JP6677284B2 - Analyte detection method and lateral flow test strip - Google Patents

Description

Translated fromJapanese

本発明は、分析対象物の検出方法及びラテラルフロー用テストストリップに関する。特に、細胞外顆粒を分析対象物として、試料中の細胞外顆粒の濃度を定量的且つ迅速的に測定する方法に好適な技術に関する。  The present invention relates to a method for detecting an analyte and a test strip for lateral flow. In particular, the present invention relates to a technique suitable for a method for quantitatively and quickly measuring the concentration of extracellular granules in a sample using the extracellular granules as an analysis target.

基礎医学の目覚しい進歩により優れた治療薬や先進医療技術が開発されているものの、食生活・生活環境等の様々な要因により、がんや自己免疫疾患、感染症、循環器系疾患等の多種多様な疾患による不安は極めて大きい。こうした不安の解消には疾患の早期発見が重要である。近年、正常細胞およびがん細胞から分泌される細胞外顆粒が病態を示すバイオマーカーとして注目されている。  Although excellent therapeutics and advanced medical technologies have been developed due to the remarkable progress in basic medicine, various factors such as cancer, autoimmune diseases, infectious diseases, circulatory diseases, etc., depend on various factors such as dietary habits and living environment. Anxiety due to various diseases is extremely large. Early detection of the disease is important for resolving such anxiety. In recent years, extracellular granules secreted from normal cells and cancer cells have attracted attention as biomarkers indicating a disease state.

分泌された細胞外顆粒は、一般的にマイクロベシクルやエクソソームという呼び方をされている。このエクソソームは血液、唾液、汗、尿、精液、リンパ液など生体内のあらゆる試料中に存在している。２００７年にこのエクソソーム中にｍｉｃｒｏＲＮＡが存在することが発見され、新たな細胞間輸送による情報伝達が示唆された（非特許文献１）。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡががんの病態を示していることも示唆されている（非特許文献２）。つまり、エクソソームに含まれるｍｉｃｒｏＲＮＡは疾患特異的な役割を持ち、エクソソームならびエクソソーム中のｍｉｃｒｏＲＮＡを検出することは診断に有用であると示唆され、正常細胞特異的エクソソーム、がん特異的エクソソームなど分泌細胞別エクソソームを迅速かつ簡便に定量測定することにより、早期診断が可能と考えられる。  The secreted extracellular granules are generally called microvesicles or exosomes. This exosome is present in all samples in the body such as blood, saliva, sweat, urine, semen, and lymph. In 2007, it was discovered that microRNA was present in this exosome, suggesting a new signal transmission by intercellular transport (Non-Patent Document 1). It has also been suggested that microRNA indicates a pathological condition of cancer (Non-Patent Document 2). In other words, microRNAs contained in exosomes have a disease-specific role, and it is suggested that detection of exosomes and microRNAs in exosomes is useful for diagnosis, and secretory cells such as normal cell-specific exosomes and cancer-specific exosomes It is thought that early diagnosis is possible by quickly and simply quantifying another exosome.

しかし、エクソソームは直径約４０〜１００ｎｍであるため、試料中から単離するには、超遠心分離法、限外濾過法、クロマトグラフィー法、イムノキャプチャー法など非常に煩雑な手法を用いる必要がある。これらの方法により、一般的にエクソソームを単離し回収したものを測定する場合、装置や煩雑な手法を要する。  However, since exosomes have a diameter of about 40 to 100 nm, it is necessary to use very complicated techniques such as ultracentrifugation, ultrafiltration, chromatography, and immunocapture to isolate them from a sample. . In general, when these exosomes are isolated and collected by these methods to measure the recovered exosomes, an apparatus and a complicated technique are required.

上記問題を解決する為、エクソソームを特異的かつ定量的に検出する方法として、エクソソーム表面抗原を認識する抗体を標識したビーズを２種用意し、検出する方法がある（特許文献１）。この手法はアクセプタービーズとドナービーズ２種準備し、それぞれに異なるエクソソーム表面抗原を認識する抗体を標識する。エクソソームが存在していれば、エクソソームを抗原抗体反応で２種のビーズが結合する。その後、ドナービーズを励起することにより一重項酸素がアクセプターに達し、蛍光を発する。この手法は試料とビーズを混合し、反応させ、装置で検出するのみなので操作は簡便かつ定量的に試料中のエクソソームを検出することが可能である。  As a method for specifically and quantitatively detecting exosomes to solve the above problem, there is a method of preparing two kinds of beads labeled with an antibody that recognizes an exosome surface antigen and detecting the beads (Patent Document 1). In this method, two types of acceptor beads and donor beads are prepared, and each of them is labeled with an antibody that recognizes a different exosome surface antigen. If exosomes are present, the exosomes are bound to the two beads by an antigen-antibody reaction. Thereafter, by exciting the donor beads, singlet oxygen reaches the acceptor and emits fluorescence. In this method, the sample and the beads are mixed, reacted, and detected by an apparatus. Therefore, the operation is simple and quantitative, and the exosome in the sample can be detected.

国際公開２０１３／０９４３０７号International Publication 2013/094307

Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ(２００７)９：６５４−６５９Nat Cell Biol (2007) 9: 654-659.Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ（２０１０）１０１：２０８７−２０９２Cancer Sci (2010) 101: 2087-2092.

しかしながら、特許文献１では試料とビーズを混合し反応させるだけで、エクソソームを簡便かつ定量的に測定が可能であるが、蛍光による励起と蛍光検出が必要な為、光学系の専用装置が必須である。その為、専用の装置を導入できない場合、測定が不可能である。
上記方法で試料中に含まれた分析対象物の濃度を測定する際、シグナルを十分に検出するまで待機を要する等、実働における時間制限を要し、迅速な検出においては大きな障害となることがある。このため、簡易であり、より迅速な方法で分析対象物の分析が可能な方法が求められている。However, in Patent Document 1, exosomes can be measured simply and quantitatively simply by mixing and reacting a sample and beads. However, since excitation by fluorescence and fluorescence detection are required, a dedicated device for an optical system is indispensable. is there. Therefore, when a dedicated device cannot be introduced, measurement is impossible.
When measuring the concentration of an analyte contained in a sample by the above method, it is necessary to wait for a sufficient signal to be detected, such as a time limit in actual operation, which can be a major obstacle to rapid detection. is there. For this reason, there is a need for a simple and quick method capable of analyzing an analyte.

そこで、本発明は、上記の問題点を鑑みてなされたものであり、従来技術と比較して、より迅速に生体試料に含まれる分析対象物の測定可能な検出方法及びその方法を用いたラテラルフロー用テストストリップを提供することを目的とする。  Therefore, the present invention has been made in view of the above problems, and compared with the conventional art, a detection method capable of more quickly measuring an analyte contained in a biological sample and a lateral method using the method. It is intended to provide a test strip for flow.

