequence, etc. can be used respectively.
【００３３】このようにして構築されたＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有するベクタ
ーを用いて、形質転換体を製造する。宿主としては、た
とえばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫、
動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌、バチル
ス属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escher
ichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ
・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci.
ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３
〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acid
s Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Jo
urnal ofMolecular Biology）〕，１２０巻，５１７(１
９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ
６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４
０(１９５４)〕などが用いられる。A transformant is produced using the vector containing the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein thus constructed. Examples of the host include Escherichia, Bacillus, yeast, insects,
Animal cells and the like are used. Specific examples of the genus Escherichia and the genus Bacillus include Escherichia coli (Escher
ichia coli) K12 DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci.
USA), Volume 60, 160 (1968)], JM103
[Nucleic Acids Research, (Nucleic Acid
s Research), Volume 9, 309 (1981)], JA221
[Journal of Molecular Biology (Jo
urnal of Molecular Biology)], 120, 517 (1
978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C
600 [Genetics, 39, 44
0 (1954)] and the like are used.
【００３４】バチルス属菌としては、たとえばバチルス
・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジー
ン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Bioch
emistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられ
る。酵母としては、たとえばサッカロマイセス セレビ
シエ（Saccaromyces cerevisiae)ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ
-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２な
どが用いられる。昆虫としては、例えばカイコの幼虫な
どが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１
５巻，５９２(１９８５)〕。Examples of the genus Bacillus include Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Bioch.
emistry), Vol. 95, 87 (1984)]. Examples of yeasts include Saccaromyces cerevisiae AH22 and AH22R.
-, NA87-11A, DKD-5D, such as 20B-12 are used. Examples of insects include silkworm larvae [Maeda et al., Nature, 31.
Volume 5, 592 (1985)].
【００３５】動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯ
Ｓ−７，Ｖero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，
ＤＨＦＲ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ
（ｄｈｆｒ-ＣＨＯ細胞），マウスＬ細胞，マウスミエ
ローマ細胞，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。エシェリ
ヒア属菌を形質転換するには、たとえばプロシージング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Aca
d. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１９７２)やジー
ン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方
法に従って行なわれる。バチルス属菌を形質転換するに
は、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェ
ネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１
６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行
われる。Examples of animal cells include monkey cells CO
S-7, Vero, Chinese hamster cell CHO,
DHFR gene defective Chinese hamster cell CHO
(Dhfr- CHO cells), mouse L cells, mouse myeloma cells, human FL cells and the like are used. For transformation of Escherichia, for example, Proc. Natl. Aca (Proc. Natl. Aca)
d. Sci. USA), 69, 2110 (1972) and Gene, 17: 107 (1982). For transforming Bacillus, for example, Molecular & General Genetics, 1
68, 111 (1979) and the like.
【００３６】酵母を形質転換するには、たとえばプロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl.Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８)
に記載の方法に従って行なわれる。昆虫細胞を形質転換
するには、たとえばバイオ／テクノロジー（Bio/Techno
logy）,6, 47-55(1988)）などに記載の方法に従って行
なわれる。動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィ
ロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記
載の方法に従って行なわれる。To transform yeast, for example, Procedures of the National Academy of Sciences of the USA (Proc. Na
tl.Acad. Sci. USA), 75, 1929 (1978).
It is performed according to the method described in. For transforming insect cells, for example, Bio / Techno
logy), 6, 47-55 (1988)) and the like. Transformation of animal cells is performed, for example, according to the method described in Virology, 52, 456 (1973).
【００３７】このようにして、Ｇ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで
形質転換された形質転換体が得られる。宿主がエシェリ
ヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する
際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であ
り、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒
素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源として
は、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、
ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩
類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カ
ゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無
機または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシ
ウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなど
が挙げられる。また、酵母、ビタミン類、生長促進因子
などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望まし
い。Thus, a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein can be obtained. When the host is culturing a transformant that is a bacterium of the genus Escherichia, a bacterium of the genus Bacillus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culture, and among them, a carbon source necessary for the growth of the transformant, A nitrogen source, an inorganic substance, etc. are contained. Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch,
Examples of nitrogen sources such as sucrose include inorganic or organic substances such as ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal and potato extract, and examples of inorganic substances include calcium chloride and phosphoric acid. Examples thereof include sodium dihydrogen and magnesium chloride. In addition, yeast, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5-8.
【００３８】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、たとえば３β−インドリル
アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主が
エシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で
約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加える
こともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常
約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通
気や撹拌を加えることもできる。As a medium for culturing Escherichia, for example, M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics (Journa
l of Experiments in Molecular Genetics), 431-
433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1
972] is preferable. If necessary, in order to make the promoter work efficiently, for example, 3β-indolyl is used.
A drug such as acrylic acid can be added. When the host is a bacterium of the genus Escherichia, the culture is usually performed at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added. When the host is a bacterium of the genus Bacillus, the culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and aeration and stirring can be added if necessary.
【００３９】宿主が酵母である形質転換体を培養する
際、培地としては、たとえばバークホールダー（Burkho
lder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、「プロシージン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１９８０)〕や
０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A.
ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエス
エー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５
３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５
〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３
５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌
を加える。When culturing a transformant whose host is yeast, the medium is, for example, Burkholder.
lder) Minimal medium [Bostian, KL, et al., "Proc. Natl. Ac.
ad. Sci. USA), 77, 4505 (1980)] and SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA.
Et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 81, 5,
330 (1984)]. PH of medium is about 5
It is preferable to adjust to -8. Culturing is usually about 20 ° C-3
It is performed at 5 ° C. for about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added if necessary.
【００４０】宿主が昆虫である形質転換体を培養する
際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.
C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化
した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが
用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整する
のが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行
い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞
である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえ
ば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエ
ンス（Seience），１２２巻，５０１(１９５２)〕，Ｄ
ＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６
(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・
オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション
（The Jounal of the American Medical Association）
１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシー
ジング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオ
ロジカル・メディスン（Proceeding of the Society fo
r the Biological Medicine），７３巻，１(１９５
０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好
ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時
間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。When culturing a transformant whose host is an insect, the medium is Grace's Insect Medium (Grace, T.
CC, Nature, 195,788 (1962)) to which an additive such as immobilized 10% bovine serum is appropriately added is used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culturing is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added if necessary. When culturing a transformant whose host is an animal cell, as a medium, for example, MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Seience, Volume 122, 501 (1952)], D
MEM medium [Virology, Volume 8, 396
(1959)], RPMI 1640 medium [Journal
The Jounal of the American Medical Association
199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society fo (Proceeding of the Society fo)
r the Biological Medicine), 73, 1 (195
0)] is used. The pH is preferably about 6-8. Culturing is usually carried out at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added if necessary.
【００４１】上記培養物からＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質を分離精製するには、例えば下記の方法により行
なうことができる。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養
後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当
な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または
凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したの
ち、遠心分離やろ過によりＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液
の中に尿素や塩酸グアニジンなどのたんぱく変性剤や、
トリトンＸ−１００（登録商標。以下、ＴＭと省略する
ことがある。）などの界面活性剤が含まれていてもよ
い。The G protein-coupled receptor protein can be separated and purified from the culture described above, for example, by the following method. When the G protein-coupled receptor protein is extracted from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, and the cells or cells are suspended in an appropriate buffer solution and subjected to ultrasonic wave, lysozyme and / or freezing. A method of obtaining a crude extract of G protein-coupled receptor protein by disrupting cells or cells by thawing and then centrifuging or filtering can be appropriately used. In the buffer solution, protein denaturants such as urea and guanidine hydrochloride,
A surfactant such as Triton X-100 (registered trademark; hereinafter, sometimes abbreviated as TM) may be included.
【００４２】培養液中にＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の
方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集め
る。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液
中に含まれるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の精製
は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行な
うことができる。これらの公知の分離、精製法として
は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透
析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差
を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの
荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラ
フィーなどの特異的新和性を利用する方法、逆相高速液
体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方
法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法
などが用いられる。When the G protein-coupled receptor protein is secreted into the culture medium, after the completion of the culture, the cells or cells are separated from the supernatant by a method known per se, and the supernatant is collected. Purification of the G protein-coupled receptor protein contained in the thus obtained culture supernatant or the extract can be carried out by appropriately combining separation / purification methods known per se. As the known separation and purification methods thereof, a method utilizing solubility such as salting out or solvent precipitation method, a dialysis method, an ultrafiltration method, a gel filtration method, and an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis method are mainly used. Difference, charge difference such as ion exchange chromatography, specific relevance such as affinity chromatography, hydrophobicity difference such as reversed-phase high performance liquid chromatography And a method of utilizing a difference in isoelectric points, such as an isoelectric focusing method.
【００４３】かくして得られるＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法
あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することが
でき、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるい
はそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換
することができる。なお、組換え体が産生するＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質を、精製前または精製後に適当
な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を
加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもでき
る。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモ
トリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテイ
ンキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かくし
て生成するＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の活性は標
識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエ
ンザイムイムノアッセイなどにより測定することができ
る。When the G protein-coupled receptor protein thus obtained is obtained as a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained as a salt. The free form or other salt can be converted by a method known per se or a method analogous thereto. The G protein-coupled receptor protein produced by the recombinant can be optionally modified or partially removed by reacting it with an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification. . Examples of the protein-modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like. The activity of the G protein-coupled receptor protein thus produced can be measured by a binding experiment with a labeled ligand, an enzyme immunoassay using a specific antibody, or the like.
【００４４】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
をコードするＤＮＡおよびＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質は、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に
対するリガンドの決定方法、抗体および抗血清の入
手、組換え型レセプター蛋白質の発現系の構築、同
発現系を用いたレセプター結合アッセイ系の開発と医薬
品候補化合物のスクリーニング、構造的に類似したリ
ガンド・レセプターとの比較にもとづいたドラッグデザ
インの実施、遺伝子診断におけるプローブ、ＰＣＲプ
ライマーの作成、トランスジェニック動物の作製、
レセプター蛋白質ＤＮＡの欠失による病態モデル動物の
作製等に用いることができる。特に、本発明の組み替え
型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現系を用いたレ
セプター結合アッセイ系によって、ヒトなどの温血動物
に特異的なＧ蛋白質共役型レセプターアゴニストまたは
アンタゴニストをスクリーニングすることができ、該ア
ゴニストまたはアンタゴニストを各種疾病の予防・治療
剤などとして使用することができる。本発明のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質、部分ペプチド、Ｇ蛋白質共役
型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡおよび抗体の用
途について、以下により具体的に説明するThe DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention and the G protein-coupled receptor protein are the method for determining the ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention, the acquisition of antibodies and antisera, and the recombinant type. Construction of receptor protein expression system, development of receptor binding assay system using the expression system, screening of drug candidate compounds, drug design based on comparison with structurally similar ligand / receptor, probe in gene diagnosis , Making PCR primers, making transgenic animals,
It can be used for preparation of pathological model animals by deletion of receptor protein DNA. In particular, a G protein-coupled receptor agonist or antagonist specific to warm-blooded animals such as humans can be screened by a receptor binding assay system using the recombinant G protein-coupled receptor protein expression system of the present invention, The agonist or antagonist can be used as a prophylactic / therapeutic agent for various diseases. The use of the G protein-coupled receptor protein, partial peptide, DNA encoding the G protein-coupled receptor protein and antibody of the present invention will be described more specifically below.
【００４５】（１）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質に対するリガンドの決定方法 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその
塩または本発明の部分ペプチドもしくはその塩は、本発
明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンド
を探索しまたは決定するための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、本発明のＧ蛋白質共役型レセプタ
ー蛋白質もしくはその塩または本発明の部分ペプチドも
しくはその塩と、試験化合物とを接触させることを特徴
とする本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対す
るリガンドの決定方法を提供する。(1) Method for determining ligand for G protein-coupled receptor protein of the present invention The G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof or the partial peptide of the present invention or a salt thereof is a G protein-coupled type of the present invention. It is useful as a reagent for searching or determining a ligand for a receptor protein.
That is, the present invention relates to the G protein-coupled receptor protein of the present invention, which comprises contacting a test compound with the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof or the partial peptide of the present invention or a salt thereof. A method for determining a ligand is provided.
【００４６】試験化合物としては、公知のリガンド（例
えば、アンギオテンシン、モンベシン、カナビノイド、
コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニ
ン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプ
レッシン、オキシトシン、ＶＩＰ（バソアクティブ イ
ンテスティナル アンド リレイテッド ペプチド）、
ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブ
ラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティ
ッドペプチド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチ
ン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシ
ン、アドレナリン、αおよびβ−chemokine（ＩＬ−
８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮ
Ａ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−
１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩＰ１α、
ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなど）、エンドセリン、エ
ンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、Ｔ
ＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニンな
ど）の他に、例えば温血動物（例えば、マウス、ラッ
ト、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出
物、細胞培養上清などが用いられる。例えば、該組織抽
出物、細胞培養上清などを本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質に添加し、細胞刺激活性などを測定しなが
ら分画し、最終的に単一のリガンドを得ることができ
る。As the test compound, known ligands (eg, angiotensin, montbesin, cannabinoid,
Cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, VIP (vasoactive intestinal and related peptide),
Somatostatin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene relayed peptide), leukotriene, pancreatatin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, adrenaline, α- and β-chemokine (IL-
8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2, EN
A-78, PF4, IP10, GCP-2, MCP-
1, HC14, MCP-3, I-309, MIP1α,
MIP-1β, RANTES, etc.), endothelin, enterogastrin, histamine, neurotensin, T
In addition to RH, pancreatic polypeptide, galanin, etc., for example, tissue extracts of warm-blooded animals (eg, mouse, rat, pig, cow, sheep, monkey, human, etc.), cell culture supernatant, etc. are used. . For example, the tissue extract, cell culture supernatant, etc. may be added to the G protein-coupled receptor protein of the present invention and fractionated while measuring the cell stimulating activity and the like to finally obtain a single ligand. .
