【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、水及び有機溶媒に対して両親媒性である高
分子を介して磁性体と生理活性物質を結合させて複合体
としたもので、水溶液および有機溶媒中で安定に分散ま
たはコロイドとして溶解して生理活性を有し、磁性を利
用して液状で生理活性物質への適用又は回収を可能とし
たバイオリアクターに関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial field of use] The present invention is a complex obtained by binding a magnetic substance and a physiologically active substance through a polymer that is amphipathic to water and an organic solvent. The present invention relates to a bioreactor which has a physiological activity by being stably dispersed or dissolved as a colloid in an aqueous solution and an organic solvent, and which can be applied to or recovered from a physiologically active substance in a liquid state by utilizing magnetism.
たとえば酵素は一般に水溶液中でバイオリアクターと
して取り扱われているが、その生理活性を有機溶媒中で
発現させて、これを有機合成等に利用すればバイオテク
ノロジーの応用範囲と可能性を大きく広げることができ
る。つまり酵素が有機溶媒中に溶解して、その中で高い
触媒効率を示せば、たとえば加水分解の逆反応や水に溶
け難い疎水性物質の酵素処理など、より多くの反応に利
用可能となる。そのほか酵素以外のタンパク質を有機溶
媒に可溶化させ、そのタンパク質の機能を有機溶媒中で
発現させることも可能となる。そこで、本発明者は先に
酵素を両親媒性の高分子で修飾することによつて有機溶
媒に可溶化することを可能とした（特開昭60-15639
5）。しかしながら、一般に生理活性物質に利用するに
はこれらの回収、再利用が必要となる。For example, enzymes are generally handled as bioreactors in aqueous solution, but if the physiological activity is expressed in an organic solvent and it is used for organic synthesis, the application range and potential of biotechnology can be greatly expanded. it can. That is, if the enzyme is dissolved in an organic solvent and exhibits high catalytic efficiency therein, it can be used for more reactions such as reverse hydrolysis reaction and enzymatic treatment of a hydrophobic substance that is difficult to dissolve in water. In addition, proteins other than enzymes can be solubilized in an organic solvent and the function of the protein can be expressed in the organic solvent. Therefore, the present inventor previously made it possible to solubilize the enzyme in an organic solvent by modifying the enzyme with an amphipathic polymer (JP-A-60-15639).
Five). However, it is generally necessary to recover and reuse these in order to use them as physiologically active substances.
酵素タンパク質の分離回収法としては、従来の酵素タ
ンパク質を高分子または無機物質の担体と結合させて不
溶化し、沈降または遠心分離により回収する方法に代わ
つて、最近迅速簡便で急速分離が可能となる磁気分離が
注目を集めている。この方法は、磁性体粒子表面にタン
パク質を直接に吸着させる方法、当該粒子表面に有機高
分子（ポリアクリルアミド、デキストラン、デンプン、
牛血清アルブミン、セルロース）を吸着もしくは被覆さ
せて、これにタンパク質を結合させる方法であり、一般
の電磁石では約30nmまでの粒子径の磁性体が、超伝導電
磁石ではさらに小さいものまで分離可能である。しかし
これらの複合体は、水溶液中のみに安定に分散し、有機
溶媒中では凝集して大塊状となつて使用できない。そこ
で磁性体とタンパク質などの生理活性物質との複合体を
水溶液中および有機溶媒中に分散もしくはコロイドとし
て溶解させる技術について鋭意研究を行つた結果、本発
明を完成するに至つた。As a method for separating and recovering enzyme proteins, it has become possible to perform rapid and simple separation recently, instead of the conventional method of insolubilizing an enzyme protein by binding it to a carrier of a polymer or an inorganic substance and recovering it by sedimentation or centrifugation. Magnetic separation is gaining attention. This method is a method of directly adsorbing a protein on the surface of magnetic particles, and an organic polymer (polyacrylamide, dextran, starch,
It is a method of adsorbing or coating (bovine serum albumin, cellulose) and binding proteins to it. With a general electromagnet, a magnetic substance with a particle size up to about 30 nm can be separated into even smaller particles with a superconducting electromagnet. . However, these composites are stably dispersed only in an aqueous solution and aggregate in an organic solvent to form a large lump, which cannot be used. Therefore, as a result of intensive research into a technique of dispersing a complex of a magnetic substance and a physiologically active substance such as protein in an aqueous solution or an organic solvent, the present invention has been completed.
本発明は、水及び有機溶媒に対して両親媒性である高
分子を介して、磁性体と生理活性物質が結合した磁性体
生理活性物質複合体である。The present invention is a magnetic substance physiologically active substance complex in which a magnetic substance and a physiologically active substance are bound via a polymer that is amphipathic to water and an organic solvent.
両親媒性の高分子としては、ポリエチレングリコール
誘導体、ポリプロピレングリコール誘導体、ポリスチレ
ンマレイン酸誘導体などを用いることができる。これら
のうちポリエチレングリコール誘導体が特に好ましい。As the amphipathic polymer, a polyethylene glycol derivative, a polypropylene glycol derivative, a polystyrene maleic acid derivative or the like can be used. Of these, polyethylene glycol derivatives are particularly preferable.
両親媒性高分子の分子量は、生理活性物質の分子量お
よび磁性体の粒子径に応じて変えることにより有機溶媒
への分散安定性を得ることができる。一般には磁性体生
理活性物質複合体がベンゼンなどの有機溶媒中に安定に
溶解もしくは分散するには両親媒性高分子の分子量は大
きい方が望ましい。代表的な両親媒性高分子の１種であ
るポリエチレングリコール誘導体では500-200,000の分
子量が好ましい。生理活性物質の１つであるタンパク質
に関しては、たとえば分子量約14,000のリゾチウムでは
1000以上の高分子、分子量約33,000のリパーゼでは2,00
0以上の高分子、分子量約240,000のカタラーゼでは10,0
00以上の分子量の高分子がよい。また30nm以上の粒子径
のフエライトを磁性体とする時は2,000以上の分子量の
高分子、30nmより小さい粒子径の磁性体では500以上の
分子量の高分子が使用できる。また生理活性物質の１つ
である分子量132のＤ−アスパラギンでは500以上の分子
量の高分子が使用できる。Dispersion stability in an organic solvent can be obtained by changing the molecular weight of the amphipathic polymer depending on the molecular weight of the physiologically active substance and the particle size of the magnetic substance. In general, in order to stably dissolve or disperse the magnetic substance-physiologically active substance complex in an organic solvent such as benzene, it is desirable that the amphiphilic polymer has a large molecular weight. A polyethylene glycol derivative, which is one of typical amphiphilic polymers, preferably has a molecular weight of 500 to 200,000. Regarding proteins, which are one of the physiologically active substances, for example, in lysodium with a molecular weight of about 14,000,
2,000 for lipases with a high molecular weight of over 1,000 and a molecular weight of about 33,000
Higher than 0, 10,0 for catalase with a molecular weight of about 240,000
A polymer having a molecular weight of 00 or more is preferable. Further, when a ferrite having a particle diameter of 30 nm or more is used as a magnetic material, a polymer having a molecular weight of 2,000 or more can be used, and for a magnetic material having a particle diameter of less than 30 nm, a polymer having a molecular weight of 500 or more can be used. Further, D-asparagine having a molecular weight of 132, which is one of the physiologically active substances, can use a polymer having a molecular weight of 500 or more.
本発明の複合体を調製する反応は、次の２つの反応様
式で行える。磁性体はＭ、生理活性物質をＥ、両親媒性
高分子をＰ、そして本発明の磁性体生理活性物質複合体
をＭ−Ｐ−Ｅとする。The reaction for preparing the complex of the present invention can be carried out in the following two reaction modes. The magnetic substance is M, the physiologically active substance is E, the amphipathic polymer is P, and the magnetic substance physiologically active substance complex of the present invention is M-P-E.
反応様式（１）：まず両親媒性高分子と生理活性物質
を化学結合させて複合体Ｐ−Ｅを合成し、このＰ−Ｅを
磁性化してＭ−Ｐ−Ｅを合成する。Reaction mode (1): First, an amphipathic polymer and a physiologically active substance are chemically bonded to synthesize a complex PE, and this PE is magnetized to synthesize MPE.
ｉ） Ｐ＋Ｅ→Ｐ−Ｅ − ii） Ｍ＋Ｐ−Ｅ→Ｍ−Ｐ−Ｅ − 反応様式（２）：まず両親媒性高分子を磁性化して複合
体Ｍ−Ｐを合成し、このＭ−Ｐに生理活性物質Ｅを化学
結合させてＭ−Ｐ−Ｅを合成する。i) P + E → P−E− ii) M + P−E → M−P−E− Reaction mode (2): First, an amphipathic polymer is magnetized to synthesize a complex M−P, and this M−P is obtained. The physiologically active substance E is chemically bonded to synthesize M-P-E.
ｉ） Ｍ＋Ｐ→Ｍ−Ｐ − ii） Ｍ−Ｐ＋Ｅ→Ｍ−Ｐ−Ｅ − ＰとＥの結合及びＭ−ＰとＥの結合は、好ましく
は共有結合であり、両親媒性高分子の水酸基、カルボキ
シル基、アミノ基、スルフヒドリル基が、生理活性物質
の水酸基、アミノ基、カルボキシル基などと共有結合
し、たとえば酸アミド結合、エステル結合、ジスルフイ
ド結合する。i) M + P → MP− ii) M−P + E → M−P−E − The bond between P and E and the bond between M−P and E are preferably covalent bonds, and the hydroxyl group of the amphipathic polymer, A carboxyl group, an amino group, and a sulfhydryl group are covalently bonded to a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, and the like of a physiologically active substance, for example, an acid amide bond, an ester bond, and a disulfide bond.
以下にその例を示す。ここでＰ−OHは水酸基を持つ両
親媒性高分子を示し、Ｅは生理活性物質分子を示し、Ｅ
−OH、Ｅ−NH2、Ｅ−COOH、Ｅ−SHなどは水酸基、アミ
ノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基を有する生理
活性物質を示す。An example is shown below. Here, P-OH represents an amphipathic polymer having a hydroxyl group, E represents a bioactive substance molecule, and E
-OH, E-NH 2, E -COOH, etc. E-SH indicates a physiologically active substance having a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, a sulfhydryl group.
１） Ｐ−OHと塩化シアヌルとを塩基の存在下、不活性
溶媒中で反応させ、Ｐ−OH鎖が１又は２個結合した活性
化誘導体を得る。活性化誘導体は緩衝溶液中で生理活性
物質と反応させ、生理活性物質分子中のアミノ基とまた
は水酸基と結合させる。1) P-OH and cyanuric chloride are reacted in the presence of a base in an inert solvent to obtain an activated derivative having 1 or 2 P-OH chains bonded. The activated derivative is reacted with a physiologically active substance in a buffer solution to bond with an amino group or a hydroxyl group in the molecule of the physiologically active substance.
２） Ｐ−OHとブロモアセチルブロミドをジブロム酢酸
とジオキサン中で反応させてＰ−ブロモアセートを得
る。このアセチル誘導体を生理活性物質と反応させる。
ジブロモ無水こはく酸を用いて製造されるＰ−ジブロモ
サクシネートも又生理活性物質と反応させうる。 2) P-OH and bromoacetyl bromide are reacted with dibromoacetic acid in dioxane to obtain P-bromoacetate. This acetyl derivative is reacted with a physiologically active substance.
P-dibromosuccinate prepared with dibromosuccinic anhydride can also be reacted with bioactive substances.
３） 酸アジド法としては、Ｐ−OHをクロル酢酸無水
物、次いでジアゾメタンと反応させてＰ−酢酸メチルエ
ーテルを得、これをヒドラジドで処理して相当するヒド
ラジドを得、亜硝酸ソーダで処理して酸ジアド誘導体を
得る。この活性誘導体を生理活性物質と反応させて、生
理活性物質中の遊離アミノ基とアミド結合させる。 3) As the acid azide method, P-OH is reacted with chloroacetic anhydride and then diazomethane to obtain P-acetic acid methyl ether, which is treated with hydrazide to obtain the corresponding hydrazide, and treated with sodium nitrite. To obtain an acid diad derivative. This active derivative is reacted with a physiologically active substance to form an amide bond with a free amino group in the physiologically active substance.
