【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は植物細胞の遺伝的修飾方
法に関する。The present invention relates to a method for genetically modifying plant cells.
【０００２】[0002]
【従来の技術】シャトルベクター RuvkunとAusubel（1981）Nature298：85ー88、により
開発されたシャトルベクターは、外来遺伝物質を、大プ
ラスミド、ウイルスまたはゲノムの選ばれた位置に挿入
する方法を可能とする。大プラスミド又はゲノムを扱う
場合、２つの主要な問題がある。１つは大プラスミド
が、各制限酵素に対して多くの部位を有することであ
る。特定の部位特異的切断反応は再現性がなく、多部位
切断反応とそれに続く連結は、変化させたくない多くの
フラグメントの順序および方向を混乱させる大きな難点
を生ずる。第２に大ＤＮＡプラスミドを用いた形質転換
効率は非常に低い。シャトルベクターは、しばしばイン
ビトロで、外来遺伝物質を小プラスミドに容易に挿入
し、次に通常インビボ技術により、大プラスミドに移す
ことにより、これらの困難を打開することが可能であ
る。BACKGROUND OF THE INVENTION Theshuttle vector , developed by theshuttle vectors Ruvkun and Ausubel (1981) Nature298 : 85-88, allows the insertion of foreign genetic material into a large plasmid, virus or genome at selected locations. And When dealing with large plasmids or genomes, there are two major problems. One is that large plasmids have many sites for each restriction enzyme. Certain site-specific cleavage reactions are not reproducible, and multisite cleavage reactions and subsequent ligation create major difficulties that disrupt the order and orientation of many fragments that you do not want to change. Second, the transformation efficiency with large DNA plasmids is very low. Shuttle vectors can overcome these difficulties by easily inserting foreign genetic material into small plasmids, often in vitro, and then transferring them to large plasmids, usually by in vivo techniques.
【０００３】シャトルベクターは、究極の受容細菌へ導
入され得る通常プラスミドである、ＤＮＡ分子より成
る。それはまた、外来遺伝物質が挿入され得る受容ゲノ
ムのフラグメントのコピーと、これもまた受容ゲノムフ
ラグメントに挿入される選択形質をコードするＤＮＡセ
グメントを含む。選択形質（"マーカー"）は、トランス
ポソン突然変異誘発または制限酵素とリガーゼにより容
易に挿入される。[0003] Shuttle vectors consist of DNA molecules, usually plasmids, which can be introduced into the ultimate recipient bacterium. It also contains a copy of a fragment of the recipient genome into which foreign genetic material can be inserted, and a DNA segment encoding a selection trait that is also inserted into the recipient genomic fragment. Selection traits ("markers") are easily inserted by transposon mutagenesis or restriction enzymes and ligases.
【０００４】該シャトルベクターは究極受容細胞、典型
的にはアグロバクテリウム属の細菌ヘ三親交雑（Ruvkun
とAusubel 、前出）、二親交雑での自己可動性ベクター
の直接移送、アグロバクテリウム細胞による外部ＤＮＡ
の直接取込み（M.Holsterset al.（1978）Molec. Gen.
Genet.163：181-187 の条件を用いる"形質転換"）、他
の細菌細胞とアグロバクテリウムのスフェロプラスト融
合、リポソーム包括ＤＮＡの取込み、またはインビトロ
でパッケージ可能なウイルス上にあるシャトルベクター
の感染、により導入される。三親交雑はプラスミド可動
と接合移送に関する遺伝子を有する可動性プラスミドを
有する菌株とシャトルベクターを有する菌株との交雑を
含む。もしシャトルベクターがプラスミド遺伝子により
移動可能ならば、そのシャトルベクターは大ゲノム、例
えばアグロバクテリウム菌株のTiまたはRiプラスミドを
有する受容細胞へ移される。[0004] The shuttle vector is a triparental hybrid (Ruvkun) to the ultimate recipient cell, typically a bacterium of the genus Agrobacterium.
And Ausubel, supra), direct transfer of self-moving vectors in two-parent crosses, external DNA by Agrobacterium cells.
(M. Holsterset al . (1978) Molec. Gen.
Genet.163 : "Transformation" using the conditions of 181-187), spheroplast fusion of Agrobacterium with other bacterial cells, incorporation of liposome-encapsulated DNA, or transfer of a shuttle vector on a virus that can be packaged in vitro. Infected, introduced by. Triparental crossing involves crossing a strain with a mobile plasmid with genes for plasmid mobility and conjugative transfer with a strain with a shuttle vector. If the shuttle vector is transferable by a plasmid gene, the shuttle vector is transferred to a recipient cell having a large genome, for example, a Ti or Ri plasmid of an Agrobacterium strain.
【０００５】シャトルベクターが受容細胞へ導入された
後、マーカーのいずれか一方の側での１回の組換えを伴
う二重乗換えが期待される。この現象はマーカーを含む
ＤＮＡセグメントを受容ゲノムへ移し、挿入物を欠く相
同セグメントと置換し得る。元のシャトルベクターを欠
失した細胞を選択する為に、そのシャトルベクターは究
極受容細胞中で複製が不可能であるか、受容細胞に既存
の独立に選択可能なプラスミドと不和合性でなければな
らない。この為の１つの共通的な手段は、シャトルベク
ターと不和合性でかつ他の薬剤耐性マーカーを有する他
のプラスミドを第３の親に備えることである。[0005] After the shuttle vector has been introduced into the recipient cell, a double cross-over with one recombination on either side of the marker is expected. This phenomenon can transfer the DNA segment containing the marker to the recipient genome and replace it with a homologous segment lacking the insert. To select cells that have deleted the original shuttle vector, the shuttle vector must be either incapable of replicating in the ultimate recipient cell or incompatible with an existing independently selectable plasmid in the recipient cell. No. One common means for this is to provide a third parent with another plasmid that is incompatible with the shuttle vector and has other drug resistance markers.
【０００６】従って両薬剤耐性で選択すると、生存細胞
はその中でシャトルベクターのマーカーが受容ゲノムと
組換えを起こしたもののみである。もしシャトルベクタ
ーが余分のマーカーを持っていれば、シャトルベクター
と受容プラスミド間での１回の乗換えの結果生じる完全
なシャトルベクターが受容プラスミドに組み込まれたも
のを有する細胞を選択し、排除できる。もし外来遺伝物
質が選択しようとするマーカー内か、近接した位置に挿
入されていれば、同じ二重組換の結果、それは受容プラ
スミドに組み込まれ得る。相同フラグメントのマーカー
内または近接した位置でなく、外来遺伝物質がマーカー
から遠く離れて挿入されている場合、外来遺伝物質とマ
ーカーの間で組換えが起こり、外来遺伝物質を移せない
ことも起こるだろう。[0006] Thus, when selected for both drug resistances, the only viable cells are those in which the shuttle vector marker has recombined with the recipient genome. If the shuttle vector has an extra marker, cells having the complete shuttle vector integrated into the recipient plasmid as a result of a single transfer between the shuttle vector and the recipient plasmid can be selected and eliminated. If the foreign genetic material is inserted within the marker to be selected or at a nearby location, it can be incorporated into the recipient plasmid as a result of the same double recombination. If the exogenous genetic material is inserted far away from the marker, but not within or near the marker of the homologous fragment, recombination between the exogenous genetic material and the marker may result in the inability to transfer the exogenous genetic material. Would.
【０００７】シャトルベクターはアグロバクテリウムの
プラスミドの操作に有用であることが証明されている：
D.J.Garfinkeletal.（1981）Cell27：143-153, A.J.
M.Matzke and M.D.Chilton（1981）J.Molec.Appl.Gene
t.1：39-49、およびJ.Leemansetal.（1981）J.Male
c. Appl. Genet.1：149-164を参照のこと、そこではシ
ャトルベクターを"中間ベクター（intermedeate vector
s）"と呼んでいる。[0007] Shuttle vectors have proven useful in the manipulation of Agrobacterium plasmids:
DJ Garfinkeletal . (1981) Cell27 : 143-153, AJ
M. Matzke and MDChilton (1981) J. Molec. Appl. Gene
t.1 : 39-49, and J. Leemansetal . (1981) J. Male.
c. Appl. Genet.1 : 149-164, where the shuttle vector is referred to as an "intermedeate vector
s) ".
【０００８】アグロバクテリウム−概説 グラム陰性細菌、リゾビウム科のアグロバクテリウム属
には、アグロバクテリウム・チューメファシエンス（A.
tumefaciens）種とアグロバクテリウム・リゾゲネス
（A.rhizogenes）種がある。これらの種は夫々植物のク
ラウンゴール病、毛状根病（hairly root disease）の
原因となる。クラウンゴールは未分化組織の瘤（gall）
化に特徴付けられる。毛根は感染組織での異常な根（ル
ート）の誘導により特徴付けられる奇形腫である。両病
において、異状な増殖植物組織は、植物により正常には
生産されない通常オピンとして知られている、１つまた
はそれ以上のアミノ酸誘導体を生産し、これは感染細菌
により異化される。既知のオピンは３族に分類され、そ
の典型的なメンバーはオクトピン、ノパリン、アグロピ
ンである。異常増殖組織の細胞は培養により増殖可能で
あり、また適当な条件下で形質転換した表現型を保ちつ
つ完全な植物に再生される。Agrobacterium-Overview A gram-negative bacterium, the genus Agrobacterium of the family Rhizobium, includes Agrobacterium tumefaciens (A.
tumefaciens ) and Agrobacterium rhizogenes (A. rhizogenes). These species cause crown gall disease and hairy root disease in plants, respectively. Crown gall is a gall of undifferentiated tissue
Is characterized by Hair roots are teratomas characterized by the induction of abnormal roots in infected tissues. In both diseases, abnormally growing plant tissue produces one or more amino acid derivatives, commonly known as opines, that are not normally produced by plants, which are catabolized by infecting bacteria. Known opines are classified into three families, typical members of which are octopine, nopaline, and agropine. The cells of the overgrown tissue can be grown in culture and, under appropriate conditions, regenerate into a complete plant while maintaining the transformed phenotype.
【０００９】アグロバクテリウムのヴィルレント株はア
グロバクテリウム・チューメファシエンスではTi（腫瘍
誘導；Tumor-inducing）プラスミド、アグロバクテリウ
ム・リゾゲネスではRi（ルート誘導；root- inducing）
プラスミドと呼ばれる大プラスミドを有する。これらの
プラスミドを菌から消去すると病原性を失う。Tiプラス
ミドはＴ−ＤＮＡ（転移ＤＮＡ）と呼ばれる、腫瘍では
宿主植物のゲノム中に組み込まれている領域を含む。Ｔ
−ＤＮＡは数種の転写物をコードしている。突然変異の
研究からこれらのうちのいくつかは腫瘍の増殖の誘導に
関与していることが示された。tml、tmrおよびtms遺伝
子の変異は夫々巨大腫瘍（タバコで）、ルート出現傾
向、シュート誘発傾向を示す。Ｔ−ＤＮＡはまた少なく
とも１つのオピンシンセターゼ遺伝子をコードし、Tiプ
ラスミドは、しばしば、それが合成し得るオピンにより
分類される。各Ｔ−ＤＮＡ遺伝子はＴ−ＤＮＡプロモー
ターの支配下にある。このＴ−ＤＮＡプロモーターは真
核生物のプロモーターに構造が類似しており、形質転換
植物細胞でのみ機能するらしい。TiプラスミドはまたＴ
−ＤＮＡ領域外にも遺伝子を担っている。これらの遺伝
子はオピン異化、発癌性、アグロシン感受性、複製、細
菌細胞への自己輸送の機能に関与している。Riプラスミ
ドはTiプラスミドと類似の構造をとっている。植物細胞
の形質転換に関与する一連の遺伝子とＤＮＡ配列は、以
下では形質転換誘導因子（ＴＩＰ）として総合的に呼
ぶ。従ってＴＩＰの名称はTiおよびRiプラスミド両者を
包含する。ＴＩＰの取り込まれたセグメントを、ここで
はＴ−ＤＮＡと称し、TiプラスミドあるいはRiプラスミ
ドに由来している。最近のアグロバクテリウム起因病の
一般的総説はD.J.Marlo(1982)、Adv. Plant Pathol.
1：139-178、L.W.Ream and M.P.Gordon（1982）、Scien
ce218：854-859,および M.W.Bevan and M.D.Chilton
（1982）、Ann.Reb.Genet.16：357-384; G.Kahl and
J.Schell（1982）MolecularBiologyofPlantTumorsに
述べられている。Agrobacterium virulent strains are Ti (Tumor-inducing) plasmid in Agrobacterium tumefaciens and Ri (root-inducing) in Agrobacterium rhizogenes.
It has a large plasmid called a plasmid. Elimination of these plasmids from the bacteria results in loss of pathogenicity. The Ti plasmid contains a region called T-DNA (transferred DNA), which in tumors is integrated into the genome of the host plant. T
-DNA encodes several transcripts. Mutation studies have shown that some of these are involved in inducing tumor growth. Mutations in thetml ,tmr andtms genes areindicative of large tumors (in tobacco), prone to root emergence, and prone to shoot induction, respectively. T-DNA also encodes at least one opin synthetase gene, and Ti plasmids are often categorized by the opin they can synthesize. Each T-DNA gene is under the control of a T-DNA promoter. This T-DNA promoter is similar in structure to eukaryotic promoters and appears to function only in transformed plant cells. The Ti plasmid also
-Carrying a gene outside the DNA region. These genes are involved in the functions of opine catabolism, carcinogenesis, agrosine sensitivity, replication, and self-transport to bacterial cells. The Ri plasmid has a similar structure to the Ti plasmid. A series of genes and DNA sequences involved in the transformation of plant cells are collectively referred to below as transformation inducers (TIP). Thus, the name of TIP includes both Ti and Ri plasmids. The segment in which TIP has been incorporated is referred to herein as T-DNA and is derived from the Ti plasmid or Ri plasmid. A general review of recent Agrobacterium-induced diseases can be found in DJ Marlo (1982), Adv. Plant Pathol.
1 : 139-178, LWReam and MPGordon (1982), Scien
ce218 : 854-859, and MWBevan and MDChilton
(1982) Ann. Reb. Genet.16 : 357-384; G. Kahl and
J. Schell (1982)Molecular BiologyofPlantTumors .
【００１０】アグロバクテリウム−植物組織の感染 植物細胞は既知の多くの方法によりアグロバクテリウム
により形質転換され得る；例えば植物細胞とアグロバク
テリウムとの共存培養；植物の直接感染；植物プロトプ
ラストとアグロバクテリウムスフェロプラストの融合；
植物細胞プロトプラストによる遊離ＤＮＡの取込みによ
る直接形質転換；部分的に細胞壁を再生しているプロト
プラストの完全な細菌による形質転換；プロトプラスト
のＴ−ＤＮＡ含有リポソームによる形質転換；Ｔ−ＤＮ
Ａを保持するウイルスの利用；ミクロインジェクション
等。いずれの方法も遺伝子が確実に発現される限り充分
であり、有糸分裂および減数分裂を通じて安定に伝達さ
れる。Agrobacterium-Infected Plant Tissue Plant cells can be transformed by Agrobacterium in a number of known ways; for example, co-culture of plant cells with Agrobacterium; direct infection of plants; plant protoplasts and agro Fusion of bacterial spheroplasts;
Direct transformation by incorporation of free DNA by plant cell protoplasts; transformation of protoplasts partially regenerating cell walls by complete bacteria; transformation of protoplasts by liposomes containing T-DNA; T-DN
Use of virus retaining A; microinjection and the like. Either method is sufficient as long as the gene is expressed reliably and is stably transmitted through mitosis and meiosis.
【００１１】植物組織のアグロバクテリウムによる感染
は、当業者には公知の単純な技術である（例えばD.N.Bu
tcheretal.（1980）inTissueCultureMethodsfor
PlantPathologists, eds.：D.S.Ingrams and J.P.Helg
eson、pp.203-208 参照）。植物は種々のどの方法によ
っても傷つけられる、例えば刃で切る、針で穴をあけ
る、あるいは研磨剤で摺るなど。次いで傷口を腫瘍誘導
細菌を含む溶液で感染させる。完全な植物を感染させる
他の方法はジャガイモの塊茎小片（D.K.Anand and G.T.
Herberlein（1977）Amer.J.Bot.64：153-158）または
タバコ茎の断片（Binnsetal.）などの組織の小片を植
えつけることである。誘導後、腫瘍は植物ホルモンを含
まない培地で組織培養され得る。ホルモン非依存性増殖
は形質転換植物組織の典型であり、培養組織の増殖の通
常の条件とは大いに対照的である（A.C.Braun（1956）C
ancer Res.16：53-56）。[0011] Infection of plant tissue with Agrobacterium is a simple technique known to those skilled in the art (eg DNBu).
tcheretal . (1980) inTissueCultureMethodsfor
PlantPathologists , eds .: DSIngrams and JPHelg
eson, pp. 203-208). Plants can be damaged by any of a variety of methods, such as cutting with a blade, piercing with a needle, or rubbing with an abrasive. The wound is then infected with a solution containing tumor-inducing bacteria. Another method to infect complete plants is to use potato tuber pieces (DK Anand and GT
Herberlein (1977) Amer. J. Bot.64 : 153-158) or a piece of tissue such as a fragment of tobacco stem (Binnsetal .). After induction, the tumor can be tissue cultured in a medium free of plant hormones. Hormone-independent growth is typical of transformed plant tissues and is in sharp contrast to the normal conditions of growth of cultured tissues (ACBraun (1956) C
ancer Res.16 : 53-56).
【００１２】アグロバクテリウムはまた単離細胞および
培養細胞（Martonetal.（1979）Nature277：129-13
1）、および単離したタバコ葉肉プロトプラストを感染
し得る。後者の技術では、新しい細胞壁を一部再生させ
る時間をおいた後、一定時間の間アグロバクテリウム細
胞を培養に加え、次いで抗生物質を添加し殺した。Tiプ
ラスミドを保持するアグロバクテリウム・テューメファ
シエンス細胞に接触した細胞のみが、ホルモンを含まな
い培地にプレートしたとき、カルスを形成した。大部分
のカルスはオピン同化に関する酵素活性を有していた。
他の研究者（R.B.Horsch and R.T.Fraley（18 January
1983 15th Miami Winter Symposium）は共存培養によ
り、形質転換しホルモン非依存性増殖するカルスを高頻
度（10％以上）で得、カルスの95％がオピンを作った。
M.R.Daveyetal.（1980）in Ingram and Helgeson、前
出、pp.209-219、は、プロトプラスから再生した老細胞
の感染について述べている。Agrobacterium has also been isolated and cultured (Martonetal . (1979) Nature277 : 129-13).
1), and isolated tobacco mesophyll protoplasts. In the latter technique, Agrobacterium cells were added to the culture for a period of time after a period of partial regeneration of the new cell wall, and then antibiotics were added and killed. Only cells that contacted Agrobacterium tumefaciens cells carrying the Ti plasmid formed calli when plated on hormone-free medium. Most calli had enzymatic activity for opine assimilation.
Other researchers (RBHorsch and RTFraley (18 January
1983 15th Miami Winter Symposium) transformed and produced hormone-independently growing calli at high frequency (over 10%) by co-culture, and 95% of the calli produced opine.
MRDaveyetal . (1980) in Ingram and Helgeson, supra, pp. 209-219, describes infection of renal cells regenerated from protoplasts.
【００１３】植物プロトプラストは、ＴＩＰプラスミド
の直接取込みにより形質転換され得る。M.R.Daveyeta
l.（1980）Plant Sci.Lett.18：307-313,およびM.R.Dav
eyetal.（1980）in Ingram and Helgeson、前出、
は、ペチュニアのプロトプラストをポリ-Ｌ-α-オルニ
チン存在下でTiプラスミドで形質転換し、培養によりオ
ピン合成とホルモン非依存性増殖の表現型を示した。そ
の後、ポリエチレングリコールがTi取込みを促進し、特
定のＴ−ＤＮＡ配列がゲノムに取り込まれることが示さ
れた。（J.Draperetal.（1982）Plant and Cell Phys
iol.23：451-458、M.R.Daveyetal.（1982）inPlant
TissueCulture 1982、ed：A.Fujiwara、pp.515-51
6）。F.A.Krens et al.（1982）Nature296：72-74、は
同様の結果をポリエチレングリコール次いでカルシウム
ショックによる方法で報告したが、彼らの結果では取り
込まれたＴ−ＤＮＡはTiプラスミド配列の近接部分を含
んでいた。[0013] Plant protoplasts can be transformed by direct uptake of the TIP plasmid. MRDaveyeta
l . (1980) Plant Sci. Lett.18 : 307-313, and MRDav
eyetal . (1980) in Ingram and Helgeson, supra,
Transformed petunia protoplasts with the Ti plasmid in the presence of poly-L-α-ornithine and showed a phenotype of opin synthesis and hormone-independent growth upon culture. Subsequently, polyethylene glycol was shown to promote Ti incorporation and specific T-DNA sequences were incorporated into the genome. (J. Draperetal . (1982) Plant and Cell Phys
iol.23 : 451-458, MRDaveyetal . (1982) inPlant
TissueCulture 1982, ed: A. Fujiwara, pp.515-51
6). FAKrens et al. (1982) Nature296 : 72-74 reported similar results by the method of polyethylene glycol followed by calcium shock, in which the incorporated T-DNA contained a contiguous portion of the Ti plasmid sequence. Was out.
【００１４】ＤＮＡを取り込ませる他の方法にリポソー
ムの使用がある。ＤＮＡ含有リポソームの調製は、Papa
hadjopoulosの米国特許第4,078,052号と第4,235,871号
にある。Ti−ＤＮＡをリポソームによる導入する方法が
報告されている（T.Nagataetal.（1982）in Fujiwar
a、前出、pp.509-510、および T.Nagata（1981）Mol.Ge
n.Genet.184：161-165）。類似の系に細胞壁を除去した
植物と細菌の細胞の融合がある。この技術の例は S.Has
ezawaetal.（1981）Mol. Gen. Genet.182：206-210に
より報告されているアグロバクテリウムのスフェロプラ
ストによるツルニチニチソウ（Vinca）の形質転換であ
る。植物プロトプラストは細胞壁が不完全なアグロバク
テリウム細胞を取り込むことができる（S.Hasezawaet
al.（1982）in Fujiwara、前出、pp.517-518）。Another method of incorporating DNA involves the use of liposomes. Preparation of DNA-containing liposomes
In hadjopoulos U.S. Pat. Nos. 4,078,052 and 4,235,871. A method for introducing Ti-DNA using liposomes has been reported (T. Nagataetal . (1982) in Fujiwar).
a, supra, pp. 509-510, and T. Nagata (1981) Mol. Ge
n.Genet.184 : 161-165). A similar system is the fusion of plant and bacterial cells with cell walls removed. An example of this technology is S. Has
Ezawaetal . (1981) Transformation of periwinkle (Vinca) with spheroplasts of Agrobacterium reported by Mol. Gen. Genet.182 : 206-210. Plant protoplasts can take up Agrobacterium cells with imperfect cell walls (S. Hasezawaet al.
al . (1982) in Fujiwara, supra, pp. 517-518).
【００１５】Ｔ−ＤＮＡは２つのプロトプラストの融合
による再生した組織に移り、一方のみが形質転換される
（G.J.Wullems et al.（1980）Theor. Appl.Genet.56：
203-208）。植物の再生の項で詳しく述べるように、Ｔ
−ＤＮＡは減数分裂でも伝わり、単純なメンデル法則に
従って子孫に伝達される。T-DNA is transferred to regenerated tissue by fusion of two protoplasts, and only one is transformed (GJ Wullems et al. (1980) Theor. Appl. Genet.56 :
203-208). As detailed in the section on plant regeneration,
-DNA is also transmitted in meiosis and transmitted to progeny according to simple Mendelian law.
【００１６】アグロバクテリウム−植物の再生 正常な形態を有する分化植物組織がクラウンゴール腫瘍
から得られた。A.C.Braun and H.N.Wood（1976）Proc.N
atl.Acad.Sci. USA73：496-500、はタバコ奇形腫（ter
atomas）を正常な植物につぎ木し、正常に見える開花し
得るシュートを得た。このシュートは培地におくと、オ
ピン生成能と、植物ホルモン非依存増殖能を保持した。
選択された植物では、これら腫瘍表現型は子孫に伝達さ
れないようで、多分減数分裂の間に消失した（R.Turgeo
netal.（1976）Proc.Natl.Acad.Sci. USA73：3562-3
564 ）。自然に腫瘍の性質を失った、あるいは奇形腫の
種から生じた植物は、当初すべてのＴ−ＤＮＡを失った
ように思われていた（F.-M.Yangetal.（1980）In Vit
ro16：87-92, F.Yang et al.（1980）Molec.Gen.Gene
t.177：707-714、M.Lemmersetal.（1980）J.Mol.Bio
l.144：353-376）。しかし、ホルモン（１mg/l カイネ
チン）処理後復帰した植物を用いた後の研究で、減数分
裂を経た植物は形質転換表現型に関するＴ−ＤＮＡ遺伝
子は失っているが、Ｔ−ＤＮＡの両端に相同性のある配
列を維持していた（F.Yang and R.B.Simpson（1981）Pr
oc.Natl.Acad.Sci. USA78：4151-4155）。Agrobacterium-Plant Regeneration Differentiated plant tissue with normal morphology was obtained from crown gall tumors. ACBraun and HNWood (1976) Proc.N
atl.Acad.Sci. USA73 : 496-500, is a tobacco teratoma (ter
atomas) was planted to a normal plant to obtain a normal-looking flowering shoot. When placed in a medium, the shoot retained opin-producing ability and plant hormone-independent growth ability.
In selected plants, these tumor phenotypes did not appear to be transmitted to progeny and were probably lost during meiosis (R. Turgeo
.. n et al (1976) Proc.Natl.Acad.Sci USA 73: 3562-3
564). Plants that spontaneously lost tumor characteristics or resulted from teratoma seeds initially appeared to have lost all T-DNA (F.-M. Yangetal . (1980) In Vit.
ro16 : 87-92, F. Yang et al. (1980) Molec. Gen. Gene
t.177 : 707-714, M. Lemmersetal . (1980) J. Mol. Bio
l.144 : 353-376). However, in a study using plants reverted after treatment with hormone (1 mg / l kinetin), plants that had undergone meiosis lost the T-DNA gene associated with the transformed phenotype, but were homologous to both ends of T-DNA. (F. Yang and RBSimpson (1981) Pr
oc.Natl.Acad.Sci. USA78 : 4151-4155).
【００１７】G.J.Wullemsetal.（1981）Cell24：719
-724、はさらに、オピン同化に関する遺伝子が、その植
物は雄性不稔であるが、減数分裂を通して伝わること、
そしておそらくＴ−ＤＮＡはそのままメンデル法則に従
って遺伝し得ることを示した（G.Wullemsetal.（198
2）in A.Fujiwara、前出）。L.Ottenetal.（1981）Mo
lec.Gen.Genet.183：209-213、は、シュートを生じる腫
瘍生成にtms（シュート誘導）遺伝子座でのTn７トラン
スポソン起因のTiプラスミド変異を用いた。これらのシ
ュートが植物中で再生すると自己稔性花を生じた。着生
した種が発芽した植物はＴ−ＤＮＡを有しオピンを生成
した。tmr（ルート誘導）変異を用いた同様の実験で、
全Ｔ−ＤＮＡが減数分裂を通して子孫に伝わり、これら
子孫で、程度にバラツキがあるが、ノパリン遺伝子が発
現すること、また同時に伝達された酵母のアルコール脱
水素酵素Ｉ遺伝子は発現しないことが示された（K.A.Ba
rtonetal.（1983）Cell32：1033-1043）。Ｔ−ＤＮ
Ａ配列を欠く再生組織はおそらく腫瘍に混在していた非
形質転換細胞の子孫であるらしい（G.Oomsetal.（198
2）Cell30：589-597）。アグロバクテリウム・リゾゲ
ネスによる形質転換の結果生じたルートは比較的容易に
苗に再生することが示された。（M.-D.Chiltonetal.
（1982）Nature295：432-434）。GJ Wullemsetal . (1981) Cell24 : 719.
-724, furthermore, that the gene for opine assimilation is transmitted through meiosis, although the plant is male sterile,
It has been shown that probably T-DNA can be inherited as it is according to Mendelian law (G. Wullemsetal . (198
2) in A. Fujiwara, supra). L. Ottenetal . (1981) Mo
Lec. Gen. Genet.183 : 209-213, used a Ti plasmid mutation due to the Tn7 transposon at thetms (shoot induction) locus for tumor generation toproduce shoots. When these shoots regenerated in plants, they produced self-fertile flowers. The plants in which the settled seeds germinated had T-DNA and produced opin.In a similar experiment using thetmr (root-derived) mutation,
Total T-DNA is transmitted to progeny through meiosis, and in these progeny, to varying degrees, it is shown that the nopaline gene is expressed and that the co-transmitted yeast alcohol dehydrogenase I gene is not expressed. Ta (KABa
rtonetal . (1983) Cell32 : 1033-1043). T-DN
Regenerating tissues lacking the A sequence are likely progeny of non-transformed cells that were mixed in the tumor (G. Oomsetal . (198
2) Cell30 : 589-597). The route resulting from the transformation with Agrobacterium rhizogenes was shown to regenerate into seedlings relatively easily. (M.-D.Chiltonetal .
(1982) Nature295 : 432-434).
【００１８】アグロバクテリウム−TIP プラスミド上の
遺伝子 ＴＩＰプラスミドのＴ−ＤＮＡ内に多数の遺伝子が同定
された。約半ダースのオクトピンプラスミドＴ−ＤＮＡ
転写物がマッピングされ（S.B.Gelvinetal.（1982）P
roc.Natl.Acad.Sci. USA79：76-80、L.Willmitzeret
al.（1982）EMBO J.1：139-146）、またいくつかの機
能が明確にされた（J.Leemans et al.（1982）EMBO J.
