本発明は、インフルエンザウイルスの感染を阻害するインフルエンザウイルス感染阻害剤、インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを含有するリポソーム、インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを含有するインフルエンザの予防・治療剤に関する。 The present invention relates to an influenza virus infection inhibitor that inhibits influenza virus infection, a liposome containing an influenza virus infection inhibitory peptide, and an influenza preventive/therapeutic agent containing an influenza virus infection inhibitory peptide.
インフルエンザウイルス膜にはヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ、シアリダーゼ）といった２種類のスパイク糖蛋白質が存在し、それぞれウイルスの感染成立及びウイルスの宿主細胞からの出芽に重要な役割を果たしている。前者のヘマグルチニンは、ヒトやその他の動物（ほ乳類、鳥類、は虫類、魚類、両生類等）といった宿主の細胞膜上に普遍的に存在するシアル酸含有糖鎖を受容体として認識してそれに特異的に結合し、インフルエンザウイルスの細胞内へのエンドサイトーシスを導く。一方、後者のノイラミニダーゼは、受容体破壊酵素であり、宿主細胞からウイルス粒子が出芽又は遊離する際に、自らの又は宿主細胞膜上のシアル酸残基を切断する役割を担っている。 Two types of spike glycoproteins such as hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA, sialidase) are present in the influenza virus membrane, and each plays an important role in establishment of virus infection and budding of virus from host cells. The former hemagglutinin recognizes and specifically binds to sialic acid-containing sugar chains that are universally present on the cell membrane of the host of humans and other animals (mammals, birds, reptiles, fish, amphibians, etc.) as receptors. And induce intracellular endocytosis of influenza virus. On the other hand, the latter neuraminidase is a receptor-destroying enzyme, and plays a role of cleaving sialic acid residues of itself or on the host cell membrane when virus particles bud or release from the host cell.
インフルエンザウイルス感染の第１ステップに関与するヘマグルチニンには、極めて変異しやすい抗原決定領域（Ａ〜Ｅ）のアミノ酸配列の多様性に基づいて、種々の亜型が存在する。ヘマグルチニンの亜型間のアミノ酸配列の相同性は２５〜７５％であるため、抗原性を基にした普遍的なインフルエンザワクチンの開発は非常に困難である。一方、宿主細胞の受容体と結合するいわゆる受容体結合ポケット領域は、比較的変異が少なく、その三次元構造はよく保存されている（非特許文献１参照）。従って、インフルエンザウイルスの感染を防止するために、感染成立に寄与するヘマグルチニンに特異的に結合することによってその働きを阻害すれば、広くインフルエンザウイルスの感染防止に効果があることが期待され、そのような薬剤の開発が求められている。 Hemagglutinin, which is involved in the first step of influenza virus infection, has various subtypes based on the diversity of the amino acid sequences of the antigenic determinant regions (AE) that are highly variable. Since the amino acid sequence homology between hemagglutinin subtypes is 25 to 75%, it is very difficult to develop a universal influenza vaccine based on antigenicity. On the other hand, the so-called receptor-binding pocket region that binds to the receptor of the host cell has relatively few mutations and its three-dimensional structure is well conserved (see Non-Patent Document 1). Therefore, in order to prevent influenza virus infection, if it inhibits its action by specifically binding to hemagglutinin, which contributes to the establishment of infection, it is expected to be widely effective in preventing influenza virus infection. The development of new drugs is required.
例えば、ヘマグルチニンが宿主受容体のシアル酸含有糖鎖を認識して結合することに基づいて、ヘマグルチニンのその結合部位に特異的に結合する糖アナログをスクリーニングするという手法により、現在までに種々のヘマグルチニン結合性糖アナログが取得されている（非特許文献２〜５参照）。 For example, based on the fact that hemagglutinin recognizes and binds to a sialic acid-containing sugar chain of a host receptor, a method of screening a sugar analog that specifically binds to the binding site of hemagglutinin has led to various hemagglutinin to date. Bound sugar analogues have been obtained (see Non-Patent Documents 2 to 5).
そのほか、ヘマグルチニンの受容体糖鎖に対するモノクローナル抗体の抗原結合部位のもつ抗原性（イディオタイプ）に対する抗体（抗イディオタイプ抗体）を作成する手法もある。すなわち、これはヘマグルチニンの受容体となるシアル酸及びシアロ糖鎖の三次元構造に代えて、それと立体構造が類似する抗イディオタイプ抗体の超可変部のアミノ酸配列を作成し、宿主細胞のヘマグルチニン受容体に模擬させるというものである（非特許文献６参照）。 In addition, there is also a method of preparing an antibody (anti-idiotype antibody) against the antigenicity (idiotype) of the antigen-binding site of the monoclonal antibody to the hemagglutinin receptor sugar chain. That is, instead of the three-dimensional structure of sialic acid and sialo-glycan, which are receptors for hemagglutinin, the amino acid sequence of the hypervariable region of an anti-idiotype antibody having a similar three-dimensional structure to that of the hemagglutinin was created, and the hemagglutinin receptor of the host cell was prepared. It is to imitate the body (see Non-Patent Document 6).
また、ファージディスプレイ法を用いて、ヘマグルチニンに結合し、インフルエンザウイルスの感染を防止する１５残基のオリゴペプチドが同定され（特許文献１参照）、さらに短い４残基以上１４残基以下のオリゴペプチドも同定された（特許文献２参照）。 Also, a 15-residue oligopeptide that binds to hemagglutinin and prevents influenza virus infection was identified using the phage display method (see Patent Document 1), and a shorter oligopeptide of 4 residues or more and 14 residues or less was identified. Was also identified (see Patent Document 2).
本発明は、ヘマグルチニンの中でも、特にＨ５、Ｈ７、またはＨ９型ヘマグルチニンを有するインフルエンザウイルスに対し、強力な感染阻害活性を有するペプチドを有効成分として含有するインフルエンザウイルス感染阻害剤を提供することを目的としてなされた。 The present invention aims to provide an influenza virus infection inhibitor containing, as an active ingredient, a peptide having a strong infection inhibitory activity against influenza viruses having hemagglutinin, particularly H5, H7, or H9 type hemagglutinin. Made
本発明に係る一実施態様は、配列ＡＲＬＰＲからなるペプチドを有効成分として含有するインフルエンザウイルス感染阻害剤であって、感染阻害対象のインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの型がＨ５型、Ｈ７型、Ｈ９型またはである、インフルエンザウイルス感染阻害剤である。 One embodiment according to the present invention is an influenza virus infection inhibitor containing a peptide comprising the sequence ARLPR as an active ingredient, wherein the type of hemagglutinin of the influenza virus to be infected is H5 type, H7 type, H9 type or It is an influenza virus infection inhibitor.