４） ジアゾ法としては、例えばＰ−OHをイサト酸無水
物と反応させてアトラニル酸エステルを得、次いで酸性
で亜硝酸ソーダを処理してジアゾニウム誘導体とし、こ
れを生理活性物質とジアゾカツプリングさせる。 4) As the diazo method, for example, P-OH is reacted with isatoic acid anhydride to obtain an atranilic acid ester, and then sodium nitrite is treated with an acid to form a diazonium derivative, which is then coupled with a physiologically active substance by diazo coupling. .
５） Ｐ−OHの水酸基はアミノ基に変えうる。この方法
は、例えばＰ−OHにトシルクロリドを反応させてＰ−OH
−トシレートとし、次ぎにフタルイミド塩と反応させて
Ｎ−Ｐ置換フタルイミドを得、これをヒドラジンで処理
するとアミノ基を持つ両親媒性高分子Ｐ−NH2が得られ
る。このＰ−NH2をカルボジイミド試薬やウツドワード
試薬Ｋによつて生理活性物質中のカルボキシル基と反応
させる。或はＰ−OH−トシレート又はハロゲン化剤を反
応させて得られるＰ−OH−ブロミドをナトリウムアジド
でＰ−OH−アジドとし、水素還元してＰ−NH2とするこ
ともできる。 5) The hydroxyl group of P-OH can be changed to an amino group. This method is carried out, for example, by reacting P-OH with tosyl chloride.
-Tosylate, and then reacted with a phthalimide salt to obtain an NP-substituted phthalimide, which is treated with hydrazine to obtain an amphipathic polymer P-NH2 having an amino group. The P-NH2 is reacted with the carboxyl group in the physiologically active substance by using a carbodiimide reagent or Woodward reagent K. Or the P-OH @ - azide P-OH @ - bromide obtained by reacting P-OH @ - tosylate or halogenating agent with sodium azide, may be a P-NH2 by hydrogen reduction.
６） Ｐ−OHのカルボン酸誘導体は前記の方法の外に、
カリウムｔ−ブトキシドの存在下にブロモ酢酸エステル
を反応させ、加水分解してＰ−カルボキシメチルエーテ
ルを得ることができる。このカルボン酸を有する両親媒
性高分子P-O-CH2COOHをカルボジイミド試薬を利用して
Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミドと反応させて相当するこ
はく酸イミドエステルを得、これを生理活性物質中のア
ミノ基または水酸基と反応させる。 6) Carboxylic acid derivatives of P-OH are obtained by the method described above,
Bromoacetic acid ester can be reacted in the presence of potassium t-butoxide and hydrolyzed to give P-carboxymethyl ether. The amphiphilic polymer PO-CH2 COOH having this carboxylic acid is reacted with N-hydroxysuccinimide using a carbodiimide reagent to obtain a corresponding succinimide ester, which is used as an amino group in a physiologically active substance. Alternatively, it is reacted with a hydroxyl group.
７） Ｅのスルフヒドリル基へのＰの結合は上記のアミ
ノ基への結合法でできるが、スルフヒドリル基に特異的
に結合させるには例えば塩化シアヌルを用いた結合反応
時にpHを中性付近まで下げるか、スルフヒドリル基に特
異的な反応性を示す次の試薬をＰに導入すればよい。 7) P can be bound to the sulfhydryl group of E by the above-mentioned method of binding to the amino group, but in order to specifically bind to the sulfhydryl group, the pH is lowered to around neutral during the binding reaction using cyanuric chloride, for example. Alternatively, the following reagent having a specific reactivity with a sulfhydryl group may be introduced into P.
ＭとＰ−Ｅとが結合する反応及びＭとＰとが結合す
る反応は磁性化反応であり、磁性化反応では予め調製
された磁性体粒子を用いてもよく、また磁性体の生成反
応を同時に行わせてもよい。 The reaction between M and P-E and the reaction between M and P is a magnetizing reaction. In the magnetizing reaction, magnetic particles prepared in advance may be used. You may make it perform simultaneously.
ＭとＰとの間の結合は非可逆的であれば共有結合、イ
オン結合などの化学結合あるいは物理的化学的吸着など
のいずれの結合様式でもあつてもよい。たとえば、両親
媒性の高分子にカルボキシル基、水酸基、アミノ基、ス
ルフヒドリル基、フエノール基などがあれば、磁性体の
水酸基との共有結合もしくは配位結合、あるいはこれら
の間でのフアンデルワールス力による結合を用いること
ができる。また、PEGの場合にはエーテル結合の酸素原
子との結合を用いることができる。The bond between M and P may be any bond mode such as covalent bond, ionic bond or other chemical bond, or physical / chemical adsorption as long as it is irreversible. For example, if the amphipathic polymer has a carboxyl group, a hydroxyl group, an amino group, a sulfhydryl group, a phenol group, etc., a covalent bond or a coordinate bond with the hydroxyl group of the magnetic substance, or a Van der Waals force between them. Can be used. Further, in the case of PEG, a bond with an oxygen atom of an ether bond can be used.
磁性体としては遷移金属またはそのイオン、その酸化
物あるいはこれらと他の元素との化合物、つまり鉄、コ
バルト、ニツケルなどの金属及びこれらの酸化物、マグ
ネタイト、フエライト、ガーネツト型酸化物、コランダ
ム型酸化物、ペロブスカイト型酸化物、マグネツト、プ
ランバイト型酸化物、ルチル型酸化物、エルビウム、ル
テチウム、ジスプロシウム、テルビウム、ツリウム、カ
ドリニウム、さらにフエリチンやハイスピン型のデオキ
シヘモグロビンおよびヘムまたはその誘導体を用いるこ
とができる。The magnetic substance is a transition metal or its ion, its oxide or a compound of these with other elements, that is, metals such as iron, cobalt, nickel and their oxides, magnetite, ferrite, garnett type oxide, corundum type oxide. Compounds, perovskite type oxides, magnets, prumbite type oxides, rutile type oxides, erbium, lutetium, dysprosium, terbium, thulium, cadolinium, and ferritin and high spin type deoxyhemoglobin and heme or derivatives thereof can be used. .
磁性体の生成反応を同時に行わせる場合は、第一鉄イ
オンと第二鉄イオンとの中性−アルカリでの反応、第一
鉄イオンの酸化による反応、レピドクロサイトあるいは
アカガネサイトと第一鉄イオンとの反応、グリーンラス
トの酸化もしくは自発反応、無定型第二鉄酸化物と第一
鉄イオンとの反応などを用いることができる。When carrying out the reaction of forming the magnetic substance at the same time, the reaction of ferrous ion and ferric ion in neutral-alkali, the reaction by the oxidation of ferrous ion, lepidocrocite or akaganesite and ferrous iron A reaction with an ion, an oxidation or spontaneous reaction of green last, a reaction between an amorphous ferric oxide and a ferrous ion can be used.
上に示した２つの反応様式の磁性体生理活性物質複合
体の合成法の何れを用いても、両親媒性高分子の分子量
を変えることによつて有機溶媒中への溶解性及び分散
性、さらに安定性及び活性が同じ磁性体生理活性物質複
合体を得ることができる。例えば生理活性物質がリパー
ゼの場合、反応様式（１）で分子量2,000のポリエチレ
ングリコール誘導体を用いて得た磁性体リパーゼ複合体
と、反応様式（２）で分子量10,000のポリエチレングリ
コール誘導体を用いて得た磁性体リパーゼ複合体は同じ
性質を有する。Whichever method of synthesizing the magnetic substance-physiologically active substance complex having the two reaction modes shown above, solubility and dispersibility in an organic solvent can be obtained by changing the molecular weight of the amphipathic polymer. Furthermore, it is possible to obtain a magnetic substance physiologically active substance complex having the same stability and activity. For example, when the physiologically active substance is lipase, it was obtained by using a magnetic substance lipase complex obtained by using a polyethylene glycol derivative having a molecular weight of 2,000 in the reaction mode (1) and a polyethylene glycol derivative having a molecular weight of 10,000 in the reaction mode (2). The magnetic lipase complex has the same properties.
磁性体生理活性物質複合体粒子の大きさは、予め調製
した磁性体を用いる場合はその磁性体粒子の大きさとな
り、磁性体生成反応を行う場合はＰ−Ｅ（反応様式
（１））またはＰ（反応様式（２））と磁性体生成に用
いる試薬の量とによつて決まる。たとえば粒子径50nmの
フエライトを用いた場合は粒子型50nmの磁性体生理活性
物質複合体となる。また1gのポリエチレングリコール−
リパーゼ（Ｐ−Ｅ）に64mg塩化第一鉄と151mg塩化第二
鉄を反応させた場合は粒子径30nmの複合体となり、これ
らの鉄イオンの量を少なくすると、たとえば6.4mg塩化
第一鉄と15mg塩化第二鉄を反応させた場合は粒子径10nm
の複合体となる。The size of the magnetic substance-physiologically active substance complex particle is the size of the magnetic substance particle when the previously prepared magnetic substance is used, and when the magnetic substance-forming reaction is performed, PE (reaction mode (1)) or It is determined by P (reaction mode (2)) and the amount of the reagent used for producing the magnetic substance. For example, when ferrite having a particle diameter of 50 nm is used, it becomes a particle-type 50 nm magnetic substance-physiologically active substance complex. 1g of polyethylene glycol-
When 64 mg ferrous chloride and 151 mg ferric chloride are reacted with lipase (P-E), a complex having a particle size of 30 nm is formed, and if the amount of these iron ions is reduced, for example, 6.4 mg ferrous chloride Particle size is 10 nm when reacted with 15 mg ferric chloride
Becomes a complex of.
磁性体生理活性物質複合体の生理活性、たとえば酵素
活性はその粒子径の大きさに依存し、粒子径が小さいほ
ど活性は大となる。これは粒子径が小さくなるにともな
つて粒子の表面積が増大することによる。たとえばポリ
エチレングリコール誘導体を用いて合成した磁性体リパ
ーゼ複合体のベンゼン中でのエステル合成活性をポリエ
チレングリコール−リパーゼ（上記反応様式（１）中の
Ｐ−Ｅ）と比較すると、粒子径70および10nmの磁性体リ
パーゼ複合体の活性はポリエチレングリコール−リパー
ゼの活性のそれぞれ10および95％である。The physiological activity of the magnetic substance physiologically active substance complex, for example, the enzyme activity depends on the size of the particle diameter, and the smaller the particle diameter, the greater the activity. This is because the surface area of the particles increases as the particle size decreases. For example, comparing the ester synthesis activity in benzene of a magnetic lipase complex synthesized using a polyethylene glycol derivative with polyethylene glycol-lipase (PE in the above reaction mode (1)), the particle diameters of 70 and 10 nm were found. The activity of the magnetic lipase complex is 10 and 95% of that of polyethylene glycol-lipase, respectively.
磁性体生理活性物質複合体は水溶液中および有機溶媒
中に安定に分散する。たとえば磁性体リパーゼ複合体は
ベンゼン中で2000xgで５分間の遠心では沈澱せず、約２
日ないし７日間水溶液およびベンゼンなどの有機溶媒の
中に分散溶解する。The magnetic substance-bioactive substance complex is stably dispersed in an aqueous solution and an organic solvent. For example, the magnetic lipase complex does not precipitate by centrifugation in benzene at 2000xg for 5 minutes,
Disperse and dissolve in an aqueous solution and an organic solvent such as benzene for one to seven days.
