JP3587438B2 - Multi-well plate for freezing cultured cells - Google Patents

Description

Translated fromJapanese

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査や創薬、バイオテクノロジーの分野で主に利用される、培養細胞を用いたアッセイシステムに使用する凍結培養細胞において、培養基質上に培養された形態的特徴を維持したまま細胞を凍結し、長期保存可能になっている状態の動物細胞を凍結解凍し細胞を用いた測定系に使用する細胞培養用マルチウェルプレートに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、臨床検査や創薬、バイオテクノロジーの分野において、培養細胞を利用した細胞障害性や毒性に関するテストが多く実施されている。こうしたテストに用いられる細胞は、動物の組織から直接採取された初代細胞や、市販されている経代が可能な株細胞などが用いられる。特に経代が可能な株細胞はその細胞の特性を維持したままの凍結保存が可能であり、多数の種類があるので良く使用されている。こうした培養細胞を用いた細胞障害性や毒性に関するテストは、多数の検体を一度に処理できるウェルを多数持つマルチウェルプレート、特に９６ウェルのマルチウェルプレート（図１）を培養容器として実施される場合が多い。
【０００３】
一般的には、試験に用いる細胞を培養用シャーレや培養用フラスコなどの培養容器上で多量に培養した後、試験用の９６ウェルのマルチウェルプレートに細胞数を調製して播種し直し、細胞がマルチウェルプレートに接着、伸展して通常の培養形態を取ってから実際のテストに用いられる。培養細胞を用いたテストでは、細胞を必要量まで増殖させることに時間がかかり必要なときにすぐにテストが出来ない、また、いつでもテストを出来るようにするには常に多量の細胞を培養し維持してなければならない、といった問題点がある。まず第一の問題点のすぐにテストが出来ないという点は、素早く結果を出さなければならない臨床検査や創薬において重要な問題である。また、第二の問題点であるすぐにテストするために多量の細胞を維持しておくことは、常に細胞を培養するという時間と培養のための試薬類の無駄を抱えることになる。
【０００４】
通常、培養動物細胞は液体窒素中で凍結保存されており、必要に応じて解凍、培養して使用されるが、凍結保存には凍結用ガラスやプラスチックチューブが用いられ、その中で細胞は単細胞で溶液中に分散された状態で凍結されている。これは、こうした球状に分散した状態で細胞を保存することが最も安定に細胞を保存する方法だからである。しかし、この方法では、凍結細胞を溶解した後、細胞が必要量になるまで培養し続けなければいけない。
【０００５】
こうした培養の手間と時間を省略すべく特開平５−７７３８９号公報において、培養動物細胞を培養基質に培養された状態で凍結する方法が示されている。培養基質上で細胞を培養し、その形態を保ったままで凍結する方法である。特開平５−７７３８９号公報においては実施例として３５ｍｍのプラスチック製培養皿を用いて培養細胞の凍結を実施しており、良好な結果を得たとしている。しかし、多くの場合、解凍後、細胞は生きてはいるものの、シャーレやプレートから一部剥がれたりしており、すべての細胞が凍結前の接着した状態を保つのは難しい状況である。特に、この技術は細胞を培養することが目的でなく、その培養細胞を用いてアッセイする系で使用するため、生存している細胞はすべて同じ状態でなければならない。従って、細胞の剥がれを防止する方法を講じなければならない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、マルチウェルプレート上で培養した細胞を凍結し、解凍時にマルチウェルプレート内でのウェル毎の生存細胞の接着性を高め、解凍後は細胞培養用または実験用マルチウェルプレートとして活用することを目的とし、種々の検討を加えた結果、本発明に至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、細胞を培養した状態で培養器ごと凍結させ、必要時に解凍して培養するためのマルチウェルプレートであって、多数の細胞を培養するための区画からなり、解凍時の解凍時間を短縮するためにウェルの肉厚を０．５ｍｍ以下にしたもので、解凍時に細胞を培養器表面に保持するためにその培養面に細胞接着因子を塗布することを特徴とする培養細胞凍結用マルチウェルプレートである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
