【発明の詳細な説明】 発明の背景 大腸菌K12菌株が、遺伝子工学実験を実施するのに好適
な微生物の一であることは周知である。主に次の二つの
理由によつて大腸菌K12の宿主−ベクター系を使用して
商業的に興味のある物質を製造するための組換えDNA技
術が工業的に開発されている。即ち１つには、現在、こ
れらの微生物の遺伝学が最もよく知られているためであ
り、もう１つには、いくつかの国における組換えDNAガ
イドラインが組換え実験を実施するのにこの菌株の使用
に固執しているからである。しかしこれらの菌株は、バ
シルス、コリネバクテリウム、アクチノミセス及びイー
ストのような他の工業的に有用な微生物が有しているシ
ヨ糖醗酵能を有していない。従つて、大腸菌K12は、主
炭素源としてシヨ糖を含有する、糖蜜のような原料を使
用して能率よく生育することができない。そこで、工業
的に有益な遺伝子情報を運ぶのに用いることができるの
と同時に、これらの細菌にシヨ糖醗酵特性を授与するの
に使用することができる大腸菌プラスミド・ベクターが
得られれば望ましい。BACKGROUND OF THE INVENTION It is well known that the E. coli K12 strain is one of the suitable microorganisms for carrying out genetic engineering experiments. Recombinant DNA technology has been industrially developed to produce commercially interesting materials using the E. coli K12 host-vector system for two main reasons. One is because the genetics of these microorganisms are currently best known, and the other is that the recombinant DNA guidelines in some countries have been used to carry out recombination experiments. This is because they stick to the use of strains. However, these strains do not have the sucrose fermentation ability possessed by other industrially useful microorganisms such as Bacillus, Corynebacterium, Actinomyces and yeast. Therefore, E. coli K12 cannot grow efficiently using a raw material such as molasses, which contains sucrose as the main carbon source. It would therefore be desirable to have an E. coli plasmid vector that can be used to carry industrially valuable genetic information while at the same time conferring sucrose fermentation characteristics to these bacteria.
炭素源としてシヨ糖を有する培地が利用される時、この
ベクターを有する微生物の培養物の安定性を確保するの
にシヨ糖醗酵表現型が寄与することができるという事実
によつて、このプラスミド・ベクターは、他の常用のベ
クターに比べて別の利点となる。このプラスミドを持つ
細胞は単独でシヨ糖醗酵能を有するので、このような培
地においては、この細胞のみが生育することができる。
細胞が商業的に有用な遺伝子を有するそれらのプラスミ
ドを失なう場合には、細胞はそれらのシヨ糖醗酵能も失
ない、生育することができなくなる。このことは、経済
的に高価につく、プラスミドの安定性を確保するための
抗生物質の培地中への大量の添加をなくすることができ
る。Due to the fact that the sucrose fermentation phenotype can contribute to ensure the stability of the culture of the microorganisms carrying this vector when a medium with sucrose as the carbon source is utilized, this plasmid Vectors offer another advantage over other commonly used vectors. Since the cell having this plasmid alone has the ability to ferment sucrose, only this cell can grow in such a medium.
When cells lose their plasmids with commercially useful genes, they also lose their ability to ferment sucrose and become unable to grow. This can be economically expensive and can eliminate large additions of antibiotics to the medium to ensure plasmid stability.
発明の要約 従つて、工業的に有用な能力を持つ微生物を与えるプラ
スミド・ベクターを構成することが本発明の一目的であ
る。SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, it is an object of the present invention to construct a plasmid vector that provides a microorganism with industrially useful capabilities.
他の一目的は、工業的に有用なプラスミドを有する微生
物が生育し、一方このようなプラスミドを有しないよう
な微生物は生育しない微生物の培養物を提供することで
ある。Another object is to provide a culture of microorganisms in which microorganisms carrying industrially useful plasmids grow, whereas microorganisms without such plasmids do not grow.
