【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は新規なポリペプチド及び
その用途に係る。本発明によるポリペプチド又はその塩
は一般細菌のみならず、真菌に対しても優れた抗菌活性
を有しており且つ毒性が極めて低いので、一般細菌性疾
患又はカンジダ症等の真菌性疾患治療剤の有効成分とし
て、更には食品又は飼料用の抗菌性添加剤として使用す
ることができる。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a novel polypeptide and its use. The polypeptide or a salt thereof according to the present invention has an excellent antibacterial activity against not only general bacteria but also fungi and has extremely low toxicity, and therefore, a therapeutic agent for fungal diseases such as general bacterial diseases or candidiasis. Can be used as an active ingredient, and as an antibacterial additive for food or feed.
【０００２】[0002]
【従来の技術】抗菌活性を有するペプチド類の開発に関
するの研究は従来から盛んに行われている。例えば、環
状ペプチド誘導体 (特開昭 58 - 213744 号公報)、酵母
類に対する抗菌ポリペプチド (特開昭 60 - 130599 号
公報)、新規グリコペプチド (特開昭61- 251699 号公
報)、グラム陽性菌に効果を示すオリゴペプチド (特開
昭 62 -22798 号公報)、ペプチド系抗生物質 (特開昭 6
3 - 17897 及び特開平 6 -56889 号公報) 等を例示する
ことができる。しかしながら、これらのペプチド類の内
で、殊に真菌に対して充分な抗菌効果を発揮するものは
存在しないようである。尚、近年に至り臨床の場では A
IDS 等による真菌症が問題になってきている。抗真菌剤
としてはアムホテリシン B やトリアゾール系のものが
主として用いられているが、その効果が充分でなかった
り副作用が強い等の点で満足し得る抗真菌剤は得られて
いないのが現状である。従って、安全性に優れ、効果が
充分に期待できるペプチド性の抗真菌剤が求められてい
る。2. Description of the Related Art Research on the development of peptides having antibacterial activity has been extensively carried out. For example, cyclic peptide derivatives (JP-A 58-213744), antimicrobial polypeptides for yeasts (JP-A 60-130599), novel glycopeptides (JP-A 61-251699), Gram-positive bacteria Oligopeptides (Japanese Patent Application Laid-Open No. 62-22798) and peptide antibiotics (Japanese Patent Application Laid-Open No.
3-17897 and JP-A-6-56889). However, none of these peptides appears to exert a sufficient antimicrobial effect, especially against fungi. In recent years, in clinical settings A
Mycosis caused by IDS is becoming a problem. Although amphotericin B and triazoles are mainly used as antifungal agents, the present situation is that no satisfactory antifungal agent has been obtained because of insufficient effects or strong side effects. . Therefore, there is a demand for a peptide antifungal agent which is highly safe and can be expected to have a sufficient effect.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題乃至発明の目的】本発明
は従来技術におけるこのような困難をふまえてなされた
ものであり、本発明の目的は、ポリペプチド系抗菌剤を
開発する上で従来課題とされてきた生産コストを低く抑
え且つ合成が容易であり、しかも正常細胞に対しては毒
性が極めて低く且つ抗菌活性、殊に抗真菌活性において
も優れた新規なポリペプチドを提供することにある。DISCLOSURE OF THE INVENTION Problems to be Solved by the Invention and Objects of the Invention The present invention has been made in view of such difficulties in the prior art, and an object of the present invention is to solve the conventional problems in developing a polypeptide antibacterial agent. It is an object of the present invention to provide a novel polypeptide which has a low production cost, is easy to synthesize, has extremely low toxicity to normal cells, and has excellent antibacterial activity, particularly antifungal activity. .
