【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention] 本発明は、溶液中のアルコール、特にエタノー
ルの濃度を酵素法で測定する試験片に関するもの
であり、さらに詳細には、ニコチンアミド アデ
ニン ジヌクレオチド（以後NADと略す）又は、
ニコチンアミド アデニン ジヌクレオチドフオ
スフエート（以後NADPと略す）と、好熱性細
菌由来のアルコールデヒドロゲナーゼと、好熱性
細菌由来のジアホラーゼと、色素と、担体とから
なるアルコール検出用試験片に関するものであ
る。 溶液中のアルコール濃度の測定は、食品工業や
化学工業において、プロセス管理の目的で頻繁に
行われている。アルコールのうち、特にエタノー
ル濃度の測定は、医学や臨床検査部門において日
常的な測定項目であり、また、交通法規上では重
要な検査項目となつている。 溶液中のアルコール測定に利用されてきた多く
の化学的方法は、アルコールの酸化に要した酸化
剤の容量的な変化や酸化剤の色調変化による方法
が採用されている。これらの方法はすべて使用す
る酸化剤がアルコール以外の様々な揮発性物質と
反応しうるため、特異性を欠くという重大な難点
がつきまとつた。 このため、目的とする物質のみを特異的に測定
する物理化学的な方法として、ガスクロマトグラ
フイー、液体クロマトグラフイーによるアルコー
ルの分析方法が1960年代に開発されたが、それら
の方法は正確に定量ができ、特異的である反面、
分析に長時間を要し、特殊で高価な装置や、それ
を十分使いことなくしうる人材の育成が必要であ
り、汎用性に欠け、即時性、実用性に難点があつ
た。 一方、酵素を用いる生化学的分析方法は、化学
的方法や物理化学的方法に比べると一般的に特異
性に優れ、装置的にも特殊なもの、大型のものを
用いる必要がない等の利点があり、この方法とし
て、アルコールデヒドロゲナーゼを用いた方法
（スキヤンド・ジエイ・クリニ・ラボ・アンド
インベスト，358頁，1951年，ボニチエセン筆
著；Scand.J.Clin.Lab.and Invest.，358，1951，
R.Bonnichsen et al）やアルコールオキシダー
ゼを用いた方法（バイオキミ・バイオフイジ・ア
クタ 151巻330〜342頁，1968年，ジャンセン筆
著；Biochim.Biophys.Acta，151，330〜342，
1968，Frank.W.Janssen et al）が報告されてい
る。これらの方法はいずれも、溶液中で酵素反応
を行わせ、生成したニコチンアミド アデニンジ
ヌクレオチド還元型（以後NADHと略す）を
340nmで測定したり、生成した過酸化水素をパー
オキシダーゼの作用でオルトジアニシジンと反応
させ、その発色を436nmで測定したりする方法が
あり、またNADHの測定法として、ジアホラー
ゼと色素とを組合せた報告（アーチ・バイオキ
ミ・バイオフイジ・132巻，91頁，1969年，カプ
ラン筆著；Arch.Biochim.Biochys.，132，91，
1969，F.Kaplan et al）もあるが、光学的な方
法であるため、分光光度計などの装置はやはり必
要であり、血液や食品などのように混濁したサン
プルの場合は測定が不可能であつた。また、酵素
反応を行わせるには、種々の試薬を溶解した上
で、反応器中に所定量ずつ分注する操作が必要
で、煩雑であり、溶解した試薬の保存性も悪く、
汎用性に欠けている。 このような欠点を克服するために、酵素的方法
と電気化学的方法とを組合せてアルコールを測定
する方法が研究されており、酵素電極法として例
