JP4043312B2 - ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の製造方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の製造方法に関し、更に詳細には、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を用いて、又は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとを併用して糖転移反応せしめ、得られる糖転移物を含有する溶液からの２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸は、特開平３−１３５９９２号公報、特開平３−１３９２８８号公報などに開示されているように、化学式１で示される化学構造を有しており、直接還元性を示さず、安定性に優れ、しかも生体内で容易に加水分解され、Ｌ−アスコルビン酸本来の生理活性を発揮するＬ−アスコルビン酸の糖誘導体である。
【０００３】
【化１】
化学式１：

【０００４】
その工業的製造方法としては、特開平３−１８３４９２号公報に開示されているように、例えば、Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液に糖転移酵素または糖転移酵素とグルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）とを作用させて得られる２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸とともにそれ以外の夾雑物を含有する溶液を原料溶液として、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行ない、この溶出液の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有画分を採取することにより、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有液を製造する方法、更に、これを濃縮して過飽和とし、結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を製造する方法が開示されている。
【０００５】
しかしながら、糖転移酵素または糖転移酵素とグルコアミラーゼとを作用させて得られるＬ−アスコルビン酸糖誘導体は、例えば、糖転移酵素がシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１９）（以下、本明細書では、ＣＧＴａｓｅと略することもある。）の場合には、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸以外に、副生成物として、その結合異性体である５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸（化学式２）及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸（化学式３）が生成し、また、糖転移酵素がα−グルコシダーゼの場合には、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸以外に、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸が生成することが知られている。強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーの際、原料溶液に含まれるＬ−アスコルビン酸やグルコースは２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸と分子量が異なるために２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸と分離が比較的に容易であるが、一方、副生成物として生成した５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸は２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸と分子量が同一であるために２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸と分離が困難であり、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有画分の純度向上を妨げ、更に、過飽和溶液からの結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の析出をも阻害する。
【０００６】
【化２】
化学式２：

【０００７】
【化３】
化学式３：

【０００８】
更に、これら結合異性体である５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸は、結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を分離除去した母液中に残存し、この母液からの更なる結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の析出を阻害し、２番晶、３番晶の回収量を著しく低下させる。
【０００９】
５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の除去方法としては、特開平５−１１７２９０号公報に開示されているように、これら結合異性体が直接還元性を有するため酸化されやすいという特性を利用して、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸とともにこれら結合異性体とを含有する溶液を酸化処理して、直接還元性を示す結合異性体だけを酸化せしめ、次いで、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行なうことにより、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸とＬ−アスコルビン酸糖誘導体の酸化物（以下、単にＬ−アスコルビン酸糖誘導体酸化物と略称する。）とを分離し、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物を製造する方法が開示されている。
【００１０】
しかしながら、上記のようにして、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸とともにこれら直接還元性を示す結合異性体を含有する溶液を酸化処理するには、できるだけ、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸に作用することなく、直接還元性を示す結合異性体を優先的に酸化する条件が必要で、例えば、通気攪拌などの好気的条件にさらす方法が採用され、この際、ｐＨを弱酸性乃至アルカリ性にしたり、銅塩、鉄塩などの金属塩、水蒸気炭、塩化亜鉛炭などの活性炭など酸化促進剤を共存させたり、過酸化水素、過マンガン酸カリウムなどの酸化剤を添加するなど操作が煩雑で、また、酸化反応が不十分であれば、直接還元性を示す結合異性体が残存し、酸化反応が過度であれば、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸にまで作用が及び、結果として得られる２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の収率が低下することとなるため、酸化反応の工程にはその適正な反応進行を維持するための正確な制御が必要で、それに掛かる経済的労力には多大なものがあった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような従来の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の製造方法の欠点を解消するために為されたもので、結合異性体を分離する必要がなく、効率良く２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を製造することができる２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の製造方法を提供するものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の製造において、その初発工程であるＬ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液に糖転移酵素または糖転移酵素とグルコアミラーゼとを作用させる工程で得られる２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を含有する溶液中に夾雑物である５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成しないか、若しくは検出されないほど生成量を少なくすることができれば、これら直接還元性を示すＬ−アスコルビン酸糖誘導体を酸化処理するなどの除去工程を必要とすることなく、高純度の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物を工業的規模で高収率に製造できるのではないかと考え、５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成しないか若しくはそれらの生成が検出できないほど少ない２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸生成反応の確立を目指して、研究を続けてきた。
【００１３】
その結果、意外にも、Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液に、糖転移酵素として、先に発明した国際公開番号ＷＯ０２／１０３６１号明細書で開示したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を作用させることによって、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸が著量生成し、しかも、夾雑物である５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成しないか若しくはそれらの生成が検出できないほど少ないことを見いだした。
【００１４】
