JP3307636B2 - Assays and treatments for autoimmune diseases - Google Patents

Description

Translated fromJapanese

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、自己免疫疾患、特に全身性エリテマトーデ
スの予防、診断および治療の分野に関する。Description: BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to the field of prevention, diagnosis and treatment of autoimmune diseases, especially systemic lupus erythematosus.

米国政府は、合衆国国立衛生研究所および在郷軍人局
からの許可により、本発明の権利を有する。The United States Government has rights in this invention with permission from the United States National Institutes of Health and the Office of the Legion.

本発明は、John B.Harleyによって、1990年１月31日
付けで提出された、米国特許第07/472,947号「自己免疫
疾患のためのアッセイおよび治療」の一部継続出願であ
る。This invention is a continuation-in-part of U.S. Patent No. 07 / 472,947, "Assays and Therapies for Autoimmune Diseases," filed January 31, 1990 by John B. Harley.

全身性エリテマトーデス（SLE）は、自己抗体が発現
され、それが病因および病原において重要であると思わ
れる、他の多数の疾患と同様である。SLEは、一般に自
己抗体を有するが、疾患が臨床発現にいたるまでの、病
原中の自己抗体の主要な役割については、まだ十分に確
立または容認されていないような疾患に分類される。こ
のような疾患の他の例としては、Sjogren症候群、慢性
関節リウマチ、若年性糖尿病、原発性胆汁性肝硬変、ウ
ェーグナー肉芽腫症、炎症性腸疾患などが挙げられる。
通常、自己免疫疾患は、広範囲にわたる症状および臨床
兆候を示す。リボ核タンパク複合体（RNPs）に対する循
環自己抗体の生産は、いくつかのリウマチ性自己免疫疾
患の一体的な特徴である。SEL中の最も一般的な抗原お
よび密接に関連した疾患には、Ro/SSA、La/SSB、nRNPお
よびSmが含まれる。最初に、これらの抗体は二重免疫拡
散を使用して発見されたが、最近では、自己抗体を定量
するために、感受性の高い固相アッセイが開発されてい
る。今日までに、Ro/SSA RNAタンパク質粒子が、評価さ
れたすべてのヒト細胞の構成要素であることが発見され
ている。Sjogren症候群および全身性エリテマトーデス
（SLE）患者の約半分が、抗Ro/SSA沈降抗体を有する。
亜急性皮膚エリテマトーデスまたはSLEに伴う補体成分C
2欠損症を煩う約75％の患者が、抗Ro/SSA沈降抗体を有
する。新生児浪瘡皮膚炎または完全先天性心ブロックを
煩う新生児の母親の80％以上が、この自己抗体を有す
る。R.M.Bernsteinら、Mol.Biol.Med.2:105−120（198
4）ならびにJ.B.HarleyおよびK.K.Gaither,Autoantibod
ies,In Rheumatic Disease Clinics of North America
n:Systemic Lupus Erythematosus 14:1,43−56（1988）
に記載されているように、慢性関節リウマチ、多発筋炎
および進行性全身性硬化症を煩う患者の約５％もが、抗
Ro/SSAを有する。Systemic lupus erythematosus (SLE) is similar to many other diseases in which autoantibodies are expressed, which are thought to be important in etiology and pathogenesis. SLE is generally classified as a disease in which it has autoantibodies, but the major role of autoantibodies in the pathogens until the disease reaches clinical manifestation is not yet well established or tolerated. Other examples of such diseases include Sjogren syndrome, rheumatoid arthritis, juvenile diabetes, primary biliary cirrhosis, Wegner's granulomatosis, inflammatory bowel disease, and the like.
Autoimmune diseases usually present a wide range of symptoms and clinical signs. Production of circulating autoantibodies to ribonucleoprotein complexes (RNPs) is an integral feature of some rheumatic autoimmune diseases. The most common antigens and closely related diseases in SEL include Ro / SSA, La / SSB, nRNP and Sm. Initially, these antibodies were discovered using double immunodiffusion, but recently, sensitive solid-phase assays have been developed to quantify autoantibodies. To date, Ro / SSA RNA protein particles have been discovered to be a component of all human cells evaluated. About half of patients with Sjogren syndrome and systemic lupus erythematosus (SLE) have anti-Ro / SSA-precipitating antibodies.
Complement component C associated with subacute cutaneous lupus erythematosus or SLE
2 Approximately 75% of patients with deficiency have anti-Ro / SSA-precipitating antibodies. More than 80% of newborn mothers who suffer from neonatal acne dermatitis or complete congenital heart block have this autoantibody. RMBernstein et al., Mol. Biol. Med. 2: 105-120 (198
4) and JBHarley and KKGaither, Autoantibod
ies, In Rheumatic Disease Clinics of North America
n: Systemic Lupus Erythematosus 14: 1, 43-56 (1988)
Approximately 5% of patients suffering from rheumatoid arthritis, polymyositis and progressive systemic sclerosis, as described in
Has Ro / SSA.

全身性エリテマトーデスおよび関連の疾患において発
見される多数の自己抗体が、抗原特異的応答またはエポ
リクローナルあるいは抗原非特異的応答を示すか否かに
ついて、多くの議論がなされている。SLEおよび関連症
候群の発現において、自己抗体が重要であるという証明
には、説得力がある。心ブロックの新生児における特異
的な消耗（Harley,J.B.ら、Arthritis Rheum.28:1321−
1325（1985））およびヒトの皮膚における特異的な抗Ro
/SSA免疫グロブリン沈着（Lee,L.A.ら、J.Clin.Invest.
83:1556−1562（1989））が示されている。抗Ro/SSAの
特定の濃度は、浪瘡腎炎に冒された腎臓からの腎溶出物
の免疫グロブリン中で示されている（Maddison,P.J.お
よびRejchlin,M.Arthritis Rheum.22:858−863（179
9））。抗Ro/SSAは、Sjogren症候群および原発性胆汁性
肝硬変を煩う患者の耳下腺に特異的に集中しているのが
発見されている（Penner,E.およびReichlin,M.Arthriti
s Rheum.25:1250−1253（1982））。胎盤を通じて得た
母性IgGを有する胎児が、新生児浪瘡皮膚炎および／ま
たは完全先天性心ブロックの症状を示すことが観察され
（Harley,J.B.およびGaither.K.K.:Autoantibodies.In
Rheumatic Disease Clinics of North America:Systemi
c Lupus Erythematosus 14:1,43−56（1988））、これ
によって、胎盤を通じて運搬された母性自己抗体（抗Ro
/SSAまたは抗La/SSB）が、これらの臨床上の問題にとっ
て十分ではないが、必要かつ重要な成分であることが示
唆されている。There has been much debate as to whether the large number of autoantibodies found in systemic lupus erythematosus and related diseases show an antigen-specific response or an epoliclonal or non-antigen-specific response. The proof that autoantibodies are important in the development of SLE and related syndromes is compelling. Specific depletion in neonates with heart block (Harley, JB et al., Arthritis Rheum. 28: 1321-
1325 (1985)) and specific anti-Ro in human skin
/ SSA immunoglobulin deposition (Lee, LA et al., J. Clin. Invest.
83: 1556-1562 (1989)). Specific concentrations of anti-Ro / SSA have been shown in immunoglobulins of renal eluate from kidneys affected by acne nephritis (Maddison, PJ and Rejchlin, M. Arthritis Rheum. 22: 858-863 ( 179
9)). Anti-Ro / SSA has been found to be specifically concentrated in the parotid glands of patients suffering from Sjogren syndrome and primary biliary cirrhosis (Penner, E. and Reichlin, M. Arthriti
s Rheum. 25: 1250-1253 (1982)). Fetuses with maternal IgG obtained through the placenta have been observed to exhibit symptoms of neonatal acne dermatitis and / or complete congenital heart block (Harley, JB and Gaither. KK: Autoantibodies.
Rheumatic Disease Clinics of North America: Systemi
c Lupus Erythematosus 14: 1, 43-56 (1988)), which allows maternal autoantibodies (anti-Ro
/ SSA or anti-La / SSB) has been suggested as a necessary but important component, though not sufficient for these clinical problems.

正常な個体の中には、低レベルの抗Ro/SSAを有するも
のがいること、SLE患者の正常な家族のメンバーの中に
は、抗Ro/SSAを有するものがいること、正常な妊婦の１
％および入院患者の一群の0.1％が、沈降レベルの自己
抗体を有することも示されている（K.K.Gaitherら、J.C
lin.Invest.79:841−846（1987）;T.J.A.Lehmanら、J.R
heumatol.11:644−647（1987）;M.CalmesおよびB.A.Bar
tholomew,J.Clin.Pathol.38:73−75（1985）;P.J.Maddi
sonら、J.Rheumatol.5:407−411（1978））。抗Ro/SSA
自己抗体が病原性でないとしても、患者の抗Ro/SSA自己
抗体の濃度は異常であり得、一般に、1mg/mlの特異的抗
Ro/SSA免疫グロブリンよりも多い（K.K.Gaitherおよび
J.B.Harley,Prot.Biol.Fluids Proc.Colloq.33:413−41
6（1985）;J.B.Harleyら、Arthritis Rhuem.29:196−20
6（1986））。抗Ro/SSAの特異的な過剰生産につながる
免疫系障害は、明白ではないが、関連疾患の免疫病原に
関連する基本的なメカニズムを反映しているようであ
る。That some normal individuals have low levels of anti-Ro / SSA; some members of the normal family of SLE patients have anti-Ro / SSA; 1
% And 0.1% of a group of hospitalized patients have also been shown to have sedimentation levels of autoantibodies (KKGaither et al., JC
lin. Invest. 79: 841-846 (1987); TJALehman et al., JR.
heumatol. 11: 644-647 (1987); M. Calmes and BABar.
tholomew, J. Clin. Pathol. 38: 73-75 (1985); PJMaddi
son et al., J. Rheumatol. 5: 407-411 (1978)). Anti-Ro / SSA
Even if the autoantibodies are not pathogenic, the concentration of anti-Ro / SSA autoantibodies in the patient can be abnormal, typically 1 mg / ml specific antibody.
More than Ro / SSA immunoglobulin (KKGaither and
JB Harley, Prot. Biol. Fluids Proc. Colloq. 33: 413-41
6 (1985); JB Harley et al., Arthritis Rhuem. 29: 196-20.
6 (1986)). The immune system impairment leading to specific overproduction of anti-Ro / SSA is less obvious, but appears to reflect a fundamental mechanism associated with the immune pathogenesis of the associated disease.

現在、Ro/SSAファミリーのタンパク質には、同定され
た抗原の分子量によって、操作上定義されるいくつかの
分子の型があることが示されている。主要な型は、60キ
ロダルトン（kD）の見かけ上の分子量を有する。このタ
ンパク質は、４つのhY RNAのうちの１つと関連してい
る。最近、抗Ro/SSA血清に結合したさらに２つのタンパ
ク質が、52kDおよび54kDの分子量を有することが、M.D.
Raderら、J.Clin.Invest.83:1556−1562（1989）によっ
て同定されている。48kDのタンパク質であるカルモジェ
リンは、抗Ro/SSA血清が結合することが同定されている
（McCauliffeら、J.Clin.Invest.85:1379−1391（199
0））。J.C.ChambersおよびJ.D.Keene,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 82:2115−2119（1985）によって記載されてい
るように、La/SSBタンパク質である48kDのタンパク質も
また、このグループの自己抗体のメンバーである。そし
て、J.E.Stephano,Cell 36:145−154（1984）によって
報告されているように、ポリウリジン末端を有する小RA
Nと結合する。La/SSBは、抗Ro/SSA沈降抗体陽性血清の
３分の１（a third of）と結合される。抗Ro/SSA自己免
疫血清および異種免疫ウサギ血清が使用され、リンパ球
Ro/SSAおよび赤血球Ro/SSAに対する異なる特異性が示さ
れている。Ro/SSA RNPの特異性のいくつかは、留意され
てきたが、自己免疫応答に関与する特異的エピトープを
定義する情報は、ほとんど存在しない。Currently, the Ro / SSA family of proteins has been shown to have several molecular types that are operationally defined by the molecular weight of the identified antigen. The major form has an apparent molecular weight of 60 kilodaltons (kD). This protein is associated with one of the four hY RNAs. Recently, two additional proteins bound to anti-Ro / SSA serum have molecular weights of 52 kD and 54 kD, according to MD.
Rader et al., J. Clin. Invest. 83: 1556-1562 (1989). Carmogelin, a 48 kD protein, has been identified to bind anti-Ro / SSA serum (McCauliffe et al., J. Clin. Invest. 85: 1379-1391 (199
0)). JCChambers and JDKeene, Proc. Natl. Acad.
The 48 kD protein, a La / SSB protein, is also a member of this group of autoantibodies, as described by Sci. USA 82: 2115-2119 (1985). And, as reported by JE Stephano, Cell 36: 145-154 (1984), small RAs with polyuridine ends
Combine with N. La / SSB is bound to a third of anti-Ro / SSA precipitated antibody positive sera. Anti-Ro / SSA autoimmune serum and xenoimmune rabbit serum were used and lymphocytes
Different specificities for Ro / SSA and erythrocyte Ro / SSA have been demonstrated. Although some of the specificity of the Ro / SSA RNP has been noted, there is little information defining specific epitopes involved in the autoimmune response.

従って、本発明の目的は、免疫原ならびに特異的エピ
トープおよびそのエピトープをコードする配列を同定す
るための方法を提供することである。このエピトープ
は、免疫グロブリン、抗原特異的Ｂ細胞表面受容体分子
または抗原特異的Ｔ細胞受容体が結合する抗原または自
己抗原が関与する自己免疫応答の生産を誘起する。Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for identifying an immunogen as well as a specific epitope and a sequence encoding that epitope. This epitope triggers the production of an autoimmune response involving an antigen or an autoantigen to which an immunoglobulin, antigen-specific B cell surface receptor molecule or antigen-specific T cell receptor binds.

本発明の他の目的は、特定の免疫原に予め曝されたか
これらの抗体を発現する個体を確認するか、またはこれ
らの自己抗体の生産を誘起するエピトープ（もしくはそ
れらの免疫等価物）を確認するためのアッセイおよび診
断試薬を提供することである。Another object of the invention is to identify individuals previously exposed to a particular immunogen or expressing these antibodies, or to identify epitopes (or their immunoequivalents) that induce the production of these autoantibodies. To provide assays and diagnostic reagents for

本発明の他の目的は、Sjogren症候群、慢性関節リウ
マチ、若年性糖尿病、原発性胆汁性肝硬変、ウェーグナ
ー肉芽腫症、炎症性腸疾患、潜在的自己免疫疾患または
免疫発現を有するその他の疾患等の様々な疾患を含む、
自己免疫疾患を同定し治療するための方法および組成物
を提供することである。Other objects of the invention include Sjogren syndrome, rheumatoid arthritis, juvenile diabetes, primary biliary cirrhosis, Wegner's granulomatosis, inflammatory bowel disease, potential autoimmune disease or other diseases with immune manifestations, etc. Including various diseases,
It is to provide methods and compositions for identifying and treating autoimmune diseases.

本発明の他の目的は、自己免疫疾患の発現の免疫源を
決定するための手法を提供することである。It is another object of the present invention to provide a technique for determining the immunogen of an autoimmune disease episode.

本発明の他の目的は、治療薬をスクリーニングするた
めの、ヒト自己抗体を発現する動物モデルを提供するこ
とである。It is another object of the present invention to provide an animal model expressing human autoantibodies for screening therapeutic agents.

本発明の他の目的は、公知の病因の、選択された疾患
発現の源を決定するための手法を提供することである。Another object of the present invention is to provide a technique for determining the source of selected disease manifestations of known etiology.

発明の要旨 特定疾患に特徴的な自己抗体の生産に関与する病因性
または抗原性物質を同定するために、特異的な方法が開
発された。例えば、まず、１またはそれ以上の患者から
単離した自己抗体を使用して、抗原を単離する。次い
で、オーバーラップする短いアミノ酸配列、好ましくは
20個以下のアミノ酸（以下に記載する実施例ではRo/SSA
およびLa/SSBのオクタペプチド）に分割する。自己抗体
との反応性が大きい配列を同定する。次いで、コンピュ
ータデータベースを用いて、これらの配列を、すべての
既知のアミノ酸配列と比較する。自己抗体との反応性が
大きい配列に相同性のある配列を最大数または最大の割
合で有するタンパク質は、公知の配列が決定しているタ
ンパク質の中で病原性物質または免疫原として最も可能
性の大きい候補である。SUMMARY OF THE INVENTION Specific methods have been developed to identify pathogenic or antigenic substances involved in the production of autoantibodies characteristic of a particular disease. For example, first the antigen is isolated using autoantibodies isolated from one or more patients. Then, the overlapping short amino acid sequences, preferably
20 amino acids or less (Ro / SSA in the examples described below)
And La / SSB octapeptide). Identify sequences that are highly reactive with autoantibodies. These sequences are then compared to all known amino acid sequences using a computer database. Proteins with the greatest number or percentage of sequences homologous to sequences that are highly reactive with autoantibodies are the most likely pathogenic agents or immunogens among known sequenced proteins It is a big candidate.

この方法を用いて、SLEのような多数の自己免疫疾患
に特徴的なRo/SSA抗原を含む、いくつかの自己抗体を生
産するための病因性物質が、水疱性口炎ウイルスのイン
ディアナ株に相同なウイルスであると思われることが判
定されている。このウイルスのヌクレオカプシドタンパ
ク質（Ｎ）には、60kDのRo/SSA配列に対して同様に相同
な少なくとも６つの領域（３個のペンタペプチドおよび
３個のクアドラペプチド）が含まれる。（同様に相同な
トリペプチドに基づくと、少なくともトリペプチド相同
を有する23領域が存在する。）60kDのRo/SSAに対してＮ
タンパク質より高い相同性を示す、他のいくつかのタン
パク質配列が知られている。抗原性および相同性は、Ｎ
およびRo/SSAの上記の領域においてのみよく一致する
（ｐ＜0.00017）。Using this method, pathogens to produce several autoantibodies, including Ro / SSA antigens characteristic of many autoimmune diseases such as SLE, were introduced into the vesicular stomatitis virus Indiana strain. It has been determined that it appears to be a homologous virus. The nucleocapsid protein (N) of this virus contains at least six regions (3 pentapeptides and 3 quadrapeptides) that are also homologous to the 60 kD Ro / SSA sequence. (Similarly, based on homologous tripeptides, there are at least 23 regions with tripeptide homology.) N to the 60 kD Ro / SSA
Several other protein sequences are known that exhibit higher homology than proteins. Antigenicity and homology are N
And good agreement only in the above regions of Ro / SSA (p <0.00017).

病因性物質および抗原性配列が一旦知られると、病因
性物質および／または自己抗体を有する患者の診断およ
び治療のためのアッセイおよび試薬を作製することが可
能となる。重症の合併型免疫欠損を有するマウスに、ヒ
ト自己抗体を生産する細胞をトランスファーすることに
よって、発達させた動物モデルは、これらおよび他の自
己抗体の発現を治療または予防するための化合物をスク
リーニングするのに特に有用でなければならない。Once the pathogen and antigenic sequence are known, it is possible to make assays and reagents for the diagnosis and treatment of patients with the pathogen and / or autoantibodies. Developed animal models by transferring cells producing human autoantibodies to mice with severe combined immunodeficiency screen compounds to treat or prevent expression of these and other autoantibodies Must be particularly useful for

図面の簡単な説明 図１は、60kDのヒトRo/SSAタンパク質のカルボキシル
末端にある、119個のアミノ酸配列の特徴の概略を示
す。BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 outlines the characteristics of the 119 amino acid sequence at the carboxyl terminus of the 60 kD human Ro / SSA protein.

パネルA:Wisconsin Genetics Systems software（Dev
ereauxら、Sequence analysis software of the geneti
cs computer group.pp.233−239,University of Wiscon
sin,Madison,WI（1987）;JamesonおよびWolff CABIOS
4:181−187（1988））から入手したアミノ酸配列に基づ
いた物理的特徴の予想。Panel A: Wisconsin Genetics Systems software (Dev
ereaux et al., Sequence analysis software of the geneti
cs computer group.pp.233-239, University of Wiscon
sin, Madison, WI (1987); Jameson and Wolff CABIOS
4: 181-187 (1988)). Prediction of physical characteristics based on the amino acid sequence obtained.

パネルB:配列の各位置における119個のオーバーラッ
プしているオクタマーの固相イムノアッセイ。グラフの
棒は、V8プロテアーゼで消化されたウシRo/SSAの13kDペ
プチドのカルボキシル末端にも結合する、抗Ro/SSA標準
血清の固相ELISAにおける活性を示す。このアッセイに
おけるバックグラウンド活性は、通常のコントロール血
清からのものである。２回の実験から得られた値の平均
を示す。オクタペプチド番号は、オクタペプチドのアミ
ノ末端アミノ酸の配列位置である。Panel B: solid phase immunoassay of 119 overlapping octamers at each position in the sequence. The bars in the graph show the activity in solid phase ELISA of anti-Ro / SSA standard sera, which also binds to the carboxyl terminus of the 13 kD peptide of bovine Ro / SSA digested with V8 protease. Background activity in this assay is from normal control serum. Shown is the average of the values obtained from two experiments. The octapeptide number is the sequence position of the amino terminal amino acid of the octapeptide.