【００４７】具体的には、本発明のリガンド決定方法
は、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは
その塩、または本発明の部分ペプチドもしくはその塩を
用いるか、または組換え型レセプター蛋白質の発現系を
構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を
用いることによって、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質
に結合して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、
アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭ
Ｐ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産
生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆ
ｏｓ活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制
する活性）を有する化合物（例えば、ペプチド、蛋白
質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物な
ど）またはその塩を決定する方法である。本発明のリガ
ンド決定方法においては、本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質または本発明の部分ペプチドと試験化合物
とを接触させた場合の、例えば該Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質または該部分ペプチドに対する試験化合物の
結合量、細胞刺激活性などを測定することを特徴とす
る。Specifically, the method for determining a ligand of the present invention uses the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof, or the partial peptide of the present invention or a salt thereof, or expresses a recombinant receptor protein. By constructing a system and using a receptor binding assay system using the expression system, a cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release, binding to a G protein-coupled receptor protein,
Acetylcholine release, intracellular Ca2+ release, intracellular cAM
P production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, cf
It is a method for determining a compound (for example, a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, etc.) or a salt thereof having an os activation, an activity of promoting or suppressing a decrease in pH, etc.). In the method for determining a ligand of the present invention, when the test compound is contacted with the G protein-coupled receptor protein of the present invention or the partial peptide of the present invention, for example, a test compound for the G protein-coupled receptor protein or the partial peptide It is characterized by measuring the amount of binding of the, the cell stimulating activity and the like.
【００４８】より具体的には、本発明は、 標識した試験化合物を、本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質もしくはその塩または本発明の部分ペプチ
ドもしくはその塩に接触させた場合における、標識した
試験化合物の該蛋白質もしくはその塩、または該部分ペ
プチドもしくはその塩に対する結合量を測定することを
特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリ
ガンドの決定方法、 標識した試験化合物を、本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接
触させた場合における、標識した試験化合物の該細胞ま
たは該膜画分に対する結合量を測定することを特徴とす
るＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの
決定方法、More specifically, the present invention provides a labeled test in which a labeled test compound is contacted with the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof or the partial peptide of the present invention or a salt thereof. A method for determining a ligand for a G protein-coupled receptor protein, which comprises measuring a binding amount of a compound to the protein or a salt thereof, or the partial peptide or a salt thereof, and a labeled test compound is used as a G protein-conjugated compound of the present invention. G protein-coupled receptor protein characterized by measuring the amount of labeled test compound bound to the cell or the membrane fraction when contacted with the cell containing the receptor protein or the membrane fraction of the cell For determining the ligand for
【００４９】標識した試験化合物を、本発明のＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有す
る形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現し
たＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合に
おける、標識した試験化合物の該Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質に対する結合量を測定しすることを特徴とす
るＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドの
決定方法、 試験化合物を、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を含有する細胞に接触させた場合における、Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質を介した細胞刺激活性（例え
ば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃ
ａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、
イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白
質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを
促進する活性または抑制する活性など）を測定すること
を特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する
リガンドの決定方法、およびIn the case where the labeled test compound is brought into contact with the G protein-coupled receptor protein expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention. A method for determining a ligand for a G protein-coupled receptor protein, which comprises measuring the amount of a labeled test compound bound to the G protein-coupled receptor protein, the test compound being a G protein-coupled receptor protein of the present invention -Stimulating activity mediated by G protein-coupled receptor protein (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular C
a2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production,
G protein-coupled receptor characterized by measuring inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, activity promoting or suppressing pH decrease, etc. Method for determining ligand for protein, and
【００５０】試験化合物を、本発明のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転
換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合における、
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性
（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細
胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ
生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞
内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下
などを促進する活性または抑制する活性など）を測定す
ることを特徴とするＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に
対するリガンドの決定方法を提供する。When the test compound is brought into contact with the G protein-coupled receptor protein expressed on the cell membrane by culturing the transformant containing the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention,
Cell stimulating activity via G protein-coupled receptor protein (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP
Production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, activity promoting or suppressing pH decrease, etc.) A method for determining a ligand for a receptor protein of type I is provided.
【００５１】本発明のリガンド決定方法の具体的な説明
を以下にする。まず、リガンド決定方法に用いるＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質としては、本発明のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質または本発明のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質の部分ペプチドを含有するものであれ
ば何れのものであってもよいが、動物細胞を用いて大量
発現させたＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質が適してい
る。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を製造するには、
前述の方法が用いられるが、該蛋白質をコードするＤＮ
Ａを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することにより行う
ことができる。目的部分をコードするＤＮＡ断片には相
補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるも
のではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いて
もよい。A specific description of the ligand determination method of the present invention will be given below. First, any G protein-coupled receptor protein used in the method for determining a ligand may be used as long as it contains the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein of the present invention. However, a G protein-coupled receptor protein expressed in large quantities using animal cells is suitable. To produce a G protein-coupled receptor protein,
The above-mentioned method can be used, but DN encoding the protein is used.
It can be carried out by expressing A in mammalian cells or insect cells. Although complementary DNA is used as the DNA fragment encoding the target portion, it is not necessarily limited thereto. For example, a gene fragment or synthetic DNA may be used.
【００５２】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコード
するＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率
よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主と
するバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nu
clear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプ
ロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイ
ルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、
ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイル
スプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み
込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査
はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文
献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜
19559頁,1992年〕に記載の方法に従って行うことができ
る。A nuclear polyhedrosis virus belonging to a baculovirus that uses an insect host as a host for introducing a DNA fragment encoding a G protein-coupled receptor protein into a host animal cell and expressing them efficiently (Nu
clear polyhedrosis virus (NPV) polyhedrin promoter, SV40-derived promoter, retrovirus promoter, metallothionein promoter,
It is preferably incorporated downstream of the human heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, SRα promoter and the like. The amount and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, the literature [Nambi, P. Et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), Vol. 267, 19555-.
[19559, 1992].
【００５３】したがって、本発明のリガンド決定方法に
おいて、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドを含有するも
のとしては、それ自体公知の方法に従って精製したＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質または該Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質の部分ペプチドであってもよいし、該蛋
白質を含有する細胞を用いてもよく、また該蛋白質を含
有する細胞の膜画分を用いてもよい。本発明のリガンド
決定方法において、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒ
ド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は
それ自体公知の方法に従って行うことができる。Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞としては、Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現した宿主細胞をい
うが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆
虫細胞、動物細胞などが挙げられる。Therefore, in the method for determining a ligand of the present invention, the G protein-coupled receptor protein or the partial peptide of the G protein-coupled receptor protein is a G protein-coupled receptor protein purified by a method known per se. Alternatively, it may be a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein, cells containing the protein may be used, or a membrane fraction of cells containing the protein may be used. When a cell containing a G protein-coupled receptor protein is used in the ligand determination method of the present invention, the cell may be immobilized with glutaraldehyde, formalin or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se. The cells containing the G protein-coupled receptor protein include G
The host cell expressing the protein-coupled receptor protein includes Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells and the like.
【００５４】細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、
それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画
分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−El
vehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリ
ングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による
破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧し
ながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕
などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法
や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主と
して用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒ
ｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０
分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３
００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られ
る沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜
蛋白質などの膜成分が多く含まれる。As the cell membrane fraction, after crushing the cells,
It refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a method known per se. As a cell disruption method, Potter-El
Examples of the method include crushing cells with a vehjem homogenizer, crushing with a Waring blender or Polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, and crushing by ejecting cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press. For the fractionation of the cell membrane, a fractionation method by centrifugal force such as a fractionation centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used. For example, the cell lysate should be slow (500r
pm to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes)
Centrifuge, and the supernatant is spun at a higher speed (15000 rpm to 3
It is usually centrifuged at 0000 rpm) for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as a membrane fraction. The membrane fraction is rich in expressed G protein-coupled receptor protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
【００５５】該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有
する細胞や膜画分中のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
の量は、１細胞当たり１０3〜１０8分子であるのが好ま
しく、１０5〜１０7分子であるのが好適である。なお、
発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比
活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が
可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測
定できるようになる。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質
に結合するリガンドを決定する前記の〜の方法を実
施するためには、適当なＧ蛋白質共役型レセプター画分
と、標識した試験化合物が必要である。Ｇ蛋白質共役型
レセプター画分としては、天然型のＧ蛋白質共役型レセ
プター画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え
型Ｇ蛋白質共役型レセプター画分などが望ましい。ここ
で、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示
す。The amount of the G protein-coupled receptor protein in the cell or the membrane fraction containing the G protein-coupled receptor protein is preferably 103 to 108 molecules per cell, and 105 to 107 It is preferably a molecule. In addition,
The higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, which makes it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large number of samples in the same lot. In order to carry out the above methods (1) to (3) for determining a ligand that binds to a G protein-coupled receptor protein, an appropriate G protein-coupled receptor fraction and a labeled test compound are required. As the G protein-coupled receptor fraction, a natural G protein-coupled receptor fraction or a recombinant G protein-coupled receptor fraction having an activity equivalent to that is desirable. Here, the equivalent activity refers to equivalent ligand binding activity and the like.
【００５６】標識した試験化合物としては、〔3Ｈ〕、
〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識したアンギ
オテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキ
ニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロ
ペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オ
キシトシン、ＶＩＰ（バソアクティブ インテスティナ
ル アンド リレイテッド ペプチド）、ソマトスタチ
ン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、
ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプチ
ド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタ
グランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリ
ン、αおよびβ−chemokine（ＩＬ−８、ＧＲＯα、Ｇ
ＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ
４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、Ｍ
ＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ−１β、Ｒ
ＡＮＴＥＳなど）、エンドセリン、エンテロガストリ
ン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレ
アティックポリペプタイド、ガラニンなどが好適であ
る。The labeled test compound includes [3 H],
Angiotensin, bombesin, cannabinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, VIP (vasoactive) labeled with [125 I], [14 C], [35 S], etc. Intestinal and related peptide), somatostatin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin,
CGRP (calcitonin gene relayed peptide), leukotriene, pancreatatin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, adrenaline, α and β-chemokine (IL-8, GROα, G
ROβ, GROγ, NAP-2, ENA-78, PF
4, IP10, GCP-2, MCP-1, HC14, M
CP-3, I-309, MIP1α, MIP-1β, R
(ANTES, etc.), endothelin, enterogastrin, histamine, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptide, galanin and the like are preferable.
【００５７】具体的には、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋
白質に結合するリガンドの決定方法を行うには、まずＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞または細
胞の膜画分を、決定方法に適したバッファーに懸濁する
ことによりレセプター標品を調製する。バッファーに
は、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バ
ッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレ
セプターとの結合を阻害しないバッファーであればいず
れでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、
ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０TM（花王−アトラス
社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤
やウシ血清アルブミンやゼラチンなどの各種蛋白質をバ
ッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼ
によるリセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭ
ＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、
ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加すること
もできる。Specifically, in order to carry out a method for determining a ligand that binds to a G protein-coupled receptor protein, first, G
A receptor preparation is prepared by suspending cells or a membrane fraction of cells containing a protein-coupled receptor protein in a buffer suitable for the determination method. Any buffer may be used as long as it does not inhibit the binding between the ligand and the receptor, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably a pH of 6 to 8) and a Tris-hydrochloric acid buffer. In addition, for the purpose of reducing non-specific binding,
Surfactants such as CHAPS, Tween-80™ (Kao-Atlas), digitonin and deoxycholate, and various proteins such as bovine serum albumin and gelatin may be added to the buffer. In addition, PM is used to suppress the decomposition of receptors and ligands by protease.
SF, leupeptin, E-64 (made by Peptide Institute),
Protease inhibitors such as pepstatin can also be added.
【００５８】０.０１ｍｌ〜１０ｍlの該レセプター溶液
に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の
〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識し
た試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）
を知るために大過剰の未標識の試験化合物を加えた反応
チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましく
は４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３
０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過
し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙
に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンター
あるいはγ−カウンターで計測する。全結合量（Ｂ）か
ら非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ−Ｎ
ＳＢ）が０ｃｐｍを越える試験化合物を本発明のＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質に対するリガンドとして選択
することができる。A fixed amount (5000 cpm to 500,000 cpm) of a test compound labeled with [3 H], [125 I], [14 C], [35 S] or the like is allowed to coexist with 0.01 ml to 10 ml of the receptor solution. . Non-specific binding (NSB)
Also prepare a reaction tube containing a large excess of unlabeled test compound. The reaction is carried out at 0 ° C to 50 ° C, preferably 4 ° C to 37 ° C for 20 minutes to 24 hours, preferably 3
Do from 0 minutes to 3 hours. After the reaction, the mixture is filtered through a glass fiber filter paper or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter paper is measured with a liquid scintillation counter or a γ-counter. Count (BN) obtained by subtracting the nonspecific binding amount (NSB) from the total binding amount (B).
