【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は医薬品等に有用なＬ−グルタミンの発酵法によ
る製造方法に関する。より詳しくは本発明は、６−ジア
ゾ−５−オキソーノルロイシンに対して耐性を有するコ
リネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属す
る微生物を使用してＬ−グルタミンを効率的に製造する
方法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Application Field] The present invention relates to a method for producing L-glutamine, which is useful for pharmaceuticals and the like, by a fermentation method. More specifically, the present invention relates to a method for efficiently producing L-glutamine using a microorganism belonging to the genus Corynebacterium or Brevibacterium that is resistant to 6-diazo-5-oxonorleucine. .
［従来技術の説明］Ｌ−グルタミンを発酵法により製造する方法として従来
い（つか提案されている。それらの方法は、ブレビバク
テリウム属あるいはミクロコツカス属に属するＬ−グル
タミン生産能を有する菌株を過剰の窒素源の存在下で培
養する方法（特公昭３９−７３９１号公報）；前記菌株
を酸性条件下で培養する方法（特公昭４０−１２４７４
号公報）；前記菌株を特定量の重金属イオンの存在下で
培養する方法（特公昭４２−７５９５号公報、同４３−
６９９３号公報）等である。[Description of the Prior Art] Conventionally, several methods have been proposed for producing L-glutamine by fermentation. A method of culturing the above strain in the presence of a nitrogen source (Japanese Patent Publication No. 39-7391); a method of culturing the above strain under acidic conditions (Japanese Patent Publication No. 12474/1983)
(Japanese Patent Publication No. 42-7595, Japanese Patent Publication No. 42-7595, Japanese Patent Publication No. 43-7595)
6993) etc.
これらの方法の他に次のような方法も提案されている。In addition to these methods, the following methods have also been proposed.
即ち、コリネバクテリウム グルタミカム、ミクロバク
テリウム フラバムまたはブレビバクテリウム フラバ
ムに属し、サルファ剤に対して耐性を有し、Ｌ−グルタ
ミン生産能を有する菌株を用いる方法（特公昭５１−４
４１９６号公報、同５３１７６７５号公報）；コリネバ
クテリウム属に属し、トリメトプリム、モノフルオロ酢
酸、弗化ナトリウムあるいはアザセリンに対して、耐性
を有し、Ｌ−グルタミン生産能を有する菌株を用いる方
法（特公昭６２−５１１１２号公報）；コ；ノネバクテ
リウム属に属するオレイン酸要求性変異株を用いる方法
（特公昭６３−１６０５９３号公報）等が提案されてい
る。That is, a method using a strain belonging to Corynebacterium glutamicum, Microbacterium flavum, or Brevibacterium flavum and having resistance to sulfa drugs and ability to produce L-glutamine (Japanese Patent Publication No. 51-4
No. 4196, No. 5317675); A method using a strain belonging to the genus Corynebacterium that is resistant to trimethoprim, monofluoroacetic acid, sodium fluoride, or azaserine and has the ability to produce L-glutamine. Japanese Patent Publication No. 63-160593) and the like have been proposed using an oleic acid auxotrophic mutant strain belonging to the genus Nonebacterium (Japanese Patent Publication No. 63-160593).
上述の方法によれば、それなりの収量でＬ−グルタミン
が得られるが、いずれの場合にあってもＬ−グルタミン
酸が可成りの量副生するという問題がある。この問題を
解決するについて、培地に過剰量のビオチンを添加する
方法が例えば特開昭６２−１８６７９６号公報により提
案されている。この方法によれば、Ｌ−グルタミン酸の
生成蓄積をある程度抑えることはできるが、いずれにし
ろ、依然可成りの量のＬ−グルタミン酸の副生があり、
且つＬ−グルタミンの収量が減退する場合がしばしばあ
る。According to the above-mentioned method, L-glutamine can be obtained in a reasonable yield, but in any case there is a problem that a considerable amount of L-glutamic acid is produced as a by-product. To solve this problem, a method of adding an excessive amount of biotin to the culture medium has been proposed, for example, in JP-A-62-186796. According to this method, the production and accumulation of L-glutamic acid can be suppressed to some extent, but in any case, a considerable amount of L-glutamic acid is still produced as a by-product.
Moreover, the yield of L-glutamine is often reduced.
［発明の目的１本発明の目的は、Ｌ−グルタミンを効率よく多収量で得
ることができる方法を提供することにある。[Objective of the Invention 1 An object of the present invention is to provide a method that can efficiently obtain L-glutamine in a high yield.
本発明の他の目的は、Ｌ−グルタミン酸の副生が顕著に
抑えられてＬ−グルタミンを効率よく多収量で得ること
ができる方法を提供することにある。Another object of the present invention is to provide a method by which L-glutamic acid by-product can be significantly suppressed and L-glutamine can be obtained efficiently and in a high yield.