更に、糖転移反応する際、該α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とＣＧＴａｓｅとを併用し糖転移反応を起こさせ、次いで、グルコアミラーゼを作用させることによって、得られる２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の生成量は、糖転移酵素としてα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を単独で使用する場合よりも増加し、しかも、その時の５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸等の結合異性体は、糖転移酵素としてα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を単独で使用する場合と同様に生成しないか若しくはそれらの生成が検出できないほど少ないことも判明した。
【００１５】
上記のような糖転移反応によって得られる２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を含有する糖転移反応生成物は、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーでは分離が困難であった５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸等の結合異性体を含有していないか、若しくは含有していてもその量が極めて少ないため、該クロマトグラフィーによって目的とする２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸が容易に、且つ高収率で分離・精製でき、高純度の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物を工業的規模で高収率に製造できるものである。
【００１６】
また、このようにして得られる高純度の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の過飽和溶液は、結晶の析出が容易で収率も高く、結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の工業的製造方法としてきわめて有利であることが判明した。
【００１７】
本明細書でいう生成しないか若しくはそれらの生成が検出できないほど少ないとは、反応液固形物当り０．１ｗ／ｗ％（以下、本明細書では、特にことわらない限り、％はｗ／ｗ％を意味する。）未満の生成量を意味する。また、本明細書でいう直接還元性を示すとは、Ｌ−アスコルビン酸の場合と同様に、そのままで、２，６−ジクロルフェノールインドフェノールを還元脱色することを意味する。
【００１８】
また、本明細書でいうＬ−アスコルビン酸とは、Ｌ−アスコルビン酸のみならず、Ｌ−アスコルビン酸のアルカリ金属塩若しくはアルカリ土類金属塩などのＬ−アスコルビン酸塩、または、それらの混合物を意味する。
【００１９】
また、同様に、本明細書でいう２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸、５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸、α−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸などについても、特に不都合が生じない限り、遊離の酸のみならず、それらの塩をも意味する。
【００２０】
以下、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素による糖転移反応方法、または、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とＣＧＴａｓｅとの併用による糖転移方法について、より具体的に説明する。
【００２１】
本発明で用いるα−グルコシル糖化合物は、α−グルコースを有する化合物であり、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素単独、または、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とＣＧＴａｓｅとの併用によって、Ｌ−アスコルビン酸から２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸又は／及び２−Ｏ−α−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成できるものであればよく、例えば、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオースなどのマルトオリゴ糖、マルトデキストリン、シクロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉、グリコーゲンなどが適宜選択できる。
【００２２】
反応時のＬ−アスコルビン酸の濃度は、通常、１％以上、望ましくは、約２乃至３０％（ｗ／ｖ）であればよく、α−グルコシル糖化合物は、Ｌ−アスコルビン酸１重量部に対して、通常、約０．５乃至３０重量部の範囲が好適である。
【００２３】
本発明に用いるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、例えば、国際公開番号ＷＯ０２／１０３６１号明細書に記載の如く、非還元性末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質に対して、該糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元性末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成する酵素活性を有しており、具体例としては、下記の理化学的性質を有する酵素がある。尚、前記非還元性末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質としては、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、アミロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉及びグリコーゲンから選ばれる１種又は２種以上の糖質を例示できる。
（１） 作用
非還元性末端の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が２以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなくα−グルコシル転移することによって、非還元性末端の結合様式としてα−１，６グルコシド結合を有し、この非還元末端以外の結合様式としてα−１，４グルコシド結合を有するグルコース重合度が３以上の糖質を生成する。
（２） 分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法により、約７４，０００乃至１６０，０００ダルトンの範囲内で分子量を有する。
（３）等電点
アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．８乃至７．８の範囲内に等電点を有する。
（４） 至適温度
ｐＨ６．０、６０分間反応で、約４０乃至５０℃の範囲内で至適温度を有する。
ｐＨ６．０、６０分間反応で、１ｍＭＣａ^２＋存在下、約４５乃至５５℃の範囲内に至適温度を有する。
ｐＨ８．４、６０分間反応で、約６０℃に至適温度を有する。または、
ｐＨ８．４、６０分間反応で１ｍＭＣａ^２＋存在下、約６５℃に至適温度を有する。
（５） 至適ｐＨ
３５℃、６０分間反応で、ｐＨ約６．０乃至８．４の範囲内に至適ｐＨを有する。
（６） 温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、約４５℃以下に温度安定域を有する。
ｐＨ６．０、６０分間保持する条件で、１ｍＭＣａ^２＋存在下、約５０℃以下に温度安定域を有する。
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件で、約５５℃以下に温度安定域を有する。または、
ｐＨ８．０、６０分間保持する条件で、１ｍＭＣａ^２＋存在下、約６０℃以下に温度安定域を有する。
（７） ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持する条件で、ｐＨ約４．５乃至１０．０の範囲内に安定ｐＨ域を有する。
（８） Ｎ末端アミノ酸配列
チロシン−バリン−セリン−セリン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−イソロイシン（配列表における配列番号１）、ヒスチジン−バリン−セリン−アラニン−ロイシン−グリシン−アスパラギン−ロイシン−ロイシン（配列表における配列番号２）、または、アラニン−プロリン−ロイシン−グリシン−バリン−グルタミン−アルギニン−アラニン−グルタミン−フェニルアラニン−グルタミン−セリン−グリシン（配列表における配列番号３）を有する場合がある。
【００２４】
本発明に用いるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、糖転移反応の供与体として、非還元性末端の結合様式がα−１，４グルコシド結合であるグルコース重合度が２以上の糖質を用いると、Ｌ−アスコルビン酸に糖転移し２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸、及び、更にこの２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸のグルコピラノシル基にα−グルコピラノシル基が１個または２個以上転移した２−Ｏ−α−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成する。
【００２５】
本発明に用いるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素としては、例えば、アルスロバクター属及びバチルス属などに属する細菌由来の酵素があり、例えば、アルスロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ａ１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７５９０）、バチルス・グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４３）、バチルス・グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｃ１１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４４）、バチルス・グロビスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）Ｎ７５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７５９０）などを挙げることができる。勿論、ＮＴＧなどの化学変異誘発剤または紫外線や照射線などを用いた人為的変異を施したり、突然変異株を分離して、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素高生産株などを取得し、その変異株由来の酵素も有利に利用できる。
【００２６】