A test compound having an SB of more than 0 cpm can be selected as a ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention.
【００５９】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に結合す
るリガンドを決定する前記の〜の方法を実施するた
めには、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を介する細胞
刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン
遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内
ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐ
Ｈの低下などを促進する活性または抑制する活性など）
を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定す
ることができる。具体的には、まず、Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質を含有する細胞をマルチウェルプレート
等に培養する。In order to carry out the above methods (1) to (3) for determining a ligand that binds to a G protein-coupled receptor protein, cell stimulating activity mediated by the G protein coupled receptor protein (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, cell Intracellular Ca2+ release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, p
Activity that promotes or suppresses reduction of H, etc.)
Can be measured using a known method or a commercially available measurement kit. Specifically, first, cells containing the G protein-coupled receptor protein are cultured in a multiwell plate or the like.
【００６０】リガンド決定を行なうにあたっては前もっ
て新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッ
ファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間イ
ンキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収
して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量す
る。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキド
ン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって
検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加し
てアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制
などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基
礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作
用として検出することができる。In determining the ligand, the medium is exchanged with a fresh medium or an appropriate buffer which does not show toxicity to cells in advance, a test compound or the like is added and incubated for a certain period of time, and then cells are extracted or a supernatant is collected. Then, the produced product is quantified according to each method. When the production of a substance that serves as an index of cell stimulating activity (for example, arachidonic acid) is difficult to assay by the degrading enzyme contained in the cell, an inhibitor for the degrading enzyme may be added to the assay. Further, the activity of suppressing cAMP production and the like can be detected as a production suppressing action on cells in which the basic production amount of cells has been increased by forskolin or the like.
【００６１】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
に結合するリガンド決定用キットは、本発明のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質またはその塩、本発明のＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその
塩、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有す
る細胞、あるいは本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を含有する細胞の膜画分を含有するものである。本
発明のリガンド決定用キットの例としては、次のものが
挙げられる。 １．リガンド決定用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。The kit for determining a ligand that binds to the G protein-coupled receptor protein of the present invention comprises a G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof, a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof, A cell containing the G protein-coupled receptor protein of the present invention, or a membrane fraction of a cell containing the G protein-coupled receptor protein of the present invention. Examples of the ligand determination kit of the present invention include the following. 1. Ligand determination reagent Measurement buffer and washing buffer Hanks' Balanced Salt Solution (manufactured by Gibco) was added with 0.
To which 05% bovine serum albumin (manufactured by Sigma) was added. Sterilize by filtration with a 0.45μm filter at 4 ℃
It may be stored at or prepared at the time of use.
【００６２】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質標品 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細
胞を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３
７℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したも
の。 標識試験化合物 市販の〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで
標識した化合物、または適当な方法で標識化したもの水
溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、
用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。水に難溶性
を示す試験化合物については、ジメチルホルムアミド、
ＤＭＳＯ、メタノール等に溶解する。 非標識試験化合物 標識化合物を同じものを１００〜１０００倍濃い濃度に
調製する。G protein-coupled receptor protein preparation CHO cells expressing the G protein-coupled receptor protein were subcultured on a 12-well plate at 5 × 105 cells / well and 3
One cultured at 7 ° C., 5% CO2 , 95% air for 2 days. Labeled test compound Compound labeled with commercially available [3 H], [125 I], [14 C], [35 S] or the like, or labeled by an appropriate method in an aqueous solution at 4 ° C. or −20 Store at ℃,
When using, dilute to 1 μM with measurement buffer. For test compounds that are poorly soluble in water, dimethylformamide,
Dissolve in DMSO, methanol, etc. Unlabeled test compound The same labeled compound is prepared at a concentration of 100 to 1000 times higher.
【００６３】２．測定法 １２穴組織培養用プレートにて培養したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を、測定用
緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩
衝液を各穴に加える。 標識試験化合物を５μｌ加え、室温にて１時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには非標識試験化合物
を５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識試験化合物を０.２Ｎ ＮａＯ
Ｈ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーター
Ａ（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定する。2. Assay method G-protein coupled receptor protein-expressing CHO cells cultured in a 12-well tissue culture plate are washed twice with 1 ml of assay buffer, and then 490 μl of assay buffer is added to each well. 5 μl of the labeled test compound is added, and the mixture is reacted at room temperature for 1 hour. To know the amount of non-specific binding, 5 μl of unlabeled test compound is added. Remove the reaction solution and wash 3 times with 1 ml of wash buffer. The labeled test compound bound to the cells was treated with 0.2 N NaO.
It is dissolved in H-1% SDS and mixed with 4 ml of liquid scintillator A (manufactured by Wako Pure Chemical Industries). Liquid scintillation counter (Beckman)
Is used to measure the radioactivity.
【００６４】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
に結合することができるリガンドとしては、例えば脳、
下垂体、膵臓などに特異的に存在する物質などが挙げら
れ、具体的にはアンギオテンシン、ボンベシン、カナビ
ノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、
メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリ
ン、バソプレッシン、オキシトシン、ＶＩＰ（バソアク
ティブ インテスティナル アンド リレイテッド ペ
プチド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、ア
ミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーン
リレーティッドペプチド）、ロイコトリエン、パンクレ
アスタチン、プロスタグランジン、トロンボキサン、ア
デノシン、アドレナリン、αおよびβ−chemokine（Ｉ
Ｌ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、
ＥＮＡ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ
−１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩＰ１
α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなど）、エンドセリ
ン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシ
ン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラ
ニンなどが挙げられる。As the ligand capable of binding to the G protein-coupled receptor protein of the present invention, for example, brain,
Examples include substances specifically present in the pituitary gland, the pancreas, and the like. Specifically, angiotensin, bombesin, cannabinoids, cholecystokinin, glutamine, serotonin,
Melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxytocin, VIP (vasoactive intestinal and related peptide), somatostatin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene relayed peptide), leukotriene, pancreatatin. , Prostaglandins, thromboxane, adenosine, adrenaline, α and β-chemokine (I
L-8, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2,
ENA-78, PF4, IP10, GCP-2, MCP
-1, HC14, MCP-3, I-309, MIP1
α, MIP-1β, RANTES, etc.), endothelin, enterogastrin, histamine, neurotensin, TRH, pancreatic polypeptide, galanin and the like.
【００６５】（２）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質に対するリガンドの定量法 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその
塩、または本発明の部分ペプチドまたはその塩は、リガ
ンドに対して結合性を有しているので、生体内における
リガンド濃度を感度良く定量することができる。本発明
の定量法は、例えば競合法と組み合わせることによって
用いることができる。すなわち、被検体を本発明のＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩、またはＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドもしくは
その塩と接触させることによって被検体中のリガンド濃
度を測定することができる。具体的には、例えば、以下
のまたはなどに記載の方法あるいはそれに準じる方
法に従って用いることができる。 入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４
９年発行） 入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和
５４年発行）(2) Method for quantifying a ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention The G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof, or the partial peptide of the present invention or a salt thereof has a binding property to a ligand. Since it has, the ligand concentration in the living body can be quantified with high sensitivity. The quantification method of the present invention can be used, for example, in combination with a competitive method. That is, the subject is a G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof, or G
The ligand concentration in the test sample can be measured by bringing it into contact with a partial peptide of the protein-coupled receptor protein or a salt thereof. Specifically, for example, it can be used according to the method described below or the like or a method similar thereto. Hiroshi Irie "Radioimmunoassay" (Kodansha, Showa 4
Published in 9 years) Hiroshi Irie “Radioimmunoassay” (Kodansha, 1979)
【００６６】（３）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質とリガンドの結合を阻害する化合物のスクリーニ
ング方法 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその
塩、または本発明の部分ペプチドもしくはその塩を用い
るか、または組換え型レセプター蛋白質の発現系を構築
し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用い
ることによって、リガンドとＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質との結合を阻害する化合物（例えば、ペプチド、
蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物
など）またはその塩をスクリーニングすることができ
る。このような化合物には、Ｇ蛋白質共役型レセプター
を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、ア
セチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ
生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、
細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ
の活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制す
る活性など）を有する化合物（いわゆる本発明のＧ蛋白
質共役型レセプターアゴニスト）と該細胞刺激活性を有
しない化合物（いわゆる本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ターアンタゴニスト）などが含まれる。(3) Method for screening compound that inhibits binding between G protein-coupled receptor protein of the present invention and ligand Use the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof, or the partial peptide of the present invention or a salt thereof. Or a compound that inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein by constructing an expression system for a recombinant receptor protein and using a receptor binding assay system using the expression system (for example, peptide,
Proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.) or salts thereof can be screened. Such compounds include cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2+ release, intracellular cAMP) via G protein-coupled receptors.
Production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production,
Cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos
And a compound (so-called G protein-coupled receptor agonist of the present invention) that does not have the cell stimulating activity (so-called G protein-coupled of the present invention). Type receptor antagonists) and the like.
【００６７】すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または本発
明の部分ペプチドもしくはその塩に、リガンドを接触さ
せた場合と（ii）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質もしくはその塩または本発明の部分ペプチドもしく
はその塩に、リガンドおよび試験化合物を接触させた場
合との比較を行なうことを特徴とするリガンドと本発明
のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合を阻害する
化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）本発明
のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質または本発明の部分
ペプチドに、リガンドを接触させた場合と（ii）本発明
のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質または本発明の部分
ペプチドに、リガンドおよび試験化合物を接触させた場
合における、例えば該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質
または該部分ペプチドに対するリガンドの結合量、細胞
刺激活性などを測定して、比較することを特徴とする。That is, the present invention includes (i) a case where a ligand is brought into contact with the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof, or a partial peptide of the present invention or a salt thereof, and (ii) the G protein of the present invention. Comparison of a ligand and a G protein-coupled receptor protein of the present invention, which is characterized in that a ligand and a test compound are contacted with the coupled receptor protein or a salt thereof or a partial peptide of the present invention or a salt thereof. A method for screening a compound or a salt thereof that inhibits binding is provided.
In the screening method of the present invention, (i) a case where a ligand is contacted with the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a partial peptide of the present invention, and (ii) a G protein-coupled receptor protein of the present invention or the present invention When the ligand and the test compound are contacted with the partial peptide of, the binding amount of the ligand to the G protein-coupled receptor protein or the partial peptide, the cell stimulating activity, etc. are measured and compared. .
【００６８】より具体的には、本発明は、 標識したリガンドを、本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質もしくはその塩または本発明のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩に接触
させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物を本
発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩
または本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分
ペプチドもしくはその塩に接触させた場合における、標
識したリガンドの該蛋白質もしくはその塩、または該部
分ペプチドもしくはその塩に対する結合量を測定し、比
較することを特徴とするリガンドと本発明のＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質との結合を阻害する化合物または
その塩のスクリーニング方法、More specifically, in the present invention, the labeled ligand is brought into contact with the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof or a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof. And a labeled ligand and a test compound are contacted with the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof or a partial peptide of the G protein coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof, A method for screening a compound or a salt thereof which inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention, which comprises measuring and comparing the amount of binding to a protein or a salt thereof, or the partial peptide or a salt thereof. ,
【００６９】標識したリガンドを、本発明のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質を含有する細胞または該細胞の
膜画分に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試
験化合物を本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合に
おける、標識したリガンドの該細胞または該膜画分に対
する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガン
ドと本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合
を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、When the labeled ligand is brought into contact with a cell containing the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a membrane fraction of the cell, the labeled ligand and a test compound are added to the G protein-coupled receptor of the present invention. The amount of a labeled ligand bound to the cell or the membrane fraction when contacted with a cell containing the protein or the membrane fraction of the cell is measured and compared with the ligand of the present invention and G of the present invention. A method for screening a compound or a salt thereof that inhibits binding to a protein-coupled receptor protein,
【００７０】標識したリガンドを、本発明のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する
形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合と、
標識したリガンドおよび試験化合物を本発明のＧ蛋白質
共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する
形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合にお
ける、標識したリガンドの該Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質に対する結合量を測定し、比較することを特徴と
するリガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質との結合を阻害する化合物またはその塩のスクリーニ
ング方法、When the labeled ligand is brought into contact with the G protein-coupled receptor protein expressed on the cell membrane by culturing the transformant containing the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention,
Labeling when a labeled ligand and a test compound are contacted with a G protein-coupled receptor protein expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing a DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention A method for screening a compound or a salt thereof, which inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention, which comprises measuring and comparing the amount of binding of the ligand to the G protein-coupled receptor protein.
【００７１】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質を活性化する化合物（例えば、本発明のＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質に対するリガンドなど）を本発明の
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触
させた場合と、本発明のＧ蛋白質共役型レセプターを活
性化する化合物および試験化合物を本発明のＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合
における、Ｇ蛋白質共役型レセプターを介した細胞刺激
活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊
離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃ
ＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変
動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐ
Ｈの低下などを促進する活性または抑制する活性など）
を測定し、比較することを特徴とするリガンドと本発明
のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合を阻害する
化合物またはその塩のスクリーニング方法、およびA compound that activates the G protein-coupled receptor protein of the present invention (eg, a ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention) is brought into contact with cells containing the G protein-coupled receptor protein of the present invention. And a compound that activates the G protein-coupled receptor of the present invention and a test compound are contacted with cells containing the G protein-coupled receptor protein of the present invention, cells mediated by the G protein-coupled receptor Stimulatory activity (eg arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2+ release, intracellular cAMP production, intracellular c
GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, p
Activity that promotes or suppresses reduction of H, etc.)