磁性体生理活性物質複合体を構成する磁性体が強磁性
体で粒子径約30nm以上のもの永久磁石および電磁石で分
離でき、その他の磁性体では粒子径の大きさを問わず超
伝導電磁石で分離できる。たとえば粒子径約70nmの強磁
性体（フエライト）−リパーゼ複合体は、常磁石を用い
た1.7cm間隔で300エルステツド（Oe）の磁場中で、５分
間で100％回収される。また粒子径が30nmのものでは、
電磁石を用いた1.7cm間隔で5000Oeの磁場中で、７分間
で100％回収される。また常磁性体（エルビウム）−生
理活性物質複合体は超伝導電磁石を用いた２テスラ
（Ｔ）＝20,000Oeの磁場中で、５分間で100％回収され
る。Magnetic substance The magnetic substance that constitutes the physiologically active substance complex is a ferromagnetic substance with a particle size of about 30 nm or more, which can be separated by a permanent magnet or an electromagnet, and other magnetic substances can be separated by a superconducting electromagnet regardless of the particle size. it can. For example, a ferromagnetic substance (ferrite) -lipase complex having a particle size of about 70 nm is 100% recovered in 5 minutes in a magnetic field of 300 oersteds (Oe) at 1.7 cm intervals using a normal magnet. If the particle size is 30 nm,
100% recovery in 7 minutes in a magnetic field of 5000 Oe at 1.7 cm intervals using an electromagnet. The paramagnetic substance (erbium) -physiologically active substance complex is 100% recovered in 5 minutes in a magnetic field of 2 tesla (T) = 20,000 Oe using a superconducting electromagnet.
本発明は、生理活性物質である酵素、タンパク質、抗
体、抗原、多糖類、核酸、脂質、アミノ酸、補酵素（NA
D+、NADP+など）、高エネルギーリン酸化合物（ATP、AD
Pなど）、補欠分子族（ヘム、リボフラビンなど）、ホ
ルモン、ビタミン、レセプター、リガンド、抗生物質、
抗腫瘍性物質、薬剤、またはクロロプラスト、ミトコン
ドリア、ウイルス、細胞などおよびその構成成分に適用
できる。たとえば酵素としてはリパーゼ、エステラー
ゼ、キモトリプシン、トリプシン、サブチリシンのよう
な加水分解酵素、ペルオキシダーゼ、カタラーゼのよう
な酸化還元酵素、ウロキナーゼであつて、基質又は生成
物が水不溶性である場合に好適に用いられ、有機溶媒中
で反応を行うことにより可逆的に反応を進行させること
できる場合も含む。補酵素を用いた場合には、補酵素を
必要とする酵素反応、たとえばアルコール脱水素反応を
行わせることができる。ATP、ADPなどを用いた場合に
は、これらを基質とする酵素反応に利用できる。また特
異抗体、コンカナバリンＡ、多糖類、アミノ酸、ビタミ
ン、脂質、ホルモン、ウイルスなどのような物質を用い
て、これと親和性を有する物質を分離、精製、回収する
ことができる。さらに抗生物質、抗腫瘍性物質、薬剤を
用いた場合には、これらの物質に磁性を付与できるの
で、磁性を有する両親媒性の薬剤とすることができる。The present invention relates to physiologically active substances such as enzymes, proteins, antibodies, antigens, polysaccharides, nucleic acids, lipids, amino acids, coenzymes (NA
D+ , NADP+, etc., high energy phosphate compounds (ATP, AD
P, etc.), prosthetic group (heme, riboflavin, etc.), hormones, vitamins, receptors, ligands, antibiotics,
It can be applied to anti-tumor substances, drugs or chloroplasts, mitochondria, viruses, cells etc. and their constituents. For example, the enzyme is a hydrolase such as lipase, esterase, chymotrypsin, trypsin or subtilisin, redox enzyme such as peroxidase or catalase, urokinase, which is preferably used when the substrate or product is water-insoluble. Including cases where the reaction can be reversibly progressed by carrying out the reaction in an organic solvent. When a coenzyme is used, an enzymatic reaction requiring the coenzyme, for example, an alcohol dehydrogenation reaction can be performed. When ATP, ADP, etc. are used, they can be used for the enzymatic reaction using these as substrates. In addition, substances such as specific antibodies, concanavalin A, polysaccharides, amino acids, vitamins, lipids, hormones, viruses can be used to separate, purify, and recover substances having an affinity for them. Further, when an antibiotic, an antitumor substance or a drug is used, it is possible to impart magnetism to these substances, so that the drug can be an amphipathic drug having magnetism.
本発明の特徴は、両親媒性を有する高分子を介して磁
性体と生理活性物質が結合しており、この結果、１）磁
性によつて磁性体生理活性物質複合体は、水溶液中およ
び有機溶媒中から磁気分離による迅速簡便な回収が可能
となる。２）高分子の持つ両親媒性によつて磁性体生理
活性物質複合体は水溶液および有機溶媒にコロイドとし
て溶解もしくは分散する。３）従来の水溶液を用いるバ
イオリアクターでは不可能な有機合成反応もしくは生物
活性の発現を可能にする。４）磁気分離した磁性体生理
活性物質複合体は、使用した溶媒に再び溶解もしくは分
散し、再使用することが可能となる。５）薬剤として用
いた場合患部の疎水的、親水的環境を問わず、薬剤を患
部に磁気的に誘導することができる。The feature of the present invention is that a magnetic substance and a physiologically active substance are bound to each other through an amphiphilic polymer, and as a result, 1) the magnetic substance has a physiologically active substance complex in an aqueous solution or an organic substance. It enables rapid and simple recovery from the solvent by magnetic separation. 2) Due to the amphipathic nature of the polymer, the magnetic substance physiologically active substance complex is dissolved or dispersed as a colloid in an aqueous solution and an organic solvent. 3) It enables the expression of organic synthetic reactions or biological activities that are not possible with conventional bioreactors using aqueous solutions. 4) The magnetic substance-physiologically active substance complex separated magnetically can be reused after being dissolved or dispersed again in the solvent used. 5) When used as a drug The drug can be magnetically guided to the affected area regardless of the hydrophobic or hydrophilic environment of the affected area.
以下に本発明の実施例を示す。 Hereinafter, examples of the present invention will be described.
実施例１ ａ） 5g（2.5m mol）のα，ω−ジカルボキシポリ（オ
キシエチレン）（平均分子量2000）と288mg（2.5m mo
l）のＮ−ヒドロキシこはく酸イミドを15mlのジメチル
ホルムアミドに溶かし、618mgのジシクロヘキシルカル
ボジイミドを含む1mlのジメチルホルムアミドを加え
て、ポリエチレングリコール誘導体のカルボキシル基を
活性化した。200mgのシユウドモナス・フルオレスセン
ス菌体より得たリパーゼを含む20mlのリン酸緩衝水溶液
（pH7.0）に2gの上記活性化ポリエチレングリコール誘
導体を加えて25℃で１時間反応させて、ポリエチレング
リコール−リパーゼを得た。Example 1 a) 5 g (2.5 mmol) α, ω-dicarboxypoly (oxyethylene) (average molecular weight 2000) and 288 mg (2.5 mmol)
The N-hydroxysuccinimide of l) was dissolved in 15 ml of dimethylformamide, and 1 ml of dimethylformamide containing 618 mg of dicyclohexylcarbodiimide was added to activate the carboxyl group of the polyethylene glycol derivative. To 20 ml of a phosphate buffered aqueous solution (pH 7.0) containing lipase obtained from 200 mg of C. fluorescens cells, 2 g of the activated polyethylene glycol derivative was added and reacted at 25 ° C. for 1 hour to give polyethylene glycol- I got lipase.
1gのポリエチレングリコール−リパーゼを1.3mlの水
に溶かし、アンモニア水でpH8.0にし、この溶液に64mg
の塩化第一鉄と151mgの塩化第二鉄を含む0.6mlの水溶液
を滴加した。滴加中はアンモニア水でpHを8.0から8.5に
維持し、室温で十分に攪拌した。水に十分透析した後、
凍結乾燥により磁性体−リパーゼ複合体を得た。Dissolve 1 g of polyethylene glycol-lipase in 1.3 ml of water, adjust to pH 8.0 with aqueous ammonia, and add 64 mg to this solution.
Was added dropwise to an aqueous solution containing 0.6 ml of ferrous chloride and 151 mg of ferric chloride. The pH was maintained at 8.0 to 8.5 with aqueous ammonia during the dropwise addition, and the mixture was sufficiently stirred at room temperature. After sufficient dialysis against water,
A magnetic substance-lipase complex was obtained by freeze-drying.
この磁性体−リパーゼ複合体の磁性体含有率は34％
で、タンパク質含有率は30％であつた。また、水溶液中
でのオリーブ油の加水分解活性は1500単位/mgタンパク
質であり、代表的な疎水性有機溶媒の一つであるベンゼ
ン中でのラウリン酸ラウリルの合成活性は10μmol/分/m
gタンパク質であつた。磁性体−リパーゼ複合体は反応
溶液中から6000エルステツド（Oe）の磁場中で５分間で
完全に回収された。これは再びコロイドとして反応溶液
に溶解し、同様の活性を示した。The magnetic substance content of this magnetic substance-lipase complex is 34%.
The protein content was 30%. The hydrolysis activity of olive oil in an aqueous solution is 1500 units / mg protein, and the synthetic activity of lauryl laurate in benzene, which is one of the typical hydrophobic organic solvents, is 10 μmol / min / m.
g protein. The magnetic substance-lipase complex was completely recovered from the reaction solution in a magnetic field of 6000 oersteds (Oe) in 5 minutes. It again dissolved in the reaction solution as a colloid and showed similar activity.
水溶液およびベンゼン中にコロイドとして溶解した磁
性体−リパーゼ複合体は、2000xgの遠心では沈降せず、
600nmでの濁度測定では24-60時間変化せず、有機溶媒中
に安定に分散することが判つた。水溶液中でも同様の分
散安定性がみられた。電子顕微鏡観察によれば、粒径が
10-40nmの超微粒子であつた。The magnetic substance-lipase complex dissolved as a colloid in an aqueous solution and benzene did not sediment by centrifugation at 2000xg,
Turbidity measurement at 600 nm did not change for 24 to 60 hours, and it was found to be stable in organic solvent. Similar dispersion stability was observed in the aqueous solution. According to electron microscope observation,
It was 10-40 nm ultrafine particles.
ベンゼン以外の有機溶媒ではトルエン、クロロホル
ム、塩素化炭化水素類などの、ここで使用した両親媒性
高分子が溶解する溶媒中で、この磁性体−リパーゼ複合
体は同様の性質を示した。In an organic solvent other than benzene, the magnetic substance-lipase complex exhibited similar properties in a solvent in which the amphiphilic polymer used here, such as toluene, chloroform, and chlorinated hydrocarbons, dissolves.
ｂ） 分子量2000のα，ω−ジカルボキシポリ（オキシ
エチレン）のかわりに分子量5000および20000のα，ω
−ジカルボキシポリ（オキシエチレン）を用いても同様
の性質を有する磁性体−リパーゼ複合体を得た。b) α, ω-dicarboxypoly (oxyethylene) with a molecular weight of 2000, instead of α, ω with a molecular weight of 5000 and 20000
A magnetic substance-lipase complex having the same properties was obtained by using dicarboxypoly (oxyethylene).
ｃ） α，ω−ジカルボキシポリ（オキシエチレン）の
かわりにα−アミノ−ω−カルボキシポリ（オキシエチ
レン）（分子量2000）、またはα−カルボキシ−ω−メ
トキシポリ（オキシエチレン）（分子量2000）2,4−ビ
ス（メトキシポリオキシエチレン）−６−クロル−ｓ−
トリアジン（分子量10000）を用いても同様の性質を有
する磁性体−リパーゼ複合体を得た。c) α-amino-ω-carboxypoly (oxyethylene) (molecular weight 2000) or α-carboxy-ω-methoxypoly (oxyethylene) (molecular weight 2000) 2 in place of α, ω-dicarboxypoly (oxyethylene) 2 , 4-bis (methoxypolyoxyethylene) -6-chloro-s-
A magnetic substance-lipase complex having similar properties was also obtained by using triazine (molecular weight: 10,000).
ｄ） またα，ω−ジカルボキシポリ（オキシエチレ
ン）のかわりにのα，ω−ジアミノポリ（オキシエチレ
ン）を用いて得たポリエチレングリコール−リパーゼか
らでも同様の磁性体−リパーゼ複合体を得た。ポリエチ
レングリコール−リパーゼは、2gのα，ω−ジアミノポ
リ（オキシエチレン）200mgのリパーゼを含む20mlのリ
ン酸緩衝水溶液（pH7.0）に200mgの水溶性カルボジイミ
ドを加えて37℃で30分間反応させた後、水に透析してポ
リエチレングリコール−リパーゼを得た。d) A similar magnetic substance-lipase complex was obtained from polyethylene glycol-lipase obtained by using α, ω-diaminopoly (oxyethylene) instead of α, ω-dicarboxypoly (oxyethylene). For polyethylene glycol-lipase, 200 mg of water-soluble carbodiimide was added to 20 ml of a phosphate buffer aqueous solution (pH 7.0) containing 2 g of α, ω-diaminopoly (oxyethylene) and 200 mg of lipase and reacted at 37 ° C for 30 minutes. Then, it was dialyzed against water to obtain polyethylene glycol-lipase.
