本発明は、生体組織中に細胞を注入するための細胞注入装置、および、その作動方法に関する。The present invention relates to a cell injection device for injecting cells into biological tissue and a method for operating the same.
生体組織（以下、単に、組織ともいう）中に細胞を移植する方法の１つとして、移植すべき細胞を搬送用の液体と共に組織中に注入する方法が知られている（例えば、非特許文献１など）。以下、移植のために組織中に注入される細胞を「移植細胞」とも呼び、移植細胞の注入先（移植先）の生体組織を「ホスト組織」とも呼び、ホスト組織を構成する細胞を「ホスト細胞」とも呼ぶ。One method for transplanting cells into living tissue (hereinafter simply referred to as tissue) is to inject the cells to be transplanted into the tissue together with a transport liquid (for example, Non-Patent Document 1, etc.). Hereinafter, the cells injected into the tissue for transplantation are also referred to as "transplant cells", the living tissue into which the transplant cells are injected (transplant destination) is also referred to as "host tissue", and the cells that make up the host tissue are also referred to as "host cells".
従来、組織中に移植細胞を注入するための装置としては、シリンジやインジェクターなど、種々の薬物注入装置が転用されている（特許文献１、２など）。例えば、シリンジを用いた細胞注入では、細胞搬送用の液体中に移植細胞が分散してなる懸濁流体が、注射針付きのシリンジ内に吸引され、該注射針の先端部がホスト組織中に挿入され、手動によってシリンジのプランジャーが押され、懸濁流体が注入される。このときの懸濁流体の注入速度（流量）は、数１０～数１００〔μＬ／秒〕程度である。本明細書では、単位中の「Ｌ」は、リットルを表す。Conventionally, various drug injection devices such as syringes and injectors have been used as devices for injecting transplant cells into tissues (Patent Documents 1 and 2, etc.). For example, in cell injection using a syringe, a suspension fluid in which transplant cells are dispersed in a cell transport liquid is drawn into a syringe with an injection needle, the tip of the needle is inserted into the host tissue, and the syringe plunger is manually pressed to inject the suspension fluid. The injection speed (flow rate) of the suspension fluid at this time is on the order of several tens to several hundreds [μL/sec]. In this specification, "L" in the unit stands for liter.
しかしながら、ホスト組織中に移植細胞を注入する方法では、次のような問題が発生することが知られている。
例えば、図１９は、心臓壁中に心筋細胞を注入によって移植する治療の様子を模式的に示す図である。該治療では、図１９（ａ）に示すように、移植細胞である心筋細胞２１０が、懸濁液２００の態様にて、注射針など細管３００を通じて、ホスト組織１００である心臓壁中に注入される。懸濁液２００は、心筋細胞２１０が注入用液２２０中に分散したものである。該懸濁液がホスト組織中に注入されると、図１９（ｂ）に示すように、移植細胞２１０をとりまく注入用液２２０の部分が線維化し、移植細胞全体を取り囲む隔壁となり、それによって、健常なホスト細胞と移植細胞との直接的な結合が妨げられる場合がある。図２０は、移植細胞２１０をとりまく部分が線維化部分２３０となった様子を示す顕微鏡写真図であり、線維化部分２３０が絶縁壁となって、移植細胞２１０がホスト組織１００の細胞に接触できない状態を示している。 However, the method of injecting transplant cells into a host tissue is known to cause the following problems.
For example, FIG. 19 is a schematic diagram showing a treatment in which cardiomyocytes are transplanted into the heart wall by injection. In this treatment, as shown in FIG. 19(a), cardiomyocytes 210, which are transplant cells, are injected in the form of a suspension 200 through a thin tube 300 such as an injection needle into the heart wall, which is the host tissue 100. The suspension 200 is a suspension in which cardiomyocytes 210 are dispersed in an injection liquid 220. When the suspension is injected into the host tissue, as shown in FIG. 19(b), the part of the injection liquid 220 surrounding the transplant cells 210 becomes fibrotic and becomes a partition wall surrounding the entire transplant cells, which may prevent direct binding between healthy host cells and the transplant cells. FIG. 20 is a micrograph showing the part surrounding the transplant cells 210 becoming a fibrotic part 230, and shows a state in which the fibrotic part 230 becomes an insulating wall and the transplant cells 210 cannot come into contact with the cells of the host tissue 100.
また、皮膚の真皮中に移植細胞を懸濁液の態様にて注入する治療では、該懸濁液を注入すると、ホスト組織である真皮に炎症と線維化が惹起され、該真皮が部分的に瘢痕化する場合があることが知られている。よって、皮膚に対する細胞注入治療では、真皮の瘢痕形成を抑制すべきであることが報告されている。In addition, in a treatment in which transplant cells are injected in the form of a suspension into the dermis of the skin, it is known that injection of the suspension induces inflammation and fibrosis in the dermis, which is the host tissue, and may result in partial scarring of the dermis. Therefore, it has been reported that in cell injection treatments for the skin, scar formation in the dermis should be suppressed.
また、脳の損傷や脊髄損傷に対する細胞注入治療では、移植細胞を含んだ懸濁液の注入によって脳や脊髄が損傷を受けて、グリア細胞が惹起されて活性化し、グリア瘢痕と呼ばれる瘢痕化をきたす場合があることが知られている。よって、脳の損傷や脊髄の損傷に対する細胞注入治療では、注入操作そのものにより惹起されるグリア細胞の活性化を抑制することで、さらに有効性を高められる可能性があることが報告されている。In addition, it is known that in cell injection therapy for brain or spinal cord injuries, the injection of a suspension containing transplanted cells can damage the brain or spinal cord, causing glial cells to become activated and resulting in scarring known as glial scarring. Therefore, it has been reported that the effectiveness of cell injection therapy for brain or spinal cord injuries can be further improved by suppressing the activation of glial cells caused by the injection procedure itself.
本発明者は、上記の問題（第１の問題）を解決すべく、移植細胞の注入によって生じる上記変質（線維化、瘢痕化、グリア瘢痕など）の発生メカニズムをより詳細に検討し、ホスト組織中に懸濁液が急激に流入すること自体によって、注入部位のホスト組織またはホスト細胞が、せん断、破断、圧縮などの損傷を受け、それにより上記の変質が発生することを見出した。In order to solve the above problem (problem 1), the inventors have investigated in more detail the mechanism of the above-mentioned alterations (fibrosis, scarring, glial scarring, etc.) caused by the injection of transplanted cells, and have found that the sudden inflow of the suspension into the host tissue itself causes damage such as shearing, rupture, and compression to the host tissue or host cells at the injection site, which results in the above-mentioned alterations.
本発明の目的は、注入部位のホスト組織の損傷を低減し得、生体組織中に移植細胞を好ましく注入し得る装置を提供すること、および、該装置を作動させる方法を提供することにある。The object of the present invention is to provide a device that can reduce damage to host tissue at the injection site and can preferably inject transplant cells into living tissue, and to provide a method for operating the device.
本発明の主たる構成は、次のとおりである。
〔１〕生体組織中に細胞を注入するための細胞注入装置であって、当該細胞注入装置は、
収容部を有し、
前記収容部に収容された懸濁流体を有し、該懸濁流体は前記細胞が媒質流体中に分散したものであり、
前記収容部に直接的にまたは管路を介して接続された注射針を有し、
前記懸濁流体が前記注射針の先から流出するときの流量が１〔μＬ／秒〕以下であるように、該懸濁流体を前記収容部から前記注射針を通じて外部へと押し出す作動を行うよう構成された押出し機構を有する、
前記細胞注入装置。
〔２〕上記媒質流体は、上記生体組織の温度を含む高温側の温度範囲Ｔ１における第１の粘度α１と、該高温側の温度範囲Ｔ１よりも低い低温側の温度範囲Ｔ２における第２の粘度α２を有し、第１の粘度α１は、１０００〔ｍＰａ・ｓ〕以下であり、第２の粘度α２は、１００００〔ｍＰａ・ｓ〕以上であり、
当該細胞注入装置は、上記収容部内の懸濁流体を低温側の温度範囲Ｔ２に維持するための冷却器または断熱材を有し、
使用時においては、上記収容部内で低温側の温度範囲Ｔ２に維持された懸濁流体が、前記注射針の先端では高温側の温度範囲Ｔ１へと温められて第１の粘度α１となって、上記注射針の先端から流出する、
上記〔１〕に記載の細胞注入装置。
〔３〕高温側の温度範囲Ｔ１が、２１～４２〔℃〕であり、
第１の粘度α１が、０．５～１０００〔ｍＰａ・ｓ〕であり、
低温側の温度範囲Ｔ２が、０～２０〔℃〕であり、
第２の粘度α２が、５０００より大きい値〔ｍＰａ・ｓ〕である、
上記〔２〕に記載の細胞注入装置。
〔４〕上記媒質流体が、高温側の温度範囲Ｔ１において第１の粘度α１を有するゾルとなり、低温側の温度範囲Ｔ２において第２の粘度α２を有するゲルとなるものである、上記〔２〕または〔３〕に記載の細胞注入装置。
〔５〕当該細胞注入装置は、上記押出し機構として、シリンダーとプランジャーとを有するシリンジを有し、該シリンダーと該プランジャーとによって該シリンダー内の先端側には上記収容部が形成され、該シリンダーの先端部には、上記注射針が接続されており、
前記押出し機構は、上記流量が達成される速度にて前記プランジャーを前記シリンジの先端部の方へと移動させるよう構成されたアクチュエーターを、駆動源としてさらに有する、
上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の細胞注入装置。
〔６〕上記アクチュエーターが、作動液の供給によってピストンが直線的に移動する液圧シリンダーであって、
前記ピストンに接続されたピストンロッドが、上記シリンジのプランジャーを押すように、該プランジャーに接続されている、
上記〔５〕に記載の細胞注入装置。
〔７〕上記アクチュエーターが、弾性体とダンパーを有し、
前記弾性体は、原形状から変形した状態で配置され、かつ、原形状への復帰力が前記プランジャーを移動させるように配置され、
前記ダンパーは、前記プランジャーの移動に抵抗し、該弾性体の該形状変位の速度を制限するように配置され、
前記弾性体の復帰力と前記ダンパーの抵抗とが、上記流量が達成される速度にて前記プランジャーを前記シリンジの先端部の方へと移動させるように選択されている、
上記〔５〕に記載の細胞注入装置。
〔８〕上記シリンジのシリンダーの外側先端面には、上記注射針を上記生体組織に穿刺したときに、該生体組織の表面と該シリンダーとの間に介在するための第１の支持部材が設けられ、
第１の支持部材は、上記生体組織の表面に直接的にまたは接着剤を介して接触するための対物面を有し、上記注射針は、該シリンダーから第１の支持部材を貫通し、前記対物面から突き出している、
上記〔５〕～〔７〕のいずれかに記載の細胞注入装置。
〔９〕上記第１の支持部材の対物面には、該第１の支持部材を上記生体組織の表面に固定するための接着剤層が付与されている、上記〔８〕に記載の細胞注入装置。
〔１０〕上記注射針は、その針管部が円弧をなして湾曲しており、該円弧の中心角は、４５～９０度であり、
上記第１の支持部材は、さらに、
前記円弧の中心点を通過しかつ該円弧を含む平面に直交する中心軸線と一致して延びるエッジ部を有するか、または、
前記中心軸線を内部に包含し、該中心軸線に沿って延び、かつ、該中心軸線と同心状に丸みを帯びたエッジ部を有する、
上記〔８〕または〔９〕に記載の細胞注入装置。
〔１１〕上記第１の支持部材の対物面と、該対物面から突き出す上記注射針の針管部とのなす角度が、９０度ではない、上記〔８〕～〔１０〕のいずれかに記載の細胞注入装置。
〔１２〕上記注射針は、その針管部が円弧をなして湾曲しており、該円弧の中心角は、４５～９０度であり、
上記シリンジのシリンダーには第２の支持部材が設けられ、該第２の支持部材は、
前記円弧の中心点を通過しかつ該円弧を含む平面に直交する中心軸線と一致して延びるエッジ部を有するか、または、
前記中心軸線を内部に包含し、該中心軸線に沿って延び、かつ、該中心軸線と同心状に丸みを帯びたエッジ部を有する、
上記〔８〕または〔９〕に記載の細胞注入装置。
〔１３〕当該細胞注入装置は、上記押出し機構として浸透圧ポンプを有し、
該浸透圧ポンプは、
液体透過膜を介して互いに隣接する第１室と第２室とを有し、
第１室内に配置された液体が浸透圧差によって前記液体透過膜を透過して第２室内に配置された浸透圧生成材料中へと移動し、それにより第２室が膨張し、第２室の膨張によって上記収容部が押圧され、上記流量にて懸濁流体が該収容部から注射針を通じて外部へと押し出されるように構成されている、
上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の細胞注入装置。
〔１３〕上記〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の細胞注入装置の作動方法であって、
前記細胞注入装置の押出し機構の作動によって、該細胞注入装置の収容部に収容された懸濁流体を、該細胞注入装置の注射針の先から１〔μＬ／秒〕以下の流量にて流出させる工程を有する、
前記作動方法。 The main configuration of the present invention is as follows.
[1] A cell injection device for injecting cells into biological tissue, the cell injection device comprising:
A container is provided.
a suspension fluid contained in the container, the suspension fluid being a medium fluid in which the cells are dispersed;
The syringe has an injection needle connected to the container directly or via a pipeline,
an extrusion mechanism configured to extrude the suspension fluid from the storage portion to the outside through the injection needle so that the flow rate of the suspension fluid when it flows out from the tip of the injection needle is 1 [μL/sec] or less;
The cell injection device.
[2] The medium fluid has a first viscosity α1 in a high-temperature range T1 including the temperature of the biological tissue, and a second viscosity α2 in a low-temperature range T2 lower than the high-temperature range T1, the first viscosity α1 being 1000 [mPa·s] or less, and the second viscosity α2 being 10000 [mPa·s] or more;
The cell injection device has a cooler or a heat insulator for maintaining the suspension fluid in the storage unit at a low temperature range T2,
During use, the suspension fluid maintained in the low temperature range T2 in the container is heated to a high temperature range T1 at the tip of the injection needle, and has a first viscosity α1, and flows out from the tip of the injection needle.
The cell injection device described in [1] above.
[3] The high temperature range T1 is 21 to 42°C,
The first viscosity α1 is 0.5 to 1000 [mPa s],
The low temperature range T2 is 0 to 20°C.
The second viscosity α2 is greater than 5000 [mPa s];
The cell injection device described in [2] above.
[4] The cell injection device described in [2] or [3] above, wherein the medium fluid becomes a sol having a first viscosity α1 in a higher temperature range T1 and a gel having a second viscosity α2 in a lower temperature range T2.
[5] The cell injection device has a syringe having a cylinder and a plunger as the extrusion mechanism, the cylinder and the plunger form the storage section at the tip side of the cylinder, and the injection needle is connected to the tip of the cylinder;
The extrusion mechanism further includes an actuator as a drive source configured to move the plunger toward the tip of the syringe at a speed at which the flow rate is achieved.
The cell injection device according to any one of claims 1 to 4.
[6] The actuator is a hydraulic cylinder in which a piston moves linearly by supplying hydraulic fluid,
A piston rod connected to the piston is connected to the plunger of the syringe so as to push the plunger.
The cell injection device described in [5] above.
[7] The actuator has an elastic body and a damper,
the elastic body is arranged in a state in which it is deformed from its original shape, and arranged so that a restoring force to the original shape moves the plunger;
the damper is arranged to resist movement of the plunger and limit the rate of the shape displacement of the elastic body;
the return force of the elastic body and the resistance of the damper are selected to move the plunger toward the tip of the syringe at a speed at which the flow rate is achieved.
The cell injection device described in [5] above.
[8] A first support member is provided on an outer tip surface of the cylinder of the syringe to be interposed between the surface of the biological tissue and the cylinder when the injection needle is inserted into the biological tissue;
The first support member has an objective surface for contacting the surface of the biological tissue directly or via an adhesive, and the injection needle passes through the first support member from the cylinder and protrudes from the objective surface.
The cell injection device according to any one of claims 5 to 7.
[9] The cell injection device described in [8] above, wherein an adhesive layer is provided on the objective surface of the first support member for fixing the first support member to the surface of the biological tissue.
[10] The above-mentioned injection needle has a needle tube portion curved in an arc, and the central angle of the arc is 45 to 90 degrees;
The first support member further includes:
or having an edge portion extending coincident with a central axis passing through a center point of the arc and perpendicular to a plane containing the arc;
a rounded edge portion that includes the central axis, extends along the central axis, and is concentric with the central axis;
The cell injection device according to claim 8 or 9.
[11] A cell injection device described in any one of [8] to [10] above, wherein the angle between the objective surface of the first support member and the needle tube portion of the injection needle protruding from the objective surface is not 90 degrees.
[12] The above-mentioned injection needle has a needle tube portion curved in an arc, and the central angle of the arc is 45 to 90 degrees;
The cylinder of the syringe is provided with a second support member, the second support member comprising:
or having an edge portion extending coincident with a central axis passing through a center point of the arc and perpendicular to a plane containing the arc;
a rounded edge portion that includes the central axis, extends along the central axis, and is concentric with the central axis;
The cell injection device according to claim 8 or 9.
[13] The cell injection device has an osmotic pump as the extrusion mechanism,
The osmotic pump comprises:
The liquid-permeable membrane is disposed between a first chamber and a second chamber adjacent to each other.
The liquid disposed in the first chamber permeates the liquid permeable membrane due to an osmotic pressure difference and moves into the osmotic pressure generating material disposed in the second chamber, whereby the second chamber expands, and the expansion of the second chamber presses the above-mentioned storage section, so that the suspension fluid is pushed out from the storage section through the injection needle at the above-mentioned flow rate.
The cell injection device according to any one of claims 1 to 4.
[13] A method for operating the cell injection device according to any one of [1] to [12] above,
The method includes a step of causing the suspension fluid contained in the container of the cell injection device to flow out from the tip of the injection needle of the cell injection device at a flow rate of 1 μL/sec or less by operating the extrusion mechanism of the cell injection device.
The method of operation.
従来の細胞移植では、細胞を含んだ懸濁液が注射針付きのシリンジ内に吸引され、組織に注射針を挿入した後に、手動によってシリンジのプランジャーが押し込まれ、数１０～数１００〔μＬ/秒〕の流量にて、懸濁液が組織中に注入されていた。そのような注入は、従来ではゆっくりした注入であると考えられていたが、本発明によれば、組織が損傷を受けるような高速の注入である。所定量の懸濁液が手動によって高速で流入することによって、注入部位における組織（または細胞）は引き裂かれ、圧縮をも受け、損傷を受ける。この損傷が引き金となって、図１９（ｂ）に示したように、間質細胞や線維芽細胞の浸潤が誘導され、細胞外マトリックスのランダムな編み目構造を有する線維化組織（いわゆる瘢痕）が形成される。注入された移植細胞は、この線維化組織に囲まれて絶縁され、周囲のホスト組織と接触することができず、本来の治療目的を果たすことが出来なかった。In conventional cell transplantation, a suspension containing cells is drawn into a syringe with a needle, and after inserting the needle into the tissue, the plunger of the syringe is manually pushed in to inject the suspension into the tissue at a flow rate of several tens to several hundreds of μL/sec. Such injections were previously considered slow injections, but according to the present invention, they are high-speed injections that can damage the tissue. When a certain amount of suspension is manually injected at high speed, the tissue (or cells) at the injection site is torn, compressed, and damaged. This damage triggers the infiltration of interstitial cells and fibroblasts, as shown in Figure 19(b), and fibrotic tissue (so-called scar) with a random mesh structure of the extracellular matrix is formed. The injected transplant cells are surrounded and insulated by this fibrotic tissue, and cannot come into contact with the surrounding host tissue, so the original therapeutic purpose cannot be achieved.
これに対して、本発明では、注射針の先から流出するときの流量が１〔μＬ／秒〕以下にて、懸濁流体がホスト組織中に流入する。なお、通常のシリンジでは、シリンダーの内径が注射針の内径よりも大きいから、懸濁流体の流速よりも、プランジャーの移動速度をさらに小さくしなければならない。本発明において十分に遅くされた懸濁流体の流速よりもさらに小さい速度でプランジャーを正確に移動させることは、手動では実質的に困難であるから、プランジャーの極めて遅い移動は、本発明において新たに開発された押出し機構によって達成される。In contrast, in the present invention, the suspension fluid flows into the host tissue at a flow rate of 1 μL/sec or less when it exits the tip of the needle. In a normal syringe, the inner diameter of the cylinder is larger than the inner diameter of the needle, so the plunger movement speed must be slower than the flow rate of the suspension fluid. Since it is practically difficult to manually move the plunger accurately at a speed slower than the sufficiently slow flow rate of the suspension fluid in the present invention, the extremely slow movement of the plunger is achieved by a newly developed extrusion mechanism in the present invention.
一方、該ホスト組織では、毛細血管から染み出した組織液が、ゆっくりとリンパ管へと向かって流れている。本発明において実施する前記のような極めて小さい流量（１〔μＬ／秒〕以下）は、ホスト組織中における組織液の流れに近づけようとしたものである。即ち、前記のような極めて小さい流量にて懸濁流体がホスト組織中に流入すると、その懸濁流体を構成する媒質流体は、組織液の流れによって注入部位からホスト組織中へと次々に流れ去り、注入部位には移植細胞だけが残される。その結果、注入部位のホスト組織が受ける損傷は、注入された移植細胞の体積だけに起因する最小限のものとなる。よって、移植細胞の周囲に線維化組織が発生することが抑制され、移植細胞はホスト組織（またはホスト細胞）に接触して結合することができる。On the other hand, in the host tissue, the tissue fluid seeping out of the capillaries flows slowly toward the lymphatic vessels. The extremely small flow rate (1 μL/sec or less) implemented in the present invention is intended to approximate the flow of tissue fluid in the host tissue. That is, when the suspension fluid flows into the host tissue at the extremely small flow rate, the medium fluid constituting the suspension fluid flows away one after another from the injection site into the host tissue by the flow of the tissue fluid, and only the transplanted cells are left at the injection site. As a result, the damage to the host tissue at the injection site caused only by the volume of the injected transplanted cells is minimized. Therefore, the generation of fibrotic tissue around the transplanted cells is suppressed, and the transplanted cells can contact and bind to the host tissue (or host cells).
（さらなる問題と解決策）
本発明者は、シリンジのプランジャーが精密に微小な速度で移動する注入装置を開発して、従来よりも十分に小さい流量で懸濁液を注射針の先からホスト組織中へ流出させることを新たに試みた。しかしながら、プランジャーの移動速度を極めて遅くすると、シリンダー内の懸濁液に生じる注射針への流れの速さは、注射針内での流れの速さに比べて極めて遅くなる。そのような場合、シリンダー内の懸濁液のうち、媒質液だけがシリンダーから注射針内へと極めてゆっくり出て行き、移植細胞は移動せずにシリンダー内に残される場合が多くなるという、新たな問題が生じることがわかった。以下、懸濁液の流量を小さくすることで新たに生じる、このようなさらなる問題を「第２の問題」とも呼ぶ。(More problems and solutions)
The present inventor developed an injection device in which the plunger of the syringe moves precisely at a minute speed, and attempted to make the suspension flow out of the tip of the injection needle into the host tissue at a flow rate sufficiently smaller than that of the conventional device. However, when the speed of the plunger movement is made extremely slow, the flow rate of the suspension in the cylinder toward the injection needle becomes extremely slow compared to the flow rate inside the injection needle. In such a case, it was found that a new problem occurs in that only the medium liquid of the suspension in the cylinder flows out of the cylinder into the injection needle extremely slowly, and the transplanted cells are often left in the cylinder without moving. Hereinafter, this further problem that arises by reducing the flow rate of the suspension is also referred to as the "second problem."
本発明では、前記の第２の問題を解決するために、さらに、次の（Ｉ）および（ＩＩ）の特徴的な構成を備えている。
（Ｉ）細胞注入装置の収容部に収容される懸濁流体を構成する媒質流体が、生体組織の温度を含む高温側の温度範囲Ｔ１における第１の粘度α１と、該高温側の温度範囲Ｔ１よりも低い低温側の温度範囲Ｔ２における第２の粘度α２とを有し、第１の粘度α１は、１０００〔ｍＰａ・ｓ〕以下であり、第２の粘度α２は、１００００〔ｍＰａ・ｓ〕以上である。以下、「高温側の温度範囲Ｔ１」を「高温Ｔ１」と略し、かつ、「低温側の温度範囲Ｔ２」を「低温Ｔ２」と略す場合がある。
（ＩＩ）細胞注入装置が冷却器または断熱材を有し、それにより、収容部内の懸濁流体の温度が、低温側の温度範囲Ｔ２に維持される。 In order to solve the second problem, the present invention further comprises the following characteristic configurations (I) and (II).
(I) The medium fluid constituting the suspension fluid contained in the container of the cell injection device has a first viscosity α1 in a high-temperature range T1 including the temperature of the living tissue, and a second viscosity α2 in a low-temperature range T2 lower than the high-temperature range T1, the first viscosity α1 being 1000 [mPa·s] or less, and the second viscosity α2 being 10000 [mPa·s] or more. Hereinafter, the "high-temperature range T1" may be abbreviated as "high temperature T1," and the "low-temperature range T2" may be abbreviated as "low temperature T2."
(II) The cell injection device has a cooler or insulation, which maintains the temperature of the suspending fluid in the container within a lower temperature range T2.