また、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のポリペプチドをコードする遺伝子ＤＮＡを化学合成したり、本来、該遺伝子ＤＮＡを保有する細胞からクローニングしたりして該遺伝子ＤＮＡを得た後、該遺伝子ＤＮＡをそのまま、若しくは１個または２個以上のＤＮＡを他のＤＮＡに置換したり、１個または２個以上のＤＮＡを欠失または付加、挿入して、同種または異種の細胞に導入し発現させた、所謂、セルフクローニング体及び組換え体の由来の酵素であってもよい。
【００２７】
本発明に用いるＣＧＴａｓｅは、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、クレブシーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属などに属する細菌由来の酵素が適宜選択される。また、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の場合と同様に、ＣＧＴａｓｅのポリペプチドをコードする遺伝子ＤＮＡを化学合成したり、本来、該遺伝子ＤＮＡを保有する細胞からクローニングしたりして該遺伝子ＤＮＡを得た後、該遺伝子ＤＮＡをそのまま、若しくは１個または２個以上のＤＮＡを他のＤＮＡに置換したり、１個または２個以上のＤＮＡを欠失または付加、挿入して、同種または異種の細胞に導入し発現させた、所謂、セルフクローニング体及び組換え体の由来の酵素であってもよい。
【００２８】
これら糖転移酵素は、必ずしも精製して使用する必要はなく、通常は、粗酵素で本発明の目的を達成することができる。必要ならば、公知の各種方法で精製して使用してもよい。
【００２９】
また、使用酵素量と反応時間とは、密接な関係があり、通常は、経済性の点から約３乃至８０時間で反応を終了するように酵素量が選ばれる。
【００３０】
また、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とＣＧＴａｓｅとを併用して使用する場合、ＣＧＴａｓｅの使用量が過剰であると、ＣＧＴａｓｅの糖転移反応による副生成物である５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の生成量が著しく増加し、本発明の効果が発揮できなくなる。したがって、本発明に用いるＣＧＴａｓｅの量は、望ましくは、基質のα−グルコシル糖化合物１グラム当り約０．０１乃至５０単位の範囲から選択される。なお、ここでいうＣＧＴａｓｅの酵素活性を示す単位は、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）及び２ｍＭの塩化カルシウムを含む０．３％（ｗ／ｖ）の澱粉溶液にＣＧＴａｓｅを添加し、４０℃、１０分間反応することで測定し、その酵素活性１単位は、１５ｍｇの溶液状澱粉のヨウ素呈色を完全に消失させる酵素量とする。
【００３１】
また、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とＣＧＴａｓｅとを別々の担体に固定化し、または、両酵素を同一の担体に固定化し、得られる固定化された糖転移酵素をバッチ式で繰り返し、または連続式で反応に利用することも有利に実施できる。
【００３２】
本発明の糖転移方法は、通常、前述のＬ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液にα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素、または、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とＣＧＴａｓｅとを加え、該両酵素が充分作用する条件、望ましくは、ｐＨ約３乃至１０、温度３０乃至７０℃の範囲から選ばれる反応条件にして行う。
【００３３】
また、反応中にＬ−アスコルビン酸が酸化分解を受け易いので、できるだけ嫌気または還元状態で遮光下に維持するのが望ましく、必要ならば、チオ尿素、硫化水素などを共存させて反応させることも有利に実施できる。
【００３４】
本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素単独、または、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とＣＧＴａｓｅとを併用して、Ｌ−アスコルビン酸に糖転移させると、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸が生成するとともに、α−Ｄ−グルコピラノシル残基が更に１個又は２個以上付加した２−Ｏ−α−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸も混在して生成する。
【００３５】
以上述べたように、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素単独、または、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とＣＧＴａｓｅとの併用による糖転移反応を採用すると、Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とから、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸が生成するとともに、α−Ｄ−グルコピラノシル残基が更に１個又は２個以上付加した２−Ｏ−α−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸も混在して生成するものの、工業的カラムクロマトグラフィーなどで分離困難な夾雑物である５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸などＬ−アスコルビン酸の５位水酸基への糖転移物や６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸などＬ−アスコルビン酸の６位水酸基への糖転移物の副生成は無いか検出できないほど少ない。
【００３６】
本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素単独、または、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とＣＧＴａｓｅとの併用による糖転移反応によって得られる生成物にグルコアミラーゼを作用させると、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸より高分子の２−Ｏ−α−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸のグリコシル部分のα−１，４結合又はα−１，６結合を加水分解し、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を蓄積生成させることができる。
【００３７】
グルコアミラーゼの作用条件は、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸より高分子の２−Ｏ−α−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を加水分解し、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を蓄積生成させることができる条件であればよく、反応ｐＨ、反応温度、作用量、作用時間など適当な条件で実施すればよい。また、担体結合法、架橋法、又は包括法などで固定化されたグルコアミラーゼを用いて連続式に、またはバッチ式にグルコアミラーゼ反応することも、反応後に膜分離などして、反応液とグルコアミラーゼとを別々に回収し、グルコアミラーゼを再利用することも有利に実施できる。
【００３８】
通常、反応溶液は加熱するなどして酵素を失活させた後、またはそのまま、活性炭で脱色し、濾過して不溶物を除き、必要であれば濃縮する。得られる２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸含有溶液は、目的とする２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸とともに、夾雑物として未反応のＬ−アスコルビン酸、Ｄ−グルコースなど中性糖質を含有している。グルコースなどの中性糖質を、公知の方法、例えば、電気透析法、アニオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィー法などで分離、除去、又は低減させてもよい。このようにして得られる２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸含有溶液を原料として、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行い、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有画分を得る。
【００３９】
強酸性カチオン樹脂は、公知の、例えば、スルホン酸基を結合したスチレン−ジビニルベンゼン架橋共重合体樹脂のＮａ^＋型、Ｋ^＋型などのアルカリ金属塩型、または、Ｃａ^＋＋型、Ｍｇ^＋＋型などのアルカリ土類金属塩型、またはＨ^＋型などが適宜使用され、市販品としては、例えば、ダウケミカル社製造の商品名『ダウエックス ５０Ｗ×８』、ローム＆ハース社製造の商品名『アンバーライトＣＧ−６０００』、東京有機化学工業株式会社製造の商品名『ＸＴ−１０２２Ｅ』、三菱化学株式会社製造の商品名『ダイヤイオン ＳＫ１０４』などがある。
【００４０】
原料溶液として、例えば、目的とする２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸とともに、Ｌ−アスコルビン酸、Ｄ−グルコースなどの夾雑物を含有する溶液を用いる場合には、強酸性カチオン交換樹脂を充填したカラムに原料溶液を流し、次いで、水で溶出し、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有画分、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸・Ｌ−アスコルビン酸・Ｄ−グルコース高含有画分、Ｌ−アスコルビン酸・Ｄ−グルコース高含有画分などの順に複数の画分に分画して、この２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有画分を採取することにより、容易に２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物が製造される。
【００４１】