【０００４】[0004]
【課題を解決し、目的を達成する手段及び作用】本発明
者等は鋭意検討を重ねた結果、正電荷を有するリジン残
基を基本とし、これに主としてバリン又はロイシン残基
を組み合わせた 10 個以下の構成アミノ酸からなるポリ
ペプチドがカンジタ菌等に対しても強い抗真菌活性を示
すと共に、赤血球やミドリザル由来の腎細胞等の正常細
胞に対する毒性が極めて低いことを見い出し、これによ
って本発明を基本的には完成するに至った。[Means and Actions for Solving the Problem and Achieving the Object] As a result of intensive studies, the present inventors have found that a lysine residue having a positive charge is the basis and a valine or leucine residue is mainly combined with the lysine residue. It was found that the polypeptide consisting of the following constituent amino acids exhibits strong antifungal activity against Candida and the like, and has extremely low toxicity to normal cells such as erythrocytes and kidney cells derived from green monkeys, and thereby the present invention is basically used. It was finally completed.
【０００５】従って、本発明は一般式 (I、配列番号 :
1) Lys-Xaa1-Lys-Xaa2-Xaa2-Xaa2-Lys-Xaa1-Lys-R (式中 Xaa1 は Val、Leu、Phe 又は Ile を意味し、Xaa
2 は Val 又は Leu を意味し、R は OH 又は NH2 を意
味する)にて示されるポリペプチド又はその塩を提供す
ると共に、これらの内の少なくとも 1 種を有効成分と
して含有する抗菌剤乃至食品及び飼料用の抗菌性添加剤
を提供するものである。Accordingly, the present invention provides the general formula (I, SEQ ID NO:
1) Lys-Xaa1 -Lys-Xaa2 -Xaa2 -Xaa2 -Lys-Xaa1 -Lys-R (wherein Xaa1 means Val, Leu, Phe or Ile, and Xaa
2 means Val or Leu and R means OH or NH2 ) or an antibacterial agent or food containing at least one of these as an active ingredient. And an antibacterial additive for feed.
【０００６】本明細書において、アミノ酸は本技術分野
において慣用されている 3 文字又は 1 文字略号で示さ
れ、例示すれば下記の通りである。 リジン : Lys 又は K、ロイシン : Leu 又は L、バリン
: Val 又は V、フェニルアラニン : Phe 又は F、イソ
ロイシン : Ile 又は I。[0006] In the present specification, amino acids are represented by the three-letter or one-letter abbreviations commonly used in this technical field, and examples thereof are as follows. Lysine: Lys or K, Leucine: Leu or L, Valine
: Val or V, phenylalanine: Phe or F, isoleucine: Ile or I.
【０００７】本発明によるポリペプチドは、上記の一般
式 (I) から明らかなようにLys- Xaa1-Lys (Xaa1 は上
記の疎水性アミノ酸を意味する) なる配列を有するトリ
ペプチドを N 及び C 末端に有し、中央の部位にロイシ
ン又はバリンを 3 個有している比較的単純な構造を有
するポリペプチドである。尚、C 末端がカルボキシル基
であっても、アミド化されていてもポリペプチドの抗菌
活性は殆ど同じであり、アミド化されている場合の方が
若干高い。本発明によるポリペプチドは、その構成アミ
ノ酸の数が僅か 9 個であり、合成上に課題のあるトリ
プトファン、システイン、メチオニン等を含有していな
いので、化学合成法により容易に且つ廉価に大量生産す
ることが可能でき、これにより既述の課題を解決すると
共に本発明の目的を達成することができる。これらのポ
リペプチドは塩の形であることが可能であり、例えば塩
酸、トリフルオロ酢酸や燐酸等の無機又は有機酸の付加
塩であることができる。The polypeptide according to the present invention comprises a tripeptide having a sequence of Lys-Xaa1 -Lys (Xaa1 means the above-mentioned hydrophobic amino acid) as N and N as shown in the above general formula (I). It is a polypeptide having a relatively simple structure, which has three leucines or valines in the central region at the C-terminus. It should be noted that the antibacterial activity of the polypeptide is almost the same regardless of whether the C-terminal is a carboxyl group or is amidated, and the case of amidation is slightly higher. Since the polypeptide according to the present invention has only 9 constituent amino acids and does not contain tryptophan, cysteine, methionine, etc., which pose problems in synthesis, it can be mass-produced easily and inexpensively by a chemical synthesis method. This makes it possible to solve the above-mentioned problems and achieve the object of the present invention. These polypeptides can be in the form of salts, for example addition salts of inorganic or organic acids such as hydrochloric acid, trifluoroacetic acid or phosphoric acid.