上記の（Ｉ）および（ＩＩ）の特徴的な構成を備えることによって、懸濁流体の媒質流体は、収容部内では、低温Ｔ２でより高い粘度（第２の粘度α２）となる。よって、たとえ１〔μＬ／秒〕以下という極めて小さい流量を達成するために押出し機構が極めて遅く作動しても、媒質流体がその高い粘度α２ゆえに、移植細胞を伴って収容部から注射針へと入る可能性がより高くなる。一方、注射針の先端側は組織中に挿入されて組織の温度に加熱される。また、注射針の中間部分は、外気に接触することで加熱される場合もある。また、注射針の先端から出ようとする懸濁流体は組織によって直接的に加熱される。よって、懸濁流体の媒質流体は、注射針中を移動しながら高温Ｔ１となり、よって、より低い粘度（第１の粘度α１）となって、注射針の先からホスト組織中へと流入する。よって、前記の第２の問題が解決される。By providing the above characteristic configurations (I) and (II), the medium fluid of the suspension fluid has a higher viscosity (second viscosity α2) at a low temperature T2 in the container. Therefore, even if the extrusion mechanism operates very slowly to achieve an extremely small flow rate of 1 μL/sec or less, the medium fluid is more likely to enter the container from the container into the injection needle due to its high viscosity α2. On the other hand, the tip side of the injection needle is inserted into the tissue and heated to the temperature of the tissue. The middle part of the injection needle may also be heated by contact with the outside air. The suspension fluid trying to exit from the tip of the injection needle is directly heated by the tissue. Therefore, the medium fluid of the suspension fluid becomes a high temperature T1 while moving through the injection needle, and therefore becomes a lower viscosity (first viscosity α1) and flows from the tip of the injection needle into the host tissue. Thus, the second problem is solved.
以下、先ず、本発明の細胞注入装置を詳細に説明する。
図１に構成の一例を模式的に示すように、当該細胞注入装置は、生体組織１００中に移植細胞を注入するための装置であって、懸濁流体３０が収容された収容部１３と、注射針２０と、押出し機構（１０、５０）とを少なくとも有する。懸濁流体３０は、移植細胞３１が媒質流体３２中に分散してなるものである。押出し機構は、１〔μＬ／秒〕以下という極めて小さい流量Ｑ１でかつ遅い流速となるように、懸濁流体３０を注射針２０の先から流出させることができる。 First, the cell injection device of the present invention will be described in detail below.
As an example of the configuration is shown in Fig. 1, the cell injection device is a device for injecting transplant cells into a biological tissue 100, and includes at least a storage section 13 that stores a suspension fluid 30, an injection needle 20, and an extrusion mechanism (10, 50). The suspension fluid 30 is formed by dispersing transplant cells 31 in a medium fluid 32. The extrusion mechanism can cause the suspension fluid 30 to flow out from the tip of the injection needle 20 at an extremely small flow rate Q1 of 1 [μL/sec] or less and at a slow flow rate.
これにより、懸濁流体３０がホスト組織中に流入すると、媒質流体３２は組織液の流れと共に周囲の組織へと流れ去り、移植細胞だけが注入部位に残される。その結果、注入部位のホスト組織が受ける損傷は、注入された移植細胞だけの体積に応じた最小限のものとなる。よって、移植細胞の周囲に線維化組織が発生することが抑制され、移植細胞はホスト組織（またはホスト細胞）に接触して結合し、目的の治療効果が得られる。As a result, when the suspension fluid 30 flows into the host tissue, the medium fluid 32 flows away with the tissue fluid into the surrounding tissue, leaving only the transplanted cells at the injection site. As a result, damage to the host tissue at the injection site is minimized according to the volume of the injected transplanted cells alone. This prevents fibrotic tissue from developing around the transplanted cells, and the transplanted cells come into contact with and bind to the host tissue (or host cells), achieving the desired therapeutic effect.
（生体）
本発明によって移植細胞を注入する対象の生体は、特に限定はされず、植物および動物であってよい。上記した第２の問題を解決すべく、媒質流体として温度に応じて粘度が変わるものを用いる場合には、組織の温度が高い生体の方が、本発明の作用効果がより顕著に示される。そのような生体としては、種々の動物、とりわけ、恒温動物である哺乳類（ヒト、伴侶動物（イヌ、ネコ、ウサギ、げっ歯類、その他）、産業動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、その他）、実験用動物（げっ歯類、ヒト以外の霊長類）など）が例示される。(Living organism)
The subject living body into which transplant cells are injected according to the present invention is not particularly limited, and may be a plant or an animal. In order to solve the second problem described above, when a medium fluid whose viscosity changes depending on temperature is used, the effect of the present invention is more pronounced in living bodies with higher tissue temperatures. Examples of such living bodies include various animals, particularly mammals that are warm-blooded animals (humans, companion animals (dogs, cats, rabbits, rodents, etc.), industrial animals (cows, horses, pigs, sheep, etc.), and laboratory animals (rodents, non-human primates), etc.).
（懸濁流体）
懸濁流体３０は、媒質流体３２と、その中に分散した移植細胞３１を有する。媒質流体３２は、組織中に注入することが可能な流体または液体が利用可能である。媒質流体の詳細については、後述する。移植細胞３１は、媒質流体中に均一に分散することが好ましいが、沈降などによって、媒質流体中一部に偏っていてもよい。組織中に注入される懸濁流体の体積は、生体の種類によっても異なるが、例えば、ヒトの心臓の治療を目的として、心臓壁内に心筋細胞を注入する場合などでは、一回の注入量は、１０μＬ～２ｍＬ程度である。(Suspension Fluid)
The suspension fluid 30 has a medium fluid 32 and transplant cells 31 dispersed therein. The medium fluid 32 can be a fluid or liquid that can be injected into tissue. Details of the medium fluid will be described later. The transplant cells 31 are preferably uniformly dispersed in the medium fluid, but may be biased to a certain part of the medium fluid due to sedimentation or the like. The volume of the suspension fluid injected into the tissue varies depending on the type of living organism, but for example, when injecting cardiomyocytes into the heart wall for the purpose of treating a human heart, the amount injected at one time is about 10 μL to 2 mL.
（治療対象の疾患）
細胞注入による治療対象の疾患は、特に限定はされないが、例えば、神経、眼、循環器、腎、消化器、筋・骨格、皮膚などの分野における疾患が挙げられ、重症心不全、骨髄損傷、パーキンソン氏病、腎不全、網膜色素神経障害、筋無力症などが挙げられる。(Disease to be treated)
Diseases to be treated by cell injection are not particularly limited, but examples include diseases in the fields of nerves, eyes, circulatory system, kidneys, digestive system, musculoskeletal system, skin, etc., as well as severe heart failure, bone marrow damage, Parkinson's disease, renal failure, retinal pigment neuropathy, myasthenia gravis, etc.
（移植細胞）
移植細胞としては、特に限定はされないが、心筋細胞、神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、蛸足細胞、メサンギウム細胞、上皮細胞、内皮細胞、間質細胞、網膜色素細胞、視細胞、肝細胞、真皮細胞、組織幹細胞などが挙げられる。(transplanted cells)
Transplant cells include, but are not limited to, cardiomyocytes, neurons, astrocytes, oligodendrocytes, glial cells, octopus pod cells, mesangial cells, epithelial cells, endothelial cells, interstitial cells, retinal pigment cells, photoreceptor cells, hepatic cells, dermal cells, and tissue stem cells.
（懸濁流体に占める細胞の比率）
懸濁流体中の媒質流体と移植細胞との体積比率は、特に限定はされないが、移植時間（細胞注入装置からの流出時間）の短縮の点から、該体積比率（媒質流体の体積／移植細胞の体積）は、２～１０程度が好ましい。(Ratio of cells to the suspending fluid)
The volume ratio of the medium fluid to the transplanted cells in the suspension fluid is not particularly limited, but from the viewpoint of shortening the transplantation time (outflow time from the cell injection device), the volume ratio (volume of medium fluid/volume of transplanted cells) is preferably about 2 to 10.
（懸濁流体が注射針の先から流出するときの流量Ｑ１）
懸濁流体が注射針の先から流出するときの流量Ｑ１は、注入部位に流入する懸濁流体中の媒質流体がホスト組織中に好ましく流れ去る点から、１〔μＬ／秒〕以下が好ましく、そのときの流速は、例えば、９１〔ｍｍ／秒〕以下が好ましい。この９１〔ｍｍ／秒〕という流速は、市販の汎用的な注射針のうち最も細い注射針３０Ｇの内径０．１２〔ｍｍ〕と、前記の流量の上限値１〔μＬ／秒〕とから算出した、流速が最も高くなる組み合わせの例における値である。従来の細胞注入における流量は、数１０～数１００〔μＬ／秒〕程度の高速であったから、本発明で提唱する流量の上限は、１〔μＬ／秒〕を超えてもよいが、線維化の抑制を考慮して、流量の上限を１〔μＬ／秒〕としている。(Flow rate Q1 when the suspension fluid flows out from the tip of the injection needle)
The flow rate Q1 when the suspension fluid flows out from the tip of the injection needle is preferably 1 [μL/sec] or less, from the viewpoint that the medium fluid in the suspension fluid flowing into the injection site flows away into the host tissue, and the flow rate at that time is preferably 91 [mm/sec] or less. This flow rate of 91 [mm/sec] is the value in the example of the combination that gives the highest flow rate, calculated from the inner diameter of the 30G injection needle, which is the thinnest of commercially available general-purpose injection needles, 0.12 [mm], and the upper limit value of the flow rate of 1 [μL/sec]. Since the flow rate in conventional cell injection was high, about several tens to several hundreds [μL/sec], the upper limit of the flow rate proposed in the present invention may exceed 1 [μL/sec], but the upper limit of the flow rate is set to 1 [μL/sec] in consideration of the suppression of fibrosis.
該流量Ｑ１の下限は特に限定はされないが、該流量が過度に小さいと、治療に必要な移植細胞を全て注入するのに要する時間が無駄に長くなり、被験体にも負担となる。また、押出し機構の構成および／または制御の構成の点からも、過度に小さい送り量（流量）を達成するには、構成が複雑になり、達成が困難にもなり得る。そこで、これらの付帯的な理由に鑑み、本発明では、該流量の適当な下限の一例として、０．０１〔μＬ／秒〕を提案する。このときの流速の下限は、例えば、０．０１５〔ｍｍ／秒〕である。この０．０１５〔ｍｍ／秒〕という流速は、市販の汎用的な注射針のうち最も太い注射針１６Ｇの内径１．６５〔ｍｍ〕と、前記の流量の下限値０．０１〔μＬ／秒〕とから算出した、流速が最も低くなる組み合わせの例における値である。The lower limit of the flow rate Q1 is not particularly limited, but if the flow rate is too small, the time required to inject all the transplant cells required for treatment will be unnecessarily long, which will be a burden on the subject. In addition, in terms of the configuration of the extrusion mechanism and/or the configuration of the control, achieving an excessively small feed amount (flow rate) may be difficult because the configuration becomes complicated. In view of these incidental reasons, the present invention proposes 0.01 [μL/sec] as an example of an appropriate lower limit of the flow rate. The lower limit of the flow rate in this case is, for example, 0.015 [mm/sec]. This flow rate of 0.015 [mm/sec] is the value in an example of a combination that results in the lowest flow rate, calculated from the inner diameter of the 16G injection needle, which is the thickest of the commercially available general-purpose injection needles, 1.65 [mm], and the lower limit value of the flow rate, 0.01 [μL/sec].
以上の点からは、流量Ｑ１の好ましい範囲は、０．０１～１．０〔μＬ／秒〕が例示される。また、注入時間の適正化の点からは、０．０２～０．５〔μＬ／秒〕、さらには、０．０５～０．５〔μＬ／秒〕、さらには、０．０５～０．１〔μＬ／秒〕がより好ましい範囲として例示される。流速は、前記のように、使用される注射針の内径と流量から算出され得る。なお、注入すべき移植細胞の量や懸濁流体の量がごく微量であり、かつ、より高精度な押出し機構を用いることができるならば、０．００５〔μＬ／秒〕など、０．０１〔μＬ／秒〕よりもさらに小さい流量を下限とすることもでき、注入部位のホスト組織が受ける損傷を低減するという本発明の目的を達成しながら、懸濁流体を注入することができる範囲内で、流量を適宜に決定してよい。From the above viewpoints, the preferred range of the flow rate Q1 is 0.01 to 1.0 μL/sec. From the viewpoint of optimizing the injection time, the preferred range is 0.02 to 0.5 μL/sec, further 0.05 to 0.5 μL/sec, and further 0.05 to 0.1 μL/sec. As described above, the flow rate can be calculated from the inner diameter and flow rate of the injection needle used. If the amount of transplant cells or the amount of suspension fluid to be injected is very small and a more accurate extrusion mechanism can be used, the lower limit of the flow rate can be set to 0.005 μL/sec, or even lower than 0.01 μL/sec., and the flow rate can be appropriately determined within the range in which the suspension fluid can be injected while achieving the object of the present invention of reducing damage to the host tissue at the injection site.
（収容部）
収容部の態様や形は、後述の押出し機構の構成や押し出しの原理に関連し得、該収容部は、該押出し機構の一部であると解することもできる。図１に示す好ましい例では、収容部１３は、押出し機構の構成要素の１つであるシリンジ１０内の空間として設けられる。より詳細には、シリンジ１０はシリンダー１１とプランジャー１２とを有し、プランジャー１２は、ガスケット部１２ａとプランジャーロッド１２ｂとを有し、収容部１３は、シリンダー１１とガスケット部１２ａとによって形成される、シリンダー１１内の先端側の空間として設けられる。シリンジの各部の材料は、懸濁流体に悪影響を与えないものが利用可能であり、ガラス、プラスチック、金属など、従来公知の医療用のシリンジの材料を用いてよい。(Storage section)
The mode and shape of the storage part may be related to the configuration of the extrusion mechanism and the principle of extrusion described below, and the storage part may be considered to be a part of the extrusion mechanism. In a preferred example shown in FIG. 1, the storage part 13 is provided as a space in a syringe 10, which is one of the components of the extrusion mechanism. More specifically, the syringe 10 has a cylinder 11 and a plunger 12, the plunger 12 has a gasket part 12a and a plunger rod 12b, and the storage part 13 is provided as a space on the tip side of the cylinder 11 formed by the cylinder 11 and the gasket part 12a. Materials that do not adversely affect the suspension fluid can be used for each part of the syringe, and materials of conventionally known medical syringes, such as glass, plastic, and metal, may be used.
（収容部の容積）
収容部の容積は、注入すべき懸濁流体の体積（注入体積）であってよく、注入体積にデッドボリュームによるロス等を適宜加えた容積であってよい。例えば、ヒトの心臓壁、皮膚の真皮、脳または脊髄などに対して移植細胞の一般的な一回分の注入体積としては、１０〔μＬ〕～３〔ｍＬ〕程度が例示される。収容部の容積は、一回分の注入のための容積であってもよいし、同じ部位に時間をおいて複数回注入したり、異なる部位に次々と注入し得るような、より大きい容積であってもよい。また、収容部の容積は、単に注入体積よりも大きいだけであってもよく、注入体積は押出し機構によって決定され、注入後、収容部内に懸濁流体が残ってもよい。(Volume of storage section)
The volume of the container may be the volume of the suspension fluid to be injected (injection volume), or may be a volume obtained by appropriately adding loss due to dead volume to the injection volume. For example, a typical injection volume of transplant cells for a single injection into a human heart wall, dermis of the skin, brain, or spinal cord is about 10 μL to 3 mL. The volume of the container may be a volume for a single injection, or may be a larger volume that allows multiple injections at a time interval into the same site, or injections into different sites one after another. The volume of the container may simply be larger than the injection volume, and the injection volume may be determined by the extrusion mechanism, and the suspension fluid may remain in the container after injection.
（シリンダーの内径）
収容部がシリンジ内の空間として設けられる場合、該シリンジを構成するシリンダーの内径ｄ１は、特に限定はされないが、該内径ｄ１が過度に大きいと、プランジャーを微量だけ移動させるだけで、大量の懸濁流体が送りだされる結果となり、微小な流量を正確に制御することが困難になる場合がある。一方、該内径ｄ１が過度に小さいと、収容部の所定の容積を確保するためにシリンジが過度に長くなり、また、プランジャーの全移動距離も過度に大きくなり、好ましくない場合がある。
これらの点から、ヒトの心臓壁、皮膚の真皮、脳または脊髄などに対して移植細胞の通常の注入を一回行う場合、前記シリンダーの内径ｄ１は、３ｍｍ～１５ｍｍ程度が好ましく、４ｍｍ～１０ｍｍ程度がより好ましい。(cylinder inner diameter)
When the container is provided as a space inside a syringe, the inner diameter d1 of the cylinder constituting the syringe is not particularly limited, but if the inner diameter d1 is excessively large, a large amount of suspension fluid will be pumped out by moving the plunger only a small amount, which may make it difficult to accurately control a small flow rate. On the other hand, if the inner diameter d1 is excessively small, the syringe will be excessively long in order to ensure a predetermined volume of the container, and the total movement distance of the plunger will also be excessively large, which may be undesirable.
From these points of view, when a normal single injection of transplant cells into the human heart wall, dermis of the skin, brain or spinal cord, etc. is performed, the inner diameter d1 of the cylinder is preferably about 3 mm to 15 mm, more preferably about 4 mm to 10 mm.
（注射針）
本発明でいう「注射針」には、従来公知の医療用の注射針のみならず、上記した１〔μＬ／秒〕以下という極めて小さい流量Ｑ１にて懸濁流体を流出させ得る細管も含まれる。即ち、本発明でいう「注射針」は、必ずしも、皮膚を穿刺するための鋭利な先端を有していなくともよい。生体の外部から皮膚を貫通し得、懸濁流体をホスト組織中に注入する点では、注射筒の先端に装着される医療用の注射針（例えば、ＪＩＳ Ｔ３１０１－１９７９に規定されたもの）は好ましい態様である。注射針の形態は特に限定はされないが、図１に示すように、市販の標準的な医療用の注射針２０は、針管部２１と針基部２２とを有し、シリンダー１１に直接的に取り付けることが可能になっている。針管部の材料は、ステンレスなどの金属や、プラスチックが例示される。針基部とシリンダーとの着脱構造（ルアーテーパ、ルアーロックなど）も、従来公知のものを利用することができる。また、注射針は、シリンダーに対して、軟質のチューブなどを介して接続されてもよく、その場合には、必要量の懸濁流体が組織中に送達されるように、チューブ内のデッドボリュームが適宜考慮される。(syringe needle)
The "injection needle" in the present invention includes not only conventionally known medical injection needles, but also thin tubes capable of discharging the suspension fluid at an extremely small flow rate Q1 of 1 μL/sec or less. That is, the "injection needle" in the present invention does not necessarily have a sharp tip for puncturing the skin. A medical injection needle (e.g., one specified in JIS T3101-1979) attached to the tip of a syringe is a preferred embodiment in terms of being able to penetrate the skin from outside the living body and injecting the suspension fluid into the host tissue. The shape of the injection needle is not particularly limited, but as shown in FIG. 1, a commercially available standard medical injection needle 20 has a needle tube portion 21 and a needle base portion 22, and can be directly attached to a cylinder 11. Examples of materials for the needle tube portion include metals such as stainless steel and plastics. The detachable structure (luer taper, luer lock, etc.) between the needle base portion and the cylinder can also be a conventionally known one. The injection needle may also be connected to the cylinder via a soft tube or the like, in which case the dead volume within the tube is appropriately taken into consideration so that the required amount of suspension fluid is delivered into the tissue.
注射針の針管部の内径（注射針が単なる細い管である場合には、該管の内径）は、特に限定はされないが、組織の損傷をより小さくする点からは、針管部の内径はより小さい方が好ましい場合があり、一方、針管部の内径が過度に小さいと、移植細胞（細胞塊など）が通過できずダメージを受ける場合があり、また、収容部内において高粘度となった媒質流体が針管部内にスムーズには入らない場合もある。これらの点からは、針管部の内径は、０．０７ｍｍ～１．６５ｍｍ程度が好ましく、０．１２ｍｍ～０．５１ｍｍ程度がより好ましい。The inner diameter of the needle tube of the injection needle (the inner diameter of the tube when the injection needle is simply a thin tube) is not particularly limited, but in terms of minimizing damage to the tissue, a smaller inner diameter of the needle tube may be preferable. On the other hand, if the inner diameter of the needle tube is too small, transplant cells (cell masses, etc.) may not be able to pass through and may be damaged, and the medium fluid that has become highly viscous in the storage section may not enter the needle tube smoothly. From these points of view, the inner diameter of the needle tube is preferably about 0.07 mm to 1.65 mm, and more preferably about 0.12 mm to 0.51 mm.
（押出し機構）
押出し機構は、図１に示すように、収容部１３内の懸濁流体３０を、該収容部から注射針２０を通じて外部（即ち、注射針の先が挿入された組織中）へと押し出す作動を行うように構成され、かつ、該懸濁流体３０を注射針２０の先から１〔μＬ／秒〕以下の流量にて流出させるように構成または制御される。図１の例では、押出し機構は、シリンジ１０を有し、かつ、そのプランジャー１２をシリンダー１１内に所定の速度ｖ１〔ｍｍ／秒〕で押し込んで移動させるように作動する駆動源５０を有する。前記の所定の速度ｖ１〔ｍｍ／秒〕は、懸濁流体が上記した規定の流量Ｑ１（１〔μＬ／秒〕以下）にて、該注射針の先から流出するように、シリンダーの内径ｄ１〔ｍｍ〕に応じて設定されてよい。例えば、流量Ｑ１が１〔μＬ／秒〕である場合、プランジャーの移動速度ｖ１〔ｍｍ／秒〕は、次式から求めることができる。
Ｑ１＝１〔μＬ／秒〕＝｛（ｄ１）２π／４｝〔ｍｍ２〕×ｖ１〔ｍｍ／秒〕
上記した好ましいシリンダーの内径ｄ１におけるプランジャーの好ましい移動速度ｖ１〔ｍｍ／秒〕は、０．１４〔ｍｍ／秒〕以下であり、好ましくは、０．００３２～０．０２〔ｍｍ／秒〕程度が例示される。(Extrusion mechanism)
As shown in FIG. 1, the extrusion mechanism is configured to extrude the suspension fluid 30 in the container 13 from the container to the outside (i.e., into the tissue into which the tip of the needle is inserted) through the injection needle 20, and is configured or controlled to cause the suspension fluid 30 to flow out from the tip of the injection needle 20 at a flow rate of 1 [μL/sec] or less. In the example of FIG. 1, the extrusion mechanism has a syringe 10 and a drive source 50 that operates to push and move the plunger 12 into the cylinder 11 at a predetermined speed v1 [mm/sec]. The predetermined speed v1 [mm/sec] may be set according to the inner diameter d1 [mm] of the cylinder so that the suspension fluid flows out from the tip of the injection needle at the above-mentioned specified flow rate Q1 (1 [μL/sec] or less). For example, when the flow rate Q1 is 1 [μL/sec], the moving speed v1 [mm/sec] of the plunger can be calculated from the following formula.
Q1 = 1 [μL/sec] = {(d1)2 π/4} [mm2 ] x v1 [mm/sec]
The preferred moving speed v1 (mm/sec) of the plunger at the above-mentioned preferred inner diameter d1 of the cylinder is 0.14 (mm/sec) or less, and preferably, is exemplified to be about 0.0032 to 0.02 (mm/sec).
（押出し機構の駆動源）
押出し機構が、図１に示すようなシリンジ１０内の懸濁流体３０を送り出す機構（１０、５０）である場合、駆動源５０としては、上記移動速度ｖ１にて該シリンジのプランジャーを該シリンジの先端側へと後方側から押して（または、先端側から引っ張って）移動させるよう構成されたアクチュエーターが挙げられる。(Drive source of the extrusion mechanism)
When the extrusion mechanism is a mechanism (10, 50) for pumping out the suspension fluid 30 in a syringe 10 as shown in FIG. 1, the driving source 50 can be an actuator configured to push the plunger of the syringe from the rear side toward the tip side of the syringe (or pull it from the tip side) at the above-mentioned moving speed v1.
（押出し機構の駆動源の例１：液圧シリンダー)
上記アクチュエーターとしては、後述の図２に例示するように、作動液供給源からの作動液（水や作動オイルなど）の供給によってピストンが直線的に移動する液圧シリンダー（水圧シリンダー、油圧シリンダーなど）が例示される。液圧シリンダーにおける「シリンダー」は、シリンダーチューブと、その内部を直線的に移動するピストンと、該ピストンに連結されたピストンロッドとを少なくとも有するアクチュエーター装置を意味する。該ピストンロッドの先端部が、シリンジ１０のプランジャーロッドを押して移動させるように、該液圧シリンダーはシリンジ１０に連結される。図２（ｂ）の例では、医療用のシリンジ５０ａが液圧シリンダーとして転用されており、作動液供給源に配管（チューブ）５５で接続された注射針を通してシリンジ内に作動液が供給され、それにより、該シリンジのプランジャーロッド（ピストンロッド）がシリンジ１０のプランジャー１２を押すように構成されている。作動液供給源のポンプの作動液を送る原理は特に限定はされず、電動シリンジポンプや蠕動ポンプ（チューブポンプ）などが挙げられる。(Example 1 of the driving source for the extrusion mechanism: hydraulic cylinder)
As an example of the actuator, as shown in FIG. 2 described later, a hydraulic cylinder (water pressure cylinder, hydraulic cylinder, etc.) in which a piston moves linearly by supplying hydraulic fluid (water, hydraulic oil, etc.) from a hydraulic fluid supply source is exemplified. The "cylinder" in the hydraulic cylinder means an actuator device having at least a cylinder tube, a piston that moves linearly inside the cylinder tube, and a piston rod connected to the piston. The hydraulic cylinder is connected to the syringe 10 so that the tip of the piston rod pushes and moves the plunger rod of the syringe 10. In the example of FIG. 2(b), a medical syringe 50a is repurposed as a hydraulic cylinder, and hydraulic fluid is supplied into the syringe through an injection needle connected to a hydraulic fluid supply source by a piping (tube) 55, so that the plunger rod (piston rod) of the syringe pushes the plunger 12 of the syringe 10. The principle of pumping the working fluid of the working fluid supply source is not particularly limited, and examples thereof include an electric syringe pump and a peristaltic pump (tube pump).
