【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡ塩基配列決定装置
に関する。更に詳細には、本発明は蛍光標識を用いてＤ
ＮＡの塩基配列を効率的に迅速に決定することのできる
装置に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a DNA base sequencer. More specifically, the present invention uses D
The present invention relates to an apparatus capable of efficiently and quickly determining the base sequence of NA.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ＤＮＡ等の塩基配列を決定する方法とし
て、ゲル電気泳動法が広く実施されている。2. Description of the Related Art Gel electrophoresis is widely used as a method for determining the base sequence of DNA or the like.
【０００３】電気泳動する際に、従来は試料をラジオア
イソトープでラベルし、分析していたが、この方法では
手間と時間がかかる難点があった。更に、放射能管理の
点から常に最大限の安全性と管理が求められ、特別な施
設内でなければ分析を行うことができない。このため、
最近では、試料を蛍光体でラベルする方式が検討されて
いる。Conventionally, during electrophoresis, a sample was labeled with a radioisotope and analyzed, but this method has a drawback that it takes time and labor. Furthermore, from the viewpoint of radioactivity control, maximum safety and control are always required, and analysis can be performed only in a special facility. For this reason,
Recently, a method of labeling a sample with a phosphor has been studied.
【０００４】光を用いる方法では、蛍光色素でラベルし
たＤＮＡ断片をゲル中を泳動させるが、泳動開始部か
ら、１５〜２０cm下方に各泳動路毎に光励起部と光検出
器を設けておき、ここを通過するＤＮＡ断片を順に計測
する。例えば、配列を決定しようとするＤＮＡ鎖を鋳型
として酵素反応（ダイデオキシ法）による操作で末端塩
基種が０かった種々の長さのＤＮＡを複製し、これらに
蛍光体を標識する。つまり、蛍光体で標識されたアデニ
ン（Ａ）断片群，シトシン（Ｃ）断片群，グアニン
（Ｇ）断片群およびチミン（Ｔ）断片群を得る。これら
の断片群を混合して電気泳動用ゲルの別々の泳動レーン
溝に注入し、電圧を印加する。ＤＮＡは負の電荷を持つ
鎖状の重合体高分子のため、ゲル中を分子量に反比例し
た速度で移動する。短い（分子量の小さい）ＤＮＡ鎖ほ
ど早く、長い（分子量の大きい）ＤＮＡ鎖ほどゆっくり
と移動するので、分子量によりＤＮＡを分画できる。In the method using light, a DNA fragment labeled with a fluorescent dye is made to migrate in a gel. A photoexcitation part and a photodetector are provided for each migration path 15 to 20 cm below the migration start part. The DNA fragments passing through here are sequentially measured. For example, DNAs of various lengths having 0 terminal base species are duplicated by an operation by an enzymatic reaction (dideoxy method) using a DNA chain whose sequence is to be determined as a template, and these are labeled with a fluorescent substance. That is, a fluorescent substance-labeled adenine (A) fragment group, cytosine (C) fragment group, guanine (G) fragment group, and thymine (T) fragment group are obtained. These fragment groups are mixed, injected into separate migration lane grooves of the electrophoresis gel, and a voltage is applied. Since DNA is a chain polymer having a negative charge, it moves in the gel at a speed inversely proportional to the molecular weight. Since shorter (smaller molecular weight) DNA chains move faster and longer (larger molecular weight) DNA chains move slowly, DNA can be fractionated by molecular weight.
【０００５】特開昭６３−２１５５６号公報には、レー
ザで照射される電気泳動装置のゲル上のラインと光ダイ
オードアレイの配列方向が電気泳動装置内のＤＮＡ断片
の泳動方向と直角となるように構成されたＤＮＡ塩基配
列決定装置が開示されている。In Japanese Patent Laid-Open No. 63-21556, a line on the gel of the electrophoretic device irradiated with a laser and the arrangement direction of the photodiode array are perpendicular to the electrophoretic direction of the DNA fragments in the electrophoretic device. The DNA nucleotide sequencer having the above-mentioned structure is disclosed.