本発明者は、シヨ糖醗酵能を細胞に授与するDNA断片を
組入れるプラスミド・ベクターを形質転換によつて大腸
菌K12菌株中に導入するエシエリチア属の微生物を遺伝
学的に構成するのに成功した。この新しく構成された微
生物は、唯一の炭素源としてシヨ糖を有する培地中生育
することができる。このプラスミドが細胞から除かれた
場合には、微生物はシヨ糖を用いることができず、この
ような培地中生育しない。従つて、このプラスミド・ベ
クターを持つ大腸菌K12菌株は、シヨ糖を主炭素源とし
て含有する糖蜜のような原料中効率よく生育することが
できる。The present inventors have succeeded in genetically constructing a microorganism of the genus Escherichia in which a plasmid vector incorporating a DNA fragment that confers sucrose fermentation ability into cells is introduced into Escherichia coli K12 strain by transformation. This newly constructed microorganism is able to grow in medium with sucrose as the sole carbon source. If this plasmid is removed from the cells, the microorganism cannot use sucrose and will not grow in such a medium. Therefore, the Escherichia coli K12 strain having this plasmid vector can grow efficiently in a raw material such as molasses containing sucrose as a main carbon source.
この新しいプラスミド・ベクターは、工業的に興味のあ
る他の遺伝子を組入れるのに用いることができる。この
場合、このプラスミド・ベクターによつて授与されたシ
ヨ糖醗酵能は、シヨ糖含有培地中微生物の生育を可能に
するのみではなく、培養物に抗生物質が添加されなくて
もこれらの培地中で醗酵が行なわれる時プラスミドの安
定性を増大させるのに有用であることができる。その
上、他の微生物の存在を抑えるべき場合には、プラスミ
ド・ベクターが抵抗性を授与する抗生物質を培地に添加
し、この別法によつてプラスミドの安定性を増大させる
ことが可能である。その結果、この微生物及びこの形質
転換細菌が得られる方法は、商業的醗酵法において大き
な用途を有する。This new plasmid vector can be used to incorporate other genes of industrial interest. In this case, the sucrose fermentation ability conferred by this plasmid vector not only enables the growth of microorganisms in the sucrose-containing medium, but also in these medium even if no antibiotics are added to the culture. It can be useful to increase the stability of plasmids when fermentation is carried out in. Moreover, if the presence of other microorganisms should be suppressed, it is possible to increase the stability of the plasmid by adding an antibiotic to the medium, which plasmid confers resistance. . As a result, the method by which this microorganism and this transformed bacterium are obtained has great application in commercial fermentation processes.
望ましい具体例の説明 本発明中使用される微生物は、良好な形質転換性の故に
クローニング実験を実施するのに好適な大腸菌K12菌株
の一つである、（molecular cloning、コールド・スプ
リング・ハーバー（1982））に記載されている大腸菌K1
2 DH1の周知の菌株である。しかし、他の大腸菌菌株を
使用してよい結果を得ることもできる。Description of the preferred embodiments The microorganism used in the present invention is one of the E. coli K12 strains suitable for carrying out cloning experiments due to its good transformability, (molecular cloning, Cold Spring Harbor (1982 )) E. coli K1
2 A well-known strain of DH1. However, other E. coli strains may be used with good results.
シヨ糖醗酵遺伝子を得るため、大腸菌AB1281株のDNA（s
cr53）を使用した。この菌株は、W.A.ウオールヒーテル
博士の好意で提供され、臨床的に分離されたサルモネラ
菌株に通常のシヨ糖醗酵性を授与することが見出された
接合プラスミドscr53（53Mdal）を持つ（I.Bacteriol12
2、401（1975））。シヨ糖オペロンを有するscr53プラ
スミドは、接合又は形質導入によつてシヨ糖醗酵能を他
のサルモネラ又は大腸菌菌株に移すのに使用することが
できる（J.Bacteriol.122、401（1975））が、遺伝学実
験のためにクローニングプラスミドベクターとして利用
することはできない。かくして、scr53プラスミド中に
含まれるシヨ糖オペロンを適当なプラスミドベクター中
サブクローン化し、このオペロンの新しい遺伝学操作を
可能にした。To obtain the saccharose fermentation gene, DNA (s) of E. coli AB1281 strain
cr53) was used. This strain was kindly provided by Dr. WA Wallheater and carries the mating plasmid scr53 (53Mdal) which was found to confer normal saccharose fermentability to clinically isolated Salmonella strains (I. Bacteriol12
2, 401 (1975)). The scr53 plasmid having the sucrose operon can be used to transfer the sucrose fermentation ability to other Salmonella or Escherichia coli strains by conjugation or transduction (J. Bacteriol. 122, 401 (1975)), It cannot be used as a cloning plasmid vector for genetic experiments. Thus, the sucrose operon contained in the scr53 plasmid was subcloned into an appropriate plasmid vector, allowing new genetic engineering of this operon.
