JP4225576B2 - Method and apparatus for making changes detectable at the time of verification into a predetermined distribution state - Google Patents

Description

Translated fromJapanese

発明者：ジョエル・Ｍ・ブラット（Joel M.Blatt）、ミッチェル・Ｐ・アレン（Michael P.Allen）、及びポール・Ｊ・パッテル（Paul J.Patel）
関連する出願
本発明の主題は、ミッチェル・Ｐ・アレンが1993年8月24日付けで出願し、現在は放棄されている「新規な使い捨て型電子式検定装置（Novel Disposable Electronic Assay Device）」という名称の米国特許出願第08／111,347号、ミッチェル・Ｐ・アレンが1995年5月31日付けで出願した、「新規な使い捨て型の電子式検定装置（Novel Disposable Electronic Assay Device）」という名称の米国特許出願第08／455,236号、ジョエル・Ｍ・ブラット及びミッチェル・Ｐ・アレンが1995年8月9日付けで出願した「乾燥試薬の粒子検定法及び多数の試験領域を有する検定装置並びにその方法（Dry Reagent Particle Assay And Device Having Multiple Test Zones And Method Therefor）」という名称の米国特許出願第08／512,844号、及びレイモンド・Ｔ・ヘバート（Raymond T.Hebert）及びその他の者が1996年4月30日付けで出願した米国特許出願第号に開示されたような、全ての化学試薬を含む、完全に自己内蔵型である、使い捨て型、一回限り使用のデジタル電子式器具に関する。上述した出願は、本発明の譲受人と同一人が譲受人となっており、その内容の全体を引用して本明細書に含めてある。
発明の分野
本発明は、医療情報を表示する診断装置において、検体が露出された分析化学ストリップの表面における物理的変化を検出するため、ある領域に亙る捕獲効率を変化させる方法及び装置に関するものである。
発明の背景
過去、細かい方法及び高価な計測器を使用して実験施設内にて種々の化合物を定性的に且つ定量的に測定するための免疫学的検定法が開発されている。免疫学的診断法における最近の開発の結果、臨床的検体を迅速に分析するためのより簡単な方法を追求する傾向となっている。固体相の結合試薬の開発は、自由試薬から結合した試薬を分離させるときに析出させることを不要にしている。固体相の免疫化学における更なる進歩の結果、計測器を使用しない乾燥試薬のストリップの免疫学的検定法が得られている。この形態は、計測器を使用せずに、患者の検体中の分析物質を視覚的に定性的又は半定量的に測定することを可能にするものである。
計測器を使用しない（ｎｏｎ−ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅｄ）、免疫学的検定法には２つの基本的な型式の形態がある。第一の型式すなわち視覚的カラー領域型式のものにおいて、ストリップ上の特定の領域にて信号が発生され、この信号は、分析物質の存在を表示し、また、その信号の強さは、検体中の分析物質の濃度を表示する。この型式の検定法は、定性試験におけるように、閾値以上の色が存在するか否か視覚的に色を解釈し、又は、半定量性試験におけるように、色の強さをカラーチャートと比較することを必要とする。第二の型式のものにおいて、この視覚的信号は、吸収性の検定ストリップの長さに沿って発生される。吸い上げられる間に、この分析物質は、信号を発生する試験と反応し、支持体に沿って可視信号を発生させる。ストリップの基端から信号が進む距離は、分析物質の濃度の直接的な測定値となる。計測器を使用しない、この型式の移動高さ検定法は、妥当な性能にて定量的結果を達成することができる。
こうした一回限り使用の温度計型であり且つ計測器を使用しない定量装置、及び定性測定のために計測器を使用しない色比較装置は、十分な性能を発揮しているものの、信頼性及び使い勝手に伴う幾つかの難点がある。これらの装置にて発生された色は、常に、均一で且つ鮮明であるとは限らない。移動型検定法の場合、境界部の色は薄く、不鮮明で且つ読み取りが困難であることがしばしばである。ユーザが色帯域の境界の位置に関して判断しなければならないため、このことは、直接、ユーザの誤りにつながる。計測器を使用しない妊娠試験の場合、着色箇所の強さ（特に、カットオフ感度に近いＨＣＧ濃度）を視覚的に解釈することが困難である場合があり、その結果の解釈が問題となる場合がある。未熟練の操作者が視覚的，に判断し又は解釈しなければならないとき、誤りが生じ、また、不回的である場合もある。
検定法の結果の正確さ及び信頼性を高めるため、分析化学ストリップにおける検出部分のような試験要素から反射した光線を測定するため反射率計を利用する幾つかの定性的及び定量的診断試験が開発されている。反射率計は、レンズ、フィルタ、開口、光線源、及び検出器を光学的に配置することを特徴とする構造とされている。その例は、米国特許第4,219,529号、同第4,224,032号、同第3,536,927号に記載されている。
検体採取領域すなわち検出領域内にて検定ストリップの表面から拡散して反射した光線の正確で且つ精密な測定値を得ることに関して問題が生ずることがしばしばである。その原因の１つは、測定される、物理的に検出可能な変化が試験領域の全体に亙って均一に生じないためである。側方向流動検定ストリップは、固定された捕獲試薬を内蔵する検出領域を通じて信号試薬を通す。この信号試薬は、最初に、検出領域の前縁境界にて拘束試薬の全量ではないにしても、その相当な部分と出会い且つその部分と直ちに、結合し始める。その結果、前縁境界の狭小領域内にて著しく高強度の信号となり、その強さは、検出領域の後縁境界に向けて急激に低下する。全体として、信号の強さは、検出領域に亙って不均一な勾配の分布状態となる。
不正確な測定の別の可能な原因は、分析物質が高濃度である結果、信号の強さが低下し、すなわち「フック効果」が生じるためである。分析物質の濃度が捕獲試薬の濃度よりも著しく高いとき、信号の強さは、実際上、低下し、許容可能な検定法の結果であると誤って表示する可能性がある。
捕獲試薬又はその他の信号発生試薬を使用して、検出領域に亙って物理的に検出可能な変化が略均一に分布するようにする必要がある。また、検定ストリップの検出領域内にて物理的に検出可能な変化が所定の分布状態となるようにする必要もある。これらの必要性は、従来技術によっては満たされてはいない。
このように、検体が露出された分析化学ストリップの表面における物理的な変化を検出すべくある領域に亙って捕獲効率を変化させる方法及びその装置が診断分野にて必要とされている。均一な又は所定の分布状態は、診断装置にて使用するのに十分に経済的、適宜で、効率的、耐久性且つ信頼性がある必要があり、また、この診断装置は、家庭、医療の緊急現場、又は病院以外の場所のような場所にて未熟練者が応急処置を施すことを可能にするものでなければならない。
発明の概要
本発明は、ある検体中における選択された分析物質の量と相関する物理的に検出可能な変化を検出領域に亙って所定の分布状態に生じさせる輸送マトリックスを提供するものである。このマトリックスは、検定中の選択された分析物質の量と相関する物理的に検出可能な変化を生じさせる捕獲試薬を有する検出領域を含む。この検出領域は、検体に最初に出会う前縁境界と、検出領域に亙って搬送された後、検体に出会う後縁境界とを有している。この捕獲試薬は、検出領域の前縁境界から後縁境界まで所定の分布状態にてマトリックス上に固定される。
また、本発明は、検体中に選択された分析物質が存在するか否かを判断するため輸送マトリックスをも提供するものである。このマトリックスは、検体中の選択された分析物質の量と相関する物理的に検出可能な変化を生じさせる捕獲試薬を有する検出領域を含む。この物理的に検出可能な変化は、検出領域に亙って略均一な分布状態にて固定される。
本発明の１つの実施の形態は、検体中の選択された分析物質の量と相関する物理的に検出可能な変化を信号発生共役体により、検出領域に亙って所定の分布状態にて生じさせる輸送マトリックスを提供する。このマトリックスは、検体中の選択された分析物質の量と相関する物理的に検出可能な変化を生じさせる捕獲試薬を有する検出領域を含む。この検出領域は、検体に最初に出会う前縁境界と、検出領域を亙って搬送された後、検体に出会う後縁境界とを有している。この捕獲試薬は、検出領域の前縁境界から後縁境界まで略均一な所定の分布状態にて固定される。領域は、その内部にて拡散状に固定された遮断試薬を有する検出領域の前縁の前に配置される。この遮断試薬は、検出領域に亙って拡散し且つ捕獲試薬が略均一な分布状態とするように捕獲効率を修正して、検出領域に亙って略均一な捕獲効率となるようにする。
本発明の別の実施の形態は、検出領域内にて分配された拡散制御材料を含む、上述の輸送マトリックスを提供する。この分拡散御材料は、検体が検出領域を亙って搬送される速度を遅くし、また、前縁から後縁までの捕獲試薬の捕獲効率を高めるものである。
本発明の一つの好適な実施の形態は、検体中の選択された分析物質の量と相関する物理的に検出可能な変化を複数の検出領域に亙って所定の分布パターンにて生じさせる輸送マトリックスを提供する。このマトリックスは、第一及び第二の検出領域を有する。検出領域の各々は、検体中の選択された分析物質の量と相関する物理的に検出可能な変化を生じさせる、非拡散状に固定された捕獲試薬を有している。検出領域の各々は、検体に最初に出会う前縁境界と、検出領域の各々に亙って搬送された後、検体に出会う後縁境界とを有している。この捕獲試薬は、検出領域の各々の前縁境界から後縁境界まで所定の分布状態にて固定される。
本発明のもう１つの好適な実施の形態は、検体中に選択された分析物質が存在するか否かを判断する診断装置である。該装置は、外面を有し且つ内部領域を密封するハウジングを備えている。受容部は、選択された分析物質が存在するか否かを判断すべくその分析物質を含む検体を受け入れ得る形態とされている。該受容部は、ハウジングの外面に設けられている。少なくとも１つの輸送マトリックスが検体を捕獲試薬と反応させ、検体中の選択された分析物質の量に相関する物理的に検出可能な変化を検出領域内にて発生させる。この検出領域は、検体に最初に出会う前縁境界と、検出領域を亙って搬送された後、検体に出会う後縁境界とを有している。捕獲試薬は、検出領域の前縁境界から後縁境界まで所定の分布状態にて固定されている。
また、本発明は、選択された分析物質の量に相関する物理的に検出可能な変化を輸送マトリックス上における検出領域に亙って所定のパターンにて分布させるステップを含む、検体中の選択された分析物質の濃度を測定する方法をも提供する。
有利な点、実施の形態及び変形例は、添付図面及び添付した請求の範囲と共に本明細書から当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
この開示内容の一部分を構成する図面において、
図１は、本発明の照射光学素子及び検出光学素子を示すべく一部分切欠いた診断装置の部分平面図である。
図２は、図１の線２−２に沿って示した診断装置の部分断面図である。
図３は、本発明を使用する、計測器無しの診断装置の平面図である。
図４は、本発明を利用する２つの検出領域を有する輸送マトリックスの独立的な図である。
図５は、本発明にて捕獲試薬の均一な分布状態をドットを利用して示す検出領域の独立的な図である。
図６は、本発明において捕獲試薬のストライプの増大する頻度を利用する検出領域の独立的な図である。
図７は、本発明において捕獲試薬のストライプの不均一な分布状態を利用する検出領域の独立的な図である。
図８は、本発明において重なり合う捕獲試薬のストライプを利用する検出領域の独立的な図である。
図９は、本発明を利用する２つの検出領域を有する輸送マトリックスの独立的な図である。
図１０は、本発明の吸収材料及び捕獲試薬がその上に配置された輸送マトリックスの断面側面図である。
図１１は、本発明を使用する輸送マトリックス及び反射率計の積み重ね形態の側面図である。
図１２は、本発明の輸送マトリックスを包み込む毛管の断面図である。
好適な実施の形態の説明
本発明は、計測器使用型又は計測器不使用型の何れかの検定装置にて利用することができる。計測器使用型装置の例には、引用して本明細書に含めた上述した関連する出願に詳細に記載された使い捨て型の一回限り使用及び多数回使用のデジタル電子式計測器及び検定装置が含まれる。本発明は、検定法の１つ以上の検出領域内にて選択された分析物質の量に対応する、物理的に検出可能な変化を視覚的な観察又は計測器によってより正確に測定することを可能にするものである。
本発明の分析化学ストリップ又は輸送マトリックスを有する計測器使用型の診断装置１０の一例が図１及び図２に示されている。該装置１０は、入口ポート１４のような受容部を有するハウジング１２を備えている。この入口ポート１４は、測定すべき１以上の分析物質を保持する検体２０を受け取るため、ハウジングの表面１６からその内部１８まで伸長している。該入口ポート１４は、検体２０中に１つ以上の選択された分析物質が存在するか否かを判断するための化学試薬を保持する第一の輸送マトリックス２２及び第二の輸送マトリックス２４に検体２０を導入することを可能にする。
検体２０が入口ポート１４を通じて第一の輸送マトリックス２２及び第二の輸送マトリックス２４の双方に導入されたならば、該検体２０は、輸送マトリックス２２、２４の各々の表面にある少なくとも１つの試薬と化学的に反応し、該試薬に対応する反応生成物の混合体を形成する。反応生成物の混合体の一部分は、輸送マトリックス２２、２４の各々における少なくとも１つの検出領域に輸送され、検体２０内の対応する選択された分析物質の量に相関する物理的に検出可能な変化を生じさせる。
図１に具体的に示すように、第一の輸送マトリックス２２及び第二の輸送マトリックス２４の各々は、それぞれ、２つの検出領域２６、２８及び３０、３２を有している。検出器３４は、第一の輸送マトリックス上の検出領域２６、２８から反射した光線を測定し得る位置に配置されている。検出器３６は、第二の輸送マトリックス上の検出領域３０、３２から反射した光線を測定し得る位置に配置されている。品質制御領域４２は、検出領域の各々にて測定された、物理的に検出可能な変化を示さない。検出領域及び品質制御領域の各々は、反射した光線を試料採取し且つ１つの検出器によって測定する、輸送マトリックス上の試料採取領域の異なる型式のものの例である。
発光ダイオード（ＬＥＤ）４４は、複数の全内部反射要素（ＴＩＲ）４６により検出領域２６、２８、３０、３２の各々に及び品質制御領域４２に向けられる放射線源を提供する。全内部反射要素４６はミラーとして機能し、該要素を製造する透明な材料の屈折率の結果として、反射性被覆が不要である。
ＬＥＤ４４からの照射光は、４方向に分割される。照射光の一部分は、反射要素４８から基準検出器４０に向けられる。照射光の別の部分は、一連の反射要素５０、５２から検出領域２６、２８に向けられる。また、照射光は、一連の反射要素５４、５６から検出領域３０、３２にも向けられる。該反射要素４６は、品質制御検出器３８に対して第二の検定ストリップ２４上の別の試料採取領域を照射する。
図２には、ハウジングの内部１８内に配置された光学素子組立体５８及びプリント回路板（ＰＣＢ）６０を有する装置の別の図が特に示してある。入口ポート１４は、光学素子組立体５８上に支持された第一の検定ストリップ２２及び第二の検定ストリップ２４に達している。検出器３４、３６、３８、４０の各々及びＬＥＤ４４は、ＰＣＢ６０に直接、取り付けられている。また、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）６２もＰＣＢ６０上に配置されており、また、ハウジング１２の外側部分に形成された窓部６４又は開口部を通じてその表示物を向ける位置に配置されている。ＬＥＤ４４、検出器３６の各々、及びＬＣＤ６２は、ＰＣＢ６０を通じて接続されている。水分が装置１０の貯蔵寿命の安定性又は作動に影響を与えるのを防止するため、乾燥剤の収納部６６を設けることができる。