課題を解決するために、本発明の一態様である分析対象物の検出方法は、生体試料に含まれる分析対象物と第一物質との反応と、上記分析対象物と第二物質との反応により形成される複合体に由来するシグナルを測定し、上記分析対象物は、エクソソームであることを特徴とする。
また、本発明の一態様であるラテラルフロー用テストストリップは、生体試料に含まれる分析対象物と第一物質の反応によって複合物を形成する複合物形成部と、上記複合物と第二物質とを反応させることで検出可能なシグナルを発生可能なシグナル発生部とを備え、上記第一物質は第一支持体に固定され、上記第一支持体は上記複合物形成部に乾燥固化され、上記分析対象物がエクソソームであることを特徴とする。To solve the problem, the detection method of an analyte which is one embodiment of the present invention,the reactionofthe reaction ofthe analyte and the first substance contained in a biologicalsample, andthe analyte and a second substanceA signalderived from the complex formed by the method is measured, and theanalyte is an exosome .
Further, lateral flow test strip which is one embodiment of the present invention, a composite forming unit for forming a composite by reaction of the analyte and the first substance contained in a biological sample,said compound and the second material A signal generating portion capable of generating a detectable signal by reacting, the first substance is fixed to a first support, the first support is dried and solidified in the complex forming portion, the The analyte is an exosome .

本発明の一態様であれば、試料に含まれる分析対象物の反応開始後、所定時間における検出シグナルを測定する。
例えば、ラテラルフローアッセイを用いることによって、分泌細胞別エクソソームを簡便に検出でき、エクソソームを対象とした疾患診断が可能となる。According to one embodiment of the present invention, a detection signal is measured at a predetermined time after the start of the reaction of the analyte contained in the sample.
For example, by using a lateral flow assay, exosomes for each secretory cell can be easily detected, and a disease diagnosis targeting exosomes becomes possible.

本発明に基づく実施形態に係るラテラルフロー用テストストリップの基本構造を示す模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing a basic structure of a lateral flow test strip according to an embodiment of the present invention.

まず、本実施形態で使用される試料と、本実施形態で測定される分析対象物について、具体例を挙げつつ説明する。
（試料について）
本実施形態で使用される試料は、生体試料であって液状のものが好ましい。生体試料は、例えば、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液若しくは射精前液、汗、糞便、毛髪、涙、嚢胞液、胸水若しくは腹水、囲心腔液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜からの分泌物、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔液、臍帯血等である。また、未希釈の試料を測定試料としても、溶媒にて希釈したものを測定試料としても良い。First, the sample used in the present embodiment and the analyte to be measured in the present embodiment will be described with reference to specific examples.
(About sample)
The sample used in the present embodiment is a biological sample and is preferably a liquid sample. Biological samples include, for example, peripheral blood, serum, plasma, ascites, urine, cerebrospinal fluid, sputum, saliva, bone marrow, synovial fluid, aqueous humor, amniotic fluid, earwax, breast milk, bronchoalveolar lavage fluid, semen, prostate fluid, Cowper's fluid or pre-ejaculatory fluid, sweat, feces, hair, tears, cystic fluid, pleural or ascites fluid, pericardial fluid, lymph, chyme, chylous, bile, interstitial fluid, menstrual discharge, pus, sebum, vomit , Vaginal secretions, mucosal secretions, stool, pancreatic juice, nasal washings, broncho-pulmonary aspirates, blastocyst fluid, umbilical cord blood, and the like. An undiluted sample may be used as a measurement sample, or a sample diluted with a solvent may be used as a measurement sample.

（分析対象物について）
本実施形態における分析対象物は、例えば、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液、痰、唾液、骨髄、滑液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液若しくは射精前液、汗、糞便、毛髪、涙、嚢胞液、胸水若しくは腹水、囲心腔液、リンパ液、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、月経分泌物、膿、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜からの分泌物、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔液、臍帯血のいずれか１つに存在するエクソソームである。以下、これらの分析対象物の具体例について説明する。(About the analyte)
Analyte in the present embodiment, for example, peripheral blood, serum, plasma, ascites, urine, cerebrospinal fluid, sputum, saliva, bone marrow, synovial fluid, aqueous humor, amniotic fluid, earwax, breast milk, bronchoalveolar lavage fluid, Semen, prostate fluid, Cowper's fluid or pre-ejaculatory fluid, sweat, feces, hair, tears, cystic fluid, pleural effusion or ascites, pericardial fluid, lymph, chyme, chyle, bile, interstitial fluid, menstrual discharge, pus Exosomes present in any one of sebum, vomiting, vaginal secretions, secretions from mucous membranes, faeces, pancreatic juice, nasal washings, broncho-pulmonary aspirate, blastocyst fluid, and umbilical cord blood . Hereinafter, specific examples of these analytes will be described.

（エクソソームについて）
エクソソームは、直径４０〜１００ｎｍでリン脂質二重膜にて形成され、膜にはテトラスパニン類（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１など）、抗原提示タンパク質（ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ）、ＥＧＦＲ、ＩＣＡＭ−１、ＴＧＦ−βなど抗原となりうるタンパク質、膜内には核酸（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）やヒートショックタンパク質などが存在している。本発明では、膜に存在している分子に対し、特異的親和性がある物質を使用し検出や単離させる。例えば、膜表面のタンパク質であれば抗原として、タンパク質に特異的親和性のある物質の抗体で検出や単離することができる。(About exosomes)
Exosomes are formed in a phospholipid bilayer with a diameter of 40 to 100 nm, and have tetraspanins (CD9, CD63, CD81, etc.), antigen presenting proteins (MHCI, MHCII), EGFR, ICAM-1, TGF-β For example, nucleic acids (microRNA) and heat shock proteins are present in the membrane. In the present invention, a substance having a specific affinity for a molecule existing in a membrane is detected and isolated. For example, a protein on the surface of a membrane can be detected or isolated as an antigen using an antibody of a substance having specific affinity for the protein.

（ラテラルフロー用テストストリップ）
以下、本実施形態に係る分析対象物の濃度測定方法で用いられるラテラルフロー用テストストリップについて説明する。
図１は本実施形態におけるラテラルフロー用テストストリップの基本構造である。
本実施形態に係るラテラルフロー用テストストリップ１は、試料に含まれる分析対象物を検出して濃度を定量するものであって、試料滴下部材であるサンプルパッド１１、試料が流れる方向に分析対象物に特異的親和性のある第一の検出対象捕捉物質（第一物質）が標識された粒子が乾燥固化されている結合パッド１２、そして分析対象物に特異的親和性のある第二の検出対象捕捉物質（第二物質）が固相化された部位（テストライン１３ａ）と粒子表面の検出対象捕捉物質を認識する捕捉物質が固相化された部位（コントロールライン１３ｂ）を持つ展開膜（メンブレン１３）更にその下流に毛細管現象により浸潤してきた試料を吸収する吸収パッド１４の４種の部材がバッキングシート１０を介して直列に連結されたものである。(Test strip for lateral flow)
Hereinafter, a test strip for lateral flow used in the method for measuring the concentration of an analyte according to the present embodiment will be described.
FIG. 1 shows the basic structure of a test strip for lateral flow in the present embodiment.
The lateral flow test strip 1 according to the present embodiment detects an analyte contained in a sample and quantifies the concentration. Thesample pad 11, which is a sample dropping member, and the analyte flows in a direction in which the sample flows. Bindingpad 12 in which particles labeled with a first detection target capture substance (first substance) having specific affinity for are dried and solidified, and a second detection target having specific affinity for the analyte A developing membrane (membrane) having a part where the capture substance (second substance) is immobilized (test line 13a) and a part where the capture substance for recognizing the capture substance to be detected on the particle surface is immobilized (control line 13b). 13) Four types of members of anabsorption pad 14 for absorbing a sample infiltrated further downstream by a capillary phenomenon are connected in series via abacking sheet 10.