And a method for screening a compound or a salt thereof which inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention, which comprises:
【００７２】本発明のＧ蛋白質共役型レセプターを活
性化する化合物（例えば、本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質に対するリガンドなど）を本発明のＧ蛋白
質共役型レセプター蛋白質をコードするＤＮＡを含有す
る形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現し
たＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に接触させた場合
と、本発明のＧ蛋白質共役型レセプターを活性化する化
合物および試験化合物を本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を
培養することによって細胞膜上に発現したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質に接触させた場合における、Ｇ蛋白
質共役型レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、ア
ラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進す
る活性または抑制する活性など）を測定し、比較するこ
とを特徴とするリガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩の
スクリーニング方法を提供する。A compound containing a DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention is a compound which activates the G protein-coupled receptor protein of the present invention (for example, a ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention). When the transformant is brought into contact with the G protein-coupled receptor protein expressed on the cell membrane by culturing, the compound that activates the G protein-coupled receptor of the present invention and the test compound are the G protein-coupled receptor of the present invention. Cell-stimulating activity mediated by G protein-coupled receptors (eg, arachidonic acid release) when contacted with G protein-coupled receptor proteins expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding a protein , acetylcholine release, intracellular Ca2+ release, intracellular cAMP production , Intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, activity promoting or suppressing pH decrease, etc.), and comparing There is provided a method for screening a compound or a salt thereof which inhibits the binding between the ligand characterized by the above and the G protein-coupled receptor protein of the present invention.
【００７３】本発明のスクリーニング方法の具体的な説
明を以下にする。まず、本発明のスクリーニング方法に
用いるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質としては、本発
明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはＧ蛋白質共
役型レセプター蛋白質の部分ペプチドを含有するもので
あれば何れのものであってもよいが、温血動物の臓器の
膜画分が好適である。しかし、スクリーニングに用いら
れるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質が適している。A specific description of the screening method of the present invention is given below. First, any G protein-coupled receptor protein used in the screening method of the present invention may be used as long as it contains the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein. However, a membrane fraction of an organ of a warm-blooded animal is preferable. However, as the one used for screening, G expressed in a large amount using a recombinant was used.
Protein-coupled receptor proteins are suitable.
【００７４】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を製造す
るには、前述の方法が用いられるが、該蛋白質をコード
するＤＮＡを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現することに
より行うことができる。目的部分をコードするＤＮＡ断
片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約
されるものではない。例えば遺伝子断片や合成ＤＮＡを
用いてもよい。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコー
ドするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効
率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主
とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス
（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリ
ンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロ
ウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモータ
ー、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウ
イルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に
組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の
検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例え
ば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,1
9555〜19559頁,1992年〕に記載の方法に従って行うこと
ができる。The above-mentioned method is used for producing the G protein-coupled receptor protein, which can be carried out by expressing the DNA encoding the protein in mammalian cells or insect cells. Although complementary DNA is used as the DNA fragment encoding the target portion, it is not necessarily limited thereto. For example, a gene fragment or synthetic DNA may be used. To introduce a DNA fragment encoding a G protein-coupled receptor protein into a host animal cell and express them efficiently, in order to efficiently express them, a nuclear polyhedrosis virus (nuclear polyhedrosis virus) belonging to a baculovirus in which an insect is used as a host is used. virus; NPV) polyhedrin promoter, SV40-derived promoter, retrovirus promoter, metallothionein promoter, human heat shock promoter, cytomegalovirus promoter, SRα promoter and the like are preferably incorporated downstream. The amount and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, the literature [Nambi, P. Et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), Vol. 267, 1
9555-19559, 1992].
【００７５】したがって、本発明のスクリーニング方法
において、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質またはＧ蛋
白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドを含有する
ものとしては、それ自体公知の方法に従って精製したＧ
蛋白質共役型レセプター蛋白質または該Ｇ蛋白質共役型
レセプター蛋白質の部分ペプチドであってもよいし、該
蛋白質を含有する細胞を用いてもよく、また該蛋白質を
含有する細胞の膜画分を用いてもよい。本発明のスクリ
ーニング方法において、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白
質を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアル
デヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方
法はそれ自体公知の方法に従って行うことができる。Ｇ
蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞として
は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現した宿主細
胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵
母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。Therefore, in the screening method of the present invention, a G protein-coupled receptor protein or a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein is purified by a method known per se.
It may be a protein-coupled receptor protein or a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein, a cell containing the protein may be used, or a membrane fraction of cells containing the protein may be used. Good. When a cell containing a G protein-coupled receptor protein is used in the screening method of the present invention, the cell may be immobilized with glutaraldehyde, formalin or the like. The immobilization method can be performed according to a method known per se. G
The cell containing the protein-coupled receptor protein refers to a host cell expressing the G protein-coupled receptor protein, and examples of the host cell include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells and the like.
【００７６】細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、
それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画
分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−El
vehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリ
ングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる
破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧し
ながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕
などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法
や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主と
して用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒ
ｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０
分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３
００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られ
る沈澱を膜画分とする。As the cell membrane fraction, after crushing the cells,
It refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a method known per se. As a cell disruption method, Potter-El
The method includes crushing cells with a vehjem homogenizer, crushing with a Waring blender or Polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, crushing by ejecting cells from a thin nozzle while applying pressure with a French press, etc. For the fractionation of the cell membrane, a fractionation method by centrifugal force such as a fractionation centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used. For example, the cell lysate should be slow (500r
pm to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes)
Centrifuge, and the supernatant is spun at a higher speed (15000 rpm to 3
It is usually centrifuged at 0000 rpm) for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as a membrane fraction.
【００７７】該膜画分中には、発現したＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質など
の膜成分が多く含まれる。該Ｇ蛋白質共役型レセプター
蛋白質を含有する細胞や膜画分中のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質の量は、１細胞当たり１０3〜１０8分子で
あるのが好ましく、１０5〜１０7分子であるのが好適で
ある。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド
結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニン
グ系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大
量の試料を測定できるようになる。The membrane fraction contains a large amount of expressed G protein-coupled receptor protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins. The amount of G protein-coupled receptor protein in cells or membrane fractions containing the G protein-coupled receptor protein is preferably 103 to 108 molecules per cell, and is 105 to 107 molecules. Is preferred. It should be noted that the higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, making it possible not only to construct a highly sensitive screening system, but also to measure a large number of samples in the same lot. .
【００７８】リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ターとの結合を阻害する化合物をスクリーニングする前
記の〜を実施するためには、適当なＧ蛋白質共役型
レセプター画分と、標識したリガンドが必要である。Ｇ
蛋白質共役型レセプター画分としては、天然型のＧ蛋白
質共役型レセプター画分か、またはそれと同等の活性を
有する組換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター画分などが望
ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合
活性などを示す。標識したリガンドとしては、標識した
リガンド、標識したリガンドアナログ化合物などが用い
られる。例えば〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、
〔35Ｓ〕などで標識されたリガンドなどを利用すること
ができる。In order to carry out (1) to (3) above for screening a compound that inhibits the binding of the ligand to the G protein-coupled receptor of the present invention, an appropriate G protein-coupled receptor fraction and a labeled ligand are required. is there. G
As the protein-coupled receptor fraction, a natural G protein-coupled receptor fraction or a recombinant G protein-coupled receptor fraction having an activity equivalent to that is desirable. Here, the equivalent activity refers to equivalent ligand binding activity and the like. As the labeled ligand, a labeled ligand, a labeled ligand analog compound or the like is used. For example, [3 H], [125 I], [14 C],
A ligand labeled with [35 S] or the like can be used.
【００７９】具体的には、リガンドとＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質との結合を阻害する化合物のスクリーニ
ングを行うには、まずＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニング
に適したバッファーに懸濁することによりレセプター標
品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望まし
くはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バ
ッファーなどのリガンドＸとレセプターとの結合を阻害
しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特
異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ
−８０TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシ
コレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることも
できる。さらに、プロテアーゼによるレセプターやリガ
ンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ
−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロ
テアーゼ阻害剤を添加することもできる。Specifically, in order to screen a compound that inhibits the binding between a ligand and a G protein-coupled receptor protein, first, a cell or a cell membrane fraction containing the G protein-coupled receptor protein is screened. Prepare a receptor preparation by suspending it in a buffer suitable for. Any buffer may be used as long as it does not inhibit the binding between the ligand X and the receptor, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably a pH of 6 to 8) and a Tris-hydrochloric acid buffer. Moreover, in order to reduce non-specific binding, CHAPS, Tween
It is also possible to add a surfactant such as −80™ (Kao-Atlas), digitonin and deoxycholate to the buffer. In addition, PMSF, leupeptin, E for the purpose of suppressing the degradation of receptors and ligands by proteases.
A protease inhibitor such as -64 (manufactured by Peptide Institute) or pepstatin can also be added.
【００８０】０.０１ml〜１０ｍｌの該レセプター溶液
に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の
標識したリガンドを添加し、同時に１０-4Ｍ〜１０-10
Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳ
Ｂ）を知るために大過剰の未標識のリガンドを加えた反
応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望まし
くは４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは
３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾
過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾
紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンタ
ーまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がな
い場合のカウント(Ｂ0）から非特異的結合量（ＮＳＢ）
を引いたカウント（Ｂ0−ＮＳＢ）を１００％とした
時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下に
なる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選
択することができる。To 0.01 ml to 10 ml of the receptor solution, a fixed amount (5000 cpm to 500,000 cpm) of the labeled ligand was added, and at the same time, 10-4 M to10 -10 was added.
M test compounds are allowed to coexist. Non-specific binding (NS
In order to know B), prepare a reaction tube containing a large excess of unlabeled ligand. The reaction is carried out at 0 ° C to 50 ° C, preferably 4 ° C to 37 ° C for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours. After the reaction, the mixture is filtered through a glass fiber filter paper or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter paper is measured with a liquid scintillation counter or a γ-counter. From the count (B0 ) when there is no antagonistic substance, the amount of non-specific binding (NSB)
A test compound having a specific binding amount (B-NSB) of, for example, 50% or less when the count obtained by subtracting (B0 -NSB) is 100% can be selected as a candidate substance capable of competitive inhibition.
【００８１】リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質との結合を阻害する化合物スクリーニングす
る前記の〜の方法を実施するためには、Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、
アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ遊
離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシ
トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリ
ン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進す
る活性または抑制する活性など）を公知の方法または市
販の測定用キットを用いて測定することができる。In order to carry out the above-mentioned methods (1) to (3) for screening a compound which inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention, the cell stimulating activity mediated by the G protein-coupled receptor protein (for example,
Arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH decrease, etc. The promoting activity or the suppressing activity) can be measured using a known method or a commercially available measurement kit.
【００８２】具体的には、まず、Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質を含有する細胞をマルチウェルプレート等に
培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もっ
て新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッ
ファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間イ
ンキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収
して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量す
る。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキド
ン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって
検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加し
てアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制
などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基
礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作
用として検出することができる。Specifically, first, cells containing the G protein-coupled receptor protein are cultured in a multiwell plate or the like. For screening, the medium was exchanged with a fresh medium or an appropriate buffer that did not show toxicity to cells in advance, and after adding a test compound or the like and incubating for a certain period of time, cells were extracted or supernatant was collected to generate The product is quantified according to the respective method. When the production of a substance that serves as an index of cell stimulating activity (for example, arachidonic acid) is difficult to assay by the degrading enzyme contained in the cell, an inhibitor for the degrading enzyme may be added to the assay. Further, the activity of suppressing cAMP production and the like can be detected as a production suppressing action on cells in which the basic production amount of cells has been increased by forskolin or the like.
【００８３】細胞刺激活性を測定してスクリーニングを
行なうには、適当なＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
発現した細胞が必要である。本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質を発現した細胞としては、天然型の本発
明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を有する細胞株
（例えば、マウス膵臓β細胞株ＭＩＮ６など）、前述の
組換え型Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質発現細胞株な
どが望ましい。試験化合物としては、例えばペプチド、
タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産
物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙
げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよい
し、公知の化合物であってもよい。In order to carry out the screening by measuring the cell stimulating activity, cells expressing an appropriate G protein-coupled receptor protein are required. Cells expressing the G protein-coupled receptor protein of the present invention include cell lines having a natural G protein-coupled receptor protein of the present invention (eg, mouse pancreatic β cell line MIN6, etc.), the recombinant G described above. A cell line expressing a protein-coupled receptor protein is preferable. Examples of test compounds include peptides,
Examples include proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like, and these compounds may be novel compounds or known compounds. Good.
【００８４】リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質との結合を阻害する化合物またはその塩のス
クリーニング用キットは、本発明のＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質またはその塩、本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、本発明の
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞、ある
いは本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有す
る細胞の膜画分を含有するものである。本発明のスクリ
ーニング用キットの例としては、次のものが挙げられ
る。 １．スクリーニング用試薬 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液 Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.
０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたも
の。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃
で保存するか、あるいは用時調製しても良い。The screening kit for a compound or a salt thereof that inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention comprises a G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof, and a G protein-coupled type of the present invention. It comprises a partial peptide of a receptor protein or a salt thereof, a cell containing the G protein-coupled receptor protein of the present invention, or a membrane fraction of a cell containing the G protein-coupled receptor protein of the present invention. Examples of the screening kit of the present invention include the following. 1. Reagent for screening Assay buffer and washing buffer Hanks' Balanced Salt Solution (Gibco)
To which 05% bovine serum albumin (manufactured by Sigma) was added. Sterilize by filtration with a 0.45μm filter at 4 ℃
It may be stored at or prepared at the time of use.