〔発明の構成・効果１本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた
結果、コリネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウ
ム属に属しかっ６−ジアゾ−５オキソ−ノルロイシン（
以後” Ｄ ＯＮ”と略称する。）に対する耐性が賦与
された菌株が該耐性を有しない菌株の場合に比べてＬ−
グルタミン生産能において顕著に優れていることを見い
出した。[Structure/Effect 1 of the Invention The present inventors have conducted extensive research to achieve the above object, and have discovered that 6-diazo-5oxo-norleucine (6-diazo-5oxo-norleucine), which belongs to the genus Corynebacterium or Brevibacterium
Hereinafter, it will be abbreviated as "D ON". ) has been endowed with resistance to L-
It was found that the glutamine production ability was significantly superior.
本発明はこの知見を基に更なる検討を行った結果完成に
至ったものであり、その骨子は上述する内容のものであ
る。The present invention was completed as a result of further studies based on this knowledge, and its gist is as described above.
即ち、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属し、ＤＯＮ （即ち、６−シアシーＳ−オキソー
ノルロイシン）に対して耐性を有し、且つＬ−グルタミ
ン生産能を有する菌株を炭素源、窒素源及びその他の栄
養素を含有する培地中で培養してＬ−グルタミンを前記
培養物中に生成蓄積させ、該培養物からＬ−グルタミン
を採取することを特徴とするＬ−グルタミンの製造方法
。That is, a strain belonging to the genus Corynebacterium or Brevibacterium, resistant to DON (i.e., 6-siacy S-oxonorleucine), and capable of producing L-glutamine was used as a carbon source and nitrogen. A method for producing L-glutamine, which comprises culturing in a medium containing sources and other nutrients to produce and accumulate L-glutamine in the culture, and collecting L-glutamine from the culture.
本発明において使用する菌株としては、上述したように
、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に
属し、ＤＯＮに対し耐性を有し、Ｌ−グルタミン生産能
を有する菌株であればいずれのものであっても使用でき
る。As mentioned above, the strain used in the present invention may be any strain that belongs to the genus Corynebacterium or Brevibacterium, is resistant to DON, and has the ability to produce L-glutamine. It can also be used.
こうした菌株の選択分離は例えば次のようにして行なう
ことができる。Such selective isolation of bacterial strains can be carried out, for example, as follows.
即ち、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属し、Ｌ−グルタミンまたはＬ−グルタミン酸生産
能を有する菌株を親株とし、これに公知の手法で変異誘
導処理を施して変異菌株を得る。この際の変異誘導処理
手法としては、紫外線照射処理、放射線照射処理、変異
誘起剤による処理等が好ましいものとして例示できる。That is, a strain belonging to the genus Corynebacterium or Brevibacterium and having the ability to produce L-glutamine or L-glutamic acid is used as a parent strain, and this is subjected to mutation induction treatment by a known method to obtain a mutant strain. Preferred examples of mutation induction treatment techniques in this case include ultraviolet irradiation treatment, radiation irradiation treatment, treatment with a mutagenic agent, and the like.
こうして変異誘導処理して得られる変異菌株の中からＤ
ＯＮに対して耐性を有する菌株を分離する。この際の分
離は、例えば、ＤＯＮを含有する培地で前記変異菌株を
馴致培養することによって分離する。Among the mutant strains obtained by mutagenesis treatment in this way, D
Isolate a strain that is resistant to ON. In this case, separation is performed, for example, by acclimatizing the mutant strain in a medium containing DON.
この際、使用するＤＯＮとしては、６−ジアゾ−５−オ
キソ−Ｌ−ノルロイシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｄ
−ノルロイシン及び６−ジアゾ−５−オキソ−Ｄ、Ｌ−
ノルロイシンが挙げられる。これらのＤＯＮの中、６−
ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシンが好ましく使用
される。これらのＤＯＮは、親株の生育を阻害する濃度
、即ち、通７＃１〜１０００ ｍｇ／（２で使用される
。At this time, the DON used is 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, 6-diazo-5-oxo-D
-norleucine and 6-diazo-5-oxo-D,L-
One example is norleucine. Among these DONs, 6-
Diazo-5-oxo-L-norleucine is preferably used. These DONs are used at concentrations that inhibit the growth of the parent strain, ie, 7#1 to 1000 mg/(2).
なお、本発明においては、上述の人為的に処理して得ら
れる菌株以外に、自然界に存在する野生株の中から、Ｌ
−グルタミン生産能を有し且つＤＯＮに対し耐性を有す
るものをスクリーニングにより選択分離して得られる株
を使用することもちろん可能である。In addition, in the present invention, in addition to the above-mentioned strains obtained by artificial treatment, L.
- It is of course possible to use strains obtained by selectively separating strains that have the ability to produce glutamine and are resistant to DON by screening.
本発明において使用する、コリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属し、Ｌ−グルタミン生産能を
有し且つＤＯＮに対し耐性を有する菌株の具体的代表例
として次のものを挙げることができる。The following are specific representative examples of strains that belong to the genus Corynebacterium or Brevibacterium and have an ability to produce L-glutamine and are resistant to DON, to be used in the present invention.