本発明の分析化学ストリップすなわち輸送マトリックスを有する、計測器不使用型の診断装置７０の１つの実施の形態が図３に示してある。該装置７０は、入口ポート７４のような受容部を有するハウジング７２を備えている。該入口ポート７４は、測定すべき１つ以上の分析物質を保持する検体２０を受け取り得るように、ハウジングの表面７６からその内部まで伸長している。また、該入口ポート７４は、検体２０内に１つ以上の選択した分析物質が存在するか否かを判断する化学試薬を保持する検定ストリップ７８に検体２０を導入することを可能にする。
検体２０が入口ポート７４を通じて検定ストリップ７８に導入されたならば、試薬検体２０は、検定ストリップ７８上の少なくとも１つの試薬と化学的に反応して、その試薬に対応する反応生成物の混合体を生じさせる。その反応生成物の混合体の一部は、検定ストリップ上の少なくとも１つの検出領域８０に搬送され、検体２０中の選択した対応する分析物質の量に相関する物理的に検出可能な変化を生じさせる。次に、検出領域８０内にて生じた色をカラーバー８２又はその他の基準と比較して、選択した分析物質が存在するか否か及びその濃度を視覚的に判断することができる。
本発明は、輸送マトリックス上にて検体の流動方向に向けて検出領域に亙る捕獲効率を変化させ、物理的に検出可能な変化の均一な分布状態にし、又は変化したが、依然として所定の分布状態を実現する。特段の説明が無い限り、検出領域を亙るという語は、検体の流動方向を意味するものとする。検出領域という語は、物理的に検出可能な変化を知るために視覚的な観察により又は計測器により測定した領域を意味するものとする。
本明細書にて使用する所定の分布状態という語は、検出領域を亙る均一な又は変化した任意の選択されたパターンを含めることができる。また、所定の分布状態という語は、具体的に、分布状態が検出領域に亙って略均一である例を含む。物理的に検出可能な変化の分布状態を検出領域に亙ってに変化させることが望ましいことがある。これを行う理由の１つは、変化し又は不均一な試料採取領域を有する反射率計の光学素子を補正し又は相関させるためである。
物理的に検出可能な変化の分布状態は、捕獲試薬の分布状態によって制御される。捕獲試薬は、信号発生試薬と組み合わさり、この信号発生試薬は、分析物質又はその他の選択された試薬との反応を通じて物理的に検出可能な変化を提供することができる。捕獲試薬の分布状態は、輸送マトリックス上における捕獲試薬の濃度又は付与（付着）密度によって変化させることができる。捕獲マトリックスを輸送マトリックス上にて所定の分布状態にすることは、以下に説明する物理的又は化学的方法を通じて実現することができる。
本発明は、特定の結合要素を使用することのできる検定法を提供するものである。本明細書にて使用する特定の結合要素又は捕獲試薬は、特定の対の結合要素である。すなわち、分子の一方が化学的又は物理的手段を通じて第二の分子に特に結合する、２つの異なる分子である。このため、一般的な免疫学的検定法の抗原又は抗体の特定の結合対に加えて、その他の特定の結合対は、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）及びアビジン（ａｖｉｄｉｎ）、カルボヒドラーゼ及びレクチン、相補的ヌクレチオド・シーケンス、エフェクタ及び受容体分子、共同因子及び酵素、酵素阻害剤及び酵素等を含むことができる。更に、特定の結合対は、例えば、分析物質の類似体のような当初の特定の結合要素の類似体である要素を含むことができる。免疫学的反応性のある特定の結合要素は、単クローン及び多クローン双方の抗原、抗原分画体（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）、抗体、抗体分画体及びその錯体を含み、該錯体は、組換えＤＮＡ分子によって形成されるものを含む。本明細書にて使用するハプテンという語は、抗体に結合することができるが、担体タンパクに結合しない限り、抗体の形成を顕在化させることのできない、部分的抗原又は非タンパクの結合要素を意味するものとする。
本発明は、各試験領域内にて、検体中の分析物質の濃度に関連した物理的に検出可能な変化又は検出可能な応答に対して粒子検出法を使用することが好ましい。試験領域中に物理的に検出可能な変化を生じさせる、その他の手段も本発明にて使用するのに適している。例えば、非限定的ではあるが、電気的コンダクタンス、又は特定の光の波長の反射及び吸収を測定するため指示薬にて分析物質を同定することができる。本明細書にて使用するように、信号発生試薬及び指示薬という語は、分析物質又はその共役体を同定することができ且つ検体中の分析物質の濃度を示す検出可能な応答又は信号を発生させることのできる全ての化合物を含む意味であるものとする。
本明細書にて使用する分析物質は、試験検体中に存在するであろう、検出すべき物質である。この分析物質は、自然に生じる特定の結合要素（抗体のような）又は特定の結合要素を形成するすることのできる任意の物質とすることができる。このように、分析物質は、検定法にて１つ以上の特定の結合要素に結合することのできる物質である。また、分析物質は、任意の抗原性物質、ハプテン、抗体、巨大分子及びその組み合わせ体を含むこともできる。ビタミンＢ１２を測定するため、特定の結合対の要素として内性因子のタンパクを使用するといった、自然に生じる、特定の結合対の同類体を使用することにより、又はカルボヒドラーゼを測定するため、特定の結合対の１つの要素としてレクチンを使用することにより、特定の結合対の１つの要素として、分析物質を検出することができる。該分析物質は、タンパク、ペクチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、治療目的のために投与される薬及び不法な目的のために投与される薬を含む薬剤、細菌、ウィルス及び上述した任意の物質の代謝産物又は抗体を含むことができる。特に、かかる分析物質は、次のものを含むが、これらにのみ限定されるものではない。すなわち、フェリチン、クレアチニン、キナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、ジゴキシン、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、バンコマイシン、ゲンタマイシン、テオフィリン、バルブロエック酸、キニジン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、エストラジオール、プロゲステロン、ＩｇＥ抗体、ビタミンＢ２マイクログロブリン、糖化ヘモグロビン（Ｇｌｙ．Ｈｂ）、コルチゾル、ジギトキシン、Ｎ−アセチルプロカインアミド（ＮＡＰＡ）、プロカインアミド、ＩｇＧ風疹、ＩｇＥ風疹のような風疹に対する抗体、ＩｇＧトキソプラズマ（Ｔｏｘｏ−ＩｇＧ）及びＩｇＭトキソプラズマ（Ｔｏｘｏ−ＩｇＭ）のようなトキソプラズマに対する抗体、テストステロン、サリチル酸塩、アセトアミノフェン、抗Ｂ型肝炎コア抗原ＩｇＧ及びＩｇＭ（抗−ＨＢＣ）のようなＢ型肝炎コア抗原、ヒト免疫欠乏症ウィルス１、２（ＨＩＶ１及び２）、ヒトＴ細胞白血病ウィルス１及び２（ＨＴＬＶ）、Ｂ型肝炎抗原（ＨＢＡｇ）、Ｂ型肝炎抗原に対する抗体（Ａｎｔｉ−ＨＢ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、サイロキシン（Ｔ４）、総トリヨードサイロニン（Total Ｔ３）、自由総トリヨードサイロニン（Free Ｔ３）、胎児癌抗原（ＣＥＡ）及びアルファ胎児タンパク（ＡＦＰ）である。麻薬及び基準物質は、次のものを含むが、これらにのみ限定されるものではない。すなわち、アンフェタミン、メタンフェタミン、アモバルビタール、セコプ（secp）バルビタール、ベントバルビタール、フェノバルビタール及びバルビタールのようなバルビタール酸塩、リブリウム及びバリウムのようなベンゾジアゼピン、ハシシュ及びマリファナのようなカンナビノイド、コカイン、フェンタニール、ＬＳＤ、メタクアロン、ヘロイン、モルヒネ、コディン、ヒドロモルホン、ヒドロコドン、メサドン、オキシコドン、オキシモルホン及びアヘンのようなアヘン剤、フェニルシクリジン、及びプロポキシフェンである。かかる抗体の形成及び特定の結合要素として使用することの適格性に関する詳細は、当業者に周知である。
試験すべき検体は、次のものを含む生理学的流体のような任意の生物学的発生源から得ることができる。すなわち、全血又は赤血球細胞、白血球細胞、血小板、血清及び血漿を含む全血成分、腹水、尿、汗、乳、滑液流体、腹膜流体、羊膜流体及び対象とする分析物質を含む可能性のある身体のその他の成分である。試験検体は、血液から血漿を形成し、粘性流体を希釈する等とて、使用前に予め処理することができる。この処理方法は、ろ過、蒸留、濃縮化、干渉化合物の不活性化、及び試薬の添加を含むことができる。生理学的流体以外に、環境学的又は食品製造検定法を行うために、水、食品製品等のようなその他の液体試料を使用することもできる。更に、試験検体として、分析物質を含むことが疑われる固体材料を使用することができる。ある場合には、液体媒体を形成し、又は分析物質を解放するために固体の試験検体を改質することが有利なこともある。この分析物質は、検出し又は測定すべき任意の化合物又は組成物として、又は少なくとも１つのエピトープ又は結合部分を有することができる。
一般に、本発明は、検体が流動するための経路内に領域を提供する固体相の支持体、すなわち輸送マトリックス上にて捕獲試薬を非拡散状態に固定するものである。この輸送マトリックスは、捕獲試薬を固定することのできる任意の固体材料とすることができ、ビード、磁気粒子、常磁性粒子、ミクロ粒子又はマクロ粒子、ガラス又はその他の透明な材料で出来たスライド、毛管及び試験管、織り又は成形した織地又はメッシュ、及び微量滴定レートを含むが、これらにのみ限定されるものではない。かかる固体相支持体は、合成材料、天然材料又は合成的に改質した天然材料で形成することができ、また、次のものを含むが、これらにのみ限定されるものではない。すなわち、紙、セルロース及びセルロースアセテート及びニトロセルロースのようなセルロース誘導体、繊維ガラス、綿のような天然の布地、ナイロンのような合成布地、シリカ、アガロースデキストラン及びゼラチンのような多孔質ゲル、多孔質の繊維状材料、架橋結合したデキストラン鎖のような澱粉系材料、セラミック材料、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリビニルアセテート、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリスチレン、ビニルアセテート及び塩化ビニルの共重合体、塩化ポリビニル−シリカの組み合わせ体等を含むオレフィン又は熱可塑性材料である。
本発明の検定装置は、多数の形態が可能であり、その幾つかは、本明細書に具体的に記載してある。これらの検定装置は、多孔質材料又は吸上げ部材である輸送マトリックスを使用する。多孔質という語により、試験検体が容易に通過することができ、また、試験検体に露呈させ得るように捕獲試薬を支持する材料を意味するものとする。この輸送マトリックスは、吸水性及び非吸水性の固体相材料の双方を含むが、これらにのみ限定されない。本発明において、輸送マトリックスは、多数の検体試薬用の多数の層を有する注入及びフロースルー検定装置内にて使用するための繊維ガラス、セルロース又はナイロンパッドと、吸い上がるため、又は薄層のクロマトグラフィ毛管作用（例えば、ニトロセルロース）技術用の試験ストリップとを含み、又は当業者に周知の多孔質又は開放孔材料（例えば、焼結ポリエチレンシート材料）を含むことができる。
本発明は、定性的又は定量的結果を発生させるために計測器不使用型又は計測器使用型の検定法用にて検定試験部分を亙って検体を搬送するために使用されるマトリックスを提供する。図４を参照すると、本発明の好適な実施の形態は、図１の側方フロー検定ストリップ２２を提供する。この検定ストリップ２２は、３つの領域を有しており、その２つの検出領域２６、２８は、試験領域であり、その試験領域の一方は基準領域である。第一の領域２５は、検体を化学試薬で処理する。第一の検出領域２６は、分析物質の濃度と逆比例する強さの信号を発生させ、第二の検出領域２８は、１つの基準として作用し、分析物質の濃度に直比例する信号を発生させる。第一の検出領域２６及び第二の検出領域２８からの信号の合計値は、分析物質の全ての濃度にて略等しい。第一の検出領域２６、第二の検出領域２８又は第一及び第二の検出領域２６、２８の双方における色の強さを計測器で読み取ることにより、定量的又は定性的な結果が得られる。また、任意の１つの検定部分領域により表現される結果は、双方の検出領域により表された実際の結果の合計値の割合として求めることもできる。双方の検出領域を計測器で読み取ることにより、品質の基準値が得られる。その双方の検出領域の読み取り値の合計は、特定の範囲内にて略一定でなければならない。
図４の実施の形態は、拮抗的形態及び阻害形態を含む２つの好適な形態の例である。本発明は、これらの実施例にのみ限定されるものではなく、例えば、サンドイッチ型の免疫学的検定法のようなその他の免疫学的検定に使用するために適している。
拮抗的型式の形態を使用する場合、第一の領域２５は、拡散状に固定した粒子連結の抗原を含む吸水性材料を備えている。第一の検出領域２６は、第一の領域２５と独立的で且つ離れており、また、輸送マトリックス２２の末端２９に向けてある距離の位置に配置されている。第一の検出領域２６は、非拡散状に固定した抗体を含む吸水性材料を有しており、この抗体は、粒子連結した抗原及び自由な検体抗原を結合させることができる。
第二の検出領域２８は、第一の検出領域２６と独立的で且つ離れており、また、第一の検出領域２６から輸送マトリックス２２の末端２９に向けてある距離の位置に配置されている。第二の検出領域２８は、特定の結合対の非拡散状に固定した第一の要素を含む吸水性材料を有している。この第一の要素は、粒子連結した抗原の表面における特定の結合対の第二の要素である、その特定の結合相手に特定的に結合することができる。特定結合対のこの第二の要素は、検体の抗原に抗原的に関係しておらず、このため、この第二の部材は、抗抗原の単クローン抗体に結合すべく抗原と効果的に拮抗しない。
検体は、付与箇所すなわち第一の領域２５にて輸送マトリックス２２に付与される。粒子連結した抗原は、その付与箇所に、又はその付近に配置される。検体抗原を含む検体は、共役体を溶融又は分散させることにより、乾燥した粒子抗原の共役体を再構成する。共役結合し且つ自由な分析物質の混合体は、吸水性の吸上げ作用を介して移動し、第一の検出領域２６に達し、この第一の検出領域２６にて自由な抗原及び粒子共役結合した抗原は、この領域における非拡散状に固定した抗体となるように拮抗する。非拡散状に固定した抗体に結合する粒子−共役結合した抗原の部分（例えば、０％乃至100％）は、第一の検出領域２６に保持される。第一の検出領域２６に結合しない抗原−粒子共役体は、第二の検出領域２８に移行する。この第二の検出領域において、第一の検出領域２６内に保持されなかった粒子−共役結合した抗原の略全ての部分は、第二の検出領域２８内にて特定の結合対の非拡散状に固定した第一の部材により結合される。
阻害型の形態を使用する場合、第一の領域２５は、検体の抗原を結合させることのできる、拡散状に固定し且つ粒子連結した抗体を含む吸水性材料を有している。この第一の検出領域２６は、第一の領域２５から分離し且つ遠方にあり、吸水性ストリップの末端２９に向けてある距離の位置に配置されている。該第一の検出領域２６は、粒子連結した抗体が結合することのできる非拡散状に固定した抗原を含む吸水性材料を有する。