本発明に係る他の実施態様は、上記ペプチドを有効成分として含有するインフルエンザ予防・治療剤である。 Another embodiment of the present invention is an influenza preventive/therapeutic agent containing the above peptide as an active ingredient.
本発明に係るさらなる実施態様は、上記ペプチドをコードするＤＮＡ、または当該ＤＮＡを有する発現ベクターである。 A further embodiment according to the present invention is a DNA encoding the above peptide, or an expression vector containing said DNA.
本発明に係るさらなる実施態様は、上記ペプチドを含有するリポソームである。当該ペプチドがアルキル化されていてもよい。 A further embodiment according to the invention is a liposome containing the above peptide. The peptide may be alkylated.
本発明に係るさらなる実施態様は、上記ペプチドを含有するインフルエンザウイルス感染阻害剤である。当該ペプチドが両親媒性を有するように修飾されて、ペプチド凝集体を形成していてもよく、当該修飾がアルキル化であってもよい。 A further embodiment according to the present invention is an influenza virus infection inhibitor containing the above peptide. The peptide may be modified to be amphipathic to form peptide aggregates, and the modification may be alkylation.
本発明に係るさらなる実施態様は、上記ペプチド凝集体である。 A further embodiment according to the present invention is the above peptide aggregate.
本発明に係るさらなる実施態様は、上記ペプチドを含有するインフルエンザウイルス感染阻害剤である。当該ペプチドがデンドリマーを構成しており、当該デンドリマーがカルボシランデンドリマーであってもよい。 A further embodiment according to the present invention is an influenza virus infection inhibitor containing the above peptide. The peptide constitutes a dendrimer, and the dendrimer may be a carbosilane dendrimer.
本発明によって、ヘマグルチニンの中でも、特にＨ５、Ｈ７、またはＨ９型ヘマグルチニンを有するインフルエンザウイルスに対し、強力な感染阻害活性を有するペプチドを有効成分として含有するインフルエンザウイルス感染阻害剤を提供することができるようになった。 According to the present invention, it is possible to provide an influenza virus infection inhibitor containing, as an active ingredient, a peptide having a strong infection inhibitory activity against an influenza virus having hemagglutinin, particularly H5, H7, or H9 type hemagglutinin. Became.
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。 Unless otherwise described in the embodiments and examples, J. Sambrook, EF Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. The method described in the protocol collection, or the method modified or modified is used. When a commercially available reagent kit or measuring device is used, the protocol attached thereto is used unless otherwise specified.
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。 The objects, features, advantages and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification. it can. The embodiments and specific examples of the invention described below show preferred embodiments of the present invention, and are shown for the purpose of illustration or explanation, and the present invention is not limited thereto. It is not limited. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications can be made based on the description of the present specification without departing from the spirit and scope of the present invention disclosed in the specification.
＝＝インフルエンザウイルス感染阻害剤の有効成分＝＝
本発明のインフルエンザウイルス感染阻害剤は、配列ＡＲＬＰＲ（配列番号１）からなるペプチド（以下、「インフルエンザウイルス感染阻害ペプチド」とも呼ぶ）を有効成分として含有するインフルエンザウイルス感染阻害剤であって、感染阻害対象のインフルエンザウイルスのヘマグルチニンの型がＨ５型、Ｈ７型、またはＨ９型であることを特徴とする。配列ＡＲＬＰＲからなるペプチドはヘマグルチニン結合性ペプチドであることが知られていたが、実施例で示したように、このペプチドは、Ｈ１型、Ｈ３型のヘマグルチニンを有するインフルエンザウイルスよりはるかに強力に、Ｈ５型、Ｈ７型、またはＨ９型のヘマグルチニンを有するインフルエンザウイルスに対して感染阻害する。== Active ingredient of influenza virus infection inhibitor ==
The influenza virus infection inhibitor of the present invention is an influenza virus infection inhibitor containing a peptide comprising the sequence ARLPR (SEQ ID NO: 1) (hereinafter, also referred to as “influenza virus infection inhibition peptide”) as an active ingredient, The type of hemagglutinin of the target influenza virus is H5 type, H7 type, or H9 type. It was known that the peptide consisting of the sequence ARLPR is a hemagglutinin-binding peptide, but as shown in the examples, this peptide is much more potent than H1 type and H3 type hemagglutinin-containing influenza viruses in H5 and H5. Inhibits influenza virus having hemagglutinin of H7, H7, or H9 type.
ここで、インフルエンザウイルス感染阻害剤によるインフルエンザウイルスの宿主細胞への感染阻害は、例えば、プラークアッセイ法によって測定することができる。 Here, the inhibition of influenza virus infection into a host cell by an influenza virus infection inhibitor can be measured, for example, by the plaque assay method.
なお、本発明が感染阻害対象とするインフルエンザウイルスは、Ｈ５型、Ｈ７型、およびＨ９型のヘマグルチニンのうち少なくとも一つを有していれば、その由来を特に制限するものではなく、Ａ型、Ｂ型もしくはＣ型、又はヒト分離型、ブタやウマ等の他の哺乳動物分離型もしくは鳥類分類型等のいずれであってもよく、また、ノイラミニダーゼの型も特に限定されない。 The influenza virus targeted for infection inhibition by the present invention is not particularly limited in its origin as long as it has at least one of H5 type, H7 type, and H9 type hemagglutinin, and A type, It may be any of B type or C type, human isolated type, other mammalian isolated type such as pig or horse, or avian classification type, and the type of neuraminidase is not particularly limited.
＝＝インフルエンザウイルス感染阻害剤の構成と利用＝＝
上述したように、本発明のインフルエンザウイルス感染阻害剤は、Ｈ５型、Ｈ７型、またはＨ９型のヘマグルチニンを有するインフルエンザウイルスが宿主に感染するのを強力に阻害することができる。従って、本発明のインフルエンザウイルス感染阻害剤は、インフルエンザに罹患したヒト又はヒト以外の脊椎動物に投与することにより、体内でのインフルエンザウイルスの増殖を抑制することができる。また、インフルエンザ罹患前のヒト又はヒト以外の脊椎動物に予め投与しておくことにより、インフルエンザウイルスが体内に侵入しても感染を防止することができる。== Composition and use of influenza virus infection inhibitors ==
As described above, the influenza virus infection inhibitor of the present invention can strongly inhibit infection of a host with an influenza virus having H5, H7, or H9 hemagglutinin. Therefore, the influenza virus infection inhibitor of the present invention can suppress the growth of influenza virus in the body when administered to humans or vertebrates other than humans affected by influenza. In addition, by pre-administering to humans or vertebrates other than humans before suffering from influenza, infection can be prevented even if the influenza virus enters the body.
