【発明の詳細な説明】核酸の単一工程増幅および配列決定本発明は、核酸、デオキシリホ核酸（ＤＮＡ）およびリホ核酸（ＲＮＡ）の単一工程増幅および配列決定方法に関する。[Detailed description of the invention]Single-step amplification and sequencing of nucleic acidsThe present invention relates to the use of single nucleic acids, deoxyliphonucleic acid (DNA) and liphonucleic acid (RNA).Concerning process amplification and sequencing methods.
背景技術ＤＮＡか、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅できることは知られている。ＰＣＲＯ間に、ゲノムＤＮＡのような二重鎖ＤＮＡは融解して２つの相補性のＤＮＡ鎖に分離し、２つのＤＮＡＨのそれぞれに、２つのプライマー、すなわち既知配列と相補性である方のプライマーか付加される。適当なヌクレオチドの存在下、ポリメラーゼ酵素は、反応条件か変更されるまでプライマーとされた鋳型上に相補性のＤＮＡｊ！を構築することになる。プライマーは、センス鎖へのプライマーアニーリングかアンチセンス鎖車のプライマーの位置に対して３′になるように選択される。このサイクルの反復が元のゲノム鋳型を再び再生させる。さらに、第一のサイクルで形成された相補性績は再生されるが、２つのプライマーに挟まれそれらを含む元のゲノムＤＮＡの領域の範囲までのみである。プライマー間の増幅されたＤＮＡ領域はついで、電気泳動による精製によって回収される。このＰＣＲ反応は、５ａｉｋｉ、 Ｒ，Ｋ、、 Ｇｅ１ｆａｎｄ、 Ｄ、 Ｈ，、５ｔｏｆｆｅ１． Ｓ、。Background technologyIt is known that DNA can be amplified by polymerase chain reaction (PCR).There is. During PCRO, double-stranded DNA, such as genomic DNA, is melted into two complementarySeparate the DNA strands into two DNA strands, and apply two primers to each of the two DNA strands, i.e.That is, only the primer that is complementary to the known sequence is added. appropriate nucleotideIn the presence of the polymerase enzyme, the primer was primed until the reaction conditions were changed.Complementary DNAj on the template! will be constructed. Primer to sense strandPrimer annealing or antisense strand 3′ to the primer position on the wheelselected to be. Repeating this cycle regenerates the original genomic template.Ru. Furthermore, the complementary performance formed in the first cycle is regenerated, but the twoIt extends only to the region of the original genomic DNA that is sandwiched between the imers and includes them. PThe amplified DNA region between the primers is then recovered by electrophoretic purification.be done. This PCR reaction was carried out by 5aiki, R.K., Gelfand, D., H,, 5toffe1. S.
５ｃｈａｒｆｔ、 Ｓ、 Ｊ、、 Ｈｉｇｕｃｈｉ、 Ｒ，、１（ｏｒｎ、 Ｇ、 Ｔ、、 Ｍｕｌｌｉｓ、 Ｋ、 Ｂ、 ＆ Ｅｒ１ｉｃ■A Ｈ，Ａ。5charft, S, J,, Higuchi, R,, 1(orn, G, T, , Mullis, K, B, & Erlic■A H,A.
（＋９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，４８７−４９１にさらに詳細に記載されている。(+988) Science 239, 487-491.ing.
単一の標識プライマーか適当に融解したＤＮＡにアニーリングされる方法を用いるＤＮＡの配列決定方法も知られている。この反応は、各反応容器に通常のヌクレオチドの一つのジデオキシヌクレオチド類縁体を含有させた４つの別個の反応混合物中で行われる。適当な濃度でのジデオキシ類縁体の存在は、各相補性ヌクレオチドが鋳型中に３００ないし４００回生じる毎に１回、連鎖反応を停止させる。４つの反応それぞれからの延長されたＤＮＡ生成物を、平行して適当な電気泳動ゲルにかけ、可視化する。ゲル上のバンドの相対位置から、新たに合成された鋳型ＤＮＡの配列を帰納することか可能になる。このジデオキシ核酸配列決定反応はＳａｎｇｅｒ、 Ｆ、、 Ｎ１ｃｋｌｉｎ、 Ｓ、 ＆ Ｃｏｕｌｓｅｎ、 Ａ、 Ｒ，（１９７７） Ｐｒｏｃ。using a method in which a single labeled primer is annealed to appropriately molten DNA.Methods for sequencing DNA are also known. This reaction is carried out using a standard vacuum tube in each reaction vessel.Four separate reactions containing one dideoxynucleotide analog of leotideIt is done in a mixture. The presence of dideoxy analogs at appropriate concentrationsThe chain reaction is stopped once every 300 to 400 times that leotide occurs in the template.Ru. The extended DNA products from each of the four reactions are subjected to appropriate electrical stimulation in parallel.Run on a running gel and visualize. The newly synthesizedIt becomes possible to infer the sequence of the template DNA. This dideoxy nucleic acid sequencingThe reaction is based on Sanger, F., N1cklin, S., & Coulsen., A., R. (1977) Proc.