1：147-152 ）。オクトピン型プラスミドの４つの遺伝
子がtms、tmr およびtmlを含むトランスポソン変異誘発
により充分明確になった（D.J.Garfinkeletal.（198
1）Cell27：143-153）。これらの遺伝子に変異をもつT
iプラスミドは、ニコチニア・タバカムの腫瘍カルスを
刺激し、シュートを生じ、ルートを生じ、そして正常よ
り大きくなる。他の宿主では、これら遺伝子の変異は、
異なった表現型を誘導し得る（Chilton, M.D. Ann.Rev.
Genet.（1982）参照）。tmsとtmrの表現型は、腫瘍に存
在する植物ホルモンレベルの差異と相関している。サイ
トカイニン：オーキシン比の相違は、非形質転換カルス
組織でシュートまたはルート形成を誘導する培養中のサ
イトカイン：オーキシン比の相違と類似している(D.E.
Akiyoshietal.（1983）Proc.Natl.Acad.Sci. USA8
0：407-411）。tmsまたはtmrどちらか一方のみの機能遺
伝子を持つＴ−ＤＮＡ（機能するtmlのみの場合ではな
いが）は、明白な腫瘍増殖を刺激し得る。シュートとル
ートの刺激は機能tmlにより夫々促進と阻害を受ける
（L.W.Reametal.（1983）Proc.Natl.Acad.Sci. USA8
0：1660-1664）。Ｔ−ＤＮＡ遺伝子の変異が植物ゲノム
へのＴ−ＤＮＡの挿入に影響することはないようである
（J.Leemansetal.（1982）同上；L.W.Reametal.（1
983）同上）。オクトピンシンセターゼをコードするocs
遺伝子はH.De Greveetal.（1982）J.Mol.Appl. Gene
t.1：499-511、により塩基配列が決定された。これはイ
ントロン（真核遺伝子に共通して見られる介在配列で転
写後ｍＲＮＡのプロセッシングの間にメッセンジャー前
駆体から除かれる）を有していない。また真核の転写シ
グナル（ＴＡＴＡボックス）とポリアデニル化部位があ
る。オクトピンシンセターゼを有する植物細胞はホモア
ルギニンを無毒化するので、ocs遺伝子は、外来ＤＮＡ
による形質転換された植物細胞の有効な選択マーカーと
なり得る（G.M.S.Van Slogterenetal.（1982）Plant
Mol.Biol.1：133-142）。[0018]On Agrobacterium-TIP plasmid
gene Many genes identified in T-DNA of TIP plasmid
Was done. About half a dozen octopine plasmid T-DNA
Transcripts are mapped (S.B.Gelvinet al. (1982) P
roc.Natl.Acad.Sci. USA79: 76-80, L. Willmitzeret
al. (1982) EMBO J.1: 139-146), and some machines
Function was clarified (J. Leemans et al. (1982) EMBO J.
1: 147-152). Four inheritances of octopine-type plasmids
Childtms,tmr andtmlTransposon mutagenesis containing
Became clearer (D.J.Garfinkelet al. (198
1) Cell27: 143-153). T with mutations in these genes
The i plasmid harbors the tumor callus of Nicotiana tabacum
Irritates, produces shoots, produces routes, and is normal
Larger. In other hosts, mutations in these genes
Different phenotypes can be induced (Chilton, M.D. Ann. Rev.
Genet. (1982)).tmsWhentmrPhenotype depends on the tumor
It correlates with differences in existing plant hormone levels. Rhinoceros
The difference in the tokainin: auxin ratio is due to the untransformed callus.
Cultures that induce shoot or root formation in tissue
Similar to the difference in the Itokine: auxin ratio (D.E.
Akiyoshiet al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA8
0: 407-411).tmsOrtmrOnly one of the functional remains
T-DNA with gene (workstmlNot only in case
Can stimulate overt tumor growth. Shoot and Le
The stimulus of the function is functionaltmlPromoted and hindered respectively by
(L.W.Reamet al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA8
0: 1660-1664). Mutation of T-DNA gene is plant genome
Does not appear to affect the insertion of T-DNA into DNA
(J. Leemanset al. (1982) Same as above; L.W. Reamet al. (1
983) Id.). Encodes octopine synthetaseocs
The gene is H. De Greveet al. (1982) J. Mol. Appl. Gene
t.1: 499-511, whereby the nucleotide sequence was determined. This is a
Introns (intervening sequences commonly found in eukaryotic genes)
Before messenger during post-mRNA processing
(Excluded from the carcass). Eukaryotic transcription systems
Signal (TATA box) and polyadenylation site
You. Plant cells with octopine synthetase are homozygous
Since it detoxifies luginin,ocsGenes are foreign DNA
Effective selectable marker for plant cells transformed by
(G.M.S.Van Slogterenet al. (1982) Plant
Mol.Biol.1: 133-142).
【００１９】ノパリンTiプラスミドはノパリンシンセタ
ーゼ遺伝子（nos）をコードしており、nosは A. Depick
eretal.（1982）J.Mol.Appl.Genet.1：561-573、によ
り配列決定された。ocs遺伝子と同様nosもイントロンが
ない。２つのポリアデニン化部位の候補とＴＡＴＡボッ
クスとなり得る配列がある。ocsと対照的にnosの上流に
はＣＡＴボックスとして知られる転写シグナルらしい配
列がある。J.C.McPherssonetal.（1980）Proc.Natl.A
cad. Sci.USA77：2666-2670、は、クラウンゴール組織
のＴ−ＤＮＡがコードするｍＲＮＡのインビトロ翻訳を
報告した。The nopaline Ti plasmid encodes the nopaline synthetase gene (nos ), wherenos is the A. Depick
.. er et al (1982) J.Mol.Appl.Genet 1: 561-573, was sequenced by. Like theocs gene,nos has no intron. There are two potential polyadenylation sites and a sequence that can be a TATA box.In contrast toocs , upstream ofnos is a sequence that is likely to be a transcription signal known as a CAT box. JCMcPherssonetal . (1980) Proc. Natl.A
cad. Sci. USA77 : 2666-2670 reported in vitro translation of mRNA encoded by T-DNA of crown gall tissue.
【００２０】毛根Ｔ−ＤＮＡの転写もまた検出された
（L. Willmitzeretal.（1982）Mol.Gen.Genet.186：1
6-22）。機能的には毛根症候群はtmrの変異したTiプラ
スミドによりもたらされるクラウンゴール腫瘍と同等の
ようである（F.F.White and E.W.Nester（1980）J.Bact
eriol.144：710-720）。Transcription of hair root T-DNA was also detected (L. Willmitzeretal . (1982) Mol. Gen. Genet.186 : 1).
6-22). Functionally, hair root syndromeappears to be equivalent to crown gall tumors caused bytmr mutated Ti plasmids (FFWhite and EWNester (1980) J. Bact
eriol.144 : 710-720).
【００２１】真核生物において、ＤＮＡのメチル化（特
にシトシン残基の）は転写不活性化と相関している。比
較的メチル化が少ない遺伝子はｍＲＮＡに転写される。
Gelvinetal.（1983）Nucleic Acids Res.1：159-17
4、はクラウンゴール腫瘍のＴ−ＤＮＡは常に少なくと
もメチル化されていない１コピーが存在することを見出
した。同じゲノムがメチル化されている多くの他のＴ−
ＤＮＡコピーを含むということは１つ以上の過剰のＴ−
ＤＮＡのコピーは生物学的に不活性であることを示唆す
る（G. Oomsetal.（1982）Cell30：589-597 も参
照）。In eukaryotes, DNA methylation (particularly of cytosine residues) is correlated with transcriptional inactivation. Genes with relatively low methylation are transcribed into mRNA.
Gelvinetal . (1983) Nucleic Acids Res.1 : 159-17
4, found that the T-DNA of crown gall tumor always had at least one unmethylated copy. Many other T-s in which the same genome is methylated
Including a DNA copy means that one or more excess T-
A copy of the DNA is suggested to be biologically inactive (see also G. Oomsetal . (1982) Cell30 : 589-597).
【００２２】TiプラスミドはＴ−ＤＮＡ領域の外側にあ
り、感染過程に必要な他の遺伝子をコードしている（ノ
パリンプラスミドについては M.Holstersetal.（198
0）Plasmid3：212-230,オクトピンプラスミドについて
は H.De Greveetal.（1981）Plasmid6：235-248、D.
J.Garfinkeland E.W.Nester（1980）J.Bacteriol144：
732-743、および G.Ooms（1980）J.Bacteriol144：82-
91参照）。最も重要なのはonc遺伝子で、これが変異す
るとTiプラスミドの発癌性を失わせる（これらの遺伝子
座はビルレンスに関する言葉virとして知られてい
る）。onc遺伝子はトランスに作用し、異なったプラス
ミド型で物理的に他のプラスミドに局在しているＴ−Ｄ
ＮＡでの植物細胞の形質転換を引き起こし得る（J.Hill
eetal.（1982)Plasmid7：107-118、H.J. Kleeeta
l.（1982）J.Bacteriol150：327-331、M.-D.Chilton
（18 January 1983）15th Miami Winter Symp.）。ノパ
リンTiＤＮＡはTiプラスミドからの切出し、または、宿
主ゲノムへの取込みに関与するらしく、Ｔ−ＤＮＡの左
または右側の境界に極めて隣接している約25塩基対の順
方向繰り返し配列（direct repeat）を有し（N.S.Yadav
etal.（1982）Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：6322-632
6）、そして類似配列がオクトピンＴ−ＤＮＡ境界に隣
接した場所に見つかっている（R.B.Simpsonetal.（19
82）Cell29：1005-1014）。オピン同化はオクトピンお
よびノパリン型プラスミドの夫々ocsおよびnos遺伝子に
より特徴付けられる。Tiプラスミドはまた複製開始点を
含むそれ自身の増殖に必要な機能をもコードしている。
Tiプラスミド転写物は S.B.Gelvinetal.（1981）Plas
mid6：17-29、によりアグロバクテリウム・チューメフ
ァシエンス細胞中に見出されており、彼らはＴ−ＤＮＡ
領域が非Ｔ−ＤＮＡ配列に沿って弱く転写されることを
見い出した。Tiプラスミドにより支配される性質はMerl
o、前出（特に第２表参照）、およびReam and Gordon、
前出によりまとめられている。The Ti plasmid is located outside the T-DNA region.
And encodes other genes required for the infection process.
M. Holsters for palin plasmidset al. (198
0) PlasmidThree: About 212-230, octopine plasmid
Is H.De Greveet al. (1981) Plasmid6: 235-248, D.
J. Garfinkeland E.W. Nester (1980) J. Bacteriol144:
732-743, and G. Ooms (1980) J. Bacteriol144： 82-
91). Most importantlyoncThis is a gene that mutates
Causes the carcinogenicity of Ti plasmid to be lost (these genes
Za is a word about virulencevirKnown as
).oncGenes act on trans and have a different plus
Mid-type and physically localized T-D
NA can cause transformation of plant cells (J. Hill
eet al. (1982) Plasmid7: 107-118, H.J.Kleeet a
l. (1982) J. Bacteriol150: 327-331, M.-D.Chilton
(18 January 1983) 15th Miami Winter Symp.). Nopa
Phosphorus TiDNA can be excised from Ti plasmid or
Apparently involved in integration into the main genome, T-DNA left
Or approximately 25 base pairs in close proximity to the right border
It has a direction repeat sequence (direct repeat) (N.S.Yadav
et al. (1982) Proc.Natl.Acad.Sci.USA79: 6322-632
6) and a similar sequence is adjacent to the octopine T-DNA border
(R.B.Simpsonet al. (19
82) Cell29: 1005-1014). Opin assimilation is octopine
And nopaline-type plasmids respectivelyocsandnosTo the gene
More characterized. The Ti plasmid also has an origin of replication.
It also codes for the functions necessary for its own propagation, including:
Ti plasmid transcript is S.B.Gelvinet al. (1981) Plas
mid6: 17-29, by Agrobacterium tumef
Bacillus cells, which contain T-DNA
That the region is weakly transcribed along the non-T-DNA sequence.
I found it. The properties governed by the Ti plasmid are Merl
o, supra (particularly see Table 2), and Ream and Gordon,
Summarized above.
【００２３】アグロバクテリウム−ＴＩＰプラスミドＤ
ＮＡ 種々のオクトピン型Tiプラスミドは、互いにほぼ100％
相同性があることがＤＮＡハイブリダイゼーション（T.
C.Currier and E.W.Nester（1976）J.Bacteriol.126：1
57-165）または制限酵素解析（D.Sciakyetal.（197
8）Plasmid1：238-253）により調べられた。ノパリン
型Tiプラスミドは互いに少なくとも67％相同性がある
（Currier and Nester、前出）。種々のRiプラスミドは
互いに非常に相同性があることが明らかとなった（P.Co
stantinoetal.（1981）Plasmid5：170-182）。N.H.D
rummond and M.-D.Chilton（1978）J.Bacteriol.136：1
178-1183、は、オクトピンおよびノパリン型Tiプラスミ
ドは比較的狭い部分に互いに相同性があることを示し
た。これらの相同性は、G.Engleretal.（1981）J.Mol
Biol.152：183-208、により詳しくマップされた。それ
らは、４つの類似領域の３つが、更に３（Ｔ−ＤＮＡに
またがる）、４（特定のonc遺伝子を含む）、および９
（onc遺伝子を有する）の類似領域に細分化されること
を見出した。連結している相同領域は、少なくともtra
遺伝子（Tiプラスミドの他の細菌細胞への接合伝達に関
与する）と、複製および不和合性に関する遺伝子とを含
む。この領域はリゾビアッシー科の別の属であるリゾビ
ウムの一種から分離されたSymプラスミド（共生窒素固
定に関与する）と相同性がある（R.K.Prakashetal.
（1982）Plasmid7：271-280）。４つの領域の順序は保
存されていないが、いずれも同一方向に配置している。
Ｔ−ＤＮＡ配列の一部はノパリンおよびオクトピンプラ
スミド間で極めて良く保存されている（M.-D. Chilton
etal.（1978）Nature275：147-149、A.Depickereta
l.（1978）Nature275：150-153）。Riプラスミドはそ
れらの間、およびオクトピン（F.F.White and E.W.Nest
er（1980）J.Bacteriol.144：710-720）とノパリン（G.
Risuleoetal.(1982)Plasmid7：45-51）の両Tiプラス
ミドにはかなり相同性がある。その領域はおもにonc遺
伝子をコードしている領域である。RiＴ−ＤＮＡはTiプ
ラスミドの両型のＴ−ＤＮＡに弱いながらも、かなり相
同性がある（L.Willmitzeretal.（1982）Mol.Gen.Gen
et.186：3193-3197）。未感染のニコチニア・グラウカ
の植物ＤＮＡは、ｃＴ−ＤＮＡ（細胞のＴ−ＤＮＡ）と
呼ばれる配列を含んでおり、RiＴ−ＤＮＡの一部と相同
性がある（F.F.Whiteetal.（1983）Nature301：348-
350）。Agrobacterium-TIP plasmid D
NA Various octopine-type Ti plasmids are almost 100%
DNA hybridization (T.
C. Currier and EWNester (1976) J. Bacteriol.126 : 1
57-165) or restriction analysis (D. Sciakyetal . (197
8) Determined by Plasmid1 : 238-253). Nopaline-type Ti plasmids are at least 67% homologous to each other (Currier and Nester, supra). The various Ri plasmids were found to be very homologous to each other (P. Co.
stantinoetal . (1981) Plasmid5 : 170-182). NHD
rummond and M.-D.Chilton (1978) J. Bacteriol.13 6: 1
178-1183, showed that octopine and nopaline-type Ti plasmids were homologous to each other in a relatively narrow region. These homologies are described in G. Engleretal . (1981) J. Mol.
Biol.152 : 183-208. They show that three of the four similar regions have three additional (spread over the T-DNA), four (including the specificonc gene), and nine.
(Having theonc gene). The connected homologous region must be at leasttra
Genes, which are involved in conjugative transmission of Ti plasmids to other bacterial cells, and genes for replication and incompatibility. This region is homologous to aSym plasmid (involved in symbiotic nitrogen fixation) isolated from one species of Rhizobium, another genus of the Rhizobiassiaceae family (RKPrakashetal .
(1982) Plasmid7 : 271-280). Although the order of the four areas is not preserved, they are all arranged in the same direction.
Some of the T-DNA sequences are very well conserved between the nopaline and octopine plasmids (M.-D. Chilton
. et al (1978) Nature 275 : 147-149, A.Depicker et a
l . (1978) Nature275 : 150-153). Ri plasmids are between them, and octopine (FFWhite and EWNest
er (1980) J. Bacteriol.144 : 710-720) and nopaline (G.
Risuleoetal . (1982) Plasmid7 : 45-51) have considerable homology to both Ti plasmids. The region is mainly a region encoding theonc gene. RiT-DNA is weak but has considerable homology to both types of T-DNA of the Ti plasmid (L. Willmitzeretal . (1982) Mol. Gen. Gen.
et.186 : 3193-3197). Uninfected Nicotinia glauca plant DNA contains a sequence called cT-DNA (cellular T-DNA) and is homologous to a portion of RiT-DNA (FFWhiteetal . (1983) Nature301 ). : 348-
350).
【００２４】Ti（M.-D.Chiltonetal.（1977）Cell1
1：263-271）またはRi（M.-D.Chilton（1982）Nature2
95：432-434、F.F.Whiteetal.（1982）Proc. Natl.Ac
ad.Sci. USA79：3193-3197、L.Willmitzer（1982）Mo
l.Gen.Genet.186：16-22）プラスミドの一部分は、腫
瘍植物細胞のＤＮＡに見出される。転移したＤＮＡはＴ
−ＤＮＡとして知られている。Ｔ−ＤＮＡは核内（M.P.
Nutietal.（1980）Plant Sci.Lett.18：1-6、L.Will
mitzer et al.（1980）Nature287：359-361、M.-D.Chi
lton et al.（1980）Proc.Natl.Acad.Sci. USA77：406
0-4064）の宿主ＤＮＡ（M.F.Thomashowetal.(1980)Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA77：6448-6452、N.S.Yadaveta
l.（1980）Nature287：458-461）に取り込まれる。Ti (M.-D.Chiltonet al. (1977) Cell1
1: 263-271) or Ri (M.-D.Chilton (1982) NatureTwo
95: 432-434, F.F.Whiteet al. (1982) Proc. Natl.Ac
ad.Sci. USA79: 3193-3197, L. Willmitzer (1982) Mo
l.Gen.Genet.186: 16-22) A part of the plasmid
It is found in the DNA of tumor cells. The transferred DNA is T
-Known as DNA. T-DNA is nuclear (M.P.
Nutiet al. (1980) Plant Sci. Lett.18: 1-6, L. Will
mitzer et al. (1980) Nature287: 359-361, M.-D.Chi
(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA77: 406
0-4064) host DNA (M.F.Thomashowet al. (1980) Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA77: 6448-6452, N.S.Yadavet a
l. (1980) Nature287: 458-461).
【００２５】M.F.Thomashow et al.（1980）Proc.Natl.
Acad.Sci. USA77：6448-6452、および M.F. Thomashow
etal.（1980）Cell19：729-739、は、オクトピン型T
iプラスミドのＴ−ＤＮＡが、Ｔ−ＤＮＡの左と右の夫
々ＴＬ−ＤＮＡおよびＴＲ−ＤＮＡの２つの別の場所に
取り込まれることを見出した。ＴＲおよびＴＬのコピー
数は変動し得る（D.J.Merloetal.（1980）Molec.Gen.
Genet.177：637-643）。Ｔ−ＤＮＡの中芯（core）は、
ノパリンＴ−ＤＮＡと相同性が高く（Chiltonet al.（1
978）前出、およびDepickeretal.（1978）前出）、腫
瘍維持に必要で、ＴＬに見られ、一般的に細胞当り１コ
ピー存在し、そしてtms、tmr およびtml遺伝子をコード
する。他方、ＴＲはコピー数は多い（D.J.Merloetal.
(1980)前出）が、まったく不要である（M.De Beuckelee
retal.（1981）Molec.Gen.Genet.183：283-288、G.Oo
msetal.（1982）Cell30：589-597）。G.Oomsetal.
（1982）Plasmid7：15-29 によれば、ＴＲがTiプラス
ミドから欠失してもアグロバクテリウム・チューメファ
シエンスはヴィルレンスを保っているが、ＴＲがＴ−Ｄ
ＮＡ取込みに関与すると想定されている。G.Oomseta
l.（1982）Cell30：589-597により、Ｔ−ＤＮＡは植物
ゲノムに取り込まれた後、時として欠失するが、一般に
安定であること、またＴ−ＤＮＡ構成が異なる混成細胞
を含む腫瘍は、複数の形質転換現象の結果であることが
示された。ocsはＴＬに存在する。しかし、腫瘍増殖に
関連する表現型を失うことなく植物ゲノムから欠失させ
得る。組み込まれたＴＬの左端は順または逆向きの繰り
返しＴ−ＤＮＡ配列から成る（R.B.Simpsonetal.（19
82）Cell29：1005-1014）。M.F.Thomashow et al. (1980) Proc. Natl.
Acad.Sci. USA77: 6448-6452, and M.F. Thomashow
et al. (1980) Cell19: 729-739 is the Octopin T
i The T-DNA of the plasmid is the left and right husband of the T-DNA.
In two separate places, TL-DNA and TR-DNA
Found to be incorporated. Copy of TR and TL
Numbers can vary (D.J.Merloet al. (1980) Molec.Gen.
Genet.177: 637-643). The core of T-DNA is
High homology with nopaline T-DNA (Chiltonet al. (1
978) supra, and Depickeret al(1978, supra), tumor
Necessary for tumor maintenance, found in TL, typically 1 cell per cell
Exists, andtms,tmr andtmlCode the gene
I do. On the other hand, TR has a large copy number (D.J.Merloet al.
(1980) supra) but completely unnecessary (M.De Beuckelee
ret al. (1981) Molec.Gen.Genet.183: 283-288, G.Oo
mset al. (1982) Cell30: 589-597). G.Oomset al.
(1982) Plasmid7: According to 15-29, TR is Ti plus
Agrobacterium tumefa
Science keeps Virence, but TR is T-D
It is assumed to be involved in NA uptake. G.Oomset a
l. (1982) Cell30: According to 589-597, T-DNA is plant
Occasionally deleted after integration into the genome, but generally
Mixed cells that are stable and have different T-DNA composition
-Containing tumors may be the result of multiple transformation events
Indicated.ocsExists in the TL. However, tumor growth
Deletion from the plant genome without losing the associated phenotype
obtain. The left end of the built-in TL is forward or backward
Consisting of a reverse T-DNA sequence (R.B.Simpsonet al. (19
82) Cell29: 1005-1014).
【００２６】オクトピン型腫瘍の状況とは対照的にノパ
リンＴ−ＤＮＡは一連のフラグメントで宿主ゲノムに組
み込まれる（M.Lemmersetal.（1980）J.Mol.Biol.14
4：353-376、P.Zambryskietal.（1980）Science20
9：1385-1391）。順方向繰り返し配列が観察された。奇
形腫から生じた植物のＴ−ＤＮＡは、挿入ＤＮＡの端の
フラグメントにわずかな修飾がある（Lemmersetal.、
前出）。右端と左端の間の結合部の配列の解析から多く
の順繰り返し配列と１つ逆繰り返し配列が明らかになっ
た。後者は結合部にまたがっている（Zambryskietal.
（1980）前出）。左側の結合部は少なくとも70塩基対
（bp）が変動すること、一方、右結合部は１bpのみの変
動である（P.Zambryskietal.（1982）J.Molec.Appl.G
enet.1：361-370 ）ことが示された。繰り返し配列の結
合部の左および右端は、130bp以上のスペーサーにより
分断されている。このスペーサーの由来は不明であり、
特定のＴ−ＤＮＡ配列を含んでいる。Ｔ−ＤＮＡは繰り
返し配列と低コピー数宿主配列の両者に組み込まれてい
る。In contrast to the situation of octopine-type tumors, nopa
Phosphorus T-DNA is integrated into the host genome in a series of fragments.
(M.Lemmerset al. (1980) J. Mol. Biol.14
Four: 353-376, P.Zambryskiet al. (1980) Science20
9: 1385-1391). A forward repeating sequence was observed. Strange
The T-DNA of the plant resulting from the sarcoma was
Fragments have slight modifications (Lemmerset al.,
Supra). Many from the analysis of the sequence of the junction between the right end and the left end
Sequence and one reverse sequence
Was. The latter straddles the joint (Zambryskiet al.
(1980) supra). The left junction is at least 70 base pairs
(Bp), while the right junction changes only 1 bp.
Movement (P.Zambryskiet al. (1982) J.Molec.Appl.G
enet.1: 361-370). Concatenation of repeated arrays
The left and right ends of the joint are with a spacer of 130bp or more.
It is divided. The origin of this spacer is unknown,
Contains specific T-DNA sequences. T-DNA repeats
Integrated into both the return sequence and the low copy number host sequence
You.
【００２７】N.S.Yadavetal.（1982）Proc.Natl.Aca
d. Sci. USA79：6322-6326、は、Ｔ−ＤＮＡの左端の
すぐ外側のノパリンTiプラスミド内にchi部位を見出
し、これはバクテリオファージλで10Kbp離れているま
わりのＤＮＡで一般組み換えを増大させる。R.B.Simpso
netal.（1982）Cell29：1005-1014、は、オクトピン
Tiプラスミド内にchi配列を見出さなかったが、配列を
決定した領域の外側に存在する可能性を排除できない。
Tiプラスミドでのchiの意義は不明である。もしchiが機
能を有しているとすれば、chiがＴ−ＤＮＡ内にないの
で、恐らく植物ではなくアグロバクテリウム細胞内で用
いられているだろう。NSYadavetal . (1982) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA79 : 6322-6326 finds achi site in the nopaline Ti plasmid just outside the left edge of the T-DNA, which enhances general recombination in DNA around 10 Kbp away with bacteriophage λ. Let it. RBSimpso
. n et al (1982) Cell 29: 1005-1014, is, octopine
Although nochi sequence was found in the Ti plasmid, the possibility of being outside the sequenced region cannot be ruled out.
The significance ofchi in the Ti plasmid is unknown. Ifchi had a function, it would probably be used in Agrobacterium cells rather than plants becausechi is not in T-DNA.
【００２８】アグロバクテリウム−ＴＩＰプラスミドの
操作 シャトルベクターの項で詳しく述べるように、変化させ
たＤＮＡ配列をＴＩＰプラスミドの望みの場所に導入す
る技術が開発された。トランスポソンはこの技術で容易
に挿入される（D.J.Garfinkeletal.（1981）Cell2
7：143-153）。J.-P.Hernalsteenetal.（1980）Natur
e287：654-656、は、TiプラスミドのＴ−ＤＮＡに挿入
されたＤＮＡ配列（ここでは細菌のトランスポソン）
が、受容植物ゲノムへ移され取り込まれることを示し
た。種々の起源の多くの外来ＤＮＡが挿入されたが、こ
れまで、その遺伝子は自身のプロモーターの支配下で発
現しなかった。これらの遺伝子には酵母のアルコール脱
水素酵素（Adh）（K.A.Bartonetal.（1983））、トウ
モロコシのAdhI（J.Bennetzen、未発表）とゼイン、哺
乳類のインターフェロンとグロビン、哺乳類のウイルス
SV40（J.Schell、未発表）などがある。M.Holsterset
al.（1982）Mol.Gen.Genet.185：283-289、によれば、
Ｔ−ＤＮＡに挿入された細菌のトランスポソン（Tn７）
が植物ゲノムに取り込まれた後、完全な機能を有し、多
分変化していない形で回収された。[0028]Agrobacterium-TIP plasmid
operation As detailed in the section on shuttle vectors,
The DNA sequence into the desired location of the TIP plasmid
Technology has been developed. Transposons are easy with this technology
(D.J.Garfinkelet al. (1981) CellTwo
7: 143-153). J.-P. Hernalsteenet al. (1980) Natur
e287: 654-656 inserted into T-DNA of Ti plasmid
DNA sequence (here, bacterial transposon)
Is transferred and incorporated into the recipient plant genome
Was. Many foreign DNAs of various origins have been inserted.
Until that time, the gene was released under the control of its own promoter.
Did not show. These genes include alcohol dehydration in yeast.
Hydrogenase (Adh) (K.A. Bartonetal. (1983)), toe
Sorghum AdhI (J. Bennetzen, unpublished)
Milk interferons and globins, mammalian viruses
SV40 (J.Schell, unpublished) and others. M. Holsterset
al. (1982) Mol. Gen. Genet.185: 283-289, according to
Bacterial transposon inserted into T-DNA (Tn7)
Is fully functional and highly integrated after it has been incorporated into the plant genome.
Minutes recovered in unchanged form.
【００２９】ＴＩＰプラスミド内で欠失を種々の方法で
生成し得る。シャトルベクターを標準の組み換えＤＮＡ
技術でつくられた欠失の導入に用いることができる（Co
henand Boyer US Pat. 4,237,224）。前もって決められ
た一方の端の欠失はトランスポソンの誤った切出しによ
り作成し得る（B.P.Koekmanetal.（1979）Plasmid
2：347-357、G.Oomsetal.（1982）Plasmid7：15-2
9）。J.Hille and R.Schilperoot（1981）Plasmid6：1
51-154は、前もって決められた位置での両端を有する欠
失が、２つのトランスポソンを用いて作成し得ることを
示した。この技術はまたインビボで"組み換えＤＮＡ分
子"の構築に用いられる。Deletions can be made in the TIP plasmid in a variety of ways. Shuttle vector to standard recombinant DNA
Can be used to introduce technology-created deletions (Co
henand Boyer US Pat. 4,237,224). Predetermined deletions at one end can be made by incorrect excision of transposons (BP Koekmanetal . (1979) Plasmid
2 : 347-357, G. Oomsetal . (1982) Plasmid7 : 15-2
9). J. Hille and R. Schilperoot (1981) Plasmid6 : 1
51-154 showed that a deletion with both ends at predetermined positions could be created using two transposons. This technique is also used for the construction of "recombinant DNA molecules" in vivo.