第二の検出領域２８は、第一の検出領域２６から分離し且つ遠方にあり、吸水性ストリップの末端２９に向けてある距離の位置に配置されている。この第二の検出領域２８は、その特定の結合相手に特に結合することのできる特定の結合対の非拡散状に固定した第一の要素を含んでいる。上記の特定の結合相手は、粒子連結した抗原の表面における特定の結合対の第二の要素である。特定の結合対のこの第二の要素は、検体の抗原に対して抗原的に関係しておらず、このため、該結合対は、抗抗原単クローン抗体に結合するように抗原と効果的に拮抗することはない。
流体検体は、粒子連結した抗体が配置される箇所である第一の領域２５に隣接して輸送マトリックス２２に付与される。この検体中に存在するであろう検体抗原は、粒子−抗原の共役体を再構成し、この共役体により結合される。結合した抗原：抗体−粒子錯体及び非結合状態の抗体−粒子錯体は、毛管作用、すなわち吸上げ作用を介して第一の検出領域２６に輸送され又は移行し、この第一の検出領域において、自由抗体−粒子共役体の略全てが非拡散状に固定した抗原により結合される。結合した検体の抗原：抗体−粒子錯体は、第一の検出領域２６を通じて第二の検出領域２８に移行し、この第二の検出領域にて、その略全ては特定の結合対の非拡散状態に固定した第一の部材によって結合される。
上述した形態において、第一の検出領域２６に存在する物理的に検出可能な変化の程度は、検体の分析物質の濃度の逆数であり、第二の検出領域２８における物理的に検出可能な変化の程度は、検体の分析物質の濃度の直接的な測定値である。第一の検出領域２６及び第二の検出領域２８から組み合わさった物理的に検出可能な変化は、検体の分析物質の濃度の全範囲に亙って略一定である。この全体的な検出可能な応答性すなわち信号は、検定法及び試薬の品質の双方に対する基準メカニズムとして機能する。このため、その全体的な信号が特定の範囲以下であるならば、ユーザは誤りであることが分かる。更に、不正確な検定法の具体的な理由を明らかにすることができる。例えば、この誤りは、特定の温度／又は湿度範囲外にて作動すること、検体の量が不十分であること、試薬の使用期間が経過していること等として明らかにすることができる。
検定法の定量化は、第一の検出領域２６、第二の検出領域２８又は第一及び第二の検出領域２６、２８の双方を読み取ることにより、判断することができる。検体の濃度の出力は、第一の検出領域２６単独、第二の検出領域２８単独、又は第一の検出領域２６及び第二の検出領域２８の双方に関連した較正アルゴリズムの結果である。この結果、定量的な分析物質の濃度のより信頼性の高い結果を得ることができる。分析物質の濃度に関係なく、略一定の全体的な信号を発生し得るように、第一の検出領域２６及び第二の検出領域２８からの検出可能な応答、すなわち信号を合算することにより、正確な検定法を行うための基準メカニズムが得られる。
１つの好適な実施の形態において、輸送マトリックスの形態は、所望の数の領域を提供し、また、（ａ）所望の結合反応が再現可能な方法にて終了すること、（ｂ）物理的に検出可能な変化又は反応の表示物を検出することを可能にする任意の寸法とすることができる。本発明の輸送マトリックスは、全長が約100ｍｍ以内、幅約６ｍｍであることが好ましく、長さが約10ｍｍ乃至約40ｍｍで、幅が約１ｍｍ乃至約５ｍｍであることがより好ましい。この輸送マトリックスは、任意の反射光系計測器内に一体化することが都合良く、また、引用してその内容を本明細書に含めた、上述の関連出願に記載されたような使い捨て型の電子式検定装置に一体化することがより好ましい。本発明の化学的作用及び形態は、一体化した検定装置に使用することができるが、本発明は、置換可能な試薬として任意のその他の計測器使用の反射計又は透過計にて使用することができる。
該輸送マトリックスは、その長さに沿って複数の領域を備えることができる。該領域は、拡散状に又は非拡散状に結合した試薬を保持することができる。領域の各々は、約0.1ｍｍ乃至約10ｍｍの幅とすることができ、約0.25ｍｍ乃至約５ｍｍの幅とすることがより好ましい。１つの輸送マトリックスにて行われる検定の数に対応して、少なくとも２つの領域、最大で約10以上の領域があるようにする。
輸送マトリックスは、吸水性材料から成る１つの連続的な部分とし、又は、１、２、３又はそれ以上の部分で構成することもできる。領域の各々は、独立的な吸水性材料とすることができ、この場合、領域の各々は、隣接する領域と流体連通しており、又は隣接する２つ以上の領域が共通の材料を使用し、その他の領域が異なる材料から成るようにしてもよい。領域の各々を含む輸送マトリックスは、同一又は異なる吸水性材料で形成することができる。この吸水性材料は、流体検体を付与したとき、吸上げ作用、すなわち毛管作用により、種々の領域、スペーサ（存在するならば）、及び検体の付与箇所の間を流体連通させることを可能にする。
好適な実施の形態において、該輸送マトリックスは、吸水性基層を有しており、同定することのできる捕獲試薬をこの吸水性基層に対して拡散状又は非拡散状に固定される。非拡散状の固定は、捕獲試薬を吸水性基層に吸収、吸着、架橋結合又は共有結合させることにより行うことができる。
拡散状の固定は、固定すべき検体試薬を調合すること（例えば、任意の所望の添加剤と共に、水、Ｃ₁−Ｃ₄アルコール又はその混合体のような適当な溶媒中で溶融させることにより）、得られた調合物を所望の位置にて薄膜、フィルタ又は輸送層の吸水性材料に付与すること、その材料を乾燥させることとによって行うことができる。適当な添加剤は、洗浄剤、タンパク、遮断剤、ポリマー、砂糖等を含めることができる。これと代替的に、添加剤及び検定試薬は、「遮断剤」である、水溶性ポリマー、砂糖又は洗浄剤で予め被覆することにより薄膜、フィルタ又は輸送層に付与し、その後、共役体又は共役調合剤を付着させ、その材料を乾燥させてもよい。拡散状の固定化は、反応し、又は未反応であるかどうかを問わずに、吸水性基層を通じて試薬を迅速に再構成し且つ移動させることを可能にする。非拡散状の固定化は、捕獲試薬を輸送マトリックスに対して共有結合させ、吸着又は吸収させることにより行うことができる。
該領域は、抗体、抗原、酵素、基層、小分子、タンパク、組換えタンパク、ウィルス又はバクテリアの溶解体、受容体、砂糖、炭水化物、ＰＶＡ及び洗浄剤のようなポリマーを含むが、これらにのみ限定されない、拡散状に又は非拡散状に結合した試薬を保持することができる。
図４に図示した輸送マトリックス２２の好適な実施の形態を参照すると、第一の検出領域２６及び第二の検出領域２８は、前縁境界１００と、後縁境界１０２とを有している。検出領域２６、２８の各々には、捕獲試薬のドット１０４のパターン１０６として所定の付着部分の分布状態が示してある。プリントしたパターン１０６は、矢印１０８で示した検体の流動方向に向けて前縁境界１００から後縁境界１０２まで検出領域２６、２８の各々を亙ってドット１０４の密度を増大させる。検出領域の各々の一側部１１０から反対側の側部１１２までのドット１０４の密度は、略均一であることが好ましい。図４に図示したパターン１０６の捕獲効率は、検出領域２６、２８の各々を亙って略一定の率にて有効に増大し、均一な勾配を提供する。
パターン１０６内のドット１０４は、従来のインクジェットプリンタを使用して輸送マトリックス２２に機械的に又は物理的に付与される。本発明と共に使用するのに適したその他の塗布具は、万年筆、パッドプリンタ、ピペット、エアブラシ、計測分配ポンプ及び注出装置等を含むが、これらにのみ限定されるものではない。また、所定の分布の適当な領域の上に試薬を正確に測定した供給するその他の塗布具も適している。ドット１０４は、任意の形状又は寸法とすることができ、パターン１０６内にてこれらの寸法を変化させることができる。
本発明の別の実施の形態は、図５に図示するように、捕獲試薬のドット１０４を検出領域２６内にて均一なパターン１１４で所定の分布状態にて物理的に付与するためのものである。プリントした均一なパターン１１４は、矢印１０８で示すように、検体の流動方向に向けて前縁境界１００から後縁境界１０２まで検出領域２６を亙って各ドット１０４内の捕獲試薬の濃度を増大させる。その結果、個々のドット１１６の捕獲試薬の濃度は、ドット１１８よりも低くなる。
図６に図示した別の好適な実施の形態は、検体の流動方向１０８に向けて前縁境界１００から後縁境界１０２まで検出領域２６を横断して一連のストライプ１２０にて捕獲試薬を輸送マトリックス２２に付着させて所定の分布状態のパターン１２２を形成する。ストライプ１２０は、検体の流動方向に対して垂直な検出領域の幅を亙って伸長することが好ましい。一連のストライプ１２０は、検出領域２６を亙って頻度が変化する。この実施の形態において、ストライプ１２０の各々における捕獲試薬の濃度は、略等しい。パターン１２２の捕獲効率は、ストライプ１２０の頻度が増大するために増す。図６に図示したパターンの捕獲効率は、検出領域２６を亙って略一定の率にて効果的に増し、均一な勾配を提供する。
パターン１２２内のストライプ１２０は、プリンタ、エアブラシ、計測分配ポンプ及び注出装置及びピペット等を使用して、輸送マトリックス２２に機械的に又は物理的に付与される。条１２０は、任意の幅とすることができ、また、パターン１２２内にて幅を変化させることができる。これと代替的に、条１２０の各々における捕獲試薬の化学的含有量、すなわち濃度は、パターン１２２に沿って変化するようにしてもよい。
本発明のもう１つの実施の形態は、一連のストライプ１２０の頻度及びその濃度を変化させることを組み合わせ、図７に図示した所定の分布状態を有するパターン１２４を形成する。パターン１２４の捕獲効率は、前縁境界１００から検出領域２６の中間に向けて効果的に増し、次に、後縁領域１０２に向けて効果的に低下し、不均一な勾配を開示する上での本発明の種々の形態を明らかにしている。
図８に図示した実施の形態は、検出領域２６を横断して前縁境界１００から後縁境界１０２までパターン１２６を形成し得る捕獲試薬の濃度及び／又は密度が増す所定の分布状態を提供する。第一のストライプ１２８は、検出領域２６を略覆う。第二のストライプ１３０は、第一のストライプ１２８に部分的に重なり合うが、第一のストライプ１２８のみが存在する１つの領域を残す。同様の方法にて、別のストライプ１３２が第一のストライプ１２８及び第二のストライプ１３０に部分的に重なり合うが、第一のストライプ１２８のみ、及び第一のストライプ１２８及び第二のストライプ１３０のみが存在する１つの領域を残す。その結果、形成されたパターン１２６は、重なり合うストライプの翼列となる。捕獲試薬の濃度は、ストライプが順次重なり合う領域内にて増す。捕獲試薬の濃度がストライプ１２８、１３０、１３２の各々にて等しいならば、重なり合う面積は、捕獲試薬の濃度を２倍及び３倍にする。ストライプの各々における捕獲試薬の量を変化させることも適当である。
輸送マトリックスに付与されるパターンの例が、図４乃至図８に図示されているが、本発明は、ドット及びストライプのような図示した沈着の特定の形状にのみ限定されず、また、その設計の特別な頻度又は寸法にも限定されないことを理解すべきである。
捕獲試薬を付与する本発明の好適な化学的方法の１つは、従来のプリンタを使用して、捕獲試薬の所定の分布状態を表すパターンを輸送マトリックスに印刷することである。次に、その印刷したパターンを処理して、捕獲試薬の効率を調整し、分析物質又はその共役体と効果的に結合するようにすることで、捕獲試薬の効果を所定の分布状態にて改変させる。例えば且つ非限定的に、捕獲試薬の捕獲効率は、遮断試薬を使用することにより調節することができ、この遮断試薬は、捕獲試薬と又は分析物質と結合し、分析物質又はその共役体と結合する捕獲試薬の機能を効果的に低下させることができる。
捕獲試薬の効率を化学的に調節する１つの好適な実施の形態の２つの形態が図９に示してある。１つの形態は、矢印１０８で示すように、検体の流動方向に沿って検出領域２６の前方の領域１３６内にて遮断試薬１３４を付与するためのものである。遮断試薬を保持する領域１３６は、検出領域２６と別個とし、又は、前縁境界１００に重なり合うようにすることができる。次に、検体が検出領域２６を亙って流れるときに遮断試薬１３４が分配される。これと代替的に、検体を輸送マトリックスに付与する前に、検出領域２６を亙って遮断試薬１３４が分配されるようにしてもよい。輸送マトリックス２２を製造する間におけるように、検体に対して露呈させる前に、遮断試薬１３４を拡散させることのできる溶液を輸送マトリックス２２を処理するために使用することができる。
捕獲試薬の効率を化学的に調節する１つの好適な実施の形態の第二の形態は、捕獲試薬のパターン１３８の上方に亙って第二の所定の分布パターンにて遮断試薬１３４を付与するためのものである。パターン１３８で示した捕獲試薬の所定の分布状態は、均一な一連のストライプ１４０である。遮断試薬１３４の第二のパターンは、遮断試薬１３８の濃度及び／又は密度が第二の検出領域２８の前縁境界１００から後縁境界１０２まで低下する所定の分布状態である。遮断試薬１３４の型式は、分析物質と結合する捕獲試薬の効果を低下させるために分析物質又は捕獲試薬の何れかと結合するように選択する。具体的に図示するように、前縁境界１００から後縁境界１０２までの増大する捕獲効率の勾配は、遮断試薬１３４が捕獲試薬又は分析物質の何れか一方と相互作用することにより形成される。
遮断試薬は、捕獲試薬又は分析物質に対するその遮断効果の点で特定的か又は非特定的の何れかとすることができる。非特定的な遮断試薬の例には、ポリマー及び粒子が含まれる。特定的な遮断試薬は、抗体及びポリマー又は粒子との抗体共役体を含み、この場合、粒子の寸法が大きければ大きい程、その拡散速度は遅くなる。その他の特定的な遮断試薬には、抗原、及び種々の寸法のポリマー又は粒子との抗原共役体が含まれる。
膨張材料は、捕獲試薬の濃度を変化させ、従って、所定の分布状態にて検出領域の捕獲効率を変更する別の方法として使用することができる。捕獲試薬を輸送マトリックスに付着させる前に、膨張材料を最初のマトリックスの一部として捕獲試薬と組み合わせることができる。遮断材料を捕獲試薬と共に、輸送マトリックス上に付着させたとき、該膨張材料は、捕獲試薬に対する非特定的な遮断試薬として機能する。
図１０に示すように、簡略図には、輸送マトリックス２２に付着させる前に、捕獲試薬１４６と混合させたかさを増すための材料１４４が示してある。かさを増すための材料１４８も示してあり、このかさを増すための材料１４８は、個々の捕獲試薬の結合箇所上における特定の遮断試薬１５０と比較して、捕獲試薬１４６の結合箇所における非特定的な遮断試薬として使用される。
物理的に検出可能な変化の所定の分布状態を形成するために検出領域の捕獲効率を変更する別の方法も図９に示されている。この実施の形態において、検出領域２８は、検出領域２８を亙る検体の流れ１０８を変更する拡散制御材料で被覆するか、又はその拡散制御材料を含浸させることができる。検出領域２８に亙る検体の拡散速度を調節すれば、捕獲試薬との結合時間がより長く又は短くなるから、これに対応して捕獲試薬の捕獲効率も調節される。一例であって、限定的ではなく、本発明と共に使用するのに適した拡散制御材料は、デクストラン（dextran）である。その他の適当な拡散制御材料には、検体マトリックス中にて可溶なポリエチレングリコール及びその他の重合系材料が含まれるが、これらにのみ限定されるものではない。
ＮＴｘ（登録商標名）（オステックス・インターナショナル（Ostex International））のような特定型式の検定法の場合、捕獲試薬と拮抗結合する遮断試薬を検出領域２６の前にて領域１２８に追加することができる。拮抗的な遮断試薬は、検体と共に拡散し、捕獲効率を低下させる傾向がある。拮抗的な遮断試薬が検出領域２６を亙って拡散するとき、その濃度は低下し、捕獲試薬の捕獲効率が増して、逆の勾配を生じさせる。この方法の実施の形態は、その他の検定法と共に使用するのに適しており、適当な拮抗的な遮断試薬は、塩化ナトリウム、尿素及びチャオトロペス（chaotropes）のような塩を含むが、これらにのみ限定されるものではない。
