【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明はアルツハイマー病の検査方法に関する。[Detailed description of the invention]<Industrial application field>The present invention relates to a method for testing Alzheimer's disease.
〈従来の技術及び発明が解決しようとする課題〉中年期
〜老年期に発症する老年痴呆に対して、従来、種々の定
義・分類がなされてきたが、これらは病理学的に差異が
ないことから、現在は−括してアルツハイマー病（又は
アルツハイマー型痴呆）と称されている。<Problems to be solved by conventional technology and invention> Various definitions and classifications have been made for senile dementia that develops between middle age and old age, but there are no pathological differences between these. Therefore, it is now collectively referred to as Alzheimer's disease (or Alzheimer's type dementia).
アルツハイマー病の診断法としては、アメリカ精神医学
協会が定めた診断マニュアル、ＷＨＯが定めた診断マニ
ュアル等が知られている。これらのマニュアルにおける
アルツハイマー病の診断は、基準に規定された痴呆の概
念と患者の言動とを対比すると共に他の痴呆又は神経性
疾患を除外することにより診断するものである。Known methods for diagnosing Alzheimer's disease include the diagnostic manual established by the American Psychiatric Association and the diagnostic manual established by the WHO. Diagnosis of Alzheimer's disease in these manuals is made by comparing the concept of dementia defined in the standards with the patient's speech and behavior and excluding other dementias or neurological diseases.
そのため、アルツハイマー病患者の検診による診断は、
病理学的もしくは生化学的な診断結果に基づいているわ
けではなく、確定的な診断規準があるというわけではな
い。従って、生前にアルツハイマー病の確定診断をする
ことは困難で、患者の死後、患者脳の病理学的所見が、
現在では、最も確実な診断結果を得る手段である。Therefore, diagnosis by screening of Alzheimer's disease patients is
It is not based on pathological or biochemical diagnostic results, and there are no definitive diagnostic criteria. Therefore, it is difficult to make a definitive diagnosis of Alzheimer's disease before the patient's death, and after the patient's death, pathological findings in the patient's brain are
Currently, it is the means to obtain the most reliable diagnostic results.
アルツハイマー病の病理学的診断規準は、アルツハイマ
ー病患者の脳の病理切片に神経原線維変化と老人斑を認
めることである（例えば、中野今治、「治療学」第２１
巻、第３号、第３１６頁、１９８８年参照）。神経原線
維変化及び老人斑の同定には、Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋ
ｙ変法、Ｂｏｄｌａｎ−大塚変法が主に用いられている
。しかし、こられの方法は手順が複雑であり、良好な染
色結果を得るには高い熟練度が要求され、また染色特異
性の点で染色結果の判断が難しいという難点がある。The pathological diagnostic criteria for Alzheimer's disease is the observation of neurofibrillary tangles and senile plaques in pathological sections of the brain of Alzheimer's disease patients (for example, Imabari Nakano, "Therapeutics" Vol. 21).
Vol. 3, p. 316, 1988). For identification of neurofibrillary tangles and senile plaques, Bielschowsk
The y variant method and the Bodlan-Otsuka variant method are mainly used. However, these methods have complicated procedures, require a high degree of skill to obtain good staining results, and have the disadvantage that it is difficult to judge staining results due to staining specificity.
本発明は、上記従来技術の有する欠点を解決するために
創案されたもので、発明者らが脳の病理切片の神経原線
維変化と老人斑の同定を鋭意研究した結果、塩基性線維
芽細胞成長因子（ＢａｓｉｃＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇ
ｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、以下、ｂＦＧＦという）が
神経原線維変化及び老人斑と特異的に結合する性質を有
するという知見を得、かかる性質を利用して病理切片の
神経原線維変化及び老人斑を同定する方法を見出し、本
発明を完成した。即ち、本発明は、手順が簡便であると
共に染色特異性が高く、判別が容易であるアルツハイマ
ー病の病理学的検査方法を提供することを目的とする。The present invention was devised to solve the drawbacks of the above-mentioned conventional techniques, and as a result of intensive research by the inventors on the identification of neurofibrillary tangles and senile plaques in pathological brain sections, basic fibroblasts Growth factors (BasicFibroblast G
A method for identifying neurofibrillary tangles and senile plaques in pathological sections by obtaining the knowledge that rowth factor (hereinafter referred to as bFGF) has the property of specifically binding to neurofibrillary tangles and senile plaques, and utilizing such properties They discovered this and completed the present invention. That is, an object of the present invention is to provide a pathological testing method for Alzheimer's disease that has simple procedures, high staining specificity, and easy discrimination.