えば、特公昭57−56019号公報には、アルコール
デヒドロゲナーゼ（アルコール脱水素酵素）を用
いた方法が記載されている。この方法は酵素反応
でエタノールから生成した水素を酸化−還元系を
用いて電気的に測定するもので、酵素固定化膜や
電気的な測定装置が必要であり、酵素膜は耐久性
に乏しく、液体酵素膜は４℃で２日間、酵素固定
化膜でも２週間の安定性しかなく、実用的でな
い。また、測定に要するサンプルも電極を十分ひ
たす量、すなわち比較的多量のサンプルが必要と
考えられ、臨床検査に用いる時などは採血する血
液量に限界があることから、やはりこの方法も汎
用性、一般性、実用性に欠けている。 したがつて、当業界では持ち運びが容易で、特
別の装置、技術を要することなく、任意の場所で
簡便に、微量のサンプルでアルコール濃度が測定
できる方法が臨まれながら、それらすべてを満足
する方法のないまま今日に至つているのが現状で
ある。 本発明者らは、かかる現状に鑑み、食品製造管
理、急性アルコール中毒症の診断や交通取締りの
現場から持ち運びが容易で特別の装置、技術を要
することなく、任意の場所で簡便に、微量のサン
プルで、アルコール濃度を検出することができる
アルコールの測定について鋭意研究を重ねた結
果、NAD又はNADPと、好熱性細菌由来のアル
コールデヒドロゲナーゼと、好熱性細菌由来のジ
アホラーゼと、色素と、担体とからなる試験片
が、極く微量の被検液でも被検液中のアルコール
の含有量に応じて発色又は脱色し、アルコール濃
度が測定でき、しかも保存安定性がよく、上記の
目的が達成されることを見い出し、本発明を完成
するに至つた。 すなわち、本発明は、(a)NAD又はNADPと、
(b)好熱性細菌由来のアルコールデヒドロゲナーゼ
と、(c)好熱性細菌由来のジアホラーゼと、(d)色素
と、(e)担体とからなるアルコール検出用試験片で
ある。 本発明の試験片は、アルコールを含有する溶液
を含浸させると、直ちにアルコールと酵素反応を
起こし、まずアルコールがNAD又はNADPの存
在下、好熱性細菌由来のアルコールデヒドロゲナ
ーゼによつてアルデヒドとNADH又はNADPH
に変換される段階（反応式−１）、次に生成した
NADH又はNADPHは好熱性細菌由来のジアホ
ラーゼによつて色素に水素を移され、その結果色
素は退色もしくは発色する段階とからなつている
（反応式−２）。アルコール量の測定は試験片をア
ルコールを含む溶液に浸し、その退色あるいは発
色の程度や速さを視認することで行われる。反応
式−１ アルコールデヒドロゲナーゼ アルコール＋NAD（Ｐ）NAD（Ｐ）Ｈ＋アル
デヒド反応式 ２ ジアホラーゼ NAD（Ｐ）Ｈ＋色素（酸化型）NAD（Ｐ）＋
色素（還元型） 本発明に用いられる酵素のうち、アルコールデ
ヒドロゲナーゼは、一般に、Alcohol：NAD
oxidoreductase，EC １，１，１，１や
Alcohol；NAD（Ｐ）oxidoreductase，EC １，
１，１，２に分類されるものであつて、好熱性細
菌由来のものを用いることが必要である。この好
熱性細菌由来のアルコールデヒドロゲナーゼを得
る場合には、常法に従つて精製すればよく、例え
ば、バチルス ステアロサーモフイラス
（Bacillus stearothermophilus）からアルコール
デヒドロゲナーゼを精製するには、バイオケミカ
ル ジヤーナル 127巻，３号63〜64頁，1972年
（Biochem.J.127，３，63−64，1972，A.
ATKINSON）や、エフ．イー．ビー．エス．レ
ター．33巻，１号１〜３頁，1973年（F.E.B.S.