図２は、ヒト抗Ro/SSA標準血清の、Ro/SSAのオーバー
ラップするオクタペプチドへの結合分析を示す。ヒト60
−kDa Ro/SSAアミノ酸配列からのすべての可能なオクタ
ペプチドは、固相支持体上で合成した。固相酸素免疫測
定法は、ヒト抗体による結合を検出するために使用し
た。オクタペプチド番号は、アミノ末端アミノ酸の配列
位置を示す。（Ａ）通常のコントロール血清の場合。
（Ｂ）抗Ro/SSA標準血清の結合。（Ｃ）中央抗原オクタ
ペプチドは、破線によって示される。（Ｄ）黒塗のブロ
ックは、インディアナ血清型のＮタンパク質と共通して
いるRo/SSA配列のテトラペプチドおよびより長い領域を
示す。３個のテトラペプチドと３個のペンタペプチドの
同一性が存在するため平均5.5個のオクタペプチドであ
る。Ro/SSA配列の残りは、平均5.5個のオクタペプチド
を有するグループに任意に分割される（白抜きのブロッ
ク）。残りのオクタペプチド以外すべてのグループが連
続している。この残りのオクタペプチドは、配列の異な
る部分から回収して集めた。（Ｅ）別の３つの抗Ro/SSA
沈降抗体陽性血清からの中央抗原オクタペプチドは、▼
によって示される。FIG. 2 shows binding analysis of human anti-Ro / SSA standard sera to overlapping octapeptides of Ro / SSA. Human 60
All possible octapeptides from the -kDa Ro / SSA amino acid sequence were synthesized on a solid support. Solid phase oxygen immunoassay was used to detect binding by human antibodies. Octapeptide numbers indicate the sequence position of the amino terminal amino acid. (A) Normal control serum.
(B) Binding of anti-Ro / SSA standard serum. (C) Central antigen octapeptide is indicated by a dashed line. (D) Solid blocks indicate tetrapeptides of Ro / SSA sequence and longer regions common to the N protein of Indiana serotype. The average is 5.5 octapeptides due to the presence of three tetrapeptides and three pentapeptides. The rest of the Ro / SSA sequence is arbitrarily divided into groups with an average of 5.5 octapeptides (open blocks). All groups except the remaining octapeptides are contiguous. The remaining octapeptide was recovered and collected from different parts of the sequence. (E) Another three anti-Ro / SSA
The central antigen octapeptide from the precipitated antibody-positive serum is ▼
Indicated by

図３は、ヒト抗Ro/SSA標準血清の、Ro/SSAのオーバー
ラップするオクタペプチドへの結合の概略を示す。60kD
のヒトRo/SSAアミノ酸配列からの可能なすべてのオクタ
ペプチドを、固相支持体上で合成した。固相をアルブミ
ンでブロックし、次いで抗Ro/SSA標準血清または他のRo
でインキュベートした。免疫グロブリンの固相オクタペ
プチドに対する結合を、ELISAアッセイの標準手法に従
って、アルカリホスファターゼに結合したヤギの抗ヒト
γ鎖特異的IgGで示した。（このアッセイ手法はまた、
図１および図２におけるオクタペプチド結合を検出する
ために使用した。）水疱性口炎ウイルスのインディアナ
株のヌクレオカプシドタンパク質との相同領域は、４つ
またはそれ以上のアミノ酸の正確な相同性を共有するす
べての領域を同定する棒によって示される。アステリス
ク（＊）は、抗原性および相同性関連を分析するための
最大または中央オクタペプチドを示す。FIG. 3 shows a schematic of the binding of human anti-Ro / SSA standard sera to overlapping Ro / SSA octapeptides. 60kD
All possible octapeptides from the human Ro / SSA amino acid sequence were synthesized on a solid support. Block the solid phase with albumin and then use anti-Ro / SSA standard serum or other Ro
Incubated. Binding of the immunoglobulin to the solid phase octapeptide was demonstrated by goat anti-human gamma chain specific IgG conjugated to alkaline phosphatase according to standard ELISA assay procedures. (This assay technique also
Used to detect octapeptide binding in FIGS. 1 and 2. ) Regions of homology to the nucleocapsid protein of the Indiana strain of vesicular stomatitis virus are indicated by bars identifying all regions that share the exact homology of four or more amino acids. Asterisks (*) indicate the largest or central octapeptide for analyzing antigenicity and homology associations.

図４は、60kDのヒトRo/SSAタンパク質と、水疱性口炎
ウイルスのインディアナ株のヌクレオカプシドタンパク
質（Ｎ）との間の４つまたはそれ以上のアミノ酸の相同
性領域を示す。Ro/SSA配列上の相同領域はその順番に標
識されている。相同性領域の配列位置は、Ro/SSAおよび
Ｎタンパク質上に示してある。標準単一文字コードは、
相同性のある領域におけるアミノ酸を示す。FIG. 4 shows a homology region of four or more amino acids between the 60 kD human Ro / SSA protein and the nucleocapsid protein (N) of the vesicular stomatitis virus Indiana strain. The homologous regions on the Ro / SSA sequence are labeled in that order. The sequence position of the homology region is indicated on the Ro / SSA and N proteins. The standard single character code is
The amino acids in the region of homology are indicated.

図５は、60kDのRo/SSAとラブドウイルスＮタンパク質
との間の少なくとも４個の連続したアミノ酸の相同領域
を示す。Ro/SSAとＮタンパク質との間の共有された小ペ
プチド。このＮタンパク質は、Ro/SSAの中央抗原ペプチ
ドとオーバーラップするか、またはRo/SSA配列中の単一
アミノ酸ギャップ（＊）によって延長され得る。水疱性
口炎ウイルスインディアナ血清型（VSV−IND＃１）（Ga
llioneら、J.Virol.39:529−535（1981））、VSV−イン
ディアナ株２（VSV−IND＃２）（DePoloら、J.Virol.6
1:454−464（1987））およびニュジャージー株（VSV−N
J）（Banerjeeら、Virology 137:432−438（1984））、
Chandipura株（VSV−Chand）（Mastersら、Virology 15
7:298−306（1987））および狂犬病ウイルス（Tordo
ら、Nuc.Acid Res.14（６）:2671−2683（1986））が示
される。アミノ酸残基は、単一文字コードで、60−kDa
Ro/SSA配列上にその順番で示され、ギャップがRo/SSA中
に導入されたところは、小文字を使用する。抗Ro/SSA標
準血清の中央抗原オクタペプチドの部分であるRo/SSA配
列中のアミノ酸残基は、点線の下線で示される。中央抗
原オクタペプチドとのオーバーラップまたはRo/SSA中の
単一アミノ酸ギャップによる配列延長を有さない共有の
配列は示されない。DEMVは、Ro/SSA中の残基417−420お
よびVSV−Ind中の残基256−259に見いだされる。DLLR
は、Ro/SSAの181−184およびVSV−Chandの258−261にあ
る。Ro/SSAの117−120からのEVCRペプチドは、258−261
のPiry株配列と共有される唯一のペプチドである（Crys
lerら、J.Gen.Virol.71:2191−2194（1990））。AAAMお
よびDPDDは、それぞれ、Ro/SSAの369−399および510−5
13に、狂犬病ウイルスの75−78および66−69に見いださ
れる。FIG. 5 shows a homologous region of at least 4 contiguous amino acids between the 60 kD Ro / SSA and the Rhabdovirus N protein. Small peptide shared between Ro / SSA and N protein. This N protein can overlap with the central antigenic peptide of Ro / SSA or be extended by a single amino acid gap (*) in the Ro / SSA sequence. Vesicular stomatitis virus Indiana serotype (VSV-IND # 1) (Ga
llione et al., J. Virol. 39: 529-535 (1981)), VSV-Indiana strain 2 (VSV-IND # 2) (DePolo et al., J. Virol. 6).
1: 454-464 (1987)) and New Jersey strains (VSV-N
J) (Banerjee et al., Virology 137: 432-438 (1984)),
Chandipura strain (VSV-Chand) (Masters et al., Virology 15
7: 298-306 (1987)) and the rabies virus (Tordo).
Et al., Nuc. Acid Res. 14 (6): 2671-2683 (1986)). Amino acid residues are in the single letter code, 60-kDa
Lowercase letters are used where indicated on the Ro / SSA sequence and where gaps were introduced in Ro / SSA. Amino acid residues in the Ro / SSA sequence that are part of the central antigen octapeptide of the anti-Ro / SSA standard serum are indicated by a dotted underline. Shared sequences without overlap with the central antigen octapeptide or sequence extension by a single amino acid gap in Ro / SSA are not shown. DEMV is found at residues 417-420 in Ro / SSA and residues 256-259 in VSV-Ind. DLLR
Are in Ro / SSA 181-184 and VSV-Chand 258-261. The EVCR peptide from Ro / SSA 117-120 is 258-261
Is the only peptide shared with the Piry strain sequence of
ler et al., J. Gen. Virol. 71: 2191-2194 (1990)). AAAM and DPDD were Ro / SSA 369-399 and 510-5, respectively.
13, found in rabies viruses 75-78 and 66-69.

図６は、免疫および自己免疫調節の重要性を有する異
なるタンパク質からの、並列した配列の２つの例を示
す。図6Aは、60kDのRo/SSA配列（Ro）のアミノ酸残基21
7と226との間が、60S POタンパク質（PO）の配列のアミ
ノ酸配列残基250と255との間の残基76から79の組合せ部
分と、完全に一致することを示す。第２のEKLL配列は、
残基311と314との間のRo/SSA内に見いだされる。図6B
は、HLA−B27アミノ酸配列の残基69と77との間が、クレ
ブシエラノイラミダーゼタンパク質（KLEB）の188と193
との間の領域に、残基51と54との間の領域を組み合わせ
たものと完全に一致することを示す。FIG. 6 shows two examples of side-by-side sequences from different proteins having important immune and autoimmune regulation. FIG. 6A shows amino acid residue 21 of the 60 kD Ro / SSA sequence (Ro).
It shows that the region between 7 and 226 completely matches the combination of residues 76 to 79 between amino acid residues 250 and 255 in the sequence of the 60S PO protein (PO). The second EKLL array is
Found in Ro / SSA between residues 311 and 314. FIG.
Indicates that between residues 69 and 77 of the HLA-B27 amino acid sequence is 188 and 193 of the Klebsiella neuraminidase protein (KLEB).
Indicates that the region between and completely matches the combination of the region between residues 51 and 54.

発明の詳細な説明 本発明は、SLEのような自己免疫疾患の病因性または
免疫原性物質、免疫型応答を誘起する非自己核酸または
アミノ酸配列を同定する方法と、これらの疾患の予防お
よび治療のための診断および治療薬の発見である。この
方法は、SLE患者における自己免疫応答を誘起する病因
性および／または抗原性および／または免疫原性物質を
決定するために、特異的に適用される。水疱性口炎ウイ
ルスインディアナ株（VSV−Ind）に相同なウイルスであ
るこの物質は、SLEに特徴的な自己抗体の主要抗原にお
ける抗原性領域での配列の同一性によって特徴づけた。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides a method for identifying the etiological or immunogenic agents of autoimmune diseases such as SLE, non-self nucleic acid or amino acid sequences that elicit an immune-type response, and the prevention and treatment of these diseases. For the discovery of diagnostic and therapeutic agents. This method is specifically applied to determine the pathogenic and / or antigenic and / or immunogenic substances that elicit an autoimmune response in SLE patients. This material, a virus homologous to the vesicular stomatitis virus Indiana strain (VSV-Ind), was characterized by sequence identity in the antigenic region in the major antigen of autoantibodies characteristic of SLE.

本明細書では、自己免疫疾患とは、主として自己免疫
である疾患、および主として見かけ上自己免疫ではない
が、免疫グロブリン、抗原特異的Ｂ細胞表面受容体、ま
たは抗原特異的Ｔ細胞受容体を含む、免疫発現を有する
疾患を指す。これらのカテゴリーに分類される疾患の例
としては、以下のものが挙げられる。SLE、Sjogren症候
群、慢性関節リウマチ、若年性糖尿病、ウェーグナー肉
芽腫症、炎症性腸疾患、多発筋炎、皮膚筋炎、多発性内
分泌不全、シュミット症候群、自己免疫ブドウ膜炎、ア
ジソン病、副腎炎、グレーブス病、甲状腺炎、橋本病、
自己免疫甲状腺病、悪性貧血、異萎縮、慢性肝炎、ルポ
イド肝炎、アテローム硬化症、初老期痴呆、脱髄疾患、
多発性硬化症、亜急性皮膚エリテマトーデス、上皮小体
低下症、Dressler症候群、重症筋無力症、自己免疫血小
板減少症、特発性血小板減少紫斑、溶血性貧血、尋常性
天疱瘡、天疱瘡、疱瘡状皮膚炎、円形脱毛症、類天疱
瘡、硬皮症、進行性全身性硬化、CREST症候群（石灰
症、レイノー現象、食道異常運動性（dysmotility）、
強指症、および末梢血管拡張症）、成人性糖尿病（II型
糖尿病）、男性および女性自己免疫不妊症、強直性脊椎
炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、混合結合組織疾患、結
節性多発性動脈炎、全身壊死性脈管炎、若年性慢性関節
リウマチ、糸球体腎炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性
鼻炎、グッドパスチャー症候群、Chagas病、類肉腫症、
リウマチ熱、ぜん息、再発性流産、抗リン脂質症候群、
農夫肺、多形紅斑、心臓切開後症候群、クッシング症候
群、自己免疫活動性慢性肝炎、トリ愛好者肺、アレルギ
ー疾患、アレルギー性脳脊髄炎、中毒性表皮壊死症、脱
毛症、アルポート症候群、歯槽炎、アレルギー性歯槽
炎、繊維形成性歯槽炎、間質性肺炎、結節性紅斑、壊疽
性膿皮症、輸血反応、らい病、マラリア、リーシュマニ
ア症、トリパノソーマ症、Takayasu動脈炎、リウマチ性
多筋痛、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞動脈炎、回虫
症、アスペルギルス症、Sampter症候群、湿疹、リンパ
腫様肉芽腫症、ベーチェット病、キャプラン症候群、川
崎病、デング熱、脳脊椎炎、心内膜炎、心内膜心筋繊維
症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、乾癬、胎児性赤芽球
症、好酸球性筋膜、Shulman症候群、フェルティ症候
群、フィラリア症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異時性毛
様体炎、フックス毛様体炎、IgA腎症、ヘノッホ・シェ
ーンライン紫斑病、糸球体炎、移植片対宿主病、移植拒
絶、ヒト免疫不全ウイルス感染、エコーウイルス感染、
心筋症、アルツハイマー病、パルボウイルス感染、風疹
ウイルス感染、予防接種後症候群、先天性風疹感染、ホ
ジキンおよび非ホジキンリンパ腫、腎細胞がん腫、多発
性骨髄腫、イートン・ランバート症候群、再発性多発性
軟骨炎、悪性黒色腫、寒冷グロブリン血症、ワルデンス
トレームマクログロブリン血症、エプスタイン−パーウ
イルス感染、おたふくかぜ、エバンズ症候群、および生
殖腺不全。免疫化は、特異的な物質に対する体液性また
は細胞性免疫応答につながる任意の手法であればよい。
自己抗原は、自己抗体によって特異的に認識され、自己
抗体に結合する任意のタンパク質あるいはタンパク質の
部分である。病因性または抗原性物質は、バクテリア、
ウイルス、ウイルス様体、リケッチアおよびかびを含
む、自己抗体の生産を誘起する任意の物質、または食物
もしくは化学物質を含む環境剤（environmentalagent）
である。自己抗体は、タンパク質もしくは核酸等の、免
疫グロブリン、抗原特異的Ｂ細胞表面受容体（表面免疫
グロブリン）、または自己抗原に体する抗原特異的Ｔ細
胞受容体の任意のものである。抗体は、免疫グロブリ
ン、抗原特異的Ｂ細胞表面受容体（表面免疫グロブリ
ン）、または抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞受容体の任
意のものである。As used herein, an autoimmune disease is a disease that is predominantly autoimmune, and includes immunoglobulins, antigen-specific B-cell surface receptors, or antigen-specific T-cell receptors that are not predominantly autoimmune. , A disease that has immune development. Examples of the diseases classified into these categories include the following. SLE, Sjogren syndrome, rheumatoid arthritis, juvenile diabetes, Wegner's granulomatosis, inflammatory bowel disease, polymyositis, dermatomyositis, polyendocrine deficiency, Schmidt syndrome, autoimmune uveitis, Addison's disease, adrenalitis, Graves Disease, thyroiditis, Hashimoto's disease,
Autoimmune thyroid disease, pernicious anemia, dystrophy, chronic hepatitis, lupoid hepatitis, atherosclerosis, presenile dementia, demyelinating disease,
Multiple sclerosis, subacute cutaneous lupus erythematosus, hypoparathyroidism, Dressler syndrome, myasthenia gravis, autoimmune thrombocytopenia, idiopathic thrombocytopenic purpura, hemolytic anemia, pemphigus vulgaris, pemphigus, pemphigoid Dermatitis, alopecia areata, pemphigoid, scleroderma, progressive systemic sclerosis, CREST syndrome (calcosis, Raynaud's phenomenon, esophageal dysmotility),
Polydactyly and peripheral vasodilatory), adult diabetes (type II diabetes), male and female autoimmune infertility, ankylosing spondylitis, ulcerative colitis, Crohn's disease, mixed connective tissue disease, multiple nodularity Arteritis, systemic necrotizing vasculitis, juvenile rheumatoid arthritis, glomerulonephritis, atopic dermatitis, atopic rhinitis, Goodpasture syndrome, Chagas disease, sarcoidosis,
Rheumatic fever, asthma, recurrent miscarriage, antiphospholipid syndrome,
Farmer's lung, erythema multiforme, post-heart incision syndrome, Cushing's syndrome, autoimmune active chronic hepatitis, avian lover lung, allergic disease, allergic encephalomyelitis, toxic epidermal necrolysis, alopecia, Alport syndrome, alveolaritis , Allergic Alveolitis, Fibrogenic Alveolitis, Interstitial Pneumonia, Erythema Nodosum, Gangrene Pyoderma, Transfusion Response, Leprosy, Malaria, Leishmaniasis, Trypanosomiasis, Takayasu Arteritis, Rheumatoid Polymyria Pain, temporal arteritis, schistosomiasis, giant cell arteritis, ascariasis, aspergillosis, Sampter syndrome, eczema, lymphomatous granulomatosis, Behcet's disease, Caplan syndrome, Kawasaki disease, dengue fever, encephalopathy, intracardiac Meningitis, endocardial myocardial fibrosis, endophthalmitis, erythema nodosum, psoriasis, fetal erythroblastosis, eosinophilic fascia, Shulman syndrome, Felty syndrome, filariasis, ciliitis, Chronic Ciliitis, metachronous ciliitis, Fuchs's ciliitis, IgA nephropathy, Henoch-Schönlein purpura, glomeritis, graft-versus-host disease, transplant rejection, human immunodeficiency virus infection, echo Virus infection,
Cardiomyopathy, Alzheimer's disease, parvovirus infection, rubella virus infection, post-vaccination syndrome, congenital rubella infection, Hodgkin and non-Hodgkin lymphoma, renal cell carcinoma, multiple myeloma, Eaton-Lambert syndrome, recurrent multiple Chondritis, malignant melanoma, cold globulinemia, Waldenstrom's macroglobulinemia, Epstein-Par virus infection, mumps, Evans syndrome, and gonadal failure. Immunization can be any technique that leads to a humoral or cellular immune response to a specific substance.
An autoantigen is any protein or portion of a protein that is specifically recognized by and binds to an autoantibody. Pathogenic or antigenic substances include bacteria,
Any substance that induces the production of autoantibodies, including viruses, virus-like bodies, rickettsiae and mold, or environmental agents, including food or chemicals
It is. An autoantibody is any immunoglobulin, antigen-specific B-cell surface receptor (surface immunoglobulin), such as a protein or nucleic acid, or any antigen-specific T-cell receptor that embraces an autoantigen. The antibody is any of an immunoglobulin, an antigen-specific B cell surface receptor (surface immunoglobulin), or an antigen-specific T cell receptor for an antigen.

任意の自己免疫疾患、強力な自己免疫疾患または免疫
発現を有する疾患の抗原性または病因性物質を決定する
ために適用され得る方法を、全身性エリテマトーデス
（SEL）を有する患者のRo/SSA等の自己抗体を誘起する
病因性および／または抗原性物質の決定に特異的に適用
した。Methods that can be applied to determine the antigenic or etiological agent of any autoimmune disease, strong autoimmune disease or disease with immune manifestations, such as Ro / SSA in patients with systemic lupus erythematosus (SEL) It was specifically applied to the determination of pathogenic and / or antigenic substances that elicit autoantibodies.

下記の単一アミノ酸コードを図面および以下の実施例
で使用する： Ａ−アラニン Ｉ−イソロイシン Ｒ−アルギニン Ｃ−システイン Ｋ−リシン Ｓ−セリン Ｄ−アスパラギン酸 Ｌ−ロイシン Ｔ−スレオニン Ｅ−グルタミン酸 Ｍ−メチオニン Ｖ−バリン Ｆ−フェニルアラニン Ｎ−アスパラギン Ｗ−トリプトファン Ｇ−グリシン Ｐ−プロリン Ｙ−チロシン Ｈ−ヒスチジン Ｑ−グルタミン 本明細書では、２つのペプチド配列の間の相同性は、
２つのペプチド間に少なくとも３つの同一または構造的
に同様の連続的なアミノ酸が共通していることと定義さ
れる。連続的なとは、共有結合したアミノ酸または抗体
に対して連続的な配列を与えるアミノ酸を意味する（す
なわち、これには、ベータプリーツシートのような構造
も含まれる。このベータプリーツシートでは、他のすべ
てのアミノ酸が結合し得るので、構造中の他のすべての
アミノ酸は、同一または構造上同様であるといえる）。
相同性および抗原性の領域を有すると定義されるタンパ
ク質は、同一性または構造的同様性に基づいて、３つま
たはそれ以上の共通のアミノ酸を有する、少なくとも２
つの連続的な配列をもつタンパク質である。このタンパ
ク質は、同一の抗体源と反応する。The following single amino acid code is used in the drawings and in the following examples: A-alanine I-isoleucine R-arginine C-cysteine K-lysine S-serine D-aspartic acid L-leucine T-threonine E-glutamic acid M- Methionine V-valine F-phenylalanine N-asparagine W-tryptophan G-glycine P-proline Y-tyrosine H-histidine Q-glutamine As used herein, the homology between two peptide sequences is:
It is defined that at least three identical or structurally similar contiguous amino acids are common between two peptides. Contiguous refers to covalently linked amino acids or amino acids that provide a continuous sequence to the antibody (ie, it includes structures such as beta-pleated sheets. , All other amino acids in the structure can be said to be identical or structurally similar).
Proteins defined as having regions of homology and antigenicity have at least two amino acids having three or more common amino acids based on identity or structural similarity.
It is a protein with two consecutive sequences. This protein reacts with the same source of antibodies.

実施例1:Ro/SSAフラグメントの調製および好Ro/SSA抗体
と反応するペプチドの同定。Example 1: Preparation of Ro / SSA fragments and identification of peptides that react with good Ro / SSA antibodies.

自己抗原の主要な免疫反応フラグメントの単離。Isolation of the major immunoreactive fragment of the autoantigen.

