JP3476679B2 - Composition for electrochemiluminescence assay - Google Patents

Abstract

Novel compounds for use in electrochemiluminescent assays and characterised by containing the structure        X - Y - ZwhereinX represents one or more nucleotides which may be the same or different, one or more amino acids which may be the same or different, an antibody, an analyte of interest or an analogue of an analyte of interestY represents a linker group attached to X and Z,andZ represents an electrochemiluminescent moiety, and intermediates employed in their synthesis.

Description

Translated fromJapanese

【発明の詳細な説明】【０００１】【産業上の利用分野】本出願に関する刊行物はカッコ内
にアラビア数字で示す。これらの参考文献の引用一覧は
請求の範囲のすぐ前の発明明細書の最後に挙げてある。
これらの刊行物に関する完全な説明を記載するのは、そ
れによって本発明に関連する技術状況をより完全に説明
できるよう本出願に参考文献を引用しているためであ
る。化学的、生化学的、生物学的物質を検出し定量する
ための速やかかつ高度に特異的な方法が常に必要とされ
需要が拡大している。特に少量の医薬品、代謝産物、微
生物やその他の診断上価値のある材料を測定するための
方法は重要である。このような材料の例としては麻薬及
び毒薬、治療上の目的で投与される薬物、ホルモン、病
原性をもつ微生物及びウイルス、抗体、代謝産物、酵素
や核酸等が挙げられる。【０００２】【従来の技術】このような材料の存在は高度な特異性を
もつ結合法を用いて検出されることが多く、これによっ
て多くの生化学及び生物学的系の特徴が明らかになって
いる。頻繁に使用されている方法の例としては、抗原−
抗体系、核酸ハイブリッド形成法、たん白質−リガンド
系等がある。このような方法においては通常複雑な材料
の１つあるいはそれ以上に目印としてつけた検出可能な
「標識」の有無によって診断上有用な複合体の存在が明
らかになっている。選択した特異的標識方法によって当
該材料の検出のための特別な系の有用性及び融通性が決
まることが多い。好ましい標識物の条件としては安価で
あり安全であって、多岐にわたる化学的、生化学的、生
物学的材料の重要な結合特性を変化させることなしに効
率よくそれらの材料に標識できることが必要である。標
識物は高度に特徴的な目印をもっていなければならず、
さらに天然にはほとんど、あるいはより好ましくは全く
存在していないことが必要である。標識物は安定であり
何か月にもわたる期間を経て水溶液系中で検出可能であ
ることが要求される。検出の際には高価な特別の設備や
技術者を必要とせず、速やかに、かつ高い感度、及び再
現性をもって標識物が検出されなければならない。標識
物の定量に当たっては、温度や供試混合物の組成といっ
た変化要素に比較的影響されにくいことが必要である。
均一系、すなわち標識材料の複合体及び非複合体を分離
する必要のない系において使用できる標識物が最も有用
である。標識された材料が特定の複合体中に取り込まれ
た時に標識物の検出度を調節するようにすればこれが可
能である。【０００３】非常に多くの種類の標識物が開発されてお
り、それぞれ長所、短所をもっている。例えば放射性標
識物はきわめて多用途に使用でき、非常に低い濃度にお
いても検出可能である。しかし高価で危険性もあり、そ
の使用のためには精巧な装置と訓練を受けた技術者とが
必要である。さらに放射性標識物の感度は、標識された
材料において検出し得る事象というのがその本質上放射
性原子当たり１回しか起こらないという事実によって限
定されてしまう。また放射性標識物は均質法においては
使用できない。【０００４】このため非放射性の標識物に高い関心が集
まっている。例えば分光測光、スピン共鳴、ルミネセン
ス法によって検出可能な分子や、そのような分子を産生
し得る酵素等がそれに含まれる。有用な非放射性標識材
料の中に有機金属化合物がある。ある種の金属は生物学
的系においてまれにしか存在しないため、有機金属化合
物中の金属成分を特異的に試験する方法が有効となる。
例えばＣａｉｓ、アメリカ特許番号４，２０５，９５２
（１９８０年）は、特異的抗原を定量するのにある種の
有機金属化合物によって標識された免疫化学的活性材料
を使用している。このような標識物に対しては選択した
金属を検出するのに発光、吸収、蛍光分光法、原子吸
光、中性子活性化等を含む一般的手法がどれでも使用で
きる。これらの方法は感度が低いという欠点をもつこと
が多く、均質系にはほとんど適用できない。また原子吸
光に関しては時として試料の破壊を伴う。光化学的、化
学的、電気化学的手段を通じて発光するように作られた
標識物は特に興味深い。「光化学ルミネセンス」とは材
料が電磁放射線を吸収した時に発光するように作られた
過程である。蛍光及びりん光は光化学ルミネセンスの一
種である。「化学ルミネセンス」過程にはエネルギーの
化学的変換による発光物の産生が伴っている。「エレク
トロ化学ルミネセンス」には電気化学的に産生される発
光物が伴う。【０００５】このような発光系の重要性は増加してい
る。例えばＮａｎｄｌｅ、アメリカ特許番号４，３７
２，７４５（１９８３年）は免疫化学的応用分野におい
て化学ルミネセンス標識物を使用している。この系では
標識物がＨ₂Ｏ₂とシュウ酸塩と反応することによる化
学的手段によって標識物を発光状態に励起させている。
この系ではＨ₂Ｏ₂がシュウ酸塩を酸化して高エネルギ
ー誘導体に転換しその結果標識物を励起させるのであ
る。この系は原理的には、試験における酸化条件下で安
定であり高エネルギーシュウ酸塩誘導体によって励起さ
れ得る発光物質であればどんな材料でも使用できる。残
念なことにこのようにきわめて融通性の高いことが技術
の限界の主な要因となってしまう。当該分析物を含む生
物学的溶液は一般に発光の可能性をもつ物質も大量に含
んでおり、ルミネセンスのバックグラウンド値を高くす
る原因となる。【０００６】化学ルミネセンスの免疫化学的利用法でや
はり同様の欠点をもつもう１つの例は、Ｏｂｅｒｈａｒ
ｄｔら、アメリカ特許番号４，２８０，８１５（１９８
１年）によるもので、化学ルミネセンスによって標識さ
れた免疫反応物質と非常によく類似しているｉｎｓｉ
ｔｕにおける酸化剤（例えばＨ₂Ｏ₂）の電気化学的産
生に関して述べている。電気的に産生されたオキシダン
トが化学ルミネセンス物質中に拡散しそれを化学的に酸
化することによって１つ以上の電子を電気的に産生され
たオキシダントに転移させる。化学ルミネセンス物質は
酸化される際に光子を放つ。これに対し本発明の対象物
では、電気化学的エネルギー源から化学ルミネセンス物
質への直接の電子転移が必要であり、このため光子の連
続放出が可能となる。【０００７】【発明が解決しようとする課題】本発明はエレクトロ化
学ルミネセンス標識物に関するものである。適切な標識
物としては有機化合物及び有機金属化合物を含むエレク
トロ化学ルミネセンス化合物から成るものを用いる。多
くの理由から、標識された材料の存在を検出する方法と
しては他の方法よりもエレクトロ化学ルミネセンス法の
方が適している。特定の標識物の存在を高度に判定で
き、感度が高く、危険性が少なく、安価であり、さらに
応用範囲も広い。電気化学的標識物として適切な有機化
合物には例えばルブレンや９，１０−ジフェニルアント
ラセン等がある。有機金属化合物の多くが電気化学的標
識物として適しているが、特にルテニウム及びオスミウ
ム含有化合物は有用である。【０００８】このため１つの具体例として本発明では多
岐にわたる方法を用いて検出可能なルテニウム及びオス
ミウム含有標識物の使用について述べている。これらの
標識物は以下の文中で論ずるように数多くの点で有益な
ものである。ルテニウム及びオスミウム含有有機金属化
合物については文献中でも論じられている。Ｃａｉｓは
ルテニウムのような第８群の貴金属を含む金属元素ある
いはそのような金属元素の組み合わせであればどれでも
原子吸光法によって検出可能な有機金属標識物の成分と
して適切であると述べている（Ｃａｉｓ、１１列２０
行）。しかしＣａｉｓの文献においてはルテニウムは適
切な金属とされておらずオスミウムに関しては特に言及
されておらず、記載されたどの方法にもルテニウムまた
はオスミウムを使用した場合の有効性に関するデータは
含まれていないし、適切な方法とされている原子吸光法
には試料の破壊が伴っている。【０００９】Ｗｅｂｅｒ、アメリカ特許番号４，２９
３，３１０（１９８１年）はイムノアッセイにおける分
析物の電気化学的標識物としてルテニウム及びオスミウ
ム含有複合体を使用することに関する報告をしている。
この複合体は分析物のチオ尿素結合を通じてアミノ基に
結合している。Ｗｅｂｅｒはまた他の分析物の水酸基と
標識物との間にカルボキシルエステルを形成し得る可能
性もあると述べている。Ｗｅｂｅｒによると標識された
材料の存在は、消光物質と光学手段を用いた電気化学的
フローセルから成る器具、方法で検出できるとのことで
ある。光電気化学的に活性な標識物が励起すると、電子
を消光物質分子に転移させる。酸化された分子は続いて
適当な電位に保ったフローセルの電極からの電子によっ
て還元される。この電子を光電子流として測定するので
ある。系中の遊離標識分析物は光電子流信号によって測
定する。この方法は発光材料のエレクトロ化学ルミネセ
ンス検出の逆であることに留意すべきである。【００１０】Ｗｅｂｅｒらはその後の報告で、ルテニウ
ム含有標識物を検出するためにこの方法を用いる際の問
題点について論じている（１）。Ｗｅｂｅｒら（１）の
表２によると、トリス（ビピリジル）ルテニウム（Ｉ
Ｉ）の外挿検出限界は最適条件下で１．１×１０^-10モ
ル／ｌとなっている。これらの標識物を実際に使用する
際には複合体混合物の存在下で測定することになるであ
ろうと予想し、Ｗｅｂｅｒらはその系において考えられ
る妨害物について調査した。Ｗｅｂｅｒらの表３ではジ
メチルアルキルアミン類、ＥＤＴＡ、Ｎ−メチルモルホ
リン、Ｎ，Ｎ′−ジメチルピペラジン、水酸化物、シュ
ウ酸塩、アスコルビン酸塩、尿酸、血清等が、実際の検
出限界を１．１×１０^-10モル／ｌ以上に引き上げると
考えられる妨害物として挙げられている。これらの研究
は単純なルテニウム含有化合物を用いて行なわれてい
る。ルテニウム含有標識物によって標識した複合体の検
出限界に関して、またこの試験条件下において標識され
た材料と標識物との間のチオ尿素結合が安定であるかど
うかに関しての記述はＷｅｂｅｒ、あるいはＷｅｂｅｒ
らの報告中にはされていなかった。【００１１】本発明における標識物はエレクトロ化学ル
ミネセンスに関するものである。この標識物は電磁放射
線や、シュウ酸塩−Ｈ₂Ｏ₂のような代表的系により産
生される化学エネルギー源に接触することで酸化あるい
は還元されなくても、発光状態にまで励起し得ることが
多い。さらに酸化、還元を伴う電気化学的方法によって
もこれらの化合物の発光を起こすことができる。光化学
ルミネセンス、化学ルミネセンス、エレクトロ化学ルミ
ネセンスの手段を用いてルテニウム（２，２−ビピリジ
ン）₃２⁺を検出する方法に関しての詳細な研究が報告
されている（２，３）。この研究ではシュウ酸イオンま
たは他の有機酸の酸化の中間体として産生された強い還
元剤と共に化学的あるいは電気的に生成されるルテニウ
ム（ｂｐｙ）₃³⁺（「ｂｐｙ」はビピリジルリガンドの
こと）の水性反応によって明るいオレンジ色の化学ルミ
ネセンスが得られると述べている。また過酸化二硫酸の
還元に伴い産生された強い還元剤と共に電気的あるいは
化学的に生成されるルテニウム（ｂｐｙ）₃¹⁺の反応に
よって、有機溶剤−水溶液中でルミネセンスを得ること
も可能である。ルテニウム（ｂｐｙ）₃²⁺からエレクト
ロ化学ルミネセンスを得るための３番目の機構として
は、電極の電位をルテニウム（ｂｐｙ）₃¹⁺を産生する
のに十分なマイナス電位とルテニウム（ｂｐｙ）₃³⁺を
産生するのに十分なプラス電位との間で振動させるとい
う方法がある。以上の３種類の方法はそれぞれ「酸化還
元」、「還元酸化」、「ルテニウム（ｂｐｙ）₃^3+/+再
生系」と呼ばれている。【００１２】酸化還元法は水中で行うことができ、強
く、有効で、安定なルミネセンスが得られ、酸素や不純
物の存在に対しては比較的感受性が低い。このルテニウ
ム（ｂｐｙ）₃²⁺からのルミネセンスは、シュウ酸塩や
その他ピルビン酸塩、乳酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、
クエン酸塩等の有機酸、そしてルテニウム（ｂｐｙ）₃^3
+を酸化的に生成し得る手段が存在する場合に得られ
る。この酸化はＰｂｏ₂やセリウム（ＩＶ）塩のような
強い酸化剤によって化学的に起こすことができる。また
連続的あるいは間欠的に十分にプラスである電位をかけ
ることによって電気化学的に起こすこともできる。ルテ
ニウム（ｂｐｙ）₃²⁺を電気化学的に酸化させるのに適
当な電極としては、例えばプラチナ、熱分解性グラファ
イト、ガラスカーボン等がある。シュウ酸塩やその他の
有機酸は化学ルミネセンスを出す過程で消費されてゆく
が、このように消費されてしまう材料を過剰に添加して
おくか、反応チャンバー中に連続的に供給するかによっ
て強く一定した化学ルミネセンスを何時間にもわたって
得ることができる。【００１３】還元酸化法は例えばアセトニトリルのよう
な有機共溶剤を含む部分水性溶液中で行うことができ
る。このルミネセンスは、過酸化二硫酸と、ルテニウム
（ｂｐｙ）₃¹⁺を還元的に生成し得る手段とが存在する
場合に得られる。この還元は例えばマグネシウムや他の
金属のような強い還元剤によって化学的に起こすことが
できる。また連続的あるいは間欠的に十分にマイナスで
ある電位をかけることによって電気化学的に起こすこと
もできる。ルテニウム（ｂｐｙ）₃²⁺を電気化学的に還
元させるのに適当な電極としては、例えば光沢ガラスカ
ーボンがある。酸化還元法の場合と同様、試薬を過剰に
添加しておくか、反応液中に消費された試薬を連続的に
供給するかによって連続的な強いルミネセンスを何時間
にもわたって得ることができる。【００１４】ルテニウム（ｂｐｙ）₃^3+/+再生系はアセ
トニトリルのような有機溶剤中、または部分水性溶液中
で、電極の電位をルテニウム（ｂｐｙ）₃²⁺を還元する
のに十分なマイナス電位とルテニウム（ｂｐｙ）₃²⁺を
酸化するのに十分なプラス電位の間で振動させることに
よって行うことができる。このような再生系に適当な電
極としては、例えばプラチナ電極がある。この系では化
学試薬が消費されず、原理的には無限に続行することが
可能である。以上の３種類のルテニウム含有化合物のル
ミネセンスを産生させる方法では、ルテニウム含有化合
物の反復酸化還元あるいは還元酸化というのが共通点で
ある。このためこれらの化合物を含む溶液のルミネセン
スは、与えられたエネルギー源の電気的ポテンシャルに
強く依存しており、そのためにルテニウム含有化合物の
存在を高感度で検出できることになる。【００１５】ＭａｎｄｌｅはＣｕｒｔｉｓらの報告
（４）を、化学ルミネセンスの応用として使用可能な標
識物として引用している。Ｃｕｒｔｉｓらは未発表デー
タとしてではあるがルテニウム複合体はシュウ酸塩／Ｈ
₂Ｏ₂系によって化学的に励起されると発光するように
なると報告している（Ｃｕｒｔｉｓらｐ．３５０）Ｍａ
ｎｄｌｅもＣｕｒｔｉｓもルテニウム及びオスミウム複
合体が化学ルミネセンスの応用分野として有用であるこ
とは、エレクトロ化学ルミネセンス系で有用であること
は認識していない。Ｓｐｒｉｎｔｓｃｈｎｉｋ，Ｇら
（５）はオクタデカノールまたはデヒドロコレステロー
ルを用いてエステル化したトリス（２，２′−ビピリジ
ン）ルテニウム（ＩＩ）について報告し、これらの界面
活性剤複合体の単層フィルムを産生した。この複合体は
光学ルミネセンスを発する。しかしフィルムを水につけ
その後光に当てると、ルテニウム複合体は光学ルミネセ
ンスを発しなくなる。これは光の存在下でエステル基の
光学的加水分解が起きるためである。アミド結合または
アミン結合を通して多岐にわたる分析当該物及び分析当
該物に結合する化学種に対しルテニウム含有あるいはオ
スミウム含有標識物を容易に標識し得る方法を開発した
ので以下に報告する。このようにして標識された材料は
非常に多くの手段を用いて分析できるが、その中でも最
も効率的で信頼性があり感度も高い方法は光学ルミネセ
ンス、化学ルミネセンス、エレクトロ化学ルミネセンス
を用いる方法である。またルテニウム含有及びオスミウ
ム含有標識物のようなエレクトロ化学ルミネセンス標識
物、ルブレン及び９，１０−ジフェニルアントラセンの
ような有機分子が特に多用途に使用でき有効であること
についても以下に述べる。このような新規標識材料を使
用すること、そしてそれらを検出する方法についての大
きな利点に関しても以下でさらに詳しく論じる。【００１６】食品会社は長年にわたり生の食品成分及び
加工食品中の生物学的、化学的汚染物質の存在について
関心をもってきている。技術進歩によって食品中の汚染
物質混入及びその結果起こる食品起因の病気の発生は減
少しつつあるが、その一方食品汚染物質の検出及び同定
のための迅速で感度の高い方法の開発における進歩はほ
とんど見られていない。食品中の有害な汚染物質を検出
するための既存の標準的方法は一般に非常に時間がかか
り、労力も必要で、技術的にも困難である。分析方法自
体は適度の感受性をもつものが大部分であっても、検出
を行う前の試料調製過程が長くかかるために当該汚染物
質の回収率が低くなってしまうことも多く、陰性である
との誤判断が下されることもしばしばある。このような
問題点の例となるのは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＳｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのエンテロトキシンが食品中
に存在するかどうかを検出するのに現在用いられている
標準的方法の２例である。食品中のＳａｌｍｏｎｅｌｌ
ａを検出する際には、これらの細菌が食品中に存在する
としても通常少数しか生息しておらず致死寸前の損傷を
受けていることも多いため、いくつかの濃縮段階が含ま
れている。このためＳａｌｍｏｎｅｌｌａの検出方法は
感度が高く、損傷を受けた細胞を蘇生させ増殖させるよ
うなものでなくてはならない。【００１７】現在Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの検出方法とし
てはアメリカ食品医薬品局によって２種類が推奨されて
いる。これらの方法はＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｆｏ
ｏｄｓ（１９８４年）第６版、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｏｆｆｉｃｉａｌ ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈ
ｅｍｉｓｔｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．に記載さ
れている。このうち一法は前濃縮、選択的濃縮、選択的
プレーティングを含む純粋培養技法であり、推定結果を
得るのに４日間、完全な結果を得るのに５〜７日間を要
する。もう一法は選択的濃縮の後、免疫蛍光検査法を用
いるものである。この方法はより迅速であるが、試験に
使用する多価の抗血清が交差反応性をもつという問題点
があるため、陽性であるとの誤判断が下されることが高
率で起こり得る（６，７）。食品中のＳｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンを検出する方法としてア
メリカ食品医薬品局が推奨している方法もＢａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａ
ｌ ｆｏｒ Ｆｏｏｄｓ（１９８４年）第６版、Ａｓｓ
ｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ａｎａｌ
ｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ
ｎ，ＤＣ．に記載されている。この方法では大量の食品
試料、例えば約１００ｇのものの抽出物を透析濃縮の数
段階を経て約０．２ｍｌ程度の少量に濃縮し、マイクロ
スライド二重免疫拡散法の試料として調製するために試
料抽出物をイオン交換カラムによって精製する。この方
法を行うためには通常一週間以上を要する。【００１８】食品中の細菌、毒素、抗生物質、農薬のよ
うな各種の汚染物質を検出するより迅速な試験方法が最
近開発されている。しかし多くの場合試験を実施する前
の試料調製に依然として労力と時間を要する。ラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素標識イムノソルベント
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって分析方法自体の実施時
間は短縮されたが、それでもこのような方法はやはり労
力を要するもので、簡単に実施できるとは言い難い。さ
らにこれらの方法は通常特異性も感受性も様々な多価の
抗血清を使用することに基づいており、当該食品汚染物
質の試験のためには量的に不足していることが多い。Ｅ
ＬＩＳＡ法は多価の抗血清ではなくモノクローナル抗体
を用いて食品試料を分析するために開発された方法であ
る。食品汚染物質の試験系にモノクローナル抗体を使用
することによって試薬の一定した供給が得られるように
なり、試験自体の不変の特異性、感度が保証される。Ｅ
ＬＩＳＡ系ではＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（８）やＳｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのエンテロトキシン（９）のよう
な食品汚染物質を試験するのにモノクローナル抗体が用
いられている。ＥＩＡ法（Ｂｉｏ−Ｅｎｚａｂｅａｄ
Ｓｃｒｅｅｎ Ｋｉｔ，Ｌｉｔｔｏｎ Ｂｉｏｎｅｔｉ
ｃｓ）及びＤＮＡプローブ技法（Ｇｅｎｅ−Ｔｒａｋ，
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いる市
販のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ検出用製品は、時間がかかる
し労力も要する。逆受身ラテックス凝集反応（ＳＥＴ−
ＲＰＬＡ，Ｄｅｎｋａ Ｓｅｉｋｅｎ Ｃｏ．）及びＥ
ＩＡ法（ＳＥＴ−ＥＩＡ，Ｄｒ．Ｗ．Ｂｏｍｍｅｌｉ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いる市販の食品中Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシン検出用製品
も同様の欠点をもっている。水質及び汚水汚染の発生を
管理するための指標として過去１００年の間細菌Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ及び大腸菌型群が広く使用
されてきた。【００１９】現在Ｅ．ｃｏｌｉ及び／または大腸菌型群
の検出に使用されている方法は、乳糖の発酵による酸ま
たは気体産生の特性に基づいている。最も広く使われて
いる方法は、最大可能菌数（ＭＰＮ）試験と膜ろ過（Ｍ
Ｆ）試験である。両方法共上水及び下水の微生物学的検
査法として環境保護庁（ＥＰＡ）及びアメリカ公衆衛生
協会（ＡＰＨＡ）により承認されており（１０）、牛乳
及び食品の微生物学的検査法として食品医薬品局（ＦＤ
Ａ）によっても承認されている。（１１）。ＭＰＮ法は
実際には３種の（１２）別個の試験から成っている（１
０）。推定試験においてはラウリル硫酸トリプトース
（ＬＳＴ）ブロスや乳糖ブロスのような非選択的培地を
用いて、乳糖発酵による気体産生を調べる。次に気体発
生陽性であった試験管についてより選択的な培地中で継
代培養を行う。大腸菌型群の培養にはブリリアントグリ
ーン乳糖胆汁酸（ＢＧＬＢ）ブロスを、糞便大腸菌型群
の培養にはＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）ブロスを使用し、気体
産生について再び調査する（確認試験）。確認試験で陽
性を呈した試料はさらにエオシンメチレンブルー（ＥＭ
Ｂ）寒天培地や遠藤寒天培地のような選択的鑑別培地上
にプレーティングし、指標細菌の存在を明確に証明する
ためにグラム染色やその他の生化学的試験を行う（完全
試験）。ＭＰＮ試験を完全に終結するには最大５日間
（５）必要なので、ほとんどの研究所では日常的水分析
としてはＭＰＮ試験のうちの推定試験と確認試験のみを
採用しているが、それでも終了までに４８〜７２時間を
要する。ＭＰＮ試験は時間がかかり材料の面からも費用
がかかるばかりでなく、陽性及び陰性であるとの誤判断
が発生することが多い（１５，１６，２０）。【００２０】水の微生物学的検査法としてＭＦ法が導入
されたのは１９５０年代の初期である（１２）。冗長で
時間のかかるＭＰＮ試験とは異なり、ＭＦ分析は２４時
間で完結しさらに確認する必要もない。ＭＦ法の基本手
順は次の通りである。水試料の一定量、通常１００ｍｌ
を０．４５μｍ孔径のろ紙を通じてろ過し、選択的培地
で満たした滅菌パッド上で培養する。最もよく使用され
る培地は３５℃で大腸菌型に選択的なｍ遠藤ブロスと４
４．５℃で糞便大腸菌型に選択的なｍＦＣブロスの２種
類である（１０）。これらの培地が使用されるようにな
って以来、多くの著者らがｍ遠藤及びｍＦＣブロスは共
に実際に存在する指標細菌数よりも少なく算定する傾向
にあると報告してきた。これは培地の選択性、あるいは
培養に使用した高温度（４４．５℃）のどちらかによる
ものであろう（２１，２２）。試料中の菌体が環境因子
及び／または化学物質によって致死寸前の損傷を受けて
いる場合には、このような陰性誤判断が特に起こりやす
い（１７，１８）。最近ＥＰＡによってＭＦ試験を確認
的手順を用いて補うための改良法が提案されており、そ
れによるとＭＰＮ試験におけるＢＧＬＢブロスと同様Ｌ
ＳＴブロスを用いて気体産生を調べるのに各ろ紙上に最
低１０個のコロニーがなければならない（１４）。この
改良法を用いれば陰性及び陽性の両誤判断は減るであろ
うけれども、材料費が高くなりＭＦ試験に要する時間は
２４時間から７２時間へと３倍になる。【００２１】１９８２年にＦｅｎｇとＨａｒｔｍａｎは
４−メチルウンベリフェロングルクロニド（ＭＵＧ）を
基質として使用したＥ．ｃｏｌｉ検出のための蛍光発生
試験を導入した（１３）。Ｅ．ｃｏｌｉの細胞がβ−グ
ルクロニダーゼという酵素を産生し、それによって基質
を切断して蛍光を発する４−メチルウンベリフェロンラ
ジカルを放出するのである（１９）。ＭＵＧ化合物を推
定試験のＬＳＴ培地に加えることによって、ＬＳＴ−Ｍ
ＵＧ培地の試験管１本で糞便大腸菌型に関する推定デー
タ（気体産生）及び確認データ（蛍光）の両方が２４時
間以内に得られるようになった。ＭＵＧ試験は迅速で簡
単であるが、Ｅ．ｃｏｌｉの８５〜９５％しかこの酵素
を産生しないため（出所による）、試験は１００％信頼
性をもつわけではない。またこの系は大腸菌型群には適
用できない。現在１つの試料中の大腸菌型及び糞便大腸
菌型を検出し計数するのに適切な試験はない。簡単で迅
速、信頼性のある検出試験が開発されれば、経費及び時
間の節約になるばかりでなく、水道設備や食品加工、取
扱いの管理がずっと効率よく行われることになろう。【００２２】【課題を解決するための手段】本発明は予め測定された
量の多成分液体試料において、その試料中に約１０^-3モ
ル以下の濃度で存在する目的分析物を検出するための方
法に関するもので、以下の部分から構成されている。
ａ）試料を（ｉ）試薬がくり返し放射線を放出し得るよ
うな適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を受け
た時に電磁放射線をくり返し放出するようになる、及び
（ｉｉ）目的分析物と結合することができる、ような試
薬と接触させる。ただし分析物と試薬が結合するのに最
適な条件下で接触させる。ｂ）このようにして得た試料
に、試薬がくり返し放射線を放出し得るような適切な源
からの電気化学的エネルギー一定量を与える。ただし試
薬がくり返し電磁放射線を放出し得るような最適条件下
で与える。ｃ）このようにして放出された電磁放射線を
検出し、それによって試料中の分析物の存在も検出す
る。【００２３】また本発明は予め測定された量の多成分液
体試料において、その試料中に約１０^-3モル以下の濃度
で存在する目的分析物を検出するための競合的方法に関
するものでもあり、以下の部分から構成されている。
ａ）試料を（ｉ）試薬がくり返し放射線を放出し得るよ
うな適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を受け
た時に電磁放射線をくり返し放出するようになる、及び
（ｉｉ）試料中には通常存在しない相補的材料の結合部
位について目的分析物、及び相補的材料と競合し得る、
ような試薬と接触させる。ただし目的分析物と試薬が相
補的材料と競合的に結合するのに最適な条件下で接触さ
せる。ｂ）このようにして得た試料に、試薬がくり返し
放射線を放出し得るような適切な源からの電気化学的エ
ネルギー一定量を与える。ただし試薬がくり返し電磁放
射線を放出し得るような最適条件下で与える。ｃ）この
ようにして放出された電磁放射線を検出し、それによっ
て試料中の分析物の存在も検出する。また予め測定され
た量の多成分液体試料において、その試料中に存在する
目的分析物の量を定量的に測定するための方法に関する
ものも含み、以下の部分から構成されている。ａ）試料
を既知量の（ｉ）試薬がくり返し放射線を放出し得るよ
うな適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を受け
た時に電磁放射線をくり返し放出するようになる、及び
（ｉｉ）目的分析物と結合することができる、ような試
薬と接触させる。ただし分析物と試薬が結合するのに最
適な条件下で接触させる。ｂ）このようにして得た試料
に、試薬がくり返し放射線を放出し得るような適切な源
からの電気化学的エネルギー一定量を与える。ただし試
薬がくり返し電磁放射線を放出し得るような最適条件下
で与える。ｃ）このようにして放出された放射線の量を
定量的に測定し、それによって試料中に存在する目的分
析物の量も定量的に測定する。【００２４】本発明はさらに予め測定された量の多成分
液体試料において、その試料中に存在する目的分析物の
量を定量的に測定するための競合的方法に関するものも
含む。この方法は以下の部分から構成されている。ａ）
試料を既知量の（ｉ）試薬がくり返し放射線を放出し得
るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を
受けた時に電磁放射線をくり返し放出するようになる、
及び（ｉｉ）試料中には通常存在しない相補的材料の結
合部位について目的分析物、及び既知量の相補的材料と
競合し得る、ような試薬と接触させる。ただし目的分析
物と試薬が相補的材料と競合的に結合するのに最適な条
件下で接触させる。ｂ）このようにして得た試料に、試
薬がくり返し放射線を放出し得るような適切な源からの
電気化学的エネルギー一定量を与える。ただし試薬がく
り返し電磁放射線を放出し得るような最適条件下で与え
る。ｃ）このようにして放出された放射線の量を定量的
に測定し、それによって試料中に存在する目的分析物の
量も定量的に測定する。【００２５】また液体食品、食品ホモジネート中に多数
存在する目的分析物を検出し同定するための方法に関す
るものも含む。この方法は以下の部分から構成されてい
る。ａ）液体または固体懸濁液に浸すのに適切で多数の試薬
に対して固定された診断試薬ホルダーを液体食品あるい
は食品ホモジネート中に浸す。ただし各試薬は診断試薬
ホルダーの明確に区別できる位置に固定し、固定された
試薬−目的分析物複合体が形成されるよう目的分析物１
種類ずつと複合体を形成し得るようにする。ｂ）液体食
品あるいは食品ホモジネート中から診断試薬ホルダーを
取り除く。ｃ）適当な洗浄溶液を用いて診断試薬ホルダ
ーを洗浄する。ｄ）固定された試薬−目的分析物複合体
を含む判断試薬ホルダーを、固定された試薬−目的分析
物複合体と複合体を形成することができ、固定された試
薬−目的分析物検出試薬複合体を形成し得るような最低
１種類の検出試薬を含む検出溶液中に浸す。ｅ）試薬
が、固定された試薬−目的分析物−検出試薬複合体とし
て固定されている診断試薬ホルダーの同定可能な部分を
検出し、それによって液体食品あるいは食品ホモジネー
ト中に多数存在する目的分析物を検出し同定する。【００２６】本発明はまた試料中に多数存在するエンテ
ロトキシン類を検出し同定するのに有用なキットも含
む。このキットは以下の部分から構成されている。ａ）
液体または固体懸濁液に浸すのに適切なように表面部分
に連結された取っ手のついた診断試薬ホルダー；ただし
上記の表面部分には最低１枚のニトロセルロース膜がつ
いており、このニトロセルロース膜上には区別し得る位
置に別々に明確に固定された各種モノクローナル抗体が
つけてあり、固定されたモノクローナル抗体はそれぞれ
１種類のエンテロトキシンの抗原決定基に対し特異的な
ものとなっている；ｂ）界面活性剤入り水性緩衝溶液か
ら成る第一洗浄溶液；ｃ）最低一種類のモノクローナル
抗体酵素結合から成る検出部；モノクローナル抗体は各
エンテロトキシンに対する異なる抗原決定基に特異的な
もので、診断試薬ホルダーにつけられたニトロセルロー
ス膜上に固定されている；ｄ）バッファー水溶液からな
る第２洗浄液；ｅ）検出溶液中のモノクローナル抗体に
結合された酵素と反応し得る酵素基質；及びｆ）無色染
液。【００２７】本発明には１つの試料中の細菌最低１種の
存在を検出するための方法も含まれる。この方法は以下
の部分から構成されている。ａ）試料を開放式で細菌種
の増殖に適する培地を含む容器中に接種する。ｂ）キャ
ップを容器の端に連結する。このキャップの面は容器に
連結した時に容器の内部と接触するようになっており表
面が最低１つの細菌成分を固定するのに適切な構造とな
っている。ｃ）培地中に接種された細菌が増殖し得るよ
うな条件下で、接種された培地を培養する。ｄ）容器の
上下を適当な時間の間反転させ、培地中に存在する細菌
成分が容器の内部に面したキャップの表面上に固定され
るようにする。ｅ）容器の上下を反転させ正しい方向に
戻す。ｆ）容器からキャップを取りはずす。ｇ）細菌成
分が固定されているキャップの表面を、固定された細菌
成分−試薬複合体が形成されるのに適切な条件下で、固
定された細菌成分と複合体を形成し得る試薬に接触させ
る。ｈ）固定された細菌成分−試薬複合体を検出し、そ
れによって試料中の細菌種の存在をも検出する。【００２８】さらに本発明には試料中の大腸菌型細菌の
存在を検出するための方法も含まれる。この方法は以下
の部分から構成されている。ａ）試料を開放式で非選択
的乳糖培地及び倒立Ｄｕｒｈａｍを入れた容器中に接種
する。ｂ）ポリスチレン挿入物をつけたキャップを各容
器の開放側の端に連結する。ｃ）接種された培地を３７
℃で最低２時間培養する。ｄ）各容器中に倒立させたＤ
ｕｒｈａｍバイアル内に採取されている細菌発酵により
産生された気体があるかどうか検出する。ｅ）倒立させ
たＤｕｒｈａｍバイアル内に気体が採取されている容器
の上下を適当な時間の間反転させ、培地中に存在する大
腸菌型細菌が大腸菌型−ポリスチレン複合体を形成し得
るようにする。ｆ）容器の上下を反転させ正しい方向に
戻す。ｇ）容器からキャップを取りはずす。ｈ）取りは
ずしたキャップのポリスチレン挿入物を、未結合部位を
ふさぐのに適切な物質を用いて処理する。ｉ）未結合部
位をふさぐのに適切な物質を用いて処理されたキャップ
のポリスチレン挿入物を、抗体−大腸菌型−ポリスチレ
ン複合体が形成し得るような条件下で大腸菌型細菌に結
合でき検出可能となる標識物によって標識した抗大腸菌
型細菌抗体最低１種類を用いて処理する。ｊ）ポリスチ
レン挿入物上の抗体−大腸菌型−ポリスチレン複合体の
存在を検出し、それによって試料中の大腸菌型細菌の存
在をも検出する。【００２９】図の説明要約第１図は溶液中の一種の抗原の濃度を測定するための均
質系イムノアッセイ用に用いられるエレクトロ化学ルミ
ネセンス測定法について表わしたものである。第２図は
均質系ＥＣＬテオフィリン試験の結果をグラフに表わし
たものである。第３図は各種血清における均質系テオフ
ィリン試験の結果をグラフに表わしたものである。●＝正常血清■＝溶血血清◆＝脂肪血症血清□＝黄疸血清第４図はＥＣＬテオフィリン試験の結果を蛍光偏光テオ
フィリン試験の結果と比較しグラフに表わしたものであ
る。Ａ．正常血清：ｎ＝４；傾き＝０．９８６；ｒ＝１．０
０Ｂ．溶血血清：ｎ＝３；傾き＝０．８７８；ｒ＝１．０
０Ｃ．脂肪血症血清：ｎ＝５；傾き＝０．８７２；ｒ＝
０．９９Ｄ．黄疸血清：ｎ＝４；傾き＝２．１４；ｒ＝１．００第５図はＥＣＬテオフィリン試験の結果を高速液体クロ
マトグラフィ−試験の結果と比較しグラフに表わしたも
のである。【００３０】ｎ＝９；傾き＝１．１９７；ｒ＝０．９８第６図はＥＣＬジゴキシンイムノアッセイにおいて産生
されたＥＣＬ信号の調整をグラフに表わしたものであ
る。第７図はＥＣＬジゴキシンイムノアッセイの結果を
グラフに表わしたものである。■：対照●：ジゴキシン第８図はＭＢＩ３８−化合物Ｉの各濃度において産生さ
れたＥＣＬ信号をグラフに表わしたものである。第９図
はＭＢＩ３８−化合物Ｉのハイブリッド形成／感受性試
験の結果を示したものである。ＴＡＧ＝化合物Ｉ第１０
図はＭＢＩ３８−化合物Ｉの特異性試験の結果を示した
ものである。【００３１】本発明の詳細本発明は予め測定された量の多成分液体試料において、
その試料中に約１０^-3モル以下の濃度で存在する目的分
析物を検出するための方法に関するもので、以下の部分
から構成されている。ａ）試料を（ｉ）試薬がくり返し
放射線を放出し得るような適切な源からの電気化学的エ
ネルギー一定量を受けた時に電磁放射線をくり返し放出
するようになる、及び（ｉｉ）目的分析物と結合するこ
とができる、ような試薬と接触させる。ただし分析物と
試薬が結合するのに最適な条件下で接触させる。ｂ）こ
のようにして得た試料に、試薬がくり返し放射線を放出
し得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定
量を与える。ただし試薬がくり返し電磁放射線を放出し
得るような最適条件下で与える。ｃ）このようにして放
出された電磁放射線を検出し、それによって試料中の目
的分析物の存在をも検出する。本出願において「モル」
とは、溶液中に１リットル当たり存在する分析物の濃度
をモルで表わしたもの、あるいは液体試料中に１リット
ル当たり存在する粒子またはユニットで粒子状物質の量
を表わしたものを意味する。例えば１リットル中６．０
２×１０²³個の粒子のことを１モルと表わす。【００３２】本発明における方法は、不均一試験すなわ
ち結合した標識試薬に電気化学的エネルギーを与える前
に結合した標識試薬から未結合標識試薬を分離する試験
と、均質系試験すなわち未結合標識試薬と結合した標識
試薬の両方に同時に電気化学的エネルギーを与える試験
として実施されるものである。本発明の均質系試験にお
いては、結合した標識試薬から放出された電磁放射線
は、未結合標識試薬と比較して結合した標識試薬から放
出された電磁放射線の量が増加したか減少したか、ある
いは波長の異なる電磁放射線によって未結合標識試薬か
ら放出された電磁放射線と区別し得る。従って本発明の
１つの具体例として、目的分析物と結合していない試薬
はすべて、試料に電気化学的エネルギーを与える前に試
薬と接触した試料から分離されることになる。本発明の
もう１つの具体例では、試料を試薬と接触させる前に、
目的分析物を固定するために試料を処理する。目的分析
物の固定方法はその技術分野ではよく知られているもの
であり、試料をポリスチレン、ニトロセルロース、ナイ
ロンの表面に接触させるか、または全細胞、準細胞粒
子、ビールス、プリオン、ビイロイド、脂質、脂肪酸、
核酸、多糖、タンパク質、リポタンパク質、リポ多糖、
糖タンパク質、ペプチド、細胞代謝産物、ホルモン、薬
理学的試薬、精神安定薬、バルビツール酸塩、アルカロ
イド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物学
的ポリマー、合成有機分子、有機金属化合物分子、無機
分子でコーティングした表面に接触させるのである。ま
た目的分析物が以上の物質の中のどれかであってもよ
い。本発明の１つの具体例では、目的分析物がテオフィ
リンである。また別の具体例では目的分析物がジゴキシ
ンである。さらに別の具体例では目的分析物がヒト繊毛
性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）である。また目的分析物が
全細胞、準細胞粒子、ビールス、プリオン、ビイロイ
ド、核酸、タンパク質、リポタン白質、リポ多糖、糖タ
ン白質、ペプチド、ホルモン、薬理学的試薬、非生物学
的ポリマー、合成有機分子、有機金属化合物分子、無機
分子であることも可能で、試料中に約１０^-12モル以下
の濃度で存在するこれらの物質を分析できる。さらに目
的分析物が試料中に約１０^-15モル以下の濃度で存在す
る全細胞、準細胞粒子、ビールス、プリオン、ビイロイ
ド、核酸であることも可能である。【００３３】試料と接触させる試薬は、全細胞、準細胞
粒子、ビイルス、プリオン、ビイロイド、脂質、脂肪
酸、核酸、多糖、たん白質、リポタン白質、リポ多糖、
糖タン白質、ペプチド、細胞代謝産物、ホルモン、薬理
学的試薬、精神安定薬、バルビツール酸塩、アルカロイ
ド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物学的
高分子、合成有機分子、有機金属化合物分子、無機分
子、ビオチン、アビジン、ストレプタビジンに結合した
エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種を含むもの
である。本発明の１つの具体例では試薬は抗体、抗原、
核酸、ハプテン、リガンドまたは酵素、ビオチン、アビ
ジン、ストレプタビジンに結合したエレクトロ化学ルミ
ネセンスを発する化学種である。【００３４】エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学
種としてはルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジ
ウム、ロジウム、プラチナ、パラジウム、モリブデン、
テクネチウムから成る群から選択した金属を含む有機化
合物が用いられる。本発明の１つの具体例では金属はル
テニウムあるいはオスミウムを使用している。また別の
具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種
としてルブレンまたは９，１０−ジフェニルアントラセ
ンを使用している。さらに別の具体例ではエレクトロ化
学ルミネセンスを発する化学種としてビス〔（４，４′
−カルボメトキシ）−２，２′−ビピリジン〕２−〔３
−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４−ｙｌ）プ
ロピル〕−１，３−ジオキソランルテニウム（ＩＩ）を
使用している。また別の具体例ではエレクトロ化学ルミ
ネセンスを発する化学種としてビス（２，２′ビピリジ
ン）〔４−（ブタン−１−ａｌ）−４′−メチル−２，
２′−ビピリジン〕ルテニウム（ＩＩ）を使用してい
る。さらに別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンス
を発する化学種としてビス（２，２′−ビピリジン）
〔４−（４′−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−
ｙｌ）−酪酸〕ルテニウム（ＩＩ）を使用している。ま
た別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する
化学種として（２，２′−ビピリジン）〔シス−ビス
（１，２ジフェニルホスフイノ）エチレン〕｛２−〔３
−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ｙｌ）
プロピル〕−１，３−ジオキソラン｝オスミウム（Ｉ
Ｉ）を使用している。さらに別の具体例ではエレクトロ
化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２，２′
−ビピリジン）〔４−（４′−メチル−２，２′−ビピ
リジン）−ブチラミン〕ルテニウム（ＩＩ）を使用して
いる。また別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンス
を発する化学種としてビス（２，２′−ビピリジン）
〔１−ブロモ−４（４′−メチル−２，２′−ビピリジ
ン−４−ｙｌ）ブタン〕ルテニウム（ＩＩ）を使用して
いる。さらに別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセン
スを発する化学種としてビス（２，２′−ビピリジン）
マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビピリ
ジン−４′ブチラミドルテニウム（ＩＩ）を使用してい
る。【００３５】試料は固体、乳濁液、懸濁液、液体、気体
から得たものが使用できる。さらに水、食品、血液、血
清、尿、便、組織、唾液、油、有機溶剤、空気から得た
試料も使用できる。また試料中にアセトニトリル、ジメ
チルスルフオキシド、ジメチルホルムアミド、ｎ−メチ
ル−ピロリジノン、第三級ブチルアルコールが含まれて
いても使用できる。試料中に還元剤あるいは酸化剤が含
まれていても使用できる。また本発明は予め測定された
量の多成分液体試料において、その試料中に約１０^-3モ
ル以下の濃度で存在する目的分析物を検出するための競
合的方法に関するものであり、以下の部分から構成され
ている。ａ）試料を（ｉ）試薬がくり返し放射線を放出
し得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定
量を受けた時に電磁放射線をくり返し放出するようにな
る、及び（ｉｉ）試料中には通常存在しない相補的材料
の結合部位について目的分析物、及び相補的材料と競合
し得る、ような試薬と接触させる。ただし目的分析物と
試薬が相補的材料と競合的に結合するのに最適な条件下
で接触させる。ｂ）このようにして得た試料に、試薬が
くり返し放射線を放出し得るような適切な源からの電気
化学的エネルギー一定量を与える。ただし試薬がくり返
し電磁放射線を放出し得るような最適条件下で与える。
ｃ）このようにして放出された電磁放射線を検出し、そ
れによって試料中の目的分析物の存在をも検出する。【００３６】試薬はエレクトロ化学ルミネセンスを発す
る化学種に結合した目的分析物、あるいはエレクトロ化
学ルミネセンスを発する化学種に結合した目的分析物の
類似体を用いる。また目的分析物としてテオフィリン、
ジゴキシン、ｈＣＧが使用できる。エレクトロ化学ルミ
ネセンスを発する化学種としてはビス｛（４，４′−カ
ルボメトキシ）−２，２′−ビピリジン〕２−〔３−
（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４−ｙｌ）プロ
ピル−１，３−ジオキソランルテニウム（ＩＩ）が使用
できる。また本発明の別の具体例ではエレクトロ化学ル
ミネセンスを発する化学種としてビス（２，２′−ビピ
リジン）〔４−（ブタン−１−ａｌ）−４′−メチル−
２，２′−ビピリジン〕ルテニウム（ＩＩ）を使用して
いる。さらに別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセン
スを発する化学種としてビス（２，２′−ビピリジン）
〔４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イ
ル）−酪酸〕ルテニウム（ＩＩ）を使用している。また
別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化
学種として（２，２′−ビピリジン）〔シス−ビス
（１，２−ジフェニルホスフィノ）エチレン〕｛２−
〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イ
ル）プロピル〕−１，３−ジオキソラン｝オスミウム
（ＩＩ）を使用している。さらに別の具体例ではエレク
トロ化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２，
２′−ビピリジン）〔４−（４′−メチル−２，２′−
ビピリジン）−ブチラミン〕ルテニウム（ＩＩ）を使用
している。また別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセ
ンスを発する化学種としてビス（２，２′−ビピリジ
ン）〔１−ブロモ−４（４′−メチル−２，２′−ビピ
リジン−４−ｙｌ）ブタン〕ルテニウム（ＩＩ）を使用
している。さらに別の具体例ではエレクトロ化学ルミネ
センスを発する化学種としてビス（２，２′−ビピリジ
ン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビ
ピリジン−４′−ブチラミドルテニウム（ＩＩ）を使用
している。【００３７】相補的材料としては全細胞、準細胞粒子、
ビールス、プリオン、ビイロイド、脂質、脂肪酸、核
酸、多糖、タン白質、リポタン白質、リポ多糖、糖タン
白質、ペプチド、細胞代謝産物、ホルモン、薬理学的試
薬、精神安定薬、バルビツール酸塩、ステロイド、ビタ
ミン、アミノ酸、糖、非生物学的高分子、合成有機分
子、有機金属化合物分子、無機分子を使用することがで
きる。【００３８】本出願の範囲内ではここに述べる方法は目
的分析物を定量するために用いるものである。従って本
発明は予め測定された量の多成分液体試料において、そ
の試料中に存在する目的分析物の量を定量的に測定する
ための方法に関するものも含み、以下の部分から構成さ
れている。ａ）試料を既知量の（ｉ）試薬がくり返し放
射線を放出し得るような適切な源からの電気化学的エネ
ルギー一定量を受けた時に電磁放射線をくり返し放出す
るようになる、及び（ｉｉ）目的分析物と結合すること
ができる、ような試薬と接触させる。ただし分析物と試
薬が結合するのに最適な条件下で接触させる。ｂ）この
ようにして得た試料に、試薬がくり返し放射線を放出し
得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定量
を与える。ただし試薬がくり返し電磁放射線を放出し得
るような最適条件下で与える。ｃ）このようにして放出
された放射線の量を定量的に測定し、それによって試料
中に存在する目的分析物の量をも定量的に測定する。本
方法は不均一試験としても均一系試験としても使用でき
る。本発明の１つの具体例では目的分析物と結合してい
ない試薬はすべて、試料に試薬がくり返し放射線を放出
し得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定
量を与える前に、既知量の試薬と接触した試料から分離
される。また本発明の別の具体例では、試料を試薬と接
触させる前に、目的分析物を固定するために試料を処理
する。【００３９】目的分析物としては全細胞、準細胞粒子、
ビールス、プリオン、ビイロイド、脂質、脂肪酸、核
酸、多糖、タン白質、リポタン白質、リポ多糖、糖タン
白質、ペプチド、細胞代謝産物、ホルモン、薬理学的試
薬、精神安定薬、バルビツール酸塩、アルカロイド、ス
テロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物学的高分
子、合成有機分子、有機金属化合物分子、無機分子であ
ることが可能である。本発明の１つの具体例では目的分
析物がテオフィリンである。また本発明の別の具体例で
は目的分析物がジゴキシンである。さらに本発明の別の
具体例では目的分析物がｈＣＧである。試料と接触させ
る試薬は、全細胞、準細胞粒子、ウイルス、プリオン、
ビイロイド、脂質、脂肪酸、核酸、多糖、タン白質、リ
ポタン白質、リポ多糖、糖タン白質、ペプチド、細胞代
謝産物、ホルモン、薬理学的試薬、精神安定薬、バルビ
ツール酸塩、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、ア
ミノ酸、糖、非生物学的ポリマー、合成有機分子、有機
金属化合物分子、無機分子に結合したエレクトロ化学ル
ミネセンスを発する化学種である。本発明の１つの具体
例では試薬は抗体、抗原、核酸、ハプテン、リガンドま
たは酵素、ビオチン、アビジン、ストレプタビジンに結
合したエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種であ
る。【００４０】エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学
種としてはルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジ
ウム、ロジウム、プラチナ、パラジウム、モリブデン、
テクネチウムから成る群から選択した金属を含む有機化
合物が用いられる。本発明の１つの具体例では金属はル
テニウムあるいはオスミウムを使用している。また別の
具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種
としてルブレンまたは９，１０−ジフェニルアントラセ
ンを使用している。さらに別の具体例ではエレクトロ化
学ルミネセンスを発する化学種としてビス〔（４，４′
−カルボメトキシ）−２，２′−ビピリジン〕２−〔３
−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４−ｙｌ）プ
ロピル〕−１，３−ジオキソランルテニウム（ＩＩ）を
使用している。また別の具体例ではエレクトロ化学ルミ
ネセンスを発する化学種としてビス（２，２′−ビピリ
ジン）〔４−（ブタン−１−ａｌ）−４′−メチル−
２，２′−ビピリジン〕ルテニウム（ＩＩ）を使用して
いる。さらに別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセン
スを発する化学種としてビス（２，２′−ビピリジン）
〔４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ｙ
ｌ）−酪酸〕ルテニウム（ＩＩ）を使用している。また
別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化
学種として（２，２′−ビピリジン）〔シス−ビス
（１，２−ジフェニルホスフィノ）エチレン〕｛２−
〔３−（４ーメチル−２，２′−ビピリジン−４′−ｙ
ｌ）プロピル〕−１，３−ジオキソラン｝オスミウム
（ＩＩ）を使用している。さらに別の具体例ではエレク
トロ化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２，
２′−ビピリジン）〔４−（４′−メチル−２，２′−
ビピリジン）−ブチラミン〕ルテニウム（ＩＩ）を使用
している。また別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセ
ンスを発する化学種としてビス（２，２′−ビピリジ
ン）〔１−ブロモ−４（４′−メチル−２，２′−ビピ
リジン−４−ｙｌ）ブタン〕ルテニウム（ＩＩ）を使用
している。さらに別の具体例ではエレクトロ化学ルミネ
センスを発する化学種としてビス（２，２′−ビピリジ
ン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビ
ピリジン−４′−ブチラミドルテニウム（ＩＩ）を使用
している。【００４１】試料は固体、乳濁液、懸濁液、液体、気体
から得たものが使用できる。さらに水、食品、血液、血
清、尿、便、組織、唾液、油、有機溶剤、空気から得た
試料も使用できる。また試料中にアセトニトリル、ジメ
チルスルフオキシド、ジメチルホルムアミド、ｎ−メチ
ルピロリジノン、第三級ブチルアルコールが含まれてい
ても使用できる。試料中に還元剤あるいは酸化剤が含ま
れていても使用できる。本発明はまた予め測定された量
の多成分液体試料において、その試料中に存在する目的
分析物の量を定量的に測定するための競合的方法に関す
るものも含む。この方法は以下の部分から構成されてい
る。ａ）試料を既知量の（ｉ）試薬がくり返し放射線を
放出し得るような適切な源からの電気化学的エネルギー
一定量を受けた時に電磁放射線をくり返し放出するよう
になる、及び（ｉｉ）試料中には通常存在しない相補的
材料の結合部位について目的分析物、及び既知量の相補
的材料と競合し得る、ような試薬と接触させる。ただし
目的分析物と試薬が相補的材料と競合的に結合するのに
最適な条件下で接触させる。ｂ）このようにして得た試
料に、試薬がくり返し放射線を放出し得るような適切な
源からの電気化学的エネルギー一定量を与える。ただし
試薬がくり返し電磁放射線を放出し得るような最適条件
下で与える。ｃ）このようにして放出された放射線の量
を定量的に測定し、それによって試料中に存在する目的
分析物の量をも定量的に測定する。目的分析物としてテ
オフィリン、ジゴキシン、ｈＣＧが使用できる。【００４２】本発明の１つの具体例では試薬はエレクト
ロ化学ルミネセンスを発する化学種に結合した目的分析
物、あるいはエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学
種に結合した目的分析物の類似体を用いている。エレク
トロ化学ルミネセンスを発する化学種としてはビス
〔（４，４′−カルボメトキシ）−２，２′−ビピリジ
ン〕２−〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−
４−ｙｌ）プロピル〕−１，３−ジオキソランルテニウ
ム（ＩＩ）が使用できる。また本発明の別の具体例では
エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種としてビス
（２，２′−ビピリジン）〔４−（ブタン−１−ａｌ）
−４′−メチル−２，２′−ビピリジン〕ルテニウム
（ＩＩ）を使用している。さらに別の具体例ではエレク
トロ化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２，
２′−ビピリジン）〔４−（４−メチル−２，２′−ビ
ピリジン−４′−ｙｌ）−酪酸〕ルテニウム（ＩＩ）を
使用している。また別の具体例ではエレクトロ化学ルミ
ネセンスを発する化学種として（２，２′−ビピリジ
ン）〔シス−ビス（１，２−ジフェニルホスフィノ）エ
チレン｛２−〔３−（４ーメチル−２，２′−ビピリジ
ン−４′−ｙｌ）プロピル〕−１，３−ジオキソラン｝
オスミウム（ＩＩ）を使用している。さらに別の具体例
ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種として
ビス（２，２′−ビピリジン）〔４−（４′−メチル−
２，２′−ビピリジン）ブチラミン〕ルテニウム（Ｉ
Ｉ）を使用している。また別の具体例ではエレクトロ化
学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２，２′−
ビピリジン）〔１−ブロモ−４（４′−メチル−２，
２′−ビピリジン−４−イル）ブタン〕ルテニウム（Ｉ
Ｉ）を使用している。さらに別の具体例ではエレクトロ
化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２，２′
−ビピリジン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−
２，２′−ビピリジン−４′−ブチラミドルテニウム
（ＩＩ）を使用している。【００４３】相補的材料としては全細胞、準細胞粒子、
ビールス、プリオン、ビイロイド、脂質、脂肪酸、核
酸、多糖、タン白質、リポタン白質、リポ多糖、糖タン
白質、ペプチド、細胞代謝産物、ホルモン、薬理学的試
薬、精神安定薬、バルビツール酸塩、アルカロイド、ス
テロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物学的ポリマ
ー、合成有機分子、有機金属化合物分子、無機分子を使
用することができる。本発明はまた液体食品、食品ホモ
ジネート中に多数存在する目的分析物を検出し同定する
ための方法に関するものも含む。この方法は以下の部分
から構成されている。ａ）液体または固体懸濁液に浸す
のに適切で多数の試薬に対して固定された診断試薬ホル
ダーを液体食品あるいは食品ホモジネート中に浸す。た
だし各試薬は診断試薬ホルダーの明確に区別できる位置
に固定し、固定された試薬−目的分析物複合体が形成さ
れるよう目的分析物１種類ずつと複合体を形成し得るよ
うにする。ｂ）液体食品あるいは食品ホモジネート中か
ら判断試薬ホルダーを取り除く。ｃ）適当な洗浄溶液を
用いて判断試薬ホルダーを洗浄する。ｄ）固定された試
薬−目的分析物複合体を含む判断試薬ホルダーを、固定
された試薬−目的分析物複合体と複合体を形成すること
ができ、固定された試薬−目的分析物−検出試薬複合体
を形成し得るような最低１種類の検出試薬を含む検出溶
液に浸す。ｅ）試薬が、固定された試薬−目的分析物−
検出試薬複合体として固定されている判断試薬ホルダー
の同定可能な部分を検出し、それによって液体食品ある
いは食品ホモジネート中に多数存在する目的分析物を検
出し同定する。【００４４】目的分析物としては微生物を用いることが
できる。微生物の生死は問わない。また微生物は細菌で
もよい。本方法によって検出し得る細菌の例としてはサ
ルモネラ属、カンピロバクター属、エシエリキア属、エ
ルジニア属、バチルス属、ビブリオ酸、レジュネラ属、
クロストリジウム属、連鎖球菌属、ブドウ球菌属が挙げ
られるが、これらの細菌のみに限定されるわけではな
い。また目的分析物として抗原を用いることができる。
このような抗原としてはエンテロトキシン類及びアフラ
トキシン類が挙げられるが、これに限定されるわけでは
ない。【００４５】固定される試薬及び検出試薬としてはポリ
クローナル抗体、モノクローナル抗体、モノクローナル
抗体の混合物、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗
体の混合物が使用できる。検出試薬は検出可能な標識物
を用いて標識することができる。本発明の１つの具体例
では検出試薬がそれぞれ同じ検出可能標識物によって標
識されている。このような標識物はその技術分野でよく
知られているものであり、例えばアルカリ性ホスファタ
ーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼのような酵
素、例えばフルオレセインイソチオシアネート、テトラ
メチルローダミンイソチオシアネート、ジクロロトリア
ジニラミノフルオレセイン、テキサスレッドのような蛍
光種、例えばルミノール、イソルミノール、アクリジニ
ウムエステルのような化学ルミネセンス種が含まれてい
る。また検出可能標識物として化学種が放射線を放出し
得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定量
を受けた時に電磁放射線をくり返し放出するようになる
エレクトロ化学ルミネセンス化学種も使用できる。この
エレクトロ化学ルミネセンス化学種にはルテニウム、オ
スミウムが含まれる。固定試薬は、診断試薬ホルダーに
取りつけたニトロセルロース膜に固定する。【００４６】本発明はまた試料中に多数存在するエンテ
ロトキシン類を検出し同定するのに有用なキットも含
む。このキットは以下の部分から構成されている。ａ）
液体または固体懸濁液に浸すのに適切なように表面部分
に連結された取っ手のついた診断試薬ホルダー。ただし
上記の表面部分には最低１枚のニトロセルロース膜がつ
いており、このニトロセルロース膜上には区別し得る位
置に別々に明確に固定された各種モノクローナル抗体が
つけてあり、固定されたモノクローナル抗体はそれぞれ
１種類のエンテロトキシンの抗原決定基に対し特異的な
ものとなっている。ｂ）界面活性剤入り水性緩衝溶液か
ら成る第一洗浄溶液。ｃ）最低一種類のモノクローナル
抗体酵素結合から成る検出部。モノクローナル抗体は各
エンテロトキシンに対する異なる抗原に決定基に特異的
なもので、診断試薬ホルダーにつけられたニトロセルロ
ース膜上に固定されている。ｅ）検出溶液中のモノクロ
ーナル抗体に結合された酵素と反応し得る酵素基質。
ｆ）無色染液。【００４７】本発明の１つの具体例ではニトロセルロー
ス膜に別々に明確に固定され、各種Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓエンテロトキシン類の抗原決定基に特異的で
あるモノクローナル抗体をつけたニトロセルロース膜を
使用している。また本発明の別の具体例ではニトロセル
ロース膜に別々に明確に固定され、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓのエンテロトキシンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅに対して
特異的である４種のモノクローナル抗体をつけたニトロ
セルロース膜を使用している。またこのニトロセルロー
ス膜には、膜に別々に明確に固定され、１種以上のＳｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンの１つの抗
原決定基に特異的であるモノクローナル抗体がつけてあ
ることもある。このエンテロトキシンはＳｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓのエンテロトキシン類Ｃ₁，Ｃ₂，Ｃ₃
の抗原決定基に特異的なものである。各Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンの抗原決定基に特異的
で、ニトロセルロース膜に固定されたモノクローナル抗
体が特異性をもつＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテ
ロトキシンに向けられたモノクローナル抗体に結合され
るこのキットの酵素はアルカリ性ホスファターゼ等があ
り、この酵素と反応し得る酵素基質は５−ブロモ、４−
クロロインドリルホスフェート、無色染液はニトロブル
ーテトラゾリウムである。【００４８】本発明はまた液体あるいは固体懸濁液中に
多数存在するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのエンテロ
トキシン類を検出し同定するための方法も含む。この方
法は以下の部分から構成されている。ａ）Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓのエンテロトキシン類に特異的で、診
断試薬ホルダーに別々に明確に固定された多数のモノク
ローナル抗体のついている診断試薬ホルダーを適当な時
間液体あるいは固体懸濁液中に浸し、固定されたモノク
ローナル抗体−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロ
トキシン複合体を形成させる。ｂ）試料から判断試薬ホ
ルダーを取り除く。ｃ）界面活性剤入り水性緩衝溶液中
に判断試薬ホルダーを浸す。ｄ）界面活性剤入り水性緩
衝溶液から判断試薬ホルダーを取り除く。ｅ）モノクロ
ーナル抗体−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲート
を含む検出溶液中に診断試薬ホルダーを適当な時間浸
し、固定されたモノクローナル抗体−Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓエンテロトキシン−モノクローナル抗体−
アルカリ性ホスファターゼ複合体を形成させる。ｆ）検
出溶液から診断試薬ホルダーを取り除く。ｇ）水性緩衝
溶液中に診断試薬ホルダーを浸す。ｈ）水性緩衝溶液か