また、原料溶液をカラムに流して分画するに際し、既に得られている２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸・Ｌ−アスコルビン酸・Ｄ−グルコース高含有画分などの２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸含有画分を原料溶液の前後に、または、原料溶液とともに流すことにより、分画に要する水の使用量を減少させ、原料溶液から２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物を高濃度、高収率で採取することも有利に実施できる。本発明で使用される分画方式は固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれであってもよい。
【００４２】
このようにして得られる本発明の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物、望ましくは、純度７０％以上の高含有物は、溶液状であっても、また濃縮してシラップ状であっても、安定であり、その取り扱いは容易である。通常、更に濃縮して、過飽和溶液とし、結晶化して、さらに安定化した結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を製造する。本発明で使用する晶出用２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物は、結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の析出を阻害する直接還元性を示す結合異性体を、初発の糖転移反応段階で実質的に含有していないので、その結晶の析出は、きわめて容易であり、結晶収率も高い。晶出方法は、通常、２０乃至６０℃の過飽和２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸溶液を助晶缶にとり、これに種結晶を望ましくは、０．１乃至２％共存せしめて、ゆっくり攪拌しつつ徐冷し、晶出を促してマスキットにすればよい。
【００４３】
このように、本発明の結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸は、過飽和２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸溶液に結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を種晶として加えることにより容易に晶出させることができる。
【００４４】
晶出したマスキットから結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸粉末を製造する方法としては、結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸粉末を採取できる方法を適宜選択すればよく、例えば、分蜜方法、ブロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法などが挙げられる。
【００４５】
このようにして得られる結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸は、その純度、晶出率によって多少変動するものの、実質的に非吸湿性または、難吸湿性であり、その結晶粉末は流動性であり、固着の懸念もなく、その優れた特長は、次の通りである。
（1）直接還元性を示さず、きわめて安定である。
Ｌ−アスコルビン酸とは違って、メイラード反応を起こしにくい。従って、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、脂質、糖質、生理活性物質などが共存しても無用の反応を起こさず、むしろ、これらの物質を安定化する。
（２）加水分解を受けてＬ−アスコルビン酸を生成し、Ｌ−アスコルビン酸と同様の還元作用、抗酸化作用を示す。
（３）体内の酵素により、Ｌ−アスコルビン酸とＤ−グルコースとに容易に加水分解され、Ｌ−アスコルビン酸本来の生理活性を示す。
また、ビタミンＥ、ビタミンＰなどとの併用により、その生理活性を増強することができる。
（４）Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを経口摂取することにより、生体内で生成され、代謝される物質であることから、その安全性は極めて高い。
（５）実質的に、非吸湿性、難吸湿性であるにもかかわらず、水に対して大きな溶解速度、溶解度を有しており、粉末、顆粒、錠剤などのビタミン剤、サンドクリーム、チョコレート、チューインガム、即席ジュース、即席調味料などの飲食物のビタミンＣ強化剤、呈味改善剤、酸味剤、安定剤などとして有利に利用できる。
（６）実質的に非吸湿性または難吸湿性であり、固結しないことからその粉末は流動性であり、その取り扱いは容易で非晶質の場合と比較して、その包装、輸送、貯蔵に要する物的、人的経費が大幅に削減できる。
【００４６】
次に実験により本発明のＬ−アスコルビン酸への糖転移方法をさらに具体的に説明する。
【００４７】
【実験１】
〈α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の生産〉
澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター・グロビホルミスＡ１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７５９０）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。容量３０Ｌのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１％（ｖ／ｖ）を接種し、温度２７℃、ｐＨ６．０乃至９．０に保ちつつ、４８時間通気攪拌培養した。培養後、培養物中の酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約１．１単位／ｍｌであった。この培養物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した上清約１８Ｌの酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約１．０６単位／ｍｌ（総活性約１９，１００単位）であった。
【００４８】
尚、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性測定は、次のようにして測定する。
マルトトリオースを濃度２ｗ／ｖ％となるよう１００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶解させ基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌ加えて、４０℃で６０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中のマルトース含量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法で定量することによって行った。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルのマルトースを生成する酵素量と定義した。尚、ＨＰＬＣは、『Ｓｈｏｄｅｘ ＫＳ−８０１カラム』（昭和電工株式会社製造）を用い、カラム温度６０℃、溶離液として水を用いて流速０．５ｍｌ／ｍｉｎの条件で行い、検出は示差屈折計『ＲＩ−８０１２』（東ソー株式会社製造）を用いて行なった。
【００４９】
【実験２】
〈α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の精製〉
実験１の方法で得た培養上清約１８Ｌを８０％飽和硫安液で塩析して４℃、２４時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収し１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約８５０ｍｌを得た。この粗酵素液は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を約８，２１０単位含んでいた。この粗酵素液を『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｓ』ゲル（東ソー株式会社製造）を用いたイオン交換クロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）に供した。酵素活性成分は、『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｓ』ゲルには吸着し、ＮａＣｌ濃度０Ｍから１Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性成分は、ＮａＣｌのリニアグラジエントでその濃度が約０．２Ｍ付近で溶出した。そこで、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分を回収し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品を回収した。
【００５０】
得られたα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、この透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） ＨＲ Ｓ−２００』ゲル（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製造）を用いたアフィニティークロマトグラフィー（ゲル量５００ｍｌ）に供した。酵素活性成分は、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ＨＲ Ｓ−２００』ゲルに吸着し、硫安１Ｍから０Ｍに濃度低下するリニアグラジエントで溶出させたところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、硫安のリニアグラジエント濃度が約０．２Ｍ付近の画分に検出された。そこで、本酵素活性画分を回収し、精製酵素標品とした。この精製の各ステップにおけるα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する酵素標品の酵素活性量、比活性、収率を表１に示す。
【００５１】
【表１】

【００５２】
精製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を７．５％（ｗ／ｖ）濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い酵素標品であった。
【００５３】
【実験３】
＜α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の諸性質＞
【００５４】
【実験３−１】
＜分子量＞
実験２の方法で精製して得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製造）と比較して当該酵素の分子量を測定した。当該酵素の分子量は約９４，０００±２０，０００ダルトンであった。
【００５５】
【実験３−２】
＜等電点＞