凍結させた培養細胞の解凍後の生存率を高めるためには解凍に要する時間を短縮することが重要であることが必要である。その場合、多量の熱量を加えれば解凍時間が短縮されることは明らかである。しかし、本来の目的である解凍後の細胞を培養して使用するためには、細胞が正常な状態で生存していることが重要なポイントとなり、細胞の正常性を保つためには、細胞の由来動物の体温（ヒトの場合３７℃）を越えて加熱することが出来ない。これを越えて加熱すると蛋白質の変成や、ストレス蛋白質の発現が生じ細胞が正常な状態でなくなり、時には細胞死が生じるといった事態になる。従って、加温する環境温度は３７℃前後でなくてはならない。
【０００９】
通常、細胞培養用マルチウェルプレートは、顕微鏡下での観察が可能なようにポリスチレン等の透明樹脂で成形され、通常、１．５〜２．５ｍｍの厚みを有している。この培養容器を用いた凍結培養容器を３７℃インキュベーターに入れただけでは、肉厚があるため、解凍に時間がかかり、そのため、解凍後の細胞の生存率が低くなり、細胞が使用に耐えない状態となる。特にこの傾向はマルチウェルプレートの中央部でウェルが多数集まっている部分で顕著に現れる。
【００１０】
上記の問題を解決する一つの方法として、マルチウェルプレートを形成する樹脂を一般的に使用されるポリスチレンから熱伝導率の良いプラスチック樹脂に変えることと、マルチウェルプレートの肉厚を薄くすることが考えられる。熱伝導率の良い樹脂では、マルチウェルプレート内部への熱伝導が可能となり少しでも早く内部の凍結部位に熱が伝わることとなる。さらに肉厚を薄くする事によってマルチウェルプレート自体を暖めるために使われる熱量を少なくし、少しでも早く多く、マルチウェルプレート内部の凍結物に熱を伝えようとするものである。
【００１１】
こうして熱伝導を高め、素早い解凍を行っても、先述したように、解凍後、細胞は生きてはいるものの、シャーレやプレートから剥がれて培養液中に浮いたり、接着細胞がシート上になりそのシートの一部が剥がれて丸まったりしており、こうした細胞の剥がれを防止するためには細胞の基材への接着性を高めることである。培養において細胞の接着を高める方法は種々あるが、最も確実で簡便なのは、培養器の細胞接着領域（図２）、具体的にはウェルの底面部に細胞接着因子を塗布または固定化する方法である。細胞接着因子は、生体内で実際に細胞が存在しているときに、その足場として存在する蛋白質、ペプチドのことで、細胞との親和性、接着性の高さは生体内での細胞の安定性で証明されている。
【００１２】
細胞接着因子をプラスチック製品の表面に塗布または固定化する方法は、単純に容器に目的とする細胞接着因子溶液を入れ物理的な吸着により容器表面に細胞接着因子を吸着させる方法、容器表面にプラズマ放電や化学薬品の処理により水酸基やアミノ基、カルボキシル基等の官能基を導入し細胞接着因子の持つ反応性の官能基群と化学的に結合させ表面に細胞接着因子を固定化する方法などがある。
【００１３】
細胞接着因子を培養器に塗布するには、単純に成形した成型物に細胞接着因子を含む溶液を分注して１時間から１晩放置して物理吸着させることも可能であるが、より吸着量を高めるには、プレートの培養表面を、コロナ放電処理、プラズマ処理、又は酸化処理等を施すことで細胞接着因子の吸着量や吸着の強度を変えることができる。
【００１４】
化学結合で樹脂表面に細胞接着因子を固定化するためには、培養器の培養領域に反応性の官能基を導入する必要がある。こうした官能基を導入する方法としては、酸素、一酸化炭素、窒素、アンモニアを用いたプラズマ放電処理が簡単で汎用性、生産性の点で優れている。また、表面プラズマ重合等で官能基を多数持つポリマー（アクリル酸等）を重合させ、それを利用することも可能である。培養器側の官能基と細胞接着因子を化学結合させるための方法としては、グルタルアルデヒド等の化学架橋剤を用いる方法と、一方の官能基を活性化させてもう一方の官能基と反応させる方法がある。一例を挙げると、プレート表面に一酸化炭素プラズマ処理によりカルボキシル基を導入し、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）で活性化させたのち、直ちに細胞接着因子を含む水溶液を入れ、細胞接着因子のアミノ基とのあいだでアミド結合を起こさせる。
【００１５】
簡便さでは物理吸着法であるが、細胞接着因子の確実な保持や、分子量の小さな細胞接着因子には化学結合法が適している。本発明においてはどちらをの方法も使用することができる。