【０００８】本発明による抗菌剤はペプチドであるため
に経口投与等された場合においては、毒性の発現は殆ど
ない。その他の投与経路であっても、他の化学物質であ
る抗生物質のように残留性が問題になることはない。従
って、本発明によるポリペプチドはヒト又は他の動物に
おける細菌性疾患、特に真菌症に対して有効であり、又
食品や飼料用の抗菌性添加物としても使用することがで
きる。本発明によるポリペプチドを医薬品として用いる
場合には、主として注射剤として製剤化されるが、錠剤
等の経口剤、クリーム剤乃至軟膏剤、ローション剤、ゲ
ル剤、膣剤又はトローチ剤とすることもできる。Since the antibacterial agent according to the present invention is a peptide, it exhibits almost no toxicity when orally administered. Even with other administration routes, persistence does not pose a problem like with other chemical substances such as antibiotics. Therefore, the polypeptide according to the present invention is effective against bacterial diseases, especially mycosis, in humans or other animals, and can also be used as an antibacterial additive for food and feed. When the polypeptide according to the present invention is used as a pharmaceutical, it is mainly formulated as an injection, but it may be an oral preparation such as a tablet, a cream or ointment, a lotion, a gel, a vaginal preparation or a troche. it can.
【０００９】[0009]
【実施例等】次に、製造例及び薬理活性試験例に関連し
て本発明を更に詳細且つ具体的に説明する。製造例 (1) 抗菌性ポリペプチドの合成と精製 ポリペプチドの合成は、パーキンエルマー社製のペプチ
ド合成装置 (model431A) を使用し、t-Boc アミノ酸を
用いた固相法により行った。アミノ酸は、α-アミノ基
が t-ブトキシカルボニル基 (t-Boc 基) にて保護され
たもので、その他 ε-アミノ基は 2-クロロベンジルオ
キシカルボニル基等で保護されたものを用いた。樹脂
は、C 末端がアミドのペプチドを与える p-メチルベン
ズヒドリルアミン (MBHA) 樹脂又は C 末端がカルボキ
シルのペプチドを与えるフェニルアセトアミドメチル
(PAM) 樹脂を用いた。MBHA 樹脂または t-Boc リジンが
導入された PAM 樹脂 0.5 mmol をトリフルオロ酢酸／
塩化メチレンにより t-Boc 基を除去し、保護アミノ酸
2 mmol とジシクロヘキシルカルボジイミド (DCC)／ヒ
ドロキシベンゾトリアゾール (HOBt)で縮合反応を行う
ことによりペプチド結合を形成させた。塩化メチレンに
て洗浄後、上記の操作を繰り返すことによりカルボキシ
ル末端から順次アミノ酸を導入することにより本発明に
よる各種のペプチドを合成していった。合成したペプチ
ドについてはトリフルオロメタンスルホン酸法にて脱保
護基、脱樹脂を行なった。即ち、ペプチド 500 mg に対
しトリフルオロメタンスルホン酸 1ml、トリフルオロ酢
酸 5ml、チオアニソール 1ml 及びエタンジチオール0.5
ml を氷冷しながら 2 - 3 時間反応させた。粗ペプチド
を下記に示す条件の逆相 HPLC により精製した。 カラム：ウォーターズ社製の μ-ボンダスフェア C-18
(19mm x 15cm)、 溶出液：0.012N 塩酸中 15% から 50% のアセトニトリ
ルの直線勾配、35 分間、 流速 ：7.0ml/min。 HPLC によるメインピーク部分を回収して凍結乾燥し
た。その一部をパーキンエルマー社製のペプチドシーク
ェンサーにて調べた処、サンプルはすべて正しく化学合
成されていることが確認された。尚、本発明の範畴に属
しない各種のアミノ酸配列を有する抗菌性ポリペプチド
も同様に合成され、精製された。EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail and specifically with reference to Production Examples and Pharmacological Activity Test Examples.Production Example (1) Synthesis and Purification of Antibacterial Polypeptide Polypeptides were synthesized by a solid phase method using t-Boc amino acid using a peptide synthesizer (model 431A) manufactured by Perkin Elmer. The amino acid used was one in which the α-amino group was protected by a t-butoxycarbonyl group (t-Boc group), and the other ε-amino group was protected by a 2-chlorobenzyloxycarbonyl group or the like. Resins are p-methylbenzhydrylamine (MBHA) resins that give C-terminal amide peptides or phenylacetamidomethyl that give C-terminal carboxyl peptides.