ら診断試薬ホルダーを取り除く。ｉ）５−ブロモ、４−
クロロインドリルホスフェート及びニトロブルーテトラ
ゾリウムを含む溶液中に診断試薬ホルダーを浸す。ｊ）
青色沈澱が蓄積したニトロセルロース膜上の同定可能な
部分を肉眼で検出する。ｋ）青色沈澱が蓄積したニトロ
セルロース膜上の同定可能な部分と、その部分に固定し
たモノクローナル抗体が特異性を示すＳｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンとを対応させ、それによ
って試料中の各種Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテ
ロトキシンの存在を検出し同定する。【００４９】さらに本発明には１つの試料中の細菌最低
１種の存在を検出するための方法も含まれる。この方法
は以下の部分から構成されている。ａ）試料を開放式で
細菌種の増殖に適する培地を含む容器の最低１つに接種
する。ｂ）キャップを容器の端に連結する。このキャッ
プの面は容器に連結した時に容器の内部と接触するよう
になっており表面が最低１つの細菌成分を固定するのに
適切な構造となっている。ｃ）培地中に接種された細菌
が増殖し得るような条件下で、接種された培地を培養す
る。ｄ）容器の上下を適当な時間の間反転させ、培地中
に存在する細菌成分が容器の内部に面したキャップの表
面上に固定されるようにする。ｅ）容器の上下を反転さ
せ正しい方向に戻す。ｆ）容器からキャップを取りはず
す。ｇ）細菌成分が固定されているキャップの表面を、
固定された細菌成分−試薬複合体が形成されるのに適切
な条件下で、固定された細菌成分と複合体を形成し得る
試薬に接触させる。ｈ）固定された細菌成分−試薬複合
体を検出し、それによって試料中の細菌種の存在をも検
出する。本出願の範囲内では「細菌成分」とは全細胞、
細胞壁成分、細胞膜成分、べん毛成分を含むがこれらの
みに限定されるわけではない。【００５０】最低１つの細菌成分を固定するのに適切な
キャップ表面としては、ポリスチレン挿入物、ニトロセ
ルロース膜、ナイロン膜を用いることができる。また表
面をポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、モノク
ローナル抗体の混合物、ポリクローナル抗体とモノクロ
ーナル抗体の混合物でコ−ティングしたものも用いられ
る。固定された細菌成分と複合体を形成し得る試薬には
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、モノクロー
ナル抗体の混合物、ポリクローナル抗体とモノクローナ
ル抗体の混合物がある。また試薬は例えば検出可能な酵
素、蛍光を発する種、化学ルミネセンスを発する種のよ
うな検出可能な標識物で標識するこもできる。さらに検
出可能な標識物としてエレクトロ化学ルミネセンスを発
する種を用いることもできる。本発明の１つの具体例で
はルテニウムまたはオスミウムを含むエレクトロ化学ル
ミネセンス種を使用している。また本発明の別の具体例
では固定された細菌成分−試薬複合体を検出するのに、
固定された細菌成分−試薬複合体と複合体を形成し得る
検出可能標識をした第２試薬を使用することもできる。
さらに本発明の別の具体例では試薬としてポリクローナ
ル抗体、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の混
合物、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の混合
物を使用し、第２試薬としてその試薬に対する抗−抗体
を検出可能なように標識したものを使用している。【００５１】細菌を検出できる試料には水及び食品も含
まれる。本発明の１つの具体例では細菌種の増殖に適す
る培地として非選択的乳糖培地を使用している。また１
つの具体例では培地として非選択的乳糖培地を使用し、
検出できる細菌は最低１種類の大腸菌型である。本発明
には試料中の大腸菌型細菌の存在を検出するための方法
も含まれる。この方法は以下の部分から構成されてい
る。ａ）試料を開放式で非選択的乳糖培地及び倒立Ｄｕ
ｒｈａｍを入れた容器の最低１つに接種する。ｂ）ポリ
スチレン挿入物をつけたキャップを各容器の開放側の端
に連結する。ｃ）接種された培地を３７℃で最低２時間
培養する。ｄ）各容器中に倒立させたＤｕｒｈａｍバイ
アル内に採取されている細菌発酵により産生された気体
があるかどうか検出する。ｅ）倒立させたＤｕｒｈａｍ
バイアル内に気体が採取されている容器の上下を適当な
時間の間反転させ、培地中に存在する大腸菌型細菌が大
腸菌型−ポリスチレン複合体を形成し得るようにする。
ｆ）容器の上下を反転させ正しい方向に戻す。ｇ）容器
からキャップを取りはずす。ｈ）取りはずしたキャップ
のポリスチレン挿入物を、未結合部位をふさぐのに適切
な物質を用いて処理する。（ｉ）未結合部位をふさぐの
に適切な物質を用いて処理されたキャップのポリスチレ
ン挿入物を、抗体−大腸菌型−ポリスチレン複合体が形
成し得るような条件下で大腸菌型細菌に結合でき検出可
能となる標識物によって標識した抗大腸菌型細菌抗体最
低１種類を用いて処理する。ｊ）ポリスチレン挿入物上
の抗体−大腸菌型−ポリスチレン複合体の存在を検出
し、それによって試料中の大腸菌型細菌の存在をも検出
する。【００５２】本発明の１つの具体例では非選択的乳糖培
地はフェノールレッドブロスである。ポリスチレン挿入
物上の未結合部位をふさぐのに適切な物質としてはウシ
血清アルブミンが使用できる。検出可能な標識物で標識
された抗大腸菌型細菌抗体としては検出可能な標識物で
標識されたモノクローナル抗体が使用できる。検出可能
な標識物としてはモノクローナル抗体に結合した酵素が
使用できる。本発明の１つの具体例ではこの酵素として
子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼを使用している。ま
た本発明の別の具体例では検出可能な標識物としてモノ
クローナル抗体に結合した蛍光を発する種を使用してい
る。さらに別の具体例では検出可能な標識物としてモノ
クローナル抗体に結合したエレクトロ化学ルミネセンス
を発する種を使用している。エレクトロ化学ルミネセン
スを発する種にはルテニウムやオスミウムが含まれる。
本発明の１つの具体例では試料は水である。また本発明
の別の具体例では試料は食品である。【００５３】開放式の容器としてはバイアルが使用でき
る。また水試料中の大腸菌型細菌を検出するためのキッ
トも含まれる。このキットは以下の部分から構成されて
いる。ａ）非選択的乳糖培地の入ったバイアル最低１
本、ｂ）Ｄｕｒｈａｍバイアル最低１本、ｃ）ポリスチ
レン挿入物をつけたバイアルキャップ最低１個、ｄ）ウ
シ血清アルブミン溶液、ｅ）抗大腸菌型細菌モノクロー
ナル抗体−酵素結合体、ｆ）洗浄用水性緩衝溶液、ｇ）
酵素基質溶液。本発明の１つの具体例では抗大腸菌型細
菌モノクローナル抗体に結合した酵素は子ウシ腸アルカ
リ性ホスファターゼであり、酵素基質はｐ−ニトロフェ
ニルリン酸二ナトリウムである。本発明は次の構造をも
つ化合物も含み、【化１】ｎは整数である。本発明の１つの具体例ではｎは２であ
る。さらに本発明は次の構造をもつ化合物も含み、【化２】ｎは整数である。本発明の１つの具体例ではｎは２であ
る。また本発明は次の構造をもつ化合物も含み、【化３】ｎは整数である。本発明の１つの具体例ではｎは２であ
る。【００５４】さらに本発明には次の構造をもつ化合物も
含まれ、【化４】Ｒは陰イオンで、ｎは整数である。本発明の１つの具体
例ではｎは２である。この化合物は次の構造をもつ構成
物を含み、【化５】Ｘ−（Ｙ）_n−ＺＸは同種または異種のヌクレオチド１つ以上、同種また
は異種のアミノ酸１つ以上、抗体、目的分析物、目的分
析物の類似体を表わし、ｎは整数、Ｚは本発明に含まれ
る化合物を表わしている。【００５５】また本発明は次の構造をもつ化合物も含
み、Ｒは陰イオンで、ｎは整数である。本発明の１つの
具体例ではｎは２である。【化６】この化合物は次の構造をもつ構成物を含み、【化７】Ｘ−（Ｙ）_n−ＺＸは同種または異種のヌクレオチド１つ以上、同種また
は異種のアミノ酸１つ以上、抗体、目的分析物、目的分
析物の類似体を表わし、ｎは整数、Ｚは本発明に含まれ
る化合物を表わしている。【００５６】さらに本発明には次の構造をもつ化合物も
含まれ、Ｒは陰イオンで、ｎは整数である。本発明の１
つの具体例ではｎは３である。【化８】この化合物は次の構造をもつ構成物を含み、【化９】Ｘ−（Ｙ）_n−ＺＸは同種または異種のヌクレオチド１つ以上、同種また
は異種のアミノ酸１つ以上、抗体、目的分析物、目的分
析物の類似体を表わし、ｎは整数、Ｚは本発明に含まれ
る化合物を表わしている。【００５７】また本発明は次の構造をもつ化合物も含
み、Ｒは陰イオンで、ｎは整数である。本発明の１つの
具体例ではｎは３である。【化１０】この化合物は次の構造をもつ構成物を含み、【化１１】Ｘ−（Ｙ）_n−ＺＸは同種または異種のヌクレオチド１つ以上、同種また
は異種のアミノ酸１つ以上、抗体、目的分析物、目的分
析物の類似体を表わし、ｎは整数、Ｚは本発明に含まれ
る化合物を表わしている。【００５８】さらに本発明には次の構造をもつ化合物も
含まれ、【化１２】ｎは整数である。本発明の１つの具体例ではｎは３であ
る。また本発明は次の構造をもつ化合物を含み、【化１３】ｍとｎはそれぞれ同じまたは異なる整数である。本発明
の１つの具体例ではｍとｎは両方とも３である。【００５９】さらに本発明には次の構造をもつ化合物も
含まれ【化１４】Ｒは陰イオンで、ｎは整数である。本発明の１つの具体
例ではｎは２である。【００６０】この化合物は次の構造をもつ構成物を含
み、【化１５】Ｘ−（Ｙ）_n−ＺＸは同種または異種のヌクレオチド１つ以上、同種また
は異種のアミノ酸１つ以上、抗体、目的分析物、目的分
析物の類似体を表わし、ｎは整数、Ｚは本発明に含まれ
る化合物を表わしている。また本発明は次の構造をもつ
化合物を含む。【化１６】さらに次の構造をもつ化合物も含み、【化１７】Ｒは陰イオンで、ｎは整数である。本発明の１つの具体
例ではｎは２である。【００６１】この化合物は次の構造をもつ構成物を含
み、【化１８】Ｘ−（Ｙ）_n−ＺＸは同種または異種のヌクレオチド１つ以上、同種また
は異種のアミノ酸１つ以上、抗体、目的分析物、目的分
析物の類似体を表わし、ｎは整数、Ｚは本発明に含まれ
る化合物を表わしている。また本発明は次の構造をもつ
化合物を含み、【化１９】Ｒは陰イオンで、ｍとｎは整数である。本発明の１つの
具体例ではｍは５、ｎは３である。【００６２】この化合物は次の構造をもつ構成物を含
み、【化２０】Ｘ−（Ｙ）_n−ＺＸは同種または異種のヌクレオチド１つ以上、同種また
は異種のアミノ酸１つ以上、抗体、目的分析物、目的分
析物の類似体を表わし、ｎは整数、Ｚは本発明に含まれ
る化合物を表わしている。本発明の１つの具体例ではＸ
はテオフィリンである。また本発明の別の具体例ではＸ
はジゴキシゲニンである。さらに本発明の別の具体例で
はＸはｈＣＧ由来のペプチドである。さらに本発明には
次の構造をもつ化合物が含まれ、【化２１】Ｘ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ₂）_n
−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ₂）_m−ＺＸは同種または異種のヌクレオチド１つ以上、Ｚはエレ
クトロ化学ルミネセンスを発する化学種、ｎは１以上の
整数、ｍは１以上の整数、をそれぞれ表わしている。本
発明の１つの具体例ではＸが５番目の炭素の位置のＣＨ
につけたチミジン、ｎが７でｍが３である。【００６３】また本発明の別の具体例ではＺがビス
（２，２′−ビピリジン）〔４−（ブタン−１−ａｌ）
−４′メチル−２，２′−ビピリジン〕ルテニウム（Ｉ
Ｉ）である。さらに本発明の別の具体例ではチミジンヌ
クレオチドが次のヌクレオチド配列につけた３′末端ヌ
クレオチドとなっている。【化２２】ＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＡＣＣＧＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＣＡＧ本発明はまた次の構造をもつ化合物を含み、【化２３】〔Ｔ−Ｙ−Ｚ〕²⁺（Ｒ）₂Ｔはテオフィリン、ＹはＴからＺにつくリンカー基、Ｚ
はビス−（２，２′−ビピリジン）〔４−メチル−２，
２′−ビピリジン−４′−ｙｌ〕ルテニウム（ＩＩ）、
Ｒは陰イオンを表わしている。本発明の１つの具体例で
はＹは８番目のＴの位置の炭素についている。また本発
明の別の具体例ではＹは次の構造をもち、【化２４】（ＣＨ₂）_m−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ₂）_nｍとｎは同じまたは異なる１つ以上の整数を表わしてい
る。また別の具体例ではｍは３、ｎは４である。さらに
別の具体例ではｍとｎは両方とも３である。【００６４】また本発明の別の具体例ではＹは次の構造
をもち、【化２５】ｍ、ｎ、ｒは同じまたは異なる１つ以上の整数を表わし
ている。１つの具体例ではｍは１、ｎは１、ｒは４であ
る。さらに本発明の別の具体例ではＹは次の構造をも
ち、【化２６】ｍ、ｎ、ｒは同じまたは異なる１以上の整数を表わして
いる。１つの具体例ではｍは１、ｎは１、ｒは４であ
る。また本発明の別の具体例ではＹは７番目のＴの位置
の窒素についている。１つの具体例ではＹは次の構造を
もち、【化２７】（ＣＨ₂）_nｎは１以上の整数である。別の具体例ではｎは４であ
る。【００６５】本発明はまた次の構造をもつ化合物を含
み、【化２８】Ｙはリンカーアームである。本発明の１つの具体例では
Ｙは次の構造をもち【化２９】（ＣＨ₂）_m−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ₂）_nｍとｎは同じまたは異なる１以上の整数である。１つの
具体例ではｍは３、ｎは２である。【００６６】本発明はさらに次の構造をもつ化合物を含
み、【化３０】ｍとｎは同じまたは異なる整数である。１つの具体例で
はｍとｎは両方とも１である。また次の構造をもつ構成
物を含み、【化３１】Ｘ−ＺＸはシステインまたはメチオニンの最低１つのアミノ酸
から成る同種あるいは異種のアミノ酸１つ以上を表わ
し、Ｚは３番目または４番目のマレイミドの位置の炭素
によってシステインまたはメチオニンのイオウ置換基に
つけたビス（２，２′−ビピリジン）マレイミドヘキサ
ン酸、４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ブチ
ラミドルテニウム（ＩＩ）を表わしている。以下に挙げ
る例は本発明の具体的説明であるが、これに限られるわ
けではなく、発明明細書に続く承認請求によってその範
囲を定めている。【００６７】実施例１−各種有機溶剤中のエレクトロ化
学ルミネセンストリス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）ク
ロリドヘキサヒドレートのエレクトロ化学ルミネセンス
を、以下のようにして調製した溶液１０ｍｌを含む１５
ｍｌ ３口丸底フラスコ中で測定した：１．５ｍｍ×１
０ｍｍマグネチックスターラーバー、直径１．０ｍｍの
銀線準基準電極、配合２８ゲージプラチナ線対電極、厚
さ０．１ｍｍの高度に研磨したプラチナ箔１ｃｍ×１ｃ
ｍ正方形片に溶接した２２ゲージプラチナ線から成る作
動電極（プラチナ箔作動電極は直径３／１６インチの半
円形とし、２８ゲージプラチナ線対電極を３／３２イン
チの等距離をおいて囲むようにした）。銀線をＥＧ＆Ｇ
１７３型電位調節器／電流調節器のＥＧ＆Ｇ１７８型電
位計プローブに接続した。プラチナ線対電極とプラチナ
作動電極はＥＧ＆Ｇ１７３型電位調節器の陽極及び陰極
にそれぞれ接続した。装置はアースした。【００６８】ＥＧ＆Ｇ１７５型ユニバーサルプログラマ
ーをつけたＥＧ＆Ｇ１７３型電位調節器を用いて循環電
圧電流を測定した。プログラマーは陽極電位＋１．７５
ボルトと陰極電位−１．８０ボルトの間を１００ｍＶ／
秒で掃引するように設定した。Ｈａｍａ−ｍａｔｓｕ
Ｒ９２８光電増倍管チューブをＫｏｄａｋ＃２３Ａゼラ
チン（赤色）フィルターをつけたＰｒｏｄｕｃｔｓ ｆ
ｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＲ１４０２ＲＦ型光電増倍
管チューブハウジングの中に入れ、エレクトロ化学ルミ
ネセンスを検出した。光電増倍管チューブハウジングは
Ｏｒｉｅｌ ７０７０型光電増倍管検出システムに接続
した。循環電圧電流はＨｏｕｓｔｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ２００Ｘ−Ｙ型記録計に記録した。循環電圧電流
は次の有機溶剤と１ｍＭトリス（２，２′−ビピリジ
ル）ルテニウム（ＩＩ）クロリドヘキサヒドレート（Ａ
ｌｄｒｉｃｈ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）及び
０．１Ｍテトラブチルアンモニウムテトラフルオロボレ
ート（ＴＢＡＢＦ₄）（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）とによって産生された。：アセ
トニトリル、ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド、１−メチル、２−ピロリジノン（Ａｌｄｒｉ
ｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）。また１ｍ
Ｍトリス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）
クロリドヘキサヒドレート及び０．１Ｍ ＴＢＡＢＦ₄
を含む溶液を調製する時には第三級ブチルアルコールと
脱イオン蒸留水の溶液（１：１、ｖ／ｖ）を使用した。
このようにして産生された電圧電流によると、各有機溶
剤中でのトリス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム
（ＩＩ）クロリドヘキサヒドレートの酸化還元電位に変
化は見られなかった。【００６９】エレクトロ化学ルミネセンスを肉眼で検出
するため、次のようにして溶液を調製した：十分量のト
リス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）クロ
リドヘキサヒドレート及びＴＢＡＢＦ₄を上記の有機溶
剤分光器用等級（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｍｐａｎｙ）に溶解し、最終濃度をそれぞれ１ｍ
Ｍ、０．１Ｍとした。この溶液１０ｍｌを１５ｍｌ ３
口丸底フラスコに入れた。電極をこの溶液中に浸し、作
動電極は＋１．７５から−１．４５ボルトの電位間を振
動させエレクトロ化学ルミネセンスが産生されるように
した。エレクトロ化学ルミネセンスは前述の各溶液中で
肉眼的に観察した。各種溶剤によるエレクトロ化学ルミ
ネセンスへの影響を定量的に測定するため、次のように
して溶液を調製した：十分量のトリス（２，２′−ビピ
リジル）ルテニウム（ＩＩ）クロリドヘキサヒドレート
及びＴＢＡＢＦ₄を前述の有機溶剤中に溶解し、最終濃
度をそれぞれ２ｍＭ、０．２ｍＭとした。この溶液一定
量に、強酸化剤過硫酸アンモニウムを３６ｍＭの濃度で
含有する脱イオン蒸留水を等量加えた。トリス（２，
２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）クロリドヘキサ
ヒドレートの入っていない対照溶液も調製した。このよ
うにして得た溶液１０ｍｌを１５ｍｌ ３口丸底フラス
コに入れた。陰極電位を０から−２．０ボルトまで１／
２秒間隔で振動させ、エレクトロ化学ルミネセンスが産
生されるようにした。【００７０】Ｍｉｃｒｏｎｔａ２２１９１型デジタルマ
ルチメーターに接続したインテグレーターを用い、この
ようにして得たエレクトロ化学ルミネセンスの光電増倍
管チューブ信号の総和を計算することによってエレクト
ロ化学ルミネセンスを測定した。エレクトロ化学ルミネ
センス信号は振動期間の１０秒間の和を求め、ｍＶで記
録した。結果は表Ｉに示す通りで、各種溶剤によってル
テニウム（ＩＩ）クロリドの効率が量的に異なることが
わかる。【表１】表 Ｉ 有機 トリスＲｕＢｉＰｙ溶剤（１０^-6Ｍ）対 照 Δ アセトニトリル ２, ５４０ １０４ ２，４３６ 第三級ブチルアルコール １，２８０ ０ １，２８０ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド ２，３９０ １４３ ２，２４７ ジメチルスルホキシド ２，７６０ ２９ ２，７３１ １−メチル−２−ピロリジノン １，６３０ ０ １，６３０ ＊ 測定値の単位はすべてｍＶ。【００７１】実施例２−ルテニウム標識ウサギ抗マウス
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体のエレクトロ化学ルミ
ネセンス検出感度４，４′−（ジクロロメチル）−２，２′−ビピリジ
ル、ビス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）
で標識したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ルテニウム標識
ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体）のエレクトロ化学ルミネセ
ンスを、以下のようにして調製した溶液１０ｍｌを含む
１５ｍｌ ３口丸底フラスコ中で測定した：１．５ｍｍ
×１０ｍｍマグネチックスターラーバー、直径１．０ｍ
ｍの銀線準基準電極、配合２８ゲージプラチナ線対電
極、厚さ０．１ｍｍの高度に研磨したプラチナ箔１ｃｍ
×１ｃｍ正方形片に溶接した２２ゲージプラチナ線から
成る作動電極（プラチナ箔作動電極は直径３／１６イン
チの半円形とし、２８ゲージプラチナ線対電極を３／３
２インチの等距離をおいて囲むようにした）。銀線をＥ
Ｇ＆Ｇ１７３型電位調節器／電流調節器のＥＧ＆Ｇ１７
８型電位計プローブに接続した。プラチナ線対電極とプ
ラチナ作動電極はＥＧ＆Ｇ１７３型電位調節器の陽極及
び陰極にそれぞれ接続した。装置はアースした。【００７２】ルテニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体
溶液から放出されたエレクトロ化学ルミネセンスは、Ｋ
ｏｄａｋ ＃２３Ａゼラチン（赤色）フィルターをつけ
たＰｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＲ
１４０２ＲＦ型光電増倍管チューブハウジングの中に入
れたＨａｍａｍａｔｓｕ Ｒ９２８光電増倍管チューブ
を用いて検出した。光電増倍管チューブハウジングはＯ
ｒｉｅｌ ７０７０型光電増倍管検出システムに接続し
た。陰極電位を０から−２．０ボルトまで１／２秒間隔
で振動させ、エレクトロ化学ルミネセンスが産生される
ようにした。Ｍｉｃｒｏｎｔａ２２１９１型デジタルマ
ルチメーターに接続したインテグレーターを用い、この
ようにして得たエレクトロ化学ルミネセンスの光電増倍
管チューブ信号の総和を計算することによってエレクト
ロ化学ルミネセンスを測定した。エレクトロ化学ルミネ
センス信号は振動期間の１０秒間の和を求め、ｍＶで記
録した。ルテニウニム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体の
１．２５×１０^-7Ｍの保存用溶液は、標識抗体の濃縮液
（２ｍｇ／ｍｌ、７．５Ｒｕ／抗体）をリン酸緩衝溶液
（ＰＢＳ）で希釈することにより調製した。この溶液一
定量（８０μｌ）を反応容器中の０．１Ｍテトラブチル
アンモニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＡＢＦ₄）
及び１８ｍＭ過硫酸アンモニウムを含むジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）／脱イオン蒸留水（１：１）１０ｍ
ｌに加えた。ルテニウム標識抗体の最終濃度は１×１０
^-9Ｍとした。前述のようにしてエレクトロ化学ルミネセ
ンスを測定した。【００７３】ルテニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体
保存用溶液の各種希釈溶液をも調製し、これらの溶液一
定量（８０μｌ）を反応容器中のルテニウム標識抗体同
溶液に加え、標識抗体の濃度が次のようになるようにし
た：５×１０^-9Ｍ、１×１０^-8Ｍ、５×１０^-8Ｍ。各溶
液のエレクトロ化学ルミネセンスを前述のようにして測
定した。この測定値を以下の表ＩＩに挙げる。これらの
結果から標識抗体（１×１０^-9Ｍ）のエレクトロ化学ル
ミネセンス検出感度が示され、エレクトロ化学ルミネセ
ンスの強度はルテニウム標識抗マウスＩｇＧ抗体の濃度
に依存することがわかる。【表２】表 ＩＩルテニウム標識ウサギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体のエレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ） ルテニウム標識抗マウスＩｇＧ抗体の濃度ＥＣＬ（ｍＶ） ５×１０^-8Ｍ １６１０ １×１０^-8Ｍ ８９２ ５×１０^-9Ｍ ４１８ １×１０^-9Ｍ ７２ ０ ０【００７４】実施例３−固相酵素標識イムノソルベント
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）におけるルテニウム標識ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）の免疫学的反応性ポリスチレン製マイクロタイター板の各穴を、４，４′
−（ジクロロメチル）−２，２′−ビピリジル、ビス
（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）で標識し
たウシ血清アルブミン、すなわちルテニウム標識ウシ血
清アルブミン（６Ｒｕ／ＢＳＡ、２０μｇ／ｍｌ ＰＢ
Ｓ、５０μｌ／穴）あるいは未標識ＢＳＡ（２０μｇ／
ｍｌ ＰＢＳ、５０μｌ／穴）の十分な濃度の溶液でコ
ーティングし、室温で１時間インキュベートした。この
インキュベート期間終了後、タイター板をＰＢＳで１回
当たり５分間、３回洗浄した。６ｍｇ／ｍｌのウサギ抗
ＢＳＡ抗体を含む溶液をＰＢＳで１：２０，０００、
１：３０，０００、１：４０，０００、１：５０，００
０、１：６０，０００に希釈し、ルテニウム標識ＢＳＡ
あるいは未標識ＢＳＡでコーティングした各穴２つずつ
にこの希釈液を加え、タイター板を室温で１時間インキ
ュベートした。前回と同様ＰＢＳを用いて３回洗浄した
後、各穴にヤギ抗ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合
体（０．５ｍｇ／ｍｌ溶液をＰＢＳで１：１０００に希
釈）を加えタイター板を室温で１時間インキュベートす
ることにより、結合したウサギ抗ＢＳＡ抗体が存在する
かどうかを検出した。タイター板を前回と同様にして
０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで２回、ＰＢＳで
２回洗浄した後、過酸化水素（３０％）と２，２′−ア
ジノ−ジ−〔３−エチル−ベンツチアゾリンスルホネー
ト〕（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）とを
等量ずつ混合し、そのうち２００μｌをタイター板の各
穴に加えた。室温で３０分間インキュベートした後、４
１４ｎｍでタイター板の吸光度測定を行った。ルテニウ
ム標識ＢＳＡあるいは未標識ＢＳＡでコーティングした
穴に加えたウサギ抗ＢＳＡ抗体の各希釈液の２穴の平均
測定値から対照穴のバックグラウンド吸光度の平均値を
引いた。これらの補正吸光度を表Ｖに示す。【００７５】未標識ＢＳＡとルテニウム標識ＢＳＡから
得られた曲線は平行で、２つの曲線の各点の補正吸光度
の比は約０．６と一定であった。前述の活性化ルテニウ
ム複合体と同じものを用いて調製し同様のＲｕ／ＢＳＡ
標識比をもつ他のルテニウム標識ＢＳＡ２ロットによる
実験でも同一の結果が得られた。以上の結果から、ルテ
ニウム標識ＢＳＡは免疫学的反応性を有し、ルテニウム
で標識した時の免疫反応性は未標識ＢＳＡと比較して約
６０％に達することが示される。【表３】表 ＩＩＩ ４１４ｎｍにおける吸光度 ウサギ抗ＢＳＡ 未標識 ルテニウム 相対免疫抗体希釈ＢＳＡ標識ＢＳＡ反応性 ２0,０００ 1.０６ 0.６６ ６２％ ３0,０００ 0.８３ 0.５０ ６０％ ４0,０００ 0.６７ 0.４０ ６０％ ５0,０００ 0.５６ 0.３３ ５９％ ６0,０００ 0.４７ 0.２８ ６０％【００７６】実施例４−競合固相酵素標識イムノソルベ
ントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）におけるルテニウム標識ウ
サギ抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）抗体の免疫学的
反応性４，４′−（ジクロロメチル）−２，２′−ビピリジ
ル、ビス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）
で標識したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ルテニウム標識
ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体）について、マウスＩｇＧへ
の結合を酵素標識抗マウスＩｇＧ抗体と競合する能力に
関して未標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体と比較した。９
６穴ポリスチレン製マイクロタイター板の各穴をマウス
ＩｇＧ溶液（５μｇ／ｍｌ ＰＢＳ）でコーティング
し、室温で６０分間インキュベートした後、ＰＢＳで１
回当たり５分間、３回洗浄した。ウサギ抗マウスＩｇＧ
−アルカリ性ホスファターゼ結合体とウサギ抗マウスＩ
ｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）との混合物を含む溶液及びウサギ
抗マウスＩｇＧ−アルカリ性ホスファターゼ結合体とル
テニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ、
７．５Ｒｕ／抗体）との混合物を含む溶液の２種類を調
製した。これら２種類の溶液と、ウサギ抗マウスＩｇＧ
−アルカリ性ホスファターゼ結合体を含む第３の溶液と
を、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで１：６０
００、１：７０００、１：８０００、１：９０００、
１：１０，０００、１：１２，０００、１：１４，００
０、１：１６，０００に希釈し、マウスＩｇＧを結合さ
せたタイター板の各列に加えた（５０μｌ／穴）。タイ
ター板を室温で６０分間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎ−２０で２回、ＰＢＳで２回、１回当たり５分
間洗浄した。各穴に酵素基質ｐ−ニトロフェニルホスフ
ェート（１．５ｍｇ／ｍｌ １０％ジエタノールアミン
緩衝液、ｐＨ９．６）を加え（２００μｌ／穴）、タイ
ター板を室温で３０分間インキュベートした後、４０５
ｎｍで吸光度測定を行った。３種類の溶液の各希釈液の
２穴の平均測定値から対照穴のバックグラウンド吸光度
の平均値を引いた。これらの吸光度の値を表ＶＩに示
す。【００７７】得られた３本の曲線は平行で、一番上が酵
素結合体の結合を阻害しなかった場合、二番目と三番目
がルテニウム標識抗マウスＩｇＧ及び未標識抗マウスＩ
ｇＧによって阻害した場合である。ルテニウム標識抗マ
ウスＩｇＧの曲線は、酵素結合体の曲線と比較して各点
共未標識抗マウスＩｇＧの曲線の値の約８１％である。
以上の結果から、ルテニウム標識抗マウスＩｇＧ抗体は
その抗原（マウスＩｇＧ）に対する免疫学的反応性を有
し、マウスＩｇＧへの結合を酵素標識抗マウスＩｇＧ抗
体と競合する能力は未標識抗マウスＩｇＧ抗体の約８０
％であることが示される。【表４】表 ＩＶ ４０５ｎｍにおける吸光度 Ａ Ｂ Ｃ 抗マウスIgG 酵素結合体＋ アルカリ性ホ ルテニウム 酵素結合体＋ スファターゼ 標識抗マウス 未標識抗マウ 相対希 釈 (酵素結合体）ＩｇＧスＩｇＧ阻害度^* 6,０００ １．４８ ０．９４ ０．７９ ７７％ 7,０００ １．３３ ０．８２ ０．６９ ７９％ 8,０００ １．２１ ０．７２ ０．６２ ８２％ 9,０００ １．１０ ０．６５ ０．５６ ８４％ １0,０００ １．０１ ０．６０ ０．５１ ８２％ １2,０００ ０．８７ ０．５１ ０．４３ ８０％ １4,０００ ０．７７ ０．４５ ０．３７ ８１％ １6,０００ ０．６８ ０．４０ ０．３３ ８０％ ──────────────────────────────────── ＊（Ａ−Ｂ／Ａ−Ｃ）×１００％ 【００７８】実施例５−ルテニウム標識ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）のエレクトロ化学ルミネセンス４，４′−（ジクロロメチル）−２，２′−ビピリジ
ル、ビス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）
で標識したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ルテニウム
標識ウシ血清アルブミン）の７．８×１０^-6Ｍ溶液を、
ルテニウム標識ＢＳＡの保存用溶液（２．６ｍｇ／ｍ
ｌ、６Ｒｕ／ＢＳＡ）のリン酸緩衝溶液を用いた希釈に
よって調製した。この溶液２６μｌを反応容器中の０．
１Ｍ ＴＢＡＢＦ₄及び１８ｍＭ過硫酸アンモニウムを
含むＤＭＳＯ／脱イオン蒸留水（１：１）１０ｍｌに加
えた。ルテニウム標識ＢＳＡの最終濃度は２×１０^-8Ｍ
とした。実施例Ｖと同様にしてエレクトロ化学ルミネセ
ンスを測定した。同じ方法を用いて未標識ＢＳＡの７．
８×１０^-6Ｍ溶液を調製し、未標識ＢＳＡの最終濃度が
２×１０^-8Ｍとなるよう反応容器中に加えた。この溶液
とＢＳＡを含まない同様の溶液のエレクトロ化学ルミネ
センスを測定した。共有結合したルテニウム標識ＢＳ
Ａ、未標識ＢＳＡのエレクトロ化学ルミネセンス測定値
を表Ｖに示す。【表５】表 Ｖルテニウム標識ＢＳＡのエレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ）溶 液ＥＣＬ（ｍＶ） ２×１０^-8Ｍルテニウム標識ＢＳＡ ７３０ ２×１０^-8Ｍ ＢＳＡ １００ ＤＭＳＯ：Ｈ₂Ｏ（１：１） ０【００７９】実施例６−ルテニウム標識ウサギ抗マウス
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体のエレクトロ化学ルミ
ネセンス４，４′−（ジクロロメチル）−２，２′−ビピリジ
ル、ビス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）
で標識したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ルテニウム標識
ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体）の１．２５×１０^-6Ｍ溶液
を、ルテニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体の保存用
溶液（２ｍｇ／ｍｌ、７．５Ｒｕ／抗体）のリン酸緩衝
溶液を用いた希釈によって調製した。この溶液８０μｌ
を反応容器中の０．１Ｍ ＴＢＡＢＦ₄及び１８ｍＭ過
硫酸アンモニウムを含むＤＭＳＯ／脱イオン蒸留水
（１：１）１０ｍｌに加えた。ルテニウム標識抗体の最
終濃度は１×１０^-8Ｍとした。実施例２と同様にしてエ
レクトロ化学ルミネセンスを測定した。同じ方法を用い
て未標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体の１．２５×１０^-6
Ｍ溶液を調製し、未標識抗体の最終濃度が１×１０^-8Ｍ
となるよう反応容器中に加えた。この溶液と抗体を含ま
ない同様の溶液のエレクトロ化学ルミネセンスも前述の
ようにして測定した。共有結合したルテニウム標識ウサ
ギ抗マウスＩｇＧ抗体、未標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗
体のエレクトロ化学ルミネセンス測定値を表ＶＩＩＩに
示す。【表６】表 ＶＩ ルテニウム標識ウサギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ） 抗体のエレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ）溶液ＥＣＬ（ｍＶ） １×１０^-8ルテニウム標識ウサギ ８９２ 抗マウスＩｇＧ抗体 １×１０^-8ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体 ０ ＤＭＳＯ：Ｈ₂Ｏ（１：１） ０【００８０】実施例７−ウシ血清アルブミンに対する抗
体の均質系エレクトロ化学ルミネセンスイムノアッセイ４，４′−（ジクロロメチル）−２，２′−ビピリジ
ル、ビス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）
で標識したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ルテニウム
標識ウシ血清アルブミン）の７．８×１０^-6Ｍ溶液を、
ルテニウム標識ＢＳＡの保存用溶液（２．５ｍｇ／ｍ
ｌ、６Ｒｕ／ＢＳＡ）のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を用
いた希釈によって調製した。この溶液２６μｌを反応容
器中の０．１Ｍ ＴＢＡＢＦ₄及び１８ｍＭ過硫酸アン
モニウムを含むＤＭＳＯ／脱イオン蒸留水（１：１）１
０ｍｌに加えた。ルテニウム標識ＢＳＡの最終濃度は２
×１０^-8Ｍとした。実施例２と同様にしてエレクトロ化
学ルミネセンスを測定した。同じ方法を用いて未標識Ｂ
ＳＡの７．８×１０^-6Ｍ溶液を調製し、未標識ＢＳＡの
最終濃度が５×１０^-8Ｍとなるよう反応容器中に加え
た。この溶液とＢＳＡを含まない同様の溶液のエレクト
ロ化学ルミネセンスを測定した。ウサギ抗ＢＳＡ抗体の
３．７５×１０^-5Ｍ溶液を、ウサギ抗ＢＳＡ抗体の保存
用溶液（６．０ｍｇ／ｍｌ）のＰＢＳを用いた希釈によ
って調製し、この溶液一定量（２６μｌ）を反応容器中
のルテニウム標識ＢＳＡ溶液に加えてウサギ抗ＢＳＡ抗
体の最終濃度が１×１０^-7Ｍとなるようにした。【００８１】このようにして得たルテニウム標識ＢＳＡ
抗原と抗体（ウサギ抗ＢＳＡ）との混合物のエレクトロ
化学ルミネセンスを測定した。表ＶＩＩに示した結果か
ら、ルテニウム標識ＢＳＡのエレクトロ化学ルミネセン
スはウサギ抗ＢＳＡ抗体を加えると減少することが示さ
れ、ＢＳＡに対する抗体の均質系エレクトロ化学ルミネ
センス検出が可能であることがわかる。以上の結果に基
づき、本技術分野の専門家によって他の目的分析物を検
出するための均質系エレクトロ化学ルミネセンスイムノ
アッセイも開発され得るであろう。【表７】表 ＶＩＩ ルテニウム標識ウシ血清アルブミンの抗体結合時における エレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ）の減少 未標識 ルテニウム標識 ウサギ ＢＳＡ ＢＳＡ 抗ＢＳＡ（対照）（抗原）（抗体）ＥＣＬ（ｍＶ） ０ ２×１０^-8Ｍ ０ ７２７ ０ ２×１０^-8Ｍ １×１０^-7Ｍ ９２ ２×１０^-8Ｍ ０ ０ ９４【００８２】実施例８−マウス免疫グロブリンＧ（Ｉｇ
Ｇ）の均質系エレクトロ化学ルミネセンスイムノアッセ
イ４，４′−（ジクロロメチル）−２，２′−ビピリジ
ル、ビス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）
で標識したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ルテニウム標識
ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体）の６．２５×１０^-6Ｍ溶液
を、ルテニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体の保存用
溶液（２ｍｇ／ｍｌ、７．５Ｒｕ／抗体）のリン酸緩衝
溶液（ＰＢＳ）を用いた希釈によって調製した。この溶
液８０μｌを反応容器中の０．１Ｍ ＴＢＡＢＦ₄及び
１８ｍＭ過硫酸アンモニウムを含むＤＭＳＯ／脱イオン
蒸留水（１：１）１０ｍｌに加えた。ルテニウム標識抗
体の最終濃度は５×１０^-8Ｍとした。実施例２と同様に
してエレクトロ化学ルミネセンスを測定した。同じ方法
を用いて未標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体の６．２５×
１０^-6Ｍ溶液を調製し、未標識抗体の最終濃度が５×１
０^-8Ｍとなるよう反応容器中に加えた。この溶液と抗体
を含まない同様の溶液のエレクトロ化学ルミネセンスを
測定した。【００８３】マウスＩｇＧの２．５×１０^-5Ｍ溶液を、
マウスＩｇＧの保存用溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）のＰＢ
Ｓを用いた希釈によって調製し、この溶液の２容量（２
０μｌ及び４０μｌ）を反応容器中のルテニウム標識抗
マウスＩｇＧ溶液に加えてマウスＩｇＧの最終濃度がそ
れぞれ５×１０^-8Ｍ、１×１０^-7Ｍとなるようにした。
このようにして得たルテニウム標識抗マウスＩｇＧ抗体
と抗原（マウスＩｇＧ）との混合物のエレクトロ化学ル
ミネセンスを測定した。結果は表ＶＩＩＩに示す。エレ
クトロ化学ルミネセンス測定値がマウスＩｇＧ抗原の濃
度に依存する様子を図１に示してある。以上の結果か
ら、ルテニウム標識抗体のエレクトロ化学ルミネセンス
は抗原を加えると減少することがわかる。これらの結果
に基づき、本技術分野の専門家によって他の目的分析物
の濃度を測定するための均質系エレクトロ化学ルミネセ
ンスイムノアッセイも開発され得るであろう。【表８】表 ＶＩＩＩ ルテニウム標識抗体の抗原結合時におけるエレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ）の減少 未標識抗 ルテニウム標識 マウスＩｇＧ 抗マウスＩｇＧ マウスＩｇＧ（対照） （抗体） （抗原）ＥＣＬ（ｍＶ） ０ ５×１０^-8Ｍ ０ １６１０ ０ ５×１０^-8Ｍ ５×１０^-8Ｍ １３６０ ０ ５×１０^-8Ｍ １×１０^-7Ｍ １２４０ ５×１０^-8Ｍ ０ ０ ０【００８４】実施例９−マウス抗Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体及びルテニウム標識ウ
サギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を用いた
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａの異質系エレクトロ化学ルミネセ
ンスイムノアッセイ─────────────────────────
───────────細菌Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｍｉｃｄａｄｅｉのホルマ
リン化懸濁液を、光学密度１．００（４２５ｎｍで）と
なるようにＰＢＳで希釈した。約３×１０⁹細胞を円錐
形ミクロ遠心チューブに入れた。細胞を遠心し（１０分
間、１０，０００ＲＰＭ）、上清を捨て、Ｌｅｇｉｏｎ
ｅｌｌａｍｉｃｄａｄｅｉに特異的なマウスモノクロ
ーナルＩｇＧ抗体（１．４５ｍｇ／ｍｌ）のＰＢＳ中
１：５０希釈液（１ｍｌ）に細胞を再懸濁した。室温で
１時間インキュベートした後、細胞を遠心し、上清を捨
て、ＰＢＳ中に細胞を再懸濁して再び遠心した。上清を
捨てた後、４，４′−（ジクロロメチル）−２，２′−
ビピリジル、ビス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム
（ＩＩ）で標識したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体、すなわ
ちルテニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（２ｍｇ／
ｍｌ、７．５Ｒｕ／抗体）のＰＢＳ中１：５０希釈液に
細胞を再懸濁した。室温で１時間インキュベートした
後、細胞を遠心し、上清を捨て、ＰＢＳ中に細胞を再懸
濁して前述のように遠心により２回洗浄した。最後の洗
浄の後ＰＢＳ２００μｌ中に細胞を再懸濁した。この細
胞懸濁液１００μｌを反応容器中の０．１Ｍ ＴＢＡＢ
Ｆ₄及び１８ｍＭ過硫酸アンモニウムを含むＤＭＳＯ／
脱イオン蒸留水（１：１）１０ｍｌに加え、反応容器に
移した。この細胞懸濁液のエレクトロ化学ルミネセンス
を測定した。細胞懸濁液の残り１００μｌを反応容器に
加え、エレクトロ化学ルミネセンスを測定した。実施例
２で述べた方法に従い、細胞を含まない溶液のエレクト
ロ化学ルミネセンスを対照として測定した。表ＩＸに示
した結果から、ルテニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗
体を用いたＬｅｇｉｏｎｅｌｌａの異質系エレクトロ化
学ルミネセンスイムノアッセイが成功していることがわ
かる。【表９】表 ＩＸＬｅｇｉｏｎｅｌｌａｍｉｃｄａｄｅｉの異質系エレクトロ 化学ルミネセンス（ＥＣＬ）イムノアッセイ試 料ＥＣＬ（ｍＶ）Legionellamicdadei細胞懸濁液 １６０ DMSO／H₂O （１：１）中１．９×１０⁹細胞Legionellamicdadei細胞懸濁液 ９０ DMSO／H₂O （１：１）中９．３×１０⁸細胞 DMSO：H₂O （１：１） ０【００８５】実施例１０−マウス抗Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌ
ａ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体及びルテニウム標識
ウサギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を用い
たＬｅｇｉｏｎｅｌｌａの均質系エレクトロ化学ルミネ
センスイムノアッセイ─────────────────────────
───────────実施例９で述べたのと同様にして細菌Ｌｅｇｉｏｎｅｌ
ｌａｍｉｃｄａｄｅｉの懸濁液を調製し、Ｌｅｇｉｏ
ｎｅｌｌａに特異的なマウスモノクローナルＩｇＧ抗体
と共にインキュベートした。細胞を遠心し、洗浄し、Ｐ
ＢＳ０．２ｍｌ中に再懸濁した。４，４′−（ジクロロ
メチル）−２，２′−ビピリジル、ビス（２，２′−ビ
ピリジル）ルテニウム（ＩＩ）で標識したウサギ抗マウ
スＩｇＧ抗体、すなわちルテニウム標識ウサギ抗マウス
ＩｇＧ抗体（１．２５×１０^-6Ｍ）の一定量（８０μ
ｌ）を細胞懸濁液に加え、混合物を室温で２時間インキ
ュベートした。対照として細胞懸濁液を含まないルテニ
ウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体の同一希釈液を同様
にインキュベートした。インキュベーション終了後、標
識抗体溶液を反応容器中の０．１Ｍ ＴＢＡＢＦ₄及び
１８ｍＭ過硫酸アンモニウムを含むＤＭＳＯ／脱イオン
蒸留水（１：１）１０ｍｌに加え、ルテニウム標識ウサ
ギ抗マウスＩｇＧ抗体の最終濃度が１×１０^-8Ｍとなる
ようにした。実施例２と同様にしてエレクトロ化学ルミ
ネセンスを測定した。ルテニウム標識ウサギ抗マウスＩ
ｇＧ抗体を加えた細胞懸濁液についても同様に測定を行
った。表Ｘに示した結果から、エレクトロ化学ルミネセ
ンスの放出がルテニウム標識抗マウスＩｇＧ抗体とＬｅ
ｇｉｏｎｅｌｌａに結合したマウスモノクローナル抗体
との間の相互作用によって減少することがわかり、Ｌｅ
ｇｉｏｎｅｌｌａｍｉｃｄａｄｅｉの均質系エレクト
ロ化学ルミネセンスイムノアッセイが成功していること
が示されている。【表１０】表 ＸＬｅｇｉｏｎｅｌｌａｍｉｃｄａｄｅｉの均質系エレクトロ 化学ルミネセンス（ＥＣＬ）イムノアッセイ試 料ＥＣＬ（ｍＶ） １×１０^-8Ｍルテニウム標識 ９７６ 抗マウスＩｇＧ抗体 １×１０^-8Ｍルテニウム標識 ８０３ 抗マウスＩｇＧ抗体＋Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｍｉｃｄａｄｅｉに結合した モノクローナル抗体 ＤＭＳＯ：Ｈ₂Ｏ（１：１） ０【００８６】実施例１１−細菌に結合したルテニウム標
識抗体放出時のエレクトロ化学ルミネセンス増加細菌Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｍｉｃｄａｄｅｉのホルマ
リン化懸濁液を、光学密度１．００（４２５ｎｍで）と
なるようにＰＢＳで希釈し、この懸濁液２ｍｌを円錐形
ミクロ遠心チューブに入れた。細胞を遠心し（１０分、
１０，０００ＲＰＭ）、上清を捨て、Ｌｅｇｉｏｎｅｌ
ｌａｍｉｃｄａｄｅｉに特異的なマウスモノクローナ
ルＩｇＧ抗体（１．４５ｍｇ／ｍｌ）のＰＢＳ中１：１
０希釈液（１ｍｌ）に細胞を再懸濁した。室温で１時間
インキュベートした後、前述のように細胞を遠心し、上
清を捨て、ＰＢＳ中に細胞を再懸濁して再び遠心した。
上清を捨てた後、ルテニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ
抗体（１ｍｌ、７．５Ｒｕ／抗体）のＰＢＳ中１：５０
希釈液に細胞を再懸濁した。室温で１時間インキュベー
トした後、前述のように細胞を遠心し、上清を捨て、Ｐ
ＢＳ中に細胞を再懸濁して前述のように遠心により２回
洗浄した。最後の洗浄の後ＰＢＳまたは１．０Ｍ酢酸−
０．９％ＮａＣｌ（生理食塩水）溶液１００μｌ中に細
胞を再懸濁し、室温で４０分間インキュベートした。遠
心後、細胞上清液１００μｌを０．１Ｍ ＴＢＡＢＦ₄
及び１８ｍＭ過硫酸アンモニウムを含むＤＭＳＯ／脱イ
オン蒸留水（１：１）１０ｍｌと共に反応容器に移し
た。実施例２で述べた方法に従い、酢酸／生理食塩水細
胞上清液とＰＢＳ洗浄細胞からの上清液のエレクトロ化
学ルミネセンスを測定した。エレクトロ化学ルミネセン
スの測定値は表ＸＩに示す通りで、モノクローナル抗体
でコーティングしたＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ細菌を１．０
Ｍ酢酸−生理食塩水で処理することによって（Ｒｅｆ．
２３）ルテニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧをそこから
溶離させると、未結合のルテニウム標識抗体により産生
されるエレクトロ化学ルミネセンスが増加することがわ
かる。以上の結果から、ルテニウム標識抗体はモノクロ
ーナル抗体でコーティングしたＬｅｇｉｏｎｅｌｌａに
結合しておりＰＢＳによる洗浄ではバックグラウンドと
比較してＥＣＬが増加しないことも示される。【表１１】表 ＸＩ ルテニウム標識抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）でコーティングした細胞の上清液のエレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ）溶 液ＥＣＬ（ｍＶ） バックグラウンド対照： １．０Ｍ酢酸−生理食塩水１００μｌ １３４ ＰＢＳ洗浄細胞上清液１００μｌ １２１ １．０Ｍ酢酸−生理食塩水洗浄 ２１４ 細胞上清液１００μｌ 【００８７】実施例１２−尿中プレグナン−ジオール−
３グルクロニド（ＰＤ３Ｇ）の均質系競合イムノアッセ
イ尿試料を既知量のエレクトロ化学ルミネセンス種で標識
したＰＤ３Ｇ及び既知量の抗ＰＤ３Ｇ抗体と、試料中に
存在するＰＤ３ＧとＰＤ３Ｇ−エレクトロ化学種とが抗
体の結合部位に対して競合するような条件下で接触させ
ることによって、プレグナン−ジオール−３−グルクロ
ニド（ＰＤ３Ｇ）を検出し定量し得る。適当な時間後、
得られた試料にエレクトロ化学ルミネセンス種がくり返
し電磁放射線を放出し得るような電気化学的エネルギー
源を直接与えることによって、電磁放射線をくり返し放
出するようになる。放出された放射線を定量し、それに
よって試料中に存在するＰＤ３Ｇの量を測定することが
できる。【００８８】実施例１３−トリス−ルテニウムビピリジ
ル−ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステルを用いた核酸
標識１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ
中の核酸試料（５〜２５μｇ）を熱変性させ、冷却し、
シトシン残基のエチレンジアミンによる亜硫酸水素塩触
媒アミノ基転移を４２℃で３時間行って修飾する。５ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５中で１晩、外液を
３回交換して透析を行った後、試料を限外ろ過によって
１００μｌまで濃縮する。このようにして修飾した核酸
（１〜１０μｇ）を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐ
Ｈ８．５ １００μｌで希釈する。トリス−ルテニウム
ビピリジル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル誘導
体を、当該技術分野における既知の方法によってＮ，
Ｎ′ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の０．２Ｍ保存
用溶液として調製する。このエステル溶液５μｌを０．
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５中の修飾核酸溶
液に加え、室温で１時間インキュベートする。標識した
核酸プローブを１５０ｍＭ塩化ナトリウム−１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で外液を最低３
回交換しながら透析して精製し、使用時まで４℃で保存
する。【００８９】実施例１４−血中ヒトＴ細胞白血病ＩＩＩ
ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）の核酸ハイブリッド形成
アッセイウイルス粒子からＲＮＡが遊離されるよう血液を処理す
ることによって、全血中のＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスを
検出し得る。ＨＴＬＶ−ＩＩＩのＲＮＡを含む試料をＨ
ＴＬＶ−ＩＩＩのＲＮＡに相補的でエレクトロ化学ルミ
ネセンス種で標識してある一本鎖オリゴヌクレオチドプ
ローブと接触させる。適当な時間後、得られた試料にエ
レクトロ化学ルミネセンス種がくり返し電磁放射線を放
出し得るような電気化学的エネルギー源を直接与えるこ
とによって、電磁放射線をくり返し放出されるようにな
る。放出された放射線を定量し、それによって試料中に
存在するＨＴＬＶ−ＩＩＩのＲＮＡ量を測定することが
できる。【００９０】実施例１５−臨床試料中Ｌｅｇｉｏｎｅｌ
ｌａ細菌の均質系核酸ハイブリッド形成アッセイ痰のような臨床試料中のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ細菌を、
細菌からリボソームＲＮＡが遊離されるよう痰を処理す
ることによって検出し得る。このようにして得た試料を
リボソームＲＮＡ中のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａに特異的な
配列と相補的でエレクトロ化学ルミネセンス種で標識し
た一本鎖オリゴヌクレオチドプローブと接触させる。適
当な時間後、得られた試料にエレクトロ化学ルミネセン
ス種がくり返し電磁放射線を放出し得るような電気化学
的エネルギー源を直接与えることによって、電磁放射線
をくり返し放出するようにする。放出された放射線を定
量し、それによって試料中に存在するＬｅｇｉｏｎｅｌ
ｌａ細菌の量を測定することができる。【００９１】実施例１６−鎖置換法によってゲノムＤＮ
Ａ中に挿入したサイトメガロウイルスＤＮＡを検出する
ためのハイブリッド形成アッセイ例えばリンパ球のような組織試料からＤＮＡが遊離さ
れ、制限酵素によってＤＮＡが切断されるよう処理する
ことで、ヒトゲノムＤＮＡ中のサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）ＤＮＡを検出し得る。このようにして得たＣ
ＭＶの二本鎖断片を含む試料を、ＣＭＶのＤＮＡに相補
的でエレクトロ化学ルミネセンス種で標識してありＤＮ
Ａ二本鎖のうちの１方を置換し得る一本鎖オリゴヌクレ
オチドプローブと接触させる。適当な時間後、得られた
試料にエレクトロ化学ルミネセンス種がくり返し電磁放
射線を放出し得るような電気化学的エネルギー源を直接
与えることによって、電磁放射線をくり返し放出するよ
うにする。放出された放射線を定量し、それによって試
料中に存在するサイトメガロウイルスＲＮＡの量を測定
することができる。【００９２】実施例１７−異質法によってヒト膀胱ガン
細胞中のｒａｓ腫瘍遺伝子を検出するためのハイブリッ
ド形成アッセイＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔら（２４）によって以前に報告さ
れている方法を用いて、組織試料からＤＮＡが遊離さ
れ、制限酵素によりＤＮＡが切断され、ＤＮＡが一本鎖
となりニトロセルロース紙に結合するよう処理すること
で、ヒト膀胱ガン細胞中のｒａｓ腫瘍遺伝子を検出し得
る。一本鎖ＤＮＡが結合したろ紙をｒａｓ腫瘍遺伝子に
特異的でエレクトロ化学ルミネセンス種で標識したオリ
ゴヌクレオチドプローブと接触させる。適当な反応時間
後、得られた試料にエレクトロ化学ルミネセンス種がく
り返し電磁放射線を放出し得るような電気化学的エネル
ギー源を直接与えることによって、電磁放射線をくり返
し放出するようにする。放出された放射線を検出し、そ
れによって試料中に存在するｒａｓ腫瘍遺伝子を測定す
ることができる。【００９３】実施例１８−エレクトロ化学ルミネセンス
ポリマーを基質とする酵素アッセイ例えばデンブン、デキストラン、合成高分子ポリマーの
ような高分子酵素基質をエレクトロ化学ルミネセンス種
で標識し得る。標識した基質は多成分系中に存在する酵
素を検出し定量するのに使われる。また標識した基質は
抗体、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ストレプタビ
ジン、ビオチン等と結合した酵素の量を定量するのにも
使われる。標識した基質は適当な酵素を用いて選択的に
より小さい断片へと切断し得る。どのような酵素−基質
の組み合わせでも使用できる。酵素の例としてはグルコ
シダーゼ、リアーゼ、デキストラナーゼ等が挙げられ
る。適当な時間後、得られた試料にエレクトロ化学ルミ
ネセンス種がくり返し電磁放射線を放出し得るような電
気化学的エネルギー源を直接与えることによって、電磁
放射線をくり返し放出するようにする。放出された放射
線を定量し、それによって試料中に存在する酵素の量を
測定することができる。それぞれエレクトロ化学ルミネ
センス種で標識されている切断断片から増幅されたエレ
クトロ化学ルミネセンス信号が得られることが利点であ
る。【００９４】実施例１９−エレクトロ化学ルミネセンス
酵素アッセイによる連鎖球菌属の検出連鎖球菌属を含む試料を、エレクトロ化学ルミネセンス
種で標識した合成ぺプチドを含む反応液と接触させる。
合成ぺプチドはこの細菌のぺプチダーゼに特異的な基質
を用いる。ぺプチダーゼが合成ぺプチドに作用すること
によってエレクトロ化学ルミネセンス種で標識された断
片が産生される。適当な時間後、得られた試料にエレク
トロ化学ルミネセンス種がくり返し電磁放射線を放出し
得るような電気化学的エネルギー源を直接与えることに
よって、電磁放射線をくり返し放出するようにする。放
出された放射線を定量し、それによって試料中に存在す
る連鎖球菌属の量を測定することができる。【００９５】実施例２０−エレクトロ化学ルミネセンス
を利用したＢ型肝炎表面抗原の酵素イムノアッセイＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓａｇ）を含む血液試料を、Ｈ
Ｂｓａｇに特異的でデキストラナーゼで標識した抗体と
適当な時間接触させる。ＨＢｓａｇと結合していない抗
体を除去し、抗原−抗体複合物をエレクトロ化学ルミネ
センス種で標識したデキストランと接触させる。デキス
トラナーゼが標識したポリマーに作用することによって
エレクトロ化学ルミネセンス種で標識された各断片が産
生される。適当な時間後、得られた試料にエレクトロ化
学ルミネセンス種がくり返し電磁放射線を放出し得るよ
うな電気化学的エネルギー源を直接与えることによっ
て、電磁放射線をくり返し放出するようにする。放出さ
れた放射線を定量し、それによって試料中に存在するＢ
型肝炎表面抗原の量を測定することができる。【００９６】実施例２１−エレクトロ化学ルミネセンス
標識ブラジキニンを用いたブラジキニンリセプターの均
質系アッセイブラジキニンリセプターを含む適当な組織試料を調製
し、エレクトロ化学ルミネセンス種で標識したブラジキ
ニンと接触させる。適当な時間後、得られた試料にエレ
クトロ化学ルミネセンス種がくり返し電磁放射線を放出
し得るような電気化学的エネルギー源を直接与えること
によって、電磁放射線をくり返し放出するようにする。
放出された放射線を定量し、それによって試料中に存在
するブラジキニンリセプターの量を測定することができ
る。このアッセイはエストロジエン−エストロジエンリ
セプターのような他のリガンド−リセプター相互作用を
測定するのにも使用できる。さらにこのアッセイは、競
合結合アッセイの形式を用いれば未標識リガンドの量を
測定、定量するのにも使用できる。【００９７】実施例２２−核酸ハイブリッドの検出にお
けるエレクトロ化学ルミネセンス種の利用二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖、二本鎖ＲＮＡの
ような核酸ハイブリッドを含む試料を、特に核酸ハイブ
リッドの間に挿入し得るエレクトロ化学ルミネセンス種
と接触させる。適当な時間後、得られた試料にエレクト
ロ化学ルミネセンス種がくり返し電磁放射線を放出し得
るような電気化学的エネルギー源を直接与えることによ
って、電磁放射線をくり返し放出するようにする。放出
された放射線を定量し、それによって試料中に存在する
核酸ハイブリッドの量を測定することができる。【００９８】実施例２３−エレクトロ化学ルミネセンス
を用いた均質系イムノアッセイによる唾液中の抗体と複
合体を形成するヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩＩ（ＨＴ
ＬＶ−ＩＩＩ）抗原の検出抗体と複合体を形成するＨＴＬＶ−ＩＩＩを含む唾液試
料を、抗原−抗体複合物を分離させるカオトロピック剤
を含む溶液と接触させる。次にこの溶液を、ＨＴＬＶ−
ＩＩＩに特異的でエレクトロ化学ルミネセンス種で標識
した抗体と接触させる。カオトロピック剤を除去し、標
識抗体、未標識抗体を再び抗原と結合させる。適当な時
間後、得られた試料にエレクトロ化学ルミネセンス種が
くり返し電磁放射線を放出し得るような電気化学的エネ
ルギー源を直接与えることによって、電磁放射線をくり
返し放出するようにする。放出された放射線を定量し、
それによって試料中に存在するヒトＴ細胞白血病ウイル
スＩＩＩ（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）抗原の量を測定すること
ができる。以上の方法は肝炎抗原−抗体複合物、サイト
メガロウイルス−抗体複合物、非Ａ非Ｂ肝炎−抗体複合
物のような血清中の他の型の抗原−抗体複合物を含む試
料にも応用できる。【００９９】実施例２４−各種Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓエンテロトキシン類の検出、同定のためのイムノ
アッセイＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの各Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
エンテロトキシンに特異的なモノクローナル抗体とこれ
らのエンテロトキシンに対して交差反応性をもつモノク
ローナル抗体とを精製した。各抗体は、腹水をアガロー
スゲル支持担体に結合させたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓのＡたん白質カラムにかけ、モノクローナル抗体精
製法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．）の一部に基づき結合、溶出、再生緩衝液を流す
ことによって精製した。精製過程では、通常１ｍｌ当た
り５〜１５ｍｇのモノクローナル抗体を含む腹水２ｍｌ
を、２枚のＦ−１３分析紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａ
ｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．）の間にＭｅｔｒｉｃ
ｅｌｌメンブランフィルター（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を入れ底においた１０ｍｌ注射器
（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｉｎｃ．）の中
に入れ、ピストンを挿入し、腹水を収集容器中にろ過す
るという予備ろ過を行った。ろ液に等量の結合緩衝液を
加え、５ｍｌのＡたん白質−アガロースカラムに重層し
た。次にカラムの試薬容器に結合緩衝液を入れ溶出を開
始した。流出画分の２８０ｎｍにおける吸光度
（Ａ₂₈₀）をチェックし、１ｍｌずつの画分を採取し
た。Ａ₂₈₀が安定した基準値に戻ったら、カラムを結合
緩衝液５ベッド容量で洗浄し、次に溶出緩衝液を流して
精製された免疫グロブリンをカラムから溶離させた。免
疫グロブリンを中和するため、溶離画分を１Ｍトリス塩
酸ｐＨ９．０ ０．３ｍｌ中に採取した。Ａ₂₈₀が再び
安定した基準値に戻ったら、カラムを溶出緩衝液５ベッ
ド容量で洗浄し、続いて再生緩衝液１０ベッド容量、結
合緩衝液５ベッド容量で洗浄してカラムを次の精製過程
が行えるよう調整しておいた。精製された免疫グロブリ
ンを含む画分を集め、かくはん式限外ろ過器（Ａｍｉｃ
ｏｎ Ｃｏｒｐ．）を用いて濃縮した。精製された免疫
グロブリンの総たん白質をＬｏｗｒｙ法により測定した
ところ、最終濃度は５ｍｇ／ｍｌ以上であった。精製さ
れた抗体は０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝
液（ＰＢＳ）中で外液を２回交換しながら４℃で４８時
間透析した。【０１００】精製されたモノクローナル抗体の特異的エ
ンテロトキシンに対する免疫学的反応性を測定するた
め、９６穴マイクロタイター板ＥＬＩＳＡ系に分注し
た。抗体の力価として得られた値を、各抗体の以前に認
定されているロットの対照力価値と比較した。十分な力
価をもつ抗体を、判断試薬ホルダーすなわちデイップス
ティックに固定するため、あるいはイムノアッセイにお
いてプローブとして使用する酵素と結合させるための免
疫学的に機能をもつコーティング用抗体として認定し
た。抗体をニトロセルロース膜の表面に固定して膜を付
けた診断試薬ホルダー（デイップスティック）を調製す
るため、まず膜をリン酸緩衝溶液中に室温で１時間浸し
て膜の湿潤性を上げた。スティックを溶液から取り出し
膜を空気乾燥させた。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの
各エンテロトキシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの１つに特異的
な精製モノクローナル抗体または非特異的な対照マウス
免疫グロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）
の溶液を２μｌずつ膜表面上の異なる位置に直接スポッ
トした。使用した各抗体の濃度はニトロセルロースの結
合部位を飽和し得ることが知られている濃度であった：
３Ａ抗体（Ａトキシンに特異的）２５０μｇ／ｍｌ、２
Ｂ抗体（Ｂトキシンに特異的）５０μｇ／ｍｌ、１Ｃ３
抗体（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３トキシンに特異的）３００μｇ