結合パッド１２が、生体試料に含まれる分析対象物と第一物質の反応によって複合物を形成する複合物形成部を構成する。メンブレン１３が、前記複合物と第二物質とを反応させることで検出可能なシグナルを発生可能なシグナル発生部を構成する。
なお、上述の分析対象物に特異的親和性のある第一物質が標識された粒子は、例えば、平均粒径２０〜１００ｎｍの金コロイド粒子である。また、分析対象物を検出するための第二物質は、例えば、メンブレン１３においては線状に固定化されている。また、ラテラルフロー用テストストリップ１の幅は、例えば、１．５ｍｍ〜５ｍｍであり、サンプルパッド１１に滴下する分析対象物を含む試料の体積は、例えば２５μｌ〜１００μｌである。Thebinding pad 12 constitutes a complex forming section that forms a complex by a reaction between the analyte contained in the biological sample and the first substance. Themembrane 13 constitutes a signal generating unit capable of generating a detectable signal by reacting the complex with the second substance.
The particles labeled with the first substance having a specific affinity for the analyte are, for example, gold colloid particles having an average particle diameter of 20 to 100 nm. In addition, the second substance for detecting the analyte is, for example, linearly immobilized on themembrane 13. The width of the test strip 1 for lateral flow is, for example, 1.5 mm to 5 mm, and the volume of the sample containing the analyte to be dropped on thesample pad 11 is, for example, 25 μl to 100 μl.

本実施形態に係るラテラルフロー用テストストリップ１は、テストライン１３ａにおいては分析対象物と第一物質との混合物と、第二物質との複合体が形成されることにより、検出強度が分析対象物の濃度依存的に上昇し、コントロールライン１３ｂにおいては第一物質標識粒子が毛細管現象にて流れてきたものを検出するものである。より詳しくは、サンプルパッド１１に試料を滴下した時点から、光学的手法を用いて、第二物質が固定化された部位のシグナルを経時的に検出するものである。  In the test strip 1 for lateral flow according to the present embodiment, the detection intensity is increased by forming a complex of the mixture of the analyte and the first substance and the second substance in thetest line 13a. Thecontrol line 13b detects the first substance labeling particles flowing by capillary action. More specifically, from the time when the sample is dropped onto thesample pad 11, the signal at the site where the second substance is immobilized is detected over time using an optical method.

以下、本実施形態に係るラテラルフロー用テストストリップ１を構成する部材の材料及び構成について、詳細に説明する。
（部材の材料について）
上述の第一物質と第二物質のそれぞれは、例えば、アミノ酸、核酸、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、リン脂質、糖質、多糖、低分子化合物、無機物質及びこれらの融合体のいずれか１つである。Hereinafter, materials and configurations of members constituting the lateral flow test strip 1 according to the present embodiment will be described in detail.
(About the material of the member)
Each of the first substance and the second substance is, for example, any one of an amino acid, a nucleic acid, a polypeptide, a polynucleotide, a lipid, a phospholipid, a saccharide, a polysaccharide, a low molecular compound, an inorganic substance, and a fusion thereof. One.

また、上述のアミノ酸とポリペプチドのそれぞれは、例えば、タンパク質、タンパク質断片、結合ドメイン、標的結合ドメイン、結合タンパク質、結合タンパク質断片、抗体、抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆｃ抗体断片、Ｆｖ抗体断片、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片、Ｆａｂ’抗体断片、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片、抗体結合ドメイン、抗原、抗原決定基、エピトープ、ハプテン、免疫原、免疫原断片、ビオチン、ビオチン誘導体、アビジン、ストレプトアビジン、基質、酵素、抗体酵素、補因子、受容体、受容体断片、受容体サブユニット、受容体サブユニット断片、ホルモン、レクチン、ポリヒスチジンのいずれか１つである。  In addition, each of the above-described amino acids and polypeptides is, for example, a protein, a protein fragment, a binding domain, a target binding domain, a binding protein, a binding protein fragment, an antibody, an antibody fragment, an antibody heavy chain, an antibody light chain, or a single-chain antibody. Single domain antibody, Fab antibody fragment, Fc antibody fragment, Fv antibody fragment, F (ab ') 2 antibody fragment, Fab' antibody fragment, single chain Fv (scFv) antibody fragment, antibody binding domain, antigen, antigen determination Group, epitope, hapten, immunogen, immunogen fragment, biotin, biotin derivative, avidin, streptavidin, substrate, enzyme, antibody enzyme, cofactor, receptor, receptor fragment, receptor subunit, receptor subunit fragment , A hormone, a lectin, or a polyhistidine.

また、上述の核酸は、例えば、ｍＲＮＡ、総ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、植物ＤＮＡのいずれか１つである。
また、上述の第一物質が標識された粒子（第一支持体）は、例えば、金コロイド、銀コロイド、鉄コロイド、アルミニウムコロイド、または白金コロイドを含む金属コロイド粒子、または高分子化合物を材料とする粒子である。より詳しくは、高分子化合物を材料とする粒子は、蛍光色素内包粒子または可視色素内包粒子である。The above-described nucleic acid is, for example, any one of mRNA, total RNA, genomic DNA, plasmid DNA, and plant DNA.
The particles labeled with the first substance (first support) are, for example, metal colloid particles including gold colloid, silver colloid, iron colloid, aluminum colloid, or platinum colloid, or a polymer compound. Particles. More specifically, the particles made of a polymer compound are fluorescent dye-containing particles or visible dye-containing particles.

また、蛍光色素内包粒子に内包される蛍光色素は、例えば、二価のマンガン、鉛、アンチモン、セリウム、三価のセリウム、三価のクロム、二価または三価の鉄、三価または四価のチタン、銅、銀、二価のサマリウム、二価または三価のユーロピウム、三価のテルビウム、三価のジスプロシウム、三価のホルミウム、三価のエルビウム、ウラニル化合物、ルテニウム化合物、錫化合物、タリウム化合物、ビスマス化合物、タングステン酸化合物、モリブデン酸化合物、硫黄、バナジウム化合物、ランタン化合物、プラセオジム化合物、ネオジム化合物、プロメチウム化合物、ガドリニウム化合物、ツリウム化合物、イッテルビウム化合物、ルテチウム化合物、有機蛍光色素化合物、有機可視色素化合物の群から選ばれる少なくとも１つの物質を含んだ色素である。  The fluorescent dye included in the fluorescent dye-containing particles may be, for example, divalent manganese, lead, antimony, cerium, trivalent cerium, trivalent chromium, divalent or trivalent iron, trivalent or tetravalent. Titanium, copper, silver, divalent samarium, divalent or trivalent europium, trivalent terbium, trivalent dysprosium, trivalent holmium, trivalent erbium, uranyl compound, ruthenium compound, tin compound, thallium Compound, bismuth compound, tungstate compound, molybdate compound, sulfur, vanadium compound, lanthanum compound, praseodymium compound, neodymium compound, promethium compound, gadolinium compound, thulium compound, ytterbium compound, lutetium compound, organic fluorescent dye compound, organic visible dye At least one substance selected from the group of compounds It is an inclusive dye.