(PAM) resin was used. 0.5 mmol of PHA resin containing MBHA resin or t-Boc lysine was added to trifluoroacetic acid /
Remove the t-Boc group with methylene chloride and remove the protected amino acid.
A peptide bond was formed by performing a condensation reaction between 2 mmol and dicyclohexylcarbodiimide (DCC) / hydroxybenzotriazole (HOBt). After washing with methylene chloride, the above operation was repeated to successively introduce amino acids from the carboxyl terminus to synthesize various peptides according to the present invention. The synthesized peptide was deprotected and deresined by the trifluoromethanesulfonic acid method. That is, for 500 mg of peptide, 1 ml of trifluoromethanesulfonic acid, 5 ml of trifluoroacetic acid, 1 ml of thioanisole and 0.5 ml of ethanedithiol.
ml was reacted with ice for 2-3 hours. The crude peptide was purified by reverse phase HPLC under the conditions shown below. Column: Waters μ-Bondasphere C-18
(19 mm x 15 cm), eluent: linear gradient of 15% to 50% acetonitrile in 0.012N hydrochloric acid, 35 minutes, flow rate: 7.0 ml / min. The main peak portion by HPLC was collected and freeze-dried. When a part of the sample was examined with a peptide sequencer manufactured by Perkin Elmer, it was confirmed that all the samples were chemically synthesized correctly. Incidentally, antibacterial polypeptides having various amino acid sequences which do not belong to the scope of the present invention were similarly synthesized and purified.
【００１０】(2) 生理活性の試験法 抗菌活性は、微量液体希釈法により最小発育阻止濃度
(MIC) として求めた。測定は National Committee for
Clinical Laboratory Standards (NCCLS,Villanova, 19
88) from USA に従って行った。即ち、各菌体を Cation
Supplemented Mueller-Hinton Broth (CSMHB) 培地で振
盪培養後、650nm における吸光度が 0.3 になるように
菌の濃度を調整し、更に培地で 106 CFU/ml になるよう
に希釈する。この菌体溶液と培地で希釈した抗菌物質の
サンプルを各々50μl 添加し、35℃ で 20 - 24 時間培
養し最小発育阻止濃度を求めた。(2) Test method for physiological activity The antibacterial activity was measured by the trace liquid dilution method to determine the minimum inhibitory concentration.
(MIC) Measured by National Committee for
Clinical Laboratory Standards (NCCLS, Villanova, 19
88) from USA. In other words,
After shaking culture in Supplemented Mueller-Hinton Broth (CSMHB) medium, adjust the concentration of the bacteria so that the absorbance at 650 nm is 0.3, and further dilute the medium to 106 CFU / ml. 50 μl of each of the bacterial cell solution and the antimicrobial substance sample diluted with the medium were added, and cultured at 35 ° C. for 20-24 hours to determine the minimum inhibitory concentration.
【００１１】抗菌活性の測定例 1 (中央部の Leu の数
が異なるアナログの抗菌活性) N 末端と C 末端におけるアミノ酸配列が RLK の場合と
KLK の場合について、中央の部位が L であって、その
数が異なるポリペプチドの抗菌活性を調べた結果は、下
記の表 1 に示される通りであった。この表 1 から、N
及び C 末端が RLK の場合には、Leu の数が 5 個の場
合に最も活性が高く 4 個 、3 個になると活性は弱くな
る傾向がある。一方、本発明が関与する KLK を基本に
した場合には 4 個や 3 個の方が活性において優れてい
ることが明らかになった。Measurement example 1 of antibacterial activity (antibacterial activity of analogs having different numbers of Leu in the center) When the amino acid sequences at the N-terminal and C-terminal are RLK
In the case of KLK, the results of examining the antibacterial activity of polypeptides having a central region of L and having different numbers are shown in Table 1 below. From this table 1, N
When the C-terminal is RLK, the activity is highest when the number of Leu is 5, and the activity tends to be weaker when the number is 4, and 3. On the other hand, when KLK involved in the present invention was used as a basis, it was revealed that 4 or 3 were more excellent in activity.