即ち、コリネバクテリウム メラセコラ（徹工研菌寄第
５５８号）を親株とし、これから得られたＤＯＮ耐性変
異株コリネバクテリウム メラセコラＤＨ３４４（微工
研菌寄第１１１１７号）、ブレビバクテリウムフラバム
（ＡＴＣＣ１３８２６）を親株とし、これから得られた
ＤＯＮ耐性変異株ブレビバクテリウムフラバムＤＨ１８
ｆ微工研菌寄第１１１１６号）等である。That is, Corynebacterium melasecola (Tetsukoken Bacteria No. 558) was used as the parent strain, and the DON-resistant mutants obtained from it were Corynebacterium melasecola DH344 (Feikoken Bacterium No. 11117), Brevibacterium flavum ( Brevibacterium flavum DH18, a DON-resistant mutant strain obtained from the parent strain Brevibacterium flavum ATCC13826)
F Microtechnical Research Institute No. 11116), etc.
本発明において使用する上記ＤＯＮ耐性株は、上述した
方法により採取することができるが、その具体的内容を
以下の採取例により説明する。The DON-resistant strain used in the present invention can be collected by the method described above, and the specific details thereof will be explained using the following collection example.
振取土ユコリネバクテリウム メラセコラ（微工研菌寄第５５８
号）を親株にしたＤＯＮ耐性株の採取前記コリネバクテ
リウム メラセコラの菌株をニトロソグアニジン処理（
１００ｍｇ／、ｅ ： ３０分間）した後、下記の組成
の寒天培地に菌数約４Ｘ１０’個を塗布し、５〜１０日
間３２℃にて培養した。Shaking soil Yucorynebacterium Melasecola (Feikoken Bacterium 558
Collection of DON-resistant strains using Corynebacterium melasecola as the parent strain.
100 mg/e: 30 minutes), approximately 4×10' bacteria were applied to an agar medium having the following composition, and cultured at 32° C. for 5 to 10 days.
壇上Ｊ１成グルコース ０１％硫酸アンモ
ニウム ０３％Ｎ ａｘ ３０４
０．２％ＫＨ２Ｐ０．
０．１％ＫａＨＰ０．
０．３％Ｍ ｇ Ｓ Ｏ４・７Ｈ，ＯＯ，０５％ビオ
チン ５０ｕｇ／ｉＤ ＯＮ
（６−ジアゾ−５−オＮソーＬ−ノルロイシン）
ｌｏｏｍｇ／ｊ２寒天
２．０％（ｐＨ７，ＯＮａ０Ｈ）その結果、５３個のコロニーが出現した。これらをＤＯ
Ｎ耐性株とて分離した。Danjo J1 Synthetic Glucose 01% Ammonium Sulfate 03% N ax 304
0.2%KH2P0.
0.1% KaHP0.
0.3%Mg SO4.7H,OO,05%biotin 50ug/iD ON
(6-diazo-5-oN-so-L-norleucine)
loomg/j2 agar
2.0% (pH 7, ONaOH) As a result, 53 colonies appeared. DO these
It was isolated as an N-resistant strain.
１肛±ユブレビバクテリウム フラバム ＡＴＣＣ： １３８２
６を親株にしたＤＯＮ耐性薗の採取前記ブレビバクテリウム フラバムの菌株をニトロソグ
アニジン処理 ｆ１００ｍｇ／ｆ２：３０分間）した後
上述と同様の寒天培地に約４ Ｘ ｔｏ’個塗布し５〜
１０日間３２℃にて培養したところ、３２個のコロニー
が出現した。1 anal ± Jublevibacterium flavum ATCC: 1382
Collection of DON-resistant strains using Brevibacterium flavum as the parent strain.After treating the Brevibacterium flavum strain with nitrosoguanidine (f100mg/f2: 30 minutes), approximately 4X to' cells were plated on the same agar medium as described above.
After culturing at 32°C for 10 days, 32 colonies appeared.
これらをＤ ＯＮ ｉｊＩ性株として分離した。These were isolated as DON ijI strains.
それぞれの菌株をブイヨンスラントで、３２℃の温度で
２４時間培養し、得られた菌体を無菌水に懸濁し、ＤＯ
Ｎ （６−ジアゾ−５−オキソ−し−ノルロイシン）を
第１表に示す温度で含有した上述の寒天土音地にｌ！１
体を１０′個／プレートの濃度となるように接種して３
２℃の温度で４２時間培養を行って生育の有無を調べた
。その結果は第１表に示すとおりであった。なお、採取
例１で得た５３個のコロニーからする菌株については、
その一部を選択して供試した。第１表に示す結果から明
らかなように、供試した採取例１で得た菌株は全て、親
株の生育が阻害される１００ｍｇ／ｆ２のＤＯＮ濃度の
プレートで良好に生育した。Each strain was cultured in a bouillon slant at a temperature of 32°C for 24 hours, the resulting bacterial cells were suspended in sterile water, and DO
l! to the above-mentioned agar Toonji containing N (6-diazo-5-oxo-norleucine) at the temperature shown in Table 1! 1
Inoculate 3 cells at a concentration of 10 cells/plate.
The cells were cultured at a temperature of 2° C. for 42 hours, and the presence or absence of growth was examined. The results were as shown in Table 1. Regarding the bacterial strains from the 53 colonies obtained in Collection Example 1,
I selected some of them and tried them out. As is clear from the results shown in Table 1, all of the tested bacterial strains obtained in Collection Example 1 grew well on plates with a DON concentration of 100 mg/f2, which inhibits the growth of the parent strain.