く課題を解決するための手段及び作用〉上記の課題を解
決すべくなされた本発明のアルツハイマー病の検査方法
は、脳の病理切片の神経原線維変化及び老人斑を同定し
てアルツハイマー病を診断する病理学的検査方法におい
て、脳の病理切片にｂＦＧＦ又は標識化されたｂＦＧＦ
を作用させ、神経原線維変化及び老人斑と当該成長因子
又は標識化された成長因子とを特異的に結合させる工程
を含むことを特徴とする。Means and Effects for Solving the Problems> The Alzheimer's disease testing method of the present invention, which was made to solve the above problems, identifies neurofibrillary tangles and senile plaques in pathological sections of the brain and diagnoses Alzheimer's disease. In a pathological examination method, bFGF or labeled bFGF is added to a pathological section of the brain.
The method is characterized by including a step of specifically binding the growth factor or the labeled growth factor to neurofibrillary tangles and senile plaques.
本発明は、上記の構成よりなり、ｂＦＧＦは脳の病理切
片の神経原線維変化及び老人斑と特異的に結合するので
、神経原線維変化及び老人斑と結合したｂＦＧＦを免疫
染色法で染色することにより、神経原線維変化及び老人
斑を同定することができる。また、標識化されたｂＦＧ
Ｆを用いる場合には神経原線維変化及び老人斑を直接的
に染色・同定することができる。The present invention has the above configuration, and since bFGF specifically binds to neurofibrillary tangles and senile plaques in pathological sections of the brain, bFGF bound to neurofibrillary tangles and senile plaques is stained by immunostaining. By this, neurofibrillary tangles and senile plaques can be identified. In addition, labeled bFG
When F is used, neurofibrillary tangles and senile plaques can be directly stained and identified.
本発明で使用されるｂＦＧＦは、脳下垂体、網膜、黄体
、副腎、腎、胎盤等に存在することが知られている公知
の成長因子であり、アミノ酸配列も明らかにされている
（例えば、日本組織培養学会編、「細胞成長因子ｐａｒ
ｔ Ｉ及びｐａｒｔ ＩＩ Ｊ朝食書店発行など参照）
。ｂＦＧＦは、基本的には、分子ｆｆ１ｌ ６ｋＤａ、
ｐ Ｉ ９．６、アミノ酸１４６個の単鎖ポリペプチド
であるが、神経原線維変化及び老人斑と特異的に結合す
る性質を保持する限り、ｂＦＧＦのアミノ酸又はアミノ
酸配列の一部が欠落又は置換されたものでもよく、また
ｂＦＧＦの末端に−又は二以上のアミノ酸が付加したも
のでもよい。ｂＦＧＦの由来は特に限定されず、例えば
、ヒト、ウシ、マウス、ラット等から得られたｂＦＧＦ
のいずれも用いることができる。bFGF used in the present invention is a known growth factor that is known to exist in the pituitary gland, retina, corpus luteum, adrenal gland, kidney, placenta, etc., and the amino acid sequence has also been clarified (for example, Edited by the Japanese Society of Tissue Culture, “Cell growth factor par
(See t I and part II J published by Breakfast Shoten, etc.)
. bFGF is basically a molecule ff1l 6kDa,
p I 9.6, a single chain polypeptide of 146 amino acids, but as long as it retains the property of specifically binding to neurofibrillary tangles and senile plaques, bFGF amino acids or part of the amino acid sequence may be deleted or substituted. It may also be one in which - or two or more amino acids are added to the end of bFGF. The origin of bFGF is not particularly limited; for example, bFGF obtained from humans, cows, mice, rats, etc.
Any of these can be used.
本発明の検査方法は、上記のｂＦＧＦが神経原線維変化
及び老人斑と特異的に結合する性質を利用するもので、
神経原線維変化及び老人斑と特異的に結合したｂＦＧＦ
を免疫染色法を用いて染色し、神経原線維変化及び老人
斑を同定する方法（以下、第１の方法という）：標識化
されたｂＦＧＦを用いて直接的に神経原線維変化及び老
人斑を染色・同定する方法（以下、第２の方法という）
に関する。The testing method of the present invention utilizes the property of bFGF described above to specifically bind to neurofibrillary tangles and senile plaques,
bFGF specifically bound to neurofibrillary tangles and senile plaques
Method of staining using immunostaining method to identify neurofibrillary tangles and senile plaques (hereinafter referred to as the first method): Directly identifying neurofibrillary tangles and senile plaques using labeled bFGF. Staining/identification method (hereinafter referred to as the second method)
Regarding.