高度に精製したウシのRo/SSAを用いそしてスタフィロ
コッカスのＶ−８プロテアーゼによる、選択的なタンパ
ク質分解を行って、ウエスタンブロット上で、見かけの
分子量が13kDの主要な免疫反応フラグメントを同定し
た。この時、ポリクローナルウサギ抗Ro/SSA血清と患者
の抗Ro/SSA標準血清を用いた。ポリ二フッ化ビニリデン
（PVDF）膜に電気的にブロットした後、13kDのペプチド
を部分的に配列決定した。この配列は、アミノ酸残基41
9に始まって、540まで続くRo/SSAリボヌクレオタンパク
質のクローン化したヒトcDNAから予想されるアミノ酸配
列と高い相同性を示した。この13kDのペプチドが含まれ
るRo/SSAのカルボキシル末端部分のオーバーラップオク
タペプチドを合成した。EYRKKMDIの配列を有するオクタ
ペプチドは、抗Ro/SSA標準血清に対して最大の抗原性を
示した（図１および図５）。近接するオーバーラップペ
プチドもまた、抗原性であったが、ELISAでの反応性は
低かった。反応性が低く、オーバーラップ抗原ペプチド
を有さない、２つの別々の抗原オクタペプチドもまた同
定した。Selective proteolysis was performed using highly purified bovine Ro / SSA and by Staphylococcus V-8 protease to identify a major immunoreactive fragment with an apparent molecular weight of 13 kD on a Western blot. . At this time, polyclonal rabbit anti-Ro / SSA serum and patient anti-Ro / SSA standard serum were used. After electroblotting onto polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane, the 13 kD peptide was partially sequenced. This sequence has amino acid residue 41
Starting from 9 and continuing up to 540, the Ro / SSA ribonucleoprotein showed high homology with the amino acid sequence predicted from the cloned human cDNA. An overlapping octapeptide at the carboxyl-terminal portion of Ro / SSA containing this 13 kD peptide was synthesized. The octapeptide having the sequence of EYRKKMDI showed the greatest antigenicity against anti-Ro / SSA standard serum (FIGS. 1 and 5). The adjacent overlapping peptides were also antigenic, but were less reactive in the ELISA. Two separate antigenic octapeptides with low reactivity and no overlapping antigenic peptides were also identified.

本願で使用した手法に特に関連する文献を援用する。 References specifically relating to the techniques used in this application are incorporated by reference.

ウシRo/SSAの抗血清は、Mamulaら、J.Exp.Med.86:188
9−1901（1986）によって記載されるように調製した。
ニュージーランド白ウサギを、筋肉および皮下を通し
て、フロインド完全アジュバント中の200mgの精製Ro/SS
Aで免疫する。２週間目および４週間目で、静脈注射に
より追加免疫し、10日後に採血した。使用したすべての
ヒト血清は、リウマチ病患者または正常な実験者から得
た。Bovine Ro / SSA antiserum is described in Mamula et al., J. Exp. Med. 86: 188.
Prepared as described by 9-1901 (1986).
New Zealand white rabbits are injected through muscle and subcutaneously with 200 mg of purified Ro / SS in Freund's complete adjuvant.
Immunize with A. Boosters were boosted intravenously at 2 and 4 weeks and blood was collected 10 days later. All human sera used were obtained from rheumatic patients or normal experimenters.

Ro/SSAをスタフィロコッカスのＶ−８プロテアーゼで
分解するために、精製したウシRo/SSAを、0.1M炭酸水素
アンモニウム緩衝液、pH7.9で濃縮した。試料を蒸発さ
せて乾燥し、黄色スタフィロコッカス（Staphylococcus
aureus）のプロテアーゼの等分量（Type XVII−S Sigm
a Chemical,St.Louis,MO）を、0.1％のドデシル硫酸ナ
トリウムと50μg/mlのRNAase（Sigma Chemical Co.,St.
Louis,MO）の存在下で、酵素とRo/SSAタンパク質の比が
1:15（w:w）となるように加えた。水浴中攪拌して、37
℃で２時間分解を行った。その後、分解物を真空下で十
分に乾燥させ、−20℃で保管した。To degrade Ro / SSA with Staphylococcus V-8 protease, purified bovine Ro / SSA was concentrated in 0.1 M ammonium bicarbonate buffer, pH 7.9. The sample was evaporated to dryness and the yellow Staphylococcus
aureus) (Type XVII-S Sigm
a Chemical, St. Louis, MO) with 0.1% sodium dodecyl sulfate and 50 μg / ml RNAase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
Louis, MO), the ratio of enzyme to Ro / SSA protein
1:15 (w: w) was added. Stir in a water bath, 37
Decomposition was performed for 2 hours at ° C. Thereafter, the decomposed product was sufficiently dried under vacuum and stored at -20 ° C.

様々なタンパク質分解酵素を使用して、Ro/SSA分子を
分解し、異なる数および大きさの免疫反応性ペプチドフ
ラグメントを得た。酵素のうちウエスタンブロット分析
で最大数の免疫反応性ペプチドを提供したものは、スタ
フィロコッカスのＶ−８プロテアーゼであった。Houmar
dおよびDrapeau,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:3506−350
9（1972）により、適切なpH条件（pH7.8）の下で、この
酵素が、グルタミン酸のカルボキシル基側を選択的に開
裂することが示された。Ro/SSA分解の最適なパラメータ
ーを決定するために、多数の異なる条件を試みた。最適
条件は、酵素（Ｖ−８プロテアーゼ）とタンパク質（Ro
/SSA）との比が1:15で、0.1％のドデシル硫酸ナトリウ
ムおよび50μg/mlのRNAaseを用い、旋回水浴中で、37℃
で４時間分解を行うことであった。The Ro / SSA molecule was degraded using various proteolytic enzymes to obtain different numbers and sizes of immunoreactive peptide fragments. The enzyme that provided the largest number of immunoreactive peptides in Western blot analysis was Staphylococcus V-8 protease. Houmar
d and Drapeau, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 3506-350.
9 (1972) showed that under appropriate pH conditions (pH 7.8), this enzyme selectively cleaves the carboxyl side of glutamic acid. A number of different conditions were tried to determine the optimal parameters for Ro / SSA degradation. The optimal conditions are the enzyme (V-8 protease) and the protein (Ro
/ SSA) at 1:15 and 0.1% sodium dodecyl sulfate and 50 μg / ml RNAase at 37 ° C. in a swirling water bath.
For 4 hours.

0.2％のドデシル硫酸ナトリウムを含む4.5％のポリア
クリルアミドスタッキングゲルを有する12.5％のポリア
クリルアミドゲルを不連続な緩衝液条件で用いて、ウエ
スタン免疫ブロット法によるペプチド分析を行った。電
気泳動にかける前に、すべての試料を、４％のドデシル
硫酸ナトリウムおよび10％の２−メルカプトエタノール
の存在下で５分間沸騰した。精製したウシのRo/SSAの分
解物を、Mamulaら、J.Exp.Med.86:1889−1901（1986）
の方法を使用して、12.5％のポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分析した。次いで、P.Matsudaira,J.Biol.
Chem.262:10035−10038（1987）の手法を用い、TransBl
ot装置（BioRad Labs,Richmond,CA）で、タンパク質試
料をニトロセルロースまたはポリ二フッ化ビニリデン
（PVDF）膜に電気的にブロットした。0.025Mトリス、0.
192Mグリシン、および20％のメタノール、pH8.3中、200
mAmpsで、トランスファーを一晩行った。次いで、ニト
ロセルロースをファーストグリーン（0.1％）で染色
し、同時に処理した標準によって分子量を確認した。ブ
ロッキングの後、自己抗体を含む血清試料を希釈し、ゆ
るやかに４時間攪拌してインキュベートした。洗浄後、
アルカリホスファターゼに連結した、特異的抗ヒトまた
は特異的抗ウサギIgGγ鎖（Sigma Chemical Co.,St.Lou
is,MO）を、0.1Mトリス、0.1M NaCl、0.005M MgCl₃、pH
9.5に（1:7500希釈で）加えた。次いで、ゲルを基質で
ある、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフ
ェートおよびニトロブルーテトラゾリウム（Promega Co
rporation,Madison,WI）に２−10分間さらし、バンドを
出現させた。Peptide analysis by Western immunoblot was performed using a 12.5% polyacrylamide gel with a 4.5% polyacrylamide stacking gel containing 0.2% sodium dodecyl sulfate in discontinuous buffer conditions. Prior to electrophoresis, all samples were boiled for 5 minutes in the presence of 4% sodium dodecyl sulfate and 10% 2-mercaptoethanol. Purified bovine Ro / SSA degradation products were obtained from Mamula et al., J. Exp. Med. 86: 1889-1901 (1986).
Was analyzed by 12.5% polyacrylamide gel electrophoresis using the method described above. Then, P. Matsudaira, J. Biol.
Chem. 262: 10035-10038 (1987), using TransBl
Protein samples were electroblotted onto nitrocellulose or polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes on an ot instrument (BioRad Labs, Richmond, CA). 0.025M Tris, 0.
200 in 192M glycine, and 20% methanol, pH 8.3
Transfer was performed overnight with mAmps. The nitrocellulose was then stained with Fast Green (0.1%) and the molecular weight was confirmed by simultaneously running standards. After blocking, the serum samples containing the autoantibodies were diluted and incubated with gentle stirring for 4 hours. After washing
Specific anti-human or specific anti-rabbit IgG gamma chain linked to alkaline phosphatase (Sigma Chemical Co., St. Louis)
is, MO), 0.1M Tris, 0.1M NaCl, 0.005M MgCl₃ , pH
9.5 (at 1: 7500 dilution). The gel was then coated with the substrates 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate and nitroblue tetrazolium (Promega Co.
rporation, Madison, WI) for 2-10 minutes to allow bands to appear.

Ro/SSA（20μｇ）のスタフィロコッカスのＶ−８プロ
テアーゼ分解物を、電気泳動、電気ブロットにかけ、60
kDの精製Ro/SSAに対して誘起されたヘテロ免疫ウサギ血
清で希釈1:1000でプローブした。多数の免疫反応ペプチ
ドを生成した。免疫反応性の高いペプチドは、分子量51
kD、40kD、35kD、28Kdおよび13kDであり、免疫反応性の
低いペプチドは、56kD、45kDおよび22kDであることが見
い出された。Ro / SSA (20 μg) Staphylococcus V-8 protease digest was electrophoresed, electroblotted,
Heteroimmune rabbit sera raised against purified Ro / SSA of kD was probed at a dilution of 1: 1000. A number of immunoreactive peptides were generated. Highly immunoreactive peptides have a molecular weight of 51
The low immunoreactive peptides were found to be 56 kD, 45 kD and 22 kD, which are kD, 40 kD, 35 kD, 28 Kd and 13 kD.

同様に、分解物を電気泳動にかけ、電気的にブロット
し、全身性エリテマトーデスをもつ患者からのヒト血清
（標準血清）（1:100希釈）でプローブした。この患者
は、二重拡散法により、ウシおよびヒトRo/SSAに対する
沈降抗体を有していた。抗Ro/SSA ELISAは、4.44x10⁶ユ
ニットのRo/SSAタイターを示した。GaitherおよびHarle
y,Protides Biol.Fluids Proc.Colloq.33:413−416（19
85）に報告されているように、これは、1mlの血清当り
８または9mgの特異的抗Ro/SSA自己抗体とほぼ同等であ
る。主要な免疫反応ペプチドは、51kD、30kD、28kDおよ
び13kDに対応する分子量を有することが認められた。ヘ
テロ免疫ウサギ抗体およびSLE患者血清はどちらも、13k
Dの主要な反応バンドと結合した。このバンドをアミノ
酸配列分析のために選択した。ペプチドの配列決定をす
るために、目的のバンドをポリ二フッ化ビニリデン膜か
ら切り出し、Matsudaira,J.Biol.Chem.262:10035−1003
8（1987）に記載されているように、直接配列決定し
た。Similarly, the lysates were electrophoresed, electroblotted and probed with human serum (standard serum) from a patient with systemic lupus erythematosus (1: 100 dilution). This patient had precipitated antibodies to bovine and human Ro / SSA by double diffusion. Anti-Ro / SSA ELISA indicated 4.44 × 10⁶ units of Ro / SSA titer. Gaither and Harle
y, Protides Biol. Fluids Proc.Colloq. 33: 413-416 (19
As reported in 85), this is roughly equivalent to 8 or 9 mg of specific anti-Ro / SSA autoantibodies per ml of serum. The major immunoreactive peptides were found to have molecular weights corresponding to 51 kD, 30 kD, 28 kD and 13 kD. Heteroimmune rabbit antibody and SLE patient serum are both 13k
It bound to the major reaction band of D. This band was selected for amino acid sequence analysis. To sequence the peptide, the band of interest was excised from the polyvinylidene difluoride membrane and was extracted from Matsudaira, J. Biol. Chem. 262: 10035-1003.
8 (1987).

配列分析のために、スタフィロコッカスのＶ−８プロ
テアーゼ分解物（100μg/レーン）を12.5％のゲル上で
電気泳動にかけ、ポリ二フッ化ビニリデン膜上に電気ブ
ロットした。これは、自動気相シークエネーターでの配
列決定のための、優れた固相支持体になることが示され
た。13kDに対応するバンドを、膜から注意深く切断し、
Matsudaira,J.Biol.Chem.262:10035−10038（1987）に
記載されているように、自動シークエネーターで配列決
定した。アミノ酸配列は、クローン化されたヒトRo/SSA
と高い相同性を示し、配列データが利用できる20個のア
ミノ酸のうち19個までが同一である。これは、60kDのRo
/SSAのカルボキシル末端からの119個のアミノ酸で始ま
る。For sequence analysis, Staphylococcus V-8 protease digest (100 μg / lane) was electrophoresed on a 12.5% gel and electroblotted onto polyvinylidene difluoride membrane. This has been shown to be an excellent solid support for sequencing on an automated gas phase sequenator. Carefully cut the band corresponding to 13 kD from the membrane,
Sequences were performed on an automatic sequencer as described in Matsudaira, J. Biol. Chem. 262: 10035-10038 (1987). Amino acid sequence was cloned human Ro / SSA
And up to 19 of the 20 amino acids for which sequence data is available are identical. This is a 60kD Ro
Begins with 119 amino acids from the carboxyl terminus of / SSA.

主要な免疫反応自己抗原ペプチドの配列に基づいた、短
いオーバーラップオクタペプチドの合成 １個ずつの連続するアミノ酸が異なるオーバーラップ
オクタマーを、カルボキシ末端ペプチドの119個のアミ
ノ酸について作製した。Deutscherら、Proc.Natl.Acad.
Sci.85:9479−9483（1988）によって報告された、60kD
のヒトRo/SSA遺伝子産物の予想アミノ酸配列をテンプレ
ートとして使用して、適切なアミノ酸配列を決定した。
この配列と、Ben−Chetritら、J.Clin.Invest.83:1284
−1292（1989）によって得られたクローンからの予想ア
ミノ酸配列との違いも含まれていたが、図１、図２およ
び図３には示していない。Synthesis of Short Overlapping Octapeptides Based on the Sequence of the Primary Immune Response Autoantigen Peptide Overlapping octamers differing by one consecutive amino acid were generated for the 119 amino acids of the carboxy terminal peptide. Deutscher et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 85: 9479-9483 (1988), 60 kD
The appropriate amino acid sequence was determined using the predicted amino acid sequence of the human Ro / SSA gene product as a template.
This sequence, and Ben-Chetrit et al., J. Clin. Invest. 83: 1284.
Differences from the predicted amino acid sequence from the clone obtained by -1292 (1989) were also included, but are not shown in FIGS. 1, 2 and 3.

Fmocで保護された第１アミノ基およびｔ−ブチルで保
護された側鎖基を有する20個の天然に存在するアミノ酸
を合成に使用した。Geyson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:
3998−4002（1984）に記載されているように、96ウエル
マイクロリットルプレート（Cambridge Research Bioch
emicals,Cambridge,UK）中に用意された、ラジエーショ
ンに固定した（radiation derivatized）ポリエチレン
ロッドの先端（tips）で、オクタペプチドを合成した。
最終濃度が30mMとなるように１−ヒドロキシ−ベンゾト
リアゾールを加えたN,N−ジメチルホルムアミド（DMF）
中で、Ｆ−moc、ｔ−ブチルアミノ酸溶液（30mM）を調
製した。そして、ヒトRo/SSA cDNAの知られている配列
から指示されるように、マイクロリットルプレートのウ
エルに分配した。次いで、18時間後、N,N−ジメチルホ
ルムアミドに５分間、メタノールに２分間ずつ４回、最
後に、N,N−ジメチルホルムアミドに５分間、ピン（pi
n）を連続して漬けた。次いで、20％のピペリジン/DMF
に30分間漬けることによって、最後に加えたアミノ酸か
ら、Fmoc保護基を除去した。所望のペプチドが作製され
るまで、この操作を繰り返した。一旦、所望の長さが得
られると、ピンをN,Nジメチルホルムアミド：無水酢
酸：トリエチルアミンの混合物（5:2:1（v/v/v））に室
温で90分間置くことによって、アセチル化した。次い
で、ピンをN,N−ジメチルホルムアミドに２分間、メタ
ノールに２分間ずつ４回漬け、10分間空気乾燥させた。
最後に、側鎖アミノ保護基を95:2.5:2.5（v/w/v）のト
リフルオロ酢酸：フェノール：エタンジチオールによっ
て除去した。次いで、ピンを、塩化メチレンで２分間、
塩化メチレン中５％のジイソプロピルエチレンで５分間
ずつ２回、再び塩化メチレンで５分間洗浄した。10分間
乾燥させた後、蒸留水に２分間置き、メタノール浴に移
して18時間放置し、真空下で18時間乾燥させた。Twenty naturally occurring amino acids with an Fmoc protected primary amino group and a t-butyl protected side chain group were used in the synthesis. Geyson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:
96-well microliter plates (Cambridge Research Bioch) as described in 3998-4002 (1984).
The octapeptide was synthesized at the tip of a radiation derivatized polyethylene rod prepared in Emicals, Cambridge, UK).
N, N-dimethylformamide (DMF) with 1-hydroxy-benzotriazole added to a final concentration of 30 mM
Inside, F-moc, t-butyl amino acid solution (30 mM) was prepared. It was then distributed into wells of a microliter plate as indicated by the known sequence of the human Ro / SSA cDNA. Then, 18 hours later, 4 minutes each in N, N-dimethylformamide for 5 minutes and in methanol for 2 minutes, and finally in N, N-dimethylformamide for 5 minutes in a pin (pi).
n) was continuously pickled. Then 20% piperidine / DMF
The Fmoc protecting group was removed from the last added amino acid by immersion in a 30. This operation was repeated until the desired peptide was produced. Once the desired length is obtained, acetylation can be achieved by placing the pins in a mixture of N, N dimethylformamide: acetic anhydride: triethylamine (5: 2: 1 (v / v / v)) for 90 minutes at room temperature. did. The pins were then immersed in N, N-dimethylformamide for 2 minutes and methanol for 2 minutes four times and air dried for 10 minutes.
Finally, the side chain amino protecting group was removed with 95: 2.5: 2.5 (v / w / v) trifluoroacetic acid: phenol: ethanedithiol. The pins were then removed with methylene chloride for 2 minutes.
Washed twice with 5% diisopropylethylene in methylene chloride for 5 minutes and again with methylene chloride for 5 minutes. After drying for 10 minutes, it was placed in distilled water for 2 minutes, transferred to a methanol bath, left for 18 hours, and dried under vacuum for 18 hours.

固相抗ペプチドアッセイを行った。すべての工程を、
マイクロリットルプレートウエルにピンブロックを降下
させることによって行った。まず、0.05％のTweenを含
むPBS（PBS/Tween）中１％のウシ血清アルブミン（BS
A）でピンをブロックし、次に吸湿した密封コンテナー
中で、PBS中１％のBSAで、1:100に希釈して、血清と共
に４℃で一晩インキュベートした。次にピンブロック
を、激しく攪拌しながら、PBS/Tweenを用いて10分間ず
つ４回洗浄した。次いで、それぞれのピンをアルカリホ
スファターゼに連結したブドウ球菌タンパク質Ａ、また
はアルカリホスファターゼに連結した、ヤギからの抗ヒ
トγ鎖特異的IgG（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）
を用いて1:300に希釈し、４℃で18時間インキュベート
した。パラニトロフェニルホスフェート二ナトリウム中
でピンをインキュベートする前に、上記のように洗浄を
繰り返した。MicroELISA Reader（Dynatech,Alexandri
a,VA）を用いて、405nmで、プレートを読み取った。A solid phase anti-peptide assay was performed. All processes,
This was done by lowering the pin block into a microliter plate well. First, 1% bovine serum albumin (BS) in PBS containing 0.05% Tween (PBS / Tween)
The pins were blocked with A) and then diluted 1: 100 with 1% BSA in PBS in a sealed, moistened container and incubated with serum overnight at 4 ° C. The pin block was then washed four times for 10 minutes each with vigorous stirring using PBS / Tween. Each pin was then linked to staphylococcal protein A linked to alkaline phosphatase, or anti-human gamma chain specific IgG from goat linked to alkaline phosphatase (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
And diluted 1: 300 and incubated at 4 ° C. for 18 hours. Washing was repeated as above before incubating the pins in disodium paranitrophenyl phosphate. MicroELISA Reader (Dynatech, Alexandri
The plate was read at 405 nm using a, VA).

抗自己抗原血清との免疫反応に基づいたグループへの、
オクタペプチドの分類 固相に共有結合したオクタペプチドを用いた固相アッ
セイを使用して、以下の免疫反応をスクリーニングし
た。すなわち、正常なヒト血清、13kDのペプチドを同定
する抗Ro/SSA血清、および13kDのペプチドを同定しない
抗Ro/SSA血清に対する免疫反応である。To a group based on an immune reaction with anti-self antigen sera,
Octapeptide Classification The following immune reactions were screened using a solid phase assay using octapeptide covalently attached to a solid phase. That is, an immune response to normal human serum, an anti-Ro / SSA serum that identifies a 13 kD peptide, and an anti-Ro / SSA serum that does not identify a 13 kD peptide.