（２）ブレビバクテリウム フラバム ＡＴＣｏ １３
８２６の び採取例２で た についての 察そ
れぞれの菌株をブイヨンスラントで、３２℃の温度で２
４時間培養し、得られた菌体を無菌水に懸濁し、ＤＯＮ
（６−ジアゾ−５−オキソ−し−ノルロイシン）を第
２表に示す濃度で含有した上述の寒天培地に菌体を１０
７個／プレートの濃度となるように接種して３２℃の温
度で４２時間培養を行って生育の有無を調べた。その結
果は第２表に示すとおりであった。なお、採取例２で得
た３２個のコロニーからする菌株については、その一部
を選択して供試した。第２表に示す結果から明らかなよ
うに、供試した採取例２で得た菌株は全て、親株の生育
が阻害される１００ｍｇ／βのＤＯＮ濃度のプレートで
良好に生育した。(2) Brevibacterium flavum ATCo 13
Incubation of each bacterial strain in bouillon slant at a temperature of 32℃ for 2 hours.
After culturing for 4 hours, the resulting bacterial cells were suspended in sterile water and DON
10 bacterial cells were placed on the above agar medium containing (6-diazo-5-oxo-norleucine) at the concentration shown in Table 2.
The cells were inoculated at a concentration of 7 cells/plate, cultured for 42 hours at 32° C., and the presence or absence of growth was examined. The results were as shown in Table 2. In addition, some of the bacterial strains from the 32 colonies obtained in Collection Example 2 were selected and tested. As is clear from the results shown in Table 2, all of the tested bacterial strains obtained in Collection Example 2 grew well on the plate with a DON concentration of 100 mg/β, which inhibits the growth of the parent strain.
（以下余白）第１表第２表のＬ−グルタミンについてのそれぞれの菌株を後述する実施例１と同様にして培養し
、Ｌ−グルタミンの生産性を調べた。その結果第３表に
示す結果が得られた。第３表に示した結果から次のこと
が判明した。即ち、親株である前記コリネバクテリウム
メラセコラの場合、Ｌ−グルタミン酸が多量生成し、
Ｌ−グルタミンの生成量は極めて少ない。これに対し、
供試したＤＯＮ耐性菌株については、全て、Ｌ−グルタ
ミンが多量生成し、Ｌ−グルタミン酸の生成は顕著に少
ない。そして、供試したＤＯＮ耐性菌株の中、コリネバ
クテリウム メラセコラＤＨ３４４の場合、Ｌ−グルタ
ミンの生成量は特に顕著で、Ｌ−グルタミン酸の生成は
極めて少ないことが判った。該コリネバクテリウム メ
ラセコラＤＨ３４４を代表株として通商産業省工業技術
院微生物工業研究所に平成元年１１月１６日付けで徹工
研菌寄第１１１１７号ｆＦＥＲＭ Ｐ−１１１１７）と
して寄託しである。(The following is a blank space) Each strain for L-glutamine in Table 1 and Table 2 was cultured in the same manner as in Example 1 described below, and the productivity of L-glutamine was examined. As a result, the results shown in Table 3 were obtained. The results shown in Table 3 revealed the following. That is, in the case of the parent strain Corynebacterium melasecola, a large amount of L-glutamic acid is produced,
The amount of L-glutamine produced is extremely small. In contrast,
All of the DON-resistant strains tested produced large amounts of L-glutamine, and produced significantly less L-glutamic acid. Among the DON-resistant strains tested, it was found that in the case of Corynebacterium melasecola DH344, the amount of L-glutamine produced was particularly remarkable, and the amount of L-glutamic acid produced was extremely small. The Corynebacterium melasecola DH344 as a representative strain has been deposited with the Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry as Tekkoken Bacteria Collection No. 11117 fFERM P-11117) dated November 16, 1989.
それぞれの菌株を後述する実施例１と同様にして培養し
、Ｌ−グルタミンの生産性を調べた。その結果第４表に
示す結果が得られた。第４表に示す結果から次のことが
判明した。即ち、親株である前記ブレビバクテリウム
フラバムの場合、Ｌ−グルタミン酸の生成は多く、Ｌ−
グルタミンの生成は極めて少ない。これに対し、供試し
たＤＯＮ耐性菌株については、全て、Ｌ−グルタミンが
多量生成し、Ｌ−グルタミン酸の生成は顕著に少ない。Each strain was cultured in the same manner as in Example 1 described below, and the productivity of L-glutamine was examined. As a result, the results shown in Table 4 were obtained. The results shown in Table 4 revealed the following. That is, the parent strain Brevibacterium
In the case of flavum, L-glutamic acid is produced in large quantities;
Glutamine production is extremely low. On the other hand, all of the DON-resistant strains tested produced large amounts of L-glutamine and produced significantly less L-glutamic acid.