【００８５】Ｇ蛋白質共役型レセプター標品 Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細
胞を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３
７℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したも
の。 標識リガンド 市販の〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで
標識したリガンド水溶液の状態のものを４℃あるいは−
２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希
釈する。 リガンド標準液 リガンドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）
を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で
保存する。G protein-coupled receptor preparation CHO cells expressing the G protein-coupled receptor protein were subcultured on a 12-well plate at 5 × 105 cells / well and 3
One cultured at 7 ° C., 5% CO2 , 95% air for 2 days. Labeled ligand A commercially available ligand labeled with [3 H], [125 I], [14 C], [35 S] or the like in an aqueous solution is used at 4 ° C or-
Store at 20 ° C. and dilute to 1 μM with measurement buffer before use. Standard ligand solution 0.1% bovine serum albumin (manufactured by Sigma)
Dissolve to 1 mM in PBS containing and store at -20 ° C.
【００８６】２．測定法 １２穴組織培養用プレートにて培養したＧ蛋白質共役
型レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を、測定用
緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩
衝液を各穴に加える。 １０-3〜１０-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた
後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応さ
せる。非特異的結合量を知るためには試験化合物のかわ
りに１０-3Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。 反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄す
る。細胞に結合した標識リガンドを０.２Ｎ ＮａＯＨ
−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ
（和光純薬製）と混合する。 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）
を用いて放射活性を測定し、Percent of Maximum Bindi
ng（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。2. Assay method G-protein coupled receptor protein-expressing CHO cells cultured in a 12-well tissue culture plate are washed twice with 1 ml of assay buffer, and then 490 μl of assay buffer is added to each well. After adding 5 μl of a test compound solution of 10−3 to 10−10 M, 5 μl of a labeled ligand is added, and the mixture is reacted at room temperature for 1 hour. In order to know the amount of non-specific binding, 5 μl of 10−3 M ligand was added in place of the test compound. Remove the reaction solution and wash 3 times with 1 ml of wash buffer. Labeled ligand bound to cells is 0.2N NaOH
Dissolve in -1% SDS, 4 ml of liquid scintillator A
Mix with (Wako Pure Chemical Industries). Liquid scintillation counter (Beckman)
Radioactivity was measured using a Percent of Maximum Bindi
ng (PMB) is calculated by the following formula [Equation 1].
【００８７】[0087]
【数１】ＰＭＢ：Percent of Maximum Binding Ｂ ：検体を加えた時の値 ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量） Ｂ0 ：最大結合量[Equation 1] PMB: Percent of Maximum Binding B: Value when a sample is added NSB: Non-specific Binding B0 : Maximum binding amount
【００８８】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
は、リガンドと本発明のＧ蛋白質共役型レセプターとの
結合を阻害する化合物であり、具体的にはＧ蛋白質共役
型レセプターを介して細胞刺激活性を有する化合物また
はその塩（いわゆるＧ蛋白質共役型レセプターアゴニス
ト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物（いわゆる
Ｇ蛋白質共役型レセプターアンタゴニスト）である。該
化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化
合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら
化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物
であってもよい。The compound or its salt obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound which inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor of the present invention, and specifically, G protein-coupled. A compound or a salt thereof having a cell stimulating activity via a type receptor (so-called G protein-coupled receptor agonist), or a compound having no such stimulating activity (a so-called G protein-coupled receptor antagonist). Examples of the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc. These compounds may be novel compounds or known compounds.
【００８９】該Ｇ蛋白質共役型レセプターアゴニスト
は、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する
リガンドが有する生理活性と同様の作用を有しているの
で、該リガンド活性に応じて安全で低毒性な医薬組成物
として有用である。逆に、Ｇ蛋白質共役型レセプターア
ンタゴニストは、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質に対するリガンドが有する生理活性を抑制すること
ができるので、該リガンド活性を抑制する安全で低毒性
な医薬組成物として有用である。Since the G protein-coupled receptor agonist has the same physiological activity as that of the ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention, it is a safe and low-toxic drug depending on the ligand activity. It is useful as a composition. On the contrary, since the G protein-coupled receptor antagonist can suppress the physiological activity of the ligand for the G protein-coupled receptor protein of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic pharmaceutical composition for suppressing the ligand activity. Is.
【００９０】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩
を上述の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従
って実施することができる。例えば、必要に応じて糖衣
を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカ
プセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ
以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸
濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例え
ば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担
体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合
剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される
単位用量形態で混和することによって製造することがで
きる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲
の適当な容量が得られるようにするものである。When the compound or its salt obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it can be carried out by a conventional means. For example, orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., optionally sugar-coated, or aseptic solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or suspension It can be used parenterally in the form of injections such as. For example, the compound or salt thereof is admixed with a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder and the like in a unit dosage form generally required for pharmaceutical practice. It can be manufactured by The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable amount within the indicated range can be obtained.
【００９１】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたが
って処方することができる。Examples of additives that can be mixed with tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Such as a leavening agent, a lubricant such as magnesium stearate, a sweetener such as sucrose, lactose or saccharin, and a flavoring agent such as peppermint, red oil or cherry. When the unit dosage form is a capsule, a liquid carrier such as fat may be included in addition to materials of the above type. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practices such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, etc. .
【００９２】（４）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質もしくはその塩または本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩に対する
抗体または抗血清の製造 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその
塩または本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部
分ペプチドもしくはその塩に対する抗体（例えば、ポリ
クローナル抗体、モノクローナル抗体）または抗血清
は、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは
その塩または本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
の部分ペプチドもしくはその塩を抗原として用い、自体
公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造すること
ができる。例えば、モノクローナル抗体は、後述の方法
に従って製造することができる。(4) Production of antibody or antiserum against the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof or a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof The G protein-coupled receptor protein of the present invention Alternatively, an antibody (for example, a polyclonal antibody, a monoclonal antibody) or an antiserum against a salt thereof, a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof is a G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof or the present invention. Can be produced according to a method for producing an antibody or antiserum known per se using a partial peptide of the G protein-coupled receptor protein or the salt thereof as an antigen. For example, a monoclonal antibody can be produced according to the method described below.
【００９３】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその
塩または本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質の部
分ペプチドもしくはその塩（以下、Ｇ蛋白質共役型レセ
プターと略称する場合がある）は、温血動物に対して投
与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担
体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生
能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全
フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常
２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用
いられる温血動物としては、たとえばサル、ウサギ、イ
ヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワ
トリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用
いられる。[Preparation of Monoclonal Antibody] (a) Preparation of Monoclonal Antibody-Producing Cell G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof, or partial peptide of G protein-coupled receptor protein of the present invention or a salt thereof (hereinafter, referred to as (G protein-coupled receptor may be abbreviated) may be administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production can be performed by itself or together with a carrier or diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, about 2 to 10 times in total. Examples of warm-blooded animals used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
【００９４】モノクローナル抗体産生細胞の作製に際し
ては、抗原を免疫された温血動物、たとえばマウスから
抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後
に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体
産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができ
る。抗血清中の抗体価の測定は、例えば後記の標識化Ｇ
蛋白質共役型レセプターと抗血清とを反応させたのち、
抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなさ
れる。融合操作は既知の方法、たとえばケーラーとミル
スタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (197
5)〕に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げ
られるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。In the preparation of monoclonal antibody-producing cells, warm-blooded animals immunized with the antigen, for example, individuals with recognized antibody titers were selected from mice, and spleens or lymph nodes were collected 2 to 5 days after the final immunization. By fusing the antibody-producing cells contained therein with myeloma cells, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared. The antibody titer in the antiserum can be measured by, for example, labeled G described below.
After reacting the protein-coupled receptor with the antiserum,
This is done by measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. The fusion operation is a known method, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495 (197
5)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
【００９５】骨髄腫細胞としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ
３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられるが、Ｐ
３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞
（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：
１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１
０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で
添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１
〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞
融合を実施できる。Examples of myeloma cells include NS-1, P
3U1, SP2 / 0, AP-1 etc., but P
3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is 1:
1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1
000 to PEG6000) at a concentration of about 10 to 80%, and added at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C.
By incubating for 10 minutes, cell fusion can be efficiently performed.
【００９６】抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体産生ハイ
ブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用でき
るが、たとえばＧ蛋白質共役型レセプター抗原を直接あ
るいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレ
ート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性
物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞
融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グ
ロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加
え、固相に結合した抗Ｇ蛋白質共役型レセプターモノク
ローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体ま
たはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培
養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したＧ蛋
白質共役型レセプターを加え、固相に結合した抗Ｇ蛋白
質共役型レセプターモノクローナル抗体を検出する方法
などがあげられる。Various methods can be used for screening anti-G protein-coupled receptor antibody-producing hybridomas. For example, hybridoma culture can be carried out on a solid phase (eg, microplate) on which G protein-coupled receptor antigen is directly or adsorbed with a carrier. The supernatant is added, and then an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme (if the cell used for cell fusion is a mouse, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A is added to the solid phase. Method for detecting bound anti-G protein-coupled receptor monoclonal antibody, G protein-coupled receptor labeled with radioactive substance or enzyme by adding hybridoma culture supernatant to solid phase on which anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed Anti-G protein coupled receptor bound to solid phase Such as a method of detecting a monoclonal antibody, and the like.
【００９７】抗Ｇ蛋白質共役型レセプターモノクローナ
ル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に
従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用
培地で行なわれる。選別および育種用培地としては、ハ
イビリドーマが生育できるものならばどのような培地を
用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜
２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１
〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業
（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（Ｓ
ＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることがで
きる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３
７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましく
は１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下
で行なわれる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上
記の抗血清中の抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体価の測
定と同様にして測定できる。The anti-G protein coupled receptor monoclonal antibody can be selected according to a method known per se or a method analogous thereto. It is usually carried out in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As a medium for selection and breeding, any medium can be used as long as it can grow a hybridoma. For example, 1 to 20%, preferably 10 to
RPMI 1640 medium containing 20% fetal bovine serum, 1
GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 10% to fetal bovine serum or serum-free medium for hybridoma culture (S
FM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., etc. can be used. The culture temperature is usually 20 to 40 ° C., preferably about 3
It is 7 ° C. Cultivation time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. Culturing is usually performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the above-mentioned measurement of the anti-G protein-coupled receptor antibody titer in the antiserum.
【００９８】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 抗Ｇ蛋白質共役型レセプターモノクローナル抗体の分離
精製は通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免
疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈
殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、
ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗
原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧ
などの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離
させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行われる。以
上の（１）および（２）の方法に従って製造させる本発
明のＧ蛋白質共役型レセプター抗体は、Ｇ蛋白質共役型
レセプターを特異的に認識することができるので、被検
液中のＧ蛋白質共役型レセプターの定量、特にサンドイ
ッチ免疫測定法による定量などに使用することができ
る。(B) Purification of monoclonal antibody The isolation and purification of the anti-G protein-coupled receptor monoclonal antibody is carried out by the same method as the isolation and purification of ordinary polyclonal antibodies [eg, salting out, alcohol precipitation, Isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchanger (eg,
DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or protein A or protein G
Specific purification method in which only the antibody is collected by an active adsorbent such as, and the bond is dissociated to obtain the antibody]. The G protein-coupled receptor antibody of the present invention produced according to the above methods (1) and (2) can specifically recognize the G protein-coupled receptor. It can be used for quantification of a receptor, particularly by a sandwich immunoassay.
【００９９】すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）本発
明のＧ蛋白質共役型レセプターに反応する抗体と、被検
液および標識化Ｇ蛋白質共役型レセプターとを競合的に
反応させ、該抗体に結合した標識化Ｇ蛋白質共役型レセ
プターの割合を測定することを特徴とする被検液中のＧ
蛋白質共役型レセプターの定量法、および（ii）被検液
と担体上に不溶化した抗体および標識化された抗体とを
同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の
標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のＧ
蛋白質共役型レセプターの定量法において、一方の抗体
がＧ蛋白質共役型レセプターのＮ端部を認識する抗体
で、他方の抗体がＧ蛋白質共役型レセプターのＣ端部に
反応する抗体であることを特徴とする被検液中のＧ蛋白
質共役型レセプターの定量法を提供する。That is, according to the present invention, for example, (i) an antibody that reacts with the G protein-coupled receptor of the present invention is allowed to competitively react with a test solution and a labeled G protein-coupled receptor to give the antibody. G in a test solution, characterized by measuring the ratio of bound labeled G protein-coupled receptor
Method for quantifying protein-coupled receptor, and (ii) measuring the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier after reacting the test solution with the insolubilized antibody on the carrier and the labeled antibody simultaneously or continuously G in the test liquid characterized by
In the method for quantifying a protein-coupled receptor, one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the G-protein coupled receptor, and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the G-protein coupled receptor. And a method for quantifying a G protein-coupled receptor in a test solution.