Lett.，33，１，１〜３，1973，Bridgen，John）
の方法を用いることができる。 またジアホラーゼは、NADH：lipoamide
oxidoreductase Ｅ Ｃ 1.6.4.3や、ジアホラー
ゼNADH：dye oxidoreductase Ｅ Ｃ 1.6.99
に分類されるものであつて、用いる色素を還元で
きる好熱性細菌由来のジアホラーゼを用いること
が必要である。例えばバチルス ステアロサーモ
フイラスのジアホラーゼを得るには、バイオケミ
カル ジヤーナル 191巻，457〜465頁，1980年
（Biochem.J.191，457〜465，1980）に従えばよ
い。 さらにNAD、NADPも試薬として、例えば各
社（ベーリンガーマンハイム山之内社，オリエン
タル酵母社，シグマ社，生化学工業社）から市販
されているものを用いればよい。色素としては、
ジアホラーゼの作用によつて発色もしくは退色す
るものならいかなるものでもよく、例えばフエリ
シアン化合物や一般にホルマザン色素と呼ばれる
ものがあり、前者の例としては、フエリシアン化
カリウム、後者の例としては、ヨードニトロテト
ラゾリウム塩を用いることができる。またその他
の色素として、メチレンブルー、２，６−ジクロ
ルフエノールインドフエノール、インジゴカルミ
ン、アマランスなどをあげることができ、測定者
の安全衛生上の観点から安全性が確認されている
色素、すなわち食品添加物として許可されている
ものや、医薬として用いられているインジゴカル
ミン、アマランス、メチレンブルーを用いるのが
好ましい。このように安全が確認されている色素
を用いたアルコール検出用試験片は、唾液中のア
ルコール濃度の検出に最適で、交通法規上のエタ
ノール測定にメリツトが甚大である。 また、本発明の試験片に用いる担体としては、
常温で水に不溶性もしくは難溶性（溶解度1.0％
以下、25℃）のものならばいかなるものでもよ
く、例えばゼラチン、寒天、サイクロデキストリ
ン、セルロース、紙、キチン、グルカンなどに代
表される天然物の低分子から高分子のものや、レ
ーヨン、ビニロン、ポリエステル、ある種のポリ
ビニルアルコール、ナイロン、アクリルなどの半
合成から合成高分子のいずれをも用いることがで
きる。大きさや厚さ、形状は任意のものを用いれ
ばよい。 本発明の試験片を作るにあたつて、それぞれの
試薬の濃度は次のようにすればよい。例えば、１
モル／の濃度のアルコール検出用試験片を作る
場合、色素は0.01〜10モル／、好ましくは
0.1／2.0モル／、最も好ましくは0.2〜1.0モ
ル／とすればよく、アルコールデヒドロゲナー
ゼやビアホラーゼはそれぞれ102〜1011ユニツ
ト／、好ましくは104〜109ユニツト／、最も
好ましくは106〜108ユニツト／とすればよい。
またNADやNADPは、0.001〜2.0モル／、好
ましくは0.01〜1.5モル／、最も好ましくは0.1
〜1.0モル／とすればよい。これらを溶解する
緩衝液はいかなる種類のものでも用いることがで
きる。そのPHとしては４〜12、好ましくは６〜
11、最も好ましくは7.0〜9.5であればよく、その
濃度としては、0.01〜２モル／、好ましくは
0.1／1.0モル／、最も好ましくは0.2〜0.8モ
ル／とすればよい。このような緩衝液として
は、例えば、トリス−塩酸緩衝液があげられる。
検出しようとするアルコール濃度が１モル／よ
り低い時には、その低い割合に応じて、各成分を
減少させればよいが、実際には酵素反応に要する
時間が長くなるので、色素のみを減少させること
が普通である。また、用いる酵素の性質によつ
て、NADのみ、NADPのみ、あるいは両者を一
緒に加えてもよい。添加する酵素の単位ユニツト
とは、国際単位であり、１分間に基質１マイクロ
モルを25〜30℃の反応条件で変化させる活性をい
う。 本発明の試験片を作るには、例えば、水不溶性
あるいは難溶性の担体の１部あるいは全部を上記
の各試薬の溶解液に含浸せしめればよく、引き上
げた後、そのまま使つたり、あるいは乾燥後、使
用に供すればよい。また、一層ずつ積層するよう
な方法で作成してもよい。大きな担体を用いた場
合は、各試薬の溶解液にひたしたのち、適当な大
きさ、例えば幅５mm、長さ40mmくらいに細断すれ
ばよい。乾燥を行う際には、酵素が元来熱に対し
て不安定であるので、低温乾燥や凍結乾燥などを
行う方がよい。乾燥したものは、室温保存１カ月
後にも十分使用に供することができる。 本発明の試験片で実際に溶液中のアルコール濃
度を測定するには、例えば測定に適した濃度の試
験片を測定する溶液にひたし、引き上げて室温に
てその色素の退色もしくは発色に要する時間を測
定することで行うことができる。また色調変化に
よつてもアルコール濃度を測定することができ
る。唾液中のアルコール濃度を測定する場合も、
唾液にアルコール検出用試験片をひたし、退色に
要する時間を測定したり、あるいは色調変化を視
認することで唾液中のアルコール濃度の測定がで
きる。 本発明のアルコール検出用試験片は、持ち運び
が非常に容易であることはもちろん、ジアホラー
ゼと色素とが加わつているために、酵素反応の結
果を視認で判断できるため、分光光度計や電気化
学的な特殊な装置を全く必要とせず、任意の場所
で簡便に、微量のサンプルで短時間のうちにアル
コール濃度を検出することができる。特に乾燥し
た試験片は１カ月以上の長期保存性に優れてお
り、さらに、好熱性細菌由来の酵素を用いた場合
には、一層保存性が優れた試験片が得られること
から、急性アルコール中毒の診断のように急を要
する場合や、交通法規上の使用に非常に有益であ
り、社会生活上、公衆が得る利益ははかり知れな
いものがある。 次に本発明を実施例及び比較例により具体的に
説明する。この実施例及び比較例で下記の試薬を
用いた。１ NAD又はNADP；オリエンタル酵母社製。２ アルコールデヒドロゲナーゼ；オリエンタル
酵母社製カタログNo.ADH−01又はバチルス
ステアロサーモフイラス由来。３ ジアホラーゼ；ベーリンガー マンハイム山
之内社製カタログNo.411558又はバチルス ステ