（押出し機構の駆動源の例２：弾性体とダンパー)
上記アクチュエーターとして、後述の図３に例示するように、弾性体（図３の例では、引張りバネ）５８と、ダンパー（流体を封入した粘性ダンパーなど）５６とを組み合わせた機構が挙げられる。該弾性体５８は、原形状から変形した状態で配置され、ストッパー５９などで変形した状態に維持される。該弾性体５８は、原形状への復帰力が前記プランジャーを押して移動させるように配置される。一方、ダンパー５６は、その粘性抵抗によって前記プランジャーの移動に抵抗し、その移動の速度を上記移動速度ｖ１に制限するように配置される。弾性体の復帰力とダンパーの抵抗は、上記した規定の流量Ｑ１が達成される速度にて前記プランジャーを前記シリンジの先端側へと押して移動させるように選択される。該弾性体は圧縮バネであってもよく、その場合には、シリンジは、例えば、適当なハウジング内にセットされ、該圧縮バネは、プランジャーロッドの後方に圧縮変形した状態で配置される。該圧縮バネの一端はハウジングに接触し、他端はプランジャーに接触する。プランジャーの移動を阻止するストッパーは適宜に設けられる。図３の構成については下記で詳細に説明する。(Example 2 of the driving source for the push-out mechanism: Elastic body and damper)
As an example of the actuator, as shown in FIG. 3 described later, there is a mechanism that combines an elastic body (in the example of FIG. 3, a tension spring) 58 and a damper (such as a viscous damper filled with a fluid) 56. The elastic body 58 is arranged in a state deformed from its original shape, and is maintained in the deformed state by a stopper 59 or the like. The elastic body 58 is arranged so that the force of returning to the original shape pushes and moves the plunger. On the other hand, the damper 56 is arranged so that it resists the movement of the plunger by its viscous resistance and limits the speed of the movement to the above-mentioned moving speed v1. The return force of the elastic body and the resistance of the damper are selected so that the plunger is pushed and moved toward the tip side of the syringe at a speed at which the above-mentioned specified flow rate Q1 is achieved. The elastic body may be a compression spring, and in that case, the syringe is set, for example, in a suitable housing, and the compression spring is arranged in a compressed and deformed state behind the plunger rod. One end of the compression spring contacts the housing, and the other end contacts the plunger. A stopper for preventing the movement of the plunger is appropriately provided. The configuration of FIG.
アクチュエーターは、シリンジのプランジャーロッドを上記移動速度ｖ１で移動させ得るものであれば、上記の液圧公知の種々の精密直動装置が利用することができる。例えば、電動スピンドル装置やボールネジアクチュエーターなどは、制御されたモーターの回転運動を精密な直動運動に変換し得る。As long as the actuator can move the plunger rod of the syringe at the above-mentioned moving speed v1, various known hydraulic precision linear motion devices can be used. For example, an electric spindle device or a ball screw actuator can convert the rotational motion of a controlled motor into precise linear motion.
前記の所定の速度ｖ１は、駆動源が電気的または電子的な制御装置を有するならば、該制御装置に記憶または設定されてもよいし、また、モーターの回転数を決定する素子の値や、弾性定数とダンパーの減衰特性など、作動を決定する要素自体の特性によって設定されてもよい。If the drive source has an electrical or electronic control device, the predetermined speed v1 may be stored or set in the control device, or may be set by the characteristics of the element itself that determines the operation, such as the value of an element that determines the rotation speed of the motor, or the elastic constant and damping characteristics of a damper.
（収容部と押出し機構の他の態様）
収容部は、細いチューブ内の空間などであってもよい。この場合、該チューブ内に懸濁流体が充填され、該チューブの一端側に注射針が接続される。そして、他端側（懸濁流体の後ろ側）から、ポンプによって、押し出し用の作動流体が前記の極めて小さい流量Ｑ１にて該チューブ内に送り込まれる。これにより、懸濁流体は作動流体に押されて注射針から前記流量Ｑ１にて流出する。押し出し用の作動流体は、懸濁流体と容易に混ざり合わないような高い粘度のものであることが好ましく、懸濁流体の媒質流体を冷却して用いてもよい。また、このような態様で用いられるポンプは、シリンジポンプやチューブポンプ（蠕動ポンプ）など、押し出し用の作動流体の流量を正確に制御し得るものが利用可能である。(Other Aspects of the Storage Section and the Push-Out Mechanism)
The storage section may be a space in a thin tube. In this case, the tube is filled with a suspension fluid, and an injection needle is connected to one end of the tube. Then, a pump pumps a working fluid for pushing into the tube from the other end (behind the suspension fluid) at the extremely small flow rate Q1. As a result, the suspension fluid is pushed by the working fluid and flows out of the injection needle at the flow rate Q1. The working fluid for pushing is preferably one with a high viscosity that does not easily mix with the suspension fluid, and the medium fluid of the suspension fluid may be cooled before use. In addition, the pump used in this embodiment may be one that can accurately control the flow rate of the working fluid for pushing, such as a syringe pump or a tube pump (peristaltic pump).
当該細胞注入装置は、臨床において使い易く、少なくとも、懸濁流体が接触する部分がディスポーザブルであることが好ましい。このような点からは、注射針が接続されたシリンジや注射針が接続されたチューブが、ディスポーザブルであるように、駆動装置やポンプと着脱可能に接続した押出し機構は好ましい態様である。The cell injection device is preferably easy to use in clinical settings, and at least the parts that come into contact with the suspension fluid are disposable. From this perspective, a preferred embodiment is an extrusion mechanism that is detachably connected to a drive unit or pump, so that the syringe to which the injection needle is connected and the tube to which the injection needle is connected are disposable.
（懸濁流体に用いられる媒質流体）
媒質流体は、コラーゲン、ゼラチン、カラギーナン、人工ペプチド、高分子重合体、高分子複合体などが挙げられ、従来において移植細胞の注入に用いられていた液体であってもよい。ゼラチン等を用いる場合には、移植細胞を注入する対象の生体の生物種に適合するものを用いることが好ましい。特に、移植細胞を注入する対象の生体がヒトの場合は、人工的に合成されたヒトゼラチンを用いることが好ましい。(Medium fluid used in suspension fluid)
The medium fluid may be a liquid that has been used in the past for injecting transplant cells, such as collagen, gelatin, carrageenan, artificial peptides, high molecular weight polymers, and high molecular weight complexes. When gelatin or the like is used, it is preferable to use one that is compatible with the species of the target organism into which the transplant cells are to be injected. In particular, when the target organism into which the transplant cells are to be injected is a human, it is preferable to use artificially synthesized human gelatin.
（第２の問題を解決するための媒質流体）
上記した第２の問題を解決するためには、媒質流体は、次の（ａ１）、（ａ２）の条件を満たすことが好ましい。
（ａ１）媒質流体は、組織の温度を含む高温側の温度範囲である高温Ｔ１においては、第１の粘度α１を有する。第１の粘度α１は、ホスト組織中で組織液と共に速やかに流れ去ることができる粘度である点から、該組織液と同等またはそれより低い粘度であることが好ましい。
（ａ２）媒質流体は、高温Ｔ１よりも低い低温側の温度範囲である低温Ｔ２においては、第２の粘度α２を有する。第２の粘度α２は、第１の粘度α１よりも大きく、収容部内において、極めて遅い流れであっても、移植細胞を置き去りにすることなく、移植細胞を伴って注射針へと向うことができる高い粘度であることが好ましい。(Medium fluid for solving the second problem)
In order to solve the above-mentioned second problem, it is preferable that the medium fluid satisfies the following conditions (a1) and (a2).
(a1) The medium fluid has a first viscosity α1 at a high temperature T1, which is a high temperature range including the temperature of the tissue. The first viscosity α1 is preferably a viscosity equivalent to or lower than that of the tissue fluid, so that the first viscosity α1 can flow away quickly together with the tissue fluid in the host tissue.
(a2) The medium fluid has a second viscosity α2 at a low temperature T2, which is a temperature range on the low temperature side lower than the high temperature T1. The second viscosity α2 is preferably higher than the first viscosity α1 and is a high viscosity that allows the medium fluid to move toward the injection needle along with the transplanted cells without leaving the transplanted cells behind even in a very slow flow in the storage section.
（生体組織の温度）
組織（ホスト組織）の温度は、生体の種類や部位に応じて異なるが、例えば、ヒトの組織の温度は、２０～４２℃程度であり、例えば、マウスなどの組織の温度は、２０～４２℃程度であり、サルなどの組織の温度は、３６～４０℃程度である。
なお、生体の体温がそもそも低いためにホスト組織の温度も低い場合や、気温などの影響によってホスト組織の温度が低くなっている場合には、移植細胞の注入に臨んで、その生体に悪影響が及ばない範囲で該生体全体やホスト組織を温め、それにより、ホスト組織の温度をより高くしてもよい。(Tissue temperature)
The temperature of tissue (host tissue) varies depending on the type and part of the living body. For example, the temperature of human tissue is about 20 to 42°C, the temperature of mouse tissue is about 20 to 42°C, and the temperature of monkey tissue is about 36 to 40°C.
In addition, when the temperature of the host tissue is low because the body temperature of the living organism is low to begin with, or when the temperature of the host tissue is low due to the influence of air temperature or the like, the entire living organism or the host tissue may be warmed to an extent that does not adversely affect the living organism prior to injection of transplant cells, thereby raising the temperature of the host tissue.
（高温側の温度範囲Ｔ１）
高温Ｔ１は、前記した生体組織の温度を含む高温側の温度範囲であり、組織の温度や、外気の温度に応じて決定される。高温Ｔ１は、生体の種類や部位によっても異なるが、哺乳動物であれば、２０℃程度以上が好ましく、３０℃程度以上がより好ましい。
高温Ｔ１の上限側の範囲は、特に限定はされず、移植細胞の注入では特に必要のない温度であるが、生体機能維持などの点からは、４２℃程度以下が好ましく、４０℃程度以下がより好ましい。前記した下限と上限とを組み合わせた高温Ｔ１の範囲は、２０～４２℃、３０～４２℃、２０～４０℃、または、３０～４０℃など、自由に組み合わせることができる。(Higher temperature range T1)
The high temperature T1 is a high temperature range including the temperature of the biological tissue described above, and is determined according to the temperature of the tissue and the temperature of the outside air. The high temperature T1 varies depending on the type and part of the living body, but for mammals, it is preferably about 20° C. or higher, and more preferably about 30° C. or higher.
The upper limit range of high temperature T1 is not particularly limited and is not particularly required for the injection of transplant cells, but from the viewpoint of maintaining biological functions, it is preferably about 42° C. or less, and more preferably about 40° C. or less. The range of high temperature T1 combining the above-mentioned lower and upper limits can be freely combined, such as 20 to 42° C., 30 to 42° C., 20 to 40° C., or 30 to 40° C.
（低温側の温度範囲Ｔ２）
低温Ｔ２は、組織の温度よりも低い温度、さらには、外気の温度よりも低い温度として決定され得る。懸濁液の組成による粘度の増加およびゲル化の点からは、１０℃程度以下が好ましい温度として挙げられ、５℃程度以下がより好ましい温度として挙げられる。低温Ｔ２の下限側の温度は、特に限定はされないが、媒質流体が凍結しない温度である点や、移植細胞の保護の観点などからは、０℃程度以上が挙げられ、より好ましくは１℃程度以上が挙げられる。前記した下限側の範囲と上限側の範囲は、０～１０℃、１～１０℃、０～５℃、１～５℃など、自由に組み合わせることができる。(Low temperature range T2)
The low temperature T2 can be determined as a temperature lower than the temperature of the tissue, and further, a temperature lower than the temperature of the outside air. From the viewpoint of the increase in viscosity and gelation due to the composition of the suspension, a temperature of about 10°C or lower is preferred, and a temperature of about 5°C or lower is more preferred. The lower limit temperature of the low temperature T2 is not particularly limited, but from the viewpoint of the temperature at which the medium fluid does not freeze and the protection of the transplanted cells, a temperature of about 0°C or higher is preferred, and a temperature of about 1°C or higher is more preferred. The above-mentioned lower limit range and upper limit range can be freely combined, such as 0 to 10°C, 1 to 10°C, 0 to 5°C, and 1 to 5°C.
（媒質流体の粘度α１）
高温Ｔ１における第１の粘度α１は、ホスト組織中において、媒質流体が注入部位（注射針の先端開口のすぐ外側周囲）に留まらず、速やかにホスト組織中に流れ去ることができるような粘度である。このような第１の粘度α１としては、例えば、生体がヒトの場合には、高温Ｔ１（２１～４２℃程度以上）において、１０００〔ｍＰａ・ｓ〕以下が挙げられ、好ましくは０．５～１０００〔ｍＰａ・ｓ〕程度が挙げられる。他の生体の場合についても、第１の粘度α１は概ね同様である。(Viscosity of medium fluid α1)
The first viscosity α1 at high temperature T1 is a viscosity at which the medium fluid does not remain at the injection site (just outside the tip opening of the injection needle) in the host tissue, but can quickly flow away into the host tissue. For example, when the living body is a human, the first viscosity α1 at high temperature T1 (about 21 to 42°C or higher) is 1000 [mPa·s] or less, and preferably about 0.5 to 1000 [mPa·s]. For other living bodies, the first viscosity α1 is generally similar.
（媒質流体の粘度α２）
低温Ｔ２における第２の粘度α２は、第１の粘度α１よりも大きく、かつ、収容部内において、媒質流体が注射針へと押し出されることができ、移植細胞を収容部内に置き去りにすることなく、該移植細胞と共に注射針に流入できるような粘度である。このような第２の粘度α２としては、例えば、生体がヒトの場合には、低温Ｔ２（０～２０℃程度以下）において、５０００〔ｍＰａ・ｓ〕以上が挙げられ、好ましくは１００００～１００００００〔ｍＰａ・ｓ〕程度が挙げられる。(Viscosity of medium fluid α2)
The second viscosity α2 at low temperature T2 is greater than the first viscosity α1 and is a viscosity that allows the medium fluid to be pushed out into the injection needle in the container and to flow into the injection needle together with the transplant cells without leaving the transplant cells behind in the container. For example, when the living body is a human, the second viscosity α2 at low temperature T2 (0 to 20° C. or less) is 5,000 mPa·s or more, preferably 10,000 to 1,000,000 mPa·s.
高温Ｔ１の下限の温度は、第１の粘度α１が第２の粘度α２へと急激に転換する境界の温度（転移温度）であってよい。また、高温Ｔ１の下限の温度よりも、低温Ｔ２の上限の温度の方が低く、高温Ｔ１の下限の温度と、低温Ｔ２の上限の温度との間に、前記転移温度があってもよい。
第１の粘度α１、および、第２の粘度α２は、それぞれ一定であってよい。その場合、媒質流体は、該転移温度を境に、２種類の粘度を示す。
第１の粘度α１は、温度が上昇するにつれて下降してもよい。第２の粘度α２は、温度が下降するにつれて上昇してもよい。
第１の粘度α１と第２の粘度α２は、本発明の目的が達成されるような値であればよい。
媒質流体は、高温Ｔ１よりも高い温度において第１の粘度α１を有してよく、また、低温Ｔ２よりも低い温度において第２の粘度α２を有してよい。 The lower limit temperature of the high temperature T1 may be a boundary temperature (transition temperature) at which the first viscosity α1 rapidly changes to the second viscosity α2. The upper limit temperature of the low temperature T2 may be lower than the lower limit temperature of the high temperature T1, and the transition temperature may be between the lower limit temperature of the high temperature T1 and the upper limit temperature of the low temperature T2.
The first viscosity α1 and the second viscosity α2 may be constant. In this case, the medium fluid exhibits two types of viscosities on either side of the transition temperature.
The first viscosity α1 may decrease as the temperature increases, and the second viscosity α2 may increase as the temperature decreases.
The first viscosity α1 and the second viscosity α2 may have any value so long as the object of the present invention is achieved.
The medium fluid may have a first viscosity α1 at a temperature higher than a high temperature T1, and may have a second viscosity α2 at a temperature lower than a low temperature T2.
（粘度の測定方法）
本発明における粘度は、ＪＩＳ Ｚ８８０３に規定された「円すい－平板形回転粘度計による粘度測定方法」に基づいて測定される。前記の「円すい－平板形回転粘度計」は、コーンプレート型粘度計とも呼ばれる装置である。本明細書に記載した粘度の値は、円すい－平板形回転粘度計として、東機産業株式会社製のＴＶ２５形粘度計（機種番号：ＴＶＥ－２５Ｌ）を用いて測定した値である。(Method of measuring viscosity)
The viscosity in the present invention is measured based on the "Viscosity measurement method using a cone-plate type rotational viscometer" specified in JIS Z8803. The "cone-plate type rotational viscometer" is a device also called a cone-plate type viscometer. The viscosity values described in this specification are values measured using a TV25 type viscometer (model number: TVE-25L) manufactured by Toki Sangyo Co., Ltd. as a cone-plate type rotational viscometer.
（第２の問題を解決するための好ましい媒質流体の態様）
上記した高温Ｔ１における第１の粘度α１と、低温Ｔ２における第２の粘度α２とを有する好ましい媒質流体としては、収容部における低温Ｔ２ではゲルとなって第２の粘度α２を示し、注射針の先端部における高温Ｔ１ではゾルとなって第１の粘度α１を示すもの（以下、ゲル－ゾル変化流体ともいう）が挙げられる。なお、媒質流体がゲル－ゾル変化流体である場合、媒質流体は、収容部では低温Ｔ２に冷却されてゲル化し、流体ではなくなるが、本明細書では、ゲル化した媒質流体と呼ぶ。ゲル化した媒質流体は、例えば、シリンジ内に収容された状態でプランジャーによって押されると、注射針の基部開口に近い部分が容易に変形し、一体性が崩壊して、注射針内へと流れ出すことができるような性質である。(Preferable embodiment of medium fluid for solving the second problem)
A preferred medium fluid having the above-mentioned first viscosity α1 at high temperature T1 and the second viscosity α2 at low temperature T2 is one that gels at low temperature T2 in the container and exhibits the second viscosity α2, and sol at high temperature T1 in the tip of the injection needle and exhibits the first viscosity α1 (hereinafter also referred to as a gel-sol change fluid). When the medium fluid is a gel-sol change fluid, the medium fluid is cooled to low temperature T2 in the container and gels, and is no longer a fluid, but is referred to as a gelled medium fluid in this specification. The gelled medium fluid has such a property that, for example, when the medium fluid is contained in a syringe and pushed by a plunger, the part close to the base opening of the injection needle is easily deformed, the integrity is broken, and the medium fluid can flow into the injection needle.
（ゲル－ゾル変化流体）
本発明に利用可能なゲル－ゾル変化流体は、特に限定はされないが、移植細胞と生体組織に悪影響を与えない点から、ゼラチン水溶液、κカラギーナン水溶液、ιカラギーナン水溶液、多糖類、人工ペプチド、高分子重合体、高分子複合体等から選択されるゲル化剤の単体、もしくは上記ゲル化剤の混合物、さらには、グルコマンナン水溶液、ガラクトマンナン水溶液、キサンタンサンガム、カルボキシメチルセルロース水溶液、多糖類、人工ペプチド、高分子重合体、高分子複合体等のゲル化補助剤から選択される物質と、ゲル化剤の混合水溶液などが好ましいものとして挙げられる。(Gel-sol change fluid)
The gel-sol change fluid that can be used in the present invention is not particularly limited, but from the viewpoint of not adversely affecting transplanted cells and living tissues, preferred examples include a single gelling agent selected from gelatin aqueous solution, κ-carrageenan aqueous solution, ι-carrageenan aqueous solution, polysaccharides, artificial peptides, high molecular weight polymers, polymer complexes, etc., or a mixture of the above gelling agents, as well as a mixed aqueous solution of a gelling agent and a substance selected from gelling auxiliary agents such as glucomannan aqueous solution, galactomannan aqueous solution, xanthan gum, carboxymethylcellulose aqueous solution, polysaccharides, artificial peptides, high molecular weight polymers, polymer complexes, etc.
前記のゼラチン水溶液、カラギーナン水溶液、カルボキシメチルセルロース水溶液のそれぞれの好ましい濃度や添加物は、次のものが例示される。ゼラチン０．１～１０％（重量/容量）、カラギーナン（ι、κ型）０．０１～０．５％（重量/容量）、グルコマンナン水溶液またはガラクトマンナン水溶液０．０１～０．５％（重量/容量）、キサンタンサンガム０．０１～０．５％（重量/容量）、カルボキシメチルセルロース０．５～１２％（重量/容量）。Preferable concentrations and additives of the gelatin aqueous solution, carrageenan aqueous solution, and carboxymethylcellulose aqueous solution are as follows: gelatin 0.1-10% (weight/volume), carrageenan (ι, κ type) 0.01-0.5% (weight/volume), glucomannan aqueous solution or galactomannan aqueous solution 0.01-0.5% (weight/volume), xanthan gum 0.01-0.5% (weight/volume), carboxymethylcellulose 0.5-12% (weight/volume).
例えば、濃度５％（重量/容量）のゼラチン水溶液は、３０℃以上では、粘度１０００〔ｍＰａ・ｓ〕以下のゾルとなり、１０℃未満では、粘度１００００〔ｍＰａ・ｓ〕以上のゲルとなる。For example, a gelatin solution with a concentration of 5% (weight/volume) becomes a sol with a viscosity of 1,000 mPa·s or less at temperatures above 30°C, and becomes a gel with a viscosity of 10,000 mPa·s or more at temperatures below 10°C.
（冷却器）
図１に示すように、本発明の好ましい態様では、当該細胞注入装置には、収容部内の懸濁流体を低温Ｔ２に維持するように構成された冷却器または断熱材（以下、冷却器とも略す）４０が設けられる。後述のように、該冷却器４０は、単なる保冷剤や断熱材であってもよく、収容部を能動的に冷却する機能を有する冷却装置と保冷剤・断熱材とを組み合わせたものであってもよい。該冷却器４０の配置位置は特に限定はされないが、収容部を取り巻くように配置する態様が簡単であり好ましい。(cooler)
As shown in Fig. 1, in a preferred embodiment of the present invention, the cell injection device is provided with a cooler or insulator (hereinafter also referred to as cooler) 40 configured to maintain the suspension fluid in the storage unit at a low temperature T2. As described below, the cooler 40 may be a simple ice pack or insulator, or may be a combination of a cooling device having a function of actively cooling the storage unit and an ice pack/insulator. The position of the cooler 40 is not particularly limited, but a simple and preferred embodiment is one in which the cooler 40 is arranged so as to surround the storage unit.
上記した好ましい媒質流体を懸濁流体に用い、かつ、冷却器を備えることで、該懸濁流体は、収容部１３に収容されている状態では、低温に維持されて高い粘度α２を示し、前記の極めて小さい流量Ｑ１にて注射針２０の先から流出するときには、組織によって温められて低い粘度α１を示す。よって、上記したように、収容部１３に収容された懸濁流体３０は、移植細胞３１を含んだままで注射針２０に流入し得、また、懸濁流体３０が注射針２０から組織１００中に入ると、媒質流体３２は、組織液の流れと共に周囲の組織へと流れ去り、移植細胞だけが注入部位に残される。By using the above-mentioned preferred medium fluid as the suspension fluid and providing a cooler, the suspension fluid is maintained at a low temperature and exhibits a high viscosity α2 while contained in the storage section 13, and when it flows out of the tip of the injection needle 20 at the above-mentioned extremely small flow rate Q1, it is warmed by the tissue and exhibits a low viscosity α1. Therefore, as described above, the suspension fluid 30 contained in the storage section 13 can flow into the injection needle 20 while still containing the transplant cells 31, and when the suspension fluid 30 enters the tissue 100 from the injection needle 20, the medium fluid 32 flows away into the surrounding tissue together with the flow of tissue fluid, leaving only the transplant cells at the injection site.
