JP7688480B2

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Publication number: JP7688480B2
Application number: JP2019556314A
Authority: JP
Inventors: ローラ・セップ－ロレンジノ; ウルリケ・プロツァー; トーマス・ミヒラー
Original assignee: Technische Universitaet Muenchen; Alnylam Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Technische Universitaet Muenchen; Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2017-04-18
Filing date: 2018-04-18
Publication date: 2025-06-04
Anticipated expiration: 2038-04-18
Also published as: JP2020516673A; JP2023123449A

Description

関連出願
本出願は、２０１７年４月１８日出願の米国仮出願６２／４８６,６１８、２０１７年９月１日出願の米国仮出願６２／５５３,３５８、２０１８の３月２３日出願の米国仮出願６２／６４６,９７８および２０１８年４月１１日出願の米国仮出願６２／６５５,８６２に基づく優先権を主張する。前記仮出願の各々の全内容を、引用により本明細書に包含させる。RELATED APPLICATIONS This application claims priority to U.S. Provisional Application No. 62/486,618, filed April 18, 2017, U.S. Provisional Application No. 62/553,358, filed September 1, 2017, U.S. Provisional Application No. 62/646,978, filed March 23, 2018, and U.S. Provisional Application No. 62/655,862, filed April 11, 2018. The entire contents of each of the foregoing provisional applications are incorporated herein by reference.

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提供し、その全体を引用により包含させる配列表を含む。該ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年４月１２日に作成し、121301-07220_SL.txtなる名称であり、サイズは４２９,８４１バイトである。SEQUENCE LISTING This application contains a Sequence Listing, which has been provided electronically in ASCII format and is incorporated by reference in its entirety. The ASCII copy was created on April 12, 2018, is named 121301-07220_SL.txt and is 429,841 bytes in size.

発明の背景
Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)は、肝細胞壊死、炎症を引き起こし、硬変および肝細胞癌(ＨＣＣ)の発症の主要リスク因子である、肝臓に感染するエンベロープＤＮＡウイルスである。世界保健機関(ＷＨＯ)は、世界中で、主に低～中所得国で２億４０００万の慢性ＨＢＶ感染個体があり、年間約６５０,０００名がＨＢＶ感染の合併症により死亡すると推定している。有効なＨＢＶワクチンは利用可能であり、新生児への誕生時のワクチン接種の努力が、ＨＢＶ感染の発生率および有病率の減少に効果を示しているが、このようなプログラムは、ここ数年死亡率で実証できる効果はあがっていない(WHO Guidelines for prevention, care and treatment of persons with chronic Hepatitis B Infection, 2015 at apps.who.int/iris/bitstream/10665/154590/1/9789241549059_eng.pdf?ua=1&ua=1)。2. Background of the Invention Hepatitis B virus (HBV) is an enveloped DNA virus that infects the liver, causing hepatocyte necrosis, inflammation, and is a major risk factor for the development of cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The World Health Organization (WHO) estimates that there are 240 million chronically HBV-infected individuals worldwide, mostly in low- and middle-income countries, with approximately 650,000 deaths annually from complications of HBV infection. Although an effective HBV vaccine is available and efforts to vaccinate newborns at birth have been effective in reducing the incidence and prevalence of HBV infection, such programs have not had a demonstrable effect on mortality in recent years (WHO Guidelines for prevention, care and treatment of persons with chronic Hepatitis B Infection, 2015 at apps.who.int/iris/bitstream/10665/154590/1/9789241549059_eng.pdf?ua=1&ua=1).

ＨＢＶ感染の疾患負荷を効果的に軽減する、ＨＢＶ処置のための多数の治療剤が開発されているが、肝細胞核に存在し、ウイルス複製およびウイルスＲＮＡの転写の鋳型となる、共有結合閉環状ＤＮＡ(ｃｃｃＤＮＡ)を含むウイルスの全復製型を完全に排除できないため、一般に治癒しない。ヌクレオチドおよびヌクレオシドアナログは、安全性および有効性のために一般に慢性ＨＢＶ感染の処置のゴールドスタンダードと考えられており、ＨＢＶ複製抑制に効果的であるが、ｃｃｃＤＮＡを排除せず、ウイルスタンパク質発現を阻止せず、慢性的に投与しなければならず、耐性獲得をもたらし得る。さらに、ヌクレオチ(シ)ド阻害剤での処置は、肝細胞癌(ＨＣＣ)発症リスクを十分に軽減しない(処置後においても、５～７年で約７％)。インターフェロンベースの治療は、セロコンバージョンをもたらし得て、患者の約１０～１５％が治癒して処置終了を可能とするが、該薬剤は重篤な副作用があり、長期保存には冷蔵しなければならず、ＨＢＶ感染が最も蔓延している諸国での使用には望ましくない。Numerous therapeutic agents have been developed for the treatment of HBV that effectively reduce the disease burden of HBV infection, but generally do not provide a cure because they do not completely eliminate all replicating forms of the virus, including the covalently closed circular DNA (cccDNA) that resides in the hepatocyte nucleus and serves as a template for viral replication and transcription of viral RNA. Nucleotide and nucleoside analogues are generally considered the gold standard for the treatment of chronic HBV infection due to their safety and efficacy, and although they are effective in suppressing HBV replication, they do not eliminate cccDNA, do not block viral protein expression, must be administered chronically, and may result in acquired resistance. Furthermore, treatment with nucleoside inhibitors does not adequately reduce the risk of developing hepatocellular carcinoma (HCC) (approximately 7% at 5-7 years, even after treatment). Interferon-based treatments can result in seroconversion, allowing approximately 10-15% of patients to be cured and terminate treatment, but the drugs have serious side effects, must be refrigerated for long-term storage, and are undesirable for use in countries where HBV infection is most prevalent.

慢性ＨＢＶの処置は、ＨＢＶの免疫応答を回避しまたは抑制する能力によりさらに複雑となり、感染の持続化をもたらす。ＨＢＶタンパク質は、免疫阻害性を有し、ＨＢＶ感染対象の循環ＨＢＶタンパク質の圧倒的大部分をなす、Ｂ型肝炎ｓ抗原(ＨＢｓＡｇ)が含まれる。さらに、Ｂ型肝炎ｅ抗原(ＨＢｅＡｇ)の除去(セロコンバージョンによる)または血清ウイルス血症における減少は、ＨＢＶ感染処置中止の持続的管理の開始と相関せず、ＨＢＶ感染における血液からの血清ＨＢｓＡｇの除去(およびセロコンバージョン)は、ＨＢＶ感染処置中止の管理に至る、抗ウイルス応答の十分認識された予後指標である。しかしながら、これは、免疫療法を受けている患者のほんの一部でしか見られない。それ故に、稀ではあるが、ＨＢＶ感染の抑制または排除に十分に強固な免疫応答を患者に負荷し、本疾患の少なくとも機能的治癒をもたらすことが可能である。Treatment of chronic HBV is further complicated by the ability of HBV to evade or suppress immune responses, resulting in persistence of infection. HBV proteins include the hepatitis B s antigen (HBsAg), which has immunoinhibitory properties and constitutes the vast majority of circulating HBV proteins in HBV-infected subjects. Furthermore, removal of hepatitis B e antigen (HBeAg) (by seroconversion) or reduction in serum viremia does not correlate with the onset of sustained management of HBV infection without treatment, and removal of serum HBsAg from the blood (and seroconversion) in HBV infection is a well-recognized prognostic indicator of an antiviral response leading to management of HBV infection without treatment. However, this is seen in only a small proportion of patients undergoing immunotherapy. It is therefore possible, although rare, to challenge a patient with an immune response robust enough to suppress or eliminate HBV infection, resulting in at least a functional cure of the disease.

発明の概要
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)感染の処置に使用するためのＲＮＡｉ剤およびＨＢＶワクチンならびに少なくとも一つのＨＢＶ転写物を標的とするＲＮＡｉ剤および治療ワクチン接種を含む組み合わせ治療または処置レジメンを含む、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)感染、例えば、慢性ＨＢＶ感染を有する対象を処置する方法を提供する。SUMMARY OF THE DISCLOSURE The present invention provides methods of treating a subject with a Hepatitis B Virus (HBV) infection, e.g., a chronic HBV infection, comprising an RNAi agent and an HBV vaccine for use in treating HBV infection, and a combination therapy or treatment regimen comprising an RNAi agent targeted to at least one HBV transcript and therapeutic vaccination.

従って、ある態様において、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)感染の処置に使用するためのＲＮＡｉ剤およびＨＢＶワクチンおよびＢ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)感染、例えば、慢性ＨＢＶ感染を有する対象を処置する方法を提供する。方法は、ＨＢＶ感染を有する対象に、少なとも３つのＨＢＶ転写物を標的とするＲＮＡｉ剤であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤；ＨＢＶコア抗原(ＨＢｃＡｇ)およびＨＢＶ表面抗原(ＨＢｓＡｇ)を含むタンパク質ベースのワクチン；およびＨＢｃＡｇまたはＨＢｓＡｇをコードする発現構築物を含む核酸ベースのワクチンであって、該構築物が該タンパク質ベースのワクチンとエピトープを共有するタンパク質をコードするワクチンを投与する、例えば、連続的に投与し、それにより対象を処置するレジメンを含む。Thus, in one embodiment, the present invention provides an RNAi agent and an HBV vaccine for use in treating Hepatitis B virus (HBV) infection and a method of treating a subject having a Hepatitis B virus (HBV) infection, e.g., a chronic HBV infection. The method includes a regimen of administering, e.g., sequentially, to a subject having an HBV infection an RNAi agent targeting at least three HBV transcripts, the RNAi agent comprising a sense strand and an antisense strand; a protein-based vaccine comprising an HBV core antigen (HBcAg) and an HBV surface antigen (HBsAg); and a nucleic acid-based vaccine comprising an expression construct encoding HBcAg or HBsAg, the construct encoding a protein that shares an epitope with the protein-based vaccine, thereby treating the subject.

他の態様において、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)感染、例えば、慢性ＨＢＶ感染を有する対象を処置するためのレジメンを提供する。レジメンは、少なとも３つのＨＢＶ転写物を標的とするＲＮＡｉ剤であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤；ＨＢＶコア抗原(ＨＢｃＡｇ)およびＨＢＶ表面抗原(ＨＢｓＡｇ)を含むタンパク質ベースのワクチン；およびＨＢｃＡｇまたはＨＢｓＡｇをコードする発現構築物を含む核酸ベースのワクチンであって、該構築物が該タンパク質ベースのワクチンとエピトープを共有するタンパク質をコードするワクチンの使用を含む。In another aspect, the invention provides a regimen for treating a subject having a Hepatitis B virus (HBV) infection, e.g., a chronic HBV infection. The regimen includes the use of an RNAi agent targeting at least three HBV transcripts, the RNAi agent including a sense strand and an antisense strand; a protein-based vaccine including HBV core antigen (HBcAg) and HBV surface antigen (HBsAg); and a nucleic acid-based vaccine including an expression construct encoding HBcAg or HBsAg, the construct encoding a protein that shares an epitope with the protein-based vaccine.

ある実施態様において、ＨＢｃＡｇタンパク質またはその免疫原性フラグメントは、タンパク質ベースのワクチンに存在するＨＢＶコア抗原(ＨＢｃＡｇ)ポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントとエピトープを共有するおよび／またはＨＢｓＡｇタンパク質またはその免疫原性フラグメントは、タンパク質ベースのワクチンに存在するＨＢＶ表面抗原(ＨＢｓＡｇ)ポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントとエピトープを共有する。In some embodiments, the HBcAg protein or immunogenic fragment thereof shares an epitope with an HBV core antigen (HBcAg) polypeptide or immunogenic fragment thereof present in a protein-based vaccine and/or the HBsAg protein or immunogenic fragment thereof shares an epitope with an HBV surface antigen (HBsAg) polypeptide or immunogenic fragment thereof present in a protein-based vaccine.

ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む。In some embodiments, the RNAi agent includes at least one modified nucleotide.

ある実施態様において、核酸ベースのワクチンは、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇをコードする発現構築物を含む。In one embodiment, the nucleic acid-based vaccine comprises an expression construct encoding HBcAg and HBsAg.

ある実施態様において、ＨＢＶをコードするＲＮＡｉ剤は、対象に少なくとも２回投与する。In one embodiment, the RNAi agent encoding HBV is administered to the subject at least twice.

ある実施態様において、対象に投与されるＨＢＶをコードするＲＮＡｉ剤は、対象の血清のＨＢｓＡｇを、少なくとも０.５log 10IU/ml減少させる。ある実施態様において、対象で、タンパク質ベースのワクチンの初回量投与前の血清におけるＨＢｓＡｇが少なくとも０.５log 10IU/ml減少する。ある実施態様において、対象で、タンパク質ベースのワクチンの初回量投与前の血清におけるＨＢｓＡｇが少なくとも１log 10IU/ml減少する。ある実施態様において、対象で、ワクチン投与前の血清において２log 10IU/ml以下のＨＢｓＡｇを有する。In some embodiments, the RNAi agent encoding HBV administered to the subject reduces HBsAg in the subject's serum by at least 0.5 log 10 IU/ml. In some embodiments, the subject has at least a 0.5 log 10 IU/ml reduction in HBsAg in serum prior to administration of the first dose of the protein-based vaccine. In some embodiments, the subject has at least a 1 log 10 IU/ml reduction in HBsAg in serum prior to administration of the first dose of the protein-based vaccine. In some embodiments, the subject has no more than 2 log 10 IU/ml of HBsAg in serum prior to administration of the vaccine.

ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、対象に週１回以下で投与される。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、対象に４週に１回以下で投与される。In some embodiments, the RNAi agent is administered to the subject no more than once a week. In some embodiments, the RNAi agent is administered to the subject no more than once every four weeks.

ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤を、０.０１mg／kg～１０mg／kg；または０.５mg／kg～５０mg／kg；または１０mg／kg～３０mg／kgの用量で対象に投与する。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、０.５mg／kg、１mg／kg、１.５mg／kg、３mg／kg、５mg／kg、１０mg／kgおよび３０mg／kgから選択される用量で対象に投与される。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤の１用量は対象に約週１回；約２週に１回；約３週に１回；約４週に１回投与される；またはＲＮＡｉ剤の１用量は対象に週１回以下で投与される；またはＲＮＡｉ剤の１用量は対象に４週に１回以下で投与される。In some embodiments, the RNAi agent is administered to the subject at a dose of 0.01 mg/kg to 10 mg/kg; or 0.5 mg/kg to 50 mg/kg; or 10 mg/kg to 30 mg/kg. In some embodiments, the RNAi agent is administered to the subject at a dose selected from 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, and 30 mg/kg. In some embodiments, a dose of the RNAi agent is administered to the subject about once a week; about once every two weeks; about once every three weeks; about once every four weeks; or a dose of the RNAi agent is administered to the subject no more than once a week; or a dose of the RNAi agent is administered to the subject no more than once every four weeks.

ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンは、ＨＢｓＡｇの少なくとも一つの決定基およびＨＢｃＡｇの少なくとも一つの決定基のアミノ酸配列を含む。In one embodiment, the protein-based vaccine comprises the amino acid sequence of at least one determinant of HBsAg and at least one determinant of HBcAg.

ある実施態様において、ＨＢｃＡｇまたはＨＢｓＡｇをコードする発現ベクター構築物を含む核酸ベースのワクチンは、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｃＡｇの少なくとも一つの決定基の少なくとも一つの決定基を含むアミノ酸配列を含む。In one embodiment, the nucleic acid-based vaccine comprising an expression vector construct encoding HBcAg or HBsAg comprises an amino acid sequence comprising at least one determinant of HBsAg or at least one determinant of HBcAg.

ある実施態様において、ＨＢｓＡｇの決定基は、配列番号２２のアミノ酸１２４～１４７と少なくとも９０％同一の配列を含む。ある実施態様において、ＨＢｓＡｇの決定基は、配列番号２３のアミノ酸９９～１６８と少なくとも９０％同一の配列を含む。In one embodiment, the determinant of HBsAg comprises a sequence at least 90% identical to amino acids 124-147 of SEQ ID NO:22. In one embodiment, the determinant of HBsAg comprises a sequence at least 90% identical to amino acids 99-168 of SEQ ID NO:23.

ある実施態様において、ＨＢｃＡｇの決定基は、配列番号２４のアミノ酸８０を含む配列を含む。ある実施態様において、配列番号２４のアミノ酸８０を含む配列は、少なくとも配列番号２４のアミノ酸７０～９０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＨＢｃＡｇの決定基は、配列番号２４のアミノ酸１３８を含む配列を含む。ある実施態様において、配列番号１４のアミノ酸８０を含む配列は、少なくとも配列番号２４のアミノ酸１２８～１４３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＨＢｃＡｇの決定基は、配列番号２４の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００連続アミノ酸と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＨＢｃＡｇの決定基は、配列番号２４のアミノ酸１８～１４３と少なくとも９０％同一の配列を含む。In some embodiments, the HBcAg determinant comprises a sequence comprising amino acid 80 of SEQ ID NO:24. In some embodiments, the sequence comprising amino acid 80 of SEQ ID NO:24 comprises an amino acid sequence at least 90% identical to at least amino acids 70-90 of SEQ ID NO:24. In some embodiments, the HBcAg determinant comprises a sequence comprising amino acid 138 of SEQ ID NO:24. In some embodiments, the sequence comprising amino acid 80 of SEQ ID NO:14 comprises an amino acid sequence at least 90% identical to at least amino acids 128-143 of SEQ ID NO:24. In some embodiments, the HBcAg determinant comprises an amino acid sequence at least 90% identical to at least 40, 50, 60, 70, 80, 90 or 100 consecutive amino acids of SEQ ID NO:24. In some embodiments, the HBcAg determinant comprises a sequence at least 90% identical to amino acids 18-143 of SEQ ID NO:24.

ある実施態様において、対象に投与するタンパク質ベースのワクチンは、０.１μg～１.０mg用量のＨＢｃＡｇおよび０.１μg～１.０mg用量のＨＢｓＡｇを含む。ある実施態様において、１用量のタンパク質ベースのワクチンは対象に約週１回；約２週に１回；約３週に１回；約４週に１回投与される；または１用量のタンパク質ベースのワクチンは、対象に週１回以下で投与される；または１用量のタンパク質ベースのワクチンは、対象に４週に１回以下で投与される。In some embodiments, the protein-based vaccine administered to the subject comprises a 0.1 μg to 1.0 mg dose of HBcAg and a 0.1 μg to 1.0 mg dose of HBsAg. In some embodiments, a dose of the protein-based vaccine is administered to the subject about once a week; about once every two weeks; about once every three weeks; about once every four weeks; or a dose of the protein-based vaccine is administered to the subject no more than once a week; or a dose of the protein-based vaccine is administered to the subject no more than once every four weeks.

ある実施態様において、ＨＢｃＡｇタンパク質およびＨＢｓＡｇタンパク質は、単一製剤で存在する。ある実施態様において、ＨＢｃＡｇタンパク質およびＨＢｓＡｇタンパク質は、単一製剤で存在しない。ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンはアジュバントを含む。ある実施態様において、アジュバントは、バランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２応答を刺激する。ある実施態様において、アジュバントは、モノホスホリルリピドＡ(ＭＰＬ)、ポリ(Ｉ：Ｃ)、ポリＩＣＬＣアジュバント、ＣｐＧＤＮＡ、ポリＩＣＬＣアジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ｃ－ジ－ＡＭＰ、ｃ－ジ－ＧＭＰ、ｃ－ジ－ＣＭＰ；短、平滑断端５’－三リン酸ｄｓＲＮＡ(３ｐＲＮＡ)、Ｒｉｇ－Ｉリガンド、ポリ[ジ(ナトリウムカルボキシレートエチルフェノキシ)ホスファゼン](ＰＣＥＰ))、ミョウバン、ビロソーム、サイトカイン、ＩＬ－１２、ＡＳ０２、ＡＳ０３、ＡＳ０４、ＭＦ５９、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ(登録商標)、ＩＣ３１(登録商標)またはＲｉｇ－Ｉリガンドから選択される。ある実施態様において、アジュバントは、ポリＩ：Ｃアジュバント、ＣｐＧアジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニストまたはＰＣＥＰアジュバントから選択される。In some embodiments, the HBcAg protein and the HBsAg protein are present in a single formulation. In some embodiments, the HBcAg protein and the HBsAg protein are not present in a single formulation. In some embodiments, the protein-based vaccine includes an adjuvant. In some embodiments, the adjuvant stimulates a balanced Th1/Th2 response. In some embodiments, the adjuvant is selected from monophosphoryl lipid A (MPL), poly(I:C), polyICLC adjuvant, CpG DNA, polyICLC adjuvant, STING agonist, c-di-AMP, c-di-GMP, c-di-CMP; short, blunt-ended 5'-triphosphate dsRNA (3pRNA), Rig-I ligand, poly[di(sodium carboxylate ethylphenoxy)phosphazene] (PCEP)), alum, virosomes, cytokines, IL-12, AS02, AS03, AS04, MF59, ISCOMATRIX®, IC31®, or Rig-I ligand. In some embodiments, the adjuvant is selected from polyI:C adjuvant, CpG adjuvant, STING agonist, or PCEP adjuvant.

ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンは、対象に少なくとも２回投与する。ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンは、対象に週２回以下投与する。ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンを、対象にＲＮＡｉ剤の最終用量を投与した日以降に対象に投与する。ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンを、対象にＲＮＡｉ剤の最終用量を投与したのと同じ日に対象に投与する。ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンを、対象にＲＮＡｉ剤の最終用量を投与した後１か月以内に対象に投与する。ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンを、対象にＲＮＡｉ剤の最終用量を投与した後２か月以内に対象に投与する。ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンを、対象にＲＮＡｉ剤の最終用量を投与した後３か月以内に対象に投与する。In some embodiments, the protein-based vaccine is administered to the subject at least twice. In some embodiments, the protein-based vaccine is administered to the subject no more than twice a week. In some embodiments, the protein-based vaccine is administered to the subject on or after the day the subject is administered the final dose of the RNAi agent. In some embodiments, the protein-based vaccine is administered to the subject on the same day the subject is administered the final dose of the RNAi agent. In some embodiments, the protein-based vaccine is administered to the subject within one month after the subject is administered the final dose of the RNAi agent. In some embodiments, the protein-based vaccine is administered to the subject within two months after the subject is administered the final dose of the RNAi agent. In some embodiments, the protein-based vaccine is administered to the subject within three months after the subject is administered the final dose of the RNAi agent.

ある実施態様において、本発明の方法は、さらに少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつタンパク質ベースのワクチン投与前に血清ＨＢｓＡｇレベルを決定することを含む。すなわち、血清ＨＢｓＡｇレベルを、対象で少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の与後かつタンパク質ベースのワクチン投与前に決定する。In some embodiments, the methods of the invention further include determining serum HBsAg levels after administration of at least one dose of the RNAi agent and before administration of the protein-based vaccine. That is, serum HBsAg levels are determined in the subject after administration of at least one dose of the RNAi agent and before administration of the protein-based vaccine.

ある実施態様において、本発明の方法は、さらに少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつタンパク質ベースのワクチン投与前に血清ＨＢｅＡｇレベルを決定することを含むすなわち、血清ＨＢｅＡｇレベルを、対象で少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつタンパク質ベースのワクチン投与前に決定する。In some embodiments, the methods of the invention further include determining serum HBeAg levels after administration of at least one dose of the RNAi agent and before administration of the protein-based vaccine, i.e., serum HBeAg levels are determined in the subject after administration of at least one dose of the RNAi agent and before administration of the protein-based vaccine.

ある実施態様において、本発明の方法は、さらに少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつタンパク質ベースのワクチン投与前に血清ＨＢｓＡｇレベルおよびＨＢｅＡｇレベルを決定することを含む。すなわち、血清ＨＢｓＡｇレベルおよび血清ＨＢｅＡｇレベルを、対象で少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつタンパク質ベースのワクチン投与前に決定する。In some embodiments, the methods of the invention further include determining serum HBsAg and HBeAg levels after administration of at least one dose of the RNAi agent and before administration of the protein-based vaccine. That is, serum HBsAg and serum HBeAg levels are determined in a subject after administration of at least one dose of the RNAi agent and before administration of a protein-based vaccine.

ある実施態様において、核酸ベースのワクチンは、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇ両者をコードする少なくとも一つの発現ベクター構築物を含む。ある実施態様において、発現構築物は、単一プロモーターからのＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇ発現を促進する。他の実施態様において、発現構築物は、別々のプロモーターからのＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇの発現を促進する。In some embodiments, the nucleic acid-based vaccine comprises at least one expression vector construct encoding both HBcAg and HBsAg. In some embodiments, the expression construct drives expression of HBcAg and HBsAg from a single promoter. In other embodiments, the expression construct drives expression of HBcAg and HBsAg from separate promoters.

ある実施態様において、少なくとも一つのプロモーターは、呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)プロモーター、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター、ＰＨ５プロモーターおよびＨ１プロモーターから選択される。ある実施態様において、発現構築物はウイルスベクターを含む。ある実施態様において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター；レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター；単純ヘルペスウイルスベクター；ＳＶ４０ベクター；ポリオーマウイルスベクター；乳頭腫ウイルスベクター；ピコルナウイルスベクター；ポックスウイルスベクター、オルソポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ(ＭＶＡ)ベクター、トリポックスベクター、カナリアポックスベクター、鶏痘ベクター、アデノウイルスベクターおよびエプスタイン・バーウイルスベクターから選択される。ある実施態様において、ウイルスベクターはＭＶＡベクターである。In some embodiments, the at least one promoter is selected from a respiratory syncytial virus (RSV) promoter, a cytomegalovirus (CMV) promoter, a PH5 promoter, and an H1 promoter. In some embodiments, the expression construct comprises a viral vector. In some embodiments, the viral vector is selected from an adenoviral vector; a retroviral vector, a lentiviral vector, a Moloney murine leukemia virus vector, an adeno-associated virus vector; a herpes simplex virus vector; an SV 40 vector; a polyoma virus vector; a papilloma virus vector; a picornavirus vector; a poxvirus vector, an orthopoxvirus vector, a vaccinia virus vector, a modified vaccinia virus Ankara (MVA) vector, an avian pox vector, a canarypox vector, a fowlpox vector, an adenovirus vector, and an Epstein-Barr virus vector. In some embodiments, the viral vector is an MVA vector.

ある実施態様において、対象に投与される核酸ベースのワクチンは、組織培養感染量(ＴＣＩＤ_５０)が１０^６～１０^１０ＴＣＩＤ_５０；または１０^６～１０^９ＴＣＩＤ_５０；または１０^６～１０^８ＴＣＩＤ_５０で含まれる。 In some embodiments, the nucleic acid-based vaccine administered to a subject comprises a tissue culture infectious dose (TCID₅₀ ) of 10⁶ to 10¹⁰ TCID₅₀ ; or 10⁶ to 10⁹ TCID₅₀ ; or 10⁶ to 10⁸ TCID₅₀ .

ある実施態様において、核酸ベースのベクターは、最終用量のタンパク質ベースのワクチンが対象に投与された後２週間以降に対象に投与される。
In some embodiments, the nucleic acid-based vector is administered to the subject no later than two weeks after the final dose of the protein-based vaccine is administered to the subject.

ある実施態様において、方法は、さらに、少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつ核酸ベースのワクチンの投与前に血清ＨＢｓＡｇレベルを決定することを含む。すなわち、血清ＨＢｓＡｇレベルを、少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつ核酸ベースのワクチンの投与前に対象で決定する。ある実施態様において、核酸ベースのワクチンを、対象に少なくとも１用量のタンパク質ベースのワクチンを投与した後の少なくとも０.５log 10の血清ＨＢｓＡｇの減少後、対象に投与する。本レジメンのある実施態様において、単回用量の核酸ベースのワクチンを対象に投与する。In some embodiments, the method further includes determining serum HBsAg levels after administration of at least one dose of the RNAi agent and before administration of the nucleic acid-based vaccine. That is, serum HBsAg levels are determined in the subject after administration of at least one dose of the RNAi agent and before administration of the nucleic acid-based vaccine. In some embodiments, the nucleic acid-based vaccine is administered to the subject after a reduction in serum HBsAg of at least 0.5 log 10 after administration of at least one dose of the protein-based vaccine to the subject. In some embodiments of this regimen, a single dose of the nucleic acid-based vaccine is administered to the subject.

ある実施態様において、方法は、さらに少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつ核酸ベースのワクチンの投与前に血清ＨＢｅＡｇレベルを決定することを含む。すなわち、血清ＨＢｅＡｇレベルを、少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつ核酸ベースのワクチンの投与前に対象で決定する。ある実施態様において、核酸ベースのワクチンを、少なくとも１用量のタンパク質ベースのワクチンを対象に投与した後の少なくとも０.５log 10の血清ＨＢｅＡｇの減少後、対象に投与する。本レジメンのある実施態様において、単回用量の核酸ベースのワクチンを対象に投与する。In some embodiments, the method further includes determining serum HBeAg levels after administration of at least one dose of the RNAi agent and before administration of the nucleic acid-based vaccine. That is, serum HBeAg levels are determined in the subject after administration of at least one dose of the RNAi agent and before administration of the nucleic acid-based vaccine. In some embodiments, the nucleic acid-based vaccine is administered to the subject after a reduction in serum HBeAg of at least 0.5 log 10 after administration of at least one dose of the protein-based vaccine to the subject. In some embodiments of this regimen, a single dose of the nucleic acid-based vaccine is administered to the subject.

ある実施態様において、方法は、さらに少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつ核酸ベースのワクチンの投与前に血清ＨＢｓＡｇレベルおよびＨＢｅＡｇレベルを決定することを含む。すなわち、血清ＨＢｓＡｇレベルおよび血清ＨＢｅＡｇレベルを、対象において少なくとも１用量のＲＮＡｉ剤の投与後かつ核酸ベースのワクチンの投与前に決定する。ある実施態様において、核酸ベースのワクチンを、少なくとも１用量のタンパク質ベースのワクチンを対象に投与した後の少なくとも０.５log 10の血清ＨＢｓＡｇおよび血清ＨＢｅＡｇのさらなる減少後、対象に投与する。本レジメンのある実施態様において、単回用量の核酸ベースのワクチンを対象に投与する。In some embodiments, the method further includes determining serum HBsAg and HBeAg levels after administration of at least one dose of the RNAi agent and before administration of the nucleic acid-based vaccine. That is, serum HBsAg and serum HBeAg levels are determined in the subject after administration of at least one dose of the RNAi agent and before administration of the nucleic acid-based vaccine. In some embodiments, the nucleic acid-based vaccine is administered to the subject after a further reduction in serum HBsAg and serum HBeAg of at least 0.5 log 10 after administration of at least one dose of the protein-based vaccine to the subject. In some embodiments of this regimen, a single dose of the nucleic acid-based vaccine is administered to the subject.

ある実施態様において、方法は、さらに、少なくともＨＢＶを標的とするｉＲＮＡの投与前に対象にヌクレオチ(シ)ドアナログを投与することを含む。ある実施態様において、ヌクレオチ(シ)ドアナログは、レジメン全体にわたって投与される。ある実施態様において、ヌクレオチ(シ)ドアナログは、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩(ＴＤＦ)、テノホビルアラフェナミド(ＴＡＦ)、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル(ＥＴＶ)、テルビブジン、ＡＧＸ－１００９、エムトリシタビン、クレブジン、リトナビル、ジピボキシル、ロブカビル、ファムビル、ＦＴＣ、Ｎ－アセチル－システイン(ＮＡＣ)、ＰＣ１３２３、セラダイム－ＨＢＶ、チモシン－アルファおよびガンシクロビル、ベシフォビル(ＡＮＡ－３８０／ＬＢ－８０３８０)およびテノフォビル－エクサリエード(tenofovir-exaliades)(ＴＬＸ／ＣＭＸ１５７)から選択される。In some embodiments, the method further comprises administering a nucleotide analog to the subject at least prior to administration of the iRNA targeting HBV. In some embodiments, the nucleotide analog is administered throughout the regimen. In some embodiments, the nucleotide analog is selected from tenofovir disoproxil fumarate (TDF), tenofovir alafenamide (TAF), lamivudine, adefovir dipivoxil, entecavir (ETV), telbivudine, AGX-1009, emtricitabine, clevudine, ritonavir, dipivoxil, lobucavir, famvir, FTC, N-acetyl-cysteine (NAC), PC1323, Seradigm-HBV, thymosin-alpha, and ganciclovir, besifovir (ANA-380/LB-80380), and tenofovir-exaliades (TLX/CMX157).

ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与前に３０００IU／ml未満の血清ＨＢｓＡｇを有する。ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与前に４０００IU／ml未満の血清ＨＢｓＡｇを有する。ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与前に５０００IU／ml未満の血清ＨＢｓＡｇを有する。In some embodiments, the subject has a serum HBsAg of less than 3000 IU/ml prior to administration of the RNAi agent. In some embodiments, the subject has a serum HBsAg of less than 4000 IU/ml prior to administration of the RNAi agent. In some embodiments, the subject has a serum HBsAg of less than 5000 IU/ml prior to administration of the RNAi agent.

ある実施態様において、対象で、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、少なくとも２ログ_１０スケールのＨＢｓＡｇレベルの減少がある。ある実施態様において、対象で、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、少なくとも１ログ_１０スケールのＨＢｅＡｇレベルの減少がある。ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、少なくとも２ログ_１０スケールのＨＢｓＡｇレベルの減少および少なくとも１ログ_１０スケールのＨＢｅＡｇレベルの減少がある。 In some embodiments, the subject has a reduction in HBsAg levels of at least 2 log₁₀ scale after administration of the RNAi agent and before administration of the first dose of a protein-based vaccine. In some embodiments, the subject has a reduction in HBeAg levels of at least 1 log₁₀ scale after administration of the RNAi agent and before administration of the first dose of a protein-based vaccine. In some embodiments, the subject has a reduction in HBsAg levels of at least 2 log₁₀ scale and a reduction in HBeAg levels of at least 1 log₁₀ scale after administration of the RNAi agent and before administration of the first dose of a protein-based vaccine.

ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、５００IU／ml以下へのＨＢｓＡｇレベルの減少がある。ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、２００IU／ml以下へのＨＢｓＡｇレベルの減少がある。ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、１００IU／ml以下へのＨＢｓＡｇレベルの減少がある。In some embodiments, the subject has a reduction in HBsAg levels to 500 IU/ml or less after administration of the RNAi agent and before administration of the first dose of a protein-based vaccine. In some embodiments, the subject has a reduction in HBsAg levels to 200 IU/ml or less after administration of the RNAi agent and before administration of the first dose of a protein-based vaccine. In some embodiments, the subject has a reduction in HBsAg levels to 100 IU/ml or less after administration of the RNAi agent and before administration of the first dose of a protein-based vaccine.

ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、５００IU／ml以下へのＨＢｅＡｇレベルの減少がある。ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、２００IU／ml以下へのＨＢｅＡｇレベルの減少がある。ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、１００IU／ml以下へのＨＢｅＡｇレベルの減少がある。In some embodiments, the subject has a reduction in HBeAg levels to 500 IU/ml or less after administration of the RNAi agent and before administration of the first dose of a protein-based vaccine. In some embodiments, the subject has a reduction in HBeAg levels to 200 IU/ml or less after administration of the RNAi agent and before administration of the first dose of a protein-based vaccine. In some embodiments, the subject has a reduction in HBeAg levels to 100 IU/ml or less after administration of the RNAi agent and before administration of the first dose of a protein-based vaccine.

ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、５００IU／ml以下へのＨＢｓＡｇレベルおよびＨＢｅＡｇレベルの減少がある。ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、２００IU／ml以下へのＨＢｓＡｇレベルおよびＨＢｅＡｇレベルの減少がある。ある実施態様において、対象は、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのワクチン投与前、１００IU／ml以下へのＨＢｓＡｇレベルおよびＨＢｅＡｇレベルの減少がある。In some embodiments, the subject has a reduction in HBsAg and HBeAg levels to 500 IU/ml or less after administration of the RNAi agent and before administration of the first dose of a protein-based vaccine. In some embodiments, the subject has a reduction in HBsAg and HBeAg levels to 200 IU/ml or less after administration of the RNAi agent and before administration of the first dose of a protein-based vaccine. In some embodiments, the subject has a reduction in HBsAg and HBeAg levels to 100 IU/ml or less after administration of the RNAi agent and before administration of the first dose of a protein-based vaccine.

ある実施態様において、対象における血清ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇのレベルは、核酸ベースのワクチンの投与終了後少なとも３か月、臨床アッセイを使用する検出のレベル未満まで減少する。ある実施態様において、対象における血清ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇのレベルは、核酸ベースのワクチンの投与終了後少なくとも６か月、臨床アッセイを使用する検出のレベル未満まで減少する。In some embodiments, serum HBsAg and HBeAg levels in a subject decrease to below the level of detection using a clinical assay at least 3 months after administration of the nucleic acid-based vaccine ends. In some embodiments, serum HBsAg and HBeAg levels in a subject decrease to below the level of detection using a clinical assay at least 6 months after administration of the nucleic acid-based vaccine ends.

ある実施態様において、対象における血清ＨＢｓＡｇは、核酸ベースのワクチンの投与終了後少なくとも６か月、臨床アッセイを使用する検出のレベル未満まで減少する。In one embodiment, serum HBsAg in the subject decreases to below the level of detection using a clinical assay for at least 6 months after administration of the nucleic acid-based vaccine has ended.

ある実施態様において、方法は、さらに対象に免疫刺激剤を投与することを含む。ある実施態様において、免疫刺激剤は、ペグ化インターフェロンアルファ２ａ(ＰＥＧ－ＩＦＮ－アルファ－２ａ)、インターフェロンａｌｆａ－２ｂ、ＰＥＧ－ＩＦＮ－アルファ－２ｂ、インターフェロンラムダ、組み換えヒトインターロイキン－７およびトール様受容体３、７、８または９(ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９)アゴニスト、ウイルス侵入阻害剤、Myrcludex、ＨＢｓＡｇの分泌または放出を阻害するオリゴヌクレオチド、ＲＥＰ９ＡＣ、カプシド阻害剤、Ｂａｙ４１－４１０９、ＮＶＲ－１２２１、ｃｃｃＤＮＡ阻害剤、ＩＨＶＲ－２５)、ウイルスカプシド、ＭＶＡカプシド、免疫チェックポイント制御因子、ＣＴＬＡ－４阻害剤、イピリムマブ、ＰＤ－１阻害剤、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ＢＧＢ－Ａ３１７抗体、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブおよびアフィマー生物学的製剤からなる群から選択される。In some embodiments, the method further comprises administering to the subject an immune stimulant. In some embodiments, the immune stimulant is pegylated interferon alpha 2a (PEG-IFN-alpha-2a), interferon alfa-2b, PEG-IFN-alpha-2b, interferon lambda, recombinant human interleukin-7, and toll-like receptor 3, 7, 8, or 9 (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9) agonists, viral entry inhibitors, Myrcludex, oligonucleotides that inhibit secretion or release of HBsAg, REP 9AC, capsid inhibitors, Bay41-4109, NVR-1221, cccDNA inhibitors, IHVR-25), viral capsids, MVA capsids, immune checkpoint regulators, CTLA-4 inhibitors, ipilimumab, PD-1 inhibitors, nivolumab, pembrolizumab, BGB-A317 antibody, PD-L1 inhibitors, atezolizumab, avelumab, durvalumab and Afimer biologics.

本レジメンのある実施態様において、対象はヒトである。In one embodiment of this regimen, the subject is a human.

本レジメンのある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、ＨＢＶの４転写物を標的とする。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、付属表ＡのｉＲＮＡから選択される。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、付属表Ａの表２～１１のいずれかの薬剤のいずれかから選択される。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、配列番号１(ＮＣ＿００３９７７.１)のヌクレオチド２０６～２２８、２０７～２２９、２１０～２３２、２１２～２３４、２１４～２３６、２１５～２３７、２１６～２３８、２２６～２４８、２４５～２６７、２５０～２７２、２５２～２７４、２５３～２７５、２５４～２７６、２５６～２７８、２５８～２８０、２６３～２８５、３７０～３９２、３７３～３９５、３７５～３９７、４０１～４２３、４０５～４２７、４１０～４３２、４１１～４３３、４２２～４４４、４２４～４４６、４２５～４４７、４２６～４４８、７３１～７５３、７３４～７５６、１１７４～１１９６、１２５０～１２７２、１２５５～１２７７、１２５６～１２７８、１５４５～１５６７、１５４７～１５６９、１５５１～１５７１、１５７７～１５９７、１５７９～１５９７、１５８０～１５９８、１８０６～１８２５、１８１２～１８３１、１８１４～１８３６、１８２９～１８５１、１８３１～１８５３、１８５７～１８７９、１８６４～１８８６、２２５９～２２８１、２２９８～２３２０または２８２８～２８５０の少なくとも１５連続ヌクレオチドを標的とする。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、配列番号１(ＮＣ＿００３９７７.１)のヌクレオチド１５７９～１５９７または１８１２～１８３１の少なくとも１５連続ヌクレオチドを標的とする。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤は、配列番号１(ＮＣ＿００３９７７.１)のヌクレオチド１５７９～１５９７または１８１２～１８３１を標的とする。In some embodiments of this regimen, the RNAi agent targets HBV 4 transcript. In some embodiments, the RNAi agent is selected from an iRNA in Appendix Table A. In some embodiments, the RNAi agent is selected from any of the agents in any of Tables 2-11 of Appendix Table A. In some embodiments, the RNAi agent is selected from nucleotides 206-228, 207-229, 210-232, 212-234, 214-236, 215-237, 216-238, 226-248, 245-267, 250-272, 252-274, 253-275, 254-276, 256-278, 258-280, 263-285, 370-392, 373-395, 375-397, 401-423, 405-427, 410-432, 411-433, 422-444, 424-446, 425-448, 426-449, 430-431, 432-433, 434-435, 436-437, 438-439, 440-441, 442-443, 444-445, 446-447, 448-449, 449-450, 450-451, 452-453, 454-455, 456-457, 458-459, 460-461, 462-463, 464-465, 466-467, 468-469, 470-472, 472-474, 474-475, 476-478, 478-479, 480-481, 482-483, 4 1545-1567, 1547-1569, 1551-1571, 1577-1597, 1579-1597, 1580-1598, 1806-1825, 1812-1831, 1814-1836, 1829-1851, 1831-1853, 1857-1879, 1864-1886, 2259-2281, 2298-2320 or 2828-2850. In some embodiments, the RNAi agent targets at least 15 contiguous nucleotides between nucleotides 1579-1597 or 1812-1831 of SEQ ID NO:1 (NC_003977.1). In some embodiments, the RNAi agent targets nucleotides 1579-1597 or 1812-1831 of SEQ ID NO:1 (NC_003977.1).

ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、UGUGAAGCGAAGUGCACACUU(配列番号２５)またはAGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU(配列番号２６)の少なくとも１５連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、UGUGAAGCGAAGUGCACACUU(配列番号２５)またはAGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU(配列番号２６)の少なくとも１９連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、UGUGAAGCGAAGUGCACACUU(配列番号２５)またはAGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU(配列番号２６)のヌクレオチド配列を含む。In some embodiments, the antisense strand of the RNAi agent comprises a nucleotide sequence of at least 15 contiguous nucleotides of UGUGAAGCGAAGUGCACACUU (SEQ ID NO: 25) or AGGUGAAAAAAGUUGCAUGGUGUU (SEQ ID NO: 26). In some embodiments, the antisense strand of the RNAi agent comprises a nucleotide sequence of at least 19 contiguous nucleotides of UGUGAAGCGAAGUGCACACUU (SEQ ID NO: 25) or AGGUGAAAAAAGUUGCAUGGUGUU (SEQ ID NO: 26). In some embodiments, the antisense strand of the RNAi agent comprises a nucleotide sequence of UGUGAAGCGAAGUGCACACUU (SEQ ID NO: 25) or AGGUGAAAAAAGUUGCAUGGUGUU (SEQ ID NO: 26).

ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、GUGUGCACUUCGCUUCACA(配列番号２７)またはCACCAUGCAACUUUUUCACCU(配列番号２８)の少なくとも１５連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、GUGUGCACUUCGCUUCACA(配列番号２７)またはCACCAUGCAACUUUUUCACCU(配列番号２８)の少なくとも１９連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、GUGUGCACUUCGCUUCACA(配列番号２７)またはCACCAUGCAACUUUUUCACCU(配列番号２８)のヌクレオチド配列を含む。In some embodiments, the sense strand of the RNAi agent comprises a nucleotide sequence of at least 15 contiguous nucleotides of GUGUGCACUUCGCUUCACA (SEQ ID NO: 27) or CACCAUGCAACUUUUUCACCU (SEQ ID NO: 28). In some embodiments, the sense strand of the RNAi agent comprises a nucleotide sequence of at least 19 contiguous nucleotides of GUGUGCACUUCGCUUCACA (SEQ ID NO: 27) or CACCAUGCAACUUUUUCACCU (SEQ ID NO: 28). In some embodiments, the sense strand of the RNAi agent comprises a nucleotide sequence of GUGUGCACUUCGCUUCACA (SEQ ID NO: 27) or CACCAUGCAACUUUUUCACCU (SEQ ID NO: 28).

ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖はUGUGAAGCGAAGUGCACACUU(配列番号２５)の少なくとも１５連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、センス鎖はGUGUGCACUUCGCUUCACA(配列番号２７)の少なくとも１５連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖はUGUGAAGCGAAGUGCACACUU(配列番号２５)の少なくとも１９連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、センス鎖はGUGUGCACUUCGCUUCACA(配列番号２７)の少なくとも１９連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖はUGUGAAGCGAAGUGCACACUU(配列番号２５)のヌクレオチド配列を含み、センス鎖はGUGUGCACUUCGCUUCACA(配列番号２７)のヌクレオチド配列を含む。In one embodiment, the antisense strand of the RNAi agent comprises a nucleotide sequence of at least 15 contiguous nucleotides of UGUGAAGCGAAGUGCACACUU (SEQ ID NO: 25) and the sense strand comprises a nucleotide sequence of at least 15 contiguous nucleotides of GUGUGCACUUCGCUUCACA (SEQ ID NO: 27). In one embodiment, the antisense strand of the RNAi agent comprises a nucleotide sequence of at least 19 contiguous nucleotides of UGUGAAGCGAAGUGCACACUU (SEQ ID NO: 25) and the sense strand comprises a nucleotide sequence of at least 19 contiguous nucleotides of GUGUGCACUUCGCUUCACA (SEQ ID NO: 27). In one embodiment, the antisense strand of the RNAi agent comprises a nucleotide sequence ... GUGUGCACUUCGCUUCACA (SEQ ID NO: 27).

ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖はAGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU(配列番号２６)の少なくとも１５連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖はCACCAUGCAACUUUUUCACCU(配列番号２８)の少なくとも１５連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖はAGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU(配列番号２６)の少なくとも１９連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖はCACCAUGCAACUUUUUCACCU(配列番号２８)の少なくとも１９連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖はAGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU(配列番号２６)のヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖はCACCAUGCAACUUUUUCACCU(配列番号２８)のヌクレオチド配列を含む。In one embodiment, the antisense strand of the RNAi agent comprises a nucleotide sequence of at least 15 contiguous nucleotides of AGGUGAAAAAAGUUGCAUGGUGUU (SEQ ID NO: 26) and the sense strand of the RNAi agent comprises a nucleotide sequence of at least 15 contiguous nucleotides of CACCAUGCAACUUUUUCACCU (SEQ ID NO: 28). In one embodiment, the antisense strand of the RNAi agent comprises a nucleotide sequence of at least 19 contiguous nucleotides of AGGUGAAAAAAGUUGCAUGGUGUU (SEQ ID NO: 26) and the sense strand of the RNAi agent comprises a nucleotide sequence of at least 19 contiguous nucleotides of CACCAUGCAACUUUUUCACCU (SEQ ID NO: 28). In one embodiment, the antisense strand of the RNAi agent comprises a nucleotide sequence ... CACCAUGCAACUUUUUCACCU (SEQ ID NO: 28).

本レジメンのある実施態様において、該センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよび該アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全ては修飾ヌクレオチドであり、ここで、該センス鎖は、３’末端で結合するリガンドにコンジュゲートする。ある実施態様において、リガンドは、単価リンカー、二価分岐リンカーまたは三価分岐リンカーを介して結合した１以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。ある実施態様において、該修飾ヌクレオチドの少なくとも一つは、デオキシ－ヌクレオチド、３’末端デオキシ－チミン(ｄＴ)ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、配座固定ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル－修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル－修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミド酸、ヌクレオチド含有非天然塩基、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１,５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基含有ヌクレオチド、メチルホスホネート基含有ヌクレオチド、５’－ホスフェート含有ヌクレオチドおよび５’－ホスフェート模倣体含有ヌクレオチドからなる群から選択される。In certain embodiments of this regimen, substantially all of the nucleotides of the sense strand and substantially all of the nucleotides of the antisense strand are modified nucleotides, and wherein the sense strand is conjugated to a ligand attached at the 3' terminus. In certain embodiments, the ligand is one or more GalNAc derivatives attached via a monovalent linker, a divalent branched linker, or a trivalent branched linker. In some embodiments, at least one of the modified nucleotides is selected from the group consisting of deoxy-nucleotides, 3'-terminal deoxy-thymine (dT) nucleotides, 2'-O-methyl modified nucleotides, 2'-fluoro modified nucleotides, 2'-deoxy-modified nucleotides, locked nucleotides, unlocked nucleotides, conformationally fixed nucleotides, constrained ethyl nucleotides, abasic nucleotides, 2'-amino-modified nucleotides, 2'-O-allyl-modified nucleotides, 2'-C-alkyl-modified nucleotides, 2'-hydroxyl-modified nucleotides, 2'-methoxyethyl-modified nucleotides, 2'-O-alkyl-modified nucleotides, morpholino nucleotides, phosphoramidates, nucleotides containing non-natural bases, tetrahydropyran-modified nucleotides, 1,5-anhydrohexitol-modified nucleotides, cyclohexenyl-modified nucleotides, phosphorothioate group-containing nucleotides, methylphosphonate group-containing nucleotides, 5'-phosphate-containing nucleotides, and 5'-phosphate mimic-containing nucleotides.

ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤の少なくとも一つの鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤の少なくとも一つの鎖は、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域は、１５～３０ヌクレオチド対長；１７～２３ヌクレオチド対長；１７～２５ヌクレオチド対長；２３～２７ヌクレオチド対長；１９～２１ヌクレオチド対長；２１～２３ヌクレオチド対長である。In some embodiments, at least one strand of the RNAi agent comprises a 3' overhang of at least one nucleotide. In some embodiments, at least one strand of the RNAi agent comprises a 3' overhang of at least two nucleotides. In some embodiments, the double-stranded region of the RNAi agent is 15-30 nucleotide pairs long; 17-23 nucleotide pairs long; 17-25 nucleotide pairs long; 23-27 nucleotide pairs long; 19-21 nucleotide pairs long; 21-23 nucleotide pairs long.

ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１５～３０ヌクレオチド有する。In some embodiments, each strand of the RNAi agent has 15-30 nucleotides.

ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１９～３０ヌクレオチド有する。In some embodiments, each strand of the RNAi agent has 19-30 nucleotides.

ある実施態様において、リガンドは
であり、ＲＮＡｉ剤は所望により下記模式図に示すとおりリガンドにコンジュゲートする。
〔式中、ＸはＯまたはＳである。〕。 In one embodiment, the ligand is
and the RNAi agent is optionally conjugated to a ligand as shown in the schematic below.
wherein X is O or S.

ある実施態様において、センス鎖はヌクレオチド配列５’－gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca－３’(配列番号２９)を含み、アンチセンス鎖はヌクレオチド配列５’－usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu－３’(配列番号３０)を含む；またはセンス鎖はヌクレオチド配列５’－csasccauGfcAfAfCfuuuuucaccu－３’(配列番号３１)を含み、アンチセンス鎖はヌクレオチド配列５’－asGfsgugAfaAfAfaguuGfcAfuggugsusu－３’(配列番号３２)を含み、ここで、ａ、ｃおよびｕはそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスフェート、２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－ホスフェートおよび２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスフェートであり；ａｓ、ｃｓ、ｇｓおよびｕｓはそれぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’－ホスホロチオエート、２’－Ｏ－メチルシチジン－３’－ホスホロチオエート、２’－Ｏ－メチルグアノシン－３’－ホスホロチオエートおよび２’－Ｏ－メチルウリジン－３’－ホスホロチオエートであり；Ａｆ、Ｃｆ、ＧｆおよびＵｆはそれぞれ２’－フルオロアデノシン－３’－ホスフェート、２’－フルオロシチジン－３’－ホスフェート、２’－フルオログアノシン－３’－ホスフェートおよび２’－フルオロウリジン－３’－ホスフェートであり；そしてＧｆｓは２’－フルオログアノシン－３’－ホスホロチオエートである。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤はＡＤ－６６８１０またはＡＤ－６６８１６である。In one embodiment, the sense strand comprises the nucleotide sequence 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (SEQ ID NO:29) and the antisense strand comprises the nucleotide sequence 5'-usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (SEQ ID NO:30); or the sense strand comprises the nucleotide sequence 5'-csasccauGfcAfAfCfuuuuucaccu-3' (SEQ ID NO:31) and the antisense strand comprises the nucleotide sequence 5'-asGfsgugAfaAfAfaguuGfcAfuggugsusu-3' (SEQ ID NO:32), where a, c and u are 2'-O-methyl adenosine-3'-phosphate, 2'-O-methyl cytidine ... '-phosphate and 2'-O-methyluridine-3'-phosphate; as, cs, gs and us are 2'-O-methyladenosine-3'-phosphorothioate, 2'-O-methylcytidine-3'-phosphorothioate, 2'-O-methylguanosine-3'-phosphorothioate and 2'-O-methyluridine-3'-phosphorothioate, respectively; Af, Cf, Gf and Uf are 2'-fluoroadenosine-3'-phosphate, 2'-fluorocytidine-3'-phosphate, 2'-fluoroguanosine-3'-phosphate and 2'-fluorouridine-3'-phosphate, respectively; and Gfs is 2'-fluoroguanosine-3'-phosphorothioate. In some embodiments, the RNAi agent is AD-66810 or AD-66816.

ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンは、ＨＢＶの少なくとも４、５、６、７、８、９または１０遺伝子型に存在するエピトープを含む。In one embodiment, the protein-based vaccine comprises epitopes present in at least genotypes 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 of HBV.

ある実施態様において、核酸ベースのワクチンは、ＨＢＶの少なくとも４、５、６、７、８、９または１０遺伝子型に存在するエピトープを含む。In one embodiment, the nucleic acid-based vaccine comprises epitopes present in at least genotypes 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 of HBV.

本発明は、さらにここに提供する方法に基づくＢ型肝炎ウイルス感染を有する対象の処置のためのここに提供するＲＮＡｉ剤およびワクチンの使用を提供する。ある実施態様において、ＲＮＡｉ剤およびＨＢＶワクチンは、ＨＢＶ感染を有する対象の処置用医薬の製造に使用される。The present invention further provides the use of the RNAi agents and vaccines provided herein for the treatment of a subject having a Hepatitis B virus infection according to the methods provided herein. In some embodiments, the RNAi agents and HBV vaccines are used in the manufacture of a medicament for the treatment of a subject having an HBV infection.

本発明は、さらにここに提供するＲＮＡｉ剤およびワクチンおよびＢ型肝炎ウイルス感染を有する対象の処置へのその使用に関する処置レジメンを提供する指示を含む、キットを提供する。The present invention further provides kits comprising the RNAi agents and vaccines provided herein and instructions providing a treatment regimen for their use in treating a subject having a Hepatitis B virus infection.

本発明を、次の詳細な記載および図面によりさらに説明する。The invention is further described in the following detailed description and drawings.

図１は、約３.２kb二本鎖ＨＢＶゲノムの構造の模式図である。ＨＢＶゲノムの複製はＲＮＡ中間体を経て生じ、約３.５kb、２.４kb、２.１kbおよび０.７kbの４つの重複ウイルス転写物(停止部位は矢印で示す)および３つの読み枠にわたり翻訳される７ウイルスタンパク質(ｐｒｅ－Ｓ１、ｐｒｅ－Ｓ２、Ｓ、Ｐ、Ｘ、ｐｒｅ－ＣおよびＣ)をコードする共通３’末端を産生する。Figure 1 is a schematic diagram of the structure of the approximately 3.2 kb double-stranded HBV genome. Replication of the HBV genome occurs via an RNA intermediate to produce four overlapping viral transcripts of approximately 3.5 kb, 2.4 kb, 2.1 kb and 0.7 kb (termination sites indicated by arrows) and a common 3' end that encodes seven viral proteins (pre-S1, pre-S2, S, P, X, pre-C and C) that are translated across three reading frames.

図２Ａ～２Ｅは、トランスジェニックマウスモデルでのｓｉＲＮＡによるＨＢＶの抑制を示すグラフである。単一皮下３mg／kgまたは９mg／kg用量の対照ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡ(ＨＢＶを標的としないｓｉＲＮＡ)、ＡＤ－６６８１６またはＡＤ－６６８１０後のＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウス(ｎ＝６／群)の血清における(２Ａ)ＨＢｓＡｇ、(２Ｂ)ＨＢｅＡｇおよび(２Ｃ)ＨＢＶ－ＤＮＡのレベル。ＲＴ－ｑＰＣＲおよびグリセルアルデヒド３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ(ＧＡＰＤＨ)の発現に対して正規化により決定した肝臓ライセートからの(２Ｄ)総ＨＢＶＲＮＡおよび(２Ｅ)３.５kb ＨＢＶ転写物のレベル。2A-2E are graphs showing inhibition of HBV by siRNA in a transgenic mouse model. (2A) HBsAg, (2B) HBeAg, and (2C) HBV-DNA levels in serum of HBV1.3-xfs mice (n=6/group) following a single subcutaneous 3 mg/kg or 9 mg/kg dose of control GalNAc-siRNA (a siRNA not targeting HBV), AD-66816, or AD-66810. (2D) Total HBV RNA and (2E) 3.5 kb HBV transcript levels from liver lysates determined by RT-qPCR and normalization to expression of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH).

図３は、ＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスのＨＢＶに対する治療ワクチンの投与前のヌクレオシド阻害剤、エンテカビル、ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡ、対照ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡ、ＡＤ－６６８１６またはＡＤ－６６８１０での前処置の効果をアッセイする実験の投与レジメンを示す模式図である。FIG. 3 is a schematic diagram showing the dosing regimen for an experiment assaying the effect of pretreatment with the nucleoside inhibitors, entecavir, HBV-shRNA, control GalNAc-siRNA, AD-66816, or AD-66810 prior to administration of a therapeutic vaccine against HBV in HBV1.3-xfs mice.

図４Ａ～４Ｃは、図３に示す投与レジメンに基づく処置後のＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスの血清における(４Ａ)ＨＢｓＡｇ、(４Ｂ)ＨＢｅＡｇおよび(４Ｃ)ＨＢＶ－ＤＮＡのレベルを示すグラフである。4A-4C are graphs showing levels of (4A) HBsAg, (4B) HBeAg, and (4C) HBV-DNA in the serum of HBV1.3-xfs mice following treatment according to the dosing regimen shown in FIG.

図５Ａ～５Ｆは、図３に示す投与レジメンに基づく処置後のＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスにおけるペプチド(５Ａ)ＨＢｓ(Ｓ２０８)、(５Ｂ)ＨＢｃ(Ｃ９３)および(５Ｃ)ＭＶＡ(Ｂ８Ｒ)に対する肝臓のＴ細胞免疫応答を示すグラフである。図５Ｄ～５Ｆは、死亡免疫細胞の不十分な排除に適応させるために実施した図５Ａ～５Ｃと同じデータの再分析であり、ペプチド(５Ｄ)ＨＢｓ(Ｓ２０８)、(５Ｅ)ＨＢｃ(Ｃ９３)および(５Ｆ) ＭＶＡ(Ｂ８Ｒ)に対する肝臓のＴ細胞免疫応答を示す。Figures 5A-5F are graphs showing hepatic T cell immune responses to peptides (5A) HBs(S208), (5B) HBc(C93) and (5C) MVA(B8R) in HBV1.3-xfs mice following treatment according to the dosing regimen shown in Figure 3. Figures 5D-5F are reanalysis of the same data as Figures 5A-5C performed to accommodate for inefficient clearance of dead immune cells, showing hepatic T cell immune responses to peptides (5D) HBs(S208), (5E) HBc(C93) and (5F) MVA(B8R).

図６Ａ～６Ｃは、図３に示す投与レジメンに基づく処置後のＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスの肝細胞におけるＨＢＶＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを示す。図６Ａは総ＨＢＶＲＮＡを示す。図６Ｂは、ＲＴ－ｑＰＣＲにより決定したＧＡＰＤＨに対するＨＢＶ３.５kb転写物を示す。図６Ｃは、免疫組織化学染色により検出した肝臓切片mm^２あたりのＨＢｃＡｇ陽性細胞数を示す。Figures 6A-6C show HBV RNA and protein levels in hepatocytes of HBV1.3-xfs mice following treatment according to the dosing regimen shown in Figure 3. Figure 6A shows total HBV RNA. Figure 6B shows HBV 3.5 kb transcript relative to GAPDH as determined by RT-qPCR. Figure 6C shows the number of HBcAg positive cells per^mm2 of liver section as detected by immunohistochemical staining.

図７は、ＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスの、ＨＢＶに対する治療ワクチンの投与前の対照ｓｉＲＮＡまたはＡＤ－６６８１６での前処置の効果をアッセイする実験の投与レジメンの模式図である。FIG. 7 is a schematic diagram of the dosing regimen for an experiment assaying the effect of pretreatment of HBV1.3-xfs mice with control siRNA or AD-66816 prior to administration of a therapeutic vaccine against HBV.

図８Ａ～８Ｃは、図７に示す投与レジメンに基づく処置後のＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスの血清の(８Ａ)ＨＢｓＡｇ、(８Ｂ)ＨＢｅＡｇおよび(８Ｃ)ＨＢＶ－ＤＮＡレベルを示すグラフである。8A-8C are graphs showing (8A) HBsAg, (8B) HBeAg, and (8C) HBV-DNA levels in serum of HBV1.3-xfs mice following treatment according to the dosing regimen shown in FIG.

図９Ａ～９Ｄは、図７に示す投与レジメンに基づく処置後のＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスのペプチド(９Ａ)ＨＢｓ(Ｓ２０８)、(９Ｂ)ＨＢｃ(Ｃ９３)、(９Ｃ)ＨＢｃ(Ｃｐｏｏｌ)および(９Ｄ)ＭＶＡ(Ｂ８Ｒ)に対する肝臓のＴ細胞免疫応答を示すグラフである。9A-9D are graphs showing hepatic T cell immune responses to peptides (9A) HBs(S208), (9B) HBc(C93), (9C) HBc(Cpool) and (9D) MVA(B8R) in HBV1.3-xfs mice following treatment according to the dosing regimen shown in FIG.

図１０Ａ～１０Ｃは、図７に示す投与レジメンに基づく処置後のＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスの肝細胞におけるＨＢＶＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを示す。図１０Ａは総ＨＢＶＲＮＡを示す。図１０Ｂは、ＲＴ－ｑＰＣＲにより決定したＧＡＰＤＨに対するＨＢＶ３.５kb転写物を示す。図１０Ｃは、免疫組織化学染色により検出した肝臓切片mm^２あたりのＨＢｃＡｇ陽性細胞数を示す。Figures 10A-10C show HBV RNA and protein levels in hepatocytes of HBV1.3-xfs mice following treatment according to the dosing regimen shown in Figure 7. Figure 10A shows total HBV RNA. Figure 10B shows HBV 3.5 kb transcript relative to GAPDH as determined by RT-qPCR. Figure 10C shows the number of HBcAg positive cells per^mm2 of liver section as detected by immunohistochemical staining.