実験２の方法で精製して得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を、２ｗ／ｖ％アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製造）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、電気泳動後の蛋白バンド及びゲルのｐＨを測定して当該酵素ポリペプチドの等電点を求めた。その結果、当該酵素の等電点はｐＩ約４．３±０．５であった。
【００５６】
【実験３−３】
＜作用温度及びｐＨ＞
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性に及ぼす温度とｐＨの影響について、各種温度、ｐＨ条件下、実験１に記載のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性測定法に準じて調べた。その結果、至適温度は、ｐＨ８．４、６０分間反応で、約６０℃（Ｃａ^２＋非存在）又は約６５℃（１ｍＭＣａ^２＋存在）で、その至適ｐＨは、３５℃、６０分間反応で約８．４であった。
【００５７】
【実験３−４】
＜安定性＞
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の温度安定性は、当該酵素含有溶液（２０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ８．０）をＣａ^２＋非存在下または１ｍＭＣａ^２＋存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存するα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を測定することにより求めた。又、ｐＨ安定性は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を各ｐＨの５０ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを８．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。その結果、温度安定性は約５５℃まで（Ｃａ^２＋非存在）又は約６０℃まで（１ｍＭＣａ^２＋存在）で、ｐＨ安定性は約５．０乃至９．０であった。
【００５８】
【実験３−５】
＜Ｎ末端アミノ酸配列＞
実験２の方法で精製して得たα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素について、そのＮ末端アミノ酸配列を、『プロテインシーケンサー モデル４７３A』（アプライドバイオシステムズ社製造）を用いて分析したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は配列表に於ける配列番号３に示すアミノ酸配列を有することが判明した。
【００５９】
以上、アルスロバクター・グロビホルミスＡ１９株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の調製方法及びその性質を示したが、本発明においては、他の菌株由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素であっても用いることができる。
【００６０】
【実験４】
〈Ｌ−アスコルビン酸への糖転移試験〉
以下に示す各種糖質が、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を用いる糖転移反応における糖供与体となり、Ｌ−アスコルビン酸へ糖転移するかどうかを試験した。すなわち、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソパノース、トレハロース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、マルトトリイトール、ラクトース、スクロース、エルロース、セラギノース、マルトシルグルコシド、イソマルトシルグルコシド、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、プルラン、デキストランを含む溶液を調製した。それぞれ溶液にＬ−アスコルビン酸を加えて、糖質濃度及びＬ−アスコルビン酸濃度を２ｗ／ｖ％に調整した。これらの溶液に、実験２の方法で得た精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素標品を糖質固形物１グラム当たりそれぞれ３単位ずつ加え、基質濃度を１．６ｗ／ｖ％になるように調整し、これらを４０℃、ｐＨ６．０で２０時間作用させた。酵素反応後の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の生成を調べるため、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略す。）を行なった。展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）、薄層プレートとしてメルク社製造『キーゼルゲル６０Ｆ２５４』（アルミプレート、２０×２０ｃｍ）を用い１回展開した後、紫外線を薄層プレートに照射してアスコルビン酸及び２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸検出し、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸生成の有無を確認した。結果を表２に示す。
【００６１】
【表２】

【００６２】
表２の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、試験した各種糖質の内、グルコース重合度が３以上で、非還元末端にマルトース構造を有する糖質を糖供与体として、Ｌ−アスコルビン酸に糖転移し、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成することが判明した。又、グルコース重合度が２の糖質では、マルトース、コージビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、マルトトリイトール、エルロースにも作用し２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成することが判明した。
【００６３】
【実験５】
〈Ｌ−アスコルビン酸への糖転移生成物〉
Ｌ−アスコルビン酸を濃度５ｗ／ｖ％、マルトペンタオースを濃度５ｗ／ｖ％、及び１ｍＭの塩化カルシウムを含む水溶液をｐＨ５．０に調整し、これに実験２の方法で調製した精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素をマルトペンタオース１ｇ当たり１０単位になるように加えて５０℃で２４時間反応させ、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液の一部分を採り、それにグルコアミラーゼ（生化学工業株式会社製造）をマルトペンタオース１ｇ当たり４０単位加え、４０℃で１６時間作用させた後、１０分間煮沸して反応を停止させた。これら反応液中のＬ−アスコルビン酸への糖転移生成物及び残存するＬ−アスコルビン酸を、以下の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法で分離し測定した。『Ｗａｋｏｐａｋ ＷＢ−Ｔ−３３０カラム』（和光純薬工業株式会社製造)を用い、カラム温度２５℃、溶離液として７０ｐｐｍ硝酸水溶液の流速０．５ｍｌ／ｍｉｎの条件で行い、検出は、アスコルビン酸及びアスコルビン酸への糖転移物を分光光度計『ＵＶ−８０２０』（東ソー株式会社製造）を用いて波長２３８ｎｍ吸収で測定するとともに、アスコルビン酸及びアスコルビン酸への糖転移物を含めた全組成を示差屈折計『ＲＩ−８０２０』（東ソー株式会社製造）を用いて測定することで行ない、アスコルビン酸及びアスコルビン酸への糖転移物の反応液固形物当りの生成量（以下、本明細書では、特に断らない限り、生成量は反応液固形物当りの生成量を意味する。）を求めた。それらの結果を表３に示す。
【００６４】
【表３】

【００６５】
表３の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素によるＬ−アスコルビン酸への糖転移生成物として、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸が約１８．７％生成するとともに、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸とは異なる転移生成物が約０．４％生成することがわかった。また、この反応液にグルコアミラーゼを作用させると、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸とは異なる転移生成物は消失し、その消失とともに２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸量が増加し、Ｌ−アスコルビン酸への糖転移生成物として、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸のみが生成することが判明した。グルコアミラーゼの作用特性を考慮すると、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸とは異なる転移生成物は、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸にα−Ｄ−グルコピラノシル残基が更に１個又は２個以上付加した２−Ｏ−α−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸であり、グルコアミラーゼ作用の結果、この２−Ｏ−α−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸の１個又は２個以上付加したα−Ｄ−グルコピラノシル残基が加水分解され、２−Ｏ−α−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸が２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸に変換されたと判断される。
【００６６】
【実験６】
〈２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸生成の作用温度及びｐＨ〉
α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸生成活性に及ぼす温度とｐＨの影響について、各種温度、ｐＨ条件下で調べた。２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸生成活性測定は、次のようにして測定した。