細胞接着因子には、コラーゲンＩ型やコラーゲンＩＶ型に代表されるコラーゲン類、細胞接着因子として広く認められているファイブロネクチン、入手しやすく取り扱いも簡単なゼラチン、神経細胞の培養に適しているポリ−Ｌ−リジン、生体内でコラーゲンＩＶ型と一緒に基底膜を形成しているラミニン等、多種存在し、必要に応じてどれを用いても良い。また、１種類だけでなく、２種類、３種類と細胞接着因子を混合して使用することもできる。これらの細胞接着因子は細胞により接着挙動が異なるため、本来ならば、培養するそれぞれの細胞に適した細胞接着因子を探して用いることが最も良い方法である。しかし現実問題として個々の細胞に適した細胞接着因子を検索することは、それだけでかなりの労力を割くこととなる。従って、既に公知となっている細胞と細胞接着因子の組み合わせ（例えばポリ−Ｌ−リジンと神経細胞）以外では、コラーゲンＩ型コートが好適に用いられている。
【００１６】
【実施例】
（実施例）
透明塩ビシートをマルチウェルプレート状に加工したものを、紫外線滅菌し、ウェル底面に０．２μｍの孔径のメンブレンフィルターで濾過滅菌した塩酸酸性コラーゲンＩ型溶液０．０３％溶液を１時間入れ、コラーゲンを塗布した。
ヒト肝細胞癌由来株細胞のＨｅｐＧ２細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０％のウシ胎児血清を加えた培養液で１Ｘ１０^５細胞／ｍＬに懸濁し、プレートの各ウェルの１００μＬづつ分注した。（最終細胞濃度１Ｘ１０^４細胞／ウェル）細胞播種後プレートは、３７℃、炭酸ガス濃度５％の炭酸ガス培養器中で一晩培養した。
【００１７】
光学顕微鏡による形態観察で、細胞がプレートに接着しているのを確認した後、培養液を、細胞凍結保存用培地に交換し、−２０℃の冷凍庫で培養細胞ごと凍結させた。凍結後は−８０℃の冷凍庫中で保存。−８０℃の冷凍庫保存３日目に、凍結したプレートを冷凍庫より取り出し、３７℃のインキュベーター中で、既に３７℃に加温してあるプレート加温用のアルミブロックの上で加温処理し、凍結を解凍した。解凍後そのままま状態でプレート内に存在する細胞数を計測した。さらに、プレート内をＰＢＳ２００μＬで３回洗浄し、生きている細胞でも剥がれた細胞や、剥がれ掛けている細胞を除去した後、プレートの培養面に接着して残っている細胞数を求めた。
【００１８】
（比較例）
透明塩ビシートをマルチウェルプレート状に加工したものを、紫外線滅菌した。
ヒト肝細胞癌由来株細胞のＨｅｐＧ２細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０％のウシ胎児血清を加えた培養液で１Ｘ１０^５細胞／ｍＬに懸濁し、プレートの各ウェルの１００μＬづつ分注した。（最終細胞濃度１Ｘ１０^４細胞／ウェル）細胞播種後プレートは、３７℃、炭酸ガス濃度５％の炭酸ガス培養器中で一晩培養した。
【００１９】
光学顕微鏡による形態観察で、細胞がプレートに接着しているのを確認した後、培養液を、細胞凍結保存用培地に交換し、−２０℃の冷凍庫で培養細胞ごと凍結させた。凍結後は−８０℃の冷凍庫中で保存。−８０℃の冷凍庫保存３日目に、凍結したプレートを冷凍庫より取り出し、３７℃のインキュベーター中で加温処理し、凍結を解凍した。解凍後そのままま状態でプレート内に存在する細胞数を計測した。さらに、プレート内をＰＢＳ２００μＬで３回洗浄し、生きている細胞でも剥がれた細胞や、剥がれ掛けている細胞を除去した後、プレートの培養面に接着して残っている細胞数を求めた。
【００２０】

【００２１】
上記のように、実施例１、２において凍結状態の解凍時間には影響がないが、細胞生存率で数％であるが、表面にコラーゲンを塗布したほうが、細胞生存率が高くり、それ以上に、剥がれた細胞、剥がれ掛けている細胞を除いて接着細胞だけで生存率を計算するとコラーゲン塗布の方が細胞生存率の落ち込みが８％、コラーゲン塗布のない方が、１８％と大きな差がみられた。
【００２２】
【発明の効果】
本発明の培養面に細胞接着因子を塗布した培養細胞凍結用マルチウェルプレートで細胞を培養することにより、細胞を培養状態で凍結させられ、細胞が必要な時に凍結融解させた際に剥がれる細胞が少なく、細胞を用いた実験が安定に行えるので、細胞が増えるのを待ったり、細胞を常に培養しておく必要が無く、時間的、経済的な無駄を減らすことが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞培養用のマルチウェルプレートの１例の斜視図
【図２】細胞培養用マルチウェルプレートのウェル断面図
【符号の説明】
１１ 細胞培養用マルチウェルプレート
１２ ウェル
１３ マルチウェルプレート用プレート蓋