有機蛍光色素化合物、有機可視色素化合物としては、ＤＹ６３０、ＤＹ６３１、ＤＹ６３３、ＤＹ６３５、ＤＹ６３６、ＤＹ６５０、ＤＹ６５１（以上、Ｄｙｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ社製）、Ｏｙｓｔｅｒ６４３、Ｏｙｓｔｅｒ６５６（以上、Ｄｅｎｏｖｏ Ｂｉｏｌａｂｅｌｓ社製）５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，４′，５′，７，７′−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，７，７′−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４′，５′−ジクロロ−２′，７′−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５（以上、インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７などが例示出来る。  Examples of the organic fluorescent dye compound and the organic visible dye compound include DY630, DY631, DY633, DY635, DY636, DY650, and DY651 (manufactured by Dyomics GmbH), Oyster643, and Oyster656 (manufactured by Denovo Biolabels Inle-Carboxy). , 6-carboxy-fluorescein, 5,6-dicarboxy-fluorescein, 6-carboxy-2 ', 4,4', 5 ', 7,7'-hexachlorofluorescein, 6-carboxy-2', 4,7, 7'-tetrachlorofluorescein, 6-carboxy-4 ', 5'-dichloro-2', 7'-dimethoxyfluorescein, naphthofluorescein, 5-carboxy-rhodamine, 6-carboxy-rhodamine, 5,6-dicarboxy C-rhodamine, rhodamine 6G, tetramethylrhodamine, X-rhodamine, and Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 500, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 514 555; Alexa Fluor 568; Alexa Fluor 594; Alexa Fluor 610; Alexa Fluor 633; PY FL, BODIPY TMR, BODIPY 493/503, BODIPY 530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650, BODIPY 650, 66 Methoxycoumarin, eosin, NBD, pyrene, Cy5, Cy5.5, Cy7 and the like.

また、上述の第二物質が固定化されたメンブレン１３（第二支持体）は、例えば、ポリメチルメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ＡＢＳ樹脂、ポリジメチルシロキサン、ニトロセルロース、シリコンの樹脂、それらの高分子化合物を含む共重合体あるいは複合体、石英ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、ソーダガラス、ホウ酸ガラス、ケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス、セラミックス及びその複合体のいずれか１つによって構成される。
なお、上述の第一物質は、化学結合または物理結合によって第一支持体に固定化されている。また、上述の第二物質は、化学結合または物理結合によって第二支持体に固定化されている。The membrane 13 (second support) on which the second substance is immobilized includes, for example, polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate, polypropylene, polyethylene, polymethylpentene, polystyrene, polytetrafluoroethylene, ABS resin, polydimethylsiloxane, nitrocellulose, silicone resin, copolymer or composite containing their high molecular compounds, quartz glass, Pyrex (registered trademark) glass, soda glass, borate glass, silicate glass, borosilicate It is composed of any one of an acid glass, a ceramic, and a composite thereof.
The above-mentioned first substance is fixed to the first support by a chemical bond or a physical bond. Further, the above-mentioned second substance is immobilized on the second support by a chemical bond or a physical bond.

（構造について）
ラテラルフロー用テストストリップ１の形状は、滴下する試料がテストストリップ中を毛細管現象により移動することができる限り、特に制限を受けない。例えば、サンプルパッド１１、結合パッド１２、メンブレン１３、吸水パッドの４部材が、基板となるバッキングシート上にこの順番で一方向に直列連結して固定化された構造が代表的である。各部材をバッキングシートに固定化した後、そのバッキングシートを裁断機で２ｍｍ〜５ｍｍ幅に裁断してテストストリップとするのが好ましい。(About structure)
The shape of the test strip 1 for lateral flow is not particularly limited as long as the sample to be dropped can move in the test strip by capillary action. For example, a typical example is a structure in which four members of asample pad 11, abonding pad 12, amembrane 13, and a water absorbing pad are serially connected in one direction in this order on a backing sheet serving as a substrate and fixed. After each member is fixed to the backing sheet, it is preferable that the backing sheet is cut into a width of 2 mm to 5 mm by a cutting machine to form a test strip.

以下、ラテラルフロー用テストストリップ１を構成する上記４部材の詳細について説明する。
（１）サンプルパッド
サンプルパッド１１は、滴下された、分析対象物を含む液体試料（生体試料）を一定時間保持する部材である。サンプルパッド１１としては、セルロースを素材としたものを使用するのが好ましく、より詳しくは、例えばＣｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ Ｐａｄ（Ｐａｌｌ社製）等が挙げられる。また、滴下された試料によりｐＨが異なることを鑑み、サンプルパッド１１に緩衝液を浸潤させて乾燥させた後に、そのサンプルパッド１１を使用するのが好ましい。Hereinafter, the details of the four members constituting the test strip 1 for lateral flow will be described.
(1) Sample Pad Thesample pad 11 is a member that holds a dropped liquid sample (biological sample) containing an analyte for a certain period of time. Thesample pad 11 is preferably made of cellulose, and more specifically, for example, Cellulose Absorbent Pad (manufactured by Pall) or the like. In consideration of the fact that the pH differs depending on the sample dropped, it is preferable to use thesample pad 11 after infiltrating thesample pad 11 with a buffer solution and drying the buffer.

（２）結合パッド
結合パッド１２は、分析対象物に対する標識粒子が乾燥固化された部材であり、サンプルパッド１１から毛細管現象により移動してきた試料に含まれる分析対象物が抗原抗体反応等の特異的認識反応で上記標識粒子と結合される部分である。結合パッド１２の材質は、ガラス繊維で不織状のものが好ましく、より詳しくは、例えばＧｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｐａｄ（Millipore社製）等が挙げられる。なお、上述の分析対象物と標識粒子に備わる抗体（第一物質）との反応は、物理的親和性、化学的親和性、化学結合、免疫学的方法のいずれか１つを利用して行われるものである。(2) Binding Pad Thebinding pad 12 is a member in which the labeled particles for the analyte are dried and solidified, and the analyte contained in the sample that has moved from thesample pad 11 due to the capillary action is a specific substance such as an antigen-antibody reaction. This is a portion that is bound to the above-mentioned labeled particles in a recognition reaction. The material of thebonding pad 12 is preferably non-woven glass fiber, and more specifically, for example, Glass Fiber Pad (manufactured by Millipore) or the like. The above-described reaction between the analyte and the antibody (first substance) provided on the labeled particles is performed using one of physical affinity, chemical affinity, chemical bonding, and immunological methods. It is something to be done.