常法によつてscr53プラスミドDNAを抽出して後、このDN
Aを制限エンドヌクレアーゼで処理した。ベクターDNAと
して、エシエリチアの微生物細胞中増殖することができ
るプラスミド又はフアージはいずれも用いることができ
る。ベクターDNAを制限エンドヌクレアーゼで消化して
後、scr53断片DNAをベクター中に挿入するため特殊な方
法を必要としない。組換えDNAをつくるのに使用される
常用の技術のいずれを利用してもよい。かくして得られ
た雑種プラスミドは、常用の形質転換技術によつてエシ
エリチア属の微生物中に組入れることができる（これら
の技術の間で効率は異なることがあるが）。After extracting the scr53 plasmid DNA by a conventional method,
A was treated with restriction endonuclease. As vector DNA, any plasmid or phage capable of growing in Escherichia microbial cells can be used. No special method is required for inserting the scr53 fragment DNA into the vector after digesting the vector DNA with restriction endonuclease. Any of the conventional techniques used to make recombinant DNA may be utilized. The hybrid plasmid thus obtained can be incorporated into microorganisms of the genus Escherichia by conventional transformation techniques (although efficiencies may differ between these techniques).
形質転換体は、これらのコロニーが唯一の炭素源として
シヨ糖を有する培地中生育することができ、抗生物質抵
抗性のような使用されるベクター中マーカーを有するの
で容易に選択される。Transformants are easily selected because these colonies can grow in medium with sucrose as the sole carbon source and have markers in the vector used such as antibiotic resistance.
かくして得られた形質転換体中プラスミドが、シヨ糖醗
酵遺伝子と共に醗酵プロセスに有用な遺伝情報を持つ時
には、形質転換体は、糖蜜のようなシヨ糖含有培地中好
適に生育することができ、シヨ糖オペロンがプラスミド
安定性を維持するのに寄与する。When the plasmid in the transformant thus obtained has the genetic information useful for the fermentation process together with the sucrose sugar fermentation gene, the transformant can grow favorably in a medium containing sucrose such as molasses. The sugar operon contributes to maintaining plasmid stability.
かくしてクローン化されたシヨ糖オペロンは、RSF1010
プラスミドのような、広い宿主の範囲の他のプラスミド
ベクター中サブクローン化することができ、形質転換に
より、シヨ糖醗酵能を他のグラム陰性細菌に授与するの
に用いることができる。The cloned sucrose operon is RSF1010.
It can be subcloned into other plasmid vectors with a wide host range, such as plasmids, and used by transformation to confer sucrose fermentation ability to other Gram-negative bacteria.
本発明を一般的に説明したが、いくつかの特定の実施例
を参照することによつて更に完全な理解を得ることがで
きる。実施例は、例示の目的のみで示され、別記しない
限り限定するものではない。Although the invention has been generally described, a more complete understanding can be obtained by reference to some specific embodiments. The examples are given for illustrative purposes only and are not limiting unless otherwise stated.