ＮＴｘ（登録商標名）のような分析物質は、検出領域２６の前にて輸送マトリックス２２に合成ペプチド類似体又はその他の分析物質を追加することにより不感性にすることができる。このことは、検出領域の前縁境界にて捕獲効率を低下させることになる。次に、分析物質がペプチド類似体から受ける拮抗が少なくなり、捕獲試薬と結合することに対してより感性的となるに伴って、捕獲効率は増大する。分析物質が低濃度であるとき、最初の感性は、特定の検定法に対する化学的反応の較正曲線の下端にて低い。検体の前に、又は検体と同時に、輸送マトリックスに沿って拡散するように、所定の少量量の分析物質を追加すれば、検定法の感性は、較正曲線に沿って更に調節されて較正曲線のより高感度の部分となる。
本発明は、また、２つ以上の領域に亙って物理的に検出可能な変化を測定する合計値を利用して、この実施の形態中にて「フック効果」を生じさせることに関して分析物質の高濃度が有害な影響を与えるのを最小にする方法をも提供する。図９を再度、参照すると、捕集領域すなわちストライプ１４２が輸送マトリックス２２に選択随意的に追加される。この捕集領域１４２は、その内部にて固定された捕集試薬を含んでおり、この捕集試薬は、第一の検出領域２６の捕獲効率を超える余剰な分析物質を結合させる。この捕集試薬はラテックスに結合する。このラテックスは、さもなければ第二の検出領域２８内にて結合し、第一の検出領域２６及び第二の検出領域２８内における物理的に検出可能な変化の測定値の合計値を不正確なものとするものである。本発明のこの実施の形態を使用すれば、分析物質の濃度が装置で測定しようとする範囲以上となる結果として、所定の最小値以下である測定値の合計値を識別する。
輸送マトリックスに対する上述の実施の形態以外の異なる形態を使用する本発明の別の実施の形態が図１１に分解図で示してある。輸送マトリックス１５２は、層状の積み重ねた形態にて配置される。１つ以上の選択された分析物質に対して分析すべき検体１５４は、吸水性材料の第一の層１５６に付与され、この吸水性材料は、未処理のままとするか、又は図４の第一の領域２５により行われたように、検体を処理するための試薬を含めることができる。次に、検体１５４は、矢印１５８の方向に層１６０まで流れる。この層１６０は、検出領域１６２の前縁境界である。該層１６０は、その内部に非拡散状に固定された捕獲試薬を保持している。同様に、層１６４、１６６、１６８の各々は、独立的に、その内部に非拡散状に固定された、捕獲試薬を保持しており、この捕獲試薬の量は、益々、増大する。このため、捕獲試薬の濃度及び／又は密度は、検出領域１６２に亙って層１６０から層１６８まで増大する。作動時、検体は、検出領域１６２を亙って層１６０から層１６８まで側方向に吸い上がる。層１６０、１６４、１６６、１６８の側部１７２は、従来の反射率計から光源１７０によって照射され、光線を検出器１７４に拡散状に反射させる。吸水性材料の層の数を増すことにより、より多くの検出領域を輸送マトリックス１５２に追加することができる。
輸送マトリックスに対して、上述した実施例以外の異なる形態を使用する本発明の別の実施の形態が図１２に示してある。輸送マトリックス１８０は、毛管のような囲い物１８２内に保持されている。該輸送マトリックス１８０は、この囲い物内に、充填された固体層の支持体１８４を有している。第一の検出領域１８６及び第二の検出領域１８８内にて固体層の支持体１８４は、その上に固定した捕獲試薬１９０を有している。検体は、入口ポート１９２を通じて囲い物１８２内に導入され、矢印１９４の方向に向けて囲い物１８２を亙って流れ又は吸い上がる。検出領域１８６、１８８内における物理的に検出可能な変化は、囲い物の壁の透明部分２０２を通じて光源２００によって照射される。拡散して反射した光線は、検出器２０４によって測定される。
図１２の１つの形態において、捕獲試薬１９０の量は、検出領域１８６、１８８に亙って均一に分配される。囲い物１８２は、遮断試薬を保持する領域１９６、１９８を含んでおり、この遮断試薬は、検体が流れる前に、それぞれの検出領域１８６、１８８を亙って輸送されるとき、捕獲試薬の効率の分布状態を所定のものにする。
図１２で示した１つの代替的な形態において、捕獲試薬１９０は、囲い物１８２内に充填されて、各検出領域１８６、１８８を亙る捕獲試薬の量を変化させることにより、所望通りの所定の分布状態を直ちに形成する。その結果、領域１９６、１９８は、不要となる。
本明細書に示し且つ説明した輸送マトリックスの形態は、幾つかの組み立て方法により形成することができる。試薬を含む溶液中に輸送マトリックスを浸漬し、その後に、乾燥させる従来の方法は、本発明の一部分に使用するのに適している。かかる複合的な方法において、試薬の略均一な層又は被覆を最初に、輸送マトリックスに付着させる。次に、第一の試薬の上方に亙って、又は第一の試薬の前方にて輸送マトリックス上の領域内で第二の試薬のパターンを付着させることにより、均一な付着状態を変更する。この方法は、第一の試薬として、捕獲試薬及び拡散制御試薬と共に使用することができる。第二の試薬として遮断試薬を使用することができる。以下の実験例は、これらの方法の詳細を具体的に示すものである。
本発明の全体を説明したが、本明細書において更に一例の目的のためにのみ掲げ、本発明を限定することを意図するものではない以下の特定の実施例を参照することにより、更なる理解が可能である。
実験例１
本発明を実施する際、以下のストリップ組立体及び捕獲試薬の固定化方法をに使用した。実施例の検定ストリップは、両面接着剤又は移し接着剤を使用して、吸水性材料をポリビニルアセテートのシート（厚さ0.254ｍｍ（0.01インチ））に接続することによって輸送マトリックスをプラスチック裏当て材に積層することで作製した。
ポリビニルアセテートのシートのカード（厚さ0.254ｍｍ（0.01インチ））を約2.3ｃｍ×10ｃｍに切断した。このカードの寸法は、所望の検定カードの寸法に対応して変更した。ポリビニルアセテート裏当て材は、種々の検定ストリップの領域の位置を示す適当な位置にて長さに沿って鉛筆の線で標識した。３Ｍ４６５のような両面接着剤をポリビニルアセテートに付与し、表面を鉛筆の線で覆うようにし、ローラ組立体によって強固な圧力を付与し、気泡が確実に発生しないようにした。両面接着剤の剥離ライナーを除去し、鉛筆の線で案内して、輸送マトリックス又は紙の検定部分を正確な位置に付与し、ローラ組立体により強固な圧力を付与して気泡が確実に生じないようにした。吸水性の検定マトリックスの各部分は、その隣接する部分と確実に流体連通するように注意した。最後に、個々の検定ストリップをカードの長さに沿って各々0.03ｃｍの幅となるように切断し、長さ2.3ｃｍ×幅0.3ｃｍの検定ストリップとなるようにした。このことは、ダイカッター、又は標準的なペーパーカッターを使用して行った。
表１に掲げた遮断試薬の場合、該遮断試薬は、約0.1μｍ乃至約20μｍの所望の寸法範囲を有するラテックス微小球粒子に共有結合し、これらの粒子は、毛管作用により輸送マトリックス内に吸引した。この微小球粒子方法は、最初に、次のように、カルボキシル官能基を有する微小球に対して所望の遮断試薬を共有結合するように固定化することで行った。すなわち、0.4μｍの微小球−ＣＯＯＨの懸濁液（例えば、バーンズ・ラボラトリーズ（Bangs Laboratories））に対して、ｐＨ６、50ｍＭ２−（Ｎ−モルヒネ）エタンスルホン基の酸緩衝剤（ＭＥＳ、シグマＭ−5287）中にて１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジミド（ＥＤＡＣ、シグマＥ0388）の1.1モル等価物及びＮ−ハイドロキシトクジイミド（ＮＨＳ、ピアス24500）の1.1モル等価物を室温にて添加し、30分間撹拌した。次に、この懸濁液は遠心分離し、ＭＥＳ内にて洗浄して、余剰なＮＨＳ及びＥＤＡＣを除去した。その後、所望の遮断試薬を50ｍＭホウ酸塩ナトリウム、ｐＨ8.5と共に添加した（このタンパクは、ビード表面にてＣＯＯＨ感応群よりも10倍のモル余剰である）、室温にて２時間反応させ、次に、遠心分離により精製し、その後、洗浄及び再度の遠心分離を行った。この時、微小球粒子は、共有結合して固定化した所望の遮断試薬を有していた。この遮断試薬−粒子の懸濁液を混合し、ピペットを使用して２−10μＬの検体を取り上げ、直ちにその検体を捕獲試薬の前にて輸送マトリックスの上に載せた。
捕獲試薬に対する抗原共役体を作製するため、ｐＨ7.2の50ｍＭリン酸塩（ＰＢＳ）中にてマウスＩｇＧ又はウシＩｇＧ（ＢｇＧ）を50：１のモル比にて0.15Ｍ・ＮａＣｌ、及びサクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）サイクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、ピアスNo.22320）で、室温にて約60分間反応させることにより、活性化させた。マレイミドを加えたＩｇＧを50ｍＭのリン酸ナトリウム及び１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ7.0と共に平衡状態としたセパデックスＧ１５（10ｍｌ）カラムを通じて下方に流れるようにした。Ｃ−ペプチド（オステックス・インターナショナルから得られた合成抗原）を50ｍＭのリン酸ナトリウム及び１ｍＭＥＤＡ、ｐＨ7.0中にて50：１のモル比（ｃ−ペプチド：ＩｇＧ）でマレイミドを加えたＩｇＧに液滴状に加え、室温にて約２時間反応させた。その後、その混合体はｐＨ7.2のＰＢＳにて平衡状態としたセパデックスＧ２５カラムを通じて下方に流し、未反応の合成抗原を除去した。ｃ−ペプチド：ＩｇＧの比は、表１に掲げた材料が得られるように変更した。
抗−ＮＴｘ（Ｍａｂ１Ｈ１１）、ＢＳＡ又はＢｇＧにて輸送マトリックスを処理するため、検出領域を亙って幅約1.5ｍｍの単一のストライプとなるように配置した。このとき、カリフォルニア州、カールスバードのＩＳＭＥＣＡ・グループが製造したバイオ・ライン（Bio-line）（登録商標名）プログラム化可能な分配装置であるストライパを使用した。このストライパには、ＶＴのノーススプリングフィールドのＩＶＥＫ・コーポレーションが製造した２つのデジペンス（Digipense）2000ポンプが取り付けられている。Ｃ−ＩｇＧで処理するため、同一のストライパを使用して、各々の幅が約0.75ｍｍである２つの別個のストライプとして表１に掲げた２つの比を検出領域を亙るように付着させた。そのストライプの反射光の密度を検出領域（領域）の前縁境界（Ｌ）及び後縁境界（Ｔ）にて測定した。

表１に掲げた反射密度は、約１ｍｍ直径の測定領域を使用する、グレターグ（Gretag）製造による携帯型の反射濃度計で測定した。対照以外、検出領域を亙って物理的に検出可能な変化のより均一な分布状態を提供する、本発明の機能を明らかにするため、１つの分析物質としてＮＴｘ（登録商標名）の３つの異なる濃度を有する捕獲試薬の６つの異なる分布状態を使用した。検出領域の前縁境界及び後縁境界にて測定した反射密度により明らかにされるように、その比は著しく小さく、物理的に検出可能な変化のより均一な分布状態であることを示す。
実験例２
実験例１にて使用したものと同一のストリップ組立て方法に従って、勾配線の対照線及び３つの異なる組み合わせを形成した。ＮＨのウェスト・レバノンのシナジー・リサーチ（Snaergy Research）が製造したインキ・ジェット・プリンタシリーズ810の分配装置及びコーレルドロー（CorelDraw）ソフトウェアを使用して非拡散状の固定化を行い、輸送マトリックスの適当な検出領域上に表２に掲げた種々の捕獲試薬及びその濃度を正確に測定した。この場合、捕獲試薬の溶液は、ｐＨ7.2の50ｍＭのリン酸（ＰＢＳ）中にて0.15Ｍ・ＮａＣｌにより0.01ｍｇ／ｍＬ乃至10ｍｇ／ｍＬの範囲に希釈し、付与装置内に導入した。次に、この付与装置を適当な検出領域上に配置し、単一のストライプとして、又は検出領域に亙ってドットの分布頻度が増す、一連の別個のストライプとして固定材料を印刷した。別個のストライプの幅は、約0.25ｍｍ乃至約５ｍｍとし、好ましくは約0.5乃至約1.5ｍｍとした。次に、輸送マトリックスを乾燥する迄、45℃にて10分間乾燥させた。輸送マトリックスを洗浄し且つ１％のポリビニル・プロリジンを付与し、その後、再度、乾燥させた。
表２には、ＮＴｘ（登録商標名）の３つの異なる濃度におけるドットマトリックスの勾配の各パターンについて、検出領域の前縁境界及び後縁境界での反射密度の測定結果が示してある。表２の最初の２つの勾配パターンは、ドット密度を連続的な勾配にて付着させるプリンタによって形成したものである。最後の処理は、４つの別個のストライプから成る不連続的なドット密度の勾配とした。表２には、例えば、０％乃至100％対20％乃至100％のドット密度のような、勾配の急峻さの程度の僅かな差の効果も示してある。

表２に掲げた反対密度は、検出領域に亙って物理的に検出可能な変化をより均一に分布させる本発明の機能を明らかにするものである。検出領域の前縁境界及び後縁境界にて測定した反射密度により明らかにされるように、その比は著しく小さくなり、物理的に検出可能な変化がより均一に分布した状態であることを示す。
上記の教示に鑑みて、本発明の多数の改変例及び変形例が可能である。このため、添付した請求の範囲内において、本発明は、本明細書に特に記載した以外の形態にて実施することができることを理解すべきである。Inventors: Joel M. Blatt, Michael P. Allen, and Paul J. Patel
Related applications
The subject of the present invention is the United States of America, named “New Novel Disposable Electronic Assay Device”, filed August 24, 1993 by Mitchell P. Allen and now abandoned. Patent application No. 08 / 111,347, filed on May 31, 1995 by Mitchell P. Allen, US patent application entitled “Novel Disposable Electronic Assay Device” 08 / 455,236, filed August 9, 1995 by Joel M. Bratt and Mitchell P. Allen, “Dry Reagent Particle Test Method and Test Device with Multiple Test Areas and its Method (Dry Reagent Particle US Patent Application No. 08 / 512,844 entitled "Assay And Device Having Multiple Test Zones And Method Therefor" and Raymond T. Hebert and others filed April 30, 1996 U.S. Patent Application No.Relates to a fully self-contained, disposable, one-time-use digital electronic instrument containing all chemical reagents, as disclosed in US Pat. The above-mentioned application is assigned to the same person as the assignee of the present invention, and the entire contents thereof are incorporated herein by reference.