実施例２ リパーゼのかわりに150mgのバチルス・サブチリス菌
体由来のサブチリシンを用いて実施例１のａ）の方法に
従つて磁性体−サブチリシン複合体を得た。この磁性体
−サブチリシン複合体の磁性体含有率は36％で、タンパ
ク質含有率は25％であつた。また、水溶液中でのアセチ
ルチロシンエチルエステルの加水分解活性は600単位/mg
タンパク質であり、代表的な疎水性有機溶媒の一つであ
るベンゼン中でのＮ−ベンゾイルチロシンブチルアミド
の合成活性は4.0μmol/分/mgタンパク質であつた。磁性
体−サブチリシン複合体は反応溶液中から5500エルステ
ツド（Oe）の磁場中で５分間で完全に回収された。これ
は再びコロイドとして反応溶液に溶解し、同様の活性を
示した。水溶液および有機溶媒中にコロイドとして溶解
した磁性体−サブチリシン複合体の分散安定性、その粒
子径およびその他の性質は上記の磁性体−リパーゼ複合
体と同じであつた。Example 2 A magnetic substance-subtilisin complex was obtained according to the method of Example 1 a) using 150 mg of subtilisin derived from Bacillus subtilis cells instead of lipase. The magnetic substance-subtilisin complex had a magnetic substance content of 36% and a protein content of 25%. The hydrolysis activity of acetyltyrosine ethyl ester in aqueous solution is 600 units / mg.
As a protein, the synthetic activity of N-benzoyltyrosine butyramide in benzene, which is one of the typical hydrophobic organic solvents, was 4.0 μmol / min / mg protein. The magnetic substance-subtilisin complex was completely recovered from the reaction solution in a magnetic field of 5500 oersteds (Oe) in 5 minutes. It again dissolved in the reaction solution as a colloid and showed similar activity. The dispersion stability, the particle size and other properties of the magnetic substance-subtilisin complex dissolved as a colloid in an aqueous solution and an organic solvent were the same as those of the above magnetic substance-lipase complex.
実施例３ リパーゼのかわりに70mgの牛肝臓由来のカタラーゼを
用いて実施例１のａ）の方法に従つて磁性体−カタラー
ゼ複合体を得た。この磁性体−カタラーゼ複合体の磁性
体含有率は25％で、タンパク質含有率は45％であつた。
また、水溶液中での過酸化水素の分解活性は60000単位/
mgタンパク質であり、代表的な疎水性有機溶媒の一つで
あるベンゼン中での過酸化水素の分解活性は70000単位/
mgタンパク質であつた。磁性体−カタラーゼ複合体は反
応溶液中から6000エルステツド（Oe）の磁場中で７分間
で完全に回収された。これは再びコロイドとして反応溶
液に溶解し、同様の活性を示した。水溶液および有機溶
媒中にコロイドとして溶解した磁性体−カタラーゼ複合
体の分散安定性およびその粒子径は上記の磁性体−リパ
ーゼ複合体と同じであつた。Example 3 A magnetic substance-catalase complex was obtained according to the method of Example 1 a) using 70 mg of catalase derived from bovine liver instead of lipase. The magnetic substance-catalase complex had a magnetic substance content of 25% and a protein content of 45%.
The decomposition activity of hydrogen peroxide in aqueous solution is 60,000 units /
mg protein, the decomposition activity of hydrogen peroxide in benzene, which is one of the typical hydrophobic organic solvents, is 70,000 units /
It was mg protein. The magnetic substance-catalase complex was completely recovered from the reaction solution in a magnetic field of 6000 oersteds (Oe) in 7 minutes. It again dissolved in the reaction solution as a colloid and showed similar activity. The dispersion stability and particle size of the magnetic substance-catalase complex dissolved as a colloid in an aqueous solution and an organic solvent were the same as those of the above magnetic substance-lipase complex.
またリパーゼの代わりにエステラーゼでも同様の結果
を得た。Similar results were obtained with esterase instead of lipase.
実施例４ 5gのα，ω−ジカルボキシポリ（オキシエチレン）
（平均分子量2000）を5mlの水に溶かし、アンモニア水
溶液でpHを8.0にし、この溶液に250mgの塩化第一鉄50mg
の塩化コバルトと750mgの塩化第二鉄を含む2.4mlの蒸留
水を滴加した。滴加中はアンモニア水溶液でpHを8.0か
ら8.5に維持し、60℃で十分に攪拌した。反応液を水に
十分透析して、磁性体−ポリエチレングリコールを得
た。Example 4 5 g of α, ω-dicarboxypoly (oxyethylene)
(Average molecular weight 2000) is dissolved in 5 ml of water, pH is adjusted to 8.0 with aqueous ammonia solution, and 250 mg of ferrous chloride 50 mg is added to this solution.
2.4 ml of distilled water containing cobalt chloride and 750 mg of ferric chloride was added dropwise. During the dropwise addition, the pH was maintained at 8.0 to 8.5 with an aqueous ammonia solution, and the mixture was sufficiently stirred at 60 ° C. The reaction solution was thoroughly dialyzed against water to obtain a magnetic substance-polyethylene glycol.
5mgのシユウドモナス・フルオレスセンス菌体より得
たリパーゼと75mgの磁性体−ポリエチレングリコールを
含む4mlのりん酸緩衝液（pH7.0）に500mgの水溶性カル
ボジイミドを加え、37℃で90分間反応させた後、反応液
に5mlの水を加えた後、磁気分離により生成した磁性体
−リパーゼ複合体を水で十分洗浄後、凍結乾燥して、磁
性体−リパーゼ複合体を得た。Lipase obtained from 5 mg of C. fluorescens and 75 mg of magnetic substance-4 ml of phosphate buffer (pH 7.0) containing polyethylene glycol was added with 500 mg of water-soluble carbodiimide and reacted at 37 ° C for 90 minutes. After adding 5 ml of water to the reaction solution, the magnetic substance-lipase complex generated by magnetic separation was thoroughly washed with water and freeze-dried to obtain a magnetic substance-lipase complex.
この磁性体−リパーゼ複合体の磁性体含有率は50％
で、タンパク質含有率は20％であつた。また、水溶液中
でのオリーブ油の加水分解活性は500単位/mgタンパク質
であり、代表的な疎水性有機溶媒の一つであるベンゼン
中でのラウリン酸ラウリルの合成活性は1.5μmol/分/mg
タンパク質であつた。磁性体−リパーゼ複合体は反応溶
液中から300エルステツド（Oe）の磁場中で５分間で完
全に回収された。これは再びコロイドとして反応溶液に
溶解し、同様の活性を示した。The magnetic substance content of this magnetic substance-lipase complex is 50%.
The protein content was 20%. The hydrolysis activity of olive oil in an aqueous solution is 500 units / mg protein, and the synthetic activity of lauryl laurate in benzene, which is one of the typical hydrophobic organic solvents, is 1.5 μmol / min / mg.
It was protein. The magnetic substance-lipase complex was completely recovered from the reaction solution in a magnetic field of 300 oersteds (Oe) in 5 minutes. It again dissolved in the reaction solution as a colloid and showed similar activity.
水溶液およびベンゼン中にコロイドとして溶解した磁
性体−リパーゼ複合体は、2000xgの遠心では沈降せず、
600nmでの濁度測定では24-60時間変化せず、有機溶媒中
に安定に分散することが判つた。水溶液中でも同様の分
散安定性がみられた。電子顕微鏡観察によれば、粒径が
60-100nmの超微粒子であつた。The magnetic substance-lipase complex dissolved as a colloid in an aqueous solution and benzene did not sediment by centrifugation at 2000xg,
Turbidity measurement at 600 nm did not change for 24 to 60 hours, and it was found to be stable in organic solvent. Similar dispersion stability was observed in the aqueous solution. According to electron microscope observation,
It was ultrafine particles of 60-100 nm.
ベンゼン以外の有機溶媒ではトルエン、クロロホル
ム、塩素化炭化水素類などの、ここで使用した両親媒性
高分子が溶解する溶媒中で、この磁性体−リパーゼ複合
体は同様の性質を示した。In an organic solvent other than benzene, the magnetic substance-lipase complex exhibited similar properties in a solvent in which the amphiphilic polymer used here, such as toluene, chloroform, and chlorinated hydrocarbons, dissolves.
また上記の方法で得た磁性体−ポリエチレングリコー
ルのカルボキシル基にＮ−ヒドロキシこはく酸イミドを
ジオキサン中常法に従い結合させて、活性化した磁性体
−ポリエチレングリコールを合成した。そして5mgのシ
ユウドモナス・フラギ22-39B菌体より得たリパーゼを含
む4mlのりん酸緩衝液（pH7.0）に75mgの活性化した磁性
体−ポリエチレングリコールを加え、37℃で90分間反応
させた後、精製して、同様の性質を有する磁性体−リパ
ーゼ複合体を得た。Further, N-hydroxysuccinimide was bound to the carboxyl group of the magnetic substance-polyethylene glycol obtained by the above method in dioxane according to a conventional method to synthesize activated magnetic substance-polyethylene glycol. Then, 75 mg of activated magnetic substance-polyethylene glycol was added to 4 ml of a phosphate buffer solution (pH 7.0) containing lipase obtained from 5 mg of C. chrysalis 22-39B cells and reacted at 37 ° C for 90 minutes. Then, the product was purified to obtain a magnetic substance-lipase complex having similar properties.
実施例５ 5gのα，ω−ジカルボキシポリ（オキシエチレン）
（平均分子量2000）と150mgの塩化第一鉄を4mlの水に溶
かし、アンモニア水溶液でpHを8.0にし、65℃で酸素を
１時間通じて酸化させた。反応液を水に十分透析して、
磁性体−ポリエチレングリコールを得た。この磁性体−
ポリエチレングリコールのカルボキシル基にＮ−ヒドロ
キシこはく酸イミドを常法に従い結合させて、活性化し
た磁性体−ポリエチレングリコールを合成した。そして
5mgのシユウドモナス・フルオレスセンス菌体より得た
リパーゼを含む4mlのりん酸緩衝液（pH7.0）に75mgの活
性化した磁性体−ポリエチレングリコールを加え、37℃
で90分間反応させた後、磁気分離により生成した磁性体
−リパーゼ複合体を水で十分洗浄後、凍結乾燥して、磁
性体−リパーゼ複合体を得た。この複合体の分散性ある
いは磁気分離特性などは実施例１の磁性体−リパーゼ複
合体と同じであつた。Example 5 5 g of α, ω-dicarboxypoly (oxyethylene)
(Average molecular weight of 2000) and 150 mg of ferrous chloride were dissolved in 4 ml of water, the pH was adjusted to 8.0 with an aqueous ammonia solution, and oxygen was oxidized at 65 ° C. for 1 hour. Dialyze the reaction solution against water thoroughly,
A magnetic substance-polyethylene glycol was obtained. This magnetic body
N-hydroxysuccinimide was bonded to the carboxyl group of polyethylene glycol by a conventional method to synthesize activated magnetic material-polyethylene glycol. And
To 4 ml of phosphate buffer (pH 7.0) containing lipase obtained from 5 mg of C. fluorescens cells, 75 mg of activated magnetic substance-polyethylene glycol was added, and the temperature was 37 ° C.
After 90 minutes of reaction, the magnetic substance-lipase complex produced by magnetic separation was thoroughly washed with water and freeze-dried to obtain a magnetic substance-lipase complex. The dispersibility and magnetic separation characteristics of this complex were the same as those of the magnetic substance-lipase complex of Example 1.
