本発明は、核酸バイオテクノロジーの分野に関し、アタキシン－２の発現に関連する疾患を治療するための、組成物、及び方法を提供する。The present invention relates to the field of nucleic acid biotechnology and provides compositions and methods for treating diseases associated with the expression of ataxin-2.
アタキシン－２は、ストレス顆粒、Ｐ体の形成、及びｍＲＮＡ翻訳の調節等の、いくつかの機能に関与するタンパク質である。アタキシン－２タンパク質は、ＡＴＸＮ２遺伝子によってコードされ、ＡＴＸＮ２遺伝子におけるＣＡＧトリヌクレオチドリピートの変異はニューロン変性を引き起こしうるので、脊髄小脳変性症－２（ＳＣＡ２）等の疾患に関連している。アタキシン－２タンパク質は、一般に、ポリグルタミンリピートと称されるグルタミン残基の配列を有する。野生型アタキシン－２遺伝子は、典型的には、約１３～約３１のＣＡＧトリヌクレオチドリピートを含有し、２２のリピートが、最も一般的である。健常体における配列の長さは、約２２アミノ酸であり、しかし、この配列の拡大が観察されている。例えば、ＳＣＡ２を有する体では、３４残基以上のグルタミンリピートが見出されており、２７～４０残基のリピートが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する体で報告されている。ＡＬＳ、及びＳＣＡ２は、両方とも進行性であり、神経変性であり、高度に消耗性であり得、多くの場合、本質的に致命的である。現在、ＳＣＡ２、ＡＬＳ、ハンチントン病、パーキンソン病、ＦＴＤ（前頭側頭型認知症）、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）プロテオパチー、及び野生型、または変異ＡＴＸＮ２に関連する他の疾患、または障害の症状を、首尾よく治療し、改善するために利用可能な戦略は不足している。したがって、これらの病態に対する効果的な治療法が依然として必要とされている。Ataxin-2 is a protein involved in several functions, including the formation of stress granules and P bodies, and the regulation of mRNA translation. The ataxin-2 protein is encoded by the ATXN2 gene. Mutations in the CAG trinucleotide repeat in the ATXN2 gene can cause neuronal degeneration and are therefore associated with diseases such as spinocerebellar ataxia-2 (SCA2). The ataxin-2 protein generally contains a sequence of glutamine residues referred to as a polyglutamine repeat. Wild-type ataxin-2 genes typically contain approximately 13 to 31 CAG trinucleotide repeats, with 22 repeats being the most common. In healthy individuals, the sequence is approximately 22 amino acids in length; however, expansion of this sequence has been observed. For example, glutamine repeats of 34 or more residues have been found in individuals with SCA2, and repeats of 27 to 40 residues have been reported in individuals with amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Both ALS and SCA2 are progressive, neurodegenerative, can be highly debilitating, and are often inherently fatal. Currently, there are a lack of strategies available to successfully treat and ameliorate the symptoms of SCA2, ALS, Huntington's disease, Parkinson's disease, FTD (frontotemporal dementia), TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) proteopathies, and other diseases or disorders associated with wild-type or mutant ATXN2. Therefore, there remains a need for effective therapies for these conditions.
本明細書には、野生型、または変異型アタキシン－２（ＡＴＸＮ２）の発現に関連する疾患を治療するために、有用な組成物、及び方法が記載される。そのような障害を治療するために使用され得る、本明細書に記載の組成物は、野生型、または変異ｍＲＮＡ転写産物の発現を抑制する、阻害性核酸構築物、例えば、干渉ＲＮＡ構築物を含む。本開示の例示的な阻害性核酸は、限定されないが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）構築物である。機構によって限定されることなく、これらの阻害性核酸は、野生型、または変異型ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡの部分にアニーリングし、様々な細胞プロセスを介して病的転写産物の分解を促進し得る。本開示は、更に、そのような阻害性核酸構築物をコードする、ウイルスベクター等のベクターを特徴とする。阻害性核酸構築物（例えば、干渉ＲＮＡ構築物（例えば、ｍｉＲＮＡ））をコードする、本明細書に記載の例示的なウイルスベクターは、偽型ＡＡＶ２／８、及びＡＡＶ２／９ベクター等の、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。Described herein are compositions and methods useful for treating diseases associated with the expression of wild-type or mutant ataxin-2 (ATXN2). Compositions described herein that can be used to treat such disorders include inhibitory nucleic acid constructs, e.g., interfering RNA constructs, that suppress the expression of wild-type or mutant mRNA transcripts. Exemplary inhibitory nucleic acids of the present disclosure include, but are not limited to, microRNA (miRNA), short hairpin RNA (shRNA), and short interfering RNA (siRNA) constructs. Without being limited by mechanism, these inhibitory nucleic acids may anneal to portions of wild-type or mutant ATXN2 mRNA and promote the degradation of the pathological transcript through various cellular processes. The present disclosure further features vectors, such as viral vectors, that encode such inhibitory nucleic acid constructs. Exemplary viral vectors described herein that encode inhibitory nucleic acid constructs (e.g., interfering RNA constructs (e.g., miRNAs)) are adeno-associated viral (AAV) vectors, such as pseudotyped AAV2/8 and AAV2/9 vectors.
本明細書に記載の組成物、及び方法を使用して、野生型、または変異型ＡＴＸＮ２に関連する疾患、例えば、脊髄小脳失調症２型、または脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、ＦＴＤ（前頭側頭型認知症）、及びＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）プロテオパチーを有すると診断された患者に、とりわけ、干渉ＲＮＡ構築物、またはそれをコードするベクター等の阻害性核酸を投与して、野生型、または変異型ｍＲＮＡ転写産物の発現を減少させることができる。例えば、本明細書に記載の組成物、及び方法は、ＳＣＡ２を有する患者を治療するために使用することができ、そのような患者に、阻害性核酸構築物、またはそのような構築物をコードするＡＡＶベクター等のウイルスベクターを投与して、野生型、または変異アタキシン－２タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物の発現を減少させることができる。野生型アタキシン－２遺伝子は、典型的には、約１３～約３１のＣＡＧトリヌクレオチドリピートを含有し、２２のリピートが、最も一般的である。３４以上のＣＡＧリピート（例えば、少なくとも３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ＣＡＧリピート）を含む遺伝子の変異型から転写されたＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物リピートは、ＳＣＡ２を有する患者で報告されており、２７～４０のＣＡＧリピートを含有する遺伝子の変異型から転写されたＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物は、ＡＬＳを有する患者で報告されている（例えば、少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のＣＡＧリピート）。本明細書に記載の組成物、及び方法は、野生型、または変異型ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ（例えば、野生型、または変異型ヒトＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ）を発現している患者を、例えば、阻害性核酸構築物を使用して、野生型、または変異型ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡの発現を抑制することによって治療するために使用することができる。The compositions and methods described herein can be used to administer an inhibitory nucleic acid, such as an interfering RNA construct or a vector encoding the same, to patients diagnosed with a disease associated with wild-type or mutant ATXN2, such as spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Huntington's disease, frontotemporal dementia (FTD), and TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) proteopathy, among others, to reduce the expression of wild-type or mutant mRNA transcripts. For example, the compositions and methods described herein can be used to treat patients with SCA2 by administering to such patients an inhibitory nucleic acid construct or a viral vector, such as an AAV vector, encoding such a construct to reduce the expression of mRNA transcripts encoding wild-type or mutant ataxin-2 proteins. Wild-type ataxin-2 genes typically contain about 13 to about 31 CAG trinucleotide repeats, with 22 repeats being most common. ATXN2 mRNA transcripts transcribed from mutant forms of the gene containing 34 or more CAG repeats (e.g., at least 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or 100 CAG repeats) have been reported in patients with SCA2, and ATXN2 mRNA transcripts transcribed from mutant forms of the gene containing 27-40 CAG repeats (e.g., at least 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, or 40 CAG repeats) have been reported in patients with ALS. The compositions and methods described herein can be used to treat patients expressing wild-type or mutant ATXN2 mRNA (e.g., wild-type or mutant human ATXN2 mRNA) by suppressing expression of the wild-type or mutant ATXN2 mRNA, for example, using an inhibitory nucleic acid construct.
第１の態様では、本開示は、ガイド鎖（及び任意選択的に、ガイド鎖に対する相補性を有するパッセンジャー鎖）を含む阻害性核酸を特徴とする。いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産内の領域にハイブリダイズするのに十分な相補性を有する。いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、またはそれ以上の連続したポリヌクレオチドセグメントに対して、少なくとも７０％の相補性を有する。In a first aspect, the disclosure features an inhibitory nucleic acid including a guide strand (and optionally a passenger strand having complementarity to the guide strand). In some embodiments, the guide strand has sufficient complementarity to hybridize to a region within an ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153. In some embodiments, the guide strand has at least 70% complementarity to 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, or more contiguous polynucleotide segments within a region of an ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、またはそれ以上の連続したポリヌクレオチドセグメントに対して、少なくとも７０％の相補性を有する。いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、またはそれ以上の連続したポリヌクレオチドセグメントに対して、少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相補性を有する。In some embodiments, the guide strand has at least 70% complementarity to 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, or more contiguous polynucleotide segments within a region of the ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153. In some embodiments, the guide strand has at least 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% complementarity to 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, or more contiguous polynucleotide segments within a region of the ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の、１５の連続したポリヌクレオチドに対して、少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相補性を有する。In some embodiments, the guide strand has at least 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% complementarity to 15 consecutive polynucleotides within a region of the ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の、１６の連続したポリヌクレオチドに対して、少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相補性を有し得る。In some embodiments, the guide strand may have at least 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% complementarity to 16 contiguous polynucleotides within a region of the ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物内の領域内の、１７の連続したポリヌクレオチドに対して、少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相補性を有する。In some embodiments, the guide strand has at least 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% complementarity to 17 contiguous polynucleotides within a region within an ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、例えば、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物内の領域内の、１８の連続したポリヌクレオチドに対して、少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相補性を有する。In some embodiments, for example, the guide strand has at least 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% complementarity to 18 contiguous polynucleotides within a region within an ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物内の領域内の、１９の連続したポリヌクレオチドに対して、少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相補性を有する。In some embodiments, the guide strand has at least 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% complementarity to 19 contiguous polynucleotides within a region within an ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物内の領域内の、２０の連続したポリヌクレオチドに対して、少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相補性を有する。In some embodiments, the guide strand has at least 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% complementarity to 20 consecutive polynucleotides within a region within an ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物内の領域内の、２１の連続したポリヌクレオチドに対して、少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相補性を有する。In some embodiments, the guide strand has at least 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% complementarity to 21 contiguous polynucleotides within a region within an ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ＲＮＡ転写産物の領域内の等しい長さの連続したポリヌクレオチドと完全に相補的な、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、または少なくとも２１の連続したヌクレオチドを含む。In some embodiments, the guide strand comprises at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, or at least 21 contiguous nucleotides that are completely complementary to a contiguous polynucleotide of equal length within a region of the ATXN2 RNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の等しい長さの連続したポリヌクレオチと完全に相補的な、少なくとも１０の連続したヌクレオチドを含む。In some embodiments, the guide strand comprises at least 10 contiguous nucleotides that are perfectly complementary to a contiguous polynucleotide of equal length within a region of the ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の等しい長さの連続したポリヌクレオチと完全に相補的な、少なくとも１１の連続したヌクレオチドを含む。In some embodiments, the guide strand comprises at least 11 contiguous nucleotides that are perfectly complementary to a contiguous polynucleotide of equal length within a region of the ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の等しい長さの連続したポリヌクレオチと完全に相補的な、少なくとも１２の連続したヌクレオチドを含む。In some embodiments, the guide strand comprises at least 12 contiguous nucleotides that are perfectly complementary to a contiguous polynucleotide of equal length within a region of the ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の等しい長さの連続したポリヌクレオチと完全に相補的な、少なくとも１３の連続したヌクレオチドを含む。In some embodiments, the guide strand comprises at least 13 contiguous nucleotides that are perfectly complementary to a contiguous polynucleotide of equal length within a region of the ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の等しい長さの連続したポリヌクレオチと完全に相補的な、少なくとも１４の連続したヌクレオチドを含む。In some embodiments, the guide strand comprises at least 14 contiguous nucleotides that are perfectly complementary to a contiguous polynucleotide of equal length within a region of the ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の等しい長さの連続したポリヌクレオチと完全に相補的な、少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含む。In some embodiments, the guide strand comprises at least 15 contiguous nucleotides that are perfectly complementary to a contiguous polynucleotide of equal length within a region of the ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の等しい長さの連続したポリヌクレオチと完全に相補的な、少なくとも１６の連続したヌクレオチドを含む。In some embodiments, the guide strand comprises at least 16 contiguous nucleotides that are perfectly complementary to a contiguous polynucleotide of equal length within a region of the ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の等しい長さの連続したポリヌクレオチと完全に相補的な、少なくとも１７の連続したヌクレオチドを含む。In some embodiments, the guide strand comprises at least 17 contiguous nucleotides that are perfectly complementary to a contiguous polynucleotide of equal length within a region of the ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の等しい長さの連続したポリヌクレオチと完全に相補的な、少なくとも１８の連続したヌクレオチドを含む。In some embodiments, the guide strand comprises at least 18 contiguous nucleotides that are perfectly complementary to a contiguous polynucleotide of equal length within a region of the ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の等しい長さの連続したポリヌクレオチと完全に相補的な、少なくとも１９の連続したヌクレオチドを含む。In some embodiments, the guide strand comprises at least 19 contiguous nucleotides that are perfectly complementary to a contiguous polynucleotide of equal length within a region of the ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の等しい長さの連続したポリヌクレオチと完全に相補的な、少なくとも２０の連続したヌクレオチドを含む。In some embodiments, the guide strand comprises at least 20 contiguous nucleotides that are perfectly complementary to a contiguous polynucleotide of equal length within a region of the ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の等しい長さの連続したポリヌクレオチと完全に相補的な、少なくとも２１の連続したヌクレオチドを含む。In some embodiments, the guide strand comprises at least 21 contiguous nucleotides that are perfectly complementary to a contiguous polynucleotide of equal length within a region of the ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の等しい長さの連続したポリヌクレオチと完全に相補的な、１０～２１の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の等しい長さの連続したポリヌクレオチと完全に相補的な、１２～２１の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の等しい長さの連続したポリヌクレオチと完全に相補的な、１５～２１の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の等しい長さの連続したポリヌクレオチと完全に相補的な、１８～２１の連続したヌクレオチドを含む。In some embodiments, the guide strand comprises 10 to 21 contiguous nucleotides that are fully complementary to a contiguous polynucleotide of equal length within a region of an ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153. In some embodiments, the guide strand comprises 12 to 21 contiguous nucleotides that are fully complementary to a contiguous polynucleotide of equal length within a region of an ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153. In some embodiments, the guide strand comprises 15 to 21 contiguous nucleotides that are fully complementary to a contiguous polynucleotide of equal length within a region of an ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153. In some embodiments, the guide strand comprises 18 to 21 contiguous nucleotides that are fully complementary to a contiguous polynucleotide of equal length within a region of an ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の等しい長さの連続したポリヌクレオチと完全に相補的な、１９、２０、または２１の連続したヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、In some embodiments, the guide strand comprises 19, 20, or 21 contiguous nucleotides that are fully complementary to a contiguous polynucleotide of equal length within a region of the ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域内の、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１の連続したヌクレオチドのセグメントに対して、９以下のヌクレオチドミスマッチを含み、任意選択的に、前記ガイド鎖は、配列番号１０３～１５３のいずれか１つの核酸配列を有する、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域に対して、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１のみのミスマッチを含む。The guide strand contains 9 or fewer nucleotide mismatches to a segment of 15, 16, 17, 18, 19, 20, or 21 consecutive nucleotides within a region of an ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153; optionally, the guide strand contains 8 or fewer, 7 or fewer, 6 or fewer, 5 or fewer, 4 or fewer, 3 or fewer, 2 or fewer, or only 1 mismatch to a region of an ATXN2 mRNA transcript having the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103-153.