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、７４．５４８３−５４８７に、より詳細に記載されている。Natl, Acad, Sci, U, S, A, 74.5483-5487, described in more detail.
配列決定反応の感度を、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによる熱サイクルで改良することも知られている（Ｌｅｅ、 Ｊ、 Ｓ、 （１９９１） ＤＮＡ＆Ｃｅ１１ Ｂｉｏｌ、１０．８７−７３参照〕。ＤＮＡのポリメラーゼ増幅を用いて配列決定←緒に行う現時点ての提案では、鋳型ＤＮＡの増幅、生成物の精製および配列決定に全く別個の工程か行われている。本発明は、核酸の増幅および配列決定の既知方法の別法を提供するものである。Improving the sensitivity of sequencing reactions by thermal cycling with thermostable DNA polymerasesIt is also known that (Lee, J, S, (1991) DNA & Ce11 Biol, 10.87-73]. alignment using polymerase amplification of DNA.The current proposal involves amplification of the template DNA, purification of the product, andA completely separate step is performed for sequencing. The present invention relates to the amplification and sequencing of nucleic acids.provides an alternative to certain known methods.
発明の開示本発明は、核酸の増幅および配列決定方法において、１）二重鎖核酸を融解して１対の核酸の相補性績を生成させ、ｌｌ）核酸のそれぞれの鎖に、センス鎖へのブライマーアニーリングがアンチセンス鎖車のプライマーの位置に対し３′になるように選択され、一方のプライマーは他のプライマーとは無関係に可視化が可能なように標識されたプライマーをハイブリダイズし、１ｉｉ）核酸中に通常存在するヌクレオチドの一つのジデオキシヌクレオチド類縁体の存在下、ポリメラーゼ酵素によって核酸を増幅させ、この場合、ジデオキシヌクレオチド類縁体は、新たに合成された核酸鎖の大部分が、第二のプライマーを用いる対抗鎖の合成のための鋳型として作用するのに十分なまで延長することなくジブオキソヌクレオチドの取り込みによって終結するような濃度で存在させ、ｉｖ）工程ｉ）〜１ｉｉ）を順次何回も反復し、■）工程ｉ）〜ｉｖ）を、核酸中に存在する他のヌクレオチドの一つを除く少なくともすべてのジデオキシヌクレオチド類縁体を用いて反復し、ついてｖｉ）工程ｉ）〜ｉいのそれぞれの反復の反応生成物を分離し、標識績を可視化して、２つのプライマーの結合部位の間に標識プライマーがアニーリングした核酸鎖の少なくとも一部の配列の決定を可能にする、各工程からなる方法である。Disclosure of inventionThe present invention provides a nucleic acid amplification and sequencing method that includes: 1) melting a double-stranded nucleic acid;1) generating a complementary sequence of a pair of nucleic acids; ll) each strand of the nucleic acid isBrimer annealing occurs 3′ to the primer position on the antisense chain wheel.one primer can be visualized independently of the other.hybridize the primers labeled as1ii) Dideoxynucleotides, one of the nucleotides normally present in nucleic acidsThe nucleic acid is amplified by a polymerase enzyme in the presence of acynucleotide analogs, the majority of the newly synthesized nucleic acid strand is derived from the second primer.strands can be extended long enough to act as a template for the synthesis of the opposite strand usingpresent at such a concentration that it is terminated by the incorporation of dibuoxonucleotides.iv) Repeat steps i) to 1ii) many times in sequence, ■) Steps i) to iv),at least all dideoxys except one of the other nucleotides present in the nucleic acidvi) each of steps i) to i).Separate the repeat reaction products, visualize the labeling results, and identify the binding sites of the two primers.Determination of the sequence of at least a portion of the nucleic acid strand to which the labeled primer has been annealed duringIt is a method consisting of each step that makes it possible.