標準血清は、６つの連続するオクタマーからなる１つ
のグループに結合した。このオクタマーは、図１に示す
ように、正常な血清および他の周囲のオクタマーよりも
高い活性を示したアミノ酸残基位置480−494に広がって
いた。対応する配列AIALREYRKKMDIPAは、抗原部位を含
み、60kDのRo/SSA分子の表面に存在する可能性が高いこ
とが予想される。これらの配列およびウエスタンブロッ
トで13kDのペプチドを同定する。別の７つの抗Ro/SSA陽
性血清中の隣接アミノ酸には、主要な反応性も存在して
いた（図２）。この領域は、JamesonおよびWolff.CABIO
S 4:181−187（1988）（図１）のアルゴリズムによって
決定されるように、119個のアミノ酸配列において、２
番目に高い抗原指数を示した。Standard sera bound to one group of six consecutive octamers. This octamer extended to amino acid residue positions 480-494, which showed higher activity than normal serum and other surrounding octamers, as shown in FIG. The corresponding sequence AIALREYRKKMDIPA contains the antigenic site and is expected to be likely to be on the surface of a 60 kD Ro / SSA molecule. A 13 kD peptide is identified on these sequences and on the Western blot. There was also major reactivity with adjacent amino acids in another seven anti-Ro / SSA-positive sera (FIG. 2). This area is based on Jameson and Wolff.CABIO
S 4: 181-187 (1988). As determined by the algorithm of FIG.
It showed the second highest antigen index.

図２のパネルＡは、８人の抗Ro/SSA患者のカルボキシ
ル末端の112オーバーラップオクタペプチドの結合に関
する対数平均を示す。これらの患者は、Ro/SSAの13kDd
のペプチドの結合がウエスタンブロットにおいて陽性で
ある。パネルＢは、13kDのペプチドの結合が陰性の患者
を示す。13kDのペプチドに結合する血清中で実質的によ
り反応が大きいように見えるオクタペプチドには、３つ
のグループがある。このオクタペプチドは、残基457か
ら462（グループＡ）、残基477から485（グループＢ）
および残基525から527（グループＣ）のオクタペプチド
である。これらは、それぞれ、配列TNTPADVFIVFTD、VHP
AIALREYRKKMDI、およびALDVIRNFTLを含む。グループＡ
は、テストした８個の13kD結合抗Ro/SSA血清のうちの３
個、グループＢはその７個、そしてグループＣはその４
個によって同定された。パネルＣは、13kDのペプチドに
結合する８個の血清（黒い棒）、および13kDのペプチド
に結合しないが、グループＢのオクタペプチドに結合を
示す２個の血清（白抜きの棒線）の最大反応性を示す。
オクタペプチドの個体血清への最大結合（パネルＣ）
は、抗13kDウエスタン免疫プロント陽性血清に対する結
合の対数平均（パネルＡ）の２倍よりも大きい。しか
し、13kDのRo/SSAペプチドへの結合を最も明確に反映す
るのは、残基477から492位にわたるオクタペプチドのよ
うである。Panel A of FIG. 2 shows the logarithmic mean for binding of 112 overlapping octapeptides at the carboxyl terminus of eight anti-Ro / SSA patients. These patients had a Ro / SSA 13 kDd
Is positive in Western blots. Panel B shows patients with a negative 13 kD peptide binding. There are three groups of octapeptides that appear to be substantially more responsive in serum that bind to the 13 kD peptide. This octapeptide has residues 457-462 (group A) and residues 477-485 (group B)
And the octapeptide of residues 525 to 527 (group C). These are the sequences TNTPADVFIVFTD, VHP, respectively.
Including AIALREYRKKMDI, and ALDVIRNFTL. Group A
Indicates that 3 of the 8 13kD conjugated anti-Ro / SSA sera tested
, Group B is 7 of them, and Group C is 4
Individually identified. Panel C shows the maximum of eight sera that bind to the 13 kD peptide (black bars) and two sera that do not bind to the 13 kD peptide but bind to the Group B octapeptide (open bars). Shows reactivity.
Maximum binding of octapeptide to individual serum (panel C)
Is greater than twice the log-average of binding to anti-13kD western immunopron positive sera (panel A). However, it seems that the octapeptide ranging from residues 477 to 492 most clearly reflects the binding of the 13 kD to the Ro / SSA peptide.

アミノ酸残基477から492位の間の領域に観察される結
合が、特異的抗体、特に抗Ro/SSA自己抗体結合を示すか
否かを決定するために、合成ペプチドおよびアフィニテ
ィー親和性精製されたウシRo/SSA抗原を用いて、阻害実
験を行った。標準血清は、アミノ酸残基番号485から始
まるオクタペプチドであって、配列EYRKKMDIを有してい
るものに最大結合を示した。この配列を用いて多数のピ
ンを調製した。標準技術を用いて、この配列、CALREYKK
MDIPAおよび２つのコントロールペプチドを含むペプチ
ドを調製した（表Ｉ）。EYRRKMDI配列を含むペプチド
は、抗体の固相への結合を阻害したが、EYRKKMDI配列を
含まないペプチドは、結合を阻害しなかった。同様に、
Ro/SSA抗原は、抗Ro/SSA標準血清中の抗体がEYRKKMDIへ
結合するのを阻害したが、ウシ血清アルブミンは、結合
を阻害しなかった。これらの結果から、EYRKKMDIへの結
合が特異的であり、この抗体が抗体の抗Ro/SSA群の一部
であることが確立された。Synthetic peptides and affinity affinity purified to determine if the binding observed in the region between amino acid residues 477 to 492 shows specific antibody, especially anti-Ro / SSA autoantibody binding. Inhibition experiments were performed using bovine Ro / SSA antigen. The standard serum showed maximum binding to the octapeptide starting at amino acid residue number 485 and having the sequence EYRKKMDI. A number of pins were prepared using this sequence. Using standard technology, this array, CALREYKK
Peptides containing MDIPA and two control peptides were prepared (Table I). Peptides containing the EYRRKMDI sequence inhibited binding of the antibody to the solid phase, whereas peptides without the EYRKKMDI sequence did not. Similarly,
Ro / SSA antigen inhibited binding of antibodies in anti-Ro / SSA standard serum to EYRKKMDI, whereas bovine serum albumin did not. These results established that binding to EYRKKMDI was specific and that this antibody was part of the anti-Ro / SSA group of antibodies.

Deutscherら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:9479−948
3（1988）およびBen−Chetritら、J.Clin.Invest.83:12
93−1298（1988）によって公開された、ヒトRo/SSA抗原
配列の間には違いがある。これらの違いを、８個の抗Ro
/SSA血清において調べた。これらの１つは、Ben−Cheri
tらによって公開された60kD配列のカルボキシル末端に
特有のオクタペプチドに結合した。Deutscher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9479-948.
3 (1988) and Ben-Chetrit et al., J. Clin. Invest. 83:12.
There are differences between the human Ro / SSA antigen sequences published by 93-1298 (1988). The difference between these eight anti-Ro
/ SSA serum. One of these is Ben-Cheri
bound to the unique octapeptide at the carboxyl terminus of the 60 kD sequence published by T et al.

代表的な実験は以下の通りである。共有結合したEYRR
KMDIペプチドを含むポリエチレンロッドとインキュベー
トする前に、Ro/SSA標準血清の10^-2希釈液を、上記の濃
度のウシRo/SSAあるいはウシ血清アルブミンまたは４個
のうちの１個の10mcg/mlのペプチドを用いてプレインキ
ュベートした。抗体の結合範囲を405nmでモニターし、
アルカリホスファターゼに特異的に連結した抗ヒトγ鎖
および適切な基質、この場合、ｐ−ニトロフェニルホス
フェートで検出した。60kDのRo/SSAペプチドの480から4
92の配列を含む可溶性合成ペプチドのうち固相ロッドに
結合した配列、EYRKKMDIには下線を引いた。 A typical experiment is as follows. EYRR covalently bonded
Prior to incubation with polyethylene rod containing KMDI peptide, a 10^-2 dilution of Ro / SSA reference serum, of one of the bovine Ro / SSA or or 4 bovine serum albumin in the above concentration of 10 mcg / ml Preincubated with peptide. Monitor the binding range of the antibody at 405 nm,
Detection was performed with an anti-human gamma chain specifically linked to alkaline phosphatase and a suitable substrate, in this case p-nitrophenyl phosphate. 480-4 of the 60 kD Ro / SSA peptide
Among the soluble synthetic peptides containing 92 sequences, the sequence bound to the solid phase rod, EYRKKMDI, is underlined.

実施例2:60kDのRo/SSAペプチドと水疱性口炎ウイルス
（VSV）のインディアナ株のヌクレオカプシドタンパク
質との関係 アミノ酸残基485で始まるオクタペプチド、EYRKKMDI
は、Ro/SSAのカルボキシ末端13kDフラグメントの抗Ro/S
SA標準血清と最も大きな抗原性を有していた（図１）。
National Biomedical Research Foundation（NBRF）タ
ンパク質配列バンクの調査により、水疱性口炎ウイルス
のインディアナ株のヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質
中の配列EYRKKLMDがRo/SSA配列ににギャップ（＊）を含
ませたEYRKK＊MDの配列と非常に高い相同性を有するこ
とが発見された。Example 2: Relationship between the 60 kD Ro / SSA peptide and the nucleocapsid protein of the vesicular stomatitis virus (VSV) Indiana strain EYRKKMDI, an octapeptide starting at amino acid residue 485
Is the anti-Ro / S of the carboxy-terminal 13 kD fragment of Ro / SSA
It had the highest antigenicity with SA standard serum (FIG. 1).
A survey of the National Biomedical Research Foundation (NBRF) protein sequence bank revealed that the sequence EYRKKLMD in the nucleocapsid (N) protein of the Indiana strain of vesicular stomatitis virus had a gap (*) in the Ro / SSA sequence. Has been found to have very high homology to the sequence of

ＮとRo/SSAとの相同性が、１つの抗原部位で反映され
るならば、Ro/SSA抗原性の他の部位が、ＮとRo/SSAとの
相同性に関連し得ることが推理された。少なくともクア
ドラペプチドが相同性を有する６つの領域が、ＮとRo/S
SAとの間で共有されていることが示された（図４）。ク
アドラペプチドレベルでの相同性をまず選択した。なぜ
なら、これは、充分に低頻度で比較数の点から重要であ
り、かつ抗原結合するだけの十分な大きさを有している
からである。明らかに、エピトープは小さい。なぜな
ら、Reichlin,M.,Immunochemistry 11:21−27（1974）;
Benjamin,D.C.ら、Ann.Rev.Immunol.2:67−101（198
4）；およびGeysen,J.M.ら、Proc.Acad.Sci.USA 81:399
8（1984）によって示されているように、抗原における
単一アミノ酸の改変は、実質的に結合を減少させるのに
しばしば十分であるからである。If the homology between N and Ro / SSA is reflected at one antigenic site, it is inferred that other sites of Ro / SSA antigenicity may be related to the homology between N and Ro / SSA. Was. At least six regions where the quadrapeptides have homology are N and Ro / S
It was shown to be shared with SA (FIG. 4). Homology at the quadrapeptide level was first selected. This is because it is sufficiently infrequent, important in terms of comparative numbers, and large enough to bind antigen. Clearly, the epitope is small. Because Reichlin, M., Immunochemistry 11: 21-27 (1974);
Benjamin, DC et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101 (198
4); and Geysen, JM et al., Proc. Acad. Sci. USA 81: 399.
8 (1984), because altering a single amino acid in an antigen is often sufficient to substantially reduce binding.

クアドラペプチド相同性によって測定されるような構
造類似性が、Ro/SSAの抗原性と関連があるか否かを評価
するために、アルゴリズムを用いて、抗原性と相同性と
の関連の確率を見積った。以下に、これを抗原性配列確
率（Antigenicity Alignment Probability）として示し
た。まず、各エピトープの主要オクタペプチドを、簡単
な規則に従って選択した。1.0よりも大きい吸光度で抗R
o/SSA標準血清に結合するオクタペプチドのみが、エピ
トープの主要抗原オクタペプチドとなり得た。すべての
オクタペプチドが少なくともクアドラペプチド相同性を
示したときには、1.0よりも大きい吸光度を有する多数
の隣接オクタペプチドから、１つの主要抗原オクタペプ
チドを選択した。主要抗原オクタペプチド候補の中で、
別の同等の選択が必要とされるときのみ、1.0未満の吸
光度を有するオクタペプチドを考慮に入れた。次いで、
抗Ro/SSA血清による結合がなされるオクタペプチドに最
も近接するオクタペプチドを選択した。To assess whether structural similarity as measured by quadrapeptide homology is related to Ro / SSA antigenicity, an algorithm was used to determine the probability of association between antigenicity and homology. Estimated. This is shown below as Antigenicity Alignment Probability. First, the major octapeptide for each epitope was selected according to simple rules. Anti-R with absorbance greater than 1.0
Only the octapeptide that bound to the o / SSA standard serum could be the major antigen octapeptide of the epitope. When all octapeptides showed at least quadrapeptide homology, one major antigen octapeptide was selected from a number of adjacent octapeptides having an absorbance greater than 1.0. Among the major antigen octapeptide candidates,
Octapeptides with an absorbance of less than 1.0 were only taken into account when another equivalent selection was needed. Then
The octapeptide closest to the octapeptide bound by the anti-Ro / SSA serum was selected.

各エピトープの主要オクタペプチドを選択した後、Ro
/SSA分子のオクタペプチドを、Ｎとの相同性に有無に基
づいて分類した。このレベルのＮとの相同性を有するRo
/SSAオクタペプチドのグループに、個々のオクタペプチ
ドが含まれるには、少なくともクアドラペプチド相同性
を有するというしきい値が必要であった。これらの基準
によると、Ｎとの相同性を有する６つのグループのRo/S
SAオクタペプチドがあった。これらのオクタペプチドグ
ループの各メンバーは、ＮとRo/SSAとの間にクアドラペ
プチド相同性を有しており、図３の塗りつぶし部分によ
って同定される。分子の残りを、実質的に同一の平均サ
イズを有するオクタペプチドのグループに任意に分割し
た。これらの後者のグループのRo/SSAオクタペプチドメ
ンバーはいずれも、Ｎとクアドラペプチド相同性を有し
ていなかった。After selecting the major octapeptide for each epitope, Ro
Octapeptides of the / SSA molecule were classified based on homology with N based on the presence or absence. Ro with homology to this level of N
The inclusion of individual octapeptides in the / SSA octapeptide group required a threshold of at least quadrapeptide homology. According to these criteria, six groups of Ro / S with homology to N
There was SA octapeptide. Each member of these octapeptide groups has a quadrapeptide homology between N and Ro / SSA and is identified by the shaded area in FIG. The rest of the molecule was arbitrarily divided into groups of octapeptides having substantially the same average size. None of these latter groups of Ro / SSA octapeptide members had N and quadrapeptide homology.

添付の表は、ＮとRo/SSAとの相同性の有無およびグル
ープが主要抗原オクタペプチドとして予め同定されたオ
クタペプチドを有しているか否かに基づいて、各グルー
プのRo/SSAオクタペプチドを４つのカテゴリーの１つに
割り当てることによって作製した。１つの実施例では、
Ｎに対してクアドラペプチド相同性を有するRo/SSAの６
つのオクタペプチドグループの５つがまた、主要抗原ペ
プチドを含んでいた。もう１つの実施例では、Ｎに対し
てクアドラペプチド相同性を有さない90個のオクタペプ
チドグループのうち９個のみが、主要抗原ペプチドを含
んでいた。Ro/SSAのエピトープおよびそのＮとの相同性
に対する抗原性配列確率は、0.00017である。このこと
は、このような関係が5,900回比較した内ほんの１回だ
け予想され得ることを意味している。426に対する、4.7
の95％信頼区間を有する45のオッズ比はまた、強力な関
連性を支持している。従って、Ro/SSAの自己免疫と、水
疱性口炎ウイルスのＮタンパク質の構造との間に強力な
関連が存在する。これらは、配列抗原性を有する異なる
領域が、自己抗原と異種タンパク質との間に短い配列相
同性を有する多数の領域と関連し得ることを示唆する最
初のデータである。The attached table lists the Ro / SSA octapeptides for each group based on the presence or absence of homology between N and Ro / SSA and whether the group has an octapeptide previously identified as the major antigen octapeptide. It was made by assigning it to one of four categories. In one embodiment,
Ro / SSA 6 with quadrapeptide homology to N
Five of the two octapeptide groups also contained the major antigenic peptide. In another example, only 9 of the 90 octapeptide groups without quadrapeptide homology to N contained the major antigenic peptide. The antigenic sequence probability for the Ro / SSA epitope and its homology to N is 0.00017. This means that such a relationship can only be expected once in 5,900 comparisons. 4.7 for 426
An odds ratio of 45 with a 95% confidence interval of also supports a strong association. Thus, there is a strong association between Ro / SSA autoimmunity and the structure of the N protein of vesicular stomatitis virus. These are the first data suggesting that different regions with sequence antigenicity may be associated with multiple regions with short sequence homology between self antigens and heterologous proteins.

Ro/SSAとＮとの間の配列相同性が、Ro/SSAの自己抗原
性と関連しているという蓋然性に関する多数の議論がな
され得る。抗原性配列確率（Ｐ＜0.0002）に加えて、RO
/SSAのEYRKK＊MDと、ＮのERRKKLMDとが、８個のうち７
個が一致しているというのはそれ自体あまりあり得ない
ことである。20個のアミノ酸のランダム分配および配列
内のアミノ酸ランダム分布を仮定すると、6x10^-9の確率
を見積ることができる。NBRFデータベースには、3,318,
616個のオクタペプチドが存在するため、このサイズの
データベースを100回サーチする毎に、特定の疑問の配
列に対して、８レベルのうち７レベルで、平均２つの一
致が発見されると予想される。オーバーラップするクア
ドラペプチドが独立であることを考慮することに加え
て、これらの仮定を考慮すると、Ro/SSAおよび図４に示
された少なくともクアドラペプチド相同性を有するＮタ
ンパク質の２つのタンパク質を発見する可能性は、ポア
ソン分布によって50,000回比較する毎に１回未満の割合
と、予想される。Numerous arguments can be made regarding the probability that sequence homology between Ro / SSA and N is related to the autoantigenicity of Ro / SSA. In addition to antigenic sequence probability (P <0.0002), RO
/ SSA's EYRKK * MD and N's ERRKKLMD are 7 out of 8
It is very unlikely that the individuals match. Assuming a random distribution of 20 amino acids and a random distribution of amino acids in the sequence, a probability of 6 × 10⁻⁹ can be estimated. The NBRF database contains 3,318,
Due to the presence of 616 octapeptides, it is expected that every 100 searches of this size database will find an average of two matches at 7 out of 8 levels for a particular query sequence. You. In view of these assumptions, in addition to considering that the overlapping quadrapeptides are independent, we found two proteins, Ro / SSA and the N protein with at least the quadrapeptide homology shown in FIG. The likelihood of doing so is expected to be less than one per 50,000 comparisons by Poisson distribution.

利用できる配列の数は十分に大きいため、相同性に基
づいて発見された関係を導く結論および仮定は、模擬実
験によって直接評価され得る。Ro/SSAとＮとの間に観察
される相同性のレベルがいかに異常であるかを決定する
ために、全NBRFデータベースにおけるすべてのタンパク
質の、Ro/SSAに対するクアドラペプチド相同性を評価し
た。クアドラペプチド相同性を持つすべての領域が比較
され、そしてRo/SSAおよび疑問のタンパク質の100アミ
ノ酸毎に標準化された。もし、すべてのオーバーラップ
するクアドラペプチドが独立している場合には、Ro/SSA
およびＮは、0.401という特異的な相同性スコア（表I
I）を達成する。このレベルでの相同性は、予想外に一
般的なものであった。なぜなら、より大きな相同性スコ
アを有する、309個のタンパク質配列または2.5％のNBRF
データベースが存在したからである。確かに、ＮとRo/S
SAとの間に見いだされる密度での相同性は、上記で見積
ったように50,000分の１よりははるかに大きいものであ
る。従って、アミノ酸の同等分配またはランダム分配に
関する確率見積りの一般的な予想は、誤りである。Since the number of available sequences is large enough, the conclusions and assumptions leading to the discovered relationships based on homology can be evaluated directly by simulation. To determine how abnormal the level of homology observed between Ro / SSA and N was, all proteins in the entire NBRF database were evaluated for quadrapeptide homology to Ro / SSA. All regions with quadrapeptide homology were compared and normalized to every 100 amino acids of Ro / SSA and the protein in question. If all overlapping quadrapeptides are independent, Ro / SSA
And N have specific homology scores of 0.401 (Table I).
Achieve I). The homology at this level was unexpectedly general. 309 protein sequences or 2.5% NBRF with greater homology score
Because the database existed. Sure, N and Ro / S
The homology in density found with SA is much greater than 1 in 50,000, as estimated above. Thus, the general expectation of probability estimates for equivalent or random distribution of amino acids is incorrect.

主要な問題は、Ro/SSAの抗原性が、Ro/SSAとＮとの間
にすでに同定された相同性よりも、Ro/SSAデータバンク
の他の配列との間の相同性に、より密接に関連している
か否かである。模擬実験を拡張して、表IIに示されるよ
うに、NBRFデータベースの12,476個のすべてのタンパク
質配列の抗原性配列確率を計算した。多数の配列が、相
同性と抗原性との間に可能なかなりの関連性を有してい
ることが示される。16個が、0.01未満の抗原性配列確率
を有している（表II）。1,000回テストすると、1.3個の
配列がこのレベルの確率を成し遂げる。これにもかかわ
らず、12,476のタンパク質配列と水疱性口炎ウイルスの
Ｎタンパク質が、Ro/SSAの自己抗原性に最も密接に関連
している。その比較を表IIに示す。The major problem is that the antigenicity of Ro / SSA is more closely related to the homology between the Ro / SSA databank and other sequences than the homology already identified between Ro / SSA and N. Or not. The simulation was extended to calculate the antigenic sequence probabilities of all 12,476 protein sequences in the NBRF database, as shown in Table II. A number of sequences have been shown to have a possible considerable relationship between homology and antigenicity. Sixteen have an antigenic sequence probability of less than 0.01 (Table II). After 1,000 tests, 1.3 arrays achieve this level of probability. Nevertheless, 12,476 protein sequences and the N protein of vesicular stomatitis virus are most closely related to the autoantigenicity of Ro / SSA. The comparison is shown in Table II.