【０１００】本発明のＧ蛋白質共役型レセプターを認識
するモノクローナル抗体（以下、抗Ｇ蛋白質共役型レセ
プター抗体と称する場合がある）を用いてＧ蛋白質共役
型レセプターの測定を行なえるほか、組織染色等による
検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分
子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａ
ｂ')2 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよ
い。本発明の抗体を用いる測定法は、 特に制限される
べきものではなく、被測定液中の抗原量（例えばＧ蛋白
質共役型レセプター量）に対応した抗体、抗原もしくは
抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により
検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製
した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測
定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合
法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に
用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイ
ッチ法を用いるのが特に好ましい。The G protein-coupled receptor can be measured using the monoclonal antibody of the present invention that recognizes the G protein-coupled receptor (hereinafter sometimes referred to as anti-G protein-coupled receptor antibody), tissue staining, etc. Can also be detected. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or the F (a
b ′)2 , Fab ′, or Fab fraction may be used. The assay method using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the amount of the antibody, the antigen or the antibody-antigen complex corresponding to the amount of the antigen (eg, the amount of G protein-coupled receptor) in the liquid to be measured can be determined. Any measuring method may be used as long as it is detected by chemical or physical means and is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, competitive method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but from the viewpoint of sensitivity and specificity, the sandwich method described later is particularly preferably used.
【０１０１】標識物質を用いる測定法に用いられる標識
剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物
質などが挙げられる。放射性同位元素としては、例えば
〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕などが、上
記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好まし
く、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リ
ンゴ酸脱水素酵素等が、蛍光物質としては、フルオレス
カミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発
光物質としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシ
フェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。さら
に、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−ア
ビジン系を用いることもできる。Examples of the labeling agent used in the measuring method using a labeling substance include radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances and the like. As the radioisotope, for example, [125 I], [131 I], [3 H], [14 C] and the like are preferable, and as the above enzyme, those having stable and large specific activity are preferable, for example, β-galactosidase, β -Glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc., fluorescent substances such as fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, and luminescent substances such as luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin, etc. To be Furthermore, the biotin-avidin system can be used for binding the antibody or the antigen to the labeling agent.
【０１０２】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等
を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる
方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラ
ン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポ
リアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガ
ラス等が挙げられる。サンドイッチ法においては不溶化
した抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体に被検液を反応さ
せ（１次反応）、さらに標識化抗Ｇ蛋白質共役型レセプ
ター抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上
の標識剤の活性を測定することにより被検液中のＧ蛋白
質共役型レセプター量を定量することができる。１次反
応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行な
ってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤
および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができ
る。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、
固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず
しも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等
の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。For the insolubilization of an antigen or an antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing or immobilizing proteins or enzymes. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide and silicon, and glass. In the sandwich method, an insolubilized anti-G protein-coupled receptor antibody is reacted with a test solution (first reaction), and further a labeled anti-G protein-coupled receptor antibody is reacted (second reaction), and then on an insolubilized carrier. The amount of the G protein-coupled receptor in the test solution can be quantified by measuring the activity of the labeling agent. The primary reaction and the secondary reaction may be carried out in the reverse order, may be carried out simultaneously, or may be carried out at different times. The labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above. In addition, in the immunoassay method by the sandwich method,
The antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily have to be one type, and a mixture of two or more types of antibodies may be used for the purpose of improving the measurement sensitivity.
【０１０３】本発明のサンドイッチ法によるＧ蛋白質共
役型レセプターの測定法においては、１次反応と２次反
応に用いられる抗Ｇ蛋白質共役型レセプター抗体はＧ蛋
白質共役型レセプターの結合する部位が相異なる抗体が
好ましく用いられる。即ち、１次反応および２次反応に
用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体
が、Ｇ蛋白質共役型レセプターのＣ端部を認識する場
合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以
外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。In the method for measuring a G protein-coupled receptor according to the sandwich method of the present invention, the anti-G protein-coupled receptor antibodies used in the primary reaction and the secondary reaction have different binding sites for the G protein-coupled receptor. Antibodies are preferably used. That is, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal portion of the G protein-coupled receptor, the antibody used in the primary reaction is preferably the antibody used in the primary reaction. An antibody that recognizes an N-terminal other than the C-terminal is used.
【０１０４】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター抗体を
サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、
イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用い
ることができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗
原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の
標識抗原と(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを
分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定
し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体
として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレング
リコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相
法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あ
るいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として
固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。The G protein-coupled receptor antibody of the present invention may be assayed by a measuring system other than the sandwich method, such as a competitive method,
It can be used for immunometric method or nephrometry. In the competitive method, the antigen in the test liquid and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the labeled amount of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test liquid is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as the antibody, a liquid phase method using polyethylene glycol, a second antibody against the antibody is used for B / F separation, and a solid phase antibody is used as the first antibody, or The first antibody is soluble and the second antibody is a solid-phased antibody.
【０１０５】イムノメトリック法では、被検液中の抗原
と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応
させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中
の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化
抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたの
ち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識
量を測定し被検液中の抗原量を定量する。また、ネフロ
メトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の
結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の
抗原量僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合に
もレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーな
どが好適に用いられる。In the immunometric method, the antigen in the test solution and the solid-phased antigen are competitively reacted with a fixed amount of the labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or After reacting the antigen therein with an excess amount of the labeled antibody and then adding the immobilized antigen to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the labeled amount of either phase is measured to quantify the amount of antigen in the test liquid. In nephrometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of the antigen-antibody reaction in the gel or in the solution is measured. Even when the amount of antigen in the test liquid is small and only a small amount of precipitate is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
【０１０６】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測
定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＧ蛋
白質共役型レセプターの測定系を構築すればよい。これ
らの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書な
どを参照することができるるIn applying these individual immunological assay methods to the assay method of the present invention, it is not necessary to set special conditions, operations and the like. The measurement system for the G protein-coupled receptor may be constructed by adding ordinary technical consideration to those skilled in the art to ordinary conditions and operating methods in each method. For details of these general technical means, refer to reviews, books, etc.
【０１０７】例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセ
イ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジ
オイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発行）、石川
栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医
学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測
定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Me
thods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochemical Techniq
ues(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniq
ues(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniq
ues(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniq
ues(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92
(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antib
odies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vo
l. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma
Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカ
デミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
抗体を用いることによって、本発明のＧ蛋白質共役型レ
セプターを感度良く定量することができる。[0107] For example, Hiroshi Irie "Radioimmunoassay" (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie "Radioimmunoassay" (Kodansha, published in 1979), Eiji Ishikawa et al. "Enzyme Immunoassay" (medical science) Shoin (published in 1978), Eiji Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay" (second edition) (medicine Shoin, published in 1982) Eiji Ishikawa, et al. "Enzyme Immunoassay" (third edition) (medicine) Shoin (published in 1987), "Me
thods in ENZYMOLOGY '' Vol. 70 (Immunochemical Techniq
ues (Part A)), ibid Vol. 73 (Immunochemical Techniq
ues (Part B)), ibid Vol. 74 (Immunochemical Techniq
ues (Part C)), ibid Vol. 84 (Immunochemical Techniq
ues (Part D: Selected Immunoassays)), ibid Vol. 92
(Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antib
odies and General Immunoassay Methods)), ibid Vo
l. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma
Technology and Monoclonal Antibodies)) (above, published by Academic Press).
As described above, by using the G protein-coupled receptor antibody of the present invention, the G protein-coupled receptor of the present invention can be quantified with high sensitivity.
【０１０８】（５）本発明のＧ蛋白質共役型レセプター
蛋白質をコードするＤＮＡを有する動物の作製 本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする
ＤＮＡを用いて、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を発現するトランジェニック動物を作製することが
できる。動物としては、温血哺乳動物（例えば、ラッ
ト、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルな
ど）が挙げれれるが、特に、ウサギなどが好適である。(5) Preparation of Animal Having DNA Encoding G Protein-Coupled Receptor Protein of the Present Invention Using the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention, the G protein-coupled receptor protein of the present invention A transgenic animal that expresses can be produced. Examples of the animal include warm-blooded mammals (eg, rat, rabbit, sheep, pig, cow, cat, dog, monkey, etc.), with rabbits and the like being particularly preferable.
【０１０９】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
をコードするＤＮＡを対象動物に転移させるにあたって
は、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの
下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用いるのが
一般に有利である。たとえばウサギＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質ＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が
高い動物由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ＤＮＡ
を動物細胞で発現させうる各種プロモーターの下流に結
合した遺伝子コンストラクトを、対象動物の受精卵、た
とえばウサギ受精卵へマイクロインジェクションするこ
とによって本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を
高産生するＤＮＡ転移動物を作出できる。このプロモー
ターとしては、たとえばウイルス由来プロモーター、メ
タロチオネイン等のユビキアスな発現プロモーターも使
用しうるが、好ましくは脳で特異的に発現するＮＧＦ遺
伝子プロモーターやエノラーゼ遺伝子プロモーターなど
が用いられる。When transferring the DNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a gene construct linked downstream of a promoter that can be expressed in animal cells. . For example, when transferring a rabbit G protein-coupled receptor protein DNA, a G protein-coupled receptor protein DNA derived from an animal with high homology to this
DNA-transferred animal that produces a high amount of the G protein-coupled receptor protein of the present invention by microinjecting a gene construct linked to the downstream of various promoters capable of expressing Escherichia coli in animal cells Can be created. As this promoter, for example, a virus-derived promoter or a ubiquitous expression promoter such as metallothionein can be used, but preferably an NGF gene promoter or an enolase gene promoter which is specifically expressed in the brain is used.
【０１１０】受精卵細胞段階におけるＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質ＤＮＡの転移は、対象動物の胚芽細胞お
よび体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ
転移後の作出動物の胚芽細胞においてＧ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質が存在することは、作出動物の子孫が全
てその胚芽細胞及び体細胞の全てにＧ蛋白質共役型レセ
プター蛋白質を有することを意味する。遺伝子を受け継
いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の
全てにＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を有する。The transfer of G protein-coupled receptor protein DNA at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all embryonic cells and somatic cells of the target animal. DNA
The presence of the G protein-coupled receptor protein in the germinal cells of the produced animal after the transfer means that all the progeny of the created animal have the G protein-coupled receptor protein in all of the germinal cells and somatic cells. The offspring of this type of animal that inherits the gene has the G protein-coupled receptor protein in all of its germ cells and somatic cells.
【０１１１】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質
ＤＮＡ転移動物は、交配により遺伝子を安定に保持する
ことを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環
境で飼育継代を行うことができる。さらに、目的ＤＮＡ
を保有する雌雄の動物を交配することにより、導入遺伝
子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得
し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫
が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質ＤＮＡが転移
された動物は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質が高発
現させられているので、本発明のＧ蛋白質共役型レセプ
ター蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストの
スクリーニング用の動物などとして有用である。The G protein-coupled receptor protein DNA-transferred animal of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as the DNA-carrying animal after confirming that the gene is stably retained by mating. Furthermore, the target DNA
By obtaining a homozygous animal having the transgene on both homologous chromosomes by mating the male and female animals that carry the can do.
The animal to which the G protein-coupled receptor protein DNA of the present invention has been transferred has a high expression of the G protein-coupled receptor protein. It is useful as
【０１１２】本発明のＤＮＡ転移動物を、組織培養のた
めの細胞源として使用することもできる。たとえば、本
発明のＤＮＡ転移マウスの組織中のＤＮＡもしくはＲＮ
Ａを直接分析するかあるいは遺伝子により発現されたタ
ンパク質組織を分析することにより、Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質について分析することができる。Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質を有する組織の細胞を標準組
織培養技術により培養し、これらを使用して、たとえば
脳や末梢組織由来のような一般に培養困難な組織からの
細胞の機能を研究することができる。また、その細胞を
用いることにより、たとえば各種組織の機能を高めるよ
うな医薬の選択も可能である。また、高発現細胞株があ
れば、そこから、本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質を単離精製することも可能である。The DNA-transferred animal of the present invention can also be used as a cell source for tissue culture. For example, DNA or RN in the tissue of the DNA-transferred mouse of the present invention
The G protein-coupled receptor protein can be analyzed by analyzing A directly or by analyzing the protein tissue expressed by the gene. It is possible to culture cells of a tissue having a G protein-coupled receptor protein by a standard tissue culture technique, and use these to study the function of cells from a generally difficult-to-culture tissue such as those derived from brain or peripheral tissues. it can. Further, by using the cells, it is possible to select a drug that enhances the functions of various tissues, for example. Moreover, if there is a highly expressing cell line, the G protein-coupled receptor protein of the present invention can be isolated and purified from the cell line.
【０１１３】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclature による略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシンIn the present specification and drawings, when an abbreviation is used for a base or amino acid, IUPAC-IUB is used.