本発明の方法は、ＲＮＡに対しても実施できるか、そのＲＮＡの二重ｇＤＮＡ類縁体庖形成し、それを配列決定することか好ましい。本発明の方法はとくに、原核生物ＤＮＡについての使用に適してはいるが、真核生物のＤＮＡの配列決定にも使用できる。The method of the invention can also be carried out on RNA or double gDNA derivatives of that RNA.It is preferable to form a margin and sequence it. In particular, the method of the present inventionAlthough suitable for use with karyotic DNA, it is not suitable for sequencing eukaryotic DNA.can also be used.
好ましくは、工程（ｉ）から（ｉｖ）までの様々な繰返しの反応生成物は適切なゲルで電気泳動により分離する。これにより様々な反応生成物を、ゲルから核酸配列を直接読み取ることができるよう並んで走らせることかできる。様々な繰返しをユニークに標識したプライマーを用いて、例えば各繰返しにつき１つの異なる蛍光標識を用いることにより行えば、単一のゲルトラックで走らせ、オートシーケンサ−を用いてゲルから核酸配列を自動的に読み取ることか可能となるだろう。Preferably, the reaction products of the various iterations of steps (i) to (iv) areSeparate by electrophoresis in a gel. This allows various reaction products to be removed from the gel.They can be run side by side to read arrays directly. various repetitionsUsing uniquely labeled primers, e.g. one different primer for each repeat.This can be done by using a fluorescent label that can be run in a single gel track andIt will be possible to automatically read nucleic acid sequences from gels using a sequencer.cormorant.
標識されたプライマーは当該技術で公知のいかなる適当な方法でも標識することかできる。１つの適当な方法はプライマー中の元素の放射活性同位元素の取り込みによる。他の適当な手段はビオチンのような結合リガンドでプライマーを標識するか、又は蛍光マーカーでプライマーを標識することを包含する。Labeled primers may be labeled by any suitable method known in the art.I can do it. One suitable method is the incorporation of radioactive isotopes of the elements in the primer.It depends. Another suitable means is to label the primer with a binding ligand such as biotin.or labeling the primer with a fluorescent marker.
鋳型上のプライマー間の距離を変えて感度を変えることかできる。増幅の効率は第２のプライマーを用いる相補鎖の合成のための鋳型として作用するのに十分長く伸びている新しいＤＮＡＨの割合に依存する。約２５０の塩基対のプライマー分離は真核細胞ＤＮＡについて合理的な水準の増幅をもたらし、信頼できる配列データの取得を可能にする。原核細胞ＤＮＡの場合には６００塩基対のプライマー分離か十分可能である。本発明による方法はナノグラム量のＤＮＡを用いて行うことかできるか、より多くの量かより良いプライマー分離をもたらす上で望ましい。Sensitivity can be changed by changing the distance between the primers on the template. The efficiency of amplification islong enough to act as a template for synthesis of a complementary strand using a second primerdepends on the proportion of new DNAH that is being extended. Primer of approximately 250 base pairsSeparation provides a reasonable level of amplification for eukaryotic DNA, resulting in reliable sequences.Enable data retrieval. 600 base pair primers for prokaryotic DNA- Separation is possible. The method according to the invention is carried out using nanogram quantities of DNA.It is possible to increase the amount of primer that is desired in yielding better primer separation.Yes.
交差バント（ｃｒｏｓｓ ｂａｎｄｉｎｇ）になる場合には、得られる結果は時として、オリノナルプライマーに隣接して混乱することがある。他のプライマーに密接に隣接して、阻害（ｂｌｏｃｋａｇｅ）のような異常か見出されることもある。最良の結果は、２つのプライマーの間の中間ＤＮＡから得られる。In case of cross banding, the result obtained isAs such, it may be confused adjacent to the original primer. other primersAbnormalities such as blockage may also be found in close proximity tobe. Best results are obtained with intermediate DNA between the two primers.
研究対象となるいかなる核酸も４つのヌクレオチドを含むのが通常である。したかって、核酸中のそれぞれのヌクレオチドについてのジデオキシヌクレオチドアナログに関して、工程（ｉ）から（ｉｖ）を４回実施するのか通常である。分離におけるギャップによって示唆される４つのヌクレオチドの存在に関しては、３つのヌクレオチドのみについて該工程を実施することは明らかであろう。この技法は好ましくないかもしれないか、本発明の範囲内のものと考えられる。Any nucleic acid under study typically contains four nucleotides. didOnce upon a time, the dideoxynucleotide atom for each nucleotide in a nucleic acid wasFor analogues, it is usual to carry out steps (i) to (iv) four times. separationRegarding the presence of four nucleotides suggested by the gap in 3It will be obvious to carry out the step for only one nucleotide. This techniquemethods may not be preferred or are considered within the scope of this invention.