こうした医療用以外にも、本発明のインフルエンザウイルス感染阻害剤は、ヘマグルチニンを介して生じるインフルエンザウイルスの感染、及びそれに伴う種々の細胞機能や生命現象を解明するためのツールとして用いることもできる。 In addition to such medical use, the influenza virus infection inhibitor of the present invention can also be used as a tool for elucidating influenza virus infection caused by hemagglutinin, and various cell functions and life phenomena associated therewith.
したがって、本発明のインフルエンザウイルス感染阻害剤は、インフルエンザウイルスがin vitroで宿主細胞に感染するのを阻害するためのインフルエンザウイルス感染阻害剤、インフルエンザに罹患した患者を治療するためのインフルエンザ治療剤、インフルエンザに罹患する前に予防的に投与するためのインフルエンザ予防剤等として利用できる。これらの薬剤は、有効成分として配列ＡＲＬＰＲからなるペプチドの他に、必要に応じて薬学的に許容される担体とを含有する製剤とすることができる。ここで用いられる薬学的に許容される担体は、調製される薬剤の形態に応じて、慣用されている担体の中から適宜選択することができる。例えば、薬剤が溶液形態として調製される場合、担体として、水又は生理学的緩衝液、グリコール、グリセロール、オリーブ油のような注射投与可能な有機エステルなどを使用することができる。さらに、この薬剤には、慣用的に用いられる安定剤、賦形剤などを含んでもよい。 Therefore, the influenza virus infection inhibitor of the present invention is an influenza virus infection inhibitor for inhibiting the infectiousness of influenza virus to infect host cells in vitro, an influenza therapeutic agent for treating a patient suffering from influenza, and influenza. It can be used as a prophylactic agent for influenza, etc. for prophylactic administration before being affected by the disease These drugs can be formulated into a preparation containing, as an active ingredient, a peptide comprising the sequence ARLPR and, if necessary, a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carrier used here can be appropriately selected from commonly used carriers according to the form of the drug to be prepared. For example, when the drug is prepared as a solution, water or physiological buffer, glycol, glycerol, injectable organic ester such as olive oil and the like can be used as a carrier. In addition, the drug may contain conventional stabilizers, excipients and the like.
ヒト又はヒト以外の脊椎動物への薬剤の投与方法には特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、疾病の重篤度等に応じて適宜決定すればよいが、製剤形態としては、特に注射剤、点滴剤、噴霧剤、点鼻剤、吸入剤などが好ましく、投与形態に適合した剤型を選択できる。投与経路としては、経口投与又は非経口投与があり、具体的には、経口投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、気管内投与、吸入投与、舌下投与等が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ヒトインフルエンザウイルスは、口腔や鼻腔から侵入し、主に上気道の粘膜上皮細胞で増殖することが知られているので、本剤は、ヒトインフルエンザウイルスが感染するヒト又はヒト以外の脊椎動物に対し、経口、気管内、鼻、口腔咽頭、吸入等の投与経路で使用されることが好ましい。具体的には、本剤をスプレー、（噴霧式）エアゾール又は吸入剤として製剤化すれば、本剤を経口、気管内、鼻、口腔咽頭、吸入等の投与経路を通じて投与することができ、インフルエンザウイルスの気道上皮細胞への感染を効率よく阻害することができる。 There are no particular restrictions on the method of administration of the drug to humans or vertebrates other than humans, various formulation forms, the age of the patient, sex, other conditions, may be appropriately determined depending on the severity of the disease, As the dosage form, injections, drops, sprays, nasal drops, inhalants and the like are particularly preferable, and a dosage form suitable for the dosage form can be selected. The administration route includes oral administration or parenteral administration, and specifically, oral administration, intravenous administration, intraarterial administration, intramuscular administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intratracheal administration, inhalation administration, tongue Examples include, but are not limited to, sub-administration. For example, since human influenza virus is known to invade from the oral cavity and nasal cavity and proliferate mainly in mucosal epithelial cells of the upper respiratory tract, this drug should be used in humans or non-human vertebrates infected with human influenza virus. On the other hand, it is preferably used by the administration route such as oral, intratracheal, nasal, oropharyngeal, and inhalation. Specifically, if this drug is formulated as a spray, (nebulized) aerosol or inhalant, this drug can be administered via the administration route such as oral, intratracheal, nasal, oropharyngeal and inhalation. The infection of the respiratory epithelial cells of the virus can be efficiently inhibited.
また、本剤の１日当たりの投与量は、投与する者の症状、年齢、体重、性別、治療期間、治療効果、投与方法などにより適宜変更しうるが、インフルエンザウイルス感染を阻害でき、かつ、生じる副作用が許容し得る範囲内であれば特に限定されない。 The daily dose of this drug can be appropriately changed depending on the symptoms, age, weight, sex, treatment period, therapeutic effect, administration method, etc. of the recipient, but it can inhibit and cause influenza virus infection. There is no particular limitation as long as the side effect is within an acceptable range.
本剤は、単独で使用してもよいし、あるいは他の薬剤（例えば、他の抗ウイルス剤、抗炎症剤や、症状を緩和する薬剤など）と併用してもよい。併用する場合、複合剤として使用してもよく、単剤を同時に使用してもよい。ここで、「同時に使用」とは、一方の薬理効果が残っている間に投与することを意味するのであって、時間的に一緒に投与することに限定されない。 This agent may be used alone or in combination with other agents (eg, other antiviral agents, anti-inflammatory agents, agents for alleviating symptoms, etc.). When used in combination, they may be used as a composite agent or a single agent may be used simultaneously. Here, “used simultaneously” means administration while one pharmacological effect remains, and is not limited to administration together temporally.