抗原性配列確率は、クアドラペプチド相同性の有無によ
り作製されたRo/SSA配列のオクタペプチドグループで
の、主要抗原オクタペプチドのカテゴリー分布を、one
−tailed Fisher's exact testにより求める。AAP（抗
原性配列確率）のオッズ比は、得られた添付の表のオッ
ズ比である。相同性スコアは、Ro/SSAと疑問のタンパク
質とのオーバーラップするクアドラペプチド類似性を測
定したものである。各領域の相同性をＸ−３として計算
し、ここで、Ｘは、正確な相同性を有するアミノ酸の数
である、次いでRo/SSAおよび疑問の配列の100個のアミ
ノ酸当りのオーバーラップするクアドラペプチド相同性
の密度として表現する。 Antigenic sequence probability, the category distribution of the major antigen octapeptide in the octapeptide group of Ro / SSA sequence created by the presence or absence of quadrapeptide homology, one
-Determined by tailed Fisher's exact test. The odds ratio of AAP (antigenic sequence probability) is the odds ratio of the attached table obtained. The homology score measures the overlapping quadrapeptide similarity between Ro / SSA and the protein in question. The homology of each region was calculated as X-3, where X is the number of amino acids with exact homology, then Ro / SSA and the overlapping quadra per 100 amino acids of the sequence in question. Expressed as the density of peptide homology.

水疱性口炎ウイルス 水疱性口炎ウイルスは、ベシクロウイルス属の原型で
あり、ニュジャージーおよびインディアナ株が、一般
に、実験室用として使用される。Gallione,C.J.ら、J.V
irol.39:529−535（1981）；およびBanerjee,A.K.ら、V
irology 137:432−438（1984）によって報告されている
ように、２つの株からのＮタンパク質は、アミノ酸レベ
ルで80％相同である。しかし、この違いは、抗原性に関
して相同性が著しく改変するには十分である。クアドラ
ペプチド相同性を持つ領域が、ニュージャージーＮタン
パク質とRo/SSAとの間に３つだけ存在し、これらのう
ち、１つのみが、Ro/SSAの抗原オクタペプチドを同定す
る。表IIに計算されているように、Ro/SSA自己抗原性に
関連するニュージャージー株のＮタンパク質に対するRo
/SSAの相同性の抗原性配列確率は、0.95である。これ
は、インディアナ株Ｎタンパク質を用いて得られた結果
とは著しく異なっている。従って、ニュージーランド株
は、候補ウイルス物質と最も関連してはいないようであ
る。Vesicular stomatitis virus Vesicular stomatitis virus is a prototype of the genus Vesiculovirus, and New Jersey and Indiana strains are commonly used for laboratory use. Gallione, CJ et al., JV
irol. 39: 529-535 (1981); and Banerjee, AK et al., V.
As reported by irology 137: 432-438 (1984), the N proteins from the two strains are 80% homologous at the amino acid level. However, this difference is sufficient to significantly alter homology with respect to antigenicity. There are only three regions with quadrapeptide homology between the New Jersey N protein and Ro / SSA, of which only one identifies the Ro / SSA antigen octapeptide. As calculated in Table II, the Ro / SSA N protein of the New Jersey strain is associated with autoantigenicity.
The antigenic sequence probability of / SSA homology is 0.95. This is significantly different from the results obtained with the Indiana strain N protein. Thus, the New Zealand strain does not appear to be most associated with the candidate viral material.

Gallione,C.J.ら、J.Virol.39:529−535（1981）；お
よびDePolo,N.J.ら、J.Virol.61:454−464（1987）によ
って記載されているように、３つのアミノ酸のみ異な
る、２つのインディアナ株Ｎタンパク質配列が利用でき
る。これらの変化の１つは、その変化がなければ相同性
および抗原性が一致する領域において発見されるため、
抗原性配列確率は、悪影響を受ける（表IIおよび図
５）。相同性部位の除去にもかかわらず、このタンパク
質配列は、データベースにおける２番目に高い抗原性配
列確率を達成する（表II）。39: 529-535 (1981); and DePolo, NJ et al., J. Virol. 61: 454-464 (1987), differing only by three amino acids. Two Indiana strain N protein sequences are available. One of these changes is found in regions where homology and antigenicity are identical without the change,
Antigenic sequence probability is adversely affected (Table II and FIG. 5). Despite the removal of homology sites, this protein sequence achieves the second highest antigenic sequence probability in the database (Table II).

Ro/SSAと同一相同性の近隣のインディアナ株のアミノ
酸配列により（図５）、この株が候補ウイルスと非常に
密接に関連していることがさらに証明される。Ro/SSA配
列に単一アミノ酸ギャップを加えることによって、図５
に示されるように、インディアナＮおよびRo/SSAとの間
の相同性が増加する。それぞれの場合において、Ro/SSA
とのクアドラペプチドまたはペンタペプチド相同性領域
のカルボキシ側のRo/SSA配列に、ギャップが発見され
る。インディアナ株と隣接相同性を有する３つの領域の
それぞれは、抗原性がある。狂犬病ウイルスＮタンパク
質は、そのような隣接相同性を有していない。このよう
な類似性は、ニュージャージー株相同性に存在するが、
２つの領域のどちらも抗原性ではない。事実、最も高い
抗原性配列確率を有する35タンパク質のうち、Ｎタンパ
ク質ほど、抗Ro/SSAに対する抗原領域においてRo/SSAと
隣接相同性を有しているものはなかった（５個のアミノ
酸がインディアナ株Ｎタンパク質（図５）の隣接相同性
に含まれるポアソン分布により、Ｐ＜0.015）。この結
果は、相同性と抗原性との間に可能な構造的関連を有す
るタンパク質のセットのなかでも、Ｎは、例外であるこ
とを意味している。このことによって、抗原性配列確率
（表II）を考慮した同一相同性に加えて、ＮとRo/SSA自
己抗原性との間の関係をさらに示唆する構造上の情報が
提供される。The amino acid sequence of a nearby Indiana strain with homology to Ro / SSA (FIG. 5) further demonstrates that this strain is very closely related to the candidate virus. By adding a single amino acid gap to the Ro / SSA sequence, FIG.
As shown in Figure 4, the homology between Indiana N and Ro / SSA is increased. In each case, Ro / SSA
A gap is found in the Ro / SSA sequence on the carboxy side of the region of homology to the quadrapeptide or pentapeptide. Each of the three regions with flanking homology to the Indiana strain is antigenic. The rabies virus N protein does not have such flanking homology. Such similarities exist in New Jersey strain homology,
Neither of the two regions is antigenic. In fact, of the 35 proteins with the highest antigenic sequence probabilities, none of the N proteins had adjacent homology to Ro / SSA in the antigenic region to anti-Ro / SSA as compared to the N protein (5 amino acids in Indiana). P <0.015 due to Poisson distribution included in flanking homology of strain N protein (FIG. 5). This result implies that N is an exception in the set of proteins that have a possible structural relationship between homology and antigenicity. This provides structural information that further suggests a relationship between N and Ro / SSA autoantigenicity, in addition to identity homology in view of antigenic sequence probabilities (Table II).

水疱性口炎ウイルスの多くの特徴は、抗Ro/SSAが関連
するリウマチ自己免疫疾患の強力な病因性物質の特徴と
一致する。水疱性口炎ウイルスリーダー配列はLa/SSBに
結合し、Kurilla,M.G.ら、Cell 34:837−845（1983）;F
resco,L.D.ら、Mol.Cell Biol.7:1148−1155（1987）；
およびCrone,D.E.ら、J.Virol.63:4172−4180（1989）
によって報告されているように、水疱性口炎ウイルス感
染の、細胞性代謝に対する初期の既知の影響は、Ｕ粒子
アセンブリーの阻害である。Harley,J.B.ら、Rheumatic
Disease Clinics of North America:Systemic Lupus E
rythematosus 14（１）:43−56（1988）によって報告さ
れているように、La/SSBおよびＵ粒子は、全身性エリテ
マトーデス（SLE）における共通の自己抗原である。水
疱性口炎ウイルスは、非特異的糖タンパク質を介して細
胞に感染する。その結果、Superti,F.ら、J.Gen.Virol.
68:387−399（1987）によって記載されているように、
たとえ哺乳類組織培養細胞において良好に成長する植物
からの単離物を用いても、ウイルスは、広い宿主範囲を
有する。様々なヒトの組織はまた、ウイルス感染を支持
することが予想され、これは、SLEおよびSjorgren症候
群の臨床上の異質性を反映している。Beebe,D.P.ら、J.
Immunol.126:1562−1568（1981）;Agnello,V.,in Syste
mic Lupus Erythematosus,pp.565−589（John Wiley an
d Sons,New York 1987）によって概説されているよう
に、水疱性口炎ウイルスは、補体欠損血清において生存
性が向上しており、このことは、多くの補体成分欠損状
態が、SLEに予めかかりやすくなっていることと一致す
る。SLE患者は、水疱性口炎ウイルスを潜伏させるイン
ターフェロンを非常に高いレベルで生産する。Prebie,
O.T.ら、Science 216:429−431（1982）;Bishop,D.H.
L.,Rhadboviruses pp.69−98（CRC Press,Boca Raton,F
L 1980）によって報告されているように、インターフェ
ロンは、完全なウイルス粒子の生産を阻害する。このこ
とによって、患者の組織材料から組み立てられたウイル
ス粒子が発見されないことが説明できる。潜伏期には、
ウイルス抗原は、細胞表面上で発現され、連続する抗原
性刺激の原因となり得る。Many features of the vesicular stomatitis virus are consistent with those of a potent etiological agent of anti-Ro / SSA-associated rheumatic autoimmune disease. The vesicular stomatitis virus leader sequence binds to La / SSB and is described in Kurilla, MG et al., Cell 34: 837-845 (1983);
resco, LD et al., Mol. Cell Biol. 7: 1148-1155 (1987);
And Crone, DE et al., J. Virol. 63: 4172-4180 (1989).
An early known effect of vesicular stomatitis virus infection on cellular metabolism is the inhibition of U-particle assembly, as reported by A. Harley, JB et al., Rheumatic
Disease Clinics of North America: Systemic Lupus E
As reported by rythematosus 14 (1): 43-56 (1988), La / SSB and U particles are common autoantigens in systemic lupus erythematosus (SLE). Vesicular stomatitis virus infects cells through non-specific glycoproteins. As a result, Superti, F. et al., J. Gen. Virol.
68: 387-399 (1987),
Even with isolates from plants that grow well in mammalian tissue culture cells, the virus has a broad host range. Various human tissues are also expected to support viral infection, reflecting the clinical heterogeneity of SLE and Sjorgren syndrome. Beebe, DP et al., J.
Immunol. 126: 1562-1568 (1981); Agnello, V., in Syste
mic Lupus Erythematosus, pp. 565-589 (John Wiley an
d Sons, New York 1987), vesicular stomatitis virus has improved viability in complement-deficient sera, indicating that many complement-deficient states are associated with SLE. This is consistent with the fact that it is easier to apply in advance. SLE patients produce very high levels of interferon that harbors vesicular stomatitis virus. Prebie,
OT et al., Science 216: 429-431 (1982); Bishop, DH.
L., Rhadboviruses pp. 69-98 (CRC Press, Boca Raton, F.
L 1980), interferons inhibit the production of intact virions. This may explain that virus particles assembled from the patient's tissue material are not found. During the incubation period,
Viral antigens are expressed on the cell surface and can be responsible for a continuous antigenic stimulus.

生産される特異的自己抗体が、一般的な欠陥に起因す
る、別のモデルの疾患もまた考慮されなければならな
い。従って、Ｎタンパク質および水疱性口炎ウイルス
は、抗Ro−SSA自己抗体にのみ関連し得る。他のウイル
スまたは異種抗原は、一般的な疾患の範囲内での、他に
観察された自己抗体および他の自己免疫疾患に関連した
現象に対する刺激または免疫原としての役割を果たす。Another model of the disease, in which the specific autoantibodies produced are due to a common defect, must also be considered. Thus, the N protein and vesicular stomatitis virus may only be associated with anti-Ro-SSA autoantibodies. Other viruses or heterologous antigens serve as stimuli or immunogens for other observed autoantibodies and other autoimmune disease related phenomena within the common disease.

ヨーロッパでは、家畜の水疱性口炎ウイルス感染の記
録はない。抗Ro−SSAに関連したヒトの疾患は、ヨーロ
ッパおよび北米において発生するため、水疱性口炎ウイ
ルスのインディアナ株は、それ自身、抗Ro−SSA自己免
疫応答に関与していない。しかし、Bishop,D.H.L.,Rhab
doviruses,Vol.1,pp.1−22（CRC Press,Boca Raton,FL
1979）によって報告されているように、30個より多くの
既知の近縁ラブドウイルス株が存在するが、その大半に
ついて、地球上での分布は知られていない。There are no records of vesicular stomatitis virus transmission in livestock in Europe. Since human disease associated with anti-Ro-SSA occurs in Europe and North America, the Indiana strain of vesicular stomatitis virus is not itself involved in the anti-Ro-SSA autoimmune response. However, Bishop, DHL, Rhab
doviruses, Vol.1, pp.1-22 (CRC Press, Boca Raton, FL
As reported by 1979), there are more than 30 known closely related rhabdovirus strains, of which the distribution on earth is unknown for most.

Ｎタンパク質とRo−SSAとの間のトリペプチド相同性の
分析 方法全体の確実性を試すために、Ｎタンパク質とRo/S
SAとの間のトリペプチド相同性の場合の、抗原性配列確
率を修正した。抗原性は、図３に示すような標準抗Ro/S
SA血清による主要抗原オクタペプチド結合によって定義
した。少なくともＮとのトリペプチド相同性を有するRo
/SSAの27領域のうち、８領域が抗原性があり、一方、ト
リペプチド相同性を有しない52の領域のうちでは６領域
のみが抗原性があった。そのため、抗原性配列確率は、
0.048であり、オッズ比は3.2であった。この関係は、ク
ワドラペプチドレベルに見られるよりも有為に弱いが、
それでも顕著である。従って、これらのデータは、抗原
性に無関係なホモロジーの数が増加し得るトリペプチド
相同性レベルにおいても、ＮとRo/SSAの間の特異性自己
免疫関係を支持する。Analysis of Tripeptide Homology between N Protein and Ro-SSA To test the overall method certainty, the N protein and Ro / S
The antigenic sequence probability in case of tripeptide homology with SA was corrected. Antigenicity was measured using standard anti-Ro / S as shown in FIG.
Defined by major antigen octapeptide binding by SA sera. Ro having at least a tripeptide homology with N
Of the 27 regions of / SSA, 8 regions were antigenic, while of the 52 regions without tripeptide homology, only 6 regions were antigenic. Therefore, the antigenic sequence probability is
It was 0.048 and the odds ratio was 3.2. This relationship is significantly weaker than seen at the quadrapeptide level,
Still notable. Thus, these data support a specific autoimmune relationship between N and Ro / SSA, even at tripeptide homology levels where the number of homology independent of antigenicity can be increased.

その他の抗Ro/SSA血清。Other anti-Ro / SSA sera.

全６個の抗Ro/SSA血清の抗原性を、Ro/SSAの531オク
タペプチドへの結合について評価した。精製された天然
60−kDa Ro/SSAとは沈澱を形成したが、イムノブロット
中では60−kDA Ro/SSAと十分結合しなかった２つの血清
は、どのRo/SSAオクタペプチドともバックグラウンドを
超えて結合しなかった。おそらく、これらの血清の抗Ro
/SSA自己抗体は、立体的に高次なエピトープのみを結合
する。血清の同様の挙動が、すでにJamesら、Arthritis
Rheum.33:102−106（1990）によるイムノブロット分
析、およびRo/SSAの13−kDaカルボキシル末端の精巧な
特異性を分析する実験に記載されている。他の血清は、
図３に示すような、標準血清によって結合されたエピト
ープの適当なサブセットに結合した。これらの血清のた
めの主要抗原ペプチドの位置を、図3Eに示す。インディ
アナ血清型Ｎ配列（VHVNN）の場合、これらの血清の抗
原配列確率は、0.0013、0.0048、および0.0081であっ
た。これらの血清のうちどれ１つとして、共有ペンタペ
プチドLKALDを含有するオクタペプチドと結合しなかっ
た。このペンタペプチドは、第２のインディアナ株Ｎタ
ンパク質配列［図５のVSV−IND＃２（VHVN4）］と共通
ではなかったので、上記抗原配列確率は、このＮタンパ
ク質配列との抗原配列確率、すなわち、それぞれ0.0004
0、0.00016、および0.0027よりも高かった。線形配列を
結合しないように見える抗Ro/SSA血清がいくつかある一
方、他の多くの抗Ro/SSA血清においては、Ro/SSAの配列
自己抗原が、Ro/SSAの水疱性口炎ウイルスのＮタンパク
質との配列類似性と関係がある。The antigenicity of all six anti-Ro / SSA sera was evaluated for binding of Ro / SSA to 531 octapeptide. Purified natural
Two sera that formed a precipitate with 60-kDa Ro / SSA, but did not bind well to 60-kDA Ro / SSA in the immunoblot, did not bind to any Ro / SSA octapeptide above background. Was. Probably the anti-Ro of these sera
/ SSA autoantibodies bind only sterically higher epitopes. Similar behavior of serum has already been described by James et al., Arthritis
Rheum. 33: 102-106 (1990) and described in experiments analyzing the elaborate specificity of the 13-kDa carboxyl terminus of Ro / SSA. Other sera
It bound to the appropriate subset of epitopes bound by the standard serum, as shown in FIG. The location of the major antigenic peptides for these sera is shown in FIG. 3E. For the Indiana serotype N sequence (VHVNN), the antigenic sequence probabilities of these sera were 0.0013, 0.0048, and 0.0081. None of these sera bound to the octapeptide containing the covalent pentapeptide LKALD. Since this pentapeptide was not common to the second Indiana strain N protein sequence [VSV-IND # 2 (VHVN4) in FIG. 5], the antigen sequence probability was calculated as the antigen sequence probability with this N protein sequence, ie, , Each 0.0004
It was higher than 0, 0.00016, and 0.0027. While some anti-Ro / SSA sera appear to not bind linear arrays, many other anti-Ro / SSA sera have Ro / SSA sequence autoantigens Related to sequence similarity to N protein.

実施例3:La/SSBおよびnRNP自己抗原の病因性または潜在
的免疫原を同定する方法の応用。Example 3: Application of the method to identify the pathogenic or potential immunogen of La / SSB and nRNP autoantigen.

抗Ro/SSA自己抗体は、抗La/SSBを含む他の自己抗体と
関連づけられてきた。ChambersおよびKeene,J.Biol.Che
m.263:18043−18051（1988）に報告されているように、
La/SSBの遺伝子がクローン化され、タンパク質の配列決
定がなされてきた。アミノ酸485位から492位にまたがる
最も活性なオクタペプチドの配列を、La/SSBの既知の配
列と比較した場合、近い関係にある配列はない。しか
し、La/SSBは、水疱性口内炎ウイルスリーダー配列に結
合するLa/SSBに対しては、抗Ro/SSA沈降抗体陽性の患者
の約３分の１の体内で自己抗体が生成されている。VSV
マトリックス（Ｍ）タンパク質は、残基315−318（LKK
I）、337−342（KGKGKG）、および351−354（CGCG）を
含む３つの位置において、La/SSBと相同な短い配列を含
有していた。Anti-Ro / SSA autoantibodies have been associated with other autoantibodies, including anti-La / SSB. Chambers and Keene, J. Biol. Che
m. 263: 18043-18051 (1988),
The La / SSB gene has been cloned and the protein sequenced. When the sequence of the most active octapeptide spanning amino acids 485 to 492 is compared to the known sequence of La / SSB, there are no closely related sequences. However, La / SSB generates autoantibodies to La / SSB, which binds to the vesicular stomatitis virus leader sequence, in about one-third of patients who are positive for anti-Ro / SSA precipitated antibodies. VSV
Matrix (M) protein is available at residues 315-318 (LKK
Three positions, including I), 337-342 (KGKGKG), and 351-354 (CGCG), contained short sequences homologous to La / SSB.

U1 nRNP 68KD抗原も、インディアナ株およびニュージ
ャージー株の両方の水疱性口内炎ウイルスタンパク質と
比較されてきた。U1 68KDタンパク質は、抗nRNP自己抗
体が結合する主要な自己抗原である。抗nRNP抗体は、SL
E患者の約40％に見られる。この自己抗原は、水疱性口
内炎ウイルスのインディアナ株のＭタンパク質と相同性
を持つことが発見されている。これは、La/SSBと相同領
域を共有する、同一のウイルス性タンパク質であるが、
全３種類のタンパク質間で共通するアミノ酸が４個以上
の相同性を有する個々の配列は無い。U1 68KDタンパク
質配列に広がるオーバーラップするオリゴペプチドが合
成され、Ro/SSBに関して行ったようなサーチが既知のタ
ンパク質配列に対して行われる。これらの自己抗原が水
疱性口内炎ウイルスタンパク質と、複数の短いホモロジ
ーを共有するというデータは、水疱性口内炎ウイルスが
自己免疫疾患における潜在的な病因性物質であるとの考
えを裏付ける。さらに、抗原性と複数部位分子擬態との
一致に関するRo/SSAおよびLa/SSBに対して得たデータも
興味を引き得る。The U1 nRNP 68KD antigen has also been compared to vesicular stomatitis virus proteins in both Indiana and New Jersey strains. U1 68KD protein is the major autoantigen to which anti-nRNP autoantibodies bind. Anti-nRNP antibody, SL
Found in about 40% of E patients. This autoantigen has been found to have homology to the M protein of the Indiana strain of vesicular stomatitis virus. This is the same viral protein that shares a homologous region with La / SSB,
No individual sequence has four or more homologous amino acids common to all three proteins. Overlapping oligopeptides spanning the U1 68KD protein sequence are synthesized, and a search as performed for Ro / SSB is performed on the known protein sequence. Data that these self-antigens share multiple short homology with vesicular stomatitis virus proteins support the notion that vesicular stomatitis virus is a potential etiological agent in autoimmune diseases. In addition, the data obtained for Ro / SSA and La / SSB regarding the agreement between antigenicity and multi-site molecular mimicry may be of interest.

実施例4:自己免疫疾患の病因性物質としてのRo/SSAと相
同な抗原性物質のテスト。Example 4: Testing of antigenic substances homologous to Ro / SSA as pathogens of autoimmune diseases.