（能動的な冷却機能）
冷却器の冷却原理や構成は、少なくとも注入の間、収容部を低温に保つことができるものであるならば特に限定はされず、従来公知の冷却装置、保冷剤、後述の断熱材が利用可能である。例えば、能動的に収容部および懸濁流体の温度を低温Ｔ２へと降下させることができる冷却器の構成としては、低温流体供給源から供給される低温（例えば、温度範囲Ｔ２）の流体が内部を流れる冷却用パイプ（好ましくは、熱伝導性が高い銅製やアルミニウム製のパイプなど）がコイル状や蛇行状にて収容部を取り巻く構成、ペルチェ素子（冷却側）を用いる構成、冷却された保冷剤を用いる構成などが例示され得る。これらの能動的な冷却器が収容部の周囲に設けられる場合、その冷却効率をより高めるために、該冷却器の周囲をさらに断熱材で取り囲んでもよい。(Active cooling function)
The cooling principle and configuration of the cooler are not particularly limited as long as they can keep the storage section at a low temperature at least during injection, and conventionally known cooling devices, ice packs, and heat insulating materials described below can be used. For example, examples of the configuration of the cooler that can actively lower the temperature of the storage section and the suspension fluid to a low temperature T2 include a configuration in which a cooling pipe (preferably a copper or aluminum pipe with high thermal conductivity) flows through the inside of the low-temperature fluid (for example, temperature range T2) supplied from a low-temperature fluid supply source, surrounds the storage section in a coiled or serpentine shape, a configuration using a Peltier element (cooling side), and a configuration using a cooled ice pack. When these active coolers are provided around the storage section, the cooler may be further surrounded by heat insulating material to further increase the cooling efficiency.
（保温機能）
冷却器は、収容部を能動的に冷却する機能を持たず、断熱性だけを有するものであってもよい。例えば、懸濁流体が入ったシリンジや収容部がそのまま外部の冷蔵庫で低温Ｔ２に冷却され、懸濁流体を注入する際に該シリンジが冷蔵庫から取り出される場合では、冷却器は、収容部（例えば、シリンダー）の周囲を取り巻く断熱材であってもよい。該断熱材は、独立した部品であってもよいし、収容部を構成する壁材など、収容部に一体的に組み込まれていてもよい。(heat retention function)
The cooler may be one that does not have the function of actively cooling the container, but only has thermal insulation properties. For example, in the case where the syringe containing the suspension fluid and the container are directly cooled to a low temperature T2 in an external refrigerator, and the syringe is removed from the refrigerator when the suspension fluid is injected, the cooler may be a thermal insulator surrounding the container (e.g., a cylinder). The thermal insulator may be an independent part, or may be integrally incorporated into the container, such as a wall material constituting the container.
（当該細胞注入装置の態様例１）
図２（ａ）は、当該細胞注入装置の好ましい態様の一例として、下記実施例で製作した細胞注入装置の構成を概略的に示す断面図である。図２（ｂ）は、図２（ａ）の装置の細部を改変した装置の外観を示す写真図である（作動原理は図２（ｂ）と同様である）。図２の態様では、懸濁流体３０を収容したシリンジ１０と、そのプランジャー１２を移動させる液圧シリンダー５０ａが、支持フレームＳ１に固定されて、両者は連結されている。作動液供給源５４から配管５５を通じて作動液（実施例では水）が液圧シリンダー５０ａに供給され、ピストン５２が直線的に移動し、ピストンロッド５３の先端部がシリンジ１０のプランジャー１２を押して移動速度ｖ１で移動させ、注射針２０の先端から懸濁流体３０が上記流量Ｑ１にて流出する。シリンジ１０の周囲には、冷却器４０として、銅製の冷却用パイプが密に巻き付けられており、収容部を低温Ｔ２に冷却している。冷却用パイプへは低温流体供給源（図示せず）から低温Ｔ２の流体が供給されている。作動液供給源５４は、自体の内部にポンプとしてシリンジを持っており、かつ、そのプランジャーを正確に移動させる装置を持っており、作動液を正確に送り出すことができる。図２（ａ）に示す態様では、シリンダー１１全体と冷却器４０が支持フレームＳ１内に収容されているのに対して、図２（ｂ）に示す態様では、シリンダー１１の全長のうち約３／４程度の部分が支持フレームＳ１の外側に突き出しており、その突き出した部分に銅製の冷却用パイプ４０が密に巻き付けられている。また、図２（ｂ）に示す態様では、支持フレームＳ１に連結器具Ｓ２が固定されている。該連結器具Ｓ２は、固定用スタンドのアームに当該細胞注入装置を連結し、角度や位置を微調整できるように構成されている。
以上のような構成によって、大掛かりで重い作動液供給源５４が、シリンジから分離され、注射針を生体に穿刺する操作の邪魔にならないので好ましい。(Example 1 of the cell injection device)
FIG. 2(a) is a cross-sectional view showing the configuration of a cell injection device produced in the following Example as an example of a preferred embodiment of the cell injection device. FIG. 2(b) is a photograph showing the appearance of a device in which the details of the device in FIG. 2(a) have been modified (the operating principle is the same as that in FIG. 2(b)). In the embodiment of FIG. 2, a syringe 10 containing a suspension fluid 30 and a hydraulic cylinder 50a for moving the plunger 12 are fixed to a support frame S1, and the two are connected. A hydraulic fluid (water in this embodiment) is supplied to the hydraulic cylinder 50a from a hydraulic fluid supply source 54 through a pipe 55, the piston 52 moves linearly, the tip of the piston rod 53 pushes the plunger 12 of the syringe 10 to move it at a moving speed v1, and the suspension fluid 30 flows out from the tip of the injection needle 20 at the flow rate Q1. A copper cooling pipe is tightly wound around the syringe 10 as a cooler 40, and the storage section is cooled to a low temperature T2. A low-temperature fluid T2 is supplied to the cooling pipe from a low-temperature fluid supply source (not shown). The working fluid supply source 54 has a syringe as a pump inside itself, and also has a device for accurately moving the plunger, so that the working fluid can be accurately delivered. In the embodiment shown in FIG. 2(a), the entire cylinder 11 and the cooler 40 are housed in the support frame S1, whereas in the embodiment shown in FIG. 2(b), about 3/4 of the total length of the cylinder 11 protrudes outside the support frame S1, and the copper cooling pipe 40 is tightly wound around the protruding portion. In the embodiment shown in FIG. 2(b), a connecting device S2 is fixed to the support frame S1. The connecting device S2 is configured to connect the cell injection device to the arm of the fixing stand, so that the angle and position can be finely adjusted.
With the above-mentioned configuration, the large-scale and heavy hydraulic fluid supply source 54 is separated from the syringe, and is preferable because it does not interfere with the operation of inserting the injection needle into the living body.
（当該細胞注入装置の態様例２）
図３は、当該細胞注入装置の好ましい態様の他の例を示す図である。図３の例では、押出し機構が交換可能なシリンジ１０である。該シリンジ１０のプランジャー１２を前進させるアクチュエーター５０は、上記移動速度ｖ１が作り出されるように、駆動力源となる引張りバネ５８と、移動速度を制限するための粘性ダンパー５６とが組み合わせられた構成を有する。(Example 2 of the cell injection device)
Fig. 3 is a diagram showing another example of a preferred embodiment of the cell injection device. In the example of Fig. 3, the extrusion mechanism is a replaceable syringe 10. The actuator 50 that advances the plunger 12 of the syringe 10 has a configuration in which a tension spring 58 that serves as a driving force source and a viscous damper 56 that limits the movement speed are combined so as to generate the above-mentioned movement speed v1.
図３の例では、粘性ダンパー５６とシリンジ１０とが、ハウジング６０中に同軸状にかつ直列に収容されている。駆動ロッド５７は、粘性ダンパー５６を貫通し、その先端部５７ａは、シリンジ１０のプランジャー１２の後端部１２ａに接触している。駆動ロッド５７の先端部５７ａと、シリンジ１０のプランジャー１２の後端部１２ａとは、互いに接触するだけの関係であってもよいが、ワンタッチカップリングなどを介して着脱自在に互いに固定される関係であってもよい。駆動ロッド５７はハウジング６０の上面（図の例では、蓋６３の上面）から突き出ており、その端部（後端部）にはフランジ５７ｂが設けられている。該フランジ５７ｂと、ハウジング６０との間には、駆動ロッド５７を図の下方に前進させる力を発生させるための引張りバネ５８が設けられており、該引張りバネ５８の両端はそれぞれ前記フランジ５７ｂと蓋６３に固定されている。これにより、駆動ロッド５７が人力等によって図の上方へと引っ張られると、引張りバネ５８が伸ばされて弾性エネルギーを蓄積し、復帰力によって駆動ロッド５７を前進させようとする。In the example of FIG. 3, the viscous damper 56 and the syringe 10 are coaxially and serially housed in the housing 60. The driving rod 57 passes through the viscous damper 56, and its tip 57a is in contact with the rear end 12a of the plunger 12 of the syringe 10. The tip 57a of the driving rod 57 and the rear end 12a of the plunger 12 of the syringe 10 may simply be in contact with each other, or may be detachably fixed to each other via a one-touch coupling or the like. The driving rod 57 protrudes from the upper surface of the housing 60 (the upper surface of the lid 63 in the example of the figure), and a flange 57b is provided at its end (rear end). A tension spring 58 is provided between the flange 57b and the housing 60 to generate a force that advances the driving rod 57 downward in the figure, and both ends of the tension spring 58 are fixed to the flange 57b and the lid 63, respectively. As a result, when the drive rod 57 is pulled upward in the figure by human force or the like, the tension spring 58 is stretched, storing elastic energy, and the return force tries to move the drive rod 57 forward.
図３の例では、駆動ロッド５７が引っ張られて、引張りバネ５８が伸ばされた状態にあり、該フランジ５７ｂと蓋６３との間にはストッパー５９が挿入され、引張りバネ５８の復帰（収縮）が妨げられている。一方、シリンジ１０は、懸濁流体３０を収容した状態でハウジング６０にセットされている。ストッパー５９が取り除かれると、当該細胞注入装置が作動を開始し、駆動ロッド５７が移動速度ｖ１で前進してプランジャー１２を押し、注射針２０の先端から懸濁流体３０が１〔μＬ／秒〕以下の流量にて流出する。In the example of FIG. 3, the drive rod 57 is pulled, the tension spring 58 is in an extended state, and a stopper 59 is inserted between the flange 57b and the lid 63 to prevent the tension spring 58 from returning (contracting). Meanwhile, the syringe 10 is set in the housing 60 with the suspension fluid 30 contained therein. When the stopper 59 is removed, the cell injection device starts to operate, the drive rod 57 advances at a moving speed v1 to push the plunger 12, and the suspension fluid 30 flows out from the tip of the injection needle 20 at a flow rate of 1 μL/sec or less.
（シリンジ）
シリンジ１０は、内部に懸濁液を収容した状態で、交換可能にハウジング内にセットされる。シリンジ１０は、従来公知の一般的な医療用のシリンジであってよいが、図３の例では、細胞の排出性を考慮した好ましい構成が内部に付与されている（後述）。(Syringe)
The syringe 10 is set in the housing in a replaceable manner with the suspension contained therein. The syringe 10 may be a conventionally known general medical syringe, but in the example of Fig. 3, a preferable configuration is provided inside in consideration of the dischargeability of cells (described later).
（粘性ダンパー）
粘性ダンパー５６の機構自体は、粘性流体がピストンの移動に抵抗する従来公知の粘性ダンパーの機構を参照することができる。図３の例では、粘性ダンパー５６のシリンダーは、円筒状の胴体５６ａと密閉キャップ５６ｂとによって構成されている。該シリンダー内には、適切に選択された粘度を持った粘性流体５６ｍが充填され密封されている。駆動ロッド５７は、該シリンダーを貫通しており、該粘性ダンパー５６のピストンロッドとしても機能する。該粘性ダンパー５６のシリンダー内では、ダンパー用のピストン５６ｐが該駆動ロッド５７に固定されており、シリンジにおけるガスケットの如くチャンバー内を摺動する。図では簡単に説明するために、駆動ロッド５７とピストン５６ｐとが一体であるように描いているが、シャフト部材（駆動ロッド５７）がピストン部材（ピストン５６ｐ）の中央孔を貫通した状態で両者が固定された構造であってよい。該ピストン５６ｐには微小な貫通孔５６ｈが設けられている。これにより、粘性流体５６ｍが該貫通孔５６ｈを通過することが可能になっており、よって、該ピストン５６ｐがチャンバー内を往復移動することができる。そして、粘性流体５６ｍが貫通孔５６ｈを通過するときの抵抗力によって、ピストン５６ｐの移動速度が上記移動速度ｖ１に制限される。貫通孔５６ｈの口径と、引張りバネ５８の復帰力と、粘性流体５６ｍの粘性は、上記移動速度ｖ１が達成されるように適宜に選択され得る。なお、引張りバネ５８が復帰するにつれて、復帰力が減少し、それに伴って駆動ロッド５７の移動速度も低下するが、上記移動速度ｖ１の範囲内であればよい。これに関連して、プランジャーの総移動距離をより小さく取り、引張りバネの自然長をより大きくとることで、引張りバネの復帰力の低下率を低減することができる。(Viscous damper)
The mechanism of the viscous damper 56 itself can refer to the mechanism of a conventionally known viscous damper in which a viscous fluid resists the movement of a piston. In the example of FIG. 3, the cylinder of the viscous damper 56 is composed of a cylindrical body 56a and a sealing cap 56b. The cylinder is filled with a viscous fluid 56m having an appropriately selected viscosity and sealed. The driving rod 57 penetrates the cylinder and also functions as the piston rod of the viscous damper 56. In the cylinder of the viscous damper 56, a piston 56p for the damper is fixed to the driving rod 57 and slides in the chamber like a gasket in a syringe. In the figure, the driving rod 57 and the piston 56p are drawn as if they were one unit for easy explanation, but the structure may be such that the shaft member (driving rod 57) penetrates the central hole of the piston member (piston 56p) and both are fixed. The piston 56p is provided with a small through hole 56h. This allows the viscous fluid 56m to pass through the through hole 56h, and therefore the piston 56p can reciprocate within the chamber. The resistance force of the viscous fluid 56m when passing through the through hole 56h limits the movement speed of the piston 56p to the movement speed v1. The diameter of the through hole 56h, the return force of the tension spring 58, and the viscosity of the viscous fluid 56m can be appropriately selected so that the movement speed v1 is achieved. As the tension spring 58 returns, the return force decreases, and the movement speed of the drive rod 57 also decreases accordingly, but this should be within the range of the movement speed v1. In relation to this, the reduction rate of the return force of the tension spring can be reduced by making the total movement distance of the plunger shorter and the natural length of the tension spring longer.
（粘性流体）
粘性ダンパー５６内の粘性流体５６ｍは、一般的な粘性ダンパー用のオイル、水、空気、種々の作動流体などであってよい。また、粘性流体５６ｍは、当該細胞注入装置全体を高温で滅菌することが可能であるように、耐熱性を有するものが好ましい。(viscous fluid)
The viscous fluid 56m in the viscous damper 56 may be oil, water, air, various working fluids, etc., for general viscous dampers. In addition, the viscous fluid 56m is preferably heat resistant so that the entire cell injection device can be sterilized at high temperatures.
（ハウジング）
ハウジング６０は、粘性ダンパー５６と駆動ロッド５７とを互いに同軸状に位置合わせした状態で保持する一種のホルダーであり、また、生体組織の表面（皮膚表面や臓器の表面など、ホスト組織の外面）の上に当該細胞注入装置を安定した状態でかつ所定の穿刺角度で配置することを可能にする支持体でもある。図３の例では、ハウジング６０は、生体組織の表面に安定して接触し得るように、上面６０ａよりも広い下面（接触面）６０ｂを持っており、よって、全体的には円錐台または角錐台の形状となっている。ハウジング６０の下面６０ｂには、シリンジ１０を交換可能に保持するためのシリンジ保持穴６１が設けられている。シリンジ保持穴６１内の所定位置にシリンジ１０を固定するための固定用部材、位置決め用の突起・段差などの付帯的な構造は、適宜に設けられてよい（図示は省略している）。一方、ハウジング６０の上面６０ａには、粘性ダンパー５６を収容するためのダンパー収容穴６２が設けられている。粘性ダンパー５６は、ダンパー収容穴６２内に固定されている。蓋６３は、ボルトやねじ込みなどによって、ハウジング６０に対して適宜に固定され得る。(housing)
The housing 60 is a kind of holder that holds the viscous damper 56 and the driving rod 57 in a state of being coaxially aligned with each other, and is also a support that enables the cell injection device to be placed on the surface of the biological tissue (the outer surface of the host tissue, such as the skin surface or the surface of an organ) in a stable state and at a predetermined puncture angle. In the example of FIG. 3, the housing 60 has a lower surface (contact surface) 60b that is wider than the upper surface 60a so that it can stably contact the surface of the biological tissue, and therefore has an overall shape of a truncated cone or pyramid. The lower surface 60b of the housing 60 is provided with a syringe holding hole 61 for holding the syringe 10 in an exchangeable manner. A fixing member for fixing the syringe 10 at a predetermined position in the syringe holding hole 61, and additional structures such as a protrusion or step for positioning may be provided as appropriate (not shown). On the other hand, the upper surface 60a of the housing 60 is provided with a damper accommodation hole 62 for accommodating the viscous damper 56. The viscous damper 56 is secured within a damper receiving bore 62. A lid 63 may be suitably secured to the housing 60 by bolts, screws or the like.
図３に示したハウジングの構造や形状は、あくまでも一例である。例えば、縦に２つに割れる構造など、内部に粘性ダンパーなどの必要な装置を組み込むことができるように、適宜に分解可能な構造、必要な位置に内部空間とそれを閉鎖する蓋を設けた構造、壁部が無い骨格だけの構造などを採用することができる。図２（ａ）に示した支持フレームＳ１は、前記ハウジングの一態様でもある。また、ハウジングの形状は、円柱状や多角柱状（三角柱状、四角柱状を含む）などのストレートな形状であってもよく、その胴体の下端面に生体組織の表面との接触を安定させるために側方に張り出したフランジ部や補助脚部が設けられていてもよい。The structure and shape of the housing shown in FIG. 3 are merely examples. For example, a structure that can be split vertically into two or other structures that can be disassembled as needed so that necessary devices such as a viscous damper can be installed inside, a structure with an internal space and a lid that closes it at a required position, or a structure with only a skeleton without walls can be used. The support frame S1 shown in FIG. 2(a) is also one embodiment of the housing. The shape of the housing may be a straight shape such as a cylindrical shape or a polygonal prism (including a triangular prism and a square prism), and the lower end surface of the body may be provided with a flange portion or auxiliary leg portion that protrudes laterally to stabilize contact with the surface of the biological tissue.
本発明の好ましい態様では、シリンジが低温に冷却され、その一方で、本発明に特有の超低速のインジェクションに起因して、ハウジングが生体組織の表面に接触する時間が長い。そこで、ハウジングが生体組織の表面を冷やさないように、または、生体組織の表面がハウジングを温めないように、ハウジング下面（生体組織の表面に接触する面）の表層を断熱性の材料で構成してもよい。In a preferred embodiment of the present invention, the syringe is cooled to a low temperature, while the housing is in contact with the surface of the biological tissue for a long time due to the ultra-low injection speed unique to the present invention. Therefore, the surface layer of the underside of the housing (the surface that contacts the surface of the biological tissue) may be made of a heat-insulating material so that the housing does not cool the surface of the biological tissue, or so that the surface of the biological tissue does not heat the housing.
（冷却器）
図３の例では、ハウジング６０の内部に冷却器６４が配置されている。冷却器６４は、ハウジング６０の内部に設けられた空間に冷却剤が直接的に充填されたものであってもよいし、冷却剤が柔軟なバッグや固いケースに収容されたものでもよい。前者の場合は、ハウジング６０ごと冷蔵庫で冷却してよい。後者の場合は、冷却剤入りのバッグだけを冷却して該空間に配置してもよい。また、冷却器として、種々の冷却装置が配置されていてもよい。冷却器６４はシリンジ１０に直接的に接触してもよいし、冷却器６４とシリンジ１０との間の材料を、熱伝導性の高い金属材料としてもよい。また、冷却器６４の外側を取り囲むハウジングの材料や部材を、断熱性の高いもの（例えば、プラスチック、発泡体、保温容器に用いられている真空２重構造など）としてもよい。(cooler)
In the example of FIG. 3, a cooler 64 is disposed inside the housing 60. The cooler 64 may be a space provided inside the housing 60 in which a coolant is directly filled, or a coolant may be accommodated in a flexible bag or a hard case. In the former case, the housing 60 may be cooled in a refrigerator. In the latter case, only a bag containing a coolant may be cooled and placed in the space. In addition, various cooling devices may be disposed as the cooler. The cooler 64 may be in direct contact with the syringe 10, or a material between the cooler 64 and the syringe 10 may be a metal material with high thermal conductivity. In addition, the material or member of the housing surrounding the outside of the cooler 64 may be a material with high thermal insulation (for example, plastic, foam, a vacuum double structure used in a thermal container, etc.).
図３の例では、ストッパー５９は、単純なブロック片のように描いているが、フランジ５７ｂをバランスよく支持できかつ着脱できるように、図における水平方向の断面の形状がＵ字状となったカラーなどであってもよい。また、ユーザーがスタートボタンなどを押すことによって、駆動ロッド５７の前進の阻止を解除するようにストッパー部材が移動する解除機構が設けられていてもよい。In the example of FIG. 3, the stopper 59 is depicted as a simple block piece, but it may be a collar with a U-shaped horizontal cross section in the figure so that it can support the flange 57b in a balanced manner and can be attached and detached. Also, a release mechanism may be provided in which the stopper member moves to release the blockage of the forward movement of the drive rod 57 when the user presses a start button or the like.
図２（ａ）の例において支持フレームＳ１に組み込まれたシリンジ１０とアクチュエーター（液圧シリンダー５０ａ）は、図３や図４に示したハウジング６０に組み込むことができる。換言すると、図３や図４に示した細胞注入装置におけるアクチュエーター（粘性ダンパーと引張りバネとを組み合わせた装置）は、図２に示したアクチュエーターに置き換えることができる。その場合、図２における液圧シリンダーは、図３のシリンジ１０のプランジャーを押すように、粘性ダンパーの代りにセットされ得、図２（ａ）における作動液供給源は、ハウジング６０の外部に配置されてよい。The syringe 10 and actuator (hydraulic cylinder 50a) assembled in the support frame S1 in the example of FIG. 2(a) can be assembled in the housing 60 shown in FIG. 3 or FIG. 4. In other words, the actuator (a device combining a viscous damper and a tension spring) in the cell injection device shown in FIG. 3 or FIG. 4 can be replaced with the actuator shown in FIG. 2. In that case, the hydraulic cylinder in FIG. 2 can be set in place of the viscous damper so as to push the plunger of the syringe 10 in FIG. 3, and the hydraulic fluid supply source in FIG. 2(a) can be disposed outside the housing 60.
図３に示した細胞注入装置を構成する各要素の材料は、特に限定はされず、金属、ポリマー、ガラス、セラミックなど、医療器具に用いられる材料が適宜利用可能である。The materials of the components constituting the cell injection device shown in Figure 3 are not particularly limited, and materials used in medical devices, such as metals, polymers, glass, and ceramics, can be used as appropriate.
（各部の好ましい態様１：ガスケット）
従来のシリンジでは、シリンダーの内側先端面（ここに、注射針へと通じる管路が開口している）は、漏斗状面となっており、プランジャーのガスケット部（硬質のゴム製）の先端面は該漏斗状面にフィットする凸状面となっている場合がある。しかしながら、そのような従来のシリンジで懸濁流体を最後まで注入すると、ガスケット部の先端面全体がシリンダーの内側先端面全体に一度に密着する。ガスケット部の先端面と、シリンダーの内側先端面とが、一度に全面的に互いに接触することによって、接触の瞬間には、それら両面の間に多くの移植細胞が残され、挟まれて破壊されてしまう。(Preferable embodiment 1 of each part: gasket)
In a conventional syringe, the inner tip surface of the cylinder (where the duct leading to the injection needle opens) may be a funnel-shaped surface, and the tip surface of the gasket part (made of hard rubber) of the plunger may be a convex surface that fits the funnel-shaped surface. However, when the suspension fluid is injected to the end with such a conventional syringe, the entire tip surface of the gasket part is in close contact with the entire inner tip surface of the cylinder at once. The tip surface of the gasket part and the inner tip surface of the cylinder come into full contact with each other at once, and at the moment of contact, many transplant cells are left between the two surfaces, and are pinched and destroyed.
そこで本発明では、図３に示すように、ガスケット部が２層構造（１２ａ１、１２ａ２）として設けられる。この２層構造は、プランジャーとしてのシール性および摺動性を有する硬質のゴム製の部分１２ａ１と、その先端側に接合された先端部材１２ａ２とを有する。この先端部材１２ａ２は、硬質のゴム製の部分１２ａ１に比べてより軟質で柔軟性を有する材料からなる。該先端部材１２ａ２の先端面は、平坦面（プランジャーの中心軸線に垂直な面）、または、シリンダーの前記漏斗状面にフィットしないような緩やかな凸状である。ここでは説明のために単純な２層構造として説明しているが、接着剤層などの機能層がさらに加えられた多層構造であってもよい。In the present invention, therefore, as shown in FIG. 3, the gasket portion is provided as a two-layer structure (12a1, 12a2). This two-layer structure has a hard rubber portion 12a1 that has the sealing and sliding properties of a plunger, and a tip member 12a2 that is joined to the tip side of the hard rubber portion 12a1. This tip member 12a2 is made of a material that is softer and more flexible than the hard rubber portion 12a1. The tip surface of the tip member 12a2 is a flat surface (a surface perpendicular to the central axis of the plunger) or a gently convex shape that does not fit the funnel-shaped surface of the cylinder. Here, a simple two-layer structure is described for the sake of explanation, but a multi-layer structure with an additional functional layer such as an adhesive layer may also be used.