図１１Ａおよび１１Ｂは、図７に示す投与レジメンでの６週間レジメン後の最初のワクチン投与後７週目の個々のＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスの血清における(１１Ａ)ＨＢｓＡｇおよび(１１Ｂ)ＨＢｅＡｇのレベルを示すグラフである。図１１Ｃおよび１１Ｄは、図７に示す投与レジメンでの６週間レジメン後の最初のワクチン投与後７週目の個々のＨＢＶ１.３－ｘｆｓマウスのＨＢｓ(Ｓ２０８)に対する(１１Ｃ)抗ＨＢｓ抗体応答および(１１Ｄ)肝臓のＴ細胞免疫応答を示すグラフである。Figures 11A and 11B are graphs showing (11A) HBsAg and (11B) HBeAg levels in serum of individual HBV1.3-xfs mice 7 weeks after the first vaccination after a 6 week regimen with the dosing regimen shown in Figure 7. Figures 11C and 11D are graphs showing (11C) anti-HBs antibody responses and (11D) hepatic T cell immune responses to HBs(S208) of individual HBV1.3-xfs mice 7 weeks after the first vaccination after a 6 week regimen with the dosing regimen shown in Figure 7.

図１２は、ＨＢＶをコードするＡＡＶベクターで感染させたマウスの、ＨＢＶに対する治療ワクチンの投与前の、対照ｓｉＲＮＡまたはＡＤ－６６８１６での前処置の効果をアッセイする実験の投与レジメンを示す模式図である。FIG. 12 is a schematic diagram showing the dosing regimen for an experiment assaying the effect of pretreatment of mice infected with an AAV vector encoding HBV with control siRNA or AD-66816 prior to administration of a therapeutic vaccine against HBV.

図１３Ａ～１３Ｇは、図１２に示す投与レジメンに基づく。図１３Ａおよび１３Ｂは、ＨＢＶ－ＡＡＶマウスの血清における(１３Ａ)ＨＢｓＡｇおよび(１３Ｂ)ＨＢｅＡｇのレベルを示すグラフである(差し込み図１３Ｃは、グラフ１３Ｂにおける後の時点の分解部分である)。図１３Ｄは、２２週目の血清ＨＢＶＤＮＡレベルを示す。図１３Ｄおよび１３Ｅは、２２週目の(１３Ｄ)総ＨＢＶＤＮＡおよび(１３Ｅ)ＡＡＶ－ＤＮＡの肝細胞あたりのコピー数を示す。図１３Ｆおよび１３Ｇは、(１３Ｆ)ＧＡＰＤＨＲＮＡに対するＨＢＶ３.５ＲＮＡおよび(１３Ｇ)ＧＡＰＤＨＲＮＡに対する総ＨＢＶＲＮＡの肝臓での相対的発現を示す。Figures 13A-13G are based on the dosing regimen shown in Figure 12. Figures 13A and 13B are graphs showing (13A) HBsAg and (13B) HBeAg levels in serum of HBV-AAV mice (inset 13C is a decomposition of the later time point in graph 13B). Figure 13D shows serum HBV DNA levels at week 22. Figures 13D and 13E show (13D) total HBV DNA and (13E) AAV-DNA copy number per hepatocyte at week 22. Figures 13F and 13G show (13F) relative hepatic expression of HBV3.5 RNA to GAPDH RNA and (13G) total HBV RNA to GAPDH RNA.

図１４Ａ～１４Ｃは、図１２に示す投与レジメンに基づく(１４Ａ)実験の間中の抗ＨＢｓ抗体応答および(１４Ｂ)実験１１６日目の抗ＨＢｅ抗体応答を示すグラフである。図１４Ｃは、グラフ１４Ｂの後の時点の分解部分である。Figures 14A-14C are graphs showing (14A) anti-HBs antibody responses throughout the study and (14B) anti-HBe antibody responses on study day 116, based on the dosing regimen shown in Figure 12. Figure 14C is a decomposed portion of the later time points of graph 14B.

図１５Ａおよび１５Ｂは、図１２に示す投与レジメンに基づく実験の間の動物の(１５Ａ)ＡＬＴレベルおよび(１５Ｂ)体重を示す。15A and 15B show (15A) ALT levels and (15B) body weights of animals during the experiment based on the dosing regimen shown in FIG.

正式な配列表を本明細書と共に提供し、これは本明細書の一部を形成する。A formal sequence listing is provided herewith and forms a part of this specification.

ｓｉＲＮＡターゲティングのための例示的標的配列およびｉＲＮＡ剤を提供する付属表Ａを本明細書と共に提供し、これは本明細書の一部を形成する。Appendix Table A, providing exemplary target sequences and iRNA agents for siRNA targeting, is provided herewith and forms a part of the present specification.

発明の詳細な記載
本発明は、ＨＢＶ感染の処置における１以上のＨＢＶ遺伝子(オープンリーディングフレーム／転写物)のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)介在切断を起こすｉＲＮＡ剤および１以上のＨＢＶタンパク質に対する免疫応答を刺激するＢ型肝炎ワクチンの使用の処置レジメンおよび方法を提供する。処置レジメンおよび方法は、好ましくは、一定期間内に機能的治癒を提供する。DETAILED DESCRIPTION OF THE PRESENTING The present invention provides treatment regimens and methods of use of iRNA agents that cause RNA-induced silencing complex (RISC)-mediated cleavage of RNA transcripts of one or more HBV genes (open reading frames/transcripts) and Hepatitis B vaccines that stimulate an immune response against one or more HBV proteins in the treatment of HBV infection. The treatment regimens and methods preferably provide a functional cure within a period of time.

次の詳細な記載は、ＨＢＶ遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡを含む組成物の製造および使用方法ならびにＨＢＶ遺伝子の発現阻害または減少により利益を受ける疾患および障害を有する対象を処置するための組成物、使用および方法を開示する。The following detailed description discloses methods for making and using compositions comprising iRNAs that inhibit expression of HBV genes, as well as compositions, uses and methods for treating subjects with diseases and disorders that would benefit from inhibiting or reducing expression of HBV genes.

Ｉ. 定義
本発明がより容易に理解され得るように、いくつかの用語をまず定義する。さらに、パラメータの値または値の範囲が記載されているとき、記載される値の中間の値および範囲も本発明の一部であることが意図されることは理解すべきである。I. Definitions So that the present invention may be more readily understood, certain terms are first defined. Furthermore, when a value or range of values for a parameter is listed, it should be understood that values and ranges intermediate to the listed values are also intended to be part of the present invention.

単数表現は、ここでは、文法的対象物の１または１を超える(すなわち、少なくとも１)をいう。例として、「要素」は、１つの要素または１を超える要素、例えば、複数の要素を意味する。The articles "a" and "an" are used herein to refer to one or to more than one (i.e., to at least one) of the grammatical object of the article. By way of example, "an element" means one element or more than one element, e.g., a plurality of elements.

用語「含む」は、ここでは、用語「含むが、限定されない」を意味するために使用し、両者は相互交換可能に使用される。The term "including" is used herein to mean the term "including but not limited to," and both are used interchangeably.

用語「または」は、文脈から明らかに他意が示されない限り、用語「および／または」を意味するために使用し、両者は相互交換可能に使用される。The term "or" is used to mean the term "and/or," and both are used interchangeably, unless the context clearly indicates otherwise.

用語「約」は、当分野で許容される典型的範囲内を意味するためにここで使用する。例えば、「約」は、平均からの２標準偏差内として理解され得る。ある実施態様において、「約」は±１０％を意味する。ある実施態様において、「約」は±５％を意味する。約が一連の数字または範囲の前にあるとき、「約」は、該一連のまたは範囲内の数字の各々を修飾し得ると理解される。The term "about" is used herein to mean within a typical range accepted in the art. For example, "about" may be understood as within two standard deviations from the mean. In some embodiments, "about" means ±10%. In some embodiments, "about" means ±5%. When about precedes a series of numbers or a range, it is understood that "about" may modify each of the numbers in the series or range.

数字または一連の数字の前の用語「少なくとも」は、用語「少なくとも」に隣接した数字および、文脈から明らかである、論理的に包含される全てのその後の数字または整数を含むと理解される。例えば、核酸分子のヌクレオチド数は整数でなければならない。例えば、「２１ヌクレオチド核酸分子の少なくとも１８ヌクレオチド」は、１８、１９、２０または２１ヌクレオチドが指示される性質を有することを意味する。少なくともが一連の数字または範囲の前にあるならば、「少なくとも」は、該一連のまたは範囲内の数字の各々を修飾し得ると理解される。The term "at least" before a number or series of numbers is understood to include the number adjacent to the term "at least" and all subsequent numbers or integers that are logically encompassed as are apparent from the context. For example, the number of nucleotides in a nucleic acid molecule must be an integer. For example, "at least 18 nucleotides of a 21 nucleotide nucleic acid molecule" means that 18, 19, 20, or 21 nucleotides have the indicated property. If at least precedes a series of numbers or a range, it is understood that "at least" can modify each of the numbers in the series or range.

ここで使用する「以下」または「未満」は、その用語に隣接する値および、文脈から当然の、論理的なそれより低い値または整数から０までと理解される。例えば、「２以下のヌクレオチド」のオーバーハングを有する二本鎖は、２、１または０ヌクレオチドオーバーハングを有する。「以下」が一連の数字または範囲の後ろにあるとき、「以下」は、該一連のまたは範囲内の数字の各々を修飾し得ると理解される。ここで使用する範囲は、上限および下限両者を含む。As used herein, "less than" or "less than" is understood to mean the value adjacent to the term and the logical lower value or integer up to 0 as the context dictates. For example, a duplex having an overhang of "2 nucleotides or less" has 2, 1, or 0 nucleotide overhangs. When "less than" follows a series of numbers or a range, it is understood that "less than" can modify each of the numbers in the series or range. Ranges as used herein include both the upper and lower limits.

配列と転写物または他の配列上のその指定位置の間に矛盾があるならば、本明細書で引用するヌクレオチド配列が優先する。In the event of a discrepancy between a sequence and its designated location on a transcript or other sequence, the nucleotide sequence cited herein controls.

本発明の種々の実施態様を、当業者が適切とする限り、組み合わせ得る。Various embodiments of the present invention may be combined as appropriate by those skilled in the art.

ここで使用する「Ｂ型肝炎ウイルス」は用語「ＨＢＶ」と相互交換可能に使用し、ヘパドナウイルス科に属する周知の非細胞変性、肝指向性ＤＮＡウイルスをいう。As used herein, "Hepatitis B virus" is used interchangeably with the term "HBV" and refers to a well-known non-cytopathic, hepatotropic DNA virus belonging to the Hepadnaviridae family.

ＨＢＶゲノムは、重複読み枠を有する一部二本鎖の、環状ＤＮＡである(例えば、図１参照)。The HBV genome is a partially double-stranded, circular DNA with overlapping reading frames (see, for example, Figure 1).

ＨＢＶゲノムによりコードされる、サイズに基づき４つの転写物(ここでは、「遺伝子」または「オープンリーディングフレーム」と称し得る)がある。これらは、Ｃ、Ｘ、ＰおよびＳと呼ばれるオープンリーディングフレームを含む。コアタンパク質は、遺伝子Ｃ(ＨＢｃＡｇ)によりコードされる。Ｂ型肝炎ｅ抗原(ＨＢｅＡｇ)は、プレ－コア(ｐｒｅ－Ｃ)タンパク質のタンパク質分解プロセシングにより産生される。ＤＮＡポリメラーゼは遺伝子Ｐによりコードされる。遺伝子Ｓは、表面抗原(ＨＢｓＡｇ)をコードする遺伝子である。ＨＢｓＡｇ遺伝子は、一つの長いオープンリーディングフレームであり、それは３つのフレーム内「開始」(ＡＴＧ)コドンを含み、ｐｒｅ－Ｓ１＋ｐｒｅ－Ｓ２＋Ｓ、ｐｒｅ－Ｓ２＋ＳまたはＳの大型、中型および小型Ｓ抗原と呼ばれる３つのサイズが異なるポリペプチドをもたらす。表面抗原は、ＨＢＶのエンベロープの装飾に加えて、またウイルス成分粒子の一部であり、これは、ビリオン粒子と比較して大過剰で産生され、免疫寛容および抗ＨＢｓＡｇ抗体隔離に役割を有し、それにより感染性粒子を免疫検出から回避させる。遺伝子Ｘによりコードされる非構造的タンパク質の機能は、十分には理解されていないが、転写トランス活性化および複製に役割を有し、肝臓癌の発症と関連する。例示的タンパク質配列は、添付の配列表に提供される(例えば、配列番号１、３、１６および２０参照)。There are four transcripts (which may be referred to herein as "genes" or "open reading frames") based on size that are encoded by the HBV genome. These contain open reading frames designated C, X, P, and S. The core protein is encoded by gene C (HBcAg). The Hepatitis B e antigen (HBeAg) is produced by proteolytic processing of the pre-core (pre-C) protein. The DNA polymerase is encoded by gene P. Gene S is the gene that codes for the surface antigen (HBsAg). The HBsAg gene is one long open reading frame that contains three in-frame "start" (ATG) codons, resulting in three different sized polypeptides called pre-S1+pre-S2+S, pre-S2+S, or S large, medium, and small S antigens. Surface antigens, in addition to decorating the HBV envelope, are also part of the viral component particles, which are produced in large excess compared to virion particles and play a role in immune tolerance and anti-HBsAg antibody sequestration, thereby allowing infectious particles to escape immune detection. The function of the nonstructural protein encoded by gene X is not fully understood, but it plays a role in transcriptional transactivation and replication, and is associated with the development of liver cancer. Exemplary protein sequences are provided in the attached sequence listing (see, for example, SEQ ID NOs: 1, 3, 16 and 20).

ＨＢＶは、ウイルスゲノムの核への侵入、脱外被および輸送を含む多段階が関与する、複製過程で逆転写酵素を利用する数ＤＮＡウイルスの一つである。最初は、ＨＢＶゲノムの複製は、ＲＮＡ中間体の産生を含み、次いでこれが逆転写されて、ＤＮＡウイルスゲノムを産生する。HBV is one of the few DNA viruses that utilizes reverse transcriptase in the replication process, which involves multiple steps including nuclear entry, uncoating, and transport of the viral genome. Initially, replication of the HBV genome involves the production of an RNA intermediate, which is then reverse transcribed to produce the DNA viral genome.

細胞がＨＢＶに感染すると、ウイルスゲノム弛緩環状ＤＮＡ(ｒｃＤＮＡ)が細胞核に輸送され、エピソーム共有結合閉環状ＤＮＡ(ｃｃｃＤＮＡ)に変換され、これはウイルスｍＲＮＡの転写鋳型として働く。転写および核搬出後、細胞質ウイルスプレゲノムＲＮＡ(ｐｇＲＮＡ)はＨＢＶポリメラーゼおよびカプシドタンパク質と組合されて、ヌクレオカプシドを形成し、その中で、ポリメラーゼ触媒逆転写がマイナス鎖ＤＮＡを生じ、これがその後プラス鎖ＤＮＡにコピーされて、子孫ｒｃＤＮＡゲノムを形成する。次いで、成熟ヌクレオカプシドはウイルスエンベロープタンパク質に包被されて、ビリオン粒子として放出されるかまたは核まで往復して細胞内ｃｃｃＤＮＡ増幅経路によりｃｃｃＤＮＡリザーバーを増幅する。ｃｃｃＤＮＡはＨＢＶ複製サイクルの必須成分であり、感染の確立およびウイルス持続性を担う。When a cell is infected with HBV, the viral genome relaxed circular DNA (rcDNA) is transported to the cell nucleus and converted into episomal covalently closed circular DNA (cccDNA), which serves as a transcription template for viral mRNA. After transcription and nuclear export, the cytoplasmic viral pregenomic RNA (pgRNA) combines with HBV polymerase and capsid proteins to form nucleocapsids, in which polymerase-catalyzed reverse transcription generates minus-strand DNA, which is then copied into plus-strand DNA to form progeny rcDNA genomes. The mature nucleocapsids are then encapsulated by viral envelope proteins and released as virion particles or shuttled to the nucleus to amplify the cccDNA reservoir via the intracellular cccDNA amplification pathway. The cccDNA is an essential component of the HBV replication cycle and is responsible for the establishment of infection and viral persistence.

ＨＢＶ感染は、二つの異なる粒子の産生に至る：１)ＨＢｃＡｇが集合したウイルスカプシドを含み、ＨＢＶ表面抗原を有する脂質膜からなるエンベロープで覆われる感染性ＨＢＶウイルス自体(またはデーン粒子)および２)非感染性である小型または中型形態のＢ型肝炎表面抗原ＨＢｓＡｇを含むウイルス成分粒子(またはＳＶＰ)。産生された各ウイルス粒子である、１０,０００を超えるＳＶＰが血中に放出される。そして、ＳＶＰ(およびそれらが担持するＨＢｓＡｇタンパク質)は、血中のウイルスタンパク質の圧倒的大部分を占める。ＨＢＶ感染細胞は、ＨＢＶｅ－抗原(ＨＢｅＡｇ)と称されるプレ－コアタンパク質の可溶性タンパク分解産物も分泌する。HBV infection leads to the production of two distinct particles: 1) the infectious HBV virus itself (or Dane particle), which contains the viral capsid assembled with HBcAg and is surrounded by an envelope made of a lipid membrane bearing the HBV surface antigens, and 2) the non-infectious small or medium sized forms of the hepatitis B surface antigen HBsAg, called component viral particles (or SVPs). For each viral particle produced, over 10,000 SVPs are released into the blood, and SVPs (and the HBsAg protein they carry) make up the vast majority of the viral proteins in the blood. HBV-infected cells also secrete a soluble proteolytic product of the pre-core protein, called the HBV e-antigen (HBeAg).

Ａ～Ｈと命名されるＨＢＶの８遺伝子型は決定されており、二つのさらなる遺伝子型ＩおよびＪが提案されており、各々異なる地理的分布を有する。ウイルスは非細胞変性的であり、ウイルス特異的細胞性免疫が、肝疾患が６か月で解消するＨＢＶ急性感染またはしばしば進行性肝傷害を伴う慢性ＨＢＶ感染への暴露の転帰への主決定因子である。Eight genotypes of HBV, designated A through H, have been determined, and two additional genotypes, I and J, have been proposed, each with a distinct geographic distribution. The virus is noncytopathic, and virus-specific cell-mediated immunity is the primary determinant of outcome following exposure to either acute HBV infection, in which liver disease resolves within 6 months, or chronic HBV infection, which is often accompanied by progressive liver damage.

用語「ＨＢＶ」は、ＨＢＶの遺伝子型(Ａ～Ｊ)の何れも含む。ＨＢＶゲノムの対照配列の完全コード配列は、例えば、GenBank Accession Nos. GI:21326584(配列番号１)およびGI:3582357(配列番号３)にみることができる。アンチセンス配列は、それぞれ配列番号２および４に提供される。Ｃ、Ｘ、ＰおよびＳタンパク質のアミノ酸配列は、例えばNCBI Accession numbers YP_009173857.1(Ｃタンパク質); YP_009173867.1およびBAA32912.1(Ｘタンパク質); YP_009173866.1およびBAA32913.1(Ｐタンパク質);およびYP_009173869.1, YP_009173870.1, YP_009173871.1およびBAA32914.1(Ｓタンパク質)(配列番号５～１３)にみることができる。ＨＢＶ遺伝子型Ｄ、株ａｙｗからのタンパク質およびＤＮＡ配列は、配列番号１４～１７に提供される。ＨＢＶ遺伝子型Ａ、株ａｄｗからのタンパク質およびＤＮＡ配列は、配列番号１８～２１に提供される。The term "HBV" includes any of the genotypes (A-J) of HBV. The complete coding sequence of the control sequence of the HBV genome can be found, for example, in GenBank Accession Nos. GI:21326584 (SEQ ID NO:1) and GI:3582357 (SEQ ID NO:3). Antisense sequences are provided in SEQ ID NOs:2 and 4, respectively. The amino acid sequences of the C, X, P and S proteins can be found, for example, in NCBI Accession numbers YP_009173857.1 (C protein); YP_009173867.1 and BAA32912.1 (X protein); YP_009173866.1 and BAA32913.1 (P protein); and YP_009173869.1, YP_009173870.1, YP_009173871.1 and BAA32914.1 (S protein) (SEQ ID NOs:5-13). Protein and DNA sequences from HBV genotype D, strain ayw are provided in SEQ ID NOs:14-17. Protein and DNA sequences from HBV genotype A, strain adw are provided in SEQ ID NOs:18-21.

ＨＢＶｍＲＮＡ配列のさらなる例は、一般に利用可能なデータベース、例えば、GenBank、UniProtおよびOMIMから容易に入手可能である。The International Repository for Hepatitis B Virus Strain Dataは、http://www.hpa-bioinformatics.org.uk/HepSEQ/main.phpでアクセスし得る。Further examples of HBV mRNA sequences are readily available from publicly available databases, such as GenBank, UniProt, and OMIM. The International Repository for Hepatitis B Virus Strain Data can be accessed at http://www.hpa-bioinformatics.org.uk/HepSEQ/main.php.

ここで使用する用語「ＨＢＶ」はまた、ＨＢＶゲノムの天然に存在するＤＮＡ配列多様性、すなわち、遺伝子型Ａ～Ｊおよびそのバリアントもいう。As used herein, the term "HBV" also refers to the naturally occurring DNA sequence variations of the HBV genome, i.e., genotypes A-J and variants thereof.

ここで使用する「エピトープ」はまた「抗原決定基」または「決定基」とも称され、免疫系、特に抗体、Ｂ細胞および／またはＴ細胞により認識されるタンパク質抗原の部分と理解される。エピトープは、立体構造エピトープおよび直線状エピトープを含む。タンパク質は、十分な長さまたはサイズのアミノ酸配列ならびに抗体、Ｂ細胞および／またはＴ細胞により認識される抗原性を共有するとき、エピトープである。ＭＨＣクラスＩ分子により提示されるＴ細胞エピトープは、一般に約８～１１アミノ酸長のペプチドであり、一方ＭＨＣクラスII分子は、約１３～１７アミノ酸長の長いペプチドを提示する。立体構造エピトープは一般に非連続的であり、長いアミノ酸配列に及ぶ。As used herein, "epitope" is also referred to as "antigenic determinant" or "determinant" and is understood to be a portion of a protein antigen that is recognized by the immune system, particularly antibodies, B cells and/or T cells. Epitopes include conformational epitopes and linear epitopes. Proteins are epitopes when they share an amino acid sequence of sufficient length or size and antigenicity to be recognized by antibodies, B cells and/or T cells. T cell epitopes presented by MHC class I molecules are generally peptides of about 8-11 amino acids in length, while MHC class II molecules present longer peptides of about 13-17 amino acids in length. Conformational epitopes are generally discontinuous and span long amino acid sequences.

ここで使用する用語「ヌクレオチ(シ)ドアナログ」または「逆転写酵素阻害剤」は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドに構造的に類似するＤＮＡ複製の阻害剤であり、特にＨＢＶｃｃｃＤＮＡの複製を阻害し、宿主(例えば、ヒト)ＤＮＡの複製を顕著に阻害しない。このような阻害剤は、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩(ＴＤＦ)、テノホビルアラフェナミド(ＴＡＦ)、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル(ＥＴＶ)、テルビブジン、ＡＧＸ－１００９、エムトリシタビン、クレブジン、リトナビル、ジピボキシル、ロブカビル、ファムビル、ＦＴＣ、Ｎ－アセチル－システイン(ＮＡＣ)、ＰＣ１３２３、セラダイム－ＨＢＶ、チモシン－アルファ、ガンシクロビル、ベシフォビル(ＡＮＡ－３８０／ＬＢ－８０３８０)およびテノホビル－エクサリエード(ＴＬＸ／ＣＭＸ１５７)を含む。ある実施態様において、ヌクレオチ(シ)ドアナログはエンテカビル(ＥＴＶ)である。ヌクレオチ(シ)ドアナログは、多数の供給源から商業的に入手可能であり、ラベルの指示(例えば、一般に特定用量で経口投与)に従いまたはＨＢＶ処置において技術を有する実施者により決定されたとおりここに提供する方法で使用される。As used herein, the term "nucleotide analog" or "reverse transcriptase inhibitor" refers to an inhibitor of DNA replication that is structurally similar to a nucleotide or nucleoside and that specifically inhibits the replication of HBV cccDNA but does not significantly inhibit the replication of host (e.g., human) DNA. Such inhibitors include tenofovir disoproxil fumarate (TDF), tenofovir alafenamide (TAF), lamivudine, adefovir dipivoxil, entecavir (ETV), telbivudine, AGX-1009, emtricitabine, clevudine, ritonavir, dipivoxil, lobucavir, famvir, FTC, N-acetyl-cysteine (NAC), PC1323, Seradyme-HBV, thymosin-alpha, ganciclovir, besifovir (ANA-380/LB-80380), and tenofovir-exaliade (TLX/CMX157). In some embodiments, the nucleotide analog is entecavir (ETV). Nucleotide analogs are commercially available from a number of sources and may be used in the manner provided herein according to label directions (e.g., generally administered orally at a particular dosage) or as determined by a practitioner skilled in the treatment of HBV.

ここで使用する「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＨＢＶ転写物の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分である。ある実施態様において、配列の標的部分は、ＨＢＶ転写物の転写中に形成されたｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の部分またはその近くのｉＲＮＡ依存性切断の基質として働くのに少なくとも十分長い。ある実施態様において、標的配列はＨＢＶ転写物のタンパク質コード領域内である。As used herein, a "target sequence" is a contiguous portion of the nucleotide sequence of an mRNA molecule formed during transcription of an HBV transcript, including mRNAs that are the product of RNA processing of a primary transcript. In certain embodiments, the target portion of the sequence is at least sufficiently long to serve as a substrate for iRNA-dependent cleavage at or near a portion of the nucleotide sequence of an mRNA molecule formed during transcription of an HBV transcript. In certain embodiments, the target sequence is within a protein coding region of an HBV transcript.

標的配列は、約９～３６ヌクレオチド長、例えば、約１５～３０ヌクレオチド長であり得る。例えば、標的配列は約１５～３０ヌクレオチド、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４,２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２ヌクレオチド長であり得る。上記範囲および長さの中間の範囲および長さも、本発明の一部であると考えられる。The target sequence can be about 9 to 36 nucleotides in length, e.g., about 15 to 30 nucleotides in length. For example, the target sequence can be about 15 to 30 nucleotides, 15 to 29, 15 to 28, 15 to 27, 15 to 26, 15 to 25, 15 to 24, 15 to 23, 15 to 22, 15 to 21, 15 to 20, 15 to 19, 15 to 18, 15 to 17, 18 to 30, 18 to 29, 18 to 28, 18 to 27, 18 to 26, 18 to 25, 18 to 24, 18 to 23, 18 to 22, 18 to 21, 18 to 20, 19 to 30, 19 to 29, 19 It may be up to 28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, or 21-22 nucleotides in length. Ranges and lengths intermediate to the above ranges and lengths are also considered part of the invention.

ここで使用する用語「配列を含む鎖」は、標準ヌクレオチド命名法を使用して引用される配列により説明されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドをいう。As used herein, the term "strand containing a sequence" refers to an oligonucleotide that contains a strand of nucleotides described by a sequence recited using standard nucleotide nomenclature.

「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」および「Ｕ」は、各々一般にそれぞれ塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、チミジンおよびウラシルを含むヌクレオチドをいう。しかしながら、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」はまた、下にさらに詳述する修飾ヌクレオチドまたは代替置換部分も記述し得ることは理解される。当業者は、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルを他の部分に置換することが、そのような置換部分を担持するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成性を実質的に変更することなく実施できることを十分に承知している。例えば、限定しないが、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシンまたはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対形成し得る。従って、ウラシル、グアニンまたはアデニンを含むヌクレオチドを、本発明で注目するｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドに置換し得る。他の例において、オリゴヌクレオチドのどこかのアデニンおよびシトシンを、それぞれグアニンおよびウラシルで置換し、標的ｍＲＮＡ内にＧ－Ｕゆらぎ塩基対形成を形成し得る。このような置換部分を含む配列は、本発明で注目する組成物および方法に適する。"G", "C", "A", "T" and "U" each generally refer to a nucleotide containing guanine, cytosine, adenine, thymidine and uracil as a base, respectively. However, it is understood that the term "ribonucleotide" or "nucleotide" may also describe modified nucleotides or alternative replacement moieties, as further detailed below. Those skilled in the art are well aware that substitution of guanine, cytosine, adenine and uracil with other moieties can be performed without substantially altering the base pairing properties of oligonucleotides containing nucleotides bearing such replacement moieties. For example, but not limited to, a nucleotide containing inosine as a base may base pair with a nucleotide containing adenine, cytosine or uracil. Thus, a nucleotide containing uracil, guanine or adenine may be substituted, for example, with a nucleotide containing inosine in the nucleotide sequence of a dsRNA of interest in the present invention. In another example, adenine and cytosine anywhere in an oligonucleotide may be substituted with guanine and uracil, respectively, to form a G-U wobble base pairing in the target mRNA. Sequences containing such substitutions are suitable for the compositions and methods of interest in the present invention.

ここで使用する「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ｓｉＲＮＡ剤」などは、好ましくはＨＢＶの全血清型にわたり保存されるＨＢＶゲノムの領域を標的とし、好ましくは、１を超えるＨＢＶ転写物の発現阻害により、ＨＢＶライフサイクルの全段階、例えば、複製、集合、ウイルスの分泌およびウイルス抗原の分泌を阻害するよう設計される、二本鎖ＲＮＡである。特に、ＨＢＶゲノムの転写がポリシストロニック、重複ＲＮＡをもたらすため、本発明において使用する単一ＨＢＶ転写物を標的とするＲＮＡｉ剤は、好ましくはＨＢＶ転写物の大部分または全ての発現に著しい阻害をもたらす。全ＨＢＶ転写物は、少なくとも部分的に重複し、同じポリアデニル化シグナルを共有する。それ故に、全てのウイルス転写物は、同一３'末端を有し、それ故に、Ｘ遺伝子を標的とする本発明のＲＮＡｉ剤は、全ウイルス転写物を標的とし、Ｘ遺伝子発現だけでなく、プレゲノムＲＮＡ(ｐｇＲＮＡ)を含む全ての他のウイルス転写物の発現も阻害するはずである。さらに、本発明のＲＮＡｉ剤は、ｐｇＲＮＡ、ＨＢＶ構造的遺伝子、ポリメラーゼおよびＨＢＶＸ遺伝子を標的とすることにより、ＨＢＶウイルス複製を阻害するよう設計されている。さらに、免疫寛容に役割を有するＳＶＰおよび他のウイルスタンパク質のサイレンシングに介在するよう設計されており、それにより対象の免疫系がＨＢＶ感染を制御し、排除する免疫応答が搭載されるように、ウイルス抗原の存在を検出し、応答することを可能とする。理論に拘束されることを意図しないが、これらのＲＮＡｉ剤における前記性質および特定の標的部位および／または特定の修飾の組み合わせまたは下位の組み合わせは、本発明のＲＮＡｉ剤の有効性、安定性、安全性、効力および耐久性の改善に寄与すると考えられる。このような薬剤は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０７７３２１、ＷＯ２０１２／０２４１７０、ＷＯ２０１７／０２７３５０およびＷＯ２０１３／００３５２０に開示されており、それらの内容を引用により本明細書に包含させる。ＲＮＡｉ剤の例示的標的部位および例示的ＲＮＡｉ剤は、本明細書の一部を構成する、ここに添付する付属表Ａに提供される。用語ＲＮＡｉ剤は、さらに、肝臓特異的プロモーター下、人工ｍｉ(ｃｒｏ)ＲＮＡへのｓｈＲＮＡ送達のためのｓｈＲＮＡ、例えば、アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)８ベクターを含み；所望によりオフターゲット遺伝子制御を抑えるためのｓｈＲＮセンス鎖に対する共送達デコイ(“ＴｕＤ」)がMichler et al., 2016 (EMBO Mol. Med., 8:1082-1098)に記載され、引用により本明細書に包含させる。As used herein, an "RNAi agent", "iRNA agent", "siRNA agent", etc., is a double-stranded RNA that is preferably designed to target a region of the HBV genome that is conserved across all serotypes of HBV and inhibit all stages of the HBV life cycle, e.g., replication, assembly, viral secretion, and viral antigen secretion, preferably by inhibiting the expression of more than one HBV transcript. In particular, because transcription of the HBV genome results in polycistronic, overlapping RNAs, an RNAi agent targeted to a single HBV transcript for use in the present invention preferably results in significant inhibition of expression of most or all of the HBV transcripts. All HBV transcripts are at least partially overlapping and share the same polyadenylation signal. Thus, all viral transcripts have the same 3' end, and therefore an RNAi agent of the present invention targeting the X gene should target all viral transcripts and inhibit not only X gene expression, but also expression of all other viral transcripts, including the pregenomic RNA (pgRNA). Furthermore, the RNAi agents of the present invention are designed to inhibit HBV viral replication by targeting pgRNA, HBV structural genes, polymerase and HBVX genes.Furthermore, they are designed to mediate the silencing of SVP and other viral proteins that play a role in immune tolerance, thereby allowing the subject's immune system to detect and respond to the presence of viral antigens so that an immune response that controls and eliminates HBV infection is mounted.Without intending to be bound by theory, it is believed that the above properties and combinations or subcombinations of specific target sites and/or specific modifications in these RNAi agents contribute to improving the efficacy, stability, safety, potency and durability of the RNAi agents of the present invention.Such agents are disclosed, for example, in PCT Publications WO2016/077321, WO2012/024170, WO2017/027350 and WO2013/003520, the contents of which are incorporated herein by reference. Exemplary target sites for RNAi agents and exemplary RNAi agents are provided in Appendix A, attached hereto, which forms a part of this specification. The term RNAi agent further includes shRNAs for delivery of shRNAs to artificial mi(cro)RNAs under liver-specific promoters, e.g., adeno-associated virus (AAV) 8 vectors; co-delivery decoys ("TuDs") to shRN sense strands to optionally suppress off-target gene regulation are described in Michler et al., 2016 (EMBO Mol. Med., 8:1082-1098), incorporated herein by reference.

ｉＲＮＡ剤の各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであり得るが、ここに詳述するとおり、各または両鎖は、１以上の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドを含み得る。さらに、本明細書で使用する限り、「ＲＮＡｉ剤」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含んでよく；ＲＮＡｉ剤は、複数ヌクレオチドに相当な修飾を含み得る。The majority of the nucleotides in each strand of an iRNA agent can be ribonucleotides, although, as detailed herein, each or both strands can include one or more non-ribonucleotides, e.g., deoxyribonucleotides and/or modified nucleotides. Additionally, as used herein, an "RNAi agent" can include ribonucleotides having chemical modifications; an RNAi agent can include substantial modifications to multiple nucleotides.

ここで使用する用語「修飾ヌクレオチド」は、独立して、修飾糖部分、修飾ヌクレオチド間結合および／または修飾核酸塩基を有する、ヌクレオチドをいう。それ故に、用語修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合、糖部分または核酸塩基に、例えば、官能基または原子の、置換、付加または除去を含む。本発明薬剤での使用に適する修飾は、ここに開示するまたは当分野で知られる全てのタイプの修飾を含む。任意のこのような修飾は、ｓｉＲＮＡタイプ分子で使用される限り、本明細書および特許請求の範囲の目的のために、「ＲＮＡｉ剤」に包含される。As used herein, the term "modified nucleotide" refers to a nucleotide having, independently, a modified sugar moiety, a modified internucleotidic linkage, and/or a modified nucleobase. Thus, the term modified nucleotide includes the substitution, addition, or removal of, for example, a functional group or atom, at the internucleoside linkage, sugar moiety, or nucleobase. Modifications suitable for use in the agents of the invention include all types of modifications disclosed herein or known in the art. Any such modifications, to the extent used in an siRNA type molecule, are encompassed by "RNAi agent" for purposes of this specification and claims.

ここで使用する「治療ＨＢＶワクチン」などは、１以上のＨＢＶタンパク質に対する免疫応答、好ましくはエフェクターＴ細胞誘発応答を誘発する、ペプチドワクチン、ベクターベースのワクチンを含むＤＮＡワクチンまたは細胞ベースのワクチンであり得る。好ましくは、ワクチンは、複数のＨＢＶ血清型、好ましくは全ＨＢＶ血清型と交差反応する多エピトープワクチンである。多数の治療ＨＢＶワクチンが当分野で知られ、全臨床および臨床開発の種々の段階にある。タンパク質ベースのワクチンは、Ｂ型肝炎表面抗原(ＨＢｓＡｇ)およびコア抗原(ＨＢｃＡｇ)ワクチンを含む(例えば、Li et al., 2015, Vaccine. 33:4247-4254、引用により本明細書に包含)。例示的ＤＮＡワクチンは、HB-110(Genexine, Kim et al., 2008. Exp Mol Med. 40: 669-676.)、pDPSC18(PowderMed)、INO-1800(Inovio Pharmaceuticals)、HB02 VAC-AND(ANRS)およびCVI-HBV-002(CHA Vaccine Institute Co., Ltd.)を含む。例示的タンパク質ベースのワクチンはTheravax/DV-601(Dynavax Technologies Corp.)、εPA-44(Chongqing Jiachen Biotechnology Ltd.)およびABX 203(ABIVAX S.A.)を含む。例示的細胞ベースのワクチンはHPDCs-T immune therapy(Sun Yat-Sen University)を含む。組み合わせワクチンおよび製品も知られ、HepTcell^TM(ＦＰ－０２.２ワクチン(ペプチド)＋ＩＣ３１(登録商標)アジュバント(組み合わせペプチド－オリゴヌクレオチドアジュバント)(米国特許公開２０１３／０３３０３８２、２０１２／０２７６１３８、および２０１５／０２１６９６７、これら各々の全内容を、引用により本明細書に包含させる))；ＧＳ－４７７４(Gilead、融合タンパク質Ｓ、コアＸワクチン＋ＴａｒｍｏｇｅｎＴ細胞免疫刺激剤)、ｐＳＧ２.ＨＢｓ／ＭＶＡ.ＨＢｓ(タンパク質プライム／ウイルスベクターブースト、Oxxon Therapeutics)およびタンパク質プライム／改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａベクターブースト(ＭＶＡ発現ベクターのＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇタンパク質＋ＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇ、Backes et al., 2016, Vaccine. 34:923-32およびＷＯ２０１７１２１７９１、両者は引用により本明細書に包含させる)。 As used herein, a "therapeutic HBV vaccine" or the like can be a peptide vaccine, a DNA vaccine, including a vector-based vaccine, or a cell-based vaccine that induces an immune response, preferably an effector T cell-eliciting response, against one or more HBV proteins. Preferably, the vaccine is a multi-epitope vaccine that cross-reacts with multiple HBV serotypes, preferably all HBV serotypes. Numerous therapeutic HBV vaccines are known in the art and are in various stages of full-clinical and clinical development. Protein-based vaccines include Hepatitis B surface antigen (HBsAg) and core antigen (HBcAg) vaccines (e.g., Li et al., 2015, Vaccine. 33:4247-4254, incorporated herein by reference). Exemplary DNA vaccines include HB-110 (Genexine, Kim et al., 2008. Exp Mol Med. 40: 669-676.), pDPSC18 (PowderMed), INO-1800 (Inovio Pharmaceuticals), HB02 VAC-AND (ANRS) and CVI-HBV-002 (CHA Vaccine Institute Co., Ltd.). Exemplary protein-based vaccines include Theravax/DV-601 (Dynavax Technologies Corp.), εPA-44 (Chongqing Jiachen Biotechnology Ltd.) and ABX 203 (ABIVAX SA). Exemplary cell-based vaccines include HPDCs-T immune therapy (Sun Yat-Sen University). Combination vaccines and products are also known, such as HepTcell^™ (FP-02.2 vaccine (peptide) + IC31® adjuvant (combined peptide-oligonucleotide adjuvant) (U.S. Patent Publications 2013/0330382, 2012/0276138, and 2015/0216967, the entire contents of each of which are incorporated herein by reference); GS-4774 (Gilead, Fusion Protein S, Core X vaccine + Termogen T cell immunostimulant), pSG2.HBs/MVA.HBs (protein prime/viral vector boost, Oxxon Therapeutics) and protein prime/modified vaccinia virus Ankara vector boost (HBsAg and HBsAg proteins in an MVA expressing vector + HBcAg and HBsAg, Backes et al., 2016, Vaccine. 34:923-32 and WO2017121791, both of which are incorporated herein by reference).

ここで使用する用語「アジュバント」は、長期保護免疫を誘発するために共投与される、抗原に対する免疫応答を促進(例えば、増強、加速または延長)する薬剤と理解される。実質的な免疫応答は、アジュバント自体を指向しない。アジュバントは、病原体成分、粒子アジュバントおよび組み合わせアジュバント(例えば、www.niaid.nih.gov/research/vaccine-adjuvants-types参照)を含むが、これらに限定されない。病原体成分(例えば、モノホスホリルリピドＡ(ＭＰＬ)、ポリ(Ｉ：Ｃ)、ポリＩＣＬＣアジュバント、ＣｐＧＤＮＡ、ｃ－ジ－ＡＭＰ、ｃ－ジ－ＧＭＰ、ｃ－ジ－ＣＭＰ；短、平滑断端５’－三リン酸ｄｓＲＮＡ(３ｐＲＮＡ)ＲＩＧ－１リガンドおよびエマルジョン、例えばポリ[ジ(ナトリウムカルボキシレートエチルフェノキシ)ホスファゼン](ＰＣＥＰ))は、自然免疫細胞内または表面上の種々の受容体を標的とすることにより、ワクチンに対する早期非特異的または自然免疫応答の誘発を助け得る。自然免疫系は、適応免疫応答に影響し、これはワクチンが標的とする病原体に対する長期持続性保護を提供する。粒子アジュバント(例えば、ミョウバン、ビロソーム、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１２)は、免疫系を刺激でき、また免疫細胞への抗原送達を増強し得る、極めて小さな粒子を形成する。組み合わせアジュバント(例えば、ＡＳ０２、ＡＳ０３およびＡＳ０４(全てＧＳＫ)；ＭＦ５９(Novartis)；ISCOMATRIX(登録商標)(CSL Limited)；およびＩＣ３１(登録商標)(Altimmune)は、複数の保護的免疫応答を誘発する。単独で使用したとき中程度の効果を有するアジュバントは、共使用したとき、より強力な免疫応答を誘発し得る。As used herein, the term "adjuvant" is understood to mean an agent that enhances (e.g., enhances, accelerates, or prolongs) the immune response to an antigen when co-administered to induce long-term protective immunity. The substantial immune response is not directed toward the adjuvant itself. Adjuvants include, but are not limited to, pathogen components, particulate adjuvants, and combination adjuvants (see, e.g., www.niaid.nih.gov/research/vaccine-adjuvants-types). Pathogen components (e.g., monophosphoryl lipid A (MPL), poly(I:C), poly ICLC adjuvants, CpG DNA, c-di-AMP, c-di-GMP, c-di-CMP; short, blunt-ended 5'-triphosphate dsRNA (3pRNA) RIG-1 ligands and emulsions such as poly[di(sodium carboxylate ethylphenoxy)phosphazene] (PCEP)) can help induce an early non-specific or innate immune response to the vaccine by targeting various receptors within or on the surface of innate immune cells. The innate immune system influences the adaptive immune response, which provides long-lasting protection against the pathogens targeted by the vaccine. Particulate adjuvants (e.g., alum, virosomes, cytokines such as IL-12) form extremely small particles that can stimulate the immune system and enhance antigen delivery to immune cells. Combination adjuvants (e.g., AS02, AS03, and AS04 (all GSK); MF59 (Novartis); ISCOMATRIX® (CSL Limited); and IC31® (Altimmune) induce multiple protective immune responses. Adjuvants that have moderate effectiveness when used alone may induce stronger immune responses when used together.

本発明の好ましい実施態様において、本発明で使用するアジュバントは、液性および細胞性免疫応答を促進する。このために、バランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２ヘルパーＴ細胞応答は、抗体による中和応答ならびにエフェクター細胞による毒性Ｔ細胞応答を支持するために望まれる。好ましくは、アジュバントはバランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２応答を提供する。ある実施態様において、アジュバントは、ポリＩ：Ｃアジュバント、ポリＩＣＬＣアジュバント、ＣｐＧアジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニスト(ｃ－ジ－ＡＭＰアジュバント、ｃ－ジ－ＧＭＰアジュバントまたはｃ－ジ－ＣＭＰアジュバント)、ISCOMATRIX(登録商標)アジュバント、ＰＣＥＰアジュバントおよびＲｉｇ－Ｉ－リガンドアジュバントの１以上である。ある実施態様において、アジュバントはポリＩ：Ｃアジュバント、ＣｐＧアジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニストまたはＰＣＥＰアジュバントである。ある実施態様において、アジュバントはミョウバンではない。In a preferred embodiment of the invention, the adjuvant used in the invention promotes humoral and cellular immune responses. To this end, a balanced Th1/Th2 helper T cell response is desired to support neutralizing responses by antibodies and toxic T cell responses by effector cells. Preferably, the adjuvant provides a balanced Th1/Th2 response. In one embodiment, the adjuvant is one or more of poly I:C adjuvant, poly ICLC adjuvant, CpG adjuvant, STING agonist (c-di-AMP adjuvant, c-di-GMP adjuvant or c-di-CMP adjuvant), ISCOMATRIX® adjuvant, PCEP adjuvant and Rig-I-ligand adjuvant. In one embodiment, the adjuvant is poly I:C adjuvant, CpG adjuvant, STING agonist or PCEP adjuvant. In some embodiments, the adjuvant is not alum.

ここで使用する「免疫刺激剤」は、抗原と無関係に投与しても、しなくてもよい免疫応答を刺激する薬剤である。免疫刺激剤は、ペグ化インターフェロンアルファ２ａ(ＰＥＧ－ＩＦＮ－アルファ－２ａ)、インターフェロンアルファ－２ｂ、ＰＥＧ－ＩＦＮ－アルファ－２ｂ、インターフェロンラムダ、組み換えヒトインターロイキン－７およびトール様受容体３、７、８または９(ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９)アゴニスト、ウイルス侵入阻害剤(例えば、Myrcludex)、ＨＢｓＡｇの分泌または放出を阻害するオリゴヌクレオチド(例えば、ＲＥＰ９ＡＣ)、カプシド阻害剤(例えば、Ｂａｙ４１－４１０９およびＮＶＲ－１２２１)、ｃｃｃＤＮＡ阻害剤(例えば、ＩＨＶＲ－２５)を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、免疫刺激剤はウイルスカプシド、所望により空ウイルスカプシド、例えば、ＭＶＡカプシドを含み得る。As used herein, an "immunostimulant" is an agent that stimulates an immune response that may or may not be administered independent of an antigen. Immunostimulants include, but are not limited to, pegylated interferon alpha 2a (PEG-IFN-alpha-2a), interferon alpha-2b, PEG-IFN-alpha-2b, interferon lambda, recombinant human interleukin-7, and toll-like receptor 3, 7, 8, or 9 (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9) agonists, viral entry inhibitors (e.g., Myrcludex), oligonucleotides that inhibit secretion or release of HBsAg (e.g., REP 9AC), capsid inhibitors (e.g., Bay41-4109 and NVR-1221), cccDNA inhibitors (e.g., IHVR-25). In some embodiments, the immunostimulant may comprise a viral capsid, optionally an empty viral capsid, e.g., an MVA capsid.

免疫刺激剤はまた免疫チェックポイント制御因子も含み得る。免疫チェックポイント制御因子は、刺激性または阻害性であり得る。ここで使用する免疫チェックポイント制御因子は免疫応答を増強する。免疫チェックポイント制御因子は、ＣＴＬＡ－４阻害剤、例えばイピリムマブ、ＰＤ－１阻害剤、例えばニボルマブ、ペムブロリズマブおよびＢＧＢ－Ａ３１７抗体を含むが、これらに限定されない。ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、アフィマー(affimer)バイオ治療剤に加えて、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブを含む。Immune stimulants may also include immune checkpoint regulators. Immune checkpoint regulators may be stimulatory or inhibitory. As used herein, immune checkpoint regulators enhance immune responses. Immune checkpoint regulators include, but are not limited to, CTLA-4 inhibitors, such as ipilimumab, PD-1 inhibitors, such as nivolumab, pembrolizumab, and BGB-A317 antibody. PD-L1 inhibitors include atezolizumab, avelumab, and durvalumab, in addition to affimer biotherapeutics.

ここで使用する「対象」は、霊長類(例えばヒト、非ヒト霊長類、例えば、サルおよびチンパンジー)、非霊長類(例えば、マウスモデルまたはＨＢＶで感染させ得る他の動物モデル)を含む、哺乳動物などの動物である。ある実施態様において、対象は、ＨＢＶ遺伝子発現または複製の減少により利益を受ける疾患、障害または状態を処置されているまたは評価されているヒトなどのヒトである。ある実施態様において、対象は慢性Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)感染を有する。ある実施態様において、対象は慢性Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)感染およびＤ型肝炎ウイルス(ＨＤＶ)感染の両方を有する。As used herein, a "subject" is an animal, such as a mammal, including a primate (e.g., a human, a non-human primate, e.g., monkeys and chimpanzees), a non-primate (e.g., a mouse model or other animal model that can be infected with HBV). In some embodiments, the subject is a human, such as a human being treated or evaluated for a disease, disorder, or condition that would benefit from a reduction in HBV gene expression or replication. In some embodiments, the subject has a chronic hepatitis B virus (HBV) infection. In some embodiments, the subject has both a chronic hepatitis B virus (HBV) infection and a hepatitis D virus (HDV) infection.

ここで使用する用語「処置する」または「処置」は、血清ＨＢＶＤＮＡまたは肝臓ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの存在血清または肝臓ＨＢＶ抗原の存在、例えば、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｅＡｇを含むが、これらに限定されない、ＨＢＶ感染を有する対象における徴候または症状の１以上の軽減を含むが、これらに限定されない、有益なまたは所望の結果をいう。ＨＢＶ感染の診断基準は、当分野で周知である。「処置」はまた、処置非存在下での余命と比較した生存延長またはＨＣＣ発症のリスク低減も意味し得る。As used herein, the term "treat" or "treatment" refers to a beneficial or desired result, including, but not limited to, the alleviation of one or more signs or symptoms in a subject having HBV infection, including, but not limited to, the presence of serum HBV DNA or liver HBVccc DNA, the presence of serum or liver HBV antigens, e.g., HBsAg or HBeAg. Diagnostic criteria for HBV infection are well known in the art. "Treatment" can also mean prolonged survival or reduced risk of developing HCC compared to life expectancy in the absence of treatment.

ある実施態様において、ＨＢＶ関連疾患は慢性Ｂ型肝炎(ＣＨＢ)である。ある実施態様において、対象は、ＨＢＶに少なくとも５年感染している。ある実施態様において、対象はＨＢＶに少なくとも１０年感染している。ある実施態様において、対象は、出生時ＨＢＶに感染している。慢性Ｂ型肝炎疾患を有する対象は免疫寛容であり、壊死性炎症性肝疾患を伴う活動性慢性感染を有し、検出可能な壊死性炎症非存在下で肝細胞代謝回転が増加しまたは活動性疾患の証拠が全くなく、非活動性慢性感染を有し、また無症候性であり得る。慢性Ｂ型肝炎疾患を有する対象はＨＢｓＡｇ陽性であり、高ウイルス血症(≧１０^４ＨＢＶ－ＤＮＡコピー数／ml血液)または低ウイルス血症(＜１０^３ＨＢＶ－ＤＮＡコピー数／ml血液)を有する。慢性活動性肝炎を有する患者は、特に高複製状態の間、急性肝炎に類似する症状を有し得る。ＣＨＢ対象におけるＨＢＶ感染の残留性は、ｃｃｃＨＢＶＤＮＡ残留性をもたらす。ある実施態様において、ＣＨＢを有する対象はＨＢｅＡｇ陽性である。他の実施態様において、ＣＨＢを有する対象はＨＢｅＡｇ陰性である。 In some embodiments, the HBV-related disease is chronic hepatitis B (CHB). In some embodiments, the subject has been infected with HBV for at least 5 years. In some embodiments, the subject has been infected with HBV for at least 10 years. In some embodiments, the subject has been infected with HBV since birth. Subjects with chronic hepatitis B disease may be immunotolerant, have active chronic infection with necroinflammatory liver disease, have inactive chronic infection with increased hepatocyte turnover in the absence of detectable necroinflammation or no evidence of active disease, and may be asymptomatic. Subjects with chronic hepatitis B disease are HBsAg positive and have high viremia (≧10⁴ HBV-DNA copies/ml blood) or low viremia (<10³ HBV-DNA copies/ml blood). Patients with chronic active hepatitis may have symptoms similar to acute hepatitis, especially during the hyperreplicative state. Persistence of HBV infection in CHB subjects results in cccHBV DNA persistence. In some embodiments, the subject with CHB is HBeAg positive. In other embodiments, the subject with CHB is HBeAg negative.

好ましい実施態様において、ＨＢＶ感染処置は、Ｂ型肝炎の「機能的治癒」をもたらす。ここで使用する用語「機能的治癒」は、循環ＨＢｓＡｇの排除と理解され、好ましくは臨床的に適切なアッセイを使用してＨＢｓＡｇ抗体が検出不可能となる状態への転換を伴う。例えば、検出不可能な抗体は、化学発光微粒子免疫アッセイ(ＣＭＩＡ)または任意の他の免疫アッセイで測定して、１０mIU／mlより低いシグナルを含み得て、抗ＨＢｓセロコンバージョンとも称し得る。機能的治癒は、ＨＢＶの全復製型の排除を必要としない(例えば、肝臓からのｃｃｃＤＮＡ)。抗ＨＢｓセロコンバージョンは、慢性感染患者あたり年間約０.２～１％で自然に生ずる。しかしながら、抗ＨＢｓセロコンバージョン後でも、ＨＢＶの低レベルの残留が数十年観察され、完全治癒ではなく、機能的治癒が生じていることを示す。メカニズムに拘束されないが、免疫系がＨＢＶを監視し続ける得るようにしておくことが提案される。機能的治癒は、ＨＢＶ感染のあらゆる処置の中断を可能とする。しかしながら、ＨＢＶ感染の「機能的治癒」は、ＨＢＶ感染、例えば、肝線維症、ＨＣＣ、硬変に起因する疾患または状態の予防または処置には不十分であり得る。In a preferred embodiment, the treatment of HBV infection results in a "functional cure" of hepatitis B. As used herein, the term "functional cure" is understood to mean the elimination of circulating HBsAg, preferably accompanied by conversion to a state in which HBsAg antibodies are undetectable using a clinically relevant assay. For example, undetectable antibodies may include a signal lower than 10 mIU/ml as measured by chemiluminescent microparticle immunoassay (CMIA) or any other immunoassay, and may also be referred to as anti-HBs seroconversion. Functional cure does not require the elimination of all replicating forms of HBV (e.g., cccDNA from the liver). Anti-HBs seroconversion occurs naturally in approximately 0.2-1% of chronically infected patients per year. However, even after anti-HBs seroconversion, low levels of HBV persistence have been observed for decades, indicating that functional cure, not complete cure, has occurred. Without being bound by the mechanism, it is proposed that the immune system is allowed to continue to monitor HBV. A functional cure allows for the cessation of all treatments for HBV infection. However, a "functional cure" of HBV infection may be insufficient to prevent or treat diseases or conditions resulting from HBV infection, e.g., liver fibrosis, HCC, cirrhosis.

対象におけるＨＢＶ遺伝子発現もしくはＨＢＶ複製のレベルまたは疾患マーカーまたは症状の文脈での用語「低減」は、該レベルの統計学的に有意な減少をいう。減少は、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上であり得る。ＨＢＶ感染のモニタリングにおいて、ｌｏｇ１０スケールが、抗原血症(例えば、血清のＨＢｓＡｇレベル)またはウイルス血症(血清のＨＢＶＤＮＡレベル)のレベルの記載のために一般に使用される。１ log 10減少は９０％減少(１０％残存)、２ log 10減少は９９％減少(１％残存)などと理解される。ある実施態様において、疾患マーカーは、検出レベル未満まで低減される。The term "reduction" in the context of levels of HBV gene expression or HBV replication in a subject or disease markers or symptoms refers to a statistically significant decrease in said levels. The reduction can be, for example, at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or more. In monitoring HBV infection, the log10 scale is commonly used to describe levels of antigenemia (e.g., serum HBsAg levels) or viremia (serum HBV DNA levels). A 1 log10 reduction is understood to be a 90% reduction (10% remaining), a 2 log10 reduction is understood to be a 99% reduction (1% remaining), and so on. In certain embodiments, the disease marker is reduced to below the level of detection.

ある実施態様において、疾患マーカーの発現が正常化され、すなわち、このような障害がない個体についての正常範囲内であるとして許容されるレベルまで減少し、例えば、ＡＬＴまたはＡＳＴなどの疾患マーカーのレベルが、このような障害がない個体についての正常範囲内であるとして許容されるレベルまで減少する。疾患関連レベルが正常レベルから上昇したとき、変化を、正常範囲上限(ＵＬＮ)から計算する。疾患関連レベルが正常レベルから低下したとき、変化を正常範囲下限(ＬＬＮ)から計算する。低下は、対象の値と正常値の変化のパーセント差である。例えば、正常ＡＳＴレベルは、１０～４０単位／リットルと報告され得る。処置前、対象のＡＳＴレベルが２００単位／リットル(すなわち、ＵＬＮの５倍、正常範囲上限を１６０単位／リットル超えるｌ)であり、処置後、対象のＡＳＴレベルが１２０単位／リットル(すなわち、ＵＬＮの３倍、正常範囲上限を８０単位／リットル超える)であるならば、上昇ＡＳＴは、正常に向かって５０％(８０／１６０)減少した。In one embodiment, expression of a disease marker is normalized, i.e., decreased to a level accepted as being within the normal range for an individual free of such disorder, e.g., the level of a disease marker such as ALT or AST is decreased to a level accepted as being within the normal range for an individual free of such disorder. When the disease-associated level is elevated from the normal level, the change is calculated from the upper limit of normal (ULN). When the disease-associated level is decreased from the normal level, the change is calculated from the lower limit of normal (LLN). The decrease is the percent difference between the change in the subject value and the normal value. For example, normal AST levels may be reported as 10-40 units/liter. If before treatment the subject's AST level was 200 units/liter (i.e., 5 times the ULN, 160 units/liter above the upper limit of normal), and after treatment the subject's AST level was 120 units/liter (i.e., 3 times the ULN, 80 units/liter above the upper limit of normal), then the elevated AST was reduced by 50% (80/160) toward normal.

ここで使用する用語「阻害」は、「減少」、「サイレンシング」、「下方制御」、「抑制」および他の類似用語と相互交換可能に使用され、あらゆるレベルの阻害を含む。好ましくは、阻害は統計学的に有意なまたは臨床的に顕著な阻害である。As used herein, the term "inhibition" is used interchangeably with "reduction," "silencing," "downregulation," "suppression," and other similar terms, and includes any level of inhibition. Preferably, the inhibition is statistically significant or clinically significant.

用語「ＨＢＶ遺伝子の発現阻害」は、１以上のＨＢＶウイルスタンパク質(例えば、例えば、ｐｒｅＳ１／２－Ｓ、ｐｒｅＳ、Ｓ、Ｐ、Ｘ、ｐｒｅＣおよびＣ)をコードするあらゆるＨＢＶ転写物(例えば、３.５kb、２.４kb、２.１kbまたは０.７kb転写物)ならびにＨＢＶ遺伝子のバリアントまたは変異体のノックダウンをいうことを意図する。The term "inhibition of expression of an HBV gene" is intended to refer to the knockdown of any HBV transcript (e.g., a 3.5 kb, 2.4 kb, 2.1 kb or 0.7 kb transcript) encoding one or more HBV viral proteins (e.g., preS1/2-S, preS, S, P, X, preC and C), as well as variants or mutants of HBV genes.

「ＨＢＶ遺伝子の発現阻害」は、ＨＢＶ遺伝子または転写物の任意の顕著なレベルの阻害、例えば、ＨＢＶ遺伝子Ｓ、Ｐ、ＸまたはＣまたはこれらの任意の組み合わせ、例えば、Ｓ、ＰおよびＣの発現の少なくとも部分的抑制を含む。ＨＢＶ遺伝子の発現は、ＨＢＶ遺伝子発現と関連する任意の可変値、例えば、ＨＢＶｍＲＮＡレベル、ＨＢＶタンパク質レベルおよび／またはＨＢＶｃｃｃＤＮＡレベルのレベルまたはレベル変化に基づき、評価し得る。このレベルは、例えば、対象由来のサンプルを含む、個々の細胞または細胞群で評価でき、例えば、レベルを血清でモニターし得る。"Inhibition of expression of an HBV gene" includes inhibition of any significant level of an HBV gene or transcript, e.g., at least partial suppression of expression of HBV genes S, P, X, or C, or any combination thereof, e.g., S, P, and C. Expression of an HBV gene may be assessed based on the level or change in level of any variable associated with HBV gene expression, e.g., HBV mRNA levels, HBV protein levels, and/or HBV cccDNA levels. The levels may be assessed in individual cells or groups of cells, e.g., including samples from a subject, e.g., levels may be monitored in serum.

本発明の方法のある実施態様において、ＨＢＶ遺伝子の発現は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはアッセイでの検出レベル未満まで阻害される。好ましい実施態様において、ＨＢＶ遺伝子の発現阻害は、遺伝子発現レベルの臨床的に適切な阻害、例えば、ＨＢＶタンパク質に対するワクチンへの有効な免疫応答を可能にするのに十分な阻害をもたらす。In certain embodiments of the methods of the invention, expression of an HBV gene is inhibited by at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or to below the level of detection in an assay. In preferred embodiments, inhibition of expression of an HBV gene results in a clinically relevant inhibition of gene expression levels, e.g., sufficient inhibition to allow an effective immune response to a vaccine against an HBV protein.

ＨＢＶ遺伝子の発現阻害は、ＨＢＶ遺伝子が転写され、ＨＢＶ遺伝子の発現が阻害されるように処置されている(例えば、細胞または細胞集団と本発明のＲＮＡｉ剤との接触によりまたは本発明のＲＮＡｉ剤の、該細胞が存在するまたは存在した対象への投与により)最初の細胞または細胞群(このような細胞は、例えば、対象由来のサンプルに存在し得る)により発現されるＲＮＡの量の、最初の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、そのように処置されていない第二の細胞または細胞群(対照細胞)と比較した減少により顕在化され得る。好ましい実施態様において、阻害は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０７７３２１(その内容を全体として引用により本明細書に包含させる)の実施例２に提供されるｒｔＰＣＲ方法で評価し、インビトロアッセイを、１０nM濃度で二本鎖を有する適切に適合した細胞株で行い、処置細胞を、対照細胞のｍＲＮＡレベルのパーセンテージとして、次の式を使用して表す。
Inhibition of expression of an HBV gene may be manifested by a decrease in the amount of RNA expressed by a first cell or group of cells (such cells may be present, for example, in a sample from a subject) in which the HBV gene is transcribed and which has been treated to inhibit expression of the HBV gene (e.g., by contacting a cell or cell population with an RNAi agent of the present invention or by administering an RNAi agent of the present invention to a subject in which the cell is or was present), compared to a second cell or group of cells (control cells) that is substantially identical to the first cell or group of cells but has not been so treated. In a preferred embodiment, inhibition is assessed by the rtPCR method provided in Example 2 of PCT Publication WO2016/077321 (the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety), and the in vitro assay is performed in an appropriately adapted cell line with the duplex at a concentration of 10 nM, and the treated cells are expressed as a percentage of the mRNA levels of the control cells using the following formula:

あるいは、ＨＢＶ遺伝子の発現阻害を、例えば、ここに記載する、ＨＢＶ遺伝子発現と機能的に関連するパラメータの減少の点で評価し得る。ＨＢＶ遺伝子サイレンシングは、構成的にまたはゲノム編集によりＨＢＶ遺伝子を発現する任意の細胞で、当分野で知られる任意のアッセイにより決定し得る。Alternatively, inhibition of HBV gene expression may be assessed in terms of a reduction in a parameter functionally associated with HBV gene expression, e.g., as described herein. HBV gene silencing may be determined by any assay known in the art in any cell that expresses an HBV gene, either constitutively or by genome editing.