実施例６ 5gのα，ω−ジカルボキシポリ（オキシエチレン）
（平均分子量2000）とγ−FeOOH（鉄の量で100mg）を5m
lの水に懸濁し、これに塩化第一鉄（鉄の量で50mg）を
溶解した。アンモニア水溶液でpHを8.0にし、窒素気流
中60℃で１時間放置した。反応液を水に十分透析して、
磁性体−ポリエチレングリコールを得た。この磁性体−
ポリエチレングリコールのカルボキシル基にＮ−ヒドロ
キシこはく酸イミドを常法に従い結合させて、活性化し
た磁性体−ポリエチレングリコールを合成した。そして
5mgのシユウドモナス・フルオレスセンス菌体より得た
リパーゼを含む4mlのりん酸緩衝液（pH7.0）に75mgの活
性化した磁性体−ポリエチレングリコールを加え、37℃
で90分間反応させた後、磁気分離により生成した磁性体
−リパーゼ複合体を水で十分洗浄後、凍結乾燥して、磁
性体−リパーゼ複合体を得た。この複合体の分散安定性
あるいは磁気分離特性などは実施例１の磁性体−リパー
ゼ複合体と同じであつた。Example 6 5 g of α, ω-dicarboxypoly (oxyethylene)
(Average molecular weight 2000) and γ-FeOOH (100 mg of iron) 5 m
It was suspended in 1 l of water and ferrous chloride (50 mg in terms of iron) was dissolved therein. The pH was adjusted to 8.0 with an aqueous ammonia solution, and the mixture was allowed to stand for 1 hour at 60 ° C in a nitrogen stream. Dialyze the reaction solution against water thoroughly,
A magnetic substance-polyethylene glycol was obtained. This magnetic body
N-hydroxysuccinimide was bonded to the carboxyl group of polyethylene glycol by a conventional method to synthesize activated magnetic material-polyethylene glycol. And
To 4 ml of phosphate buffer (pH 7.0) containing lipase obtained from 5 mg of C. fluorescens cells, 75 mg of activated magnetic substance-polyethylene glycol was added, and the temperature was 37 ° C.
After 90 minutes of reaction, the magnetic substance-lipase complex produced by magnetic separation was thoroughly washed with water and freeze-dried to obtain a magnetic substance-lipase complex. The dispersion stability and magnetic separation characteristics of this complex were the same as those of the magnetic substance-lipase complex of Example 1.
実施例７ 5gのα，ω−ジカルボキシポリ（オキシエチレン）
（平均分子量4000）を含むクロロホルム5mlに500mgの酸
化エルビウム（粒子径200n）を加えて、７日間ボールミ
ルで粉砕し、クロロホルムを完全に除いて、磁性体−ポ
リエチレングリコールを得た。磁性体−ポリエチレング
リコールのカルボキシル基にＮ−ヒドロキシこはく酸イ
ミドをジオキサン中に常法に従い結合させて、活性化し
た磁性体−ポリエチレングリコールを合成した。Example 7 5 g of α, ω-dicarboxypoly (oxyethylene)
To 5 ml of chloroform containing (average molecular weight of 4000) was added 500 mg of erbium oxide (particle size: 200 n), and the mixture was ground in a ball mill for 7 days to completely remove chloroform to obtain a magnetic substance-polyethylene glycol. N-hydroxysuccinimide was bound to the carboxyl group of the magnetic substance-polyethylene glycol in dioxane by a conventional method to synthesize the activated magnetic substance-polyethylene glycol.
そして5mgのシユウドモナス・フルオレスセンス菌体
より得たリパーゼを含む4mlのりん酸緩衝液（pH7.0）に
75mgの活性化した磁性体−ポリエチレングリコールを加
え、37℃で90分間反応させた後、精製して、同様の性質
を有する磁性体−リパーゼ複合体を得た。Then, in 4 ml of phosphate buffer (pH 7.0) containing lipase obtained from 5 mg of C. fluorescens cells.
75 mg of activated magnetic substance-polyethylene glycol was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 90 minutes and then purified to obtain a magnetic substance-lipase complex having similar properties.
この磁性体−リパーゼ複合体の磁性体含有率は45％
で、タンパク質含有率は20％であつた。また、水溶液中
でのオリーブ油の加水分解活性は650単位/mgタンパク質
であり、代表的な疎水性有機溶媒の一つであるベンゼン
中でのラウリン酸ラウリルの合成活性は2.5μmol/分/mg
タンパク質であつた。磁性体−リパーゼ複合体は反応溶
液中（5mg/ml）から、スチールウール存在下で20,000エ
ルステツド（Oe）＝２テスラ（Ｔ）の磁場中で５分間で
完全に回収された。これは再びコロイドとして反応溶液
に溶解し、同様の活性を示した。The magnetic substance content of this magnetic substance-lipase complex is 45%.
The protein content was 20%. The hydrolysis activity of olive oil in aqueous solution is 650 units / mg protein, and the synthetic activity of lauryl laurate in benzene, which is one of the typical hydrophobic organic solvents, is 2.5 μmol / min / mg.
It was protein. The magnetic substance-lipase complex was completely recovered from the reaction solution (5 mg / ml) in the presence of steel wool in a magnetic field of 20,000 oersteds (Oe) = 2 tesla (T) in 5 minutes. It again dissolved in the reaction solution as a colloid and showed similar activity.
水溶液およびベンゼン中にコロイドとして溶解した磁
性体−リパーゼ複合体は、2000xgの遠心では沈降せず、
600nmでの濁度測定では24-60時間変化せず、有機溶媒中
に安定に分散することが判つた。水溶液中でも同様の分
散安定性がみられた。電子顕微鏡観察によれば、粒径が
90nmの超微粒子であつた。The magnetic substance-lipase complex dissolved as a colloid in an aqueous solution and benzene did not sediment by centrifugation at 2000xg,
Turbidity measurement at 600 nm did not change for 24 to 60 hours, and it was found to be stable in organic solvent. Similar dispersion stability was observed in the aqueous solution. According to electron microscope observation,
It was ultrafine particles of 90 nm.
ベンゼン以外の有機溶媒ではトルエン、クロロホル
ム、塩素化炭化水素類などの、ここで使用した両親媒性
高分子が溶解する溶媒中で、この磁性体−リパーゼ複合
体は同様の性質を示した。In an organic solvent other than benzene, the magnetic substance-lipase complex exhibited similar properties in a solvent in which the amphiphilic polymer used here, such as toluene, chloroform, and chlorinated hydrocarbons, dissolves.
実施例８ ａ） 5gのα−カルボキシ−ω−メトキシポリ（オキシ
エチレン）（平均分子量4000）と200mgの塩化デイソプ
ロシウムを含む5mlの20mM1,4−ピペラジン−ビス（エタ
ンスルホン酸）水溶液を用意し、この溶液に水酸化ナト
リウムを加えてpHを7.0-7.5に上げる。この溶液を水へ
の透析またはゲルろ過によつて塩を除いた後、凍結乾燥
して磁性体−ポリエチレングリコールを得た。磁性体−
ポリエチレングリコールのカルボキシル基にＮ−ヒドロ
キシこはく酸イミドをジオキサン中で常法に従い結合さ
せて、活性化した磁性体−ポリエチレングリコールを合
成した。Example 8 a) Prepare 5 ml of 20 mM 1,4-piperazine-bis (ethanesulfonic acid) aqueous solution containing 5 g of α-carboxy-ω-methoxypoly (oxyethylene) (average molecular weight 4000) and 200 mg of deisoprosium chloride. Sodium hydroxide is added to this solution to raise the pH to 7.0-7.5. This solution was dialyzed against water or gel filtration to remove salts, and then freeze-dried to obtain a magnetic substance-polyethylene glycol. Magnetic body
N-hydroxysuccinimide was bound to the carboxyl group of polyethylene glycol in dioxane according to a conventional method to synthesize activated magnetic material-polyethylene glycol.
そして5mgのシユウドモナス・フルオレスセンス菌体
より得たリパーゼを含む4mlのりん酸緩衝液（pH7.0）に
75mgの活性化した磁性体−ポリエチレングリコールを加
え、37℃で90分間反応させた後、精製して、同様の性質
を有する磁性体−リパーゼ複合体を得た。Then, in 4 ml of phosphate buffer (pH 7.0) containing lipase obtained from 5 mg of C. fluorescens cells.
75 mg of activated magnetic substance-polyethylene glycol was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 90 minutes and then purified to obtain a magnetic substance-lipase complex having similar properties.
この磁性体−リパーセ複合体の磁性体含有率は20％
で、タンパク質含有率は35％であつた。また、水溶液中
でのオリーブ油の加水分解活性は750単位/mgタンパク質
であり、代表的な疎水性有機溶媒の一つであるベンゼン
中でのラウリン酸ラウリルの合成活性は8.5μmol/分/mg
タンパク質であつた。磁性体−リパーゼ複合体は反応溶
液中（5mg/ml）から、スチールウール存在下で20,000エ
ルステツド（Oe）＝２テスラ（Ｔ）の磁場中で５分間で
完全に回収された。これは再びコロイドとして反応溶液
に溶解し、同様の活性を示した。The magnetic substance content of this magnetic substance-lipase composite is 20%.
The protein content was 35%. The hydrolysis activity of olive oil in an aqueous solution is 750 units / mg protein, and the synthetic activity of lauryl laurate in benzene, which is one of the typical hydrophobic organic solvents, is 8.5 μmol / min / mg.
It was protein. The magnetic substance-lipase complex was completely recovered from the reaction solution (5 mg / ml) in the presence of steel wool in a magnetic field of 20,000 oersteds (Oe) = 2 tesla (T) in 5 minutes. It again dissolved in the reaction solution as a colloid and showed similar activity.
水溶液およびベンゼン中にコロイドとして溶解した磁
性体−リパーゼ複合体は、10000xgの遠心では沈降せ
ず、600nmでの濁度測定では24-60時間変化せず、有機溶
媒中に安定に分散することが判つた。水溶液中でも同様
の分散安定性がみられた。The magnetic substance-lipase complex dissolved as a colloid in an aqueous solution and benzene does not sediment by centrifugation at 10000xg, does not change in turbidity measurement at 600 nm for 24-60 hours, and can be stably dispersed in an organic solvent. I understand. Similar dispersion stability was observed in the aqueous solution.
ベンゼン以外の有機溶媒ではトルエン、クロロホル
ム、塩素化炭化水素類などの、ここで使用した両親媒性
高分子が溶解する溶媒中で、この磁性体−リパーゼ複合
体は同様の性質を示した。In an organic solvent other than benzene, the magnetic substance-lipase complex exhibited similar properties in a solvent in which the amphiphilic polymer used here, such as toluene, chloroform, and chlorinated hydrocarbons, dissolves.
ｂ） α−カルボキシ−ω−メトキシポリ（オキシエチ
レン）（平均分子量4000）の代わりにα，ω−ジカルボ
キシポリ（オキシエチレン）（平均分子量4000）、活性
化ポリエチレングリコール（平均分子量5000）または活
性化ポリプロピレングリコール（平均分子量5000）を用
いても同様の結果を得た。ここで活性化ポリエチレング
リコールまたは活性化ポリプロピレングリコールを用い
る場合、磁性体−高分子の水酸基を塩化シアヌルで活性
化した磁性体−高分子を用い、さらにリパーゼとの反応
はpH9.5のホウ酸緩衝溶液中４℃で５時間行い、磁性体
−リパーゼ複合体を得た。b) α, ω-dicarboxypoly (oxyethylene) (average molecular weight 4000), activated polyethylene glycol (average molecular weight 5000) or activated instead of α-carboxy-ω-methoxypoly (oxyethylene) (average molecular weight 4000) Similar results were obtained using polypropylene glycol (average molecular weight 5000). Here, when activated polyethylene glycol or activated polypropylene glycol is used, a magnetic substance-a magnetic substance in which the hydroxyl group of the polymer is activated with cyanuric chloride-is used, and the reaction with lipase is performed with a borate buffer of pH 9.5. This was carried out at 4 ° C. for 5 hours in the solution to obtain a magnetic substance-lipase complex.