上記の第１の方法において、ｂＦＧＦの染色に用いられ
る免疫染色法としては、病理学的検査において用いられ
ている種々の方法のいずれも適用することができる。例
えば、抗ｂＦＧＦ抗体を予め積繊化しておく方法（標識
法）、未標識の抗ｂＦＧＦ抗体を用い、抗原であるｂＦ
ＧＦと反応させた後ｂＦＧＦに結合した抗ｂＦＧＦ抗体
を標識化する方法（未標識法）であってもよく、また未
標識法においてｂＦＧＦと結合した抗ｂＦＧＦ抗体を標
識化する方法として、ＩｇＧのＦｃ部分と結合性を有す
るプロティンＡを用いるプロティンＡ法、ビオチンとア
ビジンとの結合性を利用するＢＡ法、ビオチン化ペルオ
キシダーゼとアビジンとの複合体を用いるＡＢＣ法、ペ
ルオキシダーゼと抗ペルオキシダーゼ抗体との複合体を
用いるＰＡＰ法などの方法を用いることができる。また
、標識は、上記の染色方法の種類、所望する染色形態等
に応じて、適宜選択することができ、例えば、螢光色素
（例えば、フルオレセイン、テトラメチルローダミン等
）、酵素（特にペルオキシダーゼが好ましい）、フェリ
チン、ヨード、金等が挙げられる。免疫染色法の好まし
い態様としては、標識として螢光色素を用いる螢光抗体
法、標識として酵素を用いる酵素抗体法が挙げられる。In the first method described above, any of various methods used in pathological examinations can be applied as the immunostaining method used for bFGF staining. For example, a method in which anti-bFGF antibodies are piled in advance (labeling method), an unlabeled anti-bFGF antibody is used, and the antigen bFGF
A method of labeling an anti-bFGF antibody bound to bFGF after reacting with GF (unlabeled method) may also be used.Also, as a method of labeling an anti-bFGF antibody bound to bFGF in the unlabeled method, IgG Protein A method that uses protein A that has binding properties to the Fc portion, BA method that uses the binding property of biotin and avidin, ABC method that uses a complex of biotinylated peroxidase and avidin, and complex of peroxidase and anti-peroxidase antibody. A method such as the PAP method using the body can be used. In addition, the label can be appropriately selected depending on the type of the above-mentioned staining method, the desired staining form, etc., and includes, for example, fluorescent dyes (e.g., fluorescein, tetramethylrhodamine, etc.), enzymes (peroxidase is particularly preferred), and the like. ), ferritin, iodine, gold, etc. Preferred embodiments of the immunostaining method include a fluorescent antibody method using a fluorescent dye as a label and an enzyme antibody method using an enzyme as a label.
免疫染色法に関しては、既に多くの底置や文献（例えば
、用生明、「病理と臨床」第２巻、第１４０１頁、１９
８４年；北村ら編「臨床検査マニュアル」文光堂発行、
第１４９４頁の免疫染色法の項等）に詳述されており、
当該記述を参照して行うことができる。Regarding immunostaining methods, there are already many foundations and documents (for example, Akira Yosei, "Pathology and Clinical Practice", Vol. 2, p. 1401, 19
1984: “Clinical Testing Manual” edited by Kitamura et al., published by Bunkodo.
It is detailed in the immunostaining method section on page 1494, etc.).
This can be done by referring to the description.
上記の免疫染色法を用いる本発明の検査方法をより明確
にするため、その−例としてＡＢＣ法を用いた酵素抗体
法にて行う場合をもって詳細に説明する。まず、患者の
死後、脳を、ホルマリン固定、ＰＬＰ固定等の慣用の方
法で固定化した後、常法に従って、脱水・パラフィン包
埋し、ミクロトームにて薄切切片を調製する。次いで、
スライドガラスに貼着後、脱パラフィンし、蒸溜水で水
和し、さらに必要に応じて、ブロック血清（例えば、ヤ
ギ血清、ウマ血清等）でブロッキング処理する。かくし
て調製された切片に、ｂＦＧＦ溶液を添加し、放置して
神経原線維変化及び老人斑にｂＦＧＦを結合させた後、
適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、以下、
ＰＢＳという）で洗浄する。次いで、抗ｂＦＧＦ抗体溶
液を添加し、放置し、神経原線維変化及び老人斑に結合
したｂＦＧＦに当該抗体を結合させた後、ＰＢＳ等の緩
衝液で洗浄する。さらに、上記の抗ｂＦＧＦ抗体に対す
る抗体（以下、二次抗体という）にビオチンを結合させ
たビオチン化二次抗体を添加し、放置して抗ｂＦＧＦ抗
体にビオチン化二次抗体を結合させた後、ＰＢＳ等の適
当な緩衝液で洗浄する。In order to clarify the testing method of the present invention using the above-mentioned immunostaining method, a case will be described in detail using an enzyme antibody method using the ABC method as an example. First, after death of a patient, the brain is fixed by a conventional method such as formalin fixation or PLP fixation, and then dehydrated and embedded in paraffin according to a conventional method, and thin sections are prepared using a microtome. Then,
After being attached to a slide glass, it is deparaffinized, hydrated with distilled water, and further subjected to blocking treatment with blocking serum (eg, goat serum, horse serum, etc.) as necessary. A bFGF solution was added to the thus prepared section and left to bind bFGF to neurofibrillary tangles and senile plaques.