いくつかの実施形態では、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物の領域は、配列番号１０３、１０４、１０５、１０６、１２１、１２２、１２６、１２７、１３９、１４０、１４１、１４７、１４９、及び１５３のいずれか１つの核酸配列を有する。In some embodiments, the region of the ATXN2 mRNA transcript has the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 103, 104, 105, 106, 121, 122, 126, 127, 139, 140, 141, 147, 149, and 153.
いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１～５１のいずれか１つの核酸配列と、少なくとも８５％同一（例えば、配列番号１～５１のいずれか１つの核酸配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）である核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１～５１のいずれか１つの核酸配列と、少なくとも９０％同一（例えば、配列番号１～５１のいずれか１つの核酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）である核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１～５１のいずれか１つの核酸配列と、少なくとも９５％同一（例えば、配列番号１～５１のいずれか１つの核酸配列と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）である核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、配列番号１～５１のいずれか１つの核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号１、２、３、４、１９、２０、２４、２５、３７、３８、３９、４５、４７、及び５１のいずれか１つである。In some embodiments, the guide strand has a nucleic acid sequence that is at least 85% identical to the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-51 (e.g., at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% identical to the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-51). In some embodiments, the guide strand has a nucleic acid sequence that is at least 90% identical to the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-51 (e.g., at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% identical to the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-51). In some embodiments, the guide strand has a nucleic acid sequence that is at least 95% identical to the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-51 (e.g., at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% identical to the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-51). In some embodiments, the guide strand has the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-51. In some embodiments, the nucleic acid sequence is any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 19, 20, 24, 25, 37, 38, 39, 45, 47, and 51.
いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、配列番号５２～１０２のいずれか１つの核酸配列と、少なくとも８５％同一（例えば、配列番号５２～１０２のいずれか１つの核酸配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）である核酸配列を有するヘアピンを含む。いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、配列番号５２～１０２のいずれか１つの核酸配列と、少なくとも９０％同一（例えば、配列番号５２～１０２のいずれか１つの核酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）である核酸配列を有するヘアピンを含む。いくつかの実施形態では、ヘアピンは、配列番号５２～１０２のいずれか１つの核酸配列と、少なくとも９５％同一（例えば、配列番号５２～１０２のいずれか１つの核酸配列と、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一）である核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ヘアピン鎖は、配列番号５２～１０２のいずれか１つの核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号５２、５３、５４、５５、７０、７１、７５、７６、８８、８９、９０、９６、９８、及び１０２のいずれか１つである。In some embodiments, the inhibitory nucleic acid comprises a hairpin having a nucleic acid sequence that is at least 85% identical to the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs:52-102 (e.g., at least 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% identical to the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs:52-102). In some embodiments, the inhibitory nucleic acid comprises a hairpin having a nucleic acid sequence that is at least 90% identical to the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs:52-102 (e.g., at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% identical to the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs:52-102). In some embodiments, the hairpin has a nucleic acid sequence that is at least 95% identical to the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 52-102 (e.g., at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or 100% identical to the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 52-102). In some embodiments, the hairpin strand has the nucleic acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 52-102. In some embodiments, the nucleic acid sequence is any one of SEQ ID NOs: 52, 53, 54, 55, 70, 71, 75, 76, 88, 89, 90, 96, 98, and 102.
いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、干渉ＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、干渉ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、または短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、ｍｉＲＮＡである。In some embodiments, the inhibitory nucleic acid is an interfering RNA molecule. In some embodiments, the interfering RNA molecule is a microRNA (miRNA), a short hairpin RNA (shRNA), or a short interfering RNA (siRNA). In some embodiments, the inhibitory nucleic acid is a miRNA.
別の態様では、本開示は、本開示の上記態様、または実施形態のいずれかの阻害性核酸をコードする導入遺伝子を含む、ウイルスベクターを特徴とする。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、複数の導入遺伝子（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上の導入遺伝子）を含む。In another aspect, the disclosure features a viral vector including a transgene encoding an inhibitory nucleic acid of any of the above aspects or embodiments of the disclosure. In some embodiments, the viral vector includes multiple transgenes (e.g., 2, 3, 4, 5, or more transgenes).
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、及び合成ウイルスからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶである。In some embodiments, the viral vector is selected from the group consisting of adeno-associated virus (AAV), adenovirus, lentivirus, retrovirus, poxvirus, baculovirus, herpes simplex virus, vaccinia virus, and synthetic virus. In some embodiments, the viral vector is AAV.
いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶｒｈ７４血清型である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、偽型化ＡＡＶである。いくつかの実施形態では、偽型化ＡＡＶは、１つのＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２）のＩＴＲ、ならびに異なるＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶｒｈ７４）由来のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３カプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態では、偽型化ＡＡＶは、ＡＡＶ２／９である。いくつかの実施形態では、偽型化ＡＡＶは、ＡＡＶ２／８である、いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、組換えカプシドタンパク質を含む。In some embodiments, the AAV is an AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrhlO, or AAVrh74 serotype. In some embodiments, the viral vector is a pseudotyped AAV. In some embodiments, the pseudotyped AAV has an ITR from one AAV serotype (e.g., AAV2) and VP1, VP2, and/or VP3 capsid proteins from a different AAV serotype (e.g., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrhlO, or AAVrh74). In some embodiments, the pseudotyped AAV is AAV2/9. In some embodiments, the pseudotyped AAV is AAV2/8. In some embodiments, the AAV comprises a recombinant capsid protein.
いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、例えばＷＯ２０１７／２１８８４２で開示されるカプシドを含み、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ １３：１３８（２０２０）で開示され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ２－レトロ、またはＡＡＶ９－レトロカプシドタンパク質を含む。In some embodiments, the AAV comprises a capsid disclosed, for example, in WO 2017/218842, the disclosure of which is incorporated herein by reference. In some embodiments, the AAV comprises a capsid disclosed in Lin et al. Mol Brain 13:138 (2020), the disclosure of which is incorporated herein by reference. In some embodiments, the AAV comprises an AAV2-retro or AAV9-retro capsid protein.
いくつかの実施形態では、合成ウイルスは、キメラウイルス、モザイクウイルス、または偽型ウイルスであり、及び／または外来タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、または小分子を含む。In some embodiments, the synthetic virus is a chimeric virus, a mosaic virus, or a pseudotyped virus, and/or comprises a foreign protein, synthetic polymer, nanoparticle, or small molecule.
更なる態様では、本開示は、本開示の前述の態様、または実施形態のいずれかのｓｉＲＮＡ分子と、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤とを含有する医薬組成物を提供する。In a further aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition containing an siRNA molecule of any of the foregoing aspects or embodiments of the present disclosure and a pharmaceutically acceptable excipient, carrier, or diluent.
別の態様では、本開示は、治療有効量の本開示の上記の態様または実施形態のいずれかのｓｉＲＮＡまたは医薬組成物を投与することによって、ＡＴＸＮ２発現の低下を必要とする対象におけるＡＴＸＮ２発現を低下させる方法を提供する。In another aspect, the present disclosure provides a method of reducing ATXN2 expression in a subject in need thereof by administering a therapeutically effective amount of an siRNA or pharmaceutical composition of any of the above aspects or embodiments of the present disclosure.
いくつかの実施形態では、神経疾患は、ＴＤＰ－４３（ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３）タンパク質症に関連する。いくつかの実施形態では、神経疾患は、ＡＴＸＮ２の野生型、または変異型の発現によって引き起こされるか、またはそれに関連する。いくつかの実施形態では、神経疾患は、ＡＬＳ、前頭側頭葉認知症、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症、慢性外傷性脳症、レビー小体型認知症、皮質基底変性症、進行性核上性麻痺、グアム複合パーキンソン認知症、ピック病、ペリー症候群、硬化を伴う加齢性ＴＤＰ－４３脳症、海馬硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはＳＣＡ２である。いくつかの実施形態では、神経疾患は、ＳＣＡ２であり、対象は、ＡＴＸＮ２遺伝子座に複数のＣＡＧトリヌクレオチドリピート変異、例えば、少なくとも３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００のＣＡＧリピートを有する者であり得る。いくつかの実施形態では、神経疾患は、ＡＬＳであり、対象は、ＡＴＸＮ２遺伝子座に複数のＣＡＧトリヌクレオチドリピート変異、例えば、少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のＣＡＧリピートを有する者で得あり得る。いくつかの実施形態では、神経疾患は、ハンチントン病であり、対象は、上方制御されたＡＴＸＮ２を有する者であり得る。In some embodiments, the neurological disease is associated with a TDP-43 (TAR DNA-binding protein 43) proteinopathy. In some embodiments, the neurological disease is caused by or associated with expression of a wild-type or mutant form of ATXN2. In some embodiments, the neurological disease is ALS, frontotemporal lobe dementia, primary lateral sclerosis, progressive muscular atrophy, limbic-predominant senile TDP-43 encephalopathy, chronic traumatic encephalopathy, dementia with Lewy bodies, corticobasal degeneration, progressive supranuclear palsy, Guam Parkinsonism-Dementia Complex, Pick's disease, Perry syndrome, age-related TDP-43 encephalopathy with sclerosis, hippocampal sclerosis, Huntington's disease, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, or SCA2. In some embodiments, the neurological disease is SCA2, and the subject can have multiple CAG trinucleotide repeat mutations at the ATXN2 locus, e.g., at least 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or 100 CAG repeats. In some embodiments, the neurological disease is ALS, and the subject can have multiple CAG trinucleotide repeat mutations at the ATXN2 locus, e.g., at least 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, or 40 CAG repeats. In some embodiments, the neurological disease is Huntington's disease, and the subject can have upregulated ATXN2.
いくつかの実施形態では、抑制性核酸、ウイルスベクター、または医薬組成物は、視床内、髄腔内、軟膜下、実質内、線条体内、頭蓋内、大槽内、脳内、脳室内、眼内（例えば、硝子体内）、脳室内、腰部内、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内、経皮、非経口、鼻腔内、経皮、気管内、動脈内、血管内、及び経口投与、吸入、灌流、洗浄、またはそれらの任意の組み合わせによって、対象に投与される。In some embodiments, the inhibitory nucleic acid, viral vector, or pharmaceutical composition is administered to a subject intrathalamic, intrathecal, subpial, intraparenchymal, intrastriatal, intracranial, intracisternal, intracerebral, intraventricular, intraocular (e.g., intravitreal), intracerebroventricular, intralumbar, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, intradermal, transdermal, parenteral, intranasal, transdermal, intratracheal, intraarterial, intravascular, and oral administration, inhalation, perfusion, lavage, or any combination thereof.
いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物（例えば、ヒト）を含む。In some embodiments, the subject includes a mammal (e.g., a human).
更なる態様では、本開示は、本開示の前述の態様、または実施形態のうちのいずれかの、阻害性核酸、ウイルスベクター、または医薬組成物を含むキットを特徴とする。キットは、治療有効量の阻害性核酸、ウイルスベクター、または医薬組成物を、対象（例えば、本明細書に記載の神経疾患と診断された哺乳動物、例えば、ヒト）に投与するためのキットの使用を指示する添付文書を更に含み得る。In a further aspect, the disclosure features a kit including an inhibitory nucleic acid, viral vector, or pharmaceutical composition of any of the foregoing aspects or embodiments of the disclosure. The kit may further include a package insert directing use of the kit to administer a therapeutically effective amount of the inhibitory nucleic acid, viral vector, or pharmaceutical composition to a subject (e.g., a mammal, e.g., a human, diagnosed with a neurological disorder described herein).
定義
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、記載される値を上回る、または下回る１０％以内の値を指す。例えば、「約１００の核酸残基」という語句は、９０～１１０の核酸残基の値を指す。 DEFINITIONS As used herein, the term "about" refers to a value within 10% above or below the stated value. For example, the phrase "about 100 nucleic acid residues" refers to a value between 90 and 110 nucleic acid residues.