ＨＢＶタンパク質の発現阻害は、細胞または細胞群により発現されるＨＢＶタンパク質レベル(例えば、対象由来のサンプルで発現されるタンパク質レベル)の減少により顕在化し得る。上記のとおり、ｍＲＮＡ抑制の評価について、処置細胞または細胞群のタンパク質発現レベル阻害を、対照細胞または細胞群または血清のタンパク質レベルのパーセンテージとして表し得る。Inhibition of expression of HBV proteins may be manifested by a decrease in the level of HBV protein expressed by a cell or cell population (e.g., the level of protein expressed in a sample from a subject). As described above, for assessment of mRNA suppression, inhibition of protein expression levels in treated cells or cell populations may be expressed as a percentage of the protein levels in control cells or cell populations or serum.

ＨＢＶ遺伝子の発現阻害の評価に使用し得る対照細胞または細胞群は、本発明のＲＮＡｉ剤とまだ接触させていない細胞または細胞群を含む。例えば、対照細胞または細胞群は、ＲＮＡｉ剤で対象を処置する前の個々の対象(例えば、ヒトまたは動物対象)に由来し得る。別の実施態様において、レベルを適切な対照サンプル、例えば、既知集団対照サンプルと比較し得る。A control cell or population of cells that can be used to assess inhibition of expression of an HBV gene includes a cell or population of cells that has not yet been contacted with an RNAi agent of the invention. For example, the control cell or population of cells can be derived from an individual subject (e.g., a human or animal subject) prior to treatment of the subject with the RNAi agent. In another embodiment, the levels can be compared to a suitable control sample, e.g., a known population control sample.

細胞または細胞群により発現されるＨＢＶＲＮＡレベルまたは循環ＨＢＶＲＮＡレベルを、ｍＲＮＡ発現を評価するための当分野で知られる任意の方法を使用して、好ましくはＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０７７３２１の実施例２またはここに提供する実施例１に提供するｒｔＰＣＲ方法を使用して、決定し得る。ある実施態様において、サンプルのＨＢＶ遺伝子の発現(例えば、総ＨＢＶＲＮＡ、ＨＢＶ転写物、例えば、ＨＢＶ３.５kb転写物)レベルを、転写ポリヌクレオチドまたはその一部、例えば、ＨＢＶ遺伝子のＲＮＡの検出により特定する。ＲＮＡは、例えば、酸フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出(RNAzol B; Biogenesis)、ＲＮｅａｓｙＲＮＡ調製キット(Qiagen(登録商標))またはＰＡＸ遺伝子(PreAnalytix, Switzerland)の使用を含む、ＲＮＡ抽出技法を使用して、細胞から抽出し得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的アッセイ形式は、核ランオンアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護アッセイ(Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035)、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーションおよびマイクロアレイ分析を含む。循環ＨＢＶｍＲＮＡは、内容全体を引用により本明細書に包含させる、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／１７７９０６に記載の方法を使用して、検出し得る。The level of HBV RNA expressed by a cell or cell population or the level of circulating HBV RNA may be determined using any method known in the art for assessing mRNA expression, preferably using the rtPCR method provided in Example 2 of PCT Publication WO2016/077321 or Example 1 provided herein. In certain embodiments, the level of expression of an HBV gene (e.g., total HBV RNA, HBV transcript, e.g., HBV 3.5 kb transcript) in a sample is determined by detection of a transcribed polynucleotide or a portion thereof, e.g., RNA of an HBV gene. RNA may be extracted from the cells using RNA extraction techniques, including, for example, acid phenol/guanidine isothiocyanate extraction (RNAzol B; Biogenesis), RNeasy RNA preparation kit (Qiagen®), or PAX gene (PreAnalytix, Switzerland). Exemplary assay formats utilizing ribonucleic acid hybridization include nuclear run-on assays, RT-PCR, RNase protection assays (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035), Northern blotting, in situ hybridization, and microarray analysis. Circulating HBV mRNA can be detected using methods described in PCT Publication WO 2012/177906, the entire contents of which are incorporated herein by reference.

ある実施態様において、ＨＢＶ遺伝子の発現レベルは、核酸プローブを使用して決定する。ここで使用する用語「プローブ」は、特定のＨＢＶ遺伝子に選択的に結合することができるあらゆる分子をいう。プローブは、当業者により合成できまたは適切な生物学的調製物に由来し得る。プローブは、標識されるように特に設計され得る。プローブとして利用され得る分子の例は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体および有機分子を含むが、これらに限定されない。In one embodiment, the expression level of an HBV gene is determined using a nucleic acid probe. As used herein, the term "probe" refers to any molecule capable of selectively binding to a particular HBV gene. Probes can be synthesized by one of skill in the art or derived from appropriate biological preparations. Probes can be specifically designed to be labeled. Examples of molecules that can be utilized as probes include, but are not limited to, RNA, DNA, proteins, antibodies, and organic molecules.

単離ＲＮＡを、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイに使用でき、これは、サザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)分析およびプローブアレイを含むが、これらに限定されない。ｍＲＮＡレベルを決定する一つの方法は、単離ｍＲＮＡと、ＨＢＶｍＲＮＡとハイブリダイズできる核酸分子(プローブ)の接触を含む。ある実施態様において、ｍＲＮＡを固体表面に固定化し、例えば単離ｍＲＮＡをアガロースゲル上に流すことにより、プローブと接触させ、該ゲルからのｍＲＮＡを、ニトロセルロースなどの膜に移すことを含む。別の実施態様において、プローブを固体表面に固定し、例えば、Affymetrix(登録商標)遺伝子チップアレイで、ｍＲＮＡを、プローブと接触させる。当業者は、ＨＢＶｍＲＮＡレベル決定に使用するために既知ｍＲＮＡ検出方法を容易に適合できる。The isolated RNA can be used in hybridization or amplification assays, including, but not limited to, Southern or Northern analysis, polymerase chain reaction (PCR) analysis, and probe arrays. One method for determining mRNA levels involves contacting the isolated mRNA with a nucleic acid molecule (probe) that can hybridize to HBV mRNA. In one embodiment, the mRNA is immobilized on a solid surface and contacted with a probe, for example, by running the isolated mRNA on an agarose gel, and transferring the mRNA from the gel to a membrane, such as nitrocellulose. In another embodiment, the probe is immobilized on a solid surface and the mRNA is contacted with the probe, for example, in an Affymetrix® gene chip array. One of skill in the art can readily adapt known mRNA detection methods for use in determining HBV mRNA levels.

サンプルにおけるＨＢＶ遺伝子の発現レベルを決定する別の方法は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ(Mullis、１９８７、米国特許４,６８３,２０２に示す実験的実施態様)、リガーゼ連鎖反応(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193)、自立型配列複製(Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写増幅系(Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Ｑ－ベータレプリカーゼ(Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197)、ローリングサークル複製(Lizardi et al.、米国特許５,８５４,０３３)または任意の他の核酸増幅方法による、例えばサンプルのｍＲＮＡの、核酸増幅または逆転写酵素(ｃＤＮＡ調製のため)、続く当業者に周知の技法を使用する増幅分子の検出の過程を含む。これらの検出スキームは、核酸分子が極めて少数で存在するならば、そのような分子の検出に特に有用である。本発明の具体的態様において、ＨＢＶ遺伝子の発現レベルは、例えば、ここに提供する方法を使用する、定量的蛍光性ＲＴ－ＰＣＲ(すなわち、TaqMan^TM System)により決定する。 Other methods for determining the expression level of HBV genes in a sample include, for example, RT-PCR (Mullis, 1987, experimental embodiment shown in U.S. Pat. No. 4,683,202), ligase chain reaction (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), self-sustained sequence replication (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), transcription amplification systems (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-beta replicase (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197), rolling circle replication (Lizardi et al. (1989) Bio/Technology 6:1197), and the like. This method includes the process of nucleic acid amplification, e.g., of the mRNA of a sample by PCR (U.S. Pat. No. 5,854,033) or any other nucleic acid amplification method, or reverse transcriptase (to prepare cDNA), followed by detection of the amplified molecules using techniques well known to those of skill in the art. These detection schemes are particularly useful for the detection of nucleic acid molecules if such molecules are present in very low numbers. In a specific embodiment of the invention, the expression levels of HBV genes are determined by quantitative fluorescent RT-PCR (i.e., TaqMan^™ System), e.g., using the methods provided herein.

ＨＢＶＲＮＡの発現レベルを、膜ブロット(例えばノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析で使用する)またはマイクロウェル、試験管、ゲル、ビーズまたは繊維(または結合核酸を含むあらゆる固体支持体)を使用してモニターし得る。米国特許５,７７０,７２２、５,８７４,２１９、５,７４４,３０５、５,６７７,１９５および５,４４５,９３４参照(これら各々の内容全体を引用により本明細書に包含する)。ＨＢＶ発現レベル決定はまた溶液での核酸プローブの使用も含み得る。HBV RNA expression levels can be monitored using membrane blots (e.g., for use in Northern, Southern, dot, and other hybridization analyses) or microwells, tubes, gels, beads, or fibers (or any solid support containing bound nucleic acid). See U.S. Patents 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195, and 5,445,934, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety. HBV expression level determination can also involve the use of nucleic acid probes in solution.

好ましい実施態様において、ＲＮＡ発現レベルを、リアルタイムＰＣＲ(ｑＰＣＲ)を使用して評価する。これらの方法の使用は、本明細書の実施例に記載し、例示される。In a preferred embodiment, RNA expression levels are assessed using real-time PCR (qPCR). The use of these methods is described and exemplified in the Examples herein.

ＨＢＶタンパク質発現レベルは、タンパク質レベル測定について当分野で知られる任意の方法を使用して、決定し得る。このような方法は、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)、超拡散クロマトグラフィー、流体またはゲル沈降反応、吸収スペクトロスコピー、比色分析アッセイ、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散法(単または二重)、免疫電気泳動、ウェスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡｓ)、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどを含む。HBV protein expression levels may be determined using any method known in the art for measuring protein levels. Such methods include, for example, electrophoresis, capillary electrophoresis, high performance liquid chromatography (HPLC), thin layer chromatography (TLC), hyperdiffusion chromatography, fluid or gel precipitation reactions, absorption spectroscopy, colorimetric assays, spectrophotometric assays, flow cytometry, immunodiffusion (single or double), immunoelectrophoresis, Western blotting, radioimmunoassays (RIA), enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), immunofluorescence assays, electrochemiluminescence assays, and the like.

ある実施態様において、本発明の方法の有効性を、ＨＢＶ感染の症状の軽減の検出またはモニタリングによりモニターし得る。症状は、当分野で知られる任意の方法を使用して評価され得る。In certain embodiments, the effectiveness of the methods of the invention may be monitored by detecting or monitoring a reduction in symptoms of HBV infection. Symptoms may be assessed using any method known in the art.

ここで使用する用語「Ｂ型肝炎ウイルス関連疾患」または「ＨＢＶ関連疾患」は、ＨＢＶ感染または複製が原因のまたはそれと関連する疾患または障害である。用語「ＨＢＶ関連疾患」は、ＨＢＶ遺伝子発現または複製の減少により利益を受ける疾患、障害または状態を含む。ＨＢＶ関連疾患の非限定的例は、例えば、Ｄ型肝炎ウイルス感染；肝炎デルタ；慢性Ｂ型肝炎；肝線維症；末期肝疾患；クリオグロブリン血症；肝細胞癌を含む。As used herein, the term "hepatitis B virus-related disease" or "HBV-related disease" refers to a disease or disorder caused by or associated with HBV infection or replication. The term "HBV-related disease" includes diseases, disorders, or conditions that would benefit from a reduction in HBV gene expression or replication. Non-limiting examples of HBV-related diseases include, for example, hepatitis D virus infection; hepatitis delta; chronic hepatitis B; liver fibrosis; end-stage liver disease; cryoglobulinemia; and hepatocellular carcinoma.

ここで使用する用語「サンプル」は、対象から単離されたまたはそこから調製された液体、細胞または組織の収集物ならびに対象内に存在する液体、細胞または組織を含む。生物学的液体の例は、血液、血清、血漿、免疫細胞、リンパ、尿、唾液などを含む。組織サンプルは、組織、臓器または局在性領域からのサンプルを含み得る。例えば、サンプルは、特定の臓器、臓器の一部もしくは液体またはこれら臓器内の液体もしくは細胞であり得る。ある実施態様において、サンプルは、肝臓(例えば、肝臓全体または肝臓のある区域または肝臓内の特定タイプの細胞、例えば、肝細胞、常在性肝臓免疫細胞)由来であり得る。好ましい実施態様において、「対象由来のサンプル」は、対象から採血した血液またはそれ由来の血漿、血清もしくは選択細胞プール(例えば、免疫細胞集団)をいう。さらなる実施態様において、「対象由来のサンプル」は、対象から得た肝臓組織(またはその小成分)をいう。As used herein, the term "sample" includes a collection of fluids, cells, or tissues isolated or prepared from a subject, as well as fluids, cells, or tissues present within a subject. Examples of biological fluids include blood, serum, plasma, immune cells, lymph, urine, saliva, and the like. Tissue samples can include samples from tissues, organs, or localized areas. For example, samples can be specific organs, parts of organs, or fluids, or fluids or cells within these organs. In certain embodiments, samples can be from the liver (e.g., the entire liver or a section of the liver, or a specific type of cell within the liver, e.g., hepatocytes, resident liver immune cells). In preferred embodiments, a "sample from a subject" refers to blood drawn from a subject or plasma, serum, or selected cell pools (e.g., immune cell populations) derived therefrom. In further embodiments, a "sample from a subject" refers to liver tissue (or a subcomponent thereof) obtained from a subject.

ここで使用する「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をいうことは理解される。ある実施態様において、ＤＮＡ配列はＲＮＡ配列から逆転写され得る。ある実施態様において、ｉＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡは、コード配列を標的とする。As used herein, a "coding sequence" is understood to refer to a DNA sequence that codes for a particular amino acid sequence. In some embodiments, the DNA sequence can be reverse transcribed from an RNA sequence. In some embodiments, an iRNA, e.g., an shRNA, targets the coding sequence.

用語「適当な制御配列」などは、ここで、コード配列の上流(５’非コード配列)、途中または下流(３’非コード配列)に位置するヌクレオチド配列をいい、これは、関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性または翻訳に影響を与える。制御配列はプロモーター、翻訳リーダー配列、イントロンおよびポリアデニル化認識配列を含み得る。The term "suitable control sequences" and the like, as used herein, refers to nucleotide sequences located upstream (5' non-coding sequences), within or downstream (3' non-coding sequences) of a coding sequence that influence the transcription, RNA processing or stability or translation of the associated coding sequence. Control sequences may include promoters, translation leader sequences, introns and polyadenylation recognition sequences.

ここで使用する「プロモーター」は、コード配列または機能的にＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列をいう。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、その全体を天然遺伝子に由来してよく、または天然で見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素からなってよくまたは合成ＤＮＡセグメントを含んでよい。プロモーターは、特定の細胞型のまたは発育の種々の段階でのまたは異なる微小環境条件に応答したコード配列の発現を選択するように選択され得る。ある実施態様において、プロモーターは、肝臓で活性なプロモーター、例えば、肝臓特異的プロモーターである。多くのプロモーター配列が当分野で知られ、特定の状況での適切なプロモーター配列の選択は、当業者の能力の範囲内である。As used herein, a "promoter" refers to a coding sequence or a DNA sequence that can functionally control expression of an RNA. Generally, the coding sequence is located 3' to the promoter sequence. The promoter may be derived in its entirety from a native gene, or may be composed of different elements derived from different promoters found in nature, or may include synthetic DNA segments. Promoters can be selected to select for expression of the coding sequence in a particular cell type, or at various stages of development, or in response to different microenvironmental conditions. In some embodiments, the promoter is a liver-active promoter, e.g., a liver-specific promoter. Many promoter sequences are known in the art, and the selection of an appropriate promoter sequence for a particular situation is within the ability of one of ordinary skill in the art.

用語「操作可能に結合」は、一方の機能が他方に影響するような、単一核酸フラグメント上への複数核酸配列の結合をいう。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を与え得るならば、該コード配列と操作可能に結合する(すなわち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある)。The term "operably linked" refers to the association of multiple nucleic acid sequences on a single nucleic acid fragment so that the function of one affects the other. For example, a promoter is operably linked to a coding sequence if it is capable of affecting the expression of that coding sequence (i.e., the coding sequence is under the transcriptional control of the promoter).

ここで使用する用語「発現」は、本主題のテクノロジーの核酸フラグメントに由来する、センス(ｍＲＮＡ)またはアンチセンスＲＮＡまたはＲＮＡｉ剤(例えば、ｓｈＲＮＡ)の転写および安定な蓄積をいう。「過発現」は、正常または非形質転換生物での産生レベルを超える、トランスジェニックまたは組み換え生物での遺伝子産物の産生をいう。As used herein, the term "expression" refers to the transcription and stable accumulation of sense (mRNA) or antisense RNA or RNAi agents (e.g., shRNA) derived from the nucleic acid fragments of the subject technology. "Overexpression" refers to the production of a gene product in a transgenic or recombinant organism that exceeds levels of production in normal or non-transformed organisms.

ここで使用する「発現ベクター」または「発現構築物」は、プロモーター制御下でのコード配列発現を可能にするために、コード配列がプロモーター配列に操作可能に結合した核酸をいう。発現ベクターは、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターを含むが、これらに限定されない。発現ベクターを細胞に送達する方法は当分野で知られる。As used herein, "expression vector" or "expression construct" refers to a nucleic acid in which a coding sequence is operably linked to a promoter sequence to permit expression of the coding sequence under the control of the promoter. Expression vectors include, but are not limited to, viral vectors or plasmid vectors. Methods for delivering expression vectors to cells are known in the art.

II. 本発明の処置方法
本発明は、ＨＢＶ感染の処置における、ＨＢＶ遺伝子の発現を減少させるための薬剤、例えば、１以上のＨＢＶ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体(ＲＩＳＣ)介在切断を起こすｉＲＮＡ剤および１以上のＨＢＶタンパク質に対する免疫応答を刺激するＢ型肝炎ワクチンの連続的使用のための処置レジメンおよび方法を提供する。処置レジメンおよび方法は、好ましくは一定期間内にＨＢＶの機能的治癒を提供する。II. Treatment Methods of the Invention The present invention provides treatment regimens and methods for the sequential use of agents to reduce expression of HBV genes, such as an iRNA agent that causes RNA-induced silencing complex (RISC)-mediated cleavage of one or more HBV transcripts, and a Hepatitis B vaccine that stimulates an immune response to one or more HBV proteins, in the treatment of HBV infection. The treatment regimens and methods preferably provide a functional cure of HBV within a period of time.

ここに提供する処置レジメンおよび方法は、ＨＢＶ感染のための、処置および好ましくは機能的治癒を提供する複数治療剤の順序付けられた投与を含む。本方法で使用される薬剤は当分野で知られる。しかしながら、薬剤は、単独では、大部分の患者でＨＢＶ疾患負荷の一貫したかつ永続的な減少ができず、例えば、ＨＢｓＡｇレベルの２ log 10、好ましくは１log 10IU/mlまたは検出レベル未満への減少ができない。ＨＢＶ疾患負荷の顕著な減少、例えば、ＨＢｓＡｇレベルの２ log 10、好ましくは１log 10IU/mlまたは検出レベル未満への減少は、相当数の対象で、治療剤投与を中断する機会を提供し、ＨＢＶの機能的治癒を提供する。メカニズムに拘束されないが、ＨＢＶを標的とするｉＲＮＡ剤の投与を含むここに提供する処置レジメンおよび方法は、対象で、複数用量の治療ワクチン投与により誘発される有効な免疫応答を可能とするために十分な強度および期間、ＨＢＶ抗原および核酸を実質的に減少させることが提案される。ここに提供するレジメンおよび方法は、安定して、相当数の対象、好ましくは対象の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％または７０％で疾患負荷の実質的減少および機能的治癒を提供する。The treatment regimens and methods provided herein include the sequenced administration of multiple therapeutic agents to provide a treatment and preferably a functional cure for HBV infection. The agents used in the methods are known in the art. However, the agents alone do not provide a consistent and durable reduction in HBV disease burden in most patients, e.g., a reduction in HBsAg levels by 2 log 10, preferably 1 log 10 IU/ml or below detection levels. A significant reduction in HBV disease burden, e.g., a reduction in HBsAg levels by 2 log 10, preferably 1 log 10 IU/ml or below detection levels, provides an opportunity to discontinue therapeutic agent administration in a significant number of subjects, providing a functional cure for HBV. Without being bound by mechanism, it is proposed that the treatment regimens and methods provided herein, including administration of an iRNA agent targeting HBV, substantially reduce HBV antigens and nucleic acids in subjects with sufficient intensity and duration to allow for an effective immune response elicited by administration of multiple doses of a therapeutic vaccine. The regimens and methods provided herein consistently provide a substantial reduction in disease burden and functional cure in a significant number of subjects, preferably at least 30%, 40%, 50%, 60% or 70% of subjects.

ＨＢＶ感染のトランスジェニックマウスモデルであるＨＢＶ１.３ｘｆｓを使用して、ここに提供する組み合わせ治療を評価した。一次試験は、二つの異なる化学修飾ＧａｌＮＡｃ－ＨＢＶを標的とするｉＲＮＡ剤(ＡＤ－６６８１６およびＡＤ－６６８１０)の、血清におけるＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇタンパク質およびＨＢＶＤＮＡのレベルを、３mg／kgまたは９mg／kgの単独皮下用量で、少なくとも２１日間阻害する有効性を評価するために使用し、類似の有効性であった。非ＨＢＶｉＲＮＡ対照で顕著なノックダウンは観察されなかった(図２参照)。この結果に基づき、３mg／kgの低用量を、組み合わせ治療試験に選択した。The combination therapy provided herein was evaluated using HBV1.3xfs, a transgenic mouse model of HBV infection. Primary studies were used to evaluate the efficacy of two different chemically modified GalNAc-HBV targeting iRNA agents (AD-66816 and AD-66810) in inhibiting serum HBsAg and HBeAg protein and HBV DNA levels for at least 21 days at single subcutaneous doses of 3 mg/kg or 9 mg/kg with similar efficacy. No significant knockdown was observed in the non-HBV iRNA control (see Figure 2). Based on this result, a lower dose of 3 mg/kg was selected for combination therapy testing.

第一の組み合わせ治療治験において(図３参照)、マウスを６処置レジメンの一つで前処置した(ｎ＝６／群)：
(１)前処置無し；
(２)０週目の初日から開始して、試験を通してエンテカビル１μg／ml水溶液；
(３)対照ｉＲＮＡ剤の０週目、４週目、８週目および１２週目の初日の３mg／kg用量；
(４)ＨＢＶをコードするｓｈＲＮＡをコードする発現ベクター(ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡ)の０週目の初日の１回用量(Michler et al., 2016)；または
(５－６)ＡＤ－６６８１６またはＡＤ－６６８１０(総称的に、ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ)の０週目、４週目、８週目および１２週目の初日の３mg／kg用量。 In the first combination therapy trial (see FIG. 3), mice were pretreated with one of six treatment regimens (n=6/group):
(1) No pretreatment;
(2) Entecavir 1 μg/ml in water starting on the first day of week 0 and continuing throughout the study;
(3) a 3 mg/kg dose of a control iRNA agent on the first day of weeks 0, 4, 8, and 12;
(4) a single dose on the first day of week 0 of an expression vector encoding an shRNA encoding HBV (HBV-shRNA) (Michler et al., 2016); or
(5-6) AD-66816 or AD-66810 (collectively, HBV-siRNA) at a dose of 3 mg/kg on the first day of weeks 0, 4, 8, and 12.

１２週目および１４週目の初日に、３１.９μg 合成ホスホロチオエート化ＣｐＧＯＤＮ１６６８ (ＣｐＧ)および２５μg ポリ[ジ(ナトリウムカルボキシレートエチル－フェノキシ)ホスファゼン](ＰＣＥＰ)でアジュバントされた組み換え発現酵母ＨＢｓＡｇ(１５μg)および大腸菌発現ＨＢｃＡｇ(１５μg)の混合物を、タンパク質プライムワクチン接種として、全マウスに皮下投与した(Backes, 2016)。On the first day of weeks 12 and 14, all mice were given a subcutaneous protein prime vaccination with a mixture of recombinantly expressed yeast HBsAg (15 μg) and E. coli expressed HBcAg (15 μg) adjuvanted with 31.9 μg synthetic phosphorothioated CpG ODN 1668 (CpG) and 25 μg poly[di(sodium carboxylate ethyl-phenoxy)phosphazene] (PCEP) (Backes, 2016).

１６週目の初日、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｃＡｇを発現する改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ(各ウイルス５×１０^７粒子)の混合物を、ブーストワクチン接種として、全マウスに投与した(Backes, 2016)。 On the first day of week 16, all mice were administered a mixture of modified vaccinia viruses Ankara expressing HBsAg or HBcAg (^5x107 particles of each virus) as a boost vaccination (Backes, 2016).

血液サンプルを０週目、２週目、４週目、８週目、１２週目、１６週目および１７週目の初日に得て、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶＤＮＡのレベルについてアッセイした。群１、２および３(偽、エンテカビル、対照ｉＲＮＡ剤)のマウスで観察されたＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベルの結果は類似した(図４Ａおよび４Ｂ)。ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡまたはＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ単独で、血清におけるＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶＤＮＡの有意な減少を起こした。３用量プライム－ブーストワクチン接種スキームは、全群でのＨＢｓＡｇのさらなる減少と、ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡおよびＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ群の一部動物でのＨＢｓＡｇレベルの検出レベル未満への減少をもたらした。しかしながら、ワクチン処置は、いずれの群でもＨＢｅＡｇレベルを減少させなかった。ＨＢＶＤＮＡレベルは、エンテカビル単独で定量限界未満まで減少せず、３用量プライム－ブーストワクチンの効果は検出されなかった(図４Ｃ)。偽処置およびＨＢＶ－ｓｈＲＮＡ、ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡおよび対照ｓｉＲＮＡでの処置はすべてＨＢＶＤＮＡレベルを減少させ、ＨＢＶ－ＤＮＡレベルは全群でプライム－ブーストワクチンによりさらに減少した。これらのデータは、ＲＮＡｉが、ウイルス抗原減少においてヌクレオチ(シ)ドアナログ治療より優れることを示す。また、ＲＮＡｉとその後のワクチン接種の組み合わせは、いずれかの薬剤単独より、ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶＤＮＡレベルに大きな効果を有する。Blood samples were obtained on the first day of weeks 0, 2, 4, 8, 12, 16, and 17 and assayed for HBsAg, HBeAg, and HBV DNA levels. Results for HBsAg and HBeAg levels observed in mice in groups 1, 2, and 3 (sham, entecavir, control iRNA agent) were similar (Figures 4A and 4B). HBV-shRNA or HBV-siRNA alone caused significant reductions in HBsAg, HBeAg, and HBV DNA in serum. A three-dose prime-boost vaccination scheme resulted in a further reduction in HBsAg in all groups and a reduction in HBsAg levels below detection levels in some animals in the HBV-shRNA and HBV-siRNA groups. However, vaccine treatment did not reduce HBeAg levels in either group. HBV DNA levels were not reduced below the limit of quantification with entecavir alone, and no effect of the three-dose prime-boost vaccine was detected (Figure 4C). Sham treatment and treatment with HBV-shRNA, HBV-siRNA, and control siRNA all reduced HBV DNA levels, and HBV-DNA levels were further reduced by prime-boost vaccination in all groups. These data indicate that RNAi is superior to nucleotide analog treatment in reducing viral antigens. Also, the combination of RNAi followed by vaccination has a greater effect on HBsAg and HBV DNA levels than either agent alone.

実験最終日(１７週目初日)、マウスを屠殺し、肝臓を採取した。肝臓内ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、Backes, 2016に提供される方法を使用して、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇおよびＭＶＡウイルス粒子の応答について評価した。ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡまたはＨＢＶ－ｓｉＲＮＡで処置したマウスは、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇに対してＣＤ８＋免疫応答を産生できた(図５Ａおよび５Ｂ)。偽、エンテカビルまたは対照ｓｉＲＮＡ群で、ＨＢＶ抗原に対する顕著な免疫応答は観察されなかった。しかしながら、ＭＶＡウイルスに対する類似の免疫応答が、前処置またはウイルス抗原レベルと無関係に全動物で観察され(図５Ｃ)、ワクチン接種が全動物で等しくよく働いていることを示し、有効な免疫系の存在を示す。図５Ａ～Ｃに示すデータは、最初の分析中の死亡免疫細胞の不十分な排除に適応させるために実施した再分析であった。２回目の分析で得たデータ(図５Ｄ～Ｆに示す)もまた、ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡまたはＨＢＶ－ｓｉＲＮＡで前処理したマウスのみが、治療ワクチン接種後にＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を産生できるが、ＭＶＡ特異的応答は前処置に影響されなかったことを示す。２回目の分析の分散の減少は、死亡細胞のより厳密な排除による。これらのデータは、ＲＮＡｉ処置が、ヌクレオシドアナログでの現在の標準処置とは対照的に、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞免疫を回復でき、治療ワクチン接種後ＨＢＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を誘発できることを示す。On the last day of the experiment (first day of week 17), mice were sacrificed and livers were harvested. Intrahepatic CD8+ T cell responses were evaluated for HBsAg, HBcAg and MVA viral particle responses using the method provided in Backes, 2016. Mice treated with HBV-shRNA or HBV-siRNA were able to generate CD8+ immune responses against HBsAg and HBcAg (Figures 5A and 5B). No significant immune responses against HBV antigens were observed in the mock, entecavir or control siRNA groups. However, a similar immune response against MVA virus was observed in all animals, independent of pretreatment or viral antigen levels (Figure 5C), indicating that vaccination worked equally well in all animals and indicating the presence of an effective immune system. The data shown in Figures 5A-C were reanalyses performed to accommodate for the insufficient elimination of dead immune cells during the first analysis. Data from the second analysis (shown in Figures 5D-F) also indicate that only mice pretreated with HBV-shRNA or HBV-siRNA were able to generate HBV-specific CD8+ T cell responses after therapeutic vaccination, whereas MVA-specific responses were not affected by pretreatment. The reduction in variance in the second analysis is due to a more rigorous exclusion of dead cells. These data indicate that RNAi treatment, in contrast to the current standard treatment with nucleoside analogues, can restore HBV-specific T cell immunity and induce HBV-specific CD8 T cell responses after therapeutic vaccination.

血清は、ＨＢＶ抗原に対する抗体免疫応答についても評価した。ワクチンは、ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡまたはＨＢＶ－ｓｈＲＮＡ前処置を受けていた動物においてのみＴ細胞免疫応答を誘発できたが、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇに対する抗体応答は、１７週目までの評価した時点で、前処置にかかわらず全群にわたり類似した。ＨＢｅＡｇ抗体応答は検出されなかった。これらのデータは、高ＨＢＶ抗原負荷が、Ｂ細胞応答ではなく、主にＨＢＶ特異的Ｔ細胞を阻害することを示す。Sera were also evaluated for antibody immune responses to HBV antigens. The vaccine was able to induce T cell immune responses only in animals that had received HBV-siRNA or HBV-shRNA pretreatment, whereas antibody responses to HBsAg and HBcAg were similar across all groups, regardless of pretreatment, at time points assessed up to week 17. No HBeAg antibody responses were detected. These data indicate that high HBV antigen load primarily inhibits HBV-specific T cells, but not B cell responses.

肝臓もＲＴ－ｑＰＣＲおよび肝臓ＧＡＰＤＨ転写物に対する正規化によりＨＢＶ転写物の存在について評価した。ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡまたはＨＢＶ－ｓｉＲＮＡで処置したマウスは、ＨＢＶ転写物レベルの有意な減少を示した(図６Ａおよび６Ｂ)。偽およびエンテカビルまたは対照ｓｉＲＮＡ群で有意差は観察されなかった。肝臓切片を、肝臓での抗ウイルス効果を評価するために、コア抗原の発現について免疫組織化学染色により分析した(図６Ｃ)。ワクチン接種前に前処置しなかった動物において、平均で、８３肝細胞／mm^２のＨＢｃ細胞質発現があった。この数字は、エンテカビルまたは対照ｓｉＲＮＡで前処置した動物と有意には違わなかった。しかしながら、細胞質ＨＢｃＡｇ陽性細胞の数は、ＡＡＶ－ｓｈＲＮＡまたはＨＢＶｓｉＲＮＡ前処置動物で有意に減少した。これらのデータは、組み合わせＲＮＡｉ／ワクチン接種治療が、血清の抗原だけでなく、肝臓のウイルス抗原発現も抑制することを示す。 Livers were also assessed for the presence of HBV transcripts by RT-qPCR and normalization to hepatic GAPDH transcripts. Mice treated with HBV-shRNA or HBV-siRNA showed a significant reduction in HBV transcript levels (Figures 6A and 6B). No significant differences were observed in the sham and entecavir or control siRNA groups. Liver sections were analyzed by immunohistochemical staining for core antigen expression to assess antiviral efficacy in the liver (Figure 6C). On average, there was HBc cytoplasmic expression of 83 hepatocytes/^mm2 in animals not pretreated prior to vaccination. This figure was not significantly different from animals pretreated with entecavir or control siRNA. However, the number of cytoplasmic HBcAg positive cells was significantly reduced in AAV-shRNA or HBV siRNA pretreated animals. These data indicate that the combined RNAi/vaccination treatment suppresses not only antigen in serum but also viral antigen expression in the liver.

ＨＢＶワクチンレジメンに対する免疫応答の増強についてｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを使用するＨＢＶ抗原の発現抑制が効果的である示されたため、ＨＢＶ抗原抑制の期間が、ＨＢＶ免疫応答増強に効果を有するか否かを決定する試験を設計した。ＨＢＶ１.３ｘｆｓマウスモデルを使用して、マウスを、８週間、６週間または３週間ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡＡＤ－６６８１６で対照ｓｉＲＮＡで８週間、３mg／kg／用量皮下投与、続いて、ＰＣＥＰ＋ＣＰＧではなく、１０μg ｃ－ジ－ＡＭＰをアジュバントとして使用する以外、上記プライム－ブーストワクチン投与レジメンに従い、処置した(８および３群についてｎ＝６、６週群についてｎ＝６)(図７参照)。Having shown that suppression of HBV antigen expression using shRNA or siRNA is effective in enhancing immune responses to HBV vaccine regimens, a study was designed to determine whether the duration of HBV antigen suppression has an effect on enhancing HBV immune responses. Using the HBV1.3xfs mouse model, mice were treated with HBV-siRNA AD-66816 subcutaneously for 8, 6 or 3 weeks, or control siRNA at 3 mg/kg/dose for 8 weeks, followed by the prime-boost vaccination regimen described above, except that 10 μg c-di-AMP was used as the adjuvant rather than PCEP+CPG (n=6 for 8 and 3 groups, n=6 for 6 week group) (see Figure 7).

ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶＤＮＡ各々のレベルの有意な減少が、ＡＤ－６６８１６の最初の投与後観察された(図８Ａ～８Ｃ)。ＨＢｓＡｇのさらに有意な減少がワクチンブーストで処置後観察され、８週間前処置群で観察された最大減少はアッセイでの検出レベル未満であり、全処置動物でＨＢｓＡｇレベルの５ log 10を超える減少を示した。免疫化は、ＨＢＶＤＮＡのわずかなさらなる減少(＜０.５ log 10)をもたらし、ＨＢｅＡｇレベルのさらなる減少はなかった。これらのデータは、治療ワクチン接種の有効性がワクチン接種開始前の抗原抑制の期間と相関することを示す。ＨＢＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答の再構成は数週間かかり、６週間または好ましくは８週間前処置が、３週間前処置よりも大きなＨＢｓＡｇノックダウンをもたらす。Significant reductions in HBsAg, HBeAg and HBV DNA levels were observed after the first dose of AD-66816 (Figures 8A-8C). Further significant reductions in HBsAg were observed after treatment with the vaccine boost, with the maximum reduction observed in the 8-week pretreatment group being below the detection level of the assay, and all treated animals showing a reduction of more than 5 log 10 in HBsAg levels. Immunization resulted in a small further reduction (<0.5 log 10) in HBV DNA and no further reduction in HBeAg levels. These data indicate that the efficacy of therapeutic vaccination correlates with the duration of antigen suppression before vaccination begins. Reconstitution of HBV-specific CD8 T cell responses takes several weeks, with 6-week or preferably 8-week pretreatment resulting in greater HBsAg knockdown than 3-week pretreatment.

同様に、肝臓でのＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇに対するＴ細胞応答はＨＢＶ抗原ノックダウンの期間と相談し、ＨＢＶ抗原抑制の期間が長いほど、Ｔ細胞応答は大きくなる(図９Ａ～９Ｃ)。ＭＶＡウイルス抗原に対する類似する応答が、前処置と無関係に全群にわたり観察された(図９Ｄ)。抗体応答は、全群にわたり類似した。Similarly, T cell responses to HBsAg and HBcAg in the liver correlated with the duration of HBV antigen knockdown, with the longer the duration of HBV antigen suppression, the greater the T cell responses (Figures 9A-9C). Similar responses to MVA viral antigens were observed across all groups, regardless of pretreatment (Figure 9D). Antibody responses were similar across all groups.

肝臓もＲＴ－ｑＰＣＲおよび肝臓ＧＡＰＤＨ転写物に対する正規化によりＨＢＶ転写物の存在について評価した。長い前処置期間は、ＨＢＶＲＮＡノックダウンのレベルが高くなる傾向にあった(図１０Ａおよび１０Ｂ)。The liver was also assessed for the presence of HBV transcripts by RT-qPCR and normalization to hepatic GAPDH transcripts. Longer pretreatment periods tended to result in higher levels of HBV RNA knockdown (Figures 10A and 10B).

肝臓切片を、肝臓での処置の抗ウイルス効果を評価するために、ＨＢｃＡｇの細胞質発現について免疫組織化学染色により分析した(図１０Ｃ)。ワクチン接種前に対照ｓｉＲＮＡで前処置した動物において、平均で、１７２肝細胞／mm^２がＨＢｃの細胞質発現を示した。ワクチン接種前のＨＢＶ抑制期間が長いほど、細胞質ＨＢｃＡｇ陽性肝細胞の減少が徐々に増え、８週間前処置群で平均１２細胞質ＨＢｃＡｇ陽性肝細胞／mm^２であった。これらのデータは、ワクチン接種前の長い抗原抑制で観察されるＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増加が、肝臓のＨＢＶ抗原発現減少に至ることを示す。応答の耐久性を評価するために、血液サンプルを、６週間のＡＤ－６６８１６ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡで前処置したマウス(ｎ＝６)でブーストワクチン接種の投与後２週目および３週目に採取した。６匹のマウス中３匹で、ＨＢｓＡｇレベルはアッセイでの検出レベル未満への低下が続いた(図１１Ａおよび１１Ｂ)。特に、ワクチン接種開始時に最高ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベルを有していた３匹の動物(２、４および５)は、ワクチン接種後抗原力価の減少を示さず、実験終了に向かって、抗原力価がリバウンドした。対照的に、ワクチン接種開始時に最低抗原力価を有していた３匹の動物(１、３および６)は、ＨＢｓＡｇが検出限界未満までさらなる減少を示した。これらのデータは、ここに提供する処置レジメンを使用して機能的治癒が可能であることを示す。これらのデータはまた、ワクチン接種開始時の抗原レベルが、治療ワクチン接種に対する応答に影響し得ることも示唆する。最後に、メカニズムに拘束されないが、これらのデータは、治療ワクチン接種後の抗原レベル減少が、少なくとも一部、ＣＤ８＋Ｔ細胞により介在されることを示唆する。これらのデータは、ＨＢＶＤＮＡ複製単独の阻害ではなく、循環ＨＢＶ抗原(例えば、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ)のノックダウンが、ＨＢＶ治療ワクチン、例えば、プライムブースト治療ワクチン接種レジメンに対する免疫応答を増強することを示す。すなわち、免疫応答は、免疫応答がＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫応答であるため、ヌクレオチ(シ)ド阻害剤単独ではなく、ｓｉＲＮＡとの前処置で増強できる。 Liver sections were analyzed by immunohistochemical staining for cytoplasmic expression of HBcAg to assess the antiviral effect of treatment in the liver (Figure 10C). On average, 172 hepatocytes/^mm2 showed cytoplasmic expression of HBc in animals pretreated with control siRNA before vaccination. A longer period of HBV suppression before vaccination led to a progressive decrease in cytoplasmic HBcAg-positive hepatocytes, with an average of 12 cytoplasmic HBcAg-positive hepatocytes/^mm2 in the 8-week pretreatment group. These data indicate that the increase in HBV-specific CD8+ T cell responses observed with longer antigen suppression before vaccination leads to a decrease in HBV antigen expression in the liver. To assess the durability of the response, blood samples were taken at weeks 2 and 3 after administration of the boost vaccination in mice (n=6) pretreated with AD-66816 HBV-siRNA for 6 weeks. In three of six mice, HBsAg levels continued to decline below the detection level in the assay (Figures 11A and 11B). Notably, three animals (2, 4, and 5) that had the highest HBsAg and HBeAg levels at the start of vaccination did not show a decrease in antigen titers after vaccination, and toward the end of the experiment, antigen titers rebounded. In contrast, three animals (1, 3, and 6) that had the lowest antigen titers at the start of vaccination showed a further decrease in HBsAg to below the detection limit. These data indicate that functional cure is possible using the treatment regimen provided herein. These data also suggest that antigen levels at the start of vaccination may affect the response to therapeutic vaccination. Finally, without being bound by mechanism, these data suggest that the decrease in antigen levels after therapeutic vaccination is mediated, at least in part, by CD8+ T cells. These data indicate that knockdown of circulating HBV antigens (e.g., HBsAg, HBcAg), but not inhibition of HBV DNA replication alone, enhances the immune response to HBV therapeutic vaccines, e.g., prime-boost therapeutic vaccination regimens. That is, the immune response can be enhanced by pretreatment with siRNA, but not with nucleotide inhibitors alone, because the immune response is a CD8+ T cell immune response.

必要なノックダウン強度および期間は、例えば、対象の疾患負荷レベルによる。循環抗原のレベルが高いほど、免疫応答増強のために必要なＨＢＶ抗原ノックダウンの強度および期間は大きくなる。血清におけるＨＢｓＡｇのノックダウンは、治療ワクチンで処置前の対象のレベルから少なくとも０.５ log 10(IU／ml)、好ましくは１ log 10(IU／ml)、１.５ log 10(IU／ml)、２ log 10(IU／ml)またはそれ以上である。ある実施態様において、血清ＨＢｓＡｇレベルは、ワクチン投与前の２.５ log 10(IU／ml)、２ log 10(IU／ml)、１.５ log 10(IU／ml)以下である。The strength and duration of knockdown required depends, for example, on the subject's disease burden level. The higher the level of circulating antigen, the greater the strength and duration of HBV antigen knockdown required to enhance the immune response. The knockdown of HBsAg in serum is at least 0.5 log 10 (IU/ml), preferably 1 log 10 (IU/ml), 1.5 log 10 (IU/ml), 2 log 10 (IU/ml) or more from the level in the subject prior to treatment with the therapeutic vaccine. In some embodiments, serum HBsAg levels are 2.5 log 10 (IU/ml), 2 log 10 (IU/ml), 1.5 log 10 (IU/ml) or less prior to administration of the vaccine.

さらに、ここで示されるとおり、ＨＢＶ抗原ノックダウンの期間が長いほど、より強固な免疫応答となる傾向がある。それ故に、少なくとも４週間、６週間または８週間の期間の十分に低いレベルまでの血清ＨＢｓＡｇのノックダウンが、ワクチン投与前に好ましい。Furthermore, as shown herein, a longer period of HBV antigen knockdown tends to result in a more robust immune response. Therefore, knockdown of serum HBsAg to sufficiently low levels for a period of at least 4, 6 or 8 weeks is preferred prior to vaccination.

第二の一連の実験を、アデノ随伴ウイルス感染系を使用する後天的ＨＢＶ感染のマウスモデルにおける組み合わせｓｉＲＮＡ／ワクチン接種処置レジメンの試験のために設計した。これらの試験について、野生型Ｃ５７／Ｂｌ６マウス(９週齢)に、遺伝子型Ｄの１.２倍過剰な長さのＨＢＶゲノムを担持するアデノ随伴ウイルス血清型８(ＡＡＶ８)(ＡＡＶ－ＨＢＶ１.２)を、ｉ.ｖ.で２×１０^１０ゲノム相当量注射した(例えば、Yang, et al. (2014) Cell and Mol Immunol 11:71参照)。ＡＡＶ形質導入(－２８日目)４週間後から開始して、動物を０日目、２９日目および５７日目に対照ｓｉＲＮＡまたはＨＢＶｓｉＲＮＡ(ＨＢＶＡＤ－６６８１６またはＡＤ－６６８１０)の３用量で処置し、続いて買各群の半分の動物を５７日目および７０日目にＨＢｓＡｇ、ＨｂｃＡｇおよび１０μg ｃ－ジ－ＡＭＰでのプライムタンパク質ワクチン接種および８４日目にＭＶＡ－ＨＢｓおよびＭＶＡ－ＨＢｃでのブーストからなるワクチンレジメンで処置した。処置レジメンを図１２に示す。 A second series of experiments was designed to test combination siRNA/vaccination treatment regimens in a mouse model of acquired HBV infection using an adeno-associated virus infection system. For these studies, wild-type C57/Bl6 mice (9 weeks old) were injected i.v. with^2x10 genome equivalents of adeno-associated virus serotype 8 (AAV8) carrying a 1.2-fold excess of HBV genome length over genotype D (AAV-HBV1.2) (see, e.g., Yang, et al. (2014) Cell and Mol Immunol 11:71). Starting 4 weeks after AAV transduction (day -28), animals were treated with 3 doses of control siRNA or HBV siRNA (HBVAD-66816 or AD-66810) on days 0, 29, and 57, followed by treatment of half the animals in each group with a vaccine regimen consisting of prime protein vaccination with HBsAg, HbcAg, and 10 μg c-di-AMP on days 57 and 70, and boost with MVA-HBs and MVA-HBc on day 84. The treatment regimen is shown in FIG.

ＡＡＶ－ＨＢＶ１.２形質導入後、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ値は、ＨＢＶトランスジェニックマウス(ＨＢＶｘｆｓ)で見られるレベルと同等レベルまで上がった(例えば、図１３Ａおよび１３Ｂ参照)。ＨＢＶｓｉＲＮＡで処置したマウスは、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベルが約５００IU／ml未満であるような、ＨＢｓＡｇレベルの約２ log 10スケールのおよびＨＢｅＡｇレベルの１ log 10スケールを超える平均減少を示し、一方対照ｓｉＲＮＡは抗原レベルに効果はなかった。ワクチンレジメンを受けなかったＨＢＶｓｉＲＮＡの一方で処置された動物は、ｓｉＲＮＡの最後の適用後抗原レベルのゆっくりしたリバウンドを示した。抗原血症は１８週間後にベースラインレベルに戻った。ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡおよびワクチンレジメンの組み合わせ処置は、実験の間、検出限界未満へのＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇが減少する、耐久性応答をもたらした。ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベルの減少はＭＶＡブースト投与前に観察されタンパク質ワクチン接種が治癒に十分であり得ることを示唆する。血清および肝臓ＨＢＶＤＮＡおよびＲＮＡ両者は、ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡおよびワクチンレジメンの組み合わせ処置後有意に減少した(図１３Ｄ～１３Ｈ)。これは、ＲＮＡｉ介在抑制が抗原発現を強く減少できるが、ワクチンレジメンでの処置は応答の耐久性を延長することを示す。After AAV-HBV1.2 transduction, HBsAg and HBeAg values rose to levels comparable to those seen in HBV transgenic mice (HBVxfs) (see, for example, Figures 13A and 13B). Mice treated with HBV siRNA showed a mean reduction of approximately 2 log 10 scale in HBsAg levels and more than 1 log 10 scale in HBeAg levels, such that HBsAg and HBeAg levels were less than approximately 500 IU/ml, while control siRNA had no effect on antigen levels. Animals treated with HBV siRNA alone, but not receiving the vaccine regimen, showed a slow rebound in antigen levels after the last application of siRNA. Antigenemia returned to baseline levels after 18 weeks. Combined treatment with HBV-siRNA and vaccine regimen resulted in a durable response, with HBsAg and HBeAg reduced to below detection limits for the duration of the experiment. A decrease in HBsAg and HBeAg levels was observed before the MVA boost dose, suggesting that protein vaccination may be sufficient for cure. Both serum and liver HBV DNA and RNA were significantly decreased after combined treatment with HBV-siRNA and vaccine regimens (Figures 13D-13H). This indicates that RNAi-mediated suppression can strongly reduce antigen expression, but treatment with the vaccine regimen prolongs the durability of the response.

対照ｓｉＲＮＡを受けた動物のワクチンレジメン単独は、一過性の抗原レベルの減少を生じ、これは実験の終わりに向けてリバウンドした。対照的に、ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡおよびワクチン接種を受けた全動物で、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベルは、ワクチン接種開始後検出限界未満まで低下した。抗原レベルは、最後のｓｉＲＮＡ適用少なくとも２２週間後測定した時点まで、全て大部分検出不可能であった(図１３Ａおよび１３Ｂ)。ＨＢＶｓｉＲＮＡ前処置動物の抗原血症の耐久性喪失は、対照ｓｉＲＮＡ前処置動物でリバウンドした抗原と対照的であり、さらに免疫制御が、ワクチン接種前に低い抗原力価を有した動物でのみ達成されたことを示す。In animals receiving control siRNA, the vaccine regimen alone resulted in a transient reduction in antigen levels that rebounded toward the end of the experiment. In contrast, in all HBV-siRNA and vaccinated animals, HBsAg and HBeAg levels fell below the limit of detection after vaccination began. Antigen levels were all largely undetectable until measurements were taken at least 22 weeks after the last siRNA application (Figures 13A and 13B). The durable loss of antigenemia in HBV siRNA pretreated animals contrasted with antigen rebound in control siRNA pretreated animals, further indicating that immune control was only achieved in animals with low antigen titers prior to vaccination.

抗原血症消失と一致して、ＨＢＶｓｉＲＮＡとワクチンレジメンで処置した動物は、高力価の抗ＨＢｓ抗体を発生させ、全ワクチン接種動物で抗ＨＢｓおよび抗ＨＢｅセロコンバージョンをもたらした(図１４)。ｓｉＲＮＡ前処置動物は、１０倍高く、より一貫した抗ＨＢｓ力価を発生させ、完全にかつ永続的に、血清ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇを浄化できた。興味深いことに、ＨＢＶｓｉＲＮＡ処置後ワクチン接種した３／１２マウスは、１５～２２週目に抗ＨＢｅレベルの一過性の低下を示し、ＨＢｅＡｇの低レベル再発をもたらし(図１３Ｃ)、これも同様に制御された。対照ｓｉＲＮＡとワクチンレジメンを受けた動物で抗ＨＢｓ抗体も測定されたが、レベルは低かった。さらに、ＨＢＶｓｉＲＮＡとワクチンレジメンを受けた動物のみが抗ＨＢｅ抗体を生じた。併せて、機能的治癒はｓｉＲＮＡ処置レジメンまたは治療ワクチン接種レジメン単独では達成されなかった。しかしながら、抗原血症消失ならびに抗ＨＢｓおよび抗ＨＢｅ抗体発生は、組み合わせＨＢＶｓｉＲＮＡとワクチンレジメンが機能的治癒を達成できることを示す。Consistent with antigenemia clearance, animals treated with the HBV siRNA and vaccine regimen developed high titers of anti-HBs antibodies, leading to anti-HBs and anti-HBe seroconversion in all vaccinated animals (Figure 14). siRNA pre-treated animals developed 10-fold higher and more consistent anti-HBs titers and were able to completely and durably clear serum HBsAg and HBeAg. Interestingly, 3/12 mice vaccinated after HBV siRNA treatment showed a transient decline in anti-HBe levels at weeks 15-22, leading to a low-level recurrence of HBeAg (Figure 13C), which was similarly controlled. Anti-HBs antibodies were also measured in animals receiving the control siRNA and vaccine regimen, but at low levels. Furthermore, only animals receiving the HBV siRNA and vaccine regimen developed anti-HBe antibodies. Taken together, functional cure was not achieved with the siRNA treatment regimen or the therapeutic vaccination regimen alone. However, disappearance of antigenemia and development of anti-HBs and anti-HBe antibodies indicate that a combined HBV siRNA and vaccine regimen can achieve a functional cure.

実験を通して、動物のＡＬＴおよび体重をモニターした。抗原血症消失は、ワクチン接種レジメンと共にＨＢＶｓｉＲＮＡを受けた処置群で見られるＡＬＴ活性のわずかな増加と一致した(図１５Ａ)。これらの群は、組み合わせＨＢＶｓｉＲＮＡ－ワクチンレジメンを受けなった全ての他の処置群と比較して、有意なしかし、中程度の(両者とも反復測定二元配置ＡＮＯＶＡによりｐ＞０.０５以下；ワクチン接種開始後の時点のみ比較)増加を示した。メカニズムに拘束されないが、組み合わせＨＢＶｓｉＲＮＡ－ワクチンレジメンにより誘発されるＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＨＢＶ発現肝細胞を殺し、ＡＬＴを上昇させることが示唆される。ALT and body weight of animals were monitored throughout the experiment. Antigenemia disappearance was consistent with the slight increase in ALT activity seen in treatment groups that received HBV siRNA along with the vaccination regimen (Figure 15A). These groups showed significant, but modest (both p>0.05 by repeated measures two-way ANOVA; comparing only time points after vaccination initiation) increases compared to all other treatment groups that did not receive the combined HBV siRNA-vaccine regimen. Without being bound by mechanism, it is suggested that CD8+ T cells induced by the combined HBV siRNA-vaccine regimen kill HBV-expressing hepatocytes and increase ALT.

動物の体重を実験を通して測定し、処置の耐容性をモニターした。ｓｉＲＮＡ処置と無関係に、実験を通して一定の増加を示した。ワクチン接種した動物は、ワクチン接種後にわずかな一過性の体重減少(約５％)を示したが、９日以内に正常レベルまで回復し、その後対照群と同等に体重が増加した(図１５Ｂ)。併せて、ＡＬＴ活性および体重データ両者とも、ｓｉＲＮＡのみ、ワクチンのみならびに組み合わせｓｉＲＮＡ／ワクチンレジメンを含む全実験処置が十分に耐容性であることを示す。Animal body weight was measured throughout the experiment to monitor the tolerability of the treatment. It showed consistent gains throughout the experiment, independent of siRNA treatment. Vaccinated animals showed a slight, transient weight loss (approximately 5%) after vaccination, but recovered to normal levels within 9 days and subsequently gained weight comparable to the control group (Figure 15B). Together, both the ALT activity and body weight data indicate that all experimental treatments, including siRNA alone, vaccine alone, and the combined siRNA/vaccine regimen, were well tolerated.

血清のＨＢｓＡｇレベルノックダウンのためのｓｉＲＮＡの投与数およびタイミングは、例えば、使用する特定の薬剤による。ここでの方法で使用され、例えば、付属表ＡおよびＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０７７３２１(その内容を全体として引用により本明細書に包含させる)に提供される例示的ＧａｌＮＡｃｓｉＲＮＡの期間および効力によって、単回用量のｓｉＲＮＡが、治療ワクチン投与前に必要なノックダウンのレベルおよび期間の提供に十分であり得る。図４に示すとおり、単回用量のＡＡＶベクターコード化ｓｈＲＮＡは、ＨＢＶ抗原およびＨＢＶＤＮＡの耐久性ノックダウン提供に十分であった。当業者は、ＨＢＶ疾患状態を、例えば、血中ＨＢｓＡｇレベルの測定によりモニターし、特定の対象に適するｓｉＲＮＡおよびワクチン投与のタイミングおよびレベルを決定できる。The number and timing of siRNA doses for serum HBsAg level knockdown will depend, for example, on the particular agent used. Due to the duration and potency of the exemplary GalNAc siRNA used in the methods herein and provided, for example, in Appendix A and PCT Publication WO 2016/077321, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety, a single dose of siRNA may be sufficient to provide the level and duration of knockdown required prior to therapeutic vaccine administration. As shown in FIG. 4, a single dose of AAV vector-encoded shRNA was sufficient to provide durable knockdown of HBV antigens and HBV DNA. One of skill in the art can monitor HBV disease status, for example, by measuring blood HBsAg levels, to determine the appropriate timing and level of siRNA and vaccine administration for a particular subject.

多数の治療ＨＢＶワクチンが当分野で知られ、ここに記載されている。好ましい実施態様において、ここで使用するプロトコールのようなプライム－ブーストワクチン接種プロトコールが好ましい。しかしながら、ここに提供するＨＢＶ抗原ノックダウン方法は、単独で投与したときに不十分であることが知られているものを含み、当分野で知られる他の治療ＨＢＶワクチンと組み合わせて、使用できる。ワクチン接種は、タンパク質または核酸形態の少なくとも２用量の抗原を含む。ある実施態様において、ワクチン接種は、３用量のタンパク質ベースのワクチンを含む。好ましい実施態様において、方法は、異種性ワクチン投与、すなわち、少なくとも一つのタンパク質ベースのワクチン用量および少なくとも一つの核酸ベースのワクチン用量を含む。ワクチンおよび投与レジメンの例示的実施態様は、例えば、内容を全体として引用により本明細書に包含させる、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１７／１２１７９１に提供される。Numerous therapeutic HBV vaccines are known in the art and described herein. In a preferred embodiment, a prime-boost vaccination protocol, such as the protocol used herein, is preferred. However, the HBV antigen knockdown methods provided herein can be used in combination with other therapeutic HBV vaccines known in the art, including those known to be ineffective when administered alone. The vaccination includes at least two doses of antigen in protein or nucleic acid form. In some embodiments, the vaccination includes three doses of a protein-based vaccine. In a preferred embodiment, the method includes heterologous vaccination, i.e., at least one protein-based vaccine dose and at least one nucleic acid-based vaccine dose. Exemplary embodiments of vaccines and administration regimens are provided, for example, in PCT Publication WO 2017/121791, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.

ここに提供する方法はＨＢｃＡｇまたはＨＢｓＡｇをコードする発現ベクター構築物を含む核酸ベースのワクチンの使用を含み、ここで、構築物は該タンパク質ベースのワクチンとエピトープを共有するタンパク質をコードする。それ故に、核酸ベースのワクチンも、タンパク質ベースのワクチンも、完全長タンパク質を提供する必要がないことは明確に理解される。核酸ベースのワクチンおよびタンパク質ベースのワクチンは、ＨＢｃＡｇまたはＨＢｓＡｇに存在する少なくとも一つの共有エピトープを提供する必要があり、完全長タンパク質が提供される必要はない。上記のとおり、エピトープは比較的短い、一般に約８～１１アミノ酸長ペプチドであるＭＨＣクラスＩ分子であってよく、一方、ＭＨＣクラスII分子は、約１３～１７アミノ酸長ペプチドで長く存在し、立体構造エピトープは長い。しかしながら、タンパク質抗原および複数エピトープをコードするタンパク質抗原のためのコード配列が好ましいことは理解される。さらに、タンパク質ベースのワクチンに存在するおよび核酸ベースのワクチンによりコード化される抗原は、同一であっても、同一でなくてもよいことは理解される。抗原は免疫原性に関して選択されるべきであることも明らかである。このような抗原は、当分野で周知である。The methods provided herein include the use of a nucleic acid-based vaccine comprising an expression vector construct encoding HBcAg or HBsAg, where the construct encodes a protein that shares an epitope with the protein-based vaccine. It is therefore clearly understood that neither the nucleic acid-based vaccine nor the protein-based vaccine need provide the full-length protein. The nucleic acid-based vaccine and the protein-based vaccine need provide at least one shared epitope present in HBcAg or HBsAg, and the full-length protein need not be provided. As noted above, the epitopes may be relatively short, typically about 8-11 amino acid long peptides, MHC class I molecules, while MHC class II molecules are longer, about 13-17 amino acid long peptides, and the conformational epitopes are longer. However, it is understood that coding sequences for protein antigens and protein antigens that encode multiple epitopes are preferred. It is further understood that the antigens present in the protein-based vaccine and encoded by the nucleic acid-based vaccine may or may not be identical. It is also clear that the antigens should be selected for immunogenicity. Such antigens are well known in the art.

ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンおよび核酸ベースのワクチンの投与順は、ここに提供する方法で例示する順番と比較して逆である。すなわち、核酸ベースのワクチンをまず投与し、タンパク質ベースのワクチンを２番目に投与する。ある実施態様において、計３用量のワクチンが投与され、２用量の核酸ベースのワクチンに続いて、単一１用量のタンパク質ベースのワクチンである。別の実施態様において、単回用量の核酸ベースのワクチンの後に、２用量のタンパク質ベースのワクチンである。他の実施態様において、１用量の各ワクチンが投与される。In one embodiment, the order of administration of the protein-based vaccine and the nucleic acid-based vaccine is reversed compared to the order exemplified in the methods provided herein. That is, the nucleic acid-based vaccine is administered first and the protein-based vaccine is administered second. In one embodiment, a total of three doses of vaccine are administered: two doses of the nucleic acid-based vaccine followed by a single dose of the protein-based vaccine. In another embodiment, a single dose of the nucleic acid-based vaccine followed by two doses of the protein-based vaccine. In other embodiments, one dose of each vaccine is administered.

好ましい実施態様において、プライム－ブーストワクチン接種方法は、タンパク質抗原とアジュバントの共使用を含む。本方法で使用するための適切なアジュバントは、抗原に対する細胞ベースの応答を促進する。アジュバントは、好ましくはバランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２応答を提供する。In a preferred embodiment, the prime-boost vaccination method involves the co-use of a protein antigen and an adjuvant. A suitable adjuvant for use in this method promotes a cell-based response to the antigen. The adjuvant preferably provides a balanced Th1/Th2 response.

ここに提供するｓｉＲＮＡ＋ワクチン方法を、ＨＢＶ処置の標準治療であるヌクレオチ(シ)ド阻害剤の投与と組み合わせて使用し得る。ある実施態様において、対象を、ｓｉＲＮＡ＋ワクチン処置レジメンでの処置前にヌクレオチ(シ)ド阻害剤で処置する。ある実施態様において、対象を、ｓｉＲＮＡ＋ワクチン処置レジメンでの処置の間、ヌクレオチ(シ)ド阻害剤で処置する。ある実施態様において、ヌクレオチ(シ)ド阻害剤を、ＨＢＶにより標的とされる核酸治療(例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド)投与前に、ＨＢＶ感染と関連する先在炎症を低減するために投与する。The siRNA + vaccine methods provided herein may be used in combination with administration of a nucleotide inhibitor, which is the standard of care for HBV treatment. In some embodiments, a subject is treated with a nucleotide inhibitor prior to treatment with an siRNA + vaccine treatment regimen. In some embodiments, a subject is treated with a nucleotide inhibitor during treatment with an siRNA + vaccine treatment regimen. In some embodiments, a nucleotide inhibitor is administered prior to administration of an HBV targeted nucleic acid therapy (e.g., siRNA, shRNA, antisense oligonucleotide) to reduce pre-existing inflammation associated with HBV infection.