A suitable buffer (e.g. phosphate buffered saline, hereinafter referred to as
Wash with PBS). Next, an anti-bFGF antibody solution is added and left to stand to allow the antibody to bind to bFGF bound to neurofibrillary tangles and senile plaques, and then washed with a buffer such as PBS. Furthermore, a biotinylated secondary antibody in which biotin was bound to the above-mentioned anti-bFGF antibody (hereinafter referred to as "secondary antibody") was added, and the biotinylated secondary antibody was allowed to bind to the anti-bFGF antibody. Wash with a suitable buffer such as PBS.
一方、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ等）にビオチンを結合させたビオチン化ベルオ
キダーゼを別途調製しておき、これとアビジンを混合す
ることにより、アビジン−ビオチン化ベルオキダーゼ複
合体（ａｖｌｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎｐｅｒｏｘｌｄａｓ
ｅ ｃｏＩＩｐｌｅｘｓいわゆるＡＢＣ）を調製する。On the other hand, by separately preparing biotinylated peroxidase in which biotin is bound to peroxidase (for example, horseradish peroxidase, etc.) and mixing this with avidin, an avidin-biotinylated peroxidase complex (avldin-biotinperoxldas) is formed.
Prepare e coIIplexs (so-called ABC).
かくして調製されたアビジン−ビオチン化ベルオキダー
ゼ複合体を、上記のビオチン化二次抗体で処理がされた
切片に添加する。アビジンは４価の結合性を有するので
、切片上のビオチン化二次抗体にアビジン及びビオチン
を介してペルオキシダーゼが固定化される。次いで、ペ
ルオキシダーゼの適当な基質（例えば、ジアミノベンジ
ジンと過酸化水素水の混合液等）を添加し、必要に応じ
てオスミウム溶液などの反応増強剤を加えると、神経原
線維変化及び老人斑は褐色に染色され、同定されるので
、以下、常法に準じて、水洗、脱水、透徹、封入する。The avidin-biotinylated peroxidase complex thus prepared is added to the section treated with the above biotinylated secondary antibody. Since avidin has tetravalent binding properties, peroxidase is immobilized on the biotinylated secondary antibody on the section via avidin and biotin. Next, by adding a suitable substrate for peroxidase (for example, a mixture of diaminobenzidine and hydrogen peroxide) and, if necessary, a reaction enhancer such as osmium solution, the neurofibrillary tangles and senile plaques turn brown. The sample is stained and identified, and then washed, dehydrated, cleared, and sealed in accordance with conventional methods.
かくして調製された標本を顕微鏡等で観察し、神経原線
維変化及び老人斑の有無を検査し、アルツハイマー病の
診断を行う。The thus prepared specimen is observed under a microscope, and the presence or absence of neurofibrillary tangles and senile plaques is examined to diagnose Alzheimer's disease.
上記の方法において、ｂＦＧＦ溶液は、ヒト、ラン等か
ら得られたｂＦＧＦをＰＢＳ等の適当な緩衝液に溶解し
たものを用いればよく、必要に応じてヤギ血清等の血清
を添加する。ｂＦＧＦの濃度は、通常、０．５〜５μｇ
／ １１程度、好ましくは１〜３μｇ ／ ７Ｎ程度
に調整される。In the above method, bFGF solution obtained by dissolving bFGF obtained from humans, orchids, etc. in an appropriate buffer such as PBS may be used, and serum such as goat serum may be added as necessary. The concentration of bFGF is usually 0.5 to 5 μg
/11, preferably about 1 to 3 μg/7N.
また、抗ｂＦＧＦ抗体の調製は常法の抗体産生法やモノ
クロナール抗体作製技術に準じて行うことができ、例え
ば、ｂＦＧＦを生理食塩水で適宜な濃度に希釈し、フロ
イントの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｅ
ｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ、 ＣＰＡ）等のアジュ
バントと混合して懸濁液を調製し、実験動物（例えば、
ウサギ、モルモット等）に適当な間隔をおいて数回投与
して免疫化し、免疫化された実験動物から採血し、遠心
分離等の適当な手段で血清を分離した後、アフィニティ
ークロマトグラフィー等の手段で精製することにより得
られる。また、二次抗体も同様にして調製することがで
きる。In addition, anti-bFGF antibodies can be prepared according to conventional antibody production methods or monoclonal antibody production techniques. For example, bFGF is diluted with physiological saline to an appropriate concentration, and Freund's Complete Adjuvant (Complete Pre
und's Adjuvant, CPA) to prepare a suspension, and then inject it into experimental animals (e.g.