そして、供試したＤＯＮ耐性菌株の中、ブレビバクテリ
ウム フラバムＤＩ １８の場合、Ｌ−グルタミンの生
成量は特に顕著で、Ｌ−グルタミン酸の生成は極めて少
ないことが判った。該ブレビバクテリウム フラバムＤ
Ｈ１８を代表株として通商産業省工業技術院微生物工業
研究所に平成元年１１月１６日付けで微工研菌寄第１１
１１６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１１１６）として寄託しで
ある。Among the DON-resistant strains tested, Brevibacterium flavum DI 18 was found to produce particularly remarkable amounts of L-glutamine, and to produce extremely little L-glutamic acid. The Brevibacterium flavum D
As of November 16, 1989, H18 was submitted to the Microbiological Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, as the 11th microbiological research institute.
No. 116 (FERM P-11116).
（以下余白）第３表第４表以下に、上述した２種の菌株の菌学的性質について説明
する。(The following are blank spaces) Tables 3 and 4 below describe the mycological properties of the two types of bacterial strains mentioned above.
（１）顕微鏡による所見通章（０，５−１，０） Ｘ （０，８−２，０ｊミク
ロンの桿菌で、大小不同のものを含む。スナツピングデ
イビジョンによるｖ字状配列と多形性を示す。ダラム染
色陽性、非運動性で胞子をつくらない。(1) Microscopic findings badge (0,5-1,0) Durham staining positive, non-motile and does not produce spores.
（２）培養による所見ブイヨン寒天平板上の集落は、辺縁のはっきりした正円
形で、不透明で光沢があり、色は黄色である。寒天斜面
上では接種線に沿って線上に旺盛な生育を示し、臭気や
培地の着色はない。寒天穿刺培養では、最上部で旺盛な
生育を示す。液体ブイヨン培地では均質に濁り、表面に
リングを形成する。(2) Findings from culture The colonies on the bouillon agar plate are perfectly circular with clear edges, opaque and shiny, and yellow in color. On the agar slope, it shows vigorous growth along the inoculation line, and there is no odor or coloration of the medium. Agar puncture culture shows vigorous growth at the top. In liquid bouillon medium, it becomes homogeneously cloudy and forms a ring on the surface.
（３）生理的性質ａ、温度：２５℃−３７℃で生育する。(3) Physiological propertiesa. Temperature: Grows at 25°C-37°C.
Ｂ、 ｐＨ： ｐＨ６−ｐＨ９で生育可能である。B. pH: Can grow at pH 6-9.
Ｃ耐熱性：１０％スキムミルク中で５５℃前後で１５分程
度の耐熱性を有する。C. Heat resistance: Has heat resistance for about 15 minutes at around 55°C in 10% skim milk.
好気性である。It is aerobic.
ゼラチンを液化しない。Do not liquefy gelatin.
リドマスミルクを変化させない。Does not alter lidmus milk.
インドールを生産しない。Does not produce indole.
フォーゲス・プロスカラエル試験（Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓ Ｘａｕｅｒ ｔｅｓｔｌ ：
ｌ［ｊｉ性・硫化水素を生成しない。Voges-Pros Xauer test:
l[ji] Does not generate hydrogen sulfide.
、メチルレッド試験：陽性。, methyl red test: positive.
硝酸塩還元性：陰性。Nitrate reducing property: Negative.
クエン酸を利用しない。Do not use citric acid.
デンプンを液化しない。Do not liquefy starch.
ウレアーゼ生成：陽性。Urease production: positive.
カタラーゼ生成：ｌ１ｊｌ性。Catalase production: l1jl nature.
各種炭水化物からの酸の生成ニゲルコース、フラクトー
ス、シュークロース、マルトース、マンノースより酸を
生成するが、マンニトール、キシロース、アラビノース
、ラフィノース、ラクトースからは酸を生成しない。Acid production from various carbohydrates Acid is produced from nigercose, fructose, sucrose, maltose, and mannose, but not from mannitol, xylose, arabinose, raffinose, and lactose.
ｒ。r.
ビオチンを要求する。Requires biotin.
ビオチン制限培地で、または高濃度ビオチン含有培地で
は界面活性剤の添加により、培地中にＬ−グルタミンを
著量蓄積する。L-glutamine accumulates significantly in the medium in biotin-limited media or by the addition of surfactants in high biotin-containing media.
６−ジアゾ−５−オキソーノルロイシンに耐性を有する
。Resistant to 6-diazo-5-oxonorleucine.
（１）顕微鏡による所見通常０．５ Ｘ （０，６〜２．０）ミクロンの短桿菌
で、学園もしくは二連園であるダラム染色陽性、非運動
性で胞子をつ（らない。(1) Microscopic findings: Short rods, usually 0.5 x (0.6 to 2.0) microns, positive for Durham staining in schools or double schools, non-motile, and do not produce spores.
（２）培養による所見ブイヨン寒天平板上の集落は、辺縁のはっきりした正円
形で、表蘭が滑らかで乾燥しており、色は黄色である。(2) Findings from culture The colonies on the bouillon agar plate are perfectly circular with clear edges, the surface is smooth and dry, and the color is yellow.
寒天斜面上では接種線に沿って線状に生育し、表面は乾
燥していて、鈍い光沢があり、色は黄色である。寒天穿
刺培養では、最上部、表面上で生育を示し、空気の通わ
ない部分では生育しない。On agar slopes, it grows linearly along the inoculation line, with a dry surface, dull luster, and yellow color. In agar puncture culture, growth occurs at the top, on the surface, and no growth occurs in areas where air does not pass.