１４ ウェル内細胞培養領域[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention is a frozen culture cell used for an assay system using cultured cells, which is mainly used in the fields of clinical tests, drug discovery and biotechnology, while maintaining morphological characteristics cultured on a culture substrate. The present invention relates to a multiwell plate for cell culture used for freezing and thawing animal cells in a state where cells can be frozen and stored for a long period of time and using the cells in a measurement system.
[0002]
[Prior art]
In recent years, in the fields of clinical examination, drug discovery, and biotechnology, many tests for cytotoxicity and toxicity using cultured cells have been performed. The cells used for such tests include primary cells directly collected from animal tissues and commercially available cell lines that can be passaged. In particular, cell lines that can be passaged can be cryopreserved while maintaining the characteristics of the cells, and are often used because there are many types. Tests for cytotoxicity and toxicity using such cultured cells are performed when a multiwell plate having many wells capable of processing a large number of samples at once, particularly a 96-well multiwell plate (FIG. 1) is used as a culture vessel. There are many.
[0003]
Generally, after culturing a large number of cells to be used for a test on a culture vessel such as a culture dish or a culture flask, the number of cells is prepared and re-seeded in a 96-well multi-well plate for the test, and the cells are re-seeded. Is used in actual tests after adhering and spreading to a multiwell plate and taking a normal culture form. In the test using cultured cells, it takes time to grow the cells to the required amount and it is not possible to perform the test immediately when it is necessary.Also, to be able to perform the test at any time, always culture and maintain a large amount of cells There is a problem that must be done. The first problem is that tests cannot be performed immediately, which is an important issue in clinical tests and drug discovery that require quick results. Also, maintaining a large number of cells for immediate testing, which is the second problem, wastes the time of constantly culturing the cells and waste of culturing reagents.