本明細書で使用される場合、「アニール」という用語は、例えば、ワトソンクリックの塩基対形成に従い、鎖間水素結合によって媒介されるハイブリダイゼーションによって、核酸の安定したデュプレックスの形成を指す。デュプレックスの核酸は、例えば、互いに少なくとも５０％相補性（例えば、互いに約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％相補性）であり得る。一方の核酸を別の核酸にアニーリングする際に形成される「安定したデュプレックス」は、ストリンジェントな洗浄によって変性されないデュプレックス構造である。例示的なストリンジェントな洗浄条件は、当該技術分野で既知のものであり、デュプレックスの各々の鎖の融解温度よって約５℃低い温度、及び、０．２Ｍ未満（０．２Ｍ、０．１９Ｍ、０．１８Ｍ、０．１７Ｍ、０．１６Ｍ、０．１５Ｍ、０．１４Ｍ、０．１３Ｍ、０．１２Ｍ、０．１１Ｍ、０．１Ｍ、０．０９Ｍ、０．０８Ｍ、０．０７Ｍ、０．０６Ｍ、０．０５Ｍ、０．０４Ｍ、０．０３Ｍ、０．０２Ｍ、０．０１Ｍ、またはそれ以下）の一価の塩濃度（例えば、ＮａＣｌ濃度）等の、一価の塩の低い濃度を含む。As used herein, the term "annealing" refers to the formation of a stable duplex of nucleic acids, e.g., by hybridization mediated by interstrand hydrogen bonding according to Watson-Crick base pairing. The nucleic acids of the duplex can be, for example, at least 50% complementary to each other (e.g., about 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, or 100% complementary to each other). A "stable duplex" formed upon annealing one nucleic acid to another is a duplex structure that is not denatured by stringent washing. Exemplary stringent washing conditions are known in the art and include a temperature about 5°C lower than the melting temperature of each strand of the duplex and a low concentration of monovalent salt, such as a monovalent salt concentration (e.g., NaCl concentration) of less than 0.2M (0.2M, 0.19M, 0.18M, 0.17M, 0.16M, 0.15M, 0.14M, 0.13M, 0.12M, 0.11M, 0.1M, 0.09M, 0.08M, 0.07M, 0.06M, 0.05M, 0.04M, 0.03M, 0.02M, 0.01M, or lower).
本明細書で使用される場合、「保存的変異」、「保存的置換」、または「保存的アミノ酸置換」とう用語は、１つ、または複数のアミノ酸の、類似した物理化学的特性、例えば、極性、静電荷、及び立体容積等を示す、１つ、または複数の異なるアミノ酸への置換を指す。これらの特性を、天然に存在する２０のアミノ酸各々について、下表１にまとめる。
この表から、保存的アミノ酸ファミリーとしては、例えば、（ｉ）Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、及びＭ、（ｉｉ）Ｄ、及びＥ、（ｉｉｉ）Ｃ、Ｓ、及びＴ、（ｉｖ）Ｈ、Ｋ、及びＲ、（ｖ）Ｎ、及びＱ、ならびに（ｖｉ）Ｆ、Ｙ、及びＷが挙げられるということが理解されよう。したがって、保存的変異、または保存的置換は、１つのアミノ酸を同一アミノ酸ファミリーのメンバーに置換した（例えば、ＳｅｒのＴｈｒへの置換、またはＬｙｓのＡｒｇへの置換）保存的変異、または保存的置換である。From this table, it can be seen that conservative amino acid families include, for example, (i) G, A, V, L, I, P, and M, (ii) D and E, (iii) C, S, and T, (iv) H, K, and R, (v) N and Q, and (vi) F, Y, and W. Thus, a conservative mutation or substitution is one in which one amino acid is replaced with a member of the same amino acid family (e.g., Ser for Thr, or Lys for Arg).
本明細書で使用される場合、核酸の「長さ」は、核酸の５’から３’末端までのヌクレオチドの量を測定することによって評価される、核酸の線形サイズを指す。目的の核酸の長さを決定するために使用され得る例示的な分子生物学技術は、当該技術分野で既知である。As used herein, the "length" of a nucleic acid refers to the linear size of the nucleic acid, as assessed by measuring the amount of nucleotides from the 5' to the 3' end of the nucleic acid. Exemplary molecular biology techniques that can be used to determine the length of a nucleic acid of interest are known in the art.
本明細書で使用される場合、「動作可能に連結された」という用語は、第１の分子（例えば、第１の核酸）が第２の分子（例えば、第２の核酸）の機能に影響を及ぼすよう分子が配置されている、第２の分子に結合された第１の分子を指す。２つの分子は、１つの連続した分子の一部である場合もあれば、そうでない場合もあり、隣接している場合もあれば、そうでない場合もある。例えば、プロモーターが細胞内の目的の転写可能なポリヌクレオチド分子の転写を調節する場合、プロモーターは、転写可能なポリヌクレオチド分子に動作可能に連結される。追加的に、ある部分の転写活性化機能が他の部分の存在によって悪影響を受けないように、それらが結合されている場合、転写調節要素の２つの部分は、互いに動作可能に連結される。２つの転写調節要素は、リンカー核酸（例えば、介在する非コード核酸）を介して互いに動作可能に連結され得るか、または介在するヌクレオチドが存在せずに互いに動作可能に連結され得る。As used herein, the term "operably linked" refers to a first molecule (e.g., a first nucleic acid) attached to a second molecule (e.g., a second nucleic acid), where the molecules are positioned such that the first molecule affects the function of the second molecule (e.g., a second nucleic acid). The two molecules may or may not be part of a single, contiguous molecule, and may or may not be adjacent. For example, a promoter is operably linked to a transcribable polynucleotide molecule if the promoter controls the transcription of the transcribable polynucleotide molecule of interest in a cell. Additionally, two portions of a transcriptional regulatory element are operably linked to each other if they are linked such that the transcriptional activation function of one portion is not adversely affected by the presence of the other portion. Two transcriptional regulatory elements can be operably linked to each other via linker nucleic acid (e.g., an intervening non-coding nucleic acid) or can be operably linked to each other without any intervening nucleotides.
本明細書で使用される場合、核酸分子の１つのセグメントは、２つのセグメントが１つ以上の構成ヌクレオチドを共有する場合、同一の核酸分子の別のセグメントと「重複する」と見なされる。例えば、同一の核酸分子の２つのセグメントは、２つのセグメントが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、またはそれ以上の構成ヌクレオチドを共有する場合、互いに「重複する」とみなされる。２つのセグメントに共通の構成ヌクレオチドがゼロである場合、２つのセグメントは、互いに「重複する」とはみなされない。As used herein, one segment of a nucleic acid molecule is considered to "overlap" with another segment of the same nucleic acid molecule if the two segments share one or more constituent nucleotides. For example, two segments of the same nucleic acid molecule are considered to "overlap" with each other if the two segments share 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, or more constituent nucleotides. If the two segments have zero constituent nucleotides in common, the two segments are not considered to "overlap" with each other.
参照ポリヌクレオチド配列に対する「配列相補性パーセント（％）」とは、必要に応じて、最大の配列相補性パーセントを達成するために、配列をアラインメントさせ、ギャップを導入した後に、参照ポリヌクレオチド配列中の核酸に相補的である、候補配列中の核酸のパーセンテージとして定義される。所与のヌクレオチドは、２つのヌクレオチドがカノニカルなワトソンクリック塩基対を形成する場合、本明細書に記載の参照ヌクレオチドに「相補的」であるとみなされる。疑義の回避のために記載するならば、本開示の文脈におけるワトソンクリック塩基対としては、アデニン－チミン、アデニン－ウラシル、及びシトシン－グアニン塩基対が挙げられる。この文脈では、適切なワトソンクリック塩基対は「マッチ」と称されるが、一方、各々の非対合ヌクレオチド、及び各々の不正確に対合したヌクレオチドは、「ミスマッチ」と称される。核酸配列相補性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、例えば、公的に利用可能なコンピューターソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、またはＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェア）を使用して、当業者の能力内の様々な手法で達成され得る。当業者であれば、比較されている配列の完全長にわたる最大の相補性を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントさせるための適切なパラメータを決定することができる。例示として、所与の核酸配列Ａの、所与の核酸配列Ｂへの配列相補性パーセント（代替的に、所与の核酸配列Ｂへの特定の相補性パーセントを有する、所与の核酸配列Ａとして表現され得る）は、以下のように計算される：
１００×（分数Ｘ／Ｙ）
式中、Ｘは、そのプログラムのＡとＢのアライメントにおける、アライメント中の相補的塩基対の数（例えば、コンピューターソフトウェア（ＢＬＡＳＴ等）によって実行されるように）であり、Ｙは、Ｂ中の核酸の総数である。核酸配列Ａの長さが核酸配列Ｂの長さに等しくない場合に、ＡのＢへの配列相補性パーセントが、ＢのＡへの配列相補性パーセントに等しくないだろうことを理解されたい。本明細書において使用される場合、クエリ核酸配列は、クエリ核酸配列が参照核酸配列に１００％の配列相補性を有する場合、参照核酸配列に「完全に相補的」であるとみなされる。 "Percent (%) sequence complementarity" to a reference polynucleotide sequence is defined as the percentage of nucleic acids in a candidate sequence that are complementary to nucleic acids in the reference polynucleotide sequence, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence complementarity. A given nucleotide is considered to be "complementary" to a reference nucleotide as described herein if the two nucleotides form a canonical Watson-Crick base pair. For the avoidance of doubt, Watson-Crick base pairs in the context of the present disclosure include adenine-thymine, adenine-uracil, and cytosine-guanine base pairs. In this context, a proper Watson-Crick base pair is referred to as a "match," while each unpaired nucleotide and each incorrectly paired nucleotide is referred to as a "mismatch." Alignment for purposes of determining percent nucleic acid sequence complementarity can be accomplished in a variety of ways within the capabilities of one of ordinary skill in the art, for example, using publicly available computer software (e.g., BLAST, BLAST-2, or Megalign software). One of ordinary skill in the art can determine appropriate parameters for aligning sequences, including any algorithms needed to achieve maximal complementarity over the full length of the sequences being compared. By way of illustration, the percent sequence complementarity of a given nucleic acid sequence A to a given nucleic acid sequence B (which may alternatively be expressed as a given nucleic acid sequence A having a particular percent complementarity to a given nucleic acid sequence B) is calculated as follows:
100×(fraction X/Y)
where X is the number of complementary base pairs in the alignment of A and B in the program (e.g., as performed by computer software such as BLAST) and Y is the total number of nucleic acids in B. It should be understood that if the length of nucleic acid sequence A is not equal to the length of nucleic acid sequence B, then the percent sequence complementarity of A to B will not be equal to the percent sequence complementarity of B to A. As used herein, a query nucleic acid sequence is considered to be "fully complementary" to a reference nucleic acid sequence if the query nucleic acid sequence has 100% sequence complementarity to the reference nucleic acid sequence.
参照ポリヌクレオチド、または参照ポリペプチド配列に関しての「配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインメントし、最大の配列同一性パーセントが達成されるよう必要に応じてギャップを導入した後に、参照ポリヌクレオチド、または参照ポリペプチド配列中の、核酸、またはアミノ酸と同一である、候補配列中の核酸、またはアミノ酸のパーセンテージと定義される。核酸、またはアミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、公的に利用可能なコンピューターソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、またはＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェア）を使用して、当業者の能力の範囲内の様々な方法で達成され得る。当業者は、比較されている配列の完全長にわたる最大のアライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントさせるための適切なパラメータを決定することができる。例えば、配列同一性パーセント値は、配列比較コンピュータプログラムＢＬＡＳＴを使用して生成され得る。例示として、所与の核酸、またはアミノ酸配列Ａの、所与の核酸、またはアミノ酸配列Ｂに対する（ｔｏ）、それとの（ｗｉｔｈ）、またはそれに対する（ａｇａｉｎｓｔ）、配列同一性パーセント（代替的には、所与の核酸、またはアミノ酸配列Ｂに対して（ｔｏ）、それと（ｗｉｔｈ）、またはそれに対する（ａｇａｉｎｓｔ）、特定の配列同一性パーセントを有する、所与の核酸またはアミノ酸配列Ａとして表現され得る）は、以下のように計算される：
１００×（分数Ｘ／Ｙ）
式中、Ｘは、ＡとＢとのそのプログラムのアラインメントにおける、配列アラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）によって、同一の一致としてスコア付けされた、ヌクレオチド、またはアミノ酸の数であり、Ｙは、Ｂの核酸の総数である。核酸、またはアミノ酸配列Ａの長さが、核酸、またはアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの配列同一性パーセントは、Ａに対するＢの配列同一性パーセントに等しくないことは認識されよう。 "Percent (%) sequence identity" with respect to a reference polynucleotide or polypeptide sequence is defined as the percentage of nucleic acids or amino acids in a candidate sequence that are identical to those in the reference polynucleotide or polypeptide sequence, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percent sequence identity. Alignment for purposes of determining percent nucleic acid or amino acid sequence identity can be achieved in a variety of ways within the capabilities of those skilled in the art using publicly available computer software (e.g., BLAST, BLAST-2, or Megalign software). Those skilled in the art can determine appropriate parameters for aligning sequences, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared. For example, percent sequence identity values can be generated using the sequence comparison computer program BLAST. By way of illustration, the percent sequence identity of a given nucleic acid or amino acid sequence A to, with, or against a given nucleic acid or amino acid sequence B (alternatively, it can be expressed as a given nucleic acid or amino acid sequence A having a particular percent sequence identity to, with, or against a given nucleic acid or amino acid sequence B) is calculated as follows:
100×(fraction X/Y)
where X is the number of nucleotides or amino acids scored as identical matches by a sequence alignment program (e.g., BLAST) in that program's alignment of A and B, and Y is the total number of nucleic acids in B. It will be recognized that if the length of nucleic acid or amino acid sequence A is not equal to the length of nucleic acid or amino acid sequence B, then the percent sequence identity of A to B will not equal the percent sequence identity of B to A.
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、対象を侵しているか、もしくは侵し得る、特定の疾患、または状態を、予防、治療、または制御するために、哺乳類（例えば、ヒト）等の対象に投与される、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、及び／または担体と任意選択で組み合わせて、治療剤、例えば、本明細書に記載の核酸、またはベクターを含有する、混合物を指す。As used herein, the term "pharmaceutical composition" refers to a mixture containing a therapeutic agent, e.g., a nucleic acid or vector described herein, optionally in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients, diluents, and/or carriers, administered to a subject, such as a mammal (e.g., a human), to prevent, treat, or control a particular disease or condition that has or may affect the subject.
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な」という用語は、過渡の毒性、刺激、アレルギー反応、及び他の問題となる合併症を伴うことなく、妥当なベネフィット／リスク比に見合う、哺乳類（例えば、ヒト）等の対象の組織との接触に好適な、化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指す。As used herein, the term "pharmaceutically acceptable" refers to compounds, materials, compositions, and/or dosage forms that are suitable for contact with the tissues of a subject, such as a mammal (e.g., a human), without undue toxicity, irritation, allergic response, and other significant complications, commensurate with a reasonable benefit/risk ratio.