生理的性質温度：２０〜３７℃で生育する。physiological propertiesTemperature: Grows at 20-37°C.
ｐＨ：ｐＨ６−ｐＨ８で生育可能である。pH: Can grow at pH 6-8.
好気性であるゼラチンを液化しない。aerobicDo not liquefy gelatin.
リドマスミルクを変化させない。Does not alter lidmus milk.
インドールを生産しない。Does not produce indole.
フォーゲス・プロスカラエル試験（Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓ Ｋａｕｅｒ ｔｅｓｔｌ ：
陰性◇硫化水素を生成しない。Voges-Pros Kauer test:
Negative ◇Does not generate hydrogen sulfide.
メチルレッド試験：陰性。Methyl red test: negative.
硝酸塩還元性：陽性。Nitrate reducing property: Positive.
デンプンを液化しない。Do not liquefy starch.
ウレアーゼ生成：陽性。Urease production: positive.
カタラーゼ生成：陽性。Catalase production: positive.
アンモニア生成：陽性。Ammonia production: positive.
各炭水化物からの酸の生成ニゲルコース、フラクトース
、マンノース、シュークロース、マルトースより酸を生
成するが、マンニトール、キシロース、アラビノース、
ラフィノース、ラクトースからは酸を生成しない。Acid production from each carbohydrate Acid is produced from nigercose, fructose, mannose, sucrose, and maltose, but mannitol, xylose, arabinose,
Raffinose and lactose do not produce acid.
ｐ、各炭水化物からの気体の生成：メリビオースより気
体を生成する。p. Generation of gas from each carbohydrate: Gas is generated from melibiose.
ｑ、６−ジアゾ−５−オキソーノルロイシンに耐性を有
する。It is resistant to q,6-diazo-5-oxonorleucine.
本発明による上述した菌株を用いて本発明の方法により
Ｌ−グルタミンを生成せしめるについては特に困難はな
い。即ち、炭素源、窒素源、無機塩類、生育因子及び使
用する微生物が栄養要求性を有する場合はその要求する
栄養物質を含有する通常の栄養培地を用いて常法により
行うことができる。使用する炭素源としては、グルコー
ス、糖蜜、デンプン加水分解液などの糖類、酢酸などの
有機酸類、エタノールあるいはメタノールなどのアルコ
ール類等が使用可能である。窒素源としては硫酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、燐酸ア
ンモニウム、尿素、アンモニア等を適宜選択して使用で
きる。本発酵は振どう培養あるいは通気攪はん培養等の
好気的条件で行うことが望ましく、培養温度は２４〜３
７℃、培養日数は２〜５日である。高収率を得るために
は、培養開始時または培養期間中に適当な中和剤を用い
て培地をｐ＋＋５．５〜８．５の範囲に調整することが
好ましい。There is no particular difficulty in producing L-glutamine by the method of the present invention using the above-mentioned strain according to the present invention. That is, when the carbon source, nitrogen source, inorganic salts, growth factors, and microorganisms used have auxotrophic properties, it can be carried out by a conventional method using a conventional nutrient medium containing the required nutrients. Examples of carbon sources that can be used include sugars such as glucose, molasses, and starch hydrolyzate, organic acids such as acetic acid, and alcohols such as ethanol and methanol. As the nitrogen source, ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium phosphate, urea, ammonia, etc. can be selected and used as appropriate. The main fermentation is preferably carried out under aerobic conditions such as shaking culture or aerated agitation culture, and the culture temperature is 24-3.
Culture at 7°C for 2 to 5 days. In order to obtain a high yield, it is preferable to adjust the medium to a p++ range of 5.5 to 8.5 using a suitable neutralizing agent at the start of culture or during the culture period.
培養終了後のＬ−グルタミンの採取は、常法により、濃
縮法、イオン交換法等により行うことができる。After completion of the culture, L-glutamine can be collected by a conventional method such as a concentration method or an ion exchange method.
〔実施例］以下に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明
はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。[Examples] The present invention will be further explained with reference to Examples below, but the present invention is not limited to these Examples in any way.
グルコースペプトン尿素肉エキスＫＨ，ＰＯ４に、ＨＰＯ。glucosepeptoneureameat extractKH, PO4In, HPO.
Ｍ ｇ Ｓ Ｏ４・７ Ｈａ３．０ ％１．０ ％１．０ ％０５ ％０．０５ ％０．０５ ％０ ０．０５ ％Ｆｅ５Ｏ＝
・ ７Ｈａ ＯＯ，００１％Ｍ ｎ Ｓ Ｏ４・
４ Ｈ２００，００１％チアミン
０．０００２％ビオチン
２０μｇ／β１ｐＨ７，３〜７．４）メ イ ンを立 上室 。M g SO4・7 Ha 3.0% 1.0% 1.0% 05% 0.05% 0.05% 0 0.05%Fe5O=
・7Ha OO,001%MnSO4・
4 H200,001% Thiamine
0.0002% biotin
20 μg/β1 pH 7.3-7.4) Mainly in the rising chamber.