／ｍｌ、３Ｄ抗体（Ｄトキシンに特異的）２００μｇ／
ｍｌ、４Ｅ抗体（Ｅトキシンに特異的）２５０μｇ／ｍ
ｌ、非特異的対照マウス免疫グロブリン２００μｇ／ｍ
ｌである。デイップスティックを室温で空気乾燥させ、
膜上に残っているたん白質結合部位をブロックするため
デイップスティックを０．５％Ｔｗｅｅｎ２０及び３％
ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液中に浸した。
このブロック溶液中で一晩室温にてインキュベートした
後、スティックを空気乾燥させた。【０１０１】精製されたモノクローナル抗体２Ａ（Ａ及
びＥトキシンに特異的）、６Ｂ（Ｂ、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３
トキシンに特異的）、１Ｄ（Ｄトキシンに特異的）を酵
素アルカリ性ホスファターゼに共有結合させ、診断試薬
ホルダーのデイップスティックの膜表面に固定した抗体
に結合しているＡ、Ｂ、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｄ、Ｅトキ
シンの存在を検出するための結合プローブとして使用し
た。各結合体はグルタルアルデヒドを２種類の機能をも
つ架橋試薬として用いる２段階の化学量論的に制御され
た段階によって調製した。この段階では、ＥＩＡ等級ア
ルカリ性ホスファターゼ（２５００Ｕ／ｍｇ、Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．）０．４
７ｍｌを、１３．４μｌの水性グルタルアルデヒド溶液
（２５％、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）を含
む５０ｍＭリン酸カルシウム緩衝溶液ｐＨ７．２の１．
２ｍｌ中に加えた。混合物を室温で９０分間かくはん
し、酵素分子の未結合アミノ基にグルタルアルデヒドを
結合させた。インキュベーション終了後、精製されたモ
ノクローナル抗体１ｍｇ／ｍｌの濃度のものを２ｍｌ加
え、混合物をさらに９０分間かくはんし、氷冷すること
により結合反応を終結させた。結合体を０．１％アジ化
ナトリウムを含むリン酸緩衝溶液中で外液を２回交換し
ながら４℃で４８時間透析した。透析後の溶液にウシ血
清アルブミンを最終濃度３％となるように加え、４℃で
の保存中に安定であるようにした。抗体−酵素結合体の
特異的エンテロトキシンに対する免疫学的反応性を測定
するため、９６穴マイクロタイター板ＥＬＩＳＡ系に分
注した。結合体の力価として得られた値を、各結合体の
以前に認定されているロットの対照力価値と比較した。
十分な力価をもつ結合体を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓエンテロトキシン類のデイップスティックアッセイ
に使用するものとして認定した。【０１０２】ハム、ソーセージ、ヌードル、チーズ等の
ようなＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓによる食品汚染が
最も発生しやすい形の食品を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓエンテロトキシン類のアッセイを実施するため均
質系液体懸濁液とした。典型的な抽出方法としては、食
品２０ｇに水２０ｍｌを加え、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒｌａ
ｂｂｌｅｎｄｅｒ（Ｔｅｋｍａｒ Ｃｏ）を用いて混合
物を３０秒間ホモジナイズした。より粘性の高い食品の
場合には水の容量を２倍にした。ホモジナイズの前また
は後にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシン
を食品に加えた。食品ホモジネートについて上述の診断
試薬ホルダーデイップスティックを直接使用して試験を
行った。エンドトキシンを少量加えた食品試料において
も陽性の結果が得られた。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓエンテロトキシンの検出感度を上げるため、さらに抽
出の段階を加えた。ホモジネートのｐＨを６Ｎ ＨＣｌ
を用いて通常４．５に調整し、２０，０００ｇで２０分
間遠心し、上清のｐＨを５Ｎ ＮａＯＨを用いて７．５
に調整し、再び２０，０００ｇで２０分遠心し、上清を
デイップスティックアッセイに直接使用した。このよう
にして調製した食品抽出物のエンテロトキシン検出感度
は、試験した各食品中の各トキシンにつき１ｎｇ／ｍｌ
抽出物であった。牛乳のような液体食品については診断
試薬ホルダーデイップスティックを液体食品中に浸し固
体食品ホモジネートの場合と同じ方法で直接試験を実施
した。これらの食品を試験する際にも、上述のような追
加抽出段階を加えることにより感度が１ｎｇ／ｍｌにま
で上がるようにした。【０１０３】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの個々のエ
ンテロトキシンに特異的なモノクローナル抗体を固定し
たニトロセルロース膜のついた診断試薬ホルダー（デイ
ップスティック）を、液体食品、食品ホモジネート、ま
たは上述のようにして調製した食品抽出物１ｍｌ、ある
いはＰＢＳ １ｍｌの入った試験管中に浸した。以上の
溶液にはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシ
ン１ｎｇ／ｍｌまたはそれぞれ１ｎｇ／ｍｌの濃度のエ
ンテロトキシン類の混合物を加えておいた。デイップス
ティックをこれらの試料溶液中に室温で１時間、ロータ
リーシェーカーで振とうしながら浸した。その後デイッ
プスティックを試料から取り出し、０．５％Ｔｗｅｅｎ
−２０を含むＰＢＳ中で５分間、ＰＢＳ単独中で５分間
ずつさらに２回振とうした。前述のモノクローナル抗体
−アルカリ性ホスファターゼ結合体の混合物を次のよう
にして調製した：２Ａ結合体（Ａ及びＥトキシンに特異
的）、６Ｂ結合体（Ｂ、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３トキシンに特
異的）、１Ｄ結合体（Ｄトキシンに特異的）の１：１０
００希釈液を同一溶液中（０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０及
び３％ＢＳＡを含むＰＢＳ３０ｍｌ中各結合体３０μ
ｌ）に調製した。この結合体混合物中にデイップスティ
ックを浸し（ステイック１本当たり２ｍｌ）、室温で振
とうしながら３０分間インキュベートした。デイップス
ティックをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で２回、ＰＢＳ中で３
回、１回当たり５分間ずつ振とうしながら洗浄し、膜表
面から未結合のモノクローナル抗体−アルカリ性ホスフ
ァターゼ結合体を除去した。【０１０４】未結合のモノクローナル抗体−酵素結合体
を診断試薬ホルダーデイップスティックから除去した
後、デイップスティックを５−ブロモ−４−クロロイン
ドリルホスフェート（ＢＣＩＰ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．）及びニトロブル−テトラゾリウム
（ＮＢＴ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を
含む溶液中に浸し、結合した結合体の存在を検出した。
ＢＣＩＰ及びＮＢＴ溶液はそれぞれ次のようにして調製
した：３．２ｍｇのＢＣＩＰを０．１Ｍトリス塩酸、
０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂溶液１０ｍｌ
に、８．８ｍｇのＮＢＴを同溶液１０ｍｌに溶解した。
これらの溶液は使用直前に混合した。デイップスティッ
クを基質混合物中に室温で３０分間振とうしながら浸
し、その後水で洗浄して空気乾燥させ、アッセイの結果
が永久に記録されるようにした。本アッセイの全過程を
通じてピペット操作はほとんどあるいは全く必要なく、
処理時間も最小限ですみ、約２時間で終了することがで
きる。酵素結合体の基質であるＢＣＩＰは膜上のトキシ
ンに結合した結合体によって加水分解され、ＮＢＴを還
元してデイップスティック上の膜に結合する不溶性の青
色物質とし得る反応産物を産生する。試料中にＳｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンが存在し膜上に
固定された第１モノクローナル抗体に結合して第２モノ
クローナル抗体−酵素結合体と結合することによって検
出されていれば、ニトロセルロース膜上に青色スポット
が出現し指示される。試料中にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓエンテロトキシンが存在しない場合は、ニトロセ
ルロース膜は白色のままである。対照のマウス免疫グロ
ブリンを固定した位置の膜も各場合共白色のままであっ
た。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの各Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓエンテロトキシンに特異的なモノクローナル抗体を
固定した膜上の明確に区別し得る位置に青色スポットが
出現することによって、特定のエンテロトキシンが同定
される。診断試薬ホルダーデイップスティックを使用す
る本方法により、液体食品、食品ホモジネート、食品抽
出物中の１種類あるいは複数のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓエンテロトキシン類を１ｎｇ／ｍｌの量まで検出
することが可能である。【０１０５】実施例２５−大腸菌型細菌の酵素イムノア
ッセイ（ＥＩＡ）本発明の方法（ＣＡＰ−ＥＩＡ ＭＰＮ）と４４．５℃
においてＥＣブロスを使用するＥＰＡによって承認され
ているＭＰＮ確認試験の方法との便中大腸菌型の検出効
率を比較するための実験を行った。実験は標準５−バイ
アルＭＰＮアッセイに以下の変更を加えて実施した。硫
酸ラウリルトリプトースブロス（ＬＳＴ、Ｄｉｆｃｏ
Ｌａｂｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）の代わりに、４−メ
チルウンベリフェロングルクロニド（ＭＵＧ，Ｓｉｇｍ
ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏ）８０μｇ／ｍｌを含むフェノールレッド乳糖ブロス
（ＰＲＬＢ，Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，
ＭＩ）を推定用培地として使用した。【０１０６】フェノールレッド染色剤によって乳糖の発
酵により産生される酸を検出し得るため、ＰＲＬＢを選
択した。乳糖発酵により得られた気体は、各バイアル中
に挿入した倒立Ｄｕｒｈａｍバイアルに集気した。Ｅ．
ｃｏｌｉの存在を予備的に確認するための選択薬剤とし
てＭＵＧを用いた。便中の主要大腸菌型であるＥ．ｃｏ
ｌｉは、ＭＵＧを切断しＵＶ光線下で見える蛍光性ラジ
カルを遊離させることのできる水中に存在する唯一の細
菌である（４、１０）。ＣＡＰ−ＥＩＡ ＭＰＮアッセ
イ方法によって次の３種類のデータが得られる：１）乳
糖の発酵による酸及び気体の産生（推定大腸菌型アッセ
イ）、２）ＭＵＧの切断による蛍光（Ｅ．ｃｏｌｉまた
は便中大腸菌型の推定確認）、３）ＣＡＰ−酵素イムノ
アッセイ確認（モノクローナル抗体を利用した確認試
験）。次にＭＵＧ及びＣＡＰ−ＥＩＡ反応の結果を、Ｅ
Ｃブロス（Ｄｉｆｃｏ．Ｌａｂｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍ
Ｉ）を用いた４４．５℃の高温下での乳糖発酵に基づく
標準方法（１）による結果と比較した。実験は次のよう
にして行った：ＭＰＮアッセイに必要な３種類の１０倍
希釈系列を作るため、付近の河川から採取した水試料を
以下に示す容量で、ＰＲＬＢ−ＭＵＧ １０ｍｌを含み
バイアルキャップの内側にポリスチレン製穴のついたバ
イアルに接種した。【０１０７】系列Ａ−５バイアル、１．００ｍｌ接種系列Ｂ−５バイアル、０．１０ｍｌ接種系列Ｃ−５バイアル、０．０１ｍｌ接種その後バイアルをすべて３５℃で約１８〜２０時間イン
キュベートした。次の日すべてのバイアルについて酸及
び気体の産生、ＵＶ光線下での蛍光を試験した。酸また
は気体の反応の有無にかかわらず、濁度（増殖）の見ら
れたバイアルはすべて倒立させ、細胞−培地懸濁液がキ
ャップ内側のポリスチレン製穴を満たすようにした。倒
立させたバイアルを３５℃で１時間インキュベートし、
細菌（抗原）をポリスチレン製キャップ穴に付着させ
た。次にキャップ穴に結合した抗原をバイアルから除去
し、抗体を用いる確認試験を続けた。【０１０８】アッセイのＥＩＡ（酵素イムノアッセイ）
の部分を行うため、穴をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、Ｎａ
Ｃｌ ８．５ｇ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄ １．０２ｇ、ＮａＨ
₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ ０．３８６ｇ、蒸留水で１０００ｍ
ｌとする、ｐＨ７．２）中のウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）３％溶液で３５℃、３５分間処理し、
ポリスチレン上の未結合部位をすべてブロックした。Ｂ
ＳＡ溶液を捨てた後すぐにＰＢＳで穴を２回洗浄し、
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に対するモノクローナル抗体を含むハ
イブリドーマ細胞上清を各穴に５０μｌずつ加え、３５
℃で１時間インキュベートして抗体をポリスチレンに結
合した特異的抗原（Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）と相互作用させ
た。抗体上清を捨てた後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０溶液
（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋ
ｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂ
ｕｒｇ，ＮＪ）を用いて穴を３回洗浄し、未結合抗体を
完全に除去した。親和性カラムで精製したアルカリ性ホ
スファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（結合体、Ｋ
ＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）をＰＢＳで
１：１０００に希釈し、各穴に５０μｌずつ加えた。３
５℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎ２０溶液を用いて穴を４回洗浄し未結合の結合体をす
べて除去した。検出に使用するアルカリ性ホスファター
ゼの基質は、パラニトロフェニルリン酸ナトリウムまた
はＳｉｇｍａ−１０４基質（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１０％ジエ
タノール−アミン緩衝溶液（ジエタノールアミン９７ｍ
ｌ、ＮａＮ₃ ０．２ｇ、ＭｇＣｌ₂６Ｈ₂Ｏ １００
ｍｇ、蒸留水８００ｍｌ、ｐＨ９．８）中に最終濃度１
ｍｇ／ｍｌとなるよう溶解したものを用いた。基質を各
穴に１００μｌずつ加え、３５℃で３０分間インキュベ
ートした後各穴中の反応を肉眼で観察した。本実施例に
おける定量の目的のためには、反応した基質溶液をマイ
クロタイター板に移し、４０５ｎｍフィルターをつけた
Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ（Ｆｌｏｗ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｃｌｅａｎｓ，ＶＡ）を用
いて機器測定を行った。【０１０９】ＥＣブロス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｓ，Ｄｅ
ｔｒｏｉｔ，ＭＩ）を使用した便中大腸菌型の従来型確
認試験を行うため、ＰＲＬＢ中での各一晩培養液からの
増殖菌を一白金耳ずつ、１０ｍｌのＥＣブロスを含み倒
立Ｄｕｒｈａｍバイアルを入れた試験管中に無菌的に移
した。試験管を標準方法（１）に従い４４．５℃で２４
〜４８時間インキュベートした後、乳糖発酵の有無を検
出した（Ｄｕｒｈａｍバイアル中に採取された気体によ
って）。バイアル内に少しでも気泡の見られたものは陽
性反応と認めた。各実験のデータの概要は表ＸＩＩ及び
ＸＩＩＩに示す通りである。【０１１０】実験１の結果から、乳糖からの気体産生に
基づく陽性の組み合わせは５５１であり、ＭＰＮ統計表
によると３５大腸菌型／ｍｌである（推定試験）。気体
産生陽性（＋）バイアルのうちＭＵＧアッセイで陽性だ
ったのはわずか４本（Ａ２〜Ａ５）でありＥ．ｃｏｌｉ
の含まれていた可能性が高い（Ｅ．ｃｏｌｉまたは便中
大腸菌型の推定確認）。確認試験データのうち従来型Ｅ
Ｃ試験では５本の試験管（Ａ１〜Ａ５）が便中大腸菌型
陽性であったのに対し、ＣＡＰ−ＥＩＡ法では陽性反応
を示したのは４バイアル（Ａ２〜Ａ５）のみであった。
ＥＩＡの陽性測定値は０．５５から１．０６までの範囲
であり、陰性測定値は０．２０付近であった。ＥＩＡ試
験とＭＵＧ試験のデータでは共に同じバイアルＡ２〜Ａ
５で便中大腸菌型の存在が示されているため、ＥＩＡの
陽性データはＭＵＧの陽性データによって強く裏付けら
れている。従来型ＭＰＮ法（１５、１６、２０）では
（＋）の誤判断及び（−）の誤判断の発生率が高いた
め、バイアルＡ１がＭＵＧ及びＥＩＡでは陰性でＥＣで
は陽性であったという事実も驚くべきことではない。Ｅ
Ｃ培地では高温度でのインキュベーションによって選択
性が変わり便中大腸菌型の回収率に影響することが知ら
れている。また便中大腸菌型（Ｅ．ｃｏｌｉ）のうち約
７％はＥＣにおいて気体を産生せず（陰性の誤判断）、
非便中大腸菌型のうち８％はＥＣブロス中でも増殖し気
体を産生し得る（陽性の誤判断）ことが知られている。
すなわち試験管Ａ１中で身られたＥＣ反応は誤判断の陽
性反応である可能性があり、ＭＵＧ及びＥＩＡのＡ１に
関する結果との不一致の原因となっていると思われる。
同実験中の他のバイアル（Ｂ１〜Ｂ５、Ｃ１〜Ｃ５）に
ついては、すべての試験においてよい相関関係が見られ
た。言い換えれば、ＭＵＧで（−）であったバイアルは
ＥＣでもＥＩＡでも（−）であり、これらのバイアル中
には便中大腸菌型が存在しないことが確認できた。【０１１１】実験２においてはバイアルに接種した水試
料は、推定試験における全試験管で気体産生が陽性であ
ったため、さらに強く汚染されていたといえる。ＭＰＮ
統計表による陽性の組み合わせは５５５であり２４０大
腸菌型／ｍｌ以上が存在することが示された。確認試験
を比較すると、ＭＵＧ、ＥＣ、抗体利用ＥＩＡの間には
よい相関関係が見られた。蛍光を示した（ＭＵＧ＋）バ
イアルはすべてＥＣ及びＥＩＡでも陽性であった。ＥＩ
Ａ反応の測定値はやや弱い陽性０．４６（Ｂ２）からＣ
４で見られた非常に強い反応２．１５までの範囲であっ
た。【０１１２】以上の２つの実験結果から、本発明におけ
る抗体利用ＣＡＰ−ＥＩＡ試験は便中大腸菌型の存在を
確認するＥＰＡの承認したＥＣ試験と同様に有効である
ことが示されている。さらにバイアルＡ１の例で見られ
るように、ＣＡＰ−ＥＩＡ試験は抗体−抗原反応の特異
的性質を利用しているため陽性または陰性の誤判断がよ
り少ない。またＣＡＰ−ＥＩＡ試験は従来型ＭＰＮ試験
に比べていくつかの顕著な利点をもっている。すなわ
ち：１）簡便さ−推定試験及び確認試験共同一のバイア
ルを用いて行うことができ、液を移したり他の培地を使
用する必要がない。２）迅速さ−ＣＡＰ−ＥＩＡ試験は
従来型試験に要する時間の１／３から１／２の時間で完
了できる。３）特異性−抗体はその抗原標的に対して高
度に特異的である。以上の利点に加えてＣＡＰ−ＥＩＡ
のキャップ穴は同一バイアルから４種類の独立したデー
タ（酸、気体、蛍光、ＥＩＡ）が得られるような独自の
デザインとなっており、水及び／または食品試料中の大
腸菌型及び便中大腸菌型を分析するための従来型ＭＰＮ
試験よりもはるかに優れた代替法である。バイアルまた
はポリスチレン挿入物を含む試験管キャップを用いてＥ
ＩＡを実施するという構想は大腸菌型または便中大腸菌
のアッセイに限定されるものではなく、他の細菌の検出
にも同様に応用し得るものである。【０１１３】実施例２６２−〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′
−イル）−プロピル〕−１，３−ジオキソランの合成不活性なアルゴンで気体を置換した６００ｍｌの三頸フ
ラスコに、乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）３０ｍｌ
と乾燥ジイソプロピルアミン７．６５ｍｌ（５４．６ｍ
ｍｏｌ）を、注射器を用いて攪拌しながら添加した。
低位型ビーカー中、ドライアイス−イソプロパノールの
混合物にフラスコを浸して、溶液を−７８℃に冷却し
た。フラスコに２．５Ｍｎ−ブチルリチウム２１．６ｍ
ｌ（５４ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。この溶液を
１５分間攪拌し、ＴＨＦ３００ｍｌに溶解した４，４′
−ジメチル−２，２′−ビピリジン９．５８ｇ（５２ｍ
ｍｏｌ）の溶液を、カニューレを用いて攪拌しながら、
１時かけて滴下して加えた。生じた褐色の混合物をさら
に−７８℃で２時間攪拌し、２−（２−ブロモメチル）
−１，３−ジオキソラン１０ｇ（５５ｍ ｍｏｌ）を、
注射器を用いて添加し、生じた混合物を、−７８℃で５
時間攪拌した。その後反応容器を氷浴中（１０℃）に置
き、３０分経過すると色が変化し始めた（１時間後に
は、濃紫色となり；２時間後には、青色となり；２．５
時間後には、緑色となり；３．２５時間後には、レモン
イエローとなった）。【０１１４】反応混合物に、飽和ＮａＣｌ ３０ｍｌを
添加し、その後、水１０ｍｌとエーテル５０ｍｌを添加
して反応を止めた。水相をエーテル３００ｍｌで２度抽
出し、エーテル層を合併して水１００ｍｌで逆抽出し、
無水硫酸ナトリウムで乾燥した。反応生成物を精製する
ために、活性度ＩＩＩで、中性のアルミナ（メルク）９
０を用いてサンプルを分離した。溶出溶媒としては、石
油エーテル／ジエチルエーテル（２：１）を用い、その
後石油エーテル／ジエチルエーテル（１：１）を用いた
（原料は、石油エーテル／ジエチルエーテル（２：１）
で完全に溶出され、生成物は、その後溶出された）。プ
ロトンＮＭＲ解析により、単離した反応生成物の構造
は、以下に示すものであることを確認した。【化３２】【０１１５】実施例２７４−（ブタン−１−アル）−４′−メチル−２，２′−
ビピリジンの合成及び精製２−〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′
−イル）−プロピル〕−１，３−ジオキソラン２ｇを、
１Ｎ ＨＣｌ ５０ｍｌに溶解し、５０℃で２時間加熱
した。この溶液を冷却し、炭酸水素ナトリウムでｐＨ７
〜８に調節し、クロロホルム１００ｍｌで２度抽出し
た。クロロホルム層を合併して少量の水で洗浄し、硫酸
ナトリウムで乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレータ
ーで蒸発すると黄色のオイル状物質を与えた。この黄色
のオイル状物質を、酢酸エチル／トルエン（１：１）を
溶出溶媒として用いるシリカゲルカラムで精製し、不純
物はメタノールで溶出した。プロトンＮＭＲ解析〔δ１．９６−２．１１（ｍ，２
Ｈ）；２．４３（ｓ，３Ｈ）；２．４６−２．５０
（ｔ，２Ｈ）；２．５３−２．８０（ｍ，２Ｈ）；７．
１２−７．１４（ｍ，２Ｈ）；８．１７−８．１２（ｂ
ｒ．ｓ，２Ｈ）；８．５２−８．５８（ｍ，２Ｈ）；
９．８９（ｓ，１Ｈ）〕により、反応生成物の構造は、
以下の通りであることを確認した。【化３３】【０１１６】実施例２８４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イ
ル）酪酸の合成４−（ブタン−１−アル）−４′−メチル−２，２′−
ビピリジン０．５ｇ（２．０ｍ ｍｏｌ）を無水アセト
ン１０ｍｌに溶解した。この溶液に、微粉にした過マン
ガン酸カリウム２２５ｍｇ（ＫＭｎＯ₄；１．４２ｍ
ｍｏｌ）を少量ずつ攪拌しながら添加した。この反応を
薄層クロマトグラフィー（シリカ；酢酸エチル／トルエ
ン５０：５０）により追跡すると、アルデヒドが徐々に
消失していき、Ｒ_f値の低いビピリジンが生成すること
が指摘された。【０１１７】反応が完了した後に水を添加し、ＭｎＯ₂
を濾過し、Ｎａ₂ＣＯ₃（水溶液）少量ずつを用いて洗
浄した。アセトンを回転式エバポレーターで蒸発し、残
留物をＣＨ₂ Ｃｌ₂で抽出して非酸性ビピリジンを除去
した。０．１ＮのＨＣｌを注意深く添加することにより
水溶液を酸性としてｐＨ４．８とした。このｐＨに達す
ると溶液は部分的に懸濁し、これよりも低いｐＨでは懸
濁液は再び溶解した。この混合物を等量のＣＨ₂ Ｃｌ₂
で５回抽出し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、回転式エバポレ
ーターで蒸発するとオイル状物質を与えるが、この物質
は、減圧下では急速に固化した。この粗製の固体をクロ
ロホルム：石油エーテルから再結晶して、白色の結晶を
得た。融点：１０３．５℃−１０５．５℃；ＩＲ：１７０４ｃ
ｍ^-1。プロトンＮＭＲ解析は、以下の構造と一致した。【化３４】【０１１８】実施例２９ビス（２，２′−ビピリジン）〔４−（ブタン−１−ア
ル）−４′−メチル−２，２′−ビピリジン〕ルテニウ
ム（ＩＩ）２過塩素酸塩：化合物Ｉの合成エチレングリコール５０ｍｌ中のルテニウムビピリジル
ジクロリド２水塩２５０ｍｇ（０．４８ｍ ｍｏｌ）
（Ｓｔｒｅｍ）を急速に加熱して沸騰させ、その後シリ
コン油浴（１３０℃）に浸した。生じた赤紫色〜オレン
ジ色の溶液に、２−〔３−（４−メチル−２，２′−ビ
ピリジン−４′−イル）プロピル〕−１，３−ジオキソ
ラン１５０ｍｇ（０．５３ｍ ｍｏｌ）のエチレングリ
コール１０ｍｌ溶液を添加した。得られたオレンジ色溶
液を１３０℃で３０分間攪拌し、冷却して室温とし、蒸
留水で１：１に希釈した。この溶液に、過塩素酸ナトリ
ウムの濃水溶液を添加すると、非常に微細なオレンジ色
の沈殿を生じた。この混合物を一夜冷蔵し、濾過し、沈
殿を水で洗浄した。この沈殿を湯に溶解し、過塩素酸を
添加して再結晶を行うと、鮮明なオレンジ色をした結晶
を生成した。その後、結晶を濾過し、冷水で洗浄し、乾
燥した。この再結晶操作をくり返すと、総量１５０ｍｇ
の鮮明なオレンジ色の結晶を与えた。ＮＭＲ解析は、以
下の構造を示した。本実施例においては、上で同定した
化合物は、化合物Ｉであると見なされる。【化３５】【０１１９】実施例３０ビス（２，２′−ビピリジン）〔４−（４−メチル−
２，２′−ビピリジン−４′−イル）酪酸〕ルテニウム
（ＩＩ）ジヘキサフルオロフォスフェート：化合物ＩＩ
の合成４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イ
ル）酪酸１３４ｍｇ（０．５２ｍ ｍｏｌ）を、水１５
０ｍｌに溶解した。この溶液をアルゴンで脱気し、ルテ
ニウムビピリジルジクロリド２水塩（Ｓｔｒｅｍ）２５
０ｍｇ（０．４８ｍ ｍｏｌ）を添加した。この混合物
をアルゴン気流下で４時間還流した。水を回転式エバポ
レーターで蒸発し、残留物を最少量の水に再溶解し、Ｓ
Ｐ−２５−セファデックスイオン交換カラムにかけた。
水で不純物を溶出した後に、０．２ＭＮａＣｌ溶液を用
いて化合物を赤色帯として溶出し、ＮＨ₄ＰＦ₆の飽和
水溶液を添加することにより、ヘキサフルオロホスフェ
イトとして単離した。粗生成物を、熱アセトン−ジエチ
ルエーテルから２度再沈殿させた。元素分析：計算値；
Ｃ，４３．８０％；Ｈ，３．３６％；Ｎ，８．７６％。
測定値；Ｃ，４３．８２％；Ｈ，３．５４％；Ｎ，８．
５５％。プロトンＮＭＲの解析は、以下の構造と一致し
た。【化３６】【０１２０】実施例３１Ｎ−〔４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′
−イル）−ブチル〕−フタルイミドの合成不活性なアルゴンの気流下に、乾燥テトラヒドロフラン
（ＴＨＦ）３０ｍｌ及び乾燥ジイソプロピルアミン７．
６５ｍｌ（５４．６ｍｌ）を、６００ｍｌの三頸フラス
コに、注射器を用いて攪拌しながら添加した。低位型ビ
ーカーに入れたドライアイス−イソプロパノール混合物
にフラスコを浸すことにより、この溶液を、−７８℃に
冷却した。２．５Ｍｎ−ブチルリチウム２１．６ｍｌ
（５４ｍｍｏｌ）をゆっくりとフラスコに添加した。得
られた溶液を１５分間攪拌し、４，４′−ジエチル−
２，２′−ビピリジン９．５８ｇ（５２ｍ ｍｏｌ）の
乾燥ＴＨＦ３００ｍｌ溶液を、カニューレを介して、攪
拌しながら１時間かけて滴下した。【０１２１】生じた褐色の混合物をさらに−７８℃で２
時間攪拌し、１，３−ジブロモプロパン１００ｇ（０．
４９５ｍｏｌ）を急速に添加し、得られた混合物を−７
８℃で１時間攪拌した。その後、この混合物を室温で２
時間攪拌した。混合物の色調は、褐色から青、さらに黄
色へと変化した。殆んどの溶媒を回転式エバポレーター
で蒸発し、水２００ｍｌを添加すると二層となった。濃
塩酸を添加してｐＨを０に下げた。有機溶媒層を廃棄し
た。水層を１００ｍｌのエーテルで２度洗浄した。ｐＨ
を１〜２に上げた。赤色のオイル状物質を分離し、ＣＨ
₂ Ｃｌ₂に抽出した。この溶液を無水Ｎａ₂ＣＯ₃で乾
燥した後に、殆んどのＣＨ₂ Ｃｌ₂を回転式エバポレー
ターで蒸発し、サンプルをシリカゲルカラムにかけた。
クロロホルムでサンプルを溶出すると、淡黄色のオイル
状物質を与えた。この物質は、一夜冷却すると結晶化し
た（１２．３７ｇ）。【０１２２】この様にして合成した４−（４−ブロモブ
チル）−４′−メチル−２，２′−ビピリジンの粗結晶
４ｇ（１３．３ｍ ｍｏｌ）を、その後フタルイミドカ
リ２．４６ｇ（１３．３ｍ ｍｏｌ）のジメチルホルム
アミド（ＤＭＦ）６０ｍｌ懸濁液に添加した。その後、
この混合物を約５０℃で２時間攪拌した。この混合物に
ＣＨＣｌ₃９０ｍｌを添加し、さらに水１２５ｍｌを添
加した、ＣＨＣｌ₃層を分離し、水層をクロロホルム５
０ｍｌで２度抽出した。ＣＨＣｌ₃層を合併して水５０
ｍｌで洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、回転式エバ
ポレーターで蒸発すると、淡橙色のオイル状物質を与
え、この物質は一夜の間に固化した。この粗生成物をア
セトン／エタノールから再結晶すると、白色結晶（融
点、１１４．５−１１７．８℃）２．２１ｇ（４４．５
％）を与えた。元素分析：計算値；Ｃ，７４．３８％；
Ｈ，５．７０％；Ｎ，１１．３１％。測定値；Ｃ，７
３．９８％；Ｈ，６．１４％；Ｎ，１１．２８％。Ｉ
Ｒ：フタルイミドカルボニル伸縮１７７１及び１７０４
ｃｍ^-1。プロトンＮＭＲの解析では、アロマティック共
鳴（δ７．５７−７．８５，ｍ，４Ｈ）と通常のビピリ
ジル誘導体のシグナルを示した。これらのデータは、以
下の構造と一致する。【化３７】【０１２３】実施例３２テオフィリン−８−ブチリック−〔４−（４−メチル−
２，２′−ビピリジン−４−イル）−ブチル〕アミド：
化合物ＩＩＩの合成Ｎ−〔４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′
−イル）−ブチル〕−フタルイミド３７０ｍｇ（１ｍ
ｍｏｌ）をエタノール１０ｍｌ中で泥状にし、包水ヒド
ラジン（７２０ｍｇ、１．４ｍ ｍｏｌ）で処理し、攪
拌し、４時間還流すると、この間に固体はすべて溶解し
た。この反応の終末に向って、白色の沈殿が生成し始め
た。冷却した後に、この反応混合物を５０％ＮａＯＨで
塩基性とし、水１００ｍｌに注加した。溶液を得た後に
Ｎａ₂ＣＯ₃を添加し、生成物をオイル状物質として塩
析した。ＣＨ₂ Ｃｌ₂４０ｍｌずつを４回用いてアミン
を抽出した。抽出物をＣａＳＯ₄で乾燥し、濾過し、蒸
発するとアミノビピリジン誘導体を無色のオイル状物質
として与えた（収量＝０．１３５ｇｍ；５６％）。４−
〔４−（１−アミノブチル）〕−４′−メチル−２，
２′−ビピリジン１．３４ｇ（５．６ｍ ｍｏｌ）及び
テオフィリン−８−酪酸（１．１８ｇ；４．４ｍ ｍｏ
ｌ）を室温で乾燥ピリジン１０ｍｌ中に溶解した。この
溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド１．１６ｇ
（５．６ｍ ｍｏｌ）を添加した。室温で一夜攪拌をし
続けた。アルミナの薄層クロマトグラフィー（移動相＝
１５％メタノール／クロロホルム）を行ったところ、Ｒ
_f０．６８の単一生成スポットを示した。沈殿したジシ
クロヘキシル尿素を濾過して除去し、ピリジンを留去す
ると固体を与えるが、これをエーテル中でトリチュレー
トし、濾過した（収量＝２．１３ｇ；９９％）。【０１２４】実施例３３ビス（２，２′−ビピリジン）〔テオフィリン−８−ブ
チリック−４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−
４′−イル）−ブチルアミド〕ルテニウム（ＩＩ）ジク
ロリド：Ｒｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ結合体の合成上述の化合物ＩＩＩ１７５ｍｇ（０．３５７ｍ ｍｏｌ
ｅｓ）及びビス−（２，２′−ビピリジン）ルテニウム
（ＩＩ）ジクロリド２水塩１５４ｍｇ（０．２９６ｍ
ｍｏｌｅｓ）の混合物に、エタノール／Ｈ₂Ｏ（１：
１，ｖ／ｖ）４０ｍｌを添加した。この混合物を暗所で
１５分間アルゴンで脱気し、アルゴン気流下暗所で３時
間還流すると、澄明なチェリーレッドの溶液を与えた。
生じた澄明なチェリーレッドの溶液を室温に冷却し、回
転式エバポレーターを用いて、３７℃以下の暗所で溶液
を維持しつつ溶媒を除去した。得られた残留物を約３ｍ
ｌのメタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０ク
ロマトグラフィーカラム（７５ｃｍ×３ｃｍ）にかけ、
約０．４−０．７ｍｌ／ｍｌの流速で溶出した。鮮明な
赤色のバンド（生成物）には、褐色の非蛍光バンド（不
純物）と、２個の蛍光バンドが接近して続いていた。赤
色の生成物バンドには、褐色の非蛍光バンドからの少量
の不純物が混入していることが判明した。この混入物
は、同様の条件下の２度目のセファデックスＬＨ−２０
カラムにサンプルをかけることにより、生成物から分離
した。回転式エバポレーターで溶媒を蒸発することによ
り赤色の生成物を得た。得られた固体物質を約１ｍｌの
メタノールに溶解し、約７５ｍｌのジエチルエーテル中
で再沈殿させるとオレンジ色の粉末を与え、これを濾取
した。元素分析：計算値；Ｃ，５４．５１％；Ｈ，５．
７２％；Ｎ，１３．９９％；Ｏ，１０．４７％；Ｃｌ，
６．４４％。測定値；Ｃ，５５．０４％；Ｈ，６．３５
％；Ｎ，１３．１８％；Ｏ，１０．６２％；Ｃｌ，６．
６８％。【０１２５】実施例３４−テオフィリンに対して特異的
な抗体を用いたＲｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ結合体によ
り生ずるエレクトロルミネセントシグナルの変調実施例３３で述べたこのＲｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ結
合体を０．３５Ｍフッ化ナトリウムを含むｐＨ６．０の
０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＦ緩衝液）で最終濃度が１
５０ｎＭになるまで希釈した。テオフィリンに対し特異
的なモノクローナル抗体（クローン番号９−４９、腹水
ロット番号ＷＯ３９９、ｃａｔ ｎｏ．０４６）をＫａ
ｌｌｅｓｔａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．
（Ｃｈａｓｋａ，ＭＮ）より入手した。このモノクロー
ナル抗体をＰＢＦ緩衝液を用いて様々な濃度に希釈した
（１ｍｌ中のタンパク質が２１．９μｇから７００μｇ
の範囲）。テオフィリンに反応しないもうひとつのモノ
クローナル抗体（対照ＭＡＢ）をＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手し、ＰＢＦ緩衝液を用いて１
ｍｌ中のタンパク質が２１．９μｇから７００μｇまで
の様々な濃度に希釈した。テオフィリンの標準溶液をＡ
ｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．より入手した
テオフィリン（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ネコ番号２
６−１４０−８、Ｍ．Ｗ．１８０．１７）を用いて調製
した。テオフィリンはＰＢＦ緩衝液中に最終濃度が７５
μＭとなる様に溶かし、アッセイに使用する為にＰＢＦ
緩衝液で６μＭにまで希釈した。エレクトロ化学ルミネ
セントの測定を実施するに先立ち２５０ｍＭのシュウ酸
と５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む溶液
（ＥＣＩ溶液）を反応混合物に添加した。測定は反応溶
液を含む試験管に２つの白金ガーゼ電極を取り付けられ
る様に改良されたＢｅｒｔｈｏｌｄルミノメーターを用
いて行なった。この電極をポテンショスタットに接続
し、エレクトロ化学ルミネセンスの測定は走査速度５０
ｍＶ／ｓｅｃで１．５から２．０ボルトまでこの電極間
の印加電圧を変化させる事により実施した。この測定に
使われたＢｅｒｔｈｏｌｄルミノメーターには高利得の
赤感性光電子倍増管が付いていた。このルミノメーター
の記録計への出力は１０⁵ｃｏｕｎｔｓ／ｖｏｌｔに合
わせた。この測定値はＸ−Ｙ−Ｙ′記録計に記録され、
このピーク高をエレクトロ化学ルミネセンスの測定値と
して用いた。この電極は測定と測定の間に０．１Ｍリン
酸、００．１Ｍクエン酸、０．０２５Ｍシュウ酸、及び
１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むｐＨ４．２の緩衝液
ですすぎ、この溶液中でこの電極に＋２．２から−２．
２ボルトの間の電流を６０秒間パルスとして流し、続い
て＋２．２ボルトを１０秒間流す事によりきれいにす
る。次にこの電極をこの溶液から取り出し、蒸留水中で
すすぎ、水気を拭きとって乾かす。この実験は表ＸＩＶ
に概略を示したとおりに実施した。【０１２６】対照のモノクローナル抗体の溶液、テオフ
ィリンに対する抗体の溶液、又はＰＢＦ緩衝液を一組の
試験管に注いだ（ステップ１）。この試験管にテオフィ
リン溶液又はＰＢＦ緩衝液を加えた（ステップ２）。こ
の溶液を試験管を簡単に振る事で混合し、室温で２５分
間反応させた。その後Ｒｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ結合
体の溶液をこの試験管に加えた（ステップ３）。この試
験管を振り、室温で１５分間放置した。最後にこのＥＣ
Ｌ溶液１００μｌを各々の試験に添加し、上述の様にエ
レクトロ化学ルミネセンスを測定した。この結果は表Ｘ
Ｖに示した。【表１２】【表１３】表 ＸＶ Ｒｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ共役物のエレクトロ化学ルミネ センスに対する抗体とテオフィリンの影響 抗テオフィリン 抗体タンパク質 対照ＭＡＢ＋ 抗テオフィリン MAB ＋テオフィ 濃度 Ｒｕ（ＩＩ）− MAB + Ru(II)− リンRu(II)−化（μｇ／試験管） 化合物ＩＩＩ 化合物ＩＩＩ 合物ＩＩＩ ルミネッセンスの測定値 ２．１９ ５５，０００ ４０，０００ ４３，０００ ５５，０００ ４１，０００ ５７，０００ ４．３８ ５７，０００ ２２，５００ ３７，０００ ５７，０００ ２５，０００ ３６，０００ ８．７５ ５３，０００ ２０，０００ ３３，５００ ５０，０００ ２２，０００ ３０，５００ ３５．０ ４３，０００ １３，５００ １７，５００ ４１，０００ １４，０００ １６，０００ ７０．０ ４２，０００ １１，０００ １１，０００ ３７，５００ １２，０００ １２，５００【０１２７】重複試料のエレクトロ化学ルミネセンスを
上述した様に測定した。上の実験で用いたＲｕ（ＩＩ）
−化合物ＩＩＩ結合体のエレクトロ化学ルミネセンスは
抗体を添加しない緩衝液中で測定した際５７，２００で
あった。緩衝混合液に対するバックグラウンドは５７５
０であった。このデータはルテニウム化合物が付着した
テオフィリン類似体、即ちＲｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ
と接触した際、特異的にテオフィリンを認識するモノク
ローナル抗体はそのエレクトロ化学ルミネセンスを減じ
るであろう事を示している。エレクトロ化学ルミネセン
スの減少量はＲｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ結合体の濃度
を一定に保った場合、抗体の濃度に比例する。テオフィ
リンと反応しない抗体を使用する場合は抗体が高い濃度
でもエレクトロ化学ルミネセンスはわずかに減少するだ
けである。このデータはまた、テオフィリンを抗テオフ
ィリン抗体に接触させた後、Ｒｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩ
Ｉ共役物を混合物に加えた場合、エレクトロ化学ルミネ
センスの量はより大きくなる事も示している。この事は
テオフィリンは抗体の結合に関してＲｕ（ＩＩ）−化合
物ＩＩＩ共役物と競合しその結果としてエレクトロ化学
ルミネセンスを生じるＲｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ結合
体が大量に得られる。【０１２８】実施例３５−ホモジニアス エレクトロ化
学ルミネセント イムノアッセイに基づいた血清中のテ
オフィリンのアッセイ実施例３４で述べた結果に基づいてテオフィリンに対す
るホモジニアスイムノアッセイ法を競合結合の型につい
ての実施例３３で述べたテオフィリンとこのＲｕ（Ｉ
Ｉ）−化合物ＩＩＩ結合体に対する抗体を用いて開発し
た。材料は０．１Ｍフッ化ナトリウムを含むｐＨ６．０
の０．１Ｍリン酸緩衝液を除き実施例３４で述べた物と
同じであった。このアッセイに対してはテオフィリンに
対するモノクローナル抗体の濃度を特別に選択した。こ
の抗体濃度は５５μｇ／ｍｌであった。このＲｕ（Ｉ
Ｉ）−化合物ＩＩＩ結合体の濃度は１７５ｎＭに調整し
た。テオフィリンをヒト血清に最終濃度が１ｍｌの血清
当り２．５、５、１０、２０、及び４０マイクログラム
となる様に加えた。アッセイは１０μｌの血清を２９０
μｌの抗テオフィリンモノクローナル抗体に加え、室温
で２５分間放置する事により行なった。次に１００μｌ
のＲｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ共役物を各々の試験管に
最終濃度が３５ｎＭになる様に加え、この溶液を室温で
１５分間放置した。実施例３４で述べたＥＣＬ溶液を１
００μｌずつ各々の試験管に注ぎ、この溶液のエレクト
ロ化学ルミネセンス特性を１．５〜２．５ボルトの範囲
を５０ｍＶ／ｓｅｃで走査して先に述べた方法で測定し
た。このデータを第２図に示す。このデータは血清試料
中のテオフィリン濃度とこの反応混合物より生ずるエレ
クトロ化学ルミネセンスの量との間に相関がある事を示
している。この結果はテオフィリンのアッセイ開発の可
能性を示している。これらの結果に基づけば、この技術
に習熟した人は生物基質中の興味ある目的の分析物質を
検知したり定量する為にホモジニアス エレクトロ化学
ルミネセンス イムノアッセイを開発する事ができるで
あろう。【０１２９】実施例３６−ホモジニアス エレクトロ化
学ルミネセント イムノアッセイに基づく溶血した血
清、脂血症の血清、黄疸の血清、及び正常血清試料中の
テオフィリンのアッセイと蛍光偏光法との比較様々なタイプの血清試料中のテオフィリン濃度をホモジ
ニアス エレクトロ化学ルミネセント イムノアッセイ
を用いて測定した。このアッセイの型は実施例３３で述
べたテオフィリンに特異的なモノクローナル抗体とＲｕ
（ＩＩ）−化合物ＩＩ結合体を用いた競合結合アッセイ
である。エレクトロ化学ルミネセンスの為の試薬と方法
は先の実施例で述べられている。様々な血清試料中のテ
オフィリン濃度の測定に使われている蛍光偏光法をＡｂ
ｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｖｉｅｓ（Ｎｏｒｔｈ Ｃ
ｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）より購入した自動ＴＤＸ器機を用
いて実施した。このアッセイには溶血した血清、脂血症
の血清、黄疸の血清及び正常の血清を用い、この異常血
清に対するデータは以下の表ＸＶＩに示す。【表１４】表 ＸＶＩ ホモジニアス テオフィリン アッセイ潜在的に問題のある血清の特徴血清 ファクターの濃度 正常値の範囲 溶血 １２．４ｍｇ／ｄｌヘモグロビン ０−３．２ｍｇ／ｄｌ 脂肪血症 ４０５ｍｇ／ｄｌトリグリセリド １０−１９０ｍｇ／ｄｌ １９６ｍｇ／ｄｌコレステロール １２０−２００ｍｇ／ｄｌ 黄疸 １０ｍｇ／ｄｌビリルビン ０−１．５ｍｇ／ｄｌ様々な量のテオフィリンを最終濃度が２．５μｇテオフ
ィリン／ｍｌから４０μｇテオフィリン／ｍｌの間にな
る様にこの血清試料に加えた。このホモジニアス エレ
クトロ化学ルミネセント イムノアッセイの結果を第３
図に示す。各々の血清試料はテオフィリン濃度に関して
蛍光偏光法でも分析した。このホモジニアス エレクト
ロ化学ルミネセント イムノアッセイと蛍光偏光法とで
測定したテオフィリンの濃度を比較した。このデータは
散布図としてプロットし、第４Ａ〜Ｄ図に示す。このデ
ータの点を線型回帰により分析し、相関係数を計算し
た。この分析によりこの２つのアッセイの間には特に強
い相関がある事が示されている。この相関係数（ｒ）は
０．９８から１．００であった。正常血清、溶血した血
清、脂血症の血清試料に対する曲線の勾配は０．８から
１．２の間であり、この事はこれらの血清試料からのテ
オフィリンの回収率が非常に高い事を示している。【０１３０】テオフィリンを含め黄疸の血清試料から生
じるエレクトロ化学ルミネセンスは他の血清試料に対す
るものより高いが、これは各々のテオフィリン濃度に於
いて比例して高くなった。この事は第４Ｄ中に見る事が
出来る。この相関係数はエレクトロ化学ルミネセンスと
蛍光偏光を比較したデータ点に対して１．００である；
しかし勾配は２．１４である。この事は黄疸の血清試料
中のテオフィリンの高い回収率を示している。これらの
結果に基づいて、黄疸の試料中のテオフィリン濃度を既
知の量のＲｕ（ＩＩ）−化合物結合体を黄疸の血清の一
部に加える事により試料に対する標準曲線を描き、これ
を用いて測定することができるであろう。これらのデー
タはホモジニアス エレクトロ化学ルミネセント イム
ノアッセイは、異常な量のヘモグロビン、脂肪、及びビ
リルビンを含む血清試料中のテオフィリン濃度を測定す
る為に使用できる事を示している。ホモジニアス エレ
クトロ化学ルミネセント イムノアッセイはＥＣＬ検出
に於ける多能性、即ち生物分子のより高い濃度でより敏
感な検出が出来るという理由から蛍光偏光法よりも優れ
ている。【０１３１】さらにホモジニアス エレクトロ化学ルミ
ネセント イムノアッセイは入射光源が不必要で、電気
的励起のみが効率的な光の発生に必要であるという理由
からも蛍光偏光法よりも有利である。従ってエレクトロ
化学ルミネセント イムノアッセイには精巧な光学は必
要でない。この測定原理は電気化学的刺激によって誘発
される純粋に特異的な光子の放出であるので、このシス
テムの感度は本質的に蛍光偏光法より十分に高く、より
幅広いダイナミックレンジが達成できるであろう。ま
た、非常に多様な目的の分析物質の測定が蛍光偏光法よ
りもホモジニアスエレクトロ化学ルミネセント イムノ
アッセイで可能である。これは生物分子の認識作用、即
ち抗体−抗原相互作用により電気的に刺激された化学ル
ミネセンスが敏感な変調を起こす事に因る。これらの結
果に基づけば、この技術に習熟した者には異常な血清試
料中の興味あるその他の目的の分析物質を検知する為の
ホモジニアス エレクトロ化学ルミネセント イムノア
ッセイを開発できる事がわかるであろう。【０１３２】実施例３７−ホモジニアス エレクトロ化
学ルミネセンス イムノアッセイに基づく血清中のテオ
フィリンのアッセイ及び高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）法との比較様々な量のテオフィリンを最終濃度が２．５μｇテオフ
ィリン／ｍｌから４０μｇテオフィリン／ｍｌになる様
にヒトの血清試料に加えた。各々の試料を次に２つの部
分に分け、この試料のテオフィリン濃度をホモジニアス
エレクトロ化学ルミネセンス イムノアッセイで測定
し、同じ血清試料に対してＨＰＬＣ法で得られた結果と
比較した。ホモジニアス エレクトロ化学ルミネセンス
イムノアッセイに於けるアッセイの型はテオフィリン
に特異的なモノクローナル抗体とＲｕ（ＩＩ）−化合物
ＩＩＩ結合体を用いた競合結合アッセイである。このア
ッセイの為の試薬と方法は先の実施例で述べられてい
る。様々な血清試料中のテオフィリン濃度の測定に使わ
れたＨＰＬＣ法は以下に述べる。【０１３３】テオフィリン（１，３−ジメチルキサンチ
ン）をアセトニトリルで血清タンパク質を沈殿させる事
により血清タンパク質から分離する。テオフィリンを含
む上澄み液をＷａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｍ
ｉｃｒｏ ＢｏｎｄａｐａｋＣ１８カラム（３．９ｍｍ
×３０ｃｍ）を装備したＨＰＬＣシステムに流した。こ
のクロマトグラムは１０分以内に完全に分かれた。以下
の試薬を使用した：酢酸ナトリウム（試薬用）、脱イオ
ン水（Ｍｉｌｌｉｐｏｖｅ Ｍｉｌｌｉ Ｑシステムに
より精製）、アセトニトリル（ＨＰＬＣ用）、テオフィ
リン標準試薬、（Ｓｉｇｍａ）。血清タンパク質を沈殿
させる為に用いた溶媒は１４％（ｖ／ｖ）のアセトニト
リルを含むｐＨ４．０の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
とした。このＨＰＬＣの移動相の緩衝液は７％（ｖ／
ｖ）のアセトニトリルを含むｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸
ナトリウム緩衝液とした。流速は１．５ｍｌ／ｍｉｎと
し、流出液は２７０ｎｍにセットされているＵＶ分光光
度計でモニターした。このＵＶ吸収検出器の感度は０．
０２吸光度単位フルスケール（ＡＵＦＳ）にセットし
た。気温は２２℃から２４℃の間であった。【０１３４】血清中のテオフィリン濃度測定に関するホ
モジニアス エレクトロ化学ルミネセント イムノアッ
セイとＨＰＬＣアッセイの結果を図５に示す。データは
散布図としてプロットされデータの点は線型回帰により
分析された。その相関係数を計算した。相関係数（ｒ）
は０．９８であり、これは２つのアッセイの間に強い相
関がある事を示している。曲線の勾配は１．１９７であ
り、ＨＰＬＣに基づいた標準的方法に比べてホモジニア
ス エレクトロ化学ルミネセント イムノアッセイの方
がこの血清試料からのテオフィリンの回収率が優れてい
る事を表わしている。このホモジニアスエレクトロ化学
ルミネセント アッセイはＨＰＬＣ法よりもスピード、
感度、及び多数の試料を簡単に扱えるという点でより有
利である。これらの結果に基づけば、この技術に習熟し
た者にはＨＰＬＣやその他同類の方法で検出できる分析
対象物をホモジニアス エレクトロ化学ルミネセント
イムノアッセイで検出する方法を開発できる事がわかる
であろう。【０１３５】実施例３８−テオフィリン−ウシ血清アル
ブミン結合体の製法テオフィリン−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）共役物を
テオフィリン−３−メチル−酪酸、テオフィリン−８−
酪酸、及びテオフィリン−７−酢酸から以下の方法によ
り調製した。５０ｍｇのＢＳＡを１ｍｌの０．１５Ｍ
ＮａＨＣＯ₃、ｐＨ９．０に溶解した。１６ｍｇのエチ
ル３′，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩
酸塩（ＥＤＣＩ）と１１ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸
塩（ＮＨＳ）、及びジメチルスルホキシドに溶かした１
７．８ｍｇのテオフィリン−７−酢酸、又は２０ｍｇの
テオフィリン−８−酪酸、又は２０．９ｍｇのテオフィ
リン−３−メチル−酪酸を別々に加えこの溶液を４５℃
で１〜２時間加熱した。この溶液をＢＳＡ溶液に一滴ず
つ加え１時間反応させた。ＢＳＡのテオフィリン結合体
はＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５のカラムを用いたゲル濾
過クロマトグラフィーでｐＨ７．４の０．１５Ｍ ＰＢ
Ｓ／０．１％アジ化物を移動相とし、流速３０ｍｌ／ｈ
ｒで分離精製した。【０１３６】実施例３９−テオフィリン−ＢＳＡ Ｂｉ
ｏｍａｇ粒子の製法４ｍｌのＢｉｏｍａｇ−アミン粒子（Ａｄｖａｎｃｅｄ
Ｍａｇｎｅｔｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，
ＭＡ）を０．００８％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ
−４０）を含むｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（Ｓｉｇ
ｍａ）（ＰＢＳ）２０ｍｌで２〜３回ｓｅｐａｒａｔｅ
Ｔ−ｆｌａｓｋ中で洗った。このＢｉｏｍａｇ ｗｅ
ｔ ｃａｋｅに５％のグルタルアルデヒドを含むＰＢＳ
を１０ｍｌ加えロータリーミキサーで３時間活性化させ
た。活性化されたＢｉｏｍａｇ粒子を上述の様に合計４
回洗い、Ｔ−ｆｌａｓｋに移し換えた。１０ｍｌのＰＢ
Ｓ／ＮＰ−４０中の実施例３８に述べた方法で調製され
たテオフィリン−ＢＳＡを６．８ｍｇこの活性化された
Ｂｉｏｍａｇ ｗｅｔ ｃａｋｅに加えた。４℃で一晩
反応させた。この活性化されたＢｉｏｍａｇ ｗｅｔ
ｃａｋｅを２０ｍｌの１％ＢＳＡ／０．１５Ｍ ＰＢＳ
／０．１％アジ化物（ｐＨ７．４）で３回洗った。この
際最初の洗浄はロータリーミキサーを用いて約３０分間
続けた。【０１３７】実施例４０−化合物Ｉ−抗テオフィリン結
合体の製法１．１ｍｌのマウス抗−テオフィリン モノクローナル
抗体（Ｋａｌｌｅｓｔａｄ、ロット番号ＷＯ３９９；
４．６ｍｇ／ｍｌ）を１０，０００ｇで８分間遠心し
た。緩衝液は０．２Ｍ ＮａＨＣＯ₃、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、でアジ化物を含んだｐＨ９．０のものにＡｍｉ
ｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔ
ｏｒを用いて取り換えられた（３０００ｇで遠心され
た）。この抗体溶液は２ｍｌに希釈され、３．２ｍｇの
化合物Ｉが加えられた。室温で２時間攪拌しながら反応
させ、１ｍｇ／ｍｌの濃度のＮａＢＨ水溶液を７９μｌ
加え、この溶液を３０分間攪拌した。こうして得られた
溶液を前もってトリス緩衝液で平衡化されたＳｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｇ−２５のカラム（１．０ｃｍ×１８．０ｃ
ｍ）にかけ、流速１５ｍｌ／ｈｒで流出させた。化合物
Ｉ−抗テオフィリン結合体を含むフラクションを集め、
透析チューブに移し、０．１５Ｍリン酸塩／０．１５Ｍ
ＮａＦ（ＰＢＳ）、ｐＨ６．９（４リットル）に対し
透析した。【０１３８】実施例４１−不均質エレクトロ化学ルミネ
セント アッセイに基づいた血清中のテオフィリンのア
ッセイ免疫学的測定法のひとつの型を用いて、テオフィリンに
対する不均質アッセイを化合物Ｉで標識された抗テオフ
ィリン抗体とＢｉｏｍａｇ磁気粒子上に固定されたテオ
フィリンＢＳＡを用いて開発した。この抗体濃度は２０
μｇ／ｍｌであった。磁気粒子の濃度は１％固体（ｗｔ
／ｖｏｌ）であった。テオフィリンは１ｍｌの血清に対
し最終濃度が１０及び４０μｇとなる様に加えた。この
テオフィリン血清標準物は１％のＢＳＡを含むＰＢＦ緩
衝液（リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．１Ｍ
フッ化ナトリウム）で１０００倍に希釈した。アッセイ
は、７５μｌの希釈された血清標準物を７５μｌの抗体
が結合した化合物Ｉに加え、この溶液を室温で２０分間
反応させる事により実施した。次に５０μｌのテオフィ
リン−ＢＳＡ−Ｂｉｏｍａｇ粒子を加え、この懸濁液を
５分間放置した。この粒子を磁気的に分離し、上澄み液
の１００μｌについて実施例４８で述べる方法に従って
エレクトロ化学ルミネセンスを測定した。【表１５】これらの結果に基づけば、この技術に習熟した者は生物
基質中のその他の興味ある分析対象についても不均質エ
レクトロ化学ルミネセンスイムノアッセイを開発する事
が出来るであろう。【０１３９】実施例４２−化合物ＩＩ−ジゴキシゲニン
結合体の製法攪拌バーが付いた５０ｍｌの丸底フラスコに１００．２
ｍｇ（０．１０４ｍｍｏｌ）の化合物ＩＩ、４１ｍｇ
（０．１０５ｍ ｍｏｌ）のジゴキシゲニン（Ｓｉｇｍ
ａ）及び２８ｍｇ（０．１３６ｍ ｍｏｌ）の１，３−
ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を加えた。
この混合物に８−１０ｍｌの無水ピリジン（Ａｌｄｒｉ
ｃｈ Ｓｕｒｅ−Ｓｅａｌ）を１８ゲージの針を付けた
シリンジで加えた。このフラスコに栓をし、テフロンの
テープで封をして溶液が赤くなるまで穏やかに攪拌し
た。このフラスコはフードの中で攪拌しながら暗い状態
で２４時間放置し、この時６ｍｇ（０．０１５ｍ ｍｏ
ｌ）のジゴキシゲニンと２０ｍｇ（０．０９７ｍ ｍｏ
ｌ）のＤＣＣを加えた。この溶液には栓をし、暗い状態
で室温に於いて攪拌した。翌日、ジシクロヘキシル尿素
の沈殿は観察されなかった。さらに１８ｍｇ（０．０５
ｍ ｍｏｌ）のジゴキシゲニンと１０３ｍｇ（０．５０
ｍ ｍｏｌ）のＤＣＣを加えた。フラスコに再び封をし
暗い状態でさらに攪拌を続けた。７２時間後さらに１０
３ｍｇのＤＣＣを加え暗い状態で３時間攪拌した。【０１４０】この溶液に５〜１０滴のＨ₂Ｏを加え、次
にこれをロータリーエバポレーターに移して赤い固体を
生じるまで暗い状態で乾燥させた。得られた赤い固体は
アルミニウムホイルで覆い、デシケーター中でＣａＳＯ
₄を用いて一晩乾燥させた。この乾燥させた固体を次に
３〜５ｍｌのメタノールに溶かし、この混合物に約０．
２５ｇの無水で固体状態のＬｉＣｌＯ₄を加えた。Ｌｉ
ＣｌＯ₄が溶けたら、この溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｌ
Ｈ−２０のカラム（７５ｃｍ×１９ｍｍ）にかけ、流速
７〜１０ｓｅｃ／ｄｒｏｐの範囲でメタノールにより流
出させた。クロマトグラフィーが展開した際３つのバン
ドが確認された；第１の淡橙色（赤色ルミネセント）の
バンド（フラクション１）；第２番目の暗赤色のバンド
でこれはこの反応の主生成物を示している（フラクショ
ン２）；及び第３番目の最初の２つのバンドの後ろに続
いたバンドで（おそらく未反応の原材料から成り）これ
は捨てた。【０１４１】バンド１と２はこのカラムでかろうじて分
離されたものなのでバンド２の中の橙色生成物をフラク
ション２（１５ｍｌ）のメタノール溶液を約３００ｍｌ
の無水ジエチルエーテルに滴下し攪拌した。得られた沈
殿は１５ｍｌメデウムフリット上で吸引濾過により集
め、１５ｍｌのジエチルエーテルで５回洗った。残こっ
たエーテルを真空デシケーター中でＣａＳＯ₄を用いて
一晩この化合物を乾燥させる事により取り除いた。この
固体物質は以下の様に同定された：【化３８】【０１４２】実施例４３−化合物ＩＩ−ジゴキシゲニン
結合体のエレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ）：抗ジ
ゴキシン抗体によるＥＣＬシグナルの変調ジゴキシンに対するモノクロナル抗体をイムノアッセイ
緩衝液で以下の濃度に希釈した：１，１０，５０，２００，４００μｇ／ｍｌ化合物ＩＩ−ジゴキシゲニン結合体（５０マイクロモ
ル）をイムノアッセイ緩衝液（０．１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ６．０、０．１Ｍフッ化ナトリウムを含む）で１５
０ｎＭに希釈した。ポリプロプレン製の試験管（１２ｍ
ｍ×７５ｍｍ）に入った２００μｌのイムノアッセイ緩
衝液に様々な濃度のジゴキシン抗体を１００μｌと化合
物ＩＩ−ジゴキシゲニン結合体を１００μｌ（１５０ｎ
Ｍ）加えた。試験管をボルテックス上で攪拌し、室温で
１５分間反応させた。反応の後、１００μｌのＥＣＬ溶
液（先述）を加えエレクトロ化学ルミネセンスを測定し
た。結果：【表１６】３０ｎＭ化合物ＩＩ−ジゴキシゲニン結合体に対するＥ
ＣＬカウントの総計＝１１３６６６（ピーク高）【０１４３】試験管１本当り４０μｇの濃度でシグナル
の非特異的抗体による変調は６７，０００カウントであ
りジゴキシンに対する特異的抗体が存在する時は３６，
０００であった。第６図からわかる様に、化合物ＩＩ−
ジゴキシゲニン結合体の固定された濃度に反応する際、
抗ジゴキシン抗体の濃度が上昇するとエレクトロ化学ル
ミネセントシグナルの変調が上昇する事が示された。こ
の特徴は血清や血漿中のジゴキシゲニンの測定に対して
ホモジニアス エレクトロ化学ルミネセンスを基礎とし
たアッセイを開発に当り有益となるであろう。【０１４４】実施例４４−ホモジニアス ジゴキシン
アッセイ実施例４３で述べた結果に基づいてジゴキシンに対する
ホモジニアス エレクトロ化学ルミネセント イムノア
ッセイをジゴキシンに対する抗体と本化合物ＩＩ−ジゴ
キシゲニン結合体を用い競合結合型のアッセイ法を使っ
て開発する事ができるであろう。使用されるであろう試
薬は実施例４３に記載されている。このアッセイに対し
てはジゴキシンに対するモノクローナル抗体の特異的な
濃度が選択されるであろう。この抗体濃度は１ｍｌ当り
７５〜１００μｇである。本化合物ＩＩ−ジゴキシゲニ
ン結合体の濃度は５〜１５ｎＭ（最終濃度）となるであ
ろう。ジゴキシン標準物がヒト血清に最終濃度が血清１
ｍｌ当りジゴキシン０．１、０．５、１、２、４、８、
及び１６ｎｇとなる様に加えられるであろう。このアッ
セイは１０〜３０μｌの血清を３００μｌの抗−ジゴキ
シンモノクローナル抗体に加え、室温で３０分間この溶
液を放置する事により実施されるであろう。次に１００
μｌの本化合物ＩＩ−ジゴキシゲニン結合体を最終濃度
が５〜１５ｎＭの範囲になる様に各々の試験管に加え、
この溶液を室温で２０分間放置する。先に述べたＥＣＬ
溶液を１００μｌ各々の試験に入れ先に述べた様にして
ＥＣＬが測定されるであろう。【０１４５】実施例４５−ウアバイン−ウシ血清アルブ
ミン結合体の製法５０ｍｇのウアバイン８水和物（Ａｌｄｒｉｃｈ）を５
ｍｌの脱イオン水に溶かした。８１ｍｇのＮａＩＯ₄を
この溶かしたウアバインに加え、この混合物を室温で２
時間反応させた。この反応はｐＨが５と６の間になるま
で脱イオン水で平衡化したＤｏｗｅｘ ＩＸ−８イオン
交換樹脂のカラム（５ｍｌ）にこの混合物を通す事によ
り止めた。廃液入れに入ってくる流出液が混合のサイン
を示したら酸化されて得られたフラクションを集めた。
１００ｍｇの凍結乾燥されたウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）の結晶（Ｓｉｇｍａ）を０．０５％のアジ化物を含
むｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液５ｍｌに
溶かした。この酸化されて得られた溶液にこのＢＳＡ溶
液を一滴ずつ攪拌しながら加えた。こうして得られた溶
液は室温で１時間反応させた後ＮａＣＮＢＨ₄（Ａｌｄ
ｒｉｃｈ）を３０ｍｇ加えた。次にこの溶液を室温で一
晩攪拌した。この溶液をポリエチレングリコール−８０
００で濃縮し（１１ｍｌから４ｍｌまで）、遊離状態の
ウアバインと過剰の水素化ホウ素をこの溶液からＳｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｇ−２５（カラム＝０．６ｃｍ×３７ｃ
ｍ；溶離剤＝０．１Ｍ Ｋ₂ＰＯ₄／０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、ｐＨ７．５、０．０５％ＮａＮ₃）を用いて取り
除いた。フラクション１１−１７を集め、そのタンパク
質濃度を２８０ｎｍに於ける吸収を（希釈後に）測定す
る事により決定した。【０１４６】実施例４６−ウアバイン−ＢＳＡ−セファ
ロースの製法セファロース４Ｂで活性化された臭化ジシアンを２ｇ
ｓｉｎｔｅｒｅｄ ｄｉｓｋ ｆｕｎｎｅｌ上で４００
ｍｌの１ｍＭ ＨＣｌを１回に５０ｍｌずつ使って洗っ
た。この樹脂を次に２０ｍｌの０．１Ｍ ＮａＨＣ
Ｏ₃、０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０（カップ
リングバッファー）で洗った。この樹脂をポリプロプレ
ン製の容器に移し換えた後、１５ｍｌのカップリングバ
ッファーに溶かした３０ｍｇのウアバイン−ＢＳＡを加
えた。この活性化された樹脂をロータリー混合しながら
２時間このウアバイン−ＢＳＡと共に反応させた。残こ
った活性化部位は室温で２時間７ｍｌの０．５Ｍエタノ
ールアミン（ｐＨ８．０）と反応させた。ｓｉｎｔｅｒ
ｅｄ ｄｉｓｋ ｆｕｎｎｅｌを用いてこの樹脂を以下
の溶液それぞれ１００ｍｌずつで洗った：カップリング
バッファー；０．１５ＭＰＢＳ；１ｍＭ ＨＣｌ；カッ
プリングバッファー；０．２％ＮＰ−４０を含むＰＢ
Ｓ；及びＰＢＳ。この樹脂を再び１１ｍｌに懸濁し、十
分な量のこの懸濁液を内径１．０ｃｍのカラム（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）に入れ総ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅが３．５
ｍｌになる様にした。【０１４７】実施例４７−抗−ジゴキシン−化合物Ｉ結
合物の製法とアフィニティー精製法マウス抗ジゴキシンモノクローナル抗体（Ｃａｍｂｒｉ
ｄｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ｃ
ａｔ ｎｏ．２００Ｍ−０１４、ロット番号ＭＡ２５０
７Ｆ）の１ｍｇ／ｍｌ貯蔵用溶液を４５０μｌ Ａｍｉ
ｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０濃縮ユニットを用いて
１００μｌにまで濃縮した。この濃縮物に０．２Ｍ炭酸
水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６を９００μｌと化合
物Ｉを０．６ｍｇ加えた。反応（アミノ化）を室温で２
時間行ない、その後３０μｌの０．１Ｍ ＮａＢＨ
₄（ａｑ）（Ｓｉｇｍａ）を加えた。得られた溶液を１
時間放置した。過剰の化合物Ｉ及びその他の生成物をこ
の抗体結合体からセファデクスＧ−２５クロマトグラフ
ィー（カラム＝１．０ｃｍ_ID×１８ｃｍ；溶出剤＝０．
１Ｍリン酸塩緩衝食塩水）により分離した。試料は２０
ｍｌ／ｈｒの流速で１ｍｌずつのフラクションにして採
り、２８０ｎｍに於ける吸収を２．０ＡＵＦＳ及び０．
５ＡＵＦＳでモニターした。フラクション５、６、７、
及び８を集め、予め洗ってあるウアバイン−ＢＳＡ−セ
ファロースアフィニティーカラム（３．５ｍｌのカラム
で内径１ｃｍ）にかけた。そして１５ｍｌ／ｈｒの流速
で溶離させた。保持されていない物質が溶出した後、流
速を２０ｍｌの溶出液が集まるまで３０ｍｌ／ｈｒに上
げた。移動相のこの食塩水濃度は０．５Ｍに上昇し、さ
らに２０ｍｌをカラムから溶出させた。ウアバインに特
異的な抗ジゴキシン−化合物Ｉ結合体は４Ｍと６ＭのＫ
ＳＣＮを加える事により取り除かれた。抗ジゴキシン−
化合物Ｉ結合体に当るフラクションを集め１０ｍＭリン
酸塩緩衝食塩水（４リットル；ｐＨ７．４）、続いて
０．１Ｍリン酸塩緩衝液に対して透析した。【０１４８】実施例４８−ジゴキシンに対する不均質エ