実施例 A.−シヨ糖醗酵特性に対する遺伝情報を有するscr−53
プラスミドDNAの調製 scr−53接合プラスミドを持つ大腸菌AB1281（国際寄託
番号NCIB11993）、大腸菌菌株AB1281の経接合体（CGSC1
281）は、J.A.ウオールヒーテル博士（J.Bacteriol.12
2、401（1975））の好意により提供された。１％ヘプト
ン、0.5％イーストエキス、0.5％NaCl及び0.1％シヨ糖
を含有するＬ培地（pH7.2に調節）500ml中振とう下この
菌株を37℃において16時間培養した。細菌細胞を集め、
ハンセン及びオルセン（J.Bacteriol.135、227（197
8））に従つてプラスミドDNAを抽出した。臭化エチジウ
ムの存在下CsCl中等密度遠心分離によつてscr53プラス
ミドを更に精製した。精製DNA10μｇが得られた。Example A.-scr-53 carrying genetic information for sucrose fermentation characteristics
Preparation of plasmid DNA Escherichia coli AB1281 carrying scr-53 conjugating plasmid (International Deposit No. NCIB11993), transconjugant of Escherichia coli strain AB1281 (CGSC1
281) Dr. J. Bacteriol.
2, 401 (1975). This strain was cultivated at 37 ° C. for 16 hours under shaking in 500 ml of L medium (adjusted to pH 7.2) containing 1% heptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl and 0.1% sucrose. Collect the bacterial cells,
Hansen and Olsen (J. Bacteriol. 135, 227 (197
The plasmid DNA was extracted according to 8)). The scr53 plasmid was further purified by isopycnic centrifugation in CsCl in the presence of ethidium bromide. 10 μg of purified DNA was obtained.
B.−ベクターDNAの調製 プラスミドpBR325のDNA、マーカーとしアンピシリン、
テトラサイクリン及びクロラムフエニマール抵抗遺伝子
を有するベクター（Gone４、121（1978））を次のとお
り調製した:pBR325プラスミドを有する大腸菌K12DH1細
胞を、アンピシリン100μg/mlを含有するＬブロス（１
％ペプトン、0.5％イーストエキス、0.5％NaCl、pH7.2
に調節）500ml中37℃に温置した。指数期培養物をスペ
クチノマイシン300μg/mlで展開（amplify）させた。16
時間の温置の後、細胞を収集し、ライソザイム及びSDS
で処理することによつて分解（lyse）した（Biochim.Bi
ophys.Acta 229、516（1973））。CsCl−臭化エチジウ
ム平衡密度勾配遠心分離によつて精製して後、プラスミ
ドDNA500μｇが得られた。B.-Preparation of vector DNA DNA of plasmid pBR325, ampicillin as a marker,
A vector carrying the tetracycline and chloramphenimal resistance genes (Gone4 , 121 (1978)) was prepared as follows: E. coli K12DH1 cells carrying the pBR325 plasmid were transformed into L broth containing 100 μg / ml ampicillin (1).
% Peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.2
Incubated at 37 ° C. in 500 ml. Exponential phase cultures were amplified with spectinomycin at 300 μg / ml. 16
After incubation for hours, cells are harvested and lysozyme and SDS
Lyse by treatment with (Biochim.Bi
ophys.Acta 229, 516 (1973)). After purification by CsCl-ethidium bromide equilibrium density gradient centrifugation, 500 μg of plasmid DNA was obtained.
C.−ベクターDNA中へのscr53プラスミドDNA断片の挿入 scr53プラスミドDNA1μｇ及びベクターDNA2μｇを、37
℃において１時間各々制限エンドヌクレアーゼで処理し
てDAN鎖を開裂させ、次に65℃において10分間加熱し
た。C.-Insertion of scr53 plasmid DNA fragment into vector DNA 1 μg of scr53 plasmid DNA and 2 μg of vector DNA, 37
The DAN chains were cleaved by treatment with restriction endonucleases for 1 hour each at ° C and then heated at 65 ° C for 10 minutes.
消化されたscr53プラスミド及びベクターDNA溶液を混合
し、14℃において24時間ATP、MgCl2及びジチオスレイト
ールの存在下にT4フアージDNAリガーゼによつてDAN断片
の連続実験にかけた。エタノール沈殿によつて組換えDN
Aを回収した。The digested scr53 plasmid and vector DNA solutions were mixed and subjected to serial experiments of DAN fragments with T4 pharge DNA ligase in the presence of ATP, MgCl2 and dithiothreitol for 24 hours at 14 ° C. Recombinant DN by ethanol precipitation
A was recovered.