結合パッド１２における単位面積（ｃｍ^２）当たりの上記標識粒子の含有量は、特に制限はないが、１μｇ以上４μｇ以下であることが好ましい。また、結合パッド１２への上記標識粒子の浸潤方法としては、例えば、標識粒子を懸濁させ分散させた液体を、結合パッド１２に塗布、滴下又は噴霧した後に、その結合パッド１２を乾燥させる方法が好ましい。
また、上記標識粒子は、上述の材料の中でも、金属コロイド粒子、蛍光色素粒子、着色ラテックス粒子、アップコンバージョン燐光体粒子、量子ドット粒子等が好ましい。また、上記標識粒子の粒子径は、２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましい。
また、上記標識粒子に備わる抗体としては、上述の抗体の中でも、マウスＩｇＧ、ヤギＩｇＧの他、例えば、ウサギＩｇＧ、ニワトリＩｇＹ、マウスＩｇＥ、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＥ等が好ましい。The content of the labeled particles per unit area (cm² ) in thebinding pad 12 is not particularly limited, but is preferably 1 μg or more and 4 μg or less. As a method of infiltrating the binding particles into thebonding pad 12, for example, a method in which a liquid in which the label particles are suspended and dispersed is applied to thebonding pad 12, dropped or sprayed, and then thebonding pad 12 is dried. Is preferred.
Further, as the labeling particles, among the above-mentioned materials, metal colloid particles, fluorescent dye particles, colored latex particles, up-conversion phosphor particles, quantum dot particles, and the like are preferable. Further, the particle size of the labeling particles is preferably 20 nm or more and 1000 nm or less.
In addition, among the above-mentioned antibodies, mouse IgG and goat IgG, as well as rabbit IgG, chicken IgY, mouse IgE, human IgG, human IgE, and the like are preferable as the antibodies provided in the labeled particles.

（３）メンブレン
メンブレン１３は、上記標識粒子と分析対象物との複合体、上記標識粒子及び試料が毛細管現象によって移動する部材であり、固定化抗体−分析対象物−標識粒子からなる免疫反応が行われる抗体固定化部（テストライン１３ａ）と、固定化抗体−標識粒子からなる免疫反応が行われる抗体固定化部（コントロールライン１３ｂ）とを有している。上述の分析対象物と固定化抗体（第二物質）との反応は、物理的親和性、化学的親和性、化学結合、免疫学的方法のいずれか１つを利用して行われるものである。(3) Membrane Themembrane 13 is a member in which the complex of the labeled particles and the analyte, the labeled particles and the sample are moved by capillary action, and the immune reaction composed of the immobilized antibody, the analyte, and the labeled particles is carried out. It has an antibody immobilization section (test line 13a) to be performed and an antibody immobilization section (control line 13b) for performing an immune reaction composed of immobilized antibody-labeled particles. The above-described reaction between the analyte and the immobilized antibody (second substance) is performed using any one of physical affinity, chemical affinity, chemical bonding, and immunological methods. .

メンブレン１３は、タンパク質を物理吸着可能な素材で構成されたもの、特にニトロセルロースで構成されたものが好ましく、より詳しくは、例えたＨｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０メンブレン（Millipore社製）等が挙げられる。
上記メンブレン１３における抗体固定化部（判定部）の形状としては、局所的に捕捉用抗体が固定化されている限り特に制限はなく、例えば、ライン状、円状、帯状等が挙げられる。その形状の中でも、幅０．５〜２．０ｍｍのライン状であることが好ましく、また、１ｃｍあたりの抗体量が０．１〜２μｇであることが好ましい。Themembrane 13 is preferably composed of a material capable of physically adsorbing proteins, particularly preferably composed of nitrocellulose. More specifically, examples include a Hi-Flow Plus 120 membrane (manufactured by Millipore).
The shape of the antibody immobilization section (determination section) in themembrane 13 is not particularly limited as long as the capture antibody is locally immobilized, and examples thereof include a line shape, a circle shape, and a band shape. Among these shapes, it is preferable that the shape is a line shape having a width of 0.5 to 2.0 mm, and the amount of antibody per cm is preferably 0.1 to 2 μg.

メンブレン１３に備わる抗体としては、上述の抗体の中でも、マウスＩｇＧ、ヤギＩｇＧの他、例えば、ウサギＩｇＧ、ニワトリＩｇＹ、マウスＩｇＥ、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＥ等が好ましい。例えば、標識粒子にマウスＩｇＧが表面修飾されている場合は、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体が固定化された抗体固定化部をコントロールライン１３ｂとして用いることができる。また、抗体をメンブレン１３に固定化した後、タンパク質の非特異的吸着を防ぐために、例えば、アルブミン、カゼイン、ポリビニルアルコール等のブロッキング剤の溶液でそのメンブレン１３を浸潤させた後に乾燥させるのが好ましい。  As the antibody provided in themembrane 13, among the above-mentioned antibodies, in addition to mouse IgG and goat IgG, for example, rabbit IgG, chicken IgY, mouse IgE, human IgG, human IgE and the like are preferable. For example, when mouse IgG is surface-modified on the labeled particles, an antibody-immobilized portion on which a goat anti-mouse IgG antibody is immobilized can be used as thecontrol line 13b. After the antibody is immobilized on themembrane 13, it is preferable to dry themembrane 13 after infiltrating themembrane 13 with a solution of a blocking agent such as albumin, casein, or polyvinyl alcohol in order to prevent nonspecific adsorption of proteins. .

テストライン１３ａにおいては、固定化抗体−分析対象物−標識粒子からなる免疫反応により、形成された複合体（分析対象物−標識粒子）が捕捉される。そして、このテストライン１３ａで、捕捉された標識粒子に由来する発色又は蛍光等（具体的には、蛍光、発光、呈色、着色等）の強度（シグナル）の程度により分析対象物の有無を判定、すなわち陽性・陰性を判定する。一方、コントロールライン１３ｂにおいては、固定化抗体−標識粒子からなる免疫反応により、試料の移動を確認できる。こうして、抗体固定化部に標識粒子が濃縮され、シグナルを目視的に又は検出機器を用いて検出、判定できる。  In thetest line 13a, the formed complex (analyte-labeled particles) is captured by an immune reaction consisting of the immobilized antibody-analyte-labeled particles. Then, in thetest line 13a, the presence or absence of the analyte is determined based on the intensity (signal) of color development or fluorescence or the like (specifically, fluorescence, light emission, coloration, coloring, or the like) derived from the captured labeled particles. Judgment, that is, judgment of positive / negative. On the other hand, in thecontrol line 13b, the movement of the sample can be confirmed by the immune reaction composed of the immobilized antibody and the labeled particles. Thus, the labeled particles are concentrated in the antibody-immobilized portion, and the signal can be detected and determined visually or using a detection device.

（４）吸水パッド
吸水パッドは、毛細管現象でメンブレン１３を移動してきた試料及び標識粒子を吸収し、常に一定の流れを生じさせるための部材である。吸水パッドの材質としては、セルロース素材の繊維状のものが好ましく、より詳しくは、例えばＣｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ（Millipore社製）等が挙げられる。(4) Water-absorbing pad The water-absorbing pad is a member for absorbing the sample and the labeled particles that have moved through themembrane 13 due to the capillary phenomenon, and constantly generating a constant flow. The material of the water-absorbing pad is preferably a fibrous material of a cellulose material, and more specifically, for example, Cellulose Fiber Sample Pad (Millipore) or the like.