アロサーモフイラス由来。 なお、アルコールデヒドロゲナーゼの１ユニツ
トは、25℃で１分間に１マイクロモルのアタノー
ルを消費する酵素量であり、ジアホラーゼの１ユ
ニツトは25℃でヨードニトロテトラゾリウムバイ
オレツト存在下、１分間に１マイクロモルの
NADHを消費する酵素量である。対照例 １ メチレンブル−４ミリモル／（以後mMと略
す）、アルコールデヒドロゲナーゼ340ユニツト／
ml、ジアホラーゼ100ユニツト／ml、トリトンＸ
−100 ６ml／、トリス塩酸緩衝液（PH9.0）
200mM、NAD10mMの濃度となるよう調整した
溶液を、濾紙（東洋科学製定性濾紙No.２、直径９
cm円型、厚さ0.26mm）に含浸させ、凍結乾燥後、
幅５mm、長さ40mmの短冊状に細断して青色の試験
片を得た。 この試験片を0.5g／のエタノール溶液に浸
漬し、取り出した後、室温に報知し、肉眼で観察
したところ、浸漬部分の青色が退色しはじめ、１
分で無色になつた。浸漬するエタノール溶液のエ
タノール濃度を変化させ、退色に要する時間を測
定した所、エタノール濃度が高くなるにつれて退
色に要する時間が短くなり、エタノール濃度が非
常にうすくなると退色が完全に行われず、色調が
うすくなるにとどまつた。 その結果を第１表に示した。 The present invention relates to a test piece for measuring the concentration of alcohol, especially ethanol, in a solution by an enzymatic method, and more specifically, nicotinamide adenine dinucleotide (hereinafter abbreviated as NAD) or
The present invention relates to an alcohol detection test piece comprising nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (hereinafter abbreviated as NADP), alcohol dehydrogenase derived from thermophilic bacteria, diaphorase derived from thermophilic bacteria, a dye, and a carrier. Measuring the alcohol concentration in a solution is frequently performed in the food and chemical industries for process control purposes. Among alcohols, the measurement of ethanol concentration in particular is a routine measurement item in medical and clinical laboratory departments, and is also an important inspection item under traffic regulations. Many chemical methods that have been used to measure alcohol in solutions rely on changes in the volume of the oxidizing agent required to oxidize the alcohol or changes in the color tone of the oxidizing agent. All of these methods suffer from the serious drawback of a lack of specificity because the oxidizing agents used can react with a variety of volatile substances other than alcohols. For this reason, alcohol analysis methods using gas chromatography and liquid chromatography were developed in the 1960s as physicochemical methods to specifically measure only the target substance, but these methods do not allow accurate quantitative determination. Although it is possible and specific,
Analysis takes a long time, requires special and expensive equipment, and the training of human resources who can use it without needing to use it, and it lacks versatility and has problems with immediacy and practicality. On the other hand, biochemical analysis methods using enzymes generally have superior specificity compared to chemical or physicochemical methods, and have the advantage of not requiring special or large equipment. This method uses alcohol dehydrogenase (Skyand GA Clini Lab & Co., Ltd.).