【００３０】ノパリンシンセターゼ遺伝子が、形質転換
された植物細胞を選択するのに用いられる薬剤耐性をコ
ードするＤＮＡセグメントの挿入に用いられた。M.Beva
n（M.D.Chiltonetal.（18 January 1983）15th Miami
Winter Symp.、により報告された；およびJ.L.Marx（1
983）Science219：830 参照）とR.Horschetal.（（1
8 January 1983）15th Miami Winter Symp.、およびMar
x、前出、参照）は、Tn5のカナマイシン耐性遺伝子（ネ
オマイシンフォスフォトランスフェラーゼ）をノパリン
プロモーターの後に（その制御下に）挿入した。その作
成には、培養でカナマイシンおよびG418 のようなアナ
グロ耐性になるよう植物細胞を形質転換する方法がとら
れた。J.Schelletal.(18January 1983）15th Miami W
interSymp.（Marx、前出、も参照）は同様の作成法を報
告し、そこではTn7のメトトレキセート耐性遺伝子（ジ
ハイドロフォレートレダクターゼ）が、ノパリンシンセ
ターゼプロモーターの後につながれた。形質転換細胞は
メトトレキセート耐性であった。オクトピンシンセター
ゼを有する植物細胞は毒性化学物質、ホモアルギニンに
耐性であり、G.M.S.Van Slogterenetal.（1982）Plan
t Mol.Biol.1：133-142、は、この酵素を洗濯マーカー
に用いることを提案した。The nopaline synthetase gene was used for insertion of a DNA segment encoding drug resistance used to select transformed plant cells. M. Beva
n (MDChiltonetal . (18 January 1983) 15th Miami
Winter Symp., And JLMarx (1
983) Science219 : 830) and R. Horschetal . ((1
8 January 1983) 15th Miami Winter Symp., And Mar
x, supra) inserted the kanamycin resistance gene for Tn5 (neomycin phosphotransferase) after (under its control) the nopaline promoter. For its production, a method was used in which plant cells were transformed so as to be resistant to anagro such as kanamycin and G418 in culture. J. Schelletal . (18 January 1983) 15th Miami W
interSymp. (see also Marx, supra) reported a similar construction, in which the methotrexate resistance gene for Tn7 (dihydrofolate reductase) was spliced after the nopaline synthetase promoter. Transformed cells were methotrexate resistant. Plant cells with octopine synthetase are resistant to the toxic chemical, homoarginine, and GMS Van Slogterenetal . (1982) Plan
t Mol. Biol.1 : 133-142, proposed using this enzyme as a wash marker.
【００３１】M.-D.Chilton et al.（1983）、前出、
は、A.Defremeuが"小Ti（mini-Ti）プラスミド"を作成
したと報告した。ノパリンＴ−ＤＮＡには、通常１ケ所
の制限酵素KpnIの切断部位がある。この部位を欠く変異
がつくられ、完全なノパリンＴ−ＤＮＡを含むKpnIフラ
グメントが単離された。このフラグメントはカナマイシ
ン耐性遺伝子と共にpRK290に挿入され、アグロバクテリ
ウム・チューメファシエンス内で維持され、すべての非
Ｔ−ＤＮＡ配列を欠くプラスミドが得られた。それ自身
では、このプラスミドは植物細胞を形質転換できなかっ
た。しかし、オクトピンTiプラスミドを持つアグロバク
テリウム・チューメファシエンス株に入れると、オクト
ピンとノパリン両方を合成する腫瘍が誘導された。これ
はノパリンTiプラスミド機能の消失がオクトピンTiプラ
スミドにより相補されたこと、およびノパリン"小Ti"は
植物細胞を形質転換する能力があったことを示す。Chil
tonetal.（1983）、前出、はまた、小TiをSmaIで切
り、ノパリンシンセターゼ遺伝子とその左および右端以
外はすべてのＴ−ＤＮＡを欠失した"微Ti"（micro-Ti）
を作成した。この微TiはSmaI部位を欠くpRK290プラスミ
ド誘導対に挿入され、小Tiと同様にして用いられ、匹敵
する結果を得た。M.-D. Chilton et al. (1983), supra,
Reported that A. Defremeu has created a "mini-Ti (mini-Ti) plasmid". Nopaline T-DNA usually has one restriction enzymeKpnI cleavage site. A mutation lacking this site was made and aKpnI fragment containing the complete nopaline T-DNA was isolated. This fragment was inserted into pRK290 along with the kanamycin resistance gene and maintained in Agrobacterium tumefaciens, resulting in a plasmid lacking all non-T-DNA sequences. By itself, this plasmid failed to transform plant cells. However, tumors that synthesized both octopine and nopaline were induced when placed in the Agrobacterium tumefaciens strain carrying the octopine Ti plasmid. This indicates that the loss of nopaline Ti plasmid function was complemented by the octopine Ti plasmid, and that nopaline "small Ti" was capable of transforming plant cells. Chil
tonetal. (1983), supra, also, cut a small Ti inSma I, nopaline synthetase gene and except the left and right edges lacking all of the T-DNA "micro-Ti" (micro- Ti)
It was created. This fine Ti was inserted into the pRK290 plasmid derived pair lacking theSma I site and used in the same manner as the small Ti with comparable results.
【００３２】H.Lorzetal.（1982）inPlantTissueC
ulture1982、ed：A.Fujiwara、pp.511-512、は、ＤＮ
Ａ取込みと維持にＴＩＰ系が見掛け上無関係なプラスミ
ドベクターを作り、マーカーとしてノパリンシンセター
ゼ遺伝子を用いた。H. Lorzetal . (1982) inPlantTissueC
ulture1982 , ed: A. Fujiwara, pp.511-512, DN
A A plasmid vector was constructed that was apparently unrelated to the TIP system for uptake and maintenance, and the nopaline synthetase gene was used as a marker.
【００３３】ファセオリンと遺伝子調節 一般に高等真核生物の遺伝子は高度に調節されている。
植物のような多細胞生物は多くの分化した組織を有し、
夫々は特有の遺伝子産物を要求する特有の機能を持つ。
そのような組織の１つに子葉（cotyledon）がある。豆
果（legumes）では子葉は、発芽の間に必要となるま
で、脂質、炭水化物、無機物および蛋白質などを保存す
る種の貯蔵器官である。フォセオラス・ブルガリスＬ．
（フレンチビーン、インゲン豆（kidny bean）、乾燥白
豆（navy bean）、緑豆（green bean）などの名でも知
られる）では、主要貯蔵蛋白質はファセオリンである。
この蛋白は極めて類似しかつ互いに等量の小数の分子種
から成る。ファセオリンは乾燥豆の主要な栄養価を担っ
ており、しばしば乾燥重量の10％以上を占める。Phaseolin and Gene Regulation In general, higher eukaryotic genes are highly regulated.
Multicellular organisms such as plants have many differentiated tissues,
Each has a specific function that requires a specific gene product.
One such tissue is cotyledon. In legumes, cotyledons are species storage organs that store lipids, carbohydrates, minerals, proteins, etc. until needed during germination. Fosseolas vulgaris L.
In French bean, also known as kidney beans (kidny bean), dried white beans (navy bean), green beans, etc., the major storage protein is phaseolin.
This protein is very similar and consists of a small number of molecular species equal to each other. Phaseolin is responsible for the primary nutritional value of dried beans, often accounting for more than 10% of dry weight.
【００３４】ファセオリンはファセオラス・ブルガリス
の生活環の間で高度に調節されている。この蛋白は種が
さやの中で生ずる間でのみつくられ、そのレベルは遺伝
的に決まった合成のスケジュールに従い、検出限界の低
い値から種の蛋白の半分を占めるまで上昇する。そのピ
ークではファセオリン合成は子葉細胞の蛋白合成の80％
以上にも達する。他の時期には、また他の組織では、フ
ァセオリン合成は検知できない。世界的な栄養源の重要
性に伴い、ファセオリンの調節の仕組みは、ファセオリ
ンの研究、その性質およびその調節に大いに興味をそそ
る。Phaseolin is highly regulated during the life cycle of Phaseolus vulgaris. This protein is produced only during the time that the species occurs in the pod, and its levels rise from low detection limits to half of the species' protein, according to a genetically determined synthesis schedule. At its peak, phaseolin synthesis is 80% of cotyledon cell protein synthesis
Reaches even more. At other times, and in other tissues, phaseolin synthesis is undetectable. With the importance of global nutrient sources, the mechanism of phaseolin regulation is of great interest in the study of phaseolin, its properties and its regulation.
【００３５】[0035]
【発明の要旨】ここに開示の発明により植物遺伝子を導
入し、Ｔ−ＤＮＡプロモーターの支配下でそこで発現す
る遺伝的に修飾された植物細胞より成る植物が提供され
る。さらに、本発明は植物細胞を含む植物組織を提供す
る。この植物細胞のゲノムはＴ−ＤＮＡプロモーターの
支配下で植物細胞内で発現するようにＴ−ＤＮＡプロモ
ーターに関して方向と間隙をもって挿入された植物構造
遺伝子を含むＴ−ＤＮＡを有する。本発明は、また、Ｔ
−ＤＮＡ（ここではＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下で
植物細胞内で発現するように、Ｔ−ＤＮＡプロモーター
に関して方向と間隔をもった挿入植物構造遺伝子を含む
ように修飾されたＴ−ＤＮＡと定義される）を含みかつ
複製する新規な細菌株を提供する。さらに本発明はエセ
リシア・コリー内で複製能を有し、Ｔ−ＤＮＡを含み、
さらに植物細胞内でＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下で
発現するようにプラスミド内に含まれるＴ−ＤＮＡに挿
入された植物構造遺伝子を含む新規なプラスミドを提供
する。SUMMARY OF THE INVENTION The invention disclosed herein provides a plant comprising a genetically modified plant cell into which a plant gene has been introduced and which is expressed under the control of a T-DNA promoter. Further, the present invention provides a plant tissue containing a plant cell. The genome of the plant cell has a T-DNA containing a plant structural gene inserted in a direction and gap with respect to the T-DNA promoter to be expressed in the plant cell under the control of the T-DNA promoter. The present invention also provides T
DNA (here defined as T-DNA modified to include an inserted plant structural gene oriented and spaced with respect to the T-DNA promoter so that it is expressed in plant cells under the control of the T-DNA promoter. New bacterial strains comprising and replicating. Further, the present invention is capable of replicating in Escherichia coli, including T-DNA,
Further, the present invention provides a novel plasmid containing a plant structural gene inserted into T-DNA contained in a plasmid so as to be expressed in a plant cell under the control of a T-DNA promoter.
【００３６】ここに示された実験的研究はＴ−ＤＮＡを
介して導入後、Ｔ−ＤＮＡプロモーターの支配下で植物
細胞内で植物構造遺伝子が発現する。即ち、既知の方法
によりＴ−ＤＮＡにＴ−ＤＮＡプロモーター支配下で植
物構造遺伝子を挿入し、その挿入物を含むＴ−ＤＮＡを
植物細胞に導入することにより行ったものであるが、最
初の例であると信ずる。ここに示された実験はまた、イ
ントロンを含む植物構造遺伝子がＴ−ＤＮＡを介して導
入された植物細胞内でＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下
で発現した最初の例を提供するものと信ずる。これらの
結果は、Ｔ−ＤＮＡプロモーター支配下で発現する既報
の遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡ内生遺伝子であれ、挿入外来遺
伝子であれ、現在知られている限りイントロンを含まな
いという事実から見れば驚くべき事である。この結果は
また植物構造遺伝子が適当な条件下でＴ−ＤＮＡに導入
された時、Ｔ−ＤＮＡプロモーターは植物構造遺伝子の
発現を制御する機能を果たすという例を従来技術では示
し得なかったという観点から、容易に考えられえないも
のである。本発明は他の植物種または株から有用な植物
構造遺伝子を導入し、植物組織または全植物体を遺伝的
に修飾するのに有用である。このような有用植物構造遺
伝子は貯蔵蛋白質、レクチン、病気、昆虫および除草剤
に対する耐性因子、環境ストレスに対し耐性を与える因
子などの遺伝子、さらに特異的芳香剤の遺伝子などを含
むが、これらに限らない。本発明は豆類、ファセオラス
・ブルガリス Ｌ．の主たる種の貯蔵蛋白質であるファ
セオリン構造遺伝子をヒマワリやタバコの植物細胞への
導入と発現という例を提供する。植物構造遺伝子がＴ−
ＤＮＡプロモーターの支配下で発現する植物細胞が一度
得られれば、植物組織および全植物体を当該分野で既知
の方法と技術を用いて再生させ得る。再生した植物は次
いで通常の方法で増殖し、導入された遺伝子は通常の植
物改良技術により他の植物や培養物へ移される。例え
ば、ファセオリン構造遺伝子の導入、発現はアルファル
ファのような馬糧作物蛋白含量、栄養価の向上に用いる
ことができる。本発明の他の用途、即ち、他の植物種へ
の導入された他の構造遺伝子の性質の開拓などは当業者
にとって容易なことである。本発明によれば、原理的に
は、いかなる植物構造遺伝子も、Ｔ−ＤＮＡへの導入が
可能でかつ安定に複製維持されうるいかなる植物種へ導
入されうる。一般にこれらの種に以下のものがあるが、
それに限定されない、即ちヒマワリ（コンポシテ科）、
タバコ（ソラナシ科）、アルファルファ、大豆および他
のマメ類（レグミノシ科）および大部分の野菜類などの
ような双子葉植物である。The experimental studies presented here show that, after introduction via T-DNA, plant structural genes are expressed in plant cells under the control of the T-DNA promoter. That is, the method was carried out by inserting a plant structural gene into T-DNA under the control of a T-DNA promoter by a known method, and introducing T-DNA containing the inserted product into plant cells. I believe that. The experiments presented here also believe to provide the first example in which plant structural genes, including introns, were expressed under the control of a T-DNA promoter in plant cells introduced via T-DNA. These results are surprising given the fact that previously reported genes expressed under the control of the T-DNA promoter, whether endogenous T-DNA genes or inserted foreign genes, do not contain introns as currently known. It should be. This result also implies that the prior art could not show an example that the T-DNA promoter functions to control the expression of a plant structural gene when the plant structural gene is introduced into T-DNA under appropriate conditions. Therefore, it cannot be easily considered. The present invention is useful for introducing useful plant structural genes from other plant species or strains and genetically modifying plant tissues or whole plants. Such useful plant structural genes include, but are not limited to, genes such as storage proteins, lectins, resistance factors against diseases, insects and herbicides, factors conferring resistance to environmental stress, and genes for specific fragrances. Absent. The present invention relates to legumes, Phaseolus vulgaris L. The present invention provides an example of introducing and expressing a phaseolin structural gene, which is a storage protein of a major species of E. coli, in plant cells of sunflower and tobacco. The plant structural gene is T-
Once plant cells expressing under the control of the DNA promoter are obtained, plant tissues and whole plants can be regenerated using methods and techniques known in the art. The regenerated plants are then propagated in a conventional manner, and the introduced genes are transferred to other plants or cultures by conventional plant improvement techniques. For example, the introduction and expression of the phaseolin structural gene can be used to improve the protein content and nutritional value of horse crops such as alfalfa. Other uses of the present invention, i.e. exploitation of the properties of other introduced structural genes in other plant species, etc., will be readily apparent to those skilled in the art. According to the present invention, in principle, any plant structural gene can be introduced into any plant species that can be introduced into T-DNA and that can stably maintain replication. Generally, these species include:
But not limited to, sunflowers (composite family),
Dicotyledonous plants such as tobacco (Solanaceae), alfalfa, soybeans and other legumes (Leguminosaceae) and most vegetables.
【００３７】[0037]
【発明の構成】本発明は、植物細胞の遺伝的修飾方法で
あって、(a)Ｔ−ＤＮＡプロモーターを含むＴ−ＤＮＡ
へ植物構造遺伝子を挿入し、該プロモーターと該植物構
造遺伝子はＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下で植物細胞
内で植物構造遺伝子が発現するような位置と方向にあ
り、それにより、Ｔ−ＤＮＡと植物構造遺伝子との結合
を形成する工程、次いで、(b)該Ｔ−ＤＮＡ／植物構造
遺伝子の結合物を植物細胞に移入する工程、を包含す
る。上記植物細胞の遺伝的修飾方法は、前記工程（ｂ）
の実行後に、さらに、（ｃ）前記Ｔ−ＤＮＡプロモータ
ー／植物構造遺伝子結合物を含む植物細胞内での植物構
造遺伝子の発現を検知する工程を包含し得る。前記植物
構造遺伝子は１つあるいはそれ以上のイントロンを含み
得、ファセオリンなどの種子貯蔵タンパクをコードして
いる遺伝子などが使用され得る。The present invention relates to a method for genetically modifying a plant cell, comprising: (a) T-DNA containing a T-DNA promoter;
And the promoter and the plant structural gene are positioned and oriented such that the plant structural gene is expressed in the plant cell under the control of the T-DNA promoter, whereby the T-DNA and the plant Forming a bond with a structural gene, and then (b) transferring the T-DNA / plant structural gene conjugate to a plant cell. The method for genetically modifying a plant cell comprises the step (b)
And (c) detecting the expression of a plant structural gene in a plant cell containing the T-DNA promoter / plant structural gene conjugate. The plant structural gene may include one or more introns, and a gene encoding a seed storage protein such as phaseolin may be used.
【００３８】前記Ｔ−ＤＮＡプロモーター／植物構造遺
伝子結合物は、前記工程(b)に先立ってシャトルベクタ
ーの一部分として保存され複製される。前記工程(b)の
プロモーターは、好適には、tmr、tml、tms、ノパリン
シンセターゼ、オクトピンシンセターゼおよび"1.6"転
写物からなる群から選択される。The T-DNA promoter / plant structural gene conjugate is stored and replicated as part of a shuttle vector prior to step (b). The promoter of step (b) is preferably selected from the group consisting oftmr ,tml ,tms , nopaline synthetase, octopine synthetase and "1.6" transcript.
【００３９】前記植物構造遺伝子はＴ−ＤＮＡ構造遺伝
子へ融合し得、そのことにより前記Ｔ−ＤＮＡ構造遺伝
子／植物構造遺伝子結合物がＴ−ＤＡにコードされるタ
ンパクと植物のタンパク配列とを含む融合タンパクをコ
ードし得る。The plant structural gene can be fused to a T-DNA structural gene, whereby the T-DNA structural gene / plant structural gene combination comprises a protein encoded by T-DA and a plant protein sequence. The fusion protein may be encoded.
【００４０】前記細胞は、好適には、コンポジテあるい
はレグミノシなどの双子葉植物の細胞である。The cells are preferably cells of dicotyledonous plants such as composite or leguminos.
【００４１】明細書と特許請求の範囲に使用する意図と
範囲に関して不明瞭さを除くために以下の定義を行う。To avoid obscuring the intent and scope used in the specification and claims, the following definitions are provided.
【００４２】Ｔ−ＤＮＡ：植物ゲノムに組み込まれる腫
瘍誘導因子（ＴＩＰ）由来のＤＮＡセグメント、ここで
用いる時、この用語はアグロバクテリウム・チューメフ
ァシエンスおよびアグロバクテリウム・リゾゲネスを含
むアグロバクテリウムのいかなる腫瘍誘導株に本質的に
由来するＤＮＡを含む。後者の菌株の挿入セグメントを
従来は時々Ｒ−ＤＮＡと呼んでいた。さらにここで用い
るＴ−ＤＮＡという用語は自然発生または実験質操作に
よる、いかなる変化、修飾、変異、挿入、脱落をも含
む。修飾に関する基本的な構造上の要件および限定は、
自然に発生するＴ−ＤＮＡの右端および左端が充分量存
在しその結果、Ｔ−ＤＮＡの特徴である形質転換された
植物細胞ゲノム内への安定な組み込みという期待される
機能が確実に果たされるということである。さらにＴ−
ＤＮＡは挿入された植物構造遺伝子の転写の開始および
翻訳の開始を制御するに充分に完全な形のＴ−ＤＮＡプ
ロモーターを少なくとも含まなければならない。できれ
ばそのプロモーターに関して、そこへ挿入された植物構
造遺伝子が直接または融合蛋白として、そのプロモータ
ーの支配下で発現するような位置にあるべく、挿入部位
はそのプロモーターにより開始される転写と翻訳の方向
で“下流”にあるのがよい。T-DNA : A DNA segment from a tumor-inducing factor (TIP) that is integrated into the plant genome, as used herein, the term includes Agrobacterium including Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes. DNA derived essentially from any of the tumor-derived strains. The insert segment of the latter strain was previously sometimes referred to as R-DNA. Furthermore, the term T-DNA as used herein includes any alterations, modifications, mutations, insertions, or omissions, either by natural occurrence or by manipulation of experimental quality. The basic structural requirements and limitations for modification are:
The right and left ends of naturally occurring T-DNA are present in sufficient quantities to ensure that the expected function of stable integration into the transformed plant cell genome, a feature of T-DNA, is fulfilled. That is. Further T-
The DNA must contain at least the T-DNA promoter in a perfect form sufficient to control the initiation of transcription and the initiation of translation of the inserted plant structural gene. Preferably, with respect to the promoter, the insertion site is oriented in the direction of transcription and translation initiated by the promoter, so that the plant structural gene inserted therein is expressed, either directly or as a fusion protein, under the control of the promoter. Good "downstream".
【００４３】植物構造遺伝子：ここでの使用は植物の蛋
白、ペプチドまたはその一部をコードするが、通常プロ
モーと称される転写開始、翻訳開始を調節する植物遺伝
子の機能要素を欠く、ＤＮＡセグメントを含む植物遺伝
子の部分を言う。植物構造遺伝子は１つまたはそれ以上
のイントロンを含むかもしれないし、また分断されない
コード配列から成るかもしれない。植物構造遺伝子は完
全にまたは部分的に植物のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよ
び化学合成されたＤＮＡに由来するだろう。さらに植物
構造遺伝子はコード領域に、またはイントロンに発現産
物の化学構造、発現速度或いは発現調節様式に影響し得
る修飾を含むことができると期待される。そのような修
飾は変異、挿入、欠落および“静（silent）”修飾を含
むが、それに限らない。Plant structural gene : As used herein, a DNA segment that encodes a plant protein, peptide, or part thereof, but lacks functional elements of a plant gene that regulates transcription initiation and translation initiation, commonly referred to as promoters. The part of the plant gene that contains A plant structural gene may contain one or more introns and may consist of an uninterrupted coding sequence. Plant structural genes may be wholly or partially derived from plant genomic DNA, cDNA and chemically synthesized DNA. Further, it is expected that the plant structural gene may contain a modification in the coding region or in the intron that may affect the chemical structure, expression rate or expression regulation mode of the expression product. Such modifications include, but are not limited to, mutations, insertions, deletions, and "silent" modifications.
【００４４】この静修飾は、発現産物の化学構造を変化
させないが、発現産物の細胞内局在性、輸送、分泌また
は安定性などに影響する。構造遺伝子は複数の起源に由
来するセグメントの混成物でありうる。それは自然的に
発生するかもしくは混成蛋白をコードする。この混成蛋
白は植物蛋白の一部を成している。The static modification does not change the chemical structure of the expression product, but affects the intracellular localization, transport, secretion or stability of the expression product. A structural gene can be a hybrid of segments from multiple sources. It encodes a naturally occurring or hybrid protein. This hybrid protein forms part of the plant protein.
【００４５】Ｔ−ＤＮＡプロモーター：挿入Ｔ−ＤＮＡ
と一般に相関している、いかなる自然に生ずるプロモー
ターをも指す。これはＴ−ＤＮＡのＴＩＰ起源の部分に
依存して、オクトピンシンセターゼ遺伝子、ノパリンシ
ンセターゼ遺伝子、Tms、Tml、Tmr遺伝子を含むし、こ
れに限らない。Ｔ−ＤＮＡプロモーター支配下での発現
は、直接発現の形をとるかもしくは融合蛋白発現の形を
とりうる。直接発現においては、正常にはそのプロモー
ターにより制御されている構造遺伝子が除かれ挿入植物
構造遺伝子に置換され、開始コドンはＴ−ＤＮＡの構造
遺伝子の残りまたは挿入植物構造遺伝子の一部として提
供される。融合蛋白発現においては、植物構造遺伝子の
一部または全てがえ存在するＴ−ＤＮＡ構造遺伝子内で
正しい翻訳フレームで挿入される。後者の場合、 発現
産物は融合蛋白と呼ばれる。T-DNA promoter : inserted T-DNA
Refers to any naturally occurring promoter that is generally correlated with This includes, but is not limited to, the octopine synthetase gene, the nopaline synthetase gene, the Tms, Tml, Tmr genes, depending on the portion of the T-DNA originating from TIP. Expression under the control of a T-DNA promoter can take the form of direct expression or fusion protein expression. In direct expression, the structural gene normally controlled by its promoter is removed and replaced with an inserted plant structural gene, with the initiation codon provided as the rest of the T-DNA structural gene or as part of the inserted plant structural gene. You. In the expression of the fusion protein, a part or all of the plant structural gene is inserted in the correct translation frame in the T-DNA structural gene present. In the latter case, the expression product is called a fusion protein.
【００４６】植物組織：根、芽、花粉、種、クラウンゴ
ールのような腫瘍組織および胚、カルスのような培養植
物細胞の種々の形の集合物を含む植物の分化、未分化の
組織を含む。Plant tissues : including differentiated and undifferentiated tissues of plants including various forms of aggregates of tumor tissues such as roots, buds, pollen, seeds, crown gall and cultured plant cells such as embryos and callus. .
【００４７】植物細胞：栽培植物細胞、培養植物細胞お
よびプロトプラストを含む。Ｔ−ＤＮＡを介して導入さ
れた植物構造遺伝子を発現する遺伝的修飾植物の生産
は、本願明細書の開示事項を当該分野に既知な種々の技
術および経験を合併したものである。多くの例におい
て、別の手段が全過程の各段階に存在する。手段の選択
は基本的ＴＩＰの選択、修飾される植物種、希望する再
生方法など要素に依存し、それらにはいずれも当業者が
望む結果を達成する為に選択し用い得る別のプロセス段
階がある。本発明の基本的な特徴は植物構造遺伝子の性
質と構造であり、そのＴ−ＤＮＡの挿入方法である。Plant cells : Includes cultivated plant cells, cultured plant cells and protoplasts. The production of genetically modified plants that express plant structural genes introduced via T-DNA is a combination of the disclosure herein and various techniques and experiences known in the art. In many instances, alternative means will be present at each stage of the overall process. The choice of means will depend on such factors as the choice of the basic TIP, the plant species to be modified, the desired regeneration method, etc., all of which involve other process steps that those skilled in the art can choose and use to achieve the desired result. is there. A basic feature of the present invention is the nature and structure of a plant structural gene, and a method for inserting the T-DNA.
【００４８】遺伝的修飾植物を得る為に残っているステ
ップは、植物細胞へ修飾Ｔ−ＤＮＡを移送すること（そ
こでは、植物細胞の中で修飾Ｔ−ＤＮＡが植物細胞ゲノ
ムの一部として安定に組み込まれる）を含み、それには
インビトロ培養および完全植物体への実際の再生に関す
る技術がある。この技術は形質転換植物細胞の選択と検
出に関するステップおよび最初の形質転換株から商業的
に認められうる培養体へ導入遺伝子を移すステップを包
含しうる。The remaining step in obtaining the genetically modified plant is to transfer the modified T-DNA to the plant cells, where the modified T-DNA is stable in the plant cells as part of the plant cell genome. Which include techniques for in vitro culture and actual regeneration to whole plants. This technique can include steps for selection and detection of transformed plant cells and transferring the transgene from the first transformant to a commercially viable culture.