【０００６】図３は該装置の構成を説明する模式図であ
る。泳動板７４は２枚のガラス板の間に電気泳動用ゲル
（例えば、ポリアクリルアミド）を挟み込んでいる。泳
動板全体の厚さは約１０ｍｍ程度であるが、ゲル電解質
層自体の厚さは約１ｍｍ未満である。泳動板７４の上端
より若干下の位置に櫛歯状のゲル電解質層上端が存在す
る。この櫛歯状の溝７５内に蛍光物質で標識されたＤＮ
Ａ断片を注入する。FIG. 3 is a schematic diagram for explaining the structure of the apparatus. The electrophoresis plate 74 has an electrophoresis gel (for example, polyacrylamide) sandwiched between two glass plates. The overall thickness of the electrophoretic plate is about 10 mm, but the thickness of the gel electrolyte layer itself is less than about 1 mm. An upper end of the comb-shaped gel electrolyte layer exists at a position slightly lower than the upper end of the migration plate 74. DN labeled with a fluorescent substance in the comb-shaped groove 75
Inject the A fragment.
【０００７】図３の装置では、光源７０から出たレーザ
光はミラー７２で反射され、泳動板７４のゲル中の一定
ポイントに横から水平にレーザ光を照射する。ゲル中を
泳動してきた蛍光ラベルされたＤＮＡ断片７６がこの照
射領域を通過する際、このＤＮＡ断片から蛍光が順次放
出される。このとき、蛍光放出の水平位置から末端塩基
の種類が、また、泳動スタートからの泳動時間の差から
断片の長さを、更に、発光波長で検体の識別ができる。
各泳動路からの蛍光はレンズ７８によりイメージインテ
ンシファイヤ８０の受光部８２で結像する。この信号は
増幅されて光ダイオードアレイ８４で電気信号に変換さ
れて計測される。計測結果をコンピュータ処理すること
によって各ＤＮＡ断片の配列を計算し、目的とするＤＮ
Ａの塩基配列を決定する。In the apparatus shown in FIG. 3, the laser light emitted from the light source 70 is reflected by the mirror 72, and a certain point in the gel of the electrophoretic plate 74 is horizontally irradiated with the laser light. When the fluorescently labeled DNA fragment 76 that has migrated in the gel passes through this irradiation region, fluorescence is sequentially emitted from this DNA fragment. At this time, the type of terminal base can be identified from the horizontal position of fluorescence emission, the fragment length can be identified from the difference in migration time from the migration start, and the analyte can be identified by the emission wavelength.
The fluorescence from each migration path is imaged by the light receiving portion 82 of the image intensifier 80 by the lens 78. This signal is amplified, converted into an electric signal by the photodiode array 84, and measured. The sequence of each DNA fragment is calculated by computer processing the measurement results, and the target DN is obtained.
The base sequence of A is determined.
【０００８】塩基配列の決定においてＤＮＡを標識する
ために現に使用されている色素は例えば、イソチオシア
ン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ），イソチオシアン酸エ
オシン（ＥＩＴＣ），イソチオシアン酸テトラメチルロ
ーダミン（ＴＭＲＩＴＣ）及び置換イソチオシアン酸ロ
ーダミン（ＸＲＩＴＣ）などである。検体を１種類の色
素でラベルする方法の代わりに、２種類の色素でラベル
し、２種類の蛍光を測定すると分析のスループットが向
上する。The dyes currently used for labeling DNA in the determination of base sequences are, for example, fluorescein isothiocyanate (FITC), eosin isothiocyanate (EITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TMRITC) and substituted rhodamine isothiocyanate. (XRITC) and the like. Instead of the method of labeling the sample with one type of dye, labeling with two types of dye and measuring two types of fluorescence improves the throughput of analysis.