Field of Invention
The present invention relates to a method and apparatus for changing capture efficiency over a certain area in order to detect physical changes on the surface of an analytical chemical strip where a specimen is exposed in a diagnostic apparatus for displaying medical information.
Background of the Invention
In the past, immunoassays have been developed to qualitatively and quantitatively measure various compounds in laboratory facilities using detailed methods and expensive instruments. Recent developments in immunodiagnostics have tended to seek simpler methods for rapid analysis of clinical specimens. The development of solid phase binding reagents eliminates the need for precipitation when separating bound reagents from free reagents. Further progress in solid phase immunochemistry has resulted in immunoassays for strips of dry reagents that do not use instruments. This configuration makes it possible to visually and qualitatively or semi-quantitatively measure an analyte in a patient sample without using a measuring instrument.
There are two basic types of immunoassays that are non-instrumented. In the first type, the visual color region type, a signal is generated at a specific area on the strip, which indicates the presence of the analyte and the strength of the signal is Displays the concentration of the analyte. This type of assay visually interprets whether there is a color above a threshold, as in a qualitative test, or compares color intensity with a color chart as in a semi-quantitative test. You need to do. In the second type, this visual signal is generated along the length of the absorbent assay strip. While sucked up, the analyte reacts with a test that generates a signal and generates a visible signal along the support. The distance the signal travels from the proximal end of the strip is a direct measure of the analyte concentration. This type of moving height test, without the use of instruments, can achieve quantitative results with reasonable performance.
Such a one-time-use thermometer type quantitative device that does not use a measuring instrument and a color comparison device that does not use a measuring instrument for qualitative measurement exhibit sufficient performance, but are reliable and easy to use. There are some difficulties associated with. The colors generated by these devices are not always uniform and sharp. In the case of a mobile assay, the color of the boundary is often faint, unclear and difficult to read. This directly leads to user error, since the user has to make a decision regarding the position of the color band boundary. In the case of a pregnancy test that does not use a measuring instrument, it may be difficult to visually interpret the strength of the colored part (especially the HCG concentration close to the cutoff sensitivity), and interpretation of the result may be a problem. There is. When an unskilled operator must make a visual judgment or interpretation, an error may occur and it may be inconvenient.
In order to increase the accuracy and reliability of the results of the assay, several qualitative and quantitative diagnostic tests utilizing a reflectometer to measure the light reflected from a test element, such as a detection moiety in an analytical chemistry strip, are available. Has been developed. The reflectometer has a structure in which a lens, a filter, an aperture, a light source, and a detector are optically arranged. Examples thereof are described in US Pat. Nos. 4,219,529, 4,224,032, and 3,536,927.
Problems often arise with respect to obtaining an accurate and accurate measurement of the light beam diffused and reflected from the surface of the assay strip in the specimen collection or detection area. One reason for this is that the measured, physically detectable change does not occur uniformly across the entire test area. The lateral flow assay strip passes the signal reagent through a detection area containing a fixed capture reagent. This signal reagent first encounters a substantial portion of the restraining reagent, if not the total amount at the leading edge boundary of the detection region, and immediately begins to bind to that portion. As a result, the signal becomes extremely high in the narrow area of the leading edge boundary, and the strength of the signal rapidly decreases toward the trailing edge boundary of the detection area. Overall, the signal strength is in a non-uniform gradient distribution across the detection area.
Another possible cause of inaccurate measurements is that the concentration of the analyte results in a decrease in signal strength, ie a “hook effect”. When the concentration of the analyte is significantly higher than the concentration of the capture reagent, the signal strength may actually be reduced and falsely indicated as an acceptable assay result.
It is necessary to use a capture reagent or other signal generating reagent so that the physically detectable change is distributed substantially uniformly across the detection region. In addition, it is necessary that the physically detectable change in the detection region of the test strip has a predetermined distribution state. These needs are not met by the prior art.
Thus, there is a need in the diagnostic field for a method and apparatus for changing capture efficiency over a region to detect physical changes in the surface of an analytical chemistry strip from which an analyte is exposed. A uniform or predetermined distribution state must be sufficiently economical, appropriate, efficient, durable and reliable for use in a diagnostic device. It should be possible for unskilled personnel to give first aid at an emergency site or at a place other than a hospital.
Summary of the Invention
The present invention provides a transport matrix that causes a physically detectable change that correlates with the amount of selected analyte in a sample to occur in a predetermined distribution across a detection region. The matrix includes a detection region having capture reagents that produce a physically detectable change that correlates with the amount of selected analyte in the assay. The detection area has a leading edge boundary that first encounters the specimen and a trailing edge boundary that meets the specimen after being transported over the detection area. This capture reagent is fixed on the matrix in a predetermined distribution state from the front edge boundary to the rear edge boundary of the detection region.
The present invention also provides a transport matrix for determining whether a selected analyte is present in a sample. The matrix includes a detection region having capture reagents that produce a physically detectable change that correlates with the amount of selected analyte in the analyte. This physically detectable change is fixed in a substantially uniform distribution state over the detection region.
In one embodiment of the invention, a physically detectable change that correlates with the amount of a selected analyte in a sample is caused by a signal generating conjugate in a predetermined distribution state over a detection region. A transport matrix is provided. The matrix includes a detection region having capture reagents that produce a physically detectable change that correlates with the amount of selected analyte in the analyte. The detection area has a leading edge boundary that first encounters the specimen and a trailing edge boundary that meets the specimen after being conveyed over the detection area. This capture reagent is fixed in a substantially uniform predetermined distribution state from the front edge boundary to the rear edge boundary of the detection region. The region is arranged in front of the leading edge of the detection region with a blocking reagent fixed in a diffuse manner inside. The blocking reagent diffuses over the detection region and corrects the capture efficiency so that the capture reagent is in a substantially uniform distribution state so that the capture efficiency is substantially uniform over the detection region.
Another embodiment of the present invention provides a transport matrix as described above, comprising a diffusion control material distributed within the detection region. This diffusion control material slows the speed at which the specimen is transported across the detection region, and increases the capture efficiency of the capture reagent from the leading edge to the trailing edge.
One preferred embodiment of the present invention provides a transport that produces a physically detectable change across a plurality of detection regions in a predetermined distribution pattern that correlates with the amount of a selected analyte in a sample. Provide a matrix. This matrix has first and second detection regions. Each of the detection regions has a non-diffusible immobilized capture reagent that produces a physically detectable change that correlates with the amount of selected analyte in the sample. Each of the detection areas has a leading edge boundary that first encounters the specimen and a trailing edge boundary that meets the specimen after being transported across each of the detection areas. This capture reagent is fixed in a predetermined distribution state from the front edge boundary to the rear edge boundary of each detection region.
Another preferred embodiment of the present invention is a diagnostic apparatus that determines whether or not a selected analyte is present in a sample. The apparatus includes a housing having an outer surface and sealing an inner region. The receiving unit is configured to receive a specimen containing the selected analyte in order to determine whether or not the selected analyte exists. The receiving portion is provided on the outer surface of the housing. At least one transport matrix reacts the analyte with the capture reagent and generates a physically detectable change in the detection region that correlates to the amount of selected analyte in the analyte. The detection area has a leading edge boundary that first encounters the specimen and a trailing edge boundary that meets the specimen after being conveyed over the detection area. The capture reagent is fixed in a predetermined distribution state from the front edge boundary to the rear edge boundary of the detection region.
The present invention also includes a step of distributing a physically detectable change correlated to the amount of selected analyte in a predetermined pattern over a detection region on the transport matrix in a selected pattern. Also provided is a method for determining the concentration of an analyte.
Advantages, embodiments, and modifications will become apparent to those skilled in the art from this specification, taken in conjunction with the accompanying drawings and appended claims.
[Brief description of the drawings]
In the drawings constituting part of this disclosure,
FIG. 1 is a partial plan view of a diagnostic apparatus partially cut away to show an irradiation optical element and a detection optical element of the present invention.
FIG. 2 is a partial cross-sectional view of the diagnostic apparatus shown along line 2-2 in FIG.
FIG. 3 is a plan view of a diagnostic device without a measuring instrument using the present invention.
FIG. 4 is an independent view of a transport matrix having two detection regions utilizing the present invention.
FIG. 5 is an independent view of the detection region showing the uniform distribution state of the capture reagent using dots in the present invention.
FIG. 6 is an independent view of the detection region utilizing the increasing frequency of the capture reagent stripes in the present invention.
FIG. 7 is an independent view of the detection region that utilizes the non-uniform distribution of the capture reagent stripes in the present invention.
FIG. 8 is an independent view of the detection region utilizing overlapping capture reagent stripes in the present invention.
FIG. 9 is an independent view of a transport matrix having two detection regions utilizing the present invention.
FIG. 10 is a cross-sectional side view of a transport matrix with the absorbent material and capture reagent of the present invention disposed thereon.
FIG. 11 is a side view of a stacked configuration of transport matrix and reflectometer using the present invention.
FIG. 12 is a cross-sectional view of a capillary enclosing a transport matrix of the present invention.
DESCRIPTION OF PREFERRED EMBODIMENTS
The present invention can be used in either a measuring instrument use type or a measuring instrument non-use type verification apparatus. Examples of instrument-based devices include disposable single-use and multi-use digital electronic instruments and verification devices described in detail in the above-mentioned related applications incorporated herein by reference. Is included. The present invention provides a more accurate measurement by means of visual observation or instrumentation of a physically detectable change corresponding to the amount of analyte selected within one or more detection regions of the assay. It is what makes it possible.
An example of a meter-baseddiagnostic device 10 having an analytical chemistry strip or transport matrix of the present invention is shown in FIGS. Thedevice 10 includes ahousing 12 having a receptacle such as aninlet port 14. Theinlet port 14 extends from thehousing surface 16 to its interior 18 for receiving ananalyte 20 that holds one or more analytes to be measured. Theinlet port 14 provides a sample to thefirst transport matrix 22 and the second transport matrix 24 that hold chemical reagents for determining whether one or more selected analytes are present in thesample 20. 20 can be introduced.
If theanalyte 20 is introduced into both thefirst transport matrix 22 and the second transport matrix 24 through theinlet port 14, theanalyte 20 may contain at least one reagent on the surface of each of thetransport matrices 22, 24. It reacts chemically to form a mixture of reaction products corresponding to the reagents. A portion of the reaction product mixture is transported to at least one detection region in each of thetransport matrices 22, 24 and is physically detectable change correlated to the amount of the corresponding selected analyte in theanalyte 20. Give rise to
As specifically shown in FIG. 1, each of thefirst transport matrix 22 and the second transport matrix 24 has twodetection regions 26, 28 and 30, 32, respectively. Thedetector 34 is arranged at a position where light rays reflected from thedetection areas 26 and 28 on the first transport matrix can be measured. The detector 36 is arranged at a position where the light beam reflected from thedetection areas 30 and 32 on the second transport matrix can be measured. The quality control area 42 does not show a physically detectable change measured in each of the detection areas. Each of the detection area and quality control area is an example of a different type of sampling area on the transport matrix where the reflected light is sampled and measured by a single detector.
A light emitting diode (LED) 44 provides a radiation source that is directed to each of thedetection areas 26, 28, 30, 32 and to the quality control area 42 by a plurality of total internal reflection elements (TIRs) 46. The totalinternal reflection element 46 functions as a mirror and no reflective coating is required as a result of the refractive index of the transparent material from which the element is made.
Irradiation light from theLED 44 is divided into four directions. A portion of the illumination light is directed from thereflective element 48 to the reference detector 40. Another portion of the illumination light is directed from the series ofreflective elements 50, 52 to thedetection areas 26, 28. Irradiation light is also directed from the series ofreflective elements 54, 56 to thedetection areas 30, 32. Thereflective element 46 illuminates thequality control detector 38 with another sampling area on the second assay strip 24.
FIG. 2 specifically shows another view of the apparatus having anoptical element assembly 58 and a printed circuit board (PCB) 60 disposed within theinterior 18 of the housing. Theinlet port 14 reaches afirst assay strip 22 and a second assay strip 24 that are supported on theoptical element assembly 58. Each ofdetectors 34, 36, 38, 40 andLED 44 is directly attached toPCB 60. A liquid crystal display (LCD) 62 is also disposed on thePCB 60 and is disposed at a position where the display object is directed through awindow 64 or an opening formed in the outer portion of thehousing 12. Each of theLED 44, the detector 36, and theLCD 62 is connected through thePCB 60. In order to prevent moisture from affecting the shelf life stability or operation of thedevice 10, adesiccant storage 66 may be provided.