Invest., 358 pages, 1951, written by Bonichiesen; Scand.J.Clin.Lab.and Invest., 358, 1951,
R. Bonnichsen et al) and the method using alcohol oxidase (Biochim. Biophys. Acta, Vol. 151, pp. 330-342, 1968, by Jansen; Biochim. Biophys. Acta, 151, 330-342,
1968, Frank. W. Janssen et al) was reported. In both of these methods, an enzymatic reaction is carried out in a solution, and the resulting reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide (hereinafter abbreviated as NADH) is
There is a method of measuring at 340 nm, a method of reacting the generated hydrogen peroxide with orthodianisidine by the action of peroxidase, and measuring the color development at 436 nm, and a method of measuring NADH that uses a combination of diaphorase and a dye. (Arch. Biochim. Biochys., vol. 132, p. 91, 1969, by Kaplan; Arch. Biochim. Biochys., 132, 91,
1969, F. Kaplan et al., but since it is an optical method, equipment such as a spectrophotometer is still required, and measurement is not possible with turbid samples such as blood or food. It was hot. In addition, in order to perform an enzyme reaction, it is necessary to dissolve various reagents and then dispense them in predetermined amounts into a reactor, which is complicated, and the dissolved reagents have poor storage stability.
It lacks versatility. In order to overcome these drawbacks, methods for measuring alcohol by combining enzymatic methods and electrochemical methods have been researched. A method using dehydrogenase (alcohol dehydrogenase) is described. This method uses an oxidation-reduction system to electrically measure hydrogen generated from ethanol in an enzymatic reaction, and requires an enzyme-immobilized membrane and an electrical measuring device, and the enzyme membrane has poor durability. Liquid enzyme membranes are only stable at 4°C for 2 days, and even enzyme-immobilized membranes are only stable for 2 weeks, which is not practical. In addition, the amount of sample required for measurement is considered to be a relatively large amount to sufficiently soak the electrode, and there is a limit to the amount of blood that can be collected when used for clinical tests, so this method is also versatile. It lacks generality and practicality. Therefore, there is a need in the industry for a method that is easy to carry, does not require special equipment or technology, and can easily measure alcohol concentration in a small amount of sample at any location, but there is no method that satisfies all of these requirements. The current situation is that we have continued to this day without this. In view of the current situation, the present inventors have devised a method for easily transporting trace amounts from food production management, acute alcoholism diagnosis, and traffic control sites to any location without requiring any special equipment or technology. As a result of extensive research into the measurement of alcohol that can detect the alcohol concentration in samples, we found that NAD or NADP, alcohol dehydrogenase derived from thermophilic bacteria, diaphorase derived from thermophilic bacteria, a dye, and a carrier. The test piece develops or decolors depending on the alcohol content in the test solution even in a very small amount of test solution, and the alcohol concentration can be measured, and it has good storage stability, achieving the above objectives. This discovery led to the completion of the present invention. That is, the present invention provides (a) NAD or NADP;
This is an alcohol detection test piece consisting of (b) alcohol dehydrogenase derived from thermophilic bacteria, (c) diaphorase derived from thermophilic bacteria, (d) a dye, and (e) a carrier. When the test piece of the present invention is impregnated with an alcohol-containing solution, an enzymatic reaction with the alcohol occurs immediately, and alcohol is first converted into aldehyde and NADH or NADPH by alcohol dehydrogenase derived from thermophilic bacteria in the presence of NAD or NADP.
(reaction formula-1), then the generated
The process consists of a step in which NADH or NADPH transfers hydrogen to the dye by diaphorase derived from thermophilic bacteria, and as a result, the dye fades or develops color (reaction formula-2). The amount of alcohol is measured by immersing a test piece in a solution containing alcohol and visually observing the degree and speed of color fading or color development. Reaction formula-1 Alcohol dehydrogenase Alcohol + NAD (P) NAD (P) H + Aldehyde Reaction formula 2 Diaphorase NAD (P) H + dye (oxidized form) NAD (P) +
Dye (reduced type) Among the enzymes used in the present invention, alcohol dehydrogenase is generally referred to as Alcohol:NAD.
oxidoreductase, EC 1, 1, 1, 1 and
Alcohol; NAD (P) oxidoreductase, EC 1,
It is necessary to use one classified as 1, 1, or 2, which is derived from thermophilic bacteria. In order to obtain alcohol dehydrogenase derived from this thermophilic bacterium, it may be purified according to a conventional method. For example, in order to purify alcohol dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus, Biochemical Journal Vol. 127, No. 3, pp. 63-64, 1972 (Biochem.J.127, 3, 63-64, 1972, A.