[0004]
Usually, cultured animal cells are cryopreserved in liquid nitrogen and thawed and cultured as needed.However, cryopreservation uses frozen glass or plastic tubes, in which cells are single cells Is frozen in a state of being dispersed in the solution. This is because storing cells in such a spherically dispersed state is the most stable method for storing cells. However, in this method, after thawing the frozen cells, the culture must be continued until the cells reach the required amount.
[0005]
Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 5-77389 discloses a method of freezing cultured animal cells in a state of being cultured on a culture substrate in order to save such labor and time of culture. This is a method in which cells are cultured on a culture substrate and frozen while maintaining their morphology. In JP-A-5-77389 Patent Publication hasimplemented freezing cultured cells using plastic culture dishes 35mm as example, it is set to give good results. However, in many cases, cells are alive after thawing, but are partially detached from petri dishes or plates, and it is difficult to keep all cells in an adhered state before freezing. In particular, since this technique is not used for culturing cells but is used in a system for assaying using the cultured cells, all living cells must be in the same state. Therefore, measures must be taken to prevent cell detachment.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention freezes cells cultured on a multi-well plate, enhances the adhesion of viable cells per well in the multi-well plate at the time of thawing, and utilizes it as a cell culture or experimental multi-well plate after thawing. As a result, various studies have been made for the purpose, and the present invention has been achieved.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
That is, the present invention is a multi-well plate for freezing the whole incubator in a state where the cells are cultured, thawing and culturing when necessary, comprising a compartment for culturing a large number of cells, and the thawing time during thawing. The thickness of the well is reduced to 0.5 mm or less in order to shorten the time, and a cell adhesion factor is applied to the culture surface to hold the cells on the surface of the incubator at the time of thawing. It is a multiwell plate.
[0008]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In order to increase the survival rate of frozen cultured cells after thawing, it is necessary to reduce the time required for thawing. In that case, it is clear that the thawing time can be shortened by adding a large amount of heat. However, in order to culture and use the cells after thawing, which is the original purpose, it is important that the cells survive in a normal state, and in order to maintain the normality of the cells, It cannot be heated above the body temperature of the animal of origin (37 ° C. for humans). Heating beyond this causes denaturation of proteins and expression of stress proteins, causing cells to be in an abnormal state and sometimes causing cell death. Therefore, the temperature of the environment to be heated must be around 37 ° C.
[0009]
Usually, the multi-well plate for cell culture is formed of a transparent resin such as polystyrene so as to enable observation under a microscope, and usually has a thickness of 1.5 to 2.5 mm. If the frozen culture container using this culture container is simply placed in a 37 ° C. incubator, it takes a long time to thaw due to the thickness, and therefore, the survival rate of the cell after thawing becomes low, and the cell cannot withstand use. State. This tendency is particularly remarkable in the central part of the multi-well plate where many wells are gathered.
[0010]
One way to solve the above problem is to change the resin that forms the multiwell plate from commonly used polystyrene to a plastic resin with good thermal conductivity, and to reduce the thickness of the multiwell plate. Conceivable. With a resin having a good thermal conductivity, heat can be conducted to the inside of the multi-well plate, and the heat can be transmitted to the frozen portion inside as quickly as possible. Further, by reducing the wall thickness, the amount of heat used to warm the multi-well plate itself is reduced, and the amount is increased as soon as possible to transfer heat to the frozen material inside the multi-well plate.
[0011]
Even if the heat conduction is increased and thawed quickly, as described above, the cells are alive after thawing, but detached from the petri dish or plate and floated in the culture medium, or the adherent cells became on the sheet A part of the sheet is peeled and rounded, and in order to prevent such peeling of the cells, it is necessary to increase the adhesion of the cells to the substrate. There are various methods for increasing cell adhesion in culture, but the most reliable and simplest method is to apply or immobilize a cell adhesion factor on the cell adhesion region of the incubator (Fig. 2), specifically, the bottom of the well. is there. Cell adhesion factors are proteins and peptides that exist as scaffolds when cells actually exist in the living body. Proven by gender.