グルコース １０．０％硫酸ア
ンモニウム ５．０％ＫＨ２Ｐ○４０
．２５％Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ，ＯＯ，０５％Ｍｎ５Ｏ−・４〜６Ｈｉ ＯＯ，００１％Ｃｕ５Ｏ，’
５Ｈ，ＯＯ，０００１％ＣａＣ０，３，０％チアミン ０．０００１％ビオ
チン ２．５ＬＬｇ＃２（ｐＨ
６，５）あらかじめ３２℃で２４時間ブイヨンスラント上で生育
させたコリネバクテリウム メラセコラＤＨ３４４株（
徹工研菌寄第１１１１７号）を、上述の組成からなるシ
ード培養培地に１白金耳摺種し、３２℃で１５時時間上
う培養を行った。このシード培養液４ ｍＡを上記メイ
ン培養培地５０ ｍｆ２含む５０Ｃ４ｙａ １２容坂ロ
フラスコに移植し、常法により３２℃にて７２時時間上
う培養した。Glucose 10.0% Ammonium sulfate 5.0% KH2P○40
．． 25% Mg5O,-7H,OO,05% Mn5O-・4~6Hi OO,001%Cu5O,'
5H,OO,0001%CaC0,3,0% Thiamine 0.0001% Biotin 2.5LLg#2 (pH
6,5) Corynebacterium melasecola strain DH344 (grown in advance on a bouillon slant at 32°C for 24 hours)
Tetsukoken Bacterium No. 11117) was seeded with one platinum loop in a seed culture medium having the above-mentioned composition, and cultured at 32° C. for 15 hours. 4 mA of this seed culture solution was transferred to a 50C4ya 12-volume sloped flask containing 50 mf2 of the above-mentioned main culture medium, and cultured for 72 hours at 32°C by a conventional method.
発酵終了液中に生成蓄積されたＬ−グルタミンは３．５
ｇ／ｄｆ２であった。また、グルタミン酸の副生は０．
７ｇ／ｄ、ｅであった。一方、上記と同様の培地、培養
条件でコリネバクテリウム メラセコラ（微工研薗寄第
５５８号）を培養したところ発酵終了液中に０．４ｇ／
ｄｇのＬ−グルタミンが生成蓄積した。またグルタミン
酸の副生は２．９ｇ／ｄｆｆであった。The amount of L-glutamine produced and accumulated in the fermentation finished liquid is 3.5
g/df2. In addition, the by-product of glutamic acid is 0.
It was 7g/d, e. On the other hand, when Corynebacterium melasecola (Kaiko Kenzonoyori No. 558) was cultured in the same medium and culture conditions as above, 0.4g/
dg of L-glutamine was produced and accumulated. Furthermore, the amount of glutamic acid by-product was 2.9 g/dff.
グルコース硫酸アンモニウムコーンスチーブリカーＫＨ，ＰＯ。glucoseammonium sulfatecorn stew liquorK.H., P.O.
Ｋ、ＨＰＯ。K.H.P.O.
ＭｇＳＯ４・７Ｈａ ０５％１％１％０．１ ％０．１ ％０．０５ ％ＦｅＳＯ４・ ７Ｈａ Ｏ０，０［１０１％Ｍｎ５Ｏ
，・ ４〜５Ｈ−００，０ＣＩ０１ ％Ｚ ｎ Ｓ
Ｏ−・ ７ Ｈｘ ＯＯ，０００１％Ｃｕ５Ｏ−・
５Ｈｚ ＯＯ，０００Ｌ ％チアミン
０．０００２％ビオチン
３０μｇ＃２（ｐＨ７，４１乙と２１ＪｌＬｌ亙威グルコース ５％硫酸アン
モニウム ５．５％酵母エキス
０．２％ＫＨ２１０４０，２５％Ｍ ｇ Ｓ Ｏ４・７Ｈ２００，０４％ＺｎＳＯ４’
７Ｈｚ○ ０．０００１％ＦｅＳＯ４・７Ｈｚ
Ｏロ０００１％Ｃｕ Ｓ Ｏ４・５ Ｈ２００，０００１％Ｍｎ Ｓ
Ｏ−・４〜５ Ｈａ ＯＯ，００１％ビオチン
５μｓ／ｇ（ｐＨ７，４）あらかじめ３２℃で２４時間ブイヨンスラント上で生育
させたコリネバクテリウム メラセコラＤＨ３４４株（
黴工研菌寄第１１１１７号）を、上述の組成からなるシ
ード培養培地に１白金耳摺種し、３２℃で１５時時間上
う培養を行った。このシード培養液ＩＬを上記メイン培
養培地１０Ｉ２を含む２０β容ジャーファーメンタ−に
移植し３２℃、４５０ｒｐｍ、通気毎分１０ｉにて培養
を行った。培養中のｐＨはアンモニア水により常時６〜
７に維持し、糖の不足はグルコース（５０ｇ／ ｍｌの
補糖溶液を添加し、７２時間培養を行った。MgSO4・7Ha 0 5% 1% 1% 0.1% 0.1% 0.05% FeSO4・7Ha O0,0[101%Mn5O
,・4～5H-00,0CI01%ZnS
O-・ 7 Hx OO,0001%Cu5O-・
5Hz OO,000L %thiamine
0.0002% biotin
30μg #2 (pH 7,41 Ototo 21JlLl Koi Glucose 5% Ammonium Sulfate 5.5% Yeast Extract
0.2%KH21040, 25% M g SO4 7H200, 04% ZnSO4'
7Hz○ 0.0001%FeSO4・7Hz
0001% Cu S O4.5 H200,0001% Mn S
O-・4~5 Ha OO, 001% biotin
5 μs/g (pH 7,4) Corynebacterium melasecola strain DH344 (grown in advance on a bouillon slant at 32°C for 24 hours)
11117) was inoculated into a seed culture medium having the above-mentioned composition, and cultured at 32° C. for 15 hours. This seed culture solution IL was transferred to a 20β capacity jar fermentor containing the main culture medium 10I2 and cultured at 32° C., 450 rpm, and aeration rate of 10 i/min. The pH during culturing is always kept at 6~6 by ammonia water.