（５）バッキングシート
バッキングシートは、上記のサンプルパッド１１、結合パッド１２、メンブレン１３、吸収パッド１４の４部材を固定化させるための粘着性を有したシートである。バッキングシートとしては、例えばバッキングシートＡＲ９０２０（Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）等が挙げられる。(5) Backing sheet The backing sheet is an adhesive sheet for fixing the four members of thesample pad 11, thebonding pad 12, themembrane 13, and theabsorption pad 14. Examples of the backing sheet include a backing sheet AR9020 (manufactured by Adhesives Research).

以下、上記テストライン１３ａで、捕捉された標識粒子に由来するシグナルの検出方法について説明する。
上記テストストリップにおいて、分析対象物と、対象物特異的物質が標識された粒子との反応で生じるシグナル（検出シグナル）は、光学的な方法で検出するのが好ましい。光学的な方法としては、例えば反射光度又は蛍光検出、発光検出、あるいは電気化学発光等が挙げられる。より詳しくは、赤色系／青色系を経時的に検出できる装置としては、イムノクロマトリーダＣ１００６６−１０（浜松ホトニクス社製）等が挙げられる。Hereinafter, a method for detecting a signal derived from the labeled particles captured on thetest line 13a will be described.
In the test strip, a signal (detection signal) generated by a reaction between the analyte and the particle labeled with the analyte-specific substance is preferably detected by an optical method. Optical methods include, for example, reflected light intensity or fluorescence detection, luminescence detection, or electrochemiluminescence. More specifically, examples of an apparatus capable of detecting a red / blue color over time include an immunochromatograph reader C10066-10 (manufactured by Hamamatsu Photonics).

次に、測定方法について説明する。上記の通り、分析対象物と対象物特異的物質は免疫学的反応を利用したテストストリップにて検出される。テストストリップにて分析対象物における既知濃度試料を滴下し測定を開始する。一定のシグナルを得るために３０分程度テストストリップを展開させるのが好ましい。
ここで、免疫学的方法は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）、細胞免疫染色法、組織免疫染色法、免疫沈降法、フローサイトメトリー法、蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）、イムノクロマトグラフィー法、水晶振動子マイクロバランス法（ＱＣＭ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、二面偏波式干渉法（ＤＰＩ）、エリプソメトリー法、ＥＬＩＳＰＯＴ法、ウェスタンブロッティング法を例示出来る。Next, a measuring method will be described. As described above, the analyte and the analyte-specific substance are detected on a test strip using an immunological reaction. A sample with a known concentration in the analyte is dropped on the test strip to start measurement. Preferably, the test strip is developed for about 30 minutes to obtain a constant signal.
Here, the immunological methods include enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), fluorescent immunoassay (FIA), cell immunostaining, tissue immunostaining, immunoprecipitation, and flow cytometry. Method, fluorescence-activated cell sorting (FACS), immunochromatography, quartz crystal microbalance (QCM), surface plasmon resonance (SPR), dual-polarization interferometry (DPI), ellipsometry, ELISPOT And Western blotting.

本実施形態に係る分析対象物のエクソソームの測定方法はテストストリップを用い、エクソソームと第一物質の反応によって形成された複合物と第二物質とを反応させることで発生する検出可能なシグナルを測定し、予め設定したシグナルの基準値と比較することでエクソソームの濃度を判断するものである。
上述の実施形態では、分析対象物と第一物質との反応は、結合パッド１２で開始される場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。また、上述の実施形態では、複合物と第二物質との反応は、メンブレン１３で開始される場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。The method for measuring the exosome of the analyte according to the present embodiment uses a test strip, and measures a detectable signal generated by reacting the complex formed by the reaction of the exosome with the first substance and the second substance. Then, the exosome concentration is determined by comparing with a preset reference value of the signal.
In the above embodiment, the case where the reaction between the analyte and the first substance is started at thebonding pad 12 has been described, but the present invention is not limited to this. In the above embodiment, the case where the reaction between the composite and the second substance is started by themembrane 13 has been described, but the present invention is not limited to this.

以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
（１）抗体調製
分析対象物をエクソソーム表面抗原（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１）とし、エクソソームを検出する為、メンブレン１３固相化抗体は抗ＣＤ９マウスモノクローナル抗体：Ｃｌｏｎｅ Ｍ−Ｌ１３、抗ＣＤ６３マウスモノクローナル抗体：Ｃｌｏｎｅ Ｈ５Ｃ６、抗ＣＤ８１マウスモノクローナル抗体：Ｃｌｏｎｅ ＪＳ８１（以上、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、）を使用した。また、コントロールライン１３ｂは抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｄａｋｏ社）を使用した。この２種の抗体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で透析カートリッジＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ １０，０００ＭＷＣＯ(商品名、Ｐｉｅｒｃｅ社)にて４℃で透析した。透析後の抗体濃度を測定し、抗エクソソーム表面抗原抗体は１ｍｇ／ｍｌ、抗マウスイムノグロブリンは０．５ｍｇ／ｍｌに調製した。Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples. The present invention is not limited to these examples.
(1) Antibody preparation In order to detect exosomes using an exosome surface antigen (CD9, CD63, CD81) as an analyte, an antibody immobilized on themembrane 13 is an anti-CD9 mouse monoclonal antibody: Clone M-L13, an anti-CD63 mouse monoclonal antibody. : Clone H5C6, anti-CD81 mouse monoclonal antibody: Clone JS81 (above, BD Pharmingen) was used. Thecontrol line 13b used anti-mouse immunoglobulin G (Dako). The two antibodies were dialyzed against 50 mM phosphate buffer (pH 7.2) at 4 ° C. with a dialysis cartridge Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO (trade name, Pierce). The antibody concentration after dialysis was measured, and the anti-exosome surface antigen antibody was adjusted to 1 mg / ml, and the anti-mouse immunoglobulin was adjusted to 0.5 mg / ml.

（２）金コロイド溶液の調製
上記３種の抗エクソソーム表面抗原抗体を透析し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて６０μｇ／ｍｌに調製し、１ＯＤになるよう調製した金コロイド（粒子径４０ｎｍ，田中貴金属工業社）溶液９ｍｌとリン酸二水素カリウム溶液（ｐＨ８．０）１ｍｌの混合液に本抗体溶液を加えピペッティング後、室温で１５分静置し、１％ＰＥＧ２０，０００溶液、１０％ＢＳＡ溶液を加え混合した。この混合溶液を８０００×ｇ で１５分遠心分離後上清を廃棄し、結合パッド塗布液を加え攪拌・超音波処理し、再び遠心分離後上清を廃棄した。この操作を計２回繰り返し金コロイド溶液とした。(2) Preparation of Colloidal Gold Solution The above three anti-exosome surface antigen antibodies were dialyzed, adjusted to 60 μg / ml with a phosphate buffer (pH 7.4), and adjusted to 1 OD (particle size). (40 nm, Tanaka Kikinzoku Kogyo Co., Ltd.) solution and a mixture of 9 ml of potassium dihydrogen phosphate solution (pH 8.0), add this antibody solution, pipette, allow to stand at room temperature for 15 minutes, A 10% BSA solution was added and mixed. The mixed solution was centrifuged at 8000 × g for 15 minutes, and the supernatant was discarded. The coating solution for the binding pad was added thereto, followed by stirring and ultrasonic treatment. After centrifugation, the supernatant was discarded. This operation was repeated twice in total to obtain a colloidal gold solution.