レクトロ化学ルミネセントイムノアッセイ１０ｍｇの固体ジゴキシンを１０ｍｌのＤＭＳＯ：Ｈ₂
Ｏ（８：２）に溶かし、ジゴキシン濃度を１ｍｇ／ｍｌ
とした（今後これを貯蔵用標準液と呼ぶ）。この貯蔵用
標準液から０．１％ＢＳＡ及び０．１５Ｍ ＮａＦを含
むｐＨ７．０の０．１５Ｍリン酸緩衝液（今後ＥＣＬ緩
衝液と呼ぶ）を用いて以下の濃度の作業用標準液を調製
した；８０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍ
ｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ及び０ｎｇ／ｍｌ。
７５μｌの抗ジゴキシン−化合物Ｉ結合体（１：９０に
希釈されている）及び７５μｌのそれぞれの標準液をガ
ラス試験管にピペットで注ぎ、ｖｏｒｔｅｘ上で混合し
室温で２０分間反応させた。５０μｌの予め洗浄された
ウアバイン−ＢＳＡ−Ｂｉｏｍａｇ粒子を各々の試験管
に加え、ｖｏｒｔｅｘで混合した後室温で５分間反応さ
せた。Ｂｉｏｍａｇ粒子を分離し、上澄み液をそれぞれ
別の試験管に移した。１００μｌの上澄み液を４００μ
ｌの０．１２５Ｍリン酸カリウム０．１２５Ｍクエン
酸；３２ｍＭシュウ酸；１．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００と試験管中で混合した。この試料をＢｅｒｔｈｏ
ｌｄ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔに入れ、先に述べた様にエ
レクトロ化学ルミネセンスを測定した。但しその方法は
開回路からの加電圧を２．２Ｖに切り換え、光子の計数
を１０秒間で積算する様に改変された。電極はリン酸−
クエン酸緩衝液を用いて以下の方法で測定の間に洗浄し
た：（ａ） 電極に３秒おきに交互に−２．２Ｖと＋２．２
Ｖのパルスを１分間送る。（ｂ） 電極を＋２．２Ｖに１０秒間保つ。（ｃ） 電極を脱イオン水ですすぎ、水気をとって乾か
す。この結果を第７図に示す。【０１４９】実施例４９−エレクトロ化学ルミネセンス
を有する化学種によるＤＮＡの標識づけエレクトロ化学ルミネセントを有する化学種によるＤＮ
Ａの標識づけを以下の２つの方法を用いて行なった。合成Ａ１．０Ａ₂₆₀の標準的に合成された３８量体（ＭＢＩ
３８）【化３９】ＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＡＣＣＧＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴ^*でＴ^*が５位の炭素が【化４０】−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ₂）₇−ＮＨ₂で修飾されたチミジンであるものを０．０１Ｍリン酸緩
衝液、ｐＨ８．７に溶かした。１００μｌのビス（２，
２′−ビピリジン）〔４−（ブタン−ｌ−ａｌ）−４′
−メチル−２，２′−ビピリジン〕ルテニウム（ＩＩ）
二過塩素酸塩（化合物Ｉ）（０．０１Ｍリン酸カリウム
緩衝液、ｐＨ８．７ ３００μｌ中に２．３ｍｇ）の溶
液。内容物を攪拌し室温で一晩放置した。１００μｌの
水素化ホウ素ナトリウム飽和水溶液をこの混合物に加
え、この可逆的なイミンのシッフ塩基結合を非可逆的な
アミン結合に変換させた。この反応は室温で２時間行な
った。次にこの溶液を注意深く希酢酸で処理し、過剰の
水素化ホウ素ナトリウムを失活させた。この反応溶液を
Ｐ−２ゲル濾過のカラム（１８インチ×１／２インチ）
で予め０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ６．
７７で平衡化されているものにかけた。このカラムはこ
の同じ緩衝液で溶出させ、２ｍｌのフラクションを流速
２０ｍｌ／ｈｒで集めた。フラクション９及び１０に溶
出したＤＮＡは未反応のルテニウムビピリジル化合物と
十分に分離された。この集められたＤＮＡ試料は典型的
なＵＶ吸収を示し、さらに４５０ｎｍで励起すると６２
０ｎｍで蛍光の発光スペクトルを示した。この蛍光の発
光はこのＤＮＡ試料中にルテニウムビピリジルの化学種
が存在する事を示している。この生成物は単一の橙色の
蛍光を発するバンドとしてポリアクリルアミドゲル電気
泳動で移動する。この標識されたＤＮＡ（ＭＢＩ３８−
化合物Ｉ結合体）の電気泳動による移動度はおよそ未標
識のＤＮＡと同じである。【０１５０】合成Ｂ本ルテニウム化合物をまず３ｍｇ、６０μｌの無水ジテ
チルホルムアミドに溶かし、これを９４ｍｇのジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下で２００μ
ｌの無水ＤＭＦ中の５２ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシン
イミドで処理する事によりＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド誘導体に変換した。この反応は０℃で４時間行なっ
た。沈殿したジシクロヘキシル尿素を遠心により取り除
き、この上澄み液（２００μｌ）を０．０１Ｍリン酸緩
衝液ｐＨ８．７７中にアミノ結合したＤＮＡ（合成Ａで
述べた）を含む溶液（１００μｌの緩衝液中２Ａ₂₆₀）
に加えた。この反応は一晩室温で行なった。かなりの量
の固体が反応液中に現われたがガラスウールで濾過して
取り除いた。この濾液を濃縮し、０．５ｍｌの１Ｍ酢酸
トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．８）に溶かした。こ
の反応混合液を次に合成Ａで述べた様にクロマトにかけ
た。この標識されたＤＮＡは合成Ａで調製された材料に
ついて述べた様な全てのスペクトル上及び電気泳動上の
特徴を示した。【０１５１】実施例５０−標識されたＤＮＡの電気的に
発生させた化学ルミネセンスの特性実施例４９、合成Ａで得られた標識されたＤＮＡ試料
（ＭＢＩ−化合物Ｉ）を用いてそのエレクトロ化学ルミ
ネセンスの特性を研究した。様々な濃度の標識されたＤ
ＮＡを０．１Ｍクエン酸、２５ｍＭシュウ酸及び１．０
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む０．１Ｍリン酸緩衝
液、ｐＨ４．２、０．５ｍｌに溶かし、改良されたＢｅ
ｒｔｈｏｌｄ Ｉｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒで測定した。第
８図に様々なＤＮＡ濃度に対するエレクトロ化学ルミネ
セントシグナルの反応を示す。【０１５２】実施例５１−化合物Ｉで標識されたオリゴ
ヌクレオチドのハイブリダイゼーション実験実施例５０で述べた３８量体に対する相補ストランドを
ＡＢＩ ｍｏｄｅｌ３８０ Ｂ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｚｅｒを用いて合成し、これをＭＧＥＮ−３８と命
名した。このオリゴヌクレオチドへの化合物Ｉの共有結
合的付着がＭＢＩ３８オリゴヌクレオチドのハイブリダ
イゼーション特性に影響を与えているかどうかを調べる
為に、以下の実験を考案した。様々な濃度の標的フラグ
メント（ＭＧＥＮ−３８）をＧｅｌｍａｎ ＲＰナイロ
ンメンブランのシート上にスポットし、ＭＢＩ３８又は
ＭＢＩ３８−化合物Ｉを固定し、エーテルでプローブし
た。両方のフラグメントをＴ₄ポリヌクレオチドキナー
ゼ及びガンマ³²Ｐ〔ＡＴＰ〕で処理し、５′末端を³²Ｐ
で標識した。ＤＮＡと化合物Ｉで標識されたＤＮＡのハ
イブリダイゼーション感度を比較した。【０１５３】５０ｎｇから０．０５ｎｇまでの範囲の濃
度のＭＧＥＮ−３８ＤＮＡをナイロンメンブランにスポ
ットし、空気乾燥した。メンブランは１スポットに対し
２枚ずつ用意した。このブロットをそれぞれ以下の溶液
で２分間ずつ処理した：ＤＮＡを十分変性させる為に
１．５Ｍ ＮａＣｌ−０．５Ｍ ＮａＯＨ；ブロットを
中和する為に１．５Ｍ ＮａＣｌ−０．５Ｍ ＴＲＩ
Ｓ；最後に２Ｘ ＳＳＣ。このブロットを８０℃の真空
オーブン中で２時間焼いた。ハイブリダイゼーションプ
ローブは以下の要領で調製した：３μｇのＭＢＩ３８及
びＭＢＩ３８−化合物Ｉを１０単位のＴ₄キナーゼと１
２５μ Ｃｉのガンマ³²Ｐ−ＡＴＰでキナーゼ処理し
た。ＤＮＡへの同位体の取り込み率を測定し以下に示し
た。 ＭＢＩ３８総カウント数 ４．１×１０⁶ｃｐｍ／μｌ 取り込まれたカウント数 ３．１×１０⁵ｃｐｍ／μｌ 取り込み率＝７５．６％ ＭＢＩ３８−化合物Ｉの総カウント数 ３．２×１０⁶ｃｐｍ／μｌ 取り込まれたカウント数 ２．６×１０⁵ｃｐｍ／μｌ 取り込み率＝８１．２％【０１５４】プレハイブリダイゼーション及びハイブリ
ダイゼーションの溶液をＭａｎｉａｔｉｓ（２４）に従
って調製した。ブロットは５０μｇ／ｍｌの仔ウシ胸腺
ＤＮＡと供に５３℃で４時間ハイブリダイゼーションし
た。次にこのブロットを１０，０００，０００ｃｐｍの
各々のプローブを含むハイブリダイゼーション溶液に入
れた。そして５３℃で一晩（１２時間）ハイブリダイゼ
ーションさせた。翌日このブロットを以下の様に洗浄し
た：−５３℃の２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで１５分間ずつ
２回−０．２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで２回（上と同様
に）−０．１６×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで２回（上と同様
に）このブロットを次に空気乾燥し−７０℃でＫｏｄａｋ
Ｘ−ｏｍａｔフィルムにさらした。このＸ線分析（第９
図参照）からＭＢＩ３８とＭＢＩ３８−化合物Ｉのプロ
ーブの間には非常に似たハイブリダイゼーションのパタ
ーンが見られる事がわかった。両方の場合に於いて５ｎ
ｇの標的に対するプローブのハイブリダイゼーションが
観察され、最低０．０５ｎｇの標的ＤＮＡに至るまでわ
ずかなハイブリダイゼーションの痕跡が認められた。陰
性対照のＤＮＡ（５０ｎｇスポットしたファージラムダ
ＤＮＡ）に対してはこのプローブによるハイブリダイゼ
ーション活性は検出されなかった。【０１５５】実施例５２−化合物Ｉで標識されたＤＮＡ
プローブのハイブリダイゼーションの特異性に関する実
験幾つかのＥ．ｃｏｌｉ及び非Ｅ．ｃｏｌｉ株からゲノム
のＤＮＡをＭａｎｉａｔｉｓ（２４）の方法に従って分
離した。使用した生物は：Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＣ８株−天然分離株Ｅ．ｃｏｌｉ ＰＣＩＡ株−腸管病原性株Ｅ．ｃｏｌｉ １０Ｈ０７株−毒素原性株Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＣ５０株−天然分離株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ株−実験用株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株−実験用株Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ エン
テロバクター・エロゲネスＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ シト
ロバクター・フロインディイＳａｌｍｏｒｅｌｌａｐａｒａｔｙｐｈｉ Ｂ サル
モネラ・パラチフィＢＳａｌｍｏｒｅｌｌａｐｏｔｓｄａｍ サル
モネラ・ポツダム上述の株から得られたＤＮＡを３μｇずつ重複してＧｅ
ｌｍａｎ ＲＰナイロンメンブラン及びＳ＆Ｓニトロセ
ルロースメンブラン上にスポットした。陰性対照として
５０ｎｇのファージラムダＤＮＡをスポットした。陽性
対照は５０ｎｇから０．５ｎｇの範囲の様々な濃度の相
補ストランド、ＭＧＥＮ−３８とした。このブロットは
実施例５１で述べた方法により調製し処理した。このプ
ローブ用ＤＮＡは放射性を取り込ませる為に１２５μＣ
ｉのガンマ³²Ｐ−ＡＴＰと共にＴ₄キナーゼ処理された
３．８μｇのＭＢＩ３８−化合物Ｉフラグメントから構
成された。【０１５６】 ＭＢＩ３８−化合物総カウント数 −３．３５×１０⁶ｃｐｍ／μｌ 取り込まれたカウント数 −１．５０×１０⁶ｃｐｍ／μｌ 取り込み率 −４４．７％このアッセイの為に２，６００，０００ｃｐｍの活性を
各々のフィルターをプローブする為に用いた。このハイ
ブリダイゼーション溶液、条件、洗浄溶液及びプロトコ
ルは実施例５１で述べたものと同様のものを用いた。こ
のブロットのＸ線フィルム（第１０図）はそれぞれ適宜
反応させた陽性及び陰性対照を示している。ラムダＤＮ
Ａ（５０ｎｇ）ではハイブリダイゼーション活性は検出
されず、最低０．５ｎｇの濃度までＭＧＥＮ−３８の相
補配列に対し強いハイブリダイゼーションが観察され
た。これらの結果は感度に関する実験の結果と総合的に
一致するものである。【０１５７】実施例５３−２，２′−ビピリジニウムヘ
キサクロロオスミウム酸塩（ＩＶ）の製法１．０１ｇのヘキサクロロオスミウム酸（ＩＶ）アンモ
ニウム、（ＮＨ₄）₂ＯｓＣｌ₆、（Ａｌｆａ）（１．
００等量）を５０ｍｌの３Ｎ ＨＣｌ（ａｑ）に７０℃
で溶かした。この熱せられ、攪拌された溶液に３Ｎ Ｈ
Ｃｌ（ａｑ）に溶かした２，２′−ビピリジンを一滴ず
つ加えた。赤い塩、【化４１】（今後（ｂｐｙＨ₂²⁺）ＯｓＣｌ₆^2-と呼ぶ）で分子量
５６２．２ｇ／ｍｏｌｅがこの溶液から沈殿した。沈殿
はこの溶液を０℃の氷浴で２時間冷却する事により完了
した。生成物をｇｌａｓｓ ｆｒｉｔｔｅｄ ｆｉｌｔ
ｅｒ上で吸引濾過により集めた。この沈殿物を連続的に
５〜１０ｍｌの氷冷した３Ｎ ＨＣｌ（ａｑ）と水で洗
った。最後に２０ｍｌの無水ジエチルエーテルで洗った
後、この生成物を真空下７０℃で４８時間乾燥させた。
収量＝１．０１ｇ橙色粉末（（ＮＨ₄）₂ＯｓＣｌ₆に
基づいた収率７８％）。この生成物はさらに精製する事
なく使用した。【０１５８】実施例５４−２，２′−ビピリジンテトラ
クロロオスミウム酸塩（ＩＶ）の製法実施例５３で調製した（ｂｐｙＨ₂²⁺）（ＯｓＣ
ｌ₆^2-）塩０．９ｇ（１．６０ｍ ｍｏｌ）をパイレッ
クスの試験管に量り取る。この試験管をアルゴンの出入
口と温度計（最大目盛４００℃）の付いたパイレックス
の煙管に入れた。この装置全体を煙管に入れアルゴンを
流し込んだ。この炉を加熱し、温度を２７０−３００℃
に上げた。反応の間を通してアルゴンを穏やかに管に流
した。このアルゴンの出口を反応の間に生成したＨＣｌ
を実験室外へ排気する為にｆｕｍｅフード下に向けた。
温度が２７０℃に近づくにつれ、反応物の熱分解が開始
した。この固体からＨＣｌガスが発生するのが観察され
た。３０分間にわたり激しくＨＣｌが発生するのが観察
され、その後しだいに鎮静化し始めた。６時間後、オー
ブンを止め、試料を室温まで冷却した。この生成物、
（ｂｐｙ）ＯｓＣｌ₄、細かく分かれた茶褐色の固体を
１２時間、攪拌された３Ｎ ＨＣｌ（ａｑ）溶液中に懸
濁し、続いて６時間攪拌された無水ジエチルエーテル中
に懸濁する事により精製した。ｇｌａｓｓ ｆｒｉｔｔ
ｅｄ ｆｉｌｔｅｒ上で吸収濾過する事によりこの生成
物を分離した結果、２，２′−ビピリジンテトラクロロ
オスミウム酸塩（ＶＩ）が０．７５ｇ（９５％）収穫さ
れた。これを今後（ｂｐｙ）ＯｓＣｌ₄と呼ぶ。（ＭＷ
＝４８９．３ｇ／ｍｏｌｅ）。【化４２】この生成物はさらに精製する事なく使用した。【０１５９】実施例５５シス−（２，２′−ビピリジン）〔シス−ビス（１，２
−ジフェニルホスフィノ）エチレン〕−ジクロロオスミ
ウムの合成攪拌子と還流冷却器を付けた５０ｍｌの丸底フラスコ
に、実施例５４に於いて合成した（ｂｐｙ）ＯｓＣｌ₄
２３０ｍｇ（０．４７ｍ ｍｏｌ）とシス−ビス
（１，２−ジフェニルホスフィノ）エチレン（ＤＰＰ−
ｅｎｅ）４６５ｍｇ（１．１７ｍ ｍｏｌ）を添加し
た。ジグライム２５ｍｌを添加し、内容物をアルゴン気
流下で５時間還流した。濃緑−黒色の溶液をアルゴン気
流下で室温に冷却し、２００ｍｌのビーカーに移し入れ
た。無水ジエチルエーテル８０ｍｌを加えると濃緑色の
沈殿を与えた。この沈殿をガラスフィルター（中程度の
孔）上に吸引濾過により収集し、２０ｍｌずつの無水ジ
エチルエーテルで５回洗浄した。この沈殿をその後ＣＨ
₂Ｃｌ₂ １５ｍｌに溶解すると濃緑色の溶液を与え
た。この溶液をガラスフィルター（中程度の孔）を通し
て自然濾過して約３００ｍｌの攪拌している無水ジエチ
ルエーテル中に注入した。灰色−緑色のシス−（２，
２′−ビピリジン）〔シス−ビス（１，２−ジフェニル
フォスフィノ）エチレン〕−ジクロロオスミウムＩＩ錯
体、これ以後は、シス−（ｂｐｙ）（ＤＰＰ−ｅｎｅ）
ＯｓＣｌ₂と記述する、の沈殿が生じた。この錯体をガ
ラスフィルター（中程度の孔）上に吸引濾過して収集し
た。生成物を速かに２０ｍｌの冷１：２ｖ／ｖエタノー
ル／水で洗浄し、その後３０ｍｌずつのジエチルエーテ
ルで７回洗浄した。スレート灰色の粉末を、真空デシケ
ーター中ＣａＳＯ₄を用いて一夜乾燥した。【化４３】収量：２４０ｍｇ（（ｂｐｙ）ＯｓＣｌ₄；分子量＝８
１４．４ｇ／ｍｏｌｅに基づいて６３％）。この生成物
は、これ以上精製しないで使用した。【０１６０】実施例５６（２，２′−ビピリジン）〔シス−ビス（１，２−ジフ
ェニルホスフィノ）エチレン｛２−〔３−（４−メチル
−２，２′−ビピリジン−４′−イル）プロピル〕−
１，３−ジオキソラン｝オスミウム（ＩＩ）ジクロリド
の合成攪拌子と還流冷却器を装備した１００ｍｌの丸底フラス
コに、実施例５５で合成したシス−（ｂｐｙ）（ＤＰＰ
ｅｎｅ）ＯｓＣｌ₂ １２９ｍｇ（０．１５８ｍ ｍｏ
ｌ）と２−〔３−（４−メチル−２，２−ビピリジン−
４−イル）プロピル〕−１，３−ジオキソラン、即ちｂ
ｐｙｏｘａｌ、０．３ｇ（１．０ｍ ｍｏｌ）を添加し
た。これにエチレングリコール１５ｍｌを添加した。こ
の懸濁液をアルゴン気流下に３時間還流した。室温に冷
却した後に、水１０ｍｌをフラスコの内容物に添加し
た。水に入れたＳＰ−セファデックスＣ−２５イオン交
換樹脂のカラム（３０ｃｍの高さ×１９ｍｍ内径）を調
製した。反応フラスコの内容物をカラムにかけた。カラ
ムをＨ₂Ｏ（約５００ｍｌ）で溶出してエチレングリコ
ールと過剰のｂｐｙｏｘａｌ配位子を除去した。０．２
５Ｍ ＮａＣｌ（水）溶液で溶出して淡黄色の小バンド
（長波長のＵＶ光下ではオレンジ色の蛍光）を分離し、
その後非蛍光のオリーブグリーンのバンドを分離した。
これらのバンドは、反応の副生成物であることを示し
た。それらの同定は行わず、廃棄した。これらのバンド
をカラムから除去すると同時に、０．５Ｍ ＮａＣｌ
（水溶液）による溶出を始めた。最初のオレンジ色蛍光
を有するオレンジ色のバンドは、必要とする生成物の塩
化物塩である（２，２′−ビピリジン）〔シス−ビス
（１，２−ジフェニルホスフィノ）エチレン〕｛２−
〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イ
ル）プロピル〕−１，３−ジオキソラン｝オスミウム
（ＩＩ）、これ以後は（ｂｐｙ）（ＤＰＰｅｎｅ）（ｂ
ｐｙｏｘａｌ）Ｏｓ（ＩＩ）²⁺と記述、であると同定し
た。この物質は、テイリングした黄色バンド（緑色蛍
光）と褐色バンド（非蛍光）から純粋に分離した。【０１６１】（ｂｐｙ）（ＤＰＰｅｎｅ）（ｂｐｙｏｘ
ａｌ）Ｏｓ（ＩＩ）²⁺を含む分画中の溶液量を、回転式
エバポレーターで蒸発して５０ｍｌとした。その後濃Ｎ
ａＣｌ水溶液を５０ｍｌずつのＣＨ₂Ｃｌ₂で３回抽出
した。ＣＨ₂Ｃｌ₂抽出液を合併し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄
で乾燥し、ヒダ折りの濾紙で自然濾過した。赤色のＣＨ
₂Ｃｌ₂溶液を回転式エバポレーターで蒸発して濃縮し
１０ｍｌの容量とした。ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液を、良く攪拌
した２００ｍｌの石油エーテルにゆっくりと滴下するこ
とにより、オレンジ色の固体として錯体を単離した。沈
殿した錯体をガラスフィルター（中程度の孔）上に吸引
濾過して収集した。生成物を、１５ｍｌずつのジエチル
エーテルで３回洗浄した。生成物を真空デシケーター中
ＣａＳＯ₄により一夜乾燥した。収量：（ｂｐｙ）（ＤＰＰｅｎｅ）（ｂｐｙｏｘａｌ）
Ｏｓ（ＩＩ）²⁺（Ｃｌ^-）₂・２Ｈ₂Ｏを１１０ｍｇ
（シス−（ｂｐｙ）（ＤＰＰｅｎｅ）ＯｓＣｌ₂に基づき６３％）。生成物は２水塩であり、分析的に純
粋である：Ｃ₅₇Ｈ₅₄Ｎ₄Ｏ₄Ｐ₂Ｃｌ₂Ｏｓ・２Ｈ₂Ｏ
（分子量＝１１０９．５９ｇ／ｍｏｌｅ）。理論値：Ｃ，５５．２０％；Ｈ，４．８７％；Ｎ，５．
０５％；Ｏ，５．７７％；Ｃｌ，６．３９％。測定値：
Ｃ，５６．０３％；Ｈ，５．１８％；Ｎ，４．８８％；
Ｏ，６．８７％；Ｃｌ，７．０７％【化４４】【０１６２】実施例５７シス−ジクロロ−ビス−〔４，４′−カルボエトキシ）
−２，２′−ビピリジン〕ルテニウム（ＩＩ）の合成攪拌子と還流冷却器を装備した２５０ｍｌの丸底フラス
コに、シス−テトラ−（ジメチルスルホキシド）ジクロ
ロルテニウム（ＩＩ）（Ｒｕ（ＤＭＳＯ）₄Ｃｌ₂）７
５０ｍｇ（１．５５ｍ ｍｏｌ）とエチレングリコール
１００ｍｌを添加した。フラスコの内容物をアルゴン気
流下に軽く沸騰させ、（４，４′−カルボメトキシ）−
２，２′−ビピリジン７５６ｍｇ（３．０９ｍ ｍｏ
ｌ）を添加した。アルゴン気流下の加熱を５分間継続し
た。オレンジ色の溶液は、褐色／黒色となり、リチウム
クロリド０．７５ｇとエチレングリコール５０ｍｌを添
加した。この溶液をさらに１０分間加熱した。室温に冷
却した後に、混合物に約１００ｍｌのＨ₂Ｏを添加し
た。この混合物を、２００ｍｌずつのＣＨ₂Ｃｌ₂で５
回抽出した。ＣＨ₂Ｃｌ₂抽出液を２００ｍｌずつの水
で６回洗浄した。洗浄する毎に水層を（赤色の）蛍光に
ついてテストし、水層に蛍光が検出されなくなる迄は、
必要があれば洗浄を続けた。ＣＨ₂Ｃｌ₂抽出液を無水
Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。生成物のＣＨ₂Ｃｌ₂溶液を
蒸発し、攪拌している１０倍量の無水ジエチルエーテル
に滴下することにより単離した。沈殿した生成物を吸引
により濾取し、３０ｍｌのジエチルエーテルで１度洗浄
し、真空デシケーター中でＣａＳＯ₄により一夜乾燥し
た。収率＝２５％濃いメタリックグリーン結晶。この生
成物は、分析的に純粋である。理論値：Ｃ，４４．５７；Ｈ，４．０１；Ｎ，７．４
３；Ｃｌ，９．４０；Ｏ，２１．２１。測定値：Ｃ，４
４．１６；Ｈ，３．７２；Ｎ，７．１１；Ｃｌ，９．５
３；Ｏ，２０．１５。分子量＝７５４．５ｇ／ｍｏｌ
ｅ。【化４５】【０１６３】実施例５８ビス〔（４，４′−カルボメトキシ）−２，２′−ビピ
リジン〕２−〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリジ
ン−４−イル）プロピル〕−１，３−ジオキソランルテ
ニウム（ＩＩ）２過塩素酸塩の合成ビス（４，４′−ジカルボメトキシ−２，２′−ビピリ
ジン）ルテニウム（ＩＩ）ジクロリド２５０ｍｇ（０．
３３ｍ ｍｏｌ）のメタノール／水（１：１）５０ｍｌ
溶液に、２−〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリジ
ン−４′−イル）−プロピル〕−１，３−ジオキソラン
（ｂｐｏｘａｌ）１０５ｍｇ（０．３７ｍ ｍｏｌ）を
添加し、この混合物をアルゴン気流下に１２時間還流し
た。この溶液を冷却し、７０％ＨＣｌＯ₄０．５ｍｌを
添加した。メタノールをゆっくりと蒸発した。沈殿した
赤色結晶を濾取し、少量の冷却した水で洗浄し、ついで
エタノール及びエーテルで洗浄し、真空で乾燥した。ビ
ス（４，４′−ジカルボメトキシ−２，２′−ビピリジ
ン）ルテニウム（ＩＩ）ジクロリドと４−（４−メチル
−２，２′−ジピリジン−４′−イル）−酪酸又は４，
４′−メチル−２，２′−ビピリジンから錯体を合成す
るために、同様の方法を使用した。【化４６】【０１６４】実施例５９−ヒトＩｇＧの化合物Ｉによる
標識づけ２ｍｌのヒトＩｇＧ（２．５ｍｇ／ｍｌ）を２リットル
の０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６に対
し４℃で一晩、穏やかに攪拌しながら透析した。化合物
Ｉを存在するタンパク質（２．７ｍｇ／１００μｌジメ
チルホルムアミド）に対して１００ｍｏｌａｒ過剰に調
製し、溶かした。この透析されたタンパク質を一滴ずつ
ｔａｇ−ａｌｄｅｈｙｄｅに加えた。この間２時間、溶
液を室温で穏やかに攪拌した。タンパク質に対し１００
ｍｏｌａｒ過剰の水素化ホウ素ナトリウム（脱イオン水
に溶かした１．２４ｍｇ／ｍｌ溶液１００μｌ）をこの
溶液に加え、室温でさらに３０分間穏やかに攪拌を続け
る。この結合体を室温で０．２Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．
０で平衡化したセファデクスＧ−２５カラム（１．０ｃ
ｍ×１８．０ｃｍ）にかけ、溶出液を２８０ｎｍでモニ
ターした。ボイドボリュームのピークを集め、合わせて
２リットルのＴｒｉｓ緩衝液に対し透析した。この結合
体に対し標準的なＥＬＩＳＡ法で免疫学的活性をテスト
し、使用時まで４℃で貯蔵した。【０１６５】実施例６０−Ｂｉｏｍａｇ／ヤギ−抗ヒト
ＩｇＧ粒子の製法５％Ｂｉｏｍａｇ−ａｍｉｎｅ ｔｅｒｍｉｎａｌｅｄ
粒子（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｒｅｔｉｃｓ，Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を２．５ｍｌ清浄なＴ−フラスコ
に入れ、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で５回洗った。
このｗｅｔ ｃａｋｅを１２．５ｍｌの５％新しいグル
タルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、外界温度で
３時間十分に回転させた。このｗｅｔ ｃａｋｅを別の
Ｔ−フラスコに移しＰＢＳで３回洗浄した。この活性化
された粒子を１２．５ｍｌのＰＢＳに再び懸濁し、１５
ｍｌの遠沈管に移した。この懸濁液に２ｍｌのＰＢＳに
溶かした１２．５ｍｇのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）
（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を加えた。この管を室温
で３時間十分に回転し、次に４℃で一晩回転させる。翌
日この粒子を１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を含むＰＢＳで２回洗浄し、次に０．１％ＢＳＡを
含む１２．５ｍｌのＰＢＳ中で４℃で使用時まで貯蔵す
る。【０１６６】実施例６１−Ｂｉｏｍａｇの磁気に基づく
粒子アッセイを用いた偽ホモジニアスヒトＩｇＧエレク
トロ化学ルミネセンスアッセイ化合物Ｉ−ヒトＩｇＧ結合体を０．１％ＢＳＡを含む
０．１５Ｍリン酸緩衝液で１：５０に希釈し、１本の試
験につき２５０μｌずつ入れた。希釈剤（上述と同様Ｐ
Ｂ ｗ／ＢＳＡ）を１５０μｌずつ試験管に注ぎ、次に
様々な希釈率の目的の分析物質（ヒトＩｇＧ）又は希釈
剤（陰性対照）を加えた。さらに非特異的目的の分析物
質（ヤギ−抗ウサギＩｇＧ）を特異性のアッセイをチェ
ックする為に試験管数本に入れた。ヤギ抗ヒトＩｇＧ
（Ｈ＆Ｌ）と結合した１％Ｂｉｏｍａｇを５０μｌ各々
の試験管に加えた。この試験管はｖｏｒｔｅｘ上で混合
され、室温で穏やかに振盪しながら１５分間反応させ
た。この粒子を溶液から磁気的に除去し、得られた上澄
み液１００μｌをＢｅｒｔｈｏｌｄ管に移し、ここに４
００μｌのクエン酸塩−シュウ酸塩−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００溶液を加えた。この管をｖｏｒｔｅｘ上で混合
し、Ｒ−２６８光電子増倍管及び直径０．２９インチの
輪状の５２ゲージ二重白金メッシュ電極が付いた改良型
Ｂｅｒｔｈｏｌｄルミノメーターで測定した。この電極
は、ポリカーボネートの支持体で覆われ、直径０．０１
インチの白金線／銀ペイント・コンタクトを介して電圧
源に接続されている伝導性ペイントによって支持されて
いる。加電圧は＋１．４から＋２．１５Ｖまでステップ
して、この間１０秒間の積算をした。測定と測定の間に
はこの電極を脱イオン水ですすぐ事により電気化学的に
清浄にし、次にシュウ酸とＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を
含む０．１Ｍリン酸塩−クエン酸塩緩衝液に浸漬し、加
電を−２．２Ｖから＋２．２Ｖまで（各々の電圧で３秒
間）２分間及び２０秒間ステップし、＋２．２Ｖのｐｏ
ｔｅｎｔｉａｌで１０秒間保持した。この電極を洗浄液
から取り出し、脱イオン水ですすぎ、水気を吸い取って
乾かした。この方式に於いてはエレクトロ化学ルミネセ
ントシグナルは目的の分析物質の濃度に直接比例した。【０１６７】実施例６２−ビス（２，２′−ビピリジ
ン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビ
ピリジン−４′−ブチルアミドルテニウム（ＩＩ）二過
塩素酸塩：化合物ＩＶの製法実施例３２に記載されている方法で５００ｍｇ（１．３
５×１０^-3ｍｏｌ）のフタルイミドから調製した４−
〔４−（１−アミノブチル）〕−４′−メチル−２，
２′−ビピリジンを無水ピリジンに０．３１３ｇ（１．
４８×１０^-3ｍｏｌ）のマレイミドヘキサン酸と０．３
０６ｇ（１．４８×１０^-3ｍｏｌ）のＤＤＣと共に溶解
した。一晩攪拌した後、ジシクロヘキシル尿素を濾過に
より除去し、ピリジンを真空下で蒸発させた。この残留
物をカラムクロマトグラフィー（活性ＩＩアルミナ、５
％ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂）で精製し、精製された生成
物を得た。収量：０．５６ｇ（９５％）。１００ｍｇ
（２．３×１０^-4ｍｏｌ）のマレイミド−ヘキサン酸、
４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ブチルアミ
ド及び１００ｍｇ（２．０６×１０^-4ｍｏｌ）のビス−
（２，２′−ビピリジン）ルテニウム二塩化物二水和物
を５０ｍｌのエタノール／水（１：１）に溶かし、アル
ゴンで脱気して４時間還流した。得られた透明の橙色溶
液を２５ｍｌの固体過塩素酸ナトリウム、２５ｍｌのエ
タノール、及び２５ｍｌのアセトンで希釈し、真空状態
でゆっくりと蒸発乾固させた。乾固したら、さらに２５
ｍｌの水と２５ｍｌのアセトンを加え、この溶液を約１
５〜２０ｍｌになるまでロータリーエバポレーターで濃
縮した。沈殿した固体を集め水で洗い乾燥させた。この
試料は１：９メタノール／クロロホルムの溶媒系でアル
ミナの調製用ＴＬＣで精製した。ここで速く展開してき
たバンドをプレートをかき取り、本化合物をメタノール
／クロロホルム（１：１）中で攪拌する事により溶離さ
せて分離した。アルミナを取り除く為に濾過した後、橙
色の溶液を蒸発乾固させ８６．７ｍｇの精製された化合
物を得た（７２％）。この構造はＮＭＲにより確認され
た。【０１６８】実施例６３−化合物ＩＶによるｈＣＧペプ
チドの標識づけ２ｍｇのヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）ペプチド
（＃１０９−１４５、ＪＰ１４１、Ｖｅｒｎｏｎ Ｓｔ
ｅｖｅｎｓ，Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ）を１ｍｌの０．１５Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ６．
０に懸濁し、１．１３ｍｇの化合物ＩＶは３００μｌの
ジメチルホルムアミドに溶かした。このペプチド溶液を
一滴ずつ１分間以上かけて化合物ＩＶ溶液に加えた。こ
の溶液を室温で１時間穏やかに攪拌した。次にこの試料
を、室温で０．２Ｍ Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ８．５で流速
１５ｍｌ／ｈｒで平衡化されたＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−２
カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；１ｃｍ×４５ｃｍ）にかけ、
溶出液を２８０ｎｍでモニターした。このボイドボリュ
ームを集め、合わせて、室温で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．０で平衡化されたＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ Ａ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；１ｃｍ×
１０ｃｍ）にかけた。これは未標識の全てのペプチドを
取り除く為に行なった。（この未標識のペプチドは陽性
にチャージした樹脂に吸着され、プラス電荷の標識され
たペプチドはそのままカラムを通過する。この溶出液は
２８０ｎｍでモニターされ、最初の主なピークを集め凍
結乾燥により濃縮した。乾燥させた固体を再び最少量の
ＰＢＦに懸濁した。このｈＣＧペプチド−化合物ＩＶ結
合体は使用時まで４℃で貯蔵された。【０１６９】実施例６４−ＤＥＡＥ ＡＦＦＩ−Ｇｅｌ
Ｂｌｕｅクロマトグラフィーによるウサギ抗ｈＣＧペ
プチドの精製法４ｍｌのＤＥＡＥ ＡＦＦＩ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ）をクロマトグラフィー用のカラム（１ｃｍ
×１０カラムサイズ）に注ぎ、室温で０．０２８Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用い流速４
０ｍｌ／ｈｒで１時間かけて平衡化した。この流速を２
０ｍｌ／ｈｒに下げ、予めこのカラム緩衝液に対し透析
されたウサギ抗−ｈＣＧペプチド（ａｎｔｉ １０９−
１４５、Ｖｅｒｎｏｎ Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｏｈｉｏ Ｓ
ｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を１ｍｌこのカラム
にかけた。１ｍｌずつのフラクションを集め、溶出液は
２８０ｎｍでモニターした。ボイドボリュームのピーク
を集め、数回の実験分を合わせ、ポリエチレングリコー
ル６，０００（Ｓｉｇｍａ）で囲まれた１２Ｋ ＭＷＣ
Ｏ透析サックにこの溶出液を入れる事により濃縮した。
この抗体について標準的なＥＬＩＳＡ法を用いて免疫学
的活性をテスト、ＨＰＬＣにより純度をテストした。Ｈ
ＰＬＣの結果、ひとつの大きなピークを得、これは純粋
で活性のある製剤である事を示している。【０１７０】実施例６５−精製されたウサギ抗ｈＣＧペ
プチドに対するｈＣＧペプチド−化合物ＩＶ結合体の滴
定：エレクトロ化学ルミネセンスシグナルの変調ｈＣＧペプチド−化合物ＩＶ結合体を０．１Ｍクエン酸
ｐＨ６．２を含む０．１Ｍリン酸緩衝液で希釈した。こ
の混合物の一部をｍｉｃｒｏｆｕｇｅ管に入れた。予め
精製された抗ペプチド抗体を様々な濃度に希釈し、この
管に加え、Ｖｏｒｔｅｘで混合した後室温で１時間反応
させた。エレクトロ化学ルミネセントを測る直前に、こ
の一部をシュウ酸とＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇ
ｍａ）の入ったＢｅｒｔｈｏｌｄ管に移した。この管を
Ｖｏｒｔｅｘで混合し、Ｒ−２６８光電子増倍管を用
い、二重白金メッシュの電極を持つＢｅｒｔｈｏｌｄ
ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒでＳｗｅｅｐモード（＋１．５
から＋２．５Ｖまで５０ｍＶ／ｓｅｃで３回走査し、２
回目の走査のピーク高を測定値とする）を使って測定し
た。測定の間にこの電極を電気化学的に清浄にした。最
初にこれを脱イオン水で洗い、次にこれを２５ｍＭのシ
ュウ酸塩と１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むｐＨ
６．１の０．１Ｍリン酸塩−クエン酸塩緩衝液に浸漬し
た。加電圧は各電圧に於いて３秒間、＋２．２Ｖと−
２．２Ｖの間を１分間及び５０秒間スイッチを入れ、＋
２．２Ｖで１０秒間保持した。次に電気を切り、洗浄液
から電極を取り出し脱イオン水ですすぎ、水気を吸い取
って乾かした。この結果はエレクトロ化学ルミネセント
シグナルはこのペプチドに対する抗体の濃度に直接比例
するという一般的傾向を示した。この事はエレクトロ化
学ルミネセンスで標識された分析対象物が抗体と接触す
るとエレクトロ化学ルミネセンスシグナルが落ちるその
他の実験とは対照的である。【０１７１】実施例６６−エレクトロ化学ルミネセンス
シグナルの出力：Ｒｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ結合体の
安定性に関するデータＲｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ共役物を１％の正常なヒト
血清（ＮＨＳ）を含むか或いは含まない０．１Ｍリン酸
塩−クエン酸塩緩衝液、ｐＨ６．１で３００ｎＭまで希
釈した。各々の緩衝液の種類のうちひとつを４°、２０
°、３０°、及び５０℃でインキュベートし、３、４、
及び５日目に試料を採取した。この試料は室温と平衡状
態にし、そのエレクトロ化学ルミネセンスシグナル出力
を測定した。４００μｌの試料を試験管内で１００μｌ
の１２５ｍＭシュウ酸−５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
と混合し、浜松Ｒ−２６８光電子増倍管と二重メッシュ
白金ガーゼ電極の付いた改良型Ｂｅｒｔｈｏｌｄルミノ
メーターに入れた。測定は加電圧を＋１．５Ｖから＋
２．５Ｖまで５０ｍＶ／ｓｅｃで３回スイープし、２回
目のピーク高を記録し、エレクトロ化学ルミネセンスの
カウントに変換する事により測定した。測定の間、電極
を電気化学的に清浄にした。脱イオン水ですすぎ、電極
を２５ｍＭシュウ酸塩と１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
を含む０．１Ｍリン酸塩−クエン酸塩緩衝液に浸漬し、
−２．２Ｖから＋２．２Ｖまで３秒間の休止をして、各
電圧１分間及び５０秒間、電圧を脈送した。電圧を＋
２．２Ｖで１０秒間止め、次に取り除いた。電極を洗浄
液から取り除き、脱イオン水で洗い、水気を吸い取って
乾かした。この結果は実験の全過程を通じて各々の緩衝
液の種類で一貫したシグナルが存在する事を示してい
る。この事は本試薬の安定性とこれがエレクトロ化学ル
ミネセンスシグナルを発生する能力がある事を示してい
る。【０１７２】実施例６７−Ｒｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ
結合体の免疫学的反応性試験：安定性に関する実験本Ｒｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩ結合体を実施例６６で述べ
た条件で希釈し、インキュベートした。試料を３、４、
及び５日目に採取し、室温にまで冷却し、Ｐａｎｄｅ
ｘ，Ｉｎｃ．，Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬより入手した
Ｐａｎｄｅｘ Ｓｃｒｅｅｎ Ｍａｃｈｉｎｅを用いて
Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＰＣＦ
ＩＡ）により免疫学的反応性をテストした。このＰＣＦ
ＩＡは競合的アッセイ方式で行なった。このラテックス
粒子（Ｐａｎｄｅｘ）をテオフィリン−ＢＳＡと結合さ
せた。これらの粒子の一定量をＲｕ（ＩＩ）−化合物Ｉ
ＩＩ結合体テスト溶液と抗テオフィリンモノクローナル
抗体（腹水、Ｈｙｃｌｏｎｅ ｃａｔ ＃Ｅ−３１２０
Ｍ、ｌｏｔ ＃ ＲＤ２００）の最終濃度まで、及び一
定量のヤギ抗マウスＩｇ−ＦＩＴＣ結合体（Ｐａｎｄｅ
ｘ、ｃａｔ ＃３３−０２−１、ｌｏｔ ＃Ｃ０１）と
混合した。インキュベーションの後、この試料を加工
し、ＰａｎｄｅｘＳｃｒｅｅｎ Ｍａｃｈｉｎｅで測定
した。この結果は５５℃で５日間のインキュベーション
の後に於いてさえ目に見えるほど活性は失われなかった
事を示している。【０１７３】実施例６８−様々なルテニウム及びオスミ
ウム化合物のエレクトロ化学ルミネセンス様々なオスミウム及びルテニウム化合物を１０ｍｌの窒
素でパージしたアセトニトリルに１０ｍＭの濃度で溶か
した溶液として、電解質には１Ｍテトラブチルアンモニ
ウムテトラフルオロホウ酸塩を用いて電気化学的に測定
した。電解用電極はＢｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｌａｆａｙｅｔｔ
ｅ，ＩＮより入手した白金ディスク電極である。白金線
対向電極と１．０ｍｍの銀線を参照電極として使用し
た。測定は走査速度１００ｍＶ／ｓｅｃで−２．２Ｖか
ら＋２．２Ｖまで（ｖｓ ＳＣＥ）走査する事により実
施した。各々の電気化学的測定の後、飽和カロメル参照
電極（ＳＣＥ）と銀線との間の電圧差を測定した。従っ
て報告される値はＳＣＥに対する電圧に補正されてい
る。エレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ）の測定を
０．１Ｍリン酸塩−クエン酸塩緩衝液（ｐＨ４．２）、
２５ｍＭシュウ酸、及び１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
を含む０．５ｍｌの水溶液中で行なった。使用した電極
システムは０．１ｍｍの白金線でＲａｄｉｏ Ｓｈａｃ
ｋ トランジスタソケット（＃２７６−５４８）に接続
された２つの白金ガーゼ（５２ゲージ）電極から構成さ
れていた。この電極は６０ｍｌのセルロースアセテート
プラスチックの薄片の外側に取り付けられた。このプラ
スチックには直径１／４インチの穴があけられており、
電解用と対向−参照電極の間を容易に溶液が流れる事の
出来るようになっている。ひとつの電極が電解用（これ
は光電子増倍管に近い）として機能し、もうひとつの電
極が対向及び参照電極として機能するためにこれらの電
極をポテンショスタットに接続した。測定は走査速度５
０ｍＶ／ｓｅｃで１．５Ｖから２．５Ｖまで（バイアス
電圧）走査して行なった。Ｅｃｌの測定は化合物の与え
られた濃度に於けるシグナル対ノイズの割合、即ち、又
はシグナル対バックグランドの割合として報告する。【０１７４】バックグランドはＥｃｌ化合物の添加され
ていない緩衝液に対し観測されるルミネセンスカウント
数と定義される。ルミネセンスの測定値は第１回目又は
第２回目の線型走査の間に観測されるピーク光出力とし
た。エレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ）及びサイク
リックボルタンメトリーの測定の双方を各々の溶液につ
いて、Ｕｒｓａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄより入手
したＥＧ ＆ ＧＭｏｄｅｌ ２７３ポテンショスタッ
ト又はビポテンショスタットを用いて実施した。各々の
ＥＣＬの測定に於ける光子流はＷｉｌｅｂａｄ，Ｗｅｓ
ｔ Ｇｅｒｍａｎｙより入手したＢｅｒｔｈｏｌｄ Ｂ
ｉｏｌｕｍａｔ ＬＢ ９５００ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅ
ｒでモニターした。この装置は０．５ｍｌの測定溶液中
に２〜３個の電極システムが設置できる様に改変されて
いる。電気化学的及びエレクトロ化学ルミネセントの測
定はともにＤｅｌｆｔ，Ｈｏｌｌａｎｄより入手したＫ
ｉｐｐ ＆ Ｚｏｎｅｎ Ｍｏｄｅｌ ＢＤ９１Ｘ、
Ｙ、Ｙ′レコーダーにより記録した。目的の化合物を
３．０ｍｌのＥＣＬ溶液に溶かすか、或いはＥＣＬ溶液
に溶けない場合はアセトニトリルに溶かして、これを５
０ｍｌ用い、蛍光の測定を行なった。測定はＰｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ−５型蛍光分光光度計で行なっ
た。最大励起波長を照射中に発光スペクトルが測定で
き、逆に、最大発光波長をモニターする間に励起スペク
トルを記録できるようにする為に、励起及び発光スペク
トルを記録する前にこの溶液の励起及び発光スペクトル
の予備走査を実施した。【表１７】 Eox Ered 蛍光発光 ECL(S/N)¹ 化合物 VS.SCE 最大値の波長 及び濃度 a) Ru(bipy)₃ 1.07V-1.52V 625 nm 1×10^-9M (2.5) b) Ru(4,4'- 1.19V N.D. 628 nm 2×10^-9M CO₂-bipy)₃ (4.05) c) Ru(4,4' CO₂ 1.54V-0.89V 636 nm 1×10^-10M -Et-bipy)₃ (2.01) d) Ru(bipy)₂ 1.17V N.D. 624 nm 1×10^-9M (C-8-theo- (.97) phylline C-4-bipy) e) Os(bipy)₂ 1.82V-0.99V 585 nm 1×10^-8M (CO)(Py) f) Os(DPPene) 1.60V N.D. 630 nm 6×10^-8M (bpy)(bpyoxal) (10.8)【０１７５】^１（Ｎ／Ｓ）はシグナルを与えられた濃
度に於ける化合物のＥＣＬ出力（ルミネセンスのカウン
ト数）として定義し、ノイズを化合物が溶解している緩
衝液自体のルミネセンスのカウントと定義した際のシグ
ナル対ノイズの割合である。ｐＨ４．２で測定したその
他の化合物のＥＣＬと異なり、化合物ｃ）は生理学的な
ｐＨ７に於いてもかなりのＥＣＬを示す。ａ） トリス（２，２′−ビピリジン）ルテニウム^２＋ｂ） トリス（４，４′−カルボン酸−２，２′−ビピ
リジン）ルテニウム^２＋ｃ） トリス（４，４′−カルボエトキシ−２，２′−
ビピリジン）ルテニウム^２＋ｄ） 二塩化ビス（２，２′−ビピリジン）〔テオフィ
リン−８−酪酸−４−（４−メチル−２，２′−ビピリ
ジン）−４′−ｙｌ）−ブチル）アミド〕ルテニウム
（ＩＩ）ｅ） ジヘキサフルオロリン酸〔ビス−（２，２′−ビ
ピリジン）｛モノカルボニル｝ピリジル〕オスミウム
（ＩＩ）ｆ） 二塩化（２，２′−ビピリジン〔シス−ビス
（１，２−ジフェニルホスフィン）エテレン〕｛２−
〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イ
ル）プロピル〕−１，３−ジオキソラン｝オスミウム
（ＩＩ）以上に示したように実施例６５から６８ではシュウ酸と
ともにＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて、エレクトロ化
学ルミネスセンスの測定が効率良く行うことができた。【０１７６】実施例６９−ビス（２，２′−ビピリジ
ン）〔４−（４′−メチル−２，２′−ビピリジン）ブ
チルアミン〕ルテニウム（ＩＩ）二過塩素酸１．２９ｇ（２．４８ｍ ｍｏｌ）の二塩化ビス−
（２，２′−ピリジン）ルテニウム（ＩＩ）二水和物
（Ｓｔｒｅｍ）及び０．７１９ｇ（２．９８ｍ ｍｏ
ｌ）の４−〔４−（１−アミノブチル）〕４′−メチル
−２，２′−ビピリジン（実施例３２で記載されてい
る）を５０ｍｌの５０／５０エタノール／Ｈ₂Ｏに懸濁
し、アルゴン存在下で３時間還流した。この反応溶液を
濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５のクロマトグラフ
ィーによる分離を行ない、最初に蒸留水で、続いて０．
２５Ｍ ＮａＣｌで溶出した。最後に０．４Ｍ ＮａＣ
ｌで溶出させた。本生成物を含むフラクションを約１０
０ｍｌまで濃縮し、この溶液が濁るまで過塩素酸を加え
た。一晩冷蔵し、本生成物の赤橙色結晶（１．２１５
ｇ）を得た。元素分析の結果構造は以下の様に確認され
た：【化４７】【０１７７】実施例７０−テオフィリン−８−（３，３
−ジメチル）酪酸の製法５，６−ジアミノ，Ｎ¹，Ｎ³−ジメチルウラシル水和
物（１０ｇ、０．０５９ｍｏｌ）及び３，３−ジメチル
グルタミン酸無水物（１２．６ｇ、８．８５×１０^-2ｍ
ｏｌ）を１００ｍｌ Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンに溶か
し、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを使って還流した。
この反応の内容物は加熱後可溶化し、橙赤色に変化し
た。４時間の還流後、１ｍｌの水がこのトラップ中に集
まった。これはこの反応の完了を示している。この反応
物を室温まで冷却した。この時、全体が固まっていた。
この固体をｆｒｉｔｔｅｄ ｆｕｎｎｅｌ上で濾過し、
色が淡黄色になるまで洗った。ＤＭＦから２回再結晶さ
せた後、中間生成物であるラクタムの純粋な白色結晶
（融点２８３．１−２８４．９℃）を得た。このラクタ
ムを水の中で８時間煮沸した。冷却するとこの溶液から
純粋な白色の結晶（融点２１８−２２０℃）が生じた。
プロトンＮＭＲと元素分析から以下の構造が確認され
た：【化４８】【０１７８】実施例７１−ビス−（２，２′−ビピリジ
ン）〔テオフィリン−８−（３，３−ジメチル酪酸−
｛４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ｙ
ｌ）−ブチル｝アミドルテニウム（ＩＩ）二過塩素酸１００ｍｇ（０．３４ｍ ｍｏｌ）のテオフィリン−８
−（３，３−ジメチル）酪酸及び０．３２５ｇ（０．３
４ｍ ｍｏｌ）の二過塩素酸ビス（２，２′−ピリジ
ン）〔４−（４′−メチル−２，２′−ビピリジン）ブ
チルアミンルテニウム（ＩＩ）を０．３５１ｇ（１．７
ｍ ｍｏｌ）のジシクロヘキシルカルボジイミドと共に
１０ｍｌの無水ピリジンに溶かした。２日間攪拌して反
応させた。多量のジシクロヘキシル尿素の沈殿を濾過に
より除去し、真空状態でこのピリジン溶液を濃縮した。
この残留物をメタノールに溶かし、Ｓｅｐｈａｄｅｘ
ＬＨ−２０のクロマトグラフにかけた。目的とするフラ
クションを濃縮し、生成物をエーテルで沈殿させ、橙色
の沈殿物を得た。元素分析とプロトンＮＭＲの結果、構
造は以下のとおりである：【化４９】【０１７９】実施例７２−テオフィリン−８−プロピル
（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ブチル）
カルボン酸アミドの製法６１．８ｍｇ（１．５５×１０^-4ｍｏｌ）の８−（ガン
マ−アミノプロピル）テオフィリンフタル酸ヒドラジド
塩を１ｍｌの水に溶かし、ＨＣｌで酸性にした。沈殿さ
せたフタル酸のヒドラジドを濾過により除去し、水溶性
の濾液を蒸発乾固し、真空中で乾燥させて３４．５ｍｇ
（１．３１×１０^-4ｍｏｌ）のテオフィリン−８−プロ
ピルアミン塩酸塩を得た。この物質を５ｍｌの無水ピリ
ジンに溶かし、３６．９ｍｇ（１．４４×１０^-4ｍｏ
ｌ）の４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′
−ｙｌ）酪酸と２６．４ｍｇ（２．６２×１０^-4ｍｏ
ｌ）のトリエチルアミンをこれに加えた。最後に２９．
７ｍｇ（１．４４×１０^-4ｍｏｌ）のジシクロヘキシル
カルボジイミドをこの溶液に加えた。得られた濁った溶
液を一晩攪拌した。沈殿した塩とジシクロヘキシル尿素
を濾過により除去し、この溶液を蒸発乾固させて白色固
体を得、これを溶出剤として５％のメタノールを含むジ
クロロメタンを用いたアルミナのクロマトグラフにかけ
た。生成物は白色粉末（融点２１５°−２１６．５℃）
として４４．２ｍｇ（７１％）得られた。プロトンＮＭ
Ｒ及び元素分析により以下の構造が確かめられた：【化５０】【０１８０】実施例７３−二塩化ビス−（２，２′−ビ
ピリジン）〔テオフィリン−８−プロピル（４−メチル
−２，２′−ビピリジン−４′−ブチル）カルボンアミ
ド〕ルテニウム（ＩＩ）の製法１００ｍｇ（２．０６×１０^-4ｍｏｌ）の二塩化ビス
（２，２′−ビピリジン）ルテニウム（Ｓｔｒｅｍ）及
び１０８ｍｇ（２．２７×１０^-4ｍｏｌ）のテオフィリ
ン−８−プロピル（４−メチル−２，２′−ビピリジン
−４′−ブチル）カルボンイミドをアルゴンで脱気した
５０％エタノールに加えた。この溶液を加熱還流した。
得られたチェリーレッドの溶液を室温で高真空で濃縮し
た。この残留物を溶出剤にメタノールを用いてＳｅｐｈ
ａｄｅｘ ＬＨ−２０（７５ｃｍ×１９ｍｍ Ｉ．
Ｄ．）でクロマトグラフした。生成物のバンドを分離
し、溶媒をとばして、無水エーテル中に入れ沈殿させ
た。本生成物の収量は１５６ｍｇ（７５％）であった。
元素分析の結果、本生成物中には４モルのメタノールが
存在している事が示された。分析結果：計算上；Ｃ，５４．０９；Ｈ，５．６５；
Ｎ，１４．１６；Ｏ，１０．２９；Ｃｌ，６．５２：実
測；Ｃ，５３．３０；Ｈ，５．２２；Ｎ，１４．５６；
Ｏ，１０．６３及びＣｌ，６．９５。【化５１】【０１８１】実施例７４−二過塩素酸ビス（２，２′−
ビピリジン）〔１−ブロモ−４−（４′−メチル−２，
２′−ビピリジン−４−ｙｌ）ブタン〕ルテニウム（Ｉ
Ｉ）の製法実施例３１で調製された配位子１−ブロモ−４−（４′
−メチル−２，２′−ビピリジン−４−ｙｌ）ブタンを
０．２９ｇ及び二塩化ビス（２，２′−ビピリジン）ル
テニウム（ＩＩ）を０．３２ｇ、６０ｍｌの１：１ｖ／
ｖエタノール／水の入ったフラスコに入れた。この溶液
を窒素で１５分間脱気した。反応は窒素中で３．５時間
加熱還流して行なった。ＮａＣｌＯ₄の飽和水溶液を冷
却したこの赤色溶液に加えた。真空下で溶媒を除き、深
赤色の残留物を溶離剤としてアセトニトリル／トルエン
１：１ｖ／ｖを用いたアルミナのカラムクロマト（２０
ｃｍ×２．５ｃｍ、Ｍｅｒｃｋ、天然活性３）にかけ
た。本生成物はカラムより暗赤色のバンド（バンド＃
２）として溶出した。目的とするフラクションを集め、
約１０ｍｌのジクロロメタンに再び溶かし、無水エチル
エーテルより沈殿させ、最後に真空下で乾燥させて３２
０ｍｇ（５３％）の収量の本生成物を得た。本生成物の
構造は元素分析とスペクトル特性により確認され、以下
に示す。【化５２】【０１８２】実施例７５−二過塩素酸ビス（２，２′−
ビピリジン〔テオフィリン−９−〔４−（４−メチル−
２，２′−ビピリジン−４′−ｙｌ）ブタン〕ルテニウ
ム（ＩＩ）の製法テオフィリンの銀塩はテオフィリンのアンモニア溶液
（２５ｍｌ ｃｏｎｃ．ＮＨ₄ＯＨ及び７５ｍｌの水中
に２．１６８ｇ）と硝酸銀のアンモニア溶液（１０ｍｌ
ｃｏｎｃ． ＮＨ₄ＯＨ及び３０ｍｌ Ｈ₂Ｏ中に
２．００６ｇ）を共に混合し、暗い状態で反応させる事
により調製した。この２つの溶液を混合させた直後、白
色の生成物が出現した。生成物の沈殿が完了したら、こ
の沈殿物を６０ｍｌ ｍｅｄｉｕｍ ｇｌａｓｓ ｆｒ
ｉｔ上で濾過する事により集めた。この沈殿物を希アン
モニア水で洗浄し、真空下で乾燥させた。テオフィリン
の銀塩の構造は元素分析により確認した。４１ｍｇのテ
オフィリンの銀塩及び１２２ｍｇの二過塩素酸ビス
（２，２′−ビピリジン）〔１−ブロモ−４−（４′−
メチル−２，２′−ビピリジン−４−ｙｌ）ブタン〕ル
テニウム（ＩＩ）を１５ｍｌの無水ジメチルホルムアミ
ド（ＤＭＦ）に溶かし、反応は暗条件で行なった。得ら
れた赤色溶液はアルゴンで脱気し、２４時間加熱還流
し、次に室温までアルゴン存在下で冷却した。この溶液
の冷却は氷点まで続け、次にこの黒色の銀金属懸濁液を
濾過し、５ｍｌのアセトンで洗浄した。赤色の濾液を
０．２ｇの過塩素酸ルテニウムで処理し、ＬｉＣｌＯ₄
を溶解した後この溶液を真空下で蒸発乾固させ、赤色の
残留物を暗条件で一晩真空中に置き乾燥させた。この試
料を３−５ｍｌのメタノールに溶かし、０．２５ｇの無
水ＬｉＣｌＯ₄を加え、溶かした。得られた溶液は溶出
剤にメタノールを使用したＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２
０のカラム（７５ｃｍ×１９ｃｍ ｉ．ｄ．）にかけ
た。主生成物はフラクション＃２（暗赤色バンド）とし
て溶出した。フラクション＃２を濃縮し、メタノールに
再び溶かし、エチルエーテルに注いで沈殿させた。この
生成物を真空下で乾燥させ、８０ｍｇ（５０％収率）の
物質を得た。この構造は元素分析と赤外線及び発光スペ
クトルで確認した。【化５３】【０１８３】引用文献１． Ｗｅｂｅｒ，Ｓ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｔ
ｏｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ：Ｐｏｓｓｉｂｌｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ
ｉｎ Ｓｅｒｕｍ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｓ（２，２′−ｂｙｐ
ｙｒｉｄｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｉｎ ｔ
ｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎ
ｔｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｙ，２９，１
６６５−１６７２（１９８３）。２． Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｉ． ａｎｄ Ｂａｒ
ｄ，Ａ．Ｊ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｃ
ｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．３７．Ａｑｕｅｏ
ｕｓ ＥＣＬ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｒ
ｕ（２，２′−ｂｙｐｙｒｉｄｉｎｅ）₃²⁺ ａｎｄ
Ｏｘａｌａｔｅ ｏｒＯｒｇａｎｉｃ Ａｃｉｄｓ，
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３，５１２−５１
６（１９８１）。３． Ｗｈｉｔｅ，Ｈ．Ｓ． ａｎｄ Ｂａｒｄ，Ａ．
Ｊ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｃｈｅｍｉ
ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．４１．Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅ
ｎｅｒａｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ
ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ
ｔｈｅ Ｒｕ（２，２′−ｂｐｙ）₃²⁺−Ｓ₂Ｏ₈^-2
Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ Ｗ
ａｔｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．，１０４，６８９１（１９８２）。４． Ｃｕｒｔｉｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｌ
ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ；Ａ Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｓｅｐａｒａｔｅｄ Ｂｙ Ｔ
ｈｉｎ Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，
Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１３４，３４３−
３５０（１９７７）。５． Ｓｐｒｉｎｔｓｃｈｎｉｋ，Ｇ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆＳｕｒｆ
ａｃｔａｎｔ Ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）Ｃｏｍｐｌ
ｅｘｅｓ ｉｎ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ Ａｓｓｅｍｂｌ
ｉｅｓ ａｎｄ ａｔＷａｔｅｒ−Ｓｏｌｉｄ Ｉｎｔ
ｅｒｆａｃｅ，Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９９，
４９４７−４９５４（１９７７）。６． Ｍｉｎｎｉｃｈ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎ
ｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅ
ｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ ｉｎ Ｆ
ｏｏｄｓ，Ａｐｐｌ． ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍ
ｉｃｒｏ．，４３，１１２４−１１２７（１９８２）。【０１８４】７． Ｔｈｏｍａｓｏｎ，Ｂ．Ｍ．，Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｆｏｒＳ
ａｌｍｏｎｅｌｌａｅ，Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ．，４
４，３８１−３８４（１９８１）。８． Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｊ．Ａ．，Ａｎ Ｅｎｚｙ
ｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅ
ｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｌ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
Ｕｓｉｎｇ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａ
Ｍｙｅｌｏｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ａ Ｈｙ
ｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈ．，７３，１４７−１５６（１９８４）。９． Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｎ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅ
ｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ
ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉ
ｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ
ａｎｄ ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｃｏ
ｍｐａｒｉｓｏｎｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｄ
ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｙｓｔ
ｅｍｓ，Ａｐｐｌ． ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃ
ｒｏ．，ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏ
ｎ．１０． Ａｍｅｒｉｃａｎ ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔ
ｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ
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ｃｕｌａｒ ｆｉｌｔｅｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｔ
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３０：２４５−２５２（１９５８）。１９． Ｍｅａｄ，Ｊ．Ａ．Ｒ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．
Ｎ．，ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｔ．，Ｔｈｅ
ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅｇｌｕｃｕｒ
ｏｎｉｄｅｓ ｏｆ ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ ａ
ｎｄ４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ ａ
ｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔ
ｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ ｂｅｔａ−
ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．６
１：５６９−５７４（１９５４）。２０． Ｏｌｓｏｎ，Ｂ．Ｈ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａ
ｃｃｕｒａｃｙ ｏｆｃｏｌｉｆｏｒｍ ｔｅｓｔｉｎ
ｇ ｉｎ ｓｅａｗａｔｅｒ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ−ｐｒｏｂａｂｌｅ
−ｎｕｍｂｅｒ ｍｅｔｈｏｄ．Ａｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３６：４３８−４４４（１９
７８）。２１． Ｐｒｅｓｎｅｌｌ，Ｍ．Ｗ．，Ｅｖａｌｕａｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｎｇ ｃｏｌ
ｉｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｆｅｃａｌ ｃｏｌｉｆｏｒｍ
ｓｉｎ ｅｓｔｕａｒｉｎｅ ｗａｔｅｒｓ，Ｐｒｏ
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ｉｏｎ ｏｆ ｍＦＣ ｍｅｄｉｕｍ ｂｙ ｅｌｉｍ
ｉｎａｔｉｎｇ ｒｏｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ，Ａｐｐ
ｌ． Ｅｕｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：９
０−９４（１９７８）。２３． Ｗａｒｒ，Ｇ．Ｗ．，ａｎｄ Ｍａｒｃｈａｌ
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Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙａ
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Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃ
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Ｍａｎｕａｌ，Ｐ．１５０−１６０，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８２）。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION[0001][Industrial applications] Publications related to this application are in parentheses
In Arabic numerals. The citation list for these references is
It is listed at the end of the description just before the claims.