以上の構成により、プランジャーが先端方向に移動して、ガスケット部がシリンダーの内側先端面（漏斗状面）に到達すると、先ず、シリンダーの漏斗状面と、ガスケット部の平坦面とによって、円錐状のスペースが残され、移植細胞は潰されない。次に、プランジャーがさらに先端方向に移動すると、軟質で柔軟性を有する先端部材１２ａ２は、該漏斗状面１１ａに応じて凸状へと変形し、外周縁側から中央側へと順に該漏斗状面に密着していき、最後には、該漏斗状面に全面的にフィットするまで変形する。よって、円錐状のスペースに残された懸濁流体中の移植細胞もまた、外周縁側から中央側へと順に移動させられ、よって、全ての移植細胞をシリンダー内から注射針内へ移動させることが可能となる。また、このようなガスケット部の２層構造は、本発明の細胞注入装置のみならず、従来公知の細胞注入用のプランジャーのガスケット部にも適用されてよい。With the above configuration, when the plunger moves toward the tip and the gasket reaches the inner tip surface (funnel-shaped surface) of the cylinder, a cone-shaped space is left by the funnel-shaped surface of the cylinder and the flat surface of the gasket, and the transplant cells are not crushed. Next, when the plunger moves further toward the tip, the soft and flexible tip member 12a2 deforms into a convex shape according to the funnel-shaped surface 11a, and gradually adheres to the funnel-shaped surface from the outer edge side to the center side, and finally deforms until it fits completely against the funnel-shaped surface. Therefore, the transplant cells in the suspension fluid left in the cone-shaped space are also moved from the outer edge side to the center side, and therefore it is possible to move all the transplant cells from inside the cylinder into the injection needle. In addition, such a two-layer structure of the gasket part may be applied not only to the cell injection device of the present invention, but also to the gasket part of a conventionally known cell injection plunger.
上記のガスケットの先端部材１２ａ２の厚さ（プランジャーの中心軸方向の寸法）は、シリンダーの前記凹状面にフィットする点から、少なくともシリンダーの前記漏斗状面の深さ（プランジャーの中心軸方向の寸法）以上の寸法であることが好ましい。The thickness of the tip member 12a2 of the gasket (the dimension in the direction of the central axis of the plunger) is preferably at least equal to or greater than the depth of the funnel-shaped surface of the cylinder (the dimension in the direction of the central axis of the plunger) in order to fit the concave surface of the cylinder.
また、上記のガスケットの先端部材１２ａ２の材料は、特に限定はされず、従来公知のシリンジのプランジャー先端に付与されるガスケットの材料（エラストマーなど）が利用可能である。また、その軟質および柔軟性は、プランジャーの押圧力に応じて適宜決定してよいが、例えば、タイプＣデュロメーター(SRIS 0101 / ASKER C)で測定した硬度５～２５が挙げられる。The material of the gasket tip member 12a2 is not particularly limited, and may be any of the materials (elastomers, etc.) used for gaskets attached to the plunger tips of conventionally known syringes. The softness and flexibility of the gasket may be determined appropriately according to the pressure of the plunger, and may be, for example, a hardness of 5 to 25 as measured with a type C durometer (SRIS 0101/ASKER C).
（各部の好ましい態様２：当該装置と生体表面との間に介在する第１の支持部材）
心臓壁等は、注射針を押し込んでも、筋肉の収縮力によって該注射針は押し戻される。従来では、心臓壁等に薬剤や移植細胞などを注入する際には、人力で（即ち、一方の手で）シリンジを所定の位置に保持しながら、手動で（即ち、他方の手で）ピストンを押し下げるといった操作を行っていた。しかし、そのような操作では、シリンジを安定して保持することが困難であり、薬剤や移植細胞などの注入も困難であった。(Preferred aspect 2 of each part: First support member interposed between the device and the surface of the living body)
Even if the injection needle is pushed into the heart wall, the needle is pushed back by the contraction force of the muscle. Conventionally, when injecting medicine, transplant cells, etc. into the heart wall, the syringe was held in a predetermined position by hand (i.e., with one hand) while the piston was manually pushed down (i.e., with the other hand). However, such an operation makes it difficult to hold the syringe stably, and also makes it difficult to inject medicine, transplant cells, etc.
そこで本発明では、図４に示すように、当該細胞注入装置１のシリンジのシリンダー１１の外側先端部の前方に、第１の支持部材７０が設けられる。図４に示した細胞注入装置１は、ハウジング６０の形状が円柱状または角柱状であることを除いては、図３に示した細胞注入装置と同様の構成を有する。第１の支持部材７０は、注射針（針管部２１）を生体組織１００に穿刺したときに、該生体組織の表面１００ａとハウジング６０（または、シリンダー１１）との間に介在する。第１の支持部材７０は、生体組織の表面１００ａに、直接的にまたは接着剤層（図示せず）を介して接触するための対物面７０ａを有する。対物面７０ａは、平坦な面であってもよいし、生体組織の表面の形状に応じて湾曲した面であってもよいし、生体組織の表面の形状に応じて湾曲し得る柔軟な表層を持っていてもよい。注射針は、第１の支持部材７０を貫通し、対物面７０ａから突き出している。In the present invention, as shown in FIG. 4, a first support member 70 is provided in front of the outer tip of the cylinder 11 of the syringe of the cell injection device 1. The cell injection device 1 shown in FIG. 4 has the same configuration as the cell injection device shown in FIG. 3, except that the shape of the housing 60 is cylindrical or prismatic. The first support member 70 is interposed between the surface 100a of the biological tissue and the housing 60 (or the cylinder 11) when the injection needle (needle tube portion 21) is punctured into the biological tissue 100. The first support member 70 has an objective surface 70a for contacting the surface 100a of the biological tissue directly or via an adhesive layer (not shown). The objective surface 70a may be a flat surface, a surface curved according to the shape of the surface of the biological tissue, or a flexible surface layer that can be curved according to the shape of the surface of the biological tissue. The injection needle penetrates the first support member 70 and protrudes from the objective surface 70a.
第１の支持部材７０が設けられることによって、生体組織の表面１００ａに対する当該細胞注入装置１の接触面がより広く平坦になり、当該細胞注入装置１をより安定して保持することができる。第１の支持部材７０は、生体組織の表面に注射針を穿刺する部分を取り巻いて、外部に流れ出した血液が周囲に拡散するのを防止する作用をも示すことができる。第１の支持部材を設ける構成は、本発明の細胞注入装置のみならず、従来公知の細胞注入用のシリンジにも設けられてよい。By providing the first support member 70, the contact surface of the cell injection device 1 with the surface 100a of the biological tissue becomes wider and flatter, and the cell injection device 1 can be held more stably. The first support member 70 surrounds the part where the injection needle punctures the surface of the biological tissue, and can also act to prevent blood that has flowed out to the outside from diffusing to the surroundings. The configuration in which the first support member is provided may be provided not only in the cell injection device of the present invention, but also in a conventionally known syringe for cell injection.
第１の支持部材７０の材料は、特に限定はされないが、支持部材として機能し得る剛性や硬さと機械的強度を有するものが挙げられ、ステンレスなどの金属材料やプラスチックなどが例示される。The material of the first support member 70 is not particularly limited, but examples include materials that have the rigidity, hardness, and mechanical strength to function as a support member, such as metal materials such as stainless steel and plastics.
本発明の好ましい態様では、図４に示す第１の支持部材７０の対物面７０ａに接着剤層（図示せず）が付与される。これにより、第１の支持部材７０は、生体組織の表面１００ａに固定され、シリンジを所定位置に保持するための人力を加える必要が無くなる。
接着剤層の材料（接着剤、粘着剤）としては、生体適合性を有する材料が好ましく、例えば、コラーゲンスポンジなどが挙げられる。 In a preferred embodiment of the present invention, an adhesive layer (not shown) is applied to the object surface 70a of the first support member 70 shown in Figure 4. This secures the first support member 70 to the surface 100a of the biological tissue, eliminating the need to apply manual force to hold the syringe in place.
The material for the adhesive layer (adhesive, pressure sensitive adhesive) is preferably a biocompatible material, for example, collagen sponge.
前記の接着剤層は、移植細胞の注入操作後に、支持部材７０から剥がれて生体組織の表面１００ａに残るように構成されてよく、これにより、針を抜いた後の生体組織の表面の穴から血が出るのを防止する作用（止血作用）と穿刺中に針の周囲から血が吹出すのを防止する作用（逆流防止作用）をも示すことができる。このような構成は、本発明の細胞注入装置のみならず、従来公知の細胞注入用のシリンジにも設けられてよい。The adhesive layer may be configured to peel off from the support member 70 and remain on the surface 100a of the biological tissue after the transplant cell injection operation, thereby exhibiting the effect of preventing blood from leaking from the hole on the surface of the biological tissue after the needle is removed (hemostatic effect) and the effect of preventing blood from spurting out around the needle during puncture (anti-backflow effect). This configuration may be provided not only in the cell injection device of the present invention, but also in conventionally known syringes for cell injection.
（第１の支持部材による注射針の傾き）
本発明の好ましい態様では、図４に示すように、第１の支持部材７０の対物面７０ａと、該対物面から突き出す針管部２１とのなす角度θ１が９０度ではなく傾いた角度である。図４の例では、第１の支持部材７０の上面７０ｂと対物面７０ａとは、互いに平行ではなく、第１の支持部材７０の全体的な形状がクサビ形になっている。該角度θ１は、特に限定はされないが、鋭角側では、２０～７０度が好ましい。これにより、筋肉の走行に沿って針を挿入することで、侵襲を避けかつ、針の抜けを防止し、長く挿入長を取ることが出来るので、体液の針管内への逆流を防止できるという作用効果が得られる。なお、該角度θ１が前記の上限を超えて直角に近くなると針が抜け易くなり、また、針を抜いた後に移植した細胞が穿刺した穴から漏れる可能性が高くなる。一方、該角度θ１が前記の下限を超えて過度に小さくなると、細胞を注入すべき部位が生体組織の表面から深い位置にある場合に、該部位への到達が困難となるか、長い針が必要となるので好ましくない。(Inclination of the injection needle by the first support member)
In a preferred embodiment of the present invention, as shown in FIG. 4, the angle θ1 between the objective surface 70a of the first support member 70 and the needle tube portion 21 protruding from the objective surface is an inclined angle rather than 90 degrees. In the example of FIG. 4, the upper surface 70b and the objective surface 70a of the first support member 70 are not parallel to each other, and the overall shape of the first support member 70 is wedge-shaped. The angle θ1 is not particularly limited, but is preferably 20 to 70 degrees on the acute angle side. This makes it possible to insert the needle along the course of the muscle, avoiding invasion, preventing the needle from coming out, and allowing a long insertion length, thereby obtaining the effect of preventing backflow of body fluids into the needle tube. Note that if the angle θ1 exceeds the upper limit and becomes close to a right angle, the needle becomes more likely to come out, and the transplanted cells become more likely to leak from the punctured hole after the needle is removed. On the other hand, if the angle θ1 is excessively small beyond the lower limit, when the site to which the cells are to be injected is located deep below the surface of the biological tissue, it becomes difficult to reach the site or a long needle is required, which is not preferable.
（注射針の湾曲）
また、本発明の好ましい態様では、図５（ａ）に示すように、注射針の針管部２１が円弧をなして湾曲しており、該円弧の中心角は好ましくは４５～９０度であり、より好ましくは６０～８５度である。図５（ａ）の例では、第１の支持部材７０は単純な板状であり、対物面７０ａの端に、前記の湾曲した針管部２１を組織１００に好ましく挿入するための回転中心軸部として機能するエッジ部７０ｄを有する。このエッジ部７０ｄの態様は、特に限定はされないが、例えば、次の（ｉ）、（ｉｉ）が例示される。
（ｉ）図５（ａ）に示すように、針管部２１の円弧の中心点（図では、エッジ部を示す点７０ｄと一致する点）を通過し、かつ、該円弧を含む平面（図では紙面）に直交する中心軸線（即ち、図の紙面に直交する直線）と一致して延びる、鋭い角を持った稜線。
（ｉｉ）図５（ｂ）に示すように、前記円弧の中心点７０ｃを通過しかつ該円弧を含む平面に直交する中心軸線を内部に包含し、該中心軸線に沿って延び、かつ、該中心軸線と同心状に丸みを帯びた稜線７０ｄ。(Bending of the needle)
In a preferred embodiment of the present invention, as shown in Fig. 5(a), the needle tube portion 21 of the injection needle is curved in an arc, and the central angle of the arc is preferably 45 to 90 degrees, and more preferably 60 to 85 degrees. In the example of Fig. 5(a), the first support member 70 is a simple plate, and has an edge portion 70d at the end of the objective surface 70a, which functions as a rotation central axis portion for preferably inserting the curved needle tube portion 21 into the tissue 100. The embodiment of this edge portion 70d is not particularly limited, and examples thereof include the following (i) and (ii).
(i) As shown in Figure 5 (a), a ridgeline having a sharp corner passes through the center point of the arc of the needle tube portion 21 (a point that coincides with point 70d indicating the edge portion in the figure) and extends in line with a central axis line (i.e., a straight line perpendicular to the plane of the paper in the figure) that includes the arc.
(ii) As shown in FIG. 5(b), a ridge line 70d that includes a central axis that passes through the center point 70c of the arc and is perpendicular to a plane including the arc, extends along the central axis, and is rounded concentrically with the central axis.
針管部２１が円弧をなして湾曲し、かつ、第１の支持部材７０がエッジ部７０ｄを有する構成によって、図５（ｃ）、図５（ｄ）に示すように、エッジ部７０ｄを中心（支点）とする回転操作によって、針管部を組織内に円弧の軌道に沿って挿入することができ、また、針管部を組織内から円弧の軌道に沿って引き抜くことが可能である。この操作は、より詳細には、次のように行われる。図５（ｃ）に示すように、組織の表面１００ａの上に当該細胞注入装置１を寝かせた状態で、第１の支持部材７０のエッジ部７０ｄを該表面１００ａに接触させる。図５（ｃ）、図５（ｄ）における第１の支持部材７０は、図４の例と同様、くさび型である。次に、図５（ｄ）に示すように、該エッジ部７０ｄが支点（回転中心軸線）となるように、当該細胞注入装置１を回転させながら起こす。これにより、針管部２１は組織１００内に円弧の軌道に沿って入って行くことができる。図５（ｄ）に示すように、組織１００内に入った円弧状の針管部２１は、たとえ該組織が収縮しても、該針管部２１を円弧の軌道に沿って押し戻す力にはなり難い。よって、該針管部２１が組織から抜けることが抑制される。The needle tube portion 21 is curved in an arc and the first support member 70 has an edge portion 70d. As shown in Fig. 5(c) and Fig. 5(d), the needle tube portion can be inserted into the tissue along the arc trajectory by rotating the edge portion 70d as the center (fulcrum), and the needle tube portion can be pulled out from the tissue along the arc trajectory. More specifically, this operation is performed as follows. As shown in Fig. 5(c), the edge portion 70d of the first support member 70 is brought into contact with the surface 100a of the tissue while the cell injection device 1 is laid on the surface 100a. The first support member 70 in Fig. 5(c) and Fig. 5(d) is wedge-shaped, as in the example in Fig. 4. Next, as shown in Fig. 5(d), the cell injection device 1 is rotated and raised so that the edge portion 70d becomes the fulcrum (rotation center axis). This allows the needle tube portion 21 to enter the tissue 100 along the arc trajectory. As shown in FIG. 5(d), the arc-shaped needle tube portion 21 that has entered the tissue 100 is unlikely to exert a force that pushes the needle tube portion 21 back along the arc trajectory even if the tissue contracts. This prevents the needle tube portion 21 from coming out of the tissue.
上記（ｉ）のエッジ部は、例えば、直角をなす角部など、鋭利なエッジ（稜線状）であってもよいし、丸みを帯びたエッジ部（その表面に中心軸線が存在する）であってもよい。丸みを帯びたエッジ部の場合、当該細胞注入装置を回転させながら起こすと、中心軸線は、厳密には、回転運動の中心からずれる。しかし、丸みの曲率半径を適宜に小さく設計することによって、そのような回転運動の中心からのずれを無視することができる。上記（ｉｉ）のエッジ部の丸みの曲率半径も同様である。また、上記（ｉ）、（ｉｉ）のエッジ部に、前記丸みの曲率半径と同程度の半径を持った回転可能なローラー（図示せず）が付与されてもよく、回転中心軸部の位置をより不動にするヒンジ（図示せず）が設けられてもよい。The edge portion of (i) above may be, for example, a sharp edge (ridge-like), such as a right-angled corner, or may be a rounded edge portion (having a central axis on its surface). In the case of a rounded edge portion, when the cell injection device is raised while rotating, the central axis will, strictly speaking, deviate from the center of the rotational motion. However, by designing the radius of curvature of the roundness to be appropriately small, such deviation from the center of the rotational motion can be ignored. The same applies to the radius of curvature of the roundness of the edge portion of (ii) above. In addition, the edge portions of (i) and (ii) above may be provided with rotatable rollers (not shown) having a radius approximately equal to the radius of curvature of the roundness, and a hinge (not shown) that makes the position of the rotational central axis more immobile may be provided.
図５（ｃ）、（ｄ）に示すように、第１の支持部材７０にエッジ部７０ｄを付与する構成は、図４に示した構成と組み合わせてもよい。As shown in Figures 5(c) and (d), the configuration in which an edge portion 70d is provided on the first support member 70 may be combined with the configuration shown in Figure 4.
針管部２１の円弧の半径は、適用部位に応じて適宜決定してよいが、例えば、４～１０〔ｍｍ〕程度が有用であり、５～８〔ｍｍ〕程度が特に有用である。
第１の支持部材７０に設けられるエッジ部の全長は、特に限定はされないが、安定した回転中心軸部として機能する点からは、４～１５〔ｍｍ〕程度が好ましい。 The radius of the arc of the needle tube portion 21 may be appropriately determined depending on the application site, but for example, a radius of about 4 to 10 mm is useful, and a radius of about 5 to 8 mm is particularly useful.
The overall length of the edge portion provided on the first support member 70 is not particularly limited, but is preferably about 4 to 15 mm in terms of functioning as a stable rotation central shaft portion.
図５の例では、シリンジの前方に位置する第１の支持部材７０にエッジ部７０ｄが付与されたが、第２の支持部材（図示せず）として、シリンダーから側方へと延びる任意の部材が設けられ、その先端に、上記（ｉ）または（ｉｉ）のエッジ部が設けられてもよい。In the example of FIG. 5, an edge portion 70d is provided to the first support member 70 located in front of the syringe, but any member extending laterally from the cylinder may be provided as a second support member (not shown), and the edge portion (i) or (ii) described above may be provided at the tip of the second support member.
（当該細胞注入装置の態様例３）
図６は、当該細胞注入装置の好ましい態様のその他の例を示す断面図である。図６の例では、押出し機構として浸透圧ポンプが用いられている。本発明でいう浸透圧ポンプは、半透膜や多孔質膜などの液体透過膜８３を介して互いに隣接する第１室８１と第２室８２とを有し、浸透圧（または浸透圧差）を液体移動の駆動源として、第１室８１内の液体（第１の液体）が第２室８２内の浸透圧生成材料（液体状または固体状）中へと移動し、それにより、該浸透圧生成材料および第２室８２が膨張して対象物を押圧するように構成されたアクチュエーターである（なお、第１室８１は、後述のとおり、生体組織や体腔などの外界であってもよい）。ここで、浸透圧（または浸透圧差）は、液体透過膜としての半透膜を挟む２つの液体（第１の液体と液体状の浸透圧生成材料）同士の間に生じる浸透圧の差であってもよいし、液体透過膜としての多孔質膜を自由に通過した第１の液体が、第２室内の浸透圧生成材料（ゲル状を含む固体状の吸水性ポリマーなど）の中に浸透する際に作用する浸透圧であってもよい。換言すると、第１の液体が半透膜を通過するための駆動源が浸透圧であってもよいし、第１の液体が浸透圧とは関係なく多孔質膜を通過した後、浸透圧生成材料に接触し、該浸透圧生成材料中に浸透していく際の駆動源が浸透圧であってもよい。浸透圧生成材料は、液体であっても固体（多孔性の塊状、繊維集合体、粒子状など）であってもよく、第１の液体を吸収して膨張する材料であればよい。(Example 3 of the cell injection device)
Fig. 6 is a cross-sectional view showing another example of a preferred embodiment of the cell injection device. In the example of Fig. 6, an osmotic pump is used as the extrusion mechanism. The osmotic pump in the present invention is an actuator having a first chamber 81 and a second chamber 82 adjacent to each other via a liquid-permeable membrane 83 such as a semipermeable membrane or a porous membrane, and configured such that the liquid (first liquid) in the first chamber 81 moves into the osmotic pressure generating material (liquid or solid) in the second chamber 82 using osmotic pressure (or osmotic pressure difference) as a driving source for liquid movement, thereby causing the osmotic pressure generating material and the second chamber 82 to expand and press the target (note that the first chamber 81 may be the outside world such as a biological tissue or a body cavity, as described later). Here, the osmotic pressure (or osmotic pressure difference) may be the difference in osmotic pressure between two liquids (the first liquid and the liquid osmotic pressure generating material) sandwiching the semipermeable membrane as the liquid permeable membrane, or the osmotic pressure acting when the first liquid freely passing through the porous membrane as the liquid permeable membrane permeates into the osmotic pressure generating material (such as a solid water-absorbing polymer including a gel) in the second chamber. In other words, the driving source for the first liquid to pass through the semipermeable membrane may be osmotic pressure, or the driving source when the first liquid passes through the porous membrane regardless of the osmotic pressure, comes into contact with the osmotic pressure generating material, and permeates into the osmotic pressure generating material may be osmotic pressure. The osmotic pressure generating material may be liquid or solid (porous lump, fiber aggregate, particulate, etc.), and may be any material that absorbs the first liquid and expands.
図６において、符号８１は、第１室の外形を定める壁部の内面を指し示すことで第１室を表しており、符号８２は、第２室の外形を定める液体透過膜８３の内面を指し示すことで第２室を表している。第１室８１と第２室８２とは、液体透過膜８３によって互いに隔離されており、第１室８１内に充填される物質と、第２室８２内に充填される物質とは、液体透過膜８３を介して互いに隣接することになる。使用時において、該浸透圧ポンプの第１室８１内には、液体（第１の液体）８１ｍが配置される。図６の例では、使用時に液体注入管８８を通じて、第１の液体８１ｍが第１室８１内に注入される。一方、第２室８２内には浸透圧生成材料８２ｍが配置される。浸透圧生成材料８２ｍは、予め第２室８２内に配置されていてもよいし、注入管を設けておき、使用時に該浸透圧生成材料を第２室８２内に注入してもよい（使用時に該浸透圧生成材料が第２室８２内に注入される場合には、第１室８１内には、第１の液体８１ｍが最初から配置されていてもよい。）。第１室８１内に配置された第１の液体８１ｍは、第２室８２内の浸透圧生成材料８２ｍとの間で生じる浸透圧（浸透圧差）によって、液体透過膜８３を透過し、第２室８２内の浸透圧生成材料８２ｍ中へと移動する。これにより、浸透圧生成材料８２ｍは、第１の液体８１ｍを吸収して膨張し、よって、第２室８２も膨張する。浸透圧生成材料８２ｍおよび第２室８２が膨張することによって、第２室８２に隣接するように配置された収容部（収容室）８５が押圧され、上記した規定の流量Ｑ１にて、懸濁流体３０（移植細胞３１が媒質流体３２中に分散してなるもの）が収容部８５から注射針２０を通じて外部（即ち、注射針の先が挿入された組織中）へと押し出される。6, the reference numeral 81 indicates the first chamber by indicating the inner surface of the wall portion that defines the outer shape of the first chamber, and the reference numeral 82 indicates the second chamber by indicating the inner surface of the liquid-permeable membrane 83 that defines the outer shape of the second chamber. The first chamber 81 and the second chamber 82 are isolated from each other by the liquid-permeable membrane 83, and the substance filled in the first chamber 81 and the substance filled in the second chamber 82 are adjacent to each other via the liquid-permeable membrane 83. When in use, a liquid (first liquid) 81m is placed in the first chamber 81 of the osmotic pump. In the example of FIG. 6, the first liquid 81m is injected into the first chamber 81 through the liquid injection tube 88 during use. Meanwhile, an osmotic pressure generating material 82m is placed in the second chamber 82. The osmotic pressure generating material 82m may be placed in the second chamber 82 in advance, or an injection tube may be provided and the osmotic pressure generating material may be injected into the second chamber 82 when in use (if the osmotic pressure generating material is injected into the second chamber 82 when in use, the first liquid 81m may be placed in the first chamber 81 from the beginning). The first liquid 81m placed in the first chamber 81 permeates the liquid permeable membrane 83 due to the osmotic pressure (osmotic pressure difference) generated between the first liquid 81m and the osmotic pressure generating material 82m in the second chamber 82, and moves into the osmotic pressure generating material 82m in the second chamber 82. As a result, the osmotic pressure generating material 82m absorbs the first liquid 81m and expands, and therefore the second chamber 82 also expands. As the osmotic pressure generating material 82m and the second chamber 82 expand, the storage section (storage chamber) 85 arranged adjacent to the second chamber 82 is pressed, and the suspension fluid 30 (the transplant cells 31 dispersed in the medium fluid 32) is pushed out of the storage section 85 through the injection needle 20 to the outside (i.e., into the tissue into which the tip of the injection needle is inserted) at the specified flow rate Q1 described above.
