JP3854326B2 - Collagenase inhibitor - Google Patents

Description

Translated fromJapanese

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、結合組織の構成タンパク質であるコラーゲンを特異的に切断し、皮膚の老化，骨粗しょう症等の代謝性疾患，炎症性疾患，リューマチ関節炎，骨関節炎等の関節性疾患などの緩和，治療に副作用なく安全に使用し得るコラゲナーゼ阻害剤に関する。さらに詳しくは、ジカルボン酸或いはこれと金属キレート剤を含有して成るコラゲナーゼ阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コラーゲンは動物の結合組織を構成する主要タンパク質であり、種々の組織においてＩ型〜ＸIII型の１３種類の存在が知られている。コラゲナーゼは、かかるコラーゲンタンパク質を特異的に切断する酵素であり、加齢や紫外線による皮膚のしわの発生や粘弾性の低下、骨粗しょう症等の代謝性疾患、表皮水疱症，角膜潰瘍，歯根病等の炎症性疾患、リューマチ関節炎，骨関節炎等の関節性疾患など、実に幅広く多くの疾患に関与する。
【０００３】
従って、コラゲナーゼ活性を阻害することにより、上記のような疾患を緩和或いは治療する試みが多くなされており、コラゲナーゼ阻害剤として、羊膜由来物質（特開平６−３４５６３６），ソバ殻タンパク質抽出物（国際公開９４２０５４１），ケイガイ，ハッカ抽出物（特開平６−１８３９９０），水溶性糖誘導体（特開平６−１８３９４１），ラクトフェリン（特開平５−１８６３６８），コーヒー酸又はその塩（特開平５−１１７１４５），アスコルビン酸，エリソルビン酸及びこれらの塩の混合物（特開平４−２９０８１９），アセチルポリアミド（フランス国特許２６６９６２９），ガロタンニン（特開平４−６６５２４），κ-カゼイン（特開平４−４１４１７），カカオ殻の抽出物（特開平３−４４３３１），ヒドロキサム酸テトラペプチド（特開平１−１６０９９７），1,3-ビス-置換-ナフチルアミノカルボニルフェニル尿素誘導体（特公昭６３−８１０１）などが開示されている。
【０００４】
また、コラゲナーゼは金属プロテアーゼであるため、ディフェロキサミン（deferoxamine），エチレンディアミン四酢酸（ethylenediamine tetraacetic acid，ＥＤＴＡ）塩，酒石酸，クエン酸等の金属キレート剤もコラゲナーゼ阻害剤として用いられる。
【０００５】
しかしながら、少量で高い阻害活性を示し、しかも副作用が少なくさらに安定性の高いコラゲナーゼ阻害剤としては、いまだに満足なものが得られていないのが現状である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は少量の適用で高いコラゲナーゼ阻害活性を示し、しかも副作用がなく安全で、さらに種々の製剤基剤中で安定性が高く、いろいろな剤型の医薬品や化粧料等に応用することのできるコラゲナーゼ活性阻害剤を得ることを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するため、種々の物質のコラゲナーゼ阻害活性をスクリーニングした結果、ジカルボン酸類がやはり金属キレート作用を有し、しかも生体に対する作用が穏和で副作用がほとんどなく、また種々の形態の基剤中で安定であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明においては、ジカルボン酸より１種又は２種以上を選択して基剤に配合する。ジカルボン酸としては、グルタル酸，アジピン酸，ピメリン酸，スベリン酸，アゼライン酸，セバシン酸，1,9-ノナメチレンジカルボン酸，1,10-デカメチレンジカルボン酸の炭素数５〜１２の飽和二塩基酸が特に好ましい。配合量としては、製剤全量に対して０．０１重量％〜１０．０重量％程度が適当である。
【０００９】
また、ジカルボン酸の１種又は２種以上に加えて金属キレート剤の１種又は２種以上を併用すると、コラゲナーゼ阻害活性が相乗的に増強される。金属キレート剤としては、ディフェロキサミン（deferoxamine），エチレンジアミン四酢酸（ethylenediamine tetraacetic acid，ＥＤＴＡ）のナトリウム塩，リン酸，クエン酸，アスコルビン酸，コハク酸，グルコン酸，ポリリン酸ナトリウム，メタリン酸ナトリウム等が挙げられ、これらより１種又は２種以上を選択して配合する。
【００１０】
【作用】
本発明のコラゲナーゼ阻害剤は、少量の添加で優れたコラゲナーゼ阻害作用を示し、且つ生体に対する作用が穏和で、製剤中における安定性にも優れる。その結果、本発明のコラゲナーゼ阻害剤の適用により、加齢や紫外線による皮膚のしわの発生や粘弾性の低下、骨粗しょう症等の代謝性疾患、表皮水疱症，角膜潰瘍，歯根病等の炎症性疾患、リューマチ関節炎，骨関節炎等の関節性疾患などを緩和或いは治療することができ、また、創傷の治癒をも促進する。
【００１１】
一例として、アゼライン酸のコラゲナーゼ阻害作用について以下に示す。コラゲナーゼを最終濃度で０〜１５μg/ml含む水溶液に、アゼライン酸を最終濃度が８mM及び１６mMとなるように加え、次いでフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識を行ったコラーゲンを最終濃度４０μg/mlとなるように加えて、３７℃で１時間インキュベーションした。エタノール添加により酵素反応を停止させた後、未反応のＦＩＴＣ標識コラーゲンを除去するため遠心分離を行い、上清中の蛍光強度を励起波長４９５nm，蛍光波長５２０nmで測定した。アゼライン酸を含まない溶媒のみを添加した系についても同様に蛍光強度を測定し、対照とした。結果は表１に示す。
【００１２】
【表１】