D.−シヨ等醗酵特性に対する遺伝情報を有する雑種プラ
スミドによる遺伝形質転換 大腸菌DH1の受容能力のある細胞を、ハナハンによつて
記載されているRbCl法（J.Mol.Biol.166、557（198
3））によつて調製した。受容能力のある細胞の懸濁液
に雑種プラスミドを有する工程（Ｃ）中得られたDNAを
添加した。この懸濁液を氷中20分間保ち、37℃において
２分間加熱し、再び氷中60秒間放置した。D.-Shiyo genetic transformation with a hybrid plasmid having genetic information for fermentation characteristics Escherichia coli DH1 competent cells were subjected to the RbCl method (J. Mol. Biol. 166, 557 (198) described by Hanahan.
3)). To the suspension of competent cells was added the DNA obtained in step (C) with the hybrid plasmid. The suspension was kept in ice for 20 minutes, heated at 37 ° C. for 2 minutes, and then left in ice for 60 seconds.
このDNAを有する細胞をＬブロスに接種し、培地を37℃
において１時間振とうし、これによつて形質変換反応が
完了した。細胞を集め、食塩液（NaCl8.5g/）で洗浄
し、寒天培地（リツトツ当り9g K2HPO4、4.5g KH2PO4、
2g（NH4）2SO4、0.1g MgSO4−7H2O、0.01gFeSO47H2O、
チアミン−HCl 1mg、5gシヨ糖、15g寒天及びテトラサイ
クリン12.5μg/ml）に平板処理した。この平板を37℃に
温置した。２日温置の後、平板上8,000のコロニーを数
えた。100のコロニーを採り、精製し、単離した。Cells containing this DNA were inoculated into L broth and the medium was incubated at
Shake for 1 h at which the transformation reaction was completed. The cells were collected, washed with a saline solution (NaCl 8.5 g /), and then agar medium (9 g K2 HPO4 , 4.5 g KH2 PO4 ,
2g (NH 4) 2 SO 4 , 0.1g MgSO 4 -7H 2 O, 0.01gFeSO 4 7H 2 O,
Thiamine-HCl 1 mg, 5 g sucrose, 15 g agar and tetracycline 12.5 μg / ml). The plate was incubated at 37 ° C. After incubation for 2 days, 8,000 colonies were counted on the plate. 100 colonies were picked, purified and isolated.
かくして得られた各形質転換体を、リツトル当り10gの
ペプトン、5gのNaCl、10gのシヨ糖、0.02gのブロモクレ
ゾール・パープル、及び15gの寒天を含有する培地を使
用してシヨ糖醗酵能（scr+表現型）をスクリーニングし
た。この培地中シヨ糖醗酵形質転換体は黄色のコロニー
として現われた。形質転換体を、テトラサイクリン及び
クロラムフエニコール感受性についてもスクリーニング
した。Each transformant thus obtained, 10g peptone per liter, 5g NaCl, 10g sucrose, 0.02g bromocresol purple, and 15g agar using a medium containing agar fermentability ( scr+ phenotype) were screened. The sucrose fermentation transformant appeared in this medium as a yellow colony. Transformants were also screened for tetracycline and chloramphenicol susceptibility.
適当な表現型（scr+,CmR,TcR,ApS）を示す細胞のプラス
ミドをミニプレパレーシヨン法（molecular cloning,コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（198
2））によつて分析した。この雑種プラスミドをPst Iに
よつて消化し、4.85KbのPst Iインサートを有するプラ
スミドを持つコロンを選択した。該インサートを有する
pBR325雑種プラスミドをpSP1と命名し、10.8Kbのサイズ
を示した。A plasmid of a cell having an appropriate phenotype (scr+ , CmR , TcR , ApS ) was prepared by the minipreparation method (molecular cloning, cold spring harbor laboratory (198
2)). This hybrid plasmid was digested with Pst I and the colon with the plasmid with the 4.85 Kb Pst I insert was selected. With the insert
The pBR325 hybrid plasmid was named pSP1 and showed a size of 10.8 Kb.