ある実施態様において、対象を、ＨＢＶ処置に使用される他剤で前処置または同時処置し得る。このような薬剤は、免疫刺激剤(例えば、ペグ化インターフェロンアルファ２ａ(ＰＥＧ－ＩＦＮ－α２ａ)、インターフェロンアルファ－２ｂ、組み換えヒトインターロイキン－７およびトール様受容体７(ＴＬＲ７)アゴニスト)、ウイルス侵入阻害剤(例えば、Myrcludex)、ＨｂｓＡｇの分泌または放出を阻害するオリゴヌクレオチド(例えば、ＲＥＰ９ＡＣ)、カプシド阻害剤(例えば、Ｂａｙ４１－４１０９およびＮＶＲ－１２２１)、ｃｃｃＤＮＡ阻害剤(例えば、ＩＨＶＲ－２５)、Ｒｉｇ－Ｉリガンドまたは免疫チェックポイント制御因子を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、免疫刺激剤はＲｉｇ－Ｉリガンドまたは免疫チェックポイント制御因子である。機能的治癒は、少なくとも３か月、好ましくは６か月の５０IU／ml未満へのＨＢｓＡｇ減少またはＨＢｓＡｇへの検出可能な抗体応答の持続期間を含む。好ましい実施態様において、機能的治癒は、少なくとも３か月、好ましくは６か月の５０IU／ml未満のＨＢｓＡｇおよびＨＢｓＡｇに対する検出可能な抗体応答の持続期間を含む。In some embodiments, the subject may be pretreated or co-treated with other agents used in HBV treatment. Such agents include, but are not limited to, immune stimulants (e.g., pegylated interferon alpha 2a (PEG-IFN-α2a), interferon alpha-2b, recombinant human interleukin-7, and toll-like receptor 7 (TLR7) agonists), viral entry inhibitors (e.g., Myrcludex), oligonucleotides that inhibit secretion or release of HbsAg (e.g., REP 9AC), capsid inhibitors (e.g., Bay41-4109 and NVR-1221), cccDNA inhibitors (e.g., IHVR-25), Rig-I ligands, or immune checkpoint regulators. In some embodiments, the immune stimulant is a Rig-I ligand or immune checkpoint regulator. A functional cure includes a reduction in HBsAg to less than 50 IU/ml or a sustained detectable antibody response to HBsAg for at least 3 months, preferably 6 months. In a preferred embodiment, a functional cure includes a sustained reduction in HBsAg to less than 50 IU/ml and a sustained detectable antibody response to HBsAg for at least 3 months, preferably 6 months.

Ａ. 本発明の方法において使用するＲＮＡｉ剤
本発明は、少なくとも一つのＨＢＶ転写物および好ましくは３または４ＨＢＶ転写物(オープンリーディングフレーム、ここでは遺伝子と称することもある)の発現を阻害する、ｉＲＮＡの使用を含む。ＨＢＶゲノムの高度に凝縮された構造のため、３または４ＨＢＶ転写物の発現を阻害する単一ｉＲＮＡの設計が可能である(図１参照)。単純化のために、ここでは、「ＨＢＶ転写物」と称する。好ましい実施態様は、１を超えるＨＢＶ転写物(またはオープンリーディングフレーム)、好ましくは少なとも３つのＨＢＶ転写物(またはオープンリーディングフレーム)の阻害を含むことは明らかである。さらに、８つのＨＢＶ遺伝子型および２つの提案されたさらなる遺伝子型があり、それらがさらに公開配列からの変異を含み得ることは理解される。それ故に、あるｉＲＮＡ剤は、特定の遺伝子型およびＨＢＶに感染した対象に基づき、異なる数の遺伝子を阻害し得る。A. RNAi Agents for Use in the Methods of the Invention The present invention includes the use of iRNAs that inhibit the expression of at least one HBV transcript, and preferably three or four HBV transcripts (open reading frames, sometimes referred to herein as genes). Due to the highly condensed structure of the HBV genome, it is possible to design a single iRNA that inhibits the expression of three or four HBV transcripts (see FIG. 1). For simplicity, we refer to them herein as "HBV transcripts." It is clear that preferred embodiments include the inhibition of more than one HBV transcript (or open reading frame), preferably at least three HBV transcripts (or open reading frames). It is further understood that there are eight HBV genotypes and two proposed additional genotypes, which may further include variations from the published sequence. Therefore, an iRNA agent may inhibit a different number of genes based on the particular genotype and the subject infected with HBV.

ある実施態様において、ｉＲＮＡ剤は、ＨＢＶ感染を有する対象における細胞のＨＢＶ転写物の発現阻害またはレベルの減少のための二本鎖リボ核酸(ｄｓＲＮＡ)分子を含む。ｄｓＲＮＡは、相補性領域を有するアンチセンス鎖を含み、これは、ＨＢＶ転写物の発現で形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。相補性領域は、約３０ヌクレオチド以下長(例えば、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９または１８ヌクレオチド長以下)を有する。ＨＢＶ遺伝子を発現する細胞との接触により、ｉＲＮＡは、少なくとも１、好ましくは３または４ＨＢＶ遺伝子の発現を選択的に阻害する。好ましい実施態様において、発現の阻害は、実施例に提供する、適切な細胞株でのｑＰＣＲ方法により決定する。活性のインビトロ評価のために、パーセント阻害を、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０７７３２１の実施例２に提供される方法を使用して、１０nM 二本鎖最終濃度の単一用量で決定する。インビボ試験について、処置後のレベルを、例えば、適切な歴史的対照と比較するかまたは、例えば、ベースライン値が対象について利用可能でないときプールした集団サンプル対照と比較して、減少レベルを決定することができる。適切な対照は、当業者により注意深く選択されるべきである。In one embodiment, the iRNA agent comprises a double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) molecule for inhibiting expression or reducing levels of HBV transcripts in cells in a subject with HBV infection. The dsRNA comprises an antisense strand having a complementary region, which is complementary to at least a portion of the mRNA formed upon expression of the HBV transcript. The complementary region has a length of about 30 nucleotides or less (e.g., about 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, or 18 nucleotides or less). Upon contact with a cell expressing an HBV gene, the iRNA selectively inhibits expression of at least one, preferably 3 or 4 HBV genes. In a preferred embodiment, inhibition of expression is determined by qPCR methods in appropriate cell lines, as provided in the Examples. For in vitro assessment of activity, percent inhibition is determined at a single dose of 10 nM duplex final concentration using the method provided in Example 2 of PCT Publication WO2016/077321. For in vivo testing, post-treatment levels can be compared, for example, to appropriate historical controls or, for example, to pooled population sample controls when baseline values are not available for the subject, to determine the level of reduction. Appropriate controls should be carefully selected by one of skill in the art.

ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが使用されるであろう条件下で、相補的であり、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成する、２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖(アンチセンス鎖)は、標的配列に実質的に相補性および一般に完全に相補性である、相補性領域を含む。標的配列は、ＨＢＶ遺伝子の発現中、形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。複数ＨＢＶ遺伝子型が知られているため、ｉＲＮＡ剤は、好ましくはできるだけ多くの遺伝子型にわたり、ＨＢＶ遺伝子の発現を阻害するように設計される。１以上のＨＢＶ遺伝子型に完全に相補性のｓｉＲＮＡは、全遺伝子型に完全に相補性ではないことが理解される。他の鎖(センス鎖)は、適当な条件下で合わさったとき、２鎖がハイブリダイズし、二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖と相補性である領域を含む。本明細書の他の箇所に記載し、当分野で知ら得るとおり、ｄｓＲＮＡの相補性配列も、別々のオリゴヌクレオチドにあるのとは異なり、単一核酸分子の自己相補性領域として含まれ得る。dsRNA comprises two RNA strands that are complementary and hybridize to form a double-stranded structure under conditions in which the dsRNA will be used. One strand of the dsRNA (the antisense strand) contains a region of complementarity that is substantially complementary and generally completely complementary to the target sequence. The target sequence may be derived from the sequence of the mRNA formed during expression of the HBV gene. Because multiple HBV genotypes are known, the iRNA agent is preferably designed to inhibit expression of the HBV gene across as many genotypes as possible. It is understood that an siRNA that is completely complementary to one or more HBV genotypes will not be completely complementary to all genotypes. The other strand (the sense strand) contains a region that is complementary to the antisense strand such that when combined under appropriate conditions, the two strands hybridize to form a double-stranded structure. As described elsewhere herein and known in the art, the complementary sequences of the dsRNA may also be included as self-complementary regions of a single nucleic acid molecule, as opposed to being in separate oligonucleotides.

一般に、二本鎖構造は、１５～３０塩基対長、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２塩基対長である。上記範囲および長さの中間の範囲および長さも、本発明の一部であると考えられる。In general, the double-stranded structure is 15-30 base pairs long, e.g., 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-2 9, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, or 21-22 base pairs in length. Ranges and lengths intermediate to the above ranges and lengths are also considered part of the invention.

同様に、標的配列に対する相補性領域は、１５～３０ヌクレオチド長、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４,２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２ヌクレオチド長である。上記範囲および長さの中間の範囲および長さも、本発明の一部であると考えられる。Similarly, the region of complementarity to the target sequence may be 15 to 30 nucleotides in length, e.g., 15 to 29, 15 to 28, 15 to 27, 15 to 26, 15 to 25, 15 to 24, 15 to 23, 15 to 22, 15 to 21, 15 to 20, 15 to 19, 15 to 18, 15 to 17, 18 to 30, 18 to 29, 18 to 28, 18 to 27, 18 to 26, 18 to 25, 18 to 24, 18 to 23, 18 to 22, 18 to 21, 18 to 20, 19 to 30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, or 21-22 nucleotides in length. Ranges and lengths intermediate to the above ranges and lengths are also considered part of the invention.

ある実施態様において、ｄｓＲＮＡは約１５～２０ヌクレオチド長または約２５～３０ヌクレオチド長である。一般に、ｄｓＲＮＡは、ダイサー酵素の基質として働くのに十分長い。例えば、約２１～２３ヌクレオチド長より長いｄｓＲＮＡが、ダイサーの基質として働き得ることは当分野で周知である。当業者にはまた認識されるとおり、切断の標的とされるＲＮＡの領域は、最もしばしば大型のＲＮＡ分子、多くはｍＲＮＡ分子の一部である。適切であれば、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、切断のためにＲＮＡｉ指向される基質となり得る十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続配列である(すなわち、ＲＩＳＣ経路を経る切断)。In certain embodiments, the dsRNA is about 15-20 nucleotides in length or about 25-30 nucleotides in length. Generally, the dsRNA is long enough to serve as a substrate for the Dicer enzyme. For example, it is well known in the art that dsRNAs longer than about 21-23 nucleotides in length can serve as substrates for Dicer. As will also be appreciated by those of skill in the art, the region of an RNA targeted for cleavage is most often a portion of a larger RNA molecule, often an mRNA molecule. Where appropriate, a "portion" of an mRNA target is a contiguous sequence of the mRNA target of sufficient length to be an RNAi-directed substrate for cleavage (i.e., cleavage via the RISC pathway).

二本鎖領域、例えば、約９～３６塩基対、例えば、約１０～３６、１１～３６、１２～３６、１３～３６、１４～３６、１５～３６、９～３５、１０～３５、１１～３５、１２～３５、１３～３５、１４～３５、１５～３５、９～３４、１０～３４、１１～３４、１２～３４、１３～３４、１４～３４、１５～３４、９～３３、１０～３３、１１～３３、１２～３３、１３～３３、１４～３３、１５～３３、９～３２、１０～３２、１１～３２、１２～３２、１３～３２、１４～３２、１５～３２、９～３１、１０～３１、１１～３１、１２～３１、１３～３２、１４～３１、１５～３１、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４,２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２塩基対の二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの一次機能的部分であることも当業者は認識する。それ故に、ある実施態様において、切断について所望のＲＮＡを標的とする、例えば、１５～３０塩基対の機能的二本鎖に処理される程度において、３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の複合体はｄｓＲＮＡである。それ故に、当業者は、ある実施態様において、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識する。他の実施態様において、ｄｓＲＮＡは天然に存在するｍｉＲＮＡではない。他の実施態様において、ＨＢＶ遺伝子発現の標的に有用なｉＲＮＡ剤は、大型ｄｓＲＮＡの切断により、標的細胞で産生されない。Double-stranded region, e.g., about 9-36 base pairs, e.g., about 10-36, 11-36, 12-36, 13-36, 14-36, 15-36, 9-35, 10-35, 11-35, 12-35, 13-35, 14-35, 15-35, 9-34, 10-34, 11-34, 12-34, 13-34, 14-34, 15-34, 9-33, 10-33, 11-33 , 12-33, 13-33, 14-33, 15-33, 9-32, 10-32, 11-32, 12-32, 13-32, 14-32, 15-32, 9-31, 10-31, 11-31, 12-31, 13-32, 14-31, 15-31, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-2 2, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 1 Those of skill in the art will also recognize that a double-stranded region of 9-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, or 21-22 base pairs is the primary functional portion of a dsRNA. Thus, in certain embodiments, an RNA molecule or complex of RNA molecules having a double-stranded region of more than 30 base pairs, to the extent that it is processed into a functional duplex of, for example, 15-30 base pairs, that targets a desired RNA for cleavage, is a dsRNA. Thus, those of skill in the art will recognize that in certain embodiments, a miRNA is a dsRNA. In other embodiments, the dsRNA is not a naturally occurring miRNA. In other embodiments, iRNA agents useful for targeting HBV gene expression are not produced in target cells by cleavage of large dsRNA.

二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を経る所望の標的ＲＮＡの特定の分解を可能にする任意の長さでよく、約９～３６塩基対長、例えば、約１５～３０塩基対長、例えば、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６塩基対長、例えば約１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４,２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２塩基対長の範囲であり得る。上記範囲および長さの中間の範囲および長さも、本発明の一部であると考えられる。The double-stranded region can be of any length that allows for specific degradation of the desired target RNA through the RISC pathway, and can be about 9-36 base pairs in length, e.g., about 15-30 base pairs in length, e.g., about 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, or 36 base pairs in length, e.g., about 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-3 0, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, It may be in the range of 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, or 21-22 base pairs in length. Ranges and lengths intermediate to the above ranges and lengths are also considered part of the invention.

二本鎖構造を形成する２つの鎖は、一つの大型ＲＮＡ分子の異なる部分であってよく、または別々のＲＮＡ分子であってよい。２つの鎖が一つの大型分子の一部であり、それ故に二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と各他方の鎖の５’末端の間のヌクレオチドの中断されていない鎖で連結されているならば、連結ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と称される。ヘアピンループは、少なくとも一つの不対ヌクレオチドを含み得る。ある実施態様において、ヘアピンループは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３またはそれ以上の不対ヌクレオチドを含み得る。The two strands forming the double-stranded structure may be different portions of one larger RNA molecule or may be separate RNA molecules. If the two strands are part of one larger molecule and are therefore linked with an uninterrupted chain of nucleotides between the 3' end of one strand and the 5' end of each other strand forming the double-stranded structure, the linked RNA strands are referred to as "hairpin loops." A hairpin loop may contain at least one unpaired nucleotide. In certain embodiments, a hairpin loop may contain at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 20, at least 23 or more unpaired nucleotides.

ある実施態様において、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、テトラループを含む。ｄｓＲＮＡの文脈で、ここで使用する「テトラループ」は、隣接するワトソン－クリックハイブリダイズヌクレオチドの安定性に寄与する、安定な二次構造を形成する４つのヌクレオチドからなるループ(一本鎖領域)をいう。理論に拘束されないが、テトラループは、相互作用の積み重ねにより隣接ワトソン－クリック塩基対を安定化し得る。さらに、テトラループ内の４ヌクレオチド間の相互作用は、非ワトソン－クリック塩基対形成、積み重ね相互作用、水素結合および接触相互作用を含むが、これらに限定されない(Cheong et al., Nature 1990 Aug 16;346(6285):680-2; Heus and Pardi, Science 1991 Jul 12;253(5016): 191-4)。テトラループは、４つの無作為塩基からなる単純モデルループ配列から予測されるより、高い、隣接二本鎖の融点(Ｔｍ)増加に寄与する。例えば、テトラループは、少なくとも２塩基対長の二本鎖を含むヘアピンで、１０mM ＮａＨＰＯ_４中、少なくとも５５℃の融点を付与し得る。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドおよびそれらの組み合わせを含み得る。ＲＮＡテトラループの例は、テトラループのＵＮＣＧファミリー(例えば、ＵＵＣＧ)、テトラループのＧＮＲＡファミリー(例えば、ＧＡＡＡ)およびＣＵＵＧテトラループを含む。(Woese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Nov;87(21):8467-71 ; Antao et al., Nucleic Acids Res. 1991 Nov l l;19(21):5901-5)。ＤＮＡテトラループの例は、テトラループのｄ(ＧＮＮＡ)ファミリー(例えば、ｄ(ＧＴＴＡ))、テトラループのｄ(ＧＮＲＡ)ファミリー、テトラループのｄ(ＧＮＡＢ)ファミリー、テトラループのｄ(ＣＮＮＧ)ファミリー、テトラループのｄ(ＴＮＣＧ)ファミリーｏｆｓ(例えば、ｄ(ＴＴＣＧ))を含む(Nakano et al. Biochemistry, 41 (48), 14281 -14292, 2002; Shinji et al. Nippon Kagakkai Koen Yokoshu vol.78th; no.2; page.731 (2000))。 In some embodiments, the dsRNA agent of the invention comprises a tetraloop. In the context of dsRNA, "tetraloop" as used herein refers to a loop (single-stranded region) of four nucleotides that forms a stable secondary structure that contributes to the stability of adjacent Watson-Crick hybridizing nucleotides. Without being bound by theory, the tetraloop may stabilize adjacent Watson-Crick base pairs through stacking interactions. In addition, interactions between the four nucleotides in the tetraloop include, but are not limited to, non-Watson-Crick base pairing, stacking interactions, hydrogen bonds, and contact interactions (Cheong et al., Nature 1990 Aug 16;346(6285):680-2; Heus and Pardi, Science 1991 Jul 12;253(5016): 191-4). The tetraloop contributes to an increase in the melting temperature (Tm) of adjacent duplexes above that predicted from a simple model loop sequence of four random bases. For example, a tetraloop may confer a melting temperature of at least 55° C._in 10 mM NaHPO4 on a hairpin comprising a duplex at least 2 base pairs in length. The tetraloop may comprise ribonucleotides, deoxyribonucleotides, modified nucleotides, and combinations thereof. Examples of RNA tetraloops include the UNCG family of tetraloops (e.g., UUCG), the GNRA family of tetraloops (e.g., GAAA), and the CUUG tetraloop. (Woese et al., Proc Natl Acad Sci US A. 1990 Nov;87(21):8467-71 ; Antao et al., Nucleic Acids Res. 1991 Nov ll;19(21):5901-5). Examples of DNA tetraloops include the d(GNNA) family of tetraloops (e.g., d(GTTA)), the d(GNRA) family of tetraloops, the d(GNAB) family of tetraloops, the d(CNNG) family of tetraloops, and the d(TNCG) family of tetraloops (e.g., d(TTCG)) (Nakano et al. Biochemistry, 41 (48), 14281 -14292, 2002; Shinji et al. Nippon Kagakkai Koen Yokoshu vol.78th; no.2; page.731 (2000)).

本発明のある実施態様において、例えば、内容を引用により全体として本明細書に包含させる米国特許公開２０１１／０２８８１４７に記載のような、テトラループおよび修飾ヌクレオチド含有ｄｓＮＡが意図される。あるこのような実施態様において、本発明のｄｓＮＡは、第一鎖および第二鎖を有し、ここで、該第一鎖および第二鎖は、１９～２５ヌクレオチド長の二本鎖領域を形成し、第一鎖は、第一鎖－第二鎖二本鎖領域を超えて伸びる３’領域を含み、テトラループを含み、ｄｓＮＡは、第一鎖の３’末端と第二鎖の５’末端の間に中断を含む。In certain embodiments of the invention, tetraloop and modified nucleotide-containing dsNAs are contemplated, for example, as described in U.S. Patent Publication 2011/0288147, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety. In certain such embodiments, the dsNAs of the invention have a first strand and a second strand, where the first strand and the second strand form a double-stranded region 19-25 nucleotides in length, the first strand includes a 3' region that extends beyond the first strand-second strand double-stranded region and includes a tetraloop, and the dsNA includes an interruption between the 3' end of the first strand and the 5' end of the second strand.

所望により、中断は、テトラループ含有二本鎖核酸(ｄｓＮＡ)の突出ダイサー切断部位に位置する。任意の他の本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドにおけるとおり、本発明のテトラループ含有二本鎖は、例えば、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、逆位塩基、ＧａｌＮＡｃ部分などを含む、ここに開示するまたは当分野で他に知られるあらゆる範囲の修飾を含んでよい。一般に、テトラループ含有ｄｓＮＡの両鎖の全ヌクレオチドは、テトラループ含有ｄｓＮＡが、脂質ナノ粒子または送達過程中ｄｓＮＡを分解から保護するある他の送達方法を使用して送達されるつもりならば、化学修飾される。しかしながら、ある実施態様において、１以上のヌクレオチドは修飾されない。Optionally, the break is located at the overhanging Dicer cleavage site of the tetraloop-containing double-stranded nucleic acid (dsNA). As in any other double-stranded oligonucleotide of the invention, the tetraloop-containing duplex of the invention may contain any of the range of modifications disclosed herein or otherwise known in the art, including, for example, 2'-O-methyl, 2'-fluoro, inverted bases, GalNAc moieties, and the like. Generally, all nucleotides of both strands of the tetraloop-containing dsNA are chemically modified if the tetraloop-containing dsNA is to be delivered using lipid nanoparticles or some other delivery method that protects the dsNA from degradation during the delivery process. However, in certain embodiments, one or more nucleotides are not modified.

ｄｓＲＮＡの実質的に相補性の２鎖が別々のＲＮＡ分子に含まれるとき、これらの分子は、必要はないが、共有結合により接続され得る。２鎖が、二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と各他方の鎖の５’末端の間の中断されていないヌクレオチドの鎖以外の手段で共有結合により接続されるならば、連結構造は「リンカー」と称する。これらＲＮＡ鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最短鎖のヌクレオチドから、二本鎖に存在するあらゆるオーバーハングを減じたものである。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは１以上のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。When the two substantially complementary strands of dsRNA are contained in separate RNA molecules, the molecules may, but need not, be covalently linked. If the two strands are covalently linked by means other than an uninterrupted chain of nucleotides between the 3' end of one strand and the 5' end of each other strand forming a double-stranded structure, the linking structure is referred to as a "linker." The RNA strands may have the same or different numbers of nucleotides. The maximum number of base pairs is the nucleotides of the shortest strand of the dsRNA minus any overhangs present in the duplex. In addition to the double-stranded structure, the RNAi may include one or more nucleotide overhangs.

ここに記載するｄｓＲＮＡは、さらに１以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハング、例えば、１、２、３または４ヌクレオチドを含む。少なくとも一つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、平滑末端対応物に対して、予想外に優れた阻害性質を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含む、ヌクレオチド／ヌクレオシドアナログを含むまたはこれからなることができる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖またはこれらの任意の組み合わせにあり得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖の５’末端、３’末端または両端にあり得る。ある実施態様において、長い、伸長したオーバーハングが可能である。The dsRNA described herein further comprises one or more single-stranded nucleotide overhangs, e.g., 1, 2, 3, or 4 nucleotides. dsRNAs with at least one nucleotide overhang may have unexpectedly superior inhibitory properties relative to their blunt-ended counterparts. The nucleotide overhangs may comprise or consist of nucleotide/nucleoside analogs, including deoxynucleotides/nucleosides. The overhangs may be on the sense strand, the antisense strand, or any combination thereof. Additionally, the overhanging nucleotides may be at the 5' end, the 3' end, or both ends of the antisense or sense strand of the dsRNA. In some embodiments, long, extended overhangs are possible.

ｄｓＲＮＡは、当分野で知られる標準方法により合成され得る。本発明のｉＲＮＡ化合物は、２段階手順を使用して製造し得る。まず、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖を別々に製造する。次いで、成分鎖をアニールする。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖を、液相または固相有機合成または両者を使用して製造し得る。ある実施態様において、ｉＲＮＡ化合物は、細胞に送達された発現ベクターから産生される。dsRNA can be synthesized by standard methods known in the art. The iRNA compounds of the present invention can be produced using a two-step procedure. First, the individual strands of the double-stranded RNA molecule are produced separately. The component strands are then annealed. The individual strands of the siRNA compound can be produced using liquid phase or solid phase organic synthesis or both. In some embodiments, the iRNA compound is produced from an expression vector delivered to a cell.

ある態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチド配列、センス配列および抗センス配列を含む。センス鎖は、付属表Ａの表のいずれかに提供される配列の群から選択され、センス鎖の対応するアンチセンス鎖は、付属表Ａの表のいずれかに提供される配列の群から選択される。In some embodiments, the dsRNA of the present invention comprises at least two nucleotide sequences, a sense sequence and an antisense sequence. The sense strand is selected from the group of sequences provided in any of the tables in Appendix A, and the corresponding antisense strand of the sense strand is selected from the group of sequences provided in any of the tables in Appendix A.

ある実施態様において、センス鎖は、付属表Ａの表のいずれかに提供される配列の群から選択され、センス鎖の対応するアンチセンス鎖は、付属表Ａの表のいずれかに提供される配列の群から選択される。この態様において、２配列の一方は、２配列の他方と相補性であり、配列の一方は、ＨＢＶ遺伝子の発現により産生されるｍＲＮＡの配列と実質的に相補性である。従って、この態様において、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、１つのオリゴヌクレオチドは、付属表Ａの表のいずれかにセンス鎖として記載され、第二オリゴヌクレオチドは、付属表Ａの表のいずれかにセンス鎖の対応するアンチセンス鎖として記載される。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補性の配列は、別々のオリゴヌクレオチドに含まれる。他の実施態様において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補性の配列は、単一オリゴヌクレオチドに含まれる。In one embodiment, the sense strand is selected from the group of sequences provided in any of the tables in Appendix A, and the corresponding antisense strand of the sense strand is selected from the group of sequences provided in any of the tables in Appendix A. In this embodiment, one of the two sequences is complementary to the other of the two sequences, and one of the sequences is substantially complementary to a sequence of an mRNA produced by expression of an HBV gene. Thus, in this embodiment, the dsRNA comprises two oligonucleotides, where one oligonucleotide is described as the sense strand in any of the tables in Appendix A, and a second oligonucleotide is described as the corresponding antisense strand of the sense strand in any of the tables in Appendix A. In one embodiment, the substantially complementary sequences of the dsRNA are contained in separate oligonucleotides. In other embodiments, the substantially complementary sequences of the dsRNA are contained in a single oligonucleotide.

付属表Ａの表の配列のいくつかは、修飾またはコンジュゲート配列として記載されるが、本発明のｉＲＮＡ、例えば、本発明のｄｓＲＮＡのＲＮＡは、非修飾、非コンジュゲートまたはそこに記載されているのと異なって修飾またはコンジュゲートされている、付属表Ａの表に示す配列のいずれかを含み得る。さらなる標的部位は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０７７３２１、ＷＯ２０１２／０２４１７０、ＷＯ２０１７／０２７３５０およびＷＯ２０１３／００３５２０；およびMichler, 2016に提供され、これらの各々の内容を全体として引用により本明細書に包含させる。Although some of the sequences in the tables of Appendix A are described as modified or conjugated sequences, the iRNAs of the invention, e.g., the dsRNAs of the invention, can include any of the sequences shown in the tables of Appendix A, unmodified, unconjugated, or modified or conjugated differently than described therein. Additional target sites are provided, for example, in PCT Publications WO2016/077321, WO2012/024170, WO2017/027350, and WO2013/003520; and Michler, 2016, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

約２０～２３塩基対、例えば、２１塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉誘発に特に効果的であるとして支持されていることは、当業者は十分に知っている(Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888)。しかしながら、他者は、短いまたは長いＲＮＡ二本鎖構造も効果的であることを発見している(Chu and Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226)。上記実施態様において、付属表Ａの表のいずれかに提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質により、ここに記載するｄｓＲＮＡは、最小２１ヌクレオチド長の少なくとも一つの鎖を含む。付属表Ａの表のいずれかの配列の一つから一端または両端の数ヌクレオチドのみを減じた短い二本鎖が、上記ｄｓＲＮＡと同様に効果的であり得ることは、合理的に予測される。従って、付属表Ａの表のいずれかの配列の一つに由来し、ＨＢＶ遺伝子の発現を阻害する能力が、完全配列を含むｄｓＲＮＡと５％、１０％、１５％、２０％、２５％または３０％阻害まで異ならない少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の連続ヌクレオチドを有するｄｓＲＮＡ。Those skilled in the art are well aware that dsRNAs having a duplex structure of about 20-23 base pairs, e.g., 21 base pairs, have been advocated as being particularly effective in inducing RNA interference (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). However, others have found that shorter or longer RNA duplex structures are also effective (Chu and Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226). In the above embodiment, by the nature of the oligonucleotide sequences provided in any of the tables in Appendix A, the dsRNAs described herein include at least one strand with a minimum length of 21 nucleotides. It is reasonably expected that a shorter duplex of any of the sequences in any of the tables in Appendix A minus only a few nucleotides at one or both ends may be as effective as the dsRNAs described above. Thus, a dsRNA having at least 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more contiguous nucleotides derived from any one of the sequences in the tables of Appendix A and having an ability to inhibit expression of an HBV gene that does not differ from a dsRNA containing the complete sequence by 5%, 10%, 15%, 20%, 25% or 30% inhibition.

ここに記載するｉＲＮＡは、例えば、ＨＢＶ遺伝子型の配列多様性のため、標的配列または１以上のＨＢＶ標的配列に対する１以上のミスマッチを含み得る。ある実施態様において、ここに記載するｉＲＮＡは、３以下のミスマッチを含む。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含むならば、ミスマッチ領域が相補性領域の中心に存在しないことが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含むならば、ミスマッチが相補性領域の５’または３’末端から最後の５ヌクレオチド以内に制限されるのが好ましい。例えば、２３ヌクレオチドｉＲＮＡ剤について、ＨＢＶ遺伝子の領域に相補性である鎖は、一般に中心１３ヌクレオチド内に何らミスマッチを含まない。ここに記載する方法または当分野で知られる方法を、標的配列に対するミスマッチを含むｉＲＮＡが、ＨＢＶ遺伝子の発現阻害に効果的であるか否かの決定に使用できる。ＨＢＶ遺伝子の発現阻害におけるミスマッチを有するｉＲＮＡの有効性の考察は、特にＨＢＶ遺伝子における特定の相補性領域が、種々の遺伝子型で多型配列変種を有することが知られているとき、重要である。The iRNAs described herein may contain one or more mismatches to a target sequence or one or more HBV target sequences, for example, due to sequence variability of HBV genotypes. In some embodiments, the iRNAs described herein contain no more than three mismatches. If the antisense strand of the iRNA contains a mismatch to a target sequence, it is preferred that the mismatch region is not in the center of the region of complementarity. If the antisense strand of the iRNA contains a mismatch to a target sequence, it is preferred that the mismatch is limited to within the last 5 nucleotides from the 5' or 3' end of the region of complementarity. For example, for a 23 nucleotide iRNA agent, the strand that is complementary to a region of the HBV gene generally does not contain any mismatches within the central 13 nucleotides. Methods described herein or known in the art can be used to determine whether an iRNA containing mismatches to a target sequence is effective in inhibiting expression of an HBV gene. Consideration of the effectiveness of an iRNA with mismatches in inhibiting expression of an HBV gene is important, especially when certain regions of complementarity in the HBV gene are known to have polymorphic sequence variants in various genotypes.

ｉ. 本発明の方法で使用するための修飾ｉＲＮＡ
ある実施態様において、本発明で使用するｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは非修飾であり、例えば、発現ベクターから産生されたとき、例えば、当分野で知られ、ここに記載する化学修飾またはコンジュゲーションを含まない。他の実施態様において、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、安定性または他の有益な特徴を増強するために、化学修飾される。本発明のある実施態様において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全ては修飾される。本発明の他の実施態様において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの全ては修飾される。「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾される」本発明のｉＲＮＡは、大部分、しかし完全にではなく、修飾され、５、４、３、２または１を超えない非修飾ヌクレオチドを含み得る。i. Modified iRNAs for use in the methods of the invention
In some embodiments, the RNA of the iRNA used in the present invention, e.g., dsRNA, is unmodified, e.g., when produced from an expression vector, and does not contain any chemical modifications or conjugations known in the art and described herein. In other embodiments, the RNA of the iRNA of the present invention, e.g., dsRNA, is chemically modified to enhance stability or other beneficial characteristics. In some embodiments of the present invention, substantially all of the nucleotides of the iRNA of the present invention are modified. In other embodiments of the present invention, all of the nucleotides of the iRNA of the present invention are modified. An iRNA of the present invention in which "substantially all of the nucleotides are modified" may be largely, but not completely, modified and contain no more than 5, 4, 3, 2, or 1 unmodified nucleotides.

本発明で注目する核酸は、引用により本明細書に包含させる、“Current protocols in nucleic acid chemistry,” Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載のもののような、当分野で十分確立されている方法により合成または修飾され得る。修飾は、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾(リン酸化、コンジュゲーション、逆位結合)または３’末端修飾(コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆位結合など)；塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基または拡大されたレパートリーのパートナーと塩基対形成する塩基での置換、塩基の除去(脱塩基ヌクレオチド)またはコンジュゲート塩基；糖修飾(例えば、２’位または４’位)または糖の置換；またはホスホジエステル結合の修飾または置換を含む主鎖修飾を含む。ここに記載する実施態様で有用なｉＲＮＡ化合物の具体例は、修飾主鎖を含むまたは天然ヌクレオシド間結合を含まないＲＮＡを含むが、これらに限定されない。修飾主鎖を有するＲＮＡは、とりわけ、主鎖にリン原子を有しないものを含む。本明細書の目的でおよび当分野で時に言及されるとおり、ヌクレオシド間主鎖にリン原子を有しない修飾ＲＮＡも、オリゴヌクレオシドとして見なされ得る。ある実施態様において、修飾ｉＲＮＡは、ヌクレオシド間主鎖にリン原子を有する。Nucleic acids of interest in the present invention can be synthesized or modified by methods well established in the art, such as those described in "Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA, which is incorporated herein by reference. Modifications include, for example, end modifications, such as 5' end modifications (phosphorylation, conjugation, inverted linkage) or 3' end modifications (conjugation, DNA nucleotides, inverted linkage, etc.); base modifications, such as stabilizing bases, destabilizing bases, or substitutions with bases that base pair with partners of an expanded repertoire, removal of bases (abasic nucleotides) or conjugated bases; sugar modifications (e.g., at the 2' or 4' positions) or sugar substitutions; or backbone modifications, including modifications or substitutions of phosphodiester linkages. Specific examples of iRNA compounds useful in the embodiments described herein include, but are not limited to, RNAs that contain modified backbones or do not contain natural internucleoside linkages. RNAs with modified backbones include, among others, those that do not have a phosphorus atom in the backbone. For purposes of this specification and as sometimes referred to in the art, modified RNAs that do not have a phosphorus atom in the internucleoside backbone can also be considered oligonucleosides. In certain embodiments, the modified iRNA has a phosphorus atom in the internucleoside backbone.

修飾ＲＮＡ主鎖は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミド酸およびアミノアルキルホスホロアミド酸を含むホスホロアミド酸、チオノホスホロアミド酸、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルおよび正常３’－５’結合を有するボラノホスフェート、その２’－５’結合アナログおよびヌクレオシド単位の隣接対が３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’に結合している逆位極性を有するものを含む。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も包含される。Modified RNA backbones include, for example, phosphorothioates, chiral phosphorothioates, phosphorodithioates, phosphotriesters, aminoalkyl phosphotriesters, methyl and other alkyl phosphonates including 3'-alkylene phosphonates and chiral phosphonates, phosphinates, phosphoramidates including 3'-amino phosphoramidates and aminoalkyl phosphoramidates, thionophosphoramidates, thionoalkyl phosphonates, thionoalkyl phosphotriesters and boranophosphates with normal 3'-5' linkages, their 2'-5' linked analogs and those with inverted polarity where adjacent pairs of nucleoside units are linked 3'-5' to 5'-3' or 2'-5' to 5'-2'. Various salts, mixed salts and free acid forms are also included.

上記リン含有結合の製造を教示する代表的米国特許は、米国特許３,６８７,８０８；４,４６９,８６３；４,４７６,３０１；５,０２３,２４３；５,１７７,１９５；５,１８８,８９７；５,２６４,４２３；５,２７６,０１９；５,２７８,３０２；５,２８６,７１７；５,３２１,１３１；５,３９９,６７６；５,４０５,９３９；５,４５３,４９６；５,４５５,２３３；５,４６６,６７７；５,４７６,９２５；５,５１９,１２６；５,５３６,８２１；５,５４１,３１６；５,５５０,１１１；５,５６３,２５３；５,５７１,７９９；５,５８７,３６１；５,６２５,０５０；６,０２８,１８８；６,１２４,４４５；６,１６０,１０９；６,１６９,１７０；６,１７２,２０９；６、２３９,２６５；６,２７７,６０３；６,３２６,１９９；６,３４６,６１４；６,４４４,４２３；６,５３１,５９０；６,５３４,６３９；６,６０８,０３５；６,６８３,１６７；６,８５８,７１５；６,８６７,２９４；６,８７８,８０５；７,０１５,３１５；７,０４１,８１６；７,２７３,９３３；７,３２１,０２９；および米国特許ＲＥ３９４６４を含むが、これらに限定されず、これら各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。Representative U.S. patents which teach the preparation of the above phosphorus-containing bonds are U.S. Pat. Nos. 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,13 1; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625 ,050;6,028,188;6,124,445;6,160,109;6,169,170;6,172,209;6,239,265;6,277,603;6,326,199;6,346,614;6,444,423;6,531,590;6,534,639;6,608,035;6, Nos. 6,831,167; 6,858,715; 6,867,294; 6,878,805; 7,015,315; 7,041,816; 7,273,933; 7,321,029; and U.S. Patent RE39464, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

リン原子を中に含まない修飾ＲＮＡ主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合または１以上の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環ヌクレオシド間結合により形成される、主鎖を含む。これらは、モルホリノ結合(一部ヌクレオシドの糖部分から形成)；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ_２成分部分を含むその他を含む。 Modified RNA backbones that do not contain a phosphorus atom include backbones formed by short alkyl or cycloalkyl internucleoside linkages, mixed heteroatom and alkyl or cycloalkyl internucleoside linkages or one or more short heteroatom or heterocyclic internucleoside linkages. These include morpholino linkages (formed in part from the sugar portion of the nucleoside), siloxane backbones, sulfide, sulfoxide and sulfone backbones, formacetyl and thioformacetyl backbones, methyleneformacetyl and thioformacetyl backbones, alkene-containing backbones, sulfamate backbones, methyleneimino and methylenehydrazino backbones, sulfonate and sulfonamide backbones, amide backbones, and others containing mixed N, O, S and CH_two- component moieties.

上記オリゴヌクレオシドの製造を教示する代表的米国特許は、米国特許５,０３４,５０６；５,１６６,３１５；５,１８５,４４４；５,２１４,１３４；５,２１６,１４１；５,２３５,０３３；５,６４,５６２；５,２６４,５６４；５,４０５,９３８；５,４３４,２５７；５,４６６,６７７；５,４７０,９６７；５,４８９,６７７；５,５４１,３０７；５,５６１,２２５；５,５９６,０８６；５,６０２,２４０；５,６０８,０４６；５,６１０,２８９；５,６１８,７０４；５,６２３,０７０；５,６６３,３１２；５,６３３,３６０；５,６７７,４３７；および５,６７７,４３９を含むが、これらに限定されず、これら各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。Representative U.S. patents which teach the preparation of the above oligonucleosides are U.S. Pat. Nos. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,5 41,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; and 5,677,439, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

他の実施態様において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合両者、すなわち、主鎖が新しい基で置換される、適当なＲＮＡ模倣体がｉＲＮＡでの使用のために意図される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション性質を有することが示されているＲＮＡ模倣体である、一つのこのようなオリゴマー化合物は、ペプチド核酸(ＰＮＡ)と称される。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖主鎖は、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換される。核酸塩基は維持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の製造を教示する代表的米国特許は、米国特許５,５３９,０８２；５,７１４,３３１；および５,７１９,２６２を含むが、これらに限定されず、これら各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。本発明のｉＲＮＡにおける使用に適するさらなるＰＮＡ化合物は、例えば、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500に記載される。In another embodiment, suitable RNA mimics are contemplated for use in iRNA in which both the sugar and the internucleoside linkages, i.e., the backbone, of the nucleotide units are replaced with new groups. The base units are maintained for hybridization with an appropriate nucleic acid target compound. One such oligomeric compound, an RNA mimic that has been shown to have excellent hybridization properties, is called a peptide nucleic acid (PNA). In PNA compounds, the sugar backbone of RNA is replaced with an amide-containing backbone, particularly an aminoethylglycine backbone. The nucleobases are maintained and are linked directly or indirectly to the aza nitrogen atoms of the amide portion of the backbone. Representative U.S. patents that teach the preparation of PNA compounds include, but are not limited to, U.S. Patents 5,539,082; 5,714,331; and 5,719,262, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety. Further PNA compounds suitable for use in the iRNA of the present invention are described, for example, in Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.

本発明で注目されるある実施態様は、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオシド、特に上記米国特許５,４８９,６７７のヘテロ原子主鎖－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｎ(ＣＨ_３)－Ｏ－ＣＨ_２－[メチレン(メチルイミノ)またはＭＭＩ主鎖として知られる]、－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ(ＣＨ_３)－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｎ(ＣＨ_３)－Ｎ(ＣＨ_３)－ＣＨ_２－および－Ｎ(ＣＨ_３)－ＣＨ_２－ＣＨ_２－[ここで、天然ホスホジエステル主鎖は－Ｏ－Ｐ－Ｏ－ＣＨ_２－として表される]および上記米国特許５,６０２,２４０のアミド主鎖を有するＲＮＡを含む。ある実施態様において、ここで注目するＲＮＡは、上記米国特許５,０３４,５０６のモルホリノ主鎖構造を有する。 Certain embodiments of interest in the present invention include oligonucleosides having phosphorothioate backbones, particularly the heteroatom backbones -CH2_-NH -_CH2- , -CH2_- N(CH3)-O-_CH2- [known as methylene(methylimino) or MMI backbones], -CH2-O-N(_CH3 )-CH2-,_-CH2 -_N (CH3)-N(CH3)-CH2- and -N(_CH3 )_-CH2-CH2-_[ wherein the natural phosphodiester backbone is represented as -O-P-O-_CH2- ]_of U.S. Pat_. No. 5,489,677, and RNAs having the amide backbones of U.S. Pat. No._5,602,240 , in which_the natural phosphodiester backbone is represented as -O-P-O-_CH2- . In certain embodiments, RNAs of interest herein have morpholino backbone structures of U.S. Pat. No. 5,034,506.

修飾ＲＮＡはまた１以上の置換糖部分を含み得る。ここで注目するｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位に次の一つを含み得る：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキル(ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２～Ｃ_１０アルケニルおよびアルキニルであり得る)。例示的な適当な修飾は、Ｏ[(ＣＨ_２)_ｎＯ]_ｍＣＨ_３、Ｏ(ＣＨ_２)._ｎＯＣＨ_３、Ｏ(ＣＨ_２)_ｎＮＨ_２、Ｏ(ＣＨ_２)_ｎＣＨ_３、Ｏ(ＣＨ_２)_ｎＯＮＨ_２およびＯ(ＣＨ_２)_ｎＯＮ[(ＣＨ_２)_ｎＣＨ_３)]_２を含み、ここで、ｎおよびｍは１～約１０である。他の実施態様において、ｄｓＲＮＡは、２’位に次の一つを含む：Ｃ_１～Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、ｉＲＮＡの薬物動態性質を改善する基またはｉＲＮＡの薬力学性質を改善する基および類似の性質を有する他の置換基。ある実施態様において、修飾は、２’メトキシエトキシ(２’－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、２’－Ｏ－(２－メトキシエチル)または２’－ＭＯＥとしても知られる)(Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504)、すなわち、アルコキシ－アルコキシ基を含む。他の例示的修飾は、下記例に記載する２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’－ＤＭＡＯＥとしても既知の、Ｏ(ＣＨ_２)_２ＯＮ(ＣＨ_３)_２基および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ(当分野で２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られる)、すなわち、２’－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－Ｎ(ＣＨ_２)_２を含む。 Modified RNAs can also contain one or more substituted sugar moieties. An iRNA, e.g., a dsRNA, featured herein can contain one of the following at the 2' position: OH; F; O-, S-, or N-alkyl; O-, S-, or N-alkenyl; O-, S-, or N-alkynyl; or O-alkyl-O-alkyl, where alkyl, alkenyl, and alkynyl can be substituted or unsubstituted_C1 -_C10 alkyl or_C2 -_C10 alkenyl and alkynyl. Exemplary suitable modifications include O[(CH₂ )_n O]_m CH₃ , O(CH₂ )._n OCH₃ , O(CH₂ )_n NH₂ , O(CH₂ )_n CH₃ , O(CH₂ )_n ONH₂ and O(CH₂ )_n ON[(CH₂ )_n CH₃ )]₂ , where n and m are from 1 to about 10. In other embodiments, the dsRNA comprises one of the following at the 2' position:_C1 -_C10 lower alkyl, substituted lower alkyl, alkaryl, aralkyl, O-alkaryl or O-aralkyl, SH,_SCH3 , OCN, Cl, Br, CN,_CF3 ,_OCF3 ,_SOCH3 ,_SO2CH3 ,_ONO2 ,_NO2 ,_N3 ,_NH2 , heterocycloalkyl, heterocycloalkaryl, aminoalkylamino, polyalkylamino, substituted silyl, an RNA cleaving group, a reporter group, an intercalator, a group that improves the pharmacokinetic properties of an iRNA or_a group that improves the pharmacodynamic properties of an iRNA, and other substituents with similar properties. In certain embodiments, the modification includes 2'methoxyethoxy (2'-O-_CH2CH2OCH3 , also known_as 2'-O-(2-methoxyethyl) or 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim_. Acta, 1995, 78:486-504), i.e., an alkoxy-alkoxy group. Other exemplary modifications include the 2'-dimethylaminooxyethoxy, also known as 2'-DMAOE, i.e., O(_CH2 )_{2ON(CH3)2 group, and 2'-dimethylaminoethoxyethoxy (also known in the art as 2'-O-dimethylaminoethoxyethyl or 2'-DMAEOE), i.e., 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2}_,_as_described_in_the_examples below.

他の修飾は、２’－メトキシ(２’－ＯＣＨ_３)、２’－アミノプロポキシ(２’－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２)および２’－フルオロ(２’－Ｆ)を含む。類似の修飾を、ｉＲＮＡのＲＮＡの他の位置、特に３’末端ヌクレオチドまたは２’－５’結合ｄｓＲＮＡの糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位にも行い得る。ｉＲＮＡは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有し得る。このような修飾糖構造の製造を教示する代表的米国特許は、米国特許４,９８１,９５７；５,１１８,８００；５,３１９,０８０；５,３５９,０４４；５,３９３,８７８；５,４４６,１３７；５,４６６,７８６；５,５１４,７８５；５,５１９,１３４；５,５６７,８１１；５,５７６,４２７；５,５９１,７２２；５,５９７,９０９；５,６１０,３００；５,６２７,０５３；５,６３９,８７３；５,６４６,２６５；５,６５８,８７３；５,６７０,６３３；および５,７００,９２０を含むが、これらに限定されず、これらの一部は、本願と所有者が共通し、前記の各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。 Other modifications include 2'-methoxy (2'-OCH₃ ), 2'-aminopropoxy (2'-OCH₂ CH₂ CH₂ NH₂ ), and 2'-fluoro (2'-F). Similar modifications can also be made at other positions on the RNA of an iRNA, particularly the 3' position of the sugar of the 3' terminal nucleotide or 2'-5' linked dsRNA and the 5' position of 5' terminal nucleotide. iRNAs can also have sugar mimetics such as cyclobutyl moieties in place of the pentofuranosyl sugar. Representative U.S. patents which teach the preparation of such modified sugar structures include, but are not limited to, U.S. Pat. Nos. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,72 Nos. 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; and 5,700,920, portions of which are commonly owned with this application, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、核酸塩基(しばしば当分野では単に「塩基」と称される)修飾または置換を含む。ここで使用する「非修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン(Ａ)およびグアニン(Ｇ)およびピリミジン塩基チミン(Ｔ)、シトシン(Ｃ)およびウラシル(Ｕ)を含む。修飾核酸塩基は、他の合成および天然核酸塩基、例えばデオキシ－チミン(ｄＴ)、５－メチルシトシン(５－ｍｅ－Ｃ)、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチルおよびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２－プロピルおよびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル(シュードウラシル)、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニンおよび３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンを含む。さらに核酸塩基は、米国特許３,６８７,８０８に記載のもの、Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008に記載のもの；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990に記載のもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に記載のものおよびSanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993に記載のものを含む。これらの核酸塩基の一部は、本発明で注目されるオリゴマー化合物の結合親和性に特に有用である。これらは、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンおよびＮ－２、Ｎ－６および２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンを含む０－６置換プリンを含む。５－メチルシトシン置換は、核酸二本鎖安定性を０.６～１.２℃だけ上昇させることが示されており(Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)、特に２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わさったとき、例示的塩基置換である。The RNA of the iRNA also includes nucleobase (often referred to in the art simply as "base") modifications or substitutions. As used herein, "unmodified" or "natural" nucleobases include the purine bases adenine (A) and guanine (G) and the pyrimidine bases thymine (T), cytosine (C) and uracil (U). Modified nucleobases include other synthetic and natural nucleobases, such as deoxy-thymine (dT), 5-methylcytosine (5-me-C), 5-hydroxymethylcytosine, xanthine, hypoxanthine, 2-aminoadenine, 6-methyl and other alkyl derivatives of adenine and guanine, 2-propyl and other alkyl derivatives of adenine and guanine, 2-thiouracil, 2-thiothymine and 2-thiocytosine, 5-halouracil and cytosine, 5-propynyluracil and cytosine, 6-azouracil, These include cytosine and thymine, 5-uracil (pseudouracil), 4-thiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-thiol, 8-thioalkyl, 8-hydroxyl and other 8-substituted adenines and guanines, 5-halo, especially 5-bromo, 5-trifluoromethyl and other 5-substituted uracils and cytosines, 7-methylguanine and adenine, 8-azaguanine and adenine, 7-deazaguanine and adenine, and 3-deazaguanine and adenine. Further nucleobases include those described in U.S. Patent 3,687,808, those described in Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008, those described in The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, those described in Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, and those described in Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Some of these nucleobases are particularly useful for the binding affinity of the oligomeric compounds of interest in the present invention. These include 5-substituted pyrimidines, 6-azapyrimidines and 0-6 substituted purines including N-2, N-6 and 2-aminopropyladenine, 5-propynyluracil and 5-propynylcytosine. 5-Methylcytosine substitutions have been shown to increase nucleic acid duplex stability by 0.6-1.2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) and are an exemplary base substitution, especially when combined with 2'-O-methoxyethyl sugar modifications.

上記修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基の一部の製造を教示する代表的米国特許は、上記米国特許３,６８７,８０８、４,８４５,２０５；５,１３０,３０；５,１３４,０６６；５,１７５,２７３；５,３６７,０６６；５,４３２,２７２；５,４５７,１８７；５,４５９,２５５；５,４８４,９０８；５,５０２,１７７；５,５２５,７１１；５,５５２,５４０；５,５８７,４６９；５,５９４,１２１、５,５９６,０９１；５,６１４,６１７；５,６８１,９４１；５,７５０,６９２；６,０１５,８８６；６,１４７,２００；６,１６６,１９７；６,２２２,０２５；６,２３５,８８７；６,３８０,３６８；６,５２８,６４０；６,６３９,０６２；６,６１７,４３８；７,０４５,６１０；７,４２７,６７２；および７,４９５,０８８を含むが、これらに限定されず、これら各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。Representative U.S. patents which teach the preparation of some of the above-mentioned modified nucleobases as well as other modified nucleobases are U.S. Pat. Nos. 3,687,808; 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596, 091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; and 7,495,088, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

ｉＲＮＡのＲＮＡは、１以上のロックド核酸(ＬＮＡ)を含むように修飾されてもよい。ロックド核酸は、リボース部分が２’炭素と４’炭素を連結する余分の橋を含む修飾リボース部分を有する、ヌクレオチドである。この構造は、効果的に３’エンド配座構造のリボースを「ロック」する。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の付加は、血清におけるｓｉＲＮＡ安定性を増強し、オフターゲット効果を低減することが示されている(Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。The RNA of the iRNA may be modified to contain one or more locked nucleic acids (LNAs). Locked nucleic acids are nucleotides with a modified ribose moiety that includes an extra bridge connecting the 2' and 4' carbons. This structure effectively "locks" the ribose in the 3'-endo conformation. The addition of locked nucleic acids to siRNAs has been shown to enhance siRNA stability in serum and reduce off-target effects (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).

ある実施態様において、本発明のｉＲＮＡは、ＵＮＡ(アンロックド核酸)ヌクレオチドである１以上の単量体を含む。ＵＮＡは、糖の結合のいずれかが除去されており、アンロックド「糖」残基を形成する、アンロックド非環式核酸である。一例において、ＵＮＡはまたＣ１’－Ｃ４’間の結合(すなわちＣ１’炭素とＣ４’炭素間の共有結合性炭素－酸素－炭素結合)が除去されている単量体も含む。他の例において、糖のＣ２’－Ｃ３’結合(すなわちＣ２’炭素とＣ３’炭素間の共有結合性炭素－炭素結合)が除去されている(引用により本明細書に包含させるNuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008)およびFluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039参照)。In some embodiments, the iRNA of the present invention includes one or more monomers that are UNA (unlocked nucleic acid) nucleotides. UNAs are unlocked acyclic nucleic acids in which one of the sugar linkages has been removed to form an unlocked "sugar" residue. In one example, UNAs also include monomers in which the C1'-C4' linkage (i.e., the covalent carbon-oxygen-carbon bond between the C1' and C4' carbons) has been removed. In another example, the C2'-C3' linkage (i.e., the covalent carbon-carbon bond between the C2' and C3' carbons) of the sugar has been removed (see Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) and Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039, both of which are incorporated herein by reference).

ｉＲＮＡのＲＮＡはまた１以上の二環式糖部分を含むようにも修飾され得る。「二環式糖」は、２原子の架橋による、フラノシル環修飾である。「二環式ヌクレオシド」(「ＢＮＡ」)は、糖環の２炭素原子を連結する橋を含み、それにより二環式環系を形成する、糖部分を有するヌクレオシドである。ある実施態様において、橋は、糖環の４’－炭素と２’－炭素を接続する。それ故に、ある実施態様において、本発明の薬剤は１以上のロックド核酸(ＬＮＡ)を含み得る。ロックド核酸は、リボース部分が２’炭素と４’炭素を連結する余分の橋を含む修飾リボース部分を有する、ヌクレオチドである。換言すると、ＬＮＡは、４’－ＣＨ_２－Ｏ－２’橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、効果的に３’エンド配座構造のリボースを「ロック」する。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の付加は、血清におけるｓｉＲＮＡ安定性を増強し、オフターゲット効果を低減することが示されている(Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。本発明のポリヌクレオチドで使用するための二環式ヌクレオシドの例は、４’および２’リボシル環原子の間に橋を含むヌクレオシドを含むが、これに限定されない。ある実施態様において、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤は、４’と２’の橋を含む、１以上の二環式ヌクレオシドを含む。このような４’と２’が架橋された二環式ヌクレオシドの例は、４’－(ＣＨ_２)－Ｏ－２’(ＬＮＡ)；４’－(ＣＨ_２)－Ｓ－２’；４’－(ＣＨ_２)_２－Ｏ－２’(ＥＮＡ)；４’－ＣＨ(ＣＨ_３)－Ｏ－２’(別名「拘束エチル」または「ｃＥｔ」)および４’－ＣＨ(ＣＨ_２ＯＣＨ_３)－Ｏ－２’(およびそのアナログ；、例えば、米国特許７,３９９,８４５参照)；４’－Ｃ(ＣＨ_３)(ＣＨ_３)－Ｏ－２’(およびそのアナログ；例えば、米国特許８,２７８,２８３参照)；４’－ＣＨ_２－Ｎ(ＯＣＨ_３)－２’(およびそのアナログ；例えば、米国特許８,２７８,４２５参照)；４’－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ(ＣＨ_３)－２’(例えば、ＵＳ２００４０１７１５７０参照)；４’－ＣＨ_２－Ｎ(Ｒ)－Ｏ－２’(ここで、ＲはＨ、Ｃ_１－Ｃ_１２アルキルまたは保護基である)(例えば、米国特許７,４２７,６７２参照)；４’－ＣＨ_２－Ｃ(Ｈ)(ＣＨ_３)－２’(例えば、Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134参照)；および４’－ＣＨ_２－Ｃ(＝ＣＨ_２)－２’(およびそのアナログ；、例えば、米国特許８,２７８,４２６参照)を含むが、これらに限定されない。前記の各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。 The RNA of the iRNA may also be modified to include one or more bicyclic sugar moieties. A "bicyclic sugar" is a furanosyl ring modification with a two-atom bridge. A "bicyclic nucleoside"("BNA") is a nucleoside having a sugar moiety that includes a bridge connecting two carbon atoms of the sugar ring, thereby forming a bicyclic ring system. In certain embodiments, the bridge connects the 4'-carbon and the 2'-carbon of the sugar ring. Thus, in certain embodiments, an agent of the invention may include one or more locked nucleic acids (LNAs). Locked nucleic acids are nucleotides that have a modified ribose moiety that includes an extra bridge connecting the 2' and 4' carbons of the ribose moiety. In other words, an LNA is a nucleotide that includes a bicyclic sugar moiety that includes a 4'-CH₂ -O-2' bridge. This structure effectively "locks" the ribose in a 3'-endo conformational structure. The addition of locked nucleic acids to siRNA has been shown to enhance siRNA stability in serum and reduce off-target effects (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193). Examples of bicyclic nucleosides for use in the polynucleotides of the invention include, but are not limited to, nucleosides that contain a bridge between the 4' and 2' ribosyl ring atoms. In certain embodiments, the antisense polynucleotide agents of the invention include one or more bicyclic nucleosides that contain a 4' and 2' bridge. Examples of such 4' and 2' bridged bicyclic nucleosides are 4'-(CH₂ )-O-2'(LNA);4'-(CH 2 )-S-2';4'-(CH₂ ) 2 -O-2'(ENA);_4' -CH(CH₃₎ -O-2' (also known as "constrained ethyl" or "cEt") and 4'-CH(CH₂ OCH₃ )-O-2' (and analogs thereof; see, e.g., U.S. Pat. No. 7,399,845); 4'-C(CH₃ )(CH₃ )-O-2' (and analogs thereof; see, e.g., U.S. Pat. No. 8,278,283); 4'-CH₂ -N(OCH 3 )-2' (and analogs thereof; see, e.g., U.S. Pat. No. 8,278,425); 4'-CH₂ -O-N(_CH₃ )-2' (see, e.g., US 20040171570); 4'-CH₂ -N(R)-O-2' (wherein R is H, C₁ -C₁₂ alkyl, or a protecting group) (see, e.g., US Pat. No. 7,427,672); 4'-CH₂ -C(H)(CH₃ )-2' (see, e.g., Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); and 4'-CH₂ -C(═CH₂ )-2' (and analogs thereof; see, e.g., US Pat. No. 8,278,426). The contents of each of the foregoing are incorporated herein by reference in their entirety.

ロックド核酸ヌクレオチドの製造を教示するさらなる代表的米国特許および米国特許公開は、次のものを含むが、これらに限定されない：米国特許６,２６８,４９０；６,５２５,１９１；６,６７０,４６１；６,７７０,７４８；６,７９４,４９９；６,９９８,４８４；７,０５３,２０７；７,０３４,１３３；７,０８４,１２５；７,３９９,８４５；７,４２７,６７２；７,５６９,６８６；７,７４１,４５７；８,０２２,１９３；８,０３０,４６７；８,２７８,４２５；８,２７８,４２６；８,２７８,２８３；ＵＳ２００８００３９６１８；およびＵＳ２００９００１２２８１、これら各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。Additional representative U.S. patents and U.S. patent publications that teach the preparation of locked nucleic acid nucleotides include, but are not limited to, U.S. Patents 6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,034,133; 7,084,123; No. 5,739,845; No. 7,427,672; No. 7,569,686; No. 7,741,457; No. 8,022,193; No. 8,030,467; No. 8,278,425; No. 8,278,426; No. 8,278,283; No. US20080039618; and No. US20090012281, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

例えばα－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースを含む、１以上の立体化学糖配置を有する前記二環式ヌクレオシドの何れも製造できる(ＷＯ９９／１４２２６参照)。Any of the above bicyclic nucleosides can be prepared having one or more stereochemical sugar configurations, including, for example, α-L-ribofuranose and β-D-ribofuranose (see WO 99/14226).

ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１以上の拘束エチルヌクレオチドを含むようにも修飾し得る。ここで使用する「拘束エチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は、４’－ＣＨ(ＣＨ_３)－Ｏ－２’橋を含む二環式糖部分を含む、ロックド核酸である。ある実施態様において、拘束エチルヌクレオチドは、ここで「Ｓ－ｃＥｔ」と称する、Ｓ立体構造である。 The RNA of an iRNA can also be modified to contain one or more constrained ethyl nucleotides. As used herein, a "constrained ethyl nucleotide" or "cEt" is a locked nucleic acid that contains a bicyclic sugar moiety that includes a 4'-CH(CH₃ )-O-2' bridge. In certain embodiments, the constrained ethyl nucleotide is in the S conformation, referred to herein as "S-cEt."

本発明のｉＲＮＡはまた以上の「配座固定ヌクレオチド」(「ＣＲＮ」)も含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’炭素とＣ４’炭素またはリボースのＣ３炭素とＣ５’炭素を連結するリンカーを有するヌクレオチドアナログである。ＣＲＮは、リボース環を安定な立体構造にロックし、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性を増加させる。リンカーは、少ないリボース環パッカリングとなるように、安定性および親和性のために最適位置に酸素を配置するのに十分な長さである。The iRNA of the present invention may also include the above "conformationally locked nucleotides" ("CRNs"). CRNs are nucleotide analogs with a linker connecting the C2' and C4' carbons of ribose or the C3 and C5' carbons of ribose. The CRNs lock the ribose ring into a stable conformation and increase hybridization affinity to mRNA. The linker is long enough to place oxygens in optimal positions for stability and affinity, resulting in less ribose ring puckering.

上記ＣＲＮの製造を教示する代表的刊行物は、ＵＳ２０１３０１９０３８３およびＷＯ２０１３０３６８６８を含むが、これらに限定されず、これら各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。Representative publications that teach the preparation of the above-mentioned CRN include, but are not limited to, US20130190383 and WO2013036868, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

ＲＮＡ分子の末端への安定化の可能性のある修飾は、Ｎ－(アセチルアミノカプロイル)－４－ヒドロキシプロリノール(Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ)、Ｎ－(カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール(Ｈｙｐ－Ｃ６)、Ｎ－(アセチル－４－ヒドロキシプロリノール(Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ)、チミジン－２’－０－デオキシチミジン(エーテル)、Ｎ－(アミノカプロイル)－４－ヒドロキシプロリノール(Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ)、２－ドコサノイル－ウリジン－３”－ホスフェート、逆位塩基ｄＴ(ｉｄＴ)およびその他を含み得る。この修飾の開示は、ＷＯ２０１１００５８６１にみることができる。Potential stabilizing modifications to the ends of RNA molecules may include N-(acetylaminocaproyl)-4-hydroxyprolinol (Hyp-C6-NHAc), N-(caproyl-4-hydroxyprolinol (Hyp-C6), N-(acetyl-4-hydroxyprolinol (Hyp-NHAc), thymidine-2'-0-deoxythymidine (ether), N-(aminocaproyl)-4-hydroxyprolinol (Hyp-C6-amino), 2-docosanoyl-uridine-3"-phosphate, inverted base dT (idT) and others. Disclosure of this modification can be found in WO2011005861.

本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの他の修飾は、５’ホスフェートまたは５’ホスフェート模倣体、例えば、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖における５’末端ホスフェートまたはホスフェート模倣体を含む。適当なホスフェート模倣体は、例えばＵＳ２０１２０１５７５１１に開示され、その内容を全体として引用により本明細書に包含させる。Other modifications of nucleotides of the iRNA of the invention include 5' phosphates or 5' phosphate mimetics, e.g., 5' terminal phosphates or phosphate mimetics in the antisense strand of an RNAi agent. Suitable phosphate mimetics are disclosed, for example, in US20120157511, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.