図面の簡単な説明図１は、本発明による工程の概略図を示したものである。Brief description of the drawingFIG. 1 shows a schematic diagram of the process according to the invention.
図２は、４つの相違するジデオキシヌクレオチドアナログに関する４つの二重反応についてのＤＮＡＩの分離、並びに調へたＤＮＡの一部の推定ヌクレオチド配列を示す電気泳動ゲルである。Figure 2 shows four duplicates for four different dideoxynucleotide analogs.Isolation of DNAI for the reaction and deduced nucleotide sequence of a part of the isolated DNA.Electrophoresis gel showing columns.
図１の概略図は、本発明の工程を示している。センスストランド１１及びアンチセンスストランド１２を含む二重鎖ＤＮＡ１０を加熱し、プライマー１３及び１４の存在下にアニール化した。プライマー１３はセンスストランドＩＩに結合−し、その３′位のプライマー１４はアンチセンスストランド１２に結合している。The schematic diagram of FIG. 1 shows the process of the invention. sense strand 11 and antiDouble-stranded DNA 10 containing sense strand 12 was heated and primers 13 and 1Annealed in the presence of 4. Primer 13 binds to sense strand II-Primer 14 at the 3' position binds to antisense strand 12..
このことは、２つのストランドにおける合成は、一点に集まる方向であることを意味している。プライマー１４は、放射活性リン化合物などによってラベル化されている。このことによって、センスストランドから誘導されたＤＮＡ鎖とは独立して、アンチセンスストランドから誘導されたＤＮＡＭか工程の最後において視覚化されることか可能となる。プライマー１３と１４かアニール化されたＤＮＡｆｔ１１１及び１２は、４つのアリコート＋５．１６．１７及び１９に分割される。This means that the synthesis of two strands is in the direction of convergence at one point.It means. Primer 14 is labeled with a radioactive phosphorus compound or the like.It is. This ensures that the DNA strand derived from the sense strand is unique.At the end of the process, the DNA derived from the antisense strandIt becomes possible to be visualized. Primer 13 and 14 or annealed DNAft111 and 12 were divided into 4 aliquots + 5.16.17 and 19.It will be done.
アリコート１５，１６．１７及び１８のそれぞれは、ポリメラーゼ酵素を用いて増幅される。ＤＮＡにおけるヌクレオチドの一つのジデオキシヌクレオチドアナログが、それぞれのアリコートに加えられる。かくして、ジデオキシシトシントリホスフェートかアリコート１５に加えられ、そしてチミジン、アデニン及びグアニンに基づく対応するジデオキシヌクレオチドが、それぞれアリコート１６゜１７及び■８に加えられる。それぞれのアリコートを加熱しアニール化する工程を繰り返すことによって、長さか相違する非常に多数のＤＮＡ鎖かそれぞれのアリコートにおいて構成される。それぞれのケースにおいて、ＤＮＡのストランド１１及び１２のそれぞれは、それぞれのアリコーＨ５，１６，１７及び１８におけるコピーである。それぞれのケースにおけるコピー化は、対応するデオキシヌクレオチドに代えて、得られたストランドのコピーにジデオキシヌクレオチドアナログを挿入した時（こ、停止する。それぞれのアリコートにおいて、ジデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチドの比を調整することにより、反対側のプライマーかコピー鎖にアニール化する地点に到達するのか短くなるのを止められたＤＮＡコピー鎖の大部分を調製することか可能となる。アリコート１５における１つの例として、ストランド１９．２１及び２２によって、プライマー１３の結合か可能となるに十分な長さとなることか達成される。かくして、これらのストランドは、それに続く更なる加熱及びアニール化サイクルにおいては再生産されない。これに対して、ストランド２３は、プライマー１３かアニール化する地点まで延長され、ＤＮＡのリバースストランドの調製のためのテンプレートとして供される。Aliquots 15, 16, 17 and 18 were each treated with polymerase enzyme.amplified. dideoxynucleotide analog of one of the nucleotides in DNAA log is added to each aliquot. Thus, dideoxycytosinteRephosphate was added to aliquot 15 and thymidine, adenine andThe corresponding anine-based dideoxynucleotides were each aliquoted at 16°17 and ■8. Heating and annealing each aliquotBy repeating this, we can create a large number of DNA strands of different lengths orConstructed in recoat. In each case, a strand of DNA11 and 12 respectively to Aliko H5, 16, 17 and 18.This is a copy that can be used. Copying in each case involves the corresponding deoxynucleaseInstead of nucleotides, dideoxynucleotide nucleotides are added to the resulting copy of the strand.When the analog is inserted (this stops), in each aliquot, the dideoxyBy adjusting the ratio of nucleotides to deoxynucleotides,When the primer or copy strand reaches the point where it anneals, it stops shortening.It becomes possible to prepare most of the DNA copy strands. In aliquot 15As an example, by strands 19, 21 and 22, primer 13 isA sufficient length is achieved to allow for bonding. Thus, theseThe trand is not regenerated in subsequent further heating and annealing cycles.Not possible. On the other hand, the strand 23 is either the primer 13 or the annealing base.point and serve as a template for the preparation of the reverse strand of DNA.Served.