【００１２】[0012]
【表１】 表 1 において、数値は抗菌活性 (MIC : μg/ml)、 * は公知のペプチドを示す。[Table 1] In Table 1, numerical values indicate antibacterial activity (MIC: μg / ml), * indicates a known peptide.
【００１３】抗菌活性の測定例 2 (KLK の部位を変換し
たアナログの抗菌活性) MIC の測定結果が下記の表 2 に示されている。この表
2 から明らかなように、KLK の K (リジン) の部位を正
電荷を有する他のアミノ酸に変換した場合に、R (アル
ギニン) への変換では活性は保持されるが、H (ヒスチ
ジン) への変換では活性は消失する。又、表 2 には明
示されていないが、アミノ酸配列における中央部に L
(ロイシン) を有しないものは活性を有しないことが判
明した。尚、KLKLLLKLK-NH2 を基本として KLK の Leu
の部位を他のアミノ酸に変換したアナログでは Gly (グ
リシン) に変換したものでは活性は殆ど消失し、A(アラ
ニン) 又は C (システイン) に変換したものでは MRSA
等の耐性菌に対する活性が大幅に減少し、他の疎水性ア
ミノ酸である V (バリン)、I (イソロイシン) 又は F
(フェニルアラニン) に変換したものでは活性が保持さ
れることも判明した。Antibacterial activity measurement example 2 (antibacterial activity of analog in which KLK site is converted) The measurement results of MIC are shown in Table 2 below. This table
As is clear from 2, when the K (lysine) site of KLK is converted to another amino acid having a positive charge, conversion to R (arginine) retains the activity but conversion to H (histidine). Upon conversion, activity disappears. Although not explicitly shown in Table 2, L in the center of the amino acid sequence
Those without (leucine) were found to have no activity. In addition, based on KLKLLLKLK-NH2 , Leu of KLK
In analogs in which the amino acid site was converted to other amino acids, the activity was almost lost in Gly (glycine) conversion, and in the one converted to A (alanine) or C (cysteine) MRSA.
Activity against resistant bacteria such as V (valine), I (isoleucine) or F
It was also found that the activity converted to (phenylalanine) was retained.
【００１４】[0014]
【表２】 表 2 において、数値は抗菌活性 (MIC : μg/ml)、 * は公知のペプチドを示す。[Table 2] In Table 2, numerical values indicate antibacterial activity (MIC: μg / ml), * indicates a known peptide.
【００１５】抗菌活性の測定例 3 (C 末端に KLK の部
位を有しないポリペプチドの抗菌活性） C 末端に KLK のトリペプチドを有しないポリペプチド
のS.aureus に対する抗菌活性は Leu の数に拘らず、
C 末端に KLK を有する場合の活性と比較して1/2 - 1/8
程度に低下した (下記の表 3 参照)。Antibacterial activity measurement example 3 (antibacterial activity of a polypeptide having no KLK site at the C terminus) The antibacterial activity of a polypeptide having no KLK tripeptide at the C terminus againstS.aureus depends on the number of Leu. No
1/2-1/8 compared to the activity with KLK at the C-terminus
To some extent (see Table 3 below).
【００１６】[0016]
【表３】 表 3 において、数値は抗菌活性 (MIC : μg/ml)、 * は公知のペプチドを示す。[Table 3] In Table 3, numerical values indicate antibacterial activity (MIC: μg / ml), * indicates a known peptide.
【００１７】抗菌活性の測定例 4 (カンジタ菌に対する
活性測定) 真菌に対する活性は、Candidaalbicans を用い培地は
サブロー培地を用いてMIC の測定を行った。その結果 K
LKLLLKLK-NH2 及び KVKLLLKVK-NH2 が他のペプチドと比
較して極めて抗真菌活性の高いことが明らかになった
(下記の表 4 参照)。Measurement Example 4 of Antibacterial Activity (Measurement of Activity against Candida bacterium) For the activity against fungi, MIC was measured usingCandidaalbicans and Sabouraud medium. As a result K
LKLLLKLK-NH2 and KVKLLLKVK-NH2 were found to have extremely high antifungal activity compared with other peptides
(See Table 4 below).