（１）温度の影響については、Ｌ−アスコルビン酸を濃度０．５ｗ／ｖ％、マルトペンタオースを濃度０．５ｗ／ｖ％、及び塩化カルシウムを濃度１ｍＭとなるように１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解させ基質液とし、その基質液２ｍｌに酵素液０．２ｍｌ加えて、３０乃至６５℃で３０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた。その反応液中に生成した２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸量は、実験５に記載のＨＰＬＣ法により分離し測定することによって行った。
（２）ｐＨの影響については、Ｌ−アスコルビン酸を濃度０．５ｗ／ｖ％、マルトペンタオースを濃度０．５ｗ／ｖ％、及び塩化カルシウムを濃度１ｍＭとなるように１００ｍＭの各種緩衝液に溶解させ基質液とした。緩衝液の種類は、ｐＨ４．１乃至６．４の範囲では酢酸緩衝液を用い、ｐＨ６．７乃至７．５の範囲ではリン酸緩衝液を用い、ｐＨ７．６乃至８．５の範囲ではトリス・塩酸緩衝液を用いた。その基質液２ｍｌに酵素液０．２ｍｌ加えて、４０℃で３０分間酵素反応し、その反応液を１０分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中に生成した２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸量をＨＰＬＣ法で定量することによって行った。それらの結果を図１（温度の影響）及び図２（ｐＨの影響）に示した。
【００６７】
図１から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸生成活性の至適温度は、ｐＨ５．０、３０分間反応で、約５５乃至６０℃であった。また、図２から明らかなように、その至適ｐＨは、４０℃、３０分間反応で約５．５であった。
【００６８】
【実験７】
〈２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸生成〉
Ｌ−アスコルビン酸を５％、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１』、松谷化学株式会社製造）を５％及び１ｍＭの塩化カルシウムを含む水溶液をｐＨ５．０に調整し、これに実験２の方法で調製した精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉部分分解物１ｇ当たり５乃至２０単位になるように加えて５０℃で４８時間反応させた。これら反応液を約１００℃で１０分間加熱し、酵素を失活させた後、４０℃に冷却し、グルコアミラーゼ（生化学工業株式会社製造）を澱粉部分分解物１ｇ当たり４０単位加え、４０℃で１６時間作用させた。これら反応液を実験５に記載のＨＰＬＣ法に供し、標準品として、市販の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸（株式会社林原生物化学研究所製造）、特許第３１３４２３５号明細書に記載の方法で調製した５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を用いて、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸、及び５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を分離し、それぞれの生成量を測定し、基質固形物当りの生成率を求めた。対照として、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の代わりに、バチルス・ステアロサーモフィルス由来のＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製造）を澱粉部分分解物１ｇ当り３００単位用いた以外、同じ操作を行い、同様に、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸、及び５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の生成量を調べた。それらの結果を表４に示す。
【００６９】
【表４】

【００７０】
表４の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素は、アスコルビン酸への転移物として２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸のみを生成し、他の５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸は生成されなかった。一方、対照のＣＧＴａｓｅは、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とほぼ同じの２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸生成量であったが、５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の生成量は、それぞれ、０．８％、０．３％であった。
【００７１】
以上の結果から、ＣＧＴａｓｅのアスコルビン酸への糖転移は、アスコルビン酸の２位水酸基だけでなく、５位及び６位水酸基にも転移し、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成するとともに、副生成物として５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成するのに対して、本発明のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素のアスコルビン酸への糖転移は、アスコルビン酸の２位水酸基のみに反応し、特異的に２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成することが判明した。
【００７２】
【実験８】
〈ＣＧＴａｓｅとの併用試験〉
Ｌ−アスコルビン酸を９％、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学株式会社製造）を２１％及び１ｍＭの塩化カルシウムを含む水溶液をｐＨ５．０に調整し、これに実験２の方法で調製した精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を澱粉部分分解物１ｇ当たり１０単位、ＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製造）を１乃至１００単位になるように加えて５０℃で２４時間反応させた。これら反応液を約１００℃で１０分間加熱し、酵素を失活させた後、４０℃に冷却し、グルコアミラーゼ（生化学工業株式会社製造）を澱粉部分分解物１ｇ当たり４０単位加え、４０℃で１６時間作用させた。これら反応液を実験５に記載のＨＰＬＣ法に供し、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸、及び５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の生成量を測定し、基質固形物当りの生成量を求めた。併せて、精製α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素単独及び対照として、ＣＧＴａｓｅ単独で転移反応を行い同様に操作した。それらの結果を表５に示す。
【００７３】
【表５】

【００７４】
表５の結果から明らかなように、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素単独の場合は、上記の実験７の結果と同様に、アスコルビン酸への転移物として２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸のみを約２５％生成量で生成し、他の５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の生成は検出されなかった。α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とＣＧＴａｓｅとを併用した場合は、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の生成が増加し、約２９乃至３１％の生成量で、併用するＣＧＴａｓｅの使用量が１乃至２単位／ｇでは５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の生成は検出されず、併用するＣＧＴａｓｅの使用量が５乃至１０単位／ｇでは５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の生成が約０．１％の生成量で検出され、併用するＣＧＴａｓｅの使用量が１００単位／ｇでは５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の生成が、それぞれ０．８％及び０．１％の生成量で検出された。対照のＣＧＴａｓｅ単独の場合、その使用量が１乃至２単位／ｇでは、５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の生成は検出されないものの、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の生成量は約４乃至５％と少量で、また、ＣＧＴａｓｅ単独の使用量が５単位／ｇ以上の場合では、その使用量の増加とともに２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の生成量が約８％から約３０％に上昇するものの、５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び／又は６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸が生成することがわかった。
【００７５】
以上の結果から、５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び／又は６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の生成が無いか若しくは検出できない使用量のＣＧＴａｓｅを、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素と併用することによって、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の生成率をα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素単独使用の場合より増加させ、且つ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素単独使用の場合と同様に、５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び／又は６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の生成が無いか若しくは検出できないほどの極微量にできることが判明した。