また、本剤は、インフルエンザワクチンが使用できない場合、例えば、インフルエンザワクチンの効果が現れるまでに罹患の可能性があるハイリスク患者や、免疫不全者等ワクチンの効果が十分に現れない患者や、ワクチン接種が禁忌である患者に対しても使用可能である。 In addition, if the influenza vaccine cannot be used, for example, high-risk patients who may be affected before the effect of the influenza vaccine appears, patients with immunodeficiency who do not fully exhibit the effect of the vaccine, or vaccines It can also be used for patients who are contraindicated for vaccination.
＝＝インフルエンザウイルス感染阻害剤の製造＝＝
本発明のインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、公知のペプチド合成方法、例えば、液相法及び固相法に従って製造できる。具体的には、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法や、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法などを利用してもよい。==Production of influenza virus infection inhibitors==
The influenza virus infection-inhibiting peptide of the present invention can be produced by a known peptide synthesis method, for example, a liquid phase method or a solid phase method. Specifically, based on the amino acid sequence information, stepwise erosion method in which each amino acid is sequentially bonded one by one to extend the chain, or a fragment consisting of several amino acids is synthesized in advance, and then each fragment is You may use the fragment-condensation method etc. which make a ring reaction.
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。具体的には、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）、ウッドワード法等を例示できる。これらの方法に利用できる溶媒も、ペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。 The condensation method used for the above peptide synthesis can also follow various known methods. Specifically, for example, azide method, mixed acid anhydride method, DCC method, active ester method, redox method, DPPA (diphenylphosphoryl azide) method, DCC+ additive (1-hydroxybenzotriazole, N-hydroxysuccinamide, N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, etc.), Woodward method and the like. The solvent that can be used in these methods can also be appropriately selected from general solvents that are well known to be used in peptide condensation reactions. Examples thereof include dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), hexaphosphoramide, dioxane, tetrahydrofuran (THF), ethyl acetate and the like, and mixed solvents thereof and the like.
このように作製されたペプチドは、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、向流分配法等、ペプチド化学の分野で汎用されている常法に従って、適宜その精製を行うことができる。 The peptide thus produced is commonly used in the field of peptide chemistry, for example, ion exchange resin, partition chromatography, gel chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), countercurrent partition method and the like. According to the method, the purification can be appropriately performed.
別法として、インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドをコードするＤＮＡを作製して発現ベクターに組み込み、培養細胞などの真核細胞又は大腸菌などの原核細胞に導入し、そこで発現させたペプチドを精製してもよい。発現ベクターは、導入する宿主細胞に従って、適宜選択できる。ペプチドをコードするＤＮＡの組み込みなどを含むベクターの構築、宿主細胞への導入、宿主細胞での発現、宿主細胞の抽出物の調製は、分子生物学的手法を用いて、常法に従って行うことができる。目的のペプチドは、その抽出物から、上記したペプチド化学の分野で汎用されている常法によって、精製することができる。 Alternatively, a DNA encoding an influenza virus infection-inhibiting peptide may be prepared, incorporated into an expression vector, introduced into a eukaryotic cell such as a cultured cell or a prokaryotic cell such as Escherichia coli, and the peptide expressed therein may be purified. .. The expression vector can be appropriately selected according to the host cell to be introduced. Construction of a vector containing integration of a DNA encoding a peptide, introduction into a host cell, expression in a host cell, and preparation of an extract from a host cell can be carried out by a conventional method using a molecular biology technique. it can. The target peptide can be purified from the extract by a conventional method generally used in the field of peptide chemistry described above.
＝＝インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドの化学修飾＝＝
本発明のインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、適宜化学修飾されていてもよい。例えば、アルキル化や脂質化（特にリン脂質化）等による化学修飾によって、インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドの細胞親和性や組織親和性を増大させたり、血中半減期を延長させ薬理効果を増強をさせたりすることができる。==Chemical modification of influenza virus infection-inhibiting peptide==
The influenza virus infection-inhibiting peptide of the present invention may be appropriately chemically modified. For example, by chemical modification such as alkylation or lipidation (particularly phospholipidation), the cell affinity or tissue affinity of the influenza virus infection-inhibiting peptide is increased, or the blood half-life is extended to enhance the pharmacological effect. You can
インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドのアルキル化は、常法に従って行うことができる。例えば、上記ペプチド合成と同様に、脂肪酸とヘマグルチニン結合性ペプチドのＮ末端アミノ基とのアミド結合形成反応により容易に行うことができる。脂肪酸としては、直鎖脂肪酸でも分枝鎖脂肪酸でもよく、また飽和脂肪酸でも不飽和脂肪酸でもよく、どんな脂肪酸でも広く使用できるが、特に、生体内に存在する脂肪酸を用いるのが好ましく、例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸等の飽和脂肪酸や、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸等の不飽和脂肪酸などの、炭素数が１２〜２０程度の脂肪酸が挙げられる。 Alkylation of the influenza virus infection-inhibiting peptide can be performed according to a conventional method. For example, similar to the above peptide synthesis, it can be easily performed by an amide bond forming reaction between a fatty acid and the N-terminal amino group of a hemagglutinin-binding peptide. The fatty acid may be a straight-chain fatty acid or a branched-chain fatty acid, and may be a saturated fatty acid or an unsaturated fatty acid, and any fatty acid can be widely used. In particular, it is preferable to use a fatty acid existing in the living body, for example, lauric acid. Fatty acids having 12 to 20 carbon atoms, such as saturated fatty acids such as myristic acid, palmitic acid, stearic acid, and arachidic acid, and unsaturated fatty acids such as oleic acid, elaidic acid, linoleic acid, linolenic acid, and arachidonic acid. Can be mentioned.
またアルキル化は、ペプチド合成と同様にして、アルキルアミンとヘマグルチニン結合性ペプチドのＣ末端カルボキシル基とのアミド結合形成反応によっても行うことができる。アルキルアミンとしては、上記脂肪酸と同様に各種のアルキルアミンを用いることができるが、特に生体内に存在する脂肪鎖（炭素数が１２〜２０程度）を用いるのが好ましい。 Alkylation can also be performed by an amide bond forming reaction between an alkylamine and a C-terminal carboxyl group of a hemagglutinin-binding peptide, similarly to peptide synthesis. As the alkylamine, various alkylamines can be used in the same manner as the above fatty acid, but it is particularly preferable to use a fatty chain (having about 12 to 20 carbon atoms) existing in the living body.
インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドの脂質化も常法に従って実施できる（例えば、New Current, 11(3), 15-20 (2000); Biochemica et Biophysica Acta., 1128, 44-49 (1992); FEBSLetters, 413, 177-180 (1997); J.Biol.Chem., 257, 286-288 (1982)等を参照）。例えば、各種リン脂質の２位水酸基或いは３位のリン酸基に対し、任意のスペーサーを介して、縮合法によってインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドに結合させることができる。必要によっては、インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドのＮ端或いはＣ端に任意の長さ（通常では２〜３個）のシステインを含むアミノ酸配列を付加して、縮合に利用される反応性ＳＨ基をあらかじめ導入することもできる。ここで用いられるリン脂質には、特に制限はなく、例えば、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール等が挙げられる。 Lipidation of influenza virus infection-inhibiting peptides can also be performed according to a conventional method (for example, New Current, 11(3), 15-20 (2000); Biochemica et Biophysica Acta., 1128, 44-49 (1992); FEBSLetters, 413). , 177-180 (1997); J. Biol. Chem., 257, 286-288 (1982), etc.). For example, the 2-position hydroxyl group or the 3-position phosphate group of various phospholipids can be bound to an influenza virus infection-inhibiting peptide by a condensation method via an arbitrary spacer. If necessary, an amino acid sequence containing a cysteine of arbitrary length (usually 2 to 3) is added to the N-terminal or C-terminal of the influenza virus infection-inhibiting peptide to preliminarily add a reactive SH group used for condensation. It can also be introduced. The phospholipid used here is not particularly limited, and examples thereof include phosphatidic acid, phosphatidylcholine (lecithin), phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, and phosphatidylglycerol.
＝＝インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを含有するリポソーム＝＝
アルキル化や脂質化されたインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、リポソーム製剤調製の際の脂質成分として利用することができる。このリポソーム製剤においては、リン脂質を膜構成成分とするリポソームに、インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドが保持され、リポソーム膜上に提示されることにより、インフルエンザウイルス感染阻害剤として有効に機能する。==Liposome containing influenza virus infection-inhibiting peptide==
The alkylated or lipidated influenza virus infection-inhibiting peptide can be used as a lipid component when preparing a liposome preparation. In this liposome preparation, the influenza virus infection-inhibiting peptide is retained in the liposome having a phospholipid as a membrane constituent and is presented on the liposome membrane, thereby effectively functioning as an influenza virus infection inhibitor.
リポソーム製剤として用いるリポソーム膜は、酸性リン脂質を単独で構成成分として用いるか又は中性リン脂質と酸性リン脂質とを併用して、常法に従い製造できる。従って、リン脂質中での酸性リン脂質の割合は、約０．１〜１００モル％程度、好ましくは約１〜９０モル％、より好ましくは約１０〜５０モル％程度とすることができる。以下、アルキル化や脂質化されたインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを用いたリポソームの製造方法を具体的に詳述する。 The liposome membrane used as a liposome preparation can be produced by a conventional method using an acidic phospholipid alone as a constituent or a combination of a neutral phospholipid and an acidic phospholipid. Therefore, the proportion of the acidic phospholipid in the phospholipid can be about 0.1 to 100 mol%, preferably about 1 to 90 mol%, more preferably about 10 to 50 mol%. Hereinafter, a method for producing a liposome using an alkylated or lipidated influenza virus infection-inhibiting peptide will be described in detail.
酸性リン脂質としては、例えば、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、卵黄ホスファチジルグリセロール（卵黄ＰＧ）、水添卵黄ホスファチジルグリセロール等の天然又は合成ホスファチジルグリセロール類（ＰＧ）及びジラウロイルホスファチジルイノシトール（ＤＬＰＩ）；ジミリストイルホスファチジルイノシトール（ＤＭＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジオレオイルホスファチジルイノシトール（ＤＯＰＩ）、大豆ホスファチジルイノシトール（大豆ＰＩ）、水添大豆ホスファチジルイノシトール等の天然又は合成ホスファチジルイノシトール類（ＰＩ）等を用いることができる。これらの酸性リン脂質は一種単独で又は二種以上混合して使用することができる。 Examples of acidic phospholipids include dilauroylphosphatidylglycerol (DLPG), dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG), dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG), distearoylphosphatidylglycerol (DSPG), dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), egg yolk. Natural or synthetic phosphatidylglycerols (PG) such as phosphatidylglycerol (egg yolk PG), hydrogenated egg yolk phosphatidylglycerol and dilauroylphosphatidylinositol (DLPI); dimyristoylphosphatidylinositol (DMPI), dipalmitoylphosphatidylinositol (DPPI), distearoyl Natural or synthetic phosphatidylinositols (PI) such as phosphatidylinositol (DSPI), dioleoylphosphatidylinositol (DOPI), soybean phosphatidylinositol (soybean PI), hydrogenated soybean phosphatidylinositol and the like can be used. These acidic phospholipids can be used alone or in combination of two or more.
中性リン脂質としては、例えば、大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、水添大豆ホスファチジルコリン、水添卵黄ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、パルミトイルステアリイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）等の天然又は合成ホスファチジルコリン類（ＰＣ）、大豆ホスファチジルエタノールアミン、卵黄ホスファチジルエタノールアミン、水添大豆ホスファチジルエタノールアミン、水添卵黄ホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ミリストイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＰＥ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等の天然又は合成ホスファチジルエタノールアミン類（ＰＥ）等を用いることができる。これらの中性リン脂質は、一種単独で又は二種以上混合して使用することができる。 Examples of the neutral phospholipid include soybean phosphatidylcholine, egg yolk phosphatidylcholine, hydrogenated soybean phosphatidylcholine, hydrogenated egg yolk phosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dilauroylphosphatidylcholine (DLPC), distearoylphosphatidylcholine. DSPC), myristoyl palmitoyl phosphatidyl choline (MPPC), palmitoyl steariyl phosphatidyl choline (PSPC), dioleoylphosphatidyl choline (DOPC) or other natural or synthetic phosphatidyl choline (PC), soy phosphatidyl ethanolamine, egg yolk phosphatidyl ethanolamine, hydrogenated soy phosphatidyl Ethanolamine, hydrogenated egg yolk phosphatidylethanolamine, dimyristoylphosphatidylethanolamine (DMPE), dipalmitoylphosphatidylethanolamine (DPPE), dilauroylphosphatidylethanolamine (DLPE), distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE), myristoylpalmitoylphosphatidylethanol Natural or synthetic phosphatidylethanolamines (PE) such as amine (MPPE), palmitoylstearoylphosphatidylethanolamine (PSPE) and dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) can be used. These neutral phospholipids can be used alone or in combination of two or more.