図６の例では、冷却の観点から、第１室８１が浸透圧ポンプの一室として構造的に設けられ、第１の液体８１ｍを供給するためのチャンバーとして機能している。しかし、第１室８１は、必ずしも装置の一部として設けられる必要はない。例えば、冷却が必要ない場合には、生体組織や体腔などの外部空間が第１室として利用されてもよい。アルゼット浸透圧ポンプ（DURECT Corporation社製）といった市販の浸透圧ポンプは、皮下の生体組織中や体腔内に埋め込まれることを前提としたデバイス（即ち、周囲の生体組織や体腔内のスペースから体液（水）が供給されることを前提とした装置）であり、図６における第２室８２（浸透圧生成材料８２ｍが充填されている）と収容部８５だけを構造的に備えた構成となっている。そのような市販の浸透圧ポンプの場合には、使用時において生体組織や体腔などの使用時の外部空間が第１室として機能する。In the example of FIG. 6, from the viewpoint of cooling, the first chamber 81 is structurally provided as one chamber of the osmotic pump and functions as a chamber for supplying the first liquid 81m. However, the first chamber 81 does not necessarily have to be provided as a part of the device. For example, when cooling is not required, an external space such as a biological tissue or a body cavity may be used as the first chamber. A commercially available osmotic pump such as the Alzet osmotic pump (manufactured by DURECT Corporation) is a device that is assumed to be embedded in subcutaneous biological tissue or a body cavity (i.e., a device that is assumed to be supplied with body fluid (water) from the surrounding biological tissue or space in the body cavity), and is structurally configured to include only the second chamber 82 (filled with the osmotic pressure generating material 82m) and the container 85 in FIG. 6. In the case of such a commercially available osmotic pump, the external space such as a biological tissue or a body cavity functions as the first chamber during use.
収容部８５を構成する壁部のうちの少なくとも一部は、第２室８２または浸透圧生成材料８２ｍによって押圧されて収縮し得るように、柔軟な液体不透過性のフィルムからなる。図６の例では、収容部８５は、全体が柔軟な液体不透過性のフィルム８４によって構成された収縮可能な袋であり、これに注射針２０の針基部分が接続されている。注射針は、針基部分無しで、収容部８５に直接的に接続されていてもよい。前記のフィルム８４が、浸透圧ポンプの第２室８２の膨張（浸透圧生成材料８２ｍの膨張）によって外側から押圧されることで、収容部８５内の容積が減少し、懸濁流体３０が注射針２０から押し出される。図６の例では、収容部８５の外側全体を第２室８２の空間が取り囲んでおり、第２室８２は、全体が柔軟な半透膜８３で構成された袋であり、第２室８２の外側全体を第１室８１が取り囲んでおり、第１室８１は、ハウジング８０内に設けられた部屋である。At least a part of the wall constituting the storage section 85 is made of a flexible liquid-impermeable film so that it can be pressed and contracted by the second chamber 82 or the osmotic pressure generating material 82m. In the example of FIG. 6, the storage section 85 is a contractible bag made entirely of a flexible liquid-impermeable film 84, to which the needle base of the injection needle 20 is connected. The injection needle may be directly connected to the storage section 85 without the needle base. The film 84 is pressed from the outside by the expansion of the second chamber 82 of the osmotic pressure pump (expansion of the osmotic pressure generating material 82m), thereby reducing the volume of the storage section 85 and pushing out the suspension fluid 30 from the injection needle 20. In the example of FIG. 6, the space of the second chamber 82 surrounds the entire outside of the storage section 85, the second chamber 82 is a bag made entirely of a flexible semipermeable membrane 83, the entire outside of the second chamber 82 is surrounded by the first chamber 81, and the first chamber 81 is a room provided in the housing 80.
図６の例では、外部から収容部内に懸濁流体を注入するための懸濁流体注入管８７が挿通されている。懸濁流体注入管８７の先端口には逆流防止弁８７ａが設けられており、これにより、懸濁流体３０は懸濁流体注入管８７から外部へ流出しないようになっている。懸濁流体注入管８７は必須ではなく、注射針２０の先端口から収容部内に懸濁流体３０を注入してもよい。また、図６の例では、ハウジング６０の外部から第１室内に第１の液体を注入するための液体注入管８８が挿通されている。該液体注入管８８の先端口には逆流防止弁８８ａが設けられており、第１室８１内の第１の液体８１ｍが該液体注入管８８から外部へ流出しないようになっている。各逆流防止弁８７ａ、８８ａは、好ましい態様であるが、必須ではなく、懸濁流体注入管８７、液体注入管８８の各注入口側（ハウジング８０の外側に位置する側）にそれぞれ開閉弁が設けられてもよい。In the example of FIG. 6, a suspension fluid injection tube 87 for injecting a suspension fluid from the outside into the storage section is inserted. A check valve 87a is provided at the tip of the suspension fluid injection tube 87, so that the suspension fluid 30 does not flow out from the suspension fluid injection tube 87 to the outside. The suspension fluid injection tube 87 is not essential, and the suspension fluid 30 may be injected into the storage section from the tip of the injection needle 20. In the example of FIG. 6, a liquid injection tube 88 for injecting a first liquid into the first chamber from the outside of the housing 60 is inserted. A check valve 88a is provided at the tip of the liquid injection tube 88, so that the first liquid 81m in the first chamber 81 does not flow out from the liquid injection tube 88 to the outside. Each check valve 87a, 88a is a preferred embodiment, but is not essential, and an opening and closing valve may be provided on each injection port side (side located outside the housing 80) of the suspension fluid injection tube 87 and the liquid injection tube 88.
図６の例では、浸透圧ポンプの第２室８２が直接的に収容部８５を押圧する構造となっているが、図２に示した作動液供給源５４として浸透圧ポンプを用い、浸透圧ポンプの第２室が隣接するチャンバー（図示せず）を押圧し、該チャンバー内に収容された作動液が液圧シリンダー５０ａに注入される構成としてもよい。In the example of FIG. 6, the second chamber 82 of the osmotic pump directly presses against the storage section 85, but it is also possible to use an osmotic pump as the hydraulic fluid supply source 54 shown in FIG. 2, with the second chamber of the osmotic pump pressing against an adjacent chamber (not shown), and the hydraulic fluid contained in that chamber being injected into the hydraulic cylinder 50a.
収容部８５を構成する柔軟な液体不透過性のフィルムの材料や膜厚は、特に限定はされず、浸透圧ポンプに押されて良好に収縮するように適宜に決定してよく、例えば、厚さ１～１００μｍ程度のポリプロピレンや塩化ビニルなどのポリマー製の柔軟なフィルムが挙げられる。The material and thickness of the flexible, liquid-impermeable film that constitutes the storage section 85 are not particularly limited and may be determined appropriately so that it contracts well when pressed by the osmotic pump. For example, a flexible film made of a polymer such as polypropylene or polyvinyl chloride with a thickness of about 1 to 100 μm may be used.
第１の液体は、溶質を含まない溶媒だけの液体であってもよいし、溶質を含んだ溶液であってもよい。溶媒は、特に限定はされないが、安全性の点から水が好ましい溶媒として挙げられる。The first liquid may be a liquid that is a solvent only and does not contain a solute, or may be a solution that contains a solute. The solvent is not particularly limited, but water is a preferred solvent from the standpoint of safety.
第２室に配置される浸透圧生成材料は、固体であってもよいし、液体（溶液）であってもよい。第１の液体と浸透圧生成材料との組み合わせや濃度差は、次の（Ｉ）の条件を満たすように、適宜選択されてよい。
（Ｉ）第１の液体と浸透圧生成材料が液体透過膜を介して接触したときに、浸透圧（浸透圧差）によって第１の液体が浸透圧生成材料中へと移動し、それにより該浸透圧生成材料および第２室が膨張して収容部を押圧し、上記した流量Ｑ１が作り出されること。 The osmotic pressure generating material disposed in the second chamber may be a solid or a liquid (solution). The combination and concentration difference between the first liquid and the osmotic pressure generating material may be appropriately selected so as to satisfy the following condition (I).
(I) When the first liquid and the osmotic pressure generating material come into contact with each other through the liquid permeable membrane, the first liquid moves into the osmotic pressure generating material due to osmotic pressure (osmotic pressure difference), thereby causing the osmotic pressure generating material and the second chamber to expand and press against the storage section, thereby creating the flow rate Q1 described above.
上記（Ｉ）の条件を満たすために、とりわけ上記した流量Ｑ１を得るために、液体透過膜の厚さや面積の調節、液体透過膜の液体透過性の調節、第１室と第２室の液体の濃度差の調節（浸透圧差の調節）、浸透圧生成材料の量の調節、浸透圧生成材料の膨張性の調節などを適宜行うことができる。液体透過膜としては、４フッ化エチレン樹脂、ポリテトラフルオロエチレンなどの多孔性フィルムや、再生セルロース、酢酸セルロースのようなセルロース由来の透析膜、ポリメチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリアクリロニトリル、ポリスルホンなどの合成高分子の半透膜が挙げられる。膜厚は透過性や全体の形状に応じて適宜決定してよい。In order to satisfy the above condition (I), and in particular to obtain the above flow rate Q1, the thickness and area of the liquid-permeable membrane, the liquid permeability of the liquid-permeable membrane, the concentration difference between the liquids in the first and second chambers (the osmotic pressure difference), the amount of the osmotic pressure generating material, the expansion property of the osmotic pressure generating material, and the like can be appropriately adjusted. Examples of liquid-permeable membranes include porous films such as tetrafluoroethylene resin and polytetrafluoroethylene, dialysis membranes derived from cellulose such as regenerated cellulose and cellulose acetate, and semipermeable membranes of synthetic polymers such as polymethyl methacrylate, ethylene-vinyl alcohol copolymer, polyacrylonitrile, and polysulfone. The membrane thickness may be appropriately determined depending on the permeability and overall shape.
浸透圧生成材料は、特に限定はされず、第１の液体に対して浸透圧差（第１の液体を第２室へと移動させる浸透圧差）を生成し、それにより第１の液体を第２室へと移動させ、第２室の体積を増大させ得るものが利用可能である。そのような材料としては、例えば、イオン性の親水性材料、非イオン性の親水性材料、吸水性材料、不揮発性水溶性材料、塩、糖類、多糖類、ポリマー、ヒドロゲル、オスモポリマー、親水性ポリマー、および、吸水性ポリマーなどからなる群から選択される１以上の材料を含んで良い。The osmotic pressure generating material is not particularly limited, and any material that generates an osmotic pressure difference with respect to the first liquid (an osmotic pressure difference that moves the first liquid to the second chamber), thereby moving the first liquid to the second chamber and increasing the volume of the second chamber, can be used. Such materials may include, for example, one or more materials selected from the group consisting of ionic hydrophilic materials, non-ionic hydrophilic materials, water-absorbing materials, non-volatile water-soluble materials, salts, sugars, polysaccharides, polymers, hydrogels, osmopolymers, hydrophilic polymers, and water-absorbing polymers.
前記の親水性材料は、例えば、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸カリウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ｄ－マンニトール、ソルビトール、イノシトール、尿素、コハク酸マグネシウム、酒石酸、ラフィノース（raffinose）、種々の単糖類・オリゴ糖・多糖類（ショ糖、グルコース、乳糖、果糖、デキストランなどといったもの）、およびこれらの混合物などの、不揮発性物質や水溶性物質を含んでよい。前記の吸水性材料には、オスモポリマー、例えば、水と接触して膨張する親水性ポリマー（吸水性ポリマー）が含まれる。The hydrophilic material may include non-volatile or water-soluble substances such as magnesium sulfate, magnesium chloride, potassium sulfate, sodium chloride, sodium sulfate, lithium sulfate, sodium phosphate, potassium phosphate, d-mannitol, sorbitol, inositol, urea, magnesium succinate, tartaric acid, raffinose, various monosaccharides, oligosaccharides, and polysaccharides (such as sucrose, glucose, lactose, fructose, dextran, and the like), and mixtures thereof. The water-absorbent material includes osmopolymers, such as hydrophilic polymers (water-absorbent polymers) that swell in contact with water.
浸透圧ポンプの種々の構成例や、具体的な浸透圧生成材料（イオン性の親水性材料、非イオン性の親水性材料、吸水性ポリマーなど）は、例えば、特表２００９－５２０５１１号公報（国際公開第２００７／０５６５０１号）、米国特許出願公開第２００４／０１０６９１４号明細書、米国特許出願公開第２００４／００１５１５４号明細書などの記載を参照することができる。For various configuration examples of osmotic pumps and specific osmotic pressure generating materials (ionic hydrophilic materials, non-ionic hydrophilic materials, water-absorbent polymers, etc.), see, for example, Published Japanese Translation of PCT International Publication No. 2009-520511 (International Publication No. 2007/056501), US Patent Application Publication No. 2004/0106914, and US Patent Application Publication No. 2004/0015154.
図６に例示した細胞注入装置は、例えば、次のように使用される。
注射針２０の針先を上に向けた状態として、ゾル状となるように温めた懸濁流体３０を医療用シリンジ（図示せず）から懸濁流体注入管８７を通して収容部８５内に注入する。注射針２０の針先から懸濁流体があふれ出る状態（即ち、収容部内に懸濁流体が充填された状態）となったことを確認した後、該医療用シリンジを取り外す。逆流防止弁８７ａによって、収容部８５内の懸濁流体３０が懸濁流体注入管８７から流出することはない。収容部８５内の懸濁流体３０の媒質流体は、ハウジング８０の内部に配置された冷却器８６によって冷却されてゲル化する。次に、第１の液体（例えば、水）８１ｍを、液体注入管８８を通して第１室８１内に注入する。これにより、浸透圧ポンプの作動がスタートする。浸透圧ポンプが作動した直後に、注射針２０を生体組織内に挿入し、該生体組織の表面にハウジング８０の対物面８０ｂを密着させることにより、当該細胞注入装置を安定させる。 The cell injection device illustrated in FIG. 6 is used, for example, as follows.
With the tip of the injection needle 20 facing upward, the suspension fluid 30, which has been heated to a sol state, is injected from a medical syringe (not shown) through a suspension fluid injection tube 87 into the container 85. After confirming that the suspension fluid overflows from the tip of the injection needle 20 (i.e., the container is filled with the suspension fluid), the medical syringe is removed. The check valve 87a prevents the suspension fluid 30 in the container 85 from flowing out of the suspension fluid injection tube 87. The medium fluid of the suspension fluid 30 in the container 85 is cooled and gelled by a cooler 86 arranged inside the housing 80. Next, a first liquid (e.g., water) 81m is injected into the first chamber 81 through a liquid injection tube 88. This starts the operation of the osmotic pump. Immediately after the osmotic pump is operated, the injection needle 20 is inserted into the living tissue, and the objective surface 80b of the housing 80 is brought into close contact with the surface of the living tissue, thereby stabilizing the cell injection device.
冷却されたハウジング８０が生体組織を冷却しないように、また、生体組織によってハウジング８０内が温められないように、ハウジング８０の対物面８０ｂに断熱材層９０を設けてもよい。また、図６の例において、浸透圧ポンプにおける第２室内の空間を収容部の上部により多く存在させることで、収容部を上から下へと絞り出すように浸透圧ポンプを作動させることが可能である。A heat insulating layer 90 may be provided on the object surface 80b of the housing 80 so that the cooled housing 80 does not cool the biological tissue, and so that the inside of the housing 80 is not heated by the biological tissue. Also, in the example of FIG. 6, by making more space in the second chamber of the osmotic pump exist at the top of the storage section, it is possible to operate the osmotic pump so as to squeeze the storage section from top to bottom.
（本発明による作動方法）
当該作動方法は、上記した本発明による細胞注入装置を作動させる方法である。当該作動方法は、例えば、図１に示すように、該細胞注入装置の押出し機構（１０、５０）を作動させることによって、該細胞注入装置の収容部１３に収容された懸濁流体３０を、該細胞注入装置の注射針２０の先から１〔μＬ／秒〕以下の流量にて流出させる工程を有する。(Method of operation according to the present invention)
The operating method is a method for operating the cell injection device according to the present invention described above, and includes a step of causing the suspension fluid 30 contained in the container 13 of the cell injection device to flow out from the tip of the injection needle 20 of the cell injection device at a flow rate of 1 μL/sec or less by operating the extrusion mechanism (10, 50) of the cell injection device, as shown in FIG.
押出し機構の作動のスタートは、人間によるストッパーの解除や、人間によるスタート信号の入力（スタートボタンの押し込み）などであってもよい。押出し機構がスタート可能になると、押出し機構は、自体の駆動源によって自力で作動して、懸濁流体を注射針の先から上記の流量Ｑ１にて流出させる。The operation of the extrusion mechanism may be started by a human releasing the stopper or inputting a start signal (pressing a start button). When the extrusion mechanism is ready to start, it operates by itself using its own drive source and causes the suspension fluid to flow out of the tip of the injection needle at the flow rate Q1 described above.
（懸濁流体の保存方法）
本発明による細胞注入装置が、注射針が接続されたシリンジや注射針が接続されたチューブなど、収容室を含んだディスポーザブルな押出し機構を有する場合、懸濁流体は、該ディスポーザブルな押出し機構の収容部に収容された状態で、低温Ｔ２に冷却され、医療の現場（移植細胞を注入する現場）に供給され、そこで、上記細胞注入装置に装着されてもよい。低温Ｔ２に冷却された懸濁流体は、該細胞注入装置の冷却器によって低温Ｔ２に維持される。(Method of preserving suspension fluid)
When the cell injection device according to the present invention has a disposable extrusion mechanism including a storage chamber, such as a syringe connected to an injection needle or a tube connected to an injection needle, the suspension fluid may be cooled to a low temperature T2 while being stored in the storage section of the disposable extrusion mechanism, and supplied to a medical site (a site where transplant cells are injected), where it may be attached to the cell injection device. The suspension fluid cooled to the low temperature T2 is maintained at the low temperature T2 by a cooler of the cell injection device.
また、懸濁流体は、上記細胞注入装置を使用するまでは、バイアル瓶や培養バッグなどの別の容器内に収容され、冷蔵庫（クラーボックスを含む）内において低温Ｔ２で保存されていてもよい。この保存された懸濁流体は、該細胞注入装置の使用に際して、いったん高温Ｔ１へと加熱されて、上記細胞注入装置によって吸引されて、収容部内に移され、そこで低温Ｔ２へと再度冷却されてもよい。また、懸濁流体は、上記細胞注入装置を使用するまでは、バイアル瓶や培養バッグなどの別の容器内に収容され、室温で保存されていてもよい。この保存された懸濁流体は、該細胞注入装置の使用に際して、上記細胞注入装置によって吸引されて、収容部内に移され、そこで初めて低温Ｔ２へと冷却されてもよい。The suspension fluid may be stored in another container such as a vial or a culture bag and stored at low temperature T2 in a refrigerator (including a cooler box) until the cell injection device is used. When the cell injection device is used, this stored suspension fluid may be heated to high temperature T1 once, sucked up by the cell injection device, transferred to a storage unit, and cooled again to low temperature T2 there. The suspension fluid may be stored in another container such as a vial or a culture bag and stored at room temperature until the cell injection device is used. When the cell injection device is used, this stored suspension fluid may be sucked up by the cell injection device, transferred to a storage unit, and cooled to low temperature T2 there for the first time.
以下、本発明の有用性を確認した実験例を示す。
以下では、本発明に従って、注射針の先から懸濁流体が流出するときの流量が１〔μＬ／秒〕以下となるように、該懸濁流体を注射針から組織中へと注入する操作を、「スローインジェクション」と呼ぶ。
また、比較例（従来技術に従った注入例）として、注射針の先から懸濁流体が流出するときの流量が従来の流量（約１０〔μＬ／秒〕）であるように、該懸濁流体を注射針から組織中へと注入する操作を、「従来インジェクション」と呼ぶ。 The following are experimental examples that confirm the usefulness of the present invention.
Hereinafter, the operation of injecting the suspension fluid from an injection needle into tissue so that the flow rate of the suspension fluid flowing out from the tip of the injection needle is 1 μL/sec or less according to the present invention will be referred to as "slow injection".
As a comparative example (an injection example according to the conventional technology), the operation of injecting the suspension fluid from the injection needle into the tissue so that the flow rate of the suspension fluid flowing out from the tip of the injection needle is the conventional flow rate (approximately 10 μL/sec) is referred to as "conventional injection".
（実施例１）低粘度の媒質流体を用いたスローインジェクション
本実施例では、懸濁流体（細胞懸濁液）の媒質流体として、粘度が比較的低いＡｄｓバッファーを用いてスローインジェクションを実施し、注入された移植細胞の周囲のコラーゲン線維化が抑制されていることを調べると共に、シリンジ内に収容した懸濁流体中の細胞が、低粘度の媒質流体と共に、生体中にどれだけ移動し得るかを調べた。Example 1: Slow injection using low-viscosity medium fluid In this example, slow injection was performed using Ads buffer, which has a relatively low viscosity, as the medium fluid for the suspension fluid (cell suspension). The inhibition of collagen fibrosis around the injected transplanted cells was investigated, as well as the extent to which the cells in the suspension fluid contained in the syringe could move into the living body together with the low-viscosity medium fluid.
（移植細胞の作製）
新生仔ラットに対して、５％Isoflurane（和光純薬099-06571）含有空気によって麻酔導入し、深い麻酔状態を得た。体動が無く、かつ痛み刺激に対して不感となっていることを確認し、安楽死を実施した。胸壁を大きく切開し、胸腔圧迫により心臓を露出させた。心室の組織をハサミで切断し回収した。該組織を、１％コラゲナーゼ（和光純薬032-22364）、０．１％トリプシン（Difco 215240）を含むＡｄｓバッファー（１１６ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１２．５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５．６ｍＭglucose、５．４ｍＭ ＫＣｌ、０．８ｍＭ ＭｇＳＯ４；ｐＨ７．３５，２５℃）に浸し、３７℃で撹拌し、組織を構成する細胞を分散させた。分散した細胞を含む上清を回収し、牛胎仔血清（biowest S1820-500）を用いて酵素反応を中和した後、Ａｄｓバッファーによって細胞を洗浄した。(Preparation of transplant cells)
Neonatal rats were anesthetized with 5% Isoflurane (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 099-06571) in air to obtain a deep anesthetized state. After confirming that the rats were not moving and were insensitive to pain stimuli, they were euthanized. The chest wall was incised widely and the heart was exposed by chest compression. The ventricular tissue was cut with scissors and collected. The tissue was immersed in Ads buffer (116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mMNaH2PO4 , 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mMMgSO4 ;pH 7.35, 25°C) containing 1% collagenase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 032-22364) and 0.1% trypsin (Difco 215240), and stirred at 37°C to disperse the cells that constitute the tissue. The supernatant containing the dispersed cells was collected, and the enzyme reaction was neutralized with fetal bovine serum (biowest S1820-500), after which the cells were washed with Ads buffer.
回収した細胞から、公知文献（服部ら、"Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes"、Nature Methods 2010 Jan; 7(1):61-6.）および国際公開公報ＷＯ２００６/０２２３７７号に記載された方法に基づいて心筋細胞の精製を行った。
続いて、前記の非特許文献および国際公開公報ＷＯ２００９／０１７２５４号公報に記載された方法に基づいて、約３００個の細胞を一塊にし、心筋細胞塊を本実験に必要な数だけ作成した。この際に、PKH 26 red (シグマ)を用いて、細胞表面を生きた状態で赤色蛍光色でラベル化した。 Cardiomyocytes were purified from the collected cells based on the method described in a published literature (Hattori et al., "Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes", Nature Methods 2010 Jan; 7(1):61-6.) and International Publication WO2006/022377.
Next, about 300 cells were aggregated to prepare the number of cardiomyocyte clusters required for this experiment based on the method described in the above-mentioned non-patent document and International Publication WO2009/017254. At this time, the cell surface was labeled with red fluorescence in a live state using PKH 26 red (Sigma).
（細胞注入装置の製作）
本発明の細胞注入装置として、図２（ｂ）に示した装置を製作した。押出し機構を構成するシリンジ１０として、テルモ社製の注射針付シリンジ（SS-10M2913）を用いた。このシリンジには、２９ゲージの注射針２０が付帯している。シリンジ１０のシリンダー１１の胴体には、冷却器４０として、外径１ｍｍ、内径０．３ｍｍ（肉厚０．３５ｍｍ）の銅製の管（山洞金物店）が隙間なく巻き付けられ、図示しない外部のポンプ（アズワン社製、1-9419-02、カセットチューブポンプSMP-23AS）で、該銅製の管内に冷却水を強制循環させることによって、２℃付近の温度とした。この冷却器によって、シリンダー内の懸濁流体は、約２℃の温度に保たれた。(Production of cell injection device)
As the cell injection device of the present invention, the device shown in FIG. 2(b) was produced. A syringe with a needle (SS-10M2913) manufactured by Terumo Corporation was used as the syringe 10 constituting the extrusion mechanism. This syringe was equipped with a 29-gauge needle 20. A copper tube (Yamado Hardware Store) with an outer diameter of 1 mm and an inner diameter of 0.3 mm (wall thickness of 0.35 mm) was tightly wrapped around the body of the cylinder 11 of the syringe 10 as a cooler 40, and a temperature of about 2°C was maintained by forcibly circulating cooling water in the copper tube using an external pump (As One Corporation, 1-9419-02, cassette tube pump SMP-23AS) (not shown). The temperature of the suspension fluid in the cylinder was maintained at about 2°C by this cooler.
