本発明は、電気化学的手法における被検物質を測定するための電気化学式免疫センサーに関する。The present invention relates to an electrochemical immunosensor for measuring a test substance using an electrochemical method.
試験溶液中の微量物質を簡便且つ高感度に測定する方法の１つとして、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が知られている。免疫測定法としては、酵素で標識した抗体を用い、酵素反応に由来する発色や発光等の信号を得ることにより被検物質の検知や濃度測定を行うＥＬＩＳＡ法が、幅広い分野で採用されている。しかしながら、ＥＬＩＳＡ法では、発色や発光等の信号検出時に光学系を必要とするため、大型の測定機が必要となる。また、正確な定量を行う場合には、発色等の測定結果を電気的な信号に変換する作業が必要となる等、複雑な処理を行う必要がある。One method known for easily and sensitively measuring trace substances in test solutions is the immunoassay method that uses an antigen-antibody reaction. The ELISA method, which uses an enzyme-labeled antibody to detect and measure the concentration of a test substance by obtaining signals such as color development or luminescence resulting from an enzyme reaction, is used in a wide range of fields. However, the ELISA method requires an optical system to detect signals such as color development or luminescence, which necessitates a large measuring machine. In addition, to perform accurate quantification, complex processing is required, such as converting the measurement results such as color development into electrical signals.
そこで、発色標識や蛍光標識のような汎用の標識物質を用いた免疫測定法等において、検出に際して電気化学的測定法を利用する方法が提案されている。電気化学的測定に用いる装置はＥＬＩＳＡ等に用いられる機器に比べて小型化が可能であることから、測定機器の小型化と検出感度の向上との両立が期待される。Therefore, a method has been proposed that uses electrochemical measurement for detection in immunoassays and other methods that use general-purpose labeling substances such as colorimetric and fluorescent labels. Since the equipment used in electrochemical measurements can be made smaller than that used in ELISA and other methods, it is expected that both miniaturization of the measuring equipment and improvement of detection sensitivity can be achieved.
特許文献１は、樹脂製シートの支持体に、電極部と、電極部からの電流を伝える導電部と、この電流値を測定する電気測定器に接続する接続部とを配するとともに、前記支持体上に複数のパッド類を一部分積層配置して、試料溶液を複数のパッド類に渡って流れさせて行き、前記電極部５の位置で流れを制御して電気化学的検出を行う方法が開示されている。Patent Document 1 discloses a method of electrochemical detection in which an electrode section, a conductive section for transmitting current from the electrode section, and a connection section for connecting to an electric measuring device for measuring the current value are arranged on a resin sheet support, and multiple pads are partially stacked on the support, a sample solution is caused to flow across the multiple pads, and the flow is controlled at the position of the electrode section 5.
しかしながら、特許文献１が開示する測定方法は、パッド類を使うと測定結果にばらつきがあった。特に、特許文献１が開示する技術は、金コロイド標識抗体を担持したコンジュケーションパッドが必須であり、製造工程および組立工程において工数が多く、原価に対して支配的であった。However, the measurement method disclosed in Patent Document 1 had variation in the measurement results when pads were used. In particular, the technology disclosed in Patent Document 1 required a conjugation pad carrying gold colloid-labeled antibodies, which required many steps in the manufacturing and assembly processes and was a major factor in the cost.
本発明者らは、コンジュケーションパッドを使用せず、金コロイド標識抗体を流路内に固定して電気化学式免疫法を実行した。The inventors performed electrochemical immunoassay by immobilizing gold colloid-labeled antibodies in the flow channel without using a conjugation pad.
しかしながら、コンジュケーションパッドを除いただけでは測定が困難であった。However, simply removing the conjugation pad made it difficult to measure.
本発明者らは、鋭意研究の結果、被験物質に特異的に結合する第１の結合物質が結合した金属微粒子を有する標識体を含む標識部と被験物質に特異的に結合する第２の結合物質の両方を備える電極部を使用することによってコンジュケーションパッドを使用せず、金コロイド標識抗体を流路内に固定して電気化学式免疫法を実行することができることを明らかにし、本発明は完成した。As a result of intensive research, the inventors have demonstrated that by using an electrode section equipped with both a label section including a label having metal fine particles bound to a first binding substance that specifically binds to a test substance, and a second binding substance that specifically binds to a test substance, it is possible to immobilize gold colloid-labeled antibodies in a flow path without using a conjugation pad, thereby completing the present invention.
［１］
本発明の目的は、
被験物質を含む試料溶液が移動可能な流路を備えるケースと、
上記試料溶液と接触可能に上記流路内に配置された電極と、
上記被験物質に特異的に結合する第１の結合物質が結合した金属微粒子を有する標識体を含む標識部と、
を備え、
上記電極は、電極部を備え、
上記電極部は、
上記第１の結合物質とは異なる上記被験物質上の部位に特異的に結合する第２の結合物質と、
上記標識部と、
を備えた、
電気化学式免疫センサー
を提供することである。[1]
The object of the present invention is to
A case having a flow path through which a sample solution containing a test substance can move;
an electrode disposed in the flow channel so as to be in contact with the sample solution;
A labeling part including a label having metal fine particles bound to a first binding substance that specifically binds to the test substance;
Equipped with
The electrode includes an electrode portion,
The electrode portion is
a second binding substance that specifically binds to a site on the test substance that is different from the first binding substance;
The sign portion,
Equipped with
An electrochemical immunosensor is provided.
本発明にかかる電気化学式免疫センサーを用いることによって、コンジュケーションパッドを使用せず、金コロイド標識抗体を流路内に固定して電気化学式免疫法を実行することができる。By using the electrochemical immunosensor of the present invention, it is possible to perform electrochemical immunoassays by immobilizing gold colloid-labeled antibodies in the flow channel without using a conjugation pad.
［２］
［１］に記載の電気化学式免疫センサーにおいて、上記電極は、作用電極と対極と参照電極とを備えていてもよく、上記第２の結合物質と標識部は、上記作用電極の表面に少なくとも備わっていてもよい。[2]
In the electrochemical immunosensor described in [1], the electrodes may comprise a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode, and the second binding substance and the labeling portion may be provided at least on the surface of the working electrode.