このようにして、各種の長さのストランドの４つの集団を構築することかできる。このような集団は、電気泳動ゲル２４上において分離され、適当なフィルム上で視覚化される。このフィルムは、ラベル化されたプライマーを取込んだストランドの存在のみを記録する。４つのアリコート＋５．１６．１７及び１８はゲル２４上て展開され、より短いストランドは、ゲル２４に沿ってさらに実施される。矢印の方向にゲル２４を読むことによって、配列決定されたストランドかＣＣＴＡＧＧＧＡＴＣＴＡと読むことかできる。In this way, four populations of strands of various lengths can be constructed.. Such populations are separated on an electrophoretic gel 24 and transferred onto a suitable film.visualized in This film consists of a stratum that incorporates a labeled primer.records only the existence of the command. 4 aliquots + 5.16.17 and 18 gel24 and the shorter strands are carried further along the gel 24. By reading the gel 24 in the direction of the arrow, the sequenced strand or CCIt can be read as TAGGGATCTA.
のである。ゲルを矢印の方向に読み、同定された断片が５′から３′側に向ってＧＧＣＴＴＴＴＡＣＡＧＴＴと読まれた。It is. Read the gel in the direction of the arrow and the identified fragments will appear from the 5' to the 3' side.It was read as GGCTTTTACAGTT.
発明を実施するための最良の形感本発明の本質かより明確に理解されるように、本発明の好ましい態様を、以下の例を参照しながら記述する。The best form for carrying out inventionsIn order that the essence of the invention may be more clearly understood, preferred embodiments of the invention are described below.Describe with reference to examples.
ＤＮＡ調製及び配列決定プロトコール増幅配列決定のためのゲノムＤＮＡはバクテリアの試料から標準的方法のいずれによっても調製することができる（Ｎａｎｉａｔｉｓ、 Ｔ、、 Ｆｒ１ｔｓｏｈ、 Ｅ、 Ｆ、及びＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、（１９８２） Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。使用できる迅早かつ便宜な方法は以下の通りである。DNA preparation and sequencing protocolsGenomic DNA for amplification and sequencing can be obtained from bacterial samples using any standard method.It can also be prepared by Naniatis, T., Fr1tsoh, E., F., and Sambrook, J. (1982) Molecula.r Cloning: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory). Quick and convenient to useA suitable method is as follows.
１、５ｍｌのバクテリア懸濁液を２０００ｇで５分間遠心分離し、０．５ｍｌのＴＥバッファー中で再懸濁させ（トリスＨＣ１，ｐＨ８，帆 １０−；エチレンジアミン四酢酸、ＥＤＴＡ、ｌｒｒＭ）、２０００ｇで再度遠心分離にかけた。1. Centrifuge 5ml of bacterial suspension at 2000g for 5 minutes,Resuspend in TE buffer (Tris HC1, pH 8, 10-; ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA, lrrM) and centrifuged again at 2000 g.