シリンジ１０のプランジャーを押す駆動源としての液圧シリンダー５０ａとして、テルモ社製のシリンジ（ツベルクリン用、１ｍＬ）にテルモ社製の１８Ｇ針を装着したものを用いた。該液圧シリンダー５０ａの１８Ｇ針と作動液供給源（図２（ｂ）には図示しないシリンジポンプ）とは、配管用チューブ５５で連結されている。該配管用チューブ５５は、ポリプロピレン製であり、細く内腔の拡張性が低く、作動液の正確な供給を阻害しない。作動液は水であり、配管用チューブ内には気泡が無く、水で満たされている。作動液供給源には、アズワン社製シリンジポンプ（リモコンタイプＤＲ－１０）とコントローラーＣＴ－１０を用いた。A Terumo syringe (for tuberculin, 1 mL) with an 18G Terumo needle attached was used as the hydraulic cylinder 50a, which serves as the driving source for pushing the plunger of the syringe 10. The 18G needle of the hydraulic cylinder 50a and the hydraulic fluid supply source (a syringe pump not shown in FIG. 2(b)) are connected by a piping tube 55. The piping tube 55 is made of polypropylene, has a thin lumen with low expandability, and does not hinder the accurate supply of hydraulic fluid. The hydraulic fluid is water, and there are no air bubbles in the piping tube, which is filled with water. As the hydraulic fluid supply source, an AS ONE syringe pump (remote control type DR-10) and a controller CT-10 were used.
（スローインジェクションの実施）
懸濁流体の媒質流体として上記Ａｄｓバッファーを用い、これに上記の心筋細胞隗を１００個混合し分散させて懸濁流体を作成し、上記細胞注入装置の注射針付シリンジ内に、該懸濁流体０．０２ｍＬを吸引した。次に、押出し機構を作動させ、０．０２〔μＬ／秒〕のスローインジェクションを行い、実施例１用の被験体（サンプル数ｎ＝３）の心臓に対し懸濁流体を注入した。なお、シリンジのプランジャーは、ガスケットがシリンダーの先端面に当たるまで移動させた。(Implementation of slow injection)
The Ads buffer was used as the medium fluid for the suspension fluid, and 100 of the cardiomyocytes were mixed and dispersed in the buffer to create a suspension fluid. 0.02 mL of the suspension fluid was then drawn into the syringe with the injection needle of the cell injection device. Next, the extrusion mechanism was operated to perform a slow injection of 0.02 μL/sec, and the suspension fluid was injected into the heart of the subject (sample number n=3) for Example 1. The plunger of the syringe was moved until the gasket hit the tip surface of the cylinder.
（スローインジェクションの効果の評価）
懸濁流体を注入した後の心臓組織を観察したところ、線維化が生じないことがわかった。これにより、本発明による細胞注入装置およびそれによるスローインジェクションの有用性が明らかになった。(Evaluation of the effect of slow injection)
Observation of the cardiac tissue after injection of the suspension fluid revealed that no fibrosis occurred, demonstrating the usefulness of the cell injection device and the slow injection achieved by the device according to the present invention.
（シリンジ内の心筋細胞隗の残留の評価）
注入後のシリンジ内を観察したところ、シリンジ内に吸引した１００個の心筋細胞隗のうち、５０％±１０％（サンプル数ｎ＝３）の心筋細胞隗が、ガスケットとシリンダーの先端面との間に挟まって残存していることがわかった。(Evaluation of remaining myocardial cells in the syringe)
When the inside of the syringe was observed after injection, it was found that of the 100 cardiomyocyte fragments sucked into the syringe, 50% ± 10% (sample number n = 3) of the cardiomyocyte fragments remained sandwiched between the gasket and the tip surface of the cylinder.
（実施例２）低温でゲル状となり体温条件で非ゲル化する媒質流体の使用
上記実施例１における心筋細胞隗の残留の結果から、本発明者は、シリンジ内の全ての細胞をより多く押し出すためには、懸濁流体の媒質流体に高い粘度が必要であると考え、ゲル状の媒質流体の使用を考えた。しかしながら、インジェクションによる注入先（移植先）のホスト組織中で媒質流体がゲル状のままであると、注入された細胞の組織内での分散を阻害し、ホスト組織である心筋との接触共役を阻害する可能性がある。
そこで、本実施例２では、媒質流体として、低温に冷却したシリンジ内ではゲル状となり、インジェクション後の体温条件で非ゲル化する物質を用いた。このような性質を示す物質候補群の中で、本実施例２では、κ型カラギーナンを選択した。媒質流体は、０．２重量％のκ型カラギーナンを含む水溶液であり、低温（０～３０℃）でゲル状を呈し、３０℃を超える温度では液性となる。(Example 2) Use of a medium fluid that gels at low temperatures and becomes non-gelling at body temperature From the results of the remaining myocardial cell debris in Example 1 above, the inventors considered that a high viscosity of the medium fluid of the suspension fluid is necessary in order to push out as many of the cells as possible from within the syringe, and therefore considered the use of a gel-like medium fluid. However, if the medium fluid remains gel-like in the host tissue of the injection destination (implantation destination) by injection, it may inhibit the dispersion of the injected cells within the tissue and inhibit contact conjugation with the host tissue, the myocardium.
Therefore, in this Example 2, a substance that becomes gel-like inside a syringe cooled to a low temperature and does not become gel-like under body temperature conditions after injection was used as the medium fluid. Among the candidate substances that exhibit such properties, κ-carrageenan was selected in this Example 2. The medium fluid is an aqueous solution containing 0.2% by weight of κ-carrageenan, which becomes gel-like at low temperatures (0 to 30°C) and becomes liquid at temperatures above 30°C.
（スローインジェクションの実施）
スローインジェクションに際しては、シリンジを冷却して懸濁流体の温度を５℃とし、断熱材でシリンジを取り囲んで該温度を維持した。また、ホスト組織の温度は３７℃であった。媒質流体とシリンジの温度以外の、装置の構成および他の実施条件は実施例１と同様である。(Implementation of slow injection)
During the slow injection, the temperature of the suspending fluid was kept at 5° C. by cooling the syringe, and the syringe was surrounded by a thermal insulator to maintain the temperature. The temperature of the host tissue was 37° C. The configuration of the device and other implementation conditions were the same as those in Example 1, except for the temperatures of the medium fluid and the syringe.
（スローインジェクションの効果の評価）
懸濁流体を注入した後の心臓組織を観察したところ、線維化が生じないことがわかった。これにより、本発明による細胞注入装置およびそれによるスローインジェクションの有用性が明らかになった。(Evaluation of the effect of slow injection)
Observation of the cardiac tissue after injection of the suspension fluid revealed that no fibrosis occurred, demonstrating the usefulness of the cell injection device and the slow injection achieved by the device according to the present invention.
（シリンジ内の心筋細胞隗の残留の評価）
注入後のシリンジ内を観察したところ、シリンジ内に吸引した１００個の心筋細胞隗のうち、ガスケットとシリンダーの先端面との間に挟まって残存している心筋細胞隗は、５．９％（サンプル数ｎ＝３）まで低下していることが分かった。(Evaluation of remaining myocardial cells in the syringe)
When the inside of the syringe was observed after injection, it was found that of the 100 cardiomyocyte fragments drawn into the syringe, the number of cardiomyocyte fragments remaining sandwiched between the gasket and the tip surface of the cylinder had decreased to 5.9% (sample number n = 3).
（比較例１）他の媒質流体の検討
ゲル状の懸濁流体が注入後にゾルとなることが必要であり、組織液の流れがスローインジェクションの効果を生みだすために必要であることを示すために、以下の比較実験を行った。(Comparative Example 1) Study of other medium fluids The following comparative experiment was conducted to demonstrate that it is necessary for the gel-like suspension fluid to become a sol after injection and that the flow of interstitial fluid is necessary to produce the effect of slow injection.
媒質流体として、終濃度５重量％の加水分解ゼラチン（シグマ G9382）を含むＡｄｓバッファーを用い、これに１００個の心筋細胞塊を混合し、０．０２ｍＬの懸濁流体を作成した。この懸濁流体をシリンジ中に吸引し、冷却後、上記実施例２と同様に、０．０２〔μＬ／秒〕にて、死亡したマウスの心臓に対してでスローインジェクションを実施した。As the medium fluid, Ads buffer containing hydrolyzed gelatin (Sigma G9382) at a final concentration of 5% by weight was used, and 100 myocardial cell clusters were mixed with this to create 0.02 mL of suspension fluid. This suspension fluid was drawn into a syringe, cooled, and then slow-injected into the heart of a dead mouse at 0.02 μL/sec, as in Example 2 above.
（スローインジェクションの効果の評価）
本比較例１では、体温によるゼラチンのゾル化が起きず、組織液による希釈作用もないため、移植部位周囲に水ぶくれ状の隆起構造が出現した。(Evaluation of the effect of slow injection)
In Comparative Example 1, gelatin did not solate due to body temperature, and there was no dilution effect due to tissue fluid, so that a blister-like raised structure appeared around the transplant site.
（実施例３）
実施例３としてのスローインジェクションにて、また、比較例２としての従来インジェクションにて、新生仔ラットの心筋の細胞を、被験体である免疫不全のヌードラットの心臓に対して注入し、それぞれの注入された移植細胞の周囲のコラーゲン線維化量を調べ、比較した。実施例３、比較例２ともに、被験体の数ｎは３である。Example 3
Neonatal rat myocardial cells were injected into the hearts of immunodeficient nude rats as subjects by slow injection in Example 3 and by conventional injection in Comparative Example 2, and the amount of collagen fibrosis around the injected transplanted cells was examined and compared. In both Example 3 and Comparative Example 2, the number of subjects n was 3.
（移植細胞の作製）
実施例１と同様にして心筋細胞塊を得た。また、PKH 26 red (シグマ)を用いて、細胞表面を生きた状態で赤色蛍光色でラベル化した。(Preparation of transplant cells)
A myocardial cell cluster was obtained in the same manner as in Example 1. Furthermore, the cell surface was labeled with red fluorescence in a live state using PKH 26 red (Sigma).
（細胞注入装置）
実施例１と同様の細胞注入装置を用いた。シリンダー内の懸濁流体の温度は約２℃の温度に保たれるようにした。なお、実施例３および比較例２における液圧シリンダー５０ａのピストンの移動速度は、作動液供給源の設定によって互いに異なっている。(Cell injection device)
A cell injection device similar to that used in Example 1 was used. The temperature of the suspension fluid in the cylinder was kept at about 2° C. The movement speed of the piston of the hydraulic cylinder 50a in Example 3 and Comparative Example 2 differed from each other depending on the settings of the hydraulic fluid supply source.
（懸濁流体）
媒質流体として、終濃度５％の加水分解ゼラチン（シグマ G9382）を含むＡｄｓバッファーを用い、これに１００個の心筋細胞塊を混合し、分散させて、本実施例３の懸濁流体０．１ｍＬを得た。この媒質流体は、２５℃以上でゾル化して第１の粘度５０ｍＰａ・ｓを示し、１０℃未満ではゲル化して第２の粘度１００００ｍＰａ・ｓ以上を示す。
また、この懸濁流体と同じものを作製し、比較例２の懸濁流体とした。なお、比較例２の懸濁流体は、シリンジ内でゲル化しないように、シリンジを冷却せず、室温で用いた。(Suspension Fluid)
As the medium fluid, an Ads buffer containing hydrolyzed gelatin (Sigma G9382) at a final concentration of 5% was used, and 100 cardiomyocyte clusters were mixed and dispersed in this to obtain 0.1 mL of the suspension fluid of this Example 3. This medium fluid becomes a sol at 25° C. or higher and exhibits a first viscosity of 50 mPa·s, and becomes a gel at temperatures below 10° C. and exhibits a second viscosity of 10,000 mPa·s or higher.
In addition, the same suspension fluid was prepared as the suspension fluid of Comparative Example 2. Note that the suspension fluid of Comparative Example 2 was used at room temperature without cooling the syringe so as to prevent gelation within the syringe.
（移植術）
実施例用および比較例用の被験体として、それぞれオスの免疫不全のヌードラットを用い、各被験体に対して、Isoflurane３％含有空気にて麻酔導入を行った。気管に対してカニューレを挿入し、人工呼吸器に接続した。人工呼吸器にIsoflurane気化装置を接続し、連続的に深い麻酔を維持した。胸部皮膚および胸筋を切断し、左第３肋間筋肉を切開し、さらに胸膜を切開し、開胸器を挿入し開胸状態を維持した。(transplantation)
Male immunodeficient nude rats were used as subjects for the examples and comparative examples, and anesthesia was induced for each subject with 3% Isoflurane in air. A cannula was inserted into the trachea and connected to an artificial respirator. An Isoflurane vaporizer was connected to the artificial respirator to continuously maintain deep anesthesia. The chest skin and pectoral muscles were cut, the left third intercostal muscle was incised, the pleura was further incised, and a thoracotomy was inserted to maintain the open chest.
（実施例３による注入）
上記細胞注入装置の注射針付シリンジ内に上記０．０２ｍＬの懸濁流体を吸引し、４℃に冷却して媒質流体をゲル化させた。次に、押出し機構を作動させて、０．０２〔μＬ／秒〕のスローインジェクションを実施して、実施例用の被験体（サンプル数ｎ＝３）の心臓に対し懸濁流体を注入した。(Injection according to Example 3)
0.02 mL of the suspension fluid was aspirated into the syringe with the injection needle of the cell injection device, and the medium fluid was gelled by cooling to 4° C. Next, the extrusion mechanism was operated to perform a slow injection of 0.02 μL/sec, and the suspension fluid was injected into the heart of the subject (sample number n=3) for the example.
（比較例２による注入）
上記細胞注入装置の注射針付シリンジ内に、上記０．０２ｍＬを懸濁流体を吸引し、媒質流体が室温でゾルの状態となっているままで、押出し機構を作動させて、約１０〔μＬ／秒〕の従来インジェクションを実施して、比較例用の被験体（サンプル数ｎ＝３）の心臓に対して懸濁流体を注入した。(Injection according to Comparative Example 2)
0.02 mL of the suspension fluid was drawn into the syringe with needle of the cell injection device, and while the medium fluid was still in a sol state at room temperature, the extrusion mechanism was operated to perform a conventional injection of approximately 10 μL/sec, injecting the suspension fluid into the heart of a comparative subject (sample number n=3).
実施例３および比較例２の被験体ともに、第２肋間と第４肋間に縫合糸をかけ、開胸部を閉じ、筋および皮膚を縫合した。For both subjects in Example 3 and Comparative Example 2, sutures were placed between the second and fourth intercostal spaces, the chest opening was closed, and the muscles and skin were sutured.
（結果）
心筋細胞塊の注入から２ヵ月が経過した後、各被験体に対してIsoflurane気化麻酔で麻酔導入を行い、ソムノペンチル１μＬ／ｇ（ペントバルビタール６５μｇ／ｇ当量）を腹腔内に投与することで、深い麻酔を行った。麻酔下で胸部を切開し、心臓を取り出した。(result)
Two months after the injection of the myocardial cell mass, each subject was anesthetized with vaporized isoflurane, and deep anesthesia was achieved by intraperitoneally administering 1 μL/g of Somnopentyl (equivalent to 65 μg/g of pentobarbital). Under anesthesia, the chest was opened and the heart was removed.
サンプルである各心臓を、４％パラフォルムアルデヒド（和光純薬 163-20145）で固定化し、２０％Sucrose（和光純薬 195-07925）を含有するＴＢＳ液（Bio-rad 1706435）で置換後、ＯＣＴコンパウンド（サクラ ティシュ―テック）内に包埋凍結させ、Leica社クリオスタットCM3050Sを用いて、凍結心臓切片を作成した。該凍結切片をＴＢＳ液で洗浄し、組織像を顕微鏡観察した。顕微鏡観察にあたっては、線維化における細胞外マトリックスの代表としてＩ型コラーゲンを免疫染色した（１次抗体：Chondrex Anti-Rat Type I Collagen Antibody, Clone 1F10C2, ２次抗体：Invitrogen donkey anti-mouse IgG-Alexa fluor488）（図７（ａ）、図８（ａ））。核はＤＡＰＩ（Molecular Probe社）によって染色した（図７（ｂ）、図８（ｂ））。細胞はＰＫＨ２６ ｒｅｄによって染色した（図７（ｃ）、図８（ｃ））。これらを蛍光顕微鏡装置（オリンパス社製、IX-71、pixera pro 600es）で撮影した。Each heart sample was fixed with 4% paraformaldehyde (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 163-20145), replaced with TBS solution (Bio-rad 1706435) containing 20% sucrose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 195-07925), embedded and frozen in OCT compound (Sakura Tissue-Tec), and frozen heart sections were prepared using a Leica cryostat CM3050S. The frozen sections were washed with TBS solution, and the tissue images were observed under a microscope. For the microscopic observation, type I collagen was immunostained as a representative extracellular matrix in fibrosis (primary antibody: Chondrex Anti-Rat Type I Collagen Antibody, Clone 1F10C2, secondary antibody: Invitrogen donkey anti-mouse IgG-Alexa fluor488) (Figures 7(a) and 8(a)). Nuclei were stained with DAPI (Molecular Probe) (Figures 7(b) and 8(b)). Cells were stained with PKH26 red (Figures 7(c) and 8(c)). These were photographed using a fluorescence microscope (Olympus, IX-71, pixera pro 600es).
その結果、実施例３によるサンプルにおける生着細胞の数に比べて、比較例２によるサンプルにおける生着細胞の数は極めて少ないことがわかった。As a result, it was found that the number of engrafted cells in the sample from Comparative Example 2 was extremely small compared to the number of engrafted cells in the sample from Example 3.
また、実施例３のスローインジェクション、比較例２の従来インジェクションによって、間質の線維化が異なるか否かを調べた。We also investigated whether interstitial fibrosis differed between the slow injection in Example 3 and the conventional injection in Comparative Example 2.
その結果、実施例３のスローインジェクションにて注入を受けた組織では、図７（ｄ）の顕微鏡写真図に示すように、注入（移植）された心筋細胞塊の周囲および心筋細胞塊同士の間にはＩ型コラーゲンは見られなかった。これに対して、比較例２の従来インジェクションによって注入を受けた組織では、図８（ｄ）の顕微鏡写真図に示すように、グラフト細胞の周囲に広範囲に、かつ、心筋細胞塊同士の間に、Ｉ型コラーゲンが存在することがわかった。As a result, in the tissue injected by slow injection in Example 3, type I collagen was not found around the injected (transplanted) cardiomyocyte clusters or between the cardiomyocyte clusters, as shown in the micrograph in Figure 7(d). In contrast, in the tissue injected by conventional injection in Comparative Example 2, type I collagen was found to be present over a wide area around the graft cells and between the cardiomyocyte clusters, as shown in the micrograph in Figure 8(d).
（実施例４）
実施例４としてのスローインジェクションにて、また、比較例３としての従来インジェクションにて、新生仔ラットの心筋の細胞を、被験体である免疫不全のヌードラットの心臓に対して注入し、移植後（注入後）の生着量を比較し、かつ、移植後のホスト組織と移植細胞との接触の有無を確認した。Example 4
Using slow injection as Example 4 and conventional injection as Comparative Example 3, myocardial cells from newborn rats were injected into the hearts of immunodeficient nude rats as subjects, and the amount of engraftment after transplantation (after injection) was compared, and the presence or absence of contact between the host tissue and the transplanted cells after transplantation was confirmed.
（実験方法）
上記実施例３および上記比較例２と同様に、新生仔ラットの心筋細胞塊（１塊あたりの細胞数は３００）を１００個含んだ懸濁流体を作製し、実施例４としてのスローインジェクション（約０．０２〔μＬ／秒〕）、および、比較例３としての従来インジェクション（約１０〔μＬ／秒〕）を実施した。実施例４、比較例３ともに、被験体の数は３である。(Experimental Method)
As in Example 3 and Comparative Example 2, a suspension fluid containing 100 neonatal rat cardiomyocyte cell clusters (300 cells per cluster) was prepared, and slow injection (about 0.02 [μL/sec]) was performed as Example 4, and conventional injection (about 10 [μL/sec]) was performed as Comparative Example 3. In both Example 4 and Comparative Example 3, the number of subjects was three.
心筋細胞塊の注入から２ヵ月が経過した後、各被験体の心臓を摘出し、切片を作製した。蛍光顕微鏡にて赤色ラベル心筋を弱拡大にて撮影した。
画像解析ソフトImageJ（アメリカ国立衛生研究所 オープンソース）を用いて、心筋細胞の生着面積を定量化（pixel数）し、切片と切片の距離（μｍ）を乗じて体積を数値化した。実施例４、比較例３ともに、３つの被験体の数値の平均値と標準偏差および有意差検定の結果を、図９の棒グラフとして示す。該棒グラフの縦軸は、注入後に生存した移植細胞の体積であり、任意単位である。有意差検定はＥＺＲ（自治医科大学オープンソース）を用いStudent-t解析した。 Two months after the injection of the myocardial cell mass, the heart was excised from each subject and sliced. The red-labeled myocardium was photographed under a fluorescent microscope at low magnification.
Using image analysis software ImageJ (National Institutes of Health, open source), the engraftment area of cardiomyocytes was quantified (number of pixels), and the volume was quantified by multiplying the distance between slices (μm). The average values and standard deviations of the values of the three subjects and the results of the significant difference test are shown as bar graphs in FIG. 9 for both Example 4 and Comparative Example 3. The vertical axis of the bar graph is the volume of transplanted cells that survived after injection, and is in arbitrary units. The significant difference test was performed using Student-t analysis using EZR (Jichi Medical University, open source).
（結果）
図９の棒グラフから明らかなとおり、注入後に生着した心筋細胞の体積は、比較例３よりも実施例４の方が有意に高い生着率を示した。(result)
As is clear from the bar graph in FIG. 9, the volume of cardiomyocytes engrafted after injection showed a significantly higher engraftment rate in Example 4 than in Comparative Example 3.
（実施例５）
本実施例では、ヌードラットを用いて作製した心臓側壁梗塞モデルに対し、新生仔ラットの心筋細胞をスローインジェクション（約０．０２〔μＬ／秒〕）によって注入し、移植生着と治療効果を調べた。また、比較例４として、同様のスローインジェクションにて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注入し、実施例５の比較の対象とした。Example 5
In this example, neonatal rat cardiomyocytes were injected by slow injection (approximately 0.02 μL/sec) into a cardiac lateral wall infarction model prepared using nude rats, and the engraftment and therapeutic effect were examined. In addition, as Comparative Example 4, phosphate buffered saline (PBS) was injected by the same slow injection method, and used as a comparison subject to Example 5.
（心臓側壁梗塞モデルの作製）
オスのヌードラットをIsoflurane３％含有空気にて麻酔導入を行った。
気管に対してカニューレを挿入し、人工呼吸器に接続した。人工呼吸器にIsoflurane気化装置を接続し、連続的に深い麻酔を維持した。ラットの体を体軸線を中心に右にねじり、左脇の下を術野として、皮膚および胸筋を切断し、左第３肋間筋を切開し、さらに胸膜を切開し、開胸器を挿入して開胸状態を維持した。冠動脈の鈍角枝、第一対角枝を一本の糸で結紮し、心臓側壁の梗塞モデルを構築した。
第２肋間と第４肋間に縫合糸をかけ、開胸部を閉じた。筋および皮膚を縫合しケージへ戻し、一週間飼育した。(Preparation of a lateral cardiac infarction model)
Male nude rats were anesthetized with 3% isoflurane in air.
A cannula was inserted into the trachea and connected to an artificial ventilator. An Isoflurane vaporizer was connected to the artificial ventilator to maintain continuous deep anesthesia. The rat's body was twisted to the right around the axis of the body, and the left armpit was used as the surgical field. The skin and pectoral muscles were cut, the left third intercostal muscle was incised, and the pleura was incised. A thoracotomy was inserted to maintain the open chest. The obtuse branch and the first diagonal branch of the coronary artery were ligated with a single thread to construct an infarction model of the lateral wall of the heart.
The second and fourth intercostal spaces were sutured to close the chest opening. The muscles and skin were sutured, and the rat was returned to a cage and kept for one week.
心臓超音波検査によって、心臓収縮ポンプ機能の変化を解析した。
側壁心筋梗塞により、心臓機能は低下しており、この状態のモデル（４体）に対して、実施例５として、上記実施例１と同様に作製した、心筋細胞塊を含んだ懸濁流体を無開胸でスローインジェクションにて注入した。また、同様のモデル（３体）に対して、比較例４として、心筋細胞塊の代わりにＰＢＳを混合したＡｄｓバッファーを無開胸でスローインジェクションにて注入した。
注入では、側壁心筋梗塞モデルとしたヌードラットを吸入麻酔しながら心臓超音波検査台に固定し、心臓超音波撮像を行いながら、無開胸であること以外は、実施例２と同様にスローインジェクションを実施した。スローインジェクションに用いた細胞注入装置は、スムーズなネジ込みなどにより立体的な位置を微調整できる微動装置を介して設置し、リアルタイムに心臓超音波画像を確認しながら注入を実施した。 Changes in cardiac systolic pump function were analyzed by cardiac ultrasound.
Cardiac function was reduced due to lateral myocardial infarction, and a suspension fluid containing myocardial cell clusters prepared in the same manner as in Example 1 was injected by slow injection without thoracotomy into models in this state (4 animals) as Example 5. Moreover, Ads buffer mixed with PBS instead of myocardial cell clusters was injected by slow injection without thoracotomy into similar models (3 animals) as Comparative Example 4.