［３］
［１］に記載の電気化学式免疫センサーにおいて、上記流路は、
上流流路と、
上記上流流路よりも下流側に位置する下流流路と、
を備えていてもよく、
上記上流流路は、電極区画を備えていてもよく、
上記電極区画は、上記電極部が配置されていてもよい。[3]
In the electrochemical immunosensor according to [1], the flow path is
An upstream flow path;
a downstream flow path located downstream of the upstream flow path;
and
The upstream flow path may comprise an electrode compartment;
The electrode section may include an electrode portion disposed therein.
［４］
［３］に記載の電気化学式免疫センサーにおいて、上記下流流路は、上記試料溶液を吸収する吸収体を備えていてもよい。[4]
In the electrochemical immunosensor described in [3], the downstream flow path may include an absorbent that absorbs the sample solution.
定義
便宜上、本願で使用される特定の用語は、ここに集めている。別途規定されない限り、本願で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。文脈で別途明記されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の言及を含む。Definitions For convenience, certain terms used in this application are collected here. Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used in this application have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. The singular forms "a,""an," and "the" include plural references unless the context clearly dictates otherwise.
本発明で示す数値範囲及びパラメーターは、近似値であるが、特定の実施例に示されている数値は可能な限り正確に記載している。しかしながら、いずれの数値も本質的に、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含んでいる。また、本明細書で使用する「約」という用語は、一般に、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％以内を意味する。或いは、用語「約」は、当業者が考慮する場合、許容可能な標準誤差内にあることを意味する。The numerical ranges and parameters set forth herein are approximate, but the numerical values set forth in the specific examples are reported as precisely as possible. However, any numerical value inherently contains certain errors necessarily resulting from the standard deviation found in their respective testing measurements. Also, as used herein, the term "about" generally means within 10%, 5%, 1% or 0.5% of a given value or range. Alternatively, the term "about" means within an acceptable standard error as considered by one of ordinary skill in the art.
以下、本発明の実施形態について説明する。以下の実施形態は、例示であって、本発明の範囲は、以下の実施形態で示すものに限定されない。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑をさけるために、摘示説明を省略する。The following describes an embodiment of the present invention. The following embodiment is merely an example, and the scope of the present invention is not limited to the embodiment described below. Note that explanations of similar content will be omitted to avoid repetition.
実施形態
図１Ａは、本実施形態にかかる電気化学式免疫センサー１に関する平面斜視図を示している。図１Ａは、蓋５０を備える電気化学式免疫センサー１に関する平面斜視図を示している。図２Ａ（ａ）は、本実施形態にかかる電気化学式免疫センサー１の平面図を示し、図２Ａ（ｂ）は、図２Ａ（ａ）のＡ－Ａ線における電気化学式免疫センサー１の断面図を示している。図２Ｂ（ａ）は、蓋５０を備えた電気化学式免疫センサー１の平面図を示し、図２Ｂ（ｂ）は、図２Ｂ（ａ）のＡ－Ａ線における蓋５０を備えた電気化学式免疫センサー１の断面図を示している。図３は、本実施形態にかかる電気化学式免疫センサー１に関する展開図を示している。図４Ａは、電極２０の詳細とその配置並びに標識部４１の位置を示している。図４Ｂは、図４Ａに示す標識部４１とは異なる位置に配置された標識部４１’を示している。図４Ａ及びＢにおける破線は、標識部（４１及び４１’）によって隠れる電極部２１を便宜的に示している。1A shows a planar perspective view of an electrochemical immunosensor 1 according to the present embodiment. FIG. 1A shows a planar perspective view of an electrochemical immunosensor 1 including a lid 50. FIG. 2A(a) shows a plan view of the electrochemical immunosensor 1 according to the present embodiment, and FIG. 2A(b) shows a cross-sectional view of the electrochemical immunosensor 1 along line A-A in FIG. 2A(a). FIG. 2B(a) shows a plan view of the electrochemical immunosensor 1 including a lid 50, and FIG. 2B(b) shows a cross-sectional view of the electrochemical immunosensor 1 including the lid 50 along line A-A in FIG. 2B(a). FIG. 3 shows a development view of the electrochemical immunosensor 1 according to the present embodiment. FIG. 4A shows details of the electrodes 20, their arrangement, and the position of the label 41. FIG. 4B shows a label 41' arranged at a different position from the label 41 shown in FIG. 4A. The dashed lines in FIGS. 4A and 4B conveniently indicate the electrode portion 21 hidden by the marking portions (41 and 41').
電気化学式免疫センサー１
本実施形態にかかる電気化学式免疫センサー１は、被験物質を含む試料溶液（第一溶液）が移動可能な流路１００を備えるケース１０と、試料溶液と接触可能に流路１００内に配置された電極２０と、被験物質に特異的に結合する第１の結合物質が結合した金属微粒子を有する標識体を含む標識部４１と、を備える。Electrochemical immunosensor 1
The electrochemical immunosensor 1 of this embodiment comprises a case 10 having a flow path 100 through which a sample solution (first solution) containing a test substance can move, an electrode 20 arranged within the flow path 100 so as to be able to come into contact with the sample solution, and a labeling section 41 including a label having metal microparticles bound to a first binding substance that specifically binds to the test substance.
ケース１０
ある実施形態において、流路１００は、ケース１０に形成された凹部である。ある実施形態において、ケース１０は、流路１００の形状（流路の長さ、幅及び深さなど）を規定する型プレート１１と型プレート１１を収容する容器部１２を備えている。型プレート１１は、容器部１２から取り外し可能であってもよく、任意の結合手段（接着剤及び溶接など）を介して容器部１２に結合していてもよい。電気化学式免疫センサー１は、流路１００を少なくとも覆う形状を有するカバー５０を備えていてもよい。Case 10
In one embodiment, the flow channel 100 is a recess formed in the case 10. In one embodiment, the case 10 includes a template 11 that defines the shape of the flow channel 100 (such as the length, width, and depth of the flow channel) and a container portion 12 that houses the template 11. The template 11 may be detachable from the container portion 12, or may be bonded to the container portion 12 via any bonding means (such as adhesive or welding). The electrochemical immunosensor 1 may include a cover 50 having a shape that covers at least the flow channel 100.
電極２０
電極２０は、第１の結合物質とは異なる被験物質上の部位に特異的に結合する第２の結合物質と標識部４１の両方を備える電極部２１を備える。Electrode 20
The electrode 20 comprises an electrode portion 21 comprising both a second binding substance that specifically binds to a site on the test substance different from the first binding substance, and a label portion 41 .