【０００９】例えば、ＤＮＡ断片を標識するための蛍光
色素として、ＦＩＴＣ及びＸＲＩＴＣを使用する場合、
この蛍光色素にレーザ光が照射されると、ここから波長
約５２０ｎｍ及び６０４ｎｍの蛍光がそれぞれ発生され
る。蛍光色素を２種類使用すると、蛍光色素を１種類使
用した場合に比べて、ゲル当たりのサンプル数を単純に
倍にすることができるばかりか、識別塩基長を長くする
こともできる。例えば、蛍光色素を１種類使用した場
合、１サンプル当たりのレーン数は４で、蛍光色素を２
種類使用する場合と同じであるが、ゲル当たりのサンプ
ル数は蛍光色素が１種類の場合は８であるのに対し、蛍
光色素が２種類の場合、サンプル数は１６に倍増する。
また、蛍光色素を１種類使用した場合、識別塩基長は４
００塩基対であるのに対し、蛍光色素が２種類の場合、
識別塩基長は４５０塩基対に増大させることができる。For example, when FITC and XRITC are used as fluorescent dyes for labeling DNA fragments,
When this fluorescent dye is irradiated with laser light, fluorescence with wavelengths of about 520 nm and 604 nm is generated from this, respectively. When two kinds of fluorescent dyes are used, the number of samples per gel can be simply doubled as compared with the case of using one kind of fluorescent dye, and the discriminating base length can be lengthened. For example, when one type of fluorescent dye is used, the number of lanes per sample is 4, and the number of fluorescent dye is 2
Although the number of samples per gel is the same as when using one type, the number of samples per gel is 8 while the number of types of fluorescent dye is two, the number of samples doubles to 16.
Also, when one type of fluorescent dye is used, the identification base length is 4
In contrast to 00 base pairs, when there are two types of fluorescent dyes,
The discriminating base length can be increased to 450 base pairs.
【００１０】従来はこの２種類の蛍光を分離させるため
に図４に示されるようにプリズム９０を使用していた。
すなわち、２枚の泳動板７４の間に挟装されたゲル電解
質層７６に水平入射されたレーザビーム７７により発生
された蛍光７９をプリズム９０で２分割し、それぞれ異
なるフィルタ９２及び９４をそれぞれ通し、１つの２次
元センサ９６で検出している。しかし、プリズム９０を
使用して蛍光７９を２分割すると検出光量が半減するの
で、識別塩基長が低下したり、検出感度が低下するなど
の欠点が存在する。Conventionally, a prism 90 as shown in FIG. 4 is used to separate the two types of fluorescence.
That is, the fluorescence 79 generated by the laser beam 77 horizontally incident on the gel electrolyte layer 76 sandwiched between the two electrophoretic plates 74 is divided into two by the prism 90, and the different filters 92 and 94 are respectively passed. It is detected by one two-dimensional sensor 96. However, when the fluorescence 79 is divided into two using the prism 90, the amount of detected light is halved, so that there are drawbacks such as a reduction in the discrimination base length and a reduction in detection sensitivity.
【００１１】[0011]
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、プリズムを使用することなく２種類の蛍光を検出す
ることのできるＤＮＡ塩基配列決定装置を提供すること
である。SUMMARY OF THE INVENTION Therefore, an object of the present invention is to provide a DNA base sequencer which can detect two kinds of fluorescence without using a prism.
【００１２】[0012]
【課題を解決するための手段】前記課題を解決するため
に、本発明では、ＤＮＡ断片用の多数の泳動路を有す
る、垂直に保持される平板型ゲル電気泳動手段、該電気
泳動装置の泳動路に、該電気泳動装置の横方向から該泳
動路と直交するように、レーザ光を照射する光励起用の
レーザ光照射手段、レーザ光によって照射されたＤＮＡ
断片から発生された蛍光を検出し電気信号に変換する蛍
光検出手段とからなり、ＤＮＡの標識に２種類の異なる
蛍光色素を使用するＤＮＡ塩基配列決定装置において、
前記蛍光検出手段は泳動板を挟んで２個対峙して配置さ
れていることを特徴とするＤＮＡ塩基配列決定装置を提
供する。In order to solve the above-mentioned problems, according to the present invention, a vertically-held flat plate gel electrophoresis means having a large number of migration paths for DNA fragments, and the electrophoresis of the electrophoresis apparatus are provided. Laser light irradiation means for photoexcitation, which irradiates a laser beam so that the path is orthogonal to the migration path from the lateral direction of the electrophoretic device, and DNA irradiated by the laser light.