【００１８】[0018]
【表４】 表 4 において、数値は抗菌活性 (MIC : μg/ml)、 * は公知のペプチドを示す。[Table 4] In Table 4, numerical values indicate antibacterial activity (MIC: μg / ml), * indicates a known peptide.
【００１９】抗菌活性の測定例 5 抗菌活性の測定例 3 及び 4 の結果から KLKLLLKLK-NH2
(配列番号 7) はS.aureus やE.coli に対してのみ
でなく真菌に対しても強い抗真菌活性を示し、又 KVKLL
LKVK-NH2 (配列番号 2) も強い抗真菌活性を示すので、
アミノ酸配列のN 及び C 末端が KLK 又は KVK であり
且つ中央の部位が LLL のみ ではなく、VVV 又は V と
L の組合せからなる各種のポリペプチドを合成して MIC
を求めた結果を下記の表 5 に示す (この表 5 には上
記の配列番号 2 及 び 7 に該当するポリペプチドの抗
細菌及び抗真菌活性も併せて示されている)。Measurement example 5 of antibacterial activity From the results of measurement examples 3 and 4 of antibacterial activity, KLKLLLKLK-NH2
(SEQ ID NO: 7) shows strong antifungal activity not only againstS.aureus andE.coli but also against fungi, and KVKLL
LKVK-NH2 (SEQ ID NO: 2) also shows strong antifungal activity, so
The N- and C-terminals of the amino acid sequence are KLK or KVK and the central region is not only LLL but VVV or V
MIC was synthesized by synthesizing various polypeptides consisting of L combinations.
The results obtained are shown in Table 5 below (this Table 5 also shows the antibacterial and antifungal activities of the polypeptides corresponding to SEQ ID NOS: 2 and 7).
【００２０】[0020]
【表５】 表 5 において、数値は抗菌活性 (MIC : μg/ml)、 * は公知のペプチドを示す。[Table 5] In Table 5, numerical values indicate antibacterial activity (MIC: μg / ml), * indicates a known peptide.
【００２１】表 5 から明らかなように、本発明による
ポリペプチドはグラム陽性菌及びグラム陰性菌の広い範
囲の微生物に対してのみならず、真菌であるC.albica
nsに対しても強い抗菌活性を示すことが判明した。As is clear from Table 5, the polypeptides according to the invention are not only against a wide range of microorganisms, Gram-positive and Gram-negative but also the fungusC.albica .
It was revealed that the antibacterial activity is also strong againstns .
【００２２】正常細胞に対する細胞障害活性の測定 (1) 培養細胞における細胞障害活性 ミドリザル腎 (GMK) 由来の細胞を 96 穴プレートでコ
ンフルエントになるまで培養する。培地を捨てて新たに
検体である抗菌性ポリペプチドを含有する培地を添加す
る。37℃、5% CO2で 20 - 24 時間培養する。培地を除
去し、PBS(-)100μl にて洗浄する。1mM の臭化 3-(4,5
-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H テトラゾ
リウム (MTT) を含有する培地 50μl を添加し、37
℃、5% CO2 で 1 時間培養する。その後、10% ドデシル
硫酸ナトリウムと 0.04N 塩酸を含有する 50% イソブタ
ノール溶液 100μl を添加した後に、540nm で吸光度を
測定する。この場合に、生細胞の酵素により MTT が呈
色物質のホルマザンに還元され、このホルマザンの量は
細胞数に比例して増加するので、特異的吸光度を測定す
ることにより障害を受けていない細胞の量が判明する。
結果は、50% の細胞障害性を示す抗菌性ペプチド濃度で
表した (後記の表 6 参照)。表 6 から明かな通り、本
発明によるポリペプチド、即ちアミノ酸配列の中央部が
3 個の疎水性アミノ酸から構成されるポリペプチドは
50% の細胞障害性値が何れも 200μg/ml 以上であり、
正常細胞に対して作用する蜂毒のメリチンと比較する場
合に細胞障害活性は弱く 1/40 以下であり、中央部が 5
個 の疎水性アミノ酸から構成されるポリペプチドと比
較する場合にも 1/3 以下 であり毒性は少なく安全性に
優れたペプチドであることが判明した。Measurement of Cytotoxic Activity Against Normal Cells (1) Cytotoxic Activity in Cultured Cells Cells derived from green monkey kidney (GMK) are cultured in a 96-well plate until they become confluent. The medium is discarded and a medium containing an antimicrobial polypeptide as a sample is newly added. Incubate at 37 ℃, 5% CO2 for 20-24 hours. Remove the medium and wash with 100 μl of PBS (-). 1mM bromide 3- (4,5
-Dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H tetrazolium (MTT) in 50 μl of medium,
Incubate at ℃, 5% CO2 for 1 hour. Then, add 100 μl of 50% isobutanol solution containing 10% sodium dodecyl sulfate and 0.04N hydrochloric acid, and measure the absorbance at 540 nm. In this case, MTT is reduced to the coloring substance formazan by the enzyme of living cells, and the amount of this formazan increases in proportion to the number of cells. The amount is known.