ある実施形態において、電極２０は、電極部２１からの電流の電流値を測定する電気測定器に接続する接続部２２と、電極部２１と接続部２２の間に位置し電極部２１から接続部２２へ電流を伝える導電部２３と、を更に備える。In one embodiment, the electrode 20 further includes a connection portion 22 that is connected to an electric measuring device that measures the current value of the current from the electrode portion 21, and a conductive portion 23 that is located between the electrode portion 21 and the connection portion 22 and transmits the current from the electrode portion 21 to the connection portion 22.
ある実施形態において、電極部２１は、作用電極２１ａと対極２１ｂと参照電極２１ｃとを備える。作用電極２１ａは、作用電極用導電部２３ａと接続し、対極２１ｂは、対極用導電部２３ｂと接続し、参照電極２１ｃは、参照電極用導電部２３ｃと接続する。ある実施形態において、第１の結合物質は、作用電極２１ａの表面に備わる。In one embodiment, the electrode section 21 includes a working electrode 21a, a counter electrode 21b, and a reference electrode 21c. The working electrode 21a is connected to the working electrode conductive section 23a, the counter electrode 21b is connected to the counter electrode conductive section 23b, and the reference electrode 21c is connected to the reference electrode conductive section 23c. In one embodiment, the first binding substance is provided on the surface of the working electrode 21a.
電極２０の接続部２２は、ケース１０の下流Ｄ側において突出するように構成されているが、このような構成は必須ではなく、接続部２２は、ケース１０内に配置されていてもよい。The connection portion 22 of the electrode 20 is configured to protrude on the downstream D side of the case 10, but such a configuration is not required, and the connection portion 22 may be disposed within the case 10.
流路１００
流路１００は、上流流路１１０と、上流流路１１０よりも下流Ｄ側に位置する下流流路１２０と、を備える。ある実施形態において、下流流路１２０は、第一下流流路１３０と第一下流流路１３０よりも下流Ｄ側に位置する第二下流流路１４０とを備える。ある実施形態において、流路１００は、撥水性を有する。別の実施形態において、第一下流流路１３０は、撥水領域を備える。ある実施形態において、流路１００は、親水性を有する。別の実施形態において、第一下流流路１３０は、親水性領域を備える。本実施形態にかかる流路１００は、流路幅が一定であるが、第一下流流路１３０は、上流Ｕから下流Ｄにかけて幅が広がっている形状（テーパー形状）を有していてもよい。ある実施形態において、第二下流流路１４０の幅は、上流流路１１０の幅よりも広い。ある実施形態において、第二下流流路１４０の幅は、一定であってもよい。ある実施形態において、第一下流流路１３０の上流側幅は、上流流路１１０の下流側幅と同じであり、第一下流流路１３０の下流側幅は、第二下流流路１４０の幅と同じである。Flow path 100
The flow channel 100 includes an upstream flow channel 110 and a downstream flow channel 120 located downstream D from the upstream flow channel 110. In an embodiment, the downstream flow channel 120 includes a first downstream flow channel 130 and a second downstream flow channel 140 located downstream D from the first downstream flow channel 130. In an embodiment, the flow channel 100 has water repellency. In another embodiment, the first downstream flow channel 130 includes a water repellent region. In an embodiment, the flow channel 100 has hydrophilicity. In another embodiment, the first downstream flow channel 130 includes a hydrophilic region. The flow channel 100 according to this embodiment has a constant flow channel width, but the first downstream flow channel 130 may have a shape (tapered shape) in which the width increases from the upstream U to the downstream D. In an embodiment, the width of the second downstream flow channel 140 is wider than the width of the upstream flow channel 110. In an embodiment, the width of the second downstream flow channel 140 may be constant. In one embodiment, the upstream width of first downstream flow channel 130 is the same as the downstream width of upstream flow channel 110 , and the downstream width of first downstream flow channel 130 is the same as the width of second downstream flow channel 140 .
上流流路１１０
上流流路１１０は、上流区画１１１と電極区画１１２と下流区画１１３を備える。電極区画１１２は、上流区画１１１よりも下流Ｄ側に位置し、電極部２１が配置される。下流区画１１３は、電極区画１１２よりも下流Ｄ側に位置し、下流流路１２０と接続する。Upstream flow path 110
The upstream flow path 110 includes an upstream section 111, an electrode section 112, and a downstream section 113. The electrode section 112 is located on the downstream D side of the upstream section 111, and has an electrode unit 21 disposed therein. The downstream section 113 is located on the downstream D side of the electrode section 112, and is connected to the downstream flow path 120.
ある実施形態において、上流区画１１１は、試料溶液が導入される導入区画１１４と、導入区画１１４よりも下流Ｄ側に位置し且つ電極区画１１２よりも上流Ｕ側に位置する移行区画１１６を備える。In one embodiment, the upstream compartment 111 includes an introduction compartment 114 into which the sample solution is introduced, and a transition compartment 116 located downstream D of the introduction compartment 114 and upstream U of the electrode compartment 112.
下流区画１１３は、電極部２１から下流流路１２０へ流れた試料溶液を分断する区画であり、試料溶液が分断されることにより、電極部２１に滞留した試料溶液を第二溶液（洗浄液や電気化学的測定用の溶液などの）により十分に置換することができる。The downstream compartment 113 is a compartment that divides the sample solution that has flowed from the electrode unit 21 to the downstream flow path 120. By dividing the sample solution, the sample solution remaining in the electrode unit 21 can be sufficiently replaced with a second solution (such as a cleaning solution or a solution for electrochemical measurement).
標識部４１
標識部４１は、電極部２１に備わる（と接している）。ある実施形態において、標識部４１は、作用電極２１ａに少なくとも備わる。ある実施形態において、標識部４１は、電極部２１において作用電極２１ａにのみ備わる。言い換えれば、標識部４１は、作用電極２１ａに備わり、対極２１ｂと参照電極２１ｃには備わらない。標識部４１は、標識体を含む溶液を電極部２１上で乾燥させることで電極部２１に標識体を固定することができる。Sign unit 41
The label portion 41 is provided on (is in contact with) the electrode portion 21. In an embodiment, the label portion 41 is provided on at least the working electrode 21a. In an embodiment, the label portion 41 is provided only on the working electrode 21a in the electrode portion 21. In other words, the label portion 41 is provided on the working electrode 21a, and is not provided on the counter electrode 21b and the reference electrode 21c. The label portion 41 can fix the label to the electrode portion 21 by drying a solution containing the label on the electrode portion 21.