ある特定の実施態様において、本発明の方法において使用するＲＮＡｉ剤は、付属表Ａの表の何れかに列記された薬剤の群から選択される薬剤である。これらの薬剤はさらにリガンドを含み得る。In certain embodiments, the RNAi agent used in the methods of the invention is an agent selected from the group of agents listed in any of the tables in Appendix A. These agents may further include a ligand.

ii. リガンドにコンジュゲートしたｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの他の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強する１以上のリガンド、部分またはコンジュゲートのＲＮＡへの化学連結である。このような部分は、脂質部分、例えば、コレステロール部分(Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556)、コール酸(Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060)、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54)、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１,２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783)、ポリアミンまたはａポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-97３)またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237)またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)を含むが、これらに限定されない。ii. iRNA conjugated to a ligand
Another modification of the RNA of the iRNA of the invention is the chemical linking to the RNA of one or more ligands, moieties or conjugates that enhance the activity, cellular distribution or cellular uptake of the iRNA. Such moieties include lipid moieties, e.g., cholesterol moieties (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), cholic acid (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), thioethers, e.g., beryl-S-tritylthiol (Manoharan et al., Ann. NY Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), thiocholesterols (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 1:1053-1060), and the like. 20:533-538), aliphatic chains such as dodecanediol or undecyl residues (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), phospholipids such as di-hexadecyl-rac-glycerol or triethyl-ammonium 1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-phosphonate (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), polyamines or a polyethylene glycol chain (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973) or adamantane acetic acid (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), a palmityl moiety (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237) or an octadecylamine or hexylamino-carbonyloxycholesterol moiety (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937).

ある実施態様において、リガンドは、取り込まれているｉＲＮＡ剤の分布、ターゲティングまたは寿命を変える。好ましい実施態様において、リガンドは、例えば、該リガンドがない種と比較して、選択標的、例えば、分子、細胞または細胞型、区画、例えば、体内の細胞もしくは臓器区画、組織、臓器または領域への親和性増強を提供する。好ましいリガンドは、二本鎖核酸の二本鎖対形成に参加しない。In certain embodiments, the ligand alters the distribution, targeting, or lifetime of the iRNA agent into which it is incorporated. In preferred embodiments, the ligand provides enhanced affinity to a selected target, e.g., a molecule, a cell or cell type, a compartment, e.g., a cell or organ compartment, tissue, organ, or region of the body, e.g., compared to a species lacking the ligand. Preferred ligands do not participate in duplex pairing of double-stranded nucleic acids.

リガンドは、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)、低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)またはグロブリン)；炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルガラクトサミンまたはヒアルロン酸)；または脂質などの天然に存在する物質を含み得る。リガンドはまた、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸などの組み換えまたは合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例は、ポリリシン(ＰＬＬ)、ポリＬアスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物コポリマー、ポリ(Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド)コポリマー、ジビニルエーテル－マレイン無水物コポリマー、Ｎ－(２－ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(ＨＭＰＡ)、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリウレタン、ポリ(２－エチルアクリル酸)、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンなどのポリアミノ酸を含む。ポリアミンの例は、ポリエチレンイミン、ポリリシン(ＰＬＬ)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの４級塩またはアルファヘリカルペプチドを含む。Ligands may include naturally occurring substances such as proteins (e.g., human serum albumin (HSA), low density lipoprotein (LDL) or globulins); carbohydrates (e.g., dextran, pullulan, chitin, chitosan, inulin, cyclodextrin, N-acetylgalactosamine or hyaluronic acid); or lipids. Ligands may also be recombinant or synthetic molecules such as synthetic polymers, e.g., synthetic polyamino acids. Examples of polyamino acids include polyamino acids such as polylysine (PLL), poly-L-aspartic acid, poly-L-glutamic acid, styrene-maleic anhydride copolymer, poly(L-lactide-co-glycolide) copolymer, divinyl ether-maleic anhydride copolymer, N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymer (HMPA), polyethylene glycol (PEG), polyvinyl alcohol (PVA), polyurethane, poly(2-ethylacrylic acid), N-isopropylacrylamide polymer or polyphosphazine. Examples of polyamines include polyethyleneimine, polylysine (PLL), spermine, spermidine, polyamines, pseudopeptide-polyamines, peptidomimetic polyamines, dendrimer polyamines, arginine, amidines, protamines, cationic lipids, cationic porphyrins, quaternary salts of polyamines, or alpha helical peptides.

リガンドはまた、腎細胞などの特定の細胞型に結合する、ターゲティング基、例えば、細胞または組織ターゲティング剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、抗体も含み得る。ターゲティング基はまた、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、単価または多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチンまたはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体でもあり得る。ある実施態様において、リガンドは単価または多価ガラクトースを含む。ある実施態様において、リガンドはコレステロールを含む。The ligand may also include a targeting group, e.g., a cell or tissue targeting agent, e.g., a lectin, glycoprotein, lipid, or protein, e.g., an antibody, that binds to a specific cell type, such as a renal cell. The targeting group may also be thyroid stimulating hormone, melanocyte stimulating hormone, lectin, glycoprotein, surfactant protein A, mucin carbohydrate, polyvalent lactose, monovalent or polyvalent galactose, N-acetyl-galactosamine, N-acetyl-glucosamine polyvalent mannose, polyvalent fucose, glycosylated polyamino acids, transferrin, bisphosphonates, polyglutamates, polyaspartates, lipids, cholesterol, steroids, bile acids, folic acid, vitamin B12, vitamin A, biotin, or an RGD peptide or RGD peptide mimetic. In certain embodiments, the ligand includes monovalent or polyvalent galactose. In certain embodiments, the ligand includes cholesterol.

リガンドの他の例は、色素、挿入剤(例えばアクリジン)、架橋剤(例えばソラレン、マイトマイシンＣ)、ポルフィリン(ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えばＥＤＴＡ)、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１,３－ビス－Ｏ(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１,３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－(オレオイル)リトコール酸、Ｏ３－(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジン)およびペプチドコンジュゲート(例えば、アンテナペディペプチド、Ｔａｔペプチド)、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ(例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ)、ＭＰＥＧ、[ＭＰＥＧ]_２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン(例えばビオチン)、輸送／吸収促進剤(例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋錯体)、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰを含む。 Other examples of ligands include dyes, intercalating agents (e.g., acridines), crosslinkers (e.g., psoralens, mitomycin C), porphyrins (TPPC4, texaphyrin, sapphyrin), polycyclic aromatic hydrocarbons (e.g., phenazine, dihydrophenazine), artificial endonucleases (e.g., EDTA), lipophilic molecules such as cholesterol, cholic acid, adamantane acetic acid, 1-pyrenebutyric acid, dihydrotestosterone, 1,3-bis-O(hexadecyl)glycerol, geranyloxy, and the like. dihexyl group, hexadecylglycerol, borneol, menthol, 1,3-propanediol, heptadecyl group, palmitic acid, myristic acid, O3-(oleoyl)lithocholic acid, O3-(oleoyl)cholenoic acid, dimethoxytrityl or phenoxazine) and peptide conjugates (e.g., antennapedipeptides, Tat peptides), alkylating agents, phosphate, amino, mercapto, PEG (e.g., PEG-40K), MPEG, [MPEG]₂ , polyamino, alkyl, substituted alkyl, radiolabeled markers, enzymes, haptens (e.g., biotin), transport/absorption enhancers (e.g., aspirin, vitamin E, folic acid), synthetic ribonucleases (e.g., imidazole, bis-imidazole, histamine, imidazole clusters, acridine-imidazole conjugates, Eu3+ complexes of tetraazamacrocycles), dinitrophenyl, HRP or AP.

リガンドは、例えば、肝細胞などの特定の細胞型に結合する、タンパク質、例えば、糖タンパク質またはペプチド、例えば、共リガンドに特定の親和性を有する分子または抗体、抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含み得る。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、単価または多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノースまたは多価フコースなどの非ペプチド種も含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼのアクティベーターまたはＮＦ－κＢのアクティベーターであり得る。The ligands can be, for example, proteins, e.g., glycoproteins or peptides, molecules with a specific affinity for co-ligands, e.g., antibodies, that bind to a particular cell type, e.g., hepatocytes. Ligands can also include hormones and hormone receptors. They can also include lipids, lectins, carbohydrates, vitamins, cofactors, non-peptide species such as multivalent lactose, mono- or multivalent galactose, N-acetyl-galactosamine, N-acetyl-glucosamine multivalent mannose or multivalent fucose. Ligands can be, for example, lipopolysaccharides, activators of p38 MAP kinase or activators of NF-κB.

リガンドは、例えば、細胞の微小管、微小線維または中間径フィラメントの破壊による、例えば、細胞の細胞骨格の破壊により、ｉＲＮＡ剤の細胞への取り込みを増加できる物質、例えば、薬物であり得る。薬物は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシンまたはミオセルビンであり得る。The ligand can be a substance, e.g., a drug, that can increase cellular uptake of the iRNA agent, e.g., by disruption of the cytoskeleton of the cell, e.g., by disruption of the cell's microtubules, microfibrils, or intermediate filaments. The drug can be, e.g., taxon, vincristine, vinblastine, cytochalasin, nocodazole, jasplakinolide, latrunculin A, phalloidin, swinholide A, indanocine, or myoservin.

ある実施態様において、ここに記載するｉＲＮＡに結合するリガンドは、薬物動態モジュレーター(ＰＫモジュレーター)として働く。ＰＫモジュレーターは、脂溶性物、胆汁酸、ステロイド、リン脂質アナログ、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどを含む。例示的ＰＫモジュレーターは、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどを含むが、これらに限定されない。多数のホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドも血清タンパク質に結合することが知られ、故に、主鎖に複数のホスホロチオエート結合を含む短オリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基または２０塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンドとして本発明に受け入れられる(例えばＰＫ調節リガンドとして)。さらに、血清成分(例えば血清タンパク質)に結合するアプタマーも、ここに記載する実施態様においてＰＫ調節リガンドとして使用するのに適する。In some embodiments, the ligands that bind to the iRNAs described herein act as pharmacokinetic modulators (PK modulators). PK modulators include lipid-soluble substances, bile acids, steroids, phospholipid analogs, peptides, protein binders, PEG, vitamins, and the like. Exemplary PK modulators include, but are not limited to, cholesterol, fatty acids, cholic acid, lithocholic acid, dialkyl glycerides, diacyl glycerides, phospholipids, sphingolipids, naproxen, ibuprofen, vitamin E, biotin, and the like. Oligonucleotides containing multiple phosphorothioate linkages are also known to bind to serum proteins, and therefore short oligonucleotides, e.g., oligonucleotides of about 5, 10, 15, or 20 bases, containing multiple phosphorothioate linkages in the backbone, are also amenable to the present invention as ligands (e.g., as PK-modulating ligands). Additionally, aptamers that bind to serum components (e.g., serum proteins) are also suitable for use as PK-modulating ligands in the embodiments described herein.

本発明のリガンド－コンジュゲートオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドへの連結分子の結合に由来するもののような、ペンダント反応性官能基を担持するオリゴヌクレオチドの使用により合成され得る(下記)。この反応性オリゴヌクレオチドは、直接市販のリガンド、多様な保護基のいずれかを担持する合成されたリガンドまたは結合する連結部分を有するリガンドと反応させ得る。The ligand-conjugated oligonucleotides of the invention can be synthesized by the use of oligonucleotides bearing pendant reactive functional groups, such as those derived from the attachment of a linking molecule to the oligonucleotide (below). This reactive oligonucleotide can be reacted directly with commercially available ligands, synthesized ligands bearing any of a variety of protecting groups, or ligands having a linking moiety attached.

本発明のコンジュゲートで使用するオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知技法により、好都合にかつ日常的に製造され得る。このような合成用装置は、例えば、Applied Biosystems(Foster City, Calif.)を含むいくつかのベンダーから販売されている。当分野で知られる該合成の任意の他の手段は、これに加えてまたはこれに代えて用いられ得る。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを製造する類似技法の使用も知られる。The oligonucleotides used in the conjugates of the invention can be conveniently and routinely prepared by the well-known technique of solid phase synthesis. Equipment for such synthesis is commercially available from several vendors, including, for example, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Any other means of such synthesis known in the art can be used in addition or instead. The use of similar techniques to prepare other oligonucleotides, such as phosphorothioates and alkylated derivatives, is also known.

本発明のリガンド－コンジュゲートオリゴヌクレオチドおよび配列特異的な連結オリゴヌクレオチドを担持するリガンド－分子において、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドを、標準的ヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体または、連結部分をすでに担持するヌクレオチドまたはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子をすでに担持するリガンド－ヌクレオチドまたはヌクレオシド－コンジュゲート前駆体または非ヌクレオシドリガンド担持構成要素を利用して、適当なＤＮＡ合成装置で組み立て得る。In the ligand-conjugated oligonucleotides and ligand-molecules carrying sequence-specific linking oligonucleotides of the present invention, the oligonucleotides and oligonucleosides can be assembled in a suitable DNA synthesizer using standard nucleotide or nucleoside precursors or nucleotide or nucleoside conjugate precursors already carrying a linking moiety, ligand-nucleotide or nucleoside-conjugate precursors already carrying a ligand molecule, or non-nucleoside ligand-bearing components.

連結部分をすでに担持するヌクレオチド－コンジュゲート前駆体を使用するとき、配列特異的な連結ヌクレオシドの合成を、一般に完了し、次いでリガンド分子を連結部分と反応させて、リガンド－コンジュゲートオリゴヌクレオチドを形成する。ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは連結ヌクレオシドを、市販され、オリゴヌクレオチド合成に一般に使用される標準的ホスホラミダイトおよび非標準的ホスホラミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシドコンジュゲート由来のホスホラミダイトを使用して自動化合成装置により合成する。When using a nucleotide-conjugate precursor that already carries a linking moiety, synthesis of the sequence-specific linked nucleoside is generally completed and then a ligand molecule is reacted with the linking moiety to form the ligand-conjugated oligonucleotide. In certain embodiments, the oligonucleotides or linked nucleosides of the invention are synthesized by automated synthesizers using phosphoramidites derived from the ligand-nucleoside conjugates, in addition to standard and non-standard phosphoramidites that are commercially available and commonly used in oligonucleotide synthesis.

１. 脂質コンジュゲート
ある実施態様において、リガンドまたはコンジュゲートは脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)を結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、体内の標的組織、例えば、非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分布を可能とする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む、肝臓であり得る。ＨＳＡと結合できる他の分子もリガンドとして使用し得る。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンが使用され得る。脂質または脂質ベースのリガンドは、(ａ)コンジュゲートの分解に対する抵抗性を増加させる、(ｂ)標的細胞または細胞膜へのターゲティングまたは輸送を増加させるまたは(ｃ)血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合の調節に使用し得ることができる。1. Lipid conjugate In some embodiments, the ligand or conjugate is a lipid or lipid-based molecule. Such lipid or lipid-based molecule preferably binds serum protein, such as human serum albumin (HSA). HSA-binding ligand allows the distribution of the conjugate to target tissue in the body, such as non-renal target tissue. For example, the target tissue can be the liver, including the parenchymal cells of the liver. Other molecules that can bind to HSA can also be used as ligands. For example, naproxen or aspirin can be used. Lipid or lipid-based ligand can be used to (a) increase the resistance of the conjugate to degradation, (b) increase targeting or transport to target cells or cell membranes, or (c) regulate binding to serum protein, such as HSA.

脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートの標的組織への結合阻害、例えば、制御に使用し得る。例えば、ＨＳＡへの結合が強いほど、脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓を標的化する可能性が低く、それ故に体内から除去される可能性が低い。脂質または脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡへの結合が弱いほど、コンジュゲートを腎臓に向けるのに使用し得る。Lipid-based ligands can be used to inhibit, e.g., control, binding of the conjugate to a target tissue. For example, the stronger the binding to HSA, the less likely the lipid or lipid-based ligand is to target the kidney and therefore be cleared from the body. The weaker the binding to HSA, the less likely the lipid or lipid-based ligand is to be used to target the conjugate to the kidney.

好ましい実施態様において、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、コンジュゲートが好ましくは非腎臓組織に分布されるように、十分な親和性でＨＳＡと結合する。しかしながら、親和性が、ＨＳＡ－リガンド結合が可逆性であり得ないほど強くないのが好ましい。In a preferred embodiment, the lipid-based ligand binds to HSA. Preferably, it binds to HSA with sufficient affinity such that the conjugate is preferably distributed to non-renal tissues. However, it is preferred that the affinity is not so strong that the HSA-ligand binding cannot be reversible.

他の好ましい実施態様において、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが好ましくは腎臓に分布しないように、ＨＳＡに弱く結合するかまたは全く結合しない。腎細胞を標的とする他の部分をまた、脂質ベースのリガンドの代わりにまたはそれに加えて使用し得る。In other preferred embodiments, the lipid-based ligand binds weakly or not at all to HSA, such that the conjugate preferably does not distribute to the kidney. Other moieties that target renal cells may also be used in place of or in addition to the lipid-based ligand.

他の態様において、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖性細胞により取り込まれる、部分、例えば、ビタミンである。例えば、悪性または非悪性型の望まれない細胞増殖により特徴づけられる障害、例えば、癌細胞の処置に特に有用である。例示的ビタミンはビタミンＡ、ＥおよびＫを含む。他の例示的ビタミンは、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールまたは肝細胞などの標的細胞により取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素を含む。また包含されるのは、ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)である。In another embodiment, the ligand is a moiety, e.g., a vitamin, that is taken up by a target cell, e.g., a proliferating cell. Particularly useful, e.g., for treating disorders characterized by unwanted cell proliferation, e.g., cancer cells, of malignant or non-malignant types. Exemplary vitamins include vitamins A, E, and K. Other exemplary vitamins include B vitamins, e.g., folic acid, B12, riboflavin, biotin, pyridoxal, or other vitamins or nutrients that are taken up by target cells, such as hepatocytes. Also included are HSA and low density lipoprotein (LDL).

２. 細胞透過剤
他の態様において、リガンドは、細胞透過剤、好ましくはヘリカル細胞透過剤である。好ましくは、薬剤は両親媒性である。例示的薬剤は、ｔａｔまたはアンティナペディアなどのペプチドである。薬剤がペプチドであるならば、それは、ペプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチドまたはシュード－ペプチド結合およびＤ－アミノ酸の使用を含み、修飾され得る。ヘリカル薬剤は、好ましくは親油性および疎油性相を有する、好ましくはアルファ－ヘリカル剤である。2. Cell Penetration Agents In another embodiment, the ligand is a cell penetration agent, preferably a helical cell penetration agent. Preferably, the agent is amphipathic. Exemplary agents are peptides such as tat or antinapedia. If the agent is a peptide, it may be modified, including peptidyl mimetics, invertomers, non-peptide or pseudo-peptide bonds, and the use of D-amino acids. The helical agent is preferably an alpha-helical agent, preferably having a lipophilic and lipophobic phase.

リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体(ここでは、オリゴペプチド模倣体とも称する)は、天然ペプチドに類似する規定三次元構造に折りたたまれ得る、分子である。ｉＲＮＡ剤へのペプチドおよびペプチド模倣体の結合は、細胞認識および吸収増強によるなど、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響し得る。ペプチドまたはペプチド模倣体部分は、約５～５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長であり得る。The ligand can be a peptide or peptidomimetic. Peptidomimetics (also referred to herein as oligopeptidomimetics) are molecules that can fold into defined three-dimensional structures similar to natural peptides. Attachment of peptides and peptidomimetics to an iRNA agent can affect the pharmacokinetic distribution of the iRNA, such as by enhancing cellular recognition and uptake. The peptide or peptidomimetic portion can be about 5-50 amino acids in length, e.g., about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, or 50 amino acids in length.

ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞浸透ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは疎水性ペプチド(例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる)であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。他の例において、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列(ＭＴＳ)を含み得る。例示的疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列AAVALLPAVLLALLAP(配列番号３３)を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含むＲＦＧＦアナログ(例えば、アミノ酸配列AALLPVLLAAP(配列番号３４))も、ターゲティング部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を超えるペプチド、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を含む、大極性分子を担持し得る「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶＴａｔタンパク質(GRKKRRQRRRPPQ(配列番号３５)およびショウジョウバエアンテナペディタンパク質(RQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号３６)からの配列が、送達ペプチドとして機能し得ることが判明している。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレーライブラリーまたはone-bead-one-compound(ＯＢＯＣ)組み合わせライブラリーから同定されたペプチドなど、ＤＮＡの無作為配列によりコード化され得る(Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991)。細胞ターゲティング目的のために取り込まれた単量体単位を経てｄｓＲＮＡ剤に繋がれたペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸(ＲＧＤ)－ペプチドまたはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５アミノ酸～約４０アミノ酸の範囲の長さでり得る。ペプチド部分は、安定性増加または立体構造性質指向のために構造的修飾を有し得る。下記構造的修飾の何れも利用し得る。The peptide or peptidomimetic can be, for example, a cell-penetrating peptide, a cationic peptide, an amphipathic peptide, or a hydrophobic peptide (e.g., consisting mainly of Tyr, Trp, or Phe). The peptide moiety can be a dendrimeric peptide, a constrained peptide, or a cross-linked peptide. In other examples, the peptide moiety can include a hydrophobic membrane translocation sequence (MTS). An exemplary hydrophobic MTS-containing peptide is RFGF, which has the amino acid sequence AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 33). RFGF analogs containing hydrophobic MTS (e.g., the amino acid sequence AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 34)) can also be targeting moieties. The peptide moiety can be a "delivery" peptide that can carry large polar molecules, including peptides, oligonucleotides, and proteins, across cell membranes. For example, it has been found that sequences from the HIV Tat protein (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 35) and the Drosophila antennapedi protein (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 36) can function as delivery peptides. The peptide or peptidomimetic can be encoded by a random sequence of DNA, such as peptides identified from a phage display library or a one-bead-one-compound (OBOC) combinatorial library (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). A peptide or peptidomimetic that has been tethered to a dsRNA agent via an incorporated monomeric unit for cell targeting purposes is an arginine-glycine-aspartic acid (RGD)-peptide or RGD mimic. The peptide portion can range in length from about 5 amino acids to about 40 amino acids. The peptide portion can have structural modifications for increased stability or directing conformational properties. Any of the following structural modifications can be utilized:

本発明の組成物および方法で使用し得るＲＧＤペプチドは、直線状または環状であってよく、特定の組織へのターゲティングを促進するために、修飾、例えば、グリコシル化またはメチル化されていてよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣体は、Ｄ－アミノ酸ならびに合成ＲＧＤ模倣体を含み得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用し得る。このリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦを標的とする。RGD peptides that may be used in the compositions and methods of the invention may be linear or cyclic and may be modified, e.g., glycosylated or methylated, to facilitate targeting to specific tissues. RGD-containing peptides and peptidomimetics may include D-amino acids as well as synthetic RGD mimetics. In addition to RGD, other moieties that target integrin ligands may be used. Preferred conjugates of this ligand target PECAM-1 or VEGF.

「細胞浸透ペプチド」は、細胞、例えば、細菌または真菌細胞などの微生物細胞またはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過できる。微生物細胞透過ペプチドは、例えば、α－ヘリカル直線状ペプチド(例えば、ＬＬ－３７またはＣｅｒｏｐｉｎＰ１)、ジスルフィド結合含有ペプチド(例えば、α－デフェンシン、β－デフェンシンまたはバクテネシン)または1個または２個の支配アミノ酸のみを含むペプチド(例えば、ＰＲ－３９またはインドリシジン)であり得る。Ａ細胞浸透ペプチドはまた、核局在化シグナル(ＮＬＳ)を含み得る。例えば、細胞浸透ペプチドは、ＨＩＶ－１ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０大Ｔ抗原のＮＬＳ由来のＭＰＧなどの二連両親媒性ペプチドであり得る(Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003)。A "cell-penetrating peptide" can penetrate a cell, e.g., a microbial cell, such as a bacterial or fungal cell, or a mammalian cell, such as a human cell. A microbial cell-penetrating peptide can be, for example, an α-helical linear peptide (e.g., LL-37 or Ceropin P1), a disulfide bond-containing peptide (e.g., α-defensin, β-defensin or bactenecin) or a peptide containing only one or two dominant amino acids (e.g., PR-39 or indolicidin). A cell-penetrating peptide can also contain a nuclear localization signal (NLS). For example, a cell-penetrating peptide can be a bipartite amphipathic peptide, such as MPG, derived from the fusion peptide domain of HIV-1 gp41 and the NLS of SV40 large T antigen (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).

３. 炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物および方法のある実施態様において、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、さらに炭水化物を含む。炭水化物コンジュゲートｉＲＮＡは、ここに記載する、インビボ治療使用に適する核酸および組成物のインビボ送達に有利である。ここで使用する「炭水化物」は、少なくとも６炭素原子(直線状、分岐または環状であり得る)と各炭素原子に結合した酸素、窒素または硫黄原子の１以上の単糖単位からなる炭水化物自体である化合物；または一部として少なくとも６炭素原子(直線状、分岐または環状であり得る)と各炭素原子に結合した酸素、窒素または硫黄原子の１以上の単糖単位からなる炭水化物部分を有する、化合物をいう。代表的炭水化物は、糖(単、二、三および約４、５、６、７、８または９単糖単位を含むオリゴ糖)ならびにデンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ガムなどの多糖を含む。特定の単糖は、Ｃ５以上(例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８)の糖を含む；二および三糖は、２または３単糖単位(例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８)を有する糖を含む。3. Carbohydrate conjugates In some embodiments of the compositions and methods of the present invention, the iRNA oligonucleotide further comprises a carbohydrate. Carbohydrate-conjugated iRNAs are advantageous for in vivo delivery of nucleic acids and compositions suitable for in vivo therapeutic use as described herein. As used herein, "carbohydrate" refers to a compound that is a carbohydrate itself, consisting of at least six carbon atoms (which may be linear, branched or cyclic) and one or more monosaccharide units of oxygen, nitrogen or sulfur atoms bonded to each carbon atom; or a compound that has as a part a carbohydrate moiety consisting of at least six carbon atoms (which may be linear, branched or cyclic) and one or more monosaccharide units of oxygen, nitrogen or sulfur atoms bonded to each carbon atom. Representative carbohydrates include sugars (oligosaccharides containing mono, di, tri and about 4, 5, 6, 7, 8 or 9 monosaccharide units) and polysaccharides such as starch, glycogen, cellulose and polysaccharide gums. Particular monosaccharides include sugars of C5 or higher (e.g., C5, C6, C7 or C8); di- and trisaccharides include sugars having two or three monosaccharide units (e.g., C5, C6, C7 or C8).

ある実施態様において、本発明の組成物および方法において使用する炭水化物コンジュゲートは単糖である。他の実施態様において、本発明の組成物および方法において使用する炭水化物コンジュゲートは、次のものからなる群から選択される。
In some embodiments, the carbohydrate conjugate used in the compositions and methods of the invention is a monosaccharide. In other embodiments, the carbohydrate conjugate used in the compositions and methods of the invention is selected from the group consisting of:

ある実施態様において、単糖は、
などのＮ－アセチルガラクトサミンである。 In one embodiment, the monosaccharide is
and the like.

ここに記載する実施態様で使用するための他の代表的炭水化物コンジュゲートは、ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドならば、他方は水素であるときの
を含むが、これにら限定されない。 Other exemplary carbohydrate conjugates for use in the embodiments described herein include, where one of X or Y is an oligonucleotide and the other is hydrogen:
This includes, but is not limited to:

本発明のある実施態様において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、単価リンカーを経て本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。ある実施態様において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、二価リンカーを経て本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。本発明のさらに他の実施態様において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、三価リンカーを経て本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。In certain embodiments of the invention, GalNAc or a GalNAc derivative is attached to an iRNA agent of the invention via a monovalent linker. In certain embodiments, GalNAc or a GalNAc derivative is attached to an iRNA agent of the invention via a bivalent linker. In yet other embodiments of the invention, GalNAc or a GalNAc derivative is attached to an iRNA agent of the invention via a trivalent linker.

ある実施態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤に結合した１個のＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。他の実施態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、複数(例えば、２、３、４、５または６)のＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含み、各々独立して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに、複数の単価リンカーを経て結合する。In some embodiments, a double-stranded RNAi agent of the invention includes one GalNAc or GalNAc derivative attached to the iRNA agent. In other embodiments, a double-stranded RNAi agent of the invention includes multiple (e.g., 2, 3, 4, 5, or 6) GalNAc or GalNAc derivatives, each independently attached to multiple nucleotides of the double-stranded RNAi agent via multiple monovalent linkers.

ある実施態様において、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２つの鎖が、複数の不対ヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する一方の鎖の３’末端と各他方の鎖の５’末端の間の中断されていないヌクレオチドの鎖により接続される一つの大型分子の一部であるとき、ヘアピンループ内の各不対ヌクレオチドは、独立して単価リンカーを経て結合するＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含み得る。ヘアピンループは、二本鎖の一方の鎖における伸長オーバーハングによっても形成され得る。In some embodiments, for example, when the two strands of an iRNA agent of the invention are part of one larger molecule connected by a stretch of uninterrupted nucleotides between the 3' end of one strand and the 5' end of each other strand forming a hairpin loop containing multiple unpaired nucleotides, each unpaired nucleotide in the hairpin loop can independently comprise a GalNAc or GalNAc derivative attached via a monovalent linker. A hairpin loop can also be formed by an extended overhang on one strand of the duplex.

ある実施態様において、炭水化物コンジュゲートは、さらに、ＰＫモジュレーターまたは細胞浸透ペプチドなどの、しかし、これに限定されない、上記の１以上の付加的リガンドを含み得る。In some embodiments, the carbohydrate conjugate may further comprise one or more additional ligands as described above, such as, but not limited to, a PK modulator or a cell-penetrating peptide.

本発明での使用に適するさらなる炭水化物コンジュゲートは、ＷＯ２０１４１７９６２０およびＷＯ２０１４１７９６２７に記載のものを含み、これら各々の内容全体を引用により本明細書に包含する。Further carbohydrate conjugates suitable for use in the present invention include those described in WO2014179620 and WO2014179627, the entire contents of each of which are incorporated herein by reference.

４. リンカー
ある実施態様において、ここに記載するコンジュゲートまたはリガンドは、切断可能または非切断可能であり得る種々のリンカーにより、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合され得る。4. Linkers In certain embodiments, the conjugates or ligands described herein can be attached to the iRNA oligonucleotide by a variety of linkers, which can be cleavable or non-cleavable.

用語「リンカー」または「連結基」は、化合物の二つの部分を接続する、例えば、化合物の二つの部分を共有結合する、有機部分を意味する。リンカーは、一般に直接結合または酸素または硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ(Ｏ)、Ｃ(Ｏ)ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＳＯ_２ＮＨなどの単位または、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール(１以上のメチレンがＯ、Ｓ、Ｓ(Ｏ)、ＳＯ_２、Ｎ(Ｒ８)、Ｃ(Ｏ)、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロ環式で中断または停止していてよく、ここで、Ｒ８は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である)を含むが、これらに限定されない原子鎖を含む。ある実施態様において、リンカーは、約１～２４原子、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、６～１８、７～１８、８～１８原子、７～１７、８～１７、６～１６、７～１６または８～１６原子である。 The term "linker" or "linking group" refers to an organic moiety that connects two parts of a compound, e.g., covalently bonds two parts of a compound. A linker is generally a direct bond or an atom such as oxygen or sulfur, a unit such as NR8, C(O), C(O)NH, SO,_SO2 ,_SO2NH , or a unit such as substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted alkynyl, arylalkyl, arylalkenyl, arylalkynyl, heteroarylalkyl, heteroarylalkenyl, heteroarylalkynyl, heterocyclylalkyl, heterocyclylalkenyl, heterocyclylalkynyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, alkylarylalkyl, alkylarylalkenyl, alkylarylalkynyl, alkenylarylalkyl, alkenylarylalkenyl, alkenylarylalkynyl, alkynylarylalkyl, alkynylarylalkenyl, alkynylarylalkynyl, alkylheteroarylalkyl, alkylheteroarylalkenyl, alkyl Heteroarylalkynyl, alkenylheteroarylalkyl, alkenylheteroarylalkenyl, alkenylheteroarylalkynyl, alkynylheteroarylalkyl, alkynylheteroarylalkenyl, alkynylheteroarylalkynyl, alkylheterocyclylalkyl, alkylheterocyclylalkenyl, alkylheterocyclylalkynyl, alkenylheterocyclylalkyl, alkenylheterocyclylalkenyl, alkenylheterocyclylalkynyl, alkynylheterocyclylalkyl, alkynylheterocyclylalkenyl, alkynylheterocyclylalkynyl, alkylaryl, alkenylaryl, alkynylaryl, alkylheteroaryl, alkenylheteroaryl, alkynylheteroaryl (wherein one or more methylenes are O, S, S(O), SO₂ , N(R8), C(O), substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heteroaryl, substituted or unsubstituted heterocyclic, where R8 is hydrogen, acyl, aliphatic or substituted aliphatic. In some embodiments, the linker is about 1-24 atoms, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18 atoms, 7-17, 8-17, 6-16, 7-16, or 8-16 atoms.

切断可能連結基は、細胞外で十分に安定であるが、標的細胞に侵入したら、リンカーが共に保持している２部分を放出するように切断するものである。好ましい実施態様において、切断可能連結基は、標的細胞でまたは第一引用条件下(これは、例えば、細胞内状態を模倣または代表するよう選択され得る)で、対象の血液または第二引用条件下(これは、例えば、血液または血清で見られる状態を模倣または代表するよう選択され得る)より少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍またはそれ以上または少なくとも約１００倍速く切断される。A cleavable linker is one that is sufficiently stable outside a cell, but cleaves upon entry into a target cell to release the two moieties that the linker holds together. In preferred embodiments, the cleavable linker is cleaved at least about 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 or more times faster in the target cell or under first reference conditions (which may be selected, for example, to mimic or represent intracellular conditions) than in the subject's blood or under second reference conditions (which may be selected, for example, to mimic or represent conditions found in blood or serum).

切断可能連結基は、切断因子、例えば、ｐＨ、酸化還元電位または分解分子の存在に感受性である。一般に、切断因子は、血清または血液中より細胞内で優勢であるかまたは高いレベルまたは活性である。このような分解因子の例は、例えば、酸化的または還元的酵素または、細胞に存在する、酸化還元切断可能連結基を還元により分解できる、メルカプタンなどの還元剤；エステラーゼ；エンドソームまたは酸性環境を作り得る薬剤、例えば、５以下のｐＨをもたらすもの；酸一般、ペプチダーゼ(基質特異的であり得る)およびホスファターゼとして作用することにより、酸切断可能連結基を加水分解または分解できる酵素を含む、特定の基質に選択的なまたは基質選択性がない酸化還元剤を含む。Cleavable linkers are sensitive to cleavage factors, e.g., pH, redox potential, or the presence of degrading molecules. Generally, cleavage factors are more prevalent or have higher levels or activity within cells than in serum or blood. Examples of such degrading factors include, e.g., oxidative or reductive enzymes or reducing agents present in cells that can degrade redox-cleavable linkers by reduction, such as mercaptans; esterases; agents that can create endosomes or acidic environments, e.g., those that result in a pH of 5 or less; redox agents selective for a particular substrate or no substrate selectivity, including enzymes that can hydrolyze or degrade acid-cleavable linkers by acting as acids in general, peptidases (which may be substrate specific), and phosphatases.

ジスルフィド結合などの切断可能結合基はｐＨに感受性であり得る。ヒト血清のｐＨは７.４であり、一方平均細胞内ｐＨは、約７.１～７.３とわずかに低い。エンドソームは、より酸性のｐＨであり、５.５～６.０範囲であり、リソソームは、約５.０のさらに酸性ｐＨを有する。あるリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能連結基を有し、それによりカチオン性脂質をリガンドから細胞または細胞の所望の区画内に放出する。Cleavable linking groups, such as disulfide bonds, can be sensitive to pH. The pH of human serum is 7.4, while the average intracellular pH is slightly lower at about 7.1-7.3. Endosomes have a more acidic pH, ranging from 5.5-6.0, and lysosomes have a more acidic pH of about 5.0. Some linkers have a cleavable linking group that is cleaved at a preferred pH, thereby releasing the cationic lipid from the ligand into the cell or a desired compartment of the cell.

リンカーは、特定の酵素により切断可能な切断可能連結基を含み得る。リンカーに取り込まれる切断可能連結基のタイプは、標的とされる細胞による。例えば、肝臓ターゲティングリガンドは、エステル基を含むリンカーを経てカチオン性脂質に結合し得る。肝細胞はエステラーゼに富み、それ故にリンカーは、エステラーゼリッチではない細胞型より肝細胞で効率的に切断される。エステラーゼに富む他の細胞型は、肺、腎臓皮質および精巣の細胞を含む。The linker may contain a cleavable linking group that is cleavable by a specific enzyme. The type of cleavable linking group incorporated into the linker depends on the cell to be targeted. For example, a liver targeting ligand may be attached to a cationic lipid via a linker that contains an ester group. Hepatocytes are rich in esterases and therefore the linker is cleaved more efficiently in hepatocytes than in cell types that are not esterase rich. Other cell types that are rich in esterases include cells of the lung, kidney cortex and testis.

ペプチド結合を含むリンカーを、ターゲティング細胞型が、肝細胞および滑膜細胞などペプチダーゼに富むとき、使用し得る。Linkers containing peptide bonds may be used when the target cell type is rich in peptidases, such as hepatocytes and synovial cells.

一般に、候補切断可能連結基の適性は、分解剤(または条件)が候補連結基を切断する能力の試験により評価し得る。候補切断可能連結基を、血液中でまたは他の非標的組織と接触したとき、切断に抵抗する能力について試験するのも望ましいことがある。それ故に、第一条件と第二条件の間(ここで、第一は、標的細胞における切断を示すように選択され、第二は他の組織または生物学的液体、例えば、血液または血清における切断を示すように選択される)の切断の相対的感受性を決定し得る。評価は、無細胞系、細胞、細胞培養、臓器または組織培養または動物全体で実施し得る。無細胞または培養条件下で初期評価を行い、さらに動物全体で評価して確認することが有用であり得る。好ましい実施態様において、有用な候補化合物は、血液または血清(または細胞外条件を模倣するよう選択されたインビトロ条件下)と比較して、細胞(または細胞内条件を模倣するよう選択されたインビトロ条件下)で少なくとも約２倍、４倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍または約１００倍速く開裂される。In general, the suitability of a candidate cleavable linking group may be evaluated by testing the ability of a degrading agent (or condition) to cleave the candidate linking group. It may also be desirable to test the candidate cleavable linking group for its ability to resist cleavage in blood or when in contact with other non-target tissues. Thus, the relative susceptibility to cleavage between a first condition and a second condition, where the first is selected to exhibit cleavage in target cells and the second is selected to exhibit cleavage in other tissues or biological fluids, e.g., blood or serum, may be determined. Evaluation may be performed in a cell-free system, cells, cell cultures, organ or tissue cultures, or in whole animals. It may be useful to perform an initial evaluation under cell-free or culture conditions and confirm with further evaluation in whole animals. In preferred embodiments, useful candidate compounds are cleaved at least about 2-fold, 4-fold, 10-fold, 20-fold, 30-fold, 40-fold, 50-fold, 60-fold, 70-fold, 80-fold, 90-fold, or about 100-fold faster in cells (or under in vitro conditions selected to mimic intracellular conditions) compared to blood or serum (or under in vitro conditions selected to mimic extracellular conditions).

ａ. 酸化還元切断可能連結基
ある実施態様において、切断可能連結基は、酸化または還元により切断される、酸化還元切断可能連結基である。還元的に切断可能連結基の例は、ジスルフィド連結基(－Ｓ－Ｓ－)である。切断可能連結基の候補が適当な「還元的切断可能連結基」であるかまたは例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定のターゲティング剤での使用に適するかを決定するために、ここに記載する方法を実施し得る。例えば、候補を、細胞、例えば、標的細胞で観察される切断速度を模倣する、当分野で知られる反応材を使用して、ジチオトレイトール(ＤＴＴ)または他の還元剤とインキュベーションして評価し得る。候補をまた、血液または血清条件を模倣するよう選択された条件でも評価し得る。一つの態様では、候補化合物は、血液で最大約１０％切断される。他の実施態様において、有用な候補化合物は、血液(または細胞外条件を模倣するよう選択されたインビトロ条件下)と比較して、細胞(または細胞内条件を模倣するよう選択されたインビトロ条件下)で少なくとも約２倍、４倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍または約１００倍速く切断される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するよう選択した条件下で、標準的酵素反応速度論アッセイを使用し、細胞外媒体を模倣するよう選択した条件と比較して決定し得る。a. Redox Cleavable Linkers In certain embodiments, the cleavable linker is a redox cleavable linker that is cleaved by oxidation or reduction. An example of a reductively cleavable linker is a disulfide linker (-S-S-). To determine whether a candidate cleavable linker is a suitable "reductively cleavable linker" or suitable for use with, for example, a particular iRNA moiety and a particular targeting agent, one can perform the methods described herein. For example, candidates can be evaluated by incubation with dithiothreitol (DTT) or other reducing agents using reagents known in the art that mimic the cleavage rates observed in cells, e.g., target cells. Candidates can also be evaluated under conditions selected to mimic blood or serum conditions. In one embodiment, the candidate compound is cleaved at a maximum of about 10% in blood. In other embodiments, useful candidate compounds are cleaved at least about 2-fold, 4-fold, 10-fold, 20-fold, 30-fold, 40-fold, 50-fold, 60-fold, 70-fold, 80-fold, 90-fold, or about 100-fold faster in cells (or under in vitro conditions selected to mimic intracellular conditions) compared to blood (or under in vitro conditions selected to mimic extracellular conditions). The rate of cleavage of the candidate compound may be determined using standard enzyme kinetics assays under conditions selected to mimic the intracellular medium, compared to conditions selected to mimic the extracellular medium.

ｂ. ホスフェートベースの切断可能連結基
他の実施態様において、切断可能リンカーは、ホスフェートベースの切断可能連結基を含む。ホスフェートベースの切断可能連結基は、ホスフェート基を分解または加水分解する薬剤により切断される。細胞内のホスフェート基を切断する薬剤の例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。ホスフェートベースの連結基の例は、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＳＲｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＲｋ)－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＲｋ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(ＯＲｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(Ｒｋ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｒｋ)－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｒｋ)－Ｓ－である。好ましい実施態様は、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＳＨ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(ＯＨ)－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(ＯＨ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(Ｈ)－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｈ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｈ)－Ｏ、－Ｓ－Ｐ(Ｓ)(Ｈ)－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ(Ｏ)(Ｈ)－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ(Ｓ)(Ｈ)－Ｓ－である。好ましい実施態様は、－Ｏ－Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)－Ｏ－である。これらの候補は、上記に準ずる方法を使用して、評価され得る。b. Phosphate-Based Cleavable Tethers In other embodiments, the cleavable linker comprises a phosphate-based cleavable tether. The phosphate-based cleavable tether is cleaved by an agent that degrades or hydrolyzes the phosphate group. An example of an agent that cleaves phosphate groups within a cell is an enzyme such as an intracellular phosphatase. Examples of phosphate based linking groups are -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-. Preferred embodiments are -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Preferred embodiment is -O-P(O)(OH)-O-. These candidates can be evaluated using methods similar to those described above.

ｃ. 酸切断可能連結基
他の実施態様において、切断可能リンカーは、酸切断可能連結基を含む。酸切断可能連結基は、酸性条件下で切断される、連結基である。好ましい実施態様において酸切断可能連結基は、約６.５以下(例えば、約６.０、５.７５、５.５、５.２５、５.０以下)のｐＨの酸性環境でまたは一般的な酸として作用し得る酵素などの薬剤により、切断される。細胞で、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨ小器官が、酸切断可能連結基のための切断環境を提供する。酸切断可能連結基の例は、アミノ酸のヒドラゾン、エステルおよびエステルを含むが、これらに限定されない。酸切断可能群は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ(Ｏ)Ｏまたは－ＯＣ(Ｏ)を有し得る。好ましい実施態様は、エステル(アルコキシ基)の酸素に結合した炭素がアリール基、置換アルキル基またはジメチルペンチルもしくはｔ－ブチルなどの三級アルキル基であるときである。これらの候補は、上記に準ずる方法を使用して、評価され得る。c. Acid-cleavable linkers In another embodiment, the cleavable linker comprises an acid-cleavable linker. An acid-cleavable linker is a linker that is cleaved under acidic conditions. In a preferred embodiment, the acid-cleavable linker is cleaved in an acidic environment at a pH of about 6.5 or less (e.g., about 6.0, 5.75, 5.5, 5.25, 5.0 or less) or by an agent, such as an enzyme, that can act as a general acid. In cells, certain low pH organelles, such as endosomes and lysosomes, provide a cleavage environment for the acid-cleavable linker. Examples of acid-cleavable linkers include, but are not limited to, hydrazones, esters, and esters of amino acids. Acid-cleavable groups can have the general formula -C=NN-, C(O)O, or -OC(O). A preferred embodiment is when the carbon attached to the oxygen of the ester (alkoxy group) is an aryl group, a substituted alkyl group, or a tertiary alkyl group, such as dimethylpentyl or t-butyl. These candidates can be evaluated using methods similar to those described above.

ｄ. エステルベースの連結基
他の実施態様において、切断可能リンカーは、エステルベースの切断可能連結基を含む。エステルベースの切断可能連結基は、細胞のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能連結基の例は、アルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基のエステルを含むが、これらに限定されない。エステル切断可能連結基は、一般式－Ｃ(Ｏ)Ｏ－または－ＯＣ(Ｏ)－を有する。これらの候補は、上記に準ずる方法を使用して、評価され得る。d. Ester-Based Linkers In other embodiments, the cleavable linker comprises an ester-based cleavable linker. Ester-based cleavable linkers are cleaved by enzymes such as cellular esterases and amidases. Examples of ester-based cleavable linkers include, but are not limited to, esters of alkylene, alkenylene, and alkynylene groups. Ester cleavable linkers have the general formula -C(O)O- or -OC(O)-. These candidates can be evaluated using methods similar to those described above.

ｅ. ペプチドベースの切断基
さらに他の実施態様において、切断可能リンカーは、ペプチドベースの切断可能連結基を含む。ペプチドベースの切断可能連結基は、細胞のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、オリゴペプチド(例えば、ジペプチド、トリペプチドなど)およびポリペプチドを産生するように、アミノ酸間に形成されたペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能群は、アミド基(－Ｃ(Ｏ)ＮＨ－)を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン間で形成され得る。ペプチド結合は、ペプチドおよびタンパク質を産生するように、アミノ酸間で形成された特別なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般にペプチドおよびタンパク質を産生するアミノ酸間で形成されたペプチド結合(すなわち、アミド結合)に限定され、アミド官能基全体を含まない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ(Ｏ)ＮＨＣＨＲＢＣ(Ｏ)－を有し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、２つの隣接アミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上記に準ずる方法を使用して、評価され得る。e. Peptide-Based Cleavage Groups In yet another embodiment, the cleavable linker comprises a peptide-based cleavable tether. Peptide-based cleavable tethers are cleaved by enzymes such as cellular peptidases and proteases. Peptide-based cleavable tethers are peptide bonds formed between amino acids to produce oligopeptides (e.g., dipeptides, tripeptides, etc.) and polypeptides. Peptide-based cleavable groups do not include amide groups (-C(O)NH-). Amide groups can be formed between any alkylene, alkenylene, or alkynylene. A peptide bond is a special type of amide bond formed between amino acids to produce peptides and proteins. Peptide-based cleavage groups are generally limited to peptide bonds (i.e., amide bonds) formed between amino acids to produce peptides and proteins, and do not include the entire amide functionality. Peptide-based cleavable tethers have the general formula -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, where RA and RB are the R groups of two adjacent amino acids. These candidates can be evaluated using methods similar to those described above.

ある実施態様において、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを経て炭水化物にコンジュゲートする。本発明の組成物および方法のリンカーとコンジュゲートしたｉＲＮＡ炭水化物の非限定的例は、ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドであり、他方が水素であるときの、次のものを含むが、これらに限定されない。
In some embodiments, the iRNA of the invention is conjugated to a carbohydrate via a linker. Non-limiting examples of iRNA carbohydrates conjugated to linkers of the compositions and methods of the invention include, but are not limited to, the following, where one of X or Y is an oligonucleotide and the other is hydrogen:

本発明の組成物および方法のある実施態様において、リガンドは、二価または三価分岐リンカーを介して結合した１以上の「ＧａｌＮＡｃ」(Ｎ－アセチルガラクトサミン)誘導体を含む。In certain embodiments of the compositions and methods of the invention, the ligand comprises one or more "GalNAc" (N-acetylgalactosamine) derivatives attached via a bivalent or trivalent branched linker.

ある実施態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、式(XXXII)～(XXXV)のいずれかに示す構造の基から選択される二価または三価分岐リンカーにコンジュゲートする。
〔式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂおよびｑ５Ｃは、各場合独立して、０～２０を表し、ここで、反復単位は同一でも異なってもよく；
Ｐ^２Ａ、Ｐ^２Ｂ、Ｐ^３Ａ、Ｐ^３Ｂ、Ｐ^４Ａ、Ｐ^４Ｂ、Ｐ^５Ａ、Ｐ^５Ｂ、Ｐ^５Ｃ、Ｔ^２Ａ、Ｔ^２Ｂ、Ｔ^３Ａ、Ｔ^３Ｂ、Ｔ^４Ａ、Ｔ^４Ｂ、Ｔ^４Ａ、Ｔ^５Ｂ、Ｔ^５Ｃは、各場合独立して、非存在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ(Ｏ)、ＮＨＣ(Ｏ)、ＣＨ_２、ＣＨ_２ＮＨまたはＣＨ_２Ｏであり；
Ｑ^２Ａ、Ｑ^２Ｂ、Ｑ^３Ａ、Ｑ^３Ｂ、Ｑ^４Ａ、Ｑ^４Ｂ、Ｑ^５Ａ、Ｑ^５Ｂ、Ｑ^５Ｃは、各場合独立して、非存在、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで、１以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ(Ｏ)、ＳＯ_２、Ｎ(Ｒ^Ｎ)、Ｃ(Ｒ’)＝Ｃ(Ｒ’’)、Ｃ≡ＣまたはＣ(Ｏ)の１以上で中断または終了してよく；
Ｒ^２Ａ、Ｒ^２Ｂ、Ｒ^３Ａ、Ｒ^３Ｂ、Ｒ^４Ａ、Ｒ^４Ｂ、Ｒ^５Ａ、Ｒ^５Ｂ、Ｒ^５Ｃは、各場合独立して、非存在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ_２、Ｃ(Ｏ)Ｏ、Ｃ(Ｏ)ＮＨ、ＮＨＣＨ(Ｒ^ａ)Ｃ(Ｏ)、－Ｃ(Ｏ)－ＣＨ(Ｒ^ａ)－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
またはヘテロシクリルであり；
Ｌ^２Ａ、Ｌ^２Ｂ、Ｌ^３Ａ、Ｌ^３Ｂ、Ｌ^４Ａ、Ｌ^４Ｂ、Ｌ^５Ａ、Ｌ^５ＢおよびＬ^５Ｃはリガンドを表し；すなわち、各場合、各々独立して、単糖(例えばＧａｌＮＡｃ)、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖または多糖であり；そしてＲ^ａはＨまたはアミノ酸側鎖である。〕
三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、標的遺伝子の発現阻害のためのＲＮＡｉ剤で使用するのに特に有用であり、例えば、式(XXXV)
〔式中、Ｌ^５Ａ、Ｌ^５ＢおよびＬ^５ＣはＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す。〕
である。 In certain embodiments, the dsRNA of the invention is conjugated to a bivalent or trivalent branched linker selected from the group of structures shown in any of formulas (XXXII) to (XXXV).
[During the ceremony,
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B and q5C, independently in each occurrence, represent 0 to 20, where the repeat units may be the same or different;
^P2A ,^P2B , P3A,^P3B ,^P4A ,^P4B ,^P5A ,^P5B ,^P5C ,^T2A ,^T2B ,^T3A ,^T3B ,^T4A ,^T4B ,^T4A ,^T5B ,^T^5C is in each case independently absent, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O),_CH2 ,_CH2NH or_CH2O ;
Q^2A , Q^2B , Q^3A , Q^3B , Q^4A , Q^4B , Q^5A , Q^5B , Q^5C are, independently at each occurrence, absent, alkylene, or substituted alkylene, where one or more methylenes may be interrupted or terminated by one or more of O, S, S(O), SO₂ , N(^RN ), C(R')=C(R'', C≡C, or C(O);
R^2A , R^2B , R^3A , R^3B , R^4A , R^4B , R^5A , R^5B , R^5C are independently in each case absent, NH, O, S, CH₂ , C(O)O, C(O)NH, NHCH(R^a )C(O), -C(O)-CH(R^a )-NH-, CO, CH=N-O,
or heterocyclyl;
^L2A ,^L2B ,^L3A ,^L3B ,^L4A ,^L4B ,^L5A ,^L5B and^L5C represent a ligand; i.e., each occurrence is independently a monosaccharide (e.g., GalNAc), a disaccharide, a trisaccharide, a tetrasaccharide, an oligosaccharide or a polysaccharide; and R^a is H or an amino acid side chain.
Trivalent conjugated GalNAc derivatives are particularly useful for use in RNAi agents for inhibiting expression of target genes, for example, those represented by formula (XXXV):
[In the formula,^L5A ,^L5B and^L5C represent monosaccharides such as GalNAc derivatives.]
It is.

適当な二価および三価分岐リンカー群コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体の適当な例は、式II、VII、XI、ＸおよびXIIIとして上記の構造を含むが、これらに限定されない。Suitable examples of suitable bivalent and trivalent branched linker group conjugate GalNAc derivatives include, but are not limited to, the structures shown above as formulas II, VII, XI, X and XIII.

ＲＮＡコンジュゲートの製造を教示する代表的米国特許は、米国特許４,８２８,９７９；４,９４８,８８２；５,２１８,１０５；５,５２５,４６５；５,５４１,３１３；５,５４５,７３０；５,５５２,５３８；５,５７８,７１７、５,５８０,７３１；５,５９１,５８４；５,１０９,１２４；５,１１８,８０２；５,１３８,０４５；５,４１４,０７７；５,４８６,６０３；５,５１２,４３９；５,５７８,７１８；５,６０８,０４６；４,５８７,０４４；４,６０５,７３５；４,６６７,０２５；４,７６２,７７９；４,７８９,７３７；４,８２４,９４１；４,８３５,２６３；４,８７６,３３５；４,９０４,５８２；４,９５８,０１３；５,０８２,８３０；５,１１２,９６３；５,２１４,１３６；５,０８２,８３０；５,１１２,９６３；５,２１４,１３６；５,２４５,０２２；５,２５４,４６９；５,２５８,５０６；５,２６２,５３６；５,２７２,２５０；５,２９２,８７３；５,３１７,０９８；５,３７１,２４１、５,３９１,７２３；５,４１６,２０３、５,４５１,４６３；５,５１０,４７５；５,５１２,６６７；５,５１４,７８５；５,５６５,５５２；５,５６７,８１０；５,５７４,１４２；５,５８５,４８１；５,５８７,３７１；５,５９５,７２６；５,５９７,６９６；５,５９９,９２３；５,５９９,９２８および５,６８８,９４１；６,２９４,６６４；６,３２０,０１７；６,５７６,７５２；６,７８３,９３１；６,９００,２９７；７,０３７,６４６；８,１０６,０２２を含むが、これらに限定されず、これら各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。Representative U.S. patents that teach the preparation of RNA conjugates include U.S. Patents 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5 ,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,2 14,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585 ,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 and 5,688,941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 6,783,931; 6,900,297; 7,037,646; 8,106,022, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

ある化合物の全位置が均一に修飾される必要はなく、実際１を超える前記修飾を、ｉＲＮＡ内の単一化合物または単一ヌクレオシドに取り込み得る。本発明はまた、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も含む。It is not necessary that all positions of a compound be uniformly modified, and in fact more than one of the above modifications may be incorporated into a single compound or a single nucleoside within an iRNA. The present invention also includes iRNA compounds that are chimeric compounds.

本発明の状況における「キメラ」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ」は、各々少なくとも一つの単量体単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドからなる、２以上の化学的に異なる領域を含む、ｉＲＮＡ化合物、好ましくはｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、一般にｉＲＮＡにヌクレアーゼ分解に対する抵抗性増加、細胞取り込み増加または標的核酸に対する結合親和性増加を付与するように、ＲＮＡが修飾されている、少なくとも一つの領域を含む。ｉＲＮＡのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの切断ができる酵素の基質として役立ち得る。例として、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。それ故に、ＲＮａｓｅＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効率を大きく増強する。結果として、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡを使用したとき、短いｉＲＮＡで同等な結果がしばしば得られ得る。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動および、必要であれば、当分野で知られる関連核酸ハイブリダイゼーション技法により日常的に検出できる。A "chimeric" iRNA compound or "chimera" in the context of the present invention is an iRNA compound, preferably a dsRNA, that contains two or more chemically distinct regions, each consisting of at least one monomeric unit, i.e., a nucleotide in the case of a dsRNA compound. These iRNAs generally contain at least one region in which the RNA has been modified to confer increased resistance to nuclease degradation, increased cellular uptake, or increased binding affinity to the target nucleic acid. Additional regions of the iRNA may serve as substrates for enzymes capable of cleaving RNA:DNA or RNA:RNA hybrids. As an example, RNase H is a cellular endonuclease that cleaves the RNA strand of an RNA:DNA duplex. Thus, activation of RNase H results in cleavage of the RNA target, thereby greatly enhancing the efficiency of iRNA inhibition of gene expression. As a result, comparable results can often be obtained with shorter iRNAs when using chimeric dsRNAs compared to phosphorothioate deoxy dsRNAs hybridizing to the same target region. Cleavage of the RNA target can be routinely detected by gel electrophoresis and, if necessary, associated nucleic acid hybridization techniques known in the art.

ある場合、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基で修飾され得る。多数の非リガンド分子が、ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強するためにｉＲＮＡにコンジュゲートされており、このようなコンジュゲーションを実施する方法は、科学文献から入手可能である。このような非リガンド部分は、脂質部分、例えばコレステロール(Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553)、コール酸(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053)、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49)、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１,２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969)またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229)またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)を含む。このようなＲＮＡコンジュゲートを教示する代表的米国特許は、上に記載する。典型的コンジュゲーションプロトコールは、配列の一か所以上にアミノリンカーを担持するＲＮＡの合成を含む。次いで、アミノ基を、適切なカップリングまたは活性化剤を使用して、コンジュゲートする分子と反応させる。コンジュゲーション反応は、固体支持体になお結合しているＲＮＡで、またはＲＮＡの切断後溶液相で実施し得る。ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製は、一般に純粋コンジュゲートを提供する。In some cases, the RNA of an iRNA may be modified with a non-ligand group. Numerous non-ligand molecules have been conjugated to iRNAs to enhance the activity, cellular distribution, or cellular uptake of the iRNA, and methods for performing such conjugation are available in the scientific literature. Such non-ligand moieties include lipid moieties, such as cholesterol (Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), cholic acid (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), thioethers, such as hexyl-S-tritylthiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), thiocholesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), aliphatic chains such as dodecanediol or undecyl residues (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), phospholipids such as di-hexadecyl-rac-glycerol or triethylammonium 1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonate (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), polyamines or polyethylene glycol chains (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969) or adamantane acetic acid (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), palmityl moiety (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229) or octadecylamine or hexylamino-carbonyl-oxycholesterol moiety (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Representative U.S. patents teaching such RNA conjugates are set forth above. A typical conjugation protocol involves the synthesis of an RNA bearing an amino linker at one or more positions in the sequence. The amino group is then reacted with the molecule to be conjugated using an appropriate coupling or activating agent. The conjugation reaction can be carried out with the RNA still bound to the solid support or in solution phase after cleavage of the RNA. Purification of the RNA conjugate by HPLC generally provides a pure conjugate.

iii. 本発明のｉＲＮＡの送達
本発明のｉＲＮＡの細胞、例えば、ＨＢＶに感染したヒト対象などの対象内の細胞への送達は、多数の種々の方法により達成され得る。送達は、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物の対象への投与により、直接的にも実施され得る。あるいは、インビボ送達を、ｉＲＮＡをコードし、発現を指示する１以上のベクターの投与により、間接的にも実施し得る。これらの選択肢を、さらに下に記載する。iii. Delivery of the iRNA of the invention Delivery of the iRNA of the invention to cells, e.g., cells in a subject, such as a human subject infected with HBV, can be accomplished in a number of different ways. Delivery can be performed directly, by administration of a composition containing the iRNA, e.g., dsRNA, to the subject. Alternatively, in vivo delivery can be performed indirectly, by administration of one or more vectors that encode and direct the expression of the iRNA. These options are described further below.

一般に、核酸分子(インビトロまたはインビボ)を送達するあらゆる方法を、本発明のｉＲＮＡでの使用のために適応し得る(例えば、引用により全体として本明細書に包含させるAkhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144およびＷＯ９４０２５９５参照)。インビボ送達について、ｉＲＮＡ分子の送達のために考慮すべき因子は、例えば、送達分子の生物学的安定性、不特定の効果の予防および標的組織への送達分子の蓄積である。疾患処置のためのｉＲＮＡの全身投与するためには、ＲＮＡを修飾するか、または薬物送達系を使用して送達される；両方法は、インビボでのエンドおよびエキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの速やかな分解を阻止する。ＲＮＡの修飾または医薬担体の使用も、標的組織へのｉＲＮＡ組成物のターゲティングを可能とし、望ましくないオフターゲット効果を回避し得る。ｉＲＮＡ分子を、細胞取り込みを増強し、分解を阻止するために、コレステロールなどの親油性基への化学コンジュゲーションにより修飾し得る。別の実施態様において、ｉＲＮＡを、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソームまたはカチオン性送達系などの薬物送達系を使用して送達し得る。正荷電カチオン性送達系は、ｉＲＮＡ分子(負荷電)の結合を促進し、負に荷電した細胞膜での相互作用を増強して、細胞によるｉＲＮＡの効率的取り込みを可能とする。カチオン性脂質、デンドリマーまたはポリマーはｉＲＮＡに結合するかまたは小胞もしくはミセルの形成を誘発することができる(例えば、Kim SH., et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116参照)。小胞またはミセルの形成は、全身投与されたとき、ｉＲＮＡの分解をさらに阻止する。カチオン性ｉＲＮＡ複合体の製造および投与の方法は、十分に当業者の能力の範囲内である(例えば、引用により全体として本明細書に包含させる、Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205参照)。ｉＲＮＡの全身送達に有用な薬物送達系のいくつかの非限定的例は、ＤＯＴＡＰ(Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN., et al (2003), supra)、オリゴフェクタミン、「固体核酸脂質粒子」(Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114)、カルジオリピン(Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091)、ポリエチレンイミン(Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659)、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ(ＲＧＤ)ペプチド(Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487)およびポリアミドアミン(Tomalia, DA., et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804)を含む。ある実施態様において、ｉＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、引用により全体として本明細書に包含させる、米国特許７,４２７,６０５にみることができる。ある実施態様において、ｉＲＮＡ剤を、ｐＨ依存性エンドソーム脱出を促進するために、両親媒性ペプチドと投与し得る(例えば、引用により本明細書に包含させる、Bartz et al., 2011. Biochem. J. 435:475-87参照)。In general, any method of delivering a nucleic acid molecule (in vitro or in vivo) can be adapted for use with the iRNA of the present invention (see, e.g., Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 and WO9402595, which are incorporated herein by reference in their entirety). For in vivo delivery, factors to consider for delivery of iRNA molecules are, for example, the biological stability of the delivered molecule, prevention of unspecific effects, and accumulation of the delivered molecule in the target tissue. For systemic administration of iRNA for disease treatment, the RNA is modified or delivered using a drug delivery system; both methods prevent the rapid degradation of dsRNA by endo- and exonucleases in vivo. Modification of the RNA or the use of pharmaceutical carriers can also allow targeting of iRNA compositions to target tissues and avoid undesirable off-target effects. The iRNA molecule can be modified by chemical conjugation to lipophilic groups, such as cholesterol, to enhance cellular uptake and prevent degradation. In another embodiment, iRNA can be delivered using drug delivery systems such as nanoparticles, dendrimers, polymers, liposomes, or cationic delivery systems. Positively charged cationic delivery systems promote the binding of iRNA molecules (negatively charged) and enhance the interaction with the negatively charged cell membrane, allowing for efficient uptake of iRNA by cells. Cationic lipids, dendrimers, or polymers can bind to iRNA or induce the formation of vesicles or micelles (see, for example, Kim SH., et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116). The formation of vesicles or micelles further prevents the degradation of iRNA when administered systemically. Methods for preparation and administration of cationic iRNA complexes are well within the capabilities of one of ordinary skill in the art (see, e.g., Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205, which are incorporated herein by reference in their entireties). Some non-limiting examples of drug delivery systems useful for systemic delivery of iRNA include DOTAP (Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN., et al (2003), supra), oligofectamine, "solid nucleic acid lipid particles" (Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114), cardiolipin (Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), polyethylenimine (Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), Arg-Gly-Asp (RGD) peptides (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487), and polyamidoamines (Tomalia, D. A., et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804). In some embodiments, the iRNA is complexed with cyclodextrin for systemic administration. Methods of administration and pharmaceutical compositions of iRNA and cyclodextrin can be found in U.S. Patent 7,427,605, which is incorporated herein by reference in its entirety. In certain embodiments, the iRNA agent can be administered with an amphipathic peptide to promote pH-dependent endosomal escape (see, e.g., Bartz et al., 2011. Biochem. J. 435:475-87, incorporated herein by reference).