In a DNA base sequencer, which comprises fluorescence detection means for detecting fluorescence generated from a fragment and converting it into an electric signal, and using two different types of fluorescent dyes for labeling DNA,
There is provided a DNA base sequence determination device, characterized in that two fluorescence detection means are arranged opposite to each other with a migration plate interposed therebetween.
【００１３】[0013]
【作用】泳動板の前後にそれぞれ蛍光検出手段が配設さ
れているので、各蛍光検出手段を各波長の蛍光に対応さ
せることにより、プリズム分割による光量の半減なしに
２種類の蛍光を検出することができる。Since the fluorescence detecting means is provided in front of and behind the electrophoretic plate, each fluorescence detecting means is made to correspond to the fluorescence of each wavelength, so that two kinds of fluorescence can be detected without halving the light quantity due to the prism division. be able to.
【００１４】[0014]
【実施例】以下、図面を参照しながら本発明を更に詳細
に説明する。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will be described in more detail below with reference to the drawings.
【００１５】図１は本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置の
模式的構成を示す部分概要斜視図である。図示されてい
るように、本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置では、泳動
板のレーザビーム入射点を中心にして、泳動板を挟むよ
うに２台の蛍光検出手段１及び３が配設されている。FIG. 1 is a partial schematic perspective view showing a schematic configuration of the DNA base sequence determination apparatus of the present invention. As shown in the figure, in the DNA base sequence determination device of the present invention, two fluorescence detecting means 1 and 3 are arranged so as to sandwich the electrophoretic plate with the laser beam incident point of the electrophoretic plate as the center. .
【００１６】蛍光検出手段自体は特に限定されない。従
来から光学式のＤＮＡ塩基配列決定装置において蛍光検
出に使用されてきた蛍光検出手段あるいは、それ以外の
新規な構成を有する蛍光検出手段でも全て使用できる。The fluorescence detecting means itself is not particularly limited. Any fluorescence detecting means conventionally used for fluorescence detection in an optical DNA nucleotide sequencer or fluorescence detecting means having a novel configuration other than that can be used.
【００１７】図２は本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置で
使用できる蛍光検出手段の一例の模式的構成図である。
蛍光７９が入射する側の先端にはバンドパスフィルタ５
が配設されている。バンドパスフィルタ５で所望の波長
以外の光をカットする。従って、図１に示された蛍光検
出手段１及び３はそれぞれの蛍光波長を透過する、それ
ぞれ異なるバンドパスフィルタ５が装着されている。バ
ンドパスフィルタ５の次に撮像レンズ７が配置され、レ
ンズアダプタ９により保持されている。撮像レンズの光
軸上にホトダイオードアレーのような固体撮像素子１１
（例えば、ＣＣＤ（荷電結合素子）センサ又はＭＯＳリ
ニアイメージセンサ）が配置されている。固体撮像素子
１１は温度が上昇すると暗電流が増え、Ｓ／Ｎ比を悪化
させることになるので、固体撮像素子１１をペルチェ素
子１３で一定温度（例えば、５〜１０℃）に保持するこ
とが好ましい。この冷却効率を高めるために、ペルチェ
素子１３にはヒートシンク１５を隣接させることが好ま
しい。図示されていないが、固体撮像素子１１及びペル
チェ素子１３は気密構造の筐体内に収容することが好ま
しい。図２の蛍光検出手段はラインセンサとしての機能
を有する。FIG. 2 is a schematic block diagram of an example of fluorescence detecting means that can be used in the DNA base sequence determining apparatus of the present invention.