E.−pSP1プラスミドの調製 pSP1プラスミドを持つ大腸菌DH1（pSP1）（AM512）（国
際寄託番号NCIB11940）シヨ糖醗酵細胞を使用し、工程
（Ｂ）中記載したのと同じ操作によつてpSP1プラスミド
DNAを抽出した。E.-Preparation of pSP1 plasmid Using the Escherichia coli DH1 (pSP1) (AM512) (International Deposit No. NCIB11940) sucrose fermentation cells carrying the pSP1 plasmid, the pSP1 plasmid was prepared by the same procedure as described in step (B).
The DNA was extracted.
F.−pSP1プラスミドの種々の制限エンドヌクレアーゼに
対する開裂部位 この工程においては、上に調製したpSP1プラスミドDNA
0.5μｇを、 EcoR I エシエリチア・コーリ Hing III ヘモフイルス・インフルエンゼ Pst I プロビデンシア・スチユアーチ Sal I ストレプトミセス・アルブス BamH I バシルス・アミロリクエフアシエンス Xba I キサントモナス・バドリ Pvu II プロテウス・バルガリス Cla I カリオフアヌム・ラツム Xho I キサントモナス・ホリコラ Hinc I ヘモフイルス・インフルエンゼ Sph I ストレプトミセス・フエクロモゲネス Sma I キサントモナス・アルバセルム Ba III バシルス・グロビギ のような制限エンドヌクレアーゼで消化した。制限エン
ドヌクレアーゼは、ビオラブ・ニユー・イングランド・
インコーポレーテツド及びベーリンガー・マンハイムGm
bHから得られ、各酵素に対して適当な条件下に使用され
た。得られたDNAを断片を水平0.7％アガロースゲル電気
泳動によつて分析した。各断片の分子量を電気泳動易動
度から決定した。分子量は、λ及びφ29フアージDNAのH
ind III消化から導かれた、既知の分子量のDAN断片の電
気泳動易動度に対してプロツトされた標準曲線を基にし
て評価された。F.-pSP1 plasmid cleavage sites for various restriction endonucleases In this step, the pSP1 plasmid DNA prepared above
0.5 μg of EcoR I Esherichia coli Hing III Haemophilus influenzae Pst I Providencia Stiletto Arch Sal I Streptomyces arvus BamH I Bacillus amyloliquefaciens Xba I Xanthomonas budoli Pvu II Proteus vulgaris Cla I Kaliofum I Xanthomonas horicola Hinc I Haemophilus influenzae Sph I Streptomyces fuecromogenes Sma I Xanthomonas albacerum Ba III Bacillus globigii Digested with a restriction endonuclease. Restriction endonucleases include Biolab New England
Incorporated and Boehringer Mannheim Gm
Obtained from bH and used under appropriate conditions for each enzyme. The resulting DNA was analyzed for fragments by horizontal 0.7% agarose gel electrophoresis. The molecular weight of each fragment was determined from its electrophoretic mobility. The molecular weights are λ and φ29
It was evaluated on the basis of a standard curve plotted against the electrophoretic mobility of DAN fragments of known molecular weight derived from the ind III digestion.
結果を表１に例示する。pSP1プラスミドの制限マツプ
は、制限エンドヌクレアーゼでプラスミドを単一及び二
重消化によつて構成し、アガロースゲル電気泳動によつ
てDNA断片を分析した。既知のpBR325プラスミドの制限
エンドヌクレアーゼマツプ（Gene 14、289（1981））も
使用してpSP1制限マツプを決定し、それを第１図に示
す。The results are illustrated in Table 1. Restriction maps of the pSP1 plasmid were constructed by single and double digestion of the plasmid with restriction endonucleases, and DNA fragments were analyzed by agarose gel electrophoresis. The restriction endonuclease map of the known pBR325 plasmid (Gene 14,289 (1981)) was also used to determine the pSP1 restriction map, which is shown in FIG.