Rabbits, guinea pigs, etc.) are immunized by administration several times at appropriate intervals, blood is collected from the immunized experimental animals, serum is separated by an appropriate means such as centrifugation, and then the serum is separated by means such as affinity chromatography. It can be obtained by purification with Further, a secondary antibody can also be prepared in the same manner.
さらに、ビオチン化二次抗体及びビオチン化ペルオキシ
ダーゼは、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド ビ
オチンエステル等のビオチン化剤を用いる慣用の方法で
調製することができる。Furthermore, a biotinylated secondary antibody and a biotinylated peroxidase can be prepared by a conventional method using a biotinylating agent such as N-hydroxysuccinimide biotin ester.
なお、上記の方法は免疫染色法としてＡＢＣ法を用いた
酵素抗体法にて本発明の検査方法を行うものであるが、
他の免疫染色法を用いても本発明の検査方法は行うこと
ができる。その際、使用される抗ｂＦＧＦ及び二次抗体
は上記と同様な方法で調製でき、またその他の必要な試
薬等は前記の文献等に記載された方法に準じて調製する
ことができ、例えば、螢光抗体法を用いる場合、当該方
法で用いられる螢光色素標識と結合した抗体は、イソチ
オシアン酸フルオレセイン、イソチオシアン酸テトラメ
チルローダミン等と抗体とを反応させることにより調製
される。In addition, although the above method is one in which the testing method of the present invention is performed using an enzyme antibody method using the ABC method as an immunostaining method,
The testing method of the present invention can also be performed using other immunostaining methods. At that time, the anti-bFGF and secondary antibodies used can be prepared in the same manner as above, and other necessary reagents can be prepared in accordance with the methods described in the above-mentioned literature, for example, When using a fluorescent antibody method, the antibody bound to a fluorescent dye label used in the method is prepared by reacting the antibody with fluorescein isothiocyanate, tetramethylrhodamine isothiocyanate, or the like.
本発明の検査方法の第２の方法は、標識化されたｂＦＧ
Ｆを用いて、脳の切片の神経原線維変化及び老人斑を染
色・同定するものである。この方法において、標識とし
ては前記第１の方法で例示された標識が挙げられる。ま
た、ｂＦＧＦと標識との結合方法としては、例えば、グ
ルタルアルデヒド法、マレイミド法、イソシアネート法
等の慣用の方法を用いることができる。The second method of the testing method of the present invention is to use labeled bFG
F is used to stain and identify neurofibrillary tangles and senile plaques in brain sections. In this method, examples of the label include the labels exemplified in the first method. Furthermore, as a method for binding bFGF and a label, conventional methods such as the glutaraldehyde method, the maleimide method, and the isocyanate method can be used.
この方法の手順としては、前記の第１の方法と同様にし
て調製された脳の薄切切片に、標識化されたｂＦＧＦ溶
液を添加し、神経原線維変化及び老人斑に標識化された
ｂＦＧＦを特異的に結合させて染色・同定し、水洗、透
徹、封入することにより行われる。この際、標識が酵素
の場合には、前記第１の方法と同様に基質を作用させて
発色させればよい。In this method, a labeled bFGF solution is added to a brain thin section prepared in the same manner as in the first method, and labeled bFGF is added to neurofibrillary tangles and senile plaques. This is done by specifically binding, staining and identifying, washing with water, clearing, and encapsulating. At this time, if the label is an enzyme, the substrate may be applied to develop color in the same manner as in the first method.
なお、アルツハイマー病の病理学的検査は、脳の海馬及
び側頭葉皮質を主に観察し、その他の部位としては頭項
葉、前頭葉等を観察する。従って、本発明の検査方法に
おいても、通常、上記の部位について検査される。In pathological examinations for Alzheimer's disease, the hippocampus and temporal lobe cortex of the brain are mainly observed, and other areas such as the nuchal lobe and frontal lobe are observed. Therefore, also in the inspection method of the present invention, the above-mentioned parts are usually inspected.
また、本発明の検査方法は上記で説明した例に限定され
るものではなく、例えば、抗ｂＦＧＦ抗体として、抗原
認識部位を含む断片［例えば、ＦａｂＳＦａｂ−Ｆ（ａ
ｂ−）２等］を用いるなど、本発明の要旨を変更しない
範囲で適宜変更して実施できる。Furthermore, the testing method of the present invention is not limited to the examples described above, and for example, as an anti-bFGF antibody, a fragment containing an antigen recognition site [for example, FabSFab-F (a
b-)2, etc.], etc., without changing the gist of the present invention.