The results were expressed as the concentration of antimicrobial peptide showing 50% cytotoxicity (see Table 6 below). As is clear from Table 6, the polypeptide according to the present invention, that is, the central part of the amino acid sequence is
A polypeptide composed of three hydrophobic amino acids
50% cytotoxicity value is 200 μg / ml or more,
The cytotoxic activity is weaker than 1/40, compared to the bee venom melittin, which acts on normal cells, and 5 in the central part.
Even when compared with a polypeptide composed of individual hydrophobic amino acids, it was 1/3 or less, and it was found to be a peptide with low toxicity and excellent safety.
【００２３】(2) 羊赤血球 (SRBC) の溶血反応 羊保存血液 (羊血液にアルセバー氏液を等量添加したも
の) 0.2ml に PBS を0.8ml 添加し、2000 x g で 5 分
間遠心し、上清を除去することにより洗浄を行う。PBS
を 10ml 添加した後、この赤血球溶液 25μl に検体で
ある抗菌性ポリペプチド溶液 25μl を添加し、37℃ で
2 時間インキュベーションする。 2000x g で 5 分間
遠心を行い、上清の吸光度を 576nm で測定する。結果
は、10% の溶血性を示す抗菌性ポリペプチド濃度で表し
た (下記の表 6 参照)。表 6 から明かな通り、本発明
によるポリペプチド、即ちアミノ酸配列の中央部が 3
個の疎水性アミノ酸から構成されるポリペプチドでは溶
血作用濃度が何れも 250μg/ml 以上であり、蜂毒のメ
リチンと比較する場合に赤血球に対する溶血活性は 1/6
0 以下であり、中央部が 5 個の疎水性アミノ酸から構
成されるポリペプチドと比較する場合にも有意に低く、
毒性が少ない安全性に優れたペプチドであることが判明
した。(2) Hemolysis reaction of sheep red blood cells (SRBC) 0.8 ml of PBS was added to 0.2 ml of sheep-preserved blood (equal amount of Arsever's solution added to sheep blood), and the mixture was centrifuged at 2000 xg for 5 minutes. Washing is done by removing the clean. PBS
After adding 10 ml of this solution, add 25 μl of the antibacterial polypeptide solution, which is the sample, to 25 μl of this red blood cell solution and incubate at 37 ° C.
Incubate for 2 hours. Centrifuge at 2000 x g for 5 minutes and measure the absorbance of the supernatant at 576 nm. The results were expressed as the concentration of 10% hemolytic antimicrobial polypeptide (see Table 6 below). As is clear from Table 6, the polypeptide according to the present invention, that is, the central portion of the amino acid sequence is 3
Each of the polypeptides composed of hydrophobic amino acids has a hemolytic concentration of 250 μg / ml or more, and the hemolytic activity against erythrocytes is 1/6 when compared to the bee venom melittin.
0 or less, and significantly lower when compared to a polypeptide composed of 5 hydrophobic amino acids in the central part,
It was found to be a peptide with low toxicity and excellent safety.