リポソームの調製に当たっては、さらにコレステロールなどを添加してもよい。このコレステロールの添加によってリン脂質の流動性を調整し、リポソームの調製をより簡便にすることができる。リン脂質に対するコレステロールの割合は特に限定されないが、リン脂質の重量の約０．５〜１倍量で添加されるのが好ましい。 Cholesterol or the like may be further added when preparing the liposome. By adding this cholesterol, the fluidity of the phospholipid can be adjusted, and the liposome can be prepared more easily. The ratio of cholesterol to phospholipid is not particularly limited, but it is preferably added in an amount of about 0.5 to 1 times the weight of phospholipid.
リポソームを調製する際、インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドと酸性リン脂質との分子数の割合は、ペプチド１に対して酸性リン脂質が０．５〜１００程度、好ましくは１〜６０程度、より好ましくは１．５〜２０程度とするのがよい。 When a liposome is prepared, the ratio of the number of molecules of the influenza virus infection-inhibiting peptide to the acidic phospholipid is about 0.5 to 100, preferably about 1 to 60, more preferably 1 for the peptide 1. It is good to be about 0.5 to 20.
このような脂質を有機溶媒（クロロホルム、エーテル等）に溶解した後、丸底フラスコに入れ、窒素気流下又は減圧下で有機溶媒を除去し、フラスコ底部に脂質の薄膜をつくる。この場合、さらに減圧下でデシケーター中に放置することによって有機溶媒を完全に除去することもできる。次いで、ヘマグルチニン結合性ペプチドの水溶液を脂質薄膜上に加えて脂質を水和させることによって乳濁色の多重層リポソーム（ＭＬＶ）の懸濁液が得られる。 After dissolving such a lipid in an organic solvent (chloroform, ether, etc.), it is placed in a round bottom flask, the organic solvent is removed under a nitrogen stream or under reduced pressure to form a lipid thin film at the bottom of the flask. In this case, the organic solvent can be completely removed by leaving it in a desiccator under reduced pressure. Then, an aqueous solution of hemagglutinin-binding peptide is added onto the lipid thin film to hydrate the lipid, whereby a suspension of emulsion-colored multilamellar liposomes (MLV) is obtained.
また、大きな一枚膜リポソーム（ＵＬＶ）は、ホスファチジルセリンの小さな一枚膜リポソームにＣａ2+を添加し、融合させてシリンダー状のシートとした後、キレート剤であるＥＤＴＡを添加しＣａ2+を除去する方法（Biochim. Biophys. Acta394, 483-491, 1975）やエーテルに溶解した脂質を約６０℃の水溶液中に注入し、エーテルを蒸発させる方法（Biochim. Biophys. Acta 443, 629-634, 1976）により作ることができる。For large unilamellar vesicles (ULV), Ca2+ is added to small unilamellar phosphatidylserine unilamellar vesicles and fused to form a cylindrical sheet, and then EDTA, which is a chelating agent, is added to Ca2+. (Biochim. Biophys. Acta 394, 483-491, 1975) or a method of pouring a lipid dissolved in ether into an aqueous solution at about 60° C. and evaporating the ether (Biochim. Biophys. Acta 443, 629-634). , 1976).
これらの調製法のほかに、フレンチプレス法により粒子径の小さなリポソームを調製することもできる（FEBS lett. 99, 210-214, 1979）。また大沢らによって報告されているリポソームへの保持効率の高い凍結乾燥法（Chem. Pharm. Bull. 32, 2442-2445, 1984）と凍結融解法（Chem. Pharm. Bull. 33, 2916-2923,1985）を利用することもできる。 In addition to these preparation methods, it is also possible to prepare liposomes having a small particle size by the French press method (FEBS lett. 99, 210-214, 1979). In addition, a freeze-drying method (Chem. Pharm. Bull. 32, 2442-2445, 1984) and a freeze-thaw method (Chem. Pharm. Bull. 33, 2916-2923, which have high retention efficiency to liposomes reported by Osawa et al. 1985) can also be used.
このように調製されたリポソーム膜に含まれるインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドの割合は、全脂質中、数モル％から数十モル％程度であればよく、５〜２０モル％程度であるのが好ましいが、通常は５モル％程度であってもよい。 The proportion of the influenza virus infection-inhibiting peptide contained in the liposome membrane thus prepared may be about several mol% to several tens mol% of the total lipid, and preferably about 5 to 20 mol%. Usually, it may be about 5 mol %.
さらに、こうして調製されたリポソームは、透析法（J. Pharm. Sci. 71, 806-812,1982）やポリカーボネート膜を用いたろ過法（Biochim. Biophys. Acta 557, 9-23, 1979；Biochim. Biophys. Acta 601, 559-571, 1980）により、粒子径を一定にすることができる。また調製されたリポソーム溶液から、透析法、ゲルろ過法、遠心分離法を利用して、リポソーム膜中に保持されなかったインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを除くことができる。更に透析膜等を用いてリポソームを濃縮することも可能である。 Further, the liposome thus prepared is subjected to a dialysis method (J. Pharm. Sci. 71, 806-812, 1982) or a filtration method using a polycarbonate membrane (Biochim. Biophys. Acta 557, 9-23, 1979; Biochim. Biophys. Acta 601, 559-571, 1980) makes it possible to keep the particle size constant. In addition, the dialysis method, gel filtration method, and centrifugation method can be used to remove the influenza virus infection-inhibiting peptide that is not retained in the liposome membrane from the prepared liposome solution. Furthermore, it is possible to concentrate the liposomes using a dialysis membrane or the like.
このようにして調製されるリポソーム分散液には、添加剤として、防腐剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、吸収促進剤等の各種の公知物質を適宜配合することができ、また必要に応じてこれらの添加物を含む液又は水で希釈することもできる。上記添加剤の具体例としては、防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、パラベン類（メチルパラベン、エチルパラベン等）、チメロサール等の真菌及び細菌に有効な防腐剤を、等張化剤としてはＤ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−キシリトール、グリセリン、ブドウ糖、マルトース、庶糖、プロピレングリコール等の多価アルコール類や塩化ナトリウム等の電解質類を、また安定化剤としてはトコフェロール、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、システイン等をそれぞれ用いることができる。 In the liposome dispersion thus prepared, various well-known substances such as preservatives, tonicity agents, buffers, stabilizers, solubilizers, absorption promoters, etc. may be appropriately added as additives. Alternatively, it may be diluted with a liquid containing these additives or water, if necessary. Specific examples of the additives include preservatives such as benzalkonium chloride, benzethonium chloride, chlorohexidine, parabens (methylparaben, ethylparaben, etc.), antiseptics effective against fungi and bacteria such as thimerosal, and an isotonicity agent. Examples thereof include D-mannitol, D-sorbitol, D-xylitol, glycerin, glucose, maltose, sucrose, propylene glycol and other polyhydric alcohols, and electrolytes such as sodium chloride, and stabilizers such as tocopherol and butylhydroxyanisole. , Butylhydroxytoluene, ethylenediaminetetraacetic acid salt (EDTA), cysteine and the like can be used respectively.