実施例９ 5g（2.5m mol）のα，ω−ジカルボキシポリ（オキシ
エチレン）（平均分子量20000）と288mg（2.5m mol）の
Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミドを15mlのジメチルホルム
アミドに溶かし、0.618mgのジシクロヘキシルカルボジ
イミドを含む1mlのジメチルホルムアミドを加えて、ポ
リエチレングリコール誘導体の１つのカルボキシル基を
活性化した。200mgのフエリチンを含む20mlのりん酸緩
衝水溶液（pH7.0）に2gの上記活性化ポリエチレングリ
コール誘導体を加えて25℃で１時間反応させて、限外ろ
過と水への透析の後、磁性体−ポリエチレングリコール
を得た。Example 9 5 g (2.5 mmol) α, ω-dicarboxypoly (oxyethylene) (average molecular weight 20000) and 288 mg (2.5 mmol) N-hydroxysuccinimide were dissolved in 15 ml dimethylformamide to give 0.618 mg. 1 ml of dimethylformamide containing dicyclohexylcarbodiimide of 1 was added to activate one carboxyl group of the polyethylene glycol derivative. To 20 ml of a phosphate buffered aqueous solution (pH 7.0) containing 200 mg of ferritin, 2 g of the activated polyethylene glycol derivative was added and reacted at 25 ° C for 1 hour. After ultrafiltration and dialysis against water, a magnetic substance was added. -Polyethylene glycol was obtained.
5mgのシユウドモナス・フルオレスセンス菌体より得
たリパーゼと75mgの磁性体−ポリエチレングリコールを
含む4mlのりん酸緩衝液（pH7.0）に500mgの水溶性カル
ボジイミドを加え、37℃で90分間反応させた後、反応液
に5mlの水を加えた後、磁気分離により生成した磁性体
−リパーゼ複合体を水で十分洗浄後、凍結乾燥して、磁
性体−リパーゼ複合体を得た。Lipase obtained from 5 mg of C. fluorescens and 75 mg of magnetic substance-4 ml of phosphate buffer (pH 7.0) containing polyethylene glycol was added with 500 mg of water-soluble carbodiimide and reacted at 37 ° C for 90 minutes. After adding 5 ml of water to the reaction solution, the magnetic substance-lipase complex generated by magnetic separation was thoroughly washed with water and freeze-dried to obtain a magnetic substance-lipase complex.
この磁性体−リパーゼ複合体の磁性体含有率は60％
で、タンパク質含有率は５％であつた。また、水溶液中
でのオリーブ油の加水分解活性は750単位/mgタンパク質
であり、代表的な疎水性有機溶媒の一つであるベンゼン
中でのラウリン酸ラウリルの合成活性は9.5μmol/分/mg
タンパク質であつた。磁性体−リパーゼ複合体は反応溶
液中（5mg/ml）から、スチールウール存在下で20,000エ
ルステツド（Oe）＝２テスラ（Ｔ）の磁場中で５分間で
完全に回収された。これは再びコロイドとして反応溶液
に溶解し、同様の活性を示した。The magnetic substance content of this magnetic substance-lipase complex is 60%.
The protein content was 5%. The hydrolysis activity of olive oil in an aqueous solution is 750 units / mg protein, and the synthetic activity of lauryl laurate in benzene, which is one of the typical hydrophobic organic solvents, is 9.5 μmol / min / mg.
It was protein. The magnetic substance-lipase complex was completely recovered from the reaction solution (5 mg / ml) in the presence of steel wool in a magnetic field of 20,000 oersteds (Oe) = 2 tesla (T) in 5 minutes. It again dissolved in the reaction solution as a colloid and showed similar activity.
水溶液およびベンゼン中にコロイドとして溶解した磁
性体−リパーゼ複合体は、10000xgの遠心では沈降せ
ず、600nmでの濁度測定では24-60時間変化せず、有機溶
媒中に安定に分散することが判つた。水溶液中でも同様
の分散安定性がみられた。電子顕微鏡観察によれば、粒
径が5nmの超微粒子であつた。The magnetic substance-lipase complex dissolved as a colloid in an aqueous solution and benzene does not sediment by centrifugation at 10000xg, does not change in turbidity measurement at 600 nm for 24-60 hours, and can be stably dispersed in an organic solvent. I understand. Similar dispersion stability was observed in the aqueous solution. Observation by an electron microscope revealed that the particles were ultrafine particles having a particle size of 5 nm.
ベンゼン以外の有機溶媒ではトルエン、クロロホル
ム、塩素化炭化水素類などの、ここで使用した両親媒性
高分子が溶解する溶媒中で、この磁性体−リパーゼ複合
体は同様の性質を示した。In an organic solvent other than benzene, the magnetic substance-lipase complex exhibited similar properties in a solvent in which the amphiphilic polymer used here, such as toluene, chloroform, and chlorinated hydrocarbons, dissolves.
実施例10 12.5g（2.5m mol）のα，ω−ジアミノポリ（オキシ
エチレン）（平均分子量5000）と144mg（1.25m mol）の
ヘミンを20mlのピリジンに溶かし、1.2mgのジシクロヘ
キシルカルボジイミドを含む1mlのジメチルホルムアミ
ドを加えて、60℃で６時間反応させた。反応溶液をろ過
した後、蒸発によりピリジンを除く。残留物を水に溶解
して遠心により不溶物を除き、凍結乾燥の後、磁性体−
ポリエチレングリコールを得た。Example 10 12.5 g (2.5 mmol) α, ω-diaminopoly (oxyethylene) (average molecular weight 5000) and 144 mg (1.25 mmol) hemin were dissolved in 20 ml pyridine and 1 ml containing 1.2 mg dicyclohexylcarbodiimide. Dimethylformamide was added and reacted at 60 ° C. for 6 hours. After filtering the reaction solution, pyridine is removed by evaporation. Dissolve the residue in water, remove the insoluble matter by centrifugation, freeze-dry, and then remove the magnetic substance.
Polyethylene glycol was obtained.
5mgのシユウドモナス・フルオレスセンス菌体より得
たリパーゼと75mgの磁性体−ポリエチレングリコールを
含む4mlのりん酸緩衝液（pH7.0）に500mgの水溶性カル
ボジイミドを加え、37℃で90分間反応させた後、反応液
に5mlの水を加えた後、磁気分離により生成した磁性体
−リパーゼ複合体を水で十分洗浄後、凍結乾燥して、磁
性体−リパーゼ複合体を得た。Lipase obtained from 5 mg of C. fluorescens and 75 mg of magnetic substance-4 ml of phosphate buffer (pH 7.0) containing polyethylene glycol was added with 500 mg of water-soluble carbodiimide and reacted at 37 ° C for 90 minutes. After adding 5 ml of water to the reaction solution, the magnetic substance-lipase complex generated by magnetic separation was thoroughly washed with water and freeze-dried to obtain a magnetic substance-lipase complex.
この磁性体−リパーゼ複合体の磁性体含有率は20％
で、タンパク質含有率は30％であつた。また、水溶液中
でのオリーブ油の加水分解活性は750単位/mgタンパク質
であり、代表的な疎水性有機溶媒の一つであるベンゼン
中でのラウリン酸ラウリルの合成活性は8.5μmol/分/mg
タンパク質であつた。磁性体−リパーゼ複合体は反応溶
液中（5mg/ml）から、スチールウール存在下で20,000エ
ルステツド（Oe）＝２テスラ（Ｔ）の磁場中で５分間で
完全に回収された。これは再びコロイドとして反応溶液
に溶解し、同様の活性を示した。The magnetic substance content of this magnetic substance-lipase complex is 20%.
The protein content was 30%. The hydrolysis activity of olive oil in an aqueous solution is 750 units / mg protein, and the synthetic activity of lauryl laurate in benzene, which is one of the typical hydrophobic organic solvents, is 8.5 μmol / min / mg.
It was protein. The magnetic substance-lipase complex was completely recovered from the reaction solution (5 mg / ml) in the presence of steel wool in a magnetic field of 20,000 oersteds (Oe) = 2 tesla (T) in 5 minutes. It again dissolved in the reaction solution as a colloid and showed similar activity.
水溶液およびベンゼン中にコロイドとして溶解した磁
性体−リパーゼ複合体は、10000xgの遠心では沈降せ
ず、600nmの濁度測定では24-60時間変化せず、有機溶媒
中に安定に分散することが判つた。水溶液中でも同様の
分散安定性がみられた。電子顕微鏡観察によれば、粒径
が5nmの超微粒子であつた。It was found that the magnetic substance-lipase complex dissolved as a colloid in aqueous solution and benzene did not sediment by centrifugation at 10000xg, did not change in turbidity measurement at 600 nm for 24-60 hours, and was stably dispersed in an organic solvent. Ivy. Similar dispersion stability was observed in the aqueous solution. Observation by an electron microscope revealed that the particles were ultrafine particles having a particle size of 5 nm.
ベンゼン以外の有機溶媒ではトルエン、クロロホル
ム、塩素化炭化水素類などの、ここで使用した両親媒性
高分子が溶解する溶媒中で、この磁性体−リパーゼ複合
体は同様の性質を示した。In an organic solvent other than benzene, the magnetic substance-lipase complex exhibited similar properties in a solvent in which the amphiphilic polymer used here, such as toluene, chloroform, and chlorinated hydrocarbons, dissolves.
実施例11 常法に従つてNAD+にカルボキシル基を導入したＮ6−
（２−カルボキシエチル）−NAD+を合成した。5gのα−
アミノ−ω−メトキシポリ（オキシエチレン）（平均分
子量2000）と0.6gのＮ6−（２−カルボキシエチル）−N
AD+を5mlの水に溶かし、5gの水溶性カルボジイミドを加
え、pHを4.5に維持したまま20時間反応させた。クロロ
ホルムで抽出の後、イオン交換により精製してポリエチ
レングリコール−NAD+を得た。Example 11 N6 − with a carboxyl group introduced into NAD+ according to a conventional method
(2-Carboxyethyl) -NAD+ was synthesized. 5 g α-
Amino-ω-methoxypoly (oxyethylene) (average molecular weight 2000) and 0.6 g of N6- (2-carboxyethyl) -N
AD+ was dissolved in 5 ml of water, 5 g of water-soluble carbodiimide was added, and the reaction was carried out for 20 hours while maintaining the pH at 4.5. After extraction with chloroform, the product was purified by ion exchange to obtain polyethylene glycol-NAD+ .
1gのポリエチレングリコール−NAD+を1.3mlの水に溶
かし、アンモニア水でpHを8.0にし、この溶液に64mgの
塩化第一鉄と151mgの塩化第二鉄を含む0.6mlの水溶液を
滴加した。滴加中はアンモニア水でpHを8.0から8.5に維
持し、室温で十分に攪拌した。水に十分透析した後、凍
結乾燥により磁性体−NAD+複合体を得た。1 g of polyethylene glycol-NAD+ was dissolved in 1.3 ml of water, pH was adjusted to 8.0 with aqueous ammonia, and 0.6 ml of an aqueous solution containing 64 mg of ferrous chloride and 151 mg of ferric chloride was added dropwise to this solution. The pH was maintained at 8.0 to 8.5 with aqueous ammonia during the dropwise addition, and the mixture was sufficiently stirred at room temperature. After sufficiently dialyzing against water, freeze-drying gave a magnetic substance-NAD+ complex.
この磁性体−NAD+複合体の磁性体含有率は80％で、補
酵素含有率は３％であつた。この磁性体−NAD+複合体は
水溶液およびベンゼン、トルエン、クロロホルム、塩素
化炭素類の有機溶媒に分散もしくはコロイドとして溶解
し、これらの溶液中から6000エルスエツド（Oe）の磁場
中で５分間で完全に回収された。これは再びコロイドと
して反応溶液に溶解した。The magnetic substance-NAD+ complex had a magnetic substance content of 80% and a coenzyme content of 3%. This magnetic substance-NAD+ complex is dispersed or dissolved as a colloid in an aqueous solution and an organic solvent of benzene, toluene, chloroform, and chlorinated carbons, and completely dissolved in these solutions in a magnetic field of 6000 Oersted (Oe) in 5 minutes. Recovered. It was again dissolved in the reaction solution as a colloid.