下流流路１２０
ある実施形態において、下流流路１２０は、試料溶液を吸収する吸収体３０を備える。別の実施形態において、第二下流流路１４０は、試料溶液を吸収する吸収体３０を備える。吸収体３０は、例えば、ニトロセルロースからできていてもよい。吸収体３０は、下流流路１
２０の内壁とは接していないことが好ましい。Downstream flow path 120
In one embodiment, the downstream flow path 120 includes an absorbent 30 that absorbs the sample solution. In another embodiment, the second downstream flow path 140 includes an absorbent 30 that absorbs the sample solution. The absorbent 30 may be made of, for example, nitrocellulose. The absorbent 30 is disposed in the downstream flow path 1.
It is preferable that the inner wall of the filter 20 is not in contact with the filter 20 .
カバー５０
カバー５０は、ケース１０を覆う又は部分的に覆うことができる。カバー５０は、流路１００を少なくとも覆う形状を有する。ある実施形態において、カバー５０は、型プレート１１を覆う又は部分的に覆う形状を有する。別の実施形態において、カバー５０は、容器１２を覆う又は部分的に覆う形状を有する。カバー５０が流路１００を覆うことによって、流路１００がトンネル構造となり、流路１００が外部環境から保護される。カバー５０は、外部環境と上流区画１１３が流体連通することを可能にするサンプル孔５１を備え、サンプル孔５１を通じて試料溶液を上流区画１１３に導入することができる。カバー５０の表面５２は、フラット形状であってもよく、カバー５０の裏面（不図示）は、フラット形状であってもよい。Cover 50
The cover 50 can cover or partially cover the case 10. The cover 50 has a shape that at least covers the flow path 100. In one embodiment, the cover 50 has a shape that covers or partially covers the mold plate 11. In another embodiment, the cover 50 has a shape that covers or partially covers the container 12. When the cover 50 covers the flow path 100, the flow path 100 has a tunnel structure, and the flow path 100 is protected from the external environment. The cover 50 has a sample hole 51 that allows the external environment and the upstream section 113 to be in fluid communication, and a sample solution can be introduced into the upstream section 113 through the sample hole 51. The surface 52 of the cover 50 may be flat, and the back surface (not shown) of the cover 50 may be flat.
電気化学的処理
先ず、電気化学的測定において用いる電極２０の未処理の作用電極２１ａの表面に、被検物質に対する第２の結合物質（例えば、一次抗体）を固定しておく。未処理の作用電極２１ａは、第２の結合物質が固定されていない作用電極２１ａであり、第２の結合物質と作用電極２１ａとの固定を容易にする要素を備えていてもよい。次に、作用電極２１ａの表面は非特異吸着を防ぐためにブロッキングする。Electrochemical Treatment First, a second binding substance (e.g., a primary antibody) for the test substance is immobilized on the surface of the untreated working electrode 21a of the electrode 20 used in the electrochemical measurement. The untreated working electrode 21a is a working electrode 21a to which the second binding substance is not immobilized, and may be provided with an element that facilitates the immobilization of the second binding substance to the working electrode 21a. Next, the surface of the working electrode 21a is blocked to prevent non-specific adsorption.
また、第２の結合物質（例えば、一次抗体）とは異なる被検物質上の部位を認識する第１の結合物質（例えば、二次抗体）に金属微粒子を標識することにより標識体を作成する。次に、標識体を含む溶液を電極部２１上で乾燥させることで電極部２１に標識体を塗布（固定）するA label is also created by labeling a first binding substance (e.g., a secondary antibody) that recognizes a site on the test substance that is different from the second binding substance (e.g., a primary antibody) with metal particles. Next, a solution containing the label is dried on the electrode section 21 to apply (fix) the label to the electrode section 21.
ケース１０に電極２０をセットし、アッセンブルされた電気化学式免疫センサー１を電気測定器にセットする。The electrodes 20 are placed in the case 10, and the assembled electrochemical immunosensor 1 is placed in the electrical measuring device.
導入区画１１４に試料溶液を導入する。導入区画１１４に導入された試料溶液は、毛細管現象や重力によって下流Ｄ側に流れ、電極区画１１２の標識部４１に到達する。The sample solution is introduced into the introduction section 114. The sample solution introduced into the introduction section 114 flows downstream D due to capillary action and gravity, and reaches the label section 41 of the electrode section 112.
第１の結合物質と結合する被験物質が試料溶液中に含まれる場合、被験物質－第１の結合物質－金属微粒子複合体が形成される。次に、試料溶液中の当該複合体は、電極２０の作用電極２１ａと接触する。When a test substance that binds to the first binding substance is contained in the sample solution, a test substance-first binding substance-metal microparticle complex is formed. Next, the complex in the sample solution comes into contact with the working electrode 21a of the electrode 20.
上記複合体中の被検物質が作用電極２１ａ上の第２の結合物質と接触すると、作用電極２１ａ上で抗原抗体反応が起きる。標識体が被検物質を介して第２の結合物質に結合することにより、被検物質の濃度に対応した量の金属微粒子が作用電極２１ａの近傍に集められた状態となる。操作時間を短くする目的で、抗原抗体反応は、試料溶液が作用電極２１ａ上を通過しながら行われることが好ましいが、試料溶液の流れを止めた状態で抗原抗体反応を行うことを排除するものではない。When the test substance in the complex comes into contact with the second binding substance on the working electrode 21a, an antigen-antibody reaction occurs on the working electrode 21a. When the label binds to the second binding substance via the test substance, an amount of metal particles corresponding to the concentration of the test substance is collected near the working electrode 21a. In order to shorten the operation time, it is preferable that the antigen-antibody reaction is carried out while the sample solution is passing over the working electrode 21a, but this does not exclude the antigen-antibody reaction being carried out with the flow of the sample solution stopped.