【００４９】本発明の基本的特色は先に定義したＴ−Ｄ
ＮＡプロモーターの支配下にある挿入植物構造遺伝子を
有するＴ−ＤＮＡの構築である。植物構造遺伝子はＴ−
ＤＮＡに関して正しい位置と方向で挿入されなければな
らない。まず第一に構造遺伝子をプロモーターのどちら
側へ挿入するかである。大部分のプロモーターはＤＮＡ
に沿って一方向でのみ、転写と翻訳の開始を制御するこ
とが知られている。プロモーター支配下に存在するＤＮ
Ａ領域をプロモーターの“下流”あるいは“後”にある
という。従って、プロモーターに支配される為には、植
物構造遺伝子挿入の正しい位置はプロモーターの“下
流”になければならない。（２、３の既知プロモーター
は両方向に支配する、即ちプロモーターのどちらの側も
“下流”と見なされ得る、ことが知られている。）位置
の第二の問題はプロモーターの既知機能要素、例えば転
写開始部位と構造遺伝子の翻訳開始部位間の、塩基対で
の距離である。プロモーターからプロモーターへのこの
距離に関して、事実上変動がある。従って、この点に関
して要求される構造は機能するか否かという事で判断さ
れる。近い表現をすれば、プロモーターと挿入構造遺伝
子間の距離が、正常に支配しているプロモーターとＴ−
ＤＮＡの距離に似ておればうまく作用する。方向（orie
ntation）は構造遺伝子の向きを表す。慣例により植物
蛋白質のアミノ末端を最終的にコードする構造遺伝子の
部分を、構造遺伝子の5'末端と呼び、一方、蛋白質のカ
ルボキシル末端近くのアミノ酸をコードする遺伝子の端
を構造遺伝子の3'末端と呼ぶ。植物構造遺伝子の正しい
方向はＴ−ＤＮＡプロモーターの近くにその5'末端を持
つものである。融合蛋白発現をもたらすよう構築する場
合にさらに要求されることは、植物構造遺伝子のＴ−Ｄ
ＮＡ構造遺伝子への挿入が当業者によく知られている構
造上の要求性、つまり２つの遺伝子のコード配列が同一
翻訳フレームにあるということである。本発明に関連す
る、この要求の例外が、イントロンがＴ−ＤＮＡ遺伝子
と植物構造遺伝子の最初のコード領域を分断する場合に
存在する。その場合、イントロン切断部位が、転写後の
プロセッシングによりイントロンが除去された後、Ｔ−
ＤＮＡ遺伝子と植物構造遺伝子の正しい翻訳フレームが
保存されるような位置になければならない。Ｔ−ＤＮＡ
の起源は、いかなるＴＩＰプラスミドでも良い。植物構
造遺伝子は当業者によく知られている標準的技術で挿入
される。発現度の違いは、ある植物構造遺伝子が異なっ
たＴ−ＤＮＡプロモーターの支配下に挿入されたときに
みられる。発現蛋白質自身の安定性、細胞内局在性また
は分泌、抗原性および他の機能上の性質などを含む異な
った性質は融合蛋白質の場合、見られるであろうが、そ
れは挿入部位、融合蛋白質の中に含まれるＴ−ＤＮＡ蛋
白セグメントの長さと性質、およびその立体構造に影響
する融合蛋白質の成分間で相互作用などに依存し、これ
らの全ては希望する利用目的に応じて発現産物の機能性
を操作し、制御する為の多数の機会を提供する。フォセ
オリン構造遺伝子の発現がアグロバクテリウム・チュー
メファシエンスのオクトピンプラスミドからのオクトピ
ンシンセターゼプロモーターの支配下にその遺伝子が挿
入されたときに観察された。The basic feature of the present invention is the TD defined above.
Construction of a T-DNA with an inserted plant structural gene under the control of the NA promoter. The plant structural gene is T-
It must be inserted in the correct position and orientation with respect to the DNA. The first is which side of the promoter to insert the structural gene. Most promoters are DNA
It is known to control the initiation of transcription and translation in only one direction. DN under the control of a promoter
The A region is said to be "downstream" or "after" the promoter. Thus, to be governed by the promoter, the correct position of the plant structural gene insertion must be "downstream" of the promoter. (It is known that a few known promoters dominate in both directions, i.e., either side of the promoter can be considered "downstream.") The second problem of location is that of known functional elements of the promoter, e.g. It is the distance in base pairs between the transcription start site and the translation start site of the structural gene. There is a substantial variation in this distance from promoter to promoter. Therefore, the required structure in this regard is determined by whether or not it functions. In short, the distance between the promoter and the inserted structural gene is the same as that between the normally dominant promoter and T-
It works well if it is similar to the distance of the DNA. Direction (orie
ntation) indicates the orientation of the structural gene. By convention, the portion of the structural gene that ultimately encodes the amino terminus of a plant protein is called the 5 'end of the structural gene, while the end of the gene encoding an amino acid near the carboxyl terminus of the protein is the 3' end of the structural gene. Call. The correct orientation of the plant structural gene is that with its 5 'end near the T-DNA promoter. An additional requirement when constructing to effect fusion protein expression is the TD of plant structural genes.
Insertion into the NA structural gene is a structural requirement well known to those skilled in the art, that is, the coding sequences of the two genes are in the same translation frame. An exception to this requirement, relevant to the present invention, exists when an intron interrupts the T-DNA gene and the first coding region of the plant structural gene. In that case, after the intron cleavage site was removed by intron by post-transcriptional processing, T-
It must be in a position such that the correct translation frames of the DNA gene and the plant structural gene are preserved. T-DNA
May be from any TIP plasmid. Plant structural genes are inserted by standard techniques well known to those skilled in the art. Differences in expression are seen when certain plant structural genes are inserted under the control of different T-DNA promoters. Different properties, including stability, subcellular localization or secretion of the expressed protein itself, antigenicity, and other functional properties, will be found in the case of the fusion protein, but this will be the case at the insertion site, the fusion protein It depends on the length and properties of the T-DNA protein segment contained therein and the interaction between the components of the fusion protein that affect its three-dimensional structure, all of which are dependent on the desired functionality of the expression product depending on the intended use. Provides a number of opportunities to operate and control the Expression of the foseolin structural gene was observed when the gene was inserted under the control of the octopine synthetase promoter from the octopine plasmid of Agrobacterium tumefaciens.
【００５０】植物構造遺伝子をＴ−ＤＮＡに挿入する簡
便法に、上で意義したシャトルベクターがあり、これは
エシェリヒア・コリー内で複製可能なプラスミドへ取り
込まれたＴ−ＤＮＡセグメント（ここへ挿入を期待する
セグメント）を有する。このＴ−ＤＮＡセグメントは好
ましくはシャトルベクターに特異な１つの制限部位を有
する。植物構造遺伝子は、Ｔ−ＤＮＡセグメント内の特
異的部位に挿入され得る。そしてこのシャトルベクター
は適当なアグロバクテリウム株（好ましくはそれの有す
るＴ−ＤＮＡがシャトルベクターのＴ−ＤＮＡセグメン
トと相同性がある）の細胞へ移される。形質転換された
アグロバクテリウム株を、Tiプラスミドの既存おセグメ
ントをシャトルベクターのＴ−ＤＮＡセグメントで置換
する２重相同組み換え現象を選択する条件下で増殖させ
る。A convenient method for inserting a plant structural gene into T-DNA is a shuttle vector as defined above, which is a T-DNA segment incorporated into a replicable plasmid in Escherichia coli (the insertion into which is inserted). Expected segment). This T-DNA segment preferably has one restriction site specific to the shuttle vector. Plant structural genes can be inserted at specific sites within the T-DNA segment. The shuttle vector is then transferred to cells of an appropriate Agrobacterium strain (preferably, the T-DNA of which is homologous to the T-DNA segment of the shuttle vector). The transformed Agrobacterium strain is grown under conditions that select for a double homologous recombination event in which the existing segment of the Ti plasmid is replaced with the T-DNA segment of the shuttle vector.
【００５１】ここで述べた方針に従い修飾Ｔ−ＤＮＡを
当該分野で既知のどれかの技術により植物細胞に移すこ
とができる。例えば、この移送はＴ−ＤＮＡ内に取り込
まれた植物遺伝子を含む新規のアグロバクテリウム株の
持つプラスミドの直接感染、あるいはアグロバクテリウ
ム株と植物細胞の共存培養により最も容易に達成され
る。前者の技術、直接感染はやがて感染部位に腫瘍体ま
たはクラウンゴールの出現をもたらす。クラウンゴール
細胞を次いで培養で増殖させ、そして当業者に既知の適
当な環境下で、挿入Ｔ−ＤＮＡセグメントを有する完全
植物体に再生させる。共存培養の方法により、植物細胞
のある部分が形質転換される。即ち細胞内にＴ−ＤＮＡ
が移り、植物細胞ゲノムに挿入される。いずれにして
も、形質転換細胞を選択あるいは未形質転換細胞と区別
しなければならない。選択はＴ−ＤＮＡの中に植物構造
遺伝子と共に、取り込まれる選択マーカーを用いる事に
より容易に達成される。例として、ノパリンシンセター
ゼプロモーター支配下で発現するジハイドロフォレート
レダクターゼあるいはネオマイシンファスフォトランス
フェラーゼがある。これらのマーカーは、夫々メトトレ
キセートまたはカナマイシンあるいはそれらの類似物を
含む培地での増殖により選択される。さらにＴ−ＤＮＡ
は内生マーカー、例えばTiー誘導腫瘍の培養でホルモン
非依存増殖を制御する遺伝子または遺伝子群、Riー誘導
腫瘍ルートの異常形態を制御する遺伝子または遺伝子
群、およびアミノ酸類似物のような毒性化合物に対する
耐性（その耐性はオピンシンセターゼによりもたらされ
る）を制御する遺伝子群を有する。当業者によく知られ
ている検索法には、オピン生産の測定、特徴的ＲＮＡま
たはＴ−ＤＮＡ配列に対する特異的ハイブリダイゼーシ
ョン、あるいはＥＬＩＳＡ（酵素連関免疫吸着分析の
略）、ラジオイムノアッセイ、および”ウエスタン”ブ
ロットなどの特異的蛋白質の免疫学的分析がある。The modified T-DNA can be transferred to plant cells by any of the techniques known in the art according to the principles described herein. For example, this transfer is most easily achieved by direct infection of a plasmid of a novel Agrobacterium strain containing a plant gene incorporated into the T-DNA, or by co-culture of Agrobacterium strain and plant cells. The former technique, direct infection, eventually results in the appearance of a tumor body or crown gall at the site of infection. Crown gall cells are then grown in culture and, under appropriate circumstances known to those skilled in the art, are regenerated to whole plants with inserted T-DNA segments. Certain parts of the plant cells are transformed by the co-cultivation method. That is, T-DNA is contained in cells.
Is transferred and inserted into the plant cell genome. In any case, transformed cells must be distinguished from selected or untransformed cells. Selection is easily achieved by using a selectable marker incorporated into the T-DNA together with the plant structural gene. Examples are dihydrofolate reductase or neomycin phosphotransferase expressed under the control of the nopaline synthetase promoter. These markers are selected by growth on media containing methotrexate or kanamycin or their analogs, respectively. Further T-DNA
Are endogenous markers, such as genes or genes that regulate hormone-independent growth in cultures of Ti-induced tumors, genes or genes that regulate abnormal forms of the Ri-induced tumor root, and toxic compounds such as amino acid analogs Have a group of genes that control resistance to the disease, which resistance is provided by opin synthetase. Search methods well known to those skilled in the art include measurement of opine production, specific hybridization to characteristic RNA or T-DNA sequences, or ELISA (short for enzyme-linked immunosorbent assay), radioimmunoassay, and "Western""There are immunological analyzes of specific proteins such as blots.
【００５２】シャトルベクター作戦の別の方法にＴ−Ｄ
ＮＡまたはそこに植物構造遺伝子を挿入した修飾Ｔ−Ｄ
ＮＡを含むプラスミド、即ちアグロバクテリウム株内で
独立に複製し得るプラスミドの使用がある。最近の資料
により、アグロバクテリウム株が、Ｔ−ＤＮＡの植物細
胞への移動を促進する機能をもつあるトランスに作用す
る遺伝子を有するならば、そのようなプラスミドのＴ−
ＤＮＡがアグロバクテリウム株から植物細胞へ移され得
るということが示されている。Ｔ−ＤＮＡを含み、アグ
ロバクテリウム株内で独立に複製できるプラスミドをこ
こでは”サブ−ＴＩＰ”（sub-TIP）プラスミドと呼
ぶ。変動範囲があり、そこでは、”サブ−ＴＩＰ”プラ
スミドはそれらが含有するＴ−ＤＮＡの量に差がある。
その範囲の一端はＴＩＰプラスミドからのＴ−ＤＮＡが
すべて残っているもので、特に”小ＴＩＰ”（mini-TI
P）プラスミドと呼ばれる。その範囲のもう一端はＴ−
ＤＮＡ境界のまわりのＤＮＡの最小量を残してすべてが
欠失している。その残存部分は宿主細胞内で転移と組み
込みができる必要最小量である。このようなプラスミド
は”微ＴＩＰ”（micro-TIP ）と呼ばれる。サブーＴＩ
Ｐプラスミドは小さく、直接操作するのが比較的容易で
あるという利点がある。Another method of the shuttle vector operation is TD
NA or modified TD having plant structural gene inserted therein
There is the use of plasmids containing NA, ie, plasmids that can replicate independently in Agrobacterium strains. According to recent sources, if an Agrobacterium strain has a trans-acting gene which has the function of promoting the transfer of T-DNA into plant cells, the T-
It has been shown that DNA can be transferred from Agrobacterium strains to plant cells. Plasmids that contain T-DNA and that can replicate independently in Agrobacterium strains are referred to herein as "sub-TIP" (sub-TIP) plasmids. There is a range of variation, where "sub-TIP" plasmids differ in the amount of T-DNA they contain.
One end of the range is where all of the T-DNA from the TIP plasmid remains, especially "small TIP" (mini-TI
P) Called plasmid. The other end of the range is T-
All but a minimal amount of DNA around the DNA boundary has been deleted. The remaining portion is the minimum necessary to transfer and integrate in the host cell. Such a plasmid is called "micro-TIP". Sub-TI
P-plasmids have the advantage of being small and relatively easy to manipulate directly.
【００５３】希望する構造遺伝子を挿入した後、Ｔ−Ｄ
ＮＡ転移を促進するトランスに作用する遺伝子を含むア
グロバクテリウム細胞へ直接容易に導入できる。アグロ
バクテリウム株への導入はアグロバクテリウム株の形質
転換か、供与細菌細胞から接合伝達という当業者によく
知られている技術により簡便に達成される。再生は既知
の技術で達成される。再生ステップの目的は正常に、し
かし組み込まれたＴ−ＤＮＡを保持して、増殖および再
生産する全植物体を得ることである。再生の技術は当該
分野で既知の原理によれば、Ｔ−ＤＮＡの起源、そこで
の修飾の性質、および形質転換された植物の種によりい
くらか変動する。Ri-型Ｔ−ＤＮＡで形質転換された植
物細胞は、公知の技術により何ら余分な実験なしに、容
易に再生される。Ti-型Ｔ−ＤＮＡで形質転換された植
物細胞は、ある例では培養のホルモンレベルを適当に操
作することにより再生され得る。しかし、好ましくは、
Ti-形質転換組織は、もしＴ−ＤＮＡが TmrとTms遺伝子
の一方または双方に変異を受けておれば、最も簡単に再
生される。これらの遺伝子の不活性化は形質転換組織の
ホルモンバランスを正常に戻し、培養での組織のホルモ
ンレベルを極めて容易に操作できるようになる結果、簡
単に再生するようなより正常なホルモン生理を有する植
物をもたらす。数例においては、腫瘍細胞は、ノパリン
シンセターゼのような組み込まれたＴ−ＤＮＡを持ちか
つＴ−ＤＮＡ遺伝子を発現するシュート、そしてまた挿
入植物構造遺伝子を発現するシュートを再生させること
ができる。このシュートは根を有する植物につぎ木する
事により栄養細胞で維持でき、稔性花を着生できる。シ
ュートはこのようにしてＴ−ＤＮＡを有し、そこへ挿入
された植物遺伝子を発現する正常な子孫植物の親植物体
となる。After inserting the desired structural gene, TD
It can be easily introduced directly into Agrobacterium cells containing a trans-acting gene that promotes NA transfer. Introduction into the Agrobacterium strain is conveniently accomplished by transformation of the Agrobacterium strain or conjugative transfer from donor bacterial cells, a technique well known to those skilled in the art. Regeneration is achieved by known techniques. The purpose of the regeneration step is to obtain whole plants that grow and reproduce normally, but with the integrated T-DNA. The technique of regeneration, according to principles known in the art, will vary somewhat depending on the origin of the T-DNA, the nature of the modifications therein, and the species of the transformed plant. Plant cells transformed with Ri-type T-DNA are readily regenerated by known techniques without any additional experimentation. Plant cells transformed with Ti-type T-DNA can be regenerated in some instances by appropriately manipulating the hormone levels in the culture. However, preferably,
Ti-transformed tissues are most easily regenerated if the T-DNA has a mutation in one or both of the Tmr and Tms genes. Inactivation of these genes returns the hormonal balance of the transformed tissue to normal and makes it much easier to manipulate the hormonal levels of the tissue in culture, resulting in a more normal hormonal physiology that regenerates easily. Bring plants. In some cases, the tumor cells can regenerate shoots that have integrated T-DNA such as nopaline synthetase and express the T-DNA gene, and also express the inserted plant structural gene. . This shoot can be maintained in vegetative cells by cutting onto a plant having roots, and can produce fertile flowers. The shoot thus has the T-DNA and becomes the parent plant of a normal progeny plant that expresses the plant gene inserted therein.
【００５４】[0054]
【実施例】次に述べる例は、ＴＩＰｓとアグロバクテリ
ウムの分子生物学および操作に関する当業者によく知ら
れかつ受け入れられうる多くの技術を利用している；そ
れらの方法は常に詳しく、記述されているわけではな
い。酵素は市販品であり、これらは業者の推薦あるいは
当該分野によく知られた方法により用いられた。The following examples utilize a number of techniques well known and acceptable to those skilled in the art of molecular biology and manipulation of TIPs and Agrobacterium; their methods are always described in detail. Not necessarily. Enzymes are commercially available and were used according to the recommendations of the supplier or methods well known in the art.
【００５５】試薬、緩衝液および培養条件もまた、当業
者には知られている。そのような標準となる技術を含む
関連研究を次に挙げる：R. Wu. ed. (1979) Meth. Enz
ymol.68； J.H.Miller (1972)ExperimentsinMolecul
arGenetics； R. Davisetal. (1980) AdvancedBact
erialGenetics；R.F.Schleif and P.C.Wnesink (1982)
PracticalMethodsinMolecularBiology. これらの例の中には（塩基）配列を見やすくする為に
（to clarify sequences）特別な記号が用いられてい
る。Reagents, buffers and culture conditions are also known to those skilled in the art. Related work that includes such standard technologies is: R. Wu. Ed. (1979) Meth. Enz
ymol.68 ; JHMiller (1972)Experiments inMolecul
arGenetics ; R. Davisetal . (1980)AdvancedBact
erialGenetics ; RFSchleif and PCWnesink (1982)
PracticalMethodsinMolecularBiology . In these examples, special symbols are used to make the (base) sequences easier to see (to clarify sequences).
【００５６】蛋白質をコードしているか、コードし得る
配列には下線を引き、コドンは斜線（／）で区切った。Sequences encoding or capable of encoding proteins are underlined, and codons are separated by slashes (/).
【００５７】制限酵素などにより生じた各々の鎖の切れ
目や間隙には星印（＊）を配する（ある例では、二重鎖
ＤＮＡ分子は、制限酵素切断部位の星印に隣接する一本
線で表されている； 遺伝子と思われる部分はその一本
線の下に下線を引いた“×”で示してある。）。An asterisk (*) is placed at each strand break or gap created by a restriction enzyme or the like (in one example, a double-stranded DNA molecule has a single line adjacent to the asterisk at the restriction enzyme cleavage site). The part which seems to be a gene is indicated by an underlined "x" under the single line.)
【００５８】該プラスミドは例外として、プラスミドあ
るいは唯一のプラスミド（only plasmids）は“Ｐ”で
始める。（例）p3.8あるいはpKS4。プラスミドを持つ細
胞は、その細胞本来の名にプラスミドを付加的に示すこ
とにより表す。（例）アグロバクテリウム・チュ−メフ
ァシエンス（pTil5955）あるいはK802（pKS4-KB）。With the exception of the plasmids, plasmids or only plasmids begin with "P". (Example) p3.8 or pKS4. Cells carrying a plasmid are indicated by the addition of the plasmid to the cell's native name. (Example) Agrobacterium tumefaciens (pTil5955) or K802 (pKS4-KB).
【００５９】表１、２および３にはプラスミドとそれら
の関係を同定するのに有用な索引が記されている。表４
には寄託菌株の索引が記されている。Tables 1, 2 and 3 provide indexes useful for identifying plasmids and their relationships. Table 4
Contains an index of the deposited strain.
【００６０】[0060]
【表１】[Table 1]
【００６１】[0061]
【表２】[Table 2]
【００６２】[0062]
【表３】[Table 3]
【００６３】[0063]
【表４】[Table 4]
【００６４】第４２図には例１１、１２、および１４に
記述されている構成を比較するのに有用である。FIG. 42 is useful for comparing the configurations described in Examples 11, 12, and 14.
【００６５】第４３図は遺伝コードを示し、配列の解釈
に有用である。重要なＴ−ＤＮＡ遺伝子tmlの塩基配列
はこれらの例には用いられていないが、第４４図に示さ
れている。それは、ここに記述されていない構成を示す
のに有用である。FIG. 43 shows the genetic code, which is useful for interpreting sequences. The nucleotide sequence of the important T-DNA genetml is not used in these examples, but is shown in FIG. It is useful to show configurations not described here.
【００６６】（実施例１）融合タンパクの遺伝子は、オ
クトピンシンセターゼプロモーター、オクトピンシンセ
ターゼの構造遺伝子のアミノ末端90個のアミノ酸、二つ
の遺伝子間に重複する三個のアミノ酸、そして、最初の
11個のアミノ酸を省くファセオリン遺伝子の全部分を含
むように構成されている。構成を開始するに先だち、pT
i15955 T-DNAのクローン、p233（配列はpBR322中で、p2
03、p303と提示されている;図１参照）の配列をBamHI部
位からPvuII部位まで、決定した。これは、 全オクトピ
ンシンセターゼ遺伝子を含む（図２）。オクトピンシン
セターゼ（遺伝子）配列及び、 リーディングフレーム
は、制限酵素EcoRIにより切断された部位の近くに続い
て見つかっている。Example 1 The fusion protein gene is composed of the octopine synthetase promoter, the amino-terminal 90 amino acids of the structural gene of octopine synthetase, three amino acids overlapping between the two genes, and of
It is configured to include the entire portion of the phaseolin gene omitting 11 amino acids. Before starting the configuration, pT
i15955 T-DNA clone, p233 (sequence is in pBR322, p2
03, p303; see FIG. 1) was determined from theBam HI site to thePvu II site. It contains the entire octopine synthetase gene (FIG. 2). The octopine synthetase (gene) sequence and reading frame have been found near the site cut by the restriction enzymeEcoRI .
【００６７】[0067]
【化１】Embedded image
【００６８】EcoRIによる開裂により次に示す末端をも
つ断片を生じる。Cleavage withEco RI yields fragments with the following ends:
【００６９】[0069]
【化２】Embedded image
【００７０】豆の種子の貯蔵タンパク質であるファセオ
リンの構造遺伝子（以前に配列決定されている；図３お
よび図４）は５′（アミノ末端）末端の近くに次に示す
ようにEcoRI部位を持っている。The structural gene for phaseolin, a bean seed storage protein (previously sequenced; FIGS. 3 and 4), has anEco RI site near the 5 '(amino terminus) terminus as shown below. have.
【００７１】[0071]
【化３】Embedded image
【００７２】EcoRIによる開裂により次に示す末端を持
つ断片が生じる。Cleavage withEco RI produces fragments with the following ends:
【００７３】[0073]
【化４】Embedded image
【００７４】これらの２つの断片は連結後、次に示す構
造を形成する。After ligation, these two fragments form the structure shown below.
【００７５】[0075]
【化５】Embedded image
【００７６】これは同じリーディングフレームを保持
し、かつ、間に終止信号を生じていない。つまり、ファ
セオリン遺伝子のEcoRI／BamHI制限酵素断片は、 pTi 1
5955のT-DNAのオクトピンシンセターゼ遺伝子にEcoRI部
位で連結されたのである。この融合遺伝子はocsプロモ
ーター、オクトピンシンセターゼの最初の90個のアミノ
酸、そして、プロモーターと最初の11個のアミノ酸のな
いフォセオリン遺伝子、及び、両遺伝子の継目にあたる
３個のアミノ酸配列を含んでいる。This keeps the same reading frame and no intervening end signal. In other words, theEco RI /Bam HI restriction enzyme fragment of the phaseolin gene is pTi 1
It was linked to the octopine synthetase gene of 5955 T-DNA at theEco RI site. This fusion gene contains theocs promoter, the first 90 amino acids of octopine synthetase, the foseolin gene without the promoter and the first 11 amino acids, and the three amino acid sequence that joins the genes. .
【００７７】1. 1 pBR 322 からのEcoRI部位の除去 pBR 322のEcoRI部位をEcoRIで分解後 T-4 DNAポリメラ
ーゼにより、粘着末端を埋め、平滑末端同志を連結す
る。そしてE.coli HB101 株を形質転換することによりp
BR 322 よりEcoRI部位を除去した。形質転換体の選択に
アンピシリンを用いた。又、コロニーは少量のプラスミ
ドDNAを単離する（D.Horowitz（1982）Molecnlar Cloni
ng、C.S.H ）ことにより選別した。そして、 pBR 322-R
と呼ばれるEcoRI部位を持たないクローンを選択した。[0077]1. The decomposition after T-4 DNA polymeraseEco RI site of theEcoRI site of removal pBR 322from 1 pBR 322 withEco RI, fill in the sticky ends to blunt end ligation comrades. Then, by transformingE. coli HB101 strain,
TheEco RI site was removed from BR 322. Ampicillin was used for selection of transformants. Colonies also isolate small amounts of plasmid DNA (D. Horowitz (1982)Molecnlar Cloni
ng , CSH). And pBR 322-R
Clones were selected that does not have theEco RI site called.
【００７８】1. 2 BamHI T-DNA断片のpBR 322-R への
クローニング P203（図４５）を単離し、BamHIにより分解した。T-DNA
の4.7kbp(キロベースペアー）の断片をアガロースゲル
電気泳動により単離し、pBR 322-RのBamHI部位に連結し
た。このプラスミドをE.coli HB101株に形質転換し、ア
ンピシリン耐性及びテトラサイクリン感受性を用いて選
択した。陽性クローンが得られ、それをpks 169と名づ
けた。1.2 Transfer of BamHI T-DNA Fragment to pBR322-R
Cloning P203 (FIG. 45) was isolated and digested withBam HI. T-DNA
Fragment of 4.7 kbp (kilobase pairs) is isolated by agarose gel electrophoresis and ligated intoBam HI site of pBR 322-R. This plasmid was transformed intoE. coli strain HB101 and selected using ampicillin resistance and tetracycline sensitivity. A positive clone was obtained, which was named pks 169.
【００７９】1. 3 オクトピンシンセターゼ遺伝子から
のEcoRI部位及び断片の除去 pKS 169をEcoRIで分解した。8.6 kbp(キロベースペア
ー）の断片をアガロースゲル電気泳動により単離精製し
た。この断片は除かれたocs遺伝子中に２個の小さな
（0.36kbp及び0.2kbp）断片を持っていた。1.3 from octopine synthetase gene
Removal of the EcoRI site and fragment of pKS169 was digested withEcoRI . A 8.6 kbp (kilobase pair) fragment was isolated and purified by agarose gel electrophoresis. This fragment had two small (0.36 kbp and 0.2 kbp) fragments in the removedocs gene.
【００８０】1. 4 ファセオリン遺伝子DNA 断片及び、
カナマイシン耐性遺伝子を含むEcoRI断片の単離 pKS4-KB(図９) を精製し、EcoRIで分解した。ネオマイ
シンフォスフォトランスフェラーゼII（NPT II）をコー
ドしているカナマイシン耐性遺伝子を含む、1.85kbpのD
NA断片と3.0kbpのEcoRI／BamHIファセオリン遺伝子断片
をBamHI部位で連結して用いる為に4.8kbpの断片を単離
した。1.4 phaseolin gene DNA fragment and
Purification of theisolated pKS4-KBof EcoRI fragment containing the kanamycin resistance gene (Fig. 9), was digested withEco RI. 1.85 kbp of D, containing the kanamycin resistance gene encoding neomycin phosphotransferase II (NPT II)
A 4.8 kbp fragment was isolated for use by linking the NA fragment and the 3.0 kbpEco RI /Bam HI phaseolin gene fragment at theBam HI site.
【００８１】1. 5 ファセオリン遺伝子のオクトピンシ
ンセターゼ遺伝子への連結 ファセオリン／NPTII断片を実施例１．３で記述したEco
RI断片とEcoRI部位で連結した。連結したDNAを、HB101
に形質転換し、コロニーをアンピシリンとカナマイシン
で選択した。pKS-B17-KB3.0(図４６）と名ずけたコロニ
ーを選択した。このコロニーは正しい配置（すなわち、
ファセオリン遺伝子が、正しい方向とリーディングフレ
ームでocs遺伝子へ連結されている）を持つプラスミド
を保有している。このことは、少数のコロニーからのプ
ラスミドの制限地図により確認した。適当な領域の DNA
配列を構造確認の為に決定した。1.5 Octopin of the phaseolin gene
Eco theconnecting phaseolin /NPT IIfragment into Nsetaze gene described in Example 1.3
The RI fragment and theEco RI site were ligated. The ligated DNA was converted to HB101
And colonies were selected with ampicillin and kanamycin. A colony named pKS-B17-KB3.0 (FIG. 46) was selected. This colony has the correct placement (ie,
The phaseolin gene is linked to theocs gene in the correct orientation and reading frame). This was confirmed by restriction maps of plasmids from a small number of colonies. DNA in the appropriate region
The sequence was determined for structure confirmation.
【００８２】1. 6 BPTII、ファセオリン、及びocsDNA
を含むT-DNA 断片のpRK 290への移入 広い宿主範囲をもつプラスミドであるpRK290をBglIIで
分解後、T-DNA、NPTII遺伝子、及びpKS-B17-KB3.0から
のファゼオリンDNAを含む9.1kbpのBamHI断片へ連結し
た。上記のことは、pKS-B17-KB3.0をBamHIで部分分解
後、アガロースゲル電気泳動で他の６本のバンドから単
離することにより完遂した。連結し、E.coliK802株へ形
質転換の後、コロニーをカナマイシン及びテトラサイク
リンで選択した。要求される制限パターンを有するコロ
ニーを選択しpKS-os-KB 3.0と名づけた。1.6 BPTII, Phaseolin, and ocsDNA
After decomposition withBgl II the pRK290 is a plasmid having a broad host rangetransfer into pRK 290 of the T-DNA fragment containing, including T-DNA,NPT II gene, and the phaseolin DNA from pKS-B17-KB3.0 It was ligated to a 9.1 kbpBam HI fragment. The above means that, after partial decomposition of pKS-B17-KB3.0 withBam HI, was accomplished by isolating from other six bands by agarose gel electrophoresis. After ligation and transformation intoE. coli K802 strain, colonies were selected with kanamycin and tetracycline. Colonies with the required restriction pattern were selected and named pKS-os-KB 3.0.