〈発明の効果〉本発明の検査方法は、操作が簡便であると共に染色特異
性が極めて高く、神経原線維変化及び老人斑の判別が容
易であるので、検査の迅速化及び精度の向上が図れると
いう効果を奏する。<Effects of the Invention> The testing method of the present invention is easy to operate and has extremely high staining specificity, making it easy to distinguish between neurofibrillary tangles and senile plaques, thus speeding up testing and improving accuracy. This effect is achieved.
〈実施例〉以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。<Examples> Hereinafter, the present invention will be explained in more detail based on Examples and Comparative Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
実施例アルツハイマー病患者の死後、脳の海馬及び側頭葉をＡ
ＢＣ法を用いた本発明の方法で検査した。Example After the death of an Alzheimer's disease patient, the hippocampus and temporal lobe of the brain were
It was tested by the method of the present invention using the BC method.
使用した試薬及び実験手順は下記のとおりである。The reagents and experimental procedures used are as follows.
■試薬（１１ｂ Ｆ Ｇ Ｆ溶液ウシｂＦＧＦ （アマ−ジャム社製）を２０％ヤギ血清
を含むＰＢＳに溶解し、使用時に同ＰＢＳで１〜２．５
μｇ ／ ｘｌに希釈したものを使用した。■ Reagent (11b F GF solution Bovine bFGF (manufactured by Amerjam) is dissolved in PBS containing 20% goat serum, and the solution is diluted with 1 to 2.5
A dilution of μg/xl was used.
（２）抗ｂＦＧＦ抗体溶液ウシｂＦＧＦに対するウサギ抗血清から抗ｂＦＧＦ
ＩｇＧを、ウシｂＦＧＦをリガンドとするアフィニティ
ーカラムクロマトグラフィーで精製し、抗ｂＦＧＦ抗体
として使用した。(2) Anti-bFGF antibody solution Anti-bFGF from rabbit antiserum against bovine bFGF
IgG was purified by affinity column chromatography using bovine bFGF as a ligand and used as an anti-bFGF antibody.
より詳細には、抗血清はウシｂＦＧＦを１回当たり、１
０μｇをフロイント完全アジュバントと共に、１週おき
に８回注射する。最後の注射から１０日後に全採血し、
抗血清を得、−８０℃に保存した。More specifically, the antiserum contains 1 bovine bFGF per dose.
0 μg is injected 8 times every other week with complete Freund's adjuvant. Whole blood was collected 10 days after the last injection.
Antiserum was obtained and stored at -80°C.
アフィニティーカラムは、アフィゲル１０（バイオラッ
ド社製）１１１に１００μｇのウシｂＦＧＦを固定化し
たものを使用し、抗血清２ ｘｌを上記カラムに添加し
、非結合成分をＰＢＳで洗い流した後に、ｐＨ３，０の
０，１Ｍグリシン緩衝液で、ＩｇＧを溶出した。１Ｍ
ＴｒｌｓでＩｇＧ溶液を中和し、実験に使用した。The affinity column used was one in which 100 μg of bovine bFGF was immobilized on Affigel 10 (manufactured by Bio-Rad) 111. After adding 2 xl of antiserum to the column and washing away unbound components with PBS, pH 3, The IgG was eluted with 0.1 M glycine buffer. 1M
The IgG solution was neutralized with Trls and used for experiments.
（３）ＡＢＣ試薬組織切片に結合した抗体の検出は、ＡＢＣ法により行っ
た。ＡＢＣ試薬はベクタスティンＡＢＣキット（ベクタ
ーラボラトリ−社製）を使用した。(3) ABC Reagent Antibodies bound to tissue sections were detected by the ABC method. As the ABC reagent, Vectastin ABC kit (manufactured by Vector Laboratory) was used.
また、基質として、ジアミノベンジジン５ｍｇ／ｌ ６
１１ Ｐ Ｂ Ｓ溶液に３％過酸化水素水２００μｇを
添加したものを使用した。In addition, as a substrate, diaminobenzidine 5 mg/l 6
11PBS solution to which 200 μg of 3% hydrogen peroxide was added was used.
■実験手順アルツハイマー病患者の脳の海馬及び側頭葉を、常法に
準じて、ホルマリン固定し、６μｍ厚のパラフィン切片
を調製し、脱パラフイン後、蒸溜水で水和し、２０％ヤ
ギ血清を含むＰＢＳでブロッキング処理した。次いで、
ｂＦＧＦ溶液を切片に添加し、室温で２時間放置し、Ｐ
ＢＳで洗浄した。■Experimental procedure The hippocampus and temporal lobe of the brain of an Alzheimer's disease patient were fixed in formalin according to a conventional method, and 6 μm thick paraffin sections were prepared. After deparaffinization, hydrated with distilled water and 20% goat serum. Blocking treatment was performed with PBS containing. Then,
bFGF solution was added to the sections, left at room temperature for 2 hours, and P
Washed with BS.