Based on the abbreviations used in Commision on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in this field,
An example is given below. When amino acids may have optical isomers, the L form is shown unless otherwise specified. DNA: Deoxyribonucleic acid cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid A: Adenine T: Thymine G: Guanine C: Cytosine
【０１１４】ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイRNA: ribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid dATP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine triphosphate dCTP: deoxycytidine triphosphate ATP: adenosine triphosphate EDTA: ethylenediamine tetra Acetate SDS: Sodium dodecyl sulfate EIA: Enzyme immunoassay
【０１１５】Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジンGly: Glycine Ala: Alanine Val: Valine Leu: Leucine Ile: Isoleucine Ser: Serine Thr: Threonine Cys: Cysteine Met: Methionine Glu: Glutamic acid Asp: Aspartic acid Lys: Lys:
【０１１６】Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキ
サミド基Arg: arginine His: histidine Phe: phenylalanine Tyr: tyrosine Trp: tryptophan Pro: proline Asn: asparagine Gln: glutamine pGlu: pyroglutamic acid Me: methyl group Et: phenyl group Bu: Pt: phenyl group Bu: Pt: phenyl group Bu: Ph: phenyl group Bu: ethyl group -4 (R) -carboxamide group
【０１１７】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 〔配列番号：１〕ｐＭＪ１０に含まれるウサギ胃幽門部
平滑筋由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断
片にコードされるウサギ胃幽門部平滑筋由来Ｇ蛋白質共
役型レセプター蛋白質の部分アミノ酸配列を示す。 〔配列番号：２〕ｐＭＪ１０に含まれるヒト下垂体由来
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配
列を示す。 〔配列番号：３〕本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋
白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した
合成ＤＮＡの塩基配列を示す。The SEQ ID NOs in the sequence listing in the present specification show the following sequences. [SEQ ID NO: 1] This shows the partial amino acid sequence of the rabbit gastric pyloric smooth muscle-derived G protein-coupled receptor protein encoded by the rabbit gastric pyloric smooth muscle-derived G protein-coupled receptor protein cDNA fragment contained in pMJ10. [SEQ ID NO: 2] This shows the base sequence of human pituitary-derived G protein-coupled receptor protein cDNA fragment contained in pMJ10. [SEQ ID NO: 3] This shows the base sequence of synthetic DNA used for screening of cDNA encoding G protein-coupled receptor protein of the present invention.
【０１１８】〔配列番号：４〕本発明のＧ蛋白質共役型
レセプター蛋白質をコードするｃＤＮＡのスクリーニン
グに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。後述の実施
例３で得られた形質転換体エシェリヒア コリ（Escher
ichia coli) ＪＭ１０９／ｐＭＪ１０は、平成６年１２
月１５日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４９３６
として寄託されており、また平成６年１２月１６日から
財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にＩＦＯ １５７８４と
して寄託されている。[SEQ ID NO: 4] This shows the base sequence of synthetic DNA used for screening the cDNA encoding the G protein-coupled receptor protein of the present invention. The transformant Escherichia coli (Escher) obtained in Example 3 described later was used.
ichia coli) JM109 / pMJ10 is 1994 12
Deposit number FERM BP-4936 from the Ministry of International Trade and Industry to the Institute of Biotechnology and Industrial Technology (NIBH) from 15th March
Has also been deposited as IFO 15784 at the Fermentation Research Institute (IFO) since December 16, 1994.
【０１１９】[0119]
【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, which are not intended to limit the scope of the present invention.
【０１２０】[0120]
【参考例１】公知のＧ蛋白質共役型レセプター、すなわ
ちマウス由来アンジオテンシンIIレセプター蛋白質（Ｌ
３２８４０）、ラット由来アンジオテンシンＩｂレセプ
ター蛋白質（Ｘ６４０５２）、ラット由来アンジオテン
シンレセプター蛋白質サブタイプ（Ｍ９００６５）、ヒ
ト由来アンジオテンシンＩａレセプター蛋白質（Ｍ９１
４６４）、ラット由来コレシストキニンａレセプター蛋
白質（Ｍ８８０９６）、ラット由来コレシストキニンｂ
レセプター蛋白質（Ｍ９９４１８）、ヒト由来コレシス
トキニンｂレセプター蛋白質（Ｌ０４４７３）、マウス
由来ローアフィニティーインターロイキン８レセプター
蛋白質（Ｍ７３９６９）、ヒト由来ハイアフィニティー
インターロイキン８レセプター蛋白質（Ｘ６５８５
８）、マウス由来Ｃ５ａアナフィラトキシンレセプター
蛋白質（Ｓ４６６６５）、ヒト由来Ｎ-フォルミルペプ
チドレセプター蛋白質（Ｍ６０６２６）などの、第３膜
貫通領域付近および第６膜貫通領域付近の塩基配列を比
較し、類似性の高い部分を見いだした。Reference Example 1 Known G protein-coupled receptor, that is, mouse-derived angiotensin II receptor protein (L
32840), rat-derived angiotensin Ib receptor protein (X64052), rat-derived angiotensin receptor protein subtype (M90065), human-derived angiotensin Ia receptor protein (M91
464), rat-derived cholecystokinin a receptor protein (M88096), rat-derived cholecystokinin b
Receptor protein (M99418), human cholecystokinin b receptor protein (L04473), mouse low affinity interleukin 8 receptor protein (M73969), human high affinity interleukin 8 receptor protein (X6585).
8), C5a anaphylatoxin receptor protein derived from mouse (S46665), N-formyl peptide receptor protein derived from human (M60626), etc. I found a part with high quality.
【０１２１】上記の（ ）内の略語は、Gen Bank / EMB
L データベースを検索した際に示される整理番号で、通
常 Accession Number と呼ばれるものである。特に多く
の受容体ｃＤＮＡで一致する塩基部分を基準とし、その
他の部分においてもできるだけ多くの受容体ｃＤＮＡと
配列の一致性を高めるため、混合塩基の導入を計画し
た。この配列をもとに、共通する塩基配列に相補的であ
る配列番号：３または配列番号：４で表される塩基配列
を有する合成ＤＮＡ２本を作製した。The abbreviations in parentheses above are Gen Bank / EMB
L A reference number displayed when searching the database, which is usually called an Accession Number. In particular, the introduction of mixed bases was planned in order to increase the conformity of the sequence with as many receptor cDNAs as possible in other portions, with the base portion that matches with many receptor cDNAs as a reference. Based on this sequence, two synthetic DNAs having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 which was complementary to a common base sequence were prepared.
【０１２２】〔合成ＤＮＡ〕５'−ＣＴＣＧＣ（Ｇまた
はＣ）ＧＣ（ＣまたはＴ）（ＡまたはＣ）ＴＩ（Ａまた
はＧ）Ｇ（ＣまたはＴ）ＡＴＧＧＡ（ＣまたはＴ）ＣＧ
ＩＴＡＴ−３'（配列表の配列番号：３において、Ｓは
ＧまたはＣを示し、ＹはＣまたはＴを示し、ＭはＡまた
はＣを示し、ＲはＡまたはＧを示し、ＮはＩを示す。）
（配列番号：３） ５'−ＣＡＴＧＴ（ＡまたはＧ）Ｇ（ＴまたはＡ）ＡＧ
ＧＧＡＡＩＣＣＡＧ（ＧまたはＣ）Ａ（ＡまたはＣ）Ａ
Ｉ（ＡまたはＧ）Ａ（ＡまたはＧ)(ＡまたはＧ）ＡＡ−
３’
（配列番号：４） （配列表の配列番号：４において、ＲはＡまたはＧを示
し、ＳはＧまたはＣを示し、ＭはＡまたはＣを示し、Ｎ
はＩを示す。） （ ）内は複数の塩基に混合して合成する。ただし、Ｉ
はイノシンを示す。[Synthetic DNA] 5'-CTCGC (G or C) GC (C or T) (A or C) TI (A or G) G (C or T) ATGGA (C or T) CG
ITAT-3 ′ (in the sequence listing, SEQ ID NO: 3, S represents G or C, Y represents C or T, M represents A or C, R represents A or G, and N represents I). Show.)
(SEQ ID NO: 3) 5'-CATGT (A or G) G (T or A) AG
GGAAICCAG (G or C) A (A or C) A
I (A or G) A (A or G) (A or G) AA-
3 '
(SEQ ID NO: 4) (In SEQ ID NO: 4 of the sequence listing, R represents A or G, S represents G or C, M represents A or C, N
Indicates I. ) () Is mixed with multiple bases for synthesis. However, I
Indicates inosine.
【０１２３】[0123]
【実施例１】ウサギ胃幽門部平滑筋からのpoly(Ａ)+Ｒ
ＮＡ画分の調製およびｃＤＮＡの合成 ウサギ胃幽門部平滑筋よりグアニジンイソチオシアネー
ト法により Total ＲＮＡを調製後（Kaplan B.B. et a
l., Biochem. J. 183, 181-184 (1979)）、ｍＲＮＡ精
製キット（ファルマシア社）を用いて、poly(Ａ)+ＲＮ
Ａ画分を調製した。次に、poly(Ａ)+ＲＮＡ画分５μｇ
にプライマーとしてランダムＤＮＡヘキサマー（ＢＲＬ
社）を加え、モロニイマウス白血病ウイルスの逆転写酵
素（ＢＲＬ社）により、添付バッファーを用いて相補Ｄ
ＮＡを合成した。反応後の産物はフェノール：クロロホ
ルム（１：１）で抽出し、エタノール沈殿を行なった
後、３０μｌのＴＥに溶解した。Example 1 Poly (A)+ R from rabbit gastric pyloric smooth muscle
Preparation of NA Fraction and Synthesis of cDNA After total RNA was prepared from rabbit gastric pyloric smooth muscle by the guanidine isothiocyanate method (Kaplan BB et a
l., Biochem. J. 183, 181-184 (1979)), mRNA purification kit (Pharmacia), using poly (A)+ RN.
Fraction A was prepared. Next, 5 μg of poly (A)+ RNA fraction
Random DNA hexamer (BRL
), And complemented with Moronii murine leukemia virus reverse transcriptase (BRL) using the attached buffer.
NA was synthesized. The product after the reaction was extracted with phenol: chloroform (1: 1), precipitated with ethanol, and then dissolved in 30 μl of TE.
【０１２４】[0124]
【実施例２】ウサギ胃幽門部平滑筋由来ｃＤＮＡを用い
たＰＣＲ法による受容体ｃＤＮＡの増幅と塩基配列の決
定 実施例１でウサギ胃幽門部平滑筋より調製したｃＤＮＡ
１μｌを鋳型として使用し、参考例１で合成した配列
番号：３で表わされる塩基配列を有するＤＮＡプライマ
ーおよび配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤ
ＮＡプライマを用いて、ＰＣＲによる増幅を行なった。
反応液の組成は、合成ＤＮＡプライマー（５'プライマ
ー配列および３'プライマー配列）各１００ｐＭ、０.２
５mM ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ ＤＮＡ polymerase １μｌ
および酵素に付属のバッファー１０μｌで、総反応溶液
量は１００μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマ
ルサイクラー（パーキン・エルマー社）を用い、９６℃
・３０秒、４５℃・１分、６０℃・３分のサイクルを２
５回繰り返した。増幅産物の確認は１.２％アガロース
ゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色によって行
なった。Example 2 Amplification of Receptor cDNA and Determination of Nucleotide Sequence by PCR Method Using Rabbit Gastric Pylori Smooth Muscle-Derived cDNA cDNA prepared from rabbit gastric pyloric smooth muscle in Example 1
Using 1 μl as a template, a DNA primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 synthesized in Reference Example 1 and D having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4
Amplification by PCR was performed using NA primer.
The composition of the reaction solution was 100 pM for each synthetic DNA primer (5 'primer sequence and 3'primer sequence), 0.2
5 mM dNTPs, Taq DNA polymerase 1 μl
The total reaction solution volume was 100 μl with 10 μl of the buffer attached to the enzyme. The cycle for amplification uses a thermal cycler (Perkin Elmer) at 96 ° C.
・ 2 cycles of 30 seconds, 45 ° C / 1 minute, 60 ° C / 3 minutes
Repeated 5 times. The amplification product was confirmed by 1.2% agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining.
【０１２５】[0125]
【実施例３】ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブ
クローニングおよび挿入ｃＤＮＡ部分の塩基配列の解読
による新規レセプター候補クローンの選択 実施例２で行なったＰＣＲ後の反応産物は１.０％の低
融点アガロースゲルを用いて分離し、バンドの部分をカ
ミソリで切り出した後、熱融解、フェノール抽出、エタ
ノール沈殿を行ってＤＮＡを回収した。ＴＡクローニン
グキット（インビトロゲン社）の処方に従い、回収した
ＤＮＡをプラスミドベクターｐＣＲTMIIへサブクローニ
ングした。これを大腸菌ＪＭ１０９ competent cell
（宝酒造株式会社）に導入して形質転換したのち、ｃＤ
ＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリン、ＩＰＴＧ
およびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地中で選択し、白色
を呈するクローンのみを滅菌した爪楊枝を用いて分離
し、形質転換体エシェリヒアコリ（Escherichia coli）
ＪＭ１０９／ｐＭＪ１０を得た。Example 3 Subcloning of PCR Product into Plasmid Vector and Selection of Novel Receptor Candidate Clones by Decoding Nucleotide Sequence of Inserted cDNA Part The reaction product after PCR performed in Example 2 was 1.0% low melting point agarose gel. DNA was collected by separating the band using a razor and cutting out the band portion with a razor, followed by heat melting, phenol extraction and ethanol precipitation. The recovered DNA was subcloned into the plasmid vector pCR™ II according to the prescription of TA cloning kit (Invitrogen). E. coli JM109 competent cell
(Takara Shuzo Co., Ltd.) After being transformed and transformed into cd
Ampicillin, IPTG clones with NA inserts
Selected in LB agar medium containing X-gal and X-gal, and isolated only white-colored clones using a sterilized toothpick, and a transformant Escherichia coli
JM109 / pMJ10 was obtained.