【００８３】1. 7 pTi 15955 上のオクトピンシンセタ
ーゼのオクトピンシンセターゼファセオリン融合タンパ
ク遺伝子への置換A.tumefaciens （ストレプトマイシン耐性）、E.coli（p
KS-OSI-KB 3.0）、及びE.coli（pRK 2013）の三親交雑
により、我々はストレプトマイシン、カナマイシン、及
びテトラサイクリン耐性のコロニーを選択した。あるコ
ロニーをE.coli（pPH1J1）と交雑した。カナマイシン及
び、ゲンタマイシン耐性のコロニーを選択した。これ
は、p15955−12A、pTi15955（制限酵素地図作成及び、
電気泳動的に分画した制限断片のフィルターハイブリダ
イゼーション（実施例１９）によるocs遺伝子のEcoRI部
位へ設計したファセオリン遺伝子及び、カナマイシン耐
性遺伝子を持つ）をもつアグロバクテリウム・チューメ
ファシエンスを表している。類似した三親交雑はアグロ
バクテリウム・チューメファシエンス（pTi A66)で行わ
れている。結果として生ずるプラスミドpA66-12Aにより
形質転換されたシュート（shoots) は、前述のようにフ
ォセオリンを有することを示している。1.7 Octopine Synthetater on pTi 15955
Octopine synthetase phaseolin fusion protein
Substitution of click geneA. tumefaciens (streptomycin resistant),E. coli (p
We selected streptomycin, kanamycin, and tetracycline resistant colonies by triparental crossing of KS-OSI-KB 3.0) andE. coli (pRK 2013). One colony was crossed withE. coli (pPH1J1). Kanamycin and gentamicin resistant colonies were selected. This includes p15955-12A, pTi15955 (restriction enzyme mapping and
Agrobacterium tumefaciens having a phaseolin gene designed to theEco RI site of theocs gene and a kanamycin resistance gene by filter hybridization of an electrophoretically fractionated restriction fragment (Example 19). ing. A similar triparental cross has been performed in Agrobacterium tumefaciens (pTi A66). The shoots transformed with the resulting plasmid pA66-12A are indicative of having foseolin as described above.
【００８４】1. 8 クラウンゴールの形成及び発現 設計されたTiプラスミドを、 ヒマワリに接種した。組
織培養において、クラウンゴールが形成された。発現は
ランニングELISA及び電気泳動的に分けられたmRNAへの
フィルターハイブリダイゼーション（“ノーザンブロッ
ト”；実施例１９）らにより試験した。期待される大き
さのRNAをファセオリン及びオクトピンシンセターゼの
両方に対するハイブリダイゼーションプローブにより見
つけた。又、期待される大きさの RNAは全ポリ(A)5＋4
RNAの約 0.5％であった。ゴールより単離したポリ(A)5
＋4 RNAでファセオリンに対する抗体により沈澱する期
待される大きさのタンパクのインビトロ合成を行った。1.8Formation and Expression of Crown Gall Sunflowers were inoculated with the designed Ti plasmid. In tissue culture, crown gall was formed. Expression was tested by running ELISA and filter hybridization to electrophoretically separated mRNA ("Northern blot"; Example 19). RNA of the expected size was found by hybridization probes for both phaseolin and octopine synthetase. The expected size of RNA is all poly (A) 5 + 4
About 0.5% of RNA. Poly (A) 5 isolated from Galle
In vitro synthesis of the expected size protein precipitated by an antibody to phaseolin with +4 RNA was performed.
【００８５】（実施例２）実施例１に似た融合タンパク
の遺伝子を、ファセオリンとノパリンシンターゼよりノ
パリンシンセターゼ遺伝子のプロモーターの支配下にお
いて構成した。それは、ノパリンシンセターゼのプロモ
ーター、ノパリンシンセターゼの最初の59個のアミノ酸
（最後の残基は合成して加えた）と１個のつぎ目のアミ
ノ酸をコードしている部分、及び最初の12個のアミノ酸
を除くすべてのファセオリン構造遺伝子を有する。構成
を開始するに先だち、pTiC58のT-DNA(pCF 44A、図８)
のクローンを、一番左のBglII部位から中ほどのHindIII
部位（T-DNA領域の外側）にかけて配列決定を行った。
これは、すべてのnos遺伝子を含んでいた（図５および
図６）。ノパリンシンセターゼの配列及びリーディング
フレームは、後に示すように、制限酵素ClaIにより切断
された部位の近くに見つかった。(Example 2) A fusion protein gene similar to that of Example 1 was constructed from phaseolin and nopaline synthase under the control of the promoter of the nopaline synthetase gene. It encodes the promoter of nopaline synthetase, the first 59 amino acids of nopaline synthetase (the last residue was added synthetically) and the next amino acid, and the first It has all phaseolin structural genes except for 12 amino acids. Before starting the construction, the T-DNA of pTiC58 (pCF44A, FIG. 8)
Clone from the leftmostBgl II site toHind III
Sequencing was performed over the site (outside the T-DNA region).
It contained allnos genes (FIGS. 5 and 6). The nopaline synthetase sequence and reading frame were found near the site cut by the restriction enzymeClaI , as shown below.
【００８６】[0086]
【化６】Embedded image
【００８７】ClaIによる切断で次のような末端を持つ断
片が生ずる。CleI cleavageyields fragments with the following ends:
【００８８】[0088]
【化７】Embedded image
【００８９】実施例１の場合と同様に、続くファセオリ
ンのEcoRI部位：As in Example 1, the followingEcoRI site of phaseolin:
【００９０】[0090]
【化８】Embedded image
【００９１】は、次に示す構造に切断することができ
る。Can be cut into the following structures.
【００９２】[0092]
【化９】Embedded image
【００９３】次に示す２つのリンカー：The two linkers shown below:
【００９４】[0094]
【化１０】Embedded image
【００９５】は、アニールし、次に示す構造を形成し得
る。Can be annealed to form the structure shown below.
【００９６】[0096]
【化１１】Embedded image
【００９７】これは該DNA断片と連なり次に示す構造を
形成し得る。This can be linked to the DNA fragment to form the following structure.
【００９８】[0098]
【化１２】Embedded image
【００９９】このリンカーの有するいくつかの機能を記
す：新しいアミノ酸が１つ導入される；ノパリンシンセ
ターゼの欠失した配列の一部分が再び構成されている；
２つの相反する制限部位が適合している；オープンリー
ディングフレームは保存されている。Some functions of this linker are noted: one new amino acid is introduced; part of the deleted sequence of nopaline synthetase is reconstructed;
Two opposing restriction sites are matched; the open reading frame is conserved.
【０１００】つまり、ファセオリン遺伝子のEcoRI／Bam
HI制限断片をリンカーによりEcoRI部位をClaI部位に変
換した後ノパリンシンセターゼ遺伝子のClaI部位へ結合
したのである。この融合遺伝子は、ノパリンシンセター
ゼのプロモーター、ノパリンシンセターゼの最初の58個
のアミノ酸、リンカー（これはノパリンシンセターゼ配
列の一部分を再構成し、かつ、新しいアミノ酸１個をそ
う入したもの）、及び最初の12個のアミノ酸残基を省く
すべてのファセオリンを含んでいる。In other words,EcoRI /Bam of the phaseolin gene
The HI restriction fragment is the bound toCla I site of the nopaline synthetase gene converts theEco RI site at theCla I site by linker. This fusion gene contains the promoter of nopaline synthetase, the first 58 amino acids of nopaline synthetase, a linker (which rearranges part of the nopaline synthetase sequence and inserts a new amino acid. And all phaseolin omitting the first 12 amino acid residues.
【０１０１】2. 1 リンカーの合成 次に示す２個のリンカーを合成した。2.1Synthesis of Linkers The following two linkers were synthesized.
【０１０２】[0102]
【化１３】Embedded image
【０１０３】これらを実施例１７の方法により合成し
た。これらのオリゴクレオタイドａ）とｂ）はアニール
して次の構造を形成する。These were synthesized by the method of Example 17. These oligonucleotides a) and b) anneal to form the following structure:
【０１０４】[0104]
【化１４】Embedded image
【０１０５】2. 2 シャトルベクターの調製 pKS nop IV（構造は図８に記述してある）は、pRK 290
のBglII部位にノパリンのT-DNAをクローン化したもので
ある。そのノパリンのT-DNAは唯一ClaI部位を有する。
これは、nos中のClaI部位とnos遺伝子の外側下流部分の
ClaI部位との間が欠失した結果である（図７、図８）。2.2Preparation of Shuttle Vector pKS nop IV (the structure is described in FIG. 8) was constructed using pRK290
Is a clone of the nopaline T-DNA at theBgl II site. The nopaline T-DNA has only oneCla I site.
This is outside the downstream portion of theCla I site andnos genes innos
This is the result of deletion between theClaI site (FIGS. 7 and 8).
【０１０６】我々はpKS4-KB（図９）を精製し、EcoRIで
分解した。4.8kbpのkan／bean耐性断片をゲル電気泳動
により精製した。この断片はTn5のカナマイシン耐性遺
伝子（kan)のBamHI／EcoRI断片にBamHI部位で連結して
いるEcoRI／BamHIのファセオリンDNAの断片(kan／bean
中のbeanとして称される）を含んでいる。We purified pKS4-KB (FIG. 9) and digested it withEco RI. A 4.8 kbpkan / bean resistant fragment was purified by gel electrophoresis. This fragmentBam HI /Eco RI fragment are linked byBam HI sitesEco RI /Bam HI phaseolin DNA fragment of the kanamycin resistance gene of Tn5(kan) (kan / bean
(Referred to as a bean inside).
【０１０７】我々は、ClaIにより直線化したpKS-nop IV
をkan／bean断片及び、例2.1に示すリンカーを用いて連
結した。E.coli K802を形質転換し、カナマイシン及び
テトラサイクリン耐性コロニーを選択した。二通りの配
置が存在し、その一つは、ファセオリンDNAがノパリン
シンセターゼ遺伝子に連結したものであり、もう一つ
は、カナマイシン耐性遺伝子がノパリンシンセターゼの
隣に連結したものであった。図１０に示した要求される
配置を持ったプラスミド、pNNN1、を保有する細胞を決
定する為に、 制限部位地図作成を用いた。We used pKS-nop IV linearized withCla I.
Was ligated using thekan / bean fragment and the linker shown in Example 2.1.E. coli K802 was transformed and kanamycin and tetracycline resistant colonies were selected. There were two configurations, one with phaseolin DNA linked to the nopaline synthetase gene and another with the kanamycin resistance gene linked next to the nopaline synthetase. . Restriction site mapping was used to determine cells carrying the plasmid, pNNN1, with the required configuration as shown in FIG.
【０１０８】2. 3 pTiC58上のノパリンシンセターゼ遺
伝子の修飾されたファセオリンへの置換 アグロバクテリウム・チューメファシエンス−strR C5
8、E.coli(pRK 2013)、及びE.coli（PNNN1)の間の三親
交雑（従来技術のシャトルベクターの項を参照）を用い
て、構成物をTiプラスミドへ挿入した。2.3 Nopaline Synthetase Residue on pTiC58
Substitution of genesinto modified phaseolin Agrobacterium tumefaciens-strR C5
8. The construct was inserted into the Ti plasmid using a triparental cross betweenE.coli (pRK 2013) andE. coli (PNNN1) (see section on prior art shuttle vectors).
【０１０９】我々はストレプトマイシン、カナマイシ
ン、及びテトラサイクリンに耐性なアグロバクテリウム
・チューメファシエンス細胞を選択した。選択した形質
転換体をE.coli（pPHIJI）と交雑し、カナマイシン及び
ゲンタマイシン耐性コロニーを選択した。We have selected Agrobacterium tumefaciens cells resistant to streptomycin, kanamycin and tetracycline. The selected transformants were crossed withE. coli (pPHIJI), and kanamycin and gentamicin resistant colonies were selected.
【０１１０】2. 4 クラウンゴールの形成及び発現 ヒマワリに接種し組織培養中でクラウンゴールを形成さ
せた。発現の試験は、実施例１７及び２０で示したよう
にELISA及びmRNAへのハイブリダイゼーションにより行
った。2.4Formation and expression of crown gall Sunflower was inoculated to form crown gall in tissue culture. Testing of expression was performed by ELISA and hybridization to mRNA as described in Examples 17 and 20.
【０１１１】（実施例３）この実施例の目的は、ATG翻
訳開始信号から構造遺伝子の残りの部分へ連結すること
ができるEcoRI部位までの完全なファセオリン遺伝子の
コーディング配列の再構成である。5'末端にClaI部位を
構成する。そうすれば該遺伝子を容易に復元することが
できる。次に示す２個のオリゴ又クレオタイド配列を合
成した。Example 3 The purpose of this example is to reconstruct the complete phaseolin gene coding sequence from the ATG translation initiation signal to theEco RI site which can be linked to the rest of the structural gene. Constructs aCla I site at the 5 'end. Then, the gene can be easily restored. The following two oligo or nucleotide sequences were synthesized.
【０１１２】[0112]
【化１５】Embedded image
【０１１３】これらはアニールして次に示す構造を形成
し得る。These can be annealed to form the structure shown below.
【０１１４】[0114]
【化１６】Embedded image
【０１１５】実施例１の場合と同様、 次に示すファセ
オリンのEcoRI部位：As in Example 1, the followingEcoRI site of phaseolin:
【０１１６】[0116]
【化１７】Embedded image
【０１１７】は、次の構造へ開裂し得る。Can be cleaved to the following structure:
【０１１８】[0118]
【化１８】Embedded image
【０１１９】この末端を前述の合成二本鎖ヌクレオタイ
ドリンカーへ連結するとコーディング配列の先頭のClaI
粘着末端よりの完全なファゼオリンのポリペプチドをコ
ードする遺伝子が生じる。When this end was linked to the above-mentioned synthetic double-stranded nucleotidelinker ,Cla I at the beginning of the coding sequence wasobtained.
A gene encoding the entire phaseolin polypeptide beyond the sticky ends results.
【０１２０】3. 1 リンカーの合成 実施例１７の方法により次の２個のリンカーを合成し
た。3.1Synthesis of Linker The following two linkers were synthesized by the method of Example 17.
【０１２１】[0121]
【化１９】Embedded image
【０１２２】これらはアニールし、 次の構造を形成す
る。These are annealed to form the following structure.
【０１２３】[0123]
【化２０】Embedded image
【０１２４】3. 2 pKS-nop IVにクローン化されている
ファセオリン遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子の完全
な構成Cla Iで直線化したpKS-nop IVを実施例3.1で示した。ア
ニールしたリンカーとKS4-KB（実施例2.2を参照）由来
の精製kan／beanEcoRI断片とを連結した。E. coli K80
2 を形質転換し、テトラサイクリン及びカナマイシン耐
性コロニーを選択した。また、二種の配置が可能なので
あるが、ファセオリン遺伝子がノパリンシンセターゼ遺
伝子の隣に連結されたものはただ一つであった。正しい
配置のクローンをエンドヌクレアーゼ地図作成後に選択
した。3.2 Cloned into pKS-nop IV
Complete phaseolin gene and kanamycin resistance gene
PKS -nop IV linearized withCla I in adifferent configuration is shown in Example 3.1. The annealed linker and the purified kan / beanEco RI fragment from KS4-KB (see Example 2.2) were ligated.E. coli K80
2 were transformed and tetracycline and kanamycin resistant colonies were selected. Also, two types of arrangement were possible, but only one where the phaseolin gene was linked next to the nopaline synthetase gene. Correctly placed clones were selected after endonuclease mapping.
【０１２５】3. 3 クラウンゴール形成及び発現 実施例２１に示す大要に従って、相同部位組み換え及び
クラウンゴール組織培養の単離を行った。そして、クラ
ウンゴールにおけるファセオリン遺伝子の発現の試験
は、実施例１９及び２０と同様に行った。3.3Formation and expression of crown gall Homology site recombination and isolation of crown gall tissue culture were performed according to the outline shown in Example 21. Then, a test for expression of the phaseolin gene in crown gall was performed in the same manner as in Examples 19 and 20.
【０１２６】（実施例４）ここに示す構成の目的は、ク
ラウンゴール細胞中での外来遺伝子の発現の為のpTi方
式に用いるシャトルベクターの構成方法を教えることに
ある。そこでは、外来遺伝子はnosプロモーターの支配
下にあり部分的に合成物を含む、また、ノパリンシンセ
ターゼをコードする部分は無くなっている。構成を開始
するに先だち、pTiC58T-DNA（pCF44A)クローンの配列を
nosプロモーターを見つけるべく決定した（図５および
６）。(Example 4) The purpose of the construction shown here is to teach a construction method of a shuttle vector used in the pTi system for expression of a foreign gene in crown gall cells. There, the foreign gene is under the control of thenos promoter and contains partially synthetic products, and the part encoding nopaline synthetase is missing. Before starting construction, the sequence of the pTiC58T-DNA (pCF44A) clone was
The decision was made to find thenos promoter (FIGS. 5 and 6).
【０１２７】4. 1 nosプロモーターの５′部分の単離 PCF44をXhoIで切り、再び連結し、それをpCF44Bと名ず
けた。それは次の構造をもつ。4.1Isolation of the 5 'portion of the nos promoter PCF44 was cut withXhoI , ligated again, and named pCF44B. It has the following structure:
【０１２８】[0128]
【化２１】Embedded image
【０１２９】この新しいプラスミドのSstII断片を欠失
させる結果としてできたプラスミドpCF44Cは次のとおり
である。The plasmid pCF44C resulting from deletion of theSstII fragment of this new plasmid is as follows:
【０１３０】[0130]
【化２２】Embedded image
【０１３１】これをBgl IIで分解し、3.6kbp断片をpRK2
90のBgl II部位に挿入する。Grunstein-Hogness分析に
おいてＴ−ＤＮＡをハイブリダイゼーションする為に選
択したコロニーをpKS-nop Vと名づける。それをClaIで
分解し、再び連結しpKS-nop VIを形成する。This wasdigested with BglII, and the 3.6 kbp fragment was digested with pRK2
Insert at 90Bgl II site. The colony selected for hybridizing the T-DNA in the Grunstein-Hogness analysis is named pKS-nopV. It isdigested withCla I andreligated to form pKS-nop VI.
【０１３２】[0132]
【化２３】Embedded image
【０１３３】これをClaIとSstIIで分解すると22Kbpの直
線化したビークル(Vehicle)と355bpの断片が得られる。
これらは、塩勾配遠心分離により容易に分けることがで
きる。該断片を、HinfIで分解後、149bpのSstII/HinfI
および208bpのClaI/HinfI断片をゲル電気泳道により単
離する。When this isdigested withCla I andSst II, a linearized vehicle (Vehicle) of 22 Kbp and a fragment of 355 bp are obtained.
These can be easily separated by salt gradient centrifugation. Afterdigesting the fragment withHinf I, 149bp Sst II /Hinf I
And a208 bpCla I /Hinf I fragment are isolated by gel electrophoresis.
【０１３４】4.2 リンカーの合成 実施例１７の方法により次の二つのリンカーを合成し
た。4.2 Synthesis of Linkers The following two linkers were synthesized according to the method of Example 17.
【０１３５】[0135]
【化２４】Embedded image
【０１３６】これらは、たがいにアニールし、次に示す
構造を形成する。These are annealed each other to form the following structure.
【０１３７】[0137]
【化２５】Embedded image
【０１３８】この配列は、左側にHinfI部位を、そして
右側にNcoIおよびClaI部位を有する。交互の配列はNcoI
部位とClaI部位の間に、BclI部位を有するであろう。こ
の配列は下線で示したA-TベースペアーとGLベースペア
ーの置換を除くとＴ−ＤＮＡにおいて見つかったものと
一致する。[0138] This sequence, theHinf I site on the left, and the right side has aNco I andCla I sites. Alternating sequence isNco I
There will be aBcl I site between the site and theCla I site. This sequence is identical to that found in T-DNA except for the substitutions of the AT base pair and the GL base pair which are underlined.
【０１３９】4.3 pNNN2の組み立て 22kbpのClaI／SstIIビークルを図１１に示すように149b
pのSstII／HinfI断片および合成リンカーにより連結す
ると次の構造を形成する。4.3 Assembly of pNNN2 A22 kbpCla I /Sst II vehicle was loaded with 149b as shown in FIG.
The following structure is formed when linked by theSstII /HinfI fragment of p and the synthetic linker.
【０１４０】[0140]
【化２６】Embedded image
【０１４１】4.4 フォセオリン遺伝子の挿入および発
現 実施例4.3で構成したプラスミドpNNN2（図１１）をClaI
で切り、実施例4.2で合成したClaI／EcoRIリンカーおよ
びpKS4-KBから電気泳道的に精製したEcoRI／ClaIkan／
bean遺伝子の断片と混ぜて連結し、形質転換、単離、制
限地図作成を行う。適当なプラスミドpNNN4を実施例２
１、１９および２０に記載したように導入し、発現の試
験を行う。4.4 Insertion and Expression of Fosseolin Gene
Plasmid pNNN2 (FIG. 11) constructed in thepresent Example 4.3 was replaced with ClaI.
In turn, synthesized in Example 4.2Cla I /Eco RI linker and pKS4-KB electricity from泳道to purifiedEco RI /Cla Ikan /
Mix with the bean gene fragment and ligate to transform, isolate and create a restriction map. The appropriate plasmid pNNN4 was prepared in Example 2.
Introduce and test for expression as described in 1, 19 and 20.
【０１４２】4.5 イントロンを欠くフォセオリン遺伝
子の挿入および発現 実施例4.4に概略した手順をpcDNA31のpKS4-KBあるいはp
KS4-KBのpMC6-cDNA由来のアナログについての交換によ
り繰り返す。4.5 Fosseolin inheritance lacking introns
The procedure outlined in Example 4.4 for pKS4-KB or pKS of pcDNA31
Repeat by exchanging for analog from KS4-KB pMC6-cDNA.
【０１４３】4.6 フォセオリンcDNAの挿入および発現 この構成は、cDNA、一本鎖PstIリンカーおよびPstIkan
断片を使用することについて、実施例１０に類似してい
る。又、半合成nosプロモーターの使用については実施
例4.1、4.2および4.3に類似している。性格づけ、移
入、および発現試験については実施例4.4に記述したも
のと同様である。[0143]4.6 Insertion and expression This constructionof Foseorin cDNA is, cDNA, single-strandedPst I linker andPst Ikan
Similar to Example 10 for using fragments. Also, the use of a semi-syntheticnos promoter is similar to Examples 4.1, 4.2 and 4.3. Characterization, transfer, and expression tests are as described in Example 4.4.
【０１４４】実施例4.3で構成したプラスミド、pNNN2
（図１１）をClaIで切り、実施例4.2で合成したClaI／E
coRIリンカー、pKS4-KBかから単離し、電気泳動的に精
製した1.7kbpのEcoRI／PstI bean断片、電気泳動的に精
製した0.93kbpのPstI Tn5kan断片、およびすでに実施
例１７の方法により合成した一本鎖ClaI／PstIリンカー
５’ＣＧＡＡＴＴ３’を混ぜ連結した。The plasmid constructed in Example 4.3, pNNN2
(FIG. 11) was cut withCla I andCla I /E synthesized in Example 4.2.
The coRI linker, a 1.7 kbpEco RI /Pst I bean fragment isolated from pKS4-KB and electrophoretically purified, a 0.93 kbpPst I Tn5kan fragment electrophoretically purified, and The single-chainCla I /Pst I linker 5 ′ CGAATT3 ′ synthesized by the method was mixed and ligated.
【０１４５】（実施例５）この構成の目的は、EcoRI部
位からBamHI部位までのファセオリン遺伝子をP403のHin
dIII部位にまたがる活性Ｔ−ＤＮＡ遺伝子（このmRNA
は、地図上、1.6と記されている、図１参照）へ連結す
ることである。この配列（図１２および図１３参照）を
P401の右側にClaI部位のあるHindIII部位から決定した
(図１４参照)。HindIII部位とClaI部位の間から始まりH
indIII部位へ向かうオープンリーディングフレームがあ
る（図１４に地図で示される1450bpのmRNAを参照）。[0145] (Example 5) The purpose of this arrangement,Hin of the phaseolin gene fromEco RI site to theBam HI site P403
active T-DNA gene spanningd III site (this mRNA
Means to connect to 1.6 on the map, see FIG. 1). This sequence (see FIGS. 12 and 13)
Determined fromHind III site withCla I site on the right side ofP401
(See FIG. 14).H betweenHind III site andCla I site
there is an open reading frame towards theind III site (see mRNA of 1450bp shown on map in FIG. 14).
【０１４６】このClaI部位は、HindIII部位に広がる遺
伝子のmRNAの翻訳されないリーダーの中にある。我々
は、p403の中央ClaI断片を切り省くことによりプロモー
タービークルを作成した。これは、中のClaI部位は、E.
coli株中でメチル化されていないか、EcoRI部位の隣のC
laI部位はメチル化されているので可能である。ThisCla I site is in the untranslated leader of the mRNA of the gene spanning theHind III site. We created a promoter vehicle by truncating the centralCla I fragment ofp403 . This is because theCla I site inE.
Either unmethylated in theE. coli strain orC next to theEco RI site
This is possible because thela I site is methylated.
【０１４７】ここで、ファセオリン遺伝子をClaI部位
に、ATGをもったまま連結する。これは、pKS4-3.0KBを
用いれば可能である。pBR322のClaI部位からファセオリ
ンのEcoRI部位に至る塩基配列を次に示す。Here, the phaseolin gene isligated to theClaI site with ATG. This is possible using pKS4-3.0KB. The nucleotide sequence from theCla I site of pBR322 to theEco RI site of phaseolin is shown below.
【０１４８】[0148]
【化２７】Embedded image
【０１４９】オープンリーディングフレームおよびATG
に留意のこと。ClaI部位と翻訳開始信号(ATG)の間に
は、18bpがある。これをClaI部位からＴ−ＤＮＡ遺伝子
の開始までの12bpと比較する。Open Reading Frame and ATG
Keep in mind. There is an 18 bp between theCla I site and the translation initiation signal (ATG). This is compared to 12 bp from theCla I site to the start of the T-DNA gene.
【０１５０】[0150]
【化２８】Embedded image
【０１５１】再び、オープンリーディングフレームとAT
Gに留意のこと。このように、プロモータークローンのC
laI部位へファセオリン遺伝子を連結すると、T-DNA中で
活性ファセオリン遺伝子を作ることとなる。ファセオリ
ン遺伝子は本来生ずる末端の12残基のアミノ酸について
の２個のアミノ酸が交換されたこととなる。Again, the open reading frame and the AT
Note G. Thus, the promoter cloneC
When connecting the phaseolin gene intola I site, and to make an active phaseolin gene in T-DNA in. In the phaseolin gene, two amino acids are exchanged for the terminal 12 amino acids originally occurring.
【０１５２】5. 1 プロモータービークルの構成 pKSIII（T-DNAクローンp403 (図１参照)に対応するpRK2
90クローン）をClaIで分解し、再連結する。連結混合物
をK802に形質転換し、カナマイシン耐性により選択す
る。プラスミドは、「ミニプレップ」（minipreps) (少
量の培養細胞からプラスミドを調製すること）を行うこ
とにより単離する。又、構造を証明する為に制限地図作
成を行う。新ビークルpKS-ProIはHindIIIでは分解でき
ないが、ClaIにより線状化することができる（図１５)
。pKS-ProIを精製し、ClaIによる分解で線状分子を作
る。5.1 Construction of Promoter Vehicle pKSIII (pRK2 corresponding to T-DNA clone p403 (see FIG. 1)
90 clones) aredigested withCla I andreligated . The ligation mixture is transformed into K802 and selected for kanamycin resistance. Plasmids are isolated by performing "minipreps" (preparing the plasmid from small amounts of cultured cells). In addition, a restriction map is created to prove the structure. The new vehicle pKS-Pro I cannot be degraded byHind III, but can be linearized byCla I (Fig. 15).
. Purify pKS-Pro I and make linear molecules by digestion withCla I.
【０１５３】5. 2 部分的ファセオリン遺伝子のカナマ
イシン耐性への連結 ５′側端を除く３′側への広範囲な部分のファセオリン
遺伝子を含む3.0kbpの断片をP7.2(図１６)（ファセオリ
ンゲノミッククローン177.4のpBR322サブクローンで構
造は実施例6.1に記述している。）のHindIIIとBamHI分
解物をアガロースゲル電気泳動から溶出して得た。これ
をpKS4（図２１）から同様に単離した。3.0kbpのカナマ
イシン耐性HindIII／BamHI断片及びHindIIIで線状化し
たpBR322と混ぜ連結した。アンピシリン耐性形質転換体
から単離したプラスミドの制限地図作成後、図９に示す
構造を持ったプラスミドをpKS4-KBとした。5.2 Partial Phaseolin Gene Kanama
A fragment of 3.0kbp containing a phaseolin gene of extensive portions of the 3 'side excluding end'the coupling 5to leucine resistance P7.2 (FIG. 16) (structure pBR322 subclone of the phaseolin genomic clone 177.4 mayHind III andBam HIdigests ( described in Example 6.1) were eluted from agarose gel electrophoresis. It was similarly isolated from pKS4 (FIG. 21). Linked mixed with linearized pBR322 with kanamycin resistanceHind III /Bam HI fragment andHind III of 3.0 kbp. After creating a restriction map of the plasmid isolated from the ampicillin-resistant transformant, the plasmid having the structure shown in FIG. 9 was designated as pKS4-KB.