試料溶液は、下流区画１１３を通過して下流流路１２０に流入し、下流流路１２０に配置された吸収体３０に吸収される。試料溶液は、第一下流流路１３０によって、上流流路１１０から下流流路１２０へ速やかに排出され、洗浄液や電気化学的測定用の溶液などの第二溶液を迅速に導入することができるようになる。なお、作用電極２１ａは第二溶液で洗浄されるため、作用電極２１ａ上を覆う程度に試料溶液が作用電極２１ａ上に残っていてもよい。The sample solution passes through the downstream section 113 and flows into the downstream flow path 120, where it is absorbed by the absorber 30 arranged in the downstream flow path 120. The sample solution is quickly discharged from the upstream flow path 110 to the downstream flow path 120 by the first downstream flow path 130, allowing the second solution, such as a cleaning solution or a solution for electrochemical measurement, to be quickly introduced. Note that since the working electrode 21a is washed with the second solution, the sample solution may remain on the working electrode 21a to the extent that it covers the working electrode 21a.
本発明においては、生体物質、合成物質等のあらゆる物質を被検物質とすることができる。被検物質に特異的に結合する結合物質（第１の結合物質、第２の結合物質）には、被験物質に応じて適切なものを選択する。被検物質に応じた量の金属微粒子を集めるために、本実施形態では抗原と抗体との特異的結合を利用しているが、物質間で特異的に結合するものであればこの組合せに限らず、例えば、核酸－核酸、核酸－核酸結合タンパク質、レクチン－糖鎖、又はレセプター－リガンドの特異的結合を利用してもよい。被検物質－特異的結合物質の関係の順序は、上記と逆でもよい。In the present invention, any substance, such as a biological substance or a synthetic substance, can be used as the test substance. An appropriate binding substance (first binding substance, second binding substance) that specifically binds to the test substance is selected according to the test substance. In order to collect an amount of metal microparticles according to the test substance, the specific binding between an antigen and an antibody is used in this embodiment, but this is not the only combination that can be used as long as the substances specifically bind to each other. For example, specific binding between nucleic acid-nucleic acid, nucleic acid-nucleic acid binding protein, lectin-sugar chain, or receptor-ligand may be used. The order of the relationship between the test substance and the specific binding substance may be reversed from that described above.
標識物質として用いられる金属微粒子としては特に制限されないが、例えば金、白金、銀、銅、ロジウム、パラジウム等の微粒子やそれらのコロイド粒子、量子ドット等を用いることができる。なかでも粒径１０ｎｍ～１００ｎｍの金微粒子、特に粒径４０ｎｍ程度の金微粒子を用いることが好ましい。There are no particular limitations on the metal particles used as labeling substances, but examples include fine particles of gold, platinum, silver, copper, rhodium, palladium, etc., colloidal particles thereof, quantum dots, etc. Among these, it is preferable to use gold fine particles with a particle size of 10 nm to 100 nm, and particularly gold fine particles with a particle size of about 40 nm.
試料溶液が下流流路１２０へ排出された後、導入区画１１４に第二溶液を導入し、作用電極２１ａの表面を洗浄する。更に、導入区画１１４に第二溶液を導入してもよく、異なる種類の第二溶液を導入してもよい。電気化学的測定のために、作用電極２１ａと対極２１ｂと参照電極２１ｃ上を覆う程度に第二溶液が作用電極２１ａと対極２１ｂと参照電極２１ｃ上に残った状態にさせる。After the sample solution is discharged to the downstream flow path 120, a second solution is introduced into the introduction section 114 to wash the surface of the working electrode 21a. Further, a second solution or a different type of second solution may be introduced into the introduction section 114. For electrochemical measurement, the second solution is left on the working electrode 21a, the counter electrode 21b, and the reference electrode 21c to an extent that it covers the working electrode 21a, the counter electrode 21b, and the reference electrode 21c.
金属微粒子を電気化学的に酸化させる。例えば、参照電極２１ｃに対する作用電極２１ａの電位を、金属微粒子が電気化学的に酸化する電位に所定時間保持する。このことにより、作用電極２１ａの表面近傍に集めた金属微粒子を完全に酸化する。The metal particles are electrochemically oxidized. For example, the potential of the working electrode 21a relative to the reference electrode 21c is maintained for a predetermined time at a potential at which the metal particles are electrochemically oxidized. This completely oxidizes the metal particles collected near the surface of the working electrode 21a.
金属微粒子を電気化学的に酸化させた後、酸化した金属を還元する際に生じるピーク電流値に基づいて、被検物質の有無又は濃度を測定する。具体的には、例えば、作用電極２１ａの電位を負方向に変化させていき、電位変化に伴う電流変化を測定する。電極電位を負方向に変化させていくと、前述の電位制御により酸化溶出した金属が還元されることにより還元電流が流れるので、これを測定する。試験溶液中の被検物質が多く、作用電極２１ａの近傍に集められた金属微粒子が多いほど還元電流強度も大きくなることから、これに基づいて被検物質の定量又は検出が実現される。例えば、還元電流値と既知濃度の被検物質と関係を予め求めておき、測定された還元電流値と比較することにより、被検物質濃度を求めることができる。また、得られる還元電流値から試験溶液中の被検物質の有無を知ることができる。After electrochemically oxidizing the metal particles, the presence or absence or concentration of the test substance is measured based on the peak current value that occurs when the oxidized metal is reduced. Specifically, for example, the potential of the working electrode 21a is changed in the negative direction, and the change in current accompanying the potential change is measured. When the electrode potential is changed in the negative direction, the metal that has been oxidized and dissolved is reduced by the above-mentioned potential control, and a reduction current flows, which is measured. The more the test substance in the test solution and the more the metal particles collected near the working electrode 21a, the greater the reduction current strength, and the quantification or detection of the test substance is realized based on this. For example, the relationship between the reduction current value and the test substance of known concentration is determined in advance, and the test substance concentration can be determined by comparing the measured reduction current value. In addition, the presence or absence of the test substance in the test solution can be known from the obtained reduction current value.