抗Ro/SSA自己抗体は、全身性エリテマトーデスおよび
シューグレン症候群（SS）に共通なだけでなく、先天性
完全心ブロックおよび新生児の狼瘡皮膚炎においても病
原性の役割を有し得る。T.J.A.Lehmanら、Arthritis Rh
eum.32,1414−1420（1989）に報告されているように、1
0才未満の小児を持つ母親および狼瘡にかかった男児を
持つ母親は、他の近親に比べて、抗Ro/SSAのレベルが予
想外に高い。これらの観察結果は、ウイルス構造タンパ
ク質に対するRo/SSAの抗原関係を示す免疫化学的証拠
（実施例３で述べた）と共に、特異性ウイルス感染が、
適度に影響を受ける宿主体内で、抗Ro/SSA自己抗体生産
に至るという仮説を導き出した。Anti-Ro / SSA autoantibodies are not only common in systemic lupus erythematosus and Sjogren's syndrome (SS), but may also have a pathogenic role in congenital complete heart block and neonatal lupus dermatitis. TJALehman et al., Arthritis Rh
eum. 32, 1414-1420 (1989),
Mothers with children younger than 0 years and mothers with lupus boys have unexpectedly higher levels of anti-Ro / SSA than other close relatives. These observations, together with immunochemical evidence for the antigenic relationship of Ro / SSA to viral structural proteins (described in Example 3), indicate that the specific viral infection
A hypothesis has been derived that leads to anti-Ro / SSA autoantibody production in moderately affected hosts.

実施例１から３のデータは、自己抗原Ro/SSAと水疱性
口内炎ウイルス（VSV）のインディアナ株のヌクレオキ
ャプシド（Ｎ）タンパク質との間に抗原性リンクが発見
されたことを示す。このウイルスはラブドウイルスであ
り、その既知の全種類が、５種類のタンパク質の類似の
構造を有する。ラブドウイルスの４種類のＮタンパク質
配列が、Gallioneら、J.Virol.39:529−535（1981）、D
ePoloら、J.Virol.61:454−464（1987）、およびBanerj
eeら、Virology 137:432−438（1984）によって得られ
た。狂犬病ウイルスＮタンパク質は、インディアナ株か
ら最も遠く、これら２種類のＮタンパク質は、アミノ酸
レベルで40パーセントのホモロジーを有するにすぎな
い。狂犬病ウイルスＮタンパク質配列は60kD Ro/SSA
（図５）と相同なクワドラペプチドを３つ有するが、そ
のどれもがRo/SSAの抗原領域には見られなかった。Fraz
ierおよびShope,Serologic relationships of animal r
habdoviruses（動物ラブドウイルスの血清学的関係）、
およびBishop,D.H.L.,Rhabdoviruses pp.43−64（CRC P
ress,Boca Raton,FL 1979）に報告されているように、
水疱性口内炎ウイルスのニュージャージー株は、インデ
ィアナ株と血清上異なるが、これら２つのウイルスは近
い関係にある。その２種類のＮタンパク質は、アミノ酸
レベルで60パーセントのホモロジーを有する。しかし、
これらの相違は、60 kD Ro/SSA（図５）とのホモロジー
を実質的に変更するのに十分である。Ro/SSAの抗原性
と、ニュージャージー株Ｎタンパク質とのホモロジーと
の間の関係は、Ro/SSAの抗原性と、インディアナ株Ｎタ
ンパク質配列とのホモロジーとの間に見られる関係より
も実質的に弱い。The data of Examples 1-3 show that an antigenic link was found between the autoantigen Ro / SSA and the nucleocapsid (N) protein of the Indiana strain of vesicular stomatitis virus (VSV). This virus is a rhabdovirus, all known types of which have a similar structure of five proteins. The four N protein sequences of the rhabdovirus are described in Gallione et al., J. Virol. 39: 529-535 (1981), D.
ePolo et al., J. Virol. 61: 454-464 (1987), and Banerj.
ee et al., Virology 137: 432-438 (1984). The rabies virus N protein is furthest from the Indiana strain, and these two N proteins have only 40 percent homology at the amino acid level. Rabies virus N protein sequence is 60kD Ro / SSA
It has three quadrapeptides homologous to (FIG. 5), none of which were found in the Ro / SSA antigenic region. Fraz
ier and Shope, Serologic relationships of animal r
habdoviruses (serological relationship of animal rhabdovirus),
And Bishop, DHL, Rhabdoviruses pp. 43-64 (CRC P
ress, Boca Raton, FL 1979)
Although the New Jersey strain of vesicular stomatitis virus is serum-different from the Indiana strain, the two viruses are closely related. The two N proteins have 60 percent homology at the amino acid level. But,
These differences are sufficient to substantially alter the homology with the 60 kD Ro / SSA (FIG. 5). The relationship between the antigenicity of Ro / SSA and the homology with the New Jersey strain N protein is substantially greater than that found between the antigenicity of Ro / SSA and the homology with the Indiana strain N protein sequence. weak.

水疱性口内炎ウイルスのインディアナ株に近縁のラブ
ドウイルスによる感染は、抗Ro/SSA自己抗体の発現にと
って重要であるという仮説をたてた。マウス体内で成長
させた市販の抗水疱性口内炎腹水の、ウシのRo/SSA、La
/SSB、およびnRNPへの結合をテストした。対照のマウス
腹水に比較して、抗水疱性口内炎ウイルスは、固相ELIS
Aにおいて明らかにウシのRo/SSAを結合した。そのた
め、この実験は、異種免疫系にとってもこの仮説を部分
的に確認するのに有用である。It has been hypothesized that infection with rhabdoviruses closely related to the vesicular stomatitis virus Indiana strain is important for the expression of anti-Ro / SSA autoantibodies. Bovine Ro / SSA, La, commercial antivesicular stomatitis ascites grown in mice
/ SSB, and binding to nRNP were tested. Compared to control mouse ascites, anti-vesicular stomatitis virus has a solid phase ELIS
A clearly bound bovine Ro / SSA. Therefore, this experiment is useful for partially confirming this hypothesis even for a heterogeneous immune system.

どのラブドウイルスが病因性または免疫原性物質であ
り得るかを決定するために、まず第１に、60 kD Ro/SSA
と水疱性口内炎Ｎタンパク質とでオーバーラップするオ
クタペプチドを構成し、そして小児の全身性エリテマト
ーデス（SLE）発病者および対照における抗体をテスト
し得る。仮説より、Ro/SSAとＮタンパク質間の構造的類
似性を有する領域に対する抗体は、初期の抗Ro/SSA自己
免疫応答で優位を占め、そしてＮタンパク質の他の領域
に対する抗体は、初期の抗Ro/SSA自己免疫応答にもまだ
存在する見込みが大いにあるということが予想される。
第２に、Ｎタンパク質の、これら同一の抗原特性は、幼
児を持つ母親および狼瘡にかかった男児を持つ母親にみ
られ得、このことは、先天性または小児感染の可能性が
これらの患者が次にかかる疾患にとって重要な要素であ
るということと一致する。第３に、様々なラブドウイル
ス株の抗原性をテストし得る。Ｎタンパク質だけでなく
抗Ro/SSA自己抗血清とも反応するタンパク質を有するラ
ブドウイルスは、ウェスタンイムノブロットが利用でき
る系統でテストし得る。To determine which rhabdoviruses could be pathogenic or immunogenic, first, a 60 kD Ro / SSA
And vesicular stomatitis N protein may constitute overlapping octapeptides and test antibodies in pediatric patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and controls. By hypothesis, antibodies to regions with structural similarity between Ro / SSA and the N protein dominate in the early anti-Ro / SSA autoimmune response, and antibodies to other regions of the N protein will It is expected that the Ro / SSA autoimmune response is likely to still exist.
Second, these same antigenic properties of the N protein may be found in mothers with infants and mothers with lupus-affected boys, indicating that a possible congenital or pediatric infection may cause these patients to have It is then consistent with being an important factor for such diseases. Third, the antigenicity of various rhabdovirus strains can be tested. Rhabdoviruses that have proteins that react not only with the N protein but also with the anti-Ro / SSA autoantiserum can be tested in strains where Western immunoblot is available.

早くも1967年に、NZBマウスの観察に基づいて、ウイ
ルスがSLEの原因であると考えられていた（Mellors,R.
C.およびHuang,C.Y.J.Exp.Med.126:53−62（1967））。
数々の初期の発見が、ウイルスがヒトのSLEの病因であ
ることを示唆していた。これらは、抗ウイルス性抗体力
価の上昇（Phillips,P.E.およびChristian,C.L.Science
168:982−984（1970））、インターフェロンレベルの
上昇（Preble,O.T.ら、Science 216:429−431（198
2））、および疾患のある腎臓内の顆粒画分（Fresco,R.
Fed.Proc.27:246（1968）（Abstract））を含む。最終
的に、これらの発見は全て非特異性（Levy,J.A.Science
182:1151−1153（1973）;Phillips,P.E.およびChristi
an,C.L.:Infectious agents in chronic rheumatic dis
eases（慢性リウマチ性疾患における感染性物質。In Ar
thritis and Allied Conditions（関節炎および類似の
症状）,9th ed.McCarty,D.j.,ed.pp 320−328（Leaおよ
びFebiger,Philadelphia 1979））または再現性なし（R
ussell,P.J.ら、Clin.Exp.Immunol.6:227−239（197
0）;Schaap,O.L.ら、Pathol.Microbiol.42:171−174（1
975））であると主張された。As early as 1967, the virus was thought to be the cause of SLE based on observations of NZB mice (Mellors, R. et al.
C. and Huang, CYJExp. Med. 126: 53-62 (1967)).
Numerous early findings suggested that the virus was pathogenic for human SLE. These include raised antiviral antibody titers (Phillips, PE and Christian, CLS Science).
168: 982-984 (1970)), elevated interferon levels (Preble, OT et al., Science 216: 429-431 (198).
2)) and the granular fraction in diseased kidneys (Fresco, R.
Fed. Proc. 27: 246 (1968) (Abstract)). Ultimately, all of these findings are non-specific (Levy, JAScience
182: 1511-1153 (1973); Phillips, PE and Christi
an, CL: Infectious agents in chronic rheumatic dis
eases (Infectious agent in chronic rheumatic diseases. In Ar
thritis and Allied Conditions (arthritis and similar symptoms), 9th ed. McCarty, Dj, ed. pp 320-328 (Lea and Febiger, Philadelphia 1979) or no reproducibility (R
ussell, PJ et al., Clin. Exp. Immunol. 6: 227-239 (197
0); Schaap, OL et al., Pathol. Microbiol. 42: 171-174 (1
975)).

近年、サイトメガロウイルス（CMV）、エプスタイン
−バーウイルス（EBV）、およびレトロウイルスが、SLE
およびシェーグレン症候群の両方の病原論で最も頻繁に
示唆されている。EBVまたはレトロウイルスと、SLEまた
はSSとの関連を示す血清疫学的証拠が提示されている
が、他の研究ではリウマチ性疾患においてこれらのウイ
ルスを示唆する証拠が見られないことが報告されてい
る。Recently, cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus (EBV), and retroviruses have
It is most frequently suggested in the pathogenesis of both Sjogren's syndrome. Sero-epidemiological evidence suggests an association between EBV or retrovirus and SLE or SS, but other studies report no evidence suggesting these viruses in rheumatic diseases .

推定物質（単数または複数）が自己免疫応答およびそ
れに続く疾患を引き起こすメカニズムは、いくつかあ
る。病原体からの抗原が自己成分と交差反応する分子擬
態は、このようなメカニズムの１つである。リウマチ性
心臓疾患およびシャガス病においては、分子擬態が起こ
ることが明らかになっている。しかし、これまでにSLE
またはSSにおいて、このような分子関係を有することが
示された病原体はない。上記したデータは、SLEで見ら
れる分子擬態およびラブドウイルスと抗Ro/SSA自己抗体
応答との間の免疫反応性が、疾患の病原において役割を
持つのではないかという考えを支持する。There are several mechanisms by which a putative substance or substances cause an autoimmune response and subsequent disease. Molecular mimicry in which antigens from pathogens cross-react with self components is one such mechanism. Molecular mimicry has been shown to occur in rheumatic heart disease and Chagas disease. But so far SLE
Or, in SS, no pathogen has been shown to have such a molecular relationship. The above data support the notion that the molecular mimicry seen in SLE and the immunoreactivity between the rhabdovirus and anti-Ro / SSA autoantibody response may play a role in the pathogenesis of the disease.

ラブドウイルスを、抗Ro/SSA関連の自己免疫リウマチ
性疾患の病因性物質と考えるべきであるという議論をさ
らに支持するものに以下のものがある：第１に、上記し
たように、抗Ro/SSA沈降素陽性患者の半数近くの体内
で、自己抗体が生産されるLa/SSBは、水疱性口内炎リー
ダー配列を結合する。水疱性口内炎ウイルスはまた、抗
RNPおよび抗Sm応答が結合し得るタンパク質から成るス
ピセオソーム（spiceosome）粒子の組み立てを阻害す
る。第２に、初期古典経路補体成分欠失を有する患者
は、SLEの発病率が高いという傾向がある。補体欠失お
よびSLEを有する患者の大多数は、抗Ro/SSAをも有す
る。補体成分C4が欠失した血清は、ウイルスを中和しク
リアーする能力が低下する。SLE患者はインターフェロ
ンのレベルが高い。水疱性口内炎ウイルスは、損傷のな
いビリオンが生成する溶菌感染がインビトロで禁止さ
れ、ウイルス感染が潜伏状態になるという点でインター
フェロンに対して過敏である。水疱性口内炎ウイルス
は、最高１年間インビボで潜伏状態にあることが記録さ
れている。ラブドウイルスは、細胞付着のための非特異
性メカニズムを有しており、このことは、ラブドウイル
スが多数の異なる組織に感染し得、おそらくSLEの臨床
的不均一性に寄与することを意味している。Further supporting the argument that rhabdoviruses should be considered as pathogens of anti-Ro / SSA-related autoimmune rheumatic diseases include the following: first, as noted above, anti-Ro / La / SSB, where autoantibodies are produced in nearly half of SSA-precipitin-positive patients, binds the vesicular stomatitis leader sequence. Vesicular stomatitis virus is also anti-
Inhibits assembly of spiceosome particles consisting of proteins to which RNP and anti-Sm responses can bind. Second, patients with early classical pathway complement component deficiency tend to have a higher incidence of SLE. The majority of patients with complement deficiency and SLE also have anti-Ro / SSA. Serum lacking complement component C4 has a reduced ability to neutralize and clear the virus. SLE patients have high levels of interferon. Vesicular stomatitis virus is hypersensitive to interferon in that lytic infections that produce intact virions are inhibited in vitro and the viral infection becomes latent. Vesicular stomatitis virus has been documented as latent in vivo for up to one year. Rhabdovirus has a non-specific mechanism for cell attachment, which means that rhabdovirus can infect many different tissues and probably contribute to the clinical heterogeneity of SLE. ing.

水疱性口内炎ウイルスはヒトには感染しない（Sekell
ick,M.J.およびMarcus,P.I.Persistent infections of
rhabdoviruses（ラブドウイルスの持続的感染）:in Rha
bdovirusea,Vol.1,Bishop,D.H.L.ed.pp.67−98（CRC Pr
ess,Boca Raton,1980）;Tesh,R.B.ら、Am.J.Epidemiol.
90:255−261（1969）;Tesh,R.ら、Am.J.Trop.Med.26
（２）:299−306（1977））。ウイルスが外皮寄生性で
あることが知られている地域では、ヒトの90％までが、
過去に感染した血清学的証拠を示す。外皮寄生性地域
は、西半球の大半および中東の一部を含む。しかし、水
疱性口内炎ウイルスが欧州で発見されたとは考えられて
いないので、水疱性口内炎ウイルス自体のインディアナ
株がRo/SSAに対するトレランスを喪失する原因である可
能性はほとんど無い。しかし、原型ラブドウイルスとし
て、水疱性口内炎ウイルスのインディアナ菌株は十分研
究されてきた。ヒトに感染することが知られているラブ
ドウイルスは約30種類あり、その大部分はまだ特徴づけ
られていない。これらのうちの１つ、またはまだ単離さ
れていないウイルスを、Ro/SSAおよび関連疾患状態に対
する自己免疫につながる重要な病因性物質として真剣に
かんがえるべきである。Vesicular stomatitis virus does not infect humans (Sekell
ick, MJ and Marcus, PI Persistent infections of
rhabdoviruses (persistent transmission of rhabdovirus): in Rha
bdovirusea, Vol. 1, Bishop, DHLed. pp. 67-98 (CRC Pr.
ess, Boca Raton, 1980); Tesh, RB et al., Am. J. Epidemiol.
90: 255-261 (1969); Tesh, R. et al., Am. J. Trop. Med. 26
(2): 299-306 (1977)). In areas where the virus is known to be coat parasitic, up to 90% of humans
Shows serologic evidence of past infection. Integumental parasitic areas include most of the western hemisphere and parts of the Middle East. However, since the vesicular stomatitis virus is not believed to have been found in Europe, it is highly unlikely that the Indiana strain of vesicular stomatitis virus itself loses tolerance to Ro / SSA. However, the Indiana strain of vesicular stomatitis virus as a prototype rhabdovirus has been well studied. There are approximately 30 rhabdoviruses known to infect humans, most of which have not yet been characterized. One of these, or a virus that has not yet been isolated, should be taken seriously as an important etiologic agent that leads to autoimmunity against Ro / SSA and related disease states.

水疱性口内炎ウイルスに関連するラブドウイルスは、
すでにSLEにかかっている、または潜在的な患者の体内
における抗Ro/SSA自己抗体の生産にとって重要であり得
るが、病原性物質は、SLEにかかりやすくする、またはS
LEを引き起こす要因から分離可能であり得る。従って、
抗Ro/SSA陰性のSLE患者は、水疱性口内炎ウイルスのよ
うなウイルスに前もって曝されたという免疫学的証拠を
有しないこともあり得、Ro/SSA陰性血清からのRo/SSAオ
クタペプチド結合方法においては、多くを予期すること
はできない。他の自己抗原に対するトレランスが喪失す
る複数のメカニズムはおそらく存在するが、そのメカニ
ズムは、ここでRo/SSAに関して記載したように、少なく
とも、複数部位における分子擬態のメカニズムを含むと
考えられる。様々な細菌性、ウイルス性、または他の環
境物質が、発生する特定の自己抗体に影響を与え得る。
このモデル下では、このような自己抗体を発生させる能
力が、SLEにつながる一般的な欠失であり、特異的自己
抗体のそれぞれが、限られた組の潜在的に引金となる抗
原から発生すると考えられる。Rhabdovirus associated with vesicular stomatitis virus
Already afflicted with SLE or may be important for the production of anti-Ro / SSA autoantibodies in the body of a potential patient, pathogenic agents may predispose to SLE, or
It may be separable from the factors that cause LE. Therefore,
Anti-Ro / SSA-negative SLE patients may not have immunological evidence that they have been previously exposed to a virus such as vesicular stomatitis virus, and the Ro / SSA octapeptide binding method from Ro / SSA-negative serum In can not expect much. There are probably multiple mechanisms of loss of tolerance to other self-antigens, but these may include at least those of molecular mimicry at multiple sites, as described herein for Ro / SSA. Various bacterial, viral, or other environmental substances can affect the specific autoantibodies that occur.
Under this model, the ability to generate such autoantibodies is a common deletion leading to SLE, where each of the specific autoantibodies is generated from a limited set of potentially triggered antigens It is thought that.

第２の一般的なモデルは、探求しているラブドウイル
スが、SLEの病因性物質であるということである。もし
そうであれば、全SLE患者が、オクタペプチド結合によ
って示されるＮタンパク質抗原性の証拠を有し得るが、
有する必要はない。抗nRNPおよび抗Sm自己抗体だけでな
く、SLEにおいて多くの他の既知の自己抗体特異性の存
在の証明が、証明を必要とする主要な謎であると考えら
れる。様々な可能性の中には、ここでRo/SSAとＮとの間
について記載したような、Ｕペプチドとラブドウイルス
タンパク質との間の類似関係も含まれる。68 kD U1ペプ
チドと様々なラブドウイルスタンパク質との間の配列を
比較すると、60 kD Ro/SSAとＮタンパク質との間のレベ
ルに類似のレベルにおいて、インディアナ株のＭタンパ
ク質との相同性が明らかになった。しかし、これに関す
るSLEの自己抗体特異性があまりにも多いため、全体的
な説明をすることができないと考えられる。もしこの第
２のモデルが本当であれば、ウイルス感染自体が、自己
抗体の生産を促進する免疫細胞調節集団を調整する必要
があるということになる。The second general model is that the rhabdovirus sought is the etiologic agent of SLE. If so, all SLE patients may have evidence of N protein antigenicity as indicated by the octapeptide bond,
No need to have. Proof of the existence of many other known autoantibody specificities in SLE, as well as anti-nRNP and anti-Sm autoantibodies, is considered to be the major mystery that requires proof. Among the various possibilities are similarities between U peptides and rhabdovirus proteins, as described here between Ro / SSA and N. Comparison of the sequence between the 68 kD U1 peptide and various rhabdovirus proteins reveals homology with the Indiana strain M protein at a level similar to that between the 60 kD Ro / SSA and the N protein. became. However, the autoantibody specificity of SLE in this regard is too great to give a general explanation. If this second model is true, it means that the viral infection itself needs to modulate the immune cell regulatory population that promotes the production of autoantibodies.

これらの仮説をテストするために、多数のラブドウイ
ルス株を入手し、これに続く精製のために選択された細
胞株としてラブドウイルス株を成長させ得る。Clark,H.
F.,Rhabdoviruses pp.23−24（1980）にすでに記載され
ているように、高力価ウイルスが、成長し、精製され得
る。クローン化された水疱性口内炎ウイルスは、BHK−2
1の単分子量、または適当な細胞株に添加される。感染
性の接種量で、一般的な細胞変性効果が、約24時間で見
られる。その後、上清を取り、続いて1,000 x gで10分
間、その後、10,000 x gで10分間連続して遠心分離器に
かける。次に、85,000 x gで90分間、50％のグリセロー
ルクッションを介して、ウイルスをペレット状にする。
その後、ペレットを10mM Tris,0.1M NaClおよび0.001M
EDT A（TNE）溶液で懸濁し、その後、40ワットで10秒間
超音波処理する。その後、ウイルスを10％から40％のス
クロースグラジエント上に積層し、50,000 x gで90分間
遠心分離器にかける。得られた可視帯をTNE溶液中で希
釈し、再び50,000 x gで90分間遠心分離器にかける。こ
うして精製したウイルスを一晩４℃でTrisバッファに対
して透析する。これは−70℃で貯蔵し得る。To test these hypotheses, one can obtain a number of rhabdovirus strains and grow the rhabdovirus strain as the cell line of choice for subsequent purification. Clark, H.
High titer viruses can be grown and purified as already described in F., Rhabdoviruses pp. 23-24 (1980). The cloned vesicular stomatitis virus is BHK-2
One single molecular weight, or added to the appropriate cell line. At infectious doses, a general cytopathic effect is seen in about 24 hours. The supernatant is then removed and subsequently centrifuged at 1,000 xg for 10 minutes and then at 10,000 xg for 10 minutes continuously. The virus is then pelleted through a 50% glycerol cushion at 85,000 xg for 90 minutes.
Then, pellet the pellet with 10 mM Tris, 0.1 M NaCl and 0.001 M
Suspend in EDTA (TNE) solution and then sonicate at 40 watts for 10 seconds. The virus is then layered on a 10% to 40% sucrose gradient and centrifuged at 50,000 xg for 90 minutes. The resulting visible band is diluted in the TNE solution and centrifuged again at 50,000 xg for 90 minutes. The virus thus purified is dialyzed overnight at 4 ° C. against Tris buffer. It can be stored at -70 ° C.