【０１５４】5. 3 pKS4-3.0KBからの kan／bean断片の
精製 pKS4-KB(図９)をClaIで分解し、4.9kbp断片をアガロー
スゲル電気泳動により精製した。5.3 of the kan / bean fragment from pKS4-3.0KB
Purified pKS4-KB (FIG. 9) wasdigested withClaI , and the 4.9 kbp fragment was purified by agarose gel electrophoresis.
【０１５５】5. 4 ClaI kan／bean耐性断片のClaI分解
pKS-Pro Ｉへの連結 pKS-Pro ＩをClaI分解で線状化し、実施例5.3 からのカ
ナマイシン耐性遺伝子／bean断片を一緒に連結し、K802
へ形質転換する。カナマイシン耐性形質転換体を選び
「ミニプレップ」により単離したプラスミドを適当な配
置を持つものを見つける為に制限地図作成を行った。該
プラスミドをpKS-Pro I-KB（図１７）とした。5.4 ClaI degradation of ClaI kan / bean resistant fragment
Ligation to pKS-Pro I pKS-Pro I waslinearized byCla I digestion and the kanamycin resistance gene / bean fragment from Example 5.3 was ligated together and K802
Transform to A kanamycin-resistant transformant was selected, and a restriction map was prepared for the plasmid isolated by "miniprep" to find one having an appropriate arrangement. This plasmid was designated as pKS-Pro I-KB (FIG. 17).
【０１５６】5. 5 形質転換及び発現 pKS-Pro I-KBを持つ細胞をpTi15955、pTiA60あるいは他
の適当なTIPプラスミドを持つアグロバクテリウム細胞
と交雑する。カナマイシンで組み換え体を選択後、植物
に接種し、組織培養でクラウンゴールを形成させた。フ
ァセオリンの合成の試験は実施例１９及び２０に示すと
おりである。5.5Transformation and Expression Cells harboring pKS-Pro I-KB are crossed with Agrobacterium cells harboring pTi15955, pTiA60 or other suitable TIP plasmids. After selecting recombinants with kanamycin, the plants were inoculated and allowed to form crown gall in tissue culture. Tests for the synthesis of phaseolin are shown in Examples 19 and 20.
【０１５７】（実施例６）この実施例は、他のさまざま
な例に示す、ベクターヘ、ファセオリン遺伝子を挿入す
る進んだ操作に先だって、豆（Phasealusvulgaris L.)
の種子の主要貯蔵タンパク質であるファセオリンの遺伝
子の操作を教える。Example 6 This example demonstrates the use of beans (Phasealusvulgaris L.) prior to the advancedprocedure of inserting the phaseolin gene into a vector, as shown in various other examples.
Teaches the manipulation of the gene for phaseolin, a major storage protein in the seeds of cereals.
【０１５８】6. 1 ファセオリン遺伝子のサブクローニ
ング シャロン（Charon) 24A AG-PVPh 177.4（あるいは、17
7.4 ；S.M.Sun et. al(1981) Nature289：37-41、J.L.
Slightom et.al(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA80；図
１８）中の、ファセオリンのゲノミッククローンをBglI
I及びBamHIで消化した。ファセオリン遺伝子及び隣接配
列を持つ3.8kbp の断片をアガロースゲル電気泳動で単
離し、BamHIで線状化したpBR322と混ぜ連結した。混合
物をHB101に形質転換し、アンピシリン耐性、テトラサ
イクリン感受性コロニーを選択した。6.1 Subclones of phaseolin gene
Ring Sharon (Charon) 24A AG-PVPh 177.4 ( or 17
7.4; SMSun et. Al (1981) Nature289 : 37-41, JL
Slightom et.al (1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA80; FIG. 18) in,Bgl genomic clones phaseolin I
Digested with I andBam HI. A fragment of 3.8kbp with phaseolin gene and flanking sequences was isolated by agarose gel electrophoresis and ligated mixed with linearized pBR322 withBam HI. The mixture was transformed into HB101 and ampicillin-resistant, tetracycline-sensitive colonies were selected.
【０１５９】これらのクローンから単離したプラスミド
の制限地図を作成した。図１９に示す構造を持つプラス
ミドを選択し、AG-pPVPh3.8（あるいは、代わりにP3.
8）とした。BglIIとBamHI部位が互いに連結したもの
は、両方の部位が消失する。Restriction maps of plasmids isolated from these clones were made. A plasmid having the structure shown in FIG. 19 was selected, and AG-pPVPh3.8 (or alternatively, P3.
8)When the Bgl II andBam HI sites are linked together, both sites are lost.
【０１６０】もう一つの177.4のサブクローンを次のよ
うに構成した。まず、EcoRI分解し、ファセオリン遺伝
子の３’側配列および５′側端以外のすべてを含む7.2k
bpの断片を単離し、HB101 形質転換体のアンピシリン選
択したものを制限地図作成後単離する。pBR322のHindII
I部位がファセオリン遺伝子の５′末端と３′末端の翻
訳されない領域に隣接しているような配置の挿入を有す
るプラスミドをAG-pPVPh7.2（あるいは、p7.2；図１
６；Sunetal. and Slightometal.,Supra）とした。Another 177.4 subclones were constructed as follows. First,Eco RI digestion was carried out, and 7.2k including all but the 3 'sequence and 5' end of the phaseolin gene
The bp fragment is isolated and the HB101 transformants selected for ampicillin are isolated after restriction mapping.Hind II of pBR322
Plasmids with insertions such that the I site is adjacent to the untranslated regions at the 5 'and 3' ends of the phaseolin gene were cloned into AG-pPVPh7.2 (or p7.2; FIG. 1).
6; Sunetal . And Slightometal .,Supra ).
【０１６１】6. 2 カナマイシン耐性遺伝子のクローニ
ング及び単離 pRZ102（R.A.Jorgensonetal.(1979) Molec. gen. Gen
et.177：65-72)（これはトランスポゾンTn5 を１コピー
持つColE１プラスミドである）を、BamHI及びHindIIIで
分解し、前もって同じ２つの酵素で線状化してあるpBR3
22と混ぜ、連結し、K802へ形質転換した。アンピシリン
及びカナマイシンの両方に耐性な形質転換体から単離し
たプラスミドの制限地図を作成し、図２１に示す構造を
もつものをpKS-4 とした。6.2 Cloning of Kanamycin Resistance Gene
And isolated pRZ102 (RAJorgensonetal . (1979) Molec. Gen. Gen.
et.177 : 65-72) (this is a ColE1 plasmid with one copy of the transposon Tn5) was digested withBam HI andHind III and pBR3 previously linearized with the same two enzymes.
22 and ligated and transformed into K802. A restriction map of a plasmid isolated from a transformant resistant to both ampicillin and kanamycin was prepared, and a plasmid having the structure shown in FIG. 21 was designated as pKS-4.
【０１６２】6. 3 ファセオリン遺伝子とカナマイシン
耐性との結合 P3.8をClaIとBamHIで分解し、ファセオリン遺伝子とpBR
322の一部分の配列を含む4.2kbpの断片をアガロースゲ
ル電気泳動より単離した。これをpKS4（図２１）からの
カナマイシン耐性（ネオマイシンフォスフォトランスフ
ェラーゼII）遺伝子を持ったTn5のClaI／BamHI断片及び
ClaIですでに線状化したpBR322（図２０）と混ぜた。混
合物を連結し、K802へ形質転換した。アンピシリン及び
カナマイシン耐性コロニーを選択し、制限地図作成を行
った。図２２に示す構造をもつコロニーをpKS-KB 3.8と
した。もう一つの有用なプラスミド、pKS4-KBの構造は
実施例5.2 に示してある。6.3 Phaseolin gene and kanamycin
P3.8binding toresistance is digested withCla I andBam HI, and the phaseolin gene and pBR
A 4.2 kbp fragment containing a partial sequence of 322 was isolated by agarose gel electrophoresis. This pKS4 (Fig. 21)Cla I /Bam HI fragment and the kanamycin resistance Tn5 having (neomycin phosphotransferase II) gene from
It was mixed with pBR322 alreadylinearized withClaI (FIG. 20). The mixture was ligated and transformed into K802. Ampicillin and kanamycin resistant colonies were selected and a restriction map was made. A colony having the structure shown in FIG. 22 was designated as pKS-KB 3.8. The structure of another useful plasmid, pKS4-KB, is shown in Example 5.2.
【０１６３】（実施例７）この実施例は、ファセオリン
のゲノミッククローンに対するcDNAクローンの置換以外
は、実施例５に述べた構成に類似している。この構成に
よりイントロンを欠失した遺伝子ができるだろう。Example 7 This example is similar to the configuration described in Example 5, except for the replacement of the cDNA clone with the phaseolin genomic clone. This configuration would result in a gene lacking introns.
【０１６４】7. 1 pKS4-KB 2.4（pKS4-KB に類似）の
構成 pMC6をEcoRIとBamHIで分解した後、2.4kbpのファセオリ
ンcDNA断片を塩勾配遠心かゲル電気泳動により単離す
る。カナマイシン耐性遺伝子を含む1.9kbpの断片をpKS4
（図２１）のEcoRI及びBamHI分解から精製し、cDNA断片
及び、EcoRIで線状化したpBR322と混ぜ、連結し、K802
へ形質転換する。カナマイシン耐性コロニーを選択し、
プラスミドを単離し制限地図作成後、図２４に示すプラ
スミドをpKS4-KB2.4とした。7.1 pKS4-KB 2.4 (similar to pKS4-KB)
After digestion of theconstructed pMC6 withEco RI andBam HI, a 2.4 kbp phaseolin cDNA fragment is isolated by salt gradient centrifugation or gel electrophoresis. A 1.9 kbp fragment containing the kanamycin resistance gene was cloned into pKS4
Purified fromEco RI andBam HI degradation (Fig. 21), cDNA fragments and mixed with pBR322 which had been linearized withEco RI, ligated, K802
Transform to Select kanamycin resistant colonies,
After the plasmid was isolated and a restriction map was prepared, the plasmid shown in FIG. 24 was designated as pKS4-KB2.4.
【０１６５】7. 2 Cla I kan／bean DNAのCla Iで分解
したpKS-Pro Iへの連結 pKS4-KB2.4をClaIで分解しClaIで線状化したpKS-proI
（図１５）と連結する。形質転換、選択、プラスミド単
離そして性格ずけの後、希望の構造（すなわち、ファセ
オリン配列がT-DNA プロモーターへ隣接している）をTi
プラスミドへ移入する。接種及び試験は実施例２１、１
９、及び２０に述べるとおりである。7.2 Degradation of Cla I kan / bean DNA with Cla I
The pKS-Pro connecting pKS4-KB2.4to I was digested withCla ICla I in linearizedPKS-pro I
(FIG. 15). After transformation, selection, plasmid isolation and characterization, the desired structure (ie, the phaseolin sequence flanked by the T-DNA promoter) is
Transfer to plasmid. The inoculation and test were performed in Examples 21 and 1,
9 and 20.
【０１６６】（実施例８）この実施例は遺伝子からイン
トロンを除く方法を教える。これは、ゲノミックな環境
にcDNAを配置することと同じことである。制限酵素部位
は、処理されていない転写物（transcript) の５′及び
３′末端の両方のエクソン中に見出されるかあるいは特
異的変異により作られる。これらの部位はゲノミックク
ロン及びcDNAの両方に存在する。介在イントロンを含む
DNAを除き、対応するイントロンを含まないcDNAクロー
ン断片を２つの部位に橋渡しすることができる。逆の操
作も可能である：イントロンを含むゲノミック配列をcD
NA環境に配置することもできる。Example 8 This example teaches how to remove introns from a gene. This is the same as placing cDNA in a genomic environment. Restriction enzyme sites are found in exons at both the 5 'and 3' ends of the untreated transcript or are created by specific mutations. These sites are present in both genomic clones and cDNA. Includes intervening introns
Except for DNA, the corresponding intron-free cDNA clone fragment can be bridged between the two sites. The reverse is also possible: genomic sequences containing introns can be cD
It can be placed in NA environment.
【０１６７】ゲノミッククローンの中の断片をcDNAクロ
ーンを切り出した対応するすき間（gap)へ挿入する。こ
の後者の方法は類似しているが、イントロンがその変換
される断片を作るために選ばれる酵素に感受性な部位を
含むよりもしばしば、技術的にはより困難である。この
困難は部分分解の条件の注意深い選択とアガロースゲル
電気泳動による所望断片の精製により克服された。この
戦略をさらにねったものは、遺伝子内の個々のイントロ
ンを他のイントロンとエクソンとに影響を及ばさないで
操作すること、および不都合な介在する制限部位が上述
するようにイントロン内に存在するときの配列を段階的
に交換することを含む。The fragments in the genomic clone are inserted into the corresponding gaps from which the cDNA clone has been cut. This latter method is similar, but often more technically more difficult than introns containing sites sensitive to the enzyme chosen to make the fragment to be converted. This difficulty was overcome by careful selection of the conditions for partial digestion and purification of the desired fragment by agarose gel electrophoresis. A further ramification of this strategy is the manipulation of individual introns in the gene without affecting other introns and exons, and undesired intervening restriction sites are present in introns as described above. Includes gradual replacement of the current sequence.
【０１６８】8. 1 ファセオリンのイントロンを含む断
片のcDNAとの置換 ファセオリン遺伝子及びその付近の配列のプラスミドク
ローンであるp3.8をEcoRIで部分分解、SacIで完全分解
し、pBR322ベクターと遺伝子の５′及び３′の両末端を
含む6.4kbpの断片をアガロースゲル電気泳動により単離
した。ファセオリンmRNAから作ったcDNAのpBR322プラス
ミドクローンであるpcDNA31をSacIで部分分解、EcoRIで
完全分解し、５′及び３′末端を除く全ファセオリンcD
NAを含む1.33kbpの断片をアガロースゲル電気泳動によ
り単離した。これらの２つの断片を連結して、HB101へ
形質転換した。コロニーを選択し、細胞を増殖させ、プ
ラスミドを単離し、制限地図作成により、希望の構造を
もつプラスミドを決定した。このプラスミドをp3.8-cDN
Aとした（図２５) 。8.1 Sections containing phaseolin introns
Substituted phaseolin gene and partially digested p3.8, a plasmid clone of the sequence around the atEco RIand cDNA pieces were completely digested withSac I, including both ends of the 5 'and 3' of the pBR322 vector and gene A 6.4 kbp fragment was isolated by agarose gel electrophoresis. Partially disassembled a pBR322 plasmid clone of cDNA made from phaseolin mRNA PcDNA31 withSac I, and completely digested withEco RI, all phaseolin cD except 5 'and 3' ends
A 1.33 kbp fragment containing NA was isolated by agarose gel electrophoresis. These two fragments were ligated and transformed into HB101. Colonies were selected, cells were grown, plasmids were isolated, and plasmids with the desired structure were determined by restriction mapping. This plasmid is called p3.8-cDN
A (FIG. 25).
【０１６９】8. 2 p3.8-cDNA の利用 次のことに留意のこと。p3.8-cDNA は他の実施例で用い
られているp3.8のようなゲノミックDNA源（source)の代
わりをすることができる。又、そのように使用したと
き、イントロンを欠いているという相違をもつ類似した
例となる。もしくは、この戦略はすでに作った構造から
イントロンを除くのに使うことができる。8.2 Use of p3.8-cDNA Note the following: p3.8-cDNA can replace the genomic DNA source like p3.8 used in other examples. Also, when used as such, there is a similar example with the difference that the intron is missing. Alternatively, this strategy can be used to remove introns from already created structures.
【０１７０】（実施例９）この実施例はイントロンのな
い遺伝子の発現を教える。ファセオリンcDNAを実施例８
に述べたように調製する。遺伝子はイントロンを欠いて
いるがこれも又、使うことができる。Example 9 This example teaches the expression of a gene without introns. Phaseolin cDNA in Example 8
Prepared as described. The gene lacks introns, but can also be used.
【０１７１】実施例８で教えたものと類似の構成を用い
る。pKS4-KB とpMC6を実施例８のようにEcoRIとSacIで
分解し、そこで示したようにcDNAを挿入したものをベク
ター及びファセオリンの５′及び３′末端部分を含むpK
S4-KB 断片に連結する。新プラスミド、pKS4-KBcをpKS4
-KBと類似した方法で構成に用いる。A structure similar to that taught in the eighth embodiment is used. pKS4-KB and the pMC6 digested withEco RI andSac I as in Example 8, where 5 those insert a cDNA vector and phaseolin as shown 'and 3' pK containing terminal moiety
Link to the S4-KB fragment. New plasmid, pKS4-KBc to pKS4
Used for configuration in a manner similar to -KB.
【０１７２】（実施例１０）この実施例の目的はT-DNA
の中にT-DNA遺伝子のプロモーター支配下で、Phaseolus
vulgarisレクチンのcDNAを設置し、その構成物を植物
細胞へ移入し、植物組織でのこの構成物の発現を見つけ
ることである。Example 10 The purpose of this example was to use T-DNA
Under the control of the T-DNA gene promoter,Phaseolus
To place the vulgaris lectin cDNA, transfer the construct to plant cells, and find expression of this construct in plant tissue.
【０１７３】この構成には、制限酵素PstI及びHindIII
での分解により生じた粘着末端を接続する一本鎖リンカ
ーが使われている。下記のPstI部位とHindIII部位：This construction includes the restriction enzymesPst I andHind III
A single-stranded linker is used to connect the sticky ends generated by the cleavage in the above. The followingPst I andHind III sites:
【０１７４】[0174]
【化２９】Embedded image
【０１７５】が開裂すると次の末端を形成する。When cleaved, the next end is formed.
【０１７６】[0176]
【化３０】Embedded image
【０１７７】そして適当な配列のリンカーの存在下に混
ぜる。The mixture is mixed in the presence of a linker having an appropriate sequence.
【０１７８】[0178]
【化３１】Embedded image
【０１７９】これらは、 互いに連結し、 次に示す構造
を形成し得る。These can be connected to each other to form the following structure.
【０１８０】[0180]
【化３２】Embedded image
【０１８１】HindIII部位が再び構成されたことに留意
のこと。Note that theHind III site was reconstituted.
【０１８２】レクチンのcDNAをプラスミドクローン、 p
PVL134及びATCC39181より得る。pPVL134及びATCC39181
はポリＣ鎖をつけた２本鎖cDNAをPstIで切りポリＧ鎖を
つけたpBR322に挿入することにより構成した。このクロ
ーンはL.Hoffmanetal.(1982) Nucleic Acids Res.10:
7819-7822により記述されたものと同種である。The lectin cDNA was transformed into a plasmid clone, p
Obtained from PVL134 and ATCC39181. pPVL134 and ATCC39181
It was constructed by inserting a double-stranded cDNA wearing a poly C chain pBR322 wearing a cut poly G chain atPst I. This clone was obtained from L. Hoffmanetal . (1982) Nucleic Acids Res.10 :
Similar to that described by 7819-7822.
【０１８３】10. 1 リンカーの合成 リンカー5’AGCTTGCA3’を実施例１７の方法により合成
する。10.1Synthesis of Linker The linker 5′AGCTTGCA3 ′ is synthesized by the method of Example 17.
【０１８４】10. 2 レクチンcDNA及びカナマイシン耐
性遺伝子を含むクローンの構成 pPVL134をBclI及びPstIで分解し、レクチンのコーディ
ング配列、３′の翻訳されない領域及びC/G鎖を含む中
間の大きさの断片を電気泳動で分画後アガロースゲル電
気泳動から溶出することにより単離する。pBR 325をBcl
I及びHindIIIで分解し、一番大きな断片を塩勾配を通し
て、沈降させ単離する。BclI／HindIIIpBR 325断片をBc
lI／PstIレクチン断片及び例10.1で調製したPstI／Hind
IIIリンカーと混ぜ連結する。E.coli K802を形質転換
し、薬剤耐性及びレクチン配列の存在で選択する。その
ような、細胞から単離したプラスミドをIIcとする。IIc
をHindIII及びBamHI分解することにより生じた一番大き
な断片を前もってアガロースゲル電気泳動で単離したpK
S-4 のカナマイシン耐性遺伝子を持つHindIII／BamHI断
片（図２６)と混ぜ連結する。K802を形質転換し、コロ
ニーをカナマイシン耐性で選択する。プラスミドを単離
し制限地図を作成し、性格づけをする。希望のプラスミ
ドをPL-Bとする。10.2Lectin cDNA and Kanamycin Resistance
Construction of the clone containing the sex gene pPVL134 is digested withBcl I andPst I, the intermediate size fragment containing the lectin coding sequence, the 3 'untranslated region and the C / G chain is fractionated by electrophoresis and then subjected to agarose. Isolate by elution from gel electrophoresis.Bcl to pBR 325
Decompose with I andHind III and isolate the largest fragment by sedimentation through a salt gradient.Bcl I /Hind III pBR 325 fragment intoBc
l I /Pst I lectin fragment andPst I /Hind prepared in Example 10.1.
Mix with III linker and ligate.E. coli K802 is transformed and selected for drug resistance and the presence of lectin sequences. Such a plasmid isolated from the cell is designated IIc. IIc
TheHind III andBam HI decomposition isolated large fragment most produced beforehand agarose gel electrophoresis by pK
It is mixed with aHind III /Bam HI fragment having the kanamycin resistance gene of S-4 (FIG. 26) and ligated. Transform K802 and select colonies for kanamycin resistance. Isolate the plasmid, create a restriction map, and characterize it. The desired plasmid is designated as PL-B.
【０１８５】10. 3 pKS-pro IにおけるCla I部位のBam
HIへの変換 実施例5.1に示す構造をもつpKS-pro I（図１５参照）を
ClaIで分解する。この切断点は、1.6kbpの転写物のプロ
モーターとATG翻訳開始信号の間にある（図１参照）。
粘着末端を、DNAポリメラーゼIで埋めることにより平滑
末端に変える。BamHIリンカーをすき間に連結し、露出
したBamHI粘着末端を削り取り、連結し、K802へ形質転
換する。望むプラスミドpKS-pro IA（図２７）を持つコ
ロニーは「ミニプレップ」によるプラスミド単離および
制限酵素地図作成による性格づけの後選択される。10.3 Bam of Cla I site in pKS-pro I
Conversion to HI pKS-pro I having the structure shown in Example 5.1 (see FIG. 15)
Decompose withCla I. This breakpoint is between the promoter of the 1.6 kbp transcript and the ATG translation initiation signal (see FIG. 1).
The sticky ends are changed to blunt ends by filling in with DNA polymerase I.A Bam HI linker is ligated into the gap, the exposedBam HI sticky ends are scraped off, ligated and transformed into K802. Colonies with the desired plasmid pKS-pro IA (FIG. 27) are selected after plasmid isolation by "miniprep" and characterization by restriction mapping.
【０１８６】10. 4 レクチン及びカナマイシン耐性遺
伝子のpKS-pro IA への挿入 pL-B（実施例10.2）をBclI及びBamHIで分解し、カナマ
イシン耐性遺伝子及びレクチン配列をもつ断片を電気泳
動で分画後、アガロースゲルから溶出した。この断片を
BamHIで線状化した。pKS-pro IAと混ぜ連結した。連結
混合物をK802へ形質転換した、プラスミドをカナマイシ
ン耐性コロニーから単離し、制限地図作成により性格づ
けを行い、望みの構造をpLK-pro IA とした（図２
８）。10.4Lectin and kanamycin resistance
Insertion of the gene into pKS-pro IA pL-B (Example 10.2) wasdigested withBcl I andBam HI, and a fragment having a kanamycin resistance gene and a lectin sequence was fractionated by electrophoresis and eluted from an agarose gel. . This fragment
Linearized withBam HI. It was mixed with pKS-pro IA and ligated. The ligation mixture was transformed into K802, the plasmid was isolated from kanamycin resistant colonies, characterized by restriction mapping and the desired structure was designated pLK-pro IA (FIG. 2).
8).
【０１８７】10. 5 植物中での発現 pLK-pro IAをK802 (pLK-proIA)、E.coli(2013)及びアグ
ロバクテリウム・チューメファシエンス(pTi 15955)(ス
トレプトマイシン耐性）の三親交雑（実施例２１）によ
りTiプラスミドへ移入する。pPH1J1のアグロバクテリウ
ムへの付加的、接合的移入の後、二重相同部位組み換え
体をカナマイシン、ストレプトマイシン、及びゲンタマ
イシン上で生育する細胞から選択する。レクチンは適当
な抗体を用いて、ELISA により見つける。10.5Expression in Plants pLK-pro IA is a triparental cross of K802 (pLK-proIA),E. coli (2013) and Agrobacterium tumefaciens (pTi 15955) (streptomycin resistance) Transfer to Ti plasmid by (Example 21). After additional, conjugative transfer of pPH1J1 to Agrobacterium, double homologous site recombinants are selected from cells growing on kanamycin, streptomycin, and gentamicin. Lectins are found by ELISA using appropriate antibodies.
【０１８８】（実施例１１）この実施例の目的は、pTi
15955 及び他のオクトピンTiプラスミドのtms（「シュ
ーティング」ローカス（locus)）からtmr（「ルーティ
ング」ローカス（locus)）まで欠失しているTiプラスミ
ドを生み出すことである。この誘導体は有用である。な
ぜなら、これで形質転換した細胞の方が完全なtmsとtmr
遺伝子を持つpTi 15955で形質転換したものより容易に
完全な植物に再生するからである。(Example 11) The purpose of this example was to make pTi
15955 and other octopine Ti plasmids to create a Ti plasmid that is deleted fromtms ("shooting" locus) totms ("routing" locus). This derivative is useful. Because the cells transformed in this way have more completetms andtmr
This is because the plant is more easily regenerated into a complete plant than one transformed with pTi15955 having the gene.
【０１８９】tms-tmr欠失pTi 15955は結局２つの方法で
変えられる。tms-tmrの不活性化及び外来遺伝子の挿入
である。これらの２つの変化が、T-DNAの違う所にある
ならば、各々の変化は異なるシャトルベクターによって
別々に挿入される。変化に依存する各々のシャトルベク
ターを独立に選択するには、少なくともアグロバクテリ
ウム中で２つの選択マーカーの使用が必要となるだろ
う。通常のカナマイシン耐性に加えてこの例では、pBR
325 由来のクロラムフェニコール耐性も用いる。[0189] Thetms-tmr deletion pTi 15955 is eventually altered in two ways.Inactivation of tms-tmr and insertion of foreign genes. If these two changes are at different places in the T-DNA, each change is inserted separately by a different shuttle vector. Independent selection of each shuttle vector that depends on the change would require the use of at least two selectable markers in Agrobacterium. In this example, in addition to normal kanamycin resistance, pBR
Chloramphenicol resistance from 325 is also used.
【０１９０】11. 1 クロラムフェニコール耐性遺伝子
クローンの構成 pBR325をHincIIで分解し、HindIIIリンカーと平滑末端
結合する。調製物をHindIIIで分解し、再結合し、クロ
ラムフェニコール耐性（cam)で選択したものを、pks-5
とする。これは、cam遺伝子をもつHindIII／BclI断片の
源となる（図２９）。11.1 Chloramphenicol resistance gene
Clone Construction pBR325 is digested withHinc II and blunt-ended withHind III linker. The preparation was digested withHind III, religated, and selected for chloramphenicol resistance (cam ) to pks-5
And This is a source ofHind III /Bcl I fragment having thecam gene (Fig. 29).
【０１９１】11. 2 欠失及び cam遺伝子をもつT-DNA
のpBR322クローンの構成 P203のHindIII完全分解BamHI部分分解から、9.2 kbpの
線状DNA 断片を単離する。cam遺伝子をもつ断片を、pKS
-5から単離し、9.2kbpの線状断片と混ぜ、連結し、E.co
liに形質転換する。そして、クロラムフェニコール耐性
で選択したものをpKS-Oct. Cam 203とする（図３０）。11.2 T-DNA with deletion and cam gene
FromHind III fully decomposedBam HI partial degradation ofpBR322 clone configuration P203of isolated linear DNA fragment of 9.2 kbp.The fragment containing thecam gene was
-5, mixed with a9.2 kbp linear fragment, ligated, andE.co.
Transform toli . The one selected for chloramphenicol resistance is designated as pKS-Oct. Cam 203 (FIG. 30).
【０１９２】pKS-Oct. Cam 203は現在、多数のpTi 1595
5 の欠失TL変異の構成に使えるプラスミドである。それ
は、TLの右手の腕及び右腕の左への耐性遺伝子を含む。
我々はTLの種々の左腕をCam遺伝子の左（HindIII部位）
へ付けることができる。簡単に言えば、もし、p102を付
けたら、欠失は5.2kbpでtmsとtmrのすべてを含むことに
なる。もし、p103を付けたら欠失は3.2kbpとなり、tms
の一部分とすべてのtmrを含むことになる。図１参照。PKS-Oct. Cam 203 currently has a large number of pTi 1595
This plasmid can be used to construct 5 deletion TL mutations. It contains a resistance gene to the right hand arm of the TL and to the left of the right arm.
We placed the various left arms of the TL on the left of theCam gene (Hind III site).
Can be attached to Briefly, if you add p102, the deletion will be5.2kbp andinclude all oftms andtmr . If p103 was added, the deletion would be 3.2kbp,tms
Will include some and all oftmr . See FIG.