１. 本発明で使用するためのベクターコード化ｉＲＮＡ
ＨＢＶ遺伝子を標的とするｉＲＮＡを、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入した転写単位から発現させ得る(例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al.、ＷＯ００／２２１１３、ＷＯ００／２２１１４および米国特許６,０５４,２９９参照)。ＨＢＶを標的とするｓｈＲＮＡの発現のための例示的発現ベクターはMichler et al., 2016に提供され、これは、(ｉ)肝臓特異的プロモーター下に人工マイ(クロ)ＲＮＡ内に包埋されたｓｈＲＮＡ；(ii)過剰ＲＮＡｉトリガーでの飽和が毒性となり得る律速細胞因子である共発現アルゴノート－２；または(iii)オフターゲット遺伝子制御を抑えるためのｓｈＲＮセンス鎖に対する共送達デコイ(「ＴｕＤ」)を含む、送達のためのアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)８ベクターを開示する。細胞培養試験で使用されたｓｈＲＮＡｓｈＨＢＶ４～７を発現するプラスミドは、Grimm et al, 2006(Nature 441: 537 - 541)により先に報告された、Ｈ１プロモーター、続くオリゴヌクレオチド挿入のための２つのＢｂｓＩ部位およびＲＳＶプロモーターを含む、自己相補性ＡＡＶベクタープラスミドへの各ｓｈＲＮＡコード化オリゴヌクレオチドの直接挿入によりクローン化された。このような構築物も、発現ベクターのために適切にサイズ調製されるならば、ワクチン抗原の発現にも使用し得る。1. Vectors encoding iRNA for use in the present invention
iRNAs targeting HBV genes can be expressed from transcription units inserted into DNA or RNA vectors (see, e.g., Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., WO 00/22113, WO 00/22114, and U.S. Patent 6,054,299). Exemplary expression vectors for expression of shRNAs targeting HBV are provided in Michler et al., 2016, which discloses adeno-associated virus (AAV) 8 vectors for delivery that include (i) an shRNA embedded within an artificial micro(clo)RNA under a liver-specific promoter; (ii) co-expressed Argonaute-2, a rate-limiting cellular factor whose saturation with excess RNAi triggers can be toxic; or (iii) a co-delivered decoy ("TuD") against the shRN sense strand to suppress off-target gene regulation. The plasmids expressing shRNA shHBV4-7 used in the cell culture studies were cloned by direct insertion of each shRNA-encoding oligonucleotide into a self-complementary AAV vector plasmid containing an H1 promoter followed by two BbsI sites for oligonucleotide insertion and an RSV promoter, as previously reported by Grimm et al., 2006 (Nature 441: 537-541). Such constructs can also be used for expressing vaccine antigens if appropriately sized for the expression vector.

発現は、使用する特定の構築物および標的組織または細胞型により、一過性(数日～数週間)または持続性(数週間から数か月またはそれ以上)であり得る。これらの導入遺伝子は、直線状構築物、環状プラスミドまたは、統合もしくは非統合ベクターであり得るウイルスベクターとして導入できる。導入遺伝子はまた、染色体外プラスミドとして遺伝性であることを可能にするようにも、構築され得る(Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292)。Expression can be transient (days to weeks) or persistent (weeks to months or longer) depending on the particular construct used and the target tissue or cell type. These transgenes can be introduced as linear constructs, circular plasmids, or viral vectors that can be integrating or non-integrating vectors. Transgenes can also be constructed to allow them to be heritable as extrachromosomal plasmids (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).

ｉＲＮＡの個々の鎖または複数の鎖は、発現ベクターでプロモーターから転写される。２つの別々の鎖が、例えば、ｄｓＲＮＡの産生のために、発現されるとき、２つの別々の発現ベクターは、標的細胞に共導入され得る(例えば、トランスフェクションまたは感染による)。あるいは、ｄｓＲＮＡの各個々の鎖を、両者が同じ発現プラスミドに位置する、プロモーターにより転写させ得る。ある実施態様において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが幹およびループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列により連結された、逆方向反復ポリヌクレオチドとして発現させ得る。The individual strand or strands of the iRNA are transcribed from a promoter in an expression vector. When two separate strands are expressed, for example, for the production of dsRNA, two separate expression vectors can be co-introduced into a target cell (e.g., by transfection or infection). Alternatively, each individual strand of the dsRNA can be transcribed by a promoter, both located on the same expression plasmid. In some embodiments, the dsRNA can be expressed as an inverted repeat polynucleotide linked by a linker polynucleotide sequence such that the dsRNA has a stem and loop structure.

ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核生物細胞と、好ましくは脊椎動物細胞と適合性の発現ベクターを使用して、ここに記載するｉＲＮＡの発現のための組み換え構築物を産生できる。真核生物細胞発現ベクターは、当分野で周知であり、多数の商業的供給源から入手可能である。一般に、このようなベクターは、所望の核酸セグメントの挿入のための簡便な制限部位を含んで提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、皮下、静脈内または筋肉内投与によるなど全身性であり得る。このようなベクターはまた、核酸ベースのワクチンからのウイルス抗原発現にも使用し得る。The iRNA expression vector is generally a DNA plasmid or a viral vector. Expression vectors compatible with eukaryotic cells, and preferably vertebrate cells, can be used to generate recombinant constructs for expression of the iRNAs described herein. Eukaryotic cell expression vectors are well known in the art and are available from a number of commercial sources. Generally, such vectors are provided containing convenient restriction sites for insertion of the desired nucleic acid segment. Delivery of the iRNA expression vector can be systemic, such as by subcutaneous, intravenous or intramuscular administration. Such vectors can also be used for viral antigen expression from nucleic acid-based vaccines.

ここに開示する方法および組成物で利用され得るウイルスベクター系は、(ａ)アデノウイルスベクター；(ｂ)レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどを含むがこれに限定されないレトロウイルスベクター；(ｃ)アデノ随伴ウイルスベクター；(ｄ)単純ヘルペスウイルスベクター；(ｅ)ＳＶ４０ベクター；(ｆ)ポリオーマウイルスベクター；(ｇ)乳頭腫ウイルスベクター；(ｈ)ピコルナウイルスベクター；(ｉ)オルソポックス、例えば、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａベクターを含むワクシニアウイルスベクターまたはトリポックス、例えばカナリアポックスまたは鶏痘などのポックスウイルスベクター；および(ｊ)ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスを含むが、これらに限定されない。複製欠損ウイルスもまた有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムに取り込まれるようになるか、または取り込まれない。構築物は、所望により、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。あるいは、構築物を、エピソーム複製が可能なベクター、例えばＥＰＶおよびＥＢＶベクターに取り込み得る。ｉＲＮＡまたはＨＢＶ抗原の組み換え発現のための構築物は、一般に、標的細胞でのｉＲＮＡの発現を確実にするために、制御要素、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを必要とする。ベクターおよび構築物について考慮される他の態様を、さらに下に記載する。Viral vector systems that may be utilized in the methods and compositions disclosed herein include, but are not limited to, (a) adenovirus vectors; (b) retrovirus vectors, including but not limited to lentivirus vectors, Moloney murine leukemia virus, and the like; (c) adeno-associated virus vectors; (d) herpes simplex virus vectors; (e) SV 40 vectors; (f) polyoma virus vectors; (g) papilloma virus vectors; (h) picornavirus vectors; (i) orthopox, e.g., vaccinia virus vectors, including modified vaccinia virus Ankara vectors, or poxvirus vectors, e.g., canarypox or fowlpox, such as avian pox; and (j) helper-dependent or gutless adenoviruses. Replication-deficient viruses may also be advantageous. Different vectors may or may not become integrated into the genome of the cell. The constructs may optionally include viral sequences for transfection. Alternatively, the constructs may be integrated into vectors capable of episomal replication, e.g., EPV and EBV vectors. Constructs for recombinant expression of iRNA or HBV antigens generally require control elements, such as promoters, enhancers, etc., to ensure expression of the iRNA in target cells. Other aspects of the vectors and constructs considered are described further below.

このような構築物およびベクターは、発現ベクターのために適切にサイズ調製されるならば、ワクチン抗原の発現にも使用し得る。このような制限は、当業者には十分理解される。Such constructs and vectors, if appropriately sized for expression vectors, may also be used for expression of vaccine antigens. Such limitations are well understood by those skilled in the art.

Ｂ. 本発明の方法で使用するための治療ＨＢＶワクチン
本発明のレジメンおよび方法で使用する治療ＨＢＶワクチンは、１以上のＨＢＶタンパク質に対して、免疫応答、好ましくはエフェクターＴ細胞誘発応答を誘発する、ペプチドワクチン、ベクターベースのワクチンを含むＤＮＡワクチンまたは細胞ベースのワクチンである。好ましくは、ワクチンは、複数のＨＢＶ血清型、好ましくは全ＨＢＶ血清型と交差反応する多エピトープワクチンである。B. Therapeutic HBV Vaccines for Use in the Methods of the Invention Therapeutic HBV vaccines for use in the regimens and methods of the invention are peptide vaccines, DNA vaccines, including vector-based vaccines, or cell-based vaccines that induce an immune response, preferably an effector T cell eliciting response, against one or more HBV proteins. Preferably, the vaccine is a multi-epitope vaccine that cross-reacts with multiple HBV serotypes, preferably all HBV serotypes.

治療ワクチンは、既に確立された病原体感染を認識し、制御または排除するように患者の免疫系を活性化するために設計される。これは、侵入病原体の迅速な抗体介在中和を促進するように設計される、予防ワクチン接種と異なる。肝炎、ヘルペスまたは乳頭腫ウイルスなどの持続性ウイルスの制御および排除は、多特異的および多機能的エフェクターＴ細胞応答を必要とする。これらのＴ細胞応答は、理想的には連続して発現されるウイルス抗原に指向し、病原体を抑制し続ける。治療ワクチンは、多数の慢性感染について開発中である。Ｂ型肝炎ウイルス感染は、慢性Ｂ型肝炎の自然免疫介在回復およびウイルスの排除が、ごく稀に観察されているため、治療ワクチン接種による処置の候補である。Therapeutic vaccines are designed to activate the patient's immune system to recognize and control or eliminate an already established pathogen infection. This differs from prophylactic vaccination, which is designed to promote rapid antibody-mediated neutralization of the invading pathogen. The control and elimination of persistent viruses such as hepatitis, herpes or papilloma viruses requires polyspecific and polyfunctional effector T cell responses. These T cell responses are ideally directed against continuously expressed viral antigens and keep the pathogen in check. Therapeutic vaccines are in development for many chronic infections. Hepatitis B virus infection is a candidate for treatment by therapeutic vaccination, as innate immune-mediated recovery and viral elimination of chronic hepatitis B has been observed in very rare cases.

強固なＴ細胞応答が、ＨＢＶ治癒の達成に必要であると考えられる。ＨＢＶ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＨＢＶ感染が回復した患者で容易に検出可能であるが、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞は稀であり、慢性Ｂ型肝炎ではおそらく大量の循環ウイルスＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇにより、機能的に損傷されている。Ｔ細胞は、細胞毒性活性によりＨＢＶ感染細胞を排除するが、非細胞溶解性様式でＨＢＶ遺伝子の発現および複製も制御する。A robust T cell response appears to be necessary to achieve HBV cure. HBV-specific CD4+ and CD8+ T cell responses are readily detectable in patients with resolved HBV infection, but HBV-specific T cells are rare and functionally impaired in chronic hepatitis B, presumably due to the large amounts of circulating viral HBeAg and HBsAg. T cells eliminate HBV-infected cells by cytotoxic activity, but also control HBV gene expression and replication in a non-cytolytic manner.

慢性Ｂ型肝炎の免疫寛容を克服する目的で、エフェクターＴ細胞応答を誘発するためのＤＮＡもしくはペプチドワクチンまたはベクターもしくは細胞ベースのワクチンを使用する、前臨床モデルで、種々のアプローチが試験されている。十分に異なるＨＢＶ遺伝子型および最も頻繁なＨＬＡ型をカバーする多エピトープ治療ワクチン候補が開発されている。適切なペプチド提示は示されているが、免疫原性は限定的であり、この経過は臨床では反映されなかった。非包括的一覧を下の表に示す。With the aim of overcoming immune tolerance in chronic hepatitis B, different approaches have been tested in preclinical models using DNA or peptide vaccines or vector or cell-based vaccines to induce effector T cell responses. Multi-epitope therapeutic vaccine candidates covering sufficiently different HBV genotypes and the most frequent HLA types have been developed. Although adequate peptide presentation has been demonstrated, immunogenicity was limited and this progression was not translated to the clinic. A non-comprehensive list is given in the table below.

既存の予防ワクチンは、慢性感染患者のＨＢＶ特異的免疫を回復するために提供されているが、機能的治癒の提供には失敗している。これらのウイルス成分粒子ベースのワクチンは、慢性ヘパドナウイルス感染の動物モデルでＨＢＶ複製を減少できたが、慢性Ｂ型肝炎の患者では成功していない。ミョウバンをアジュバントとする、抗原－抗体(ＨＢｓＡｇ－ＨＢＩＧ)免疫原性複合体治療ワクチン候補は、最初は、二重盲験式、ブラセボ対照、フェーズIIｂ臨床試験で有望な結果を示したが、４５０名の患者を含むフェーズIII臨床試験は期待外れであった。これは、ミョウバンベースのアジュバントを用いるウイルス成分粒子ワクチンが予防ワクチンとして設計され、優先的に抗体を誘発するが、治療有効性に必要である細胞毒性Ｔ細胞応答は誘発しないとの事実による可能性が高い。Existing prophylactic vaccines have been offered to restore HBV-specific immunity in chronically infected patients but have failed to provide a functional cure. These split virus particle-based vaccines have been able to reduce HBV replication in animal models of chronic hepadnavirus infection but have not been successful in patients with chronic hepatitis B. An alum-adjuvanted antigen-antibody (HBsAg-HBIG) immunogenic complex therapeutic vaccine candidate initially showed promising results in a double-blind, placebo-controlled, Phase IIb clinical trial, but a Phase III clinical trial involving 450 patients was disappointing. This is likely due to the fact that the split virus particle vaccine with an alum-based adjuvant was designed as a prophylactic vaccine and preferentially induces antibody but not cytotoxic T cell responses that are necessary for therapeutic efficacy.

あるいは、ＨＢＶエンベロープタンパク質をコードするＤＮＡワクチンは、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞を誘発するよう設計されたが、成功は限定的であった。ＤＮＡベースのワクチンが抗体応答をほとんど誘発しないため、ＨＢｅＡｇまたはＨＢｓＡｇセロコンバージョンの達成に失敗する。ＨＢＶエンベロープタンパク質をコードするＨＢＶｐｒｅＳ／Ｓ領域を包含する、別のＤＮＡプライム、ポックスウイルス－ブーストワクチンはチンパンジーで有望な結果を示したが、また臨床フェーズIIａ治験で失敗し、慢性ＨＢＶ保菌者で持続性Ｔ細胞応答もウイルス血症減少も誘発しなかった。Ｔ細胞補助または十分広い、多特異的免疫応答の誘発に失敗している可能性がある。Alternatively, DNA vaccines encoding HBV envelope proteins have been designed to induce HBV-specific T cells, but with limited success. DNA-based vaccines induce little antibody response and therefore fail to achieve HBeAg or HBsAg seroconversion. Another DNA prime, poxvirus-boost vaccine, encompassing the HBV preS/S region encoding the HBV envelope proteins, showed promising results in chimpanzees but also failed in a clinical Phase IIa trial, eliciting neither sustained T cell responses nor a reduction in viremia in chronic HBV carriers. This may be due to a failure to induce T cell help or a broad enough, polyspecific immune response.

当分野で知られるあらゆるワクチンが、ここに提供する方法およびレジメンに使用され得る。好ましい実施態様は、実施例に提供され、かつＰＣＴ公開ＷＯ２０１７／１２１７９１(その内容を全体として引用により本明細書に包含させる)に提供される、２回投与するタンパク質抗原および１回投与する核酸ワクチンのプライム－ブーストワクチン接種スキームを含む。上記のとおり、ワクチンにおけるタンパク質抗原の配列および核酸ベースのワクチンによりコード化されるアミノ酸配列は必ずしも同一ではない。それらは、これらワクチンの連続的投与が所望のプライム－ブースト効果を有するように、単に少なくとも一つのエピトープ、好ましくは複数エピトープを共有しなければならない。さらに、ここに記載するとおり、好ましい実施態様において、ここに提供する処置レジメンは、複数の、全てではないにしても、ＨＢＶ血清型にわたり効果的な処置レジメンを提供する。それ故に、対象に送達される抗原は、対象に感染しているＨＢＶウイルスにより発現される抗原と同一の抗原配列を有さなくてよい。Any vaccine known in the art may be used in the methods and regimens provided herein. A preferred embodiment includes a prime-boost vaccination scheme of two doses of protein antigen and one dose of nucleic acid vaccine, as provided in the Examples and in PCT Publication WO2017/121791, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety. As noted above, the sequences of the protein antigens in the vaccine and the amino acid sequences encoded by the nucleic acid-based vaccine are not necessarily identical. They simply must share at least one epitope, preferably multiple epitopes, such that sequential administration of these vaccines has the desired prime-boost effect. Furthermore, as described herein, in a preferred embodiment, the treatment regimes provided herein provide an effective treatment regime across multiple, if not all, HBV serotypes. Thus, the antigen delivered to the subject may not have the same antigen sequence as the antigen expressed by the HBV virus infecting the subject.

決定基として知られる、ＨＢＶ抗原のある部分が、ＨＢＶへの感染の最初の免疫応答の間に産生される抗体の主標的であることは知られる。例えば、ＨＢｓＡｇは、２２６アミノ酸遺伝子(配列番号８または２２)の主要親水性領域(ＭＨＲ、アミノ酸１００～１６９)内のアミノ酸１２４～１４７に位置する「1個の」決定基エピトープを有する。この「１個の」決定基は、急性Ｂ型肝炎の最初の免疫応答の間の抗ＨＢｓ抗体の主標的の一つである。ある実施態様において、ＨＢｓＡｇの免疫原性フラグメントは、完全長タンパク質と比較して小さなエンベロープタンパク質(配列番号２３)のアミノ酸位置に対応する、少なくともアミノ酸９９～１６８を含む(例えば、Lada et al., J. Virol.(2006) 80:2968-2975参照；この内容を全体として引用により本明細書に包含させる)。It is known that certain portions of HBV antigens, known as determinants, are the primary targets of antibodies produced during the initial immune response to HBV infection. For example, HBsAg has a "single" determinant epitope located at amino acids 124-147 within the major hydrophilic region (MHR, amino acids 100-169) of the 226 amino acid gene (SEQ ID NO: 8 or 22). This "single" determinant is one of the primary targets of anti-HBs antibodies during the initial immune response to acute hepatitis B. In one embodiment, an immunogenic fragment of HBsAg includes at least amino acids 99-168, which correspond to the amino acid positions of the smaller envelope protein (SEQ ID NO: 23) compared to the full-length protein (see, e.g., Lada et al., J. Virol. (2006) 80:2968-2975, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety).

同様に、決定基は、ＨＢｃＡｇで同定されている(例えば、Salfeld et al., J. Virol. (1989) 63:798-808参照; この内容を全体として引用により本明細書に包含させる)。完全長コアタンパク質は、１８３アミノ酸長であり、集合ドメイン(アミノ酸１～１４９)および核酸結合ドメイン(アミノ酸１５０～１８３)からなる。３つの異なる主要決定基が特徴づけられている。集合コア(ＨＢｃ)および直線状ＨＢｅ関連決定基(ＨＢｅｌ)のＨＢｃ抗原性を担う単一立体構造決定基は、いずれもアミノ酸８０付近の重複親水性配列にマッピングされた；第二ＨＢｅ決定基(ＨＢｅ２)は、アミノ酸１３８の近傍の位置に割り当てられたが、その抗原性のために、アミノ酸１０～１４０の伸張配列の分子内関与が必要であることが判明した。一般に、このような免疫原性フラグメントは、完全長コアタンパク質と比較して、配列番号２４に示す配列位置に対応して、少なくともアミノ酸１８～１４３を含む。類似配列が配列番号１０で同定され得る。Similarly, determinants have been identified in HBcAg (see, e.g., Salfeld et al., J. Virol. (1989) 63:798-808; the entire contents of which are incorporated herein by reference). The full-length core protein is 183 amino acids long and consists of an assembly domain (amino acids 1-149) and a nucleic acid binding domain (amino acids 150-183). Three distinct major determinants have been characterized. The single conformational determinants responsible for HBc antigenicity, the assembly core (HBc) and the linear HBe-associated determinant (HBel), both mapped to overlapping hydrophilic sequences near amino acid 80; the second HBe determinant (HBe2) was assigned to a position near amino acid 138 but was found to require intramolecular participation of a stretch of sequence from amino acids 10-140 for its antigenicity. Generally, such immunogenic fragments contain at least amino acids 18-143, corresponding to the sequence positions shown in SEQ ID NO:24, as compared to the full-length core protein. Similar sequences can be identified in SEQ ID NO:10.

好ましい実施態様において、ワクチンは、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｃＡｇの少なくとも一つの決定基を含むアミノ酸配列を含むかまたはアミノ酸配列をコードする。特に、ある実施態様において、ＨＢｓＡｇを標的とするワクチンは、少なくともＨＢｓＡｇのアミノ酸１２７～１４７のアミノ酸配列を含み、例えば、小エンベロープタンパク質(配列番号２３)のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸９９～１６８を含む。ある実施態様において、親水性配列を標的とするワクチンは、少なくともＨＢｃＡｇのアミノ酸８０付近またはアミノ酸８０またはアミノ酸１３８を含む配列番号４３の少なくともアミノ酸１３８付近のアミノ酸配列、例えば、少なくとも４０アミノ酸部分、少なくとも５０アミノ酸部分、少なくとも６０アミノ酸部分、少なくとも７０アミノ酸部分、少なくとも８０アミノ酸部分、少なくとも９０アミノ酸部分または少なくとも１００アミノ酸部分またはそのコード配列を含む。好ましい実施態様において、ＨＢｃＡｇを標的とする抗原の抗原アミノ配列は、配列番号２４のアミノ酸８０または１３８に対して少なくとも２０アミノ酸Ｎ末端およびＣ末端を含む。ある実施態様において、ＨＢｃＡｇを標的とするワクチンは、少なくともＨＢｓＡｇのアミノ酸１０～１４０または１８～１４３のアミノ酸配列を含む。In a preferred embodiment, the vaccine comprises or codes for an amino acid sequence that comprises at least one determinant of HBsAg or HBcAg. In particular, in one embodiment, the vaccine targeting HBsAg comprises at least the amino acid sequence of amino acids 127-147 of HBsAg, e.g., at least amino acids 99-168 of the amino acid sequence of the small envelope protein (SEQ ID NO:23). In one embodiment, the vaccine targeting a hydrophilic sequence comprises at least an amino acid sequence around amino acid 80 of HBcAg or around at least amino acid 138 of SEQ ID NO:43, including amino acid 80 or amino acid 138, e.g., at least a 40 amino acid portion, at least a 50 amino acid portion, at least a 60 amino acid portion, at least a 70 amino acid portion, at least a 80 amino acid portion, at least a 90 amino acid portion or at least a 100 amino acid portion or a coding sequence thereof. In a preferred embodiment, the antigen amino sequence of the antigen targeting HBcAg comprises at least 20 amino acids N-terminal and C-terminal to amino acid 80 or 138 of SEQ ID NO:24. In one embodiment, the vaccine targeting HBcAg includes at least the amino acid sequence of amino acids 10-140 or 18-143 of HBsAg.

ある実施態様において、ワクチンは、配列番号２２、２３または２４の何れか１以上のアミノ酸配列全体を含むかまたはアミノ酸配列全体をコードする。In some embodiments, the vaccine comprises or encodes the entire amino acid sequence of any one or more of SEQ ID NOs: 22, 23, or 24.

異なるアミノ酸配列をコードする、異なる核酸配列を有するＨＢＶの複数血清型があることは理解される。それ故に、タンパク質ベースのワクチンのアミノ酸配列または核酸ベースのワクチンによりコード化されるアミノ酸配列は、配列番号で提供される配列と１００％同一ではないかもしれない。本発明のある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンのアミノ酸配列または核酸ベースのワクチンによりコード化されるアミノ酸配列は、配列番号２２、２３または２４の一部と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一または少なくとも９８％同一である。さらなる例示的ＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇアミノ酸配列は、配列表に提供される。上記配列におけるＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇ決定基に対応する適切な配列を同定するためのアラインメント方法は当分野で知られる。It is understood that there are multiple serotypes of HBV with different nucleic acid sequences encoding different amino acid sequences. Therefore, the amino acid sequence of a protein-based vaccine or the amino acid sequence encoded by a nucleic acid-based vaccine may not be 100% identical to the sequence provided in a SEQ ID NO. In some embodiments of the invention, the amino acid sequence of a protein-based vaccine or the amino acid sequence encoded by a nucleic acid-based vaccine is at least 90% identical, at least 91% identical, at least 92% identical, at least 93% identical, at least 94% identical, at least 95% identical, at least 96% identical, at least 97% identical, or at least 98% identical to a portion of SEQ ID NO: 22, 23, or 24. Further exemplary HBsAg and HBcAg amino acid sequences are provided in the Sequence Listing. Alignment methods for identifying suitable sequences corresponding to HBsAg and HBcAg determinants in the above sequences are known in the art.

ワクチンは、好ましくはＭＶＡウイルスを、１０^４～１０^９組織培養感染量(ＴＣＩＤ)_５０／mlの濃度範囲、好ましくは１０^５～５×１０^８ＴＣＩＤ_５０／mlの濃度範囲、より好ましくは１０^６～１０^８ＴＣＩＤ_５０／mlの濃度範囲、最も好ましくは１０^７～１０^８ＴＣＩＤ_５０／mlの濃度範囲で含む。 The vaccine preferably comprises the MVA virus in a concentration range of¹⁰ to¹⁰ tissue culture infectious dose (_TCID )/ml, preferably in a concentration range of¹⁰ to^5x10_TCID /ml, more preferably in a concentration range of¹⁰ to¹⁰_TCID /ml, and most preferably in a concentration range of¹⁰ to¹⁰_TCID /ml.

ヒトのための好ましいワクチン接種用量は１０^６～１０^９ＴＣＩＤ_５０を含み、最も好ましくは１０^６ＴＣＩＤ_５０または１０^７ＴＣＩＤ_５０または１０^８ＴＣＩＤ_５０の用量である。 Preferred vaccination doses for humans include between 10⁶ and 10⁹ TCID₅₀ , most preferred are doses of 10⁶ TCID₅₀ or 10⁷ TCID₅₀ or 10⁸ TCID₅₀ .

本発明の好ましい方法は、タンパク質ベースのワクチンおよび核酸ベースのワクチン両者の投与を含む。しかしながら、他の方法は、タンパク質抗原のみの投与を含む。あまり好ましくない実施態様は、抗原コード化核酸のみの投与を含む。Preferred methods of the invention include administration of both protein-based and nucleic acid-based vaccines. However, other methods include administration of protein antigens only. Less preferred embodiments include administration of antigen-encoding nucleic acids only.

ｉ. アジュバント
ここで使用する「アジュバント」は、は、長期保護免疫を誘発するために共に投与される、抗原に対する免疫応答を促進(例えば、増強、加速または延長)する薬剤と理解される。実質的な免疫応答は、アジュバント自体には指向されない。アジュバントは、病原体成分、粒子アジュバントおよび組み合わせアジュバント(www.niaid.nih.gov/research/vaccine-adjuvants-types参照)を含むが、これらに限定されない。病原体成分(例えば、モノホスホリルリピドＡ(ＭＰＬ)、ポリ(Ｉ：Ｃ)、ＣｐＧＤＮＡ、エマルジョン、例えばポリ[ジ(ナトリウムカルボキシレートエチルフェノキシ)ホスファゼン](ＰＣＥＰ))は、自然免疫細胞内または表面上の種々の受容体を標的とすることにより、ワクチンに対する早期非特異的または自然免疫応答の誘発を助け得る。自然免疫系は、適応免疫応答に影響し、これはワクチンが標的とする病原体に対する長期持続性保護を提供する。粒子アジュバント(例えば、ミョウバン、ビロソーム、サイトカイン、例えば、ＩＬ－１２)は、免疫系を刺激でき、また免疫細胞への抗原送達を増強し得る、極めて小さな粒子を形成する。組み合わせアジュバント(例えば、ＡＳ０２、ＡＳ０３およびＡＳ０４(ＧＳＫ)；ＭＦ５９(Novartis)；およびＩＣ３１(登録商標)(Altimmune)は、複数の保護的免疫応答を誘発する。単独で使用したとき中程度の効果を有するアジュバントは、に使用したとき、より強力な免疫応答を誘発し得る。ある実施態様において、好ましいアジュバントは、ｃ－ジ－ＡＭＰ、ｃ－ジ－ＧＭＰ、ｃ－ジ－ＣＭＰ、ポリＩＣＬＣ、ＣｐＧ、ISCOMATRIX(登録商標)、ＡＳ０２、ＡＳ０３、ＡＳ０４またはＲＩＧ－Ｉリガンド、例えば、５’ ３Ｐ－ＲＮＡを含む。ある実施態様において、ＨＢＶ抗原を発現する核酸を伴うまたは伴わないウイルスカプシドをアジュバントとして使用し得る。例えば、ＭＶＡ－のみまたはＤＮＡプライム、ＭＶＡブーストまたはアデノウイルスベクタープライム－ＭＶＡブーストなどのＴ細胞を優先的に刺激するワクチンを、本発明の方法で使用し得る。i. Adjuvants As used herein, "adjuvant" is understood to be an agent that promotes (e.g., enhances, accelerates, or prolongs) the immune response to an antigen with which it is administered to induce long-term protective immunity. The substantial immune response is not directed to the adjuvant itself. Adjuvants include, but are not limited to, pathogen components, particle adjuvants, and combination adjuvants (see www.niaid.nih.gov/research/vaccine-adjuvants-types). Pathogen components (e.g., monophosphoryl lipid A (MPL), poly(I:C), CpG DNA, emulsions such as poly[di(sodium carboxylate ethylphenoxy)phosphazene] (PCEP)) can help induce early non-specific or innate immune responses to the vaccine by targeting various receptors within or on the surface of innate immune cells. The innate immune system influences the adaptive immune response, which provides long-lasting protection against the pathogen targeted by the vaccine. Particulate adjuvants (eg, alum, virosomes, cytokines such as IL-12) form extremely small particles that can stimulate the immune system and enhance antigen delivery to immune cells. Combination adjuvants (e.g., AS02, AS03, and AS04 (GSK); MF59 (Novartis); and IC31® (Altimmune) induce multiple protective immune responses. Adjuvants that have moderate effectiveness when used alone may induce stronger immune responses when used together. In certain embodiments, preferred adjuvants include c-di-AMP, c-di-GMP, c-di-CMP, poly ICLC, CpG, ISCOMATRIX®, AS02, AS03, AS04, or RIG-I ligands, e.g., 5' 3P-RNA. In certain embodiments, viral capsids with or without nucleic acids expressing HBV antigens may be used as adjuvants. For example, vaccines that preferentially stimulate T cells, such as MVA-only or DNA prime, MVA boost, or adenoviral vector prime-MVA boost, may be used in the methods of the invention.

本発明の好ましい実施態様において、本発明で使用するアジュバントは、上記のとおり液性および細胞免疫応答を促進する。ある実施態様において、アジュバントは、バランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２応答を提供する。In a preferred embodiment of the invention, the adjuvants used in the invention promote humoral and cellular immune responses as described above. In one embodiment, the adjuvants provide a balanced Th1/Th2 response.

ii. 非アジュバント免疫刺激剤および付加的薬剤
本発明の方法は、さらにＨＢＶ処置または免疫応答刺激に使用される付加的薬剤の投与を含む。このような薬剤は、免疫刺激剤(例えば、ペグ化インターフェロンアルファ２ａ(ＰＥＧ－ＩＦＮ－α２ａ)、インターフェロンアルファ－２ｂ、組み換えヒトインターロイキン－７およびトール様受容体３、７、８または９(ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９)アゴニスト)、ウイルス侵入阻害剤(例えば、Myrcludex)、ＨＢｓＡｇの分泌または放出を阻害するオリゴヌクレオチド(例えば、ＲＥＰ９ＡＣ)、カプシド阻害剤(例えば、Ｂａｙ４１－４１０９およびＮＶＲ－１２２１)、ｃｃｃＤＮＡ阻害剤(例えば、ＩＨＶＲ－２５)、Ｒｉｇ－Ｉ－リガンド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＨＢＶに対する抗体ベースの免疫療法(ＨＢＶに対する単、二または三特異的抗体)または免疫チェックポイント制御因子を含み得る。このような薬剤は当分野で知られる。ii. Non-Adjuvant Immunostimulating Agents and Additional Agents The methods of the present invention further include administration of additional agents used in treating HBV or stimulating the immune response. Such agents may include immune stimulants (e.g., pegylated interferon alpha 2a (PEG-IFN-α2a), interferon alpha-2b, recombinant human interleukin-7 and toll-like receptor 3, 7, 8 or 9 (TLR3, TLR7, TLR8 or TLR9) agonists), viral entry inhibitors (e.g., Myrcludex), oligonucleotides that inhibit secretion or release of HBsAg (e.g., REP 9AC), capsid inhibitors (e.g., Bay41-4109 and NVR-1221), cccDNA inhibitors (e.g., IHVR-25), Rig-I-ligands, STING agonists, antibody-based immunotherapy against HBV (mono-, bi- or trispecific antibodies against HBV) or immune checkpoint regulators. Such agents are known in the art.

Ｃ. 本発明の方法で使用するためのヌクレオチドおよびヌクレオシドアナログ
ヌクレオチドおよびヌクレオシドアナログは、一般に安全かつ安価と考えられるため、ＨＢＶ感染の標準治療として考えられる。しかしながら、ヌクレオチドおよびヌクレオシドアナログはＨＢＶ感染を治癒できず、耐性の発生を引き起こし得て、無期限に服用する必要がある。ヌクレオチドアナログおよびヌクレオシドアナログは、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩(ＴＤＦ)、テノホビルアラフェナミド、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル(ＥＴＶ)、テルビブジン、ＡＧＸ－１００９、エムトリシタビン、クレブジン、リトナビル、ジピボキシル、ロブカビル、ファムビル、ＦＴＣ、Ｎ－アセチル－システイン(ＮＡＣ)、ＰＣ１３２３、セラダイム－ＨＢＶ、チモシン－アルファ、ガンシクロビル、ベシフォビル(ＡＮＡ－３８０／ＬＢ－８０３８０)およびテノホビル－Exalidex(ＴＸＬ／ＣＭＸ１５７)を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、ヌクレオチ(シ)ドアナログは、エンテカビル(ＥＴＶ)またはテノフォビルまたはその誘導体である。ある実施態様において、ヌクレオチ(シ)ドアナログはラミブジンではない。ヌクレオチ(シ)ドアナログは、多数の供給源から商業的に入手可能であり、ラベルの指示(例えば、一般に特定用量で経口投与)に従いまたはＨＢＶ処置において技術を有する実施者により決定されたとおりここに提供する方法で使用される。C. Nucleotide and Nucleoside Analogs for Use in the Methods of the Invention Nucleotide and nucleoside analogs are generally considered safe and inexpensive and are therefore considered the standard of care for HBV infection. However, nucleotide and nucleoside analogs cannot cure HBV infection, can cause resistance to develop, and must be taken indefinitely. Nucleotide and nucleoside analogs include, but are not limited to, tenofovir disoproxil fumarate (TDF), tenofovir alafenamide, lamivudine, adefovir dipivoxil, entecavir (ETV), telbivudine, AGX-1009, emtricitabine, clevudine, ritonavir, dipivoxil, lobucavir, famvir, FTC, N-acetyl-cysteine (NAC), PC1323, Seradyme-HBV, thymosin-alpha, ganciclovir, besifovir (ANA-380/LB-80380), and tenofovir-Exalidex (TXL/CMX157). In some embodiments, the nucleoside analog is entecavir (ETV) or tenofovir or a derivative thereof. In some embodiments, the nucleotide analog is not lamivudine. Nucleotide analogs are commercially available from a number of sources and are used in the methods provided herein according to label directions (e.g., generally administered orally at a particular dose) or as determined by a practitioner skilled in the treatment of HBV.

III. ＨＢＶを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、少なくとも一つのＨＢＶ転写物および好ましくは３または４ＨＢＶ転写物の切断を促進する、ｉＲＮＡの使用を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ここに提供する本発明の方法で、少なくとも一つのＨＢＶ転写物、好ましくは３または４ＨＢＶ転写物の切断を促進するように、同様に使用され得る。ＨＢＶを標的とする例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、米国特許公開２０１３／００３５３６６、２０１２／０２０７７０９および２００４／０１２７４４６に提供され、これら各々の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。III. Antisense Oligonucleotides Targeting HBV The present invention includes the use of iRNAs to promote cleavage of at least one HBV transcript, and preferably 3 or 4 HBV transcripts. Antisense oligonucleotides can also be used in the methods of the present invention provided herein to promote cleavage of at least one HBV transcript, preferably 3 or 4 HBV transcripts. Exemplary antisense oligonucleotides targeting HBV are provided, for example, in U.S. Patent Publication Nos. 2013/0035366, 2012/0207709, and 2004/0127446, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

上に提供するｓｉＲＮＡの送達のためのコンジュゲート、リンカーおよび製剤を、アンチセンスオリゴヌクレオチド治療剤の製剤および対象への送達に使用し得ることは、当業者に理解される。It will be understood by those skilled in the art that the conjugates, linkers and formulations for delivery of siRNA provided above can be used to formulate and deliver antisense oligonucleotide therapeutics to a subject.

IV. 本発明の医薬組成物
本発明はまた本発明で使用するための、ｉＲＮＡまたはワクチンを含む医薬組成物および製剤も含む。承認された治療剤は、製剤され、その添付文書に示される経路により投与されることは理解される。IV. Pharmaceutical Compositions of the Invention The present invention also includes pharmaceutical compositions and formulations, including iRNA or vaccines, for use in the present invention. It is understood that approved therapeutic agents will be formulated and administered by the route indicated in their package insert.

ある実施態様において、ここに提供されるのは、ここに記載するｉＲＮＡまたはワクチンおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。ｉＲＮＡまたはワクチンを含む医薬組成物は、ＨＢＶ感染を有する対象の処置に有用である。このような医薬組成物は、例えば、皮下(ＳＣ)、筋肉内(ＩＭ)または静脈内(ＩＶ)送達による、非経腸送達による、例えば、全身投与のための、送達方式に基づき、製剤される。In some embodiments, provided herein is a pharmaceutical composition comprising an iRNA or vaccine described herein and a pharma-ceutical acceptable carrier. The pharmaceutical composition comprising the iRNA or vaccine is useful for treating a subject having an HBV infection. Such pharmaceutical compositions are formulated based on the mode of delivery, e.g., for systemic administration, e.g., by parenteral delivery, e.g., by subcutaneous (SC), intramuscular (IM), or intravenous (IV) delivery.

本発明で使用する医薬ＲＮＡｉ組成物を、少なくとも一つのＨＢＶ転写物のレベルを顕著に減少させるのに十分な投与量で投与する。一般に、本発明のｉＲＮＡの適当な用量は、１日あたり約０.００１～約２００.０ミリグラム／レシピエントのキログラム体重の範囲、一般に約１～５０mg／キログラム体重／日の範囲である。一般に、本発明のｉＲＮＡの適当な用量は、約０.１mg／kg～約５.０mg／kg、好ましくは約０.３mg／kgおよび約３.０mg／kgの範囲である。反復投与レジメンは、定期的な、例えば、隔週または年１回の治療量のｉＲＮＡの投与を含む。ある実施態様において、ｉＲＮＡを、約月１回から約四半期に１回(すなわち、約３か月に１回)投与する。好ましい実施態様において、ＲＮＡｉ剤は皮下投与される。The pharmaceutical RNAi compositions used in the present invention are administered in a dosage sufficient to significantly reduce the level of at least one HBV transcript. In general, suitable doses of the iRNA of the present invention range from about 0.001 to about 200.0 milligrams per kilogram of recipient body weight per day, generally from about 1 to 50 mg per kilogram of body weight per day. In general, suitable doses of the iRNA of the present invention range from about 0.1 mg/kg to about 5.0 mg/kg, preferably from about 0.3 mg/kg to about 3.0 mg/kg. Repeated dosing regimens include administration of a therapeutic amount of the iRNA on a regular basis, for example, every other week or year. In certain embodiments, the iRNA is administered about once a month to about once a quarter (i.e., about once every three months). In a preferred embodiment, the RNAi agent is administered subcutaneously.

ワクチンの製剤および投与は、投与するワクチンの性質による。タンパク質プライム－発現ベクターブーストワクチン接種戦略で、タンパク質ベースのプライミングワクチンを約２週間、３週間または４週間離れて投与し、第二のタンパク質ベースのワクチン用量を投与後、約２週間、３週間または４週間後発現ベクターワクチンブーストを投与する。ある実施態様において、タンパク質ベースのワクチンの第一および第二用量の間に、約２週間ある。ある実施態様において、第二用量のタンパク質ベースのワクチンとＤＮＡ発現ベクターワクチンブーストの間に約２週間ある。ある実施態様において、プライムおよびブーストワクチン接種は、筋肉内、皮内または皮下から独立して選択される経路により投与される。Vaccine formulation and administration will depend on the nature of the vaccine administered. In a protein prime-expression vector boost vaccination strategy, a protein-based priming vaccine is administered about 2, 3 or 4 weeks apart, followed by a second protein-based vaccine dose and then an expression vector vaccine boost about 2, 3 or 4 weeks later. In some embodiments, there are about 2 weeks between the first and second doses of protein-based vaccine. In some embodiments, there are about 2 weeks between the second dose of protein-based vaccine and the DNA expression vector vaccine boost. In some embodiments, the prime and boost vaccinations are administered by a route independently selected from intramuscular, intradermal or subcutaneous.

本発明で使用する医薬核酸ベースのワクチンを、プライム剤またはブースト剤として、免疫応答の促進に十分な用量で投与し得る。投与する核酸ベースのワクチンの量は、例えば、ワクチンのデザインによる。ここに提供するレジメンが既存の核酸ベースのワクチンの使用を含み得るため、治療有効性および安全性に基づく適切な投与量は、使用する特定の薬剤に基づかなければならない。The pharmaceutical nucleic acid-based vaccines used in the present invention may be administered as a priming or boosting agent in a dose sufficient to promote an immune response. The amount of nucleic acid-based vaccine administered will depend, for example, on the design of the vaccine. As the regimens provided herein may include the use of existing nucleic acid-based vaccines, appropriate dosages based on therapeutic efficacy and safety should be based on the particular agent used.

本発明で使用するための医薬タンパク質ベースのワクチンは、プライム剤またはブースト剤として、免疫応答の促進に十分な投与量で投与し得る。投与するタンパク質ベースのワクチンの量は、例えば、使用するアジュバントによる。タンパク質ベースのワクチンは、例えば、約５～１００mg／kg／用量、約１０～５０mg／kg／用量または約２０～４０mg／kg／用量で投与し得る。ここに提供するレジメンが既存のタンパク質ベースのワクチンの使用を含み得るため、治療有効性および安全性に基づく適切な投与量に関する知識は、使用する特定の薬剤に基づくべきである。Pharmaceutical protein-based vaccines for use in the present invention may be administered as a priming or boosting agent in a dosage sufficient to promote an immune response. The amount of protein-based vaccine administered will depend, for example, on the adjuvant used. Protein-based vaccines may be administered, for example, at about 5-100 mg/kg/dose, about 10-50 mg/kg/dose, or about 20-40 mg/kg/dose. As the regimens provided herein may involve the use of existing protein-based vaccines, knowledge of appropriate dosages based on therapeutic efficacy and safety should be based on the particular agent used.

初期処置レジメン後、処置剤を、低頻度ベースで投与し得る。好ましい実施態様において、ここに提供する処置レジメンおよび方法は、レジメン完了後または診断基準が機能的治癒、例えば、好ましくは、ここに提供する方法での検出レベル未満までのＨＢｓＡｇレベル減少およびＨＢｓＡｇに対する検出可能な免疫応答を示した後、処置中止を可能とする、機能的治癒をもたらす。After the initial treatment regimen, the treatment may be administered on a less frequent basis. In preferred embodiments, the treatment regimens and methods provided herein result in a functional cure, allowing for cessation of treatment after completion of the regimen or after diagnostic criteria indicate a functional cure, e.g., preferably a reduction in HBsAg levels to below the level of detection by the methods provided herein and a detectable immune response to HBsAg.

当業者は、ある因子が、疾患または障害の重症度、先の処置、対象の一般的健康状態または年齢および存在する他の疾患を含むが、これらに限定されない、対象の効果的処置に必要な投与量およびタイミングに影響し得ることを認識する。さらに、治療有効量の組成物での対象の処置は、単一処置または一連の処置を含み得る。本発明方法およびレジメンで使用する個々の治療剤の効果的投与量およびインビボ半減期の推定は、本明細書の他の箇所に記載され、当分野で知られる、慣用法を使用してまたは適切な動物モデルを使用するインビボ試験に基づき、行い得る。Those skilled in the art will recognize that certain factors may influence the dosage and timing required for effective treatment of a subject, including, but not limited to, the severity of the disease or disorder, previous treatments, the general health or age of the subject, and other diseases present. Furthermore, treatment of a subject with a therapeutically effective amount of a composition may include a single treatment or a series of treatments. Estimations of effective dosages and in vivo half-lives of individual therapeutic agents used in the methods and regimens of the invention may be made using conventional methods or based on in vivo testing using appropriate animal models, as described elsewhere herein and known in the art.

Ａ. 膜性分子集合体を含むｉＲＮＡ製剤
本発明の組成物および方法で使用するためのｉＲＮＡは、膜性分子集合体、例えば、リポソームまたはミセルでの送達のために製剤し得る。ここで使用する用語「リポソーム」は、少なくとも一つの二重層、例えば、１個の二重層または複数の二重層に配置された両親媒性脂質からなる小胞をいう。リポソームは、親油性物質および水性内部から形成された膜を有する、単層および多層小胞を含む。水性部分はｉＲＮＡ組成物を含む。親油性物質は、水性内部を、一般にｉＲＮＡ組成物を含まないが、いくつかの例では含んでもよい水性外面から分離する。リポソームは、活性成分の作用部位への移送および送達に有用である。リポソーム膜が生物学的膜と構造的に類似しているため、リポソームを組織に適用したとき、リポソーム二重層は、細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の混合が進むにつれて、ｉＲＮＡを含む、内部水性内容物は、細胞に送達され、そこで、ｉＲＮＡは標的ＲＮＡと特異的に結合でき、ｉＲＮＡに介在できる。ある場合、リポソームはまた例えば、特定の細胞型にｉＲＮＡを指向させるようにも特に標的化される。A. iRNA Formulations Comprising Membranous Molecular Assemblies iRNA for use in the compositions and methods of the present invention may be formulated for delivery in membranous molecular assemblies, such as liposomes or micelles. As used herein, the term "liposome" refers to a vesicle composed of amphiphilic lipids arranged in at least one bilayer, e.g., one bilayer or multiple bilayers. Liposomes include unilamellar and multilamellar vesicles, with a membrane formed from a lipophilic material and an aqueous interior. The aqueous portion comprises the iRNA composition. The lipophilic material separates the aqueous interior from the aqueous exterior, which generally does not contain the iRNA composition, but may in some instances. Liposomes are useful for transporting and delivering active ingredients to the site of action. Because the liposomal membrane is structurally similar to biological membranes, when the liposome is applied to a tissue, the liposomal bilayer fuses with the bilayer of the cell membrane. As the liposome and cell mix proceeds, the internal aqueous contents, including the iRNA, are delivered to the cell, where the iRNA can specifically bind to and mediate the target RNA. In some cases, the liposomes are also specifically targeted, for example, to direct the iRNA to a particular cell type.

ｉＲＮＡ剤を含むリポソームは、多様な方法で製造し得る。一例において、リポソームの脂質成分を、脂質成分とミセルが形成されるように、界面活性剤に溶解する。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質コンジュゲートであり得る。界面活性剤は、高臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。例示的界面活性剤は、コール酸、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸およびラウロイルザルコシンを含む。次いで、ｉＲＮＡ剤製剤を、脂質成分を含むミセルに加える。脂質のカチオン性基がｉＲＮＡ剤と相互作用し、ｉＲＮＡ剤周囲に凝縮して、リポソームを形成する。凝集後、界面活性剤を、例えば、透析により除去して、ｉＲＮＡ剤のリポソーム製剤を得る。Liposomes containing an iRNA agent can be made in a variety of ways. In one example, the lipid components of the liposome are dissolved in a detergent such that micelles are formed with the lipid components. For example, the lipid components can be amphipathic cationic lipids or lipid conjugates. The detergent can have a high critical micelle concentration and can be non-ionic. Exemplary detergents include cholic acid, CHAPS, octylglucoside, deoxycholic acid, and lauroyl sarcosine. The iRNA agent formulation is then added to the micelles containing the lipid components. The cationic groups of the lipid interact with the iRNA agent and condense around the iRNA agent to form a liposome. After condensation, the detergent is removed, for example, by dialysis, to obtain a liposomal formulation of the iRNA agent.

必要であれば、凝集を助ける担体化合物を凝集反応中に、例えば、制御された添加により、加え得る。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー(例えば、スペルミンまたはスペルミジン)。ｐＨも凝集を支持するよう調節できる。If necessary, a carrier compound that aids in aggregation can be added during the aggregation reaction, e.g., by controlled addition. For example, the carrier compound is a polymer other than a nucleic acid (e.g., spermine or spermidine). The pH can also be adjusted to support aggregation.

送達媒体の構造的成分としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を取り込む安定なポリヌクレオチド送達媒体を製造する方法は、例えば、ＷＯ９６３７１９４にさらに記載され、その内容を全体として引用により本明細書に包含させる。リポソーム形成はまた、Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987；米国特許４,８９７,３５５；米国特許５,１７１,６７８; Bangham, et al. M. Mol. Biol. 23:238, 1965; Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194, 1978; Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983;およびFukunaga, et al. Endocrinol. 115:757, 1984に記載の例示的方法の１以上の態様も含み得る。送達媒体としての使用に適するサイズの脂質凝集体を製造する一般に使用される技法は、超音波処理および凍結融解＋押し出しを含む(例えば、Mayer, et al. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986参照)。一貫して小さく(５０～２００nm)、比較的均一な凝集体が望まれるとき、微小流動化が使用され得る(Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984)。これらの方法は、ｉＲＮＡ剤製剤のリポソームへの充填に容易に適合される。Methods for producing stable polynucleotide delivery vehicles incorporating polynucleotide/cationic lipid complexes as a structural component of the delivery vehicle are further described, for example, in WO 9637194, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety. Liposome formation has also been described by Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987; U.S. Patent 4,897,355; U.S. Patent 5,171,678; Bangham, et al. M. Mol. Biol. 23:238, 1965; Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194, 1978; Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; and Fukunaga, et al. Endocrinol. 115:757, 1984. Commonly used techniques for producing lipid aggregates of a size suitable for use as a delivery vehicle include sonication and freeze-thaw+extrusion (see, e.g., Mayer, et al. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986). When consistently small (50-200 nm) and relatively uniform aggregates are desired, microfluidization can be used (Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984). These methods are readily adapted for loading iRNA agent formulations into liposomes.

リポソームは、二つの広いクラスに分けられる。カチオン性リポソームは、正荷電リポソームであり、負荷電核酸分子と相互作用して、安定な複合体を形成する。正荷電核酸／リポソーム複合体は負荷電細胞表面と結合し、エンドソームに内在化する。エンドソーム内の酸性ｐＨのために、リポソームは破裂し、内容物を細胞質に放出する(Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985)。Liposomes are divided into two broad classes. Cationic liposomes are positively charged liposomes that interact with negatively charged nucleic acid molecules to form stable complexes. The positively charged nucleic acid/liposome complexes bind to the negatively charged cell surface and are internalized into endosomes. Due to the acidic pH within the endosome, the liposomes rupture, releasing their contents into the cytoplasm (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).

ｐＨ感受性または負荷電したリポソームは、その複合体ではなく、核酸を捕捉する。核酸および脂質両者の電荷が類似するため、複合体形成ではなく、反発が起こる。それにもかかわらず、一部核酸は、これらリポソームの水性内部の中に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする遺伝子の、培養細胞単層への送達に使用されている。外来遺伝子の発現は、標的細胞で検出されている(Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274)。pH-sensitive or negatively charged liposomes entrap nucleic acids but do not complex with them. The similar charges of both the nucleic acid and the lipids result in repulsion rather than complex formation. Nevertheless, some nucleic acid is entrapped within the aqueous interior of these liposomes. pH-sensitive liposomes have been used to deliver a gene encoding a thymidine kinase gene to cultured cell monolayers. Expression of the foreign gene has been detected in the target cells (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).

リポソーム組成物の一つの主要なタイプは、天然由来ホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)またはジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物は、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、アニオン性融合型リポソームは、主にジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)から形成される。他のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン(ＰＣ)、例えば、大豆ＰＣおよび卵ＰＣから形成される。他のタイプは、リン脂質またはホスファチジルコリンまたはコレステロールの混合物から形成される。One major type of liposome composition contains phospholipids other than naturally occurring phosphatidylcholine. Neutral liposome compositions can be formed, for example, from dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC) or dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC). Anionic liposome compositions are generally formed from dimyristoyl phosphatidylglycerol, while anionic fusogenic liposomes are formed primarily from dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE). Other types of liposome compositions are formed from phosphatidylcholine (PC), such as soybean PC and egg PC. Other types are formed from mixtures of phospholipids or phosphatidylcholine or cholesterol.

インビトロおよびインビボでリポソームを細胞に導入する他の方法の例は、米国特許５,２８３,１８５および５,１７１,６７８；ＷＯ９４／００５６９；ＷＯ９３／２４６４０；ＷＯ９１／１６０２４; Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993;およびStrauss EMBO J. 11:417, 1992を含む。Other examples of methods for introducing liposomes into cells in vitro and in vivo include U.S. Patents 5,283,185 and 5,171,678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993; and Strauss EMBO J. 11:417, 1992.

非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系も、皮膚への薬物送達への有用性について試験されている。Novasome^TM Ｉ(ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル)およびNovasome^TM II(ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル)を含む非イオン性リポソーム製剤は、マウス皮膚の真皮へのシクロスポリンＡの送達に使用された。結果は、このような非イオン性リポソーム系が、シクロスポリンＡの皮膚の種々の層への沈着の促進に効果的であったことを示した(Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4(6) 466)。 Non-ionic liposomal systems, particularly those containing non-ionic surfactants and cholesterol, have also been tested for their usefulness in drug delivery to the skin. Non-ionic liposomal formulations containing Novasome^™ I (glyceryl dilaurate/cholesterol/polyoxyethylene-10-stearyl ether) and Novasome^™ II (glyceryl distearate/cholesterol/polyoxyethylene-10-stearyl ether) were used to deliver cyclosporine A to the dermis of mouse skin. Results showed that such non-ionic liposomal systems were effective in promoting deposition of cyclosporine A into various layers of the skin (Hu et al. STPPharma. Sci., 1994, 4(6) 466).

リポソームはまた「立体的に安定化された」リポソームも含み、この用語は、ここで使用する限り、リポソームに取り込まれたとき、特殊化脂質を欠くリポソームと比較して、循環寿命を延長させる、１以上の特殊化脂質を含むリポソームをいう。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が(Ａ)モノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１などの１以上の糖脂質を含むまたは(Ｂ)ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分などの１以上の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。何らかの特定の理論に拘束されることを意図しないが、当分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリンまたはＰＥＧ誘導体化脂質を含む立体的に安定化されたリポソームについて、これらの立体的に安定化されたリポソームの延長された循環半減期は、網内系(ＲＥＳ)の細胞への取り込み減少に由来すると考えられる(Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765)。 Liposomes also include "sterically stabilized" liposomes, which term, as used herein, refers to liposomes that contain one or more specialized lipids that, when incorporated into the liposome, enhance the circulation lifetime compared to liposomes lacking the specialized lipid. Examples of sterically stabilized liposomes are those in which a portion of the vesicle-forming lipid portion of the liposome (A) contains one or more glycolipids, such as monosialoganglioside_GM1 , or (B) is derivatized with one or more hydrophilic polymers, such as polyethylene glycol (PEG) moieties. Without intending to be bound by any particular theory, it is believed in the art that, at least for sterically stabilized liposomes containing gangliosides, sphingomyelin, or PEG-derivatized lipids, the extended circulation half-life of these sterically stabilized liposomes results from reduced uptake into cells of the reticuloendothelial system (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).

１以上の糖脂質を含む種々のリポソームは当分野で知られる。Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64)は、モノシアロガングリオシドＧ_Ｍ１、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファチジルイノシトールの、リポソームの血液半減期を改善する能力を報告している。これらの発見は、Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 6949)により拡大された。米国特許４,８３７,０２８およびＷＯ８８／０４９２４(両方ともAllen et al.)は、(１)スフィンゴミエリンおよび(２)ガングリオシドＧ_Ｍ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示する。米国特許５,５４３,１５２は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１,２－ｓｎ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、ＷＯ９７１３４９９(Lim et al.)に開示される。 Various liposomes containing one or more glycolipids are known in the art. Papahadjopoulos et al. (Ann. NY Acad. Sci., 1987, 507, 64) reported the ability of monosialoganglioside G_M1 , galactocerebroside sulfate and phosphatidylinositol to improve the blood half-life of liposomes. These findings were extended by Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 6949). U.S. Patent 4,837,028 and WO 88/04924 (both by Allen et al.) disclose liposomes containing (1) sphingomyelin and (2) ganglioside G_M1 or galactocerebroside sulfate. U.S. Patent 5,543,152 discloses liposomes containing sphingomyelin. Liposomes containing 1,2-sn-dimyristoylphosphatidylcholine are disclosed in WO 9713499 (Lim et al.).

カチオン性リポソームは、細胞膜に融合されることができるとの利点を有する。非カチオン性リポソームは、原形質膜に効率的には融合され得ないが、インビボでマクロファージにより取り込まれ、ｉＲＮＡ剤のマクロファージへの送達に使用され得る。Cationic liposomes have the advantage that they can fuse to the cell membrane. Non-cationic liposomes cannot fuse as efficiently to the plasma membrane, but can be taken up by macrophages in vivo and used to deliver iRNA agents to macrophages.

リポソームのさらなる利点は、天然リン脂質から得たリポソームは生体適合性および生分解性であり；リポソームは広範囲の水および脂質可溶性薬物を取り込むことができ；リポソームは内部区画に封入されたｉＲＮＡ剤を代謝および分解から保護できることである(Rosoff, in "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245)。リポソーム製剤製造における重要な考察は、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズおよび水性体積である。Additional advantages of liposomes are that liposomes derived from natural phospholipids are biocompatible and biodegradable; liposomes can entrap a wide range of water- and lipid-soluble drugs; and liposomes can protect iRNA agents encapsulated in the internal compartment from metabolism and degradation (Rosoff, in "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245). Important considerations in the manufacture of liposomal formulations are the lipid surface charge, vesicle size and aqueous volume of the liposomes.

正荷電合成カチオン性脂質、Ｎ－[１－(２,３－ジオレイルオキシ)プロピル]－Ｎ,Ｎ,Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド(ＤＯＴＭＡ)を、組織培養細胞の細胞膜の負荷電脂質と融合し、ｉＲＮＡ剤の送達をもたらし得る脂質－核酸複合体を形成するように、核酸と自然に相互作用する、小リポソームの形成のために使用できる(ＤＯＴＭＡおよびそのＤＮＡとの使用についての記載に関して、例えば、Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987および米国特許４,８９７,３５５参照)。The positively charged synthetic cationic lipid, N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA), can be used to form small liposomes that naturally interact with nucleic acids to fuse with negatively charged lipids in the plasma membrane of tissue culture cells and form lipid-nucleic acid complexes that can result in delivery of iRNA agents (see, e.g., Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987 and U.S. Patent 4,897,355 for a description of DOTMA and its use with DNA).

ＤＯＴＭＡアナログ、１,２－ビス(オレオイルオキシ)－３－(トリメチルアンモニア)プロパン(ＤＯＴＡＰ)を、リン脂質と組み合わせで使用して、ＤＮＡ複合小胞を形成し得る。リポフェクチン^TM(Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.)は、自然に負荷電ポリヌクレオチドと相互作用して、複合体を形成する正荷電ＤＯＴＭＡリポソームを含む生存組織培養細胞への高度にアニオン性の核酸の送達に有効な薬剤である。十分な正荷電リポソームが使用されたとき、得られた複合体の正味電荷も正である。この方法で調製された正荷電複合体は、自然に負荷電細胞表面と結合し、原形質膜と融合し、機能的核酸を、例えば、組織培養細胞に、効率的に送達する。他の商業的に入手可能なカチオン性脂質、１,２－ビス(オレオイルオキシ)－３,３－(トリメチルアンモニア)プロパン(「ＤＯＴＡＰ」)(Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana)は、オレオイル部分がエーテル結合ではなく、エステルで連結されている点で、ＤＯＴＭＡと異なる。 The DOTMA analog, 1,2-bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonia)propane (DOTAP), can be used in combination with phospholipids to form DNA complex vesicles. Lipofectin^™ (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) is an effective agent for delivery of highly anionic nucleic acids to living tissue culture cells that contains positively charged DOTMA liposomes that interact with naturally negatively charged polynucleotides to form complexes. When sufficient positively charged liposomes are used, the net charge of the resulting complex is also positive. Positively charged complexes prepared in this manner bind to naturally negatively charged cell surfaces and fuse with plasma membranes, efficiently delivering functional nucleic acids to, for example, tissue culture cells. Another commercially available cationic lipid, 1,2-bis(oleoyloxy)-3,3-(trimethylammonia)propane ("DOTAP") (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana), differs from DOTMA in that the oleoyl moieties are linked by ester rather than ether bonds.

他の報告されているカチオン性脂質化合物は、例えば、２タイプの脂質の一つにコンジュゲートしているカルボキシスペルミンを含む、多様な部分にコンジュゲートしているものおよび５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド(「ＤＯＧＳ」)(Transfectam^TM、Promega, Madison, Wisconsin)およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５－カルボキシスペルミル－アミド(「ＤＰＰＥＳ」)(例えば、米国特許５,１７１,６７８参照)などの化合物を含む。 Other reported cationic lipid compounds include those conjugated to a variety of moieties, including, for example, carboxyspermine conjugated to one of two types of lipids, and compounds such as 5-carboxyspermylglycine dioctaoleoylamide ("DOGS") (Transfectam^™ , Promega, Madison, Wisconsin) and dipalmitoylphosphatidylethanolamine 5-carboxyspermyl-amide ("DPPES") (see, e.g., U.S. Patent 5,171,678).

他のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソームに製剤されている、脂質のコレステロールでの誘導体化(「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」)を含む(Gao, X. and Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991)。ポリリシンのＤＯＰＥへのコンジュゲーションにより製造されるリポポリリシンは、血清存在下でのトランスフェクションに効果的であることが報告されている(Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991)。ある細胞株について、コンジュゲートカチオン性脂質を含むこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物より低い毒性を示し、より効率的なトランスフェクションを提供するとされている。他の商業的に入手可能なカチオン性脂質製品は、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ－ＨＰ(Vical, La Jolla, California)およびリポフェクタミン(ＤＯＳＰＡ)(Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland)を含む。オリゴヌクレオチド送達に適する他のカチオン性脂質は、ＷＯ９８／３９３５９およびＷＯ９６／３７１９４に記載される。Other cationic lipid conjugates include lipids derivatized with cholesterol ("DC-Chol") that are formulated into liposomes in combination with DOPE (Gao, X. and Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991). Lipopolylysine, produced by conjugation of polylysine to DOPE, has been reported to be effective for transfection in the presence of serum (Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991). For certain cell lines, these liposomes containing conjugated cationic lipids are said to exhibit lower toxicity and provide more efficient transfection than DOTMA-containing compositions. Other commercially available cationic lipid products include DMRIE and DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) and Lipofectamine (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Other cationic lipids suitable for oligonucleotide delivery are described in WO 98/39359 and WO 96/37194.

リポソーム製剤は、局所投与に特に適する。リポソームは、他の製剤を超えるいくつかの利点を提供する。このような利点は、薬物の高全身吸収と関連する副作用の減少、所望の標的への投与薬物の蓄積増加および皮膚にｉＲＮＡ剤を投与する能力である。いくつかの実践では、リポソームはｉＲＮＡ剤の上皮細胞への送達およびまた皮膚組織、例えば、皮膚へのｉＲＮＡ剤の浸透増強のために使用される。例えば、リポソームは局所的に適用できる。リポソームとして製剤された薬物の皮膚への局所送達は、実証されている(例えば、Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410 and du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. et al. Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, C. et al. Meth. Enz. 149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C. Y. and Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987参照)。Liposomal formulations are particularly suitable for topical administration. Liposomes offer several advantages over other formulations. Such advantages are reduced side effects associated with high systemic absorption of the drug, increased accumulation of the administered drug at the desired target, and the ability to administer the iRNA agent to the skin. In some implementations, liposomes are used to deliver the iRNA agent to epithelial cells and also to enhance penetration of the iRNA agent into dermal tissues, e.g., the skin. For example, liposomes can be applied topically. Topical delivery of drugs formulated as liposomes to the skin has been demonstrated (e.g., Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410 and du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. et al. Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, C. et al. Meth. Enz. 149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C. Y. and Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987).

ｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能に製造できる。このような変形能は、リポソームが、該リポソームの平均半径より小さい細孔を通って浸透することを可能とし得る。例えば、トランスファーソームは、変形可能リポソームの１種である。トランスファーソームは、標準的リポソーム組成への端面アクティベーター、通常界面活性剤の添加により製造され得る。ｉＲＮＡ剤を含むトランスファーソームは、皮膚のケラチン生成細胞にｉＲＮＡ剤を送達するために、感染により、例えば、皮下に送達され得る。無傷の哺乳動物皮膚を通過するためには、脂質小胞は、各々が直径５０nm未満である一連の微細孔を、適当な経皮勾配の影響下に、通過しなければならない。さらに、脂質性質のため、これらのトランスファーソームは、自己最適化(例えば、皮膚の細孔の形に適応)、かつ自己修復可能であり、しばしばその標的に断片化せずに到達でき、しばしば自己負荷可能であり得る。Liposomes containing iRNA can be made highly deformable. Such deformability can allow liposomes to penetrate through pores smaller than the average radius of the liposome. For example, transfersomes are one type of deformable liposome. Transfersomes can be made by adding an end activator, usually a surfactant, to a standard liposome composition. Transfersomes containing iRNA agents can be delivered, for example, subcutaneously, by infection to deliver the iRNA agent to keratinocytes in the skin. To pass through intact mammalian skin, lipid vesicles must pass through a series of micropores, each less than 50 nm in diameter, under the influence of an appropriate transdermal gradient. Furthermore, because of their lipid nature, these transfersomes can be self-optimizing (e.g., adapting to the shape of skin pores) and self-repairing, often reaching their targets without fragmentation, and often being self-loading.

本発明に受け入れられる他の製剤は、ＷＯ２００８０４２９７３に記載される。Other formulations amenable to the present invention are described in WO2008042973.

界面活性剤は、エマルジョン(マイクロエマルジョンを含む)およびリポソームなどの製剤に広く適用される。天然および合成起源の多くのタイプの界面活性剤の性質を分類および順位付けする最も一般的方法は、親水性／親油性バランス(ＨＬＢ)である。親水性基(「頭部」としても知られる)の性質は、製剤で使用される種々の界面活性剤の分類のための最も有用な手段を提供する(Rieger, in “Pharmaceutical Dosage Forms”, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285)。Surfactants find wide application in formulations such as emulsions (including microemulsions) and liposomes. The most common method for classifying and ranking the properties of the many types of surfactants of natural and synthetic origin is the hydrophilic/lipophilic balance (HLB). The nature of the hydrophilic group (also known as the "head") provides the most useful means for classifying the various surfactants used in formulations (Rieger, in "Pharmaceutical Dosage Forms", Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).

界面活性剤分子がイオン化されていないならば、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧品に広く適用され、広範囲のｐＨ値にわたり使用可能である。一般にそのＨＬＢ値範囲は、構造によって２～約１８である。非イオン性界面活性剤は、非イオン性エステル、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステルおよびエトキシル化エステルを含む。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル、例えば、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーもこの群に入る。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤群で最もポピュラーな一群である。If the surfactant molecule is not ionized, it is classified as a nonionic surfactant. Nonionic surfactants are widely applied in pharmaceuticals and cosmetics and can be used over a wide range of pH values. In general, their HLB value ranges from 2 to about 18, depending on the structure. Nonionic surfactants include nonionic esters, such as ethylene glycol esters, propylene glycol esters, glyceryl esters, polyglyceryl esters, sorbitan esters, sucrose esters, and ethoxylated esters. Nonionic alkanolamides and ethers, such as fatty alcohol ethoxylates, propoxylated alcohols, and ethoxylated/propoxylated block polymers, also fall into this group. Polyoxyethylene surfactants are the most popular group of nonionic surfactants.

界面活性剤分子が、水に溶解または分散したとき負電荷を有するならば、界面活性剤はアニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤は、カルボキシレート、例えば石鹸、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸エステル、例えば、アルキル硫酸エステルおよびエトキシル化アルキル硫酸エステル、スルホネート、例えば、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホスクシネートおよびホスフェートを含む。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーは、アルキル硫酸エステルおよび石鹸である。If the surfactant molecule carries a negative charge when dissolved or dispersed in water, the surfactant is classified as anionic. Anionic surfactants include carboxylates, such as soaps, acyl lactylates, acyl amides of amino acids, sulfate esters, such as alkyl sulfates and ethoxylated alkyl sulfates, sulfonates, such as alkyl benzene sulfonates, acyl isethionates, acyltaurates and sulfosuccinates, and phosphates. The most important members of the anionic surfactant class are the alkyl sulfates and soaps.

界面活性剤分子が、水に溶解または分散したとき正電荷を有するならば、界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤は、４級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンを含む。４級アンモニウム塩は、このクラスで最も使用されるメンバーである。If the surfactant molecule carries a positive charge when dissolved or dispersed in water, the surfactant is classified as cationic. Cationic surfactants include quaternary ammonium salts and ethoxylated amines. Quaternary ammonium salts are the most used members of this class.

界面活性剤分子が正または負電荷を有する能力を有するならば、界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤は、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタインおよびフォスファチドを含む。If the surfactant molecule has the ability to carry a positive or negative charge, the surfactant is classified as amphoteric. Amphoteric surfactants include acrylic acid derivatives, substituted alkylamides, N-alkylbetaines, and phosphatides.

医薬品、製剤およびエマルジョンにおける界面活性剤の使用は、レビューされている(Rieger, in “Pharmaceutical Dosage Forms”, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285)。The use of surfactants in pharmaceuticals, formulations and emulsions has been reviewed (Rieger, in “Pharmaceutical Dosage Forms”, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).

本発明の方法で使用するｉＲＮＡは、ミセル製剤としても提供され得る。「ミセル」は、ここでは、両親媒性分子が、分子の疎水性部分全部が内向きであり、親水性部分を周囲の水相と接触させるように球状構造に配置された、特定のタイプの分子集合体をいう。環境が疎水性であるならば、逆配置が存在する。The iRNA for use in the methods of the invention may also be provided as a micellar formulation. "Micelle" as used herein refers to a specific type of molecular assembly in which amphipathic molecules are arranged in a spherical structure with all of the hydrophobic portions of the molecules facing inward, with the hydrophilic portions in contact with the surrounding aqueous phase. If the environment is hydrophobic, then the inverse arrangement exists.

Ｂ. 脂質粒子
本発明のｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、脂質製剤、例えば、ＬＮＰまたは他の核酸－脂質粒子に完全に封入され得る。適切なプロモーター制御下に、ウイルス抗原に関するコード配列を含む発現ベクターまたはＲＮＡを送達のための脂質粒子に製剤できる。B. Lipid Particles The iRNA, e.g., dsRNA, of the invention can be fully encapsulated in a lipid formulation, e.g., LNPs or other nucleic acid-lipid particles. Expression vectors containing coding sequences for viral antigens or RNA under the control of an appropriate promoter can be formulated into lipid particles for delivery.

ここで使用する用語「ＬＮＰ」は、安定な核酸－脂質粒子をいう。ＬＮＰは、一般にカチオン性脂質、非カチオン性脂質および粒子凝集を阻止する脂質(例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート)を含む。ＬＮＰは、静脈内(ｉ.ｖ.)注射後に長い循環寿命を示し、遠位部位(例えば、投与部位と物理的に離れた部位)に蓄積されるため、全身適用に、高度に有用なである。ＬＮＰは、ＷＯ０００３６８３に示す封入された縮合剤－核酸複合体を含む、「ｐＳＰＬＰ」を含む。本発明の粒子は、一般に平均直径約５０nm～約１５０nm、より一般に約６０nm～約１３０nm、より一般に約７０nm～約１１０nm、最も一般に約７０nm～約９０nmを有し、実質的に非毒性である。さらに、核酸は、本発明の核酸－脂質粒子に存在するとき、水溶液でヌクレアーゼでの分解に抵抗性である。核酸－脂質粒子およびその製造方法は、例えば、米国特許５,９７６,５６７；５,９８１,５０１；６,５３４,４８４；６,５８６,４１０；および６,８１５,４３２；ＵＳ２０１００３２４１２０およびＷＯ９６４０９６４に開示される。The term "LNP" as used herein refers to a stable nucleic acid-lipid particle. LNPs generally include cationic lipids, non-cationic lipids, and lipids that prevent particle aggregation (e.g., PEG-lipid conjugates). LNPs exhibit long circulatory lifetimes after intravenous (i.v.) injection and accumulate at distal sites (e.g., sites physically separate from the site of administration), making them highly useful for systemic applications. LNPs include "pSPLPs," which include encapsulated condensing agent-nucleic acid complexes as shown in WO0003683. The particles of the invention generally have an average diameter of about 50 nm to about 150 nm, more typically about 60 nm to about 130 nm, more typically about 70 nm to about 110 nm, and most typically about 70 nm to about 90 nm, and are substantially non-toxic. Additionally, the nucleic acid, when present in the nucleic acid-lipid particles of the invention, is resistant to degradation by nucleases in aqueous solution. Nucleic acid-lipid particles and methods for their production are disclosed, for example, in U.S. Patents 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; and 6,815,432; US20100324120 and WO9640964.

ある実施態様において、脂質対薬物比(質量／質量比)(例えば、脂質対ｄｓＲＮＡ比)は、約１：１～約５０：１、約１：１～約２５：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１または約６：１～約９：１の範囲である。上記範囲の中間も、本発明の一部であると考えられる。In some embodiments, the lipid to drug ratio (mass/mass ratio) (e.g., lipid to dsRNA ratio) ranges from about 1:1 to about 50:1, about 1:1 to about 25:1, about 3:1 to about 15:1, about 4:1 to about 10:1, about 5:1 to about 9:1, or about 6:1 to about 9:1. Intermediate ranges are also considered part of the invention.

カチオン性脂質は、例えば、Ｎ,Ｎ－ジオレイル－Ｎ,Ｎ－ジメチルアンモニウムクロライド(ＤＯＤＡＣ)、Ｎ,Ｎ－ジステアリル－Ｎ,Ｎ－ジメチルアンモニウムブロマイド(ＤＤＡＢ)、Ｎ－(Ｉ－(２,３－ジオレイルオキシ)プロピル)－Ｎ,Ｎ,Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド(ＤＯＴＡＰ)、Ｎ－(Ｉ－(２,３－ジオレイルオキシ)プロピル)－Ｎ,Ｎ,Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド(ＤＯＴＭＡ)、Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ジオレイルオキシ)プロピルアミン(ＤＯＤＭＡ)、１,２－ジリノレイルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＤＭＡ)、１,２－ジリノレニルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｅｎＤＭＡ)、１,２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ)、１,２－ジリノレイルオキシ－３－(ジメチルアミノ)アセトキシプロパン(Ｄｌｉｎ－ＤＡＣ)、１,２－ジリノレイルオキシ－３－モルホリノプロパン(ＤＬｉｎ－ＭＡ)、１,２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＤａＰ)、１,２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ)、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ)、１,２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩(ＤＬｉｎ－ＴＭＡ.Ｃｌ)、１,２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩(ＤＬｉｎ－ＴＡＰ.Ｃｌ)、１,２－ジリノレイルオキシ－３－(Ｎ－メチルピペラジノ)プロパン(ＤＬｉｎ－ＭＰｚ)または３－(Ｎ,Ｎ－ジリノレイルアミノ)－１,２－プロパンジオール(ＤＬｉｎＡＰ)、３－(Ｎ,Ｎ－ジオレイルアミノ)－１,２－プロパンジオール(ＤＯＡＰ)、１,２－ジリノレイルオキソ－３－(２－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノ)エトキシプロパン(ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ)、１,２－ジリノレニルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＤＭＡ)、２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－[１,３]－ジオキソラン(ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ)またはそのアナログ、(３ａＲ,５ｓ,６ａＳ)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,２－ジ((９Ｚ,１２Ｚ)－オクタデカ－９,１２－ジエニル)テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ[ｄ][１,３]ジオキソール－５－アミン(ＡＬＮ１００)、(６Ｚ,９Ｚ,２８Ｚ,３１Ｚ)－ヘプタトリアコンタ－６,９,２８,３１－テトラエン－１９－イル４－(ジメチルアミノ)ブタノエート(ＭＣ３)、１,１’－(２－(４－(２－((２－(ビス(２－ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)(２－ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)ピペラジン－１－イル)エチルアザンジイル)ジドデカン－２－オール(ＴｅｃｈＧ１)またはこれらの混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子に存在する全脂質の約２０mol％～約５０mol％または約４０mol％を構成し得る。他の実施態様において、化合物２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－[１,３]－ジオキソランを、脂質－ｓｉＲＮナノ粒子の製造に使用し得る。Examples of cationic lipids include N,N-dioleyl-N,N-dimethylammonium chloride (DODAC), N,N-distearyl-N,N-dimethylammonium bromide (DDAB), N-(I-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTAP), N-(I-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA), N,N-dimethyl-2,3-dioleyloxy)propylamine (DODMA), 1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DLinDMA), 1,2-dilinolenyloxy-N,N-dimethylamine (DLinDMA), and 1,2-dilinolenyloxy-N,N-dimethylamine (DLinDMA). Nopropane (DLenDMA), 1,2-Dilinoleylcarbamoyloxy-3-dimethylaminopropane (DLin-C-DAP), 1,2-Dilinoleyloxy-3-(dimethylamino)acetoxypropane (Dlin-DAC), 1,2-Dilinoleyloxy-3-morpholinopropane (DLin-MA), 1,2-Dilinoleoyl-3-dimethylaminopropane (DLinDaP), 1,2-Dilinoleylthio-3-dimethylaminopropane (DLin-S-DMA), 1-Linoleoyl-2-Linoleyloxy-3-dimethylaminopropane (DLin-2-DMAP), 1,2-Dilinoleyloxy-3-trimethylaminopropane chloride salt (DL in-TMA.Cl), 1,2-dilinoleoyl-3-trimethylaminopropane chloride salt (DLin-TAP.Cl), 1,2-dilinoleyloxy-3-(N-methylpiperazino)propane (DLin-MPz) or 3-(N,N-dilinoleylamino)-1,2-propanediol (DLinAP), 3-(N,N-dioleylamino)-1,2-propanediol (DOAP), 1,2-dilinoleyloxo-3-(2-N,N-dimethylamino)ethoxypropane (DLin-EG-DMA), 1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane (DLinDMA), 2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl-[1,3]- It can be dioxolane (DLin-K-DMA) or an analog thereof, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimethyl-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienyl)tetrahydro-3aH-cyclopenta[d][1,3]dioxol-5-amine (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hydroxydodecyl)amino)ethyl)(2-hydroxydodecyl)amino)ethyl)piperazin-1-yl)ethylazanediyl)didodecan-2-ol (Tech G1) or a mixture thereof. The cationic lipid may comprise about 20 mol% to about 50 mol% or about 40 mol% of the total lipid present in the particle. In other embodiments, the compound 2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminoethyl-[1,3]-dioxolane may be used in the preparation of lipid-siRN nanoparticles.

ある実施態様において、脂質－ｓｉＲＮＡ粒子は、６３.０±２０nmの粒子径および０.０２７ｓｉＲＮＡ／脂質比で、４０％２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－[１,３]－ジオキソラン：１０％ＤＳＰＣ：４０％コレステロール：１０％ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ(モルパーセント)を含む。In one embodiment, the lipid-siRNA particles comprise 40% 2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminoethyl-[1,3]-dioxolane:10% DSPC:40% cholesterol:10% PEG-C-DOMG (mol percent) with a particle size of 63.0±20 nm and a 0.027 siRNA/lipid ratio.

イオン化可能／非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジオレイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジオレイルホスファチジルグリセロール(ＤＯＰＧ)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(ＤＰＰＧ)、ジオレイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＰＯＰＥ)、ジオレイル－ホスファチジルエタノールアミン４－(Ｎ－マレイミドメチル)－シクロヘキサン－１－カルボキシレート(ＤＯＰＥ－ｍａｌ)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン(ＤＳＰＥ)、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－ｔｒａｎｓＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＳＯＰＥ)、コレステロールまたはこれらの混合物を含むが、これらに限定されないアニオン性脂質または中性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、コレステロールが含まれるならば、粒子に存在する全脂質の約５mol％～約９０mol％、約１０mol％または約５８mol％であり得る。Ionizable/non-cationic lipids include distearoyl phosphatidylcholine (DSPC), dioleyl phosphatidylcholine (DOPC), dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), dioleyl phosphatidylglycerol (DOPG), dipalmitoyl phosphatidylglycerol (DPPG), dioleyl-phosphatidylethanolamine (DOPE), palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine (POPC), palmitoyl oleoyl The lipid may be an anionic or neutral lipid, including, but not limited to, phosphatidylethanolamine (POPE), dioleyl-phosphatidylethanolamine 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate (DOPE-mal), dipalmitoylphosphatidylethanolamine (DPPE), dimyristoylphosphoethanolamine (DMPE), distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine (DSPE), 16-O-monomethyl PE, 16-O-dimethyl PE, 18-1-trans PE, 1-stearoyl-2-oleoyl-phosphatidylethanolamine (SOPE), cholesterol, or mixtures thereof. The non-cationic lipid, if cholesterol is included, may be about 5 mol% to about 90 mol%, about 10 mol%, or about 58 mol% of the total lipid present in the particle.

粒子の凝集を阻止するコンジュゲート脂質は、例えば、限定しないが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール(ＤＡＧ)、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル(ＤＡＡ)、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド(Ｃｅｒ)またはこれらの混合物を含む、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)－脂質であり得る。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル(Ｃｉ_２)、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル(Ｃｉ_４)、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル(Ｃｉ_６)またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル(Ｃ]_８)であり得る。粒子の凝集を阻止するコンジュゲート脂質は、粒子に存在する全脂質の０mol％～約２０mol％または約２mol％であり得る。 The conjugated lipid that inhibits particle aggregation can be, for example, a polyethylene glycol (PEG)-lipid, including, but not limited to, PEG-diacylglycerol (DAG), PEG-dialkyloxypropyl (DAA), PEG-phospholipid, PEG-ceramide (Cer), or mixtures thereof. The PEG-DAA conjugate can be, for example, PEG-dilauryloxypropyl (Ci₂ ), PEG-dimyristyloxypropyl (Ci₄ ), PEG-dipalmityloxypropyl (Ci₆ ), or PEG-distearyloxypropyl (C]₈ ). The conjugated lipid that inhibits particle aggregation can be from 0 mol % to about 20 mol %, or about 2 mol % of the total lipid present in the particle.

ある実施態様において、核酸－脂質粒子は、さらに、コレステロールを、粒子に存在する全脂質の、例えば、約１０mol％～約６０mol％または約４８mol％で含む。In some embodiments, the nucleic acid-lipid particles further comprise cholesterol, e.g., from about 10 mol% to about 60 mol% or about 48 mol% of the total lipid present in the particle.

ある実施態様において、リピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ(ＭＷ１４８７)(引用により本明細書に包含させるＵＳ２００９００２３６７３参照)、コレステロール(Sigma-Aldrich)およびＰＥＧ－セラミドＣ１６(Avanti Polar Lipids)を、脂質－ｄｓＲＮナノ粒子(すなわち、ＬＮＰ０１粒子)の製造に使用できる。エタノール中の各々の原液を次のとおり製造する：ＮＤ９８、１３３mg／ml；コレステロール、２５mg／ml、ＰＥＧ－セラミドＣ１６、１００mg／ml。次いで、ＮＤ９８、コレステロールおよびＰＥＧ－セラミドＣ１６原液を、例えば、４２：４８：１０モル濃度比で合わせる。合わせた脂質溶液を、最終エタノール濃度が約３５～４５％であり、最終酢酸ナトリウム濃度が約１００～３００mMであるように、水性ｄｓＲＮＡ(例えば、酢酸ナトリウムｐＨ５中)と混合する。脂質－ｄｓＲＮナノ粒子は、一般に混合により自然に形成される。所望の粒子径分布によって、得られたナノ粒子混合物を、例えば、Lipex Extruder(Northern Lipids, Inc)などのサーモバレル押し出し機を使用して、ポリカーボネート膜(例えば、１００nmカットオフ)を通して押し出し得る。ある例では、押し出し工程を省き得る。エタノール除去および同時の緩衝液交換を、例えば、透析またはタンジェンシャルフロー濾過により達成し得る。緩衝液を、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６.９、約ｐＨ７.０、約ｐＨ７.１、約ｐＨ７.２、約ｐＨ７.３または約ｐＨ７.４の、例えば、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)と交換し得る。
In one embodiment, lipidoid ND98·4HCl (MW 1487) (see US20090023673, incorporated herein by reference), cholesterol (Sigma-Aldrich), and PEG-ceramide C16 (Avanti Polar Lipids) can be used to prepare lipid-dsRN nanoparticles (i.e., LNP01 particles). Stock solutions of each in ethanol are prepared as follows: ND98, 133 mg/ml; cholesterol, 25 mg/ml, PEG-ceramide C16, 100 mg/ml. The ND98, cholesterol, and PEG-ceramide C16 stock solutions are then combined, for example, in a 42:48:10 molar ratio. The combined lipid solution is mixed with aqueous dsRNA (e.g., in sodium acetate pH 5) such that the final ethanol concentration is about 35-45% and the final sodium acetate concentration is about 100-300 mM. Lipid-dsRN nanoparticles generally form spontaneously upon mixing. Depending on the desired particle size distribution, the resulting nanoparticle mixture can be extruded through a polycarbonate membrane (e.g., 100 nm cutoff) using, for example, a thermobarrel extruder such as the Lipex Extruder (Northern Lipids, Inc). In some instances, the extrusion step can be omitted. Ethanol removal and simultaneous buffer exchange can be accomplished, for example, by dialysis or tangential flow filtration. The buffer can be exchanged, for example, with phosphate buffered saline (PBS) at about pH 7, for example, about pH 6.9, about pH 7.0, about pH 7.1, about pH 7.2, about pH 7.3, or about pH 7.4.

ＬＮＰ０１製剤は、例えば、引用により本明細書に包含させる、ＷＯ２００８０４２９７３に記載される。LNP01 formulations are described, for example, in WO2008042973, which is incorporated herein by reference.

さらなる例示的脂質－ｄｓＲＮＡ製剤を、表１に示す。
Further exemplary lipid-dsRNA formulations are shown in Table 1.

ＸＴＣ含有製剤はＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／０８８５３７に記載され、その内容を全体として引用により本明細書に包含させる。XTC-containing formulations are described in PCT Publication WO 2010/088537, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.

ＭＣ３含有製剤は、例えば、米国公開２０１０／０３２４１２０に記載され、その内容を全体として引用により本明細書に包含させる。MC3-containing formulations are described, for example, in U.S. Publication No. 2010/0324120, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.

ＡＬＮＹ－１００含有製剤はＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／０５４４０６に記載され、その内容を全体として引用により本明細書に包含させる。ALNY-100-containing formulations are described in PCT Publication WO2010/054406, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.

Ｃ１２－２００含有製剤はＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／１２９７０９に記載され、その内容を全体として引用により本明細書に包含させる。C12-200-containing formulations are described in PCT Publication WO2010/129709, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.

経口投与のための組成物および製剤は散剤または顆粒剤、マイクロ粒子剤、ナノ粒子剤、水もしくは非水性媒体中の懸濁液剤もしくは溶液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤またはミニタブレット剤を含む。濃厚剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましいことがあり得る。ある実施態様において、経口製剤は、本発明で注目されるｄｓＲＮＡを浸透増強剤界面活性剤およびキレート剤の１以上と共に投与するものである。適当な界面活性剤は、脂肪酸またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸またはその塩を含む。適当な胆汁酸／塩は、ケノデオキシコール酸(ＣＤＣＡ)およびウルソデオキシケノデオキシコール酸(ＵＤＣＡ)、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ナトリウムタウロ－２４,２５－ジヒドロ－フシデートおよびナトリウムグリコジヒドロフシデートを含む。適当な脂肪酸は、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはモノグリセリド、ジグリセリドまたは薬学的に許容されるその塩(例えば、ナトリウム)を含む。ある実施態様において、浸透増強剤の組み合わせ、例えば、脂肪酸／塩と胆汁酸／塩の組み合わせが使用される。一つの例示的組み合わせは、ラウリン酸ナトリウム塩、カプリン酸およびＵＤＣＡである。さらに浸透増強剤は、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルを含む。本発明で注目されるｄｓＲＮＡを、噴霧乾燥粒子を含む顆粒形態でまたはマイクロもしくはナノ粒子を形成するために複合体化させて、経口送達し得る。ＤｓＲＮＡ複合体化剤は、ポリ－アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキシエタン、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン(pollulans)、セルロースおよびデンプンを含む。適当な複合体化剤は、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ(ＴＤＡＥ)、ポリアミノスチレン(例えば、ｐ－アミノ)、ポリ(メチルシアノアクリレート)、ポリ(エチルシアノアクリレート)、ポリ(ブチルシアノアクリレート)、ポリ(イソブチルシアノアクリレート)、ポリ(イソヘキシルシアノアクリレート)、ＤＥＡＥ－メタクリレート、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミンおよびＤＥＡＥ－デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ(Ｄ,Ｌ－乳酸)、ポリ(ＤＬ－乳酸－コ－グリコール酸(ＰＬＧＡ)、アルギネートおよびポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含む。ｄｓＲＮＡのための経口製剤およびその製造は、米国特許６,８８７,９０６および６,７４７,０１４およびＵＳ２００３００２７７８０に詳述され、その各々を引用により本明細書に包含させる。Compositions and formulations for oral administration include powders or granules, microparticles, nanoparticles, suspensions or solutions in water or non-aqueous media, capsules, gel capsules, sachets, tablets or minitablets. Thickeners, flavorings, diluents, emulsifiers, dispersing aids or binders may be desirable. In some embodiments, oral formulations are those in which the dsRNA featured in the present invention is administered with one or more of a penetration enhancer surfactant and a chelating agent. Suitable surfactants include fatty acids or esters or salts thereof, bile acids or salts thereof. Suitable bile acids/salts include chenodeoxycholic acid (CDCA) and ursodeoxychenodeoxycholic acid (UDCA), cholic acid, dehydrocholic acid, deoxycholic acid, glycolic acid, glycodeoxycholic acid, taurocholic acid, taurodeoxycholic acid, sodium tauro-24,25-dihydro-fusidate and sodium glycodihydrofusidate. Suitable fatty acids include arachidonic acid, undecanoic acid, oleic acid, lauric acid, caprylic acid, capric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, linolenic acid, dicaprate, tricaprate, monoolein, dilaurin, glyceryl 1-monocaprate, 1-dodecylazacycloheptan-2-one, acylcarnitine, acylcholine or monoglyceride, diglyceride or pharma-ceutically acceptable salts thereof (e.g., sodium). In some embodiments, combinations of penetration enhancers are used, such as fatty acid/salt and bile acid/salt combinations. One exemplary combination is sodium lauric acid, capric acid and UDCA. Further penetration enhancers include polyoxyethylene-9-lauryl ether, polyoxyethylene-20-cetyl ether. The dsRNA featured in the present invention may be delivered orally in granular form, including spray-dried particles, or complexed to form micro- or nanoparticles. DsRNA complexing agents include poly-amino acids, polyimines, polyacrylates, polyalkylacrylates, polyoxyethanes, polyalkylcyanoacrylates, cationized gelatin, albumin, starch, acrylates, polyethylene glycol (PEG) and starch, polyalkylcyanoacrylates, DEAE-derivatized polyimines, pollulans, cellulose and starch. Suitable complexing agents include chitosan, N-trimethylchitosan, poly-L-lysine, polyhistidine, polyornithine, polyspermine, protamine, polyvinylpyridine, polythiodiethylaminomethylethylene P(TDAE), polyaminostyrene (e.g., p-amino), poly(methylcyanoacrylate), poly(ethylcyanoacrylate), poly(butylcyanoacrylate), poly(isobutylcyanoacrylate), poly(isohexylcyanoacrylate), DEAE-methacrylate, ... -hexyl acrylate, DEAE-acrylamide, DEAE-albumin and DEAE-dextran, polymethyl acrylate, polyhexyl acrylate, poly(D,L-lactic acid), poly(DL-lactic-co-glycolic acid (PLGA), alginate and polyethylene glycol (PEG). Oral formulations for dsRNA and their manufacture are described in detail in U.S. Patents 6,887,906 and 6,747,014 and US20030027780, each of which is incorporated herein by reference.

本発明の医薬組成物は、溶液、エマルジョンおよびリポソーム含有製剤を含むが、これらに限定されない。これらの組成物は、予め形成された液体、自己乳化固体および自己乳化半固体を含むが、これらに限定されない多様な成分から産生され得る。特に好ましいのは、肝臓癌などの肝障害を処置するとき、肝臓を標的とする製剤である。The pharmaceutical compositions of the present invention include, but are not limited to, solutions, emulsions, and liposome-containing formulations. These compositions may be produced from a variety of components, including, but not limited to, preformed liquids, self-emulsifying solids, and self-emulsifying semisolids. Particularly preferred are formulations that target the liver when treating liver disorders such as liver cancer.

簡便には単位投与量形態で提供され得る本発明の医薬製剤は、医薬業界で周知の慣用技法により製造できる。このような技法は、活性成分と医薬担体または添加物を合わせる工程を含む。一般に、製剤は、活性成分と液体担体または微粉化固体担体または両者を均一におよび密接に合わせ、次いで、必要であれば、製品を形作ることにより、製造する。The pharmaceutical formulations of the present invention, which may conveniently be provided in unit dosage form, may be prepared by conventional techniques well known in the pharmaceutical art. Such techniques include the step of bringing into association the active ingredient with pharmaceutical carriers or excipients. In general, the formulations are prepared by uniformly and intimately bringing into association the active ingredient with liquid carriers or finely divided solid carriers, or both, and then, if necessary, shaping the product.

Ｖ. 本発明の方法の使用
本発明は、種々の方法および処置レジメンを記載する。本方法は、ここに提供するＲＮＡｉ剤およびワクチンの使用として提供され得ることは理解される。すなわち、本発明は、Ｂ型肝炎感染を有する対象を処置する方法において使用するための、
ａ) 少なとも３つのＨＢＶ転写物を標的とするＲＮＡｉ剤であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤；
ｂ) ＨＢＶコア抗原(ＨＢｃＡｇ)およびＨＢＶ表面抗原(ＨＢｓＡｇ)を含むタンパク質ベースのワクチン；および
ｃ) ＨＢｃＡｇまたはＨＢｓＡｇをコードする発現ベクター構築物を含む核酸ベースのワクチン(ここで、構築物は該タンパク質ベースのワクチンとエピトープを共有するタンパク質をコードする)；(それにより対象を処置する)；
を提供する。V. Use of the Methods of the Invention The present invention describes various methods and treatment regimens. It is understood that the methods can be provided as the use of the RNAi agents and vaccines provided herein. That is, the present invention provides a method for treating a subject with hepatitis B infection,
a) an RNAi agent that targets at least three HBV transcripts, the RNAi agent comprising a sense strand and an antisense strand;
b) a protein-based vaccine comprising HBV core antigen (HBcAg) and HBV surface antigen (HBsAg); and c) a nucleic acid-based vaccine comprising an expression vector construct encoding HBcAg or HBsAg, where the construct encodes a protein that shares an epitope with the protein-based vaccine; thereby treating a subject;
to provide.

使用は、ここに提供する全てのバリエーションおよび例示的ＲＮＡｉ剤、タンパク質ベースのワクチンおよび核酸ベースのワクチンを含む。The uses include all variations and exemplary RNAi agents, protein-based vaccines and nucleic acid-based vaccines provided herein.

VI. 本発明の方法を実施するためのキット
本発明は、Ｂ型肝炎感染を有する対象の処置のための種々の方法、処置レジメンおよび薬剤の使用を記載する。本発明の方法の実施のための薬剤は、ここに提供する開示に基づき製造され得ることは理解される。このようなキットは、
ａ) 少なとも３つのＨＢＶ転写物を標的とするＲＮＡｉ剤であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤；
ｂ) ＨＢＶコア抗原(ＨＢｃＡｇ)およびＨＢＶ表面抗原(ＨＢｓＡｇ)を含むタンパク質ベースのワクチン；
ｃ) ＨＢｃＡｇまたはＨＢｓＡｇをコードする発現ベクター構築物を含む核酸ベースのワクチン(ここで、構築物は該タンパク質ベースのワクチンとエピトープを共有するタンパク質をコードする)；(それにより対象を処置する)；および
ｄ) Ｂ型肝炎感染を有する対象を処置する方法において使用するための指示
を含む。VI. Kits for carrying out the methods of the invention The present invention describes various methods, treatment regimens and uses of agents for the treatment of subjects with hepatitis B infection. It is understood that agents for carrying out the methods of the invention can be manufactured based on the disclosure provided herein. Such kits include:
a) an RNAi agent that targets at least three HBV transcripts, the RNAi agent comprising a sense strand and an antisense strand;
b) protein-based vaccines containing HBV core antigen (HBcAg) and HBV surface antigen (HBsAg);
c) a nucleic acid-based vaccine comprising an expression vector construct encoding HBcAg or HBsAg, wherein the construct encodes a protein that shares an epitope with the protein-based vaccine; thereby treating a subject; and d) instructions for use in a method of treating a subject having a Hepatitis B infection.

使用は、ここに提供する全てのバリエーションおよび例示的ＲＮＡｉ剤、タンパク質ベースのワクチンおよび核酸ベースのワクチンを含む。キットの構成要素を、例えば、箱に一緒にし得る。ある実施態様において、本発の構成要素は、例えば、異なる保存必須要件のために、別々に提供されるが、例えば、使用のための添付文書に基づき、共に使用するために提供される。The uses include all variations and exemplary RNAi agents, protein-based vaccines, and nucleic acid-based vaccines provided herein. The components of the kit may be packaged together, for example, in a box. In some embodiments, the components of the present invention are provided separately, for example, due to different storage requirements, but are provided for use together, for example, based on a package insert for use.

本発明を、次の実施例によりさらに説明するが、これを限定的と解釈してはならない。本明細書ならびに図面、付属表Ａおよび配列表を通して引用した全ての引用文献、特許および特許出願公開は、引用により本明細書に包含させる。The present invention is further illustrated by the following examples, which should not be construed as limiting. All references, patents and published patent applications cited throughout this specification, as well as the drawings, Appendix A, and Sequence Listing, are hereby incorporated by reference.

実施例１. 材料および方法
例示的ｉＲＮＡ
例示的ｉＲＮＡ標的部位ならびに非修飾および修飾ｓｉＲＮＡ配列を、付属表Ａの表に提供する。
下記実験に使用した化学修飾ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ二本鎖は、次の配列を有する。

修飾核酸配列のヌクレオチド単量体の略語は、付属表Ａの表１に提供される。
ＡＤ－６６８１０の標的部位はGTGTGCACTTCGCTTCACA(配列番号３９)であり、これはＮＣ＿００３９７７.１(配列番号１)のヌクレオチド１５７９～１５９７である。
ＡＤ－６６８１６の標的部位はCACCATGCAACTTTTTCACCT(配列番号４０)であり、これはＮＣ＿００３９７７.１(配列番号１)のヌクレオチド１８１２～１８３２である。Example 1. Materials and Methods Exemplary iRNAs
Exemplary iRNA target sites and unmodified and modified siRNA sequences are provided in the table in Appendix A.
The chemically modified HBV-siRNA duplex used in the experiments described below has the following sequence:

Abbreviations for the nucleotide monomers of the modified nucleic acid sequences are provided in Table 1 of Appendix A.
The target site for AD-66810 is GTGTGCACTTCGCTTCACA (SEQ ID NO:39), which is nucleotides 1579 to 1597 of NC_003977.1 (SEQ ID NO:1).
The target site for AD-66816 is CACCATGCAACTTTTTCACCT (SEQ ID NO:40), which is nucleotides 1812 to 1832 of NC_003977.1 (SEQ ID NO:1).

ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡの細胞培養評価
ｈＮＴＣＰ発現ＨｅｐＧ２細胞を、デュプリケートで感染させた(１００感染効率(ＭＯＩ))ＨＢＶ粒子／細胞(サブタイプａｙｗ))。感染後４日目、細胞をトリプシン処理し、多ウェルプレートに再播種し、対照またはＨＢＶ－ｓｉＲＮＡＡＤ－６６８１０(上記表に示す化学修飾ならびにそれぞれ配列番号３７および３０に示すセンスおよびアンチセンス配列を有する)またはＡＤ－６６８１６(上記表に示す化学修飾ならびにそれぞれ配列番号３８および３２に示すセンスおよびアンチセンス配列を有する)でトランスフェクトし、各々、リポフェクタミン(登録商標)ＲＮＡｉＭａｘを使用して１００nM、１０nMまたは１nMを送達した。上清を再播種後３日目、６日目、１０日目、１３日目および１７日目に採取し、ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇレベルを、非トランスフェクト対照に対して決定した。ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベルを、Abbott Architect免疫アッセイ分析装置(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA)で測定する化学発光微粒子免疫測定法(ＣＭＩＡ)を使用して、決定した。Cell Culture Evaluation of HBV-siRNA hNTCP-expressing HepG2 cells were infected in duplicate (100 multiplicity of infection (MOI)) with HBV particles/cell (subtype ayw). Four days after infection, cells were trypsinized, replated in multi-well plates and transfected with control or HBV-siRNA AD-66810 (with chemical modifications shown in the table above and sense and antisense sequences shown in SEQ ID NOs: 37 and 30, respectively) or AD-66816 (with chemical modifications shown in the table above and sense and antisense sequences shown in SEQ ID NOs: 38 and 32, respectively), delivered at 100 nM, 10 nM or 1 nM, respectively, using Lipofectamine® RNAiMax. Supernatants were harvested 3, 6, 10, 13 and 17 days after replated and HBeAg and HBsAg levels were determined relative to non-transfected controls. HBsAg and HBeAg levels were determined using chemiluminescent microparticle immunoassay (CMIA) measured on an Abbott Architect immunoassay analyzer (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA).

マウス、ｓｉＲＮＡ投与およびワクチン接種
ＨＢＶ－トランスジェニックマウス(系統ＨＢＶ１.３ｘｆｓ(ＨＢＶ遺伝子型Ｄ、サブタイプａｙｗ))は、施設ガイドラインに従う特定の病原体フリー条件下で社内飼育由来であった。
ｓｉＲＮＡ投与について、図面および下記実施例に示すとおりマウスに、ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡ発現のために、３mg／kgまたは９mg／kg用量の対照ｓｉＲＮＡまたはＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ(修飾ＡＤ－６６８１０または修飾ＡＤ－６６８１６)を皮下投与するか；または１×１０^１１ＡＡＶ粒子を尾静脈注射により静脈内投与した。
タンパク質ワクチン接種について、マウスを、５０μｌＰＢＳ中３１.９１μgの合成ホスホロチオエート化ＣｐＧＯＤＮ１６６８および２５μg ポリ[ジ(ナトリウムカルボキシレートエチル－フェノキシ)ホスファゼン](ＰＣＥＰ)と混合した組み換え酵母ＨＢｓＡｇおよび大腸菌ＨＢｃＡｇ(APP Latvijas Biomedicinas, Riga, Latvia)で皮下的に免疫化した。
組み換えＭＶＡは、先に記載のとおり、相同組み換えおよび宿主範囲選択により産生した(Staib et al., 2003. Biotechniques. 34:694-700)。ＨＢｃＡｇ全体(遺伝子型Ｄ、サブタイプａｙｗ)およびＨＢｓＡｇオープンリーディングフレーム(遺伝子型Ａ、サブタイプａｙｗまたはａｄｗ)を、ＭＶＡトランスファープラスミドｐIIIΔＨＲ－ＰＨ５またはｐIIIΔＨＲ－Ｐ７.５にクローン化し、それによりＨＢＶタンパク質を早期／後期ワクシニアウイルス特異的プロモーターＰＨ５(ＨＢｃＡｇａｙｗ／ＨＢｓＡｇａｙｗ／ＨＢｓＡｇａｄｗ)またはＰ７.５(ＨＢｓＡｇａｙｗ)の制御下においた。各ウイルスの構築後、遺伝子発現、挿入ＤＮＡの配列およびウイルス純度を確認した。ワクチン製剤産生のために、ＭＶＡをＣＥＦで通常どおり繁殖させ、スクロースを通す超遠心分離により精製し、１mM Ｔｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ９.０で再構成し、標準的法に従い力価測定した(Staib et al., 2004. Methods Mol Biol. 269:77-100)。ＭＶＡワクチン接種について、マウスに５００μｌＰＢＳ中各組み換えＭＶＡ１×１０^８感染単位で腹腔内にワクチン接種した。
特定の投与レジメンを下の実施例および図３、７および１２に提供する。Mice, siRNA Administration and Vaccination HBV-transgenic mice (strain HBV1.3xfs (HBV genotype D, subtype ayw)) were derived from in-house breeding under specific pathogen-free conditions following institutional guidelines.
For siRNA administration, mice were administered control siRNA or HBV-siRNA (modified AD-66810 or modified AD-66816) at a dose of 3 mg/kg or 9 mg/kg subcutaneously for HBV-shRNA expression; or 1 x¹⁰ AAV particles were administered intravenously via tail vein injection, as shown in the figures and in the Examples below.
For protein vaccination, mice were immunized subcutaneously with recombinant yeast HBsAg and E. coli HBcAg (APP Latvijas Biomedicinas, Riga, Latvia) mixed with 31.91 μg of synthetic phosphorothioated CpG ODN 1668 and 25 μg poly[di(sodium carboxylate ethyl-phenoxy)phosphazene] (PCEP) in 50 μl PBS.
Recombinant MVA was produced by homologous recombination and host range selection as previously described (Staib et al., 2003. Biotechniques. 34:694-700). The entire HBcAg (genotype D, subtype ayw) and HBsAg open reading frames (genotype A, subtypes ayw or adw) were cloned into MVA transfer plasmids pIIIΔHR-PH5 or pIIIΔHR-P7.5, which placed the HBV proteins under the control of the early/late vaccinia virus specific promoters PH5 (HBcAg ayw/HBsAg ayw/HBsAg adw) or P7.5 (HBsAg ayw). After construction of each virus, gene expression, the sequence of the inserted DNA and virus purity were confirmed. For vaccine preparation production, MVA was routinely propagated in CEF, purified by ultracentrifugation through sucrose, reconstituted in 1 mM Tris-HCl pH 9.0, and titered according to standard methods (Staib et al., 2004. Methods Mol Biol. 269:77-100). For MVA vaccination, mice were vaccinated intraperitoneally with¹ x 10 infectious units of each recombinant MVA in 500 μl PBS.
Specific dosing regimens are provided in the Examples below and in Figures 3, 7 and 12.

血清学的分析
ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの血清レベルを、Abbott Architect免疫アッセイ分析装置(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA)で測定する化学発光微粒子免疫測定法(ＣＭＩＡ)を使用する、１：３３希釈で決定し；抗ＨＢｓレベルを１：１００希釈で決定した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応による血清ＨＢＶ力価の定量および血清中のＨＢＶＤＮＡレベル決定を、Untergasser et al., 2006(Hepatology. 43:539-47)に記載のとおり実施した。ＨＢＶＤＮＡの量を、処置前ＤＮＡレベルに対して正規化した。
抗ＨＢｃ抗体のレベルを、ＢＥＰIIIプラットフォームでのEnzgnost抗ＨＢｃモノクローナル試験(Both Siemens Healthcare, Eschborn, Germany)を使用して、１：２０希釈で決定した。サンプルの測定値が直線範囲を超えたならば、適宜、高いまたは低い希釈を使用した。
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応による血清ＨＢＶ力価の定量および血清中のＨＢＶＤＮＡレベル決定を、Untergasser et al., 2006(Hepatology. 43:539-47)に記載のとおり実施した。ＨＢＶＤＮＡの量を、処置前ＤＮＡレベルに対して正規化した。
ＡＬＴ活性を、レフロトロンＧＰＴ／ＡＬＴ試験(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を使用して、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)中１：４希釈で採血日に測定した。Serological Analysis Serum levels of HBsAg and HBeAg were determined at a 1:33 dilution using a chemiluminescent microparticle immunoassay (CMIA) measured on an Abbott Architect immunoassay analyzer (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA); anti-HBs levels were determined at a 1:100 dilution. Quantification of serum HBV titers by real-time polymerase chain reaction and determination of HBV DNA levels in serum were performed as described by Untergasser et al., 2006 (Hepatology. 43:539-47). HBV DNA amounts were normalized to pretreatment DNA levels.
Anti-HBc antibody levels were determined using the Enzgnost anti-HBc monoclonal test on the BEPIII platform (Both Siemens Healthcare, Eschborn, Germany) at a dilution of 1:20. If sample measurements were outside the linear range, higher or lower dilutions were used as appropriate.
Quantification of serum HBV titers by real-time polymerase chain reaction and determination of HBV DNA levels in serum were performed as described by Untergasser et al., 2006 (Hepatology. 43:539-47). HBV DNA amounts were normalized to pretreatment DNA levels.
ALT activity was measured on the day of blood collection using the Leflotron GPT/ALT test (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) at a 1:4 dilution in phosphate-buffered saline (PBS).

リンパ球刺激アッセイ
肝臓関連リンパ球(ＬＡＬ)をStross et al., 2012(Hepatology 56:873-83)に記載のとおり単離し、１mg／ml ブレフェルジンＡ(Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany)存在下、１２時間、Ｈ２－ｋｂ－またはＨ－２Ｄｂ－制限ペプチド(Backes, 2016参照)で刺激した。細胞をエチジウムモノアジドブロマイド(Invitrogen(登録商標), Karlsruhe, Germany)で生存／死染色し、抗ＣＤ１６／ＣＤ３２－Ｆｃ－Ｂｌｏｃｋ(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)でブロックした。表面マーカーをＰＢ－コンジュゲート抗ＣＤ８－アルファおよびＰＥ－コンジュゲート抗ＣＤ４(eBiosciences, Eching, Germany)で染色した。細胞内サイトカイン染色(ＩＣＳ)を、製造業者の推奨に従いCytofix/Cytopermキット(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)を使用して、ＦＩＴＣ抗ＩＦＮ－ガンマ(ＸＭＧ１.２)、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＴＮＦ－アルファおよびＡＰＣ抗ＩＬ－２(eBiosciences, Ech-ing, Germany)で実施した。同じデータを２回分析し、２回目は、死亡細胞をより厳密に排除した。Lymphocyte stimulation assay Liver-associated lymphocytes (LAL) were isolated as described by Stross et al., 2012 (Hepatology 56:873-83) and stimulated with H2-kb- or H-2Db-restricted peptides (see Backes, 2016) in the presence of 1 mg/ml Brefeldin A (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany) for 12 h. Cells were stained for live/dead with ethidium monoazide bromide (Invitrogen®, Karlsruhe, Germany) and blocked with anti-CD16/CD32-Fc-Block (BD Biosciences, Heidelberg, Germany). Surface markers were stained with PB-conjugated anti-CD8-alpha and PE-conjugated anti-CD4 (eBiosciences, Eching, Germany). Intracellular cytokine staining (ICS) was performed with FITC anti-IFN-gamma (XMG1.2), PE-Cy7 anti-TNF-alpha and APC anti-IL-2 (eBiosciences, Ech-ing, Germany) using the Cytofix/Cytoperm kit (BD Biosciences, Heidelberg, Germany) according to the manufacturer's recommendations. The same data were analyzed twice, the second time with more rigorous exclusion of dead cells.

ＨＢｃ発現肝細胞の免疫組織化学染色
肝臓を採取し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した。肝臓を薄切りし(２μm)、切片を一次抗体としてウサギ抗ＨＢｃＡｇ(Diagnostic Biosystems, Pleasanton, CA; #RP 017; １：５０希釈；１００℃で３０分間、ＥＤＴＡで回収)およびホースラディッシュペルオキシド結合二次抗体で染色した。Ventana緩衝液でのインキュベーションおよび染色を、ＮＥＸＥＳ免疫組織化学ロボット(Ventana Instruments)でIVIEW DAB Detection Kit(Ventana Instruments)またはBond MAX(Leica Biosystems)で実施した。分析について、スライドをＳＣＮ４００スライドスキャナーを使用してスキャンし、陽性細胞を、統合Tissue AI softwareを使用して計数した(両者ともLeica Biosystems)。Immunohistochemical staining of HBc-expressing hepatocytes Livers were harvested, fixed in 4% paraformaldehyde, and embedded in paraffin. Livers were sliced (2 μm) and sections were stained with rabbit anti-HBcAg (Diagnostic Biosystems, Pleasanton, CA; #RP 017; 1:50 dilution; 100°C for 30 min, retrieved with EDTA) as primary antibody and horseradish peroxide-conjugated secondary antibody. Incubation with Ventana buffer and staining were performed with IVIEW DAB Detection Kit (Ventana Instruments) or Bond MAX (Leica Biosystems) on a NEXES immunohistochemistry robot (Ventana Instruments). For analysis, slides were scanned using an SCN 400 slide scanner and positive cells were counted using integrated Tissue AI software (both Leica Biosystems).

肝臓ライセートからのＨＢＶ転写物
肝臓ライセートからのＨＢＶＲＮＡの分析について、ＲＮＡをRNeasy mini kit(Qiagen)を用いて３０mg 肝臓組織から抽出し、ｃＤＮＡをSuperscript III kit(Thermo Fisher Scientific)で合成した。ＨＢＶ転写物を、３.５kb転写物のみに特異的なプライマー(フォワードプライマー５’－ＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＴＣＧＣＡＣＴＣＣ－３’(配列番号４１)；リバースプライマー５’－ＧＡＧＧＣＧＡＧＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴ－３’(配列番号４２))または全ＨＢＶ転写物の共通３'末端に結合するプライマー(フォワードプライマー５’－ＴＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＣ－３’(配列番号４３)；リバースプライマー５’－ＡＡＧＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡＧ－３’(配列番号４４))で増幅させた(変性：９５℃で５分；増幅：９５℃で３秒、６０℃で３０秒(４０サイクル))(Yan et al., 2012)。結果を、マウスＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した(フォワードプライマー５’－ＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣＣＣ－３’(配列番号４５)；リバースプライマー５’－ＣＣＡＣＧＡＣＧＧＡＣＡＣＡＴＴ－３’(配列番号４６))(変性：９５℃で５分；増幅：９５℃で１５秒、６０℃で１０秒、７２℃で２５秒(４５サイクル))。全ＰＣＲ反応を、LightCycler 480(Roche Diagnostics)で実施した。HBV Transcripts from Liver Lysates For analysis of HBV RNA from liver lysates, RNA was extracted from 30 mg liver tissue using the RNeasy mini kit (Qiagen), and cDNA was synthesized with a Superscript III kit (Thermo Fisher Scientific). HBV transcripts were amplified with primers specific for only the 3.5 kb transcript (forward primer 5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3' (SEQ ID NO: 41); reverse primer 5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3' (SEQ ID NO: 42)) or with primers binding to the common 3' end of all HBV transcripts (forward primer 5'-TCACCAGCACCATGCAAC-3' (SEQ ID NO: 43); reverse primer 5'-AAGCCACCCAAGGCACAG-3' (SEQ ID NO: 44)) (denaturation: 95°C for 5 min; amplification: 95°C for 3 s, 60°C for 30 s (40 cycles)) (Yan et al., 2012). Results were normalized to mouse GAPDH expression (forward primer 5'-ACCAACTGCTTAGCCC-3' (SEQ ID NO: 45); reverse primer 5'-CCACGACGGACACATT-3' (SEQ ID NO: 46)) (denaturation: 95°C for 5 min; amplification: 95°C for 15 s, 60°C for 10 s, 72°C for 25 s (45 cycles)). All PCR reactions were performed on a LightCycler 480 (Roche Diagnostics).

ＡＡＶ－ＨＢＶマウスモデル
ＡＡＶマウスモデルについて、野生型Ｃ５７／Ｂｌ６マウス(９週齢；６動物／処置群)に、遺伝子型Ｄの１.２倍過剰な長さのＨＢＶゲノムを担持する、アデノ随伴ウイルス血清型８(ＡＡＶ８)(ＡＡＶ－ＨＢＶ１.２)の２×１０^１０ゲノム等量(ｇｅｑ)をｉ.ｖ.注射した(－２８日目)(例えば、Yang, et al. (2014) Cell and Mol Immunol 11:71参照)。ＡＡＶ形質導入４週間から開始して(０日目)、動物を対照ｓｉＲＮＡまたはＨＢＶｓｉＲＮＡ(ＡＤ－６６８１６またはＡＤ－６６８１０)の３回の注射(３mg／kg ｂｗ、ｎ＝１２／群)で処置した(０日目、２９日目および５７日目)。各ｓｉＲＮＡ処置群を２群(ｎ＝６／群)に分け、５７日目および７０日目に組み換えＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ(各１５μg)および１０μg ｃ－ジ－ＡＭＰを投与し、８４日目にＭＶＡ－ＨＢｓおよびＭＶＡ－ＨＢｃ(各５×１０^７ｇｅｑ)でブーストからなるワクチンレジメンで処置しないか、または処置した。処置レジメンを示す模式図を図１２に提供する。AAV-HBV Mouse Model For the AAV mouse model, wild-type C57/B16 mice (9 weeks old; 6 animals/treatment group) were injected i.v. (day -28) with^2x10 genome equivalents (geq) of adeno-associated virus serotype 8 (AAV8) (AAV-HBV1.2), carrying a 1.2-fold excess of HBV genome length over genotype D (see, e.g., Yang, et al. (2014) Cell and Mol Immunol 11:71). Starting 4 weeks after AAV transduction (day 0), animals were treated with three injections (3 mg/kg bw, n=12/group) of control siRNA or HBV siRNA (AD-66816 or AD-66810) (days 0, 29, and 57). Each siRNA-treated group was divided into two groups (n=6/group) and either untreated or treated with a vaccine regimen consisting of recombinant HBsAg, HBcAg (15 μg each) and 10 μg c-di-AMP on days 57 and 70, and boosted with MVA-HBs and MVA-HBc (5×10⁷ geq each) on day 84. A schematic showing the treatment regimen is provided in FIG.

実施例２－ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞培養におけるＨＢＶ－ｓｉＲＮＡの評価およびＨＢＶｘｆｓマウスにおける用量検定実験
抗ＨＢＶｓｉＲＮＡを、上記のとおり、修飾ＡＤ－６６８１０または修飾ＡＤ－６６８１６ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡの一つの１nM、１０nMまたは１００nMで処置したＨＢＶ感染ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞を使用するインビトロ感染モデルで、ＨＢＶ抗原およびＤＮＡの効率的ノックダウンについて評価した。上清をｓｉＲＮＡ処置後３日目、６日目、１０日目、１３日目および１７日目に採取し、非トランスフェクト対照と比較して、ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇレベルについてアッセイした。両ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡは、ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇ両者の発現を効果的にノックダウンし、最高レベルのノックダウンは１３日目および１７日目に観察された。対照ｓｉＲＮＡで顕著なノックダウンは観察されなかった。これらのデータは、ＡＤ－６６８１０またはＡＤ－６６８１６ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡが、ＨＢＶ感染のインビトロ系で持続性様式でＨＢＶ抗原発現のノックダウンに効果的であることを示す。
次いで、ＨＢＶおよび対照ｓｉＲＮＡを慢性Ｂ型肝炎のＨＢＶｘｆｓトランスジェニックモデルで試験した。ＨＢＶｘｆｓマウスは、肝臓特異的プロモーターの制御下に発現する、統合ＨＢＶゲノムを含む。約１０週齢で、マウスに３mg／kgまたは９mg／kg用量のＡＤ－６６８１０またはＡＤ－６６８１６ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡの一つ(ｎ＝６／群)を投与した。血液サンプルをｓｉＲＮＡ処置後６日目、１３日目および２１日目に採取し、血清を調製した。血清のＨＢｅＡｇ、ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶＤＮＡレベル(図２Ａ～２Ｃ)は、上記のとおり決定した。さらに、ＲＮＡを肝臓から単離し、総ＨＢＶＲＮＡおよびＨＢＶ３.５kB転写物レベルをYan, 2012の方法を使用して検出し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した(図２Ｄおよび２Ｅ)。
両用量のＨＢＶ－ｓｉＲＮＡの両者は、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ発現を効果的にノックダウンし、対照レベルと比較して血清のＨＢＶＤＮＡレベルを減少させることが示された(図２Ａ～２Ｃ参照)。さらに、ＧＡＰＤＨＤＮＡに対する総肝臓ＨＢＶＲＮＡおよびＧＡＰＤＨＲＮＡレベルに対する３.５kb ＨＢＶＲＮＡは、対照レベルと比較して、両用量のｔｈｅＨＢＶｓｉＲＮＡで強度に減少した(図２Ｄおよび２Ｅ)。Ｂこれらの結果に基づき、３mg／kg用量をさらなる実験での使用のために選択した。Example 2 - Evaluation of HBV-siRNA in HepG2-NTCP cell cultures and dose-finding experiments in HBVxfs mice Anti-HBV siRNAs were evaluated for efficient knockdown of HBV antigens and DNA in an in vitro infection model using HBV-infected HepG2-NTCP cells treated with 1 nM, 10 nM or 100 nM of modified AD-66810 or modified AD-66816 HBV-siRNA or one of the control siRNAs as described above. Supernatants were collected on days 3, 6, 10, 13 and 17 after siRNA treatment and assayed for HBeAg and HBsAg levels compared to non-transfected controls. Both HBV-siRNAs effectively knocked down both HBeAg and HBsAg expression, with the highest levels of knockdown observed on days 13 and 17. No significant knockdown was observed with the control siRNA. These data indicate that AD-66810 or AD-66816 HBV-siRNA is effective in knocking down HBV antigen expression in a sustained manner in an in vitro system of HBV infection.
HBV and control siRNA were then tested in the HBVxfs transgenic model of chronic hepatitis B. HBVxfs mice contain an integrated HBV genome expressed under the control of a liver-specific promoter. At approximately 10 weeks of age, mice were administered 3 mg/kg or 9 mg/kg doses of AD-66810 or AD-66816 HBV-siRNA or one of the control siRNAs (n=6/group). Blood samples were collected on days 6, 13, and 21 after siRNA treatment, and serum was prepared. Serum HBeAg, HBsAg, and HBV DNA levels (Figures 2A-2C) were determined as described above. Additionally, RNA was isolated from liver and total HBV RNA and HBV3.5kB transcript levels were detected using the method of Yan, 2012, and normalized to GAPDH expression (Figures 2D and 2E).
Both doses of HBV-siRNA were shown to effectively knock down HBsAg and HBeAg expression and reduce serum HBV DNA levels compared to control levels (see Figures 2A-2C). Furthermore, total liver HBV RNA to GAPDH DNA and 3.5 kb HBV RNA to GAPDH RNA levels were strongly reduced by both doses of the HBV siRNA compared to control levels (Figures 2D and 2E). Based on these results, the 3 mg/kg dose was selected for use in further experiments.

実施例３－ＨＢＶトランスジェニックマウスモデルにおける治療ワクチン投与前のヌクレオチ(シ)ドアナログに対するｓｉＲＮＡでの抗原負荷の減少比較
ＨＢＶｘｆｓマウスモデルでＨＢＶを標的とするｓｉＲＮＡがＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの発現を効果的にノックダウンし、血清のＨＢＶＤＮＡレベルを減少できることが証明されたため、プライム－ブーストレジメンを使用する治療ワクチン投与前のヌクレオシドアナログエンテカビルまたはＨＢＶ－ｓｉＲＮＡでのマウスの処置の効果を試験した。処置スキームを図３に示す。
マウスを、プライム－ブーストレジメンを使用するワクチン接種前に６処置レジメンの一つで前処置した(ｎ＝６／群)：
(１)前処置無し；
(２)０週目の処置にから開始して、試験を通してエンテカビル１μg／ml水溶液(Luetgehetmann et al., 2011, Gastroenterology.140:2074-83に提供される計算に基づき約４mg／日の予想用量)；
(３)対照ｉＲＮＡ剤の０週目、４週目、８週目および１２週目の初日の３mg／kg用量；
(４)ＨＢＶをコードするｓｈＲＮＡをコードする発現ベクター(ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡ)の０週目の初日の１回用量(Michler et al., 2016)；または
(５－６)０週目、４週目、８週目および１２週目の初日に３mg／kg用量の修飾ＡＤ－６６８１６または修飾ＡＤ－８６６１０(総称的にＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ)。Example 3 - Comparison of Reduction of Antigen Load with siRNA Versus Nucleotide Analogues Prior to Therapeutic Vaccination in an HBV Transgenic Mouse Model Having demonstrated that HBV-targeting siRNA can effectively knock down HBsAg and HBeAg expression and reduce serum HBV DNA levels in the HBVxfs mouse model, the effect of treating mice with the nucleoside analogue entecavir or HBV-siRNA prior to therapeutic vaccination using a prime-boost regimen was examined. The treatment scheme is shown in Figure 3.
Mice were pretreated with one of six treatment regimens prior to vaccination using a prime-boost regimen (n=6/group):
(1) No pretreatment;
(2) Entecavir 1 μg/mL in water (estimated dose of approximately 4 mg/day based on calculations provided in Luetgehetmann et al., 2011, Gastroenterology. 140:2074-83) beginning at week 0 of treatment and continuing throughout the study;
(3) a 3 mg/kg dose of a control iRNA agent on the first day of weeks 0, 4, 8, and 12;
(4) a single dose on the first day of week 0 of an expression vector encoding an shRNA encoding HBV (HBV-shRNA) (Michler et al., 2016); or
(5-6) Modified AD-66816 or modified AD-86610 (collectively HBV-siRNA) at a dose of 3 mg/kg on the first day of weeks 0, 4, 8, and 12.