また、ヘマグルチニン結合性ペプチドからなる上記リポソームの内部には、抗ウイルス剤等の他の薬剤を封入させて、リポソーム製剤とすることも可能である。 It is also possible to encapsulate another drug such as an antiviral agent in the inside of the liposome composed of a hemagglutinin-binding peptide to prepare a liposome preparation.
＝＝ペプチド凝集体＝＝
インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、インフルエンザウイルス感染阻害剤としてそのまま用いてもよいが、ペプチド凝集体を形成させることによって、さらに効率よくインフルエンザウイルスの宿主細胞への感染を阻害することができる。ここで、本明細書において、ペプチド凝集体とは、ミセル（疎水基を内側に向け、親水基を外側に並べて球の形状を示すもの）と自己ペプチド集合体（溶液中にて自然に凝集する直径数百ｎｍ〜数μｍのペプチド凝集体）の両方を意味するものとする。== peptide aggregate ==
The influenza virus infection-inhibiting peptide may be used as it is as an influenza virus infection inhibitor, but by forming peptide aggregates, it is possible to more efficiently inhibit the infection of influenza virus into host cells. Here, in the present specification, the peptide aggregate refers to micelles (having a hydrophobic group facing inward and hydrophilic groups arranged outside to form a sphere shape) and a self-peptide aggregate (which spontaneously aggregates in a solution). Both peptide aggregates having a diameter of several hundred nm to several μm) are meant.
ペプチド凝集体の材料として、インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを修飾し、親水性と疎水性の性質を兼ね備える両親媒性の化合物を作製することにより、ペプチド凝集体を形成しやすくすることができる。例えば、インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドをアルキル化することにより、両親媒性の化合物を作製することができる。アルキル化は、前述の通りに行うことができる。 A peptide aggregate can be easily formed by modifying an influenza virus infection-inhibiting peptide as a material for the peptide aggregate to prepare an amphipathic compound having both hydrophilicity and hydrophobicity. For example, an amphipathic compound can be prepared by alkylating an influenza virus infection-inhibiting peptide. Alkylation can be performed as described above.
溶液中で、所定の濃度以上のインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを懸濁させると、ペプチドが液体中で臨界濃度に達し、ペプチド凝集体を形成する。このようなペプチド凝集体の形成は、ヘマグルチニンと宿主細胞に存在するインフルエンザウイルス受容体との結合を立体的に障害するためにも効果的であると考えられる。なお、ペプチド凝集体の直径は、光強度分布（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ＰＳＤ）などの公知の方法を用いて測定することができる。 When the influenza virus infection-inhibiting peptide at a predetermined concentration or higher is suspended in the solution, the peptide reaches a critical concentration in the liquid and forms a peptide aggregate. It is considered that the formation of such peptide aggregates is also effective for sterically hindering the binding between hemagglutinin and the influenza virus receptor present in the host cell. The diameter of the peptide aggregate can be measured using a known method such as light intensity distribution (intensity PSD).
＝＝デンドリマー＝＝
インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドは、インフルエンザウイルス感染阻害剤としてそのまま用いてもよいが、デンドリマーの構成を採ることによって、さらに効率よくインフルエンザウイルスの宿主細胞への感染を阻害することができる。ここで、本明細書において、デンドリマーとは、コア（core）と呼ばれる中心分子と、デンドロン（dendron）と呼ばれる側鎖部分から構成される樹状高分子のことを意味するものとする。このデンドロンの先端（termini）にインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを結合させて、インフルエンザウイルス感染阻害のためのデンドリマーを構成する。== Dendrimer ==
The influenza virus infection-inhibiting peptide may be used as it is as an influenza virus infection inhibitor, but by adopting a dendrimer constitution, it is possible to more efficiently inhibit the infection of influenza virus into a host cell. Here, in the present specification, the dendrimer means a dendritic polymer composed of a central molecule called a core and a side chain part called a dendron. An influenza virus infection-inhibiting peptide is bound to the tip (termini) of this dendron to form a dendrimer for inhibiting influenza virus infection.
デンドリマーの構成は特に限定されないが、カルボシランデンドリマーが好ましい。カルボシランデンドリマーの好ましい具体例として、次式（Ｉ）または（ＩＩ）で表わされるカルボシランデンドリマーが例示できるが、さらに好ましい例を図１に示す。 The structure of the dendrimer is not particularly limited, but a carbosilane dendrimer is preferable. As a preferable specific example of the carbosilane dendrimer, a carbosilane dendrimer represented by the following formula (I) or (II) can be exemplified, and a more preferable example is shown in FIG.
（式中、Ｒ1、Ｒ6およびＲ7は、独立に置換基を有していてもよい炭化水素基を示し、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、独立に置換基を有していてもよい炭化水素鎖を示し、Ａはインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドであり、ｍは０〜３のいずれかの整数であり、ｎは１〜４のいずれかの整数であり、ｍ＋ｎ＝４であって、さらに、ｋは０〜２のいずれかの整数、Ｉは０〜２のいずれかの整数である）
（式中、Ｒ1およびＲ6は、独立に置換基を有していてもよい炭化水素基を示し、Ｒ2、Ｒ4およびＲ5は、独立に置換基を有していてもよい炭化水素鎖を示し、Ａはインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドであり、ｍは０〜３のいずれかの整数であり、ｎは１〜４のいずれかの整数であり、ｍ＋ｎ＝４であって、さらに、Ｉは０〜２のいずれかの整数である）
製造方法などは公知であり、例えばWO2002／002588や、Hatano et al.（J.Med.Chem. vol.57 p.8332-8339 2014）に詳細に記載されており、これらの文献を引用することで本明細書に含めるものとする。 (In the formula, R1 , R6 and R7 independently represent a hydrocarbon group which may have a substituent, and R2 , R3 , R4 and R5 independently have a substituent. A hydrocarbon chain which may be present, A is an influenza virus infection-inhibiting peptide, m is an integer from 0 to 3, n is an integer from 1 to 4, and m+n=4 And k is an integer of 0 to 2 and I is an integer of 0 to 2)
(In the formula, R1 and R6 independently represent a hydrocarbon group which may have a substituent, and R2 , R4 and R5 independently represent a hydrocarbon group which may have a substituent. A hydrogen chain is shown, A is an influenza virus infection-inhibiting peptide, m is an integer from 0 to 3, n is an integer from 1 to 4, m+n=4, and I is any integer of 0 to 2)
The production method and the like are known, and are described in detail in WO2002/002588 and Hatano et al. (J.Med.Chem. vol.57 p.8332-8339 2014), and these documents are referred to. Are included in this specification.