バクテリアのベレットを４■／ｍｌのリゾチームを含む０．４ｍｌのＴＥバッファーに懸濁させ、３７℃で２０分間インキュベートした。ｌＯμｌの１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を試料と混合し、次いてｌＯμｌのりボヌクレアーゼ溶液（１０ｍｇ／ｍ ｌ ）と混合して、３７℃で２０分間インキュベートした。１０μｌのプライマー間Ｋ（１０■／ｍｌ）を添加し、試料を５５°Ｃで３０分間、または清澄になるまでインキュベートした。清澄溶液を、等容量のフェノール／クロロホルム（ｌ：ｌ）で１回、０．４ｍｌのクロロホルムで２回抽出し、水相を１ｍｌのエタノールと室温で４〜５分間混合し、１２０００ｇで５分間遠心分離にかけることによりＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを０．２〜０．４１１１１の蒸留水中に再溶解させ、純度と濃度をｌ：５０稀釈のＵＶスペクトルで評価した。Bacterial pellets were added to 0.4ml TE buffer containing 4μ/ml lysozyme.The suspension was suspended in an air filter and incubated at 37°C for 20 minutes. lOμl of 10% dodeMix sodium silsulfate (SDS) with the sample, then add lOμl glue bonucleaMix with the enzyme solution (10 mg/ml) and incubate at 37°C for 20 minutes.did. Add 10 μl of interprimer K (10 μl/ml) and incubate the sample at 55°C.Incubate for 30 minutes or until clear. Transfer the clarified solution to an equal volume ofExtract once with phenol/chloroform (l:l) and twice with 0.4 ml chloroform.The aqueous phase was mixed with 1 ml of ethanol at room temperature for 4-5 minutes, and 12,000 gDNA was precipitated by centrifugation for a minute. 0.2-0.4 DNAUV spectra of 1111 redissolved in distilled water and diluted l:50 to determine purity and concentration.It was evaluated by
４つの配列決定反応のために、合計で約５〜１０９ｇのプラスミド又は５〜１０ｎＨの純粋なバクテリアのゲノムＤＮＡを鋳型として用いたが、この量は有害な効果を起こすことなく増加することができた。バクテリアＤＮＡの混合物を、反応液中少なくとも５ｎｇの標的ＤＮＡを得るに十分な量で使用した。For four sequencing reactions, approximately 5-10 g plasmid or 5-10nH pure bacterial genomic DNA was used as a template, but this amount was not harmful.could be increased without causing any effects. A mixture of bacterial DNA isA sufficient amount was used to obtain at least 5 ng of target DNA in the reaction solution.
４つの配列決定反応を、タックトラック（ＴａｑＴｒａｃｋ）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いた従来のＤＮＡ配列決定に関して調製した。鋳型ＤＮＡの単一のアリコツトを各２０ｎｇの２つのＰＣＲプライマと混合した。プライマーの１つは２２Ｐて標識しておいた。標識はγ−”Ｐ−ＡＴＰでポリヌクレオチドキナーゼ反応（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により行い、３７°Ｃで８０〜９０分間という製造者推奨の条件を用いた。Four sequencing reactions were performed using the TaqTrack kit (Promega) for conventional DNA sequencing. Single template DNAaliquots were mixed with two PCR primers, 20 ng each. Primer 1One was labeled as 22P. Labeling is γ-”P-ATP for polynucleotide kinaThe reaction time was 80-90 minutes at 37°C.The conditions recommended by the manufacturer were used.
ＰＣＲ反応バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を、通常のＤＮＡ配列決定キットバッファーの代わりに用い、鋳型とプライマーと混合し、溶液を最終的に２２μｌの体積になるよう蒸留水で調整した。混合物を、４本のチューブの各々に５μβずつ分け、それぞれに２μｌの特異的ＴａｑＴｒａｃｋ ｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ混合物を含ませた。PCR reaction buffer (Promega) was added to a standard DNA sequencing kit bag.Use in place of the buffer, mix with template and primer, and make a final volume of 22 μl of the solution.The volume was adjusted with distilled water. Add 5 μβ of the mixture to each of 4 tubes.Divide into 2 μl of specific TaqTrack dNTP/ddNTP for each.containing the mixture.
反応混合物の上層に４０μｌの鉱油をかぶせて蒸発を防ぎ、プログラム可能なインキュベータ中で２５〜３０サイクルインキユベートを行った。配列決定反応に先立つ、二重鎖鋳型の変性、及びブライマーアニーリングの工程は不要だった。Cover the top layer of the reaction mixture with 40 μl of mineral oil to prevent evaporation andIncubation was performed in an incubator for 25-30 cycles. for sequencing reactionsPrior steps of duplex template denaturation and brimer annealing were not required.
インキュベーション条件は以下の通りである。変性９２°Ｃ１９０秒ニアニーリング５５°Ｃ１８０秒：重合７２°Ｃ１８０秒。反応サイクルの完了後、５μｌのホルムアミド停止溶液を添加し、チューブを遠心分離にかけてそれを油層を通過するようにした（２０００ｇ、３０秒）。反応生成物を９５°Ｃで３分間加熱した。Incubation conditions are as follows. Denatured at 92°C for 190 secondsPolymerization at 72°C for 180 seconds. After completion of the reaction cycle, 5 μlof formamide stop solution and centrifuge the tube to force it through the oil layer.(2000 g, 30 seconds). Heat the reaction product at 95°C for 3 minutesdid.
試料をガラスキャピラリーチューブで油層の下から引き抜くか、または油層をエールで軽く２回洗浄することにより除去することができた。Pull the sample out from under the oil layer with a glass capillary tube, or evacuate the oil layer.It could be removed by gently washing it twice with a towel.