抗体結合は、血清のパネルに対する標準ウェスタンブ
ロット法によって評価し得る。Ｎタンパク質が単離され
るウイルスが、少なくとも抗Ro/SSA沈降素陽性患者およ
びSLEまたは適当な対照血清中のいづれにも存在する他
の４種類のラブドウイルスタンパク質のいづれにも結合
することは、大きな興味を引く。この方法は、関係のあ
るラブドウイルスの宿主が、非常に広い範囲である可能
性を利用している。例えば、黄色レタルウイルスさえも
哺乳動物の細胞で感染し成長するラブドウイルスであ
る。Antibody binding can be assessed by standard Western blot on a panel of sera. It is significant that the virus from which the N protein is isolated binds at least any of the anti-Ro / SSA precipitin positive patients and any of the other four rhabdovirus proteins present in SLE or any suitable control serum. Interesting. This method takes advantage of the very wide range of rhabdovirus hosts involved. For example, rhabdovirus, which even infects and grows on mammalian cells, even the yellow lethal virus.

実施例5:VSV様ラブドウイルスに基づく診断試薬および
アッセイ 自己免疫疾患、病因性または免疫原性物質への被曝ま
たはそれによる感染、および水疱性口内炎ウイルス感染
の診断に使用し得る診断試薬の、本発明による実施態様
がいくつかある。第１に、抗ウイルス抗体は、細胞抽出
物または血清および体液内のウイルス抗原を検出するた
めに使用し得る。これらの抗体アッセイは、サンドイッ
チELISAアッセイ、ウェスタンイムノブロット、ラジオ
イムノアッセイ、および免疫拡散アッセイ等のアッセイ
を含む。これらの試薬を調製する技術、およびその使用
法は、当業者にとって自明である。Example 5: Diagnostic reagents and assays based on VSV-like rhabdovirus There are several embodiments according to the invention. First, antiviral antibodies can be used to detect viral antigens in cell extracts or serum and body fluids. These antibody assays include assays such as sandwich ELISA assays, western immunoblots, radioimmunoassays, and immunodiffusion assays. Techniques for preparing these reagents, and how to use them, will be apparent to those skilled in the art.

患者によっては、水疱性口内炎ウイルスが潜伏性感染
として残存する可能性がある。このような状況では、免
疫試薬を、当業者にとって自明な方法を用いて、組織切
片中または単離細胞上の、特定のウイルス抗原の存在を
検出するために使用し得る。当業者に既知の方法を用い
て、サンドイッチELISAにおけるように、ウイルス抗原
をトラップする抗ウイルス性物質を用いて、抗ウイルス
性抗体を検出し得る。In some patients, vesicular stomatitis virus can persist as a latent infection. In such a situation, the immunoreagent may be used to detect the presence of a particular viral antigen in a tissue section or on an isolated cell, using methods apparent to one of skill in the art. Using methods known to those skilled in the art, antiviral antibodies can be detected using antiviral agents that trap viral antigens, as in sandwich ELISAs.

実施例５に記載したVSVのインディアナ株のように、
図３および図４中に確認される、試験したRo/SSAあるい
はラブドウイルスのいづれかの抗原配列に基づき核酸プ
ローブあるいはアミノ酸プローブを調製し得る。これら
は、広範な市販されている色素、あるいは酵素標識、蛍
光標識、化学発光標識、または放射標識の標識を用いて
標識し得る。これらのプローブは、病因性物質であると
考えられているウイルスの保有者であると考えられる患
者または動物からの血清または組織サンプルをスクリー
ニングするのに使用し得る。例えば、適切なウイルス配
列（またはそれらの相補的核酸）は、特定の組織または
末梢血液細胞中の感染を検出する方法としてのin situ
ハイブリダイゼーションに使用するために市販し得る。
第２の例としては、逆転写酵素と共に、ポリメラーゼチ
ェーンリアクションでウイルス配列の増大に使用し得
る、核酸プライマーを調製し得る。その後に、特異性核
酸プローブ、予期されたサイズの断片の電気泳動、また
は特定の制限エンドヌクレアーゼによる電気泳動および
制限消化によるウイルス配列の検出を行い得る。As in the Indiana strain of VSV described in Example 5,
Nucleic acid probes or amino acid probes can be prepared based on the tested Ro / SSA or rhabdovirus antigen sequences identified in FIGS. These may be labeled with a wide variety of commercially available dyes or labels with enzymes, fluorescent labels, chemiluminescent labels, or radiolabels. These probes can be used to screen serum or tissue samples from patients or animals that are thought to be carriers of the virus that is believed to be the pathogenic agent. For example, appropriate viral sequences (or their complementary nucleic acids) can be used in situ as a method of detecting infection in specific tissues or peripheral blood cells.
It is commercially available for use in hybridization.
As a second example, nucleic acid primers can be prepared that can be used with polymerase chain reaction to amplify viral sequences with reverse transcriptase. This may be followed by specific nucleic acid probes, electrophoresis of fragments of the expected size, or detection of viral sequences by electrophoresis with specific restriction endonucleases and restriction digestion.

実施例6:病因性物質としてVSV様ラブドウイルスを有す
る自己免疫疾患を治療する方法および組成物。Example 6: Methods and compositions for treating an autoimmune disease with VSV-like rhabdovirus as the etiological agent.

抗ウイルス薬剤単独または免疫抑制剤との組合せでの治
療 現在、SLE等の自己免疫不全性の治療は、根本的原因
に向け得ないので、非特異である。現在使用されている
免疫抑制剤には、グルココルチコイド、メトトレキセー
ト、アザチオプリン、シクロホスファミド、非ステロイ
ド消炎剤、抗マラリア剤、およびサンスクリーン等の他
の非特異な治療剤が含まれる。これらの薬剤の使用法お
よび投与量は、疾患の発現によって決定される。例え
ば、グルココルチコイドは、いくつかのSLEの神経性合
併症を治療する場合、多い投与量で使用される。アザチ
オプリンおよびシクロホスファミドの両方は、腎臓への
ダメージを停止あるいは、逆転するための試みとして使
用される。使用を制限する副作用は、あらゆる免疫抑制
剤に共通である。この副作用は一般に、SLEに関与する
免疫系の部分だけでなく普通に機能する防御免疫系に対
しても非特異的に作用することに関係する。例えば、シ
クロホスファミドの投与量は一般に、造血機能に対する
毒性によって規制され、制限される。Treatment with antiviral drugs alone or in combination with immunosuppressants Currently, the treatment of autoimmune deficiencies such as SLE is nonspecific because it cannot be directed to the underlying cause. Immunosuppressants currently in use include glucocorticoids, methotrexate, azathioprine, cyclophosphamide, non-steroidal anti-inflammatory agents, antimalarials, and other non-specific therapeutic agents such as sunscreens. The use and dosage of these agents will be determined by the onset of the disease. For example, glucocorticoids are used in high doses when treating some of the neurological complications of SLE. Both azathioprine and cyclophosphamide are used in an attempt to stop or reverse kidney damage. Side effects that limit use are common to all immunosuppressants. This side effect is generally associated with non-specific effects on the normally functioning protective immune system as well as the parts of the immune system involved in SLE. For example, the dosage of cyclophosphamide is generally regulated and limited by toxicity to hematopoietic function.

上記に基づいて、SLE等の自己免疫疾患は、VSV様ラブ
ドウイルスによる感染によって始まると結論し得る。従
って患者を、上記した免疫抑制剤だけでなく、インター
フェロン、あるいはフルオレン、ジベンゾフラン、チロ
ロンHClまたは細菌性リポ多糖を含むインターフェロン
誘導物質等の非特異的な抗ウイルス性活性を有する免疫
抑制組成物、あるいは単独または免疫抑制剤との組合せ
た水疱性口内炎ウイルスに対する特異性活性を有する化
合物によっても、治療し得る。Based on the above, it can be concluded that autoimmune diseases such as SLE begin with infection by a VSV-like rhabdovirus. Therefore, patients, not only the immunosuppressive agents described above, interferon, or fluorene, dibenzofuran, immunosuppressive composition having a non-specific antiviral activity such as interferon inducer including tyrolone HCl or bacterial lipopolysaccharide, or Compounds having specific activity against vesicular stomatitis virus, alone or in combination with immunosuppressants, may also be treated.

免疫抑制剤はまた、特異的および生物学的である可能
性を有する。例えば、Ｎタンパク質とRo/SSAとの相同
性、およびRo/SSAとＮの抗原性に基づく適切な組成を含
有するタンパク質は、抗Ro/SSA応答の免疫抑制剤として
作用し得る。例えば、相補性の考慮に基づくこの組成物
あるいは他の組成物は、抗Ｎタンパク質（または他のウ
イルス抗原）応答を刺激し、影響を受けた患者からのウ
イルス感染を解消するように作用し得る。他の例とし
て、VSV関連の核酸配列を含有するアンチセンスDNAまた
はRNA、あるいは、その誘導体は、ウイルス抗原の産生
を阻害し得、そしてウイルス感染を排除する可能性があ
る。Immunosuppressants also have the potential of being specific and biological. For example, a protein containing a homology between the N protein and Ro / SSA and an appropriate composition based on the antigenicity of Ro / SSA and N can act as an immunosuppressant for anti-Ro / SSA responses. For example, this or other compositions based on complementation considerations may stimulate an anti-N protein (or other viral antigen) response and act to eliminate viral infection from affected patients. . As another example, antisense DNA or RNA containing a VSV-related nucleic acid sequence, or a derivative thereof, can inhibit the production of viral antigens and potentially eliminate viral infection.

治療用化合物は一般に、薬学的に受容可能なキャリア
ー中に入れ投与される。薬学的キャリアーは、当業者に
は既知であり、例えば、経口投与用の腸到達用コーティ
ングへの化合物のカプセル化、あるいはステアリン酸ま
たはラクトース等のバインダとの組合せ、または溶液等
を含む。受容可能な溶液には、滅菌水、生理食塩水、お
よび生理的pHの緩衝液が含まれる。ワクチンは、経口、
経筋肉、または経皮的に投与し得る。他の化合物も、当
業者に使用される標準的方法に従って投与される。本明
細書では、薬学的キャリアーを、それ自身は通常、不活
性であるが、生物学的活性を有し得ると定義する。例え
ば、ワクチンは、アジュバントと組み合わせた免疫原ペ
プチドまたはタンパク質から成り得る。Therapeutic compounds are generally administered in a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutical carriers are known to those skilled in the art and include, for example, encapsulation of the compound in an enteric coating for oral administration, or in combination with a binder such as stearic acid or lactose, or a solution. Acceptable solutions include sterile water, saline, and physiological pH buffers. Vaccine is oral,
It can be administered transmuscularly or transdermally. Other compounds will be administered according to standard methods used by those skilled in the art. Pharmaceutical carriers are defined herein as being usually inert in themselves, but capable of having biological activity. For example, a vaccine may consist of an immunogenic peptide or protein in combination with an adjuvant.

自己抗体を除去または中和するための、自己抗体が結合
したペプチドでの治療。Treatment with autoantibody-bound peptides to remove or neutralize autoantibodies.

あるいは、治療に使用する薬剤は、同定された抗原性
の分子に似た配列と相同なペプチドを含有し得る。キャ
リアーなし、あるいはキャリアーに結合されたいづれか
である、これらのペプチドは、特定の特異性により、循
環している抗体の量を減少させるために、患者に送達し
得る。さらに、例えばＮおよびRo/SSAのような外来抗原
と、自己抗原との間の、交差反応するエピトープに関す
る知識が、トレランスの再誘起を導き得る。免疫応答の
実験モデルでは、応答が抑制され、抗原を用いた治療に
よりトレランスが誘起され得ることが既知である。交差
反応配列によるペプチド治療は、自己免疫疾患の潜在的
治療であり得る。Alternatively, therapeutic agents may contain peptides homologous to sequences resembling the identified antigenic molecule. These peptides, either without a carrier or conjugated to a carrier, can be delivered to a patient to reduce the amount of circulating antibodies with certain specificities. Furthermore, knowledge of the cross-reacting epitopes between foreign antigens, such as N and Ro / SSA, and self-antigens can lead to a re-induction of tolerance. In experimental models of the immune response, it is known that the response is suppressed and tolerance can be induced by treatment with the antigen. Peptide therapy with cross-reactive sequences can be a potential treatment for autoimmune diseases.

単離した病因性または抗原性物質に基づく自己免疫疾患
の発現を妨げるワクチンの製造。Production of vaccines that prevent the development of autoimmune diseases based on isolated pathogenic or antigenic substances.

危険に曝されている集団にワクチンを投与することに
より、SLEおよび関連疾患を妨げることが、可能であり
得る。ヒトの場合ワクチン投与プログラムは、選択され
た疾患（例えばポリオ）に関して、非常に成功してき
た。このようなワクチンは、弱毒化または殺したウイル
スであり得る。自己抗原中の抗原領域および相同領域
が、発現した免疫原中で、改変、欠失、または破壊され
るように、組換えDNA技術によって操作されたワクチン
製造も可能である。免疫原の複数部分に対する免疫応答
を刺激することにより、免疫系は、影響を受けた患者か
ら感染、または免疫状態のトレランス再誘導を排除する
ことができる。これらの生物製剤が患者の免疫系に与え
る結果を評価するためには移植scidマウスモデルが非常
に有益である。It may be possible to prevent SLE and related diseases by administering the vaccine to a population at risk. In the case of humans, vaccination programs have been very successful for selected diseases (eg polio). Such a vaccine may be an attenuated or killed virus. It is also possible to produce vaccines engineered by recombinant DNA technology such that the antigenic and homologous regions in the autoantigen are modified, deleted or destroyed in the expressed immunogen. By stimulating the immune response to multiple parts of the immunogen, the immune system can eliminate infection or a re-tolerance of immune status from affected patients. Implanted scid mouse models are very useful for assessing the consequences of these biologics on the patient's immune system.

実際の病因性ラブドウイルスが同定されれば、結果に
影響を与えるために多くの手段を試み得る。インターフ
ェロンは、大部分のラブドウイルスの、伝染性を喪失さ
せ潜伏状態にすることが既知であるので、組織から直接
ラブドウイルスを培養することが可能であると予想する
当業者はいない。しかし、ウイルスを規定する他の方法
がある。Ｎタンパク質核酸配列に基づき、ＮとRo/SSAと
の間で相同なペプチドの領域から構築されたDNAプライ
マーを、患者および正常な検体からのラブドウイルス配
列を増大するために使用し得る。入手可能なまたは構成
されたcDNAからのウイルスプローブを使用した、リンパ
球からのmRNAのノーザンブロットにより、感染の別の証
拠が発見され、ウイルス配列を回収しクローン化するた
めの基礎を提供することも可能である。Once the actual etiologic rhabdovirus has been identified, many measures can be taken to influence the results. Since interferons are known to lose the transmissibility and latent state of most rhabdoviruses, no one skilled in the art would expect that rhabdovirus could be cultured directly from tissues. However, there are other ways to define the virus. DNA primers based on N protein nucleic acid sequences and constructed from regions of peptides homologous between N and Ro / SSA can be used to augment rhabdovirus sequences from patient and normal specimens. Northern blot of mRNA from lymphocytes, using viral probes from available or composed cDNA, finds additional evidence of infection and provides a basis for recovering and cloning viral sequences Is also possible.

循環している自己抗体を中和する薬剤として、あるい
は外来抗原または自己抗原のエピトープに対するトレラ
ンスを誘起するために使用するために、培養したウイル
スの開裂によって製造した、または当業者に既知の方法
を用いて合成的に製造したウイルスペプチドはいづれ
も、集団の危険に曝されている部分に対するワクチンを
製造するために使用することができる。ワクチン用の使
用に好適な配列は、抗原性であるが自己抗原の領域と相
同でないウイルスタンパク質の一部分である。例えば、
ラブドウイルスタンパク質と自己抗原になる自己タンパ
ク質との間で相同な複数の領域を、組換えDNA技術によ
り分離し得る。ウイルス感染前、または少なくとも疾患
の発症前に投与したワクチンは、自己免疫を妨ぎ得る。
この方法を用いて、操作したウイルスで接種後、病因性
物質に対する免疫能を個体に発現し得る。病因性物質を
用いて挑戦された時、感染および自己免疫結果が妨げら
れる。A method produced by cleavage of a cultured virus, or known to those of skill in the art, for use as an agent to neutralize circulating autoantibodies or to induce tolerance to epitopes on foreign antigens or autoantigens. Any of the synthetically produced viral peptides used can be used to produce vaccines against endangered parts of the population. Suitable sequences for use in vaccines are those portions of the viral protein that are antigenic but not homologous to the region of the autoantigen. For example,
Multiple regions of homology between the rhabdovirus protein and the self-antigen self protein can be separated by recombinant DNA technology. Vaccines administered prior to viral infection, or at least before the onset of the disease, can prevent autoimmunity.
Using this method, an individual can develop immunity to a pathogenic agent after inoculation with the engineered virus. When challenged with pathogenic agents, infection and autoimmune consequences are hampered.

抗原性または病因性物質のペプチドを用いた、患者から
の自己抗体の排除。Elimination of autoantibodies from patients using peptides of antigenic or pathogenic substances.

当業者に既知の方法を用いて、自己抗体の特異的排除
のために、循環している抗体を、中和するための、また
は体外から導入した装置の基板上に固定化するための薬
剤を製造するために、アミノ酸配列はまた使用し得る。Using methods known to those skilled in the art, agents for neutralizing circulating antibodies or for immobilizing them on the substrate of an exogenously introduced device for the specific elimination of autoantibodies. For production, the amino acid sequence may also be used.

実施例7:自己抗原と他のタンパク質との間の相同部位
の、並置および低度の相同部位再配列。Example 7: Alignment and low degree homologous rearrangement of homologous sites between self antigens and other proteins.

60 kDのRo/SSAおよびＮタンパク質の例では、自己抗
原と刺激性であると確定したタンパク質との間に多くの
相同領域があり得ることを示している。上記した研究に
よると、自己免疫状態がどのようにして確立されるかに
関して非常に重要であると考えられる一面は、これらの
分子間で相同な領域での相対的再配列である。例えば、
Ｎタンパク質が基の免疫原である場合を考慮する。これ
らの状況下で、免疫学の当業者に一般的に受け入れられ
ている考え方に従えば、相同領域Ａ（図４参照）に対す
る免疫応答は、領域Ｂ（図４）に対する免疫応答とは殆
ど無関係である。２つの信号がRo/SSA内では非常に近接
しているため、免疫調整信号と調節信号が競合する可能
性が高い。おそらく、Ro/SSA配列内ではこれらの信号が
わずか11の塩基しか離れていないことが、Ro/SSAに対す
るトレランスを破壊に適し、結果的にある患者に見られ
る強い自己免疫応答を発生させる。相同領域ＣおよびＤ
は、この現象の第２の可能性のある例である。The example of the 60 kD Ro / SSA and N protein shows that there may be many regions of homology between the self antigen and the protein determined to be stimulatory. According to the studies described above, one aspect that may be of great importance as to how an autoimmune state is established is the relative rearrangement in regions of homology between these molecules. For example,
Consider the case where the N protein is the underlying immunogen. Under these circumstances, according to the generally accepted notion by those skilled in the art of immunology, the immune response to homologous region A (see FIG. 4) is almost independent of the immune response to region B (FIG. 4). It is. Because the two signals are so close together in the Ro / SSA, there is a high possibility that the immune and regulatory signals will compete. Presumably, these signals being only 11 bases apart in the Ro / SSA sequence lend themselves to breaking tolerance to Ro / SSA, resulting in the strong autoimmune response seen in some patients. Homologous regions C and D
Is a second possible example of this phenomenon.

この現象の、他の非常に興味を引く可能性のある例
が、Ro/SSA系で発見された。ヒトの60Sリボソームリン
タンパク質PO（アクセスコードNW:A27125）は、その自
己抗体がSLEの精神医学的症状と関係のある自己抗原で
ある。このタンパク質は、60 kD Ro/SSAとの特異的相同
を有する。相同領域を調べると、POの２つの領域（図6
A）から成るRo/SSAの10アミノ酸の伸長配列がある。お
そらく、相同領域での並置に基づく、２種類のタンパク
質間の免疫学的相互作用が存在する。さらに、EKLL配列
が、Ro/SSAのこの領域および第２の領域に見られる。Another very interesting example of this phenomenon has been found in the Ro / SSA system. Human 60S ribosomal phosphoprotein PO (access code NW: A27125) is an autoantigen whose autoantibodies have been implicated in psychiatric symptoms of SLE. This protein has specific homology to 60 kD Ro / SSA. Examination of the homologous regions reveals two regions of PO (Figure 6).
There is a 10 amino acid extension sequence of Ro / SSA consisting of A). Presumably, there is an immunological interaction between the two proteins, based on juxtaposition at homologous regions. In addition, EKLL sequences are found in this and a second region of Ro / SSA.

強直性脊椎炎での、KlebsiellaノイラミダーゼとHLA
−B27との間の相互作用は、別の可能性のある例であ
る。以前には、相同性のある６アミノ酸の伸長配列が確
認されていた。以前に確認されているB27内の相同ヘキ
サペプチド領域に隣接し、Klebsiellaタンパク質中の異
なった部位から始まる第２の相同領域が、発見された
（図6B）。おそらく、HLA−B27配列中の２つのノイラミ
ダーゼ配列の並置が、HLA−B27と脊椎炎との関係、およ
び、この疾患の症候および発現に影響を与えている。Klebsiella neuramidase and HLA in ankylosing spondylitis
Interaction with -B27 is another possible example. Previously, an extended sequence of 6 amino acids having homology was confirmed. A second homologous region was found adjacent to the previously identified homologous hexapeptide region in B27 and beginning at a different site in the Klebsiella protein (FIG. 6B). Possibly, the juxtaposition of the two neuraminidase sequences in the HLA-B27 sequence has affected the relationship between HLA-B27 and spondylitis, and the symptoms and manifestations of the disease.