Full descriptions of these publications should be provided in
Thereby more fully explain the state of the art relevant to the present invention
References to this application so that
You. Detect and quantify chemical, biochemical, and biological substances
There is always a need for fast and highly specific methods for
Demand is growing. Especially small amounts of drugs, metabolites,
For measuring biological and other diagnostically valuable materials
The method is important. Examples of such materials include drugs and drugs.
Poisons, drugs, hormones, or diseases administered for therapeutic purposes
Microorganisms and viruses, antibodies, metabolites, and enzymes
And nucleic acids.[0002]2. Description of the Related Art The existence of such materials has a
Are often detected using the binding method
Many biochemical and biological systems have been characterized
I have. Examples of frequently used methods include antigen-
Antibody system, nucleic acid hybridization method, protein-ligand
System. Such methods usually involve complex materials
Detectable mark on one or more of
The presence or absence of a “label” reveals the existence of a diagnostically useful complex
It's easy. Depending on the specific labeling method chosen,
The availability and versatility of special systems for the detection of such materials has been determined.
Often round. Preferred labeling conditions are inexpensive
Safe and versatile chemical, biochemical, raw
Effective without changing the important bonding properties of the physical material
It is necessary to be able to label those materials efficiently. Mark
Knowledge must have highly distinctive landmarks,
Moreover, little or more preferably at all in nature
It must be absent. The label is stable
It can be detected in aqueous systems over a period of months.
Is required. Expensive special equipment and
Quick, high sensitivity and re-
The label must be detected with a certainty. Sign
In quantifying the substance, the temperature and composition of the test mixture
Need to be relatively insensitive to changing factors.
Separation of homogeneous and complex labeled and uncomplexed materials
Labels are most useful in systems that do not require
It is. Labeled material is incorporated into a specific complex
This can be achieved by adjusting the detection
Noh.[0003] Numerous types of markers have been developed.
Each has its strengths and weaknesses. For example, a radioactive marker
Knowledge is extremely versatile and can be used at very low concentrations.
Can be detected. However, it is expensive and dangerous.
Use of sophisticated equipment and trained technicians
is necessary. In addition, the sensitivity of the radiolabel
The events that can be detected in a material are radiation in nature
Limited by the fact that it occurs only once per sex atom
Will be determined. In addition, radioactive label
I can not use it.[0004] Therefore, there has been a great deal of interest in non-radioactive labels.
waiting. For example, spectrophotometry, spin resonance, luminescence
Producing molecules that can be detected by
It includes enzymes that can be used. Useful non-radioactive labeling materials
There are organometallic compounds in the mixture. Certain metals are biological
Organometallic compounds because they are rare in
A method for specifically testing a metal component in a product is effective.
For example, Cais, US Patent No. 4,205,952
(1980) describe a method for quantifying specific antigens.
Immunochemically active materials labeled with organometallic compounds
You are using Selected for such labels
Emission, absorption, fluorescence spectroscopy, atomic absorption
Use any of the common techniques, including light, neutron activation, etc.
Wear. These methods have the disadvantage of low sensitivity
And it is hardly applicable to homogeneous systems. Also atomic absorption
Light sometimes involves destruction of the sample. Photochemical, chemical
Made to emit light through chemical and electrochemical means
Signs are particularly interesting. What is "photochemiluminescence"?
Made to emit light when the material absorbs electromagnetic radiation
It is a process. Fluorescence and phosphorescence are part of photochemiluminescence.
Is a seed. The “chemiluminescence” process involves energy
It is accompanied by production of luminescent material by chemical conversion. "Elect
Toro chemiluminescence ”includes electrochemically produced sources.
A light object accompanies.The importance of such light emitting systems is increasing.
You. See, for example, Nandle, U.S. Pat.
2,745 (1983) is in the field of immunochemical applications
Using chemiluminescent labels. In this system
Label is H_TwoO_TwoBy reacting with oxalate
The label is excited to a luminescent state by biological means.
In this system, H_TwoO_TwoOxidizes oxalate to increase energy
Conversion to a derivative, which in turn excites the label.
You. This system is in principle safe under oxidizing conditions in the test.
And excited by high energy oxalate derivatives
Any material that can be used can be used. Remaining
Remember, this is a very flexible technology
Will be a major factor in the limitations. Raw containing the analyte
Physical solutions generally also contain large amounts of luminescent substances.
High luminescence background
Cause[0006] In the immunochemical application of chemiluminescence,
Another example with beam-like disadvantages is Oberhar
dt et al., U.S. Patent No. 4,280,815 (198).
1 year), labeled by chemiluminescence
Very similar to selected immune reactantsinsi
tuOxidizing agent (eg, H_TwoO_Two) Of electrochemical production
Talk about life. Oxidane produced electrically
Is diffused into the chemiluminescent substance and chemically
To produce one or more electrons electrically
To an oxidant. Chemiluminescent substances
Emit photons when oxidized. In contrast, the object of the present invention
Now, the chemiluminescent substance from the electrochemical energy source
A direct electron transfer to the quality is required, which
Continuous release is possible.[0007]SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to
It relates to a chemiluminescent label. Proper sign
Substances containing organic compounds and organometallic compounds
One consisting of a Toro chemiluminescent compound is used. Many
Methods for detecting the presence of labeled material
Of electrochemiluminescence methods than other methods
Is more suitable. Highly judging the presence of specific markers
High sensitivity, low risk, low cost,
Wide range of applications. Organizing suitable for electrochemical labeling
Compounds include, for example, rubrene and 9,10-diphenylant
There are spirals. Many of the organometallic compounds are electrochemical markers
Suitable as intellectuals, especially ruthenium and osmium
System containing compounds are useful.For this reason, in one specific example, the present invention
Ruthenium and males detectable using a variety of methods
It describes the use of labels containing Mium. these
Signs are useful in many ways, as discussed in the text below.
Things. Ruthenium and osmium containing organometallics
Compounds are also discussed in the literature. Cais
There are metal elements including the 8th group of noble metals such as ruthenium
Or any combination of such metal elements
Components of organometallic labels detectable by atomic absorption spectrometry
(Cais, column 11 20)
line). However, in Cais's literature, ruthenium is suitable.
It is not considered to be a sharp metal and mentions osmium in particular
Not specified, ruthenium or
Data on the effectiveness of using osmium
Atomic absorption spectrometry not included and considered appropriate
Is accompanied by destruction of the sample.[0009] Weber, US Patent No. 4,29
3,310 (1981) is the fraction in the immunoassay.
Ruthenium and osmium as electrochemically labeled deposits
Has reported on the use of a complex containing a system.
This complex is converted to an amino group through the thiourea bond of the analyte.
Are combined. Weber also monitors the hydroxyl groups of other analytes.
Possible to form carboxylester with label
It is said that there is also. Labeled according to Weber
The presence of the material depends on the use of quenchers and optical
It is said that it can be detected with a device and method consisting of a flow cell
is there. When the photoelectrochemically active label is excited, the electron
To the quencher molecule. The oxidized molecule then
Electrons from the electrodes of the flow cell maintained at an appropriate potential
Is reduced. Since this electron is measured as a photoelectron flow,
is there. Free labeled analytes in the system are measured by photocurrent signals.
Set. This method uses electrochemiluminescence for luminescent materials.
Note that this is the opposite of sense detection.In a subsequent report, Weber et al.
Questions when using this method to detect
The topic is discussed (1). Weber et al. (1)
According to Table 2, tris (bipyridyl) ruthenium (I
The extrapolation detection limit of I) is 1.1 × 10 under optimal conditions.^-TenMo
/ L. Use these labels in practice
Measurement in the presence of a complex mixture.
Anticipating that Weber et al.
Investigations were conducted on the obstacles Table 3 of Weber et al.
Methylalkylamines, EDTA, N-methylmorpho
Phosphorus, N, N'-dimethylpiperazine, hydroxide,
Urate, ascorbate, uric acid, serum, etc.
1.1 × 10^-TenWhen it is raised to mol / l or more
Listed as a possible obstruction. These studies
Is performed using simple ruthenium-containing compounds.
You. Detection of complexes labeled with ruthenium-containing labels
Labeled for emission limits and under these test conditions
The thiourea bond between the damaged material and the label is stable
The description of whether or not Weber or Weber
It was not in their report.The label in the present invention is an electrochemical
It is about luminescence. This sign is electromagnetic radiation
Wire or oxalate-H_TwoO_TwoProduced by a representative system such as
Oxidation or contact by contact with the generated chemical energy source
Can be excited to a luminescent state even if it is not reduced
Many. Further electrochemical methods involving oxidation and reduction
Can also cause these compounds to emit light. Photochemistry
Luminescence, chemiluminescence, electrochemiluminescence
Ruthenium (2,2-bipyridyl)
N)_Three2⁺Research reports on how to detect
(2, 3). In this study, oxalate ions and
Or strong intermediates produced as intermediates in the oxidation of other organic acids
Ruthenium produced chemically or electrically with the base agent
Mu (bpy)_Three³⁺("Bpy" is the bipyridyl ligand
A) bright orange chemiluminescence by aqueous reaction
States that essence can be obtained. In addition,
Electric or with a strong reducing agent produced during the reduction
Chemically generated ruthenium (bpy)_Three¹⁺To the reaction
Therefore, obtaining luminescence in organic solvent-water solution
Is also possible. Ruthenium (bpy)_Three²⁺Elect from
As a third mechanism for obtaining chemiluminescence
Changes the potential of the electrode to ruthenium (bpy)_Three¹⁺Produces
Enough negative potential and ruthenium (bpy)_Three³⁺To
To oscillate between enough positive potential to produce
There is a way. The above three methods are referred to as “redox
Yuan "," reduction oxidation "," ruthenium (bpy)_Three^{3 + / +}Again
It is called "raw."The oxidation-reduction method can be performed in water.
Efficient, stable luminescence, oxygen and impurities
Relatively insensitive to the presence of objects. This Ruteniu
Mu (bpy)_Three²⁺Luminescence from oxalate and
Other pyruvate, lactate, malonate, tartrate,
Organic acids such as citrate, and ruthenium (bpy)_Three^Three
+Obtained when there is a means capable of producing oxidatively
You. This oxidation is Pbo_TwoAnd cerium (IV) salts
Can be caused chemically by strong oxidants. Also
Apply a sufficiently positive potential continuously or intermittently
Can also be caused electrochemically. Lute
Nium (bpy)_Three²⁺Suitable for electrochemical oxidation of
Suitable electrodes include, for example, platinum, pyrolytic
And glass carbon. Oxalate and other
Organic acids are consumed in the process of producing chemiluminescence
However, excessively adding materials that are consumed in this way
Or supply continuously into the reaction chamber.
Strong and constant chemiluminescence for hours
Obtainable.The reductive oxidation method is, for example, an acetonitrile method.
Can be carried out in a partial aqueous solution containing an organic co-solvent
You. This luminescence consists of disulfuric peroxide, ruthenium
(Bpy)_Three¹⁺Means that can be reductively produced
Obtained in the case. This reduction can be, for example, magnesium or other
Can be caused chemically by strong reducing agents such as metals
it can. Also, continuously or intermittently enough minus
What happens electrochemically by applying a certain potential
Can also. Ruthenium (bpy)_Three²⁺The electrochemical return
For example, a glossy glass
There is a Bonn. As with the redox method, excess reagent
Add the reagents or add the reagents
How many hours of continuous strong luminescence depending on the supply
Can be obtained forRuthenium (bpy)_Three^{3 + / +}The playback system is Ase
In organic solvents such as tonitrile or in partially aqueous solutions
Then, the potential of the electrode is changed to ruthenium (bpy)._Three²⁺Reduce
Enough negative potential and ruthenium (bpy)_Three²⁺To
Oscillating between positive potentials sufficient to oxidize
Therefore, it can be performed. A suitable power supply for such a regeneration system
The pole is, for example, a platinum electrode. In this system
Chemical reagents are not consumed, and in principle they can continue indefinitely
It is possible. Ru of the above three types of ruthenium-containing compounds
Methods for producing luminescence include ruthenium-containing compounds.
The common point is the repetitive redox or reductive oxidation of
is there. Therefore, the luminescence of a solution containing these compounds
The energy potential of a given energy source
It is strongly dependent on
The presence can be detected with high sensitivity.Mantle reports from Curtis et al.
(4) is a marker that can be used as an application of chemiluminescence.
Quoted as insight. Curtis et al. Unreleased day
The ruthenium complex is oxalate / H
_TwoO_TwoEmit light when chemically excited by the system
(Curtis et al., P. 350) Ma
Both ndle and Curtis are ruthenium and osmium compounds
That coalescence is useful as a chemiluminescence application field.
Is useful in electrochemiluminescence systems
Is not aware. Sprintschnik, G et al.
(5) is octadecanol or dehydrocholesterol
(2,2'-bipyridi) esterified with
N) Report on ruthenium (II)
A monolayer film of the activator complex was produced. This complex is
Emit optical luminescence. But immerse the film in water
When exposed to light, the ruthenium complex becomes optically luminescent.
No longer emits This is because of the ester group in the presence of light
This is because optical hydrolysis occurs. Amide bond or
A wide variety of analytes and analytes through amine bonds
Ruthenium-containing or ozone-bound chemical species
Developed a method for easily labeling smium-containing labels
I will report below. The material thus labeled is
Analyzes can be performed using a large number of means, but the most
The most efficient, reliable and sensitive method is optical luminescence.
Sensing, chemiluminescence, electrochemiluminescence
It is a method using. Also contains ruthenium and osmium
Electrochemiluminescent labels, such as
Product, rubrene and 9,10-diphenylanthracene
Such organic molecules are particularly versatile and effective
Is also described below. Use of such new labeling materials
And how to use them and how to detect them
These advantages are discussed in more detail below.Food companies have been working with raw food ingredients and
On the presence of biological and chemical contaminants in processed foods
I am interested. Contamination in food due to technological advances
Material contamination and consequent food-borne illnesses are reduced.
The detection and identification of food contaminants, albeit slightly
Progress in the development of fast and sensitive methods for
Not seen at all. Detect harmful contaminants in food
Existing standard methods of doing are generally very time consuming
It is labor intensive and technically difficult. Analysis method
The body can be detected even if it is mostly sensitive
The sample preparation process before the
Negative, often poor quality recovery
Often, a misjudgment is made. like this
Examples of problems include Salmonella and St.
aphylococcus enterotoxin in food
Currently used to detect if it is present in
These are two examples of the standard method. Salmonell in food
When detecting a, these bacteria are present in the food
But usually only a small number inhabit
Several enrichment stages, as they are often
Have been. For this reason, Salmonella detection method is
Sensitive, resuscitate and grow damaged cells
It must be something like that.Currently, Salmonella detection method is
The US Food and Drug Administration has recommended two
I have. These methods are based on Bacteriological.
  Analytical Manual for Fo
ods (1984) Sixth Edition, Association
  of Official AnalyticalCh
emis, Washington, DC. Described in
Have been. One of them is preconcentration, selective enrichment, and selective enrichment.
It is a pure culture technique that includes plating,
It takes 4 days to get it and 5-7 days to get the full result
I do. Another method uses selective enrichment followed by immunofluorescence.
Is what it is. This method is faster, but
The problem that the polyvalent antiserum used is cross-reactive
Are often misjudged as positive.
It can happen at a rate (6,7). Staphylo in food
coccus enterotoxin
Bacter also recommends a method recommended by the Food and Drug Administration
iologicalAnalytical Manua
l for Foods (1984) Sixth Edition, Ass
Occasion of Official Anal
yticalChemists, Washingto
n, DC. It is described in. This method requires a lot of food
The number of dialysis concentrates of a sample, for example, an extract of about 100 g
Concentrate to a small amount of about 0.2 ml through the steps,
Trial to prepare as slide double immunodiffusion sample
The feed extract is purified by means of an ion exchange column. This one
It usually takes one week or more to perform the method.Bacteria, toxins, antibiotics and pesticides in food
Faster test methods to detect various contaminants such as
It is being developed recently. But often before testing
Labor and time are still required to prepare the sample. Radioy
Munoassay (RIA) and enzyme-labeled immunosorbent
When the analysis method itself is performed by the assay (ELISA)
Although the time has been reduced, such a method is still labor intensive.
It requires power and is not easy to implement. Sa
In addition, these methods are usually multivalent with varying specificities and sensitivities.
Based on the use of antisera, such food contaminants
There is often a lack of quantity for quality testing. E
LISA is a monoclonal antibody, not a polyvalent antiserum
Is a method developed for analyzing food samples using
You. Use of monoclonal antibodies in test systems for food contaminants
A consistent supply of reagents
In this way, the constant specificity and sensitivity of the test itself are guaranteed. E
In the LISA system, Salmonella (8) or Stap
like enterocoxin (9)
Monoclonal antibodies can be used to test
It has been. EIA method (Bio-Enzabead)
Screen Kit, Littleton Bionetti
cs) and the DNA probe technique (Gene-Trak,
City with Integrated Genetics
Sales of Salmonella detection products take time
It also requires labor. Reverse passive latex agglutination (SET-
RPLA, Denka Seiken Co. ) And E
IA method (SET-EIA, Dr. W. Bommeli
Laboratories) and St in commercial foods
aphylococcus enterotoxin detection products
Have similar disadvantages. Water and sewage pollution
Bacteria for the last 100 years as indicators for managementEsc
herichiacoliAnd E. coli type group are widely used
It has been.The presentE.coliAnd / or Escherichia coli type group
The method used for the detection of acid from fermentation of lactose
Or based on the properties of gas production. Most widely used
The most common methods are the maximum possible bacterial count (MPN) test and membrane filtration (M
F) Test. Microbiological analysis of water and sewage in both methods
Environmental Protection Agency (EPA) and US Public Health
Approved by the Association (APHA) (10), milk
Food and Drug Administration (FD)
A) has also been approved. (11). MPN method
In fact it consists of three (12) separate tests (1
0). In the putative test, tryptose lauryl sulfate
(LST) Non-selective media such as broth or lactose broth
To investigate gas production by lactose fermentation. Next gas release
Test tubes that were live positive in a more selective medium
Perform subculture. Brilliant guri for culture of Escherichia coli
Lactose bile acid (BGLB) broth was added to fecal coliforms
For the culture ofE.coli(EC) Use broth and gas
The production is checked again (confirmation test). Confirmation test positive
The sample exhibiting the property was further subjected to eosin methylene blue (EM
B) On selective differentiation medium such as agar medium or Endo agar medium
To clearly demonstrate the presence of indicator bacteria
Perform Gram stain and other biochemical tests for
test). Up to 5 days to complete MPN test
(5) Most laboratories routine water analysis
Only the estimation and confirmation tests of the MPN test
And still have 48-72 hours to finish
It costs. MPN testing is time consuming and costly in terms of materials
Erroneous judgment of positive and negative
Often occur (15, 16, 20).MF method introduced as a microbiological test method for water
It was done in the early 1950s (12). Redundant
Unlike the time-consuming MPN test, the MF analysis is
It is completed in a while and there is no need for further confirmation. Basic hands of MF method
The order is as follows. A certain amount of water sample, usually 100 ml
Was filtered through a 0.45 μm pore size filter paper.
Culture on sterile pad filled with. Most commonly used
Medium at 35 ° C and 4 ml of E. coli-type selective broth.
Two types of mFC broth that are selective for fecal coliform at 4.5 ° C
(10). These media will be used
Since then, many authors have shared m Endo and mFC broth.
Tend to calculate less than the actual number of indicator bacteria actually present
Has been reported. This is the media selectivity, or
Depending on the high temperature (44.5 ° C) used for the culture
(21, 22). Bacteria in the sample are environmental factors
And / or near lethal damage from chemicals
Are particularly prone to such negative judgments.
(17, 18). Recently confirmed MF test by EPA
An improved method has been proposed to compensate using a static procedure.
According to this, L is similar to BGLB broth in MPN test.
Check the gas production using ST broth.
There must be as low as 10 colonies (14). this
Using the improved method will reduce both negative and positive misjudgments.
However, the time required for the MF test due to the high material cost
It triples from 24 hours to 72 hours.In 1982, Feng and Hartman
4-methylumbelliferone lucuronide (MUG)
Used as substrateE.coliFluorescence generation for detection
A test was introduced (13).E.coliCells are β-g
Produces the enzyme lucuronidase,
4-methylumbelliferone la that cleaves and fluoresces
It releases dicals (19). Promote MUG compounds
By adding to the constant test LST medium, LST-M
Estimated data on fecal coliforms in one test tube of UG medium
Data (gas production) and confirmation data (fluorescence) both at 24:00
Within a short time. MUG testing is fast and easy
Simply,E.coliOnly 85-95% of this enzyme
Does not produce (depending on source), testing is 100% reliable
It does not have sex. This system is also suitable for E. coli
I can't use it. E. coli type and fecal colon in one sample at present
There is no suitable test for detecting and counting bacterial types. Easy and quick
If fast and reliable detection tests are developed, costs and time
Not only saves time, but also provides water supply, food processing,
Management of treatment will be much more efficient.[0022]SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a pre-measured
Volume of a multi-component liquid sample, approximately 10^-3Mo
To detect target analytes present at sub-
It relates to the law and consists of the following parts.
a) the sample is (i) the reagent can emit radiation repeatedly
Receive a certain amount of electrochemical energy from a suitable source such as
Repeatedly emits electromagnetic radiation when
(Ii) a test that can bind to the analyte of interest;
Contact with medicine. However, the maximum binding time between analyte and reagent
Contact under appropriate conditions. b) Sample obtained in this way
A suitable source so that the reagents can emit repeated radiation
Gives a constant amount of electrochemical energy from But try
Optimal conditions under which the drug can repeatedly emit electromagnetic radiation
Give in. c) the electromagnetic radiation emitted in this way
Detection, thereby detecting the presence of the analyte in the sample.
You.The present invention also relates to a pre-measured amount of a multicomponent liquid.
In body samples, about 10^-3Sub-molar concentration
Competitive methods for detecting analytes of interest present in
It is composed of the following parts.
a) the sample is (i) the reagent can emit radiation repeatedly
Receive a certain amount of electrochemical energy from a suitable source such as
Repeatedly emits electromagnetic radiation when
(Ii) binding of complementary materials not normally present in the sample
Can compete with the analyte of interest, and the complementary material for position.
Contact with such reagents. However, the target analyte and reagent
Contact under optimal conditions for competitive binding with complementary material
Let b) The sample obtained in this way is repeatedly subjected to the reagent.
Electrochemical energy from a suitable source capable of emitting radiation
Give a certain amount of energy. However, the reagent is repeatedly electromagnetically released.
Provided under optimal conditions to emit radiation. c) this
In this way, the emitted electromagnetic radiation is detected and
To detect the presence of the analyte in the sample. Also measured in advance
Volume of multi-component liquid sample present in the sample
A method for quantitatively measuring the amount of a target analyte
It includes the following parts. a) Sample
A known amount of (i) the reagent can repeatedly emit radiation
Receive a certain amount of electrochemical energy from a suitable source such as
Repeatedly emits electromagnetic radiation when
(Ii) a test that can bind to the analyte of interest;
Contact with medicine. However, the maximum binding time between analyte and reagent
Contact under appropriate conditions. b) Sample obtained in this way
A suitable source so that the reagents can emit repeated radiation
Gives a constant amount of electrochemical energy from But try
Optimal conditions under which the drug can repeatedly emit electromagnetic radiation
Give in. c) reduce the amount of radiation thus emitted
Quantitatively measured and thereby the target component present in the sample
The amount of precipitate is also quantitatively measured.The present invention further provides a pre-determined amount of the multi-component
In a liquid sample, the target analyte present in the sample
Some are about competitive methods for quantitatively measuring quantities
Including. This method is composed of the following parts. a)
The sample may be repeatedly irradiated with a known amount of (i) reagent.
A certain amount of electrochemical energy from a suitable source
When it receives it, it will emit electromagnetic radiation repeatedly,
And (ii) binding of complementary materials not normally present in the sample.
The target site for the binding site and a known amount of complementary material
Contact with such reagents that may compete. However, objective analysis
Optimal conditions for competitive binding of analytes and reagents with complementary materials
Contact under the condition. b) The sample thus obtained was
From an appropriate source so that the drug can emit repeated radiation
Provides a constant amount of electrochemical energy. However, the reagent
Given under optimal conditions that can emit electromagnetic radiation
You. c) quantitatively determine the amount of radiation thus emitted
To the target analyte present in the sample.
The quantity is also measured quantitatively.In addition, a large number of liquid foods and food homogenates
Methods for detecting and identifying analytes of interest present
Also includes things. This method consists of the following parts:
You.a) Multiple reagents suitable for immersion in liquid or solid suspensions
Hold the diagnostic reagent holder fixed against
Soak in food homogenate. However, each reagent is a diagnostic reagent
Fixed and fixed in a clearly distinguishable position on the holder
Target analyte 1 such that a reagent-target analyte complex is formed
A complex can be formed with each type. b) Liquid food
The diagnostic reagent holder from the product or food homogenate
remove. c) Diagnostic reagent holder using appropriate washing solution
Wash d) Immobilized reagent-target analyte complex
Reagent holders containing fixed reagent-target analysis
Can form a complex with the
The minimum that can form the drug-target analyte detection reagent complex
Immerse in a detection solution containing one type of detection reagent. e) Reagent
Is the immobilized reagent-target analyte-detection reagent complex
The identifiable part of the diagnostic reagent holder
Detecting and thereby detecting liquid food or food homogenates
Detect and identify a large number of analytes of interest in the sample.The present invention also relates to a system in which a large number of
Includes kits useful for detecting and identifying rotoxins
No. This kit consists of the following parts. a)
Surface part as appropriate for immersion in liquid or solid suspension
Diagnostic reagent holder with handle connected to
At least one nitrocellulose membrane should be on the above surface
On the nitrocellulose membrane.
Various monoclonal antibodies that are separately and clearly fixed
Each of the immobilized monoclonal antibodies
Specific to one type of enterotoxin antigenic determinant
B) Is it an aqueous buffer solution containing a surfactant?
A first washing solution comprising: c) at least one monoclonal
Detector consisting of antibody-enzyme bond; monoclonal antibody
Specific for different antigenic determinants for enterotoxin
Nitrocellulose attached to the diagnostic reagent holder
D) from a buffered aqueous solution.
E) for the monoclonal antibody in the detection solution
An enzyme substrate capable of reacting with the bound enzyme; and f) colorless staining
liquid.In the present invention, at least one kind of bacteria in one sample is contained.
Methods for detecting presence are also included. This method is as follows
It consists of a part. a) Open specimens and bacterial species
Inoculate in a container containing a medium suitable for the growth of b)
Connect the top to the end of the container. The side of this cap is on the container
When connected, it comes into contact with the inside of the container and
The surface has a structure suitable for fixing at least one bacterial component.
ing. c) Inoculated bacteria can grow in the medium
The inoculated medium is cultured under such conditions. d) of the container
Turn the bacteria upside down for a suitable amount of time to remove any bacteria
The ingredients are fixed on the surface of the cap facing the inside of the container
So that e) Turn the container upside down to get the correct direction
return. f) Remove the cap from the container. g) Bacterial growth
Place the surface of the cap where the
Under conditions appropriate to form a component-reagent complex, the solid
Contact with a reagent that can form a complex with a defined bacterial component.
You. h) detecting the immobilized bacterial component-reagent complex,
This also detects the presence of bacterial species in the sample.Further, the present invention relates to the method of
Methods for detecting presence are also included. This method is as follows
It consists of a part. a) Open type non-selection of sample
Inoculated in a container containing typical lactose medium and inverted Durham
I do. b) Cap with polystyrene insert on each volume
Connect to the open end of the vessel. c) Inoculated medium 37
Incubate for at least 2 hours at ° C. d) D inverted in each container
by bacterial fermentation collected in urham vials
Detect if any gas has been produced. e) Invert
Container in which gas is collected in a Durham vial
Is turned upside down for an appropriate period of time,
Enterobacteriaceae can form E. coli-polystyrene complexes
So that f) Turn the container upside down and turn it in the right direction
return. g) Remove the cap from the container. h) picking
Remove the missing cap polystyrene insert
Treat with appropriate material to close. i) Unconnected part
Caps treated with the appropriate material to close the position
Of the polystyrene insert of antibody-E. Coli-polystyrene
Bacteria under conditions such that a complex can form.
Anti-Escherichia coli labeled with a label that can be combined and detected
Treatment with at least one type B bacterial antibody. j) Polysti
Antibody-E. Coli-type polystyrene conjugate on Len insert
Detecting the presence of E. coli bacteria in the sample.
Also detects the presence.[0029]Figure description summaryFIG. 1 shows an average for measuring the concentration of one type of antigen in a solution.
Electrochemiluminescence used for quality immunoassays
This is a representation of the essence measurement method. Figure 2
The results of the homogeneous ECL theophylline test are shown in the graph.
It is a thing. Fig. 3 shows homogeneous teof in various sera
FIG. 4 is a graph showing the results of the illin test.● = Normal serum■ = Hemolysis serum◆ = lipemic serum□ = jaundice serumFig. 4 shows the results of the ECL theophylline test with the fluorescence polarization
Compared to the results of the Filin test,
You.A. Normal serum: n = 4; slope = 0.986; r = 1.0
0B. Hemolyzed serum: n = 3; slope = 0.778; r = 1.0
0C. Lipemia serum: n = 5; slope = 0.873; r =
0.99D. Jaundice serum: n = 4; slope = 2.14; r = 1.00Figure 5 shows the results of the ECL theophylline test
Matography-compared to the results of the test
It is.N = 9; slope = 1.197; r = 0.98FIG. 6 shows production in ECL digoxin immunoassay.
This is a graph showing the adjusted ECL signal adjustment.
You. FIG. 7 shows the results of the ECL digoxin immunoassay.
This is shown in the graph.■: contrast●: DigoxinFIG. 8 shows the MBI38-Compound I produced at each concentration.
It is a graph showing the obtained ECL signal. Fig. 9
Shows the MBI38-Compound I hybridization / sensitivity assay
It shows the results of the experiment. TAG = Compound I No. 10
The figure shows the results of the specificity test of MBI38-Compound I.
Things.[0031]Details of the present inventionThe present invention relates to a pre-measured amount of a multi-component liquid sample,
About 10 in the sample^-3Target components present at sub-molar concentrations
The following sections relate to the method for detecting
It is composed of a) The sample is repeated with (i) the reagent
Electrochemical energy from a suitable source capable of emitting radiation
Repeated release of electromagnetic radiation when receiving a certain amount of energy
And (ii) bind to the analyte of interest.
Contact with such a reagent. But with analyte
Contact under optimal conditions for binding of the reagents. b) this
The reagent repeatedly emits radiation to the sample obtained as in
Constant electrochemical energy from suitable sources
Give the amount. However, the reagent repeatedly emits electromagnetic radiation
Give under optimal conditions to obtain. c) Release in this way
The emitted electromagnetic radiation is detected, thereby
It also detects the presence of a specific analyte. In this application, "mol"
Is the concentration of analyte present per liter of solution
In mol or 1 liter in liquid sample
The amount of particulate matter present in particles or units per unit
Means the following. For example, 6.0 per liter
2 × 10^{twenty three}Each particle is represented as 1 mol.The method according to the present invention provides a non-uniform test
Before applying electrochemical energy to the bound labeling reagent
For separating unbound labeled reagent from labeled reagent bound to DNA
And homogenous test, ie, label bound to unbound labeling reagent
Test to apply electrochemical energy to both reagents simultaneously
It is implemented as. In the homogeneous system test of the present invention,
Electromagnetic radiation emitted from bound labeling reagents
Is released from bound labeling reagent compared to unbound labeling reagent.
Whether the amount of electromagnetic radiation emitted has increased or decreased
Or unbound labeling reagents with different wavelengths of electromagnetic radiation?
Can be distinguished from the emitted electromagnetic radiation. Therefore, the present invention
In one embodiment, the reagent is not bound to the analyte of interest.
Are all tested before applying electrochemical energy to the sample.
It will be separated from the sample in contact with the drug. Of the present invention
In another embodiment, prior to contacting the sample with the reagent,
The sample is processed to fix the analyte of interest. Objective analysis
Methods of fixing objects are well known in the art.
The sample was made of polystyrene, nitrocellulose, nylon
Or whole cells, subcellular grains
Child, virus, prion, viroid, lipid, fatty acid,
Nucleic acids, polysaccharides, proteins, lipoproteins, lipopolysaccharides,
Glycoproteins, peptides, cell metabolites, hormones, drugs
Physical reagents, tranquilizers, barbiturates, alcalo
Ids, steroids, vitamins, amino acids, sugars, non-biology
Polymers, synthetic organic molecules, organometallic compound molecules, inorganic
It comes into contact with the surface coated with molecules. Ma
Target analyte may be any of these substances.
No. In one embodiment of the invention, the analyte of interest is a theophylline.
This is Rin. In another embodiment, the target analyte is digoxy.
It is. In yet another embodiment, the analyte of interest is human cilia
Gonadotropin (hCG). And the analyte of interest
Whole cells, quasi-cell particles, viruses, prions, viroi
, Nucleic acid, protein, lipoprotein, lipopolysaccharide, sugar
Proteins, peptides, hormones, pharmacological reagents, non-biology
Polymers, synthetic organic molecules, organometallic compound molecules, inorganic
It can also be a molecule, with about 10^-12Less than mole
Can be analyzed for these substances present at concentrations of More eyes
About 10 analytes in the sample^-15Present at sub-molar concentrations
Whole cells, quasi-cell particles, viruses, prions, viroi
And nucleic acids.The reagent to be brought into contact with the sample may be whole cells,
Particles, biils, prions, viroids, lipids, fats
Acids, nucleic acids, polysaccharides, proteins, lipoproteins, lipopolysaccharides,
Glycoproteins, peptides, cell metabolites, hormones, pharmacology
Reagents, tranquilizers, barbiturates, alkaloids
Steroids, vitamins, amino acids, sugars, non-biological
Polymers, synthetic organic molecules, organometallic compound molecules, inorganic components
Bound to offspring, biotin, avidin, streptavidin
Containing species that emit electrochemiluminescence
It is. In one embodiment of the invention, the reagent is an antibody, an antigen,
Nucleic acids, haptens, ligands or enzymes, biotin, avi
Electrochemiluminescence coupled to gin, streptavidin
It is a chemical species that emits essence.Electrochemiluminescent Chemistry
The seeds are ruthenium, osmium, rhenium, iridium
Um, rhodium, platinum, palladium, molybdenum,
Organization involving metals selected from the group consisting of technetium
Compounds are used. In one embodiment of the present invention, the metal is
Uses tenium or osmium. Another
A specific example is a species that emits electrochemiluminescence.
As rubrene or 9,10-diphenylanthrace
You are using In yet another embodiment, electroforming
Bis [(4,4 ′) as a chemical luminescent species
-Carbomethoxy) -2,2'-bipyridine] 2- [3
-(4-methyl-2,2'-bipyridine-4-yl) p
Ropyl] -1,3-dioxolane ruthenium (II)
I'm using In another embodiment, an electrochemiluminescence
Bis (2,2'bipyridyl)
) [4- (butane-1-al) -4'-methyl-2,
2'-bipyridine] ruthenium (II)
You. In yet another embodiment, electrochemiluminescence
(2,2'-bipyridine)
[4- (4'-methyl-2,2'-bipyridine-4'-
yl) -butyric acid] ruthenium (II). Ma
In another embodiment, emits electrochemiluminescence
(2,2'-bipyridine) [cis-bis
(1,2 diphenylphosphino) ethylene] ｛2- [3
-(4-methyl-2,2'-bipyridine-4'-yl)
Propyl] -1,3-dioxolane-osmium (I
I) is used. In yet another embodiment, an electro-
Bis (2,2 ′) is a chemiluminescent species.
-Bipyridine) [4- (4'-methyl-2,2'-bipi
Lysine) -butyramine] using ruthenium (II)
I have. In another embodiment, electrochemiluminescence
(2,2'-bipyridine)
[1-bromo-4 (4'-methyl-2,2'-bipyridi
N-4-yl) butane] ruthenium (II)
I have. In yet another embodiment, electrochemiluminescence
Bis (2,2'-bipyridine)
Maleimidohexanoic acid, 4-methyl-2,2'-bipyri
Using gin-4 'butyral middle ruthenium (II)
You.Samples are solids, emulsions, suspensions, liquids, gases
Can be used. Plus water, food, blood, blood
Obtained from Qing, urine, stool, tissue, saliva, oil, organic solvent, air
Samples can also be used. Also, acetonitrile,
Tylsulfoxide, dimethylformamide, n-methyl
Le-pyrrolidinone, containing tertiary butyl alcohol
It can be used even if it is. The sample contains a reducing or oxidizing agent.
Can be used even if it is rare. Also, the present invention has been measured in advance.
Volume of a multi-component liquid sample, approximately 10^-3Mo
Competition to detect target analytes at sub-
It relates to an integrated method and consists of the following parts:
ing. a) the sample is repeated (i) the reagent emits radiation
Constant electrochemical energy from suitable sources
Now emits electromagnetic radiation repeatedly when dosed
And (ii) a complementary material not normally present in the sample
Competes with target analyte and complementary material for binding site
Contact with such reagents. However, the target analyte and
Optimal conditions for competitive binding of reagents to complementary materials
Contact. b) The sample thus obtained contains reagent
Electricity from a suitable source capable of emitting repeated radiation
Gives a constant amount of chemical energy. However, the reagent is repeated
And under optimal conditions capable of emitting electromagnetic radiation.
c) detecting the electromagnetic radiation emitted in this way,
This also detects the presence of the analyte of interest in the sample.The reagent emits electrochemiluminescence
Analyte of interest, or electrolysis
Of the analyte of interest bound to the chemiluminescent species
Use analogs. Theophylline as the target analyte,
Digoxin and hCG can be used. Electro chemiluminescence
Bis 化学 (4,4'-ka
Rubomethoxy) -2,2'-bipyridine] 2- [3-
(4-methyl-2,2'-bipyridine-4-yl) pro
Uses pill-1,3-dioxolane ruthenium (II)
it can. In another embodiment of the present invention, an electrochemical
Bis (2,2'-bipi) is a luminescent species.
Lysine) [4- (butane-1-al) -4'-methyl-
2,2'-bipyridine] ruthenium (II)
I have. In yet another embodiment, electrochemiluminescence
Bis (2,2'-bipyridine)
[4- (4-methyl-2,2'-bipyridine-4'-i
Ru) -butyric acid] ruthenium (II). Also
In another embodiment, the electrochemiluminescent
(2,2'-bipyridine) [cis-bis
(1,2-diphenylphosphino) ethylene] ｛2-
[3- (4-methyl-2,2'-bipyridine-4'-i
Le) propyl] -1,3-dioxolane osmium
(II) is used. In yet another embodiment,
Bis (2,2) is a torochemiluminescent species
2'-bipyridine) [4- (4'-methyl-2,2'-
Bipyridine) -butyramine] ruthenium (II)
are doing. In another embodiment, an electrochemiluminescent
Bis (2,2'-bipyridyl)
) [1-bromo-4 (4'-methyl-2,2'-bipi
Lysine-4-yl) butane] ruthenium (II)
are doing. In yet another embodiment, an electrochemiluminescent
Bis (2,2′-bipyridyl) is a chemical species that emits sense.
N) Maleimidohexanoic acid, 4-methyl-2,2'-bi
Use of pyridine-4'-butyramiddleruthenium (II)
are doing.As complementary materials, whole cells, quasi-cell particles,
Viruses, prions, viroids, lipids, fatty acids, nuclei
Acid, polysaccharide, protein, lipoprotein, lipopolysaccharide, sugartan
White matter, peptide, cell metabolite, hormone, pharmacological test
Drugs, tranquilizers, barbiturates, steroids, vita
Mins, amino acids, sugars, non-biological macromolecules, synthetic organics
, Organometallic compound molecules, and inorganic molecules can be used.
Wear.Within the scope of the present application, the methods described here are not
It is used to quantify a target analyte. Therefore the book
The invention is based on a pre-measured volume of a multi-component liquid sample.
Quantitatively determine the amount of the target analyte present in a sample
It includes the following parts, including those related to
Have been. a) The sample is repeatedly released by a known amount of (i) reagent
Electrochemical energy from a suitable source capable of emitting radiation
Repeatedly emit electromagnetic radiation when receiving a certain amount of energy
And (ii) binding to the analyte of interest
Contact with such reagents. However, the analyte and test
Contact is made under conditions that are optimal for the drug to bind. b) this
The reagent repeatedly emits radiation into the sample obtained in this way.
Constant amount of electrochemical energy from a suitable source to obtain
give. However, reagents can emit electromagnetic radiation repeatedly.
Under optimal conditions. c) release in this way
Quantitatively measure the amount of radiation
The amount of the analyte of interest present therein is also quantitatively determined. Book
The method can be used as a heterogeneous test or a homogeneous test
You. In one embodiment of the invention, the analyte is bound to the analyte of interest.
For all reagents that are not present, the reagent repeatedly emits radiation in the sample
Constant electrochemical energy from suitable sources
Separate from a sample in contact with a known amount of reagent before applying volume
Is done. In another embodiment of the invention, the sample is contacted with a reagent.
Before touching, process the sample to fix the analyte of interest
I do.The target analytes include whole cells, quasi-cell particles,
Viruses, prions, viroids, lipids, fatty acids, nuclei
Acid, polysaccharide, protein, lipoprotein, lipopolysaccharide, sugartan
White matter, peptide, cell metabolite, hormone, pharmacological test
Drugs, tranquilizers, barbiturates, alkaloids,
Teroids, vitamins, amino acids, sugars, non-biological content
Molecules, synthetic organic molecules, organometallic compound molecules, and inorganic molecules.
It is possible to In one embodiment of the present invention,
The precipitate is theophylline. In another embodiment of the present invention,
Indicates that the target analyte is digoxin. Further another aspect of the present invention
In a specific example, the target analyte is hCG. Contact with the sample
Reagents include whole cells, subcellular particles, viruses, prions,
Viroids, lipids, fatty acids, nucleic acids, polysaccharides, proteins,
Protein, lipopolysaccharide, glycoprotein, peptide, cell fee
Products, hormones, pharmacological reagents, tranquilizers, barbi
Tool salts, alkaloids, steroids, vitamins,
Amino acids, sugars, non-biological polymers, synthetic organic molecules, organic
Electrochemical compound bound to metal compound molecules, inorganic molecules
It is a chemical species that emits luminescence. One embodiment of the present invention
In the example, the reagent is an antibody, antigen, nucleic acid, hapten, ligand, or
Or enzyme, biotin, avidin, streptavidin
Species that produce combined electrochemiluminescence
You.Electrochemiluminescent Chemistry
The seeds are ruthenium, osmium, rhenium, iridium
Um, rhodium, platinum, palladium, molybdenum,
Organization involving metals selected from the group consisting of technetium
Compounds are used. In one embodiment of the present invention, the metal is
Uses tenium or osmium. Another
A specific example is a species that emits electrochemiluminescence.
As rubrene or 9,10-diphenylanthrace
You are using In yet another embodiment, electroforming
Bis [(4,4 ′) as a chemical luminescent species
-Carbomethoxy) -2,2'-bipyridine] 2- [3
-(4-methyl-2,2'-bipyridine-4-yl) p
Ropyl] -1,3-dioxolane ruthenium (II)
I'm using In another embodiment, an electrochemiluminescence
Bis (2,2'-bipyri
Gin) [4- (butane-1-al) -4'-methyl-
2,2'-bipyridine] ruthenium (II)
I have. In yet another embodiment, electrochemiluminescence
Bis (2,2'-bipyridine)
[4- (4-methyl-2,2'-bipyridine-4'-y
1) -butyric acid] ruthenium (II). Also
In another embodiment, the electrochemiluminescent
(2,2'-bipyridine) [cis-bis
(1,2-diphenylphosphino) ethylene] ｛2-
[3- (4-Methyl-2,2'-bipyridine-4'-y
1) propyl] -1,3-dioxolane osmium
(II) is used. In yet another embodiment,
Bis (2,2) is a torochemiluminescent species
2'-bipyridine) [4- (4'-methyl-2,2'-
Bipyridine) -butyramine] ruthenium (II)
are doing. In another embodiment, an electrochemiluminescent
Bis (2,2'-bipyridyl)
) [1-bromo-4 (4'-methyl-2,2'-bipi
Lysine-4-yl) butane] ruthenium (II)
are doing. In yet another embodiment, an electrochemiluminescent
Bis (2,2'-bipyridyl)
N) Maleimidohexanoic acid, 4-methyl-2,2'-bi
Use of pyridine-4'-butyramiddleruthenium (II)
are doing.Samples are solids, emulsions, suspensions, liquids, gases
Can be used. Plus water, food, blood, blood
Obtained from Qing, urine, stool, tissue, saliva, oil, organic solvent, air
Samples can also be used. Also, acetonitrile,
Tylsulfoxide, dimethylformamide, n-methyl
Contains rupyrrolidinone, tertiary butyl alcohol
Can also be used. Sample contains reducing agent or oxidizing agent
Can be used even if it is. The invention also relates to a pre-measured quantity.
Of multi-component liquid samples
Learn about competitive methods for quantitatively measuring analyte quantities
Also includes things. This method consists of the following parts:
You. a) A sample is repetitively irradiated with a known amount of (i) reagent.
Electrochemical energy from a suitable source that can be released
To emit electromagnetic radiation repeatedly when receiving a certain amount
And (ii) complementary that is not normally present in the sample
The analyte of interest for the binding site of the material and a known amount of complement
Contact with such a reagent that can compete with the target material. However
Target analyte and reagent bind competitively to complementary material
Contact under optimal conditions. b) The trial obtained in this way
The material should be of a suitable type to allow the reagent to emit repeated radiation.
Provides a constant amount of electrochemical energy from the source. However
Optimal conditions for the reagent to emit repeated electromagnetic radiation
Give below. c) the amount of radiation thus emitted
Is quantitatively measured, thereby the purpose present in the sample
The amount of analyte is also measured quantitatively. As a target analyte
Ofillin, digoxin, hCG can be used.In one embodiment of the invention, the reagent is electo
Objective analysis coupled to chemiluminescent species
Object or chemistry that emits electrochemiluminescence
An analog of the analyte of interest bound to the species is used. Elek
Bis is a chemical species that emits torochemiluminescence
[(4,4'-carbomethoxy) -2,2'-bipyridi
2-] 3- (4-Methyl-2,2'-bipyridine-
4-yl) propyl] -1,3-dioxolanruthenium
(II) can be used. In another embodiment of the present invention,
Bis as a chemical species that emits electrochemiluminescence
(2,2'-bipyridine) [4- (butane-1-al)
-4'-Methyl-2,2'-bipyridine] ruthenium
(II) is used. In yet another embodiment,
Bis (2,2) is a torochemiluminescent species
2'-bipyridine) [4- (4-methyl-2,2'-bi
Pyridine-4'-yl) -butyric acid] ruthenium (II)
I'm using In another embodiment, an electrochemiluminescence
(2,2'-Bipiridi
) [Cis-bis (1,2-diphenylphosphino)
Tylene {2- [3- (4-methyl-2,2'-bipyridi
-4'-yl) propyl] -1,3-dioxolane
Osmium (II) is used. Yet another specific example
Now, as a species that emits electrochemiluminescence
Bis (2,2'-bipyridine) [4- (4'-methyl-
2,2'-bipyridine) butyramine] ruthenium (I
I) is used. In another embodiment, electroforming
Bis (2,2'-
Bipyridine) [1-bromo-4 (4'-methyl-2,
2'-bipyridin-4-yl) butane] ruthenium (I
I) is used. In yet another embodiment, an electro-
Bis (2,2 ′) is a chemiluminescent species.
-Bipyridine) maleimidohexanoic acid, 4-methyl-
2,2'-bipyridine-4'-butyramiddleruthenium
(II) is used.Complementary materials include whole cells, quasi-cell particles,
Viruses, prions, viroids, lipids, fatty acids, nuclei
Acid, polysaccharide, protein, lipoprotein, lipopolysaccharide, sugartan
White matter, peptide, cell metabolite, hormone, pharmacological test
Drugs, tranquilizers, barbiturates, alkaloids,
Teroids, vitamins, amino acids, sugars, non-biological polymers
-, Synthetic organic molecules, organometallic compound molecules, inorganic molecules
Can be used. The invention also relates to liquid foods, food homologs.