さらに、抗ｂＦＧＦ抗体溶液を添加し、室温で一晩放置
した後、ＰＢＳで洗浄した。次いで、二次抗体として、
ビオチン化洗ウサギＩｇＧ抗体溶液を添加し、室温で１
時間放置し、ＰＢＳて洗浄した後、ＡＢＣ試薬を用いて
染色し、常法に準じて、水洗、脱水、透徹、封入した。Further, an anti-bFGF antibody solution was added, and the mixture was left to stand at room temperature overnight, and then washed with PBS. Then, as a secondary antibody,
Add biotinylated washed rabbit IgG antibody solution and incubate for 1 hour at room temperature.
After being left for a period of time and washed with PBS, it was stained with ABC reagent, washed with water, dehydrated, cleared, and sealed according to a conventional method.
かくして得られた標本の顕微鏡写真（倍率９５倍）を第
１図に示す。第１図において、ドーナツ状に見えるのが
老人斑であり、小さい点に見えるのが神経原線維変化で
ある。同図に示されるように、本発明の方法によれば、
神経原線維変化及び老人斑が鮮明に染色されており、ま
たバックグランドも低いので、神経原線維変化及び老人
斑を極めて容易に判別できる。A micrograph (95x magnification) of the specimen thus obtained is shown in FIG. In Figure 1, what looks like a donut is a senile plaque, and what looks like a small dot is a neurofibrillary tangle. As shown in the figure, according to the method of the present invention,
Since neurofibrillary tangles and senile plaques are clearly stained and the background is low, neurofibrillary tangles and senile plaques can be distinguished very easily.
比較例１実施例で用いた脳パラフィン切片に続いて薄切されたパ
ラフィン切片を、Ｂｉｅｌｓｃｈｏｖｓｋｙ変法で検査
した。使用した試薬及び実験手順は下記のとおりである
。Comparative Example 1 A paraffin section thinly sliced following the brain paraffin section used in the example was examined by a modified Bielschovsky method. The reagents and experimental procedures used are as follows.
■試薬（１）硝酸銀溶液硝酸銀２０ｇを蒸溜水１００１１１に添加したものを用
いた。(2) Reagent (1) Silver nitrate solution A solution prepared by adding 20 g of silver nitrate to 100111 distilled water was used.
（２）現像液下記の成分を混合したものを使用した。(2) Developer solutionA mixture of the following components was used.
ホルマリン ２０１！蒸溜水 １００１１濃硝酸 １滴クエン酸 ０．５ｇ（３）アンモニア水２８％アンモニア水２００ ｘｌを２０分間蒸発させた
ものを使用した。Formalin 201! Distilled water 10011 Concentrated nitric acid 1 drop Citric acid 0.5 g (3) Ammonia water 28% Ammonia water 200 xl was evaporated for 20 minutes and used.
■実験手順脳パラフィン切片を実施例と同様に脱パラフィン及び水
和した後、硝酸銀溶液に２０分入れ、蒸溜水に浸漬した
。次いで、硝酸銀溶液に攪拌しながらアンモニア水を滴
下し、沈澱物がなくなるまでアンモニア水を滴下した。① Experimental procedure Brain paraffin sections were deparaffinized and hydrated in the same manner as in the examples, then placed in a silver nitrate solution for 20 minutes, and then immersed in distilled water. Next, ammonia water was added dropwise to the silver nitrate solution while stirring, and the ammonia water was added dropwise until there was no precipitate.
その後２滴アンモニア水を加える。この溶液に遮光下、
１５分間切片を浸漬した。切片を取り出し、蒸溜水にア
ンモニア水を３温式れたものに浸漬した。上記のアンモ
ニア・硝酸銀溶液に現像液を３７ｍ加えた溶液に切片を
入れ、現像した（現像は３〜５分かかる）。Then add 2 drops of ammonia water. In this solution, protect from light.
The sections were soaked for 15 minutes. The sections were taken out and immersed in a 3-temperature mixture of distilled water and ammonia water. The sections were placed in a solution prepared by adding 37 m of a developer to the above ammonia/silver nitrate solution and developed (development takes 3 to 5 minutes).
顕微鏡で観察し、染色の具合を判断し、蒸溜水で洗浄し
た。次いで、ハイポに５分間浸漬し、蒸溜水で洗浄した
後、常法に準じて、水洗、脱水、透徹、封入した。It was observed under a microscope to determine the degree of staining, and then washed with distilled water. Next, it was immersed in Hypo for 5 minutes, washed with distilled water, and then washed with water, dehydrated, cleared, and sealed according to a conventional method.