強皮症では、トホイソメラーゼ（scl−70）およびセ
ントロメアと結合する自己抗体は共通部分を有するが、
両方の特異性は同一の患者では見られない傾向がある。
本発明による１つのアプローチは、相同性の検索を行
い、これらの２つの自己抗原からの短いペプチド（おそ
らくオクタペプチド）の抗原性を評価することである。
次に、Ro/SSAについて行ったものと同様の工程で分析を
行う。短いペプチドの相同という原則を満たすタンパク
質を探す。次に、この被験配列が自己抗原の抗原性と一
致するがどうかで相同性の蓋然性を評価する。次にこの
アプローチを前記の抗原（単数または複数）、または免
疫原、または可能性のある感染についての仮説を構築す
るために用いる。In scleroderma, autoantibodies that bind tofosomerase (scl-70) and centromere have a common part,
Both specificities tend not to be found in the same patient.
One approach according to the invention is to perform a homology search and evaluate the antigenicity of short peptides (probably octapeptides) from these two autoantigens.
Next, analysis is performed in the same steps as those performed for Ro / SSA. Search for proteins that meet the principle of short peptide homology. Next, the probability of homology is evaluated based on whether this test sequence matches the antigenicity of the self antigen. This approach is then used to construct a hypothesis for the antigen (s), or immunogen, or potential infection.

実施例8:自己免疫疾患の治療のための化合物をスクリー
ニングするための動物モデル。Example 8: Animal model for screening compounds for treatment of autoimmune disease.

動物体内でヒトの自己抗体の産生を有効に誘起し得る
だけでなく、これらの細胞による産生を阻害する化合物
またはインビボで自己抗体の効果を中和する化合物のス
クリーニングを行うための手段を提供し得る動物モデル
を開発した。この動物モデルはまた、これらの抗体の産
生を研究するためのツールとして、容認できない危険が
伴うためにヒトでは行えない実験を行うことができる。
例えば、これらの動物に、自己抗体に対する抗原を注入
し、それによって、抗原がいまだに大きな応答を引き出
すかどうか、または循環している抗体を中和するために
抗原を使用し得るかどうかを決定し得る。これらの動物
に、ウイルスを感染させ得る。これらの動物はまた、免
疫疾患を永続させる必要要件を決定するためにも使用し
得る。The present invention provides a means for screening for compounds that not only can effectively induce the production of human autoantibodies in animals but also inhibit the production by these cells or neutralize the effects of autoantibodies in vivo. The resulting animal model was developed. This animal model can also perform experiments that cannot be performed in humans due to unacceptable risks, as a tool to study the production of these antibodies.
For example, these animals can be injected with an antigen against an autoantibody, thereby determining whether the antigen still elicits a large response or whether the antigen can be used to neutralize circulating antibodies. obtain. These animals can be infected with the virus. These animals can also be used to determine the requirements for perpetuating an immune disease.

重症複合した免疫欠損マウス。成体の繁殖期を過ぎた
C.B−17 SCIDマウス（SCID突然変異用ホモ接合）を、Ok
lahoma Medical Research Foundationで滅菌環境中に飼
育保持した。SCIDマウスは全て、注入時に生後24時間あ
るいはそれ以上であった。マウスを滅菌環境から取り出
し、ヒトの末梢血単核細胞を注入した。続いて、マウス
に標準の滅菌していない食物を与え、分離層流失（isol
ation laminar flow cubicles）（BioClean,Inc.）内に
保持した。SCIDマウスの尾の血管から採血した。Severely complex immunodeficient mice. Adult breeding season has passed
CB-17 SCID mice (homozygous for SCID mutation) were
They were bred and maintained in a sterile environment by the lahoma Medical Research Foundation. All SCID mice were 24 hours or older at the time of injection. Mice were removed from the sterile environment and injected with human peripheral blood mononuclear cells. Subsequently, the mice are fed standard non-sterile food and separated laminar erosion (isol
ation laminar flow cubicles) (BioClean, Inc.). Blood was collected from tail vessels of SCID mice.

ヒトの末梢血単核細胞の単離。事情説明した上で同意
を得た後、SLEおよび原発成胆汁性肝硬変（PBC）を有す
る患者、および正常なボランティアに対して静脈採血を
行った。約150mlの血液をヘパリンを加えた容器（保存
剤無し）に採取した。単核細胞を、低速の密度遠心（Hi
stopak,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）で分離し
た。トリパンブルー排除試験で、生存能力を確認した。
様々な数（2x10⁶から50x10⁶）の単離したヒト単核細胞
を腹腔内に注入した。Isolation of human peripheral blood mononuclear cells. After informed consent, venous blood was collected from patients with SLE and primary biliary cirrhosis (PBC) and normal volunteers. Approximately 150 ml of blood was collected in a container containing heparin (no preservative). Mononuclear cells are centrifuged at low speed (Hi
stopak, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Viability was confirmed by trypan blue exclusion test.
The isolated human mononuclear cells of various numbers (2x10⁶ from 50 × 10⁶⁾ were injected intraperitoneally.

酵素結合したイムノソーベントアッセイ（ELISA）。G
aitherおよびHarley,Protides Biol.Fluids Proc.Collo
q.33,413（1985）に記載されている確立された技法を用
い、これらのアッセイを行い、ヒトIgGおよび特異的自
己抗体の産生に関してスクリーニングした。ヒトIgG産
生のスクリーニングを行うために、96穴のマイクロタイ
タープレートを、限界希釈したマウス血清でコーティン
グした。その後、これらのプレートを洗浄し、ブロック
して、ヤギの抗ヒトIgG（ガンマ鎖特異的）とアルカリ
ホスファターゼとの複合体（Sigma Chemical Co.,St.Lo
uise,MO）を添加した。一晩インキュベートした後、マ
イクロタイタープレートを洗浄し、基質を添加し、吸光
度（OD）をELISAリーダ（Beckman Instruments）で読み
取った。Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). G
aither and Harley, Protides Biol.Fluids Proc.Collo
These assays were performed and screened for the production of human IgG and specific autoantibodies using established techniques described in q.33,413 (1985). To screen for human IgG production, 96-well microtiter plates were coated with limiting dilution of mouse serum. The plates were then washed and blocked, and a complex of goat anti-human IgG (gamma chain specific) and alkaline phosphatase (Sigma Chemical Co., St. Lo.
uise, MO). After overnight incubation, the microtiter plates were washed, the substrate was added and the absorbance (OD) was read on an ELISA reader (Beckman Instruments).

高度に精製したRo/SSAに有意に関するMamulaら、J.Ex
p.Med.86:1889（1986）に記載された標準抗Ro/SSA ELIS
Aを用いて、移植マウスの血清を、自己抗体に関してス
クリーニングした。Mamula et al., J. Ex for significance to highly purified Ro / SSA
Standard anti-Ro / SSA ELIS described in p.Med.86: 1889 (1986)
Using A, transplanted mouse sera were screened for autoantibodies.

関節免疫蛍光抗核抗体。SLE、原発性胆汁性肝硬変、
通常、のヒトの血清、移植マウスの血清を、NOVA Lite
ANA（INOVA DIAGNOSTICS,Inc.,San Diego,CA）を用い、
Hep−２細胞上の抗核抗体に関して分析した。血清サン
プルを希釈し、50−75μｌをそれぞれの基質スライドガ
ラスに塗った。室温で30分間加湿したチャンバー内でイ
ンキュベートした後、スライドをPBSで完全に洗浄し
た。ヤギの抗ヒトIgGガンマ鎖特異的FITC複合体（Sigma
Chemical Co.,St.Louis,MO）を1:7500の希釈率で添加
し、室温で30分間インキュベートした。その後、スライ
ドガラスをPBSで洗浄し、蛍光顕微鏡で免疫蛍光染色を
可視化した。Joint immunofluorescent antinuclear antibody. SLE, primary biliary cirrhosis,
Normally, human serum, transplanted mouse serum, NOVA Lite
Using ANA (INOVA DIAGNOSTICS, Inc., San Diego, CA)
Analyzed for antinuclear antibodies on Hep-2 cells. Serum samples were diluted and 50-75 μl were spread on each substrate slide. After incubation in a humidified chamber at room temperature for 30 minutes, the slides were washed thoroughly with PBS. Goat anti-human IgG gamma chain-specific FITC complex (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO) was added at a dilution of 1: 7500 and incubated at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the slide glass was washed with PBS, and immunofluorescence staining was visualized with a fluorescence microscope.

C.B−17 SCIDマウスに、滅菌したヒト末梢血単核細胞
を様々な濃度で腹腔内注入した。末梢血単核細胞は、全
身性エリテマトーデス（SLE）と臨床診断され、Ro（SS
A）およびLa（SSB）に対して沈澱する抗体を有する標準
患者から単離した。この患者は以前の臨床研究では、斑
点のある核パターンを有する1:32 40の力価の陽性ANAで
あることが証明されていた。性別および年齢の一致した
普通の対照を選定し、同数の末梢血単核細胞をSCIDマウ
スに腹腔内注入した。この対照の個体は、リウマチ性疾
患の臨床的兆候も症状を示さず、Ro（SSA）に対してもL
a（SSB）に対しても沈澱する自己抗体を有さず、そして
免疫蛍光による陰性ANAを有していた。1:12,960の力価
で陽性の免疫蛍光抗ミトコンドリア染色パターンを有す
る原発性胆汁性肝硬変を有する患者からの、末端血液単
核細胞を同様に単離し、続いてこれを、SCIDマウスに注
入した。CB-17 SCID mice were injected intraperitoneally with sterile human peripheral blood mononuclear cells at various concentrations. Peripheral blood mononuclear cells are clinically diagnosed with systemic lupus erythematosus (SLE) and Ro (SS
Isolated from standard patients with antibodies that precipitate against A) and La (SSB). This patient had been shown in previous clinical studies to be positive ANA with a titer of 1: 3240 with a speckled nuclear pattern. Gender and age matched normal controls were selected and the same number of peripheral blood mononuclear cells were injected intraperitoneally into SCID mice. This control individual had no clinical signs or symptoms of rheumatic disease and also had low L (SSA) against Ro (SSA).
It also had no autoantibodies that precipitated against a (SSB) and had negative ANA by immunofluorescence. Terminal blood mononuclear cells from patients with primary biliary cirrhosis with a positive immunofluorescent anti-mitochondrial staining pattern at a titer of 1: 12,960 were similarly isolated and subsequently injected into SCID mice.

ヒトの細胞の移植およびそれらに続く抗体産生をモニ
ターするために、移植マウス（ヒト単核細胞を腹腔内注
入したマウス）を、注入から14週間後に採血し、ヒトIg
Gの産生に関してELISAを用いて血清をスクリーニングし
た。正常なヒト単核細胞を注入した４匹のマウスのうち
２匹は、ELISAによるIgGスクリーニングで陽性であっ
た。これら２匹には、50x10⁶細胞を注入していた。5x10
⁶および1x10⁶の単核細胞を注入した２匹のマウスは、ヒ
トIgGを示さなかった。同様に、４匹のSLEマウスのうち
２匹（50x10⁶）は、ヒトIgGの産生を示し、他の２匹
は、ELISA活性を示さなかった。SLE患者からのヒト血清
は、移植マウスに見られる活性の約100倍の活性を示
し、一方、免疫前または偽処理（塩水注入）したマウス
は活性が無かった。移植マウスを21週目に、採血する
と、安定したヒトIgGのレベルを示した。To monitor the transplantation of human cells and subsequent antibody production, transplanted mice (mice injected intraperitoneally with human mononuclear cells) were bled 14 weeks after injection and human Ig
Serum was screened using ELISA for G production. Two of the four mice injected with normal human mononuclear cells were positive for IgG screening by ELISA. These two had been injected with 50 × 10⁶ cells. 5x10
Two mice injected with⁶ and 1 × 10⁶ mononuclear cells showed no human IgG. Similarly, two of the four SLE mice (50 × 10⁶ ) showed production of human IgG and the other two showed no ELISA activity. Human sera from SLE patients showed approximately 100 times the activity seen in transplanted mice, whereas pre-immune or mock-treated (saline-injected) mice had no activity. Transplanted mice were bled at 21 weeks and showed stable human IgG levels.

移植マウスの血清で間接免疫蛍光観察を行い、抗核抗
体および抗細胞質抗体の存在に関するスクリーニングを
行った。ヒトIgGのスクリーニングアッセイで陽性であ
った２匹のSLE移植マウスのうち、50x10⁶細胞を注入し
た１匹は、陽性の斑点のある核染色パターンを呈し、一
方、偽処理したマウスは、免疫蛍光を示さなかった。し
かし、25x10⁶細胞を注入したSLEマウスは、陽性の免疫
蛍光を示さなかった。Indirect immunofluorescence observations were performed on the sera of the transplanted mice to screen for the presence of antinuclear antibodies and anticytoplasmic antibodies. Of the two SLE-transplanted mice that were positive in the human IgG screening assay, one injected with 50 × 10⁶ cells exhibited a positive, speckled nuclear staining pattern, while the sham-treated mice exhibited immunofluorescence. Did not show. However, SLE mice injected with 25 × 10⁶ cells did not show positive immunofluorescence.

原発性胆汁性肝硬変の患者からの50x10⁶細胞で再構成
したSCIDマウスの血清も、抗核抗体に関して試験した。
この血清は、患者のものと同様に、核物質の染色を示さ
ない分散した細胞質染色パターンを示した。SCID mouse sera reconstituted with 50 × 10⁶ cells from patients with primary biliary cirrhosis were also tested for antinuclear antibodies.
This serum showed a diffuse cytoplasmic staining pattern similar to that of the patient, showing no staining of nuclear material.

これらの再構成したSCIDマウス内での抗体応答をさら
に調べるために、ELISAを行って、抗Ro/SSAおよび抗La/
SSBの存在をテストした。再び、SLE移植（50x10⁶）マウ
スは、10^-2の血清希釈率でのELISAでの陽性の免疫反応
性を示した。他のSLE移植マウス、正常なボランティア
で移植したマウス、免疫前マウス、の血清あるいは偽処
理したマウスのいづれもが、反応性を示さなかった。To further examine the antibody response in these reconstituted SCID mice, ELISA was performed to identify anti-Ro / SSA and anti-La /
Tested the existence of SSB. Again, SLE-transplanted (50 × 10⁶ ) mice showed positive immunoreactivity by ELISA at a serum dilution of 10⁻² . Neither other SLE-transplanted mice, mice transplanted with normal volunteers, pre-immune mice, nor sera or sham-treated mice showed reactivity.

この免疫反応性の特異性を確認するために、SLE移植
マウス血清を、精製したウシのRo（SSA）およびヒトのR
o（SSA）とインキュベートした。続いて、サンプルをEL
ISAで分析し、応答が完全に阻害可能であることが示さ
れた。これにより、抗体のRo（SSA）抗原への結合の特
異性が確認できた。To confirm the specificity of this immunoreactivity, SLE-transplanted mouse sera were purified from purified bovine Ro (SSA) and human R
Incubated with o (SSA). Next, sample EL
Analysis by ISA showed that the response could be completely inhibited. This confirmed the specificity of the binding of the antibody to the Ro (SSA) antigen.

上記の発明の詳細な説明より、本発明による方法およ
び組成物の修正および変形は当業者にとって自明であ
る。そのような修正および変形は、以下の請求の範囲に
含まれるものとする。From the above detailed description of the invention, modifications and variations of the methods and compositions according to the present invention will be obvious to those skilled in the art. Such modifications and variations are intended to fall within the scope of the following claims.

フロントページの続き (72)発明者 ハーレイ，ジョン ビー. アメリカ合衆国 オクラホマ 73103, オクラホマ シティ，エヌ．ダブリュ ー．トウェンティース ストリート 439 (56)参考文献 Ｃｅｌｌ，34（３）ｐ．837−845 （1983) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98Continued on the front page (72) Inventor Harley, John B. Oklahoma 73103, Oklahoma City, N. USA. Wow. Twenties Street 439 (56) Reference Cell, 34 (3) p. 837-845 (1983) (58) Fields investigated (Int. Cl.⁷ , DB name) G01N 33/48-33/98

Claims (10)

Translated fromJapanese

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims]【請求項１】自己抗体の産生により特徴付けられる疾患
中の病因性物質または免疫原性物質を決定する方法であ
って： 自己抗体群が結合した抗原を同定する工程； 該自己抗体と反応する該抗原の配列を同定する工程； 該抗原の配列とタンパク質のアミノ酸配列とを比較する
ことにより、潜在的な免疫原を、該抗原と相同な配列の
２つあるいはそれ以上の領域を含有するタンパク質とし
て同定する工程；および 該抗原と該潜在的な免疫原との間の相同領域を、該自己
抗体との反応に基づく抗原性と関連付ける工程； を包含する、方法。1. A method for determining a pathogenic or immunogenic substance in a disease characterized by the production of an autoantibody, comprising: identifying an antigen to which an autoantibody group has bound; reacting with the autoantibody Identifying the sequence of the antigen; comparing the sequence of the antigen with the amino acid sequence of the protein to convert a potential immunogen into a protein containing two or more regions of sequence homologous to the antigen And associating a region of homology between the antigen and the potential immunogen with antigenicity based on a reaction with the autoantibody.【請求項２】前記抗原と潜在的な免疫原との間の相同領
域を、抗原性と関連付けるために、20個以下のアミノ酸
の前記抗原のオーバーラップペプチドを合成し、該オー
バーラップペプチドを前記自己抗体と反応させることに
よって抗原性を決定する、請求項１に記載の方法。2. Synthesizing an overlapping peptide of the antigen of 20 amino acids or less to associate the homologous region between the antigen and a potential immunogen with antigenicity, The method according to claim 1, wherein the antigenicity is determined by reacting with an autoantibody.【請求項３】前記自己抗体が、抗Ro/SSAであり、前記抗
原が、Ro/SSAであり、そして前記潜在的免疫原が、水疱
性口内炎ウイルスタンパク質である、請求項１に記載の
方法。3. The method of claim 1, wherein said autoantibody is anti-Ro / SSA, said antigen is Ro / SSA, and said potential immunogen is vesicular stomatitis virus protein. .【請求項４】さらに、抗原を単離する工程を包含し、該
抗原が、免疫グロブリン、抗原特異性Ｂ細胞表面レセプ
ター、および抗原特異性Ｔ細胞レセプターから成る群か
ら選択される自己抗体との反応によって、自己免疫疾患
を有する患者からの自己抗体と結合する、請求項１に記
載の方法。4. The method of claim 1, further comprising the step of isolating the antigen with an autoantibody selected from the group consisting of immunoglobulins, antigen-specific B cell surface receptors, and antigen-specific T cell receptors. 2. The method of claim 1, wherein the reaction binds to an autoantibody from a patient with an autoimmune disease.【請求項５】さらに、前記潜在的免疫原の領域の抗原性
を決定するために、20個以下のアミノ酸から成る前記潜
在的免疫原のアミノ酸配列を合成する工程を包含する、
請求項１に記載の方法。5. The method according to claim 5, further comprising the step of synthesizing an amino acid sequence of said potential immunogen of 20 amino acids or less to determine the antigenicity of said region of said potential immunogen.
The method of claim 1.【請求項６】請求項１に記載の方法であって、以下の基
準に基づいて前記抗原の領域を分類する工程をさらに包
含する、方法： 自己抗体との反応により決定される抗原性および前記潜
在的免疫原との相同性を有すること、 自己抗体との反応により決定される抗原性を有するが前
記潜在的免疫原との相同性は有さないこと、 前記潜在的免疫原との相同性は有するが抗原性は有さな
いこと、ならびに 前記潜在的免疫原との相同性も前記自己抗体との反応性
も有さないこと。6. The method of claim 1, further comprising the step of classifying said antigenic region based on the following criteria: antigenicity determined by reaction with autoantibodies and said antigenicity. Having homology with a potential immunogen, having antigenicity determined by reaction with an autoantibody, but having no homology with the potential immunogen, homology with the potential immunogen Has no antigenicity, and has no homology with the potential immunogen nor reactivity with the autoantibody.【請求項７】請求項１に記載の方法であって、以下の基
準に基づいて前記潜在的免疫原の領域を分類する工程を
さらに包含する、方法： 抗体との反応により決定される抗原性および前記抗原と
の相同性を有すること、 抗体との反応により決定される抗原性を有するが前記抗
原との相同性は有さないこと、 前記抗原との相同性は有するが抗原性は有さないこと、
ならびに 前記抗原との相同性も前記抗体との反応性も有さないこ
と。7. The method of claim 1, further comprising the step of classifying the region of the potential immunogen based on the following criteria: Antigenicity determined by reaction with an antibody And having homology with the antigen, having antigenicity determined by a reaction with an antibody but not having homology with the antigen, having homology with the antigen but having antigenicity Not that
And have neither homology with the antigen nor reactivity with the antibody.【請求項８】前記抗原との相同領域、および自己抗体と
の反応性に基づく抗原性が、ウイルス、ウイロイド、細
菌、リケッチアおよび菌類から成る群から選択される感
染性物質によって発現された、または発現を誘起された
タンパク質中に見られるものであり、さらに、該感染性
物質からの他のタンパク質を別の自己抗体と反応させる
工程を包含する、請求項１に記載の方法。8. The antigenic region based on the homology with the antigen and the reactivity with an autoantibody is expressed by an infectious agent selected from the group consisting of a virus, a viroid, a bacterium, a rickettsia and a fungus, or 2. The method of claim 1, wherein the method is found in a protein whose expression has been induced and further comprises reacting another protein from the infectious agent with another autoantibody.【請求項９】前記自己抗体が、免疫グロブリン、抗原特
異性Ｂ細胞表面レセプター、および抗原特異性Ｔ細胞レ
セプターの群から選択される、請求項１に記載の方法。9. The method of claim 1, wherein said autoantibodies are selected from the group of immunoglobulins, antigen-specific B cell surface receptors, and antigen-specific T cell receptors.【請求項１０】前記疾患が、宿主の体の成分と反応する
抗体の産生により特徴付けられる疾患、循環している自
己抗体の存在と関連した症状の発現により特徴付けられ
る疾患、および感染性物質またはその一部に対する免疫
応答に関連した免疫システムの疾患、の群から選択され
る、請求項１に記載の方法。10. The disease, wherein the disease is characterized by the production of antibodies reactive with components of the host body, diseases characterized by the manifestation of symptoms associated with the presence of circulating autoantibodies, and infectious agents. Or a disease of the immune system associated with an immune response to a part thereof.