表１には、式（１）により求めたコラゲナーゼ阻害率を併記した。これより、アゼライン酸はコラゲナーゼによるＦＩＴＣの遊離に対して、８mMで４８〜５８％程度、１６mMで２８〜３１％程度まで抑制することが示された。すなわち、コラゲナーゼ阻害率はアゼライン酸の濃度に依存して増加し、８mMで４１．５〜５２．３、１６mMで６８．９〜７１．８％となった。
【数１】

【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明に係るコラゲナーゼ阻害剤は、粉末状，水性懸濁液，アルコール等の極性有機溶媒を含む水性基剤に可溶化した形態或いは乳剤の形態で提供でき、食品，飲料，医薬品，化粧料等に添加，配合して用いることができる。食品においては、油脂製品や乳化製品、清涼飲料等に添加することができる。医薬品では、経口製剤，注射剤，皮膚外用剤等への添加が考えられる。化粧料としては、化粧水，乳液，クリーム等の他、洗口剤など口腔用組成物への添加も可能である。
【００１４】
【実施例】
さらに本発明の特徴について、実施例により詳細に説明する。まず、本発明の実施例１〜実施例３として、含エタノール水性製剤タイプのコラゲナーゼ阻害剤について表２に示す。表２中、ジカルボン酸をエタノールに溶解し、キレート剤を溶解した精製水と混合，可溶化して調製する。
【表２】

【００１５】
表３には、乳剤タイプのコラゲナーゼ阻害剤である実施例４〜実施例６の処方を示した。表３中、油相にジカルボン酸を添加して７５℃に加熱して溶解，均一化する。一方、水相にキレート剤を添加して加熱，溶解して７５℃に保ち、これに前記油相成分を徐々に添加して乳化した後、冷却して調製する。
【表３】

【００１６】
表４には、クリームタイプのコラゲナーゼ阻害剤である実施例７〜実施例９の処方を示した。表４中、油相にジカルボン酸を添加して７５℃に加熱して溶解，均一化する。一方、水相にキレート剤を添加して加熱，溶解して７５℃に保ち、これに前記油相成分を徐々に添加して乳化した後、冷却して調製する。
【表４】