Detect and identify multiple analytes of interest in dinates
Including methods related to This method has the following parts
It is composed of a) Soak in liquid or solid suspension
Diagnostic reagent holder suitable for multiple reagents
Immersed in liquid food or food homogenate. Was
However, each reagent is clearly located on the diagnostic reagent holder
To form a fixed reagent-target analyte complex.
To form a complex with each target analyte
To do. b) In liquid food or food homogenate
And remove the judgment reagent holder. c) a suitable washing solution
Use to wash the reagent holder. d) Fixed trial
Holds the reagent holder containing the drug-target analyte complex
Forming a complex with the selected reagent-target analyte complex
And immobilized reagent-target analyte-detection reagent complex
Detection solution containing at least one detection reagent capable of forming
Soak in liquid. e) The reagent is an immobilized reagent-target analyte-
Judgment reagent holder fixed as detection reagent complex
Detect an identifiable part of the liquid food
Or a large number of target analytes in the food homogenate.
Out and identify.A microorganism may be used as the target analyte.
it can. It does not matter whether the microorganisms are alive or dead. Microorganisms are bacteria
Is also good. Examples of bacteria that can be detected by this method include
Lumonella, Campylobacter, Escherichia, D
Genus Luzinia, Bacillus, Vibrioic acid, Regenera,
Clostridium, Streptococcus, Staphylococcus
But not limited to only these bacteria
No. In addition, an antigen can be used as a target analyte.
Such antigens include enterotoxins and afra
Toxins, but not limited to
Absent.The immobilized reagent and detection reagent are poly
Clonal antibody, monoclonal antibody, monoclonal
Antibody mixture, polyclonal and monoclonal
Mixtures of the body can be used. Detection reagent is detectable label
Can be used for labeling. One embodiment of the present invention
The detection reagents are labeled with the same detectable label.
Is known. Such labels are often used in the technical field.
Known, for example, alkaline phosphata
, Horseradish peroxidase, glucose oxy
Enzymes such as dase, β-galactosidase and urease
Element such as fluorescein isothiocyanate, tetra
Methyl rhodamine isothiocyanate, dichlorotria
Firefly like Jiniramino Fluorescein, Texas Red
Light species, such as luminol, isoluminol, acridiny
Contains chemiluminescent species such as
You. The species emits radiation as a detectable label.
Constant amount of electrochemical energy from a suitable source to obtain
Will emit electromagnetic radiation repeatedly upon receiving
Electrochemiluminescent species can also be used. this
Electrochemiluminescent species include ruthenium and o
Contains smium. The fixed reagent is placed in the diagnostic reagent holder.
Fix to the attached nitrocellulose membrane.The present invention is also applicable to a large number of entities present in a sample.
Includes kits useful for detecting and identifying rotoxins
No. This kit consists of the following parts. a)
Surface part as appropriate for immersion in liquid or solid suspension
Diagnostic reagent holder with handle connected to However
At least one nitrocellulose membrane should be on the above surface
On the nitrocellulose membrane.
Various monoclonal antibodies that are separately and clearly fixed
Each of the immobilized monoclonal antibodies
Specific to one type of enterotoxin antigenic determinant
It has become something. b) Is it an aqueous buffer solution containing a surfactant?
A first cleaning solution comprising: c) at least one monoclonal
Detection part consisting of antibody enzyme bond. Each monoclonal antibody
Determinants specific for different antigens against enterotoxin
Nitrocellulose attached to the diagnostic reagent holder
Is fixed on the base membrane. e) Monochrome in detection solution
An enzyme substrate capable of reacting with the enzyme bound to the internal antibody.
f) Colorless liquor.In one embodiment of the present invention, nitrocellulose
Fixed on the membrane separately and various Staphyloc
specific for antigenic determinants of occus enterotoxins
Nitrocellulose membrane with a certain monoclonal antibody
I'm using In another embodiment of the present invention, a nitrocell
Separately immobilized on the roast membrane separately, Staphyloc
against Occus enterotoxins A, B, D and E
Nitro with 4 specific monoclonal antibodies
Uses cellulose membrane. Also this nitrocellulose
The membrane has one or more types of St that are separately and clearly fixed to the membrane.
aphylococcus enterotoxin
A monoclonal antibody specific to the original determinant
Sometimes. This enterotoxin is Staphyl
ococcus enterotoxins C₁, C_Two, C_Three
Is specific for the antigenic determinant of Each Staphyl
Specific for antigenic determinants of ococcus enterotoxin
With a monoclonal antibody immobilized on a nitrocellulose membrane.
Staphylococcus entere with specific body
Bound to a monoclonal antibody directed against rotoxin
The enzymes in this kit include alkaline phosphatase, etc.
The enzyme substrate that can react with this enzyme is 5-bromo,
Chloroindolyl phosphate, colorless liquor is Nitroble
-Tetrazolium.The invention also relates to a liquid or solid suspension.
Many Staphylococcus enteros
Methods for detecting and identifying toxins are also included. This one
The law consists of the following parts: a) Staphy
Species specific for lococcus enterotoxins
Multiple monocles separately and clearly fixed in the reagent holder
When appropriate, insert the diagnostic reagent holder with the
Immersed in a liquid or solid suspension for fixed
Lonal antibody-Staphylococcus entero
Form a toxin complex. b) Determine the reagent e from the sample
Remove rudder. c) In an aqueous buffer solution containing a surfactant
Soak the reagent holder in the judgment. d) Aqueous buffer containing surfactant
Remove the reagent holder from the buffer solution. e) Monochrome
Antibody-alkaline phosphatase conjugate
Immerse the diagnostic reagent holder in the detection solution containing
And the immobilized monoclonal antibody-Staphylo
coccus enterotoxin-monoclonal antibody-
An alkaline phosphatase complex is formed. f) Inspection
Remove the diagnostic reagent holder from the effluent. g) aqueous buffer
Immerse the diagnostic reagent holder in the solution. h) aqueous buffer solution
And remove the diagnostic reagent holder. i) 5-bromo, 4-
Chloroindolyl phosphate and nitro blue tetra
Immerse the diagnostic reagent holder in a solution containing zolium. j)
Identifiable on nitrocellulose membrane with accumulated blue precipitate
The part is detected with the naked eye. k) Nitro with accumulated blue precipitate
An identifiable part on the cellulose membrane and fixed to that part
Staphylo for which specific monoclonal antibodies show specificity
coccus enterotoxin
Staphylococcus in the sample
Detect and identify the presence of rotoxin.Further, the present invention relates to the method for controlling the number of bacteria in one sample.
Also included are methods for detecting the presence of one. This way
Is composed of the following parts. a) Open sample
Inoculate at least one of the containers containing a medium suitable for growing bacterial species
I do. b) Connect the cap to the end of the container. This cap
So that the surface of the container contacts the inside of the container when connected to the container.
And the surface fixes at least one bacterial component
It has an appropriate structure. c) Bacteria inoculated in the medium
Cultivate the inoculated medium under conditions such that
You. d) Turn the container upside down for a suitable time, and
Of the cap facing the inside of the container with bacterial components present in the container
To be fixed on the surface. e) Turn the container upside down
And return to the correct direction. f) Remove cap from container
You. g) the surface of the cap on which the bacterial components are fixed,
Suitable for formation of immobilized bacterial component-reagent complexes
Under complex conditions can form a complex with immobilized bacterial components
Contact reagent. h) Immobilized bacterial component-reagent complex
Detect the presence of bacterial species in the sample.
Put out. Within the scope of the present application, a "bacterial component" is a whole cell,
These include cell wall components, cell membrane components, and flagella components.
It is not limited to only.Suitable for fixing at least one bacterial component
Cap surfaces include polystyrene inserts, nitrose
Lulose membrane and nylon membrane can be used. Table
Polyclonal antibody, monoclonal antibody, monoclonal antibody
Mix of lonal antibody, polyclonal antibody and monoclonal
Also coated with a mixture of internal antibodies.
You. Reagents that can form a complex with immobilized bacterial components
Polyclonal antibody, monoclonal antibody, monoclonal
Mixture of null antibody, polyclonal antibody and monoclonal
There is a mixture of antibodies. The reagent may be, for example, a detectable
Element, a fluorescent species, a chemiluminescent species
Such a detectable label can also be used. Further inspection
Emits electrochemiluminescence as a releasable label
Seeds can also be used. In one embodiment of the present invention
Is an electrochemiluminescence containing ruthenium or osmium
Uses luminescent species. Another specific example of the present invention
In order to detect the immobilized bacterial component-reagent complex,
Can form complexes with immobilized bacterial component-reagent complexes
A second reagent with a detectable label can also be used.
In still another embodiment of the present invention, wherein the reagent is polyclonal
Antibody, monoclonal antibody, mixture of monoclonal antibodies
Mixture, polyclonal and monoclonal antibodies
And an anti-antibody against the reagent as a second reagent
Is used so as to be detectable.Samples in which bacteria can be detected include water and food.
I will. One embodiment of the present invention is suitable for the growth of bacterial species.
A non-selective lactose medium is used as the medium. Also one
One embodiment uses a non-selective lactose medium as the medium,
Bacteria that can be detected are at least one E. coli type. The present invention
For detecting the presence of Escherichia coli bacteria in samples
Is also included. This method consists of the following parts:
You. a) Samples were opened in open, non-selective lactose medium and inverted Du.
Inoculate at least one of the containers containing rham. b) Poly
Cap the styrene insert on the open end of each container.
Connect to c) Inoculated medium at 37 ° C for a minimum of 2 hours
Incubate. d) Durham bikes inverted in each container
Gas produced by bacterial fermentation collected in Al
Detect if there is. e) Inverted Durham
Hold the top and bottom of the container where the gas is
After inverting for a period of time,
So that an enterobacteriform-polystyrene complex can be formed.
f) Turn the container upside down and return to the correct direction. g) container
Remove the cap from. h) Cap removed
Polystyrene insert suitable for plugging unbound sites
Treat with an appropriate substance. (I) block unbound sites
Polystyrene in caps treated with appropriate materials for
The antibody insert is transformed into an antibody-Escherichia coli-polystyrene complex.
Detectable by binding to Escherichia coli bacteria under conditions that can be achieved
Anti-Escherichia coli bacterial antibody labeled with a functional label
Processing is performed using one type of low. j) on polystyrene insert
The presence of the antibody-Escherichia coli-polystyrene complex
To detect the presence of Escherichia coli-type bacteria in the sample
I do.In one embodiment of the present invention, a non-selective lactose culture
The ground is phenol red broth. Polystyrene insert
Bovine is a suitable material for plugging unbound sites on
Serum albumin can be used. Label with detectable label
Anti-Escherichia coli bacterial antibody
Labeled monoclonal antibodies can be used. Detectable
Enzyme linked to monoclonal antibody
Can be used. In one embodiment of the invention, the enzyme
Calf intestinal alkaline phosphatase is used. Ma
In another embodiment of the present invention, a monolayer is used as the detectable label.
Use fluorescent species bound to clonal antibodies.
You. In yet another embodiment, the detectable label is mono.
Electrochemiluminescence coupled to clonal antibodies
Use a species that emits. Electrochemiluminescence
Species that emit water include ruthenium and osmium.
In one embodiment of the invention, the sample is water. The present invention
In another embodiment, the sample is a food product.Vials can be used as open containers.
You. Kits for detecting Escherichia coli-type bacteria in water samples
Also included. This kit consists of the following parts
I have. a) at least 1 vial with non-selective lactose medium
B) at least one Durham vial, c) polystyrene
At least one vial cap with len insert, d) c
Serum albumin solution, e) anti-E. Coli type bacteria monochrome
Null antibody-enzyme conjugate, f) aqueous buffer solution for washing, g)
Enzyme substrate solution. In one embodiment of the present invention, an anti-E.
The enzyme bound to the bacterial monoclonal antibody is
Phosphatase, and the enzyme substrate is p-nitrophen
Disodium nil phosphate. The present invention also has the following structure.
One compound,Embedded imagen is an integer. In one embodiment of the invention, n is 2.
You. The present invention also includes compounds having the structure:Embedded imagen is an integer. In one embodiment of the invention, n is 2.
You. The invention also includes compounds having the structure:Embedded imagen is an integer. In one embodiment of the invention, n is 2.
You.Further, the present invention also includes a compound having the following structure:
Included,Embedded imageR is an anion and n is an integer. One embodiment of the present invention
In the example, n is 2. This compound has the following structure
Including things,Embedded image X- (Y)_n-ZX is one or more homologous or heterologous nucleotides,
Is one or more heterologous amino acids, antibody, target analyte, target
Represents an analog of the precipitate, n is an integer, and Z is included in the present invention.
Represents a compound.The present invention also includes a compound having the following structure:
Where R is an anion and n is an integer. One of the present invention
In a specific example, n is 2.Embedded imageThis compound includes a component having the structure:Embedded image X- (Y)_n-ZX is one or more homologous or heterologous nucleotides,
Is one or more heterologous amino acids, antibody, target analyte, target
Represents an analog of the precipitate, n is an integer, and Z is included in the present invention.
Represents a compound.Further, the present invention provides a compound having the following structure:
R is an anion and n is an integer. 1 of the present invention
In one embodiment, n is 3.Embedded imageThis compound includes a component having the structure:Embedded image X- (Y)_n-ZX is one or more homologous or heterologous nucleotides,
Is one or more heterologous amino acids, antibody, target analyte, target
Represents an analog of the precipitate, n is an integer, and Z is included in the present invention.
Represents a compound.The present invention also includes a compound having the following structure:
Where R is an anion and n is an integer. One of the present invention
In a specific example, n is 3.Embedded imageThis compound includes a component having the structure:Embedded image X- (Y)_n-ZX is one or more homologous or heterologous nucleotides,
Is one or more heterologous amino acids, antibody, target analyte, target
Represents an analog of the precipitate, n is an integer, and Z is included in the present invention.
Represents a compound.Further, the present invention provides a compound having the following structure:
Included,Embedded imagen is an integer. In one embodiment of the invention, n is 3.
You. The invention also includes a compound having the structure:Embedded imagem and n are the same or different integers. The present invention
In one embodiment, m and n are both 3.Further, the present invention provides a compound having the following structure:
IncludedEmbedded imageR is an anion and n is an integer. One embodiment of the present invention
In the example, n is 2.This compound contains a constituent having the following structure:
SeeEmbedded image X- (Y)_n-ZX is one or more homologous or heterologous nucleotides,
Is one or more heterologous amino acids, antibody, target analyte, target
Represents an analog of the precipitate, n is an integer, and Z is included in the present invention.
Represents a compound. Further, the present invention has the following structure
Including compounds.Embedded imageAlso includes compounds with the following structure:Embedded imageR is an anion and n is an integer. One embodiment of the present invention
In the example, n is 2.This compound contains a component having the following structure:
SeeEmbedded image X- (Y)_n-ZX is one or more homologous or heterologous nucleotides,
Is one or more heterologous amino acids, antibody, target analyte, target
Represents an analog of the precipitate, n is an integer, and Z is included in the present invention.
Represents a compound. Further, the present invention has the following structure
Compounds,Embedded imageR is an anion, and m and n are integers. One of the present invention
In a specific example, m is 5 and n is 3.This compound contains a component having the following structure:
SeeEmbedded image X- (Y)_n-ZX is one or more homologous or heterologous nucleotides,
Is one or more heterologous amino acids, antibody, target analyte, target
Represents an analog of the precipitate, n is an integer, and Z is included in the present invention.
Represents a compound. In one embodiment of the invention, X
Is theophylline. In another embodiment of the present invention, X
Is digoxigenin. In another embodiment of the present invention,
X is a hCG-derived peptide. Furthermore, the present invention
Includes compounds having the structure:X-CH = CH-CO-NH- (CH_Two)_n
-NH-CO- (CH_Two)_m-ZX is one or more homologous or heterologous nucleotides, and Z is
A species that emits chemochemiluminescence, where n is one or more
An integer and m represents an integer of 1 or more. Book
In one embodiment of the invention, X is CH at the fifth carbon position.
Thymidine, n = 7 and m = 3.In another embodiment of the present invention, Z is bis
(2,2'-bipyridine) [4- (butane-1-al)
-4'methyl-2,2'-bipyridine] ruthenium (I
I). In yet another embodiment of the present invention, wherein thymidine is
The 3'-terminal nucleotide added to the nucleotide sequence by the nucleotide
It has become a cleotide.Embedded imageTCACCAATAAAACCGCAAACACCCATCCCGTCCTGCCAGThe invention also includes a compound having the structure:Embedded image [TYZ]²⁺(R)_TwoT is theophylline, Y is a linker group from T to Z, Z
Is bis- (2,2'-bipyridine) [4-methyl-2,
2'-bipyridine-4'-yl] ruthenium (II),
R represents an anion. In one embodiment of the present invention
Is attached to the carbon at the eighth T position. Again
In another embodiment of Ming, Y has the structure:Embedded image (CH_Two)_m-CO-NH- (CH_Two)_nm and n represent the same or different one or more integers
You. In another specific example, m is 3 and n is 4. further
In another embodiment, m and n are both 3.In another embodiment of the present invention, Y has the following structure:
WithEmbedded imagem, n, and r represent one or more same or different integers
ing. In one embodiment, m is 1, n is 1, r is 4.
You. In yet another embodiment of the present invention, Y has the following structure:
ChiEmbedded imagem, n and r are the same or different and represent one or more integers
I have. In one embodiment, m is 1, n is 1, r is 4.
You. In another embodiment of the invention, Y is the seventh T position.
Of nitrogen. In one embodiment, Y has the following structure
Mochi,Embedded image (CH_Two)_nn is an integer of 1 or more. In another embodiment, n is 4.
You.The present invention also includes compounds having the following structures:
SeeEmbedded imageY is a linker arm. In one embodiment of the invention,
Y has the following structureEmbedded image (CH_Two)_m-NH-CO- (CH_Two)_nm and n are the same or different integers of one or more. One
In a specific example, m is 3 and n is 2.The present invention further includes a compound having the following structure:
SeeEmbedded imagem and n are the same or different integers. In one specific example
And m and n are both 1. Configuration with the following structure
Including things,Embedded image XZX is at least one amino acid of cysteine or methionine
Represents one or more homologous or heterologous amino acids consisting of
And Z is the carbon at the third or fourth maleimide position
To the cysteine or methionine sulfur substituent
Bis (2,2'-bipyridine) maleimidohexa
Acid, 4-methyl-2,2'-bipyridine-4'-buty
It represents lamiddle ruthenium (II). Listed below
Examples are specific explanations of the present invention, but are not limited thereto.
Instead, the scope of the claim is
The enclosure is defined.[0067]Example 1 Electrolysis in Various Organic Solvents
Learning luminescenceTris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II)
Electrochemiluminescence of chloride hexahydrate.
With 15 ml containing 10 ml of the solution prepared as follows.
ml measured in a 3-neck round bottom flask: 1.5 mm × 1
0mm magnetic stir bar, 1.0mm diameter
Silver wire quasi-reference electrode, compound 28 gauge platinum wire counter electrode, thickness
Highly polished platinum foil 1cm x 1c with a thickness of 0.1mm
Made of 22 gauge platinum wire welded to m square pieces
Working electrode (Platinum foil working electrode is 3/16 inch diameter half
Circular, 28 gauge platinum wire counter electrode 3/32 inch
At the same distance from each other). EG & G for silver wire
173 < EG & G178 >
It was connected to a scale probe. Platinum wire counter electrode and platinum
Working electrode is anode and cathode of EG & G173 type potential controller
Respectively. The device was grounded.EG & G175 Universal Programmer
Circulating electricity using the EG & G173 type potential controller
Piezoelectric current was measured. Programmer: anode potential + 1.75
100 mV / between the volts and the cathode potential-1.80 volts.
It was set to sweep in seconds. Hama-matsu
Kodak # 23A Zera with R928 photomultiplier tube
Products f with chin (red) filter
or Research PR1402RF type photomultiplier
Place the tube inside the tube
Nessence was detected. Photomultiplier tube housing
Connected to Oriel 7070 Photomultiplier Tube Detection System
did. The circulating voltage / current is Houston Instrument
Recorded on a nts200XY recorder. Circulating voltage / current
Is the following organic solvent and 1 mM Tris (2,2'-bipyridyl)
Ru) ruthenium (II) chloride hexahydrate (A
ldrich Chemical Company) and
0.1 M tetrabutylammonium tetrafluorobore
(TBABF_Four) (Aldrich Chemical)
al Company). : Ase
Tonitrile, n-dimethylformamide, dimethyl sulf
Foxide, 1-methyl, 2-pyrrolidinone (Aldri
ch Chemical Company). Also 1m
M tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II)
Chloride hexahydrate and 0.1 M TBABF_Four
When preparing a solution containing
A solution of deionized distilled water (1: 1, v / v) was used.
According to the voltage and current generated in this way, each organic solvent
(2,2'-bipyridyl) ruthenium in the preparation
(II) Changes in the oxidation-reduction potential of chloride hexahydrate
No change was seen.Electrochemiluminescence is detected with the naked eye
The solution was prepared as follows:
Lis (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) chloride
Lidohexahydrate and TBABF_FourThe above organic solvent
Grade for agent spectroscopy (Aldrich Chemical
(Company) and the final concentration was 1 m each.
M and 0.1M. 15 ml of this solution
Placed in a round bottom flask. Immerse the electrode in this solution and
The working electrode swings between a potential of +1.75 and -1.45 volts.
To produce electrochemiluminescence
did. Electrochemiluminescence is performed in each of the aforementioned solutions.
Observed visually. Electrochemical chemiluminescence with various solvents
To quantitatively measure the effect on essence,
To prepare a sufficient amount of Tris (2,2'-bipi
Lysyl) ruthenium (II) chloride hexahydrate
And TBABF_FourDissolved in the organic solvent described above,
The degrees were 2 mM and 0.2 mM, respectively. This solution is constant
The amount of ammonium persulfate, a strong oxidant, was added at a concentration of 36 mM.
An equal volume of deionized distilled water was added. Tris (2,
2'-bipyridyl) ruthenium (II) chloride hexa
A control solution without hydrate was also prepared. This
10 ml of the solution thus obtained is a 15 ml round bottom flask
I put it in Ko. The cathode potential is reduced from 0 to -2.0 volts by 1 /
Vibration at 2 second intervals to produce electrochemiluminescence
I was born.Micronata 22191 type digital camera
Using an integrator connected to a multimeter,
Multiplication of electrochemiluminescence obtained in this way
Elect by calculating the sum of tube tube signals
B) Chemiluminescence was measured. Electrochemiluminescence
For the sense signal, the sum of the vibration period for 10 seconds is obtained and is expressed in mV.
Recorded. The results are shown in Table I.
Quantitative differences in the efficiency of ruthenium (II) chloride
Understand.[Table 1]Table I  Organic Tris RuBiPy  solvent(10^-6 M)ControlΔ    Acetonitrile 2,540 104 2,436  Tertiary butyl alcohol 1,280 0 1,280  N, N-dimethylformamide 2,390 143 2,247  Dimethyl sulfoxide 2,760 29 2,731  1-methyl-2-pyrrolidinone 1,630 0 1,630          * All measurement values are in mV.Example 2 Ruthenium-Labeled Rabbit Anti-Mouse
Immunoglobulin G (IgG) antibodyLectro Chemi-Lumi
Nesence detection sensitivity4,4 '-(dichloromethyl) -2,2'-bipyridi
, Bis (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II)
Rabbit anti-mouse IgG antibody labeled with
Rabbit anti-mouse IgG antibody) electrochemiluminescence
Contains 10 ml of the solution prepared as follows
Measured in a 15 ml 3-neck round bottom flask: 1.5 mm
× 10mm magnetic stir bar, diameter 1.0m
m silver wire quasi-reference electrode, compound 28 gauge platinum wire
Extremely polished platinum foil with a thickness of 0.1 mm and a thickness of 1 cm
From a 22 gauge platinum wire welded to a × 1 cm square piece
Working electrode (platinum foil working electrode is 3/16 inch in diameter)
And a 28/3 platinum wire counter electrode 3/3
2 inches equidistant). Silver wire E
EG & G17 of G & G173 type potential controller / current controller
It was connected to a type 8 electrometer probe. Platinum wire counter electrode and plug
The Latin working electrode is the anode of the EG & G173 potential controller and
And cathode, respectively. The device was grounded.Ruthenium-labeled rabbit anti-mouse IgG antibody
The electrochemiluminescence released from the solution is K
Attach odak # 23A gelatin (red) filter
Products for Research PR
1402 RF type photomultiplier tube
Hamamatsu R928 Photomultiplier Tube
Detected using Photomultiplier tube housing is O
Riel 7070 Photomultiplier tube detection system
Was. Cathode potential from 0 to -2.0 volts in half-second intervals
To produce electrochemiluminescence
I did it. Micronta 22191 Digital Machine
Using an integrator connected to a multimeter,
Multiplication of electrochemiluminescence obtained in this way
Elect by calculating the sum of tube tube signals
B) Chemiluminescence was measured. Electrochemiluminescence
For the sense signal, the sum of the vibration period for 10 seconds is obtained and is expressed in mV
Recorded. Rutenium-labeled rabbit anti-mouse IgG antibody
1.25 × 10^-7The storage solution for M is a concentrated solution of the labeled antibody.
(2 mg / ml, 7.5 Ru / antibody) in phosphate buffer solution
It was prepared by dilution with (PBS). This solution
The quantitation (80 μl) was performed using 0.1 M tetrabutyl in the reaction vessel.
Ammonium tetrafluoroborate (TBABF_Four)
And dimethyl sulfo containing 18 mM ammonium persulfate
Oxide (DMSO) / deionized distilled water (1: 1) 10m
l. Final concentration of ruthenium labeled antibody is 1 × 10
^-9M. Electrochemiluminescence as described above
Was measured.Ruthenium-labeled rabbit anti-mouse IgG antibody
Prepare various dilutions of the preservation solution.
Determine the amount (80 μl) with the ruthenium-labeled antibody in the reaction vessel.
Solution and make sure that the concentration of labeled antibody is as follows:
Ta: 5 × 10^-9M, 1 × 10^-8M, 5 × 10^-8M. Each solution
Measure the electrochemiluminescence of the solution as described above.
Specified. The measurements are listed in Table II below. these
From the results, the labeled antibody (1 × 10^-9M) Electrochemical
Demonstrates the sensitivity of luminescence detection and electrochemiluminescence
The intensity of the probe was determined by the concentration of ruthenium-labeled anti-mouse IgG antibody.
It turns out that it depends.[Table 2]Table IIRuthenium-labeled rabbit anti-mouse immunoglobulin G (IgG)Electrochemiluminescence (ECL) of antibodies        Ruthenium labeled anti-mouse        IgG antibody concentrationECL (mV)            5 × 10^-8M 1610          1 × 10^-8M 892          5 × 10^-9M 418          1 × 10^-9M 72          0 0Example 3-Solid-phase enzyme-labeled immunosorbent
Lute in Assay (ELISA)Num-labeled bovine blood
Immunological reactivity of clear albumin (BSA)Insert each hole of the polystyrene microtiter plate into 4,4 '
-(Dichloromethyl) -2,2'-bipyridyl, bis
Labeled with (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II)
Bovine serum albumin, ie ruthenium-labeled bovine blood
Clear albumin (6Ru / BSA, 20μg / ml PB
S, 50 μl / well) or unlabeled BSA (20 μg / well)
(PBS, 50 μl / well).
And incubated for 1 hour at room temperature. this
After the incubation period, the titer plate is washed once with PBS.
Washed 3 times for 5 minutes per time. 6mg / ml rabbit anti
The solution containing the BSA antibody was 1: 20,000 in PBS,
1: 30,000, 1: 40,000, 1: 50,000
0, 1: 60,000 diluted, ruthenium labeled BSA
Alternatively, two holes each coated with unlabeled BSA
To the titer plate at room temperature for 1 hour.
Was added. Washed 3 times with PBS as before
Goat anti-rabbit IgG-peroxidase conjugated to each well
Body (0.5 mg / ml solution diluted 1: 1000 in PBS)
And incubate the titer plate for 1 hour at room temperature
The presence of bound rabbit anti-BSA antibody
Whether it was detected. Titer board as before
Twice with PBS containing 0.5% Tween 20, twice with PBS
After washing twice, hydrogen peroxide (30%) and 2,2'-a
Dino-di- [3-ethyl-benzthiazoline sulfonate
G) (KPL, Gaithersburg, MD)
Mix in equal volumes and 200 μl of each
Added to the hole. After incubation at room temperature for 30 minutes, 4
The absorbance of the titer plate was measured at 14 nm. Ruteniu
Coated with unlabeled or unlabeled BSA
Average of 2 wells of each dilution of rabbit anti-BSA antibody added to the wells
From the measured value, calculate the average value of the background absorbance of the control well.
I pulled. These corrected absorbances are shown in Table V.From unlabeled BSA and ruthenium-labeled BSA
The curves obtained are parallel and the corrected absorbance at each point of the two curves
Was constant at about 0.6. Activated ruthenium as described above
And the same Ru / BSA prepared using the same
With two other ruthenium-labeled BSA lots with labeling ratio
The same result was obtained in the experiment. From the above results,
N-labeled BSA is immunologically reactive, ruthenium
Immunoreactivity when labeled with
It is shown to reach 60%.[Table 3]Table III                        Absorbance at 414 nm    Rabbit anti-BSA unlabeled ruthenium relative immunity    Antibody dilutionBSALabeled BSAReactivity      20.000 1.06 0.66 62%      30.000 0.83 0.50 60%      40,000 0.67 0.40 60%      50,000 0.56 0.33 59%      60,000 0.47 0.28 60%Example 4 Competitive Solid Phase Enzyme Labeled Immunosorbet
Assay (ELISA)Ruthenium sign c
Immunology of heron anti-mouse immunoglobulin (IgG) antibody
Reactivity4,4 '-(dichloromethyl) -2,2'-bipyridi
, Bis (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II)
Rabbit anti-mouse IgG antibody labeled with
Rabbit anti-mouse IgG antibody) to mouse IgG
Binding to the ability to compete with enzyme-labeled anti-mouse IgG antibodies
In comparison with unlabeled rabbit anti-mouse IgG antibody. 9
Mouse each hole in a 6-hole polystyrene microtiter plate
Coated with IgG solution (5μg / ml PBS)
And incubate at room temperature for 60 minutes,
Washed three times for 5 minutes each time. Rabbit anti-mouse IgG
-Alkaline phosphatase conjugate and rabbit anti-mouse I
Solution containing a mixture with gG (1 mg / ml) and rabbit
Anti-mouse IgG-alkaline phosphatase conjugate
Tenium-labeled rabbit anti-mouse IgG (1 mg / ml,
7.5 Ru / antibody).
Made. These two solutions and a rabbit anti-mouse IgG
A third solution comprising an alkaline phosphatase conjugate;
Was diluted 1:60 with PBS containing 0.5% Tween-20.
00, 1: 7000, 1: 8000, 1: 9000,
1: 10,000, 1: 12,000, 1: 14,000
0, 1: 16,000 diluted with mouse IgG
Each row of the titer plate was added (50 μl / well). Thailand
The plate was incubated at room temperature for 60 minutes and PBS-T
2 times with ween-20, 2 times with PBS, 5 minutes each time
Washed for a while. Enzyme substrate p-nitrophenyl phosph
(1.5 mg / ml 10% diethanolamine
Buffer (pH 9.6) (200 μl / well),
After incubating the plate for 30 minutes at room temperature,
The absorbance was measured in nm. For each dilution of the three solutions
Average absorbance of two wells to background absorbance of control wells
The average of was subtracted. These absorbance values are shown in Table VI.
You.The three curves obtained are parallel, and the top is the yeast.
If the binding of the conjugate was not inhibited, the second and third
Is ruthenium-labeled anti-mouse IgG and unlabeled anti-mouse I
In the case of inhibition by gG. Ruthenium labeled anti-ma
The curve for the mouse IgG was compared to the curve for the enzyme conjugate at each point.
Approximately 81% of the value of the curve for co-unlabeled anti-mouse IgG.
From the above results, the ruthenium-labeled anti-mouse IgG antibody was
Has immunological reactivity to its antigen (mouse IgG)
The binding to mouse IgG was determined by enzyme-labeled anti-mouse IgG anti-mouse.
The ability to compete with the body is approximately 80% of the unlabeled anti-mouse IgG antibody.
%.[Table 4]Table IV                        Absorbance at 405 nm                ABC                Anti-mouse IgG enzyme conjugate +                Alkaline ruthenium enzyme conjugate +                Sphatase labeled anti-mouse Unlabeled anti-mouse relative    Dilution   (Enzyme conjugate)IgGIgGDegree of inhibition^*    6,000 1.48 0.94 0.79 77%    7,000 1.33 0.82 0.69 79%    8,000 1.21 0.72 0.62 82%    9,000 1.10 0.65 0.56 84%  10,000 1.01 0.60 0.51 82%  12,000 0.87 0.51 0.43 80%  14,000 0.77 0.45 0.37 81%  16,000 0.68 0.40 0.33 80%────────────────────────────────────      * (AB / AC) x 100%Example 5 Ruthenium-Labeled Bovine Serum Albu
Electrochemiluminescence of Min (BSA)Essence4,4 '-(dichloromethyl) -2,2'-bipyridi
, Bis (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II)
Serum albumin (BSA) labeled with
7.8 x 10 (labeled bovine serum albumin)^-6M solution
Storage solution of ruthenium-labeled BSA (2.6 mg / m
1, 6Ru / BSA) in phosphate buffer solution.
Therefore, it was prepared. 26 μl of this solution was placed in a reaction vessel at 0.
1M TBABF_FourAnd 18 mM ammonium persulfate
DMSO / deionized distilled water (1: 1)
I got it. Final concentration of ruthenium labeled BSA is 2 × 10^-8M
And Electrochemiluminescence in the same manner as in Example V
Was measured. 6. Unlabeled BSA using the same method.
8 × 10^-6M solution was prepared and the final concentration of unlabeled BSA was
2 × 10^-8M was added to the reaction vessel. This solution
Electrochemiluminescence of similar solutions without BSA and BSA
The sense was measured. Covalently bonded ruthenium-labeled BS
A, Electrochemiluminescence measurements of unlabeled BSA
Is shown in Table V.[Table 5]Table VElectrochemiluminescence (ECL) of ruthenium labeled BSASolutionECL (mV)    2 × 10^-8M ruthenium labeled BSA 730    2 × 10^-8MBSA 100    DMSO: H_TwoO (1: 1) 0Example 6 Ruthenium-Labeled Rabbit Anti-Mouse
Immunoglobulin G (IgG) antibodyLectro Chemi-Lumi
Essence4,4 '-(dichloromethyl) -2,2'-bipyridi
, Bis (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II)
Rabbit anti-mouse IgG antibody labeled with
Rabbit anti-mouse IgG antibody)^-6M solution
For storage of ruthenium-labeled rabbit anti-mouse IgG antibody
Phosphate buffer of solution (2 mg / ml, 7.5 Ru / antibody)
Prepared by dilution with the solution. 80 μl of this solution
With 0.1M TBABF in the reaction vessel_FourAnd 18 mM excess
DMSO / deionized distilled water containing ammonium sulfate
(1: 1) was added to 10 ml. Ruthenium labeled antibodies
Final concentration is 1 × 10^-8M. In the same manner as in Example 2,
Lectro chemiluminescence was measured. Using the same method
1.25 x 10 of unlabeled rabbit anti-mouse IgG antibody^-6
M solution was prepared and the final concentration of unlabeled antibody was 1 × 10^-8M
In the reaction vessel. Contains this solution and antibody
There is no similar solution electrochemiluminescence
Was measured as described above. Ruthenium-labeled rabbits covalently bonded
Anti-mouse IgG antibody, unlabeled rabbit anti-mouse IgG antibody
The body electrochemiluminescence measurements are shown in Table VIII.
Show.[Table 6]Table VI        Ruthenium-labeled rabbit anti-mouse immunoglobulin G (IgG)        Electrochemiluminescence (ECL) of antibodiessolutionECL (mV)      1 × 10^-8Ruthenium labeled rabbit 892      Anti-mouse IgG antibody      1 × 10^-8Rabbit anti-mouse IgG antibody 0      DMSO: H_TwoO (1: 1) 0Example 7-Antibodies to bovine serum albumin
Body homogeneous electrochemiluminescenceImmunoassay4,4 '-(dichloromethyl) -2,2'-bipyridi
, Bis (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II)
Serum albumin (BSA) labeled with
7.8 x 10 (labeled bovine serum albumin)^-6M solution
Storage solution of ruthenium-labeled BSA (2.5 mg / m
1, 6Ru / BSA) phosphate buffer solution (PBS)
Prepared by dilution. 26 μl of this solution was added to the reaction volume
0.1M TBABF in the vessel_FourAnd 18 mM persulfate
DMSO containing demonium / deionized distilled water (1: 1) 1
0 ml was added. The final concentration of ruthenium labeled BSA is 2
× 10^-8M. Electroforming in the same manner as in Example 2.
Chemiluminescence was measured. Unlabeled B using the same method
7.8 × 10 of SA^-6M solution was prepared and unlabeled BSA
Final concentration 5 × 10^-8M into the reaction vessel
Was. Elect of this solution and a similar solution without BSA
B) Chemiluminescence was measured. Rabbit anti-BSA antibody
3.75 × 10^-FiveStorage of rabbit anti-BSA antibody
Of the working solution (6.0 mg / ml) using PBS.
And a fixed amount (26 μl) of this solution is placed in a reaction vessel.
Of ruthenium-labeled BSA solution plus rabbit anti-BSA
Final body concentration 1 × 10^-7M.The thus obtained ruthenium-labeled BSA
Electrode of mixture of antigen and antibody (rabbit anti-BSA)
Chemiluminescence was measured. Is the result shown in Table VII?
Et al., Electrochemiluminescence of ruthenium-labeled BSA
Is shown to decrease with the addition of rabbit anti-BSA antibody
Homogeneous electrochemiluminescence of antibodies to BSA
It can be seen that sense detection is possible. Based on the above results
Other experts in the field to analyze other analytes of interest.
Homogeneous electrochemiluminescence immuno for delivery
Assays could also be developed.[Table 7]Table VII          Ruthenium-labeled bovine serum albumin during antibody binding          Reduction of electrochemiluminescence (ECL)  Unlabeled ruthenium labeled rabbit  BSA BSA Anti-BSA  (Control)(antigen)(antibody)ECL (mV)  0 2 × 10^-8M 0 727  0 2 × 10^-8M 1 × 10^-7M 92  2 × 10^-8M 0 0 94Example 8-Mouse immunoglobulin G (Ig
G) Homogeneous electrochemiluminescenceSwimnoasse
I4,4 '-(dichloromethyl) -2,2'-bipyridi
, Bis (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II)
Rabbit anti-mouse IgG antibody labeled with
6.25 × 10 5 rabbit anti-mouse IgG antibody)^-6M solution
For storage of ruthenium-labeled rabbit anti-mouse IgG antibody
Phosphate buffer of solution (2 mg / ml, 7.5 Ru / antibody)
Prepared by dilution with a solution (PBS). This solution
80 μl of the solution was added to 0.1 M TBABF in a reaction vessel._Fouras well as
DMSO / deionized with 18 mM ammonium persulfate
It was added to 10 ml of distilled water (1: 1). Ruthenium labeled anti
Final body concentration 5 × 10^-8M. As in the second embodiment
And measured the electrochemiluminescence. The same way
6.25 × unlabeled rabbit anti-mouse IgG antibody
10^-6M solution was prepared and the final concentration of unlabeled antibody was 5 × 1
0^-8M was added to the reaction vessel. This solution and antibody
Electrochemiluminescence of a similar solution containing no
It was measured.2.5 × 10 5 mouse IgG^-FiveM solution
PB of mouse IgG storage solution (4.0 mg / ml)
Prepared by dilution with S, 2 volumes (2
0 μl and 40 μl) in the reaction vessel.
The final concentration of mouse IgG in addition to the mouse IgG solution
5 × 10 each^-8M, 1 × 10^-7M.
Ruthenium-labeled anti-mouse IgG antibody thus obtained
Of a mixture of glycerol and an antigen (mouse IgG)
The luminescence was measured. The results are shown in Table VIII. Jere
Quantitative chemiluminescence measurements indicate mouse IgG antigen concentrations.
FIG. 1 shows the dependence on the degree. The above result
Et al, Electrochemiluminescence of ruthenium-labeled antibodies
It can be seen that decreases with the addition of antigen. These results
Other analytes of interest by experts in the field based on
Homogeneous electrochemiluminescent method for measuring the concentration of
Immunoassays could also be developed.[Table 8]Table VIII                Ruthenium-labeled antibody during antigen binding              Reduction of electrochemiluminescence (ECL)    Unlabeled anti-ruthenium label    Mouse IgG anti-mouse IgG mouse IgG    (Control)(antibody)(antigen)ECL (mV)    0 5 × 10^-8M 0 1610    0 5 × 10^-8M 5 × 10^-8M 1360    0 5 × 10^-8M 1 × 10^-7M 1240    5 × 10^-8M 0 0 0Example 9-Mouse anti-Legionella
Immunoglobulin G (IgG) antibody and ruthenium-labeled c
A heron anti-mouse immunoglobulin G (IgG) antibody was used.
LegionellaHeterogeneous Electrochemiluminescence
Immunoassay─────────────────────────
───────────BacteriaLegionellamicdadeiHorma
The phosphatized suspension has an optical density of 1.00 (at 425 nm)
And diluted with PBS. About 3 × 10⁹Conical cells
Into microcentrifuge tubes. Centrifuge the cells (10 minutes
Between 10,000 RPM), discard the supernatant,Legion
ellamicdadeiSpecific mouse monochrome
Of IgG antibody (1.45 mg / ml) in PBS
The cells were resuspended in a 1:50 dilution (1 ml). At room temperature
After 1 hour incubation, centrifuge the cells and discard the supernatant.
Cells were resuspended in PBS and centrifuged again. Supernatant
After discarding, 4,4 '-(dichloromethyl) -2,2'-
Bipyridyl, bis (2,2'-bipyridyl) ruthenium
Rabbit anti-mouse IgG antibody labeled with (II)
A ruthenium-labeled rabbit anti-mouse IgG antibody (2 mg /
ml, 7.5 Ru / antibody) in a 1:50 dilution in PBS.
The cells were resuspended. Incubated for 1 hour at room temperature
Afterwards, centrifuge the cells, discard the supernatant and resuspend the cells in PBS.
It was turbid and washed twice by centrifugation as described above. Last wash
After purification, the cells were resuspended in 200 μl of PBS. This fine
100 μl of the cell suspension is added to 0.1 M TBAB in a reaction vessel.
F_FourAnd DMSO containing 18 mM ammonium persulfate
Add 10 ml of deionized distilled water (1: 1) to the reaction vessel
Moved. Electrochemiluminescence of this cell suspension
Was measured. Transfer the remaining 100 μl of the cell suspension to the reaction vessel
In addition, electrochemiluminescence was measured. Example
Electrification of cell-free solution according to the method described in 2.
Chemiluminescence was measured as a control. Shown in Table IX
From the results, the ruthenium-labeled rabbit anti-mouse IgG anti-mouse
Using the bodyLegionellaHeterogeneous Electronization
That the luminescence immunoassay was successful.
Call[Table 9]Table IXLegionellamicdadeiHeterogeneous Electro of        Chemiluminescence (ECL) immunoassaySampleECL (mV)LegionellamicdadeiCell suspension 160    DMSO / H_Two1.9 × 10 in O (1: 1)⁹Cell    LegionellamicdadeiCell suspension 90    DMSO / H_Two9.3 × 10 in O (1: 1)⁸Cell    DMSO: H_TwoO (1: 1) 0Example 10-Mouse anti-Legionell
aImmunoglobulin G (IgG) antibody and ruthenium label
Using rabbit anti-mouse immunoglobulin G (IgG) antibody
WasLegionellaHomogeneous electrochemiluminescence of
Sense immunoassay─────────────────────────
───────────Bacteria in the same manner as described in Example 9.Legionel
lamicdadeiPrepare a suspension ofLegio
nella-Specific mouse monoclonal IgG antibody
Incubated with The cells are centrifuged, washed and
Resuspended in 0.2 ml of BS. 4,4 '-(dichloro
Methyl) -2,2'-bipyridyl, bis (2,2'-bi
Rabbit anti-mouse labeled with pyridyl) ruthenium (II)
IgG antibody, ie, ruthenium-labeled rabbit anti-mouse
IgG antibody (1.25 × 10^-6M) (80μ)
l) is added to the cell suspension and the mixture is incubated at room temperature for 2 hours.
Was added. Ruteni without cell suspension as control
The same dilution of rabbit anti-mouse IgG antibody labeled with
Incubated. After incubation is complete,
0.1M TBABF in a reaction vessel_Fouras well as
DMSO / deionized with 18 mM ammonium persulfate
Add 10 ml of distilled water (1: 1) and add ruthenium-labeled
The anti-mouse IgG antibody final concentration was 1 × 10^-8Becomes M
I did it. Electrochemiluminescence in the same manner as in Example 2.
The essence was measured. Ruthenium-labeled rabbit anti-mouse I
The same measurement was performed for the cell suspension to which the gG antibody was added.
Was. From the results shown in Table X, the electrochemiluminescence
Release of the antibody is compatible with ruthenium-labeled anti-mouse IgG antibody.Le
gionellaMouse monoclonal antibody bound to
Is found to decrease by the interaction betweenLe
gionellamicdadeiHomogeneous elect
Successful chemiluminescence immunoassay
It is shown.[Table 10]Table XLegionellamicdadeiHomogeneous electro        Chemiluminescence (ECL) immunoassaySampleECL (mV)    1 × 10^-8M ruthenium label 976    Anti-mouse IgG antibody    1 × 10^-8M ruthenium label 803    Anti-mouse IgG antibody +    LegionellamicdadeiJoined to    Monoclonal antibody    DMSO: H_TwoO (1: 1) 0Example 11-Ruthenium standard bound to bacteria
Electrochemiluminescence upon release of antibodiesSense increaseBacteriaLegionellamicdadeiHorma
The phosphatized suspension has an optical density of 1.00 (at 425 nm)
Dilute with PBS so that 2 ml of this suspension is conical
Placed in microcentrifuge tubes. Centrifuge the cells (10 minutes,
10,000 RPM), discard the supernatant,Legionel
lamicdadeiSpecific mouse monochroma
1: 1 IgG antibody (1.45 mg / ml) in PBS
Cells were resuspended in 0 dilution (1 ml). 1 hour at room temperature
After incubation, centrifuge the cells as above and
The supernatant was discarded and the cells were resuspended in PBS and centrifuged again.
After discarding the supernatant, ruthenium-labeled rabbit anti-mouse IgG
Antibody (1 ml, 7.5 Ru / antibody) 1:50 in PBS
The cells were resuspended in the diluent. Incubate for 1 hour at room temperature
After centrifugation, the cells are centrifuged as above, the supernatant discarded,
Resuspend cells in BS and centrifuge twice as described above
Washed. PBS or 1.0 M acetic acid after the last wash
Dissolve in 100 μl of 0.9% NaCl (physiological saline) solution.
The cells were resuspended and incubated at room temperature for 40 minutes. Far
After the heart, 100 μl of the cell supernatant was added to 0.1 M TBABF._Four
And DMSO containing 18 mM ammonium persulfate
Transfer to a reaction vessel with 10 ml of distilled water (1: 1)
Was. According to the method described in Example 2, acetic acid / physiological saline solution was used.
Of cell supernatant and supernatant from PBS-washed cells
Chemiluminescence was measured. Electrochemiluminescence
The measured values of the antibodies were as shown in Table XI.
Coated withLegionella1.0 bacteria
M acetic acid-saline treatment (Ref.
23) Ruthenium labeled rabbit anti-mouse IgG from there
Produced by unbound ruthenium-labeled antibody upon elution
Increased electrochemiluminescence
Call Based on the above results, the ruthenium-labeled antibody was
Coated with an internal antibodyLegionellaTo
It is bound and the background is
It is also shown that the ECL does not increase in comparison.[Table 11]Table XI      Coated with ruthenium-labeled anti-mouse immunoglobulin G (IgG)      Electrochemiluminescence (ECL) of the supernatant of the plated cellsSolutionECL (mV)  Background control:  1.0 M acetic acid-saline 100 μl 134  100 μl of PBS-washed cell supernatant 121  1.0 M acetic acid-saline wash 214  Cell supernatant 100 μlExample 12-Pregnane-diol in urine
Homogeneous system of 3-glucuronide (PD3G)Competing immunoasses
ILabeling urine samples with known amounts of electrochemiluminescent species
PD3G and a known amount of anti-PD3G antibody
Presence of PD3G and PD3G-electrochemical species
Contact under conditions that compete for the binding site of the body.
To obtain pregnane-diol-3-glucuro
Nide (PD3G) can be detected and quantified. After some time,
Electrochemiluminescent species repeated in the obtained sample
Electrochemical energy capable of emitting electromagnetic radiation
Repeated release of electromagnetic radiation by providing a source directly
It comes out. Quantifies the emitted radiation, and
Therefore, it is possible to measure the amount of PD3G present in a sample.
it can.Example 13-Tris-ruthenium bipyridi
Le-n-hydroxysuccinimide SNucleic acid using Ter
Sign10 mM Tris-HCl (pH 8.0) -1 mM EDTA
Heat-denature the nucleic acid sample (5-25 μg), cool,
Bisulfite contact of cytosine residues with ethylenediamine.
Modification is carried out by transamination at 42 ° C. for 3 hours. 5m
External solution was added overnight in M sodium phosphate buffer pH 8.5.
After dialysis with three changes, the sample is subjected to ultrafiltration.
Concentrate to 100 μl. Nucleic acid modified in this way
(1-10 μg) in 0.1 M sodium phosphate buffer p
Dilute with 100 μl of H8.5. Tris-ruthenium
Bipyridyl-N-hydroxysuccinimide ester derived
The body is transformed into N, by methods known in the art.
0.2M storage in N 'dimethylformamide (DMF)
Prepare a solution for 5 μl of this ester solution was added to 0.1 ml.
Dissolution of modified nucleic acid in 1 M sodium phosphate buffer pH 8.5
Add to the solution and incubate for 1 hour at room temperature. Marked
Nucleic acid probe was replaced with 150 mM sodium chloride-10 mM
External solution should be at least 3 in sodium phosphate buffer (pH 7.0).
Purify by dialysis with multiple changes and store at 4 ° C until use
I do.Example 14-Human T cell leukemia in blood III
Virus (HTLV-III) nucleic acidHybrid formation
AssayTreat blood to release RNA from viral particles
HTLV-III virus in whole blood
Can be detected. A sample containing HTLV-III RNA was
Electrochemiluminescence complementary to TLV-III RNA
Single-stranded oligonucleotide probes labeled with nesens species
Contact with lobe. After a suitable amount of time,
Lectro chemiluminescent species emit electromagnetic radiation repeatedly
Provide a direct source of electrochemical energy
Causes the electromagnetic radiation to be emitted repeatedly.
You. Quantifies the emitted radiation, thereby
Measuring the amount of HTLV-III RNA present
it can.Example 15-Legionel in clinical sample
La bacterial homogenous nucleic acid hybrid formAssayLegionella bacteria in clinical samples such as sputum,
Treat sputum to release ribosomal RNA from bacteria
Can be detected. The sample obtained in this way is
Specific to Legionella in ribosomal RNA
Complementary to the sequence and labeled with an electrochemiluminescent species
With the single-stranded oligonucleotide probe. Suitable
After the appropriate time, the resulting sample should be electrochemiluminescent.
Electrochemistry that can repeatedly emit electromagnetic radiation
Electromagnetic radiation by providing a direct energy source
Is released repeatedly. Determine emitted radiation
The Legionel present in the sample
The amount of bacteria can be measured.Example 16-Genomic DN by strand displacement method
Cytomegalovirus inserted in ADetect DNA
Hybridization assays forDNA is released from tissue samples such as lymphocytes
And the DNA is cut by restriction enzymes.
In addition, cytomegalovirus in human genomic DNA
(CMV) DNA can be detected. C obtained in this way
A sample containing a double-stranded fragment of MV was complemented with CMV DNA.
And labeled with an electrochemiluminescent species, DN
A: A single-stranded oligonucleotide capable of substituting one of the double strands
Contact with otide probe. After a suitable time, obtained
Electrochemiluminescent species repeatedly emitted to sample
Direct sources of electrochemical energy capable of emitting radiation
By giving, it will emit electromagnetic radiation repeatedly
To do. Quantify the emitted radiation, and
Measure the amount of cytomegalovirus RNA present in the sample
can do.Example 17-Human bladder cancer by heterogeneous method
Detect ras oncogenes in cellsHybrid for
Dosing assayPreviously reported by Maniatis, T et al. (24)
DNA is released from tissue samples using known methods.
The DNA is cleaved by the restriction enzyme,
Treated to bind to nitrocellulose paper
Can detect the ras oncogene in human bladder cancer cells
You. Filter paper with single-stranded DNA bound to ras oncogene
Ori labeled with specific, electrochemiluminescent species
Contact with a oligonucleotide probe. Suitable reaction time
Later, electrochemiluminescent species are added to the resulting sample.
Electrochemical energy capable of emitting electromagnetic radiation repeatedly
Energy source directly to regenerate electromagnetic radiation
And release it. Detects emitted radiation and
Thereby determining the ras oncogene present in the sample
Can be[0093]Example 18-Electrochemiluminescence
Enzyme assay using polymer as substrateFor example, Denbun, dextran, synthetic high polymer
Such high molecular enzyme substrates as electrochemiluminescent species
May be labeled. The labeled substrate is an enzyme present in the multicomponent system.
Used to detect and quantify elements. The labeled substrate
Antibodies, DNA probes, RNA probes, Streptavi
For quantifying the amount of enzyme bound to gin, biotin, etc.
used. The labeled substrate can be selectively
It can be cut into smaller fragments. What enzyme-substrate
Can be used in combination. An example of an enzyme is gluco
Sidase, lyase, dextranase, etc.
You. After a suitable time, the resulting sample is electrochemiluminescent.
An electric current that the essence species can emit electromagnetic radiation repeatedly.
By directly providing a source of chemochemical energy,
Radiation is emitted repeatedly. Emitted radiation
Quantifies the line, thereby determining the amount of enzyme present in the sample.
Can be measured. Each electrochemiluminescent
The element amplified from the cleavage fragment labeled with the sense species
The advantage is that an electrochromic signal is obtained.
You.[0094]Example 19-Electrochemiluminescence
Detection of Streptococcus by enzyme assayElectrochemiluminescence of samples containing Streptococcus
Contact with a reaction solution containing a species-labeled synthetic peptide.
Synthetic peptides are specific substrates for this bacterial peptide
Is used. Peptidases act on synthetic peptides
Labeled with an electrochemiluminescent species
Pieces are produced. After an appropriate time, the obtained sample is
Toro chemiluminescent species repeatedly emits electromagnetic radiation
To provide a direct source of electrochemical energy
Therefore, the electromagnetic radiation is repeatedly emitted. Release
Quantifies the emitted radiation, thereby allowing it to be present in the sample.
The amount of Streptococcus spp.Example 20-Electrochemiluminescence
Of hepatitis B surface antigen using aMuno assayA blood sample containing hepatitis B surface antigen (HBsag) was
An antibody specific to Bsag and labeled with dextranase
Contact for an appropriate time. Antibody not bound to HBsag
The body is removed and the antigen-antibody complex is electrochemiluminescent.
Contact with dextran labeled with a sense species. Dex
By the action of Tranase on the labeled polymer
Each fragment labeled with an electrochemiluminescent species is produced.
Be born. After a suitable time, the obtained sample is
Chemiluminescent species can emit electromagnetic radiation repeatedly
Directly by providing such an electrochemical energy source.
To emit electromagnetic radiation repeatedly. Released
Quantified radiation and thereby the B present in the sample
The amount of hepatitis hepatitis surface antigen can be measured.Example 21-Electrochemiluminescence
Bradykini using labeled bradykininAverage receptor
Quality AssayPrepare appropriate tissue samples containing bradykinin receptor
And labeled with electrochemiluminescent species
Contact with nin. After a suitable time, the obtained sample is
Spectrochemiluminescent species repeatedly emit electromagnetic radiation
Providing a direct source of electrochemical energy
This causes the electromagnetic radiation to be emitted repeatedly.
Quantifies emitted radiation and is therefore present in the sample
You can measure the amount of bradykinin receptor
You. This assay is an estrogen-estrodiene reagent.
Other ligand-receptor interactions such as receptors
Can also be used to measure. In addition, the assay
The amount of unlabeled ligand can be reduced using a binding assay format.
It can also be used for measurement and quantification.Example 22-Detection of nucleic acid hybrids
Of electrochemiluminescent speciesUseDouble-stranded DNA, DNA-RNA double-stranded, double-stranded RNA
Samples containing such nucleic acid hybrids, particularly nucleic acid hybrids
Electrochemiluminescent species that can be inserted between the lids
Contact. After a suitable amount of time,
Chemiluminescent species can emit electromagnetic radiation repeatedly
By providing such a source of electrochemical energy directly
Thus, the electromagnetic radiation is repeatedly emitted. release
Quantified radiation, thereby present in the sample
The amount of the nucleic acid hybrid can be measured.Example 23-Electrochemiluminescence
Of antibodies and salivary antibodies in saliva by homogeneous immunoassay
Human T-cell leukemia virus III (HT
LV-III) Detection of antigenSaliva test containing HTLV-III complexed with antibody
A chaotropic agent to separate the antigen-antibody complex
Contact with a solution containing Next, this solution was added to HTLV-
III specific and labeled with electrochemiluminescent species
Contact with the antibody. Remove chaotropic agent and
The antisense antibody and the unlabeled antibody are allowed to bind to the antigen again. When appropriate
After a short time, the resulting sample contains an electrochemiluminescent species.
Electrochemical energy that can emit repeated electromagnetic radiation
By providing a source of energy directly
Return it to release. Quantifying the emitted radiation,
Human T-cell leukemia virus present in the sample
Measuring the amount of antigen III (HTLV-III)
Can be. The above method is based on the hepatitis antigen-antibody complex,
Megalovirus-antibody conjugate, non-A non-B hepatitis-antibody conjugate
Containing other types of antigen-antibody conjugates in serum, such as
It can also be applied to materials.Example 24-Various Staphylococ
detection of cus enterotoxinsImmuno for the fixed
AssayEach Staphylococcus of A, B, C, D, E
Enterotoxin-specific monoclonal antibodies and
Monoclones cross-reactive with their enterotoxins
The lonal antibody was purified. Each antibody agaroses ascites
Staphylococc bound to a sgel support
us on the A protein column,
Production method (Bio-Rad Laboratories, I
nc. Flow binding, elution and regeneration buffer based on part of
By purification. In the purification process, usually 1 ml was applied.
2 ml of ascites containing 5 to 15 mg of monoclonal antibody
With two F-13 analytical papers (Schleicher a
nd Schuell, Inc. Metric during
Cell membrane filter (Gelman Scie)
nces, Inc. ) And 10ml syringe at the bottom
(Becton Dickenson, Inc.)
And insert the piston to filter ascites into the collection vessel
Pre-filtration. Add an equal volume of binding buffer to the filtrate
Add 5 ml A protein-agarose column and overlay
Was. Next, put the binding buffer into the reagent container of the column and start elution.
Started. Absorbance of effluent at 280 nm
(A₂₈₀) And collect 1 ml fractions
Was. A₂₈₀When column returns to stable reference value, combine column
Wash with 5 bed volumes of buffer, then flush with elution buffer
Purified immunoglobulin was eluted from the column. Exemption
Elute fractions with 1M Tris salt to neutralize
Taken in 0.3 ml of acid pH 9.0. A₂₈₀Is again
After returning to a stable reference value, remove the column from the
Volume, followed by 10 bed volumes of regeneration buffer.
Wash with 5 bed volumes of combined buffer and purify the column for the next purification step
Has been adjusted so that Purified immunoglobulin
The fractions containing the solution are collected and agitated ultrafiltration (Amic
on Corp .. ). Purified immunity
Total protein of globulin was measured by the Lowry method
However, the final concentration was 5 mg / ml or more. Refined
Antibody was phosphate buffered with 0.1% sodium azide
48 hours at 4 ° C while changing the external solution twice in liquid (PBS)
Dialyzed for a while.Specificity of purified monoclonal antibody
To measure immunological reactivity to enterotoxin
Into 96-well microtiter plate ELISA system
Was. The value obtained for the antibody titer should be
It was compared with the control potency value of the defined lot. Enough power
Antibodies with different valencies are placed in a reagent holder or dips.
Tick or for immunoassays
For binding to the enzyme used as a probe
Qualified as an epidemiologically functional coating antibody
Was. Immobilize the antibody on the surface of the nitrocellulose membrane and attach the membrane.
Prepare a diagnostic reagent holder (dipstick)
First, soak the membrane in a phosphate buffer solution for 1 hour at room temperature.
To increase the wettability of the membrane. Remove stick from solution
The membrane was allowed to air dry. Staphylococcus
Specific for one of each enterotoxin A, B, C, D, E
Purified monoclonal antibodies or non-specific control mice
Immunoglobulin (Jackson Immuno Re
search Laboratories, Inc. )
2 μl of the solution directly into different locations on the membrane surface.
I did it. The concentration of each antibody used depends on the binding of nitrocellulose.
The concentration was known to be able to saturate the joint site:
3A antibody (specific for A toxin) 250 μg / ml, 2
B antibody (specific for B toxin) 50 μg / ml, 1C3
300 μg of antibody (specific for C1, C2, C3 toxin)
/ Ml, 3 μg antibody (specific for D toxin) 200 μg /
ml, 4E antibody (specific for E toxin) 250 μg / m
1, 200 μg / m of non-specific control mouse immunoglobulin
l. Air dry the dipstick at room temperature,
To block protein binding sites remaining on the membrane
Dipstick 0.5% Tween 20 and 3%
It was immersed in a phosphate buffer solution containing bovine serum albumin.
Incubated overnight in this blocking solution at room temperature
Thereafter, the stick was air dried.The purified monoclonal antibody 2A (A and
And E toxin), 6B (B, C1, C2, C3
Toxin specific), 1D (specific for D toxin)
Diagnostic covalently bound to alkaline phosphatase
Antibody immobilized on the membrane surface of the dipstick in the holder
A, B, C1, C2, C3, D, E
Used as a binding probe to detect the presence of syn
Was. Each conjugate converts glutaraldehyde into two different functions.