水溶液および有機溶媒にコロイドとして溶解した磁性
体−NAD+複合体は、2000xgの遠心では沈降せず、600nm
での濁度測定では24-60時間変化せず、有機溶媒中に安
定に分散することが判つた。水溶液中でも同様の分散安
定性がみられた。電子顕微鏡観察によれば、粒径が20-4
0nmの超微粒子であつた。Magnetic substance-NAD+ complex dissolved as colloid in aqueous solution and organic solvent did not sediment by centrifugation at 2000 xg and 600 nm
It was found that the turbidity was stable for 24 to 60 hours and stable in organic solvents. Similar dispersion stability was observed in the aqueous solution. According to electron microscope observation, the particle size is 20-4
It was an ultrafine particle of 0 nm.
磁性体−NAD+複合体は補酵素としての活性を示し、た
とえばエチルアルコールとともにアルコール脱水素酵素
処理により磁性体−NADH複合体に変換された。The magnetic substance-NAD+ complex exhibited activity as a coenzyme, and was converted to a magnetic substance-NADH complex by treatment with alcohol dehydrogenase together with ethyl alcohol, for example.
NAD+のかわりにNADP+を用いても同様の性質を有する
磁性体−NADP+複合体を得た。Using NADP+ instead of NAD+ , magnetic substance-NADP+ composites with similar properties were obtained.
実施例12 1.2gのα，ω−ジカルボキシポリ（オキシエチレン）
（平均分子量4000）を0.8mlの蒸留水に溶かし、アンモ
ニア水溶液でpHを8.0にし、この溶液に120mgの塩化第一
鉄と51mgの塩化第二鉄を含む0.4mlの蒸留水を滴加し
た。滴加中はアンモニア水溶液でpHを8.0から8.5に維持
し、60℃で十分に攪拌した。反応液を水に十分透析し
て、磁性体−ポリエチレングリコールを得た。Example 12 1.2 g of α, ω-dicarboxypoly (oxyethylene)
(Average molecular weight 4000) was dissolved in 0.8 ml of distilled water, the pH was adjusted to 8.0 with an aqueous ammonia solution, and 0.4 ml of distilled water containing 120 mg of ferrous chloride and 51 mg of ferric chloride was added dropwise to this solution. During the dropwise addition, the pH was maintained at 8.0 to 8.5 with an aqueous ammonia solution, and the mixture was sufficiently stirred at 60 ° C. The reaction solution was thoroughly dialyzed against water to obtain a magnetic substance-polyethylene glycol.
100mgのADPと500mgの磁性体−ポリエチレングリコー
ルを含む2mlのりん酸緩衝液（pH5.0）に500mgの水溶性
カルボジイミドを加え、37℃で12時間反応させた後、反
応液に5mlの水を加えて、磁気分離により生成した磁性
体−ADP複合体を水で十分洗浄後、凍結乾燥して、磁性
体−ADP複合体を得た。To 2 ml of phosphate buffer (pH 5.0) containing 100 mg of ADP and 500 mg of magnetic substance-polyethylene glycol, 500 mg of water-soluble carbodiimide was added, and after reacting at 37 ° C for 12 hours, 5 ml of water was added to the reaction solution. In addition, the magnetic substance-ADP complex produced by magnetic separation was thoroughly washed with water and freeze-dried to obtain a magnetic substance-ADP complex.
この磁性体−ADP複合体の磁性体含有率は85％で、補
酵素含有率は３％であつた。この磁性体−ADP複合体は
水溶液およびベンゼン、トルエン、クロロホルム、塩素
化炭素類の有機溶媒に分散もしくはコロイドとして溶解
し、これらの溶液中から6000エルステツド（Oe）の磁場
中で５分間で完全に回収された。これは再びコロイドと
して反応溶液に溶解した。The magnetic substance-ADP composite had a magnetic substance content of 85% and a coenzyme content of 3%. This magnetic substance-ADP complex is dispersed or dissolved as a colloid in an aqueous solution and an organic solvent of benzene, toluene, chloroform, and chlorinated carbons, and completely dissolved in these solutions in a magnetic field of 6000 oersteds (Oe) in 5 minutes. Recovered. It was again dissolved in the reaction solution as a colloid.
水溶液および有機溶媒にコロイドとして溶解した磁性
体−ADP複合体は、2000xgの遠心では沈降せず、600nmで
の濁度測定では24-60時間変化せず、有機溶媒中に安定
に分散することが判つた。水溶液中でも同様の分散安定
性がみられた。電子顕微鏡観察によれば、粒径が10-40n
mの超微粒子であつた。The magnetic substance-ADP complex dissolved as a colloid in an aqueous solution and an organic solvent does not sediment by centrifugation at 2000xg, does not change in turbidity measurement at 600 nm for 24 to 60 hours, and can be stably dispersed in an organic solvent. I understand. Similar dispersion stability was observed in the aqueous solution. According to electron microscope observation, the particle size is 10-40n
It was ultrafine particles of m.
磁性体−ADP複合体は活性を示し、たとえばホスホエ
ノールピルビン酸とともにピルビン酸キナーゼ処理によ
り磁性体−ATP複合体に変換された。The magnetic substance-ADP complex showed activity, and was converted to the magnetic substance-ATP complex by treatment with, for example, phosphoenolpyruvate and pyruvate kinase.
またADPのかわりにATPを用いても磁性体−ATP複合体
を得ることができた。A magnetic substance-ATP complex could be obtained by using ATP instead of ADP.
実施例13 実施例1a）の方法でα，ω−ジカルボキシポリ（オキ
シエチレン）（平均分子量4000）のカルボキシル基を活
性化する。アスパラギナーゼで免疫処理した兎より得た
抗アスパラギナーゼ抗体（100mg）を含む10mlのりん酸
緩衝水溶液（pH7.0）に、準備した活性化ポリエチレン
グリコール誘導体（600mg）を加えて25℃で90分間反応
させて、ポリエチレングリコール−抗体を得た。Example 13 The carboxyl group of α, ω-dicarboxypoly (oxyethylene) (average molecular weight 4000) is activated by the method of Example 1a). The prepared activated polyethylene glycol derivative (600 mg) was added to 10 ml of phosphate buffer aqueous solution (pH 7.0) containing anti-asparaginase antibody (100 mg) obtained from the rabbit immunized with asparaginase, and the mixture was reacted at 25 ° C for 90 minutes. A polyethylene glycol-antibody was obtained.
1gのポリエチレングリコール−抗体を1.3mlの水に溶
かし、アンモニア水でpHを8.0にし、この溶液に64mgの
塩化第一鉄と151mgの塩化第二鉄を含む0.6mlの水溶液を
滴加した。滴加中はアンモニア水でpHを8.0から8.5に維
持し、室温で十分に攪拌した。水に十分透析した後、凍
結乾燥により磁性体−抗体複合体を得た。1 g of polyethylene glycol-antibody was dissolved in 1.3 ml of water, pH was adjusted to 8.0 with aqueous ammonia, and 0.6 ml of an aqueous solution containing 64 mg of ferrous chloride and 151 mg of ferric chloride was added dropwise to this solution. The pH was maintained at 8.0 to 8.5 with aqueous ammonia during the dropwise addition, and the mixture was sufficiently stirred at room temperature. After sufficiently dialyzing against water, it was freeze-dried to obtain a magnetic substance-antibody complex.
この磁性体−抗体複合体の磁性体含有率は34％で、タ
ンパク質含有率は25％であつた。この磁性体−抗体複合
体は水溶液およびベンゼン、トルエン、クロロホルム、
塩素化炭素類の有機溶媒に分散もしくはコロイドとして
溶解し、これらの溶液中から6000エルステツド（Oe）の
磁場中で５分間で完全に回収された。これは再びコロイ
ドとして反応溶液に溶解した。The magnetic substance-antibody complex had a magnetic substance content of 34% and a protein content of 25%. This magnetic substance-antibody complex is an aqueous solution and benzene, toluene, chloroform,
The chlorinated carbons were dispersed in an organic solvent or dissolved as a colloid, and were completely recovered from these solutions in a magnetic field of 6000 oersteds (Oe) in 5 minutes. It was again dissolved in the reaction solution as a colloid.
水溶液および有機溶媒にコロイドとして溶解した磁性
体−抗体複合体は、2000xgの遠心では沈降せず、600nm
での濁度測定では24-60時間変化せず、有機溶媒中に安
定に分散することが判つた。水溶液中でも同様の分散安
定性がみられた。電子顕微鏡観察によれば、粒径が10-4
0nmの超微粒子であつた。The magnetic substance-antibody complex dissolved as a colloid in an aqueous solution and an organic solvent does not sediment by centrifugation at 2000 xg and is 600 nm.
It was found that the turbidity was stable for 24 to 60 hours and stable in organic solvents. Similar dispersion stability was observed in the aqueous solution. According to electron microscope observation, the particle size is 10-4
It was an ultrafine particle of 0 nm.
この磁性体−抗体複合体はアスパラギナーゼと高い親
和性を有し、磁性体との複合体を形成していない抗アス
パラギナーゼ抗体と比較すると、その抗体あたりの力価
は70％であつた。This magnetic substance-antibody complex had a high affinity for asparaginase, and the titer per antibody was 70% as compared with the anti-asparaginase antibody which did not form a complex with the magnetic substance.
実施例14 実施例1a）の方法でα，ω−ジカルボキシポリ（オキ
シエチレン）（平均分子量4000）のカルボキシル基を活
性化する。コンカナバリンＡ（100mg）を含む10mlのり
ん酸緩衝水溶液（pH7.0）に、準備した活性化ポリエチ
レングリコール誘導体（600mg）を加えて25℃で90分間
反応させて、ポリエチレングリコール−コンカナバリン
Ａを得た。Example 14 The carboxyl group of α, ω-dicarboxypoly (oxyethylene) (average molecular weight 4000) is activated by the method of Example 1a). The prepared activated polyethylene glycol derivative (600 mg) was added to 10 ml of a phosphate buffer aqueous solution (pH 7.0) containing concanavalin A (100 mg), and the mixture was reacted at 25 ° C for 90 minutes to obtain polyethylene glycol-concanavalin A. .
1gのポリエチレングリコール−コンカナバリンＡを1.
3mlの水に溶かし、アンモニア水でpHを8.0にし、この溶
液に64mgの塩化第一鉄と151mgの塩化第二鉄を含む0.6ml
の水溶液を滴加した。滴加中はアンモニア水でpHを8.0
から8.5に維持し、室温で十分に攪拌した。水に十分透
析した後、凍結乾燥により磁性体−コンカナバリンＡ複
合体を得た。1 g of polyethylene glycol-concanavalin A 1.
Dissolve in 3 ml of water, adjust the pH to 8.0 with aqueous ammonia, and add 64 mg of ferrous chloride and 151 mg of ferric chloride to this solution 0.6 ml
Was added dropwise. PH is adjusted to 8.0 with aqueous ammonia during the addition.
To 8.5 and well stirred at room temperature. After sufficiently dialyzing against water, it was freeze-dried to obtain a magnetic substance-concanavalin A complex.
この磁性体−コンカナバリンＡ複合体の磁性体含有率
は56％で、コンカナバリンＡ含有率は25％であつた。こ
の磁性体−コンカナバリンＡ複合体は水溶液およびベン
ゼン、トルエン、クロロホルム、塩素化炭素類の有機溶
媒に分散もしくはコロイドとして溶解し、これらの溶液
中から6000エルステツド（Oe）の磁場中で５分間で完全
に回収された。これは再びコロイドとして反応溶液に溶
解した。The magnetic substance-concanavalin A complex had a magnetic substance content of 56% and a concanavalin A content of 25%. This magnetic substance-concanavalin A complex is dispersed or dissolved as a colloid in an aqueous solution and an organic solvent of benzene, toluene, chloroform, and chlorinated carbons, and completely dissolved in a magnetic field of 6000 oersteds (Oe) in 5 minutes from these solutions. Recovered. It was again dissolved in the reaction solution as a colloid.
水溶液および有機溶媒にコロイドとして溶解した磁性
体−コンカナバリンＡ複合体は、2000xgの遠心では沈降
せず、600nmでの濁度測定では24-60時間変化せず、有機
溶媒中に安定に分散することが判つた。水溶液中でも同
様の分散安定性がみられた。電子顕微鏡観察によれば、
粒径が10-40nmの超微粒子であつた。The magnetic substance-concanavalin A complex dissolved as a colloid in an aqueous solution and an organic solvent does not sediment by centrifugation at 2000xg, does not change in turbidity measurement at 600 nm for 24-60 hours, and should be stably dispersed in an organic solvent. I found out. Similar dispersion stability was observed in the aqueous solution. According to electron microscope observation,
The particles were ultrafine particles having a particle size of 10-40 nm.