（３）サンプルパッドの作製
セルロースを素材としたサンプルパッド（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ Ｐａｄ ＃１１１， Ｐａｌｌ社）を１．８ｍｍ×１５０ｍｍに裁断し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を１ｍｌ滴下して、５０℃にて１時間乾燥させた。(3) Preparation of Sample Pad A sample pad made of cellulose (Cellulose Absorbent Pad # 111, Pall) was cut into 1.8 mm × 150 mm, and 1 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) was added dropwise to the sample pad. Dried for 1 hour at ° C.

（４）結合パッドの作製
１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに塗布液と金コロイド溶液を加え、２８ｋＨｚで超音波処理後、計９００μｌの金コロイド塗布溶液を１０ｍｍ×１５０ｍｍのガラスファイバーパッド（glass fwiber Pad, millipore社）に滴下し、真空減圧ポンプにて減圧下１８時間乾燥した。(4) Preparation of bonding pad A coating solution and a gold colloid solution were added to a 1.5 ml Eppendorf tube, and after sonication at 28 kHz, a total of 900 μl of the gold colloid coating solution was added to a glass fiber pad (glass fwiber pad, 10 mm × 150 mm). (Millipore) and dried for 18 hours under reduced pressure with a vacuum reduced pressure pump.

（５）メンブレンの作製
メンブレンであるＨｉＦｌｏｗ Ｐｌｕｓ ＨＦ１２０（Milipore社）に抗体塗布機ＸＹＺ３０６０(商品名、BioDot社)にて上記固相化抗体（１）を１μｌ／ｃｍで塗布した。塗布後、０．５％乳性カゼイン溶液でブロッキングし、スクロースや界面活性剤を含む洗浄液にて洗浄・安定化し、一晩室温で乾燥させた。(5) Preparation of Membrane The immobilized antibody (1) was applied at 1 μl / cm to HiFlow Plus HF120 (Milipore), which is a membrane, using an antibody coating machine XYZ3060 (trade name, BioDot). After the application, it was blocked with a 0.5% milk casein solution, washed and stabilized with a washing solution containing sucrose and a surfactant, and dried overnight at room temperature.

（６）テストストリップの作製
乾燥させたメンブレン、吸収パッド(CFSP203000,Milipore社)、結合パッド、サンプルパッドをバッキングシート(AdhesiveResearch社)に貼り付け、カッティング機器ＣＭ４０００（商品名、BioDot社）にて５ｍｍ幅で裁断後、ハウジングケースに収め、テストストリップキットとした。(6) Preparation of test strip A dried membrane, an absorption pad (CFSP203000, manufactured by Millipore), a bonding pad, and a sample pad were attached to a backing sheet (AdhesiveResearch), and 5 mm was cut with a cutting machine CM4000 (trade name, BioDot). After being cut by the width, it was housed in a housing case to obtain a test strip kit.

（７）抗原溶液の調製
検出標的であるエクソソームを含む試料は血清を使用した。この抗原溶液を１×ＰＢＳ，５％ＢＳＡ溶液にて、５０％に希釈し測定用抗原溶液とした。血清は全部で８個体分準備した。(7) Preparation of antigen solution Serum was used as a sample containing exosomes as detection targets. This antigen solution was diluted to 50% with 1 × PBS, 5% BSA solution to obtain an antigen solution for measurement. Serum was prepared for a total of 8 individuals.

（８）テストストリップでの対象物の測定
上記（６）で作製したテストストリップを水平に置き、上記（７）の抗原溶液を1枚のテストストリップあたり１００μl滴下した。滴下開始後、イムノクロマトリーダＣ１００６６（商品名、浜松ホトニクス社）内の測定位置に設置し、反応開始後２０分でデータを取得した。測定データは、テストストリップの展開方向にスキャニングし、テストライン、コントロールラインにおけるピーク中心（Ｈｅｉｇｈｔ：ピークトップ）における強度を測定データとした。(8) Measurement of object on test strip The test strip prepared in (6) was placed horizontally, and the antigen solution of (7) was dropped at 100 μl per test strip. After the start of the dropping, the sample was placed at a measurement position in an immunochromatographer C10066 (trade name, Hamamatsu Photonics), and data was acquired 20 minutes after the start of the reaction. The measurement data was scanned in the developing direction of the test strip, and the intensity at the peak center (Height: peak top) in the test line and control line was used as the measurement data.

（９）試料中の対象物量の把握
上記（８）の結果から、反応開始後２０分での強度を測定し、テストラインでの強度とテストライン以外の強度比（Ｓ／Ｎ比）を確認した。各検体のＳ／Ｎ比の結果を測定した。Ｓ／Ｎ比を比較したところ５以上となり、このＳ／Ｎ比を達成すればエクソソームの存在を示すことが確認された。(9) Grasping the amount of the target substance in the sample From the result of (8) above, measure the intensity at 20 minutes after the start of the reaction, and confirm the intensity ratio at the test line and the intensity other than the test line (S / N ratio). did. The result of the S / N ratio of each sample was measured. When the S / N ratio was compared, it was 5 or more, and it was confirmed that the achievement of this S / N ratio indicates the presence of exosomes.

１ ラテラルフロー用テストストリップ
１０ バッキングシート
１１ サンプルパッド
１２ 結合パッド
１３ メンブレン
１３ａ テストライン
１３ｂ コントロールライン
１４ 吸収パッドReference Signs List 1 Test strip forlateral flow 10Backing sheet 11Sample pad 12Bonding pad 13Membrane13a Test line13b Control line 14 Absorption pad

Claims (13)