本明細書で使用される場合、遺伝子の「野生型」、または「非変異」型という用語は、正常、または非病原性活性（例えば、神経変性疾患の発症、発症、または進行のリスクが高くなる領域の拡大を繰り返す等の、変位を欠くタンパク質）に関連する、タンパク質をコードする核酸を指す。As used herein, the term "wild-type" or "non-mutated" form of a gene refers to a nucleic acid encoding a protein associated with normal or non-pathogenic activity (e.g., a protein lacking a mutation, such as a recurrent expansion of a region that confers an increased risk for the onset, development, or progression of a neurodegenerative disease).
本明細書で使用される場合、「変異」という用語は、遺伝子の構造、例えば、遺伝子配列における任意の変化を指し、結果として、当該遺伝子の変化した形態がもたらされ、それは後続の世代に引き継がれ得るか（遺伝変異）、または引き継がれなくてもよい（体細胞変異）。遺伝子変異としては、ＤＮＡにおける単一の塩基の置換、挿入、もしくは欠失、またはリピート伸長を含む、遺伝子、もしくは染色体の複数の塩基、もしくはよって大きなセクションの置換、挿入、欠失、もしくは再配置が含まれる。As used herein, the term "mutation" refers to any change in the structure of a gene, e.g., in the sequence of a gene, that results in an altered form of that gene that may or may not be passed on to subsequent generations (genetic mutation) or may not be passed on (somatic mutation). Genetic mutations include the substitution, insertion, deletion, or rearrangement of multiple bases, or thus larger sections, of a gene or chromosome, including the substitution, insertion, deletion, or deletion of a single base in DNA, or repeat expansions.
本明細書で使用される場合、「アタキシン２」、または「アタキシン－２」、または「ＡＴＸＮ２」という用語は、ＡＴＸＮ２遺伝子によってコードされるタンパク質を指し、ポリグルタミン（ｐｏｌｙＱ、ＣＡＧリピート）トラクトを含有する。ＡＴＸＮ２遺伝子、または転写産物は、通常２２、または２３のリピートを有するＡＴＸＮ２の正常アレル、または中間（約２４～３２リピート）、もしくはよって長いリピート拡大（約３３～１００超のリピート）を有する変異アレルを指し得る。いくつかの実施形態では、ＡＴＸＮ２は、ヒトＡＴＸＮ２を含む哺乳類ＡＴＸＮ２を指す。本開示の組成物、及び方法を使用して標的化され得る例示的なＡＴＸＮ２タンパク質には、ＮＣＢＩ ＩＤ ＮＰ＿００１２９７０５０．１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、ならびにその天然に存在するバリアントが含まれる。いくつかの実施形態では、例示的なＡＴＸＮ２遺伝子は、ＮＣＢＩ ＩＤ ＮＣ＿００００１２．１２：ｃ１１１５９９６７３－１１１４５２２１４の核酸配列、またはその天然に存在するバリアントを有する。例示的なＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ転写産物には、ＮＣＢＩ ＩＤ ＮＭ＿００２９７３．４の核酸配列を有するもの、及びその天然に存在するバリアントが含まれる。As used herein, the terms "ataxin 2," "ataxin-2," or "ATXN2" refer to the protein encoded by the ATXN2 gene, which contains a polyglutamine (polyQ, CAG repeat) tract. The ATXN2 gene, or transcript, can refer to a normal allele of ATXN2, typically having 22 or 23 repeats, or a mutant allele with intermediate (approximately 24-32 repeats) or longer repeat expansions (approximately 33-100+ repeats). In some embodiments, ATXN2 refers to mammalian ATXN2, including human ATXN2. Exemplary ATXN2 proteins that can be targeted using the compositions and methods of the present disclosure include the protein having the amino acid sequence represented by NCBI ID NP_001297050.1, as well as naturally occurring variants thereof. In some embodiments, an exemplary ATXN2 gene has the nucleic acid sequence of NCBI ID NC_000012.12:c111599673-111452214, or a naturally occurring variant thereof. Exemplary ATXN2 mRNA transcripts include those having the nucleic acid sequence of NCBI ID NM_002973.4, and naturally occurring variants thereof.
本明細書で使用される場合、「阻害性核酸」という用語は、標的核酸、例えば、ＡＴＸＮ２ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、または成熟ｍＲＮＡの少なくとも一部分にハイブリダイズするガイド鎖配列を含む核酸を指し、その発現、または活性を阻害する。阻害性核酸は、標的核酸のタンパク質コード領域（例えば、エクソン）、または非コード領域（例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、イントロン等）を標的とし得る。いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、一本鎖、または二本鎖分子である。阻害性核酸は、別の鎖（例えば、二本鎖デュプレックス）、または同一の鎖（例えば、一本鎖、自己アニーリングデュプレックス構造）にパッセンジャー鎖配列を更に含み得る。いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、干渉ＲＮＡ分子、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。As used herein, the term "inhibitory nucleic acid" refers to a nucleic acid comprising a guide strand sequence that hybridizes to at least a portion of a target nucleic acid, e.g., ATXN2 RNA, mRNA, pre-mRNA, or mature mRNA, and inhibits its expression or activity. The inhibitory nucleic acid may target a protein-coding region (e.g., an exon) or a non-coding region (e.g., a 5' UTR, a 3' UTR, an intron, etc.) of the target nucleic acid. In some embodiments, the inhibitory nucleic acid is a single-stranded or double-stranded molecule. The inhibitory nucleic acid may further comprise a passenger strand sequence on another strand (e.g., a double-stranded duplex) or on the same strand (e.g., a single-stranded, self-annealing duplex structure). In some embodiments, the inhibitory nucleic acid is an interfering RNA molecule, e.g., a short interfering RNA (siRNA), a short hairpin RNA (shRNA), a microRNA (miRNA), or a double-stranded RNA (dsRNA).
本明細書で使用される場合、「干渉ＲＮＡ」という用語は、例えば、（ｉ）標的ＲＮＡ転写産物へアニーリングし、それによって、核酸デュプレックスを形成すること、及び（ｉｉ）ＲＮＡ転写産物のヌクレアーゼ媒介性分解を促進すること、及び／または（ｉｉｉ）機能的なリボソームＲＮＡ転写産物複合体の形成を立体的に排除すること、もしくはそうでなければ標的ＲＮＡ転写産物からの機能的タンパク質産物の形成を減弱すること等によって、ＲＮＡの転写産物の翻訳を、減速、阻害、もしくは防止することという手法によって、標的ＲＮＡ転写産物の発現を抑制する、ＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを指す。本明細書で記載される干渉ＲＮＡは、例えば、一本鎖、もしくは二本鎖オリゴヌクレオチドの形態で、または干渉ＲＮＡをコードする導入遺伝子を含有するベクター、例えば、本明細書の記載のアデノウイルス随伴ベクターの形態で、患者、例えば、筋ジストロフィーを有するヒト患者へ提供され得る。例示的な干渉ＲＮＡプラットフォームは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ４：ｅ２５２ （２０１５）；Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６１：７４６－７６９ （２００９）、及びＢｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２：６９２－７０１ （２０１４）中で記載され、それらの各々の開示は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。As used herein, the term "interfering RNA" refers to an RNA, e.g., an siRNA, miRNA, or shRNA, that silences expression of a target RNA transcript by slowing down, inhibiting, or preventing translation of the RNA transcript, e.g., by (i) annealing to the target RNA transcript, thereby forming a nucleic acid duplex, and (ii) promoting nuclease-mediated degradation of the RNA transcript, and/or (iii) sterically excluding the formation of a functional ribosomal RNA-transcript complex or otherwise attenuating the formation of a functional protein product from the target RNA transcript. The interfering RNA described herein can be provided to a patient, e.g., a human patient with muscular dystrophy, in the form of, for example, a single-stranded or double-stranded oligonucleotide, or in the form of a vector, e.g., an adenovirus-associated vector described herein, containing a transgene encoding the interfering RNA. Exemplary interfering RNA platforms are described, for example, in Molecular Therapy-Nucleic Acids 4:e252 (2015); Rao et al., Advanced Drug Delivery Reviews 61:746-769 (2009), and Borel et al., Molecular Therapy 22:692-701 (2014), the disclosures of each of which are incorporated herein by reference in their entireties.
本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ」、または「ｍｉＲＮＡ」は、標的ｍＲＮＡの切断、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制、標的ｍＲＮＡの分解、またはそれらの組み合わせによって、標的遺伝子のサイレンシングを媒介することができる、低分子非コードＲＮＡ分子を指す。典型的には、ｍｉＲＮＡは、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）と称されるヘアピン、またはステム－ループ（例えば、自己相補的な一本鎖骨格を有する）デュプレックス構造として転写され、これは、酵素的に、プレｍｉＲＮＡに（例えば、Ｄｒｏｓｈａ、ＤＧＣＲ８、Ｐａｓｈａなどによって）プロセシングされる。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは細胞質に輸送され、そこで、Ｄｉｃｅｒによって酵素的にプロセシングされて、パッセンジャー鎖とのｍｉＲＮＡデュプレックス、次いで、一本鎖の成熟ｍｉＲＮＡ分子が生成され、その後、これが、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にローディングされる。ｍｉＲＮＡへの言及は、合成、または人工ｍｉＲＮＡを含み得る。As used herein, "microRNA" or "miRNA" refers to a small, non-coding RNA molecule that can mediate target gene silencing by cleavage of target mRNA, translational repression of target mRNA, degradation of target mRNA, or a combination thereof. Typically, miRNAs are transcribed as hairpin or stem-loop (e.g., having a self-complementary single-stranded backbone) duplex structures termed primary miRNAs (pri-miRNAs), which are enzymatically processed into pre-miRNAs (e.g., by Drosha, DGCR8, Pasha, etc.). The pre-miRNAs are transported to the cytoplasm, where they are enzymatically processed by Dicer to generate miRNA duplexes with passenger strands and then single-stranded mature miRNA molecules, which are subsequently loaded into the RNA-induced silencing complex (RISC). Reference to miRNAs can also include synthetic or artificial miRNAs.
本明細書で使用される場合、「合成ｍｉＲＮＡ」、または「人工ｍｉＲＮＡ」、または「ａｍｉＲＮＡ」は、内因性、修飾、または合成のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、またはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ骨格、またはスキャフォールド）を指し、そこで、内因性ｍｉＲＮＡガイド配列は、ステム配列内のパッセンジャー配列は、標的遺伝子の高効率のＲＮＡサイレンシングを指示する、ｍｉＲＮＡガイド配列、及びｍｉＲＮＡパッセンジャー配列で置き換えられている（例えば、Ｅａｍｅｎｓ ｅｔ ａｌ． （２０１４）， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １０６２：２１１－２２４を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ガイド配列、及びパッセンジャー配列の相補性の性質（例えば、塩基の数、ミスマッチの位置、バルジのタイプ等）は、合成ｍｉＲＮＡが構築される内因性ｍｉＲＮＡ骨格中の、ガイド配列、及びパッセンジャー配列の相補性の性質と類似しているか、または異なり得る。As used herein, "synthetic miRNA," or "artificial miRNA," or "amiRNA" refers to an endogenous, modified, or synthetic pri-miRNA or pre-miRNA (e.g., miRNA backbone or scaffold) in which the endogenous miRNA guide sequence and passenger sequence within the stem sequence have been replaced with a miRNA guide sequence and a miRNA passenger sequence that direct highly efficient RNA silencing of target genes (see, e.g., Eamens et al. (2014), Methods Mol. Biol. 1062:211-224). In some embodiments, the nature of the complementarity of the guide sequence and passenger sequence (e.g., number of bases, location of mismatches, type of bulge, etc.) can be similar to or different from the nature of the complementarity of the guide sequence and passenger sequence in the endogenous miRNA scaffold from which the synthetic miRNA is constructed.
本明細書で使用される、「マイクロＲＮＡ骨格」、「ｍｉＲ骨格」、「マイクロＲＮＡスキャフォールド」、または「ｍｉＲスキャフォールド」という用語は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、またはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡスキャフォールドを指し、ステム配列が、目的のｍｉＲＮＡによって置換されており、目的のｍｉＲＮＡによって標的化される遺伝子ではＲＮＡサイレンシングを指示する機能的な成熟ｍｉＲＮＡを産生することができる。ｍｉＲ骨格は、５’隣接領域（５’ｍｉＲコンテキスト、≧９ヌクレオチドとも称される）と、ｍｉＲＮＡデュプレックス（ガイド鎖配列、及びパッセンジャー鎖配列）を含むステム領域と、基本ステム（各々５’、及び３’、各々、約４～１３ヌクレオチド）、末端ループを含む少なくとも１つのループモチーフ領域（末端ループの場合、１０超ヌクレオチド）、３’隣接領域（３’ｍｉＲコンテキスト、≧９ヌクレオチドとも称される）、及び任意選択的に１つ、または複数のステムのバルジを含む。ｍｉＲ骨格は、野生型ｍｉＲＮＡスキャフォールドに、完全に、もしくは部分的に由来する場合もあれば、完全に人工配列である場合もある。As used herein, the terms "microRNA scaffold," "miR scaffold," "microRNA scaffold," or "miR scaffold" refer to a pri-miRNA or pre-miRNA scaffold in which the stem sequence has been replaced by a miRNA of interest, resulting in the production of a functional mature miRNA that directs RNA silencing at genes targeted by the miRNA of interest. The miR scaffold includes a 5' flanking region (also referred to as the 5' miR context, ≥ 9 nucleotides), a stem region comprising the miRNA duplex (guide strand sequence and passenger strand sequence), a basic stem (5' and 3', each approximately 4-13 nucleotides), at least one loop motif region comprising a terminal loop (more than 10 nucleotides in the case of a terminal loop), a 3' flanking region (also referred to as the 3' miR context, ≥ 9 nucleotides), and optionally one or more stem bulges. The miR backbone may be derived entirely or partially from a wild-type miRNA scaffold, or may be an entirely artificial sequence.