For the injection, a nude rat used as a lateral myocardial infarction model was fixed to a cardiac ultrasound examination table under inhalation anesthesia, and while performing cardiac ultrasound imaging, slow injection was performed in the same manner as in Example 2, except that the thorax was not opened. The cell injection device used for slow injection was installed via a fine adjustment device that can finely adjust the three-dimensional position by smooth screwing, etc., and injection was performed while checking the cardiac ultrasound image in real time.
注入から２ヵ月が経過した後、実施例５、比較例４のモデルに対して、心臓超音波検査を実施し、実施例１に記載の方法で安楽死させ、それぞれの心臓を回収した。
さらに実施例１に記載した方法で、心臓の凍結切片を作製した。介在板結合の一部であるギャップ結合の有無を検証する目的で、成熟心筋細胞におけるギャップ結合の構成蛋白質であるConnexin 43を免疫染色した（１次抗体：シグマ Rabbit Anti-Connexin-43 C6219、２次抗体：Invitrogen donkey anti-rabbit IgG-Alexa fluor488）。 Two months after the injection, the models of Example 5 and Comparative Example 4 were subjected to cardiac ultrasound examination, and the animals were euthanized by the method described in Example 1, and the hearts of each animal were collected.
Furthermore, frozen sections of the heart were prepared by the method described in Example 1. To verify the presence or absence of gap junctions, which are part of the intercalated disc junctions, Connexin 43, a component protein of gap junctions in mature cardiomyocytes, was immunostained (primary antibody: Sigma Rabbit Anti-Connexin-43 C6219, secondary antibody: Invitrogen donkey anti-rabbit IgG-Alexa fluor488).
（結果）
実施例５、比較例４における注入前後の心臓ポンプ機能に関して有意差検定を行った。その結果を図１０のグラフ図に示す。該グラフ図に示すように、ＰＢＳを注入したモデル群（破線のグラフ）では、心臓機能は有意に回復しなかったが、心筋細胞を注入したモデル群（太い実線のグラフ）では、注入前に比べて有意な心臓収縮・ポンプ機能の回復を認めた。(result)
A significant difference test was performed on the cardiac pump function before and after the injection in Example 5 and Comparative Example 4. The results are shown in the graph in Figure 10. As shown in the graph, the cardiac function was not significantly restored in the model group injected with PBS (graph with dashed line), but the cardiac contraction and pump function were significantly restored compared to before the injection in the model group injected with cardiomyocytes (graph with thick solid line).
また、心筋細胞を注入したモデル群では、図１１の顕微鏡写真図、および、図１１を局所的に拡大した図１２、図１３の顕微鏡写真図のとおり、蛍光赤色（PHK 26 red）で染色された心筋細胞が、ホスト細胞である心筋細胞と直接結合し、ホスト細胞と同等の成熟した細胞形態を示していることが判明した。これらの結合には、Connexin 43によるギャップ結合の様式が含まれることが分かった。以上より、移植細胞とホスト細胞は、介在板を形成し、電気的、力学的共役を達成していると考えられる。In addition, in the model group where cardiomyocytes were injected, as shown in the micrograph in Figure 11 and the micrographs in Figures 12 and 13, which are locally enlarged views of Figure 11, it was found that cardiomyocytes stained with fluorescent red (PHK 26 red) directly bound to the host cardiomyocytes and showed a mature cell morphology equivalent to that of the host cells. It was found that these bonds included gap junctions via Connexin 43. From the above, it is believed that the transplanted cells and the host cells form intercalated discs and achieve electrical and mechanical coupling.
（実施例６）
本実施例では、体温より低い温度で高粘度化（ゲル化）し、体温によって低粘度化（ゾル化）する他の媒質流体を実際に作製し、温度によって粘度が変化することを確かめた。Example 6
In this embodiment, another medium fluid was actually produced that becomes highly viscous (gelled) at temperatures lower than body temperature and becomes less viscous (solated) at body temperature, and it was confirmed that the viscosity changes with temperature.
κ型カラギーナン（和光純薬 033-09292）を０．２重量％含む水溶液を作製した。この水溶液は、低温Ｔ２（０～３０℃）ではゲル状であり、それよりも高い温度では低い粘度のゾル性となった。An aqueous solution containing 0.2% by weight of κ-type carrageenan (Wako Pure Chemical Industries, 033-09292) was prepared. This aqueous solution was in a gel state at low temperatures T2 (0-30°C), and became a low-viscosity sol at higher temperatures.
マーモセットＥＳ細胞由来の心筋細胞塊（１つの塊あたりの細胞数は３００である）を１００個、前記水溶液（０．０２ｍＬ）に混合して懸濁流体を作製した。この懸濁流体を、実施例１と同様の細胞注入装置によって、成体マーモセット心臓壁中に、スローインジェクションにて全量注入した。注入後のシリンジ内に残存した心筋細胞塊の数は、平均６個（サンプル数ｎ＝３）であった。A suspension fluid was prepared by mixing 100 marmoset ES cell-derived cardiomyocyte cell clumps (each clump had 300 cells) with the aqueous solution (0.02 mL). The entire suspension fluid was injected by slow injection into the cardiac wall of an adult marmoset using a cell injection device similar to that used in Example 1. The average number of cardiomyocyte cell clumps remaining in the syringe after injection was 6 (sample number n = 3).
上記と同様に、ゼラチン（シグマ G9382）を３重量％含む水溶液を作製した。この水溶液は、低温Ｔ２（０～３７℃）でゲル状であり、それよりも高い温度では低い粘度のゾル性となった。
マーモセットＥＳ細胞由来の心筋細胞塊（１つの塊あたりの細胞数は３００である）を１００個、前記水溶液（０．０２ｍＬ）に混合して懸濁流体を作製した。この懸濁流体を、実施例１と同様の細胞注入装置によって、成体マーモセット心臓壁に対しスローインジェクションにて全量注入した。注入後のシリンジ内に残存した心筋細胞塊の数は、平均４個（サンプル数ｎ＝３）であった。 In the same manner as above, an aqueous solution containing 3% by weight of gelatin (Sigma G9382) was prepared. This aqueous solution was in a gel state at low temperatures T2 (0 to 37°C), and became a sol with low viscosity at higher temperatures.
A suspension fluid was prepared by mixing 100 cardiomyocyte clumps (each clump had 300 cells) derived from marmoset ES cells with the aqueous solution (0.02 mL). The entire amount of this suspension fluid was injected by slow injection into the cardiac wall of an adult marmoset using the same cell injection device as in Example 1. The number of cardiomyocyte clumps remaining in the syringe after injection was an average of 4 (sample number n=3).
（実施例１～６のまとめ）
従来インジェクションでの注入では、懸濁流体の注入部位の周囲に線維化（コラーゲン２型）の沈着が見られたのに対して、スローインジェクションでの注入では、注入された移植細胞の周囲に線維化は見られなかった。
また、左冠動脈結紮を施した８週齢のヌードラットの心筋梗塞モデルに対する注入実験では、移植細胞を注入したグループでは、移植前の心機能に対して、移植後の心臓壁運動の改善が見られたが、移植細胞を注入しなかったグループ（Vehicle移植群）では、有意な壁運動の改善は見られなかった。
また、移植細胞（赤色色素で染色した新生仔ラットの心筋細胞）が、明らかにホスト細胞と電気的力学的に結合する介在板を形成していることが分かった。
新生仔ラットの心筋細胞を従来インジェクションにて注入した場合は、このような介在板の形成を見出すことは出来なかった。
さらに、注入後の移植細胞の生着率を比較したところ、スローインジェクションにて注入した心筋細胞の方が、従来インジェクションにて注入した心筋細胞よりも、統計的に有意に多く生存していた。
インジェクションの流量（または流出速度）の違いによって細胞生存率に違いが生じた理由の一つとしては、インジェクション時に注射針を通過する時のせん断応力（例えば、注射針の内壁面との摩擦によって生じるせん断応力、または、注射針の出口からホスト組織中に入ろうとするときに生じるせん断応力など）の違いによるものと考えられる。(Summary of Examples 1 to 6)
When the conventional injection method was used, fibrosis (collagen type II) deposition was observed around the injection site of the suspension fluid, whereas when the slow injection method was used, no fibrosis was observed around the injected transplanted cells.
In addition, in an injection experiment on a myocardial infarction model in 8-week-old nude rats with a left coronary artery ligation, the group injected with transplanted cells showed an improvement in cardiac wall motion after transplantation compared to pre-transplant cardiac function, but the group not injected with transplanted cells (vehicle transplant group) showed no significant improvement in wall motion.
They also found that transplanted cells (neonatal rat cardiomyocytes stained with red dye) formed intercalated discs that clearly formed electrical and mechanical connections with the host cells.
When neonatal rat cardiomyocytes were injected by conventional injection, no such intercalated disc formation was observed.
Furthermore, when the survival rates of transplanted cells after injection were compared, it was found that cardiomyocytes injected by slow injection survived at a statistically significant rate more than cardiomyocytes injected by conventional injection.
One of the reasons why differences in cell viability occurred depending on the injection flow rate (or outflow rate) is thought to be due to differences in shear stress when passing through the injection needle during injection (e.g., shear stress generated by friction with the inner wall of the injection needle, or shear stress generated when trying to enter the host tissue from the exit of the injection needle).
（実施例７）
（市販の浸透圧ポンプを用いた細胞注入装置の試作）
本実施例では、市販の浸透圧ポンプを用いて、細胞移植時の実施形態に近い押出し機構の試作機を大小２種類作製した（以下、試作機（大）、試作機（小）とも呼ぶ）。該試作機は、冷却装置を備え、ゲルを低温に維持しながらスローインジェクションを実施し得るように構成されている。試作機（大）と試作機（小）は、パーツのサイズや容量が異なるだけであり、浸透圧ポンプを利用したスローインジェクションの作動原理それ自体は、図６に示した態様と同様である。(Example 7)
(Prototype of cell injection device using a commercially available osmotic pump)
In this example, two prototypes, large and small, with an extrusion mechanism similar to that used in cell transplantation were created using a commercially available osmotic pump (hereinafter referred to as prototype (large) and prototype (small)). The prototypes are equipped with a cooling device and are configured to perform slow injection while maintaining the gel at a low temperature. The only differences between the prototype (large) and prototype (small) are the size and capacity of the parts, and the operating principle of slow injection using an osmotic pump is the same as that shown in Figure 6.
試作機（大）および試作機（小）に共通する基本構成は、図１４に示すように、市販の浸透圧ポンプ８１０と、それを取り巻く筒状容器（胴体部分の形状が円柱状の容器）８２０と、浸透圧ポンプ８１０の先端に取り付けたシリンダーの先端部分８４０と、その先に接続された注射針８４１とを有するものである。筒状容器８２０によって、浸透圧ポンプ８１０の周囲を取り巻く第１室８２０ｓが形成されている。管状部材８３０は、浸透圧ポンプ８１０と筒状容器８２０との間の隙間をシールするパッキンであり、管状部材８５０は、浸透圧ポンプ８１０の先端の針８１１とシリンダー８４０との間の隙間をシールするパッキンである。第１室８２０ｓには、浸透圧ポンプ８１０を作動させるための純水８２０ｍが充填されている。筒状容器８２０には冷却用配管９００が接続され、純水８２０ｍが、ペリスタポンプ（ローラーポンプとも呼ばれる）９１０によって冷却用配管９００内を進み、冷却装置９２０を通って冷却され、第１室８２０ｓに戻るようになっており、この循環装置によって、第１室８２０ｓ内の純水８２０ｍの温度は、任意の低温（本実施例では３～５℃程度）に保たれ得る。As shown in FIG. 14, the basic configuration common to the large prototype and the small prototype includes a commercially available osmotic pump 810, a cylindrical container (a container with a cylindrical body) 820 surrounding the pump, a tip portion 840 of the cylinder attached to the tip of the osmotic pump 810, and an injection needle 841 connected to the tip. The cylindrical container 820 forms a first chamber 820s surrounding the osmotic pump 810. The tubular member 830 is a packing that seals the gap between the osmotic pump 810 and the cylindrical container 820, and the tubular member 850 is a packing that seals the gap between the needle 811 at the tip of the osmotic pump 810 and the cylinder 840. The first chamber 820s is filled with pure water 820m for operating the osmotic pump 810. A cooling pipe 900 is connected to the cylindrical container 820, and the pure water 820m flows through the cooling pipe 900 by a peristaltic pump (also called a roller pump) 910, is cooled through a cooling device 920, and returns to the first chamber 820s. This circulation device allows the temperature of the pure water 820m in the first chamber 820s to be kept at an arbitrary low temperature (in this embodiment, about 3 to 5°C).
試作機の各部の仕様は次のとおりである。
〔試作機（大）〕
浸透圧ポンプ８１０；DURECT Corporation社製、アルゼット浸透圧ポンプ、型番２ＭＬ１、リザーバー容量２０００μＬ、流量１０．０（μＬ／ｈｒ）。
μＬは、マイクロリットルを表す。
第１室用の筒状容器８２０；ポリプロピレン製丸底管（Falcon(登録商標)、品番352059、内径１７ｍｍ、長さ１９９ｍｍ、容量１４ｍＬ）。ｍＬは、ミリリットルを表す。
パッキン８３０：シリコンチューブ（Tiger polymer corporation、品番SR1554）、内径８ｍｍ、外径１１ｍｍ、長さ５ｍｍ。
シリンダー８４０と針８４１：２９Ｇ針付シリンジ（ＢＤロードーズ（商標）、１／２ｍＬ、２９Ｇ、１２．７ｍｍ、カタログ番号326666）のシリンダーと針だけを用い、シリンダーの先端部５ｍｍを切断し利用した。
パッキン８５０：シリコンチューブ、内径０．２ｍｍ、外径３．６ｍｍ、長さ４ｍｍ。
〔試作機（小）〕
浸透圧ポンプ８１０；DURECT Corporation社製、アルゼット浸透圧ポンプ、型番２００１Ｄ、リザーバー容量２００μＬ、流量８．０（μＬ／ｈｒ）。
第１室用の筒状容器８２０；セラムチューブ（住友ベークライト、品番MS-4504W、内径１０．５ｍｍ、長さ６０ｍｍ、容量４ｍＬ）
パッキン８３０：シリコンチューブ、内径７ｍｍ、外径９ｍｍ、長さ５ｍｍ。
シリンダー８４０と針８４１：試作機（大）と同様
パッキン８５０：試作機（大）と同様 The specifications of each part of the prototype are as follows:
[Prototype (large)]
Osmotic pump 810: DURECT Corporation, Alzet osmotic pump, model number 2ML1, reservoir capacity 2000 μL, flow rate 10.0 (μL/hr).
μL stands for microliter.
Cylindrical container 820 for the first chamber: polypropylene round-bottom tube (Falcon (registered trademark), product number 352059, inner diameter 17 mm, length 199 mm, capacity 14 mL). mL stands for milliliters.
Gasket 830: Silicone tube (Tiger polymer corporation, part number SR1554), inner diameter 8 mm, outer diameter 11 mm, length 5 mm.
Cylinder 840 and needle 841: Only the cylinder and needle of a syringe with a 29G needle (BD Lordose (trademark), 1/2 mL, 29G, 12.7 mm, catalog number 326666) were used, and 5 mm of the tip of the cylinder was cut off and used.
Gasket 850: Silicone tube, inner diameter 0.2 mm, outer diameter 3.6 mm, length 4 mm.
[Prototype (small)]
Osmotic pump 810: Alzet osmotic pump, model number 2001D, reservoir capacity 200 μL, flow rate 8.0 (μL/hr), manufactured by DURECT Corporation.
Cylindrical container 820 for the first chamber: Ceramtube (Sumitomo Bakelite, product number MS-4504W, inner diameter 10.5 mm, length 60 mm, capacity 4 mL)
Gasket 830: Silicone tube, inner diameter 7 mm, outer diameter 9 mm, length 5 mm.
Cylinder 840 and needle 841: Same as the prototype (large) Gasket 850: Same as the prototype (large)
図１５（ａ）は、試作機（大）；符号８００Ａと、試作機（小）；符号８００Ｂの外観を示す写真図である。また、図１５（ｂ）は、試作機（大）に用いた浸透圧ポンプ８１０Ａと、試作機（小）に用いた浸透圧ポンプ８１０Ｂの外観を示す写真図である。Figure 15(a) is a photograph showing the appearance of a prototype (large); reference numeral 800A, and a prototype (small); reference numeral 800B. Also, Figure 15(b) is a photograph showing the appearance of an osmotic pump 810A used in the prototype (large) and an osmotic pump 810B used in the prototype (small).
（作動証明）
上記のように構成した試作機（大）および試作機（小）が、細胞を含むゲルを押し出す能力を実際に有するか否かを確認するために、上記した市販の大、小のアルゼット浸透圧ポンプ（型番２ＭＬ１と、型番２００１Ｄ）と、加水分解ゼラチンの濃度が異なる下記２種類の懸濁液（１）、（２）とを用い、以下のように作動実験を行った。
前記大、小のアルゼット浸透圧ポンプのうち、大きい方のアルゼット浸透圧ポンプを「（大）浸透圧ポンプ」と呼び、小さい方のアルゼット浸透圧ポンプを「（小）浸透圧ポンプ」と呼ぶ。また、本実施例では、これら（大）浸透圧ポンプおよび（小）浸透圧ポンプを、単に、「浸透圧ポンプ」とも呼ぶ。
懸濁液（１）：
細胞の代わりに、細胞と同等の大きさと比重を有し、かつ、赤色蛍光色素を含有する硬質ゲルビーズ（Thermofisher 製品番号F8842 製品名FluoSpheres（登録商標）、Polystyrene Microspheres, 15 μｍ, red fluorescent (580/605), for blood flow determination）を用いた。この硬質ゲルビーズ２×１０５個を、媒質流体（３７℃に加温しゾル化した終濃度５重量％の加水分解ゼラチン（シグマ G9382）を含むAdsバッファー２ｍＬ）中に分散させて、懸濁液（１）を作製した。
懸濁液（２）：
前記の硬質ゲルビーズ２×１０５個を、媒質流体（３７℃に加温しゾル化した終濃度０．３重量％の加水分解ゼラチン（シグマ G9382）を含むAdsバッファー２ｍＬ）中に分散させて、懸濁液（２）を作製した。(Operation proof)
In order to confirm whether the prototype (large) and prototype (small) constructed as described above actually have the ability to extrude gel containing cells, the following operational experiments were carried out using the commercially available large and small Alzet osmotic pumps (models 2ML1 and 2001D) and the following two types of suspensions (1) and (2) with different concentrations of hydrolyzed gelatin.
Of the large and small Alzet osmotic pumps, the larger Alzet osmotic pump is referred to as the "(large) osmotic pump" and the smaller Alzet osmotic pump is referred to as the "(small) osmotic pump." In this embodiment, the (large) osmotic pump and the (small) osmotic pump are also simply referred to as "osmotic pumps."
Suspension (1):
Instead of cells, hard gel beads having the same size and specific gravity as cells and containing a red fluorescent dye (Thermofisher product number F8842 product name FluoSpheres (registered trademark), Polystyrene Microspheres, 15 μm, red fluorescent (580/605), for blood flow determination) were used. 2×105 of these hard gel beads were dispersed in a medium fluid (2 mL of Ads buffer containing hydrolyzed gelatin (Sigma G9382) heated to 37° C. and converted into a sol at a final concentration of 5% by weight) to prepare a suspension (1).
Suspension (2):
The hard gel beads (2 x105 beads) were dispersed in a medium fluid (2 mL of Ads buffer containing hydrolyzed gelatin (Sigma G9382) heated to 37°C and converted into a solubilized solution at a final concentration of 0.3% by weight) to prepare a suspension (2).
図１６に示すように、（大）浸透圧ポンプを１つ用い（符号８１０Ａ）、（小）浸透圧ポンプを２つ用いた（符号８１０Ｂ１、８１０Ｂ２）。（大）浸透圧ポンプ８１０Ａには、懸濁液（１）を注入した。第１の（小）浸透圧ポンプ８１０Ｂ１には、懸濁液（１）を注入し、第２の（小）浸透圧ポンプ８１０Ｂ２には、懸濁液（２）を注入した。As shown in FIG. 16, one (large) osmotic pump (810A) and two (small) osmotic pumps (810B1, 810B2) were used. Suspension (1) was injected into (large) osmotic pump 810A. Suspension (1) was injected into first (small) osmotic pump 810B1, and suspension (2) was injected into second (small) osmotic pump 810B2.
前記３つの浸透圧ポンプ（８１０Ａ、８１０Ｂ１、８１０Ｂ２）のそれぞれの先端部の胴体周囲にシリコンチューブ製のパッキンを装着した。これら浸透圧ポンプを、図１６および図１７に示すように、軟質のポリマー材料からなる保持板９５０に設けた貫通孔にはめ込むことによって保持し、各浸透圧ポンプの胴体部分を、ビーカー９３０内の純水９４０（４℃、５００ｍＬ）に浸漬して、作動実験用のセットを構成した。この作動実験用のセット全体（ビーカーを含む）を、冷蔵庫（４℃）内に２４時間留置した。１つのビーカーに３つの浸透圧ポンプを浸漬したのは、簡単な構成によって、３つの浸透圧ポンプに同じ温度の同じ純水を同時に供給するためである。A silicone tube packing was attached around the body of each of the three osmotic pumps (810A, 810B1, 810B2) at the tip. As shown in Figures 16 and 17, these osmotic pumps were held by fitting them into through holes provided in a holding plate 950 made of a soft polymer material, and the body of each osmotic pump was immersed in pure water 940 (4°C, 500 mL) in a beaker 930 to form a set for operation experiments. The entire set for operation experiments (including the beaker) was left in a refrigerator (4°C) for 24 hours. The reason for immersing the three osmotic pumps in one beaker is to simultaneously supply the same pure water at the same temperature to the three osmotic pumps with a simple configuration.
浸漬開始から２４時間後には、ビーカー内の純水が各浸透圧ポンプ内に浸透し、各浸透圧ポンプの先端からゲルの排出が開始していた。さらに、図１７に示すように、冷蔵庫内に留置してから、７２時間後には、２４時間経過時点よりも多い量のゲルが排出されていた。24 hours after the start of immersion, the pure water in the beaker had permeated into each osmotic pump, and gel had begun to be discharged from the tip of each osmotic pump. Furthermore, as shown in Figure 17, 72 hours after placement in the refrigerator, a larger amount of gel had been discharged than at 24 hours.
前記の排出されたゲルを回収し、蛍光顕微鏡で観察したところ、図１８の顕微鏡写真図に示すように、ゲル中には、蛍光ビーズが含まれていた。図１８（ａ）は、蛍光ビーズがゲル中に分散した状態を示す透過像（画面全体の横幅は約２ｍｍ）であり、図１８（ｂ）は、波長４７５ｎｍの励起光を照射することによって赤色の蛍光を発したビーズの様子を示す顕微鏡写真図（画面全体の横幅は約２ｍｍ）である。The discharged gel was collected and observed under a fluorescent microscope. As shown in the micrograph of Figure 18, the gel contained fluorescent beads. Figure 18(a) is a transmission image (the width of the entire screen is approximately 2 mm) showing the state in which the fluorescent beads are dispersed in the gel, and Figure 18(b) is a micrograph (the width of the entire screen is approximately 2 mm) showing the state of the beads emitting red fluorescence when irradiated with excitation light of a wavelength of 475 nm.
実施例７に示した作動実験から、細胞を分散した状態で含みかつゲル化した媒質流体を、浸透圧ポンプを用い、スローインジョクションにて排出することが可能であることが示された。このことから、浸透圧ポンプの構成、仕様、作動条件などを適宜に変更することで、細胞を分散した状態で含みかつゲル化した媒質流体を、本発明が目的とする低速度にて対象部位に注入することを実現できることが示唆された。The operation experiment shown in Example 7 demonstrated that it is possible to use an osmotic pump to discharge a gelled medium fluid containing dispersed cells by slow injection. This suggests that by appropriately modifying the configuration, specifications, operating conditions, etc. of the osmotic pump, it is possible to inject a gelled medium fluid containing dispersed cells into a target site at the slow speed intended by the present invention.
本発明によって、懸濁流体が流入する部位のホスト組織が受ける損傷は、注入された移植細胞の体積だけに起因する最小限のものとなる。よって、本発明は、生体組織中に移植細胞を注入する種々の治療に寄与し得る。本発明によって、スローインジェクションでの生体への移植細胞の注入（投与）方法や、スローインジェクションでの生体への移植細胞の注入による治療方法が実施され得る。The present invention minimizes damage to the host tissue at the site where the suspension fluid flows in and is caused only by the volume of the injected transplant cells. Therefore, the present invention can contribute to various treatments in which transplant cells are injected into living tissue. The present invention can be used to implement a method for injecting (administering) transplant cells into a living body by slow injection, and a treatment method in which transplant cells are injected into a living body by slow injection.
１０ シリンジ
１１ シリンダー
１２ ピストン
１３ 収容部
２０ 注射針
３０ 懸濁流体
３１ 移植細胞
３２ 媒質流体
４０ 冷却器
５０ 駆動源
１００ 生体組織 REFERENCE SIGNS LIST 10 Syringe 11 Cylinder 12 Piston 13 Storage section 20 Injection needle 30 Suspension fluid 31 Transplanted cells 32 Medium fluid 40 Cooler 50 Driving source 100 Biological tissue
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