＝＝他の形態を有する医薬組成物＝＝
本発明のインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを薬剤として動物に投与する代わりに、これらのペプチドを細胞で発現できる発現ベクターを投与してもよい。ベクターは、プラスミドでもウイルスベクターでもよいが、用いた細胞で挿入遺伝子を発現できるプロモーターを有する必要がある。投与形態としては、ＤＮＡをそのまま投与しても、このＤＮＡを有するベクターを含むウイルスを感染させても、このＤＮＡを有するベクターを含む細胞を移植してもよい。ウイルスは、アデノウイルス、レトロウイルスなど、特に限定されないが、体内で細胞に感染し、インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを発現し、分泌するような構成にするのが好ましい。また、細胞を移植する場合も、細胞がインフルエンザウイルス感染阻害ペプチドを発現し、分泌できるように構成されているのが好ましい。細胞内で発現したペプチドを分泌させるためには、例えば、インフルエンザウイルス感染阻害ペプチドのＮ端側にシグナルペプチドが融合した融合ペプチドを発現させるようにベクターを構築すればよいが、分泌させるための方法は必ずしもこれに限定されない。== Pharmaceutical composition having other forms ==
Instead of administering the influenza virus infection-inhibiting peptides of the present invention to animals as drugs, an expression vector capable of expressing these peptides in cells may be administered. The vector may be a plasmid or a viral vector, but it must have a promoter capable of expressing the inserted gene in the cells used. As a dosage form, DNA may be directly administered, a virus containing a vector having this DNA may be infected, or a cell containing a vector having this DNA may be transplanted. The virus is not particularly limited, such as adenovirus and retrovirus, but it is preferable that it is configured to infect cells in the body and express and secrete an influenza virus infection-inhibiting peptide. Also, when the cells are transplanted, it is preferable that the cells are configured to express and secrete the influenza virus infection-inhibiting peptide. In order to secrete the peptide expressed in the cell, for example, a vector may be constructed so as to express a fusion peptide in which a signal peptide is fused to the N-terminal side of the influenza virus infection-inhibiting peptide. Is not necessarily limited to this.
［実施例１］C18-D1ペプチドおよびC18-s2(1-5) ペプチドを用いた感染阻害活性評価
本実施例では、C18-D1ペプチドおよびC18-s2(1-5)ペプチドを用いて、Ｈ５型、Ｈ７型、またはＨ９型ヘマグルチニンを有するインフルエンザウイルス（ＩＦＶ）に対する感染阻害活性評価をプラークアッセイにより行った。[Example 1] Evaluation of infection inhibitory activity using C18-D1 peptide and C18-s2(1-5) peptide In this example, C18-D1 peptide and C18-s2(1-5) peptide were used for H5 Infection inhibitory activity against influenza virus (IFV) having hemagglutinin type H7 type or H9 type was evaluated by plaque assay.
まず、MDCK細胞を、周知の培養方法を用い、６ウエルプレートで単層培養した。アスピレーターで培地を除去し、ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄した。 First, MDCK cells were monolayer-cultured in a 6-well plate using a well-known culture method. The medium was removed with an aspirator, and the cells were washed with PBS(-).
一方、各ペプチド（表１参照）をＰＢＳ（−）にそれぞれ溶解させて１ｍＭとし、これをＰＢＳで系列希釈したサンプル（０．０２、０．２、２、２０、２００μＭ）と対照サンプル（ＰＢＳのみで、ペプチドを含有しない）の計６種類を各３５０μＬずつ調製した。 On the other hand, each peptide (see Table 1) was dissolved in PBS(-) to 1 mM and serially diluted with PBS (0.02, 0.2, 2, 20, 200 μM) and a control sample (PBS). A total of 6 types (each containing no peptide) were prepared at 350 μL each.
次に、あらかじめ調製した重層用培地（表３）をウエルあたり２ｍＬ／で加え、室温で静置し、寒天が固まったら反転して、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で４８時間静置した。Next, a preliminarily prepared layering medium (Table 3) was added at 2 mL/well, allowed to stand at room temperature, inverted when the agar solidified, and left at 37° C. for 48 hours in a 5% CO2 atmosphere. ..
図２にC18-D1ペプチドによる感染阻害活性測定の結果を示した。C18-D1ペプチドの濃度に対して感染率をプロットしたグラフをa-1〜c-1に示し、またそのグラフをlogit-log変換を用いて線形変換したグラフをa-2〜c-2に示した。 FIG. 2 shows the results of measuring the infection inhibitory activity by the C18-D1 peptide. Graphs plotting the infection rate against C18-D1 peptide concentration are shown in a-1 to c-1, and graphs obtained by linearly converting the graph using logit-log conversion are shown in a-2 to c-2. Indicated.
図３にC18-s2(1-5)ペプチドを用いた感染阻害活性測定の結果を示した。C18-s2(1-5)ペプチドの濃度に対して感染率をプロットしたグラフをd-1〜f-1に示し、またそのグラフをlogit-log変換を用いて線形変換したグラフをd-2〜cf2に示した。 FIG. 3 shows the results of infection inhibitory activity measurement using the C18-s2(1-5) peptide. A graph plotting the infection rate against the concentration of C18-s2(1-5) peptide is shown in d-1 to f-1, and a graph obtained by linearly converting the graph using logit-log conversion is d-2. ~ Shown in cf2.
図２、３より算出したＩＣ50値を以下の表４にまとめた。The IC50 values calculated from FIGS. 2 and 3 are summarized in Table 4 below.
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