【００１７】
上記の本発明の実施例について、炎症性潰瘍に対する治癒効果を評価した。マウス５匹を１群とし、背部に界面活性剤処理により炎症性潰瘍を生じさせた。この部位に試料を１日２回０．５gずつ７日間塗布し、７日後の潰瘍の治癒状況を観察した。治癒状況は「完全治癒」，「ほぼ治癒」，「治癒不完全」の３段階にて評価し、各評価を得たマウスの数を示した。なお、表２〜表４において、ジカルボン酸をガロタンニンに、キレート剤としてアスコルビン酸を用いたものをそれぞれ比較例１〜比較例３とした。
【００１８】
また、製剤を２５℃で３カ月間保存した際の安定性及び皮膚刺激性についても評価した。保存安定性は「○；状態の変化は認められない」，「△；変退色或いは成分の分離が若干認められる」，「×；変退色或いは成分の分離が顕著に認められる」として評価し、皮膚刺激性は男性パネラー２０名による４８時間閉塞貼付試験により、表５に示す判定基準に従って皮膚刺激指数を求め、２０名の平均値を算出して評価した。以上の結果は表６にまとめて示した。
【表５】

【００１９】
【表６】

表６より、本発明の実施例塗布群においては、いずれも皮膚潰瘍の治癒傾向が認められ、治癒が不完全なマウスは見られなかった。特に実施例８及び実施例９塗布群で良好な治癒を認めた。これに対し、比較例塗布群では完全治癒を認めたマウスはなく、ほぼ半数のマウスにおいて治癒が不完全であった。
【００２０】
また、本発明の実施例については、３カ月経過後においても、いずれも製剤の状態に変化は認められなかった。これに対して、比較例ではすべてに変色が認められた。皮膚刺激性についても、エタノールを５０重量％配合する実施例１〜実施例３で若干皮膚刺激指数は高くなっているが、それでも実用的には全く問題のない程度であった。一方、比較例ではいずれも各実施例に比べて皮膚刺激指数は有意に高い結果となった。
【００２１】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明により、安定性及び安全性に優れ、良好な阻害活性を有するコラゲナーゼ阻害剤を提供することができた。[0001]
[Technical field to which the invention belongs]
The present invention specifically cuts collagen, which is a constituent protein of connective tissue, to relieve skin aging, metabolic diseases such as osteoporosis, inflammatory diseases, arthritic diseases such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, The present invention relates to a collagenase inhibitor that can be safely used for treatment without side effects. More specifically, the present invention relates to a collagenase inhibitor comprising a dicarboxylic acid or a metal chelating agent thereof.
[0002]
[Prior art]
Collagen is a major protein constituting the connective tissue of animals, and 13 types of types I to XIII are known in various tissues. Collagenase is an enzyme that specifically cleaves such collagen protein. It is caused by aging and ultraviolet rays, skin wrinkles and decreased viscoelasticity, metabolic diseases such as osteoporosis, epidermolysis bullosa, corneal ulcer, root disease It is involved in a wide variety of diseases such as inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis and arthritic diseases such as osteoarthritis.
[0003]
Therefore, many attempts have been made to alleviate or treat the above-mentioned diseases by inhibiting collagenase activity. As collagenase inhibitors, amniotic membrane-derived substances (Japanese Patent Laid-Open No. 6-345636), buckwheat shell protein extract (International Publication 9420541), mussel extract, mint extract (JP-A-6-183990), water-soluble sugar derivative (JP-A-6-183941), lactoferrin (JP-A-5-186368), caffeic acid or a salt thereof (JP-A-5-117145) , Ascorbic acid, erythorbic acid and mixtures of these salts (Japanese Patent Laid-Open No. 4-290820), acetyl polyamide (French Patent 2669629), gallotannin (Japanese Patent Laid-Open No. 4-66524), κ-casein (Japanese Patent Laid-Open No. 4-41417), cacao Shell extract (JP-A-3-44331), hydroxamic acid Tiger peptide (JP-A 1-160997), 1,3-bis - substituted - such as naphthyl aminocarbonyl phenyl urea derivatives (JP-B-63-8101) have been disclosed.
[0004]
Further, since collagenase is a metalloprotease, metal chelating agents such as deferoxamine, ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) salt, tartaric acid and citric acid are also used as collagenase inhibitors.
[0005]
However, at present, satisfactory collagenase inhibitors that exhibit high inhibitory activity in a small amount and that have few side effects and high stability have not yet been obtained.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, the present invention shows high collagenase inhibitory activity in a small amount of application, is safe with no side effects, is highly stable in various preparation bases, and is applied to pharmaceuticals and cosmetics of various dosage forms. It is an object of the present invention to obtain a collagenase activity inhibitor.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of screening collagenase inhibitory activity of various substances in order to solve the above-mentioned problems, dicarboxylic acids still have a metal chelating action, have a mild action on living organisms, have almost no side effects, and have various forms of bases. The present invention was found to be stable, and the present invention was completed.