ATKINSON), F. E. B. S. letter. Volume 33, No. 1, pp. 1-3, 1973 (FEBS
Lett., 33, 1, 1-3, 1973, Bridgen, John)
The following method can be used. Also, diaphorase is NADH: lipoamide
oxidoreductase E C 1.6.4.3, diaphorase NADH: dye oxidoreductase E C 1.6.99
It is necessary to use a diaphorase derived from a thermophilic bacterium that can reduce the dye used. For example, to obtain the diaphorase of Bacillus stearothermophilus, the method may be followed in Biochem. J. 191, 457-465, 1980. Furthermore, NAD and NADP may be used as reagents, such as those commercially available from various companies (Boehringer Mannheim Yamanouchi, Oriental Yeast, Sigma, Seikagaku Kogyo). As a dye,
Any substance that develops or discolors due to the action of diaphorase may be used, such as ferricyan compounds and what is generally called formazan dye. An example of the former is potassium ferricyanide, and an example of the latter is iodonitrotetrazolium salt. Can be used. In addition, other dyes include methylene blue, 2,6-dichlorophenol indophenol, indigo carmine, amaranth, etc., which are dyes that have been confirmed to be safe from the viewpoint of safety and health for testers, i.e., food additives. It is preferable to use indigo carmine, amaranth, and methylene blue, which are approved as commercially available substances or are used as medicines. Alcohol detection test pieces using dyes that have been confirmed to be safe are ideal for detecting alcohol concentration in saliva, and have great advantages in measuring ethanol under traffic regulations. In addition, as a carrier used for the test piece of the present invention,
Insoluble or poorly soluble in water at room temperature (solubility 1.0%)
(hereinafter referred to as 25°C), any material may be used, such as low-molecular to high-molecular natural products such as gelatin, agar, cyclodextrin, cellulose, paper, chitin, glucan, rayon, vinylon, etc. Any semi-synthetic to synthetic polymers such as polyesters, certain polyvinyl alcohols, nylons, acrylics, etc. can be used. Any size, thickness, and shape may be used. In preparing the test piece of the present invention, the concentration of each reagent may be determined as follows. For example, 1
When making a test piece for alcohol detection with a concentration of 0.01 to 10 mol/mole, the dye is preferably
The amount may be 0.1/2.0 mol/, most preferably 0.2 to 1.0 mol/, and alcohol dehydrogenase and viaphorase each have a concentration of 102 to 1011 units/, preferably 104 to 109 units/, most preferably 106 to 10 It should be8 units/.
Further, NAD or NADP is 0.001 to 2.0 mol/, preferably 0.01 to 1.5 mol/, most preferably 0.1
The amount may be ~1.0 mol/. Any type of buffer can be used to dissolve these. Its pH is 4-12, preferably 6-12.
11, most preferably 7.0 to 9.5, and the concentration is 0.01 to 2 mol/, preferably
The amount may be 0.1/1.0 mol/, most preferably 0.2 to 0.8 mol/. Examples of such buffers include Tris-HCl buffer.