One embodiment of a non-instrumenteddiagnostic device 70 having the analytical chemistry strip or transport matrix of the present invention is shown in FIG. Thedevice 70 includes ahousing 72 having a receptacle such as aninlet port 74. Theinlet port 74 extends from the housing surface 76 to its interior so as to receive theanalyte 20 holding one or more analytes to be measured. Theinlet port 74 also allows theanalyte 20 to be introduced into anassay strip 78 that holds a chemical reagent that determines whether one or more selected analytes are present in theanalyte 20.
Once theanalyte 20 has been introduced into theassay strip 78 through theinlet port 74, thereagent analyte 20 chemically reacts with at least one reagent on theassay strip 78 and a mixture of reaction products corresponding to that reagent. Give rise to A portion of the reaction product mixture is conveyed to at least onedetection region 80 on the assay strip, resulting in a physically detectable change that correlates to the amount of selected corresponding analyte in theanalyte 20. Let The color produced in thedetection region 80 can then be compared to thecolor bar 82 or other criteria to visually determine whether the selected analyte is present and its concentration.
The present invention changes the capture efficiency over the detection region toward the flow direction of the analyte on the transport matrix, resulting in a uniformly distributed state of the change that can be physically detected or changed, but still in the predetermined distribution state To realize. Unless otherwise specified, the term “squeezing the detection region” means the direction of flow of the specimen. The term detection area shall mean an area measured by visual observation or by a measuring instrument to know a physically detectable change.
As used herein, the term predetermined distribution can include any selected pattern that is uniform or varied over the detection area. The term “predetermined distribution state” specifically includes an example in which the distribution state is substantially uniform over the detection region. It may be desirable to change the distribution of physically detectable changes across the detection region. One reason for doing this is to correct or correlate reflectometer optics with varying or non-uniform sampling areas.
The distribution state of the physically detectable change is controlled by the distribution state of the capture reagent. The capture reagent is combined with a signal generating reagent, which can provide a physically detectable change through reaction with the analyte or other selected reagent. The distribution state of the capture reagent can be changed depending on the concentration or application (attachment) density of the capture reagent on the transport matrix. Making the capture matrix a predetermined distribution state on the transport matrix can be realized through physical or chemical methods described below.
The present invention provides assays that can use specific binding elements. As used herein, a specific binding member or capture reagent is a specific pair of binding members. That is, two different molecules where one of the molecules specifically binds to the second molecule through chemical or physical means. For this reason, in addition to specific binding pairs of antigens or antibodies in general immunoassays, other specific binding pairs include biotin and avidin, carbohydrases and lectins, complementary nucleotides. Sequences, effector and receptor molecules, cofactors and enzymes, enzyme inhibitors and enzymes and the like can be included. Furthermore, a particular binding pair can include an element that is an analogue of the original particular binding element, such as, for example, an analyte analogue. Specific binding elements that are immunologically reactive include both monoclonal and polyclonal antigens, antigenic fragments, antibodies, antibody fractions and complexes thereof, wherein the complex comprises recombinant DNA Includes those formed by molecules. As used herein, the term hapten means a partial antigen or non-protein binding element that can bind to an antibody but cannot manifest the formation of the antibody unless bound to a carrier protein. It shall be.
The present invention preferably uses a particle detection method for each physically detectable change or detectable response associated with the concentration of the analyte in the specimen within each test area. Other means for producing a physically detectable change in the test area are also suitable for use in the present invention. For example, but not limited to, an analyte can be identified with an indicator to measure electrical conductance, or reflection and absorption at a particular wavelength of light. As used herein, the terms signal-generating reagent and indicator can identify an analyte or conjugate thereof and generate a detectable response or signal indicative of the concentration of the analyte in the sample. It is meant to include all possible compounds.
As used herein, an analyte is a substance to be detected that will be present in a test sample. This analyte can be a naturally occurring specific binding element (such as an antibody) or any substance capable of forming a specific binding element. Thus, an analyte is a substance that can bind to one or more specific binding elements in an assay. Analytes can also include any antigenic material, hapten, antibody, macromolecule and combinations thereof. To measure vitamin B12, use a naturally occurring congener of a specific binding pair, such as using a protein of an intrinsic factor as a member of a specific binding pair, or to measure a carbohydrase By using a lectin as one element of a binding pair, the analyte can be detected as one element of a specific binding pair. The analytical substances include proteins, peptides, amino acids, hormones, steroids, vitamins, drugs that are administered for therapeutic purposes and drugs that are administered for illegal purposes, bacteria, viruses and any substances mentioned above Metabolites or antibodies. In particular, such analytes include, but are not limited to, the following: Ferritin, creatinine, kinase MB (CK-MB), digoxin, phenytoin, phenobarbital, carbamazepine, vancomycin, gentamicin, theophylline, valloecic acid, quinidine, luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH), estradiol, Progesterone, IgE antibody, vitamin B2 microglobulin, glycated hemoglobin (Gly.Hb), cortisol, digitoxin, N-acetylprocainamide (NAPA), procainamide, IgG rubella, antibodies against rubella such as IgE rubella, IgG toxoplasma (Toxoplasma) -IgG) and antibodies against Toxoplasma such as IgM Toxoplasma (Toxo-IgM), testosterone, salicylate, acetaminophen Hepatitis B core antigens, such as anti-hepatitis B core antigen IgG and IgM (anti-HBC), human immunodeficiency viruses 1 and 2 (HIV 1 and 2), human T cell leukemia virus 1 and 2 (HTLV), B Hepatitis B antigen (HBAg), antibody against hepatitis B antigen (Anti-HB), thyroid stimulating hormone (TSH), thyroxine (T4), total triiodothyronine (Total T3), free total triiodothyronine (Free T3) ), Fetal cancer antigen (CEA) and alpha fetal protein (AFP). Narcotics and reference materials include, but are not limited to: That is, barbitarates such as amphetamine, methamphetamine, amobarbital, secp barbital, bentbarbital, phenobarbital and barbital, benzodiazepines such as ribulium and barium, cannabinoids such as hashish and marijuana, cocaine, fentanyl, LSD , Opiates such as metaqualone, heroin, morphine, codin, hydromorphone, hydrocodone, methadone, oxycodone, oxymorphone and opium, phenylcyclidine, and propoxyphene. Details regarding the formation of such antibodies and their eligibility for use as specific binding members are well known to those of skill in the art.
The analyte to be tested can be obtained from any biological source such as a physiological fluid including: That is, it may contain whole blood or whole blood components including red blood cells, white blood cells, platelets, serum and plasma, ascites, urine, sweat, milk, synovial fluid, peritoneal fluid, amniotic fluid and the analyte of interest. It is another component of a body. Test specimens can be pre-treated before use, such as by forming plasma from blood and diluting viscous fluids. This treatment method can include filtration, distillation, concentration, inactivation of interfering compounds, and addition of reagents. In addition to physiological fluids, other liquid samples such as water, food products, etc. can also be used to perform environmental or food manufacturing assays. Furthermore, a solid material suspected of containing an analyte can be used as a test specimen. In some cases, it may be advantageous to modify the solid test analyte to form a liquid medium or release the analyte. The analyte can have any compound or composition to be detected or measured, or have at least one epitope or binding moiety.
In general, the present invention immobilizes capture reagents in a non-diffusing state on a solid phase support, ie, a transport matrix, that provides a region in the path for analyte flow. The transport matrix can be any solid material that can immobilize the capture reagent, such as beads, magnetic particles, paramagnetic particles, micro or macro particles, slides made of glass or other transparent material, Including but not limited to capillaries and test tubes, woven or molded fabrics or meshes, and microtiter rates. Such solid phase supports can be formed of synthetic materials, natural materials or synthetically modified natural materials and include, but are not limited to: Paper, cellulose and cellulose derivatives such as cellulose acetate and nitrocellulose, fiberglass, natural fabrics such as cotton, synthetic fabrics such as nylon, porous gels such as silica, agarose dextran and gelatin, porous Fibrous materials, starch-based materials such as cross-linked dextran chains, ceramic materials, polyvinyl chloride, polyethylene, polyvinyl acetate, polyamide, polycarbonate, polystyrene, vinyl acetate and vinyl chloride copolymers, polyvinyl chloride-silica It is an olefin or thermoplastic material including a combination.
The assay device of the present invention can take many forms, some of which are specifically described herein. These assay devices use a transport matrix that is a porous material or wicking member. By the term porous is meant a material that supports the capture reagent so that the test specimen can be easily passed through and exposed to the test specimen. This transport matrix includes, but is not limited to, both water-absorbing and non-water-absorbing solid phase materials. In the present invention, the transport matrix is a fiberglass, cellulose or nylon pad for use in an injection and flow-through assay device having multiple layers for multiple analyte reagents, or for thin layer chromatography. Test strips for capillary action (eg, nitrocellulose) technology, or can include porous or open pore materials (eg, sintered polyethylene sheet materials) well known to those skilled in the art.
The present invention provides a matrix that is used to transport specimens across a calibration test portion for instrument-free or instrument-based assays to generate qualitative or quantitative results To do. Referring to FIG. 4, the preferred embodiment of the present invention provides the lateralflow assay strip 22 of FIG. Theassay strip 22 has three regions, the twodetection regions 26 and 28 being a test region, and one of the test regions being a reference region. In thefirst region 25, the specimen is treated with a chemical reagent. Thefirst detection region 26 generates a signal having an intensity that is inversely proportional to the concentration of the analyte, and the second detection region 28 serves as one reference and generates a signal that is directly proportional to the concentration of the analyte. Let The total value of the signals from thefirst detection region 26 and the second detection region 28 is substantially equal at all concentrations of the analyte. A quantitative or qualitative result can be obtained by reading the intensity of the color in thefirst detection area 26, the second detection area 28 or both the first andsecond detection areas 26, 28 with a measuring instrument. . In addition, the result expressed by any one test partial region can be obtained as a ratio of the total value of the actual results expressed by both detection regions. A reference value of quality can be obtained by reading both detection areas with a measuring instrument. The sum of readings in both detection areas must be approximately constant within a specific range.
The embodiment of FIG. 4 is an example of two preferred forms including an antagonistic form and an inhibitory form. The present invention is not limited to these examples and is suitable for use in other immunoassays such as, for example, a sandwich type immunoassay.
When using the antagonistic form, thefirst region 25 is provided with a water-absorbing material comprising a particle-linked antigen immobilized in a diffuse manner. Thefirst detection region 26 is independent and remote from thefirst region 25 and is located at a distance toward thedistal end 29 of thetransport matrix 22. Thefirst detection region 26 has a water-absorbing material containing an antibody immobilized in a non-diffusive state, and this antibody can bind a particle-linked antigen and a free specimen antigen.
The second detection region 28 is independent and remote from thefirst detection region 26 and is located at a distance from thefirst detection region 26 toward theend 29 of thetransport matrix 22. . The second detection region 28 has a water-absorbing material including a first element fixed in a non-diffusive manner with a specific binding pair. This first element can specifically bind to its specific binding partner, which is the second element of a specific binding pair on the surface of the particle-linked antigen. This second element of the specific binding pair is not antigenically related to the antigen of the analyte, so this second member effectively antagonizes the antigen to bind to the anti-antigen monoclonal antibody. do not do.
The specimen is applied to thetransport matrix 22 at the application location, that is, thefirst region 25. The particle-linked antigen is placed at or near the application site. The specimen containing the specimen antigen reconstitutes the dried particle antigen conjugate by melting or dispersing the conjugate. The conjugate-bound and free analyte mixture moves via the water-absorbing wicking action to reach thefirst detection region 26 where free antigen and particle conjugate binding. The antigens thus antagonized to become non-diffusible immobilized antibodies in this region. The part of the particle-conjugated antigen that binds to the non-diffusible antibody (for example, 0% to 100%) is retained in thefirst detection region 26. The antigen-particle conjugate that does not bind to thefirst detection region 26 moves to the second detection region 28. In this second detection region, substantially all the part of the particle-conjugated antigen that was not held in thefirst detection region 26 is in the non-diffusive state of the specific binding pair in the second detection region 28. The first member is fixed to the first member.
In the case of using the inhibitory form, thefirst region 25 has a water-absorbing material containing a diffusion-fixed and particle-linked antibody capable of binding the analyte antigen. Thisfirst detection region 26 is separated from thefirst region 25 and is located at a distance toward thedistal end 29 of the absorbent strip. Thefirst detection region 26 has a water-absorbing material containing a non-diffusible immobilized antigen to which a particle-linked antibody can bind.
The second detection region 28 is separated from thefirst detection region 26 and is located at a distance toward thedistal end 29 of the absorbent strip. This second detection region 28 includes a non-diffusible first element of a specific binding pair that can specifically bind to that specific binding partner. The specific binding partner is the second element of a specific binding pair on the surface of the particle-linked antigen. This second element of a particular binding pair is not antigenically related to the antigen of the analyte, so that the binding pair effectively binds the antigen to bind to the anti-antigen monoclonal antibody. There is no antagonism.
The fluid specimen is applied to thetransport matrix 22 adjacent to thefirst region 25 where the particle-linked antibody is placed. The analyte antigen that would be present in the analyte reconstitutes the particle-antigen conjugate and is bound by the conjugate. The bound antigen: antibody-particle complex and unbound antibody-particle complex are transported or migrated to thefirst detection region 26 via capillary action, i.e. wicking action, in this first detection region, Nearly all of the free antibody-particle conjugate is bound by the non-diffusible immobilized antigen. The bound antigen: antibody-particle complex of the analyte migrates through thefirst detection region 26 to the second detection region 28, where almost all of it is in a non-diffusible state of the specific binding pair. The first member is fixed to the first member.
In the embodiment described above, the degree of the physically detectable change present in thefirst detection region 26 is the reciprocal of the concentration of the analyte in the sample, and the physically detectable change in the second detection region 28. Is a direct measure of the analyte concentration of the sample. The physically detectable change combined from thefirst detection region 26 and the second detection region 28 is substantially constant over the entire range of analyte concentrations of the analyte. This overall detectable response or signal serves as a reference mechanism for both the assay and reagent quality. Thus, if the overall signal is below a certain range, the user knows that it is an error. Furthermore, the specific reason for the inaccurate assay can be clarified. For example, this error can be manifested as operating outside a specific temperature / humidity range, an insufficient amount of analyte, a reagent usage period has elapsed, and the like.
The quantification of the assay can be determined by reading both thefirst detection area 26, the second detection area 28, or both the first andsecond detection areas 26,28. The analyte concentration output is the result of the calibration algorithm associated with thefirst detection region 26 alone, the second detection region 28 alone, or both thefirst detection region 26 and the second detection region 28. As a result, a more reliable result of quantitative analyte concentration can be obtained. By adding together the detectable responses, i.e. signals, from thefirst detection region 26 and the second detection region 28 so that a substantially constant overall signal can be generated regardless of the concentration of the analyte. Provides a reference mechanism for performing an accurate assay.