G.−シヨ糖開裂酵素の分析 シヨ糖活性を、シヨ糖分裂後還元糖の評価に基ずく方法
によつて次のとおり決定した:pBR325プラスミド又は新
しい雑種ベクタープラスミドpSP1を有する大腸菌DH細胞
を、10mMのシヨ糖を含有するＬブロス中生育させた。細
胞を収集し、200mMのKCl、1mMの２−メルカプトエタノ
ールを含有するpH6.5の50mM燐酸カリウム緩衝液で細胞
ペレツトを洗浄した。洗浄後、細胞を同じ緩衝液に再懸
濁し、音波処理した。音波処理した懸濁液を40,000×ｇ
において20分間４℃において遠心分離した。上清液を抽
出し、更に処理することなしに使用した。酵素標品0.5m
l及び1Mシヨ糖0.5mlの混合物を30分間37℃において温置
した。ジニトロサリチル酸試薬1mlを添加して反応を停
止させた（Methods in Enzymol.1、149（1955））。資
料と沸とう水中に５分間入れ、氷中冷却し、蒸留水20ml
で希釈した。試料の光学密度を540nmにおいて決定し
た。ブドウ糖の標準液をパトロンとして使用した。常法
によつてタン白濃度を決定した。G.-Analysis of saccharose-cleaving enzymes Saccharose activity was determined by a method based on the evaluation of saccharose post-mitotic reducing sugars as follows: E. coli DH cells carrying pBR325 plasmid or a new hybrid vector plasmid pSP1 Grow in L broth containing 10 mM sucrose. The cells were harvested and the cell pellets were washed with 50 mM potassium phosphate buffer, pH 6.5 containing 200 mM KCl, 1 mM 2-mercaptoethanol. After washing, cells were resuspended in the same buffer and sonicated. 40,000 × g of sonicated suspension
For 20 minutes at 4 ° C. The supernatant was extracted and used without further treatment. Enzyme preparation 0.5m
A mixture of 1 and 1 M sucrose 0.5 ml was incubated for 30 minutes at 37 ° C. The reaction was stopped by adding 1 ml of dinitrosalicylic acid reagent (Methods in Enzymol.1, 149 (1955)). Put the material and boiling water for 5 minutes, cool in ice, and 20 ml of distilled water
Diluted with. The optical density of the sample was determined at 540 nm. A glucose standard was used as a patron. The protein density was determined by a conventional method.
表２中示されるとおり、大腸菌DH1 pSP1含有細胞中シヨ
糖活性は構造性であつた。As shown in Table 2, the sucrose activity in E. coli DH1 pSP1-containing cells was structural.
【図面の簡単な説明】 第１図はプラスミドpSP1の制限酵素切断地図を示す。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows a restriction enzyme digestion map of plasmid pSP1.
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59240889AJPH0775544B2 (en) | 1984-11-16 | 1984-11-16 | Escherichia coli hybrid plasmid vector that confers sucrose fermentation ability |
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59240889AJPH0775544B2 (en) | 1984-11-16 | 1984-11-16 | Escherichia coli hybrid plasmid vector that confers sucrose fermentation ability |
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61119185A JPS61119185A (en) | 1986-06-06 |
| JPH0775544B2true JPH0775544B2 (en) | 1995-08-16 |
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59240889AExpired - LifetimeJPH0775544B2 (en) | 1984-11-16 | 1984-11-16 | Escherichia coli hybrid plasmid vector that confers sucrose fermentation ability |
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0775544B2 (en) |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7547516B2 (en) | 2005-03-10 | 2009-06-16 | Gen-Probe Incorporated | Method for reducing the presence of amplification inhibitors in a reaction receptacle |
| Title |
|---|
| ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２２，Ｎｏ．２（１９７５）Ｐ．４０１−４０６ |
| ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３０，Ｎｏ．３（１９７７）Ｐ．１４０２−３ |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7547516B2 (en) | 2005-03-10 | 2009-06-16 | Gen-Probe Incorporated | Method for reducing the presence of amplification inhibitors in a reaction receptacle |
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61119185A (en) | 1986-06-06 |
| Publication | Publication Date | Title |
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