【０１２６】個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ
培地で一晩培養し、自動プラスミド抽出装置（クラボ
ウ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製したＤ
ＮＡの一部を用いてＥｃｏＲＩによる切断を行い、挿入
されているｃＤＮＡ断片の大きさを確認した。残りのＤ
ＮＡの一部をさらにＲＮａｓｅ処理、フェノール・クロ
ロフォルム抽出し、エタノール沈殿によって濃縮した。
塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy Terminator C
ycle Sequencing Kit（ＡＢＩ社）を用いて行い、蛍光
式自動シーケンサーを用いて解読した。得られた塩基配
列の情報は、ＤＮＡＳＩＳ（日立システムエンジニアリ
ング社）を用いて行なった。決定した塩基配列を〔図
１〕に示した。Individual clones containing LB containing ampicillin
After culturing overnight in a medium, plasmid DNA was prepared using an automatic plasmid extractor (Kurabo). Prepared D
A part of NA was used for digestion with EcoRI to confirm the size of the inserted cDNA fragment. The rest of D
A part of NA was further treated with RNase, extracted with phenol / chloroform, and concentrated by ethanol precipitation.
The reaction for determining the nucleotide sequence is DyeDeoxy Terminator C
Ycle Sequencing Kit (ABI) was used, and decoding was performed using a fluorescent automatic sequencer. The obtained nucleotide sequence information was analyzed by using DNASIS (Hitachi System Engineering Co., Ltd.). The determined nucleotide sequence is shown in [Fig. 1].
【０１２７】決定した塩基配列〔図１〕をもとにホモロ
ジー検索を行なった結果、形質転換体エシェリヒア コ
リ（Escherichia coli) ＪＭ１０９／ｐＭＪ１０の保有
するプラスミドに挿入されたｃＤＮＡ断片が新規Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質をコードすることが分かっ
た。それをさらに確認するために、ＤＮＡＳＩＳ（日立
システムエンジニアリング社）を用い、塩基配列をアミ
ノ酸配列に変換した後〔図１〕、疎水性プロット〔図
２〕およびアミノ酸配列に基づくホモロジー検索を行な
い、ヒトリガンド不明レセプター蛋白質（Ｂ４２００
９）、ヒトＮ-フォルミルペプチドレセプター蛋白質
（ＪＣ２０１４）、ウサギＮ-フォルミルペプチドレセ
プター蛋白質（Ａ４６５２０）、マウスＣ５ａアナフィ
ラトキシンレセプター蛋白質（Ａ４６５２５）およびウ
シニューロペプチドＹレセプター蛋白質（Ｓ２８７８
７）との相同性を見いだした〔図３〕。上記の（ ）内
の略語は、NBRF-PIRにデータとして登録される際の整理
番号であり、通常Accession Numberと呼ばれるものであ
る。As a result of homology search based on the determined nucleotide sequence [FIG. 1], the cDNA fragment inserted into the plasmid carried by the transformant Escherichia coli JM109 / pMJ10 was a novel G protein-coupled type. It was found to encode a receptor protein. In order to further confirm it, DNASIS (Hitachi System Engineering Co., Ltd.) was used to convert the base sequence into an amino acid sequence [FIG. 1], followed by a hydrophobicity plot [FIG. 2] and a homology search based on the amino acid sequence, and Ligand unknown receptor protein (B4200
9), human N-formyl peptide receptor protein (JC2014), rabbit N-formyl peptide receptor protein (A46520), mouse C5a anaphylatoxin receptor protein (A46525) and bovine neuropeptide Y receptor protein (S2878).
We found homology with 7) (Fig. 3). The abbreviations in parentheses above are reference numbers when registered as data in NBRF-PIR, and are usually called Accession Numbers.
【０１２８】[0128]
【発明の効果】本発明のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白
質および該レセプター蛋白質をコードするＤＮＡは、
リガンドの決定、抗体および抗血清の入手、組み替
え型レセプター蛋白質の発現系の構築、同発現系を用
いたレセプター結合アッセイ系の開発と医薬品候補化合
物のスクリーニング、構造的に類似したリガンド・レ
セプターとの比較にもとづいたドラッグデザインの実
施、遺伝子診断におけるプローブ、ＰＣＲプライマー
の作成、トランスジェニック動物の作製、レセプタ
ー蛋白質ＤＮＡの欠失による病態モデル動物の作製等に
用いることができる。特に、Ｇ蛋白質共役型のレセプタ
ーの構造・性質の解明はこれらの系に作用するユニーク
な医薬品の開発につながる。The G protein-coupled receptor protein of the present invention and the DNA encoding the receptor protein are
Determination of ligand, acquisition of antibody and antiserum, construction of recombinant receptor protein expression system, development of receptor binding assay system using the same expression system and screening of drug candidate compounds, structurally similar ligand / receptor It can be used for carrying out drug design based on comparison, preparation of probes for gene diagnosis, preparation of PCR primers, preparation of transgenic animals, preparation of pathological model animals by deletion of receptor protein DNA, and the like. In particular, elucidation of the structure and properties of G protein-coupled receptors will lead to the development of unique drugs that act on these systems.
【０１２９】[0129]
【配列番号：１】 配列の長さ：１２５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Leu Thr Leu His Pro Val Trp Ser Gln Lys His Arg Thr Ser His 1 5 10 15 Trp Ala Ser Arg Val Val Leu Gly Val Trp Leu Ser Ala Thr Ala Phe 20 25 30 Ser Val Pro Tyr Leu Val Phe Arg Glu Thr Tyr Asp Asp Arg Lys Gly 35 40 45 Arg Val Thr Cys Arg Asn Asn Tyr Ala Val Ser Thr Asp Trp Glu Ser 50 55 60 Lys Glu Met Gln Thr Val Arg Gln Trp Ile His Ala Thr Cys Phe Ile 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ile Leu Gly Phe Leu Leu Pro Phe Leu Val Ile Gly Phe 85 90 95 Cys Tyr Glu Arg Val Ala Arg Lys Met Lys Glu Arg Gly Leu Phe Lys 100 105 110 Ser Ser Lys Pro Phe Lys Val Thr Met Thr Ala Val Ile 115 120 125[SEQ ID NO: 1] Sequence length: 125 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide Sequence Leu Leu Thr Leu His Pro Val Trp Ser Gln Lys His Arg Thr Ser His 1 5 10 15 Trp Ala Ser Arg Val Val Leu Gly Val Trp Leu Ser Ala Thr Ala Phe 20 25 30 Ser Val Pro Tyr Leu Val Phe Arg Glu Thr Tyr Asp Asp Arg Lys Gly 35 40 45 Arg Val Thr Cys Arg Asn Asn Tyr Ala Val Ser Thr Asp Trp Glu Ser 50 55 60 Lys Glu Met Gln Thr Val Arg Gln Trp Ile His Ala Thr Cys Phe Ile 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ile Leu Gly Phe Leu Leu Pro Phe Leu Val Ile Gly Phe 85 90 95 Cys Tyr Glu Arg Val Ala Arg Lys Met Lys Glu Arg Gly Leu Phe Lys 100 105 110 Ser Ser Lys Pro Phe Lys Val Thr Met Thr Ala Val Ile 115 120 125
【０１３０】[0130]
【配列番号：２】 配列の長さ：３７７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CTTCTCACCC TTCACCCAGT GTGGTCCCAA AAGCACCGAA CCTCACACTG GGCTTCCAGA 60 GTCGTTCTGG GAGTCTGGCT CTCTGCCACT GCCTTCAGCG TGCCCTATTT GGTTTTCAGG 120 GAGACATATG ATGACCGTAA AGGAAGAGTG ACCTGCAGAA ATAACTACGC TGTGTCCACT 180 GACTGGGAAA GCAAAGAGAT GCAAACAGTA AGACAATGGA TTCATGCCAC CTGTTTCATC 240 AGCCGCTTCA TACTGGGCTT CCTTCTGCCT TTCTTAGTCA TTGGCTTTTG TTATGAAAGA 300 GTAGCCCGCA AGATGAAAGA GAGGGGCCTC TTTAAATCCA GCAAACCCTT CAAAGTCACG 360 ATGACTGCTG TTATCTC 377[SEQ ID NO: 2] Sequence length: 377 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double stranded Topology: Linear Sequence type: cDNA Characterization method: S sequence CTTCTCACCC TTCACCCAGT GTGGTCCCAA AAGCACCGAA CCTCACACTG GGCTTCCAGA 60 GTCGTTCTGG GAGTCTGGCT CTCTGCCACT GCCTTCAGCG TGCCCTATTT GGTTTTCAGG 120 GAGACATATG ATGACCGTAA AGGAAGAGTG ACCTGCAGAA ATAACTACGC TGTGTCCACT 180 GACTGGGAAA GCAAAGAGAT GCAAACAGTA AGACAATGGA TTCATGCCAC CTGTTTCATC 240 AGCCGCTTCA TACTGGGCTT CCTTCTGCCT TTCTTAGTCA TTGGCTTTTG TTATGAAAGA 300 GTAGCCCGCA AGATGAAAGA GAGGGGCCTC TTTAAATCCA GCAAACCCTT CAAAGTCACG 360 ATGACTGCTG TTATCTC 377
【０１３１】[0131]
【配列番号：３】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＮはＩを示す。 配列 ＣＴＣＧＣＳＧＣＹＭ ＴＮＲＧＹＡＴＧＧＡ ＹＣＧ
ＮＴＡＴ ２７[SEQ ID NO: 3] Sequence length: 27 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence characteristics: N indicates I. Sequence CTCGCSGCYM TNRGYAATGGA YCG
NTAT 27
【０１３２】[0132]
【配列番号：４】 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：ＮはＩを示す。 配列 ＣＡＴＧＴＲＧＷＡＧ ＧＧＡＡＮＣＣＡＧＳ ＡＭＡ
ＮＲＡＲＲＡＡ ３０[SEQ ID NO: 4] Sequence length: 30 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence characteristics: N indicates I. Sequence CATGTRGWAG GGAANCCAGS AMA
NRARRAA 30
【０１３３】[0133]
【図１】ウサギ胃幽門部平滑筋よりＰＣＲ増幅によって
得た新規レセプター蛋白質ｃＤＮＡクローンｐＭＪ１０
に含まれるウサギ胃幽門部平滑筋由来Ｇ蛋白質共役型レ
セプター蛋白質ｃＤＮＡ断片の塩基配列およびそれにコ
ードされるアミノ酸配列を示す。下線部分はＰＣＲ増幅
に用いた合成プライマーに相当する。FIG. 1 is a novel receptor protein cDNA clone pMJ10 obtained by PCR amplification from rabbit gastric antral smooth muscle.
2 shows the nucleotide sequence of the rabbit gastric pyloric smooth muscle-derived G protein-coupled receptor protein cDNA fragment contained in and the amino acid sequence encoded thereby. The underlined portion corresponds to the synthetic primer used for PCR amplification.
【０１３４】[0134]
【図２】図１に示したアミノ酸配列をもとに作成した、
ｐＭＪ１０に含まれるウサギ胃幽門部平滑筋由来Ｇ蛋白
質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮＡ断片にコードされる
蛋白質の疎水性プロットを示す。この図から４〜６で示
す疎水性ドメインの存在が示唆される。FIG. 2 was prepared based on the amino acid sequence shown in FIG.
Fig. 3 shows a hydrophobicity plot of the protein encoded by the rabbit gastric antrum smooth muscle-derived G protein-coupled receptor protein cDNA fragment contained in pMJ10. This figure suggests the presence of the hydrophobic domains shown in 4-6.
【０１３５】[0135]
【図３】図１に示したｐＭＪ１０に含まれるウサギ胃幽
門部平滑筋由来Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｃＤＮ
Ａ断片にコードされる蛋白質の部分アミノ酸配列（ｐＭ
Ｊ１０）を、公知のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質で
あるヒトリガンド不明レセプター蛋白質（Ｂ４２００
９）、ヒトＮ-フォルミルペプチドレセプター蛋白質
（ＪＣ２０１４）、ウサギＮ-フォルミルペプチドレセ
プター蛋白質（Ａ４６５２０）、マウスＣ５ａアナフィ
ラトキシンレセプター蛋白質（Ａ４６５２５）およびウ
シニューロペプチドＹレセプター蛋白質（Ｓ２８７８
７）と比較した図を示す。黒く塗った部分は一致してい
る部分を示す。ｐＭＪ１０の第１番目〜第１２５番目の
アミノ酸配列は図１の第１番目〜第１２５番目のアミノ
酸配列に対応する。[Fig. 3] Rabbit gastric pyloric smooth muscle-derived G protein-coupled receptor protein cdN contained in pMJ10 shown in Fig. 1.
Partial amino acid sequence of protein encoded by A fragment (pM
J10) is a known G protein-coupled receptor protein, which is a human ligand unknown receptor protein (B4200).
9), human N-formyl peptide receptor protein (JC2014), rabbit N-formyl peptide receptor protein (A46520), mouse C5a anaphylatoxin receptor protein (A46525) and bovine neuropeptide Y receptor protein (S2878).
The figure compared with 7) is shown. The parts painted in black indicate the matching parts. The 1st to 125th amino acid sequences of pMJ10 correspond to the 1st to 125th amino acid sequences in FIG.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＥＤ 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 39/395 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＤ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl.6 Identification code Internal reference number FI Technical display location C12P 21/02 C12P 21/08 21/08 G01N 33/53 D G01N 33/53 33/566 33 / 566 A61K 39/395 D // A61K 38/00 AED 9162-4B C12N 15/00 ZNAA 39/395 A61K 37/02 AED (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19)
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