【００７６】
以下、本発明の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造方法についての実施例を述べる。
【００７７】
【実施例１】
デキストリン（ＤＥ約６）９重量部を水２８重量部に加熱溶解し、還元下に保って、Ｌ−アスコルビン酸３重量部を加え、ｐＨ５．０、５０℃に維持しつつ、これに実験２の方法で調製したα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品をデキストリン１グラム当り８単位加えて４２時間反応させた。次に、反応液を加熱して酵素を失活させた後、５５℃に調整し、これにグルコアミラーゼをデキストリン１ｇ当り５０単位加えて、１６時間反応させた。
【００７８】
反応液をＨＰＬＣで分析したところ、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を固形物当り約２４．９％含有しており、５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸は検出されなかった。さらに、本反応液を加熱して酵素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、濾液をカチオン交換樹脂（Ｈ^＋型）のカラムにかけ脱ミネラルし、次いで、アニオン交換樹脂（ＯＨ⁻型）のカラムにかけアニオンを樹脂に吸着させ、水洗してＤ−グルコースなどを除去後、０．５規定―塩酸溶液で溶出、濃縮した。
【００７９】
濃縮液をＨＰＬＣで分析したところ、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を固形物当り約５２．５％、Ｌ−アスコルビン酸を固形物当り約３９％含有しており、５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸は０．１％未満であった。本濃縮液を原料溶液として、強酸性カチオン交換樹脂（ローム＆ハース社製造、商品名『アンバーライトＣＧ−６０００』、Ｈ^＋型）を充填したカラムクロマトグラフィーを行い、この溶出液の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有画分を採取した。
【００８０】
本画分をＨＰＬＣで分析したところ、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を固形物当り約９３．６％含有しており、５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸は０．１％未満であった。本画分を減圧濃縮して濃度約７７％とし、これを助晶缶にとり、結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を種晶として２％加えて４０℃とし、ゆっくり攪拌しつつ、徐冷して２日間を要して２０℃まで下げ、更にバスケット型遠心分離機にかけ、結晶−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を原料のＬ−アスコルビン酸に対して収率約４６％で得た。また、母液として、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を固形物当り約８２．３％含有する溶液を原料のＬ−アスコルビン酸に対して固形物収率約２８％で回収した。
【００８１】
本結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸品は、直接還元性をしめさず、安定性、生理活性も充分で、ビタミンＣ強化剤としてばかりでなく、呈味改善剤、酸味剤、安定剤、品質改良剤、抗酸化剤、生理活性剤、紫外線吸収剤、医薬原料、化学品などとして、飲食物、抗感受性疾患剤、化粧品などに有利に利用できる。
【００８２】
【実施例２】
実施例１の方法で回収した母液を濃縮後、実施例２の方法に準じて、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行い、この溶出液の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有画分を採取した。本画分をＨＰＬＣで分析したところ、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を固形物当り約９３．０％含有しており、５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸は０．１％未満であった。さらに、本画分を、実施例１の方法に準じて、濃縮、晶出、分蜜し、結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を母液固形物当り収率約６３％で得た。
【００８３】
本品は、実施例１の場合と同様に、飲食物、抗感受性疾患剤、化粧品などに有利に利用できる。
【００８４】
【実施例３】
アルスロバクター・グロビホルミスＡ１９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７５９０）を常法に従って、変異剤としてニトロソグアニジンを用いて変異させ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素高生産且つα−イソマルトシル転移酵素非生産株を取得した。この変異株を、実験１の方法に準じて、澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）、及び水からなる液体培地で７２時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中の酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約１４単位／ｍｌで、α‐イソマルトシル転移酵素活性は検出されなかった。得られた培養液を、常法に従って、ＳＦ膜で除菌し、ＵＦ膜で濃縮し、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する濃縮液を得た。得られた濃縮液の酵素活性を測定したところ、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約３５０単位／ｍｌであった。
【００８５】
とうもろこし澱粉を濃度約２０％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム０．１％加え、ｐＨ６．５に調整し、α−アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製造）を澱粉グラム当たり０．３％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃に２０分間オートクレーブし、更に約５３℃に急冷してＤＥ約４の液化溶液を得、この液化溶液８８重量部にＬ−アスコルビン酸１２重量部を加え、ｐＨ５．０、５３℃に維持しつつ、これに上記のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する濃縮液をデキストリン１グラム当り１０単位とＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製造）をデキストリン１グラム当り１単位加えて３６時間反応させた。
【００８６】
反応液を加熱して酵素を失活させた後、５５℃に調整し、これにグルコアミラーゼをデキストリン１ｇ当り５０単位加えて、１６時間反応させた。反応液をＨＰＬＣで分析したところ、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を固形物当り約３３．５％含有しており、５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸は検出されなかった。
【００８７】
本反応液を加熱して酵素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、濾液をカチオン交換樹脂（Ｈ^＋型）のカラムにかけ脱ミネラルし、次いで、アニオン交換樹脂（ＯＨ⁻型）のカラムにかけアニオンを樹脂に吸着させ、水洗してＤ−グルコースなどを除去後、０．５規定―塩酸溶液で溶出、濃縮し、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を固形物当り約５６．１％含有する濃縮液を得た。
【００８８】
本濃縮液を原料溶液として、実施例１の方法に準じて強酸性カチオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーを行い、この溶出液の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有画分を採取し、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を固形物当り約９６．４％含有する２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有画分を得た。
【００８９】
本画分を減圧濃縮して濃度約７７％とし、これを助晶缶にとり、結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を種晶として１％加えて４０℃とし、ゆっくり攪拌しつつ、徐冷して２日間を要して２０℃まで下げ、更にバスケット型遠心分離機にかけ、１番晶結晶として２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を原料のＬ−アスコルビン酸に対して固形物収率約４８％で得た。また、母液として、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を固形物当り約８６．７％含有する溶液を原料のＬ−アスコルビン酸に対して固形物収率約２６％で回収した。
【００９０】
得られた母液を、活性炭で脱色濾過し、濃縮して、実施例２の方法に準じて、強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを行い、この溶出液の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有画分を採取した。
【００９１】
本画分をＨＰＬＣで分析したところ、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を固形物当り約９６．３％含有しており、５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸は０．１％未満であった。
【００９２】
本画分を、実施例１の方法に準じて、濃縮、晶出、分蜜し、２番晶結晶として２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を母液固形物当り収率約６５％で得た。
【００９３】