【０１９３】pKS-oct.Cam 203をHindIIIで分解する。p1
02あるいはp103を、HindIIIで分解し、2.2kbpあるいは
2.0kbpのT-DNA断片を単離し、線状化したpKS−oct. Cam
203と連結し、形質転換し、生ずるpKS-oct. delII（図
３１）あるいはpKS-oct. delI（図３２）をそれぞれ単
離する。これらの構成を接合、相同部位組み換え及び、
クロラムフェニコール耐性の選択によりアグロバクテリ
ウム・チューメファシエンスに移す。もしくは、BamHI
で、もっているプラスミド構成を線状化し、pRK290のBg
lII部位に連結するという。確立された方法を使えば構
成をpRK 290に移すことができる（図３３）。The pKS-oct.Cam 203 is digested withHindIII . p1
02 or p103 is digested withHind III and 2.2kbp or
A 2.0 kbp T-DNA fragment was isolated and linearized pKS-oct.Cam.
Ligation with 203, transformation, and isolation of the resulting pKS-oct. DelII (FIG. 31) or pKS-oct. DelI (FIG. 32), respectively. Conjugation, homologous site recombination and
Transfer to Agrobacterium tumefaciens by selection for chloramphenicol resistance. OrBam HI
Then, linearize the plasmid structure that you have,Bg of pRK290
It is said to be linked tol II site The structure can be transferred to pRK290 using established methods (FIG. 33).
【０１９４】（実施例１２）この実施例において、tmr
中のHpaI部位からtml中のSmaI部への間のT-DNAの欠失に
よりTiプラスミドを変異させる。修飾され得るTiプラス
ミドは、pTi 15955、pTiB6、pTiA66及びその他である。
この組み立ては、図３４に図解してある。(Embodiment 12) In this embodiment,tmr
Mutating Ti plasmid by deletion of the T-DNA between theHpa I site to theSma I portion intml in. Ti plasmids that can be modified are pTi 15955, pTiB6, pTiA66 and others.
This assembly is illustrated in FIG.
【０１９５】12. 1 cam遺伝子の単離 pKS-5(図２９)をHindIIIとBclIで分解する。実施例１１
で教えたように、最小の断片をアガロースゲルで分画
後、 単離する。12.1Isolation of the cam gene pKS-5 (Figure 29) is digested withHindIII andBclI . Example 11
Isolate the smallest fragment after fractionation on an agarose gel, as taught in.
【０１９６】12. 2 欠失のあるT-DNAのpBR322クローン
の構成 T-DNA の右手の腕の欠失をp203のSmaI部位にBglII部位
を挿入することにより構成する（図１参照）。p203をSm
aIで分解し、BglIIリンカーを連結する。そしてBglIIで
分解し、再連結する。そしてK802へ形質転換する。（変
化した構成においては、BamHIリンカーをBglIIリンカー
の代わりに用いて適当なBamHI部分分解産物を単離す
る。）生じたプラスミドをp203-BglIIとする。そしてそ
れをBglIIとHindIIIで分解する。断片を含む大きなBglI
I／HindIIIベクターを実施例12.1に示したクロラムフェ
ニコール耐性断片と連結する。K802へ形質転換後、クロ
ラムフェニコール耐性を選択する。結果として生じたプ
ラスミドをp2fとする（図３４）。12.2pBR322 clone of T-DNA with deletion
The right hand arm ofstructure T-DNAof the deletion is constructed by inserting aBgl II site at theSma I site of p203 (see Fig. 1). p203 toSm
Digest witha I and ligateBgl II linker. Then disassemble withBgl II and reconnect. Then transform to K802. (In the altered arrangement, using aBam HI linker in place of theBgl II linker to isolate the appropriateBam HI partial degradation product.) The resulting plasmid and p203-Bgl II. And it is decomposed withBgl II andHind III. LargeBgl I with fragment
The I /Hind III vector is ligated with the chloramphenicol resistant fragment shown in Example 12.1. After transformation into K802, chloramphenicol resistance is selected. The resulting plasmid is called p2f (FIG. 34).
【０１９７】12. 3 T-DNAの左手の腕の欠失したクロー
ンの構成Hpa I分解及びHindIIIリンカーとの連結によりp202のHpa
I部位にHindIII部位を挿入する。HindIII分解によりHin
dIII粘着末端を露出させた後、HindIII末端を持つ2kbp
のHpaI断片を単離する。HindIIIで分解したHindIII末端
のHpaI断片をK802へ形質転換する。所望の構造をもつコ
ロニーを単離し、性格ずけをした後、そのプラスミドを
p3eとした（図３５）。12.3T-DNA Clonesin Left Arm Deletion
Hpa linked by the p202with's configurationHpa I decomposition andHind III linker
Insert aHind III site at the I site.Hind IIIHin by the decomposition
After exposing thed III sticky ends, 2 kbp withHind III termini
TheHpaI fragment of is isolated. TheHpa I fragment decomposedHind III ends withHind III to K802 is transformed. After isolating a colony having the desired structure and characterization, the plasmid is
p3e (FIG. 35).
【０１９８】12. 4 T-DNA 欠失クローンの構成 クローンの左手の腕を、電気泳動後、アガロースゲルか
ら溶出し、p3eのHindIII分解物の2kbpの断片を精製する
ことにより得た。p2fをHindIIIで切りアルカリフォスフ
ァターゼ処理後、2kbp断片と混ぜ連結し、K802を形質転
換する。そしてクロラムフェニコール耐性で選択する。
プラスミドを個々のコロニーから単離し、制限地図作成
により性格ずけをした。望みの二つ連なった配置で２つ
の腕を持っているプラスミドを選択し、pKS−oct. delI
IIとした（図３６）。12.4Construction of T-DNA Deletion Clone The left hand arm of the clone was electrophoresed, eluted from an agarose gel, and purified by purifying a 2 kbp fragment ofHindIII digest of p3e. After p2f is cut withHindIII and treated with alkaline phosphatase, it is mixed with a 2 kbp fragment and ligated to transform K802. Then select for chloramphenicol resistance.
Plasmids were isolated from individual colonies and characterized by restriction mapping. A plasmid having two arms in the desired double-stranded configuration was selected, and pKS-oct. DelI was selected.
II (FIG. 36).
【０１９９】pKS-oct. delIIIをアグロバクテリウム・
チューメファシエンスへ交雑により移し、相同部位組み
換え体をクロラムフェニコールで選択した。ヒマワリと
タバコの根と葉茎に他の例に示したものと同様に、接種
し、腫瘍の生成をオパインについて試験した。PKS-oct. DelIII was transformed into Agrobacterium
They were transferred to Tumefaciens by hybridization and homologous site recombinants were selected with chloramphenicol. Sunflower and tobacco roots and leaf stems were inoculated and tested for tumor production for opain, as in the other examples.
【０２００】（実施例１３）この実施例は実施例１２の
変形例であり、tmrとtmlの欠失を構成することを教え
る。Example 13 This example is a modification of Example 12 and teaches constructingtmr andtml deletions.
【０２０１】13. 1 BglII部位でのクロラムフェニコー
ル耐性断片の構成 pBR325をHincIIで分離し、BglIIリンカーを平滑末端連
結しBglII分離後、再連結する（図３７）。クロラムフ
ェニコール耐性をK802あるいはGM33の形質転換した後、
選択する。結果として生じたプラスミド、pKS-6cam遺
伝子をもつBglII／BclI断片の源となる。13.1Chloramphenicol at BglII site
Theconfiguration pBR325Le resistant fragments were separated byHinc II,Bgl II after linkerBgl II separated blunt-end ligation, religated (Figure 37). After transforming chloramphenicol resistance to K802 or GM33,
select. The resulting plasmid, the source of theBglII /BclI fragment carrying the pKS-6cam gene.
【０２０２】13. 2 tmr、tml欠失クローンの構成 p203をHpaIとSmaIで分解する。BglIIリンカーの平滑末
端連結の後、BglII粘着末端を露出させる為に、BglIIで
分解する。再連結し、K802へ形質転換する。望みの構造
を同定し、p2とした（図３８）。[0202]13. 2 tmr, break down thestructure p203of tml deletion clone inHpa I andSma I. After blunt end ligation ofBgl II linkers, in order to expose theBgl II sticky ends, decomposes atBgl II. Religate and transform into K802. The desired structure was identified and designated as p2 (FIG. 38).
【０２０３】13. 3 T-DNA 欠失クローン（pKS-oct. de
lIIIa)の構成cam 遺伝子をもつBglII断片をpKS-6から単離し、BglIIで
切ったp2へ連結する。K802の形質転換後、クロラムフェ
ニコール耐性を選択した。結果として生じるプラスミド
をpKS-oct. delIIIa(図３９）とし、実施例12.4に記述
しているように試験する。The 13.3T-DNA deletion clone (pKS-oct.
TheBgl II fragment with thestructurecamgene LIIIa) isolated from pKS-6, connecting to p2 taken along theBgl II. After transformation of K802, chloramphenicol resistance was selected. The resulting plasmid is called pKS-oct. DelIIIa (FIG. 39) and is tested as described in Example 12.4.
【０２０４】（実施例１４）この構成の目的は、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子の挿入による、tmrローカス
のHpaI部位のみにおける変異の例を与えることである。
この遺伝子は、pKS-6からのBglII／BclI断片として単離
し、p203のHpaI部位をBglII部位に変えた後でそこに連
結する。Example 14 The purpose of this construction is to give an example of a mutation in thetmr locus only at theHpa I site due to the insertion of the chloramphenicol resistance gene.
This gene, isolated as aBgl II /Bcl I fragment from pKS-6, is coupled thereto after changing theHpa I site of p203 toBgl II site.
【０２０５】14. 1 HpaI部位のBglII部位への変換 p203をHpaIで分解しBglIIリンカーを連結する。BglIIで
分解し、再連結する。K802を形質転換後、コロニーBglI
I部位の挿入について制限地図作成により選別し、選択
する（図４０）。[0205] Theconversion p203into the BglII site of 14. 1 HpaI site was digested withHpaI connecting theBgl II linker. Disassemble withBgl II andreligate . K802 later transformation, coloniesBgl I
The insertion of the I site is selected by restriction map creation and selected (FIG. 40).
【０２０６】14.2 cam遺伝子の単離 pKS-6をBglII及びBclIで分解する。最小の断片をアガロ
ースゲル電気泳動より単離する。14.2 Isolation of the cam gene pKS-6 is digested withBgl II andBcl I. The smallest fragment is isolated by agarose gel electrophoresis.
【０２０７】14.3 変異したT-DNA クローンの構成 実施例14.1で得た修飾されたp203をBglIIで分解し、実
施例14.2で精製したcam遺伝子と連結し、K802へ形質転
換する。クロラムフェニコール耐性を選択し、プラスミ
ドを単離し、制限酵素地図作成により性格ずけを行い、
pKS-oct. tmrとする（図４１）。[0207]14.3 The p203 that modified obtained inConstructive Example 14.1mutated T-DNA clone was digested withBgl II, ligated withcam gene purified in Example 14.2 and transformed into K802. Select chloramphenicol resistance, isolate the plasmid, characterize it by restriction map mapping,
pKS-oct.tmr (FIG. 41).
【０２０８】（実施例１５）この実施例における再生
は、Riに基礎をおくTIP により引き起こされるニンジン
の腫瘍を含む。そしてこの例は本質的にM.D.Chiltonet
al.(1982) Nature295：432-434 により示されたのと
同様に遂げられる。Example 15 Regeneration in this example involves carrot tumors caused by Ri-based TIP. And this example is essentially MDChiltonet
al . (1982) Nature295 : 432-434.
【０２０９】15. 1 毛根（hairy root)における感染 ニンジンの平板(disk)に0.1mlの水の中で10594バクテリ
アを接種する。得られたルート(root)の端の1.5cm部分
を切りとり、ホルモンを欠く固体（1〜1.5％寒天）Moni
er培地（D.A.Tepfer and J. C.Tempe (1981) C.R.Hebd.
Seanc. Acad.Sci.Paris295：153-156)に置く。そして
25℃から27℃の暗所で成育させる。15.1 Infected Carrotsin the Hairy Root Inoculate a 10594 bacterium in 0.1 ml of water on a disk. Cut off 1.5 cm of the end of the obtained root (root) and remove the hormone-free solid (1-1.5% agar) Moni
er medium (DATepfer and JCTempe (1981) CRHebd.
Seanc. Acad.Sci.Paris295 : 153-156). And
Grow in the dark at 25 ° C to 27 ° C.
【０２１０】バクテリアの混じっていない培養物を２〜
３週間ごとに移し、ホルモンと寒天を欠くMonier培地に
おいてサブカルチャーとする。[0210] Two to two cultures free of bacteria
Transfer every 3 weeks and subculture in Monier medium lacking hormone and agar.
【０２１１】15. 2 根（root）の植物への再生 実施例9.1 における培養根組織を0.36μM 2,4-D 及び0.
72μM キネチン（kinetin)を含む固体（0.8 ％寒天) Mo
nier培地に置く。４週間後、生じたカルス組織をホルモ
ンを欠く液体Monier培地に移す。振とう器（150rpm）で
22℃〜25℃にて保温している間にカルスは懸濁培養（こ
こから卵が分化する）へ分離していく。これをホルモン
を欠くMonier培地の入ったペトリ皿に移すと植物へ成長
する。これらの小植物を徐々に、湿気の少ない環境にさ
らして「鍛えた」後に、温室あるいは庭園の土壌へ移
す。[0211] 0.36μM cultured root tissue in theplayback Example 9.1into the plant of 15.2 roots (root) 2,4-D and 0.
Solid containing 0.8μM kinetin (0.8% agar) Mo
Place in nier medium. After four weeks, the resulting callus tissue is transferred to liquid Monier medium lacking hormone. With a shaker (150rpm)
During the incubation at 22 ° C to 25 ° C, calli separate into suspension cultures (from which eggs differentiate). Transfer this to a Petri dish containing Monier's medium lacking hormone and it will grow into a plant. These plantlets are gradually "trained" by exposing them to a less humid environment before being transferred to greenhouse or garden soil.
【０２１２】15. 3 毛ではない（non-hairy)根のベク
ターの使用 機能するtmr遺伝子を持たない、Tiが基礎となっている
ベクターを実施例15.1及び15.2に示したRiが基礎となっ
ているベクターのかわりに用いる。適当な欠失の構成は
実施例１２、１３及び１４に示してある。15.3 Non-hairy root vectors
A Ti-based vector without a functionaltmr gene isused in place of the Ri-based vector shown in Examples 15.1 and 15.2. Suitable deletion constructs are shown in Examples 12, 13 and 14.
【０２１３】（実施例１６）この例における再生は、Ti
に基礎をおくTIPにより引き起こされたタバコの腫瘍を
含む。又、この例は本質的にK.A.Bartonetal.(1983)
Cellに示されたものと同様に遂げられる。(Embodiment 16) The reproduction in this example is performed by using Ti
Includes tobacco tumors caused by TIP based on. Also, this example is essentially KABartonetal . (1983)
This is accomplished in the same way as shown in Cell.
【０２１４】16. 1 クラウンゴールの感染 タバコ組織を、最初、A.C.Braun (1956) Canc.Res.16:
53-56により表わされた転化した茎の一部分を用いる方
法により形質転換する。茎を７％市販クロロックス（Ch
lorox)および80％エタノールの溶液で表面殺菌し、殺菌
した蒸留水で洗い、１cmの断片に切り端を上にして、寒
天で固化したホルモンを欠くMS培地（T.Murashige and
F.Skoog (1962) Physiol. Plant.15：473-497 ）の入っ
たペトリ皿に置く。切り取った茎の表面に注射器の針で
穴をあけ、バクテリアを注入することにより接種を行
う。茎を25℃で１日あたり16時間光にあたるようにし
て、培養する。発育したcalliを茎切片の表面から取り
去り0.2mg/mlのカルベニシリンを含みホルモンを欠く固
体MS培地に置き、続いて、約１ヶ月の周期で３回、新し
いカルベニシリン入りMS培地に移す。そして、 バクテ
リアに支配され続けているかどうか、確認する為の試験
を行う。無菌の組織を補足物を欠いた固体MS培地上で前
述の培地条件で保存する。（25℃、16時間：８時間
明：暗）。. [0214] Theinfection tobacco organizationof 16.1 crown gall, first, ACBraun (1956) Canc.Res16:
Transformation is performed by a method using a part of the converted stem represented by 53-56. 7% of the stem is commercially available Chlorox (Ch
lorox) and a solution of 80% ethanol, washed with sterilized distilled water, cut into 1 cm pieces with the cut end facing upwards and agar-solidified MS medium lacking hormone (T. Murashige and
F.Skoog (1962) Physiol. Plant.15 : 473-497). The surface of the cut stem is punctured with a syringe needle and inoculated by injecting bacteria. The stalks are cultivated at 25 ° C. under light for 16 hours per day. The developed calli is removed from the surface of the stem section and placed on a solid MS medium containing 0.2 mg / ml carbenicillin and lacking hormone, and then transferred to a fresh MS medium with carbenicillin three times in about one month cycles. A test is then performed to confirm that the bacteria are still dominating. Sterile tissue is stored on solid MS medium lacking supplements under the above medium conditions. (25 ° C, 16 hours: 8 hours
Light: dark).
【０２１５】16. 2 形質転換した組織の培養 A. Binns and F.Meins（1979）Planta145：365 −369
で示されたようにして、形質転換した無菌組織からクロ
ーンを得る。ナフタレン酢酸（NAA) 0.02mg／l入りの液
体MS培地で、2、3日間、25℃、135 rpmで振とう培養す
ることにより、カルス（calli）を懸濁細胞に変換す
る。そして、543 及び 213μmのステンレススチールメ
ッシュで、順番にろ過する。通過したろ液を濃縮し、0.
5％溶解した寒天(melted agar)、2.0 mg／l NAA、0.3mg
／lキネチン、0.4g／l Difco 酵母エキスを含む５mlのM
S培地に約８×10534 細胞／mlの濁度でプレーティング
する。直径１mmになったコロニーを外科用メス針 Scalp
el pointで拾い、2.0mg／l NAA、0.3mg／lキネチンを含
む固体MS培地へ置き、成育させる。生じたカルスを小片
に分割し、形質転換した表現型について試験する。16.2Culture of Transformed Tissue A. Binns and F. Meins (1979) Planta145 : 365-369
Clones are obtained from the transformed sterile tissue as indicated in. The calli are converted into suspension cells by culturing with shaking in liquid MS medium containing 0.02 mg / l of naphthaleneacetic acid (NAA) at 135 rpm at 25 ° C. for a few days. Then filter through stainless steel mesh of 543 and 213 μm in order. The filtrate passed through is concentrated to a concentration of 0.
5% dissolved agar (melted agar), 2.0 mg / l NAA, 0.3 mg
5 ml of M containing 1 g / l kinetin and 0.4 g / l Difco yeast extract
Plate in S medium at a turbidity of about 8 × 10534 cells / ml. Use a scalpel needle Scalp
Pick up at el point, place on solid MS medium containing 2.0 mg / l NAA, 0.3 mg / l kinetin and grow. The resulting calli are split into small pieces and tested for the transformed phenotype.
【０２１６】16. 3 植物の再生 形質転換した植物を 0.3mg／lのキネチンを含む固体MS
培地に置き、実施例16.1に示したように培養する。形成
した葉茎（Shoot)を1/10 強度のMS培地塩、0.4mg／lチ
アミンを含み、ショ糖及び、ホルモンを欠く固体（1.0
％寒天）培地（pH7.0）に置き根を出させる。根が出た
小植物を培養して成長させ、実施例15.2のように鍛え、
温室或いは、庭園の土壌に移す。16.3Plant regeneration Solid MS containing 0.3 mg / l kinetin
Place in medium and culture as described in Example 16.1. The formed shoots (Shoot) were mixed with a 1/10 strength MS medium salt, 0.4 mg / l thiamine, and a solid (1.0
% Agar) on a medium (pH 7.0) to allow roots to emerge. The rooted plantlets are cultured and grown, forged as in Example 15.2.
Transfer to greenhouse or garden soil.
【０２１７】16. 4 使用ベクター 実施例16.1、16.2及び16.3に示した方法は、機能するtm
r遺伝子を欠くTiに基礎を置くベクターに適している。
適当な欠失の構成は、実施例１２、１３及び１４に示し
てある。これらの方法は、Riに基礎を置くベクターを用
いる場合も効果的である。実施例16.1に示した転化した
茎の切片の感染に関する方法はしばしばTIPで形質転換
したセルライン（cell line)を作るのに有用である。[0217]16.4 method shown inuse vectors Examples 16.1, 16.2 and 16.3 functiontm
Suitable for Ti-based vectors lacking ther gene.
Suitable deletion constructs are shown in Examples 12, 13 and 14. These methods are also effective when using Ri-based vectors. The method for infection of converted stem sections shown in Example 16.1 is often useful for making TIP-transformed cell lines.
【０２１８】（実施例１７）これまでの実施例で用いた
DNA断片の化学合成の手法は、DNA合成の専門家によく知
られた多くの手法を利用している。ヌクレオシドの修飾
は、H.Schalloretal.(1963) J. Amer. Chem. Soc.8
5：3820及び H.Buchi and H.G.Khorana (1965) J.Amer.
Chem. Soc.87：2990らにより示されている。デオキシ
ヌクレオシドフォスフォルアミダイトの調製は S. L. B
eaucage and M.H.Caruthers (1981) Tetrahedron Lett.
22: 1859 により示されている。固相樹脂の調製は、S.
P.Adamsetal.(1983) J.Amer. Chem. Soc.により示さ
れている。二本鎖合成リンカーの形成に有用なハイブリ
ダイゼーション課程は、J.J.Rossietal.(1982) J.Bio
l.Chem.257:11070により示される。(Embodiment 17) Embodiment 17
Techniques for chemical synthesis of DNA fragments are well known to DNA synthesis experts.
Use many of the techniques that have been used. Modification of nucleoside
Is H.Schalloretal. (1963) J. Amer. Chem. Soc.8
Five: 3820 and H.Buchi and H.G.Khorana (1965) J. Amer.
Chem. Soc.87: 2990 et al. Deoxy
The preparation of nucleoside phosphoramidite is based on S.L.B.
eaucage and M.H.Caruthers (1981) Tetrahedron Lett.
twenty two: 1859. Preparation of the solid phase resin is described in S.
P. Adamset al(1983) Indicated by J. Amer. Chem. Soc.
Have been. Hybrids useful for forming double-stranded synthetic linkers
J.J.Rossiet al. (1982) J.Bio
l.Chem.257: 11070.
【０２１９】（実施例１８）ファセオリンは、Phaseoli
svulgaris.の最も豊富な貯蔵タンパクである（全種子
タンパクの約50％）。機能するファセオリン遺伝子のア
ルファルファへの移入、及び貯蔵ファセオリンへのファ
セオリンmRNAの翻訳は重要な経済的価値を持つ。なぜな
ら、家畜飼料として、用いる葉に貯蔵タンパクを導入す
ることになるからである。アルファルファは牛の飼料と
なり、生育も早く、リゾビウムの共生によりチッ素固定
が可能で、クラウンゴールの感染ができ、単細胞或いは
プロトプラストから植物体を再生することができる。こ
れらのことから、アルファルファはファセオリン遺伝子
を移入し、発現されるのに価値ある植物だといえる。こ
の例は、発現し得るファセオリン遺伝子をアルファルフ
ァに導入することを教える。(Example 18)Phaseolin was obtained fromPhaseoli
svulgaris . (about 50% of total seed protein). Transfer of a functional phaseolin gene into alfalfa and translation of phaseolin mRNA into stored phaseolin has significant economic value. This is because the stored protein is introduced into the leaves used as livestock feed. Alfalfa is a feed for cattle, grows quickly, can fix nitrogen by symbiosis of rhizobium, can infect crown gall, and can regenerate plants from single cells or protoplasts. These facts indicate that alfalfa is a valuable plant to transfer and express the phaseolin gene. This example teaches introducing an expressible phaseolin gene into alfalfa.
【０２２０】18. 1 シャトルベクターの構成 遺伝的に手を加えたアグロバクテリウムのプラスミド
（後述）を持つクラウンゴール組織からアルファルファ
を再生させる。最初の段階として、我々はT-DNAプロモ
ーターの支配下にあるファセオリン構造遺伝子に連結し
ているtmr ５−４及びtms ５−T-DNA 変異を持つ「シャ
トルベクター」を構成する。この構成を、機能するネオ
マイシンフォスフォトランスフェラーゼ(NPTII) 構造遺
伝子（カナマイシン耐性）を下流に持つノパリンシンセ
ターゼプロモーター（M.D.Chilton、etal.(18 January
1983）15th Miami Winter Symposium により報告され
ている、又、J.L.Marx(1983) Science219：830及びR.H
orschetal.(18 January 1983）15th Miami Winter Sy
mposium参照)に順に連結する。この構成の形式は実施例
１に示してある。18.1Construction of Shuttle Vector Alfalfa is regenerated from crown gall tissue having a genetically modified Agrobacterium plasmid (described below). As a first step, we construct a "shuttle vector" withtmr5-4 andtms5 -T-DNA mutations linked to the phaseolin structural gene under the control of the T-DNA promoter. This construct was constructed using the nopaline synthetase promoter (MDChilton,etal . (18 January) with a functional neomycin phosphotransferase (NPTII) structural gene (kanamycin resistance) downstream.
1983) Reported by the 15th Miami Winter Symposium, and also JLMarx (1983) Science219 : 830 and RH
orschetal . (18 January 1983) 15th Miami Winter Sy
mposium). The format of this configuration is shown in the first embodiment.
【０２２１】18. 2 アグロバクテリウム及び植物細胞
への移入 “シャトルベクター”を型にはまった手法（実施例２
１)によりpTi 15955 のようなTiプラスミドをもつアグ
ロバクテリウム株へ形質転換する。組み換えプラスミド
を持つバクテリアを選択し、細胞壁を再生するアルファ
ルファプロトプラスト（Martonetal.(1979) Nature2
77：129-131；G.J. Wullemsetal.(1981)Proc. Nat'l
Acad. Sci (U.S.A.)78：4344-4348 ；R.B.Horsch and
R.T.Fraley (18 January 1983）15th Miami Winter Sy
mposium）と一緒に培養する。培養中細胞は成長し、生
じたカルスについてスーザンブロッティング (実施例１
９)により適当なmRNAの存在を、そしてELISA 試験（実
施例２０)(J. L. Marx(1983)Science219 ：830 ；R.B.
Horschand R.T.Fraley(18 January 1983) 15th MiamiWi
nter Symposium参照）により適当なタンパクの存在を試
験する。18.2 Agrobacterium and plant cells
Of the “shuttle vector” into the mold (Example 2
According to 1), the strain is transformed into an Agrobacterium strain having a Ti plasmid such as pTi15955. Alfalfa protoplasts regenerate cell walls by selecting bacteria with recombinant plasmids (Martonetal . (1979) Nature2
77 : 129-131; GJ Wullemsetal . (1981) Proc. Nat'l
Acad. Sci (USA)78 : 4344-4348; RBHorsch and
RTFraley (18 January 1983) 15th Miami Winter Sy
mposium). The cells grew in culture and the resulting calli were Susan blotted (Example 1).
9) to determine the presence of the appropriate mRNA and ELISA test (Example 20) (JL Marx (1983) Science219 : 830; RB
Horschand RTFraley (18 January 1983) 15th MiamiWi
test for the presence of the appropriate protein.
【０２２２】18. 3 植物再生 それから、A.V.P Dos Santosetal.(1980) Z. Pflanze
nphysiol.99：261-270、T.J.McCoy and E.T.Bingham(19
77) Plant. Sci.Letters10：59-66 and K.A.Walkeret
al.(1979) Plant Sci. Letters16：23-30らによりす
でに用いられたのと同様の方法により、カルス組織から
アルファルファを再生させる。それからこれらの再生植
物を新しい商品変種についての基礎を形成する型にはま
った植物育種の手法により栽培する。18.3Plant regeneration Then AVP Dos Santosetal . (1980) Z. Pflanze
nphysiol.99 : 261-270, TJMcCoy and ETBingham (19
77) Plant. Sci. Letters10 : 59-66 and KAWalkeret
al . (1979) Plant Sci. Letters16 : Regenerate alfalfa from callus tissue by methods similar to those already used by 23-30 et al. These regenerated plants are then grown by routine plant breeding techniques that form the basis for new commercial varieties.
【０２２３】（実施例１９）全ての例においてＲＮＡを
次に示す手順により抽出し分画し発見する。(Example 19) In all cases, RNA is extracted, fractionated and found by the following procedure.
【０２２４】19.1 ＲＮＡの抽出 この手順はSilflowetal.（1981）Biochemistry13：2
725-2731の修飾型である。塩化セシウム遠心分離のかわ
りに、塩化リチウム沈澱を代用するのは、Murrayeta
l.(1981）J.Mol.Evol.17：31-42 に示されている。2M塩
化リチウムに加えて2M尿素を沈澱に用いることはRhodes
（1975）J.Biol.Chem.25：8088-8097より採用した。[0224]19.1 RNA extraction This procedure is based on Silflowet al. (1981) Biochemistry13： 2
It is a modified version of 725-2731. Cesium chloride centrifuge glue
The alternative to lithium chloride precipitation is Murrayet a
l. (1981) J. Mol. Evol.17: 31-42. 2M salt
Using 2M urea in addition to lithium iodide for precipitation
(1975) J. Biol. Chem.twenty five: Adopted from 8088-8097.
【０２２５】組織を、ポリトンあるいはグラウンドグラ
スホモジナイザーを用いて、４〜５倍容量の冷50mM Tri
s・Cl（pH8.0 ）（４％p-アミノサリシル酸、１％トリイ
ソプロピルナフタレンスルホン酸、10mM ジチオスレイ
トール（新しく作る）および10mMメタバイ亜硫酸ソーダ
（新しく作る）を含む）中でホモジナイズした。 オク
タノールは泡立ちを制御するのに必要に応じて用いられ
た。１％8-ヒドロキシキノリンを含む等量のトリス飽和
フェノールをホモジェネートに加え、乳濁するまで振
る。そして20000〜30000gで4℃15分間遠心分離した。上
層の水層をクロロホルム／オクタノール（24：1）で１
回抽出し、上記のように遠心分離した。それから濃塩化
リチウム―尿素を最終濃度がそれぞれ2Mとなるように加
え、混合物を20℃で数時間静置した。そうしてＲＮＡ沈
澱物を遠心分離で落とし、ペレットを分散させる為に2M
塩化リチウムで洗浄した。沈澱物を70％エタノール−0.