Two-stage stoichiometrically controlled
Prepared by the following steps. At this stage, EIA Grade A
Lucari phosphatase (2500 U / mg, Boeh
ringer Mannheim Corp. ) 0.4
7 ml of 13.4 μl of aqueous glutaraldehyde solution
(25%, Sigma Chemical Co)
50 mM calcium phosphate buffer solution pH 7.2
Added in 2 ml. Stir the mixture at room temperature for 90 minutes
Glutaraldehyde on the unbound amino group of the enzyme molecule
Combined. After incubation is complete,
Add 2 ml of 1 mg / ml noclonal antibody
Stir the mixture for an additional 90 minutes and cool on ice
To terminate the binding reaction. 0.1% azide conjugate
Exchange the external solution twice in a phosphate buffer solution containing sodium.
While dialysis at 4 ° C. for 48 hours. Bovine blood in the solution after dialysis
Add clear albumin to a final concentration of 3% and at 4 ° C
To be stable during storage. Antibody-enzyme conjugate
Measure immunological reactivity to specific enterotoxins
To be used in a 96-well microtiter plate ELISA system.
Noted. The value obtained as the titer of the conjugate is
Compared to the control power value of previously certified lots.
Conjugates with sufficient titer were identified as Staphylococc.
dipstick assay for us enterotoxins
Certified for use inHam, sausage, noodle, cheese, etc.
Food contamination by Staphylococcus
The most likely form of food is Staphylococ
to perform assays for cus enterotoxins
Liquid suspension. Typical extraction methods include food
20 ml of water is added to 20 g of the product, and Stomacherla
Mix using bbender (Tekmar Co)
The material was homogenized for 30 seconds. Of more viscous foods
In some cases, the volume of water was doubled. Before homogenization
Is later Staphylococcus enterotoxin
Was added to the food. Diagnosis above for food homogenates
Test directly using the reagent holder dipstick
went. In food samples with small amounts of endotoxin
Also gave a positive result. Staphylococcu
In order to increase the detection sensitivity of enterotoxin,
Added the stage of exit. Adjust the pH of the homogenate to 6N HCl
Adjust to 4.5 using 20,000 g for 20 minutes
And the pH of the supernatant was adjusted to 7.5 using 5N NaOH.
And centrifuged again at 20,000 g for 20 minutes.
Used directly for dipstick assays. like this
Of enterotoxin detection of food extract prepared in advance
Is 1 ng / ml for each toxin in each food tested
It was an extract. Diagnosis for liquid foods such as milk
Soak the reagent holder dipstick in liquid food
Performs direct tests in the same manner as body food homogenates
did. When testing these foods, the additional
Sensitivity is reduced to 1 ng / ml by adding an extraction step.
I tried to go up.The individual strains of Staphylococcus
Immobilize monoclonal antibodies specific for enterotoxin
Nitrocellulose membrane with diagnostic reagent holder
Sticks), liquid foods, food homogenates,
Or 1 ml of the food extract prepared as described above,
Or a test tube containing 1 ml of PBS. More than
The solution contains Staphylococcus enterotoxy.
Concentration of 1 ng / ml or 1 ng / ml each.
A mixture of enterotoxins was added. Dips
Ticks are placed in these sample solutions for 1 hour at room temperature
Soaked while shaking on Lee Shaker. Then date
Remove the stick from the sample and add 0.5% Tween
5 minutes in PBS containing -20, 5 minutes in PBS alone
Each was shaken twice more. The monoclonal antibody described above
The mixture of alkaline phosphatase conjugates is as follows:
2A conjugate (specific for A and E toxins)
Target), 6B conjugate (specific for B, C1, C2, C3 toxins)
1:10 of 1D conjugate (specific for D toxin)
00 dilution in the same solution (0.5% Tween-20 and
Conjugate in 30 ml of PBS containing 3% BSA
l). Dipstick in this conjugate mixture
Soak (2 ml per stick) and shake at room temperature.
Incubate for 30 minutes with shaking. Dips
Tick twice in PBS-Tween, 3 in PBS
Wash with shaking for 5 minutes each time.
Unbound monoclonal antibody-alkaline phosph
The tatase conjugate was removed.Unbound monoclonal antibody-enzyme conjugate
Was removed from the diagnostic reagent holder dipstick
Then, place the dipstick in 5-bromo-4-chloroin
Drill phosphate (BCIP, Sigma Chem)
ical Co. ) And nitroble-tetrazolium
(NBT, Sigma Chemical Co.)
The conjugate was immersed in a solution containing the conjugate and the presence of the bound conjugate was detected.
BCIP and NBT solution were prepared as follows respectively.
Done: 3.2 mg BCIP with 0.1 M Tris-HCl,
0.1 M NaCl, 5 mM MgCl_Two10 ml of solution
Then, 8.8 mg of NBT was dissolved in 10 ml of the same solution.
These solutions were mixed immediately before use. Dip stick
Immersed in the substrate mixture with shaking for 30 minutes at room temperature.
And then washed with water and air-dried.
Is now permanently recorded. The whole process of this assay
With little or no pipetting required,
Processing time is minimal and can be completed in about 2 hours
Wear. BCIP, which is a substrate of the enzyme conjugate, is toxic on the membrane.
Is hydrolyzed by the conjugate bonded to the
Insoluble blue that originally binds to the membrane on the dipstick
It produces a reaction product that can be a color material. Stap in the sample
hylococcus enterotoxin is present on the membrane
The second monoclonal antibody binds to the immobilized first monoclonal antibody.
Detection by binding to clonal antibody-enzyme conjugate
If present, a blue spot on the nitrocellulose membrane
Appears and is instructed. Staphylococ in the sample
If cus enterotoxin is not present,
The lulose membrane remains white. Control mouse immunoglobulin
In each case, the membrane at the position where the
Was. Each Staphylococc of A, B, C, D, E
us Enterotoxin specific monoclonal antibody
Blue spots at clearly distinguishable locations on the fixed membrane
Appearance identifies specific enterotoxin
Is done. Use the diagnostic reagent holder dipstick
Liquid food, food homogenate, food extraction
One or more Staphylococ in the birth
Detection of cus enterotoxins up to 1 ng / ml
It is possible to[0105]Example 25-Enzyme Immunoa of E. coli Bacteria
ISSEY (EIA)44.5 ° C. with the method of the invention (CAP-EIA MPN)
Approved by EPA using EC broth
Of Escherichia coli in the stool with the MPN confirmation test method
An experiment was performed to compare the rates. Experiment is standard 5-buy
The Al MPN assay was performed with the following changes. Sulfuric acid
Acid lauryl tryptose broth (LST, Difco
Labs, Detroit, MI)
Chillunberg Ferronglucuronide (MUG, Sigma
a Chemical Co. , St. Louis, M
O) Phenol red lactose broth containing 80 μg / ml
(PRLB, Difco Labs, Detroit,
MI) was used as the estimation medium.Production of lactose by phenol red dye
PRLB was selected to detect the acid produced by the yeast.
I chose. The gas obtained from the lactose fermentation is contained in each vial.
The air was collected in the inverted Durham vial inserted in.E.
coliDrug for preliminary confirmation of the presence of
MUG was used. The major Escherichia coli type in stoolE.co
liIs a fluorescent radiograph that cuts the MUG and is visible under UV light.
The only cell present in water that can release cal
It is a fungus (4, 10). CAP-EIA MPN Asses
The following three types of data can be obtained by the method: 1) Milk
Acid and gas production by sugar fermentation (putative E. coli
B) Fluorescence due to cleavage of MUG (E.coliAlso
Is the estimation of Escherichia coli type in stool) 3) CAP-enzyme immuno
Assay confirmation (confirmation test using monoclonal antibody)
Experiment). Next, the results of the MUG and CAP-EIA reactions
C broth (Difco. Labs, Detroit, M.
Based on lactose fermentation under high temperature of 44.5 ° C using I)
The results were compared with the results obtained by the standard method (1). The experiment is as follows
Performed: 3 times 10 times required for MPN assay
To make a dilution series, water samples taken from nearby rivers
The following volume contains 10ml of PRLB-MUG
A vial cap with a polystyrene hole inside
Iars were inoculated.Series A-5 vials, 1.00 ml inoculationSeries B-5 vial, 0.10 ml inoculationSeries C-5 vial, 0.01 ml inoculationAfterwards, all vials are introduced at 35 ° C for about 18-20 hours.
Cubbed. The next day, acid and
And gas production, and fluorescence under UV light. Acid or
Means turbidity (proliferation) regardless of gas reaction
All the vials are inverted and the cell-medium suspension is
The polystyrene hole inside the cap was filled. Defeat
Incubate the standing vial at 35 ° C. for 1 hour,
Bacteria (antigen) adhere to the polystyrene cap hole
Was. Next, remove the antigen bound to the cap hole from the vial
Then, the confirmation test using the antibody was continued.Assay EIA (Enzyme Immunoassay)
In order to perform the part of the above, the hole was made with a phosphate buffer solution (PBS, Na
8.5 g of Cl, Na_TwoHPO_Four  1.02 g, NaH
_TwoPO_Four・ H_TwoO 0.386g, 1000m with distilled water
l, bovine serum albumin (BS) in pH 7.2)
A, Sigma Chemical Co. , St. L
ois, MO) treated with 3% solution at 35 ° C. for 35 minutes,
All unbound sites on polystyrene were blocked. B
Immediately after discarding the SA solution, wash the wells twice with PBS,
E.coliC containing monoclonal antibodies against cells
50 μl of the hybridoma cell supernatant was added to each well to give 35 μl.
Incubate for 1 hour at
Specific antigen (E.coliCells)
Was. After discarding the antibody supernatant, a PBS-Tween 20 solution
(PBS + 0.05% Tween 20, JT Bak
er Chemical Co. , Phillipsb
urge, NJ) to wash unbound antibody three times.
Removed completely. The alkaline eluate purified by the affinity column
Sphatase-labeled goat anti-mouse IgG antibody (conjugate, K
PL, Gaithersburg, MD) with PBS
Dilute 1: 1000 and add 50 μl to each well. 3
After incubating at 5 ° C for 1 hour, PBS-Twee
Wash the wells four times with n20 solution to remove unbound conjugate
All were removed. Alkaline phosphaters used for detection
The substrate for the enzyme is sodium paranitrophenyl phosphate or
Is a Sigma-104 substrate (Sigma Chemical
al Co. , St. Louis, MO)
Tanol-amine buffer solution (diethanolamine 97m
1, NaN_Three  0.2g, MgCl_Two6H_TwoO 100
mg, distilled water 800 ml, pH 9.8).
What was dissolved so that it might become mg / ml was used. Substrate
Add 100 μl to each well and incubate at 35 ° C for 30 minutes.
After the heating, the reaction in each hole was visually observed. In this embodiment
For the purpose of quantification in
Transferred to crotiter plate and fitted with 405 nm filter
Titertek Multiscan (Flow L
laboratories, McCleans, VA)
Instrument measurements.EC Broth (Difco Labs, De)
troit, MI) using conventional methods
To perform a recognition test, each overnight culture in PRLB was
Incubate the growing bacteria one platinum loop at a time with 10 ml of EC broth.
Aseptically transferred into a test tube containing a standing Durham vial
did. The test tubes are prepared at 44.5 ° C. for 24
After incubation for ~ 48 hours, the presence or absence of lactose fermentation is detected.
(Due to the gas collected in the Durham vial)
). If you see any bubbles in the vial,
A sexual response was recognized. A summary of the data for each experiment is shown in Table XII and
XIII.From the results of Experiment 1, it was found that gas production from lactose
551 positive combinations based on MPN statistics
According to this, it is 35 Escherichia coli type / ml (estimated test). gas
Production positive (+) vial positive in MUG assay
Only four (A2 to A5)E.coli
Is likely to have been included (E.coliOr in flight
Escherichia coli type estimation confirmation). Conventional E
In the C test, five test tubes (A1 to A5) were used for Escherichia coli
While CAP-EIA was positive,
Only 4 vials (A2 to A5) showed.
Positive EIA readings range from 0.55 to 1.06
And the negative measurement was around 0.20. EIA trial
And MUG test data are the same vial A2-A
5 shows the presence of E. coli in the stool,
Positive data strongly supported by MUG positive data
Have been. In the conventional MPN method (15, 16, 20)
(+) And (-)
Vial A1 is negative for MUG and EIA and EC
The fact that was positive is not surprising. E
Select by incubation at high temperature in medium C
Is known to affect the recovery rate of Escherichia coli in feces
Have been. In addition, Escherichia coli type (E.coliAbout)
7% did not produce gas in EC (false negative),
8% of non-fecal coliforms grow in EC broth
It is known that the body can be produced (positive misjudgment).
That is, the EC reaction carried in the test tube A1 is a positive judgment.
May be a sexual response, and A1 of MUG and EIA
It seems to be the cause of the discrepancy with the results.
To other vials (B1-B5, C1-C5) in the same experiment
Good correlation was found in all studies.
Was. In other words, vials that were (-) in MUG
It is (-) in both EC and EIA, and in these vials
It was confirmed that there was no Escherichia coli type in E. coli.In Experiment 2, a water sample inoculated in a vial was used.
The sample is positive for gas production in all test tubes in the estimation test.
Therefore, it can be said that it was more strongly contaminated. MPN
The number of positive combinations according to the statistical table is 555, which is 240
It was shown that more than Enterobacteriform / ml was present. Confirmation test
When comparing MUG, EC and EIA using antibody,
Good correlation was seen. (MUG +)
All ears were also positive on EC and EIA. EI
The measured value of the A reaction was slightly weak positive from 0.46 (B2) to C
The very strong response seen in 4.
Was.Based on the above two experimental results, the present invention
Antibody-based CAP-EIA test detects the presence of Escherichia coli
Validate as well as EPA approved EC tests to confirm
It has been shown. See also the example of vial A1
As shown, the CAP-EIA test is specific for the antibody-antigen reaction.
Positive or negative misjudgment
Less. The CAP-EIA test is a conventional MPN test
It has some noticeable advantages over. Sand
1) Convenience-the joint via of the estimation test and the confirmation test
Transfer the solution or use another medium.
No need to use. 2) Rapidness-CAP-EIA test
Completes in 1/3 to 1/2 of the time required for conventional testing
Can be completed. 3) Specificity-antibody is high for its antigen target
Degree specific. In addition to the above advantages, CAP-EIA
Cap holes are for 4 types of independent data from the same vial.
Unique (acid, gas, fluorescence, EIA)
Designed for large samples in water and / or food samples
Conventional MPN for analyzing Enterobacteriaceae and Escherichia coli types
It is a much better alternative than testing. Vial again
E using a test tube cap containing a polystyrene insert
The concept of conducting IA is E. coli or E. coli in stool
Detection of other bacteria, not limited to assays
Can also be applied toEmbodiment 262- [3- (4-methyl-2,2'-bipyridine-4 '
-Yl) -propyl]Synthesis of -1,3-dioxolan600 ml three-necked gas purged with inert argon
In Lasco, dry tetrahydrofuran (THF) 30ml
And dry diisopropylamine 7.65 ml (54.6m
  mol) was added with stirring using a syringe.
In a low-type beaker, dry ice-isopropanol
Immerse the flask in the mixture and cool the solution to -78 ° C.
Was. 2.5Mn-butyllithium 21.6m in flask
1 (54 mmol) was added slowly. This solution
The mixture was stirred for 15 minutes, and 4,4 ′ dissolved in 300 ml of THF.
9.58 g of dimethyl-2,2'-bipyridine (52 m
mol) of the solution with stirring using a cannula.
It was added dropwise over 1 hour. The resulting brown mixture is
And stirred at -78 ° C for 2 hours.
10 g (55 mmol) of -1,3-dioxolane,
The mixture was added using a syringe and the resulting mixture was added at -78 ° C for 5 minutes.
Stirred for hours. Thereafter, the reaction vessel is placed in an ice bath (10 ° C.).
And after 30 minutes the color started to change (after 1 hour
Becomes dark purple; after 2 hours becomes blue; 2.5
Green after hours; lemon after 3.25 hours
Yellow).To the reaction mixture was added 30 ml of saturated NaCl.
And then add 10 ml of water and 50 ml of ether
And stopped the reaction. Extract the aqueous phase twice with 300 ml of ether
Out, combine the ether layers and back extract with 100 ml of water,
Dry over anhydrous sodium sulfate. Purify the reaction product
For this purpose, a neutral alumina (Merck) 9 with an activity III
The sample was separated using 0. As an elution solvent, stone
Using oil ether / diethyl ether (2: 1)
After using petroleum ether / diethyl ether (1: 1)
(The raw material is petroleum ether / diethyl ether (2: 1)
And the product was subsequently eluted). Step
The structure of the reaction product isolated by Roton NMR analysis
Was confirmed as follows.Embedded imageEmbodiment 274- (butane-1-al) -4'-methyl-2,2'-
Synthesis and purification of bipyridine2- [3- (4-methyl-2,2'-bipyridine-4 '
-Yl) -propyl] -1,3-dioxolane 2 g,
Dissolve in 50 ml of 1N HCl and heat at 50 ° C for 2 hours
did. The solution is cooled and pH 7 with sodium bicarbonate.
Adjust to ~ 8 and extract twice with 100 ml of chloroform
Was. Combine the chloroform layers and wash with a small amount of water.
Dry with sodium, filter and rotary evaporator
Evaporation gave a yellow oil. This yellow
Oily substance of ethyl acetate / toluene (1: 1)
Purified with silica gel column used as elution solvent
The material was eluted with methanol.Proton NMR analysis [δ1.96-2.11 (m, 2
H); 2.43 (s, 3H); 2.46-2.50
(T, 2H); 2.53-2.80 (m, 2H);
12-7.14 (m, 2H); 8.17-8.12 (b
r. 8.52-8.58 (m, 2H);
9.89 (s, 1H)], the structure of the reaction product is
It was confirmed that:Embedded imageEmbodiment 284- (4-methyl-2,2'-bipyridine-4'-i
B) Synthesis of butyric acid4- (butane-1-al) -4'-methyl-2,2'-
0.5 g (2.0 mmol) of bipyridine was
Dissolved in 10 ml. Add the finely powdered overman
225 mg potassium ganate (KMnO_Four; 1.42m
mol) was added little by little with stirring. This reaction
Thin layer chromatography (silica; ethyl acetate / tolue)
50:50), the aldehydes gradually
Disappears, R_fFormation of low value bipyridine
Was pointed out.After the reaction was completed, water was added and MnO was added._Two
Is filtered and Na_TwoCO_Three(Aqueous solution)
Was cleaned. The acetone is evaporated on a rotary evaporator, leaving
CH to distillate_Two Cl_TwoTo remove non-acidic bipyridine
did. By careful addition of 0.1N HCl
The aqueous solution was acidified to pH 4.8. Reach this pH
The solution will be partially suspended and suspended at lower pH.
The suspension dissolved again. The mixture is mixed with an equal amount of CH_Two Cl_Two
5 times with Na_TwoSO_FourAnd dried in a rotary evaporator
Gives off an oily substance on evaporation
Rapidly solidified under reduced pressure. This crude solid is
Roform: Recrystallize from petroleum ether to produce white crystals
Obtained.Melting point: 103.5 ° C-105.5 ° C; IR: 1704c
m^-1. Proton NMR analysis was consistent with the following structure.Embedded imageEmbodiment 29Bis (2,2'-bipyridine) [4- (butan-1-a
Ru) -4'-Methyl-2,2'-bipyridine] ruthenium
(II) diperchlorate: Synthesis of Compound IRuthenium bipyridyl in 50 ml of ethylene glycol
250 mg (0.48 mmol) of dichloride dihydrate
(Strem) is rapidly heated to boiling and then
Immersion in a corn oil bath (130 ° C.). Reddish purple to orange
To the dicolor solution, add 2- [3- (4-methyl-2,2'-bi
Pyridin-4'-yl) propyl] -1,3-dioxo
150 mg (0.53 mmol) of ethylene glycol
A 10 ml solution of Kohl was added. The orange solution obtained
The solution was stirred at 130 ° C. for 30 minutes, cooled to room temperature, and steamed.
Diluted 1: 1 with distilled water. To this solution add sodium perchlorate
A very fine orange color when a concentrated aqueous solution of
Precipitates. The mixture was refrigerated overnight, filtered and precipitated.
The temple was washed with water. Dissolve the precipitate in hot water and remove perchloric acid.
When added and recrystallized, clear orange crystals
Generated. Thereafter, the crystals are filtered, washed with cold water and dried.
Dried. By repeating this recrystallization operation, a total amount of 150 mg
To give vivid orange crystals. NMR analysis
The structure below is shown. In this example, it was identified above
The compound is considered to be compound I.Embedded imageEmbodiment 30Bis (2,2'-bipyridine) [4- (4-methyl-
2,2'-bipyridin-4'-yl) butyric acid] ruthenium
(II) Dihexafluorophosphate: Compound II
Synthesis of4- (4-methyl-2,2'-bipyridine-4'-i
B) 134 mg (0.52 mmol) of butyric acid was added to water 15
Dissolved in 0 ml. The solution is degassed with argon and
Nium bipyridyl dichloride dihydrate (Strem) 25
0 mg (0.48 mmol) was added. This mixture
Was refluxed for 4 hours under a stream of argon. Rotary evaporator for water
And the residue is redissolved in a minimum amount of water,
It was applied to a P-25-Sephadex ion exchange column.
After eluting impurities with water, use 0.2M NaCl solution
Eluted the compound as a red band_FourPF₆Saturation of
By adding an aqueous solution, hexafluorophospho
Isolated as The crude product is treated with hot acetone-diethyl
Reprecipitated twice from the ether. Elemental analysis: calculated values;
C, 43.80%; H, 3.36%; N, 8.76%.
C, 43.82%; H, 3.54%; N, 8.
55%. Proton NMR analysis was consistent with the following structure:
Was.Embedded imageEmbodiment 31N- [4- (4-methyl-2,2'-bipyridine-4 '
-Yl) -butyl] -phthalimideDry tetrahydrofuran under an inert argon stream
(THF) 30 ml and dry diisopropylamine7.
65 ml (54.6 ml) is transferred to a 600 ml three-necked flask.
The mixture was added to the flask with stirring using a syringe. Low-level bi
Dry ice-isopropanol mixture
The solution was brought to -78 ° C by immersing the flask in
Cool. 2.5Mn-butyllithium 21.6ml
(54 mmol) was slowly added to the flask. Profit
The resulting solution is stirred for 15 minutes and 4,4'-diethyl-
9.58 g (52 mmol) of 2,2'-bipyridine
A 300 ml solution of dry THF was added via a cannula and stirred.
The solution was added dropwise over 1 hour with stirring.The resulting brown mixture is further treated at -78 ° C with 2
After stirring for 1 hour, 100 g of 1,3-dibromopropane (0.
495 mol) are added rapidly and the resulting mixture is
Stirred at 8 ° C for 1 hour. The mixture is then left at room temperature for 2 hours.
Stirred for hours. The color of the mixture is brown to blue, then yellow
Changed to color. Most solvents are rotary evaporators
And two layers were formed by adding 200 ml of water. Dark
Hydrochloric acid was added to lower the pH to zero. Discard the organic solvent layer
Was. The aqueous layer was washed twice with 100 ml of ether. pH
Was raised to 1-2. The red oily substance is separated and CH
_Two Cl_TwoExtracted. This solution is dried over anhydrous Na_TwoCO_ThreeDry
After drying, most CH_Two Cl_TwoThe rotary evaporator
The sample was evaporated and applied to a silica gel column.
Elution of the sample with chloroform gives a pale yellow oil
Substance. This material crystallizes when cooled overnight.
(12.37 g).The thus synthesized 4- (4-bromobutane)
Crude crystal of tyl) -4'-methyl-2,2'-bipyridine
4 g (13.3 mmol) were subsequently added to phthalimidoca
2.46 g (13.3 mmol) of dimethylform
Amide (DMF) was added to the 60 ml suspension. afterwards,
The mixture was stirred at about 50 ° C. for 2 hours. To this mixture
CHCl_Three90 ml, and 125 ml of water
CHCl added_ThreeSeparate the layers and separate the aqueous layer with chloroform 5
Extracted twice with 0 ml. CHCl_ThreeMerge layers and water 50
wash with anhydrous Na_TwoSO_FourDry with a rotary evaporator
Evaporation with a porator gives a pale orange oily substance
Well, this material solidified overnight. This crude product is
When recrystallized from seton / ethanol, white crystals (melting
Point, 114.5-117.8 ° C) 2.21 g (44.5)
%). Elemental analysis: calculated values; C, 74.38%;
H, 5.70%; N, 11.31%. Measured value; C, 7
3.98%; H, 6.14%; N, 11.28%. I
R: Phthalimide carbonyl stretching 1771 and 1704
cm^-1. In the proton NMR analysis, the aromatic
Sound (δ 7.57-7.85, m, 4H) and normal bipi
The signal of the gill derivative was shown. These data are
Matches the structure below.Embedded imageEmbodiment 32Theophylline-8-butyric- [4- (4-methyl-
2,2'-bipyridin-4-yl) -butyl] amide:
Synthesis of compound IIIN- [4- (4-methyl-2,2'-bipyridine-4 '
-Yl) -butyl] -phthalimide 370 mg (1 m
mol) in 10 ml of ethanol.
Treated with azine (720 mg, 1.4 mmol) and stirred
Stir and reflux for 4 hours, during which time all solids dissolve
Was. Towards the end of the reaction, a white precipitate began to form
Was. After cooling, the reaction mixture was washed with 50% NaOH.
It was made basic and poured into 100 ml of water. After getting the solution
Na_TwoCO_ThreeAnd convert the product to an oily salt
Was analyzed. CH_Two Cl_TwoAmine using 4 times 40 ml each
Was extracted. Extract the CaSO_Four, Filtered, steamed
When emitted, aminobipyridine derivatives are colorless oily substances
(Yield = 0.135 gm; 56%). 4-
[4- (1-aminobutyl)]-4'-methyl-2,
1.34 g (5.6 mmol) of 2'-bipyridine and
Theophylline-8-butyric acid (1.18 g; 4.4 mmo)
l) was dissolved in 10 ml of dry pyridine at room temperature. this
1.16 g of dicyclohexylcarbodiimide was added to the solution.
(5.6 mmol) was added. Stir at room temperature overnight
Continued. Thin layer chromatography of alumina (mobile phase =
15% methanol / chloroform), R
_fA single product spot of 0.68 was shown. Set geese
Filter off the chlorhexylurea and distill off pyridine
Gives a solid, which is triturated in ether.
And filtered (yield = 2.13 g; 99%).Embodiment 33Bis (2,2'-bipyridine) [theophylline-8-bu
Tylic-4- (4-methyl-2,2'-bipyridine-
4'-yl) -Butylamido] ruthenium (II) dic
Synthesis of Lolide: Ru (II) -Compound III Conjugate175 mg (0.357 mmol) of the above compound III
es) and bis- (2,2'-bipyridine) ruthenium
(II) 154 mg of dichloride dihydrate (0.296 m
moles) in ethanol / H_TwoO (1:
(1, v / v) 40 ml was added. This mixture in the dark
Degas with argon for 15 minutes, 3:00 in the dark under a stream of argon
Reflux for a while to give a clear cherry red solution.
The resulting clear cherry red solution is cooled to room temperature and
Use a rotary evaporator to remove the solution in a dark place at 37 ° C or lower.
The solvent was removed while maintaining. Approximately 3 m of the obtained residue
of Sephadex LH-20.
Apply to a chromatographic column (75 cm x 3 cm)
Eluted at a flow rate of about 0.4-0.7 ml / ml. Vivid
The red band (product) has a brown non-fluorescent band (not
Pure) and two fluorescent bands closely followed. Red
Color product bands include small amounts from brown non-fluorescent bands
It was found that impurities were mixed. This contaminant
Is the second Sephadex LH-20 under similar conditions
Separation from product by applying sample to column
did. By evaporating the solvent with a rotary evaporator
A reddish product was obtained. Approximately 1 ml of the resulting solid material
Dissolve in methanol and in about 75 ml of diethyl ether
To give an orange powder, which is collected by filtration.
did. Elemental analysis: Calculated; C, 54.51%; H, 5.
N, 13.99%; O, 10.47%; Cl,
6.44%. Measured value; C, 55.04%; H, 6.35
%, N, 13.18%; O, 10.62%; Cl, 6.
68%.Example 34-Specific for theophylline
(II) -compound using a novel antibodyBy III conjugate
Modulation of the electroluminescent signalThis Ru (II) -compound III compound described in Example 33
The coalescence was performed at pH 6.0 with 0.35 M sodium fluoride.
0.1M phosphate buffer (PBF buffer) with a final concentration of 1
Diluted to 50 nM. Specific for theophylline
Monoclonal antibody (clone number 9-49, ascites)
Lot number WO399, cat no. 046) to Ka
llestad Laboratories, Inc.
(Chaska, MN). This monochrome
Null antibodies were diluted to various concentrations using PBF buffer
(21.9 μg to 700 μg of protein in 1 ml)
Range). Another thing that does not react to theophylline
The clonal antibody (control MAB) was purchased from Sigma (St.L.).
ouis, MO), and using PBF buffer
from 21.9 μg to 700 μg of protein per ml
Diluted to various concentrations. Theophylline standard solution
ldrich Chemical Co. Obtained from
Theophylline (Milwaukee, WI, cat number 2)
6-140-8, M.P. W. 180.17)
did. Theophylline has a final concentration of 75 in PBF buffer.
Dissolve to μM and use PBF for assay.
Diluted to 6 μM with buffer. Electrochemiluminescence
250 mM oxalic acid prior to performing cent measurement
Containing 5% (v / v) Triton-X100
(ECI solution) was added to the reaction mixture. Measurement is reaction solution
Two platinum gauze electrodes were attached to the test tube containing the liquid.
Using a modified Berthold luminometer
I did it. Connect this electrode to potentiostat
The electrochemiluminescence measurement was performed at a scan speed of 50.
1.5 to 2.0 volts at mV / sec between these electrodes
The test was performed by changing the applied voltage. For this measurement
The Berthold luminometer used has a high gain
It had a red-sensitive photomultiplier tube. This luminometer
Output to recorder is 10^Fivecounts / volt
I let you. This measurement is recorded on an XYY 'recorder,
This peak height is compared with the measured value of electrochemiluminescence.
Used. This electrode is 0.1M phosphorous between measurements.
Acid, 00.1 M citric acid, 0.025 M oxalic acid, and
PH 4.2 buffer containing 1% Triton X-100
Rinse this electrode in this solution from +2.2 to -2.
Pulse a current between 2 volts for 60 seconds, then
Clean by applying +2.2 volts for 10 seconds
You. Then remove the electrode from the solution and place in distilled water
Rinse and wipe dry. This experiment is described in Table XIV
Was performed as outlined.Control Monoclonal Antibody Solution, Teof
A solution of the antibody to E. coli or PBF buffer is added to a set of
Poured into test tubes (step 1). In this test tube
Phosphorus solution or PBF buffer was added (step 2). This
Mix the solution by briefly shaking the test tube and let it stand at room temperature for 25 minutes
Reaction. Then Ru (II) -Compound III bond
The body solution was added to the test tube (step 3). This trial
The test tube was shaken and left at room temperature for 15 minutes. Finally this EC
Add 100 μl of L solution to each test and add
Lectro chemiluminescence was measured. The result is shown in Table X
V.[Table 12][Table 13]Table XV        Electrochemiluminescence of Ru (II) -Compound III conjugates                Effects of antibodies and theophylline on sense                                                          Anti-theophylline  Antibody protein Control MAB + anti-theophylline MAB + theophylline  Concentration Ru (II)-MAB + Ru (II)-Phosphorus Ru (II)-  (Μg / test tube) Compound III Compound III Compound III                          Luminescence measurements    2.19 55,000 40,000 43,000                      55,000 41,000 57,000    4.38 57,000 22,500 37,000                      57,000 25,000 36,000    8.75 53,000 20,000 33,500                      50,000 22,000 30,500  35.0 43,000 13,500 17,500                      41,000 14,000 16,000  70.0 42,000 11,000 11,000                      37,500 12,000 12,500Electrochemiluminescence of duplicate samples
It was measured as described above. Ru (II) used in the above experiment
The electrochemiluminescence of the compound III conjugate is
57,200 when measured in buffer without antibody
there were. Background to buffer mixture is 575
It was 0. This data shows that the ruthenium compound was attached
Theophylline analogs, Ru (II) -Compound III
Monoclonal that specifically recognizes theophylline when contacted with
Lonal antibodies reduce their electrochemiluminescence
It indicates that it will be. Electrochemiluminescence
The decrease in the concentration is determined by the concentration of Ru (II) -Compound III conjugate
Is constant, it is proportional to the concentration of the antibody. Theofi
Higher antibody concentration when using an antibody that does not react with phosphorus
But electrochemiluminescence is slightly reduced
It is. This data also shows that theophylline
Ru (II) -Compound II
When the I-conjugate is added to the mixture, the electrochemiluminescence
It also shows that the amount of sense will be larger. This thing
Theophylline binds Ru (II) -compound for antibody binding
And consequent electrochemistry
Ru (II) -compound III binding producing luminescence
A large amount of body is obtained.Example 35-Homogeneous electrolysis
Based on luminescent immunoassayIn serum
Ofilin assayBased on the results described in Example 34,
Homogenous immunoassays for competitive binding types
Theophylline described in Example 33 and the Ru (I
I)-Developed using antibodies to compound III conjugates
Was. The material was pH 6.0 containing 0.1 M sodium fluoride.
And the same as described in Example 34 except for the 0.1 M phosphate buffer
It was the same. Theophylline for this assay
Concentrations of monoclonal antibodies for were specifically chosen. This
Was 55 μg / ml. This Ru (I
The concentration of the I) -Compound III conjugate was adjusted to 175 nM.
Was. Theophylline was added to human serum at a final concentration of 1 ml
2.5, 5, 10, 20, and 40 micrograms per
Was added. The assay used 10 μl of serum at 290
Add anti-theophylline monoclonal antibody
For 25 minutes. Then 100 μl
Of the Ru (II) -Compound III conjugate in each test tube
The solution was added to a final concentration of 35 nM, and the solution was allowed to stand at room temperature.
Left for 15 minutes. The ECL solution described in Example 34 was added to 1
Pour 00 μl into each test tube and elect
B) Chemiluminescence characteristics in the range of 1.5 to 2.5 volts
Is scanned at 50 mV / sec and measured by the method described above.
Was. This data is shown in FIG. This data is for serum samples
Concentration of theophylline and the amount of
Indicates that there is a correlation between the amount of
are doing. This result indicates that the theophylline assay can be developed.
The ability is shown. Based on these results, this technology
The most proficient in finding the analyte of interest in a biological substrate
Homogeneous electrochemistry for detection and quantification
You can develop a luminescence immunoassay
There will be.Example 36-Homogeneous electrolysis
Hemolyzed blood based on a luminescent immunoassay
Serum, lipemic serum, jaundice serum, and normal serum samples
TheofiPhosphorus assay compared to fluorescence polarizationHomogenization of theophylline concentrations in various types of serum samples
Nias electrochemiluminescent immunoassay
It measured using. The type of this assay is described in Example 33.
Monoclonal antibodies specific for solid theophylline and Ru
(II)-Competitive binding assay using compound II conjugate
It is. Reagents and methods for electrochemiluminescence
Is described in the previous embodiment. Te in various serum samples
Ab is the fluorescence polarization method used to measure the ophylline concentration.
boot Laboratovies (North C
Hikago, IL) using an automatic TDX device
It was carried out. This assay includes hemolyzed serum, lipemia
Serum, jaundice serum and normal serum
The data for Qing is shown in Table XVI below.[Table 14]Table XVI    Homogeneous theophylline assay Characterization of potentially problematic sera  serumFactor concentrationNormal value range  Hemolysis 12.4mg / dl Hemoglobin 0-3.2mg / dl  Lipemia 405 mg / dl triglyceride 10-190 mg / dl              196 mg / dl cholesterol 120-200 mg / dl  Jaundice 10mg / dl bilirubin 0-1.5mg / dlVarying amounts of theophylline to a final concentration of 2.5 μg
Between ilin / ml and 40 μg theophylline / ml.
Was added to this serum sample. This homogeneous element
The results of the KUTRO chemiluminescent immunoassay are
Shown in the figure. Each serum sample was tested for theophylline concentration
Analysis was also performed by fluorescence polarization. This homogeneous elect
B) Chemiluminescent immunoassay and fluorescence polarization
The measured concentrations of theophylline were compared. This data
Plotted as scatter plots and shown in FIGS. 4A-D. This de
Data points are analyzed by linear regression to calculate correlation coefficients.
Was. This analysis shows that there is a particularly strong difference between the two assays.
It is shown that there is a strong correlation. This correlation coefficient (r) is
It was 0.98 to 1.00. Normal serum, hemolyzed blood
The slope of the curve for serum samples of Qing and lipidemia is from 0.8
1.2, which means that text from these serum samples
This indicates that the recovery of ophylline is very high.From a serum sample of jaundice, including theophylline,
Electrochemiluminescence against other serum samples
Higher than that at each theophylline concentration.
And increased in proportion. This can be seen during 4D
I can do it. This correlation coefficient is the same as electrochemiluminescence.
1.00 for data points comparing fluorescence polarization;
However, the slope is 2.14. This is a jaundice serum sample
It shows a high recovery of theophylline in it. these
Based on the results, the concentration of theophylline in the jaundice sample was
A known amount of Ru (II) -compound conjugate was added to the jaundice serum.
Draw a standard curve for the sample by adding
Could be measured using These days
TA is a homogeneous electrochemiluminescent im
Assay can detect abnormal amounts of hemoglobin, fat, and
Measuring theophylline concentration in serum samples containing lilbin
Indicates that it can be used to Homogeneous ele
KUTRO chemiluminescent immunoassay detects ECL
Pluripotency at higher concentrations of biomolecules at higher concentrations
Superior to fluorescence polarization method because it can detect easily
ing.Further, homogeneous electrochemiluminescence
Nesent immunoassays do not require an incident light source and
Reason that only passive excitation is necessary for efficient light generation
This is more advantageous than the fluorescence polarization method. Therefore electro
Sophisticated optics are essential for chemiluminescent immunoassays.
It is not necessary. This measurement principle is triggered by electrochemical stimulation
This is a purely specific photon emission,
The sensitivity of the system is inherently much higher than the fluorescence polarization method,
A wide dynamic range could be achieved. Ma
In addition, the measurement of a wide variety of analytes is
Rimo homogenous electrochemiluminescent immuno
Assay is possible. This is the recognition of biomolecules,
Chemiluminescence electrically stimulated by antibody-antigen interaction
Due to the luminescence causing sensitive modulation. These conclusions
Based on the results, abnormal serum testing may be
To detect other analytes of interest of interest
Homogeneous electrochemiluminescent immunoa
You will find that you can develop an essay.Example 37-Homogeneous electrolysis
In serum based on chemiluminescence immunoassay
Filin Assay and High Performance Liquid Chromatography
(HPLC) Comparison with the methodVarying amounts of theophylline to a final concentration of 2.5 μg
From evillin / ml to 40μg theophylline / ml
Were added to human serum samples. Each sample is then divided into two parts
And the theophylline concentration of this sample
  Measured by electrochemiluminescence immunoassay
And the results obtained by the HPLC method on the same serum sample
Compared. Homogeneous electrochemiluminescence
  The type of assay in the immunoassay is theophylline
Antibodies and Ru (II) -compounds specific for
It is a competitive binding assay using a III conjugate. This
Reagents and methods for the assay are described in the previous examples.
You. Used to measure theophylline concentration in various serum samples
The HPLC method used is described below.Theophylline (1,3-dimethylxanthi)
Precipitation of serum proteins with acetonitrile
To separate from serum proteins. Contains theophylline
The supernatant liquid is transferred to Waters Associates M
micro Bondapak C18 column (3.9 mm
X 30 cm). This
Was completely separated within 10 minutes. Less than
The reagents used were: sodium acetate (for reagent), deionized
Water (for Millipore Milli Q system)
Purification), acetonitrile (for HPLC), theophylline
Phosphorus standard reagent, (Sigma). Precipitates serum proteins
The solvent used was 14% (v / v) acetonitrile
20 mM sodium acetate buffer at pH 4.0 containing ril
And The buffer of the mobile phase of this HPLC was 7% (v / v
v) 10 mM acetic acid at pH 4.0 with acetonitrile
A sodium buffer was used. The flow rate is 1.5ml / min
The effluent was UV spectroscopy set at 270 nm.
Monitored with a degree meter. The sensitivity of this UV absorption detector is 0.1.
Set to 02 absorbance unit full scale (AUFS)
Was. The air temperature was between 22 ° C and 24 ° C.Estimation of serum theophylline concentration
Modern Electrochemiluminescent Immunoass
The results of the assay and the HPLC assay are shown in FIG. Data is
Data points plotted as scatter plots using linear regression
Was analyzed. The correlation coefficient was calculated. Correlation coefficient (r)
Is 0.98, which indicates a strong phase between the two assays.
Indicates that there is a Seki. The slope of the curve is 1.197
Compared to standard HPLC-based methods
Electrochemiluminescent immunoassay
Has excellent recovery of theophylline from this serum sample.
It indicates that This homogeneous electrochemistry
Luminescent assays are faster than HPLC methods,
Better in terms of sensitivity and ease of handling large numbers of samples
It is profitable. Based on these results, you will be
Can be detected by HPLC and similar methods
The target is homogenous electrochemiluminescent
We can see that we can develop a method to detect by immunoassay
Will.[0135]Example 38-Theophylline-Bovine Serum Al
Preparation of bumin conjugateTheophylline-bovine serum albumin (BSA) conjugate
Theophylline-3-methyl-butyric acid, theophylline-8-
From butyric acid and theophylline-7-acetic acid by the following method:
Prepared. 50 mg BSA in 1 ml 0.15 M
NaHCO_Three, PH 9.0. 16mg of ethyl
3 ', 3-dimethylaminopropylcarbodiimide salt
Acid salt (EDCI) and 11 mg of N-hydroxysuccinic acid
Salt (NHS), and 1 dissolved in dimethyl sulfoxide
7.8 mg theophylline-7-acetic acid, or 20 mg
Theophylline-8-butyric acid, or 20.9 mg of theophylline
Phosphorus-3-methyl-butyric acid was added separately and the solution was heated to 45 ° C.
For 1-2 hours. Add this solution to the BSA solution
Then, the mixture was reacted for 1 hour. BSA theophylline conjugate
Indicates gel filtration using a column of Sephadex G-25.
0.15 M PB at pH 7.4 by hyperchromatography
S / 0.1% azide as mobile phase, flow rate 30 ml / h
r to separate and purify.[0136]Example 39-Theophylline-BSA Bi
Manufacturing method of omag particles4 ml of Biomag-amine particles (Advanced)
  Magnetic, Inc. , Cambridge,
MA) at 0.008% Nonidet P-40 (NP
-40) and pH 7.4 phosphate buffered saline (Sig)
ma) (PBS) Separate 2-3 times with 20 ml
  Washed in T-flash. This Biomag we
PBS containing 5% glutaraldehyde in t cake
And activated with a rotary mixer for 3 hours.
Was. Activated Biomag particles were added as described above for a total of 4
Washed twice and transferred to T-flash. 10ml of PB
Prepared in the manner described in Example 38 in S / NP-40
6.8 mg of theophylline-BSA
Added to Biomag wet cake. Overnight at 4 ° C
Reacted. This activated Biomag wet
The cake was added to 20 ml of 1% BSA / 0.15 M PBS.
Washed three times with /0.1% azide (pH 7.4). this
First wash for about 30 minutes using a rotary mixer
Continued.[0137]Example 40-Compound I-anti-theophylline binding
Combined manufacturing method1.1 ml mouse anti-theophylline monoclonal
Antibodies (Kallestad, lot number WO399;
(4.6 mg / ml) at 10,000 g for 8 minutes.
Was. The buffer is 0.2M NaHCO_Three, 0.15M N
aCl, pH 9.0 containing azide
con Centricon 30 concentrat
or replaced (centrifuged at 3000 g)
T). This antibody solution was diluted to 2 ml and 3.2 mg
Compound I was added. Reaction while stirring at room temperature for 2 hours
And 1 μg / ml NaBH aqueous solution (79 μl)
The solution was stirred for 30 minutes. Thus obtained
The solution was separated on Sepha previously equilibrated with Tris buffer.
dex G-25 column (1.0 cm × 18.0 c
m) and eluted at a flow rate of 15 ml / hr. Compound
Collecting the fractions containing the I-anti-theophylline conjugate,
Transfer to dialysis tube, 0.15M phosphate / 0.15M
  For NaF (PBS), pH 6.9 (4 liters)
Dialyzed.Example 41-Heterogeneous electrochemiluminescence
In serum based on cent assayTheophylline
SusseyOne type of immunoassay is used to measure theophylline.
Heterogeneous assay for compound I labeled anti-teof
Antibody immobilized on Biomag magnetic particles
Developed using Filin BSA. This antibody concentration is 20
μg / ml. The concentration of magnetic particles is 1% solids (wt
/ Vol). Theophylline is used in 1 ml of serum.
The final concentrations were 10 and 40 μg. this
Theophylline serum standard is a PBF buffer containing 1% BSA
Buffer (sodium phosphate buffer, pH 7.0, 0.1 M
(Sodium fluoride) 1000 times. Assay
Is performed by adding 75 μl of the diluted serum standard to 75 μl of the antibody.
Was added to Compound I to which was bound, and the solution was allowed to stand at room temperature for 20 minutes.
The reaction was performed by reacting. Next, 50 μl of theophyl
Phosphorus-BSA-Biomag particles are added and the suspension is
Left for 5 minutes. The particles are separated magnetically and the supernatant
For 100 μl according to the method described in Example 48.
Electrochemiluminescence was measured.[Table 15]Based on these results, those skilled in this technology should
Heterogeneous analysis of other interesting analytes in the substrate
Developing a Lectro chemiluminescence immunoassay
Will be possible.[0139]Example 42-Compound II-Digoxigenin
Manufacturing method of conjugate100.2 in a 50 ml round bottom flask with stir bar
mg (0.104 mmol) of compound II, 41 mg
(0.105 mmol) of digoxigenin (Sigma)
a) and 28 mg (0.136 mmol) of 1,3-
Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) was added.
Add 8-10 ml of anhydrous pyridine (Aldri) to the mixture.
ch Sure-Seal) with an 18 gauge needle.
Added with a syringe. Stopper the flask and add Teflon
Seal with tape and gently stir until the solution turns red.
Was. This flask is darkened while stirring in a hood
For 24 hours, and at this time, 6 mg (0.015 mm
l) of digoxigenin and 20 mg (0.097 mMo)
1) DCC was added. Plug this solution and keep it dark
And stirred at room temperature. The next day, dicyclohexyl urea
Was not observed. Another 18 mg (0.05
mmol) of digoxigenin and 103 mg (0.50
mmol) of DCC was added. Seal the flask again
Stirring was continued in the dark. 10 hours after 72 hours
3 mg of DCC was added, and the mixture was stirred in a dark state for 3 hours.5-10 drops of H were added to the solution._TwoAdd O, then
To a rotary evaporator to remove the red solid
Dry in the dark until formed. The red solid obtained is
Covered with aluminum foil and CaSO in desiccator
_FourAnd dried overnight. This dried solid is then
Dissolve in 3-5 ml of methanol and add about 0.
25 g of anhydrous and solid LiClO_FourWas added. Li
ClO_FourWhen dissolved, add this solution to Sephadex L
Apply to H-20 column (75cm × 19mm)
Flow with methanol in the range of 7 to 10 sec / drop
Let out. Three vans when chromatography develops
The first pale orange (red luminescent)
Band (fraction 1); second dark red band
This shows the main product of this reaction (fraction
2); and the third following the first two bands
This is the band (probably composed of unreacted raw materials)
Was thrown away.Bands 1 and 2 were barely separated on this column.
The orange product in band 2 was fractionated because it was released.
Solution 2 (15 ml) in methanol about 300 ml
Was added dropwise to anhydrous diethyl ether and stirred. The obtained sunk
Is collected by suction filtration on a 15 ml medium frit.
The mixture was washed 5 times with 15 ml of diethyl ether. Remaining
Ether in a vacuum desiccator_FourUsing
The compound was removed by drying overnight. this
Solid materials were identified as follows:Embedded imageExample 43-Compound II-Digoxigenin
Electrochemiluminescence of the conjugate(ECL): Anti-di
Modulation of ECL signal by goxin antibodyImmunoassay for monoclonal antibodies against digoxin
Diluted with buffer to the following concentrations:1,10,50,200,400μg / mlCompound II-digoxigenin conjugate (50 micromolar
) With an immunoassay buffer (0.1 M phosphate buffer,
pH 6.0, containing 0.1M sodium fluoride)
Diluted to 0 nM. Test tube made of polypropylene (12m
mx 75 mm) of the immunoassay buffer
Compound with various concentrations of digoxin antibody at 100 μl
100 μl (150 n) of the product II-digoxigenin conjugate
M) Added. Stir the tubes on a vortex and allow to stand at room temperature.
The reaction was performed for 15 minutes. After the reaction, 100 μl of ECL
Add the solution (described above) and measure the electrochemiluminescence.
Was.result:[Table 16]E for 30 nM compound II-digoxigenin conjugate
Total CL count = 113666 (peak height)Signal at a concentration of 40 μg per tube
Modulation by non-specific antibodies is 67,000 counts
36, when a specific antibody against rigigoxin is present.
000. As can be seen from FIG. 6, compound II-
When reacting to a fixed concentration of digoxigenin conjugate,
As the concentration of anti-digoxin antibody increases,
It was shown that the modulation of the luminescent signal was increased. This
Is characteristic of measuring digoxigenin in serum and plasma
Based on homogeneous electrochemiluminescence
Such assays will be useful in developing them.[0144]Example 44-Homogeneous digoxin
AssayBased on the results described in Example 43,
Homogeneous electrochemiluminescent immunoa
Antibodies against digoxin and the compound II-digo
Using a competitive binding assay with a xygenin conjugate
And develop it. Tries that will be used
The drug is described in Example 43. For this assay
Specificity of monoclonal antibodies to digoxin
The concentration will be selected. This antibody concentration per 1 ml
75-100 μg. The present compound II-digoxigeni
The concentration of the conjugate will be 5-15 nM (final concentration).
Would. Digoxin standard is human serum and final concentration is serum 1
0.1, 0.5, 1, 2, 4, 8, digoxin per ml
And 16 ng. This app
Say uses 10-30 μl of serum with 300 μl of anti-digoxin.
In addition to the syn monoclonal antibody,
It will be carried out by allowing the liquid to stand. Then 100
μl of the compound II-digoxigenin conjugate at final concentration
Is added to each test tube such that is in the range of 5-15 nM,
The solution is left at room temperature for 20 minutes. ECL mentioned earlier
100 μl of solution was placed in each test and as described above
ECL will be measured.[0145]Example 45-Ouabain-bovine serum album
Preparation of min conjugate50 mg of ouabain octahydrate (Aldrich) in 5
Dissolved in ml of deionized water. 81 mg of NaIO_FourTo
In addition to the dissolved ouabain, the mixture was added at room temperature for 2 hours.
Allowed to react for hours. The reaction is continued until the pH is between 5 and 6.
IX-8 ion equilibrated with deionized water
By passing this mixture through a column (5 ml) of exchange resin
Stopped. The effluent entering the waste tank is a sign of mixing
When was indicated, the fraction obtained by oxidation was collected.
100 mg of lyophilized bovine serum albumin (BS
The crystals of A) (Sigma) contain 0.05% azide.
5 ml of 0.1 M potassium phosphate buffer at pH 7.4
Melted. The BSA solution is added to the oxidized solution.
The solution was added dropwise with stirring. The solution thus obtained
The solution was allowed to react for 1 hour at room temperature and then NaCNBH_Four(Ald
rich) was added. The solution is then removed at room temperature.
Stirred overnight. This solution was mixed with polyethylene glycol-80.
Concentrate at 00 (from 11 ml to 4 ml)
Ouabain and excess borohydride were separated from this solution by Sep.
hadex G-25 (column = 0.6cm × 37c)
m; eluent = 0.1M K_TwoPO_Four/0.15M Na
Cl, pH 7.5, 0.05% NaN_Three)
Removed. Fractions 11-17 were collected and their proteins
Measure the absorption at 280 nm (after dilution)
Decided.[0146]Example 46-Ouabain-BSA-Sepha
Roast making2 g of dicyan bromide activated with Sepharose 4B
400 on a sliced disk funnel
Wash with 50 ml of 1 mM HCl at a time.
Was. The resin is then added to 20 ml of 0.1 M NaHC
O_Three, 0.5 M NaCl buffer, pH 9.0 (cup
(Ring buffer). This resin is
After transferring to a container made of
Add 30 mg of ouabain-BSA dissolved in
I got it. Rotary mixing this activated resin
The reaction was performed with the ouabain-BSA for 2 hours. Remnants
The activated sites were 7 ml of 0.5 M ethanol for 2 hours at room temperature.
Reaction with ethanolamine (pH 8.0). sinter
Using ed disk funnel, this resin is
Was washed with 100 ml of each solution: coupling
Buffer; 0.15 M PBS; 1 mM HCl;
Pulling buffer; PB containing 0.2% NP-40
S; and PBS. This resin was suspended again in 11 ml, and
A sufficient amount of this suspension was applied to a 1.0 cm ID column (Pha
rmacia) and the total bed volume is 3.5
ml.[0147]Example 47-Anti-digoxin-Compound I
Compound production and affinity purificationMouse anti-digoxin monoclonal antibody (Cambri
dge Medical Diagnostics, c
at no. 200M-014, lot number MA250
7F) at 450 μl Ami
Using a Con Centricon 30 enrichment unit
It was concentrated to 100 μl. Add 0.2M carbonic acid to this concentrate
Combine sodium hydrogen buffer, pH 9.6 with 900 μl
0.6 mg of substance I was added. Reaction (amination) at room temperature
Time, then 30 μl of 0.1 M NaBH
_Four(Aq) (Sigma) was added. The resulting solution is
Left for hours. Excess compound I and other products
Sephadex G-25 chromatograph from antibody conjugate
E (column = 1.0 cm_ID× 18 cm; eluent = 0.
1M phosphate buffered saline). The sample is 20
1 ml fractions were collected at a flow rate of ml / hr.
The absorption at 280 nm is 2.0 AUFS and 0.1 μM.
Monitored at 5 AUFS. Fractions 5, 6, 7,
And 8 were collected and the ouabain-BSA-se
Faroose affinity column (3.5 ml column
With an inner diameter of 1 cm). And a flow rate of 15 ml / hr
Eluted. After the unretained substance elutes,
Speed up to 30ml / hr until 20ml eluate has collected
I got it. The saline concentration of the mobile phase increased to 0.5M and
Further, 20 ml was eluted from the column. Special for ouabain
Different anti-digoxin-Compound I conjugates have 4M and 6M K
Removed by adding SCN. Anti-digoxin-
Fractions corresponding to Compound I conjugate were collected and 10 mM phosphate
Salt buffered saline (4 liters; pH 7.4), followed by
Dialyzed against 0.1 M phosphate buffer.Example 48-Heterogeneous protein against digoxin
Lectro Chemiluminescent ImmunoassSurname10 mg of solid digoxin is added to 10 ml of DMSO: H_Two
O (8: 2) and digoxin concentration 1mg / ml
(This will be referred to as a storage standard solution in the future). For this storage
Contains 0.1% BSA and 0.15 M NaF from standard solution
0.15 M phosphate buffer (pH 7.0)
To prepare a working standard solution with the following concentrations:
80 ng / ml, 40 ng / ml, 20 ng / m
1, 10 ng / ml, 5 ng / ml and 0 ng / ml.
75 μl of anti-digoxin-Compound I conjugate (1:90
Diluted) and 75 μl of each standard.
Pipette into a glass test tube and mix on a vortex
The reaction was performed at room temperature for 20 minutes. 50 μl pre-washed
Ouabain-BSA-Biomag particles in each test tube
And mixed with vortex, and reacted at room temperature for 5 minutes.
I let you. Biomag particles were separated and the supernatant was
Transferred to another test tube. 100 μl of the supernatant was added to 400 μl
l of 0.125 M potassium phosphate 0.125 M citrate
Acid; 32 mM oxalic acid; 1.25% Triton X-
And 100 in a test tube. This sample is Bertho
ld instrument, and add
Lectro chemiluminescence was measured. However, the method is
Switching the applied voltage from the open circuit to 2.2 V and counting photons
Was modified to accumulate in 10 seconds. The electrode is phosphoric acid
Wash between measurements with citrate buffer as follows:
Was:(A) -2.2 V and +2.2 alternately every 3 seconds on the electrode
Send a pulse of V for 1 minute.(B) Hold the electrode at + 2.2V for 10 seconds.(C) Rinse the electrode with deionized water, dry and dry
You.The result is shown in FIG.Example 49-Electrochemiluminescence
Labeling of DNA with Chemical SpeciesKeDN by Electrochemiluminescent Species
Labeling of A was performed using the following two methods.Synthetic A1.0A₂₆₀Of the standard synthesized 38-mer (MBI
38)Embedded imageTCACCAATAAAACCGCAAACACCCATCCCGTCCTGCCAGT^*In T^*Is the 5th carbonEmbedded image-CH = CH-CO-NH- (CH_Two)₇-NH_TwoThymidine modified with 0.01M phosphate buffer
Dissolved in the buffer solution, pH 8.7. 100 μl of screw (2,
2'-bipyridine) [4- (butane-1-al) -4 '
-Methyl-2,2'-bipyridine] ruthenium (II)
Diperchlorate (Compound I) (0.01 M potassium phosphate
2.3 mg) in 300 μl buffer, pH 8.7
liquid. The contents were stirred and left at room temperature overnight. 100 μl
A saturated aqueous solution of sodium borohydride is added to this mixture.
The reversible imine Schiff base bond is irreversible.
Converted to an amine linkage. The reaction is carried out at room temperature for 2 hours.
Was. The solution is then carefully treated with dilute acetic acid to remove excess
The sodium borohydride was deactivated. This reaction solution
P-2 gel filtration column (18 inch x 1/2 inch)
0.1M triethylammonium acetate, pH6.
It was run at 77 which had been equilibrated. This column is
Elute with the same buffer, and flow 2 ml fractions
Collected at 20 ml / hr. Soluble in fractions 9 and 10
The released DNA is combined with unreacted ruthenium bipyridyl compound.
Well separated. This collected DNA sample is typical
UV absorption, and 62 nm when excited at 450 nm.
It showed a fluorescence emission spectrum at 0 nm. This fluorescent emission
Light is a species of ruthenium bipyridyl in this DNA sample.
Indicates that there is. This product is a single orange
Polyacrylamide gel electrophoresis as a fluorescent band
Move by electrophoresis. This labeled DNA (MBI38-
(Compound I conjugate) electrophoretic mobility is approximately unmarked
It is the same as knowledge DNA.Synthetic BFirst, 3 mg of this ruthenium compound was added to 60 μl of anhydrous dite.
Dissolve in tylformamide and add 94 mg
200 μl in the presence of hexylcarbodiimide (DCC)
52 mg of N-hydroxysuccinine in 1 liter of anhydrous DMF
By treating with imide, N-hydroxysuccinimi
Converted to a derivative. The reaction was carried out at 0 ° C. for 4 hours.
Was. Precipitated dicyclohexylurea is removed by centrifugation
The supernatant (200 μl) was diluted with 0.01 M phosphoric acid.
Amino-linked DNA in the buffer pH 8.77 (synthesis A
2A in 100 μl buffer₂₆₀)
Added. The reaction was performed overnight at room temperature. Considerable amount
Solid appeared in the reaction solution, but was filtered through glass wool.
Removed. The filtrate was concentrated and 0.5 ml of 1 M acetic acid
Dissolved in triethylammonium (pH 6.8). This
The reaction mixture of is then chromatographed as described in Synthesis A.
Was. This labeled DNA is added to the material prepared in Synthesis A.
On all spectra and electrophoresis as described
The features are shown.[0151]Example 50-Electrically Labeled DNA
Properties of generated chemiluminescence.Example 49, Labeled DNA Sample Obtained in Synthesis A
(MBI-Compound I)
The properties of essence were studied. Different concentrations of labeled D
NA was adjusted to 0.1 M citric acid, 25 mM oxalic acid and 1.0
0.1 M phosphate buffer containing% Triton X-100
Solution, pH 4.2, dissolved in 0.5 ml, improved Be
It was measured with an rtold luminometer. No.
Figure 8 shows electrochemiluminescence for various DNA concentrations.
The reaction of the cent signal is shown.Example 51 Oligo Labeled with Compound I
Nucleotide hybridizationExperimentThe complementary strand to the 38-mer described in Example 50 was replaced with
ABI model 380 B DNA Synthe
It was synthesized using a sizer, and was designated as MGEN-38.
Named. Covalent binding of Compound I to this oligonucleotide
Hybridizer of MBI38 oligonucleotide with combined attachment
Find out if it is affecting the characterization properties
For that purpose, the following experiment was devised. Various concentration target flags
Mengen (MGEN-38) with Gelman RP Niro
Spot on the membrane sheet, MBI 38 or
MBI38-Compound I was immobilized and probed with ether
Was. T both fragments_FourPolynucleotide kinase
Ze and gamma³²Treated with P [ATP]³²P
Labeled with. C of DNA labeled with Compound I
The hybridization sensitivities were compared.Concentrations in the range from 50 ng to 0.05 ng
Of MGEN-38 DNA on nylon membrane
And air dried. Membrane for one spot
Two were prepared at a time. This blot was prepared using the following solutions
For 2 minutes each: to fully denature the DNA
1.5 M NaCl-0.5 M NaOH;
1.5M NaCl-0.5M TRI to neutralize
S; 2X SSC at the end. The blot is vacuumed at 80 ° C.
Bake for 2 hours in oven. Hybridization
Lobes were prepared as follows: 3 μg of MBI38 and
And MBI38-Compound I with 10 units of T_FourKinase and 1
25μCi gamma³²Kinase treatment with P-ATP
Was. The incorporation rate of the isotope into DNA was measured and shown below.
Was.  MBI38 total count 4.1 × 10⁶cpm / μl            Number of counts taken in 3.1 x 10^Fivecpm / μl            Uptake rate = 75.6%  MBI38-Compound I Total Count 3.2 x 10⁶cpm / μl            Counted count 2.6 × 10^Fivecpm / μl            Uptake rate = 81.2%Prehybridization and hybridization
The solution of the ligation was prepared according to Maniatis (24).
Was prepared. Blots were 50 μg / ml calf thymus
Hybridize with DNA for 4 hours at 53 ° C
Was. The blot was then used for 10,000,000 cpm.
Enter the hybridization solution containing each probe.
Was. And hybridizing at 53 ° C. overnight (12 hours)
Was made. The next day, wash the blot as follows:
Was:15 minutes each in 2 × SSC + 0.1% SDS at −53 ° C.