作用電極２１ａの電位制御及び電気化学測定の際に用いる溶液としては、金属微粒子を容易に電気化学的に酸化させることができることから、酸性溶液を用いることが好ましい。酸性溶液としては、金属微粒子の種類等に応じて適宜選択すればよいが、例えば塩酸、硝酸、酢酸、リン酸、クエン酸、硫酸等を含む水溶液を用いることができる。金属微粒子の電気化学的酸化のし易さを考慮すると、０．０５規定～２規定の塩酸水溶液を用いることが好ましく、０．１規定～０．５規定の塩酸水溶液を用いることがより好ましい。As the solution used for potential control of the working electrode 21a and electrochemical measurement, it is preferable to use an acidic solution because it can easily electrochemically oxidize the metal microparticles. The acidic solution may be appropriately selected depending on the type of metal microparticles, and for example, an aqueous solution containing hydrochloric acid, nitric acid, acetic acid, phosphoric acid, citric acid, sulfuric acid, etc. can be used. Considering the ease of electrochemical oxidation of the metal microparticles, it is preferable to use a 0.05N to 2N hydrochloric acid aqueous solution, and it is more preferable to use a 0.1N to 0.5N hydrochloric acid aqueous solution.
一方、作用電極２１ａの電位制御及び電気化学測定の際に用いる溶液としては、酸性溶液の他、塩素を含む中性溶液を用いることも可能である。塩素を含む中性溶液を用いることにより、酸性溶液を用いる場合に比べて大きな電流変化量が得られ、結果として、より高感度な測定が達成される。また、酸性溶液を用いる場合、例えば低電位側における還元ピークの裾が上昇する等のようにピーク形状が非対称となったり、例えば０．１Ｖ付近においてノイズが発生することがある。これに対して、塩素を含む中性溶液を用いることで、還元ピークの裾が平坦となるとともに、上記ノイズ発生が抑えられるので、還元ピーク強度検出が簡便となる。さらに、酸性溶液やアルカリ溶液のような取扱いの難しい溶液の使用を回避することができ、測定操作を安全且つ簡便に実施することができる。塩素を含む中性溶液としては、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ等を用いたときに上記の効果を得られるが、特にＫＣｌを用いたときに効果が大きい。On the other hand, as the solution used for potential control of the working electrode 21a and electrochemical measurement, in addition to an acidic solution, a neutral solution containing chlorine can also be used. By using a neutral solution containing chlorine, a larger amount of current change can be obtained compared to when an acidic solution is used, and as a result, a more sensitive measurement can be achieved. In addition, when an acidic solution is used, the peak shape may become asymmetric, for example, the tail of the reduction peak on the low potential side may rise, and noise may occur, for example, around 0.1 V. In contrast, by using a neutral solution containing chlorine, the tail of the reduction peak becomes flat and the above-mentioned noise generation is suppressed, making it easier to detect the reduction peak intensity. Furthermore, it is possible to avoid the use of solutions that are difficult to handle, such as acidic solutions and alkaline solutions, and the measurement operation can be performed safely and easily. The above effects can be obtained when, for example, KCl, NaCl, LiCl, etc. are used as the neutral solution containing chlorine, but the effect is particularly large when KCl is used.
金属微粒子を酸化させるに際して、作用電極２１ａの電位は、金属微粒子が酸化可能な電位とする。具体的には、作用電極２１ａの電位は、使用する金属微粒子の種類に応じて適宜最適な値に設定する必要があるが、例えば、銀塩化銀参照電極２１ｃに対して＋１～＋２Ｖとすることが好ましい。作用電極２１ａの電位を上記範囲内にすることにより、作用電極２１ａの表面近傍に集めた金属微粒子を完全に酸化溶出させることができ、被検物質の検出感度を確実に向上させることができる。作用電極２１ａの電位を上記範囲未満とした場合、測定時に還元電流のピークが現れないおそれがあり、逆に上記範囲を超えた場合、酸化させた金属微粒子の泳動による拡散が起こり、作用電極２１ａ近傍における酸化物の濃度が低下してしまい、これにより還元電流のピークが小さくなるおそれがある。より好ましい範囲は、＋１．２Ｖ～＋１．６Ｖである。When oxidizing the metal particles, the potential of the working electrode 21a is set to a potential at which the metal particles can be oxidized. Specifically, the potential of the working electrode 21a must be set to an optimal value depending on the type of metal particles used, and is preferably set to +1 to +2 V relative to the silver-silver chloride reference electrode 21c, for example. By setting the potential of the working electrode 21a within the above range, the metal particles collected near the surface of the working electrode 21a can be completely oxidized and eluted, and the detection sensitivity of the test substance can be reliably improved. If the potential of the working electrode 21a is set below the above range, there is a risk that the peak of the reduction current will not appear during measurement, and conversely, if it exceeds the above range, diffusion due to migration of the oxidized metal particles occurs, the concentration of oxides near the working electrode 21a decreases, and this may result in a smaller peak of the reduction current. A more preferable range is +1.2 V to +1.6 V.
金属微粒子を電気化学的に酸化させる具体的な手段としては、作用電極２１ａの電位を金属微粒子が酸化する電位に所定時間保持することが挙げられる。上記電位を所定時間保持する操作は、金属微粒子を十分に酸化させられるため、好ましい方法である。また、作用電極２１ａに金属微粒子が電気化学的に酸化する電位を印加するに際しては、前述したように作用電極２１ａの電位を所定の電位に保持する方法の他、例えばサイクリックボルタンメトリー等によって、作用電極２１ａの電位を時間経過に伴い変化させてもよい。作用電極２１ａの電位を時間経過に伴って変化させる場合には、金属微粒子が酸化する電位の範囲内（例えば、銀塩化銀参照電極２１ｃに対し＋１～＋２Ｖ）において、作用電極２１ａの電位を変化させることが好ましい。さらに、金属微粒子を酸化させるに際しては、金属微粒子が電気化学的に酸化する電位を作用電極２１ａに複数回印加してもよい。A specific method for electrochemically oxidizing metal particles is to hold the potential of the working electrode 21a at a potential at which the metal particles oxidize for a predetermined time. The operation of holding the potential for a predetermined time is a preferred method because it allows the metal particles to be sufficiently oxidized. In addition, when applying a potential at which the metal particles electrochemically oxidize to the working electrode 21a, in addition to the method of holding the potential of the working electrode 21a at a predetermined potential as described above, the potential of the working electrode 21a may be changed over time, for example, by cyclic voltammetry. When changing the potential of the working electrode 21a over time, it is preferable to change the potential of the working electrode 21a within the range of potential at which the metal particles oxidize (for example, +1 to +2 V relative to the silver-silver chloride reference electrode 21c). Furthermore, when oxidizing the metal particles, a potential at which the metal particles electrochemically oxidize may be applied to the working electrode 21a multiple times.