１２週目および１４週目の初日に、３１.９μg 合成ホスホロチオエート化ＣｐＧＯＤＮ１６６８ (ＣｐＧ)および２５μg ポリ[ジ(ナトリウムカルボキシレートエチル－フェノキシ)ホスファゼン](ＰＣＥＰ)でアジュバントされた組み換え発現酵母ＨＢｓＡｇ(１５μg)および大腸菌発現ＨＢｃＡｇ(１５μg)の混合物を、タンパク質－プライムワクチン接種(Backes, 2016)として全マウスに皮下投与した。
１６週目の初日、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｃＡｇを発現する改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａの混合物(各ウイルス５×１０^７粒子)を、ブーストワクチン接種として、全マウスに投与した(Backes, 2016)。
血液サンプルを０週目、２週目、４週目、８週目、１２週目、１６週目および１７週目の初日に得て、それから調製した血清サンプルでＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶＤＮＡのレベルについてアッセイした。結果を図４に示す。 On the first day of weeks 12 and 14, all mice were administered a mixture of recombinantly expressed yeast HBsAg (15 μg) and E. coli expressed HBcAg (15 μg) adjuvanted with 31.9 μg synthetic phosphorothioated CpG ODN 1668 (CpG) and 25 μg poly[di(sodium carboxylate ethyl-phenoxy)phosphazene] (PCEP) subcutaneously as a protein-prime vaccination (Backes, 2016).
On the first day of week 16, all mice were administered a mixture of modified vaccinia viruses Ankara expressing HBsAg or HBcAg (^5x107 particles of each virus) as a boost vaccination (Backes, 2016).
Blood samples were obtained on the first day of weeks 0, 2, 4, 8, 12, 16 and 17, and serum samples prepared therefrom were assayed for levels of HBsAg, HBeAg and HBV DNA. The results are shown in FIG.

群１、２および３(偽、エンテカビル、対照ｉＲＮＡ剤)のマウスのＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベルは類似した。ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡまたはＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ(ＡＤ－６６８１６またはＡＤ－８６６１０)単独で、血清におけるＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶＤＮＡの有意な減少を起こした(図４Ａ～４Ｃ)。３用量プライム－ブーストワクチン接種スキームは、全群でのＨＢｓＡｇのさらなる減少と、ＨＢＶ－ｓｈＲＮＡおよびＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ群の一部動物でのＨＢｓＡｇレベルの検出レベル未満への減少をもたらした。しかしながら、ワクチン処置は、いずれの群でもＨＢｅＡｇレベルを減少させなかった。メカニズムに拘束されないが、ＨＢｓＡｇは減少して、ＨＢｅＡｇしないのは、ｅ抗原ではなく、Ｃタンパク質のタンパク質分解プロセシングにより産生される、ｓ抗原に対するワクチンにより誘発された免疫応答によりもたらされることが提販される(下記図５参照)。
ＨＢＶＤＮＡレベルは、エンテカビル単独で定量限界未満まで減少せず、３用量プライム－ブーストワクチンの効果は検出されなかった(図４Ｃ)。偽処置およびＨＢＶ－ｓｈＲＮＡ、ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡおよび対照ｓｉＲＮＡでの処置はすべてＨＢＶＤＮＡレベルを減少させ、ＨＢＶ－ＤＮＡレベルは全群でプライム－ブーストワクチンによりさらに減少した。この実験で、偽処置および対照ｓｉＲＮＡがＨＢＶＤＮＡレベルを減少させた理由は不明であった。他の実験では対照ｓｉＲＮＡでの処置に応答したＨＢＶＤＮＡの減少は観察されなかった(例えば、図２Ｃおよび８Ｃ参照)。これらのデータは、ＲＮＡｉが、ウイルス抗原減少においてヌクレオチ(シ)ドアナログ治療より優れることを示す。また、ＲＮＡｉおよびその後のワクチン接種は、いずれかの薬剤単独を超える、ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶＤＮＡレベルに対する組み合わせた効果を有する。
実験最終日(１７週目の初日)、マウスを屠殺し、肝臓を採取した。肝臓関連リンパ球を肝臓から単離し、ペプチド刺激後、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を細胞内サイトカイン染色により測定した。特に、肝臓内ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、Backes, 2016に提供される方法を使用して、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇおよびＭＶＡウイルス粒子の応答について評価した。データを、図５Ａ～５Ｃに提供する最初の分析では死亡免疫細胞の排除が不十分であったため、死亡免疫細胞の排除のために二つの異なる閾値を使用して２回分析した。２回目の分析を図５Ｄ～５Ｆに示す。２回目の分析は１回目の分析の結果を確認する。
ワクチン接種前にＨＢＶ－ｓｈＲＮＡまたはＨＢＶ－ｓｉＲＮＡで前処置したマウスは、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇに対するＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を産生でき(図５Ａ、５Ｂ、５Ｄおよび５Ｅ)、細胞毒性Ｔ細胞が、ＨＢＶ抗原レベルがワクチン接種前に十分であるとき、ＨＢＶ感染を排除できることを示す。偽、エンテカビルまたは対照ｓｉＲＮＡ群でＨＢＶ抗原に対する顕著なＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答は観察されなかった。前処置またはウイルス抗原レベルと無関係の、全動物におけるＭＶＡウイルスに対する顕著なかつ類似のＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答は、ワクチン接種が全動物で等しく良好に働いており、ＨＢＶ抗原レベルにより影響されないことを示し、それによりコンピテント免疫系の存在を示す(図５Ｃおよび５Ｆ)。偽処置動物と他の何れの群の間でも抗体産生の有意差は観察されず、高ＨＢＶ抗原レベルがＴ細胞耐容性を誘発し得ることを示す。 HBsAg and HBeAg levels were similar in mice from groups 1, 2, and 3 (sham, entecavir, control iRNA agent). HBV-shRNA or HBV-siRNA (AD-66816 or AD-86610) alone caused a significant reduction in HBsAg, HBeAg, and HBV DNA in serum (Figures 4A-4C). A three-dose prime-boost vaccination scheme led to a further reduction in HBsAg in all groups, and a reduction in HBsAg levels below detection levels in some animals in the HBV-shRNA and HBV-siRNA groups. However, vaccine treatment did not reduce HBeAg levels in any group. Without being bound by mechanism, it is proposed that the reduction of HBsAg and absence of HBeAg results from a vaccine-induced immune response to the s antigen, which is generated by proteolytic processing of the C protein, but not the e antigen (see Figure 5 below).
HBV DNA levels were not reduced below the limit of quantification with entecavir alone, and no effect of the three-dose prime-boost vaccine was detected (Figure 4C). Sham and treatment with HBV-shRNA, HBV-siRNA, and control siRNA all reduced HBV DNA levels, and HBV-DNA levels were further reduced by prime-boost vaccine in all groups. It was unclear why sham and control siRNA reduced HBV DNA levels in this experiment. No reduction in HBV DNA was observed in response to treatment with control siRNA in other experiments (see, e.g., Figures 2C and 8C). These data indicate that RNAi is superior to nucleotide analog therapy in reducing viral antigens. Also, RNAi and subsequent vaccination have a combined effect on HBsAg and HBV DNA levels that exceeds either agent alone.
On the last day of the experiment (first day of week 17), mice were sacrificed and livers were harvested. Liver-associated lymphocytes were isolated from the liver and CD8+ T cell responses were measured by intracellular cytokine staining after peptide stimulation. In particular, intrahepatic CD8+ T cell responses were assessed for HBsAg, HBcAg and MVA viral particle responses using the method provided in Backes, 2016. The data were analyzed twice using two different thresholds for exclusion of dead immune cells, as the first analysis provided in Figures 5A-5C did not sufficiently exclude dead immune cells. The second analysis is shown in Figures 5D-5F. The second analysis confirms the results of the first analysis.
Mice pretreated with HBV-shRNA or HBV-siRNA before vaccination were able to generate CD8+ T cell immune responses against HBsAg and HBcAg (Figures 5A, 5B, 5D, and 5E), indicating that cytotoxic T cells can eliminate HBV infection when HBV antigen levels are sufficient before vaccination. No significant CD8+ T cell immune responses against HBV antigens were observed in the mock, entecavir, or control siRNA groups. The significant and similar CD8+ T cell immune responses against MVA virus in all animals, independent of pretreatment or viral antigen levels, indicate that vaccination works equally well in all animals and is not affected by HBV antigen levels, thereby indicating the presence of a competent immune system (Figures 5C and 5F). No significant differences in antibody production were observed between mock-treated animals and any of the other groups, indicating that high HBV antigen levels can induce T cell tolerance.

これらのデータは、ＲＮＡｉ処置が、ヌクレオシドアナログでの現在の標準処置とは対照的に、治療ワクチン接種後に、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞免疫を肝臓で回復でき、ＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発できることを示す。強固なＣＤ８＋エフェクターＴ細胞応答は、ウイルス排除および機能的治癒と結び付けられている(例えば、Thimme et al., 2003. J. Virol. 77:68-76, and Backes et al., 2016. Vaccine. 34:923-932参照)。
ＲＮＡも肝臓から単離し、総ＨＢＶＲＮＡおよびＨＢＶ３.５kB転写物レベルをYan, 2012の方法を使用して検出し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。マウスのワクチン投与前のＨＢＶ－ｓｉＲＮＡまたはＨＢＶ－ｓｈＲＮＡでの処置は、偽処置対照と比較して、ＨＢＶ総ＲＮＡおよびＨＢＶ３.５kb転写物の有意な減少をもたらした(図６Ａおよび６Ｂ)。偽処置対照と比較して、ワクチン接種前にエンテカビルまたは対照ｓｉＲＮＡで処置したマウスで、ＨＢＶ総ＲＮＡおよびＨＢＶ３.５kb転写物の有意な変化は観察されなかった。これらのデータは、ＨＢＶｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ両者が、対照およびエンテカビル群とは対照的に、ＨＢＶ転写物レベルの減少に成功したことを示す。
さらに、肝臓におけるＨＢＶ抗原発現を、肝臓切片のＨＢｃについて免疫組織化学染色し、mm^２あたりのＨＢｃ陽性細胞を計測することにより分析した(図６Ｃ)。エンテカビルまたは対照ｓｉＲＮＡではなく、ＨＢＶｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡで前処置した動物群のみが、ワクチン接種後、ＨＢｃ発現減少を示した。
実験を通して、体重およびＡＬＴレベルをモニターした。偽処置対照と比較して、処置群の何れでも有意な差は観察されなかった。 These data show that RNAi treatment, in contrast to the current standard treatment with nucleoside analogues, can restore HBV-specific T cell immunity in the liver and induce HBV-specific CD8+ T cell responses after therapeutic vaccination. Robust CD8+ effector T cell responses have been linked to viral clearance and functional cure (see, e.g., Thimme et al., 2003. J. Virol. 77:68-76, and Backes et al., 2016. Vaccine. 34:923-932).
RNA was also isolated from liver, and total HBV RNA and HBV 3.5 kB transcript levels were detected using the method of Yan, 2012, and normalized to GAPDH expression. Treatment of mice with HBV-siRNA or HBV-shRNA prior to vaccination resulted in a significant reduction in HBV total RNA and HBV 3.5 kb transcripts compared to sham-treated controls (Figures 6A and 6B). No significant changes in HBV total RNA and HBV 3.5 kb transcripts were observed in mice treated with entecavir or control siRNA prior to vaccination compared to sham-treated controls. These data indicate that both HBV siRNA and shRNA were successful in reducing HBV transcript levels, in contrast to the control and entecavir groups.
Furthermore, HBV antigen expression in the liver was analyzed by immunohistochemical staining of liver sections for HBc and counting HBc-positive cells per^mm2 (Figure 6C). Only animals pretreated with HBV siRNA or shRNA, but not with entecavir or control siRNA, showed reduced HBc expression after vaccination.
Body weight and ALT levels were monitored throughout the experiment, and no significant differences were observed in any of the treatment groups compared to sham-treated controls.

実施例４－ＨＢＶトランスジェニックマウスモデルにおける免疫化に応答したＨＢＶ抗原ノックダウンの有効期間の評価
ＨＢＶワクチンレジメンに対する免疫応答の増強についてｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを使用するＨＢＶ抗原の発現抑制が効果的である示されたため、ＨＢＶ抗原抑制の時間の長さが、ＨＢＶ免疫応答の増強に効果を有するか否かを決定する試験を設計した。処置スキームを図７に示す。
ＨＢＶ１.３ｘｆｓマウスモデルを使用して、マウスを、ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡＡＤ－６６８１６(修飾)を８週間、６週間または３週間または対照ｓｉＲＮＡを８週間、３mg／kg／用量を皮下投与して処置した。ＰＣＥＰ＋ＣＰＧではなくｃ－ジ－ＡＭＰをタンパク質投与でのアジュバントとして使用する以外、ｓｉＲＮＡ投与は上記プライム－ブーストワクチンレジメンの投与に従った(ｎ＝６／群)。それ故に、８週群のマウス(ｎ＝６)は３用量のｓｉＲＮＡを受け、３回目の用量をワクチン投与１日目に投与した。６週群のマウス(ｎ＝１２)は２用量のｓｉＲＮＡを受け、２回目の用量をワクチン投与１日目の２週間前に投与した。最後に、３週群のマウス(ｎ＝６)は１用量のｓｉＲＮＡを受け、該用量をワクチン投与１日目の３週間前に投与した。
血液サンプルを、－８週目、－６週目、－４週目、－２週目、０週目、２週目、４週目および６週目の初日、０週目の初日の最初の用量のワクチン投与前(負の数)および後に採取した。上記のとおり、血清を調製し、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶＤＮＡレベルを評価した。
各ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶＤＮＡの有意な減少が、ＡＤ－６６８１６の最初の投与後観察された(図８Ａ～８Ｃ)。ＨＢｓＡｇのさらに有意な減少が、ワクチンブーストでの処置後に観察され、８週間前処置群で観察された最大減少はアッセイでの検出レベル未満であり、全処置動物でＨＢｓＡｇレベルの５ log 10を超える減少を示した。免疫化は、ｓｉＲＮＡ処置により有意に減少していた、ＨＢＶＤＮＡのわずかなさらなる減少(＜０.５ log 10)をもたらした。ワクチン接種レジメンに応答したＨＢｅＡｇレベルのさらなる減少は観察されなかった。Example 4 - Evaluation of the Duration of Effectiveness of HBV Antigen Knockdown in Response to Immunization in an HBV Transgenic Mouse Model Having shown the effectiveness of suppressing expression of HBV antigens using shRNA or siRNA in enhancing immune responses to HBV vaccine regimens, a study was designed to determine whether the length of time of HBV antigen suppression had an effect on enhancing the HBV immune response. The treatment scheme is shown in Figure 7.
Using the HBV1.3xfs mouse model, mice were treated with HBV-siRNA AD-66816 (modified) for 8, 6 or 3 weeks or control siRNA for 8 weeks, subcutaneously at 3 mg/kg/dose. siRNA administration followed the administration of the prime-boost vaccine regimen described above, except that c-di-AMP was used as the adjuvant in the protein administration rather than PCEP+CPG (n=6/group). Thus, the 8-week group of mice (n=6) received 3 doses of siRNA, with the third dose administered on day 1 of vaccination. The 6-week group of mice (n=12) received 2 doses of siRNA, with the second dose administered 2 weeks prior to day 1 of vaccination. Finally, the 3-week group of mice (n=6) received 1 dose of siRNA, with the dose administered 3 weeks prior to day 1 of vaccination.
Blood samples were collected before (negative numbers) and after administration of the first dose of vaccine at weeks -8, -6, -4, -2, 0, 2, 4 and day 1 of 6, and day 1 of week 0. Serum was prepared and HBsAg, HBeAg and HBV DNA levels were assessed as described above.
Significant reductions in HBsAg, HBeAg and HBV DNA were observed after the first dose of AD-66816 (Figures 8A-8C). Further significant reductions in HBsAg were observed after treatment with the vaccine boost, with the maximal reduction observed in the 8-week pretreatment group being below the detection level of the assay, and all treated animals showing a greater than 5 log 10 reduction in HBsAg levels. Immunization resulted in a small further reduction (<0.5 log 10) in HBV DNA, which was significantly reduced by siRNA treatment. No further reduction in HBeAg levels was observed in response to the vaccination regimen.

これらのデータは、治療ワクチン接種の有効性がワクチン接種開始前の抗原抑制の期間と相関することを示す。ＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の再構成は数週間かかり、３週間前処置より６週間、または好ましくは８週間前処置する。
実験最終日、免疫化開始後６週目の初日、マウスを屠殺し、各群６マウスから肝臓を採取した。上記のとおり肝臓関連リンパ球を単離し、リンパ球刺激アッセイを実施した。特に、肝臓内ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、Backes, 2016に提供される方法を使用して、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇおよびＭＶＡウイルス粒子の応答について評価した。肝臓でのＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇに対するＴ細胞応答は、ＨＢＶ抗原ノックダウンの期間と相関し、ＨＢＶ抗原での高い免疫応答レベルが観察される期間が長いと、Ｔ細胞応答が大きくなる傾向にあった(図９Ａ～９Ｃ参照)。ＭＶＡウイルス抗原に対する類似する応答が、前処置と無関係に全群にわたり観察され、ワクチン接種が全動物で等しく良好に働いており、ＨＢＶ抗原レベルにより影響されないことを示し、コンピテント免疫系の存在を示す(図９Ｄ)。対照ｓｉＲＮＡ処置動物と他の何れの群の間にも、抗体産生の有意な差は観察されなかった。これは、ＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の再構成がすぐに起こらず、動物が、３週間のみと比較して、少なくとも６週間または８週間ＨＢＶ抗原力価が低下していたならば、治療ワクチン接種後強い応答が見られることを示す。Ｔ細胞応答と対照的に、Ｂ細胞免疫がＨＢＶ抗原力価により顕著に影響されないと考えられるとの先の知見をさらに確認する。
ＲＮＡも肝臓から単離し、総ＨＢＶＲＮＡおよびＨＢＶ３.５kB転写物レベルをYan, 2012の方法を使用して検出し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。マウスのワクチン投与前のＨＢＶ－ｓｉＲＮＡＡＤ－６６８１６での処置は、対照ｓｉＲＮＡ処置対照と比較して、肝臓ライセートのＨＢＶ総ＲＮＡおよびＨＢＶ３.５kb転写物の有意な減少をもたらした(図１０Ａおよび１０Ｂ)。さらに、肝臓のＨＢＶ抗原発現を、免疫組織化学染色およびmm^２あたりのＨＢｃ陽性細胞の計数により分析した(図１０Ｃ)。ＨＢＶ特異的ＣＤ８応答の観察された増加と、ｓｉＲＮＡ前処置の期間延長に相関して、ＨＢｃ発現細胞数の減少が肝臓で観察された。これらの結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が肝臓での抗原発現を阻止しなかったことを示す。 These data indicate that the efficacy of therapeutic vaccination correlates with the duration of antigen suppression before vaccination begins. Reconstitution of HBV-specific CD8+ T cell responses takes several weeks, with 6 weeks, or preferably 8 weeks, being better than 3 weeks of pretreatment.
On the last day of the experiment, the first day of the sixth week after the start of immunization, mice were sacrificed and livers were harvested from six mice in each group. Liver-associated lymphocytes were isolated as described above and lymphocyte stimulation assays were performed. In particular, intrahepatic CD8+ T cell responses were evaluated for HBsAg, HBcAg and MVA viral particle responses using the method provided in Backes, 2016. T cell responses to HBsAg and HBcAg in the liver correlated with the duration of HBV antigen knockdown, with a trend toward greater T cell responses the longer the period during which high immune response levels were observed with HBV antigen (see Figures 9A-9C). Similar responses to MVA viral antigen were observed across all groups, regardless of pretreatment, indicating that vaccination worked equally well in all animals and was not affected by HBV antigen levels, indicating the presence of a competent immune system (Figure 9D). No significant differences in antibody production were observed between control siRNA-treated animals and any of the other groups, indicating that reconstitution of HBV-specific CD8+ T cell responses did not occur immediately and robust responses were seen after therapeutic vaccination if animals had reduced HBV antigen titers for at least 6 or 8 weeks compared to only 3 weeks, further confirming previous findings that, in contrast to T cell responses, B cell immunity does not appear to be significantly affected by HBV antigen titers.
RNA was also isolated from liver and total HBV RNA and HBV 3.5 kB transcript levels were detected using the method of Yan, 2012 and normalized to GAPDH expression. Treatment of mice with HBV-siRNA AD-66816 prior to vaccination resulted in a significant reduction in HBV total RNA and HBV 3.5 kB transcripts in liver lysates compared to control siRNA-treated controls (Figures 10A and 10B). Furthermore, HBV antigen expression in liver was analyzed by immunohistochemical staining and counting of HBc positive cells per^mm2 (Figure 10C). Correlating with the observed increase in HBV-specific CD8 responses and the extended duration of siRNA pretreatment, a decrease in the number of HBc expressing cells was observed in liver. These results indicate that CD8+ T cell responses did not block antigen expression in liver.

応答の耐久性を評価するために、血液サンプルを、６週間処置レジメンを使用するＡＤ－６６８１６ＨＢＶ－ｓｉＲＮＡで前処置したマウスでブーストワクチン接種の投与後２週目および３週目に採取した(図１１Ａ～１１Ｄ)。６匹のマウス中３匹で、ＨＢｓＡｇレベルはアッセイでの検出レベル未満への低下が続いた(図１１Ａ)。実験中、ＨＢｅＡｇレベルの類似する減少は観察されなかった(図１１Ｂ)。これらのデータは、ここに提供するｓｉＲＮＡ－ワクチン接種組み合わせ治療による最大効果が、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の裁量評価の終了時点として選択した、ＭＶＡワクチン接種後１週間を超えて持続したことを示す。投与レジメンの６週間レジメン後の最初にワクチン投与後７週目の抗ＨＢｓ抗体応答(図１１Ｃ)およびＨＢｓ(Ｓ２０８)に対する肝臓のＴ細胞免疫応答(図１１Ｄ)。抗体応答は、動物間で変化した。
これらのデータは、ここに提供する処置レジメンを使用して機能的治癒が可能であることを示す。さらに、これらのデータは、少なくとも短期間の実験内で、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ負荷が低いほど、ＨＢ抗原の免疫排除および免疫応答を増強するレベルは大きく成り得ることを示す。
実験を通して、体重およびＡＬＴレベルをモニターした。偽処置対照と比較して、処置群の何れでも有意な差は観察されなかった。 To assess the durability of responses, blood samples were taken 2 and 3 weeks after administration of the boost vaccination in mice pretreated with AD-66816 HBV-siRNA using a 6-week treatment regimen (Figures 11A-11D). In 3 of 6 mice, HBsAg levels continued to decline below the detection level of the assay (Figure 11A). No similar decrease in HBeAg levels was observed during the experiment (Figure 11B). These data indicate that the maximal effect of the siRNA-vaccination combination treatment provided here lasted beyond 1 week after MVA vaccination, which was chosen as the end point for the arbitrary evaluation of CD8+ T cell responses. Anti-HBs antibody responses 7 weeks after the first vaccination after a 6-week dosing regimen (Figure 11C) and hepatic T cell immune responses to HBs(S208) (Figure 11D). Antibody responses varied between animals.
These data indicate that functional cures are possible using the treatment regimen provided herein. Furthermore, these data indicate that, at least within the short-term experiments, the lower the HBsAg and HBeAg loads, the greater the immune clearance of HB antigens and the greater the levels of enhancing immune responses.
Body weight and ALT levels were monitored throughout the experiment, and no significant differences were observed in any of the treatment groups compared to sham-treated controls.

実施例５－ＡＡＶ－ＨＢＶマウスモデルにおける免疫化に対する応答のＨＢＶ抗原ノックダウンの有効期間評価
トランスジェニックマウスモデルにおけるｓｉＲＮＡ－ワクチン組み合わせ処置レジメンの有効性が証明されたため、ＡＡＶ－ＨＢＶ感染マウスモデルを使用して、後天的感染モデルにおける処置レジメンの有効性を試験した(例えば、Yang, et al. (2014) Cell Mol Immunol 11:71参照)。このマウスモデルは、複製可能ＨＢＶゲノムを担持する組み換えアデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)で感染後、持続性ＨＢＶウイルス血症を示す。
ＨＢＶトランスジェニックマウスモデルとＡＡＶ－ＨＢＶマウスモデルの間に多数の差がある。ＨＢＶトランスジェニックマウスは、本質的に生まれたときからＨＢＶ抗原を発現できるのに対し、ＡＡＶ－ＨＢＶモデルは、マウスの生存中の後の時点でＨＢＶゲノムの導入を可能とする。これは、免疫寛容に対する効果を有し得る。さらに、ＨＢＶトランスジェニックマウスは、体内の全細胞に導入遺伝子を担持し、「漏出性」肝臓外発現の可能性を提供する。ＡＡＶ８血清型は肝臓の外の細胞に感染できるが、強い肝臓指向性を有する。さらに、トランスジェニックマウスでＨＢＶ感染を排除することは不可能である。トランスジェニックＨＢＶ発現肝細胞が殺されたとき、新しいＨＢＶ発現細胞に置き換わる。感染モデルにおいて、感染細胞が殺されたならば、新たな分裂細胞は、細胞分裂時点では感染していない。
９週齢Ｃ５７／Ｂｌ６マウスをＡＡＶ－ＨＢＶ(－２８日目)で感染させた。次いで、マウスを対照ｓｉＲＮＡの一つまたは２つのＨＢＶ－ｓｉＲＮＡ、修飾ＡＤ－６６８１６または修飾ＡＤ－６６８１０の一つで、３mg／kgを、０日目、２９日目および５７日目(すなわち、０週間、４週間、８週間)に皮下投与して処置した(ｎ＝１２／群)。各ｓｉＲＮＡ処置群を２群に分けた(ｎ＝６／群)。１群をＨＢＶワクチンプロトコール(タンパク質プライムを５７日目および７０日目ならびにＭＶＡブーストを８４日目、すなわち、それぞれ８週目、１０週目および１２週目)で処置し、１群はしなかった。投与レジメンを示す模式図を図１２に提供する。マウスを、血清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗ＨＢｓ抗体、体重およびＡＬＴについて実験を通してモニターした。抗ＨＢｅ抗体レベルも定期的に試験した。Example 5 - Evaluating the Duration of Efficacy of HBV Antigen Knockdown in Response to Immunization in an AAV-HBV Mouse Model Having demonstrated efficacy of the siRNA-vaccine combination treatment regimen in a transgenic mouse model, an AAV-HBV infected mouse model was used to test the efficacy of the treatment regimen in an acquired infection model (see, e.g., Yang, et al. (2014) Cell Mol Immunol 11:71). This mouse model exhibits persistent HBV viremia following infection with a recombinant adeno-associated virus (AAV) carrying a replication-competent HBV genome.
There are a number of differences between the HBV transgenic and AAV-HBV mouse models. HBV transgenic mice can express HBV antigens essentially from birth, whereas the AAV-HBV model allows the introduction of the HBV genome at a later time point during the mouse's life. This may have an effect on immune tolerance. Furthermore, HBV transgenic mice carry the transgene in all cells of the body, offering the possibility of "leaky" extrahepatic expression. Although the AAV8 serotype can infect cells outside the liver, it has a strong liver tropism. Furthermore, it is not possible to eliminate HBV infection in transgenic mice. When transgenic HBV-expressing hepatocytes are killed, they are replaced by new HBV-expressing cells. In the infection model, if the infected cells are killed, the new dividing cells are not infected at the time of cell division.
Nine week old C57/B16 mice were infected with AAV-HBV (day -28). Mice were then treated with one of the control siRNAs or one of the two HBV-siRNAs, modified AD-66816 or modified AD-66810, at 3 mg/kg subcutaneously on days 0, 29 and 57 (i.e., weeks 0, 4 and 8) (n=12/group). Each siRNA treatment group was divided into two groups (n=6/group). One group was treated with the HBV vaccine protocol (protein prime on days 57 and 70 and MVA boost on day 84, i.e., weeks 8, 10 and 12, respectively) and one group was not. A schematic showing the dosing regimen is provided in FIG. 12. Mice were monitored throughout the experiment for serum HBsAg, HBeAg, anti-HBs antibodies, body weight and ALT. Anti-HBe antibody levels were also tested periodically.

図１３Ａおよび１３Ｂは、ＡＡＶ－ＨＢＶウイルスで形質導入２週間以内のトランスジェニックマウスに見られるのと同等の、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇレベル増加を示す。対照ｓｉＲＮＡのみで処置したマウスは、ＨＢＶを、慢性感染ヒト(ＨＢｓＡｇレベル約２,０００IU／ml、ＨＢＶウイルス血症１０^６－１０^７IU／ml)と同等のレベルで８か月を超えて複製した。ＨＢＶｓｉＲＮＡＡＤ－６６８１６およびＡＤ－６６８１０は、ＨＢｓＡｇをそれぞれ２および２.５ log 10減少させ、ＨＢｅＡｇを≧１ log 10減少させた。効果は、ｓｉＲＮＡ処置停止後少なくとも４週間持続し、その後、抗原血症がゆっくりリバウンドし、１８週後にベースラインレベルとなった(図１３Ａおよび１３Ｂ)。
肝臓内ＨＢＶＤＮＡ(図１３Ｄ)およびＡＡＶＤＮＡ(図１３Ｅ)レベルを、上記のとおりｑＰＣＲにより２２週目に決定した。ＧＡＰＤＨＲＮＡに対するＨＢＶ３.５ＲＮＡ(図１３Ｆ)およびＧＡＰＤＨＲＮＡに対する総ＨＢＶＲＮＡ(図１３Ｇ)の肝臓における相対的発現をｒｔＰＣＲを使用して決定した。合わせたｓｉＲＮＡ－ワクチンプロトコールで処置したマウスは、２２週目時点で未処置対照またはｓｉＲＮＡまたはワクチン処置単独と比較して、総ＨＢＶＤＮＡおよびＡＡＶＤＮＡの有意な減少を示した(図１３Ｄおよび１３Ｅ)。特に、総ＨＢＶＤＮＡレベルは、組み合わせ処置の結果として、細胞あたり１コピー未満まで減少した(図１３Ｄ)。合わせたｓｉＲＮＡ－ワクチンプロトコールで処置したマウスはまた、他の全処置レジメンと比較して、ＧＡＰＤＨＲＮＡ発現に対して相対的なＨＢＶ３.５kb ＲＮＡ発現レベルの有意な減少を示した(図１３Ｆ)。ＧＡＰＤＨＲＮＡに対する総ＨＢＶＲＮＡ発現の有意な減少は、ワクチンまたはｓｉＲＮＡ単独での処置と比較して観察された(図１３Ｇ)。これらのデータは、ｓｉＲＮＡ単独またはＨＢＶに対する治療ワクチンの短期の投与がＨＢＶ感染の持続的な抑制に不十分であることを示唆する。ＨＢＶ発現のｓｉＲＮＡノックダウン後のＨＢＶの免疫介在制御は、持続性であった。最後のｓｉＲＮＡ投与２２週目に、ｓｉＲＮＡの効果は、ワクチン接種なしでＨＢＶｓｉＲＮＡのみを受けた群で見られるとおり、漸減した。ｓｉＲＮＡ－ワクチンプロトコールで処置したマウスは、ｓｉＲＮＡ投与終了後長期にＨＢＶＤＮＡおよびＲＮＡ抑制を維持した。
免疫応答は、ｓｉＲＮＡ単独処置下のこれらの完全に免疫適格性のマウスで観察されなかったが、ワクチン処置は、全ワクチン接種動物で抗ＨＢｓセロコンバージョンをもたらした(図１４Ａおよび１４Ｂ)。しかしながら、ｓｉＲＮＡ前処置動物は、１０倍高く、より一定した抗ＨＢｓ力価をもたらし、完全かつ持続性に血清ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇを排除できた。対照的に、抗ＨＢｅセロコンバージョンは、ＨＢＶｓｉＲＮＡで前処置した動物でのみ観察された。興味深いことに、ＨＢＶｓｉＲＮＡ処置後ワクチン接種した１２匹のマウス中３匹が、抗ＨＢｅのレベル減少と同時発生するＨＢｅＡｇの一過性再発を１５～２２週目に示した(図１３Ｃ)。メカニズムに拘束されないが、ＨＢｅＡｇ再発は、ワクチンによる記憶免疫応答誘発により制御されたと提案される。併せて、ｓｉＲＮＡと異種性プライム－ブーストワクチンの組み合わせによるＨＢＶ抗原発現の抑制は、ＨＢＶ抗原に対する免疫寛容の破壊に十分である。連続的治療は、持続性ＨＢＶ感染のマウスモデルで顕著な肝臓損傷なしに長期機能的治癒を達成した。 Figures 13A and 13B show increases in HBsAg and HBeAg levels comparable to those seen in transgenic mice within 2 weeks of transduction with AAV-HBV virus. Mice treated with control siRNA alone replicated HBV for over 8 months at levels comparable to chronically infected humans (HBsAg levels approx. 2,000 IU/ml, HBV viremia^10-10^IU /ml). HBV siRNAs AD-66816 and AD-66810 reduced HBsAg by 2 and 2.5 log 10, respectively, and HBeAg by > 1 log 10. Effects persisted for at least 4 weeks after cessation of siRNA treatment, after which antigenemia slowly rebounded to baseline levels after 18 weeks (Figures 13A and 13B).
Intrahepatic HBV DNA (Figure 13D) and AAV DNA (Figure 13E) levels were determined at week 22 by qPCR as described above. Relative hepatic expression of HBV3.5 RNA to GAPDH RNA (Figure 13F) and total HBV RNA to GAPDH RNA (Figure 13G) was determined using rtPCR. Mice treated with the combined siRNA-vaccine protocol showed significant reductions in total HBV DNA and AAV DNA compared to untreated controls or siRNA or vaccine treatment alone at week 22 (Figures 13D and 13E). Notably, total HBV DNA levels were reduced to less than one copy per cell as a result of the combined treatment (Figure 13D). Mice treated with the combined siRNA-vaccine protocol also showed significant reductions in HBV3.5kb RNA expression levels relative to GAPDH RNA expression compared to all other treatment regimens (Figure 13F). A significant reduction in total HBV RNA expression relative to GAPDH RNA was observed compared to treatment with vaccine or siRNA alone (Figure 13G). These data suggest that short-term administration of siRNA alone or therapeutic vaccine against HBV is insufficient for sustained suppression of HBV infection. Immune-mediated control of HBV following siRNA knockdown of HBV expression was durable. At 22 weeks after the last siRNA administration, the effect of siRNA tapered off as seen in the group that received only HBV siRNA without vaccination. Mice treated with the siRNA-vaccine protocol maintained HBV DNA and RNA suppression long-term after cessation of siRNA administration.
No immune response was observed in these fully immunocompetent mice under siRNA treatment alone, whereas vaccine treatment led to anti-HBs seroconversion in all vaccinated animals (Figures 14A and 14B). However, siRNA pre-treated animals led to 10-fold higher and more consistent anti-HBs titers and were able to completely and persistently clear serum HBsAg and HBeAg. In contrast, anti-HBe seroconversion was only observed in animals pre-treated with HBV siRNA. Interestingly, 3 of 12 mice vaccinated after HBV siRNA treatment showed a transient recurrence of HBeAg at weeks 15-22, coinciding with a decrease in the levels of anti-HBe (Figure 13C). Without being bound by the mechanism, it is proposed that HBeAg recurrence was controlled by the induction of a memory immune response by the vaccine. Together, suppression of HBV antigen expression by a combination of siRNA and a heterologous prime-boost vaccine is sufficient to break immune tolerance to HBV antigens, and sequential treatment achieved long-term functional cure without significant liver damage in a mouse model of persistent HBV infection.

図１４Ａおよび１４Ｂは、ＨＢＶｓｉＲＮＡとワクチンレジメンで処置した動物が高力価の抗ＨＢｓ抗体および抗ＨＢｅ抗体を生じたことを示す。抗ＨＢｓ抗体レベルは、最後のワクチン投与後も増加し続けた。対照ｓｉＲＮＡとワクチンレジメンを受けた動物で抗ＨＢｓ抗体も測定されたが、レベルは有意に低かった。さらに、ＨＢＶｓｉＲＮＡとワクチンレジメンを受けた動物のみ抗ＨＢｅ抗体を生じ、抗ＨＢｅセロコンバージョンを達成した。ｓｉＲＮＡおよびワクチンを使用する組み合わせ治療は、十分に耐容性であるように見えた。全マウスは等しく体重が増加し、軽度なＡＬＴ上昇のみ(正常上限の＜２倍)観察された(図１５Ａおよび１５Ｂ)。抗原血症喪失は、ワクチン接種レジメンと共にＨＢＶｓｉＲＮＡを受けた処置群で見られるＡＬＴ活性のわずかな増加と一致した(図１５Ａ)。これらの群は、組み合わせＨＢＶｓｉＲＮＡ－ワクチンレジメンを受けたかった他の全処置群と比較して、有意な、しかし軽度の増加を示した(両者とも反復測定二元配置ＡＮＯＶＡによりｐ＞０.０５以下；ワクチン接種開始後の時点のみ比較)。ｓｉＲＮＡ処置と無関係に、全動物は、実験を通して体重が一定に増加した。ワクチン接種した動物は、ワクチン接種後にわずかな一過性の体重減少(約５％)を示したが、９日以内に正常レベルまでリバウンドし、その後対照群と同等に体重増加した(図１５Ｂ)。Figures 14A and 14B show that animals treated with the HBV siRNA and vaccine regimen developed high titers of anti-HBs and anti-HBe antibodies. Anti-HBs antibody levels continued to increase after the last vaccine dose. Anti-HBs antibodies were also measured in animals receiving the control siRNA and vaccine regimen, but the levels were significantly lower. Furthermore, only animals receiving the HBV siRNA and vaccine regimen developed anti-HBe antibodies and achieved anti-HBe seroconversion. The combination treatment using siRNA and vaccine appeared to be well tolerated. All mice gained weight equally, and only mild ALT elevations (<2x upper limit of normal) were observed (Figures 15A and 15B). The loss of antigenemia was consistent with the slight increase in ALT activity seen in the treatment group receiving HBV siRNA along with the vaccination regimen (Figure 15A). These groups showed a significant, but modest, increase in body weight compared to all other treatment groups that received the combined HBV siRNA-vaccine regimen (both p>0.05 by repeated measures two-way ANOVA; comparing only time points after vaccination initiation). Regardless of siRNA treatment, all animals gained a steady amount of weight throughout the experiment. Vaccinated animals showed a small, transient weight loss (approximately 5%) after vaccination, but rebounded to normal levels within 9 days and then gained weight comparable to the control group (Figure 15B).

メカニズムに拘束されないが、ここに提供するデータは、高レベルのＨＢＶ抗原発現が常に循環ＨＢｓＡｇとして検出され、ＨＢｅＡｇがＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を阻止することを強く示唆し、これは、慢性Ｂ型肝炎の将来的な免疫療法に大きな影響を有する。慢性Ｂ型肝炎の２種の異なるマウスモデルを使用して、ＨＢＶ特異的免疫調節が、ＲＮＡｉベースの治療を使用する肝細胞のＨＢＶタンパク質発現抑制により復帰し得ることが提案される。このようなＲＮＡｉによるＨＢＶ抗原の減少は、標準治療ヌクレオ(チ)シドアナログとは対照的に、ＨＢＶ感染の制御に必要な強いＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の治療ワクチン接種による誘発を可能とする。Without being bound by mechanism, the data provided here strongly suggest that high levels of HBV antigen expression are consistently detected as circulating HBsAg and that HBeAg blocks HBV-specific CD8+ T cell responses, which has major implications for future immunotherapy of chronic hepatitis B. Using two different mouse models of chronic hepatitis B, it is proposed that HBV-specific immune regulation can be restored by suppressing HBV protein expression in hepatocytes using RNAi-based therapy. Such reduction of HBV antigens by RNAi, in contrast to standard of care nucleo(thi)side analogs, allows therapeutic vaccination to elicit the robust HBV-specific CD8+ T cell responses required for control of HBV infection.

付属表Ａ
Appendix A

等価物
当業者は、ここに記載する特定の実施態様および方法の多くの等価物を、認識するかまたは日常的な程度を超えない実験を使用して、確認できる。このような等価物は次の特許請求の範囲の範囲に包含されることを意図する。Those skilled in the art will recognize, or be able to ascertain using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific embodiments and methods described herein. Such equivalents are intended to be encompassed by the scope of the following claims.

Claims

Translated fromJapanese

（ａ）ＲＮＡｉ剤が、対象の血清ＨＢｓＡｇレベルが、少なくとも０．５ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌ減少するように対象に投与される；（ｂ）対象の血清ＨＢｓＡｇレベルが、最初の用量のタンパク質ベースのＨＢＶワクチン投与前に少なくとも０．５ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌ、少なくとも１ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌ、または少なくとも２ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌ減少する；（ｃ）対象の血清ＨＢｅＡｇレベルが、最初の用量のタンパク質ベースのＨＢＶワクチン投与前に少なくとも１ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌ減少する；（ｄ）最初の用量のタンパク質ベースのＨＢＶワクチン投与前に、対象の血清ＨＢｓＡｇレベルが、少なくとも２ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌ減少し、かつ対象の血清ＨＢｅＡｇレベルが、少なくとも１ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌ減少する；（ｅ）対象が、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのＨＢＶワクチン投与前に、５００ＩＵ／ｍｌ以下、２００ＩＵ／ｍｌ以下、または１００ＩＵ／ｍｌ以下の血清ＨＢｓＡｇレベルを有し；（ｆ）対象が、ＲＮＡｉ剤投与後かつ最初の用量のタンパク質ベースのＨＢＶワクチン投与前に、５００ＩＵ／ｍｌ以下、２００ＩＵ／ｍｌ以下、または１００ＩＵ／ｍｌ以下の血清ＨＢｅＡｇレベルを有し；（ｇ）対象における血清ＨＢｓＡｇのレベルが、ＲＮＡｉ剤の投与前に３０００ＩＵ／ｍｌ、４０００ＩＵ／ｍｌ、または５０００ＩＵ／ｍｌ未満であり；（ｈ）対象における血清ＨＢｓＡｇのレベルが、核酸ベースのＨＢＶワクチンの投与終了後少なくとも６か月間、臨床アッセイを使用する検出のレベル未満まで減少する；（ｉ）対象における血清ＨＢｅＡｇのレベルが、核酸ベースのＨＢＶワクチンの投与終了後少なくとも６か月間、臨床アッセイを使用する検出のレベル未満まで減少する；（ｊ）対象における血清ＨＢｅＡｇのレベルが、核酸ベースのＨＢＶワクチンの投与終了後少なくとも６か月間、臨床アッセイを使用する検出のレベル未満まで減少する；または（ｋ）対象における血清ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇのレベルが、核酸ベースのＨＢＶワクチンの投与終了後少なくとも６か月間、臨床アッセイを使用する検出のレベル未満まで減少する、
請求項１に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。 (a) the RNAi agent is administered to the subject such that the subject's serum HBsAg level is reduced by at least 0.5 log 10 IU/ml; (b) the subject's serum HBsAg level is reduced by at least 0.5 log 10 IU/ml, at least 1 log 10 IU/ml, or at least 2 log 10 IU/ml prior to administration of a first dose of a protein-based HBV vaccine; (c) the subject's serum HBeAg level is reduced by at least 1 log 10 IU/ml prior to administration of a first dose of a protein-based HBV vaccine; (d) the subject's serum HBsAg level is reduced by at least 2 log 10 IU/ml and the subject's serum HBeAg level is reduced by at least 1 log 10 IU/ml prior to administration of a first dose of a protein-based HBV vaccine. (e) the subject has a serum HBsAg level of 500 IU/ml or less, 200 IU/ml or less, or 100 IU/ml or less after administration of the RNAi agent and before administration of the first dose of a protein-based HBV vaccine; (f) the subject has a serum HBeAg level of 500 IU/ml or less, 200 IU/ml or less, or 100 IU/ml or less after administration of the RNAi agent and before administration of the first dose of a protein-based HBV vaccine; (g) the level of serum HBsAg in the subject is less than 3000 IU/ml, 4000 IU/ml, or 5000 IU/ml before administration of the RNAi agent; (h) the level of serum HBsAg in the subject is less than 3000 IU/ml, 4000 IU/ml, or 5000 IU/ml before administration of the RNAi agent; (i) the level of serum HBeAg in the subject is reduced to below the level of detection using a clinical assay for at least 6 months after the end of administration of the nucleic acid based HBV vaccine; (j) the level of serum HBeAg in the subject is reduced to below the level of detection using a clinical assay for at least 6 months after the end of administration of the nucleic acid based HBV vaccine; or (k) the levels of serum HBsAg and HBeAg in the subject are reduced to below the level of detection using a clinical assay for at least 6 months after the end of administration of the nucleic acid based HBV vaccine.
2. An RNAi agent for use according to claim 1.

（ａ）ＲＮＡｉ剤の少なくとも２用量が対象に投与され、または（ｂ）ＲＮＡｉ剤の１用量が、対象に週１回以下または４週に１回以下で投与される、請求項１または２に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。The RNAi agent for use according to claim 1 or 2, wherein (a) at least two doses of the RNAi agent are administered to the subject, or (b) one dose of the RNAi agent is administered to the subject no more than once per week or no more than once every four weeks.

ＲＮＡｉ剤が、０.０１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ；０.５ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ；１０ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ；０．５ｍｇ／ｋｇ；１ｍｇ／ｋｇ；１．５ｍｇ／ｋｇ；３ｍｇ／ｋｇ；５ｍｇ／ｋｇ；１０ｍｇ／ｋｇ；または３０ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。The RNAi agent for use according to any one of claims 1 to 3, wherein the RNAi agent is administered to the subject at a dose of 0.01 mg/kg to 10 mg/kg; 0.5 mg/kg to 50 mg/kg; 10 mg/kg to 30 mg/kg; 0.5 mg/kg; 1 mg/kg; 1.5 mg/kg; 3 mg/kg; 5 mg/kg; 10 mg/kg; or 30 mg/kg.

第一ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントが少なくとも一つのＨＢｃＡｇ決定基を含み、第一ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントが少なくとも一つのＨＢｓＡｇ決定基を含み、かつ第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントが少なくとも一つのＨＢｃＡｇ決定基を含み、第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントが少なくとも一つのＨＢｓＡｇ決定基を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。The RNAi agent for use according to any one of claims 1 to 4, wherein the first HBcAg polypeptide or immunogenic fragment thereof comprises at least one HBcAg determinant, the first HBsAg polypeptide or immunogenic fragment thereof comprises at least one HBsAg determinant, and the second HBcAg polypeptide or immunogenic fragment thereof comprises at least one HBcAg determinant, and the second HBsAg polypeptide or immunogenic fragment thereof comprises at least one HBsAg determinant.

第一および／または第二ＨＢｓＡｇ決定基が、配列番号２２のアミノ酸１２４～１４７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、または配列番号２３のアミノ酸９９～１６８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。The RNAi agent for use according to claim 5, wherein the first and/or second HBsAg determinant comprises an amino acid sequence that is at least 90% identical to amino acids 124-147 of SEQ ID NO:22, or an amino acid sequence that is at least 90% identical to amino acids 99-168 of SEQ ID NO:23.

第一および／または第二ＨＢｃＡｇ決定基が：配列番号２４のアミノ酸残基８０を含むアミノ酸配列；配列番号２４の少なくともアミノ酸７０～９０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列；配列番号２４のアミノ酸残基１３８を含むアミノ酸配列；配列番号２４の少なくともアミノ酸１２８～１４３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列；配列番号２４の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００連続アミノ酸と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列；または配列番号２４のアミノ酸１８～１４３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、を含む、請求項５に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。The RNAi agent for use according to claim 5, wherein the first and/or second HBcAg determinant comprises: an amino acid sequence comprising amino acid residue 80 of SEQ ID NO:24; an amino acid sequence at least 90% identical to at least amino acids 70-90 of SEQ ID NO:24; an amino acid sequence comprising amino acid residue 138 of SEQ ID NO:24; an amino acid sequence at least 90% identical to at least amino acids 128-143 of SEQ ID NO:24; an amino acid sequence at least 90% identical to at least 40, 50, 60, 70, 80, 90 or 100 consecutive amino acids of SEQ ID NO:24; or an amino acid sequence at least 90% identical to amino acids 18-143 of SEQ ID NO:24.

タンパク質ベースのＨＢＶワクチンが約０.１μｇ～約１.０ｍｇの用量の第一ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび約０.１μｇ～約１.０ｍｇの用量の第一ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントで対象に投与される、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。The RNAi agent for use according to any one of claims 1 to 7, wherein the protein-based HBV vaccine is administered to a subject at a dose of about 0.1 μg to about 1.0 mg of the first HBcAg polypeptide or immunogenic fragment thereof and at a dose of about 0.1 μg to about 1.0 mg of the first HBsAg polypeptide or immunogenic fragment thereof.

タンパク質ベースのＨＢＶワクチンがさらにアジュバントを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。The RNAi agent for use according to any one of claims 1 to 8, wherein the protein-based HBV vaccine further comprises an adjuvant.

アジュバントがモノホスホリルリピドＡ(ＭＰＬ)、ポリ(Ｉ：Ｃ)、ポリＩＣＬＣアジュバント、ＣｐＧＤＮＡ、ポリＩＣＬＣアジュバント、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ｃ－ジ－ＡＭＰ、ｃ－ジ－ＧＭＰ、ｃ－ジ－ＣＭＰ；短、平滑断端５’－三リン酸ｄｓＲＮＡ(３ｐＲＮＡ)Ｒｉｇ－Ｉリガンド、ポリ[ジ(ナトリウムカルボキシレートエチルフェノキシ)ホスファゼン](ＰＣＥＰ))、ミョウバン、ビロソーム、サイトカイン、ＩＬ－１２、ＡＳ０２、ＡＳ０３、ＡＳ０４、ＭＦ５９、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ(登録商標)、ＩＣ３１(登録商標)またはＲｉｇ－Ｉリガンドである、請求項９に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。The RNAi agent for use according to claim 9, wherein the adjuvant is monophosphoryl lipid A (MPL), poly(I:C), polyICLC adjuvant, CpG DNA, polyICLC adjuvant, STING agonist, c-di-AMP, c-di-GMP, c-di-CMP; short, blunt-ended 5'-triphosphate dsRNA (3pRNA) Rig-I ligand, poly[di(sodium carboxylate ethylphenoxy)phosphazene] (PCEP)), alum, virosomes, cytokines, IL-12, AS02, AS03, AS04, MF59, ISCOMATRIX®, IC31® or Rig-I ligand.

１用量のタンパク質ベースのＨＢＶワクチンが、対象に：少なくとも２回；２週毎に１回以下；対象にＲＮＡｉ剤の最終用量を投与した日以降に；対象にＲＮＡｉ剤の最終用量を投与した同日に；対象にＲＮＡｉ剤の最終用量を投与した後１か月以内に；または対象にＲＮＡｉ剤の最終用量を投与した後３か月以内に、投与される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。The RNAi agent for use according to any one of claims 1 to 10, wherein a dose of a protein-based HBV vaccine is administered to the subject: at least twice; not more than once every two weeks; on or after the day the subject is administered the last dose of the RNAi agent; on the same day the subject is administered the last dose of the RNAi agent; within one month after the subject is administered the last dose of the RNAi agent; or within three months after the subject is administered the last dose of the RNAi agent.

核酸ベースのＨＢＶワクチンが、第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントをコードする少なくとも一つの発現ベクター構築物を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。The RNAi agent for use according to any one of claims 1 to 11, wherein the nucleic acid-based HBV vaccine comprises at least one expression vector construct encoding a second HBcAg polypeptide or an immunogenic fragment thereof and a second HBsAg polypeptide or an immunogenic fragment thereof.

少なくとも一つの発現構築物が、（ａ）第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントの発現を促進するプロモーター、または（ｂ）第一および第二プロモーターであって、第一プロモーターは第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントの発現を促進し、第二プロモーターは第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントの発現を促進する、第一および第二プロモーターを含む、
請求項１２に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。 at least one expression construct comprises (a) a promoter driving expression of a second HBcAg polypeptide or an immunogenic fragment thereof and a second HBsAg polypeptide or an immunogenic fragment thereof, or (b) a first and a second promoter, the first promoter driving expression of the second HBcAg polypeptide or an immunogenic fragment thereof and the second promoter driving expression of the second HBsAg polypeptide or an immunogenic fragment thereof;
13. An RNAi agent for use according to claim 12.

少なくとも一つのプロモーターが、呼吸器多核体ウイルス(ＲＳＶ)プロモーター、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター、ＰＨ５プロモーターおよびＨ１プロモーターからなる群から選択される、
請求項１３に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。 At least one promoter is selected from the group consisting of a respiratory syncytial virus (RSV) promoter, a cytomegalovirus (CMV) promoter, a PH5 promoter, and an H1 promoter;
14. An RNAi agent for use according to claim 13.

発現構築物が、ウイルスベクターを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。The RNAi agent for use according to any one of claims 1 to 14, wherein the expression construct comprises a viral vector.

核酸ベースのＨＢＶワクチンが、１０^６～１０^１０組織培養感染量(ＴＣＩＤ_５０)；または１０^６～１０^９ＴＣＩＤ_５０；または１０^６～１０^８ＴＣＩＤ_５０で対象に投与される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。 The RNAi agent for use according to any one of claims 1 to 16, wherein the nucleic acid based HBV vaccine is administered to the subject at 10⁶ to 10¹⁰ tissue culture infectious doses (TCID₅₀ ); or 10⁶ to 10⁹ TCID₅₀ ; or 10⁶ to 10⁸ TCID₅₀ .

（ａ）核酸ベースのＨＢＶワクチンの１用量が、タンパク質ベースのＨＢＶワクチンの最終用量が対象に投与された後２週間以降に対象に投与される；（ｂ）第１用量の核酸ベースのＨＢＶワクチンが、対象の血清ＨＢｓＡｇレベルが少なくとも１用量のタンパク質ベースのＨＢＶワクチン投与後少なくとも０.５ｌｏｇ１０ＩＵ/ｍｌまでさらに減少したときに対象に投与される；または（ｃ）単回用量の核酸ベースのＨＢＶワクチンが対象に投与される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。The RNAi agent for use according to any one of claims 1 to 17, wherein: (a) one dose of a nucleic acid-based HBV vaccine is administered to the subject no later than 2 weeks after the final dose of a protein-based HBV vaccine is administered to the subject; (b) a first dose of a nucleic acid-based HBV vaccine is administered to the subject when the subject's serum HBsAg level has further decreased by at least 0.5 log 10 IU/ml after administration of at least one dose of a protein-based HBV vaccine; or (c) a single dose of a nucleic acid-based HBV vaccine is administered to the subject.

さらに対象がヌクレオチ(シ)ドアナログも投与される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。The RNAi agent for use according to any one of claims 1 to 18, wherein the subject is further administered a nucleotide analogue.

ヌクレオチ(シ)ドアナログがテノホビルジソプロキシルフマル酸塩(ＴＤＦ)、テノホビルアラフェナミド(ＴＡＦ)、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、エンテカビル(ＥＴＶ)、テルビブジン、ＡＧＸ－１００９、エムトリシタビン、クレブジン、リトナビル、ジピボキシル、ロブカビル、ファムビル、ＦＴＣ、Ｎ－アセチル－システイン(ＮＡＣ)、ＰＣ１３２３、セラダイム－ＨＢＶ、チモシン－アルファおよびガンシクロビル、ベシフォビル(ＡＮＡ－３８０／ＬＢ－８０３８０)またはテノホビル－エクサリエード(ＴＬＸ／ＣＭＸ１５７)である、請求項１９に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。The RNAi agent for use according to claim 19, wherein the nucleotide analogue is tenofovir disoproxil fumarate (TDF), tenofovir alafenamide (TAF), lamivudine, adefovir dipivoxil, entecavir (ETV), telbivudine, AGX-1009, emtricitabine, clevudine, ritonavir, dipivoxil, lobucavir, famvir, FTC, N-acetyl-cysteine (NAC), PC1323, Seradigm-HBV, thymosin-alpha and ganciclovir, besifovir (ANA-380/LB-80380) or tenofovir-exalied (TLX/CMX157).

対象が免疫刺激剤もさらに投与される対象である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。The RNAi agent for use according to any one of claims 1 to 20, wherein the subject is a subject to which an immune stimulant is also administered.

免疫刺激剤が、ペグ化インターフェロンアルファ２ａ(ＰＥＧ－ＩＦＮ－アルファ－２ａ)、インターフェロンアルファ－２ｂ、ＰＥＧ－ＩＦＮ－アルファ－２ｂ、インターフェロンラムダ、組み換えヒトインターロイキン－７およびトール様受容体３、７、８または９(ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９)アゴニスト、ウイルス侵入阻害剤、Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ、ＨＢｓＡｇの分泌または放出を阻害するオリゴヌクレオチド、ＲＥＰ９ＡＣ、カプシド阻害剤、Ｂａｙ４１－４１０９、ＮＶＲ－１２２１、ｃｃｃＤＮＡ阻害剤、ＩＨＶＲ－２５)、ウイルスカプシド、ＭＶＡカプシド、免疫チェックポイント制御因子、ＣＴＬＡ－４阻害剤、イピリムマブ、ＰＤ－１阻害剤、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ＢＧＢ－Ａ３１７抗体、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブまたはアフィマー生物学的製剤である、請求項２１に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。The immune stimulant is selected from the group consisting of pegylated interferon alpha 2a (PEG-IFN-alpha-2a), interferon alpha-2b, PEG-IFN-alpha-2b, interferon lambda, recombinant human interleukin-7 and toll-like receptor 3, 7, 8 or 9 (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9) agonists, viral entry inhibitors, Myrcludex, oligonucleotides that inhibit the secretion or release of HBsAg, REP 9AC, capsid inhibitor, Bay41-4109, NVR-1221, cccDNA inhibitor, IHVR-25), viral capsid, MVA capsid, immune checkpoint regulator, CTLA-4 inhibitor, ipilimumab, PD-1 inhibitor, nivolumab, pembrolizumab, BGB-A317 antibody, PD-L1 inhibitor, atezolizumab, avelumab, durvalumab or Afimer biological agent, for use according to claim 21.

対象がヒトである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。The RNAi agent for use according to any one of claims 1 to 22, wherein the subject is a human.

（ａ）ＲＮＡｉ剤が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み；
（ｂ）該センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよび該アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、ここで、該センス鎖が、３’末端で結合するリガンドにコンジュゲートされる、
（ｃ）ＲＮＡｉ剤が、少なくとも１ヌクレオチドまたは少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、
（ｄ）ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域が１９－２１、または２１－２３ヌクレオチド対長である；および／または
（ｅ）ＲＮＡｉ剤の各鎖が、１９－３０ヌクレオチド有する、
請求項１～２３のいずれか一項に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。 (a) the RNAi agent comprises at least one modified nucleotide;
(b) substantially all of the nucleotides of the sense strand and substantially all of the nucleotides of the antisense strand are modified nucleotides, wherein the sense strand is conjugated to a ligand attached at the 3'terminus;
(c) the RNAi agent comprises a 3' overhang of at least 1 nucleotide or at least 2 nucleotides;
(d) the double-stranded region of the RNAi agent is 19-21, or 21-23 nucleotide pairs in length; and/or (e) each strand of the RNAi agent has 19-30 nucleotides.
An RNAi agent for use according to any one of claims 1 to 23.

〔式中、ＸはＯまたはＳである。〕
に示すとおりリガンドにコンジュゲートされる、
請求項２４に記載の使用のためのＲＮＡｉ剤。 (i) the ligand is one or more GalNAc derivatives attached via a monovalent linker, a divalent branched linker, or a trivalent branched linker, and (ii) at least one of the modified nucleotides is a deoxy-nucleotide, a 3'-terminal deoxy-thymine (dT) nucleotide, a 2'-O-methyl modified nucleotide, a 2'-fluoro modified nucleotide, a 2'-deoxy-modified nucleotide, a locked nucleotide, an unlocked nucleotide, a conformationally restricted nucleotide, a constrained ethyl nucleotide, an abasic nucleotide, a 2'-amino-modified nucleotide, a 2'-O-allyl-modified nucleotide, a 2' (iii) the ligand is a -C-alkyl-modified nucleotide, a 2'-hydroxyl-modified nucleotide, a 2'-methoxyethyl-modified nucleotide, a 2'-O-alkyl-modified nucleotide, a morpholino nucleotide, a phosphoramidate, a non-natural base containing nucleotide, a tetrahydropyran-modified nucleotide, a 1,5-anhydrohexitol-modified nucleotide, a cyclohexenyl-modified nucleotide, a phosphorothioate group-containing nucleotide, a methylphosphonate group-containing nucleotide, a 5'-phosphate-containing nucleotide or a 5'-phosphate mimetic-containing nucleotide;
and/or (iv) the RNAi agent is

(In the formula, X is O or S.)
Conjugated to a ligand as shown in
25. An RNAi agent for use according to claim 24.

ＨＢＶ感染を有する対象を処置するためのキットであって
ａ)少なくとも３つのＨＢＶ転写物の発現を阻害するＲＮＡｉ剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、（ｉ）センス鎖が、５’－ＧＵＧＵＧＣＡＣＵＵＣＧＣＵＵＣＡＣＡ－３’(配列番号２７)のヌクレオチド配列を含み、そしてアンチセンス鎖が、５’－ＵＧＵＧＡＡＧＣＧＡＡＧＵＧＣＡＣＡＣＵＵ－３’（配列番号２５）のヌクレオチド配列を含むか、または（ｉｉ）センス鎖が、５’－ＣＡＣＣＡＵＧＣＡＡＣＵＵＵＵＵＣＡＣＣＵ－３’(配列番号２８)のヌクレオチド配列を含み、そしてアンチセンス鎖が、５’－ＡＧＧＵＧＡＡＡＡＡＧＵＵＧＣＡＵＧＧＵＧＵＵ－３’（配列番号２６）のヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡｉ剤；
ｂ)第一ＨＢＶコア抗原(ＨＢｃＡｇ)ポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび第一ＨＢＶ表面抗原(ＨＢｓＡｇ)ポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントを含むタンパク質ベースのＨＢＶワクチン；および
ｃ)第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび／または第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントをコードする発現ベクター構築物を含む核酸ベースのＨＢＶワクチンであって、
ここで、第二ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび／または第二ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントが第一ＨＢｃＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントおよび／または第一ＨＢｓＡｇポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントの少なくとも一つと少なくとも一つのエピトープを共有するＨＢＶワクチン；および
ｄ)請求項１～２５の何れかに記載の使用のためのＲＮＡｉ剤の使用のための指示
を含む、キット。 A kit for treating a subject having an HBV infection, comprising: a) an RNAi agent that inhibits expression of at least three HBV transcripts, the RNAi agent comprising a sense strand and an antisense strand that form a double-stranded region, wherein (i) the sense strand comprises the nucleotide sequence of 5'-GUGUGCACUUCGCUUCACA-3' (SEQ ID NO:27) and the antisense strand comprises the nucleotide sequence of 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU-3' (SEQ ID NO:25), or (ii) the sense strand comprises the nucleotide sequence of 5'-CACCAUGCAACUUUUUCACCU-3' (SEQ ID NO:28) and the antisense strand comprises the nucleotide sequence of 5'-AGGUGAAAAAGUUGCAUGGUGUU-3' (SEQ ID NO:26);
b) a protein-based HBV vaccine comprising a first HBV core antigen (HBcAg) polypeptide or an immunogenic fragment thereof and a first HBV surface antigen (HBsAg) polypeptide or an immunogenic fragment thereof; and c) a nucleic acid-based HBV vaccine comprising an expression vector construct encoding a second HBcAg polypeptide or an immunogenic fragment thereof and/or a second HBsAg polypeptide or an immunogenic fragment thereof,
26. A kit comprising: an HBV vaccine, wherein the second HBcAg polypeptide or immunogenic fragment thereof and/or the second HBsAg polypeptide or immunogenic fragment thereof shares at least one epitope with at least one of the first HBcAg polypeptide or immunogenic fragment thereof and/or the first HBsAg polypeptide or immunogenic fragment thereof; and d) instructions for useof the RNAi agent for use according to any of claims 1 to 25.