生成物を、２μｌの各反応混合物を、トリス−ホウ酸塩（Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ） Ｅ Ｄ ＴＡバッファー中に８Ｍの尿素を含む標準６％（Ｗ／Ｖ）変性ポリアクリルアミドゲル上に載せることにより分離した（Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｔ、、 Ｆｒ１ｔｓｃｈ、 Ｅ、 Ｆ、及びＳａｍｂｒｏｏｋ、 Ｊ、 （１９８２） Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、 Ｃ盾撃■Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） ｏ電気泳動後、ゲルを１２％（ｖ／い酢酸で１０分間固定し、１リツトルの２０％（Ｖ／Ｖ）エタノールで洗浄し、９５℃で乾燥した後に、Ｆｕｊｉ Ｘ線フィルムで一晩オートラジオグラフにかけた。The product, 2 μl of each reaction mixture, was added to Tris-borate (Tris-borate).e) E D Standard 6% (W/V) denatured pot containing 8M urea in TA buffer.Separated by loading on a lyacrylamide gel (Maniatis, T., Frltsch, E., F., and Sambrook, J. (1982) Mo1ecular Cloning: A LaboratoryManual, C shield attack■Spring Harbor Laboratory) After electrophoresis, remove the gel.Fix with 12% (v/v) acetic acid for 10 min and 1 liter of 20% (v/v) ethanol.After washing at 95℃ and drying at 95℃, autoradiate with Fuji X-ray film overnight.I put it on Ograph.
このプロセスの間、ジデオキシヌクレオチドを取り込ませることにより、高い割合の初期ＤＮＡ鎖を停止した。しかし、各サイクルにおいて、ある割合は反対側のプライマーのアニーニングが可能となるに十分な、それ放反対側の鎖の合成のために鋳型として作用するに十分な長さに伸長させた。その結果、両鎖の増幅は通常のＰＣＲ効率以下てあった。同時に、使用可能な鋳型を、各サイクルで配列決定反応のために再利用した。During this process, a high percentage ofThe initial DNA strand was terminated. But in each cycle, a certain percentage is on the other sideIt releases enough of the opposite strand to allow annealing of the primer.It was then extended to a length long enough to act as a template. As a result, the amplification of both strands isThe efficiency was below normal PCR efficiency. At the same time, available templates are arrayed in each cycle.Reused for decision reaction.
染色体ＤＮＡの試料から配列を得るのに要した時間は、従来のＰＣＲ／配列決定に要する時間の半分以下に減少する。さらにこの方法における増幅ファクターは、鋳型ＤＮＡを製造するのに通常用いるものよりもかなり減少する。これは増幅中にひき起こされるエラー数を減少すべく期待されるであろう。反応の同時に起こる二重性は迅速な配列決定を与える。The time required to obtain sequences from a sample of chromosomal DNA is much faster than traditional PCR/sequencing.This will reduce the time required to more than half. Furthermore, the amplification factor in this method is, significantly reduced from that normally used to produce template DNA. this is amplificationwould be expected to reduce the number of errors introduced during the process. reactions occur simultaneouslyThis duality provides rapid sequencing.
この技術は、莫大な数のＤＮＡ試料の詳細な遺伝的スクリーニングを要求するプロセス、たとえば点突然変異に特異的な遺伝子の検査において、あるいは特異的な株の同定により利益を受けるであろう分析において、明らかに有利となるであろう。宵機体の様々な株か様々なりＮＡ配列を有する遺伝子は、比較的純度の低いＤＮＡの少量を用いて、急速に分析することかできる。プライマーによって支配された領域内のどこにせよ、一つの塩基の変化の差異はこの方法によって検出することかできる。さらに本技術をＲＮＡ鋳型に応用することにより、例えば細菌分類学のための１６３リポソームＲＮＡの迅速な分析、又はレトロウィルス株の検出と詳細な同定を可能にするはずである。This technique is useful for protocols that require detailed genetic screening of vast numbers of DNA samples.process, e.g. in testing for point mutation-specific genes orThis would be a clear advantage in analyzes that would benefit from the identification of stocks thatDew. Genes with various NA sequences from various strains of Yoikitai have relatively low purity.Small amounts of DNA can be rapidly analyzed. Supported by primerDifferences in single base changes anywhere within the mapped region can be detected using this method.I can do something. Furthermore, by applying this technology to RNA templates, it is possible toRapid analysis of 163 liposomal RNA for fungal taxonomy or retrovirus strainsThis should enable the detection and detailed identification of
・ ＤＮＡ配列決定反応のための熱サイクルについての先の報告は、単一の未標識のプライマーと、配列決定生成物を標識すへく、反応の間ラジオアイソトープの取り込みを用いたものである化ｅｅ、 Ｊ−Ｓ、（１９９１）ＤＮＡａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌ、１０゜８７−７３）。しかし、そのようなアプローチは、非標的ＤＮＡへのラジオアイソトープの結合による問題、完全には純粋でない試料といった結果を招きやすい。・Previous reports on thermal cycling for DNA sequencing reactionsThe sequencing product is labeled with a radioisotope during the reaction.(1991) DNA and CellBiol, 10°87-73). However, such an approachProblems due to radioisotope binding to target DNA, samples that are not completely pureThis is likely to lead to similar results.