【００２４】[0024]
【表６】[Table 6]
【００２５】製剤例 本発明によるポリペプチド (KVKLLLKVK-NH2、配列番号
2) を 50mg 宛含有するようにバイアルに無菌的に分配
し、凍結乾燥により水分を除去して密封する。この製剤
は用時は注射用生理食塩水に溶解せしめられる。尚、本
発明によるポリペプチドの安定化剤としてアルギニン等
のアミノ酸類やクエン酸等の有機酸及びヒト血清アルブ
ミン等を用いることができる。Formulation Example Polypeptide according to the present invention (KVKLLLKVK-NH2 , SEQ ID NO:
Aseptically distribute 2) in a vial containing 50 mg, remove water by freeze-drying, and seal. This formulation is dissolved in physiological saline for injection before use. As the stabilizer of the polypeptide according to the present invention, amino acids such as arginine, organic acids such as citric acid, human serum albumin and the like can be used.
【００２６】[0026]
【発明の効果】本発明によるポリペプチドは、正常細胞
に対する毒性が極めて低く、幅広い抗菌活性を有してお
り、殊に真菌に対しても強い抗菌活性を示すので一般細
菌性感染症のみならず真菌症の治療剤の有効成分とし
て、更には食品及び飼料用の抗菌性添加剤として利用す
ることが可能である。尚、本発明によるポリペプチド
は、その構成アミノ酸の数が僅か 9 個であり且つ合成
上等において課題のあるアミノ酸を有していないので化
学合成法により比較的廉価に調製することができる。EFFECT OF THE INVENTION The polypeptide of the present invention has extremely low toxicity to normal cells and has a wide range of antibacterial activity. In particular, it exhibits a strong antibacterial activity against fungi as well. It can be used as an active ingredient of a therapeutic agent for mycosis and also as an antibacterial additive for food and feed. Since the polypeptide according to the present invention has only 9 constituent amino acids and does not have an amino acid that causes problems in terms of synthesis, it can be prepared at a relatively low cost by a chemical synthesis method.
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチドXaa1 : Val、Leu、Phe 又は Ile Xaa2 : Val 又は Leu R : OH 又は NH2 配列番号：２ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：３ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Val Lys Val Leu Leu Lys Val Lys NH2 1 5 配列番号：４ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：５ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：６ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：７ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：８ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：９ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：１０ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：１１ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：１２ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：１３ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：１４ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：１５ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：１６ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：１７ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：１８ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：１９ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：２０ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：２１ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：２２ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：２３ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列番号：２４ 配列の長さ：９ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド[Sequence listing] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide Xaa1 : Val, Leu, Phe or Ile Xaa2 : Val or Leu R: OH or NH2 SEQ ID NO: 2 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide SEQ ID NO: 3 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide Sequence Lys Val Lys Val Leu Leu Lys Val Lys NH2 15 SEQ ID NO: 4 Sequence length: 9 Sequence Type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide SEQ ID NO: 5 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide SEQ ID NO: 6 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide SEQ ID NO: 7 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide SEQ ID NO: 8 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide SEQ ID NO: 9 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide SEQ ID NO: 10 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide SEQ ID NO: 11 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide SEQ ID NO: 12 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide SEQ ID NO: 13 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide SEQ ID NO: 14 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide SEQ ID NO: 15 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide SEQ ID NO: 16 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide SEQ ID NO: 17 sequence length: 9 sequence type: amino acid topology: linear sequence type: peptide SEQ ID NO: 18 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide SEQ ID NO: 19 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide SEQ ID NO: 20 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide SEQ ID NO: 21 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide SEQ ID NO: 22 sequence length: 9 sequence type: amino acid topology: linear sequence type: peptide SEQ ID NO: 23 sequence length: 9 sequence type: amino acid topology: linear sequence type: peptide SEQ ID NO: 24 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide
フロントページの続き (72)発明者 星野 正治 愛知県名古屋市東区東外堀町35番地 株式 会社三和化学研究所内Front Page Continuation (72) Inventor Shoji Hoshino 35 Higashi Sotobori-cho, Higashi-ku, Nagoya, Aichi Prefecture Sanwa Chemical Research Institute Co., Ltd.
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