Translated fromJapanese

生体試料に含まれる分析対象物と第一物質との反応と、上記分析対象物と第二物質との反応により形成される複合体に由来するシグナルを測定することで上記分析対象物の有無を判定し、
上記分析対象物は、エクソソームである分析対象物の検出方法であって、
上記第二物質が第二支持体上の第二物質固定化部に固定されており、
上記第一物質と反応した上記分析対象物は、上記第二支持体上を上記第二物質固定化部よりも上流から下流に向かって移動し、上記第二物質固定化部において上記第二物質と反応し、
上記シグナルが、上記第二物質固定化部から生じ、
上記分析対象物と反応しなかった上記第一物質が、上記第二物質固定化部において上記複合体を形成せず、上記第二物質固定化部よりも下流に移動していくことを特徴とする分析対象物の検出方法。The reaction between the analyte and the first substance contained in the biological sample and the presence or absence of the analyte by measuring a signal derived from a complex formed by the reaction between the analyte and the second substance Judge,
The analyte is amethod for detecting ananalyte that is an exosome,
The second substance is fixed to a second substance fixing portion on the second support,
The analyte that has reacted with the first substance moves on the second support from upstream to downstream from the second substance immobilization section, and the second substance in the second substance immobilization section. Reacts with
The signal is generated from the second substance immobilization unit,
The first substance that has not reacted with the analyte does not form the complex in the second substance immobilization section, and moves downstream from the second substance immobilization section. Of the analyte to be analyzed. 上記シグナルを予め測定したシグナル基準値と比較することで上記分析対象物の濃度を判断することを特徴とする請求項１に記載の分析対象物の検出方法。  The method for detecting an analyte according to claim 1, wherein the concentration of the analyte is determined by comparing the signal with a signal reference value measured in advance. 上記分析対象物と第一物質の反応が、免疫学的方法により行われることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の分析対象物の検出方法。  The method for detecting an analyte according to claim 1 or 2, wherein the reaction between the analyte and the first substance is performed by an immunological method. 上記第一物質が第一支持体に固定されており、上記シグナルが上記第一支持体に由来することを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の分析対象物の検出方法。The analyte of claim 1, wherein the first substance is fixed to a first support,and the signal is derived from the first support . Detection method. 上記第一支持体が、金コロイド、銀コロイド、鉄コロイド、アルミニウムコロイド、もしくは白金コロイドを含む金属コロイド粒子、もしくは高分子化合物からなる群のいずれか１つ、もしくは２つ以上を材料とする粒子であることを特徴とする請求項４に記載の分析対象物の検出方法。  The first support is a metal colloid particle containing a gold colloid, a silver colloid, an iron colloid, an aluminum colloid, or a platinum colloid, or a particle made of any one or more of a group consisting of a polymer compound. The method for detecting an analyte according to claim 4, wherein: 上記第一支持体が、高分子化合物を材料とする粒子であり、蛍光色素内包粒子又は可視色素内包粒子であることを特徴とする請求項４に記載の分析対象物の検出方法。  The method for detecting an analyte according to claim 4, wherein the first support is a particle made of a polymer compound, and is a fluorescent dye-containing particle or a visible dye-containing particle. 上記第一支持体が、高分子化合物を材料とする粒子であり、二価のマンガン、鉛、アンチモン、セリウム、三価のセリウム、三価のクロム、二価または三価の鉄、三価または四価のチタン、銅、銀、二価のサマリウム、二価または三価のユーロピウム、三価のテルビウム、三価のジスプロシウム、三価のホルミウム、三価のエルビウム、ウラニル化合物、ルテニウム化合物、錫化合物、タリウム化合物、ビスマス化合物、タングステン酸化合物、モリブデン酸化合物、硫黄、バナジウム化合物、ランタン化合物、プラセオジム化合物、ネオジム化合物、プロメチウム化合物、ガドリニウム化合物、ツリウム化合物、イッテルビウム化合物、ルテチウム化合物、有機蛍光色素化合物、有機可視色素化合物、ならびに金属コロイド粒子の群から選ばれる少なくとも１つの物質を内包することを特徴とする請求項４に記載の分析対象物の検出方法。  The first support is a particle made of a polymer compound, divalent manganese, lead, antimony, cerium, trivalent cerium, trivalent chromium, divalent or trivalent iron, trivalent or Tetravalent titanium, copper, silver, divalent samarium, divalent or trivalent europium, trivalent terbium, trivalent dysprosium, trivalent holmium, trivalent erbium, uranyl compound, ruthenium compound, tin compound , Thallium compounds, bismuth compounds, tungstate compounds, molybdate compounds, sulfur, vanadium compounds, lanthanum compounds, praseodymium compounds, neodymium compounds, promethium compounds, gadolinium compounds, thulium compounds, ytterbium compounds, lutetium compounds, organic fluorescent dye compounds, organic Select from the group of visible dye compounds and metal colloid particles Method of detecting an analyte according to claim 4, wherein the enclosing at least one substance. 上記第一支持体の大きさが、２０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項４〜請求項７のいずれか１項に記載の分析対象物の検出方法。The method for detecting an analyte according to any one of claims 4 to7 , wherein the size of the first support is 20 nm or more and 1000 nm or less.上記第一支持体が、上記第二支持体と連続して固定され上記第二物質固定化部よりも上流にある結合領域に乾燥固化されており、The first support has been dried and solidified in a bonding region that is fixed continuously with the second support and that is upstream of the second substance fixing portion,
上記分析対象物と上記第一物質とが上記結合領域において反応することを特徴とする請求項４〜請求項８のいずれか１項に記載の分析対象物の検出方法。The method for detecting an analyte according to any one of claims 4 to 8, wherein the analyte and the first substance react in the binding region.上記分析対象物を上記結合領域よりも上流から移動させることを特徴とする請求項９に記載の分析対象物の検出方法。The method for detecting an analyte according to claim 9, wherein the analyte is moved from an upstream side of the binding region.上記分析対象物が上記第二物質固定化部に濃縮されることを特徴とする請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の分析対象物の検出方法。The method for detecting an analyte according to any one of claims 1 to 10, wherein the analyte is concentrated in the second substance immobilizing section. 生体試料に含まれる分析対象物と第一物質の反応によって複合物を形成する複合物形成部と、上記複合物と第二物質とを反応させることで検出可能なシグナルを発生可能なシグナル発生部とを備え、
上記第一物質は第一支持体に固定され、
上記第一支持体は上記複合物形成部に乾燥固化され、
上記分析対象物がエクソソームであることを特徴とするラテラルフロー用テストストリップ。A complex forming unit that forms a complex by a reaction between the analyte contained in the biological sample and the first substance, and a signal generating unit that can generate a detectable signal by reacting the complex with the second substance With
The first substance is fixed to a first support,
The first support is dried and solidified in the composite forming section,
A test strip for lateral flow, wherein the analyte is an exosome. 生体試料に含まれる分析対象物と第一支持体に固定化された第一物質との反応と、上記分析対象物と第二支持体上の第二物質固定化部に固定化された第二物質との反応により形成される複合体に由来するシグナルを測定することで上記分析対象物の有無を判定し、
上記分析対象物がエクソソームであり、
上記シグナルを検出する方法が、上記第二物質が固定化された上記第二物質固定化部において上記シグナルを光学的な方法で検出する方法であり、
上記第一物質と反応した上記分析対象物は、上記第二支持体上を上記第二物質固定化部よりも上流から下流に向かって移動し、上記第二物質固定化部において上記第二物質と反応し、
上記分析対象物と反応しなかった上記第一物質が、上記第二物質固定化部において上記複合体を形成せず、上記第二物質固定化部よりも下流に移動していき、
上記第二物質固定化部における上記シグナルと、上記第二支持体上の上記第二物質固定化部以外のシグナルとの比（Ｓ／Ｎ比）が５以上であることを特徴とする分析対象物の検出方法。The reaction between the analyte contained in the biological sample and the firstsubstance immobilized on the first support, and the second substance immobilized on the second substance immobilized portion on the analyte and the second support Determine the presence or absence of the analyte by measuring the signal derived from the complex formed by the reaction with the substance,
The analyte is an exosome,
Method for detecting the signal, a method of the second material to detect the signal in an optical method in the second material immobilized portionabove immobilized,
The analyte that has reacted with the first substance moves on the second support from upstream to downstream from the second substance immobilization section, and the second substance in the second substance immobilization section. Reacts with
The first substance that did not react with the analyte does not form the complex in the second substance immobilization section, and moves downstream from the second substance immobilization section,
An analysis object, wherein a ratio (S / N ratio) of the signal in the second substance immobilization section to the signal on the second support other than the second substance immobilization section is 5 or more. Object detection method.

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