上記の方法で得られた１番晶及び２番晶の結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸をそれぞれ乾燥し、混合して粉砕して、純度９９％以上の結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸粉末を原料のＬ−アスコルビン酸に対して固形物収率約６０％で得た。
【００９４】
本品は、直接還元性をしめさず、安定性、生理活性も充分で、ビタミンＣ強化剤としてばかりでなく、呈味改善剤、酸味剤、安定剤、品質改良剤、抗酸化剤、生理活性剤、紫外線吸収剤、医薬原料、化学品などとして、飲食物、抗感受性疾患剤、化粧品などに有利に利用できる。
【００９５】
【実施例４】
国際公開番号ＷＯ０２／１０３６１号明細書に記載の方法に準じて、澱粉部分分解物『パインデックス＃４』４．０％（ｗ／ｖ）、酵母抽出物『アサヒミースト』１．８％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一ナトリウム・１２水塩０．０６％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％（ｗ／ｖ）、及び水からなる液体培地を用いて、バチルス・グロビスポルス Ｃ１１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７１４４）を４８時間通気攪拌培養し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して回収した培養上清を８０％飽和硫安液で塩析し、透析した後、『セファビーズ（Ｓｅｐａｂｅａｄｓ）ＦＰ−ＤＡ１３』ゲル（三菱化学株式会社製造）を用いたイオン交換クロマトグラフィー、続いて、『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） ＨＲ Ｓ−２００』ゲル（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製造を用いたアフィニティークロマトグラフィー、更に『ブチル−トヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）６５０Ｍ』ゲル（東ソー株式会社製造）を用いた疎水クロマトグラフィー、再度『セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） ＨＲ Ｓ−２００』ゲルを用いたアフィニティークロマトグラフィーを行い、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を約２，０００単位有する精製酵素標品を得た。
【００９６】
デキストリン（ＤＥ約６）６重量部を水３０重量部に加熱溶解し、還元下に保って、Ｌ−アスコルビン酸４重量部を加え、ｐＨ５．０、４０℃に維持しつつ、これに上記のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する精製酵素標品をデキストリン１グラム当り１単位とＣＧＴａｓｅ（株式会社林原生物化学研究所製造）をデキストリン１グラム当り２単位加えて２４時間反応させた。反応液を加熱して酵素を失活させた後、５５℃に調整し、これにグルコアミラーゼをデキストリン１ｇ当り５０単位加えて、１６時間反応させた。この反応液を加熱して酵素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、濾液を得た
【００９７】
濾液をＨＰＬＣで分析したところ、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を固形物当り約１０．２％含有しており、５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸は検出されなかった。
【００９８】
濾液をカチオン交換樹脂（Ｈ^＋型）のカラムにかけ脱ミネラルし、次いで、アニオン交換樹脂（ＯＨ⁻型）のカラムにかけアニオンを樹脂に吸着させ、水洗してＤ−グルコースなどを除去後、０．５規定―塩酸溶液で溶出、濃縮し、実施例１の方法に準じて強酸性カチオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーを行い、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有画分を採取し、減圧濃縮して濃度約７７％とし、これを助晶缶にとり、結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を種晶として２％加えて４０℃とし、ゆっくり攪拌しつつ、徐冷して２日間を要して２０℃まで下げ、更にバスケット型遠心分離機にかけ、純度９８％以上の結晶２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を原料のＬ−アスコルビン酸に対して固形物収率約１１％で得た。
【００９９】
本品は、直接還元性をしめさず、安定性、生理活性も充分で、ビタミンＣ強化剤としてばかりでなく、呈味改善剤、酸味剤、安定剤、品質改良剤、抗酸化剤、生理活性剤、紫外線吸収剤、医薬原料、化学品などとして、飲食物、抗感受性疾患剤、化粧品などに有利に利用できる。
【０１００】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明は、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の製造方法に関し、より詳細には、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素を用いて、又は、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとを併用して、Ｌ−アスコルビン酸に糖転移反応させ、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成せしめる反応を利用した２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の製造方法に関する発明である。斯かる本発明によれば、糖転移物中には、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の結合異性体である５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸が生成してないか若しくはそれらの生成が検出できないほど少なく、糖転移物から２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を採取する工程において、これら結合異性体の悪影響を受けることなく有利に２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を採取することができる。斯かる本発明によれば、斯界に於いて有用な２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を工業的に大量かつ安価に高収率で製造し得る。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】アルスロバクター・グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸生成活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図２】アルスロバクター・グロビホルミスＡ１９由来のα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸生成活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。

Claims (5)

1. Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液にα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素またはα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１９）とを作用させ、固形物当り２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を１０ｗ／ｗ％以上含有し、且つ、固形物当り５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を０．１ｗ／ｗ％未満含有する２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸含有溶液液とし、この２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸含有溶液液から２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を採取することを特徴とする２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の製造方法。
2. α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素又はα−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素とシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとを作用させた後に、グルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）を作用させることを特徴とする請求項１記載の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の製造方法。
3. α−グルコシル糖化合物が、マルトオリゴ糖、マルトデキストリン、シクロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉、及びグリコーゲンから選ばれる１種又は２種以上の糖質である請求項１又は２に記載の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の製造方法。
4. ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を採取する工程に於いて、強酸性カチオン交換樹脂を用い、更に、必要に応じて、粉末化工程又は結晶化工程を含むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の製造方法。
5. ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を採取する工程に於いて、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸をシラップ状、粉末状又は結晶状で採取することを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の製造方法。

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