[0012]
The method of applying or immobilizing the cell adhesion factor on the surface of a plastic product consists of simply placing a cell adhesion factor solution of interest in a container and adsorbing the cell adhesion factor on the surface of the container by physical adsorption. A method of immobilizing a cell adhesion factor on the surface by introducing a functional group such as a hydroxyl group, an amino group, or a carboxyl group by discharging or treating a chemical and chemically bonding the functional group to the reactive functional group of the cell adhesion factor. is there.
[0013]
In order to apply the cell adhesion factor to the incubator, it is possible to dispense a solution containing the cell adhesion factor into a simply molded article and leave it for 1 hour to overnight to allow physical adsorption. In order to increase the amount, the amount of cell adhesion factor adsorbed or the intensity of adsorption can be changed by subjecting the culture surface of the plate to corona discharge treatment, plasma treatment, oxidation treatment, or the like.
[0014]
In order to immobilize the cell adhesion factor on the resin surface by chemical bonding, it is necessary to introduce a reactive functional group into the culture region of the incubator. As a method for introducing such a functional group, a plasma discharge treatment using oxygen, carbon monoxide, nitrogen, and ammonia is simple, and is excellent in versatility and productivity. Further, it is also possible to polymerize a polymer having a large number of functional groups (such as acrylic acid) by surface plasma polymerization or the like and use the resulting polymer. As a method for chemically bonding the cell adhesion factor to the functional group on the incubator side, a method using a chemical cross-linking agent such as glutaraldehyde, or a method in which one functional group is activated and reacted with the other functional group There is. As an example, a carboxyl group is introduced into the plate surface by a carbon monoxide plasma treatment, activated with water-soluble carbodiimide (WSC), and immediately thereafter, an aqueous solution containing a cell adhesion factor is immediately put into the cell surface. An amide bond is formed between
[0015]
Although the physical adsorption method is used for simplicity, the chemical bonding method is suitable for securely retaining the cell adhesion factor and for the cell adhesion factor having a small molecular weight. Either method can be used in the present invention.
Cell adhesion factors include collagens represented by collagen type I and collagen type IV, fibronectin, which is widely recognized as a cell adhesion factor, gelatin that is easily available and easy to handle, and poly that is suitable for culturing nerve cells. There are many types such as -L-lysine, laminin forming a basement membrane together with collagen type IV in a living body, and any of them may be used as needed. Not only one kind but also two kinds or three kinds and a cell adhesion factor can be mixed and used. Since these cell adhesion factors have different adhesion behaviors depending on the cells, it is originally best to search for and use a cell adhesion factor suitable for each cell to be cultured. However, as a matter of fact, searching for a cell adhesion factor suitable for individual cells is a considerable effort alone. Therefore, a collagen type I coat is preferably used except for a combination of a cell and a cell adhesion factor which is already known (for example, poly-L-lysine and a nerve cell).
[0016]
【Example】
(Example)
A transparent PVC sheet processed into a multi-well plate was sterilized by ultraviolet light, and a 0.03% solution of hydrochloric acid-acidic collagen type I solution sterilized by filtration through a membrane filter having a pore diameter of 0.2 μm was added to the bottom of the well for 1 hour. Was applied.
HepG2 cells, a human hepatocellular carcinoma-derived cell line, are suspended at 1 × 10⁵ cells / mL in a culture solution containing 10% fetal bovine serum in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), and 100 μL of each well of the plate is dispensed. did. (Final cell concentration: 1 × 10⁴ cells / well) After cell seeding, the plate was cultured overnight at 37 ° C. in a carbon dioxide gas incubator having a carbon dioxide gas concentration of 5%.