[0008]
In this invention, 1 type (s) or 2 or more types are selected from dicarboxylic acid and it mix | blends with a base. Dicarboxylic acids include glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, suberic acid, azelaic acid, sebacic acid, 1,9-nonamethylenedicarboxylic acid, 1,10-decamethylenedicarboxylic acid saturated dibasic having 5 to 12 carbon atoms. Acid is particularly preferred. As a compounding quantity, about 0.01 to 10.0 weight% is suitable with respect to the formulation whole quantity.
[0009]
Further, when one or more metal chelating agents are used in combination with one or more dicarboxylic acids, the collagenase inhibitory activity is synergistically enhanced. Examples of metal chelators include deferoxamine, sodium salt of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), phosphoric acid, citric acid, ascorbic acid, succinic acid, gluconic acid, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, etc. 1 type or 2 types or more are selected and blended.
[0010]
[Action]
The collagenase inhibitor of the present invention exhibits an excellent collagenase inhibitory action when added in a small amount, has a mild action on the living body, and is excellent in stability in the preparation. As a result, by applying the collagenase inhibitor of the present invention, skin wrinkles and viscoelasticity due to aging and ultraviolet rays, metabolic diseases such as osteoporosis, inflammation such as epidermolysis bullosa, corneal ulcer, and root disease It can relieve or treat arthritic diseases, arthritic diseases such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, etc., and also promotes healing of wounds.
[0011]
As an example, the collagenase inhibitory action of azelaic acid is shown below. Azelaic acid is added to an aqueous solution containing collagenase at a final concentration of 0 to 15 μg / ml so that the final concentrations are 8 mM and 16 mM, and then fluorescein isothiocyanate (FITC) -labeled collagen is added to a final concentration of 40 μg / ml. In addition, it incubated at 37 degreeC for 1 hour. After stopping the enzyme reaction by adding ethanol, centrifugation was performed to remove unreacted FITC-labeled collagen, and the fluorescence intensity in the supernatant was measured at an excitation wavelength of 495 nm and a fluorescence wavelength of 520 nm. For the system to which only a solvent containing no azelaic acid was added, the fluorescence intensity was measured in the same manner as a control. The results are shown in Table 1.
[0012]
[Table 1]

Table 1 also shows the collagenase inhibition rate determined by the formula (1). From this, it was shown that azelaic acid suppresses the release of FITC by collagenase to about 48 to 58% at 8 mM and to about 28 to 31% at 16 mM. That is, the collagenase inhibition rate increased depending on the concentration of azelaic acid, and reached 41.5 to 52.3 at 8 mM and 68.9 to 71.8% at 16 mM.
[Expression 1]

[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Collagenase inhibitors according to the present invention can be provided in the form of powders, aqueous suspensions, solubilized in aqueous bases containing polar organic solvents such as alcohol, or in the form of emulsions, foods, beverages, pharmaceuticals, cosmetics, etc. It can be added to and blended with. In food, it can be added to oil and fat products, emulsified products, soft drinks and the like. In the case of pharmaceuticals, addition to oral preparations, injections, external preparations for skin, etc. can be considered. As cosmetics, in addition to lotion, milky lotion, cream and the like, addition to oral compositions such as a mouthwash is also possible.
[0014]
【Example】
Further, the features of the present invention will be described in detail with reference to examples. First, as Examples 1 to 3 of the present invention, ethanol-containing aqueous preparation type collagenase inhibitors are shown in Table 2. In Table 2, dicarboxylic acid is dissolved in ethanol, mixed with purified water in which a chelating agent is dissolved, and solubilized.
[Table 2]