なお、金属微粒子として粒径１０ｎｍ～６０ｎｍの金微粒子を使用する場合、金微粒子を電気化学的に酸化させるに際して、０．１規定～０．５規定の塩酸溶液中で、銀塩化銀参照電極２１ｃに対する上記作用電極２１ａの電位を＋１．２Ｖ～＋１．６Ｖとすることが好ましい。When using gold particles with a particle size of 10 nm to 60 nm as the metal particles, it is preferable to electrochemically oxidize the gold particles in a 0.1N to 0.5N hydrochloric acid solution at a potential of +1.2 V to +1.6 V for the working electrode 21a relative to the silver-silver chloride reference electrode 21c.
ここで、金属微粒子を十分に酸化させるに際しては、金属微粒子の量に応じて最適な電荷量を与えるように注意する必要がある。電荷量は電流を積分した値であるため、作用電極２１ａに印加する電位が比較的低い電位であれば、金属微粒子を十分に酸化させるためには当該電位を長時間印加する必要がある。一方、作用電極２１ａに印加する電位が比較的高い電位であれば、金属微粒子を十分に酸化させるために必要な時間は短時間でよい。Here, to fully oxidize the metal microparticles, care must be taken to apply the optimal amount of charge depending on the amount of metal microparticles. Since the amount of charge is the integrated value of the current, if the potential applied to the working electrode 21a is relatively low, it is necessary to apply this potential for a long period of time to fully oxidize the metal microparticles. On the other hand, if the potential applied to the working electrode 21a is relatively high, a short period of time is sufficient to fully oxidize the metal microparticles.
金属微粒子が電気化学的に酸化する電位に作用電極２１ａの電位を保持する時間を１秒以上とすることで、金属微粒子を十分に酸化させることができ、検出感度を確実に向上させることができる。一方、印加時間を１００秒以上としても得られる電流値は殆ど変わらない。したがって、１秒以上１００秒以下が好ましい。上記電位の保持時間のさらに好ましい範囲は、４０秒以上１００秒以下である。By holding the potential of the working electrode 21a at a potential at which the metal microparticles are electrochemically oxidized for 1 second or more, the metal microparticles can be sufficiently oxidized, and the detection sensitivity can be reliably improved. On the other hand, even if the application time is set to 100 seconds or more, the obtained current value remains almost unchanged. Therefore, a holding time of the potential of 1 second or more and 100 seconds or less is preferable. A more preferable range for the holding time of the potential is 40 seconds or more and 100 seconds or less.
酸化した金属を電気化学的に還元する際に生じる電流を測定する方法としては、例えば、微分パルスボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー等のボルタンメトリー、アンペロメトリー、クロノメトリー等が挙げられる。Methods for measuring the current generated when an oxidized metal is electrochemically reduced include, for example, voltammetry such as differential pulse voltammetry and cyclic voltammetry, amperometry, and chronometry.
以上のような実施形態においては、作用電極２１ａ上で抗原抗体反応等を行って作用電極２１ａの表面近傍に金属微粒子を集め、標識体に含まれる金属微粒子に由来する還元ピーク電流を測定するので、簡便且つ高感度に試験溶液中の被検物質を測定することができる。In the above embodiment, an antigen-antibody reaction or the like is carried out on the working electrode 21a to collect metal particles near the surface of the working electrode 21a, and the reduction peak current derived from the metal particles contained in the label is measured, so that the test substance in the test solution can be measured easily and with high sensitivity.
別の実施形態においては、被検物質に応じた量の金属微粒子を作用電極２１ａの表面近傍に集めるために、被検物質に対する２種類の結合物質を用意し、一方（第１の結合物質）を磁性微粒子の表面に固定化しておくとともに、他方（第２の結合物質）を金属微粒子で標識して標識体を形成しておき、標識体と反応させた後の磁性微粒子を作用電極２１ａの表面に集めてもよい。In another embodiment, in order to collect an amount of metal microparticles corresponding to the test substance near the surface of the working electrode 21a, two types of binding substances for the test substance are prepared, one (first binding substance) is immobilized on the surface of magnetic microparticles, and the other (second binding substance) is labeled with metal microparticles to form a label, and the magnetic microparticles after reacting with the label may be collected on the surface of the working electrode 21a.
なお、以上の説明においては、被検物質量に対応する量の金属微粒子を集める方法として、非競合反応を利用して被検物質量に対応する量の金属微粒子を集める方法を例に挙げたが、競合反応を利用して被検物質量に対応する量の金属微粒子を集める方法を採用しても構わない。In the above explanation, a method of collecting metal microparticles in an amount corresponding to the amount of the test substance using a non-competitive reaction has been given as an example of a method of collecting metal microparticles in an amount corresponding to the amount of the test substance, but a method of collecting metal microparticles in an amount corresponding to the amount of the test substance using a competitive reaction may also be used.
以下、本発明の実施例について、実験結果を参照して説明する（実験装置、方法、条件及び試薬の詳細は、ＷＯ２００７／１１６８１１を参照）。The following describes examples of the present invention with reference to experimental results (for details of the experimental apparatus, method, conditions, and reagents, see WO2007/116811).
（実験１）
１．作用電極への抗体の固定化
本実験では、作用電極の表面に一次抗体（抗ｈＣＧ抗体）を固定化した印刷電極を用いて、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）で希釈したヒトゴナドトロピン（ｈＣＧ）の測定を試みた。ｈＣＧは妊娠診断用マーカーの一種である。金コロイド標識二次抗体（標識体）としては、金コロイド標識抗ｈαＳ抗体を用いた。(Experiment 1)
1. Immobilization of antibodies on the working electrode In this experiment, human gonadotropin (hCG) diluted with PBS (phosphate buffer solution) was measured using a printed electrode with a primary antibody (anti-hCG antibody) immobilized on the surface of the working electrode. hCG is a type of pregnancy diagnostic marker. Gold colloid-labeled anti-hαS antibody was used as the gold colloid-labeled secondary antibody (label).