When the alcohol concentration to be detected is lower than 1 mol/mol, each component can be reduced according to the lower ratio, but in reality the time required for the enzymatic reaction will be longer, so only the dye should be reduced. is normal. Furthermore, depending on the nature of the enzyme used, only NAD, only NADP, or both may be added. The unit of the enzyme to be added is an international unit, and refers to the activity of converting 1 micromole of substrate per minute under reaction conditions of 25 to 30°C. To make the test piece of the present invention, for example, part or all of a water-insoluble or poorly soluble carrier may be impregnated with a solution of each of the above reagents, and after being pulled out, it can be used as it is, or it can be dried. After that, it can be used. Alternatively, it may be created by laminating one layer at a time. If a large carrier is used, it may be immersed in a solution containing each reagent and then shredded into pieces of appropriate size, for example, about 5 mm in width and 40 mm in length. When drying, it is better to perform low-temperature drying or freeze-drying, since enzymes are inherently unstable to heat. The dried product can be used even after one month of storage at room temperature. To actually measure the alcohol concentration in a solution using the test piece of the present invention, for example, a test piece with a concentration suitable for the measurement is immersed in the solution to be measured, pulled out, and left at room temperature for the time required for the dye to fade or develop. This can be done by measuring. Alcohol concentration can also be measured by color change. When measuring alcohol concentration in saliva,
The alcohol concentration in saliva can be measured by soaking an alcohol detection test piece in saliva and measuring the time required for the color to fade, or by visually observing a change in color tone. The alcohol detection test piece of the present invention is very easy to carry, and since it contains diaphorase and a dye, the results of the enzymatic reaction can be determined visually, making it easy to use with a spectrophotometer or electrochemical test. Alcohol concentration can be easily detected at any location in a short time using a small amount of sample, without the need for any special equipment. In particular, dried test pieces have excellent long-term storage stability of one month or more, and when enzymes derived from thermophilic bacteria are used, test pieces with even better storage stability can be obtained. It is extremely useful in urgent cases such as the diagnosis of children, and for use in traffic regulations, and the benefits to the public in social life are immeasurable. Next, the present invention will be specifically explained with reference to Examples and Comparative Examples. The following reagents were used in this example and comparative example. 1 NAD or NADP; manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd. 2 Alcohol dehydrogenase; Catalog No. ADH-01 manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd. or Bacillus
Derived from stearothermophilus. 3 Diaphorase; derived from Boehringer Mannheim Yamanouchi Catalog No. 411558 or Bacillus stearothermophilus. One unit of alcohol dehydrogenase is the amount of enzyme that consumes 1 micromole of athanol per minute at 25°C, and one unit of diaphorase is the amount of enzyme that consumes 1 micromole of athanol per minute at 25°C in the presence of iodonitrotetrazolium violet. of
This is the amount of enzyme that consumes NADH. Control example 1 Methylene blue - 4 mmol/(hereinafter abbreviated as mM), alcohol dehydrogenase 340 units/
ml, diaphorase 100 units/ml, Triton X
-100 6ml/Tris-HCl buffer (PH9.0)
The solution adjusted to a concentration of 200mM and NAD10mM was filtered using filter paper (Toyo Kagaku Qualitative Filter Paper No. 2, diameter 9
cm circular shape, thickness 0.26 mm), and after freeze-drying,
A blue test piece was obtained by cutting it into strips with a width of 5 mm and a length of 40 mm. This test piece was immersed in a 0.5 g/ethanol solution, taken out, brought to room temperature, and observed with the naked eye.
It became colorless in minutes. When the ethanol concentration of the ethanol solution used for dipping was varied and the time required for color fading was measured, the higher the ethanol concentration, the shorter the time required for color fading, and when the ethanol concentration became very dilute, color fading did not occur completely and the color tone changed. It only became thinner. The results are shown in Table 1.
【表】 第１表に示したように、退色に要する時間、そ
の色調変化を視認することで、溶液中のエタノー
ル濃度を測定することができた。 上記組成よりなる試験片は、簡便なエタノー
ル検出用試験片として使用可能であり、室温にて
１カ月以上保存してもその性能は保たれていた。
また試験片はエタノールに対して反応したが、
メタノールには反応せず、特異性が高いことが確
認された。対照例 ２ 対照例１で示した組成のうち、メチレンブルー
をヨードニトロテトラゾリウムバイオレツト
4mMに代えて用いた以外は実施例１と同様にし
て試験片を作製した。試験片の作製はすべて
暗所で行つた。 得られた試験片は白色であり、0.5g／のエ
タノール溶液に浸漬し、取り出した後、室温に放
置し、肉眼で観察した所、浸漬部分が徐々に赤変
しはじめ、完全に赤変し、赤紫色になるのに50秒
を要した。 また、浸漬するエタノール溶液のエタノール濃
度を変化させた所、第２表に示すごとく、相関が
見られた。[Table] As shown in Table 1, the ethanol concentration in the solution could be measured by visually observing the time required for fading and the change in color tone. The test piece having the above composition could be used as a simple test piece for detecting ethanol, and its performance was maintained even when stored at room temperature for more than one month.