The bandpass filter 5 is attached to the tip on the side where the fluorescence 79 enters.
Is provided. The bandpass filter 5 cuts off light other than the desired wavelength. Therefore, the fluorescence detection means 1 and 3 shown in FIG. 1 are equipped with different band pass filters 5 that transmit respective fluorescence wavelengths. An image pickup lens 7 is arranged next to the bandpass filter 5, and is held by a lens adapter 9. A solid-state image sensor 11 such as a photodiode array on the optical axis of the image pickup lens
(For example, a CCD (charge coupled device) sensor or a MOS linear image sensor) is arranged. When the temperature of the solid-state imaging device 11 rises, the dark current increases and the S / N ratio deteriorates. Therefore, the Peltier device 13 can keep the solid-state imaging device 11 at a constant temperature (for example, 5 to 10 ° C.). preferable. In order to enhance the cooling efficiency, it is preferable that the heat sink 15 be adjacent to the Peltier element 13. Although not shown, it is preferable that the solid-state imaging device 11 and the Peltier device 13 be housed in a casing having an airtight structure. The fluorescence detecting means in FIG. 2 has a function as a line sensor.
【００１８】[0018]
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
泳動板の前後にそれぞれ蛍光検出手段が配設されている
ので、各蛍光検出手段を各波長の蛍光に対応させること
により、プリズム分割による光量の半減なしに２種類の
蛍光を検出することができる。As described above, according to the present invention,
Since the fluorescence detecting means is arranged before and after the migration plate, by making each fluorescence detecting means correspond to the fluorescence of each wavelength, it is possible to detect two kinds of fluorescence without halving the light amount due to the prism division. .
【図１】本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置の模式的構成
を示す部分概要斜視図である。FIG. 1 is a partial schematic perspective view showing a schematic configuration of a DNA base sequence determination device of the present invention.
【図２】本発明のＤＮＡ塩基配列決定装置で使用できる
蛍光検出手段の一例の模式的構成図である。FIG. 2 is a schematic configuration diagram of an example of fluorescence detection means that can be used in the DNA nucleotide sequencer of the present invention.
【図３】特開昭６３−２１５５６号公報に開示されたＤ
ＮＡ塩基配列決定装置の模式的構成図である。FIG. 3 D disclosed in JP-A-63-21556
It is a typical block diagram of a NA base sequence determination apparatus.
【図４】従来の蛍光色素を２種類使用する場合のＤＮＡ
塩基配列決定装置の模式的構成図である。FIG. 4 DNA when two kinds of conventional fluorescent dyes are used
It is a typical block diagram of a base sequence determination apparatus.
１，３ 蛍光検出手段 ５ バンドパスフィルタ ７ 撮像レンズ ９ レンズアダプタ １１ 固体撮像素子 １３ ペルチェ素子 １５ ヒートシンク 1,3 Fluorescence detection means 5 Band pass filter 7 Imaging lens 9 Lens adapter 11 Solid-state imaging device 13 Peltier device 15 Heat sink
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6064526AJPH07244046A (en) | 1994-03-08 | 1994-03-08 | DNA nucleotide sequencer |
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6064526AJPH07244046A (en) | 1994-03-08 | 1994-03-08 | DNA nucleotide sequencer |
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07244046Atrue JPH07244046A (en) | 1995-09-19 |
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6064526APendingJPH07244046A (en) | 1994-03-08 | 1994-03-08 | DNA nucleotide sequencer |
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07244046A (en) |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11098356B2 (en) | 2008-01-28 | 2021-08-24 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11098356B2 (en) | 2008-01-28 | 2021-08-24 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
| US11214832B2 (en) | 2008-01-28 | 2022-01-04 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions |
| US12227803B2 (en) | 2008-01-28 | 2025-02-18 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions |
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