本明細書で使用される場合、阻害性核酸の「アンチセンス鎖配列」、または「ガイド鎖配列」という用語は、サイレンシングの標的となる遺伝子のｍＲＮＡの、約１０～５０ヌクレオチド（例えば、約１５～３０、１６～２５、１８～２３、または１９～２２ヌクレオチド）の領域に、実質的に相補的（例えば、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％相補的）な配列を指す。アンチセンス配列は、標的ｍＲＮＡ配列に十分に相補的であり、標的特異的サイレンシングを指示し、例えば、ＲＮＡｉ機構、またはプロセスによる標的ｍＲＮＡの破壊を引き起こす。いくつかの実施形態では、アンチセンス配列、またはガイド鎖配列は、Ｄｉｃｅｒによる切断後に残る成熟配列を指す。As used herein, the term "antisense strand sequence" or "guide strand sequence" of an inhibitory nucleic acid refers to a sequence that is substantially complementary (e.g., at least 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 100% complementary) to a region of about 10-50 nucleotides (e.g., about 15-30, 16-25, 18-23, or 19-22 nucleotides) of the mRNA of a gene targeted for silencing. The antisense sequence is sufficiently complementary to the target mRNA sequence to direct target-specific silencing, e.g., to cause destruction of the target mRNA by the RNAi machinery or process. In some embodiments, the antisense sequence or guide strand sequence refers to the mature sequence remaining after cleavage by Dicer.
本明細書で使用される場合、阻害性核酸の「センス配列」、または「パッセンジャー鎖配列」という用語は、標的ｍＲＮＡに相同的であり、阻害性核酸のアンチセンス鎖配列、またはガイド鎖配列に、部分的、または完全に相補的な配列を指す。阻害性核酸のアンチセンス鎖配列、及びセンス鎖配列は、ハイブリダイズしてデュプレックス構造を形成する（例えば、二本鎖デュプレックス、または一本鎖の自己アニーリングデュプレックス構造を形成する）。いくつかの実施形態では、センス配列、またはパッセンジャー鎖配列は、Ｄｉｃｅｒによる切断後に残る成熟配列を指す。As used herein, the term "sense sequence" or "passenger strand sequence" of an inhibitory nucleic acid refers to a sequence that is homologous to a target mRNA and is partially or completely complementary to the antisense strand sequence, or guide strand sequence, of the inhibitory nucleic acid. The antisense strand sequence and the sense strand sequence of the inhibitory nucleic acid hybridize to form a duplex structure (e.g., form a double-stranded duplex or a single-stranded self-annealing duplex structure). In some embodiments, the sense sequence or passenger strand sequence refers to the mature sequence remaining after cleavage by Dicer.
本明細書で使用される場合、「デュプレックス」は、阻害性核酸に関して使用される場合、一緒にハイブリダイズしてデュプレックス構造を形成する、２つの核酸鎖（例えば、ガイド鎖、及びパッセンジャー鎖）を指す。デュプレックスは、２つの別の核酸鎖によって形成されてもよく、または自己相補性の領域（例えば、ヘアピン、もしくはステム－ループ）を有する単一の核酸鎖によって形成されてもよい。As used herein, "duplex," when used in reference to an inhibitory nucleic acid, refers to two nucleic acid strands (e.g., a guide strand and a passenger strand) that hybridize together to form a duplex structure. A duplex may be formed by two separate nucleic acid strands, or by a single nucleic acid strand having a region of self-complementarity (e.g., a hairpin or stem-loop).
本明細書で使用される場合、「発現構築物」は、核酸コード配列の一部、または全部が転写され得る、核酸（例えば、導入遺伝子）を含む任意のタイプの遺伝子構築物を指す。いくつかの実施形態では、発現は、例えば、転写された遺伝子から、生物学的に活性なポリペプチド産物、または阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を生成するための核酸の転写を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、発現制御配列に動作可能に連結されている。As used herein, "expression construct" refers to any type of genetic construct containing a nucleic acid (e.g., a transgene) from which part or all of a nucleic acid coding sequence can be transcribed. In some embodiments, expression includes transcription of a nucleic acid, for example, to produce a biologically active polypeptide product or an inhibitory RNA (e.g., siRNA, shRNA, miRNA) from the transcribed gene. In some embodiments, the transgene is operably linked to an expression control sequence.
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、自然に、または遺伝子操作手段によって別の細胞に導入され、転写され、任意選択的に翻訳されることができる外因性核酸を指す。As used herein, the term "transgene" refers to an exogenous nucleic acid that can be introduced, transcribed, and optionally translated into another cell, either naturally or by genetic engineering means.
本明細書で使用される場合、「遺伝子発現」という用語は、核酸が、核酸分子から転写され、多くの場合、ペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。プロセスは、転写、転写後制御、転写後修飾、翻訳、翻訳後制御、翻訳後修飾、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。「遺伝子発現」の測定への言及は、転写産物（例えば、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡ）、翻訳産物（例えば、ペプチド、またはタンパク質）の測定を指し得る。As used herein, the term "gene expression" refers to the process by which nucleic acids are transcribed from nucleic acid molecules and often translated into peptides or proteins. The process may include transcription, post-transcriptional control, post-transcriptional modification, translation, post-translational control, post-translational modification, or any combination thereof. Reference to measuring "gene expression" may refer to measuring transcription products (e.g., RNA or mRNA) or translation products (e.g., peptides or proteins).
本明細書で使用される場合、「遺伝子の発現を阻害する」という用語は、遺伝子の発現を、低下、下方制御、抑制、遮断、低下、または停止することを意味する。遺伝子の発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、または遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであり得る。典型的には、ｍＲＮＡのレベルの低下は、それから翻訳されるポリペプチドのレベルの低下をもたらす。発現のレベルは、ｍＲＮＡ、またはタンパク質を測定するための、標準的な技法を使用して決定することができる。As used herein, the term "inhibiting expression of a gene" means decreasing, down-regulating, suppressing, blocking, reducing, or stopping expression of a gene. The expression product of a gene can be an RNA molecule (e.g., mRNA) transcribed from the gene or a polypeptide translated from mRNA transcribed from the gene. Typically, a decrease in the level of mRNA results in a decrease in the level of the polypeptide translated from it. The level of expression can be determined using standard techniques for measuring mRNA or protein.
本明細書で使用される場合、「神経変性疾患」、または「神経変性障害」とは、病的状態として神経細胞死を示す、疾患、または障害を指す。神経変性疾患は、慢性神経変性、例えば、数年間にわたる緩徐な進行性の神経細胞死、または急性神経変性、例えば、突然の発症もしくは神経細胞死を示し得る。慢性の神経変性疾患の例としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ）、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が挙げられる。慢性神経変性疾患としては、ＴＤＰ－４３プロテオパチーを特徴とする疾患が挙げられ、この疾患は、核から細胞質への誤局在化、ユビキチン化及び過リン酸化ＴＤＰ－４３の封入体への沈着、有毒なＣ末端ＴＤＰ－４３断片の形成につながるタンパク質切断、及びタンパク質凝集。ＴＤＰ－４３プロテオパチー疾患としては、ＡＬＳ、ＦＴＬＤ、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、四肢優位の加齢性ＴＤＰ－４３脳症、慢性外傷性脳症、レビー小体を伴う認知症、皮質基底核変性、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、グアム複合パーキンソン認知症（Ｇ－ＰＤＣ）、ピック病、海馬硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、及びアルツハイマー病が挙げられる。急性神経変性は、虚血（例えば、脳卒中、外傷性脳損傷）、脱髄、または外傷による軸索切断（例えば、脊髄損傷、または多発性硬化症）によって引き起こされ得る。神経変性疾患は、主に１つのタイプのニューロン、または複数のタイプのニューロンの死滅を示し得る。As used herein, "neurodegenerative disease" or "neurodegenerative disorder" refers to a disease or disorder that exhibits neuronal cell death as a pathological condition. Neurodegenerative diseases can exhibit chronic neurodegeneration, e.g., slowly progressive neuronal cell death over several years, or acute neurodegeneration, e.g., sudden onset or death of neurons. Examples of chronic neurodegenerative diseases include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2), frontotemporal dementia (FTLD), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Chronic neurodegenerative diseases include diseases characterized by TDP-43 proteopathy, which is characterized by nuclear-to-cytoplasmic mislocalization, deposition of ubiquitinated and hyperphosphorylated TDP-43 into inclusion bodies, protein cleavage leading to the formation of toxic C-terminal TDP-43 fragments, and protein aggregation. TDP-43 proteopathy diseases include ALS, FTLD, primary lateral sclerosis, progressive muscular atrophy, limb-predominant age-related TDP-43 encephalopathy, chronic traumatic encephalopathy, dementia with Lewy bodies, corticobasal degeneration, progressive supranuclear palsy (PSP), Guam Parkinsonism-Dementia Complex (G-PDC), Pick's disease, hippocampal sclerosis, Huntington's disease, Parkinson's disease, and Alzheimer's disease. Acute neurodegeneration can be caused by ischemia (e.g., stroke, traumatic brain injury), demyelination, or traumatic axonal transection (e.g., spinal cord injury or multiple sclerosis). Neurodegenerative diseases can manifest primarily as the death of one type of neuron or multiple types of neurons.
本明細書で使用される場合、「リピート領域」という用語は、目的の遺伝子、またはＡＴＸＮ２遺伝子におけるｐｏｌｙＣＡＧ配列等の核酸リピートを含むそのＲＮＡ転写産物の内部のセグメントを指す。リピート領域は、リピート領域内のヌクレオチドのリピート数が、野生型の遺伝子、またはそのＲＮＡ転写産物の形態の、リピート領域内に通常見られるリピートの数を超える場合、「拡大したリピート領域」、「リピート拡大」等とみなされる。例えば、野生型ヒトＡＴＸＮ２遺伝子は、典型的には、１３～３１のＣＡＧリピートを含有する。したがって、ＡＴＸＮ２遺伝子、またはそのＲＮＡ転写産物の関連における、「拡大したリピート領域」、及び「リピート拡大」には、とりわけ、３１を超えるリピートを含有するリピート領域が含まれる。As used herein, the term "repeat region" refers to a segment within a gene of interest or its RNA transcript that contains nucleic acid repeats, such as the polyCAG sequence in the ATXN2 gene. A repeat region is considered an "expanded repeat region," "repeat expansion," or the like, when the number of nucleotide repeats within the repeat region exceeds the number of repeats normally found within the repeat region in the wild-type form of the gene or its RNA transcript. For example, a wild-type human ATXN2 gene typically contains 13 to 31 CAG repeats. Thus, "expanded repeat region" and "repeat expansion," in the context of the ATXN2 gene or its RNA transcript, include, among other things, repeat regions containing more than 31 repeats.
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、対象から分離された、検体（例えば、血液、血液成分（例えば、血清、または血漿）、尿、唾液、羊水、脳脊髄液、組織（例えば、胎盤、または真皮の）、膵液、絨毛膜絨毛試料、または細胞）を指す。対象は、例えば、野生型、または変異型ＡＴＸＮ２の発現に関連する疾患（例えば、ＳＣＡ２、ＡＬＳ、ハンチントン病、パーキンソン病）等、本明細書に記載の疾患に罹患している患者であり得る。As used herein, the term "sample" refers to a specimen (e.g., blood, blood components (e.g., serum or plasma), urine, saliva, amniotic fluid, cerebrospinal fluid, tissue (e.g., placental or dermal), pancreatic juice, chorionic villus sample, or cells) isolated from a subject. The subject may be, for example, a patient suffering from a disease described herein, such as a disease associated with expression of wild-type or mutant ATXN2 (e.g., SCA2, ALS, Huntington's disease, Parkinson's disease).
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」、及び「結合する」という語句は、認識されるイオン、塩、低分子、及び／またはタンパク質の不均一な集団、例えば、変異型ＡＴＸＮ２ ＲＮＡ転写産物の中で、ＲＮＡ転写物のような特定の分子の存在を決定的にする結合反応を指す。ある種（例えば、ＲＮＡ転写産物）に特異的に結合するリガンド（例えば、本明細書に記載のＲＮＡ結合タンパク質）は、例えば、１ｍＭ未満のＫＤで、その種に結合し得る。例えば、ある種に特異的に結合するリガンドは、最大１００ｎＭ（例えば、１ｐＭ～１００ｎＭ）のＫＤで、その種に結合することができる。別の分子への特異的結合を示さないリガンドは、特定の分子、またはそのイオンに対して、１ｍＭ超（例えば、１μＭ、１００μＭ、５００μＭ、１ｍＭ超の）ＫＤを示し得る。特定のタンパク質に対するリガンドの親和性を決定するために、様々なアッセイ形式を使用することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡアッセイは、標的タンパク質に特異的に結合するリガンドを特定するために日常的に使用されている。特異的なタンパク質結合を決定するために使用できる、アッセイ形式、及び条件の記載については、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）、及びＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ， Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９９）を参照のこと。 As used herein, the phrases "specifically bind" and "binding" refer to a binding reaction that is determinative of the presence of a particular molecule, such as an RNA transcript, among a heterogeneous population of recognized ions, salts, small molecules, and/or proteins, e.g., a mutant ATXN2 RNA transcript. A ligand (e.g., an RNA-binding protein described herein) that specifically binds to a species (e.g., an RNA transcript) may bind to that species with, for example, aKD of less than 1 mM. For example, a ligand that specifically binds to a species may bind to that species with aKD of up to 100 nM (e.g., 1 pM-100 nM). A ligand that does not exhibit specific binding to another molecule may exhibit aKD of greater than 1 mM (e.g., greater than 1 μM, 100 μM, 500 μM, or 1 mM) for a particular molecule or ion thereof. A variety of assay formats can be used to determine the affinity of a ligand for a particular protein. For example, solid-phase ELISA assays are routinely used to identify ligands that specifically bind to a target protein. For a description of assay formats and conditions that can be used to determine specific protein binding, see Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1988), and Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1999).
本明細書で使用される場合、「対象」、及び「患者」という用語は、本明細書に記載の特定の疾患、または症状（例えば、がん、または感染症等）に対する治療を受ける生物を指す。対象、及び患者の例としては、本明細書に記載の疾患、または状態の治療を受けている、ヒト等の哺乳動物が含まれる。As used herein, the terms "subject" and "patient" refer to an organism receiving treatment for a particular disease or condition (e.g., cancer, infectious disease, etc.) described herein. Examples of subjects and patients include mammals, such as humans, receiving treatment for a disease or condition described herein.