The test piece also reacted to ethanol, but
It was confirmed that it did not react with methanol and had high specificity. Control Example 2 Among the compositions shown in Control Example 1, methylene blue was replaced with iodonitrotetrazolium violet.
A test piece was prepared in the same manner as in Example 1 except that 4mM was used instead. All test pieces were prepared in the dark. The obtained test piece was white, and after being immersed in a 0.5 g/ethanol solution and taken out, it was left at room temperature and observed with the naked eye. , it took 50 seconds to turn reddish-purple. Furthermore, when the ethanol concentration of the ethanol solution used for immersion was varied, a correlation was observed as shown in Table 2.
【表】 第２表に示したように、ヨードニトロテトラゾ
リウムバイオレツトを使用しても、その発色に要
する時間や色調変化から、溶液中のエタノール濃
度を測定することができた。 上記組成よりなる試験片は、簡便なエタノー
ル検出用試験片として使用可能であり、冷暗所保
存で１カ月以上その性能が保たれていた。また試
験片はエタノールに対して反応したが、メタノ
ールには反応せず、特異性が高いことが確認され
る。実施例 １ 対照例１に示した組成のうち、アルコールデヒ
ドロゲナーゼとジアホラーゼを、バチルス ステ
アロサーモフイラス（Bacillus
stearothermophilus）由来のものに代えて用いた
以外は対照例１と同様にして試験片を得た。 試験片を対照例１と同様にして各濃度のエタ
ノール溶液に浸漬し、その変化を追跡した所、実
施例１と全く同等の結果が得られ、好熱性細菌由
来の酵素を用いてもアルコール検出用試験片とし
て使用可能であつた。 なお、この試験片は試験片よりも保存安定
性に優れ、室温保存で３カ月以上その性能を有し
ていた。実施例 ２ 実施例１で得られた試験片を用いて、唾液中
のアルコール濃度の測定を実施した。 すなわち、体重65Kgの成人男子に、日本酒360
mlを飲酒させ、飲酒１時間後の唾液を採取した。
その唾液中のエタノール濃度をガスクロマトグラ
フイー（島津製作所 GC−3BT）で測定したと
ころ、0.52g／のエタノールが含まれていた。 次に、試験片にこの唾液をしました所、55秒
で濃青色が白色に退色し、対照例１の結果から、
唾液中に、約0.5g／のエタノールが含まれてい
ると認められた。この結果はガスクロマトグラフ
イーで得られた結果とよく一致した。すなわち試
験片を用いることによつて、唾液中のエタノー
ル濃度を簡便に、測定しうることが確認された。[Table] As shown in Table 2, even when iodonitrotetrazolium violet was used, the ethanol concentration in the solution could be measured from the time required for color development and color change. The test piece having the above composition could be used as a simple test piece for detecting ethanol, and its performance was maintained for more than one month when stored in a cool and dark place. Furthermore, the test piece reacted to ethanol but not methanol, confirming its high specificity. Example 1 Among the compositions shown in Control Example 1, alcohol dehydrogenase and diaphorase were added to Bacillus stearothermophilus.
A test piece was obtained in the same manner as in Control Example 1, except that the sample derived from Stearothermophilus was used instead. When the test pieces were immersed in ethanol solutions of various concentrations in the same manner as in Control Example 1 and the changes were tracked, the results were exactly the same as in Example 1, and alcohol detection was also possible using enzymes derived from thermophilic bacteria. It could be used as a test piece. Note that this test piece had better storage stability than the test piece, and maintained its performance for more than 3 months when stored at room temperature. Example 2 Using the test piece obtained in Example 1, the alcohol concentration in saliva was measured. In other words, for an adult male weighing 65 kg, 360 yen of sake
ml of alcohol, and saliva was collected 1 hour after drinking.
When the ethanol concentration in the saliva was measured using gas chromatography (Shimadzu GC-3BT), it was found that it contained 0.52 g/ethanol. Next, when this saliva was applied to the test piece, the dark blue color faded to white in 55 seconds, and based on the results of Control Example 1,
Approximately 0.5g/ethanol was found to be contained in the saliva. This result was in good agreement with the results obtained by gas chromatography. That is, it was confirmed that the ethanol concentration in saliva could be easily measured by using the test piece.