[0015]
Table 3 shows the formulations of Examples 4 to 6, which are emulsion type collagenase inhibitors. In Table 3, dicarboxylic acid is added to the oil phase and heated to 75 ° C. to dissolve and homogenize. On the other hand, a chelating agent is added to the aqueous phase, heated and dissolved, and kept at 75 ° C., and the oil phase component is gradually added and emulsified therein, followed by cooling to prepare.
[Table 3]

[0016]
Table 4 shows the formulations of Examples 7 to 9, which are cream type collagenase inhibitors. In Table 4, dicarboxylic acid is added to the oil phase and heated to 75 ° C. to dissolve and homogenize. On the other hand, a chelating agent is added to the aqueous phase, heated and dissolved, and kept at 75 ° C., and the oil phase component is gradually added and emulsified therein, followed by cooling to prepare.
[Table 4]

[0017]
About the Example of said this invention, the healing effect with respect to an inflammatory ulcer was evaluated. An inflammatory ulcer was caused by treatment with a surfactant on the back of 5 mice. A sample was applied to this site twice a day at a dose of 0.5 g for 7 days, and the ulcer healing status after 7 days was observed. The healing situation was evaluated in three stages of “complete healing”, “almost healing”, and “incomplete healing”, and the number of mice that obtained each evaluation was shown. In Tables 2 to 4, Comparative Examples 1 to 3 were prepared using dicarboxylic acid as gallotannin and ascorbic acid as a chelating agent, respectively.
[0018]
In addition, the stability and skin irritation when the preparation was stored at 25 ° C. for 3 months were also evaluated. Storage stability was evaluated as “◯: no change in state”, “Δ: slight discoloration or separation of components”, “×: significant discoloration or separation of components”, Skin irritation was evaluated by calculating a skin irritation index according to the criteria shown in Table 5 by a 48-hour occlusion patch test by 20 male panelists, and calculating an average value of 20 persons. The above results are summarized in Table 6.
[Table 5]

[0019]
[Table 6]

From Table 6, in the example application group of the present invention, any skin ulcer healing tendency was observed, and no mice with incomplete healing were found. In particular, good healing was observed in the application group of Example 8 and Example 9. On the other hand, in the comparative application group, no mouse showed complete healing, and healing was incomplete in almost half of the mice.
[0020]
In the examples of the present invention, no change was observed in the state of the preparations even after 3 months. On the other hand, discoloration was recognized in all the comparative examples. Regarding skin irritation, the skin irritation index was slightly higher in Examples 1 to 3 in which 50% by weight of ethanol was blended, but it was still practically no problem. On the other hand, in all the comparative examples, the skin irritation index was significantly higher than in each of the examples.
[0021]
【The invention's effect】
As described above in detail, according to the present invention, a collagenase inhibitor having excellent stability and safety and having good inhibitory activity could be provided.

Claims (1)

Translated fromJapanese

炭素数５〜炭素数１２のジカルボン酸から選択される１種もしくは２種以上の化合物と、エチレンジアミン四酢酸のナトリウム塩、リン酸、クエン酸、コハク酸、グルコン酸、ポリリン酸ナトリウム、及びメタリン酸ナトリウムから選択される１種もしくは２種以上の化合物とを有効成分として含有する皮膚炎症性潰瘍の治癒剤。  One or more compounds selected from C5-C12 dicarboxylic acids, ethylenediaminetetraacetic acid sodium salt, phosphoric acid, citric acid, succinic acid, gluconic acid, sodium polyphosphate, and metaphosphoric acid A healing agent for skin inflammatory ulcer, comprising one or more compounds selected from sodium as an active ingredient.