[0017]
After confirming that the cells adhered to the plate by morphological observation with an optical microscope, the culture solution was replaced with a cell cryopreservation medium, and the cultured cells were frozen in a freezer at -20 ° C. After freezing, store in a -80 ° C freezer. On the third day of storage at −80 ° C. in a freezer, the frozen plate was taken out of the freezer, and heated in an incubator at 37 ° C. on an aluminum block for heating the plate that had already been heated to 37 ° C. Freeze was thawed. After thawing, the number of cells existing in the plate was counted as it was. Further, the inside of the plate was washed three times with 200 μL of PBS to remove the detached cells and the detached cells even from living cells, and then the number of cells remaining adhered to the culture surface of the plate was determined.
[0018]
(Comparative example)
A transparent PVC sheet processed into a multiwell plate was sterilized by ultraviolet light.
HepG2 cells, a human hepatocellular carcinoma-derived cell line, are suspended at 1 × 10⁵ cells / mL in a culture solution containing 10% fetal bovine serum in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), and 100 μL of each well of the plate is dispensed. did. (Final cell concentration: 1 × 10⁴ cells / well) After cell seeding, the plate was cultured overnight at 37 ° C. in a carbon dioxide gas incubator having a carbon dioxide gas concentration of 5%.
[0019]
After confirming that the cells adhered to the plate by morphological observation with an optical microscope, the culture solution was replaced with a cell cryopreservation medium, and the cultured cells were frozen in a freezer at -20 ° C. After freezing, store in a -80 ° C freezer. On the third day of storage at −80 ° C. in a freezer, the frozen plate was taken out of the freezer, heated in a 37 ° C. incubator, and thawed. After thawing, the number of cells existing in the plate was counted as it was. Further, the inside of the plate was washed three times with 200 μL of PBS to remove the detached cells and the detached cells even from living cells, and then the number of cells remaining adhered to the culture surface of the plate was determined.
[0020]

[0021]
As described above, in Examples 1 and 2, there is no effect on the thawing time in the frozen state, but the cell viability is several percent, but the cell viability is higher when the surface is coated with collagen, Excluding the detached and detached cells, the viability was calculated using only the adherent cells. The difference in cell viability was 8% with collagen application and 18% with no collagen application. Was seen.
[0022]
【The invention's effect】
By culturing the cells in a multiwell plate for freezing cultured cells coated with a cell adhesion factor on the culture surface of the present invention, the cells can be frozen in a cultured state, and the cells that peel off when frozen and thawed when necessary are removed. In addition, since experiments using cells can be stably performed, there is no need to wait for the cells to increase or to constantly culture the cells, so that time and economic waste can be reduced.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a perspective view of an example of a multi-well plate for cell culture. FIG. 2 is a cross-sectional view of wells of the multi-well plate for cell culture.
11 Multi-well plate forcell culture 12 well 13 Plate lid formulti-well plate 14 Cell culture area in well

Claims (1)

Translated fromJapanese

多数の細胞を培養するための区画からなる培養細胞凍結用マルチウェルプレートで細胞を培養し、培養した状態で培養器ごと凍結させ、加温して解凍する培養細胞の解凍方法であって、該マルチウェルプレートがプラスチック樹脂からなり、細胞培養部の樹脂の肉厚が０．５ｍｍ以下であり、解凍時に細胞を培養器表面に保持するためにその培養面にコラーゲン、ラミニン、又はフィブロネクチンからなる細胞外マトリックス、又はポリ−Ｌ−リジンのポリペプチドである細胞接着因子を塗布、または化学結合により保持することを特徴とする培養細胞の解凍方法。A method for thawing cultured cells, comprising culturing cells in a multi-well plate for freezing cultured cells comprising a compartment for culturing a large number of cells, freezing the whole incubator in the cultured state, and heating and thawing. The multiwell plate is made of a plastic resin, and the thickness of the resin in the cell culture section is 0.5 mm or less. A method for thawing cultured cells, comprising applying an external matrix or a cell adhesion factor, which is a polypeptide of poly-L-lysine, or retaining the cell adhesion factor by chemical bonding.

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