プライマーをあらかじめ標識しておくことは、適度な感度をもたらし、ＤＮＡの混合中に起こるかもしれない複雑さを回避する。Pre-labeling the primers provides reasonable sensitivity andAvoiding complications that may arise during mixing.
具体的な例に示されたような発明に対し、広く記載された発明の精神又は範囲から離れることなく、多くの変更及び／又は修飾をなすことができることは、当業者により理解されるであろう。本実施例は、それ故、あらゆる点において限定的なものとしてではなく、説明的なものとしてみなされるべきである。Is the spirit or scope of the invention broadly described as opposed to the invention shown in the specific example?It will be appreciated by those skilled in the art that many changes and/or modifications can be made without departing from theIt will be understood by the person. This example is therefore limited in all respects.It should be seen as descriptive rather than as descriptive.
手続補正書（自発）平成６年３月２日 」特許片長宮殿１、事件の表示２、発閑の名称核酸謬ヒエ程増幅及び配列決定３６補正をする者事件との関係 特許８１人氏名（名称） ユニパーシティ パートナーシップス プロブライエタリー リミテッド６、補正により増加する請求項の数７、補正の対象明細書、請求のｌｌｉ囲及び要約書簡訳文明細書、請求の範囲及び要約書間訳文の浄書（内容に変更なし）国際調査報告 １ｎｌｅＮｖ１嘗ａｐｐｌｉｃａｌｉｅｅＮ。Procedural amendment (voluntary)March 2, 1994Patent Katanaga Palace1.Display of the incident2. Name of HakkanNucleic acid amplification and sequencing36 person who makes correctionRelationship to the incident: 81 patentsName (Name) Uniper City Partnerships ProfessionallyMited 6, number of claims increased by amendment7. Subject of correctionTranslation of the specification, claims, and abstractEngraving (no changes in content) International search report 1nleNv1 applicarieeN.
■ゴＩＡＩ勇シ閃３７２ＦｏｒｍＰＣＴｎｓｋｎ１０ｆｃｏｍ＋＋＋ａ−ｏｒＩｉ＋ｍｔｈｅｍ＋２１１ｆｌｕｌｙ１９９２１ａ％ｅｍ国際調査報告 Ｉ□Ｉ曹−Ｎ。■Go IAI Yuushi Sen 372FormPCTnskn10fcom+++a-orIi+mthem+211fully19921a%em International Investigation Report I□I Ca-N.
■ゴｌ＾υ９２心３７２＋’５ｒｍＰＣ′ｒ／＋３ＡＱＩＱｆｃｔｔｍ＋ｒｍｉｅ＋＋ａ１ｍｄ＋ａ＋＋ＮＩｕｌｙＩ？９’２１ｅｏｙｋｍフロントベージの続き（８１）指定国 ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。■Gol^υ92 hearts 372+'5rmPC'r/+3AQIQfcttm+rmie++a1md+a++NIulyI? Continuation of 9'21eoykm front page(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE.
ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、 ＡＵ、 ＢＢ、 ＢＧ、 ＢＲ，ＣＡ、 ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。DK, ES, FR, GB, GR, IT, LU, MC, NL, SE), 0A (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, SN, TD, TG.), AT, AU, BB, BG, BR, CA, CH, C3, DE.
ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＵＳ（７２）発明者 クーパー、グリストファー ライルオーストラリア国 ２３５１ ニュー サウスウェールズ、アーミデール、ユニバーシティ オブ ニュー イングランド、インスチチュート オブ バイオテクノロジー気付DK, ES, FI, GB, HU, JP, KP, KR, LK, LU, MG, MN,MW, NL, No, PL, RO, RU, SD, SE, US(72) Inventor Cooper, Gristoffer Lyle Australia 2351 University of New, Armidale, New South WalesEngland, Institute of Biotechnology
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