Twice-0.2 × SSC + 0.1% SDS twice (same as above)
To)-0.16 x SSC + 0.1% SDS twice (same as above)
To)The blot was then air dried and Kodak at -70 ° C.
Exposed to X-omat film. This X-ray analysis (9th
MBI38 and MBI38-Prop of Compound I
The hybridization pattern is very similar between the probes.
Was found to be seen. 5n in both cases
g hybridization of the probe to the target
Observed, down to a minimum of 0.05 ng of target DNA.
Slight traces of hybridization were observed. shadow
Sex control DNA (phage lambda spotted at 50 ng)
DNA) for hybridization with this probe
No activity was detected.Example 52-DNA labeled with compound I
Probe hybridizationFruit about specificity
TrialsomeE.coliAnd nonE.coliGenome from strain
DNA was separated according to the method of Maniatis (24).
Released. Organisms used:E.coli  EC8 strain-natural isolateE.coli  PCIA strain-enteropathogenic strainE.coli  10H07 strain-toxigenic strainE.coli  EC50 strain-natural isolateE.coli  B strain-laboratory strainE.coli  K12 strain-laboratory strainEnterobacteraerogenes  En
Terrorobacter ErogenesCitrobacterfreundii      Sito
Robacter FreundySalmorellaparatyphi  B monkey
Monera Paratyfi BSalmorellapotsdam          monkey
Monera PotsdamThe DNA obtained from the above strains was overlapped with Ge by 3 μg each.
lman RP nylon membrane and S & S Nitrose
Spotted on Lulose membrane. As a negative control
50 ng of phage lambda DNA was spotted. Positive
Controls consisted of various concentrations of the phase ranging from 50 ng to 0.5 ng.
A supplementary strand, MGEN-38, was used. This blot is
Prepared and processed by the method described in Example 51. This
Lobe DNA is 125μC to incorporate radioactivity
gamma of i³²T with P-ATP_FourKinased
Consisting of 3.8 μg of MBI38-Compound I fragment
Was made.[0156]  MBI38-Total Compound Count-3.35 x 10⁶cpm / μl              Captured count number-1.50 x 10⁶cpm / μl              Uptake rate -44.7%An activity of 2,600,000 cpm for this assay
Each filter was used to probe. This high
Hybridization solution, conditions, washing solution and protocol
The same one as described in Example 51 was used. This
The X-ray film of the blot (Fig. 10)
The positive and negative controls reacted are shown. Lambda DN
A (50 ng) detects hybridization activity
No, MGEN-38 phase up to a minimum concentration of 0.5 ng
Strong hybridization was observed for the complement sequence.
Was. These results are comprehensive with the results of sensitivity experiments.
Matches.Example 53-2,2'-Bipyridinium
Xachloroosmate (IV)Manufacturing method1.01 g of hexachloroosmate (IV) ammonium
, (NH_Four)_TwoOsCl₆, (Alfa) (1.
00 eq.) In 50 ml of 3N HCl (aq) at 70 ° C.
Melted in. 3N H
2,2'-bipyridine dissolved in Cl (aq)
Added Red salt,Embedded image(Future (bpyH_Two²⁺) OsCl₆^2-Molecular weight)
562.2 g / mole precipitated from this solution. Settling
Is completed by cooling this solution in an ice bath at 0 ° C for 2 hours.
did. The product is made into glass fritted filter
and collected by suction filtration on a er. This precipitate is continuously
Wash with 5-10 ml of ice-cold 3N HCl (aq) and water
Was. Finally washed with 20 ml of anhydrous diethyl ether
Thereafter, the product was dried under vacuum at 70 ° C. for 48 hours.
Yield = 1.01 g orange powder ((NH_Four)_TwoOsCl₆To
78% based on). This product must be further purified.
Used without.[0158]Example 54-2 2,2'-bipyridinetetra
Method for producing chloroosmate (IV)Prepared in Example 53 (bpyH_Two²⁺) (OsC
l₆^2-) 0.9 g (1.60 mmol) of salt
Weigh into test tubes. This test tube is
Pyrex with mouth and thermometer (maximum scale 400 ° C)
Into a smoke tube. Put the entire device in a smoke tube and purge with argon
I poured it. The furnace is heated to a temperature of 270-300 ° C.
Raised to. Gently flush the tube with argon throughout the reaction.
did. The outlet of this argon was used to generate HCl
Was directed under a fume hood to evacuate out of the laboratory.
As temperature approaches 270 ° C, thermal decomposition of reactants begins
did. HCl gas is observed to evolve from this solid.
Was. Observe that HCl is generated violently for 30 minutes
After that, he gradually began to calm down. Six hours later, oh
The bun was stopped and the sample was cooled to room temperature. This product,
(Bpy) OsCl_Four, A finely divided brownish solid
Suspended in stirred 3N HCl (aq) solution for 12 hours
In anhydrous diethyl ether which is cloudy and subsequently stirred for 6 hours
Purified by suspending in water. glass frit
This is produced by absorption filtration on an ed filter.
As a result of separating the product, 2,2'-bipyridinetetrachloro
0.75 g (95%) of osmate (VI) is harvested
Was. This will be called (bpy) OsCl_FourCall. (MW
= 489.3 g / mole).Embedded imageThis product was used without further purification.Embodiment 55Cis- (2,2′-bipyridine) [cis-bis (1,2
-Diphenylphosphino) ethylene] -dichloroosmi
Synthesis of um50 ml round bottom flask equipped with stirrer and reflux condenser
The (bpy) OsCl synthesized in Example 54_Four
  230 mg (0.47 mmol) and cis-bis
(1,2-diphenylphosphino) ethylene (DPP-
ene) 465 mg (1.17 mmol)
Was. Add 25 ml of diglyme, and purge the contents with argon.
The mixture was refluxed for 5 hours. The dark green-black solution was purged with argon.
Cool to room temperature under flow and transfer to 200ml beaker
Was. When 80 ml of anhydrous diethyl ether is added,
A precipitate was given. Filter this precipitate through a glass filter (medium
And collected by suction filtration on top of
Washed 5 times with ethyl ether. This precipitate is then washed with CH
_TwoCl_Two  Dissolve in 15 ml to give a dark green solution
Was. Pass this solution through a glass filter (medium porosity)
About 300 ml of stirred anhydrous diethyl
Injected into toluene. Gray-green cis- (2,
2'-bipyridine) [cis-bis (1,2-diphenyl
Phosphino) ethylene] -dichloroosmium II complex
Body, hereinafter cis- (bpy) (DPP-ene)
OsCl_TwoA precipitate formed. This complex is
Collect by suction filtration on a lath filter (medium porosity)
Was. Immediately add 20 ml of cold 1: 2 v / v ethanol
Washed with water / water, then 30 ml of diethyl ether
And washed 7 times. Slate gray powder, vacuum desiccated
CaSO_FourAnd dried overnight.Embedded imageYield: 240 mg ((bpy) OsCl_Four; Molecular weight = 8
63% based on 14.4 g / mole). This product
Was used without further purification.Embodiment 56(2,2'-bipyridine) [cis-bis (1,2-diphenyl
Enylphosphino) ethylene {2- [3- (4-methyl)
-2,2'-bipyridin-4'-yl) propyl]-
1,3-dioxolane osmium (II) dichloride
Synthesis of100 ml round-bottomed flask equipped with stirrer and reflux condenser
Cis- (bpy) (DPP) synthesized in Example 55
ene) OsCl_Two  129mg (0.158m mo
l) and 2- [3- (4-methyl-2,2-bipyridine-
4-yl) propyl] -1,3-dioxolane, ie b
pyoxal, 0.3 g (1.0 mmol)
Was. To this was added 15 ml of ethylene glycol. This
Was refluxed for 3 hours under a stream of argon. Cool to room temperature
After the addition, add 10 ml of water to the contents of the flask.
Was. SP-Sephadex C-25 ion exchange in water
Adjust the column of exchange resin (height of 30cm x 19mm inner diameter)
Made. The contents of the reaction flask were applied to the column. Kara
H_TwoElution with O (about 500 ml)
And excess bpyoxal ligand were removed. 0.2
Small yellow band eluted with 5M NaCl (aqueous) solution
(Orange fluorescence under long wavelength UV light)
Thereafter, a non-fluorescent olive green band was separated.
These bands indicate a by-product of the reaction.
Was. They were not identified and discarded. These bands
Was removed from the column while simultaneously adding 0.5M NaCl
Elution with (aqueous solution) started. First orange fluorescent
The orange band with the required product salt
(2,2'-bipyridine) [cis-bis
(1,2-diphenylphosphino) ethylene] ｛2-
[3- (4-methyl-2,2'-bipyridine-4'-i
Le) propyl] -1,3-dioxolane osmium
(II), and thereafter (bpy) (DPPene) (b
pyoxal) Os (II)²⁺And described as
Was. This material is a tailed yellow band (green fireflies).
Light) and a brown band (non-fluorescent).(Bpy) (DPPene) (bpyox
al) Os (II)²⁺The volume of the solution in the fraction containing
Evaporate to 50 ml with an evaporator. Then dark N
The aCl aqueous solution was added in 50 ml portions of CH._TwoCl_TwoExtract 3 times with
did. CH_TwoCl_TwoCombine the extracts and add anhydrous Na_TwoSO_Four
And naturally filtered through a foldable filter paper. Red CH
_TwoCl_TwoThe solution is concentrated by evaporation on a rotary evaporator.
The volume was 10 ml. CH_TwoCl_TwoStir the solution well
Slowly drop into 200 ml of petroleum ether
And isolated the complex as an orange solid. Sinking
Aspirated complex onto glass filter (medium porosity)
Collected by filtration. The product is added in 15 ml portions of diethyl
Washed three times with ether. Product in vacuum desiccator
CaSO_FourAnd dried overnight.Yield: (bpy) (DPPene) (bpyoxal)
Os (II)²⁺(Cl^-)_Two・ 2H_Two110 mg of O
(Cis- (bpy) (DPPene) OsCl_Two63%). The product is dihydrate and is analytically pure.
It is smart: C₅₇H₅₄N_FourO_FourP_TwoCl_TwoOs ・ 2H_TwoO
(Molecular weight = 1109.59 g / mole).Theory: C, 55.20%; H, 4.87%; N, 5.
05%; O, 5.77%; Cl, 6.39%. measured value:
C, 56.03%; H, 5.18%; N, 4.88%;
O, 6.87%; Cl, 7.07%Embedded imageEmbodiment 57Cis-dichloro-bis- [4,4'-carbethoxy)
Synthesis of 2,2'-bipyridine] ruthenium (II)250 ml round-bottomed flask equipped with stirrer and reflux condenser
Cis-tetra- (dimethylsulfoxide) dichloride
Lorthenium (II) (Ru (DMSO)_FourCl_Two) 7
50 mg (1.55 mmol) and ethylene glycol
100 ml were added. Argon contents of flask
Boil gently down the stream to give (4,4'-carbomethoxy)-
756 mg of 2,2'-bipyridine (3.09 mmo)
l) was added. Continue heating under an argon stream for 5 minutes.
Was. The orange solution turns brown / black and contains lithium
Add 0.75 g of chloride and 50 ml of ethylene glycol
Added. The solution was heated for another 10 minutes. Cool to room temperature
After recirculation, add about 100 ml of H to the mixture._TwoAdd O
Was. The mixture is mixed with 200 ml of CH 2_TwoCl_TwoAt 5
Extracted times. CH_TwoCl_Two200 ml of water
And washed 6 times. The water layer becomes (red) fluorescent after each washing
Test until no fluorescence is detected in the aqueous layer.
Washing was continued if necessary. CH_TwoCl_TwoExtract solution is anhydrous
Na_TwoSO_FourAnd dried. Product CH_TwoCl_TwoThe solution
Evaporate and stir 10 volumes of anhydrous diethyl ether
And was added dropwise. Aspirate the precipitated product
And washed once with 30 ml of diethyl ether
CaSO in a vacuum desiccator_FourDry overnight
Was. Yield = 25% dark metallic green crystals. This raw
The product is analytically pure.Theory: C, 44.57; H, 4.01; N, 7.4.
3; Cl, 9.40; O, 21.21. Measured value: C, 4
4.16; H, 3.72; N, 7.11; Cl, 9.5.
3: O, 20.15. Molecular weight = 754.5 g / mol
e.Embedded imageEmbodiment 58Bis [(4,4'-carbomethoxy) -2,2'-bipi
Lysine] 2- [3- (4-methyl-2,2'-bipyridi
4-yl) propyl] -1,3-dioxolanlute
Of sodium (II) diperchlorateBis (4,4'-dicarbomethoxy-2,2'-bipyri
Gin) ruthenium (II) dichloride 250 mg (0.
50 ml of 33 mmol) methanol / water (1: 1)
Add 2- [3- (4-methyl-2,2'-bipyridi) to the solution.
-4'-yl) -propyl] -1,3-dioxolane
(Bpoxal) 105 mg (0.37 mmol)
And the mixture is refluxed for 12 hours under a stream of argon.
Was. The solution was cooled and 70% HClO_Four0.5 ml
Was added. The methanol was evaporated slowly. Precipitated
The red crystals are filtered off, washed with a little cold water and then
Washed with ethanol and ether and dried in vacuo. Bi
(4,4'-dicarbomethoxy-2,2'-bipyridi
N) Ruthenium (II) dichloride and 4- (4-methyl)
-2,2'-dipyridin-4'-yl) -butyric acid or 4,
Synthesis of complex from 4'-methyl-2,2'-bipyridine
To do so, a similar method was used.Embedded image[0164]Example 59-Compound I of human IgG
Labeling2 liters of 2 ml of human IgG (2.5 mg / ml)
0.2M sodium bicarbonate buffer, pH 9.6
Then dialyzed overnight at 4 ° C with gentle stirring. Compound
I present protein (2.7 mg / 100 μl
100 mol excess over tilformamide)
Made and melted. Drop the dialyzed protein drop by drop
tag-aldehyde. 2 hours during this time
The solution was gently stirred at room temperature. 100 per protein
molar excess of sodium borohydride (deionized water
100 μl of a 1.24 mg / ml solution dissolved in
Add to the solution and continue gentle stirring at room temperature for another 30 minutes
You. The conjugate was added at room temperature to 0.2 M Tris, pH 8.
Sephadex G-25 column (1.0 c
mx 18.0 cm), and the eluate was monitored at 280 nm.
I started Collect the void volume peaks and combine
Dialysis was performed against 2 liters of Tris buffer. This join
Tests the body for immunological activity using standard ELISA
And stored at 4 ° C. until use.[0165]Example 60-Biomag / goat-anti-human
Manufacturing method of IgG particles5% Biomag-amine terminated
Particles (Advanced Magnetics, Cam
bridge, MA) in a 2.5 ml clean T-flask
And washed 5 times with phosphate buffered saline (PBS).
12.5 ml of 5% new glue
Resuspend in Talaldehyde (Sigma) at ambient temperature
Rotated well for 3 hours. This wet cake is another
Transferred to a T-flask and washed 3 times with PBS. This activation
Resuspended particles in 12.5 ml of PBS,
Transferred to a ml centrifuge tube. Add 2 ml of PBS to this suspension
12.5 mg of goat anti-human IgG dissolved (H + L)
(Jackson Labs) was added. Keep this tube at room temperature
Rotate well for 3 hours, then rotate overnight at 4 ° C. Next day
Each day, the particles are treated with 1% (w / v) bovine serum albumin (BS
Wash twice with PBS containing A), then add 0.1% BSA
Store in 12.5 ml of PBS at 4 ° C until use
You.Example 61-Based on Biomag magnetism
Pseudohomogeneous using particle assayHuman IgG Elec
Toro chemiluminescence assayCompound I-human IgG conjugate with 0.1% BSA
Dilute 1:50 with 0.15M phosphate buffer and use one
250 μl was added per experiment. Diluent (P as above)
Bw / BSA) into a test tube,
Analyte of interest (human IgG) or dilution at various dilution rates
Agent (negative control) was added. More non-specific analytes
Quality (goat-anti-rabbit IgG) assay for specificity
The tubes were put into several test tubes to check. Goat anti-human IgG
50% of 1% Biomag conjugated with (H & L)
Of test tubes. This test tube is mixed on vortex
And allowed to react for 15 minutes at room temperature with gentle shaking.
Was. The particles were magnetically removed from the solution and the resulting supernatant
Transfer 100 μl of the solution to a Berthold tube, where 4
00 μl citrate-oxalate-Triton X
The -100 solution was added. Mix this tube on vortex
And an R-268 photomultiplier tube and 0.29 inch diameter
Improved with annular 52 gauge double platinum mesh electrode
It was measured with a Berthold luminometer. This electrode
Is covered with a polycarbonate support and has a diameter of 0.01
Voltage via inch platinum / silver paint contacts
Supported by conductive paint connected to the source
I have. The applied voltage steps from +1.4 to + 2.15V
Then, integration for 10 seconds was performed during this time. Between measurements
Electrochemically rinses this electrode with deionized water
Clean, then oxalic acid and Triton X-100
Immersion in 0.1M phosphate-citrate buffer solution containing
From -2.2V to + 2.2V (3 seconds at each voltage)
Step) Step for 2 minutes and 20 seconds, and + 2.2V po
Hold at tential for 10 seconds. Clean this electrode with cleaning solution
Remove from, rinse with deionized water, drain
Dried. In this method, electrochemiluminescence
Signal was directly proportional to the concentration of the analyte of interest.Example 6 2-bis (2,2'-bipyridi
N) Maleimidohexanoic acid, 4-methyl-2,2'-bi
Pyridine-4'-butylamidoruthenium (II) peroxide
Chlorate: Method for producing compound IV500 mg (1.3) as described in Example 32.
5 × 10^-3mol) of 4-phthalimide
[4- (1-aminobutyl)]-4'-methyl-2,
0.313 g of 2'-bipyridine in anhydrous pyridine (1.
48 × 10^-3mol) maleimide hexanoic acid and 0.3
06 g (1.48 × 10^-3mol) with DDC
did. After stirring overnight, dicyclohexylurea is filtered.
And pyridine was evaporated under vacuum. This residue
The product was subjected to column chromatography (activated II alumina, 5
% MeOH / CH_TwoCl_Two) Purified and purified product
I got something. Yield: 0.56 g (95%). 100mg
(2.3 × 10^-Fourmol) maleimide-hexanoic acid,
4-methyl-2,2'-bipyridine-4'-butylamido
And 100 mg (2.06 × 10^-Fourmol) bis-
(2,2'-bipyridine) ruthenium dichloride dihydrate
Was dissolved in 50 ml of ethanol / water (1: 1),
It was degassed with gon and refluxed for 4 hours. Transparent orange solution obtained
The solution was washed with 25 ml of solid sodium perchlorate,
Dilute with ethanol and 25 ml of acetone, and vacuum
And slowly evaporated to dryness. Once dry, 25 more
ml of water and 25 ml of acetone are added and the solution is
Concentrate on a rotary evaporator until the volume is 5-20 ml.
Shrunk. The precipitated solid was collected, washed with water and dried. this
The sample was prepared in a 1: 9 methanol / chloroform solvent system.
Purified by preparative TLC for Mina. Here it unfolds fast
The band was scraped off and the compound was
/ Chloroform (1: 1)
And separated. After filtering to remove alumina, orange
The color solution is evaporated to dryness and 86.7 mg of the purified compound
(72%). This structure has been confirmed by NMR.
Was.[0168]Example 63-hCG pep with compound IV
Pide labeling2mg human chorionic gonadotropin (hCG) peptide
(# 109-145, JP141, Vernon St
evens, Ohio State University
ty) in 1 ml of 0.15 M citrate buffer, pH 6.
0, and 1.13 mg of compound IV was added to 300 μl of
Dissolved in dimethylformamide. This peptide solution
Added dropwise to Compound IV solution over 1 minute. This
Was gently stirred at room temperature for 1 hour. Then this sample
At a flow rate of 0.2 M Tris base, pH 8.5 at room temperature.
Bio-Gel P-2 equilibrated at 15 ml / hr
Apply to a column (Bio-Rad; 1 cm × 45 cm)
The eluate was monitored at 280 nm. This void volume
And collect and combine at room temperature with 50 mM Tris-H
QAE-Sephad equilibrated with Cl, pH 7.0
ex A-25 column (Pharmacia; 1 cm ×
10 cm). This removes all unlabeled peptides
I did it to get rid of it. (This unlabeled peptide is positive
Is adsorbed on the resin charged to
The peptide passed through the column as it is. This eluate
Collect the first major peak, monitored at 280 nm and freeze
It was concentrated by freeze drying. Dry the solid again to a minimum
Suspended in PBF. This hCG peptide-compound IV
Coalescence was stored at 4 ° C. until use.Example 64 DEAE AFFI-Gel
  By Blue chromatographyRabbit anti-hCG pen
Purification method of peptide4 ml of DEAE AFFI-Gel Blue (Bi
o-Rad) with a chromatography column (1 cm).
× 10 column size) and add 0.028M N at room temperature.
Flow rate 4 using 0.2 M Tris-HCl containing aCl
Equilibrated at 0 ml / hr for 1 hour. This flow rate is 2
0 ml / hr, dialyzed against this column buffer in advance
Rabbit anti-hCG peptide (anti109-
145, Vernon Stevens, Ohio S
state University) in 1 ml of this column
To Collect 1 ml fractions and eluate
Monitored at 280 nm. Void volume peak
And several experiments are combined, and polyethylene glycol
12K MWC surrounded by 6000 (Sigma)
The eluate was concentrated in an O dialysis sac.
Immunology of this antibody using standard ELISA
Activity was tested and purity was tested by HPLC. H
PLC resulted in one large peak, which was pure
Indicates that the preparation is active.Example 65-Purified rabbit anti-hCG pen
HCG Peptides for Peptides-CompoundsDrop of substance IV conjugate
Determination: Modulation of electrochemiluminescence signalThe hCG peptide-Compound IV conjugate was converted to 0.1 M citric acid
Diluted with 0.1 M phosphate buffer containing pH 6.2. This
A portion of the mixture was placed in a microfuge tube. In advance
Dilute the purified anti-peptide antibody to various concentrations
Add to tube, mix with Vortex and react at room temperature for 1 hour
I let it. Immediately before measuring electrochemiluminescence,
Is partially converted to oxalic acid and Triton X-100 (Sig
Transferred to Berthold tube containing ma). This tube
Mix with Vortex and use R-268 photomultiplier tube
Berthold with double platinum mesh electrodes
Sweep mode (+1.5 with luminometer)
From 50 to +2.5 V three times at 50 mV / sec.
Using the peak height of the second scan as the measurement value).
Was. The electrode was cleaned electrochemically during the measurement. Most
First wash it with deionized water, then wash it with 25 mM
PH with oxalate and 1% Triton X-100
6. Immerse in 0.1 M phosphate-citrate buffer of 6.1
Was. The applied voltage was + 2.2V and-for 3 seconds at each voltage.
Switch between 2.2V for 1 minute and 50 seconds,
It was held at 2.2 V for 10 seconds. Then turn off the electricity and wash
Take the electrode out and rinse it with deionized water to remove moisture
I dried. The result is electrochemiluminescent
Signal is directly proportional to the concentration of antibody to this peptide
Showed a general tendency to do so. This thing is electro
Analyte labeled with chemiluminescence contacts antibody
Then the electrochemiluminescence signal drops
In contrast to other experiments.Example 66-Electrochemiluminescence
Signal output: Ru (II) -compoundOf compound III conjugate
Stability dataRu (II) -Compound III conjugate in 1% normal human
0.1 M phosphate with or without serum (NHS)
Salt-citrate buffer, diluted to 300 nM at pH 6.1
I shouted. One of each buffer type is 4 °, 20 °
Incubate at °, 30 °, and 50 ° C, 3, 4,
And on day 5 samples were taken. This sample is in equilibrium with room temperature
State and its electrochemiluminescence signal output
Was measured. 400 μl sample in 100 μl in test tube
125 mM oxalic acid-5% Triton X-100
Mixed with Hamamatsu R-268 photomultiplier tube and double mesh
Improved Berthold lumino with platinum gauze electrode
I put it in the meter. The measurement is performed by increasing the applied voltage from + 1.5V
Sweep 3 times at 50mV / sec to 2.5V, 2 times
Record the peak height of the eye and determine the electrochemiluminescence
It was measured by converting to counts. During the measurement, the electrodes
Was electrochemically cleaned. Rinse with deionized water, electrode
With 25 mM oxalate and 1% Triton X-100
Immersed in 0.1 M phosphate-citrate buffer containing
Pause for 3 seconds from -2.2V to + 2.2V,
The voltage was pulsed for 1 minute and 50 seconds. +
Stopped at 2.2 V for 10 seconds and then removed. Wash electrode
Remove from liquid, wash with deionized water, blot dry
Dried. The results are independent of each buffer throughout the course of the experiment.
Indicates that a consistent signal exists for each type of liquid
You. This is due to the stability of this reagent and its
Indicates the ability to generate luminescence signals
You.Example 67-Ru (II)-Compound III
Conjugate immunological reactivity test: stabilityExperiment onThis Ru (II) -Compound II conjugate is described in Example 66.
And diluted. Samples 3, 4,
And collected on day 5 and cooled to room temperature, Pande
x, Inc. , Obtained from Mundelein, IL
Using Pandex Screen Machine
Particle Concentration Fl
uorescent Immunoassay (PCF
The immunological reactivity was tested by IA). This PCF
IA was performed in a competitive assay format. This latex
Particles (Pandex) conjugated to theophylline-BSA
I let you. An aliquot of these particles was Ru (II) -Compound I
II conjugate test solution and anti-theophylline monoclonal
Antibody (ascites, Hyclone cat # E-3120
M, lot # RD200) to a final concentration of
Quantitation of goat anti-mouse Ig-FITC conjugate (Pande
x, cat # 33-02-1, lot # C01) and
Mixed. After incubation, process this sample
And measure with PandexScreen Machine
did. The results were 5 days incubation at 55 ° C.
No apparent loss of activity even after
Indicates a thing.Example 68-Various Ruthenium and Osumi
Compound electrochemiluminescenceSense10 ml of various osmium and ruthenium compounds
Dissolved in acetonitrile purged with hydrogen at a concentration of 10 mM
1M tetrabutylammonium as electrolyte
Electrochemical measurement using uranium tetrafluoroborate
did. Electrode for electrolysis is Bioanalytical Sy
stems, Inc. , West Lafayette
e, platinum disk electrode obtained from IN. Platinum wire
Using a counter electrode and a 1.0 mm silver wire as a reference electrode
Was. The measurement is -2.2 V at a scanning speed of 100 mV / sec.
To + 2.2V (vs SCE)
gave. After each electrochemical measurement, see saturated calomel
The voltage difference between the electrode (SCE) and the silver wire was measured. Follow
Values reported are corrected for voltage to SCE
You. Electrochemiluminescence (ECL) measurement
0.1 M phosphate-citrate buffer (pH 4.2),
25 mM oxalic acid and 1% Triton X-100
In 0.5 ml of an aqueous solution containing Electrodes used
The system uses a 0.1 mm platinum wire with Radio Shac
k Connect to transistor socket (# 276-548)
Composed of two platinum gauze (52 gauge) electrodes
Had been. This electrode is made of 60 ml of cellulose acetate
Attached to the outside of the plastic flake. This plastic
The stick has a 1/4 inch diameter hole,
The solution flows easily between the electrolysis and counter-reference electrodes.
You can do it. One electrode is for electrolysis (this
Functions as a photomultiplier tube), and another
These electrodes are used for the poles to function as counter and reference electrodes.
The pole was connected to a potentiostat. The measurement is scanning speed 5
From 1.5V to 2.5V at 0mV / sec (Bias
Voltage) scanning. The Ecl measurement is based on the compound given.
Signal-to-noise ratio at a given concentration, ie
Is reported as the ratio of signal to background.The background is the addition of the Ecl compound.
Luminescence counts for unbuffered buffers
Defined as a number. Luminescence readings can be taken for the first or
The peak light output observed during the second linear scan is
Was. Electrochemiluminescence (ECL) and cycle
Rick voltammetry measurements should be taken for each solution.
And Ursar Scientific Instr
uments, Oxford, England
EG & GModel 273 potentiostat
Or bipotentiostat. Each
The photon flow in ECL measurements was determined by Wilebad, Wes.
Berthold B obtained from Germany
iolumat LB 9500 luminomete
r was monitored. This device is used in 0.5 ml
Modified so that two or three electrode systems can be installed
I have. Measurement of electrochemical and electrochemiluminescent
Both are K obtained from Delft and Holland
ipp & Zonen Model BD91X,
Recorded by Y, Y 'recorder. Target compound
Dissolve in 3.0 ml of ECL solution or ECL solution
If not dissolved in acetonitrile, dissolve in 5
Using 0 ml, the fluorescence was measured. Measurement is Perki
Performed on n-Elmer LS-5 type fluorescence spectrophotometer
Was. The emission spectrum can be measured while irradiating the maximum excitation wavelength.
Conversely, while monitoring the maximum emission wavelength,
Excitation and emission spectra so that
Excitation and emission spectra of this solution before recording the torque
Prescan was performed.[Table 17]                       Eox Ered Fluorescence ECL (S / N)¹Compound VS.SCE Maximum wavelength and concentration  a) Ru (bipy)_Three         1.07V-1.52V 625 nm 1 × 10^-9M                                                              (2.5)  b) Ru (4,4'- 1.19V N.D. 628 nm 2 × 10^-9M     CO_Two-bipy)_Three                                              (4.05)  c) Ru (4,4 'CO_Two       1.54V-0.89V 636 nm 1 × 10^-TenM     -Et-bipy)_Three                                              (2.01)  d) Ru (bipy)_Two         1.17V N.D. 624 nm 1 × 10^-9M     (C-8-theo- (.97)     phylline     C-4-bipy)  e) Os (bipy)_Two         1.82V-0.99V 585 nm 1 × 10^-8M     (CO) (Py)  f) Os (DPPene) 1.60V N.D. 630 nm 6 × 10^-8M     (bpy) (bpyoxal) (10.8)[0175]¹(N / S) is the concentration given the signal.
ECL output of the compound in degrees (luminescence count
Noise) and the noise
Sig when defined as the luminescence count of the impingement liquid itself
Null to noise ratio. its measured at pH 4.2
Unlike the ECL of other compounds, compound c) is physiologically
Even at pH 7, it shows considerable ECL.a) Tris (2,2'-bipyridine) ruthenium²⁺b) Tris (4,4'-carboxylic acid-2,2'-bipi
Lysine) ruthenium²⁺c) Tris (4,4'-carbethoxy-2,2'-
Bipyridine) ruthenium²⁺d) bis (2,2'-bipyridine) dichloride [Theophyl
Phosphorus-8-butyric acid-4- (4-methyl-2,2'-bipyri
Gin) -4'-yl) -butyl) amido] ruthenium
(II)e) Dihexafluorophosphoric acid [bis- (2,2'-bi
Pyridine) ｛monocarbonyl｝ pyridyl] osmium
(II)f) dichloride (2,2'-bipyridine [cis-bis
(1,2-diphenylphosphine) etherene] ｛2-
[3- (4-methyl-2,2'-bipyridine-4'-i
Le) propyl] -1,3-dioxolane osmium
(II)As shown above, in Examples 65 to 68, oxalic acid and
Electronization using Triton X-100
The measurement of the luminescence intensity could be performed efficiently.Example 69 -bis (2,2'-bipyridi
) [4- (4'-methyl-2,2'-Bipyridine)
Tylamine] ruthenium (II) diperchlorate1.29 g (2.48 mmol) of bis-dichloride
(2,2'-pyridine) ruthenium (II) dihydrate
(Strem) and 0.719 g (2.98 mmo)
l) 4- [4- (1-Aminobutyl)] 4'-methyl
-2,2'-bipyridine (as described in Example 32)
50 ml of 50/50 ethanol / H_TwoSuspended in O
The mixture was refluxed for 3 hours in the presence of argon. This reaction solution
Concentrate and chromatograph on Sephadex C-25
Separation, first with distilled water, then with 0.1 ml.
Eluted with 25M NaCl. Finally, 0.4M NaC
and eluted with 1. About 10 fractions containing the product
Concentrate to 0 ml and add perchloric acid until the solution becomes cloudy.
Was. Refrigerated overnight, red-orange crystals of the product (1.215
g) was obtained. Elemental analysis confirmed the structure as follows:
Was:Embedded image[0177]Example 70-Theophylline-8- (3,3
-Dimethyl) butyric acid5,6-diamino, N¹, N^Three-Dimethyluracil hydration
(10 g, 0.059 mol) and 3,3-dimethyl
Glutamic anhydride (12.6 g, 8.85 × 10^-2m
ol) in 100 ml N, N-dimethylaniline
And refluxed using a Dean-Stark trap.
The contents of this reaction solubilized after heating and turned orange-red.
Was. After 4 hours of reflux, 1 ml of water was collected in this trap.
wait. This indicates the completion of the reaction. This reaction
The thing was cooled to room temperature. At this time, the whole was solidified.
This solid is filtered over a fritted funnel,
Washed until the color became pale yellow. Recrystallized twice from DMF
Pure white crystals of the intermediate product lactam
(Melting point 283.1-284.9 ° C.). This lactator
Was boiled in water for 8 hours. When cooled, this solution
Pure white crystals (mp 218-220 ° C) resulted.
The following structure was confirmed by proton NMR and elemental analysis.
Was:Embedded imageExample 7 1-Bis- (2,2'-bipyridi
) [Theophylline-8- (3,3-dimethylbutyric acid-
{4- (4-methyl-2,2'-bipyridine-4'-y
l) -BCyldiamidorthenium (II) diperchlorate100 mg (0.34 mmol) of theophylline-8
-(3,3-dimethyl) butyric acid and 0.325 g (0.3
4 mmol) of bis (2,2'-pyridyl diperchlorate)
)) [4- (4'-methyl-2,2'-bipyridine)
0.351 g (1.7) of tylamine ruthenium (II)
mmol) of dicyclohexylcarbodiimide
Dissolved in 10 ml of anhydrous pyridine. Stir for 2 days
I responded. Filtration of large amounts of dicyclohexylurea precipitate
And the pyridine solution was concentrated in vacuo.
This residue is dissolved in methanol, and Sephadex
Chromatographed on LH-20. The target hula
And the product is precipitated with ether and turns orange
A precipitate was obtained. As a result of elemental analysis and proton NMR,
The structure is as follows:Embedded imageExample 7 2-Theophylline-8-propyl
(4-methyl-2,2'-bipyridine-4'-butyl)
Preparation of carboxamide61.8 mg (1.55 × 10^-Fourmol) 8- (cancer)
(A-aminopropyl) theophylline phthalic acid hydrazide
The salt was dissolved in 1 ml of water and acidified with HCl. Settled
The phthalazide phthalazide is removed by filtration,
The filtrate from was evaporated to dryness and dried in vacuo to give 34.5 mg.
(1.31 × 10^-Fourmol) of theophylline-8-pro
Pyramine hydrochloride was obtained. Add 5 ml of anhydrous
36.9 mg (1.44 × 10^-Fourmo
1) 4- (4-methyl-2,2'-bipyridine-4 '
-Yl) butyric acid and 26.4 mg (2.62 × 10^-Fourmo
l) Triethylamine was added to this. Finally 29.
7 mg (1.44 × 10^-Fourmol) of dicyclohexyl
Carbodiimide was added to this solution. The cloudy solution obtained
The solution was stirred overnight. Precipitated salts and dicyclohexylurea
Was removed by filtration and the solution was evaporated to dryness to give a white solid.
And obtained as eluent a dimer containing 5% methanol.
Chromatography of alumina using chloromethane.
Was. The product is a white powder (melting point: 215 ° -216.5 ° C.)
44.2 mg (71%) were obtained. Proton NM
The following structures were confirmed by R and elemental analysis:Embedded imageExample 7 Bis-dichloride- (2,2'-bi
Pyridine) [theophylline-8-propyl (4-methyl
-2,2'-bipyridine-4'-butyl) carboxami
Do) leProduction method of ruthenium (II)100 mg (2.06 × 10^-Fourmol) bis dichloride
(2,2'-bipyridine) ruthenium (Strem) and
And 108 mg (2.27 × 10^-Fourmol) of theophylli
8-propyl (4-methyl-2,2'-bipyridine
-4'-butyl) carboximide was degassed with argon
Added to 50% ethanol. This solution was heated to reflux.
The resulting cherry red solution is concentrated under high vacuum at room temperature.
Was. This residue was separated by Seph using methanol as an eluent.
adex LH-20 (75 cm × 19 mm I.D.
D. ). Separate product bands
Solvent, and the residue is precipitated in anhydrous ether.
Was. The yield of this product was 156 mg (75%).
As a result of elemental analysis, 4 mol of methanol was found in the product.
It was shown to exist.Analytical results: Calculated; C, 54.09; H, 5.65;
N, 14.16; O, 10.29; Cl, 6.52: real
C, 53.30; H, 5.22; N, 14.56;
O, 10.63 and Cl, 6.95.Embedded imageExample 7 Bis (2,2'-diperchlorate)
Bipyridine) [1-bromo-4- (4'-methyl-2,
2'-bipyridine-4-yl) butane] ruthenium (I
I)Manufacturing methodThe ligand 1-bromo-4- (4 'prepared in Example 31
-Methyl-2,2'-bipyridine-4-yl) butane
0.29 g and bis (2,2'-bipyridine) dichloride
0.32 g of ruthenium (II), 60 ml of 1: 1 v /
v Placed in a flask containing ethanol / water. This solution
Was degassed with nitrogen for 15 minutes. Reaction is under nitrogen for 3.5 hours
The heating was performed under reflux. NaClO_FourCool saturated aqueous solution of
The red solution was added to the solution. Remove the solvent under vacuum and
Acetonitrile / toluene with red residue as eluent
Column chromatography of alumina using 1: 1 v / v (20
cm × 2.5cm, Merck, natural activity 3)
Was. The product is a dark red band from the column (Band #
Eluted as 2). Collect the desired fractions,
Re-dissolve in about 10 ml of dichloromethane and add anhydrous ethyl
Precipitation from ether and finally drying under vacuum
A yield of 0 mg (53%) of the product was obtained. Of this product
Structure confirmed by elemental analysis and spectral properties,
Shown inEmbedded imageExample 75 Bis (2,2'-diperchlorate)
Bipyridine [theophylline-9- [4- (4-methyl-
2,2'-bipyridine-4'-yl) butane] ruthenium
(IProduction method of I)Theophylline silver salt is a theophylline ammonia solution
(25 ml conc. NH_FourOH and 75 ml of water
2.168 g) and an ammonia solution of silver nitrate (10 ml)
  conc. NH_FourOH and 30 ml H_TwoDuring O
2.006g) and react in the dark
Prepared by Immediately after mixing the two solutions,
A colored product appeared. Once product precipitation is complete,
60ml medium glass fr
Collected by filtration on it. This precipitate is
Washed with Monia water and dried under vacuum. Theophylline
The structure of the silver salt was confirmed by elemental analysis. 41 mg of te
Silver of ophylline and 122 mg of bis-diperchlorate
(2,2'-bipyridine) [1-bromo-4- (4'-
Methyl-2,2'-bipyridine-4-yl) butane]
15% anhydrous dimethylformamide
(DMF), and the reaction was performed under dark conditions. Get
The red solution was degassed with argon and heated to reflux for 24 hours
And then cooled to room temperature in the presence of argon. This solution
Cooling to the freezing point, then add this black silver metal suspension
Filter and wash with 5 ml acetone. Red filtrate
Treated with 0.2 g of ruthenium perchlorate, LiClO_Four
After dissolving the solution, the solution is evaporated to dryness under vacuum and the red
The residue was placed in a vacuum overnight in the dark to dry. This trial
Dissolve the material in 3-5 ml of methanol and add 0.25 g
Water LiClO_FourAnd melted. The resulting solution is eluted
LH-2 using methanol as an agent
0 column (75 cm x 19 cm id)
Was. The main product is fraction # 2 (dark red band)
Eluted. Concentrate fraction # 2 into methanol
Redissolved and poured into ethyl ether to precipitate. this
The product was dried under vacuum and 80 mg (50% yield)
Material was obtained. This structure is based on elemental analysis and infrared and emission spectra.
I confirmed it in Kutul.Embedded imageReferences1. Weber, S.M. G. FIG. , Et al. , Phot
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【図面の簡単な説明】【図１】溶液中の一種の抗原の濃度を測定するための均
質系イムノアッセイ用に用いられるエレクトロ化学ルミ
ネセンス測定法について表わしたものである。【図２】均質系ＥＣＬテオフィリン試験の結果をグラフ
に表わしたものである。【図３】各種血清における均質系テオフィリン試験の結
果をグラフに表わしたものである。【図４Ａ】ＥＣＬテオフィリン試験の結果を蛍光偏光テ
オフィリン試験の結果と比較しグラフに表わしたもので
ある。【図４Ｂ】ＥＣＬテオフィリン試験の結果を蛍光偏光テ
オフィリン試験の結果と比較しグラフに表わしたもので
ある。【図４Ｃ】ＥＣＬテオフィリン試験の結果を蛍光偏光テ
オフィリン試験の結果と比較しグラフに表わしたもので
ある。【図４Ｄ】ＥＣＬテオフィリン試験の結果を蛍光偏光テ
オフィリン試験の結果と比較しグラフに表わしたもので
ある。【図５】ＥＣＬテオフィリン試験の結果を高速液体クロ
マトグラフィー試験の結果と比較しグラフに表わしたも
のである。【図６】ＥＣＬジゴキシンイムノアッセイにおいて産生
されたＥＣＬ信号の調整をグラフに表わしたものであ
る。【図７】ＥＣＬジゴキシンイムノアッセイの結果をグラ
フに表わしたものである。【図８】ＭＢＩ３８−化合物Ｉの各濃度において産生さ
れたＥＣＬ信号をグラフに表わしたものである。【図９】ＭＢＩ３８−化合物Ｉのハイブリッド形成／感
受性試験の結果を示したものである。【図１０】ＭＢＩ３８−化合物Ｉの特異性試験の結果を
示したものである。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 illustrates an electrochemiluminescence assay used for a homogeneous immunoassay for measuring the concentration of a type of antigen in a solution. FIG. 2 is a graph showing the results of a homogeneous ECL theophylline test. FIG. 3 is a graph showing the results of a homogeneous theophylline test in various sera. FIG. 4A is a graph comparing the results of the ECL theophylline test with the results of the fluorescence polarization theophylline test. FIG. 4B is a graph comparing the results of the ECL theophylline test with the results of the fluorescence polarization theophylline test. FIG. 4C is a graph comparing the results of the ECL theophylline test with the results of the fluorescence polarization theophylline test. FIG. 4D is a graph comparing the results of the ECL theophylline test with the results of the fluorescence polarization theophylline test. FIG. 5 is a graph comparing the results of the ECL theophylline test with the results of the high performance liquid chromatography test. FIG. 6 is a graphical representation of the modulation of the ECL signal generated in an ECL digoxin immunoassay. FIG. 7 is a graph showing the results of an ECL digoxin immunoassay. FIG. 8 graphically depicts the ECL signal produced at each concentration of MBI38-Compound I. FIG. 9 shows the results of the MBI38-Compound I hybridization / sensitivity test. FIG. 10 shows the results of a specificity test of MBI38-Compound I.

─────────────────────────────────────────────────────フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４１ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４１Ｚ 33/58 33/58 Ａ (72)発明者 ポウエル，マイクル ジェイ. アメリカ合衆国 20878 メリーランド 州ゲイサーズバーグ，ウオー アドミラ ル ウエイ ５(72)発明者 ミード，ポール エイ. アメリカ合衆国 21776 メリーランド 州ニューウインザー，バッファロウ ロ ード 3713(72)発明者 フェング，ピーター アメリカ合衆国 20852 メリーランド 州ロックビル，ロリンズ アベニュー 245(72)発明者 デラ シアナ レオポルド アメリカ合衆国 20851 メリーランド 州ロックビル，ハルピン プレース 5511(72)発明者 ドレシック，ウオルター ジェイ. アメリカ合衆国 20851 メリーランド 州ロックビル，クルックストン レーン 12905(72)発明者 プーニアン，モヒンダー エス. アメリカ合衆国 20879 メリーランド 州ゲイサーズバーグ，ハイ ティンバー コート 224 (56)参考文献 特開 昭60−36959（ＪＰ，Ａ) 米国特許4293310（ＵＳ，Ａ) Ｊａｉｍｅ Ｇｏｎｚａｌｅｓ−Ｖｅ ｌａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｏｒ ｇ．Ｃｈｅｍ．，22（５），Ｐ．822− 825（1983) Ｙａｗ Ｓ．Ｏｂｅｎｇ ＆ Ａｌｌ ｅｎ Ｊ．Ｂａｒｄ，Ｌａｎｇｍｕｉ ｒ，７（１）Ｐ．195−201（1991) Ｓｕｎｇ Ｃｈｕｌ Ｋａｎｇ， Ｓ ｏｏｉｌ Ｏｈ ＆ Ｋａｎｇ−Ｊｉｎ Ｋｉｍ，Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ Ｃ ｈｅｍ．Ｓｏｃ．，11（６）ｐ．505− 508──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl.⁷ Identification code FI G01N 33/543 541 G01N 33/543 541Z 33/58 33/58 A (72) Inventor Powell, Mikle Jay. United States 20878 Maryland Gaithersburg, WA Admiral Way 5 (72) Inventor Mead, Paul A. United States 21776 Buffalo Road, New Windsor, Maryland 3713 (72) Inventor Feng, Peter United States 20852 Rockville, Rollins, MD Avenue 245 (72) Inventor Dela Ciana Leopold United States 20851 Rockville, MD Harbin Place 5511 (72) Inventor Dresic, Walter Jay. United States of America 20851 Crookston Lane, Rockville, Md. 12905 (72) Inventor Puhnian, Mohinder S. United States 20879 High Timber Court, Gaithersburg, Md. 224 (56) References JP-A-60-36959 (JP, A) U.S. Pat. No. 4,293,310 (US, A) Jaime Gonzales-Velasco et al. , Inor g. Chem. , 22 (5), p. 822-825 (1983). Obeng & Allen J.S. Bard, Langmuir, 7 (1) P. 195-201 (1991) Sung Cul Kang, Soil Oh & Kang-Jin Kim, Bull. Korean Chem. Soc. , 11 (6) p. 505- 508

Claims (1)

Translated fromJapanese

(57)【特許請求の範囲】１．エレクトロケミルミネセンス（ＥＣＬ）アッセイ用
組成物であって、該組成物から検出のための電磁放射線
が放出される組成物であり；（ａ）ルテニウムもしくはオスミウム含有ＥＣＬ種であ
って、有効量の電気化学的エネルギーに暴露されて酸化
された時に、励起状態に変換されて励起された該ＥＣＬ
種が電磁放射線を誘導するに十分な条件に暴露された時
に電磁放射線を放出することができるルテニウムもしく
はオスミウム含有ＥＣＬ種；（ｂ）該ＥＣＬ種が酸化されることができるメデイウム
として機能しうる電解液；及び（ｃ）トリトンＸ−１００界面活性剤；を含むＥＣＬアッセイ用組成物。２．トリトンＸ−１００界面活性剤が式（式中、Ｘは９−１０を表わす）である請求項１のＥＣＬアッセイ用組成物。３．ルテニウムもしくはオスミウム含有ＥＣＬ種が生物
学的物質または生物学的物質の合成アナログと共役して
いる請求項１または２のＥＣＬアッセイ用組成物。４．ＥＣＬアッセイ用組成物であって、該組成物から検
出のための電磁放射線が放出される組成物であり；（ａ）ルテニウムもしくはオスミウムキレートであっ
て、有効量の電気化学的エネルギーに暴露されて酸化さ
れた時に、励起状態に変換されて励起された該ルテニウ
ムもしくはオスミウムキレートが電磁放射線を誘導する
に十分な条件に暴露された時に電磁放射線を放出するこ
とができるルテニウムもしくはオスミウムキレート；（ｂ）該ルテニウムもしくはオスミウムキレートが酸化
されることができるメデイウムとして機能しうる電解
液；及び（ｃ）トリトンＸ−１００界面活性剤；を含むＥＣＬアッセイ用組成物。５．トリトンＸ−１００界面活性剤が式（式中、Ｘは９−１０を表わす）である請求項４のＥＣＬアッセイ用組成物。６．ルテニウムもしくはオスミウムキレートが生物学的
物質または生物学的物質の合成アナログと共役している
請求項４または５のＥＣＬアッセイ用組成物。７．ＥＣＬアッセイ用試薬であって、検出のための電磁
放射線を放出するＥＣＬアッセイ用組成物を形成するた
めのＥＣＬアッセイ用試薬であり；該組成物は、（ｉ）ルテニウムもしくはオスミウム含有ＥＣＬ種であ
って、有効量の電気化学的エネルギーに暴露されて酸化
された時に、励起状態に変換されて励起された該ＥＣＬ
種が電磁放射線を誘導するに十分な条件に暴露された時
に電磁放射線を放出することができるルテニウムもしく
はオスミウム含有ＥＣＬ種；（ｉｉ）該ＥＣＬ種と該種とが酸化されることができる
メデイウムとして機能しうる電解液；及び（ｉｉｉ）トリトンＸ−１００界面活性剤；を含む組成物であり；該ＥＣＬアッセイ用試薬は、トリトンＸ−１００界面活性剤（ｉｉｉ）；及び（ａ）該ＥＣＬ種（ｉ）、あるいは（ｂ）該ＥＣＬ種
（ｉ）と該電解液（ｉｉ）、を含むＥＣＬアッセイ用試薬。８．トリトンＸ−１００界面活性剤が式（式中、Ｘは９−１０を表わす）である請求項７のＥＣＬアッセイ用試薬。９．ルテニウムもしくはオスミウム含有ＥＣＬ種が生物
学的物質または生物学的物質の合成アナログと共役して
いる請求項７または８のＥＣＬアッセイ用試薬。１０．ＥＣＬアッセイ用試薬であって、検出のための電
磁放射線を放出するＥＣＬアッセイ用組成物を形成する
ためのＥＣＬアッセイ用試薬であり；該組成物は、（ｉ）ルテニウムもしくはオスミウムキレートであっ
て、有効量の電気化学的エネルギーに暴露されて酸化さ
れた時に、励起状態に変換されて励起された該ルテニウ
ムもしくはオスミウムキレートが電磁放射線を誘導する
に十分な条件に暴露された時に電磁放射線を放出するこ
とができるルテニウムもしくはオスミウムキレート；（ｉｉ）該ルテニウムもしくはオスミウムキレートとカ
ルボン酸とが酸化されることができるメデイウムとして
機能しうる電解液；及び（ｉｉｉ）トリトンＸ−１００界面活性剤；を含む組成物であり、該ＥＣＬアッセイ用試薬は、トリトンＸ−１００界面活性剤（ｉｉｉ）；及び（ａ）該ルテニウムもしくはオスミウムキレート
（ｉ）、あるいは（ｂ）該ルテニウムもしくはオスミウ
ムキレート（ｉ）と該電解液（ｉｉ）、を含むＥＣＬアッセイ用試薬。１１．トリトンＸ−１００界面活性剤が式（式中、Ｘは９−１０を表わす）である請求項１０のＥＣＬアッセイ用試薬。１２．ルテニウムもしくはオスミウムキレートが生物学
的物質または生物学的物質の合成アナログと共役してい
る請求項１０または１１のＥＣＬアッセイ用試薬。１３．ＥＣＬアッセイ用キットであって、ＥＣＬアッセ
イ用組成物から放出される電磁放射線を検出するＥＣＬ
アッセイ用キットであり；該ＥＣＬアッセイ用キットは、（ｉ）ルテニウムもしくはオスミウム含有ＥＣＬ種であ
って、有効量の電気化学的エネルギーに暴露されて酸化
された時に、励起状態に変換されて励起された該ＥＣＬ
種が電磁放射線を誘導するに十分な条件に暴露された時
に電磁放射線を放出することができるルテニウムもしく
はオスミウム含有ＥＣＬ種；（ｉｉ）該ＥＣＬ種と該種が酸化されることができるメ
デイウムとして機能しうる電解液；及び（ｉｉｉ）トリトンＸ−１００界面活性剤；を含むキットであり；該ＥＣＬアッセイ用キットは、ルテニウムもしくはオス
ミウム含有ＥＣＬ種（ｉ），該電解液（ｉｉ）及び該ト
リトンＸ−１００界面活性剤（ｉｉｉ）からなる群から
選ばれる一つもしくはそれ以上のものを含む少なくとも
一つの分離された成分から構成されるＥＣＬアッセイ用
キット。１４．トリトンＸ−１００界面活性剤が式（式中、Ｘは９−１０を表わす）である請求項１３のＥＣＬアッセイ用キット。１５．ルテニウムもしくはオスミウム含有ＥＣＬ種が生
物学的物質または生物学的物質の合成アナログと共役し
ている請求項１３または１４のＥＣＬアッセイ用キッ
ト。１６．ＥＣＬアッセイ用キットであって、ＥＣＬアッセ
イ用組成物から放出される電磁放射線を検出するＥＣＬ
アッセイ用キットであり；該ＥＣＬアッセイ用キットは、（ｉ）ルテニウムもしくはオスミウムキレートであっ
て、有効量の電気化学的エネルギーに暴露されて酸化さ
れた時に、励起状態に変換されて励起された該ルテニウ
ムもしくはオスミウムキレートが電磁放射線を誘導する
に十分な条件に暴露された時に電磁放射線を放出するこ
とができるルテニウムもしくはオスミウムキレート；（ｉｉ）該ルテニウムもしくはオスミウムキレートと該
種とが酸化されることができるメデイウムとして機能し
うる電解液；及び（ｉｉｉ）トリトンＸ−１００界面活性剤；を含み、該ＥＣＬアッセイ用キットは、（ａ）該ルテニウムもしくはオスミウムキレート
（ｉ），該電解液（ｉｉ）及び該トリトンＸ−１００界
面活性剤（ｉｉｉ）からなる群から選ばれる少なくとも
二つのものを含む第一の分離された成分；及び（ｂ）該群の残りのものを含む第二の分離された成分；を含むＥＣＬアッセイ用キット。１７．トリトンＸ−１００界面活性剤が式（式中、Ｘは９−１０を表わす）である請求項１６のＥＣＬアッセイ用キット。１８．ルテニウムもしくはオスミウムキレートが生物学
的物質または生物学的物質の合成アナログと共役してい
る請求項１６または１７のＥＣＬアッセイ用キット。１９．電磁放射線を誘導するに十分な条件に暴露した時
に電磁放射線を放出する組成物中の物質を検出又は定量
する方法であって；（ａ）（ｉ）ルテニウムもしくはオスミウム含有ＥＣＬ
種であって、有効量の電気化学的エネルギーに暴露され
て酸化された時に、励起状態に変換されて励起された該
ＥＣＬ種が電磁放射線を誘導するに十分な条件に暴露さ
れた時に電磁放射線を放出することができるルテニウム
もしくはオスミウム含有ＥＣＬ種；及び（ｉｉ）該ＥＣ
Ｌ種と該種が酸化されることができるメデイウムとして
機能しうる電解液を含む該組成物を形成し；（ｂ）該組成物を誘導して電磁放射線を放出させるに十
分な量の電気化学的エネルギーに、該組成物を適当な条
件下で暴露し；次いで（ｃ）放出された電磁放射線を検出する；ことを含む方法であり、該組成物中に、トリトンＸ−１００界面活性剤を導入し
た、方法。２０．トリトンＸ−１００界面活性剤が式（式中、Ｘは９−１０を表わす）である請求項１９の方法。２１．ルテニウムもしくはオスミウム含有ＥＣＬ種が生
物学的物質または生物学的物質の合成アナログと共役し
ている請求項１９または２０の方法。(57) [Claims] An electrochemiluminescence (ECL) assay composition, wherein the composition emits electromagnetic radiation for detection; and (a) a ruthenium or osmium-containing ECL species, the composition comprising an effective amount of When exposed to electrochemical energy and oxidized, the ECL is converted to an excited state and excited
A ruthenium or osmium containing ECL species capable of emitting electromagnetic radiation when the species is exposed to conditions sufficient to induce electromagnetic radiation; (b) an electrolysis that can function as a medium by which the ECL species can be oxidized. A composition for ECL assay, comprising: a liquid; and (c) Triton X-100 surfactant. 2. Triton X-100 surfactant has the formula (Wherein X represents 9-10) The composition for an ECL assay according to claim 1, wherein 3. 3. The ECL assay composition of claim 1 or 2, wherein the ruthenium or osmium containing ECL species is conjugated to a biological substance or a synthetic analog of the biological substance. 4. A composition for an ECL assay, wherein the composition emits electromagnetic radiation for detection; and (a) a ruthenium or osmium chelate which is exposed to an effective amount of electrochemical energy. A ruthenium or osmium chelate capable of emitting electromagnetic radiation when oxidized and converted to an excited state and exposing the excited ruthenium or osmium chelate to conditions sufficient to induce electromagnetic radiation; (b) An ECL assay composition, comprising: an electrolyte capable of functioning as a medium capable of oxidizing the ruthenium or osmium chelate; and (c) a Triton X-100 surfactant. 5. Triton X-100 surfactant has the formula (Wherein X represents 9-10) The composition for an ECL assay according to claim 4, wherein X represents 9-10. 6. The composition for an ECL assay according to claim 4 or 5, wherein the ruthenium or osmium chelate is conjugated to a biological substance or a synthetic analog of the biological substance. 7. An ECL assay reagent for forming an ECL assay composition that emits electromagnetic radiation for detection; said composition comprising: (i) a ruthenium or osmium containing ECL species. The ECL which has been converted to an excited state and excited when exposed to an effective amount of electrochemical energy and oxidized.
A ruthenium or osmium containing ECL species capable of emitting electromagnetic radiation when the species is exposed to conditions sufficient to induce electromagnetic radiation; (ii) as a medium in which the ECL species and the species can be oxidized; A composition comprising: a functional electrolyte; and (iii) a Triton X-100 surfactant; the ECL assay reagent comprises: a Triton X-100 surfactant (iii); and (a) the ECL species. (I) or (b) an ECL assay reagent comprising the ECL species (i) and the electrolytic solution (ii). 8. Triton X-100 surfactant has the formula (Wherein X represents 9-10) The reagent for an ECL assay according to claim 7, wherein 9. 9. The reagent according to claim 7, wherein the ruthenium or osmium-containing ECL species is conjugated to a biological substance or a synthetic analog of the biological substance. 10. An ECL assay reagent for forming an ECL assay composition that emits electromagnetic radiation for detection, the composition comprising: (i) a ruthenium or osmium chelate; When exposed to an effective amount of electrochemical energy and oxidized, it is converted to an excited state and emits electromagnetic radiation when the excited ruthenium or osmium chelate is exposed to conditions sufficient to induce electromagnetic radiation. A ruthenium or osmium chelate capable of functioning as a medium capable of oxidizing the ruthenium or osmium chelate and a carboxylic acid; and (iii) a Triton X-100 surfactant. The ECL assay reagent is Triton X-100 Surface active agent (iii); and (a) the ruthenium or osmium chelates (i), or (b) the ruthenium or osmium chelates (i) and electrolyte solution (ii), ECL assay reagent containing. 11. Triton X-100 surfactant has the formula (Wherein X represents 9-10) The reagent for an ECL assay according to claim 10, wherein X represents 9-10. 12. The reagent for an ECL assay according to claim 10 or 11, wherein the ruthenium or osmium chelate is conjugated to a biological substance or a synthetic analog of the biological substance. 13. An ECL assay kit for detecting electromagnetic radiation emitted from an ECL assay composition
An ECL assay kit comprising: (i) a ruthenium or osmium-containing ECL species, which is converted to an excited state and excited when exposed to an effective amount of electrochemical energy and oxidized; The ECL
A ruthenium or osmium containing ECL species capable of emitting electromagnetic radiation when the species is exposed to conditions sufficient to induce electromagnetic radiation; (ii) acting as the ECL species and a medium from which the species can be oxidized; And (iii) a Triton X-100 surfactant. The ECL assay kit comprises a ruthenium or osmium-containing ECL species (i), the electrolyte (ii) and the Triton X An ECL assay kit comprising at least one separated component including one or more members selected from the group consisting of -100 surfactant (iii). 14． Triton X-100 surfactant has the formula (Wherein X represents 9-10) The kit for an ECL assay according to claim 13, wherein X represents 9-10. 15. The kit for an ECL assay according to claim 13 or 14, wherein the ruthenium or osmium-containing ECL species is conjugated to a biological substance or a synthetic analog of the biological substance. 16. An ECL assay kit for detecting electromagnetic radiation emitted from an ECL assay composition
An ECL assay kit comprising: (i) a ruthenium or osmium chelate, which is converted to an excited state and excited when exposed to an effective amount of electrochemical energy and oxidized; A ruthenium or osmium chelate capable of emitting electromagnetic radiation when the ruthenium or osmium chelate is exposed to conditions sufficient to induce electromagnetic radiation; (ii) the ruthenium or osmium chelate and the species are oxidized. And (iii) a Triton X-100 surfactant. The ECL assay kit comprises: (a) the ruthenium or osmium chelate (i), the electrolyte (ii) and A group consisting of the Triton X-100 surfactant (iii) And (b) wherein said group second separated component including the remaining ones; kit ECL assays including at least a first separated component containing two one selected et. 17． Triton X-100 surfactant has the formula (Wherein X represents 9-10) The kit for an ECL assay according to claim 16, wherein 18. The ECL assay kit according to claim 16 or 17, wherein the ruthenium or osmium chelate is conjugated to a biological substance or a synthetic analog of the biological substance. 19. A method for detecting or quantifying a substance in a composition that emits electromagnetic radiation when exposed to conditions sufficient to induce electromagnetic radiation, comprising: (a) (i) an ECL containing ruthenium or osmium;
A species that, when exposed to an effective amount of electrochemical energy and oxidized, is converted to an excited state and when the excited ECL species is exposed to conditions sufficient to induce electromagnetic radiation, A ruthenium- or osmium-containing ECL species capable of releasing the EC; and (ii) the EC
Forming the composition comprising an L species and an electrolyte capable of functioning as a medium in which the species can be oxidized; (b) an amount of electrochemical sufficient to induce the composition to emit electromagnetic radiation. Exposing the composition to suitable energy under suitable conditions; and then (c) detecting the emitted electromagnetic radiation. Comprising a Triton X-100 surfactant in the composition. The method introduced. 20. Triton X-100 surfactant has the formula 20. The method of claim 19, wherein X represents 9-10. 21. 21. The method of claim 19 or 20, wherein the ruthenium or osmium containing ECL species is conjugated to a biological substance or a synthetic analog of a biological substance.