In one preferred embodiment, the form of the transport matrix provides the desired number of regions and (a) the desired binding reaction is completed in a reproducible manner, (b) physically It can be of any dimension that allows detection of detectable changes or reaction indications. The transport matrix of the present invention preferably has a total length of about 100 mm or less and a width of about 6 mm, more preferably a length of about 10 mm to about 40 mm, and a width of about 1 mm to about 5 mm. This transport matrix is conveniently integrated into any reflected light meter and is disposable such as described in the above-mentioned related applications, the contents of which are incorporated herein by reference. More preferably, it is integrated with an electronic test apparatus. While the chemistry and form of the present invention can be used in an integrated assay device, the present invention should be used with any other instrumented reflectometer or transmission meter as a replaceable reagent. Can do.
The transport matrix can comprise a plurality of regions along its length. The region can hold reagents bound in a diffusive or non-diffusive manner. Each of the regions can be about 0.1 mm to about 10 mm wide, more preferably about 0.25 mm to about 5 mm wide. There should be at least two regions, up to about 10 or more regions, corresponding to the number of assays performed on one transport matrix.
The transport matrix can be one continuous part of water-absorbing material or it can be composed of 1, 2, 3 or more parts. Each of the regions can be an independent water-absorbing material, in which case each of the regions is in fluid communication with adjacent regions or two or more adjacent regions use a common material. Other regions may be made of different materials. The transport matrix containing each of the regions can be formed of the same or different water absorbing material. This water-absorbing material allows fluid communication between various areas, spacers (if present), and specimen application locations by a wicking action, ie capillary action, when a fluid specimen is applied. .
In a preferred embodiment, the transport matrix has a water-absorbing base layer, and an identifiable capture reagent is fixed to the water-absorbing base layer in a diffusive or non-diffusive manner. Non-diffusible immobilization can be performed by absorbing, adsorbing, cross-linking or covalently binding the capture reagent to the water-absorbing base layer.
Diffusive immobilization involves formulating the analyte reagent to be immobilized (eg, water, C, along with any desired additives).₁-C_FourApplying the resulting formulation to the water-absorbing material of the membrane, filter or transport layer at the desired location, by melting in a suitable solvent such as alcohol or mixtures thereof, and drying the material Can be done. Suitable additives can include detergents, proteins, blocking agents, polymers, sugars and the like. Alternatively, the additives and assay reagents are applied to the film, filter or transport layer by pre-coating with a “blocker”, a water soluble polymer, sugar or detergent, followed by a conjugate or conjugate. The preparation may be applied and the material may be dried. Diffusional immobilization allows the reagent to be rapidly reconstituted and moved through the water-absorbent substrate, whether it is reacted or unreacted. Non-diffusible immobilization can be performed by covalently binding the capture reagent to the transport matrix and adsorbing or absorbing it.
The region includes, but is not limited to, antibodies, antigens, enzymes, substrata, small molecules, proteins, recombinant proteins, viruses or bacterial lysates, receptors, sugars, carbohydrates, PVA and detergents. Without limitation, reagents bound diffusively or non-diffusively can be retained.
Referring to the preferred embodiment of thetransport matrix 22 illustrated in FIG. 4, thefirst detection region 26 and the second detection region 28 have a leading edge boundary 100 and a trailingedge boundary 102. In each of thedetection regions 26 and 28, a distribution state of a predetermined attached portion is shown as a pattern 106 ofcapture reagent dots 104. The printed pattern 106 increases the density of thedots 104 across each of thedetection regions 26 and 28 from the leading edge boundary 100 to the trailingedge boundary 102 in the specimen flow direction indicated by thearrow 108. It is preferable that the density of thedots 104 from one side portion 110 to the opposite side portion 112 of each detection region is substantially uniform. The capture efficiency of the pattern 106 illustrated in FIG. 4 effectively increases at a substantially constant rate across each of thedetection regions 26, 28 to provide a uniform gradient.
Thedots 104 in the pattern 106 are mechanically or physically applied to thetransport matrix 22 using a conventional ink jet printer. Other applicators suitable for use with the present invention include, but are not limited to, fountain pens, pad printers, pipettes, air brushes, metering and dispensing pumps, and dispensing devices. Also suitable are other applicators that supply reagents accurately measured over an appropriate area of a predetermined distribution. Thedots 104 can be any shape or size, and these dimensions can be varied within the pattern 106.
Another embodiment of the present invention is to physically apply thecapture reagent dots 104 in a predetermined distribution state in a uniform pattern 114 within thedetection region 26, as shown in FIG. is there. The printed uniform pattern 114 increases the concentration of the capture reagent in each dot 104 across thedetection region 26 from the leading edge boundary 100 to the trailingedge boundary 102 in the direction of specimen flow, as indicated by thearrow 108. Let As a result, the concentration of the capture reagent of each dot 116 is lower than that of thedot 118.
Another preferred embodiment illustrated in FIG. 6 transports the capture reagent in a series ofstripes 120 across thedetection region 26 from the leading edge boundary 100 to the trailingedge boundary 102 toward theanalyte flow direction 108. Thepattern 122 having a predetermined distribution state is formed by being attached to thesubstrate 22. Thestripe 120 preferably extends over the width of the detection region perpendicular to the flow direction of the specimen. The frequency of the series ofstripes 120 changes over thedetection region 26. In this embodiment, the concentration of capture reagent in each of thestripes 120 is approximately equal. The capture efficiency of thepattern 122 increases as the frequency of thestripes 120 increases. The capture efficiency of the pattern illustrated in FIG. 6 effectively increases at a substantially constant rate across thedetection region 26 to provide a uniform gradient.
Thestripes 120 in thepattern 122 are mechanically or physically applied to thetransport matrix 22 using a printer, airbrush, metering dispense pump and dispenser, pipette, and the like. Thestripe 120 can have any width, and the width can be changed in thepattern 122. Alternatively, the chemical content, or concentration, of the capture reagent in each of thestrips 120 may vary along thepattern 122.
Another embodiment of the present invention combines changing the frequency and density of a series ofstripes 120 to form a pattern 124 having the predetermined distribution shown in FIG. The capture efficiency of the pattern 124 effectively increases from the leading edge boundary 100 toward the middle of thedetection region 26 and then effectively decreases toward the trailingedge region 102 to disclose the non-uniform slope. The various aspects of the present invention are clarified.
The embodiment illustrated in FIG. 8 provides a predetermined distribution that increases the concentration and / or density of capture reagents that can form a pattern 126 across thedetection region 26 from the leading edge boundary 100 to the trailingedge boundary 102. . The first stripe 128 substantially covers thedetection region 26. The second stripe 130 partially overlaps the first stripe 128 but leaves one region where only the first stripe 128 exists. In a similar manner, anotherstripe 132 partially overlaps the first stripe 128 and the second stripe 130, but only the first stripe 128 and only the first stripe 128 and the second stripe 130. Leave one area that exists. As a result, the formed pattern 126 becomes a cascade of overlapping stripes. The concentration of the capture reagent increases in the region where the stripes overlap sequentially. If the concentration of capture reagent is equal in each ofstripes 128, 130, 132, the overlapping area doubles and triples the concentration of capture reagent. It is also appropriate to vary the amount of capture reagent in each of the stripes.
Examples of patterns imparted to the transport matrix are illustrated in FIGS. 4-8, but the present invention is not limited to the particular shapes of deposits illustrated, such as dots and stripes, and its design It should be understood that the present invention is not limited to any particular frequency or size.
One preferred chemical method of the present invention for applying capture reagents is to print a pattern representing a predetermined distribution of capture reagents on a transport matrix using a conventional printer. The printed pattern is then processed to adjust the efficiency of the capture reagent and effectively bind to the analyte or conjugate thereof, thereby modifying the capture reagent effect in a predetermined distribution. Let For example and without limitation, the capture efficiency of a capture reagent can be adjusted by using a blocking reagent that binds to the capture reagent or analyte and binds to the analyte or conjugate thereof. The function of the capture reagent can be effectively reduced.
Two forms of one preferred embodiment for chemically adjusting the efficiency of the capture reagent are shown in FIG. One form is for applying the blockingreagent 134 in the region 136 in front of thedetection region 26 along the flow direction of the specimen as indicated by thearrow 108. The region 136 holding the blocking reagent can be separate from thedetection region 26 or can overlap the leading edge boundary 100. Next, the blockingreagent 134 is dispensed as the specimen flows across thedetection region 26. Alternatively, the blockingreagent 134 may be dispensed across thedetection region 26 before applying the specimen to the transport matrix. A solution capable of diffusing the blockingreagent 134 can be used to treat thetransport matrix 22 prior to exposure to the analyte, such as during manufacture of thetransport matrix 22.
A second form of one preferred embodiment that chemically adjusts the efficiency of the capture reagent provides a blockingreagent 134 in a second predetermined distribution pattern over thecapture reagent pattern 138. Is for. The predetermined distribution of the capture reagent shown inpattern 138 is a uniform series of stripes 140. The second pattern of the blockingreagent 134 is a predetermined distribution state in which the concentration and / or density of the blockingreagent 138 decreases from the leading edge boundary 100 to the trailingedge boundary 102 of the second detection region 28. The type of blockingreagent 134 is selected to bind to either the analyte or the capture reagent in order to reduce the effectiveness of the capture reagent that binds to the analyte. As specifically illustrated, an increasing capture efficiency gradient from the leading edge boundary 100 to the trailingedge boundary 102 is formed by the blockingreagent 134 interacting with either the capture reagent or the analyte.
The blocking reagent can be either specific or non-specific in terms of its blocking effect on the capture reagent or analyte. Examples of non-specific blocking reagents include polymers and particles. Specific blocking reagents include antibodies and antibody conjugates with polymers or particles, where the larger the particle size, the slower its diffusion rate. Other specific blocking reagents include antigens and antigen conjugates with various sized polymers or particles.
The swelling material can be used as another way to change the concentration of the capture reagent and thus change the capture efficiency of the detection region in a given distribution. Prior to attaching the capture reagent to the transport matrix, the swelling material can be combined with the capture reagent as part of the initial matrix. When the blocking material is deposited with the capture reagent on the transport matrix, the swelling material functions as a non-specific blocking reagent for the capture reagent.
As shown in FIG. 10, a simplified diagram showsmaterial 144 for increasing the bulk mixed withcapture reagent 146 prior to attachment to transportmatrix 22. The bulking material 148 is also shown, and this bulking material 148 is non-specific at thecapture reagent 146 binding site compared to thespecific blocking reagent 150 on the individual capture reagent binding site. Used as an effective blocking reagent.
Another method for changing the capture efficiency of the detection region to form a predetermined distribution of physically detectable changes is also shown in FIG. In this embodiment, the detection region 28 can be coated with or impregnated with a diffusion control material that alters theanalyte flow 108 across the detection region 28. If the diffusion rate of the specimen over the detection region 28 is adjusted, the binding time with the capture reagent becomes longer or shorter. Accordingly, the capture efficiency of the capture reagent is also adjusted accordingly. By way of example and not limitation, a diffusion control material suitable for use with the present invention is dextran. Other suitable diffusion control materials include, but are not limited to, polyethylene glycol and other polymeric materials that are soluble in the analyte matrix.
For certain types of assays, such as NTx® (Ostex International), a blocking reagent that competitively binds the capture reagent may be added to region 128 beforedetection region 26. it can. Antagonistic blocking reagents tend to diffuse with the analyte and reduce capture efficiency. As an antagonistic blocking reagent diffuses across thedetection region 26, its concentration decreases, increasing the capture efficiency of the capture reagent and creating an inverse gradient. Embodiments of this method are suitable for use with other assays, and suitable antagonistic blocking reagents include but are not limited to salts such as sodium chloride, urea and chaotropes. It is not limited.
Analytes, such as NTx®, can be made insensitive by adding synthetic peptide analogs or other analytes to thetransport matrix 22 before thedetection region 26. This reduces the capture efficiency at the leading edge boundary of the detection region. The capture efficiency then increases as the analyte receives less antagonism from the peptide analog and becomes more sensitive to binding with the capture reagent. When the analyte is at a low concentration, the initial sensitivity is low at the bottom of the calibration curve for the chemical response for a particular assay. By adding a predetermined small amount of analyte to diffuse along the transport matrix before or at the same time as the sample, the sensitivity of the assay is further adjusted along the calibration curve. It becomes a part with higher sensitivity.
The present invention also utilizes an aggregate value that measures a physically detectable change over two or more regions to produce a “hook effect” in this embodiment. It also provides a way to minimize the high concentration of toxic effects. Referring again to FIG. 9, collection regions orstripes 142 are optionally added to thetransport matrix 22. Thecollection region 142 contains a collection reagent fixed therein, and this collection reagent binds an excess analyte exceeding the capture efficiency of thefirst detection region 26. This collection reagent binds to the latex. This latex would otherwise bind in the second detection region 28 and inaccurately add up the measured values of physically detectable changes in thefirst detection region 26 and the second detection region 28. It is what shall be. Using this embodiment of the present invention, the total value of the measured values that are below a predetermined minimum value is identified as a result of the analyte concentration being above the range to be measured by the device.
Another embodiment of the present invention that uses different configurations for the transport matrix other than those described above is shown in exploded view in FIG. The transport matrix 152 is arranged in a layered stacked form. An analyte 154 to be analyzed for one or more selected analytes is applied to the first layer 156 of water-absorbing material, which can be left untreated or in FIG. Reagents for processing the specimen can be included as was done by thefirst region 25. Next, the specimen 154 flows to thelayer 160 in the direction of the arrow 158. Thislayer 160 is the leading edge boundary of the detection region 162. Thelayer 160 holds a capture reagent fixed in a non-diffusive manner therein. Similarly, each of thelayers 164, 166, 168 independently holds a capture reagent that is non-diffusively immobilized therein, and the amount of this capture reagent increases increasingly. Thus, the concentration and / or density of the capture reagent increases fromlayer 160 to layer 168 over the detection region 162. In operation, the specimen is drawn sideways fromlayer 160 to layer 168 across the detection region 162. Thesides 172 of thelayers 160, 164, 166, 168 are illuminated by alight source 170 from a conventional reflectometer and reflect the light rays to thedetector 174 in a diffuse manner. By increasing the number of layers of water absorbent material, more detection areas can be added to the transport matrix 152.
Another embodiment of the present invention is shown in FIG. 12, which uses a different form for the transport matrix other than the examples described above. Thetransport matrix 180 is held in anenclosure 182 such as a capillary. Thetransport matrix 180 has a solid layer support 184 filled within the enclosure. Within the first detection region 186 and thesecond detection region 188, the solid layer support 184 has a capture reagent 190 immobilized thereon. The specimen is introduced into theenclosure 182 through theinlet port 192 and flows or sucks up theenclosure 182 in the direction of thearrow 194. Physically detectable changes in thedetection areas 186, 188 are illuminated by thelight source 200 through thetransparent portion 202 of the enclosure wall. The diffusely reflected light is measured bydetector 204.