かくして得られた標本の顕微鏡写真（倍率９５倍）を第
２図に示す。同図に示されるように、神経原線維変化及
び老人斑は染色されているが、バックグランドが高いた
め、神経原線維変化及び老人斑の判別が困難である。A micrograph (95x magnification) of the specimen thus obtained is shown in FIG. As shown in the figure, neurofibrillary tangles and senile plaques are stained, but the high background makes it difficult to distinguish between neurofibrillary tangles and senile plaques.
比較例２実施例で用いた脳パラフィン切片に続いて薄切されたパ
ラフィン切片を、Ｂｏｄｉａｎ−大塚変法で検査した。Comparative Example 2 A paraffin section thinly sliced following the brain paraffin section used in the example was examined by a modified Bodian-Otsuka method.
使用した試薬及び実験手順は下記のとおりである。The reagents and experimental procedures used are as follows.
■試薬（１）硝酸銀・緩衝液下記の成分を混合したものを用いた。■Reagent(1) Silver nitrate/buffer solutionA mixture of the following components was used.
０．２Ｍ硼酸水溶液 １３１１０．０５Ｍ硼砂水溶液 ７ ｙｌｏ、５％硝酸
銀水溶液 １１！蒸留水 １００１１■実験手順脳パラフィン切片を実施例と同様に脱パラフィン及び水
和した後、２０％硝酸銀水溶液（蓋付容器で）にて３〜
６時間鍍銀し、蒸溜水で洗浄した。0.2M boric acid aqueous solution 1311 0.05M borax aqueous solution 7 ylo, 5% silver nitrate aqueous solution 11! Distilled water 10011 ■ Experimental procedure Brain paraffin sections were deparaffinized and hydrated in the same manner as in the example, and then soaked in a 20% silver nitrate aqueous solution (in a container with a lid) for 3 to 30 minutes.
It was silver plated for 6 hours and washed with distilled water.
次いで、硝酸銀・緩衝液溶液にて１６〜２０時間鍍銀し
、水洗することなく、直接２５〜３０℃に温めたヒドロ
キノン・亜硫酸ナトリウム液にて５〜１０分間還元した
。流水で切片をよく水洗後、蒸溜水で洗い、１％塩化金
水溶液で１０分間鍍金した。蒸溜水でよく洗った後、２
％蓚酸水溶液に約１０分間浸漬し、流水で洗った後、５
％ハイポ水溶液で３分間定着した。充分に水洗し、鍍銀
を確認した後、脱水、透徹、封入した。Next, it was plated with a silver nitrate/buffer solution for 16 to 20 hours, and without washing with water, it was directly reduced with a hydroquinone/sodium sulfite solution heated to 25 to 30°C for 5 to 10 minutes. The sections were thoroughly washed with running water, then washed with distilled water, and plated with a 1% gold chloride aqueous solution for 10 minutes. After washing thoroughly with distilled water,
% oxalic acid aqueous solution for about 10 minutes and washed with running water.
% Hypo aqueous solution for 3 minutes. After thoroughly washing with water and checking for silver plating, it was dehydrated, cleared, and sealed.
かくして得られた標本の顕微鏡写真（倍率９５倍）を第
３図に示す。同図に示されるように、Ｂｏｄｊａｎ−大
塚変法では神経原線維変化及び老人斑の判別が困難であ
る。A micrograph (95x magnification) of the specimen thus obtained is shown in FIG. As shown in the figure, it is difficult to distinguish between neurofibrillary tangles and senile plaques using the modified Bodjan-Otsuka method.
第１図、第２図及び第３図は、夫々実施例、比較例１及
び比較例２て得られた標本の顕微鏡写真である。FIG. 1, FIG. 2, and FIG. 3 are microscopic photographs of specimens obtained in Examples, Comparative Examples 1 and 2, respectively.
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12949690AJPH0424557A (en) | 1990-05-18 | 1990-05-18 | Method for examining alzheimer's syndrome |
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12949690AJPH0424557A (en) | 1990-05-18 | 1990-05-18 | Method for examining alzheimer's syndrome |
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0424557Atrue JPH0424557A (en) | 1992-01-28 |
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12949690APendingJPH0424557A (en) | 1990-05-18 | 1990-05-18 | Method for examining alzheimer's syndrome |
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0424557A (en) |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5882003A (en)* | 1992-10-12 | 1999-03-16 | Fujitsu Limited | Apparatus having document transport mechanism |
| US6445836B1 (en) | 1997-03-18 | 2002-09-03 | Fujitsu Limited | Image processing apparatus |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5882003A (en)* | 1992-10-12 | 1999-03-16 | Fujitsu Limited | Apparatus having document transport mechanism |
| US6079707A (en)* | 1992-10-12 | 2000-06-27 | Fujitsu Limited | Apparatus having document transport mechanism |
| US6445836B1 (en) | 1997-03-18 | 2002-09-03 | Fujitsu Limited | Image processing apparatus |
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