被検物質測定用の電極デバイスとしては、図１Ａ及び１Ｂに示す電気化学式免疫センサー１及び図４Ａに示す電極２０（印刷電極）を用いた。電極の電極部は、カーボンペーストで形成した作用電極及び対極と、カーボンペーストで形成したリードと、銀／塩化銀で形成した参照電極とを絶縁支持体上に有するものであり、作用電極、対極及び参照電極の表面の一部が絶縁層で被覆されることにより、有効な電極面積が規定されている。As electrode devices for measuring the test substance, an electrochemical immunosensor 1 shown in Figures 1A and 1B and an electrode 20 (printed electrode) shown in Figure 4A were used. The electrode part of the electrode has a working electrode and a counter electrode formed from carbon paste, a lead formed from carbon paste, and a reference electrode formed from silver/silver chloride on an insulating support, and the effective electrode area is defined by covering part of the surfaces of the working electrode, counter electrode, and reference electrode with an insulating layer.
濃度１００μｇ／ｍＬに調製した抗ｈＣＧ抗体（一次抗体）溶液を作用電極上に２μＬ滴下し、４℃の冷暗所で１２時間以上静置することにより抗ｈＣＧ抗体を作用電極の表面に固定した。ＰＢＳを用いて印刷電極デバイスを洗浄後、０．１％の牛血清アルブミンでブロッキングを行った。2 μL of anti-hCG antibody (primary antibody) solution prepared to a concentration of 100 μg/mL was dropped onto the working electrode, and the anti-hCG antibody was immobilized on the surface of the working electrode by leaving it in a cool, dark place at 4°C for 12 hours or more. After washing the printed electrode device with PBS, blocking was performed with 0.1% bovine serum albumin.
２．電極上への金コロイド標識二次抗体の乾燥担持
金コロイド標識二次抗体として金コロイド標識抗ｈαＳ抗体を以下に示す電極上の位置に乾燥により担持させた。
実施例１（作用電極直上）：作用電極上の位置
比較例１（作用電極上流）：作用電極よりも上流の位置
比較例２（作用電極下流）：作用電極よりも下流の位置2. Drying and Supporting of Gold Colloid-Labeled Secondary Antibody on Electrode As a gold colloid-labeled secondary antibody, a gold colloid-labeled anti-hαS antibody was dried and supported on the electrode at the position shown below.
Example 1 (directly above the working electrode): Position on the working electrode Comparative Example 1 (upstream of the working electrode): Position upstream of the working electrode Comparative Example 2 (downstream of the working electrode): Position downstream of the working electrode
３．被検物質の測定
被検物質としてのｈＣＧをＰＢＳ（リン酸緩衝液）で希釈することにより、ｈＣＧ濃度が０ｎｇ／ｍＬ又は１００ｎｇ／ｍＬとなるように溶液を調製した。その溶液をサンプル孔を通じて印刷電極デバイスに４．５μＬ滴下した。溶液が電極部を通過した後、ＰＢＳを用いて電極部を洗浄した。3. Measurement of test substance A solution was prepared so that the hCG concentration was 0 ng/mL or 100 ng/mL by diluting the test substance hCG with PBS (phosphate buffer). 4.5 μL of the solution was dropped onto the printed electrode device through the sample hole. After the solution passed through the electrode part, the electrode part was washed with PBS.
洗浄後、０．１Ｍ塩酸水溶液の３０μＬを、作用電極、参照電極及び対極の全面が完全に覆われるように上述処理した印刷電極デバイスに導入し、銀塩化銀参照電極に対する作用電極の電位を＋１．２Ｖに保持した。保持時間は４０秒間とした。After washing, 30 μL of 0.1 M hydrochloric acid solution was introduced into the printed electrode device treated as above so that the entire surfaces of the working electrode, reference electrode, and counter electrode were completely covered, and the potential of the working electrode relative to the silver-silver chloride reference electrode was held at +1.2 V. The holding time was 40 seconds.
次に、微分パルスボルタンメトリーにより、作用電極の電位を０．８Ｖから－０．１Ｖへ変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。ボルタンメトリーの条件は電位増加０．００４Ｖ、パルス振幅０．０５Ｖ、パルス幅０．０５Ｓ、パルス期間０．２Ｓとした。結果を表１に示す。Next, the potential of the working electrode was changed from 0.8 V to -0.1 V by differential pulse voltammetry, and the change in current relative to the potential change was measured. The voltammetry conditions were: potential increase 0.004 V, pulse amplitude 0.05 V, pulse width 0.05 S, and pulse duration 0.2 S. The results are shown in Table 1.
図５は、実施例１並びに比較例１及び２の平均（ａｖｅ）ピーク値に関するグラフを示している。図５に示す通り、作用電極の直上に金コロイド標識体を乾燥担持させても還元ピーク電流を計測することができた。Figure 5 shows a graph of the average (ave) peak values for Example 1 and Comparative Examples 1 and 2. As shown in Figure 5, the reduction peak current could be measured even when the gold colloid label was dried and supported directly on the working electrode.
１ 電気化学式免疫センサー
１０ ケース
１１ 型プレート
１２ 容器部
２０ 電極
２１ 電極部
２１ａ 作用電極
２１ｂ 対極
２１ｃ 参照電極
２２ 接続部
２３ 導電部
２３ａ 作用電極用導電部
２３ｂ 対極用導電部
２３ｃ 参照電極用導電部
３０ 吸収体
４１、４１’ 標識部
５０ カバー
５１ サンプル孔
５２ 表面
１００ 流路
１１０ 上流流路
１１１ 上流区画
１１２ 電極区画
１１３ 下流区画
１１４ 導入区画
１１６ 移行区画
１２０ 下流流路
１３０ 第一下流流路
１４０ 第二下流流路
Ｕ 上流
Ｄ 下流1 Electrochemical immunosensor 10 Case 11 Mold plate 12 Container part 20 Electrode 21 Electrode part 21a Working electrode 21b Counter electrode 21c Reference electrode 22 Connection part 23 Conductive part 23a Working electrode conductive part 23b Counter electrode conductive part 23c Reference electrode conductive part 30 Absorber 41, 41' Label part 50 Cover 51 Sample hole 52 Surface 100 Flow path 110 Upstream flow path 111 Upstream section 112 Electrode section 113 Downstream section 114 Introduction section 116 Transfer section 120 Downstream flow path 130 First downstream flow path 140 Second downstream flow path U Upstream D Downstream
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