In one form of FIG. 12, the amount of capture reagent 190 is evenly distributed over the detection regions 186,188. Theenclosure 182 includesregions 196, 198 that hold the blocking reagent, which is used when transported across therespective detection regions 186, 188 before the sample flows. The distribution state of is made predetermined.
In one alternative form shown in FIG. 12, capture reagent 190 is filled intoenclosure 182 to change the amount of capture reagent over eachdetection region 186, 188 to provide a predetermined predetermined amount. A distribution state is formed immediately. As a result, theregions 196 and 198 are unnecessary.
The form of the transport matrix shown and described herein can be formed by several assembly methods. Conventional methods of immersing the transport matrix in a solution containing the reagents and then drying are suitable for use in part of the present invention. In such a complex method, a substantially uniform layer or coating of reagents is first applied to the transport matrix. The uniform adhesion state is then changed by depositing a pattern of the second reagent over the first reagent or in front of the first reagent in a region on the transport matrix. This method can be used as a first reagent with a capture reagent and a diffusion control reagent. A blocking reagent can be used as the second reagent. The following experimental examples illustrate the details of these methods.
Having described the invention in its entirety, a further understanding will be gained by reference to the following specific examples which are provided herein for purposes of illustration only and are not intended to limit the invention. Is possible.
Experimental example 1
In practicing the present invention, the following strip assembly and capture reagent immobilization method was used. The example test strip uses a double-sided or transfer adhesive to connect the water-absorbent material to a sheet of polyvinyl acetate (0.014 inches thick) to the plastic backing material. It was produced by stacking.
A card of polyvinyl acetate sheet (thickness 0.254 mm (0.01 inch)) was cut to about 2.3 cm × 10 cm. The dimensions of this card were changed corresponding to the desired dimensions of the test card. The polyvinyl acetate backing was labeled with a pencil line along its length at the appropriate location indicating the location of the various assay strip regions. A double-sided adhesive such as 3M465 was applied to the polyvinyl acetate so that the surface was covered with a pencil line, and a strong pressure was applied by the roller assembly to ensure that no bubbles were generated. Remove the double-sided adhesive release liner, guide with pencil lines, apply the transport matrix or paper test part in the correct position, and apply strong pressure by the roller assembly to ensure no bubbles I did it. Care was taken to ensure that each part of the water-absorbing assay matrix was in fluid communication with its adjacent parts. Finally, the individual assay strips were cut along the length of the card to a width of 0.03 cm each, resulting in an assay strip 2.3 cm long × 0.3 cm wide. This was done using a die cutter or a standard paper cutter.
In the case of the blocking reagents listed in Table 1, the blocking reagent is covalently bound to latex microsphere particles having a desired size range of about 0.1 μm to about 20 μm, and these particles are aspirated into the transport matrix by capillary action. did. This microsphere particle method was performed by first immobilizing a desired blocking reagent so as to be covalently bound to a microsphere having a carboxyl functional group as follows. That is, for a suspension of 0.4 μm microsphere-COOH (for example, Burns Laboratories), pH 6, 50 mM 2- (N-morphine) ethane sulfonic acid buffer (MES, Sigma M- 5287), 1.1 molar equivalent of 1-ethyl-3- (dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC, Sigma E0388) and 1.1 molar equivalent of N-hydroxytoxidiimide (NHS, Pierce 24500) were added at room temperature. And stirred for 30 minutes. The suspension was then centrifuged and washed in MES to remove excess NHS and EDAC. Thereafter, the desired blocking reagent was added with 50 mM sodium borate, pH 8.5 (this protein is a 10-fold molar excess over the COOH sensitive group on the bead surface) and allowed to react at room temperature for 2 hours, Next, it was purified by centrifugation, and then washed and centrifuged again. At this time, the microsphere particles had the desired blocking reagent immobilized by covalent bonding. The blocking reagent-particle suspension was mixed and a 2-10 μL sample was taken using a pipette and immediately placed on the transport matrix in front of the capture reagent.
To make an antigen conjugate to the capture reagent, mouse IgG or bovine IgG (BgG) at a molar ratio of 50: 1 in 50 mM phosphate (PBS) at pH 7.2, 0.15 M NaCl, and succinimidyl- It was activated by reacting with 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC, Pierce No. 22320) at room temperature for about 60 minutes. IgG added with maleimide was allowed to flow down through a Sepadex G15 (10 ml) column equilibrated with 50 mM sodium phosphate and 1 mM EDTA, pH 7.0. C-peptide (synthetic antigen obtained from Ostex International) was added to maleimide-added IgG in 50 mM sodium phosphate and 1 mM EDA, pH 7.0 at a molar ratio of 50: 1 (c-peptide: IgG). In addition to droplets, the reaction was allowed to proceed at room temperature for about 2 hours. Thereafter, the mixture was allowed to flow downward through a Sepadex G25 column equilibrated with PBS at pH 7.2 to remove unreacted synthetic antigen. The ratio of c-peptide: IgG was changed to obtain the materials listed in Table 1.
In order to treat the transport matrix with anti-NTx (Mab1H11), BSA or BgG, the detection matrix was arranged so as to form a single stripe having a width of about 1.5 mm. At this time, a striper, a bio-line (registered trademark) programmable dispensing device manufactured by the IMECA Group of Carlsbad, California, was used. The striper is fitted with two Digipense 2000 pumps manufactured by IVEK Corporation of VT's North Springfield. For treatment with C-IgG, the same striper was used to attach the two ratios listed in Table 1 as two separate stripes, each about 0.75 mm wide, over the detection area. The density of the reflected light of the stripe was measured at the leading edge boundary (L) and trailing edge boundary (T) of the detection region (region).

The reflection densities listed in Table 1 were measured with a hand-held reflection densitometer manufactured by Gretag, using a measurement area of about 1 mm diameter. In order to demonstrate the function of the present invention to provide a more uniform distribution of physically detectable changes across the detection area, other than the control, three analytes of NTx® are listed as one analyte. Six different distributions of capture reagent with different concentrations were used. The ratio is significantly smaller, as evidenced by the reflection density measured at the leading and trailing edge boundaries of the detection region, indicating a more uniform distribution of physically detectable changes.
Experimental example 2
According to the same strip assembling method used in Experimental Example 1, a gradient line control line and three different combinations were formed. Non-diffusible immobilization using the Ink Jet Printer Series 810 dispensing device and CorelDraw software manufactured by Snaergy Research, West Lebanon, NH, to ensure proper transport matrix The various capture reagents listed in Table 2 and their concentrations were accurately measured on the detection areas. In this case, the capture reagent solution was diluted with 0.15 M NaCl in a range of 0.01 mg / mL to 10 mg / mL in 50 mM phosphoric acid (PBS) at pH 7.2 and introduced into the application device. The applicator was then placed on the appropriate detection area and the anchoring material was printed as a single stripe or as a series of separate stripes with increasing dot distribution frequency over the detection area. The width of the separate stripes was about 0.25 mm to about 5 mm, preferably about 0.5 to about 1.5 mm. The transport matrix was then dried for 10 minutes at 45 ° C. until dried. The transport matrix was washed and applied with 1% polyvinyl prolysine and then dried again.
Table 2 shows the measurement results of the reflection density at the leading edge boundary and the trailing edge boundary of the detection region for each pattern of the gradient of the dot matrix at three different densities of NTx (registered trademark). The first two gradient patterns in Table 2 were formed by a printer that deposits dot density in a continuous gradient. The final treatment was a discontinuous dot density gradient consisting of four separate stripes. Table 2 also shows the effect of a slight difference in the degree of steepness of the gradient, such as a dot density of 0% to 100% versus 20% to 100%.

The opposite density listed in Table 2 demonstrates the ability of the present invention to more evenly distribute physically detectable changes across the detection region. The ratio is significantly smaller, as evidenced by the reflection density measured at the leading and trailing edge boundaries of the detection area, indicating that the physically detectable changes are more evenly distributed. .
Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings. For this reason, it is to be understood that, within the scope of the appended claims, the invention may be practiced otherwise than as specifically described herein.

Claims (8)

Translated fromJapanese

検体中の選択された分析物質の量に相関する物理的に検出可能な変化を検出領域に亙って所定の分布状態にて生じさせる輸送マトリックスにおいて、
検体中の選択された分析物質の量に相関する物理的に検出可能な変化を生じさせる捕獲試薬を有する検出領域を備え、前記検出領域が前記物理的に検出可能な変化が試料採取される領域によって画定され、該検出領域が、検体に最初に出会う前縁境界と、検出領域を亙って輸送された後、検体に出会う後縁境界とを有し、捕獲試薬が、検出領域の前縁境界から後縁境界に変化した所定の分布状態にてマトリックス上にて固定され、
固定した捕獲試薬の所定の分布状態が、捕獲試薬の複数のストライプであり、該複数のストライプが、検体の輸送方向に対して垂直な検出領域の幅に亙って伸長し、その複数のストライプ中のストライプの頻度が検出領域の前縁境界から後縁境界まで増大し、
これによって、前記物理的に検出可能な変化が、前記検体の流れの方向に略均一な分布状態を有し、固定された捕獲領域の前記所定の分布状態が前記捕獲領域の複数の付着物であり、前記複数の付着物の密度が、前記検出領域の前縁境界から後縁境界まで増大する、輸送マトリックス。In a transport matrix that causes a physically detectable change that correlates to the amount of a selected analyte in a sample over a detection region in a predetermined distribution state,
A region comprising a detection region having a capture reagent that produces a physically detectable change that correlates with an amount of a selected analyte in a sample, wherein the detection region is sampled for the physically detectable change And the detection region has a leading edge boundary that first encounters the analyte and a trailing edge boundary that is transported across the detection region and then meets the analyte, and the capture reagent is coupled to the leading edge of the detection region. Fixed on the matrix in a predetermined distribution state changed from the boundary to the trailing edge boundary,
The predetermined distribution state of the fixed capture reagent is a plurality of stripes of the capture reagent, and the plurality of stripes extend over the width of the detection region perpendicular to the transport direction of the specimen, and the plurality of stripes The frequency of the stripes inside increases from the leading edge boundary to the trailing edge boundary of the detection area,
Thereby, the physically detectable change has a substantially uniform distribution state in the direction of flow of the specimen, and the predetermined distribution state of the fixed capture region is a plurality of deposits in the capture region. A transport matrix, wherein the density of the plurality of deposits increases from a leading edge boundary to a trailing edge boundary of the detection region.請求項１に記載のマトリックスにおいて、固定した捕獲試薬の所定の分布状態が、検出領域の前縁境界から後縁境界まで捕獲試薬の濃度を増大させる、マトリックス。The matrix according to claim 1, wherein the predetermined distribution state of the immobilized capture reagent increases the concentration of the capture reagent from the leading edge boundary to the trailing edge boundary of the detection region.請求項１に記載のマトリックスにおいて、固定した捕獲試薬の所定の分布状態が、検出領域の前縁境界から後縁境界まで捕獲試薬の付与密度を増大させる、マトリックス。The matrix according to claim 1, wherein the predetermined distribution state of the immobilized capture reagent increases the application density of the capture reagent from the leading edge boundary to the trailing edge boundary of the detection region.請求項１に記載のマトリックスにおいて、複数のストライプの各々のストライプが、前縁境界から後縁境界までストライプ内の捕獲試薬の濃度を順次増大させる、マトリックス。2. The matrix of claim1 , wherein each stripe of the plurality of stripes sequentially increases the concentration of capture reagent within the stripe from the leading edge boundary to the trailing edge boundary.請求項１に記載のマトリックスにおいて、複数のストライプが互いに重なり合って、前縁境界から後縁境界まで捕獲試薬の濃度を順次増大させる領域の翼列を形成する、マトリックス。2. The matrix of claim1 wherein a plurality of stripes overlap each other to form a cascade of regions that sequentially increase the concentration of capture reagent from the leading edge boundary to the trailing edge boundary.請求項１に記載のマトリックスにおいて、検出領域が、かさを増すための試薬を更に含み、捕獲試薬が、検出領域の前縁境界から後縁境界まで膨張タンパクに対して分布状態が増す共役体を含む、マトリックス。2. The matrix according to claim 1, wherein the detection region further comprisesa reagentfor increasing thebulk, and the capture reagent comprises a conjugate whose distribution is increased with respect to the expanded protein from the leading edge boundary to the trailing edge boundary of the detection region. Contains a matrix.請求項１に記載のマトリックスにおいて、検出領域が、捕獲試薬と反応して、捕獲試薬の少なくとも一部分が更に反応するのを防止する遮断試薬を更に含み、該遮断試薬が、検出領域に亙って不均一な所定の捕獲効率の分布状態とする、マトリックス。2. The matrix of claim 1 further comprising a blocking reagent that reacts with the capture reagent to prevent further reaction of at least a portion of the capture reagent, the blocking reagent over the detection area. A matrix with a non-uniform distribution of predetermined capture efficiency.検体中に選択された分析物質が存在するか否かを判断する輸送マトリックスにおいて、
検体中の選択された分析物質の量に相関する物理的に検出可能な変化を生じさせる捕獲試薬を有する検出領域を備え、前記検出領域が、検体に最初に出会う前縁境界と、検出領域を亙って輸送された後、検体に出会う後縁境界とを有し、前記物理的に検出可能な変化が、前記検出領域に亙って変化した略均一な分布状態にて固定され、
固定した捕獲試薬の所定の分布状態が、捕獲試薬の複数のストライプであり、該複数のストライプが、検体の輸送方向に対して垂直な検出領域の幅に亙って伸長し、その複数のストライプ中のストライプの頻度が検出領域の前縁境界から後縁境界まで増大し、
これによって、前記検出領域の各領域において試料採取された前記物理的に検出可能な変化が略均一であり、前記固定された捕獲試薬の分布状態が前記捕獲領域の複数の付着物であり、前記複数の付着物の密度が、前記検出領域の前縁境界から後縁境界まで増大する、輸送マトリックス。In the transport matrix to determine whether the selected analyte is present in the sample,
A detection region having a capture reagent that produces a physically detectable change that correlates with the amount of a selected analyte in the sample, the detection region comprising a leading edge boundary that first encounters the sample, and a detection region After having been transported over and having a trailing edge boundary that meets the specimen, the physically detectable change is fixed in a substantially uniform distribution that has changed over the detection region,
The predetermined distribution state of the fixed capture reagent is a plurality of stripes of the capture reagent, and the plurality of stripes extend over the width of the detection region perpendicular to the transport direction of the specimen, and the plurality of stripes The frequency of the stripes inside increases from the leading edge boundary to the trailing edge boundary of the detection area,
Thereby, the physically detectable change sampled in each region of the detection region is substantially uniform, the distribution state of the fixed capture reagent is a plurality of deposits in the capture region, A transport matrix wherein the density of a plurality of deposits increases from a leading edge boundary to a trailing edge boundary of the detection region.

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