本明細書で使用される場合、「転写調節エレメント」という用語は、目的の遺伝子の転写を少なくとも一部を制御する核酸を指す。転写調節エレメントとしては、プロモーター、エンハンサー、及び遺伝子転写を制御する、または制御するのを助ける他の核酸（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれ得る。転写調節エレメントの例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， １９９０）に記載される。As used herein, the term "transcriptional regulatory element" refers to a nucleic acid that controls, at least in part, the transcription of a gene of interest. Transcriptional regulatory elements can include promoters, enhancers, and other nucleic acids that control or help control gene transcription (e.g., polyadenylation signals). Examples of transcriptional regulatory elements are described, for example, in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990).
本明細書で使用される場合、「治療する」、または「治療」という用語は、野生型、または変異型ＡＴＸＮ２に関連する疾患、例えば、ＳＣＡ２、ＡＬＳ、ハンチントン病、パーキンソン病の進行等の、望ましくない生理学的変化、または障害を、予防する、遅らせる（軽減する）ことを目的とする治療的処置を指す。ＳＣＡ２、ＡＬＳ、ハンチントン病、パーキンソン病治療の文脈では、治療が成功したことを示す有益、なまたは望ましい臨床結果としては、限定されないが、症状の緩和、疾患の程度の消失、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化していないこと）、疾患進行の遅延、または緩徐化、疾患状態の改善、または緩和、及び検出可能か検出不可能かに関わらず寛解（部分的か全体的かを問わない）が挙げられる。ＳＣＡ２を有する患者の治療は、変異型ＡＴＸＮ２ ＲＮＡ転写産物の発現の減少（例えば、拡大したＣＡＧトリヌクレオチドリピート領域を含有する、ＡＴＸＮ２ ＲＮＡ転写産物の発現の減少）等の、１つ以上の検出可能な変化として明示し得る。As used herein, the terms "treat" or "treatment" refer to therapeutic procedures aimed at preventing or slowing (alleviating) undesirable physiological changes or disorders, such as the progression of a disease associated with wild-type or mutant ATXN2, e.g., SCA2, ALS, Huntington's disease, or Parkinson's disease. In the context of SCA2, ALS, Huntington's disease, or Parkinson's disease treatment, beneficial or desirable clinical outcomes indicative of successful treatment include, but are not limited to, alleviation of symptoms, elimination of disease extent, stabilization of disease state (i.e., no worsening), delay or slowing of disease progression, improvement or palliation of disease state, and remission (whether partial or total), whether detectable or undetectable. Treatment of patients with SCA2 may be manifested by one or more detectable changes, such as a decrease in expression of mutant ATXN2 RNA transcripts (e.g., a decrease in expression of ATXN2 RNA transcripts containing an expanded CAG trinucleotide repeat region).
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、複製、及び／または発現の目的等のために、目的の遺伝子を、細胞（例えば、ヒト細胞等の哺乳動物細胞）に送達するビヒクルとして機能し得る、核酸、例えば、ＤＮＡ、またはＲＮＡを指す。本明細書に記載の組成物、及び方法と組み合わせて有用な例示的なベクターとしては、プラスミド、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、ビリオン、または他の適切なレプリコン（例えば、ウイルスベクター）が挙げられる。様々なベクターが、外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを原核細胞、または真核細胞に送達するために、開発されている。そのような発現ベクターの例は、例えば、ＷＯ１９９４／１１０２６に開示されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列、ならびに、例えば、タンパク質の発現、及び／または哺乳動物細胞のゲノムへのこれらのポリヌクレオチド配列の統合に使用される更なる配列要素を含む。本明細書に記載の導入遺伝子の発現に使用することができる特定のベクターとしては、遺伝子転写を指示するプロモーター、及びエンハンサー領域等の調節配列を含有するプラスミドが挙げられる。導入遺伝子の発現に対して他の有用なベクターとしては、これらの遺伝子の翻訳速度を高める、または遺伝子転写から生じるｍＲＮＡの安定性、もしくは核輸送を改善するポリヌクレオチド配列が挙げられる。これらの配列要素としては、例えば、発現ベクター上で運ばれる遺伝子の効率的な転写を指示するために、５’、及び３’非翻訳領域、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及びポリアデニル化シグナル部位が含まれる。本明細書に記載の発現ベクターはまた、このようなベクターを含有する細胞を選択するためのマーカーをコードするポリヌクレオチドを含有していてもよい。適切なマーカーの例としては、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、またはノーセオスリシン等の抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられる。As used herein, the term "vector" refers to a nucleic acid, e.g., DNA or RNA, that can function as a vehicle to deliver a gene of interest to a cell (e.g., a mammalian cell, such as a human cell), for purposes of replication and/or expression, etc. Exemplary vectors useful in conjunction with the compositions and methods described herein include plasmids, DNA vectors, RNA vectors, virions, or other suitable replicons (e.g., viral vectors). Various vectors have been developed for delivering polynucleotides encoding exogenous proteins to prokaryotic or eukaryotic cells. Examples of such expression vectors are disclosed, for example, in WO 1994/11026, the disclosure of which is incorporated herein by reference. The expression vectors described herein contain polynucleotide sequences and additional sequence elements used, for example, for protein expression and/or integration of these polynucleotide sequences into the genome of a mammalian cell. Particular vectors that can be used to express the transgenes described herein include plasmids containing regulatory sequences, such as promoters and enhancer regions, that direct gene transcription. Other useful vectors for expressing transgenes include polynucleotide sequences that increase the translation rate of these genes or improve the stability or nuclear transport of mRNA resulting from gene transcription. These sequence elements include, for example, 5' and 3' untranslated regions, internal ribosome entry sites (IRES), and polyadenylation signal sites to direct efficient transcription of genes carried on the expression vector. The expression vectors described herein may also contain a polynucleotide encoding a marker for selecting cells containing such a vector. Examples of suitable markers include genes encoding resistance to antibiotics such as ampicillin, chloramphenicol, kanamycin, or nourseothricin.
本明細書に記載の組成物、及び方法は、野生型、または変異型アタキシン－２（ＡＴＸＮ２）の発現に関連する障害、例えば、脊髄小脳失調症２型、または脊髄小脳失調症－２（ＳＣＡ２）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、ＦＴＤ（前頭側頭型認知症）、ＴＤＰ－４３（ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３）プロテオパチー等を治療するのに有用である。本明細書に記載の組成物は、干渉ＲＮＡ構築物、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等の、野生型、または変異型遺伝子由来の遺伝子から転写された、野生型、または変異ｍＲＮＡ転写産物の発現を抑制する阻害性核酸構築物を含む。機構よって限定されるものではないが、本明細書に記載の組成物は、ヌクレオチドリピートを保有する遺伝子から転写された、野生型、または変異型ｍＲＮＡ転写産物の発現を減少させ、それによって、疾患表現型の発現を防止することによって、神経病変を改善し得る。The compositions and methods described herein are useful for treating disorders associated with wild-type or mutant ataxin-2 (ATXN2) expression, such as spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Huntington's disease, frontotemporal dementia (FTD), and TDP-43 (TAR DNA-binding protein 43) proteopathy. The compositions described herein include inhibitory nucleic acid constructs, such as interfering RNA constructs, e.g., small interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), or microRNA (miRNA), that suppress the expression of wild-type or mutant mRNA transcripts transcribed from genes derived from wild-type or mutant genes. Without being limited by mechanism, the compositions described herein may ameliorate neuropathology by reducing the expression of wild-type or mutant mRNA transcripts transcribed from genes bearing nucleotide repeats, thereby preventing the manifestation of disease phenotypes.
以下のセクションでは、例示的な本開示の阻害性核酸、及びそれをコードするベクター（例えば、ウイルスベクター）、ならびに神経疾患の治療のためにそのような抑制性核酸、及びベクターを使用する方法の記載を提供する。The following sections provide a description of exemplary inhibitory nucleic acids of the present disclosure and vectors (e.g., viral vectors) encoding same, as well as methods of using such inhibitory nucleic acids and vectors for the treatment of neurological disorders.
アタキシン－２及びアタキシン－２に関連する障害
ＡＴＸＮ２タンパク質は、ストレス顆粒の成分である細胞質タンパク質である。ストレス顆粒は、タンパク質翻訳の停止によって誘導される一過性の細胞内区画であり、神経変性疾患を有する対象で変異することが知られているいくつかのタンパク質を含む（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ａｌ－Ｃｈａｌａｂｉ， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ （２０１７） ３７７：１６２－１７２）。ＡＴＸＮ２は、ポリグルタミンリピート（ｐｏｌｙＱ）として知られるグルタミン残基の配列を含有し、正常な個体では、約２２アミノ酸長である。このポリグルタミンリピートの、３４以上の長さへの拡大は、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）を含む神経変性疾患を有する個体に見出される。この疾患は、小脳、及び他の神経細胞型における、プルキンエニューロンの進行性死滅を特徴とする。ＳＣＡ２患者は、運動失調、感覚障害、及び他の臨床的特徴を発症し、時間の経過とともに悪化する。ほとんどの個体で観察されたものよって長いが、ＳＣＡ２を有する対象で通常観察されるものよっても短い、アタキシン－２ポリグルタミンリピート（例えば、２７～４０のグルタミン残基）の中程度の拡大が、運動ニューロン疾患筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する個体を、正常な対象と比較して明らかにしたところ、実質的に高い頻度で報告されている（Ｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （２０１０） ４６６：７３１０）。これは、これらの中間の長さのポリグルタミンリピート、すなわち、正常な個体に見られるものと脊髄小脳失調症－２患者に見られるものとの間のポリグルタミンリピートが、ＡＬＳのリスクを増加させることを示唆している。現在、ＳＣＡ２、及びＡＬＳの治療選択肢は限られている。 Ataxin-2 and Ataxin-2-Related Disorders The ATXN2 protein is a cytoplasmic protein that is a component of stress granules, transient intracellular compartments induced by the arrest of protein translation and containing several proteins known to be mutated in subjects with neurodegenerative diseases (Brown and Al-Chalabi, N Engl J Med (2017) 377:162-172). ATXN2 contains a sequence of glutamine residues known as a polyglutamine repeat (polyQ), which is approximately 22 amino acids long in normal individuals. Expansion of this polyglutamine repeat to a length of 34 or more is found in individuals with neurodegenerative diseases, including spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2). This disease is characterized by the progressive death of Purkinje neurons in the cerebellum and other neuronal cell types. Patients with SCA2 develop ataxia, sensory impairment, and other clinical features that worsen over time. Moderate expansions of ataxin-2 polyglutamine repeats (e.g., 27-40 glutamine residues), longer than those observed in most individuals but shorter than those typically observed in subjects with SCA2, have been reported at substantially higher frequencies in individuals with the motor neuron disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) compared with normal subjects (Elden et al., Nature (2010) 466:7310). This suggests that these intermediate-length polyglutamine repeats, i.e., polyglutamine repeats between those found in normal individuals and those found in spinocerebellar ataxia-2 patients, increase the risk of ALS. Currently, treatment options for SCA2 and ALS are limited.
ｐｏｌｙＱの拡大に伴い発生するｐｏｌｙＱ疾患タンパク質の病原性機能は、核内封入体の発生に関連する毒性の増加、または可溶性毒性オリゴマーに関連する毒性の増加に起因し得る（Ｌａｊｏｉｅ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２０１１， ５： ｅ１５２４５）。ＳＣＡ２患者の脳は、プルキンエ細胞の喪失を特徴とするが、ＳＣＡ２プルキンエ細胞は、封入体を欠いているため、ｐｏｌｙＱで拡大したアタキシン－２が封入体形成とは無関係の毒性を引き起こし得ることを示している（Ｈｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ．， １９９９， ４５： ２３２－２４１）。ｐｏｌｙＱ拡大アタキシン－２で得られる機能としては、ゴルジ体における異常な蓄積（ｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ２００３， １２： １４８５－１４９６）、正常機能の獲得（Ｄｕｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ， ２０１０， ６７： ９２９－９３５）、ならびに他のｐｏｌｙＱタンパク質と同様に転写因子（ＴＦ）、及びグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼの封鎖（Ｙａｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２０１０： ６４８， ２１５－２２９、Ｋｏｓｈｙ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， １９９６， ５： １３１１－１３１８、Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， １９９６， ２： ３４７－３５０）が挙げられる。アタキシン－２のいくつかの正常な機能が、特徴付けられている。アタキシン－２は、ストレス顆粒、及びＰ体に存在し、このことは、ｍＲＮＡの封鎖、及びストレス中のタンパク質翻訳調節で機能することを示唆している（Ｎｏｎｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，２００７，１８：１３８５－１３９６）。アタキシン－２の過剰発現は、Ｐ体アセンブリを妨げ、一方、過小発現は、ストレス顆粒アセンブリを妨げた（Ｎｏｎｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ， ２００７， １８： １３８５－１３９６）。ポリＡ結合タンパク質１、ＲＮＡスプライシング因子Ａ２ＢＰ１／Ｆｏｘ１、及びポリリボソームとの相互作用は、ＲＮＡ代謝におけるアタキシン－２の役割を更に裏付ける（Ｓｈｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ２０００， ９： １３０３－１３１３、Ｃｉｏｓｋ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ２００４， １３１： ４８３１－４８４１、Ｓａｔｔｅｒｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ２００６， １５： ２５２３－２５３２）。アタキシン－２は、ＳＲＣキナーゼ、及びエンドサイトーシスタンパク質ＣＩＮ８５との相互作用による、ＥＧＦ受容体の内部移行、及びシグナル伝達の調節因子である（Ｎｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ．， ２００８， ２０： １７２５－ １７３９）。アタキシン－２はまた、ＡＬＳ関連タンパク質ＴＤＰ－４３とＲＮＡ依存的に相互作用し、家族性、及び孤発性ＡＬＳは、長い正常なＣＡＧリピート拡大ＡＴＸＮ２の発生と関連している（Ｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２０１０， ４６６： １０６９－１０７５、Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ２０１１， ７６： ２０６６－２０７２）。The pathogenic function of polyQ disease proteins that develop upon polyQ expansion may result from increased toxicity associated with the development of intranuclear inclusions or increased toxicity associated with soluble toxic oligomers (Lajoie et al., PLoS One, 2011, 5: e15245). Although the brains of SCA2 patients are characterized by Purkinje cell loss, SCA2 Purkinje cells lack inclusions, indicating that polyQ-expanded ataxin-2 can cause toxicity independent of inclusion formation (Huynh et al., Ann. Neurol., 1999, 45: 232-241). The functions conferred by polyQ-expanded ataxin-2 include abnormal accumulation in the Golgi apparatus (Uynh et al., Hum. Mol. Genet., 2003, 12: 1485-1496), gain of normal function (Duvick et al., Neuron, 2010, 67: 929-935), and sequestering of transcription factors (TFs) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, as well as other polyQ proteins (Yamanaka et al., Methods Mol. Biol., 2010, 648, 215-229; Koshy et al., Hum. Mol. Genet., 1996, 5: 1311-1318; Burke et al., J. Immunol., 2010, 67: 929-935). et al., Nat. Med., 1996, 2: 347-350). Several normal functions of ataxin-2 have been characterized. Ataxin-2 is present in stress granules and P bodies, suggesting that it functions in sequestration of mRNA and regulation of protein translation during stress (Nonhoff et al., Mol. Biol. Cell, 2007, 18: 1385-1396). Overexpression of ataxin-2 prevented P body assembly, whereas underexpression prevented stress granule assembly (Nonhoff et al., Mol. Biol. Cell, 2007, 18: 1385-1396). Interactions with poly(A)-binding protein 1, the RNA splicing factor A2BP1/Fox1, and polyribosomes further support a role for ataxin-2 in RNA metabolism (Shibata et al., Hum. Mol. Genet., 2000, 9: 1303-1313; Ciosk et al., Development, 2004, 131: 4831-4841; Satterfield et al., Hum. Mol. Genet., 2006, 15: 2523-2532). Ataxin-2 is a regulator of EGF receptor internalization and signal transduction through interactions with SRC kinase and the endocytic protein CIN85 (Nonis et al., Cell Signal., 2008, 20: 1725-1739). Ataxin-2 also interacts with the ALS-associated protein TDP-43 in an RNA-dependent manner, and familial and sporadic ALS are associated with the occurrence of the long normal CAG repeat expansion ATXN2 (Elden et al., Nature, 2010, 466: 1069-1075; Van Damme et al., Neurology, 2011, 76: 2066-2072).