この磁性体−コンカナバリンＡ複合体をCandidautili
s細胞に用いて、650nmでの吸光度を指標として濁度変化
を調べると、13.2が2.3に減少し、細胞が回収されるこ
とを確認した。This magnetic substance-concanavalin A complex was added to Candidautili
When it was used for s cells and the change in turbidity was examined using the absorbance at 650 nm as an index, it was confirmed that 13.2 was reduced to 2.3 and cells were recovered.
実施例15 5gのα，−アミノ−ω−メトキシポリ（オキシエチレ
ン）（平均分子量2000）と0.6gのＤ−アスパラギンを5m
lに溶かし、5gの水溶性カルボジイミドを加え、pHを4.5
に維持したまま20時間反応させる。クロロホルムで抽出
の後、イオン交換により精製したポリエチレングリコー
ル−Ｄ−スパラギンを得た。Example 15 5 g of α, -amino-ω-methoxypoly (oxyethylene) (average molecular weight 2000) and 0.6 g of D-asparagine were added to 5 m.
Dissolve in l, add 5g of water-soluble carbodiimide, adjust pH to 4.5.
The reaction is continued for 20 hours with the temperature maintained at. After extraction with chloroform, polyethylene glycol-D-sparagine purified by ion exchange was obtained.
1gのポリエチレングリコール−Ｄ−アスパラギンを1.
3mlの水に溶かし、アンモニア水でpHを8.0にし、この溶
液に64mgの塩化第一鉄と151mgの塩化第二鉄を含む0.6ml
の水溶液を滴加した。滴加中はアンモニア水でpHを8.0
から8.5に維持し、室温で十分に攪拌した。水に十分透
析した後、凍結乾燥により磁性体−Ｄ−アスパラギン複
合体を得た。1 g of polyethylene glycol-D-asparagine 1.
Dissolve in 3 ml of water, adjust the pH to 8.0 with aqueous ammonia, and add 64 mg of ferrous chloride and 151 mg of ferric chloride to this solution 0.6 ml
Was added dropwise. PH is adjusted to 8.0 with aqueous ammonia during the addition.
To 8.5 and well stirred at room temperature. After sufficiently dialyzing against water, it was freeze-dried to obtain a magnetic substance-D-asparagine complex.
この磁性体−Ｄ−アスパラギン複合体の磁性体含有率
は85％で、Ｄ−アスパラギン含有率は５％であつた。こ
の磁性体−Ｄ−アスパラギン複合体は水溶液およびベン
ゼン、トルエン、クロロホルム、塩素化炭素類の有機溶
媒に分散もしくはコロイドとして溶解し、これらの溶液
中から6000エルステツド（Oe）の磁場中で５分間で完全
に回収された。これは再びコロイドとして反応溶液に溶
解した。The magnetic substance-D-asparagine complex had a magnetic substance content of 85% and a D-asparagine content of 5%. This magnetic substance-D-asparagine complex is dispersed or dissolved as a colloid in an aqueous solution and an organic solvent of benzene, toluene, chloroform and chlorinated carbons, and from these solutions in a magnetic field of 6000 oersteds (Oe) in 5 minutes. Completely recovered. It was again dissolved in the reaction solution as a colloid.
水溶液および有機溶媒にコロイドとして溶解した磁性
体−Ｄ−アスパラギン複合体は、2000xgの遠心では沈降
せず、600nmでの濁度測定では24-60時間変化せず、有機
溶媒中に安定に分散することが判つた。水溶液中でも同
様の分散安定性がみられた。電子顕微鏡観察によれば、
粒径が20-40nmの超微粒子であつた。The magnetic substance-D-asparagine complex dissolved as a colloid in an aqueous solution and an organic solvent does not sediment by centrifugation at 2000xg, does not change in turbidity measurement at 600 nm for 24-60 hours, and is stably dispersed in an organic solvent. I found out. Similar dispersion stability was observed in the aqueous solution. According to electron microscope observation,
The particles were ultrafine particles with a particle size of 20-40 nm.
磁性体−Ｄ−アスパラギン複合体は大腸菌由来のアス
パラギナーゼと高い親和性を有し、水溶液中のアスパラ
ギナーゼを磁気的に分離回収した。The magnetic substance-D-asparagine complex has a high affinity for asparaginase derived from Escherichia coli, and the asparaginase in the aqueous solution was magnetically separated and recovered.
実施例16 1.2gのα，ω−ジカルボキシポリ（オキシエチレン）
（平均分子量4000）を0.8mlの蒸留水に溶かし、アンモ
ニア水溶液でpHを8.0にし、この溶液に120mgの塩化第一
鉄と51mgの塩化第二鉄を組む0.4mlの蒸留水を滴加し
た。滴加中はアンモニア水溶液でpHを8.0から8.5に維持
し、60℃で十分に攪拌した。反応液を水に十分透析し
て、磁性体−ポリエチレングリコールを得た。Example 16 1.2 g of α, ω-dicarboxypoly (oxyethylene)
(Average molecular weight 4000) was dissolved in 0.8 ml of distilled water, the pH was adjusted to 8.0 with an aqueous ammonia solution, and 0.4 ml of distilled water containing 120 mg of ferrous chloride and 51 mg of ferric chloride was added dropwise to this solution. During the dropwise addition, the pH was maintained at 8.0 to 8.5 with an aqueous ammonia solution, and the mixture was sufficiently stirred at 60 ° C. The reaction solution was thoroughly dialyzed against water to obtain a magnetic substance-polyethylene glycol.
30mgのRNAと500mgの磁性体−ポリエチレングリコール
を含む4mlのりん酸緩衝液（pH5.0）に500mgの水溶性カ
ルボジイミドを加え、37℃で12時間反応させた後、反応
液に5mlの水を加えて、磁気分離により生成した磁性体
−RNA複合体を水で十分洗浄後、凍結乾燥して、磁性体
−RNA複合体を得た。To 4 ml of phosphate buffer (pH 5.0) containing 30 mg of RNA and 500 mg of magnetic substance-polyethylene glycol, 500 mg of water-soluble carbodiimide was added, and after reacting at 37 ° C for 12 hours, 5 ml of water was added to the reaction solution. In addition, the magnetic substance-RNA complex produced by magnetic separation was thoroughly washed with water and then freeze-dried to obtain a magnetic substance-RNA complex.
この磁性体−RNA複合体の磁性体含有率は85％で、RNA
含有率は３％であつた。この磁性体−RNA複合体は水溶
液およびベンゼン、トルエン、クロロホルム、塩素化炭
素類の有機溶媒に分散もしくはコロイドとして溶解し、
これらの溶液中から6000エルステツド（Oe）の磁場中で
５分間で完全に回収された。これは再びコロイドとして
反応溶液に溶解した。The magnetic substance-RNA complex has a magnetic substance content of 85%,
The content rate was 3%. This magnetic substance-RNA complex is dispersed or dissolved as a colloid in an aqueous solution and an organic solvent of benzene, toluene, chloroform and chlorinated carbons,
Complete recovery from these solutions in a magnetic field of 6000 oersteds (Oe) in 5 minutes. It was again dissolved in the reaction solution as a colloid.
水溶液および有機溶媒にコロイドとして溶解した磁性
体−RNA複合体は、2000xgの遠心では沈降せず、600nmで
の濁度測定では24-60時間変化せず、有機溶媒中に安定
に分散することが判つた。水溶液中でも同様の分散安定
性がみられた。電子顕微鏡観察によれば、粒径が10-40n
mの超微粒子であつた。The magnetic substance-RNA complex dissolved as a colloid in an aqueous solution and an organic solvent does not sediment by centrifugation at 2000xg, does not change in turbidity measurement at 600 nm for 24-60 hours, and can be stably dispersed in an organic solvent. I understand. Similar dispersion stability was observed in the aqueous solution. According to electron microscope observation, the particle size is 10-40n
It was ultrafine particles of m.
磁性体−RNA複合体はリポゾームと結合し、細胞抽出
液からリポゾームを磁気的に分離回収した。The magnetic substance-RNA complex bound to the liposome, and the liposome was magnetically separated and collected from the cell extract.
実施例17 大腸菌より得た抗腫瘍性物質アスパラギナーゼ（20m
g）を含む5mlのホウ酸緩衝水溶液（pH9.5）に、5gの2,4
−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−
クロロ−ｓ−トリアジンを加えて25℃で90分間反応させ
て、ポリエチレングリコール−抗腫瘍性物質を得た。Example 17 Asparaginase (20 m
g) in 5 ml of a borate buffered aqueous solution (pH 9.5) containing 5 g of 2,4
-Bis (O-methoxypolyethylene glycol) -6-
Chloro-s-triazine was added and reacted at 25 ° C. for 90 minutes to obtain a polyethylene glycol-antitumor substance.
1gのポリエチレングリコール−抗腫瘍性物質を1.3ml
の水に溶かし、アンモニア水でpHを8.0にし、この溶液
に64mgの塩化第一鉄と151mgの塩化第二鉄を含む0.6mlの
水溶液を滴加した。滴加中はアンモニア水でpHを8.0か
ら8.5に維持し、室温で十分に攪拌した。水に十分透析
した後、凍結乾燥により磁性体−抗腫瘍性物質複合体を
得た。1 g polyethylene glycol-1.3 ml antitumor substance
Was dissolved in water, adjusted to pH 8.0 with aqueous ammonia, and 0.6 ml of an aqueous solution containing 64 mg of ferrous chloride and 151 mg of ferric chloride was added dropwise to this solution. The pH was maintained at 8.0 to 8.5 with aqueous ammonia during the dropwise addition, and the mixture was sufficiently stirred at room temperature. After sufficiently dialyzing against water, it was freeze-dried to obtain a magnetic substance-antitumor substance complex.
この磁性体−抗腫瘍性物質複合体の磁性体含有率は56
％で、抗腫瘍性物質含有率は25％であつた。この磁性体
−抗腫瘍性物質複合体は水溶液（親水的環境）および有
機溶媒（疎水的環境）に分散もしくはコロイドとして溶
解し、これらの溶液中から6000エルステツド（Oe）の磁
場中で５分間で完全に回収された。これは再びコロイド
として反応溶液に溶解した。The magnetic substance content of this magnetic substance-antitumor substance composite is 56.
%, The content of antitumor substance was 25%. This magnetic substance-antitumor substance complex is dispersed or dissolved as a colloid in an aqueous solution (hydrophilic environment) and an organic solvent (hydrophobic environment), and from these solutions in a magnetic field of 6000 oersteds (Oe) for 5 minutes. Completely recovered. It was again dissolved in the reaction solution as a colloid.
この磁性体−抗腫瘍性物質複合体をガルドネンリンフ
オーマを移植したCBAマウスに投与して、患部にコバル
ト−サマリウム永久磁石を当てたところ、対称群と比べ
て、有為な生存日数の延長がみられ、抗腫瘍性が確認さ
れた。When this magnetic substance-antitumor substance complex was administered to a CBA mouse transplanted with Gardonenline's phoma, and a cobalt-samarium permanent magnet was applied to the affected part, compared with the symmetrical group, a significant survival time was observed. Prolongation was observed and antitumor activity was confirmed.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 11/14 Ｃ１２Ｎ 11/14 Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＤＵ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl.6 Identification code Internal reference number FI Technical display location C07K 16/40 C12N 11/14 C12N 11/14 A61K 37/54 ADU
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| JP61209982AJP2534849B2 (en) | 1986-09-06 | 1986-09-06 | Magnetic substance bioactive substance complex |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US5840900A (en)* | 1993-10-20 | 1998-11-24 | Enzon, Inc. | High molecular weight polymer-based prodrugs |
| JP5010561B2 (en)* | 2008-09-05 | 2012-08-29 | 株式会社東芝 | Water purification machine magnetic particles and water treatment method using the same |
| US10253063B2 (en) | 2013-02-28 | 2019-04-09 | Agency For Science, Technology And Research | Protein purification in the presence of nonionic organic polymers at elevated conductivity |
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| JPS6366196A (en) | 1988-03-24 |
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