3M酢酸ナトリウムで洗い、澄んだ溶液になるよう殺菌水
に溶かした。２分の１容量のエタノールを加え、混合物
を氷中１時間、放置した。その後、遠心分離し、余分な
多糖類を除いた。ＲＮＡ沈澱物をそれから、回収し、
水、あるいは殺菌済無塩、ポリ（Ｕ）緩衝液に再び溶解
した。[0225] Using a polyton or a ground glass homogenizer, the tissue was cultured in 4 to 5 volumes of cold 50 mM Tris.
Homogenized in s · Cl (pH 8.0) (containing 4% p-aminosalicylic acid, 1% triisopropylnaphthalenesulfonic acid, 10 mM dithiothreitol (fresh) and 10 mM sodium metabisulfite (fresh). Octanol was used as needed to control foaming. Add an equal volume of tris-saturated phenol containing 1% 8-hydroxyquinoline to the homogenate and shake until milky. Then, the mixture was centrifuged at 20,000 to 30,000 g at 4 ° C. for 15 minutes. Wash the upper aqueous layer with chloroform / octanol (24: 1).
Extracted twice and centrifuged as above. Then concentrated lithium chloride-urea was added to a final concentration of 2M each, and the mixture was allowed to stand at 20 ° C for several hours. The RNA precipitate is then removed by centrifugation and 2M to disperse the pellet.
Washed with lithium chloride. The precipitate was washed with 70% ethanol-0.
It was washed with 3M sodium acetate and dissolved in sterile water to give a clear solution. One-half volume of ethanol was added and the mixture was left on ice for 1 hour. Thereafter, the mixture was centrifuged to remove excess polysaccharide. The RNA precipitate is then recovered,
Redissolved in water or sterile, salt-free, poly (U) buffer.
【０２２６】19.2 ポリ（Ｕ）／セファデックスクロマ
トグラフィー ２つのポリ（Ｕ）セファデックス（商標：Pharmacia,In
c.,Uppsala,Sweden）緩衝液を用いた。一つは、無塩
で、20mM Tris、1mM EDTAおよび0.1％SDSを含んでい
る。もう一つは、一つめの緩衝液に0.1Mの塩化ナトリウ
ムを加えたものである。A42605において、良好な会合を
起こすために、2x貯蔵緩衝液を作ることが必要である。
そして一部分に塩を加えるべきである。最終濃度にあわ
せてから、緩衝液をオートクレーブにかける。ポリ
（Ｕ）セファデックスは、Bethesda Research laborato
riesより得た。100μgの期待されるポリ（Ｕ）ＲＮＡに
ついて1gのポリ（Ｕ）セファデックスを用いた。ポリ
（Ｕ）セファデックスを、無塩のポリ−Ｕ緩衝液に水和
し、ジャケットをつけたカラムに流し込む。温度を、60
℃に上げ、カラムを無塩緩衝液で260mm におけるベース
ラインが平滑になるまで洗った。最終的には、カラムを
塩を含むポリ（Ｕ）緩衝液で40℃で平衡化する。19.2 Poly (U) / Sephadex Chroma
Preparative chromatography Two poly (U) Sephadex (trademark: Pharmacia, an In
c., Uppsala, Sweden) buffer was used. One is salt-free and contains 20 mM Tris, 1 mM EDTA and 0.1% SDS. The other is the addition of 0.1 M sodium chloride to the first buffer. In A42605, it is necessary to make a 2x storage buffer for good association to occur.
And you should add some salt. After adjusting to the final concentration, the buffer is autoclaved. Poly (U) Sephadex is Bethesda Research laborato
ries. 1 g of poly (U) Sephadex was used for 100 μg of the expected poly (U) RNA. Poly (U) Sephadex is hydrated in salt-free poly-U buffer and poured into a jacketed column. Temperature, 60
C. and the column was washed with salt-free buffer until the baseline at 260 mm was smooth. Finally, the column is equilibrated with poly (U) buffer containing salt at 40 ° C.
【０２２７】濃度が500μg／ml以下のＲＮＡを無塩緩衝
液中で65℃、５分間加熱した。その後、冷却し、塩化ナ
トリウムを0.1Mの濃度になるように加えた。それから光
学濃度が安定なベースラインまで落ちるまで、流速1ml
／min 以下で流したカラムにＲＮＡを移す。それから、
カラム温度を60℃まで上げ、ＲＮＡを無塩ポリ（Ｕ）緩
衝液で溶出させた。ＲＮＡは普通３倍のカラム容量で洗
い出される。溶出したＲＮＡを用いやすい容量まで２級
ブタノールで濃縮し、10mMになるように塩化ナトリウム
を加えた後、２倍容量のエタノールを加え沈澱させる。
エタノール沈澱物を水に溶かし、ＮＨ445-酢酸塩を0.1M
になるよう加える。そしてエタノールで再び沈澱させ
る。最終的に、ＲＮＡを殺菌水に再溶解し、-70℃にお
いて保存する。RNA having a concentration of 500 μg / ml or less was heated in a salt-free buffer at 65 ° C. for 5 minutes. After cooling, sodium chloride was added to a concentration of 0.1M. Then flow 1 ml until the optical density drops to a stable baseline
Transfer the RNA to a column that has flowed at less than / min. then,
The column temperature was raised to 60 ° C. and the RNA was eluted with salt-free poly (U) buffer. RNA is usually washed out in three column volumes. The eluted RNA is concentrated with secondary butanol to a volume that is easy to use, sodium chloride is added to 10 mM, and twice the volume of ethanol is precipitated.
Dissolve the ethanol precipitate in water and add NH445-acetate to 0.1 M
Add so that Then precipitate again with ethanol. Finally, the RNA is redissolved in sterile water and stored at -70 ° C.
【０２２８】19.3 ホルムアルデヒドＲＮＡゲル 用いる方法は Thomas (1980) Proc. Nat'l.Acid. Sci.
（U.S.A.）77：5201および Hoffman、etal.（1981）J.
Biol. Chem.256：2597によるものである。20mMリン酸
ナトリウム（pH6.8 〜7.0 ）を含む0.75〜1.5％のアガ
ロースゲルを固めた。もし高分子の集合したバンドが現
れたら、６％あるいは2.2Mのホルムアルデヒド（36％の
貯蔵溶液を用いる）を加えて、実験をやり直した。ホル
ムアルデヒドを、アガロースに65℃まで冷やしてから加
えた。ホルムアルデヒドを加えると臭化エチヂウムによ
り発見が困難になる。泳動緩衝液は10mMリン酸ナトリウ
ム（pH6.8 〜7.0 ）である。電気泳動に先だち、ＲＮＡ
を最終濃度６％ホルムアルデヒド、50％ホルムアミド、
20mMリン酸ナトリウム緩衝液および５mMＥＤＴＡの変性
緩衝液で処理した。ＲＮＡを緩衝液中60℃で10〜20分間
保温した。保温は停止緩衝液の添加に停止した。20μl
のサンプルについて、4μl 50％グリセロール、10mMＥ
ＤＴＡ５mMリン酸ナトリウムそしてブロムフェノールブ
ルーを加えた。浸水した電気泳動を用いる。ゲルを浸す
前にＲＮＡをロードした。そして125mA で５分間ゲルの
中にいれた。それからゲルを水に浸し、電流を30mA（夜
通し）あるいは50mA（６〜８時間）に下げる。緩衝液を
循環させ、低温室で電気泳動を行った。19.3 Method usingformaldehyde RNA gel is described in Thomas (1980) Proc. Nat'l. Acid. Sci.
(USA)77 : 5201 and Hoffman,etal . (1981) J.
Biol. Chem.256 : 2597. A 0.75-1.5% agarose gel containing 20 mM sodium phosphate (pH 6.8-7.0) was consolidated. If an aggregated band of macromolecules appeared, the experiment was repeated with the addition of 6% or 2.2M formaldehyde (using a 36% stock solution). Formaldehyde was added to the agarose after cooling to 65 ° C. Addition of formaldehyde makes it difficult to discover due to ethidium bromide. The running buffer is 10 mM sodium phosphate (pH 6.8-7.0). Prior to electrophoresis, RNA
A final concentration of 6% formaldehyde, 50% formamide,
Treated with 20 mM sodium phosphate buffer and 5 mM EDTA denaturing buffer. RNA was incubated in buffer at 60 ° C. for 10-20 minutes. Incubation was stopped with the addition of stop buffer. 20μl
4 μl 50% glycerol, 10 mM
DTA 5 mM sodium phosphate and bromophenol blue were added. Use submerged electrophoresis. The RNA was loaded before soaking the gel. Then it was in the gel at 125 mA for 5 minutes. The gel is then immersed in water and the current reduced to 30 mA (overnight) or 50 mA (6-8 hours). The buffer was circulated and electrophoresis was performed in a cold room.
【０２２９】19.4 “ノーザン”ブロット もし、特異的なＲＮＡを発見するためにブロットするゲ
ルならば染色しなかった。しかし、分離したマーカーの
レーンは染色に用いた。染色は0.1M酢酸ナトリウム中５
μg/ml臭化ブロマイドで行い、脱染は、0.1M酢酸ナトリ
ウム中数時間行った。染色の前に、５〜10分間60〜70℃
の水で処理すると視認が容易になった。ブロットするゲ
ルを15分間10ｘ標準サリンクエン酸（SSC）―３％ホル
ムアルデヒドに浸した。もし、大きなＲＮＡに切れ目を
入れるために50mM水酸化ナトリウム中10〜30分間処理し
た。もし、 基礎処理を用いたのなら、ブロットする前
に、ゲルを中和し、ＳＳＣ―ホルムアルデヒドに浸すべ
きである。ＲＮＡのニトロセルロースへの転移は標準方
法により行った。プレハイブリダイゼーションを42℃で
最低４時間、50％ホルムアルデヒド、10％硫酸デキスト
ラン、5xＳＳＣ、5xデンハート、100μg/ml変性キャリ
アーＤＮＡ、20μg/mlポリ（Ａ）、40mMリン酸ナトリウ
ム（pH6.8から7.0）、0.2％ＳＤＳ中で行った。ハイブ
リダイゼーションをプローブと同じ緩衝液に加え、一晩
保温して行った。プローブは大体5x10554 c.p.m.／ml以
上の濃度で用いた。ハイブリダイゼーション後、ニトロ
セルロースを、42℃で2xＳＳＣ、25mMリン酸ナトリウ
ム、5mMＥＤＴＡ、2mMピロリン酸ナトリウム溶液を用い
て何度も洗った。最後に、64℃で20分間1xＳＳＣで洗っ
た。 もし、オートラジオグラフィーに際して、フィル
ターが乾燥していなくて、また、プローグ１mMＥＤＴＡ
により64℃で広範囲に洗ったことで除かれているのな
ら、最上の結果が得られた。19.4 “Northern” Blots If a gel was blotted to find specific RNA, it did not stain. However, the lane of the separated marker was used for staining. Staining is 5 in 0.1 M sodium acetate
Performed with μg / ml bromide bromide and destaining was performed in 0.1 M sodium acetate for several hours. 60-70 ° C for 5-10 minutes before staining
The treatment was easy with the water. The blot to be blotted was soaked in 10 × standard salicenoic acid (SSC) -3% formaldehyde for 15 minutes. If large RNAs were cut, they were treated in 50 mM sodium hydroxide for 10-30 minutes. If a basal treatment was used, the gel should be neutralized and soaked in SSC-formaldehyde before blotting. Transfer of RNA to nitrocellulose was performed by standard methods. Prehybridization at 42 ° C for a minimum of 4 hours, 50% formaldehyde, 10% dextran sulfate, 5x SSC, 5x Denhardt, 100 μg / ml denatured carrier DNA, 20 μg / ml poly (A), 40 mM sodium phosphate (pH 6.8 to 7.0). ), In 0.2% SDS. Hybridization was carried out in the same buffer as the probe and incubated overnight. The probe was used at a concentration of approximately 5 × 10554 cpm / ml or more. After hybridization, the nitrocellulose was washed multiple times at 42 ° C. with 2 × SSC, 25 mM sodium phosphate, 5 mM EDTA, 2 mM sodium pyrophosphate solution. Finally, it was washed with 1 × SSC at 64 ° C. for 20 minutes. If the filter is not dry during autoradiography and the probe is 1 mM EDTA
The best results were obtained if had been removed by extensive washing at 64 ° C.
【０２３０】（実施例２０）“ウェスタン”ブロット
（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後、抗原を発
見するために行う）は、本質的にはR.P.Legocki and D.
P.S.Verma （1981）Analyt. Biochem.111 ：385-392 に
示されているのと同様に行った。マイクロ―ＥＬＩＳＡ
（enzyme-linked immnno- sorbant assay）を96個のウ
ェル（well）をもつImmulon-２型プレートを用いて次に
示すステップにより行った。Example 20 A "Western" blot (performed after SDS polyacrylamide gel electrophoresis to find antigens) was performed essentially as RPLegocki and D.
PSVerma (1981) Analyt. Biochem.111 : 385-392. Micro-ELISA
(Enzyme-linked immnno-sorbant assay) was performed using an Immulon-2 type plate having 96 wells according to the following steps.
【０２３１】20.1 プレートへの抗体の結合 一日目、ウェルをコーティング緩衝液で１：1000に希釈
した。抗体（ウサギ抗ファセオリンIgG ）でコート（co
at）した。200μl／wellで37℃で２〜４時間、保温し
た。プレートをサランラップでおおった。それから、プ
レートをリン酸緩衝液サリン―ツィーン（ＰＢＳ−Twee
n ）で３回洗った。各々の洗いのステップは５分間あけ
た。それから１％のボバインセーラムアルブミン（ＢＳ
Ａ）を洗いのために加え、20分間放置してから捨てた。
洗いはＰＢＳ−Tween を用いて５回以上、行った。20.1 Binding of Antibody to Plate On day 1, the wells were diluted 1: 1000 in coating buffer. Coated with antibody (rabbit anti-phaseolin IgG) (co
at) Incubation was carried out at 37 ° C. for 2 to 4 hours at 200 μl / well. The plate was covered with Saran wrap. The plate was then washed with phosphate buffered saline-Tween (PBS-Twee
n) 3 times. Each washing step was open for 5 minutes. Then 1% bovine serum albumin (BS
A) was added for washing and left for 20 minutes before discarding.
Washing was performed 5 times or more using PBS-Tween.
【０２３２】20.2 組織のホモジェナイジング 組織を、小片に切ってから、ポリトロンにより１ｇの組
織／mlリン酸緩衝液サリン−ツィーン−２％ポリビニル
ピロリドン−40（ＰＢＳ−Tween−２％ＰＶＰ−40）の
条件でホモジェナイズした。すべてのサンプルは、破砕
前後およびファセオリン標準曲線の作成の前後に氷中で
保存した。組織のホモジェネートで標準曲線を作成し
た。そして、組織に依存するファセオリンの回収をチェ
ックするために緩衝液で標準曲線を作った。ホモジェナ
イズしたサンプルを、遠心分離した後、各々のサンプル
のうち100 μlをウェルに入れ、４℃で一晩放置した。
失敗を避けるために各々のサンプルについて２個同じこ
とをした。保温中、プレートはシールした。20.2 Homogenizing Tissues Tissues were cut into small pieces and then, with a polytron, 1 g of tissue / ml phosphate buffered saline-Tween-2% polyvinylpyrrolidone-40 (PBS-Tween-2% PVP-40). Homogenized under the following conditions. All samples were stored on ice before and after crushing and before and after generation of the phaseolin standard curve. A standard curve was generated with the tissue homogenate. A standard curve was then made with buffer to check for tissue-dependent recovery of phaseolin. After the homogenized sample was centrifuged, 100 μl of each sample was placed in a well and left at 4 ° C. overnight.
Duplicate was done for each sample to avoid failure. During the incubation, the plate was sealed.
【０２３３】20.3 酵素の結合 一晩保温後、抗原を捨て、ウェルをＰＢＳ−Tweenで５
回洗う。各々の洗いの間に５分間の間隔をおいた。結合
物（ウサギ抗ファセオリンIgG アルカリフォスファター
ゼ結合）をＰＢＳ−Tween−２％ＰＶＰ（0.2 ％ BSAを
含む）で１：3000に希釈し、150μlを各ウェルに加え
た。そして、37℃で３〜６時間保温した。保温後、結合
物を捨て、ウェルをＰＢＳ−Tweenで５回洗う。各々の
洗いの間に５分間の間隔を置く。20.3 Enzyme Binding After overnight incubation, the antigen was discarded and the wells were washed with PBS-Tween for 5
Wash twice. There was a 5 minute interval between each wash. The conjugate (rabbit anti-phaseolin IgG alkaline phosphatase conjugate) was diluted 1: 3000 with PBS-Tween-2% PVP (containing 0.2% BSA) and 150 μl was added to each well. And it kept at 37 degreeC for 3 to 6 hours. After incubation, discard the conjugate and wash the wells 5 times with PBS-Tween. There is a 5 minute interval between each wash.
【０２３４】20.4 分析 分析を始める直前に、p−ニトロフェニルフォスフェイ
トの５mgの錠剤（Sigmaより得た。そして暗所で凍結保
存）を、10 mlの基質に加え、錠剤が溶解するまで攪拌
する。200μlの室温溶液をすばやく各ウェルに加える。
反応を種々の時間（例えば、t＝０、10、 20、 40、 6
0、 90、 120 分）においてdynatech micro-elisa read
er 用いて測定する。p−ニトロフェニルフォスフェート
（無色）がアルカリフォスファターゼにより無機リン酸
とｐ−ニトロフェノールに加水分解されるとｐ−ニトロ
フェノールが溶液に黄色を与える。それは、410nmにお
けるスペクトロメトリカリーによむことができる。発見
できる最小量は0.1ng より小である。20.4 Analytical Immediately before starting the analysis, add 5 mg tablets of p-nitrophenyl phosphate (obtained from Sigma and stored frozen in the dark) to 10 ml of substrate and stir until the tablets dissolve . Quickly add 200 μl of room temperature solution to each well.
The reaction was allowed to proceed for various times (eg, t = 0, 10, 20, 40, 6
Dynatech micro-elisa read at 0, 90, 120 minutes)
Measure using er. When p-nitrophenyl phosphate (colorless) is hydrolyzed by alkaline phosphatase to inorganic phosphoric acid and p-nitrophenol, p-nitrophenol gives the solution a yellow color. It can be read by spectrometry at 410 nm. The minimum amount that can be found is less than 0.1 ng.
【０２３５】（実施例２１）三親交雑は、一般的に、次
に示すように行われた。当業者に知られた他の変法も用
いることができる。E.coli K802（pRK290に基礎をおく
シャトルベクター）をE.coli（pRK2013）およびストレ
プトマイシンに耐性なA.tumefaciens株と交雑した。pRK
2013は、シャトルベクターを持つ株に移り、Agrobacter
iumへ移入するためのシャトルベクターを作った。スト
レプトマイシンおよびシャトルベクターが耐性である薬
剤（だいたいカナマイシンか、クロラムフェニコール）
の両方を含む培地で成育するものの中からシャトルベク
ター配列を有する。Agrobacterium の細胞を選択した。
これらの細胞とE.coli（pPH1J1）との交雑によりAgroba
cterium細胞にpPH1J1が移った。pPH1J1とpRK290に基礎
を置くシャトルベクターは同一細胞内に長時間、共在す
ることができない。ゲンタマイシン（pPH1J1が耐性遺伝
子をもつ）を含む培地で成育させれば、pRK290配列の欠
落した細胞を選択することができた。ストレプトマイシ
ンおよびゲンタマイシンおよびカナマイシンあるいはク
ロラムフェニコールに耐性な細胞のみがシャトルベクタ
ーと二重相同部位組み換えをおこしたTiプラスミドを持
ち望みの構成をもっている。Example 21 Three-parent crosses were generally performed as follows. Other variations known to those skilled in the art can also be used.E.col i K802 (the shuttle vector founded on pRK290) was crossed with resistantA.tumefaciens strainE. coli (pRK2013) and streptomycin. pRK
2013 moved to a strain with a shuttle vector,Agrobacter
A shuttle vector was created for transfer intoium . Drugs that are resistant to streptomycin and shuttle vectors (roughly kanamycin or chloramphenicol)
Has a shuttle vector sequence among those growing on a medium containing both of the above.Agrobacterium cells were selected.
Agroba the crossing of these cells andE.coli (pPH1J1)
pPH1J1 was transferred tocterium cells. Shuttle vectors based on pPH1J1 and pRK290 cannot coexist in the same cell for a long time. When grown in a medium containing gentamicin (pPH1J1 has a resistance gene), cells lacking the pRK290 sequence could be selected. Only cells resistant to streptomycin, gentamicin, kanamycin or chloramphenicol have the desired construction with the shuttle plasmid and a double-homologous recombination Ti plasmid.
【図１】pTi 15955のＴ−ＤＮＡ領域を示す説明図であ
る。FIG. 1 is an explanatory diagram showing a T-DNA region of pTi15955.
【図２】オクトピシンセターゼ遺伝子の塩基配列図であ
る。FIG. 2 is a nucleotide sequence diagram of the octopicin setase gene.
【図３】ファセオリン遺伝子とｃＤＮＡの完全塩基配列
の一部を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing a part of the complete base sequence of the phaseolin gene and cDNA.
【図４】ファセオリン遺伝子とｃＤＮＡの完全塩基配列
の一部を示す図である。図３と図４とでファセオリン遺
伝子とｃＤＮＡの完全塩基配列を示す。FIG. 4 is a diagram showing a part of the complete base sequence of the phaseolin gene and cDNA. 3 and 4 show the complete base sequences of the phaseolin gene and cDNA.
【図５】ノパリンシンセターゼ遺伝子の完全塩基配列の
一部を示す図である。FIG. 5 is a diagram showing a part of the complete base sequence of the nopaline synthetase gene.
【図６】ノパリンシンセターゼ遺伝子の完全塩基配列の
一部を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing a part of the complete base sequence of the nopaline synthetase gene.
【図７】pKS-nop IVの構造を示す説明図である。FIG. 7 is an explanatory diagram showing the structure of pKS-nop IV.
【図８】pKS-Nop IVKB3.8の作成と構造を示す説明図で
ある。FIG. 8 is an explanatory diagram showing creation and structure of pKS-Nop IVKB3.8.
【図９】pKS4-KBの構造を示す説明図である。FIG. 9 is an explanatory diagram showing the structure of pKS4-KB.
【図１０】シャトルベクターpNNN1の構造を示す説明図
である。FIG. 10 is an explanatory diagram showing the structure of shuttle vector pNNN1.
【図１１】pNNN2の作成とその構造を示す説明図であ
る。FIG. 11 is an explanatory diagram showing creation of pNNN2 and its structure.
【図１２】p401の右側にclaI部位のあるHindIII部位か
らの塩基配列の一部を示す説明図である。FIG. 12 is an explanatory diagram showing a part of a base sequence from a HindIII site having a claI site on the right side of p401.
【図１３】p401の右側にclaI部位のあるHindIII部位か
らの塩基配列の一部を示す説明図である。図１１と図１
２とで、p401の右側にclaI部位のあるHindIII部位から
の塩基配列を示す。FIG. 13 is an explanatory diagram showing a part of a base sequence from a HindIII site having a claI site on the right side of p401. FIG. 11 and FIG.
2 and 3 show the nucleotide sequence from the HindIII site having the claI site on the right side of p401.
【図１４】pTi 15955の構造を示す説明図である。FIG. 14 is an explanatory diagram showing a structure of pTi 15955.
【図１５】pKS-Pro I の作成を示す説明図である。FIG. 15 is an explanatory diagram showing the creation of pKS-Pro I.
【図１６】p7.2の構造を示す説明図である。FIG. 16 is an explanatory diagram showing the structure of p7.2.
【図１７】pKS-Pro I-KBの構造を示す説明図である。FIG. 17 is an explanatory diagram showing the structure of pKS-Pro I-KB.
【図１８】ファセオリン貯蔵タンパク遺伝子の構造を示
す説明図である。FIG. 18 is an explanatory diagram showing the structure of a phaseolin storage protein gene.
【図１９】p3.8の構造を示す説明図である。FIG. 19 is an explanatory diagram showing the structure of p3.8.
【図２０】pBR322の構造を示す説明図である。FIG. 20 is an explanatory diagram showing the structure of pBR322.
【図２１】pKS-4の構造を示す説明図である。FIG. 21 is an explanatory diagram showing the structure of pKS-4.
【図２２】pKS-KB3.8の構造を示す説明図である。FIG. 22 is an explanatory diagram showing the structure of pKS-KB3.8.
【図２３】pKS4-KB2.4の作成手順を示す説明図である。FIG. 23 is an explanatory diagram showing a procedure for creating pKS4-KB2.4.
【図２４】pKS4-KB2.4の構造を示す説明図である。FIG. 24 is an explanatory diagram showing the structure of pKS4-KB2.4.
【図２５】ファセオリンンの遺伝的環境へのファセオリ
ンｃＤＮＡのクローニングを示す説明図である。FIG. 25 is an illustration showing the cloning of phaseolin cDNA into the phaseolin genetic environment.
【図２６】pL-Bの作成を示す説明図である。FIG. 26 is an explanatory diagram showing creation of pL-B.
【図２７】pKS-ProIAの構造を示す説明図である。FIG. 27 is an explanatory diagram showing the structure of pKS-ProIA.
【図２８】pLK-ProIAの構造を示す説明図である。FIG. 28 is an explanatory diagram showing the structure of pLK-ProIA.
【図２９】pKS-5の作成を示す説明図である。FIG. 29 is an explanatory diagram showing creation of pKS-5.
【図３０】pKS-oct.Cam203の作成を示す説明図である。FIG. 30 is an explanatory diagram showing creation of pKS-oct.Cam203.
【図３１】pKS-oct.del IIの構造を示す説明図である。FIG. 31 is an explanatory diagram showing the structure of pKS-oct.del II.
【図３２】pKS-oct.del Iの構造を示す説明図である。FIG. 32 is an explanatory diagram showing the structure of pKS-oct.del I.
【図３３】pRK290の構造を示す説明図である。FIG. 33 is an explanatory diagram showing the structure of pRK290.
【図３４】p2fの作成を示す説明図である。FIG. 34 is an explanatory diagram showing creation of p2f.
【図３５】p3eの作成を示す説明図である。FIG. 35 is an explanatory diagram showing creation of p3e.
【図３６】pKS-oct.del IIIの作成を示す説明図であ
る。FIG. 36 is an explanatory diagram showing creation of pKS-oct.del III.
【図３７】pKS-6の作成を示す説明図である。FIG. 37 is an explanatory diagram showing creation of pKS-6.
【図３８】p2の作成を示す説明図である。FIG. 38 is an explanatory diagram showing creation of p2.
【図３９】pKS-oct.del IIIaの作成を示す説明図であ
る。FIG. 39 is an explanatory diagram showing creation of pKS-oct.del IIIa.
【図４０】p203のHpaI部位のBglII部位への変換を示す
説明図である。FIG. 40 is an explanatory diagram showing the conversion of theHpa I site to theBgl II site ofp203 .
【図４１】pKS-oct.tmrの構成を示す説明図である。FIG. 41 is an explanatory diagram showing the structure of pKS-oct.tmr.
【図４２】実施例１１、１２、１４のプラスミドの構造
を示す説明図である。FIG. 42 is an explanatory diagram showing the structure of the plasmids of Examples 11, 12, and 14.
【図４３】遺伝子コードを説明する説明図である。FIG. 43 is an explanatory diagram illustrating a genetic code.
【図４４】大腫瘍遺伝子の塩基配列図である。FIG. 44 is a nucleotide sequence diagram of a large tumor gene.
【図４５】p203の構造を示す説明図である。FIG. 45 is an explanatory diagram showing the structure of p203.
【図４６】pKS-B17-KB3.0の構造を示す説明図である。FIG. 46 is an explanatory diagram showing the structure of pKS-B17-KB3.0.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (73)特許権者 594063131 1209 ＯＲＡＮＧＥ ＳＴＲＥＥＴ，Ｗ ＩＬＭＩＮＧＴＯＮ，ＤＥＬＡＷＡＲＥ 19801 Ｕ．Ｓ．Ａ. (72)発明者 ティモシー シー．ホール アメリカ合衆国 ウィスコンシン 53711 マジソン，ノース フィットニ ー ウェイ 210 (72)発明者 ジェリー エル．スライトム アメリカ合衆国 ウィスコンシン 53714 マジソン，レタナ ドライブ 5010 (72)発明者 デニス ダブリュ．サットン アメリカ合衆国 ウィスコンシン 53558 マックファーランド，アルベン アベニュー 5611 (72)発明者 ノリモト ムライ アメリカ合衆国 ウィスコンシン 53703 マジソン，ウエスト ゴーラム ストリート 138──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl.6 Identification code Office reference number FI Technical indication location C12R 1:91) (C12N 5/10 C12R 1:91) (73) Patent holder 594063131 1209 ORANGE STREET , WILMINGTON, DELAWARE 19801 U.S.A. S. A. (72) Inventor Timothy C. Hall United States Wisconsin 53711 Madison, North Fitney Way 210 (72) Inventor Jerry El. Slightum USA Wisconsin 53714 Madison, Retana Drive 5010 (72) Inventor Dennis W. Sutton USA Wisconsin 53558 McFarland, Alben Avenue 5611 (72) Inventor Norimoto Murai USA Wisconsin 53703 Madison, West Gorham Street 138
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