7, and a sugar supplement solution of 50 g/ml was added to correct the lack of sugar, and culture was performed for 72 hours.
発酵終了に生成蓄積されたＬ−グルタミンは８．４ｇ／
ｄｆｆであった。また、グルタミン酸の副生は０．５ｇ
／ｄβであった。L-glutamine produced and accumulated at the end of fermentation was 8.4g/
It was dff. In addition, the by-product of glutamic acid is 0.5g.
/dβ.
この発酵終了液１０Ｌから遠心分離によって菌体を除去
して上清液を得、これからイオン交換樹脂を用いる常法
に従ってＬ−グルタミンを分離、精製を行ったところＬ
−グルタミンの結晶６９０ｇを得た。一方、上記と同様
の培地、培養条件でコリネバクテリウム メラセコラ（
黴工研薗寄第５５８号）を培養したところ発酵終了液中
に４．５ｇ／ｄβのＬ−グルタミンが生成蓄積した。ま
たグルタミン酸の副生は２．１ｇ／ｄｆｆであった。Bacterial cells were removed from 10 L of this fermentation-finished liquid by centrifugation to obtain a supernatant liquid, from which L-glutamine was separated and purified according to a conventional method using an ion exchange resin.
- 690 g of glutamine crystals were obtained. On the other hand, Corynebacterium melasecola (
When the fermentation liquid was cultured, 4.5 g/dβ of L-glutamine was produced and accumulated in the fermentation-finished liquid. Furthermore, the amount of glutamic acid by-product was 2.1 g/dff.
１１！ユブレビバクテリウム フラバム ＤＨ１８株（徹工研菌
寄第１１１１６号）を実施例２と同様の培地組成、培養
条件で７２時間培養を行った。11! Jublevibacterium flavum strain DH18 (Tetsukoken Bacterium No. 11116) was cultured for 72 hours under the same medium composition and culture conditions as in Example 2.
発酵終了液中に生成蓄積されたＬ−グルタミンは３．２
ｇ／ｄＩ２であった。また、グルタミン酸の副生は０．
４ｇ／ｄＩ２であった。一方、ブ１／ビバクテリウム
フラバム ＡＴＣＣ１３８２６を同様に培養したところ
発酵終了液中に１．０ｇ／ｄｆｆのＬ−グルタミンが生
成蓄積した。また、Ｌ−グルタミン酸の副生は０．８ｇ
／ｄ１２であった。The amount of L-glutamine produced and accumulated in the fermentation finished liquid is 3.2
g/dI2. In addition, the by-product of glutamic acid is 0.
It was 4g/dI2. On the other hand, B1/Vibacterium
When Flavum ATCC13826 was similarly cultured, 1.0 g/dff of L-glutamine was produced and accumulated in the fermentation-finished liquid. In addition, the by-product of L-glutamic acid is 0.8g.
/d12.
［発明の効果の概要］本発明によればコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属し、かつＤＯＮに耐性を有し、Ｌ−グル
タミン生産能を有する微生物を培養することによって、
特殊な薬剤の添加や特殊な培養方法を行わなくてもＬ−
グルタミンの生成蓄積量が著しく向上し、さらに副生ず
るＬ−グルタミン酸の量が低下することから培養終了液
から容易にＬ−グルタミンを高収率で得ることができる
。[Summary of Effects of the Invention] According to the present invention, by culturing a microorganism that belongs to the genus Corynebacterium or the genus Brevibacterium, is resistant to DON, and has L-glutamine producing ability,
L- without the addition of special drugs or special culture methods
Since the amount of glutamine produced and accumulated is significantly improved and the amount of by-produced L-glutamic acid is reduced, L-glutamine can be easily obtained at a high yield from the culture-finished liquid.
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2890190AJPH03232497A (en) | 1990-02-08 | 1990-02-08 | Method for producing L-glutamine by fermentation method |
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2890190AJPH03232497A (en) | 1990-02-08 | 1990-02-08 | Method for producing L-glutamine by fermentation method |
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|---|---|
| JPH03232497Atrue JPH03232497A (en) | 1991-10-16 |
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