ＳＣＡ２は、小脳、脳幹、及び脊髄における、ニューロンの進行性の機能性、及び細胞性の喪失を特徴とする、常染色体優性の神経変性疾患である。ＳＣＡ２の原因は、ＡＴＸＮ２遺伝子のＣＡＧ拡大であり、アタキシン－２タンパク質中のポリグルタミン（ｐｏｌｙＱ）拡大をもたらす。ＳＣＡ２患者は、進行性の小脳失調症、遅いサッケード眼球運動、及び神経障害等の他の神経学的特徴によって特徴付けけられる（Ｐｕｌｓｔ， Ｓ．Ｍ． （ｅｄ．）， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｉｎｃ．， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， ２００３， ｐｐ．１９－３４）。ＡＴＸＮ２遺伝子における中程度のＣＡＧ拡大は、パーキンソニズム、またはこれらの疾患の特発性型と区別不能なＡＬＳにも関連している（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｎｅｕｒｏｌ．， ２００７， ６４： １５１０－１５１８、Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ２０１１， ２０： ３２０７－３２１２、Ｃｏｒｒａｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， ２０１１， １３０： ５７５－５８０、Ｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２０１０， ４６６： １０６９－１０７５、Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ２０１１， ７６： ２０６６－２０７２）。SCA2 is an autosomal dominant neurodegenerative disorder characterized by progressive functional and cellular loss of neurons in the cerebellum, brainstem, and spinal cord. SCA2 is caused by a CAG expansion in the ATXN2 gene, resulting in a polyglutamine (polyQ) expansion in the ataxin-2 protein. SCA2 patients are characterized by other neurological features, such as progressive cerebellar ataxia, slow saccadic eye movements, and neuropathy (Pulst, S.M. (ed.), Genetics of Movement Disorders. Elsevier, Inc., Amsterdam, 2003, pp. 19-34). Moderate CAG expansions in the ATXN2 gene have also been associated with parkinsonism or ALS indistinguishable from idiopathic forms of these diseases (Kim et al., Arch. Neurol., 2007, 64: 1510-1518; Ross et al., Hum. Mol. Genet., 2011, 20: 3207-3212; Corrado et al., Hum. Genet., 2011, 130: 575-580; Elden et al., Nature, 2010, 466: 1069-1075; Van Damme et al., Neurology, 2011, 76: 2066-2072).
ＡＴＸＮ２ポリグルタミンリピートが３４以上の長さまで拡大すると、ＳＣＡ２が引き起こされる。更に、ＡＴＸＮ２における中程度の長さのポリグルタミンの拡大は、ＡＬＳのリスクを増加させる。ＡＴＸＮ２レベルの低下は、脊髄小脳失調症－２、及びＡＬＳの動物モデルでは、治療上の利益を有することが実証されている。核酸ベースの療法を使用したＡＴＸＮ２タンパク質のノックダウンは、拡大されたポリグルタミンリピートを含有する、ヒトＡＴＸＮ２のバリアントを発現する動物モデルで生じる、進行性の神経変性を軽減する。ＡＬＳ患者に見られる最も一般的な神経病変の構成要素である、ＴＤＰ－４３タンパク質を過剰発現している、ＡＬＳの動物モデルでは、動物は、通常、運動ニューロンの進行性死滅を発症する。しかしながら、これらの動物を、ＡＴＸＮ２ノックアウトマウスと繁殖させると、生存時間が劇的に増加した（Ｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （２０１０） ４６６：７３１０）。同様に、アンチセンスオリゴヌクレオチド核酸の導入によってＡＴＸＮ２タンパク質レベルを低下させることによって、ＴＤＰ－４３トランスジェニックマウスの生存も増加した。ＡＴＸＮ２レベルを低下させると、ＴＤＰ－４３トランスジェニックマウスの寿命が著しく延び、運動機能が改善され、ＴＤＰ－４３封入体の負荷が減少した。ＡＸＴＮ２は、ＴＤＰ－４３の凝集傾向に影響を与えることによって毒性を調節し得る。ＴＤＰ－４３プロテオパチーは、ＡＬＳ、前頭側頭葉認知症（ＦＴＬＤ）、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症、慢性外傷性脳症、レビー小体型認知症、皮質基底変性症、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、グアム複合パーキンソン認知症（Ｇ－ＰＤＣ）、ピック病、海馬硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病を含む、数多くの神経変性疾患で観察されている。したがって、ＡＴＸＮ２レベルの低下は、ＡＴＸＮ２が原因物質（例えばＳＣＡ２）である神経変性疾患、ならびにＡＴＸＮ２が原因物質ではないがＴＤＰ－４３の病理学的凝集を調節する神経変性疾患の治療に有用な可能性がある。Expansion of ATXN2 polyglutamine repeats to lengths of 34 or more causes SCA2. Furthermore, moderate-length polyglutamine expansions in ATXN2 increase the risk of ALS. Reducing ATXN2 levels has been demonstrated to have therapeutic benefit in animal models of spinocerebellar ataxia-2 and ALS. Knockdown of ATXN2 protein using nucleic acid-based therapy attenuates the progressive neurodegeneration that occurs in animal models expressing a variant of human ATXN2 containing an expanded polyglutamine repeat. In animal models of ALS overexpressing the TDP-43 protein, a component of the most common neuropathology seen in ALS patients, animals typically develop progressive motor neuron death. However, breeding these animals with ATXN2 knockout mice dramatically increased survival time (Elden et al., Nature (2010) 466:7310). Similarly, reducing ATXN2 protein levels by introducing antisense oligonucleotide nucleic acids increased the survival of TDP-43 transgenic mice. Reducing ATXN2 levels significantly extended the lifespan of TDP-43 transgenic mice, improved motor function, and reduced the burden of TDP-43 inclusions. AXTN2 may regulate TDP-43 toxicity by affecting its aggregation tendency. TDP-43 proteopathy has been observed in numerous neurodegenerative diseases, including ALS, frontotemporal lobe dementia (FTLD), primary lateral sclerosis, progressive muscular atrophy, limbic-predominant senile TDP-43 encephalopathy, chronic traumatic encephalopathy, dementia with Lewy bodies, corticobasal degeneration, progressive supranuclear palsy (PSP), Guam Parkinsonism-Dementia Complex (G-PDC), Pick's disease, hippocampal sclerosis, Huntington's disease, Parkinson's disease, and Alzheimer's disease. Therefore, reducing ATXN2 levels may be useful in treating neurodegenerative diseases in which ATXN2 is a causative agent (e.g., SCA2), as well as neurodegenerative diseases in which ATXN2 is not a causative agent but regulates the pathological aggregation of TDP-43.
本開示の態様は、干渉ＲＮＡ分子（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、人工ｍｉＲＮＡを含むマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））等の、対象に投与されると、対象におけるアタキシン－２の発現または活性。したがって、本開示で提供される組成物、及び方法は、ＳＣＡ２、ＡＬＳ、ハンチントン病、アルツハイマー病、ＦＴＬＤ、パーキンソニズム、及びＴＤＰ－４３プロテオパチーに関連する状態を含む、神経変性疾患の治療に有用である。Aspects of the present disclosure relate to interfering RNA molecules (e.g., small interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), microRNA (miRNA), including artificial miRNA), which, when administered to a subject, inhibit the expression or activity of ataxin-2 in the subject. Accordingly, the compositions and methods provided herein are useful for treating neurodegenerative diseases, including conditions associated with SCA2, ALS, Huntington's disease, Alzheimer's disease, FTLD, parkinsonism, and TDP-43 proteopathy.
阻害性核酸
一態様では、本開示は、アタキシン２（ＡＴＸＮ２）の発現、または活性を阻害する、単離された阻害性核酸を提供する。阻害性核酸は、ＡＴＸＮ２ ＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ等の、ＡＴＸＮ２核酸の少なくとも一部に特異的に結合し（例えば、それとハイブリダイズし）、その発現、または活性を阻害する核酸である。いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、ＡＴＸＮ２のタンパク質コード領域、または非コード領域（例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、イントロン等）に相補的である。いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、野生型ＡＴＸＮ２核酸、またはその天然に存在するバリアントに相補的である。いくつかの実施形態では、ＡＴＸＮ２アレルは、約２２のＣＡＧトリヌクレオチドリピートを含有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＸＮ２アレルは、少なくとも２２のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも２３のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも２４のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも２５のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも２６のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも２７のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも２８のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも２９のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも３０のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも３１のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも３２のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも３３のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも３４のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも３５のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも３６のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも３７のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも３８のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも３９のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも４０のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも５０のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも６０のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも７０のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも８０のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、少なくとも９０のＣＡＧトリヌクレオチドリピート、または少なくとも１００、もしくは超のＣＡＧトリヌクレオチドリピートを有する。いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、一本鎖、または二本鎖である。いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、干渉ＲＮＡ分子、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または二本鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。 Inhibitory Nucleic Acids In one aspect, the present disclosure provides isolated inhibitory nucleic acids that inhibit the expression or activity of ataxin 2 (ATXN2). An inhibitory nucleic acid is a nucleic acid that specifically binds to (e.g., hybridizes with) at least a portion of an ATXN2 nucleic acid, such as ATXN2 RNA, pre-mRNA, or mRNA, and inhibits its expression or activity. In some embodiments, the inhibitory nucleic acid is complementary to a protein-coding region or a non-coding region (e.g., 5' UTR, 3' UTR, intron, etc.) of ATXN2. In some embodiments, the inhibitory nucleic acid is complementary to a wild-type ATXN2 nucleic acid or a naturally occurring variant thereof. In some embodiments, an ATXN2 allele contains approximately 22 CAG trinucleotide repeats. In some embodiments, the ATXN2 allele has at least 22 CAG trinucleotide repeats, at least 23 CAG trinucleotide repeats, at least 24 CAG trinucleotide repeats, at least 25 CAG trinucleotide repeats, at least 26 CAG trinucleotide repeats, at least 27 CAG trinucleotide repeats, at least 28 CAG trinucleotide repeats, at least 29 CAG trinucleotide repeats, at least 30 CAG trinucleotide repeats, at least 31 CAG trinucleotide repeats, at least 32 CAG trinucleotide repeats, at least 33 CAG trinucleotide repeats, at least 34 The inhibitory nucleic acid may have at least 35 CAG trinucleotide repeats, at least 36 CAG trinucleotide repeats, at least 37 CAG trinucleotide repeats, at least 38 CAG trinucleotide repeats, at least 39 CAG trinucleotide repeats, at least 40 CAG trinucleotide repeats, at least 50 CAG trinucleotide repeats, at least 60 CAG trinucleotide repeats, at least 70 CAG trinucleotide repeats, at least 80 CAG trinucleotide repeats, at least 90 CAG trinucleotide repeats, or at least 100 or more CAG trinucleotide repeats. In some embodiments, the inhibitory nucleic acid is single-stranded or double-stranded. In some embodiments, the inhibitory nucleic acid is an interfering RNA molecule, such as a short interfering RNA (siRNA), a short hairpin RNA (shRNA), a microRNA (miRNA), or a double-stranded RNA (shRNA).
いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、ｍｉＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、ｐｒｉ－ｍＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、または人工ｍｉＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ガイド鎖、及びパッセンジャー鎖から構成される。いくつかの実施形態では、ガイド鎖、及びパッセンジャー鎖は、同一の核酸鎖内にあり、ガイド鎖、及びパッセンジャー鎖は、互いにハイブリダイズして、自己アニーリングデュプレックス構造を形成する。ｍｉＲＮＡは、最初に、ｐｒｉ－ｍＲＮＡとして転写され、これは、核ヌクレアーゼ（例えば、Ｄｒｏｓｉａ－ＤＧＣＲ８複合体）によってプロセシングされてｐｒｅ－ｍＲＮＡとなる。ｐｒｉ－ｍＲＮＡは、ステム－ループ構造を有する一本鎖分子である。ｐｒｅ－ｍＲＮＡもまた、ステム－ループ構造を有する一本鎖分子である。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ｅｘｐｏｒｔｉｎ－５によって核から細胞質に輸送され、更にＤｉｃｅｒによってプロセシングされて、ガイド鎖、及びパッセンジャー鎖を含む成熟二本鎖ｍｉＲＮＡデュプレックスが生成される。成熟ｍｉＲＮＡ二重鎖は、次いで、ＴＲＢＰ（ＨＩＶトランス活性化応答ＲＮＡ結合タンパク質）によって媒介される、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。パッセンジャー鎖は、一般に、放出され、切断されるが、一方、ガイド鎖は、ＲＩＳＣ内に残留し、標的ｍＲＮＡに結合し、サイレンシングを媒介する。いくつかの実施形態では、成熟ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡデュプレックスのガイド鎖を指す。In some embodiments, the inhibitory nucleic acid is a miRNA. The miRNA can be a pri-mRNA, pre-mRNA, mature miRNA, or artificial miRNA. In some embodiments, the miRNA is composed of a guide strand and a passenger strand. In some embodiments, the guide strand and passenger strand are within the same nucleic acid strand, and the guide strand and passenger strand hybridize to each other to form a self-annealing duplex structure. The miRNA is initially transcribed as a pri-mRNA, which is processed by nuclear nucleases (e.g., the Drosia-DGCR8 complex) to become a pre-mRNA. The pri-mRNA is a single-stranded molecule with a stem-loop structure. The pre-mRNA is also a single-stranded molecule with a stem-loop structure. The pre-miRNA is transported from the nucleus to the cytoplasm by exportin-5 and further processed by Dicer to generate a mature double-stranded miRNA duplex containing a guide strand and a passenger strand. The mature miRNA duplex is then incorporated into the RNA-induced silencing complex (RISC) mediated by TRBP (HIV transactivation response RNA-binding protein). The passenger strand is generally released and cleaved, while the guide strand remains within the RISC, binds to the target mRNA, and mediates silencing. In some embodiments, mature miRNA refers to the guide strand of the mature miRNA duplex.
人工ｍｉＲＮＡとは、機能的成熟ｍｉＲＮＡを産生することができる、内因性、修飾、または合成の、ｐｒｉ－ｍＲＮＡ、またはｐｒｅ－ｍＲＮＡのスキャフォールド、または骨格を指し、ステム領域内のｍｉＲＮＡデュプレックスのガイド鎖配列、及びパッシブ鎖配列が、目的の標的ｍＲＮＡのサイレンシングを指示する、目的のガイド鎖配列、及びパッシブ鎖配列で置き換えられている。人工ｍｉＲＮＡ設計は、Ｅａｍｅｎｓ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １０６２：２１１－２４（その全体が参照により組み込まれる）に記載される。合成ｍｉＲＮＡ骨格は、米国特許公開第２００８／０３１３７７３号（その全体が参照により組込まれる）に記載される。Artificial miRNA refers to an endogenous, modified, or synthetic pri-mRNA or pre-mRNA scaffold or backbone capable of producing a functional mature miRNA, in which the guide and passive strand sequences of the miRNA duplex within the stem region are replaced with desired guide and passive strand sequences that direct the silencing of a target mRNA of interest. Artificial miRNA design is described in Eamens et al. (2014) Methods Mol Biol. 1062:211-24 (incorporated by reference in its entirety). Synthetic miRNA backbones are described in U.S. Patent Publication No. 2008/0313773 (incorporated by reference in its entirety).
本明細書に記載の干渉ＲＮＡ構築物等の阻害性核酸構築物は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ等の様々な形態のいずれかであり得る。本明細書に記載の干渉ＲＮＡは、更に、ウイルスベクター等のベクターによってコードされ得る。例えば、野生型、または変異体ＲＮＡ転写産物（例えば、拡大されたヌクレオチリピートを有するＲＮＡ転写産物）の発現を減弱する、干渉ＲＮＡ構築物をコードする導入遺伝子を含む、偽型ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ２／８、及びＡＡＶ２／９ベクター）等の、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、本明細書に記載される。Inhibitory nucleic acid constructs, such as the interfering RNA constructs described herein, can be in any of a variety of forms, such as siRNA, shRNA, or miRNA. The interfering RNAs described herein can also be encoded by a vector, such as a viral vector. For example, adeno-associated virus (AAV) vectors, such as pseudotyped AAV vectors (e.g., AAV2/8 and AAV2/9 vectors), are described herein that contain a transgene encoding an interfering RNA construct that attenuates expression of a wild-type or mutant RNA transcript (e.g., an RNA transcript with an expanded nucleotide repeat).
本明細書に記載の組成物、及び方法は、数ある利点の中でも、拡大したヌクレオチドリピート領域を含有する他のＲＮＡの中で、野生型、または病原ＲＮＡ転写産物の発現を選択的に抑制することができるという有利な特徴を提供する。この特性は、ヒト患者のゲノム等の、哺乳動物ゲノム中の、ヌクレオチドリピートの有病率を考慮して特に有益である。本明細書に記載の組成物、及び方法を使用して、重要な健常ＲＮＡ転写産物、及びそれらのコードされたタンパク質産物の発現を維持しながら、病的なヌクレオチドリピートの拡大を含む野生型、または変異型ＲＮＡ転写産物の発現を減少させることができる。Among other benefits, the compositions and methods described herein offer the advantageous feature of being able to selectively suppress the expression of wild-type or pathogenic RNA transcripts among other RNAs containing expanded nucleotide repeat regions. This property is particularly beneficial given the prevalence of nucleotide repeats in mammalian genomes, such as those of human patients. The compositions and methods described herein can be used to reduce the expression of wild-type or mutant RNA transcripts containing pathological nucleotide repeat expansions while maintaining the expression of important healthy RNA transcripts and their encoded protein products.
この有利な特徴は、野生型、またはリピート拡大されたＲＮＡ標的にアニーリングする阻害性核酸構築物を使用して、これらのＲＮＡ転写産物の発現を抑制することができるという驚くべき発見に部分的に基づく。したがって、本明細書に記載の組成物、及び方法は、野生型、または病原ＲＮＡ転写産物の発現を減弱することができる。This advantageous feature is based, in part, on the surprising discovery that inhibitory nucleic acid constructs that anneal to wild-type or repeat-expanded RNA targets can be used to suppress expression of these RNA transcripts. Thus, the compositions and methods described herein can attenuate expression of wild-type or pathogenic RNA transcripts.
以下のセクションでは、本明細書に記載の組成物、及び方法と組み合わせて使用してもよい、干渉ＲＮＡ構築物等の例示的な阻害性核酸構築物の記載、ならびにそのような構築物をコードするベクター、及び野生型、または変異型ＡＴＸＮ２の発現に関連する疾患を治療することを含む、使用され得る手順の記載を提供する。The following sections provide a description of exemplary inhibitory nucleic acid constructs, such as interfering RNA constructs, that may be used in conjunction with the compositions and methods described herein, as well as vectors encoding such constructs and procedures that may be used, including to treat diseases associated with expression of wild-type or mutant ATXN2.
干渉ＲＮＡ
本明細書に記載の組成物、及び方法を使用して、野生型、または変異型ＡＴＸＮ２の発現を特徴とする疾患を有する患者に、干渉ＲＮＡ分子、それを含有する組成物、またはそれをコードするベクターを投与することによって、ＲＮＡ転写産物の発現を抑制することができる。 Interfering RNA
The compositions and methods described herein can be used to suppress expression of RNA transcripts by administering interfering RNA molecules, compositions containing same, or vectors encoding same to patients having diseases characterized by expression of wild-type or mutant ATXN2.
ＳＣＡ２、ＡＬＳ、ハンチントン病、ＦＴＤ、ＴＤＰ－４３プロテオパチー、パーキンソン病等の、野生型、または変異型ＡＴＸＮ２の発現に関連する疾患の治療のために、本明細書に記載の組成物、及び方法と組み合わせて使用してもよい、例示的な干渉ＲＮＡ分子は、とりわけ、ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、及びｓｈＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡ分子の場合、ｓｉＲＮＡは、一本鎖、または二本鎖であり得る。ｍｉＲＮＡ分子は、対照的に、ヘアピンを形成する一本鎖分子であり、それによって、核酸デュプレックスを連想させる水素結合構造を採用する。いずれの場合も、干渉ＲＮＡは、リピート拡大した変異ＲＮＡ標的にアニールする（例えば、相補性を介して）、アンチセンス、または「ガイド」鎖を含有し得る。干渉ＲＮＡはまた、ガイド鎖に相補的な「パッセンジャー」鎖を含有し得、したがって、ＲＮＡ標的と同一の核酸配列を有し得る。Exemplary interfering RNA molecules that may be used in combination with the compositions and methods described herein for the treatment of diseases associated with wild-type or mutant ATXN2 expression, such as SCA2, ALS, Huntington's disease, FTD, TDP-43 proteopathy, and Parkinson's disease, are siRNA molecules, miRNA molecules, and shRNA molecules, among others. In the case of siRNA molecules, the siRNA can be single-stranded or double-stranded. miRNA molecules, in contrast, are single-stranded molecules that form hairpins, thereby adopting a hydrogen-bonding structure reminiscent of a nucleic acid duplex. In either case, the interfering RNA can contain an antisense, or "guide," strand that anneals (e.g., via complementarity) to the repeat-expanded mutant RNA target. The interfering RNA can also contain a "passenger" strand that is complementary to the guide strand and, therefore, can have the same nucleic acid sequence as the RNA target.
ＡＴＸＮ２ ＲＮＡにアニールする例示的な干渉ＲＮＡ分子は、以下の表２に示される野生型、または変異型ＡＴＸＮ２の発現に関連する疾患の治療のために、本明細書に記載の組成物、及び方法と組み合わせて使用することができる。
野生型または変異ＡＴＸＮ２の発現を特徴とする疾患の治療方法
本明細書に記載の組成物、及び方法を使用して、とりわけ、ＳＣＡ２、ＡＬＳ、ハンチントン病、ＦＴＤ、ＴＤＰ－４３プロテオパチー、パーキンソン病等の、野生型、または変異型ＡＴＸＮ２の発現に関連する疾患を経験している、及び／またはそれを有する患者に、干渉ＲＮＡ構築物、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはそれをコードするベクター等の阻害性核酸構築物を投与して、野生型、または変異型ＲＮＡ転写産物の発現を低下させることができる。 Methods of Treating Diseases Characterized by Expression of Wild-Type or Mutant ATXN2 Using the compositions and methods described herein, patients experiencing and/or having diseases associated with expression of wild-type or mutant ATXN2, such as SCA2, ALS, Huntington's disease, FTD, TDP-43 proteopathy, Parkinson's disease, among others, can be administered an inhibitory nucleic acid construct, such as an interfering RNA construct, e.g., a small interfering RNA (siRNA), a short hairpin RNA (shRNA), a microRNA (miRNA), or a vector encoding the same, to reduce expression of the wild-type or mutant RNA transcript.
別の態様では、本開示は、細胞におけるＡＴＸＮ２の発現、または活性を阻害するための方法を提供し、方法は、本開示の組成物（例えば、阻害性核酸、阻害性核酸をコードする発現構築物を含む単離された核酸、ベクター、ｒＡＡＶ粒子、医薬組成物）を細胞に投与し、それによって、細胞におけるＡＴＸＮ２の発現、または活性を阻害することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＮＳ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＮＳの非神経細胞、または神経細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＮＳの非神経細胞は、グリア細胞、アストロサイト、またはミクログリア細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、インビトロである。いくつかの実施形態では、細胞は、神経変性疾患の１つ、もしくは複数の症状を有するか、または神経変性疾患を有する疑いのある対象に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または超のＣＡＧトリヌクレオチド（ポリグルタミン）リピートを有するＡＴＸＮ２を発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、約２２、もしくは２３のリピート、２４～３２のリピート、または３３～１００、もしくは超のリピートを有するＡＴＸＮ２を発現する。In another aspect, the disclosure provides a method for inhibiting ATXN2 expression or activity in a cell, the method comprising administering to the cell a composition of the disclosure (e.g., an inhibitory nucleic acid, an isolated nucleic acid comprising an expression construct encoding the inhibitory nucleic acid, a vector, an rAAV particle, a pharmaceutical composition), thereby inhibiting ATXN2 expression or activity in the cell. In some embodiments, the cell is a CNS cell. In some embodiments, the cell is a non-neuronal cell of the CNS or a neuronal cell. In some embodiments, the non-neuronal cell of the CNS is a glial cell, an astrocyte, or a microglial cell. In some embodiments, the cell is in vitro. In some embodiments, the cell is derived from a subject having one or more symptoms of a neurodegenerative disease or suspected of having a neurodegenerative disease. In some embodiments, the cells express ATXN2 with at least 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, or more CAG trinucleotide (polyglutamine) repeats. In some embodiments, the cells express ATXN2 with about 22 or 23 repeats, 24-32 repeats, or 33-100, or more repeats.
別の態様では、本開示は、対象の中枢神経系におけるＡＴＸＮ２の発現、または活性を阻害するための方法を提供し、方法は、本開示の組成物（例えば、阻害性核酸、阻害性核酸をコードする発現構築物を含む単離された核酸、ベクター、ｒＡＡＶ粒子、医薬組成物）を対象に投与し、それによって、細胞におけるＡＴＸＮ２の発現、または活性を阻害することを含む。In another aspect, the present disclosure provides a method for inhibiting ATXN2 expression or activity in the central nervous system of a subject, the method comprising administering to the subject a composition of the present disclosure (e.g., an inhibitory nucleic acid, an isolated nucleic acid comprising an expression construct encoding the inhibitory nucleic acid, a vector, an rAAV particle, or a pharmaceutical composition), thereby inhibiting ATXN2 expression or activity in the cell.
別の態様では、本開示は、神経変性疾患を有するか、または有することが疑われる対象を治療するための方法を提供し、方法は、本開示の組成物（例えば、阻害性核酸、阻害性核酸をコードする発現構築物を含む単離された核酸、ベクター、ｒＡＡＶ粒子、医薬組成物）を対象に投与し、それによって、対象を治療することを含む。本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、神経変性疾患（例えば、ＳＣＡ２、ＡＬＳ／ＦＴＬＤ、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病等）の発症を予防する、または遅延させることと、神経変性疾患の重症度を軽減することと、神経変性疾患に特徴的な症状の発症を軽減、または予防することと、神経変性疾患に特徴的な症状の悪化を予防することと、またはそれらの任意の組み合わせを含む。In another aspect, the present disclosure provides a method for treating a subject having or suspected of having a neurodegenerative disease, the method comprising administering to the subject a composition of the present disclosure (e.g., an inhibitory nucleic acid, an isolated nucleic acid comprising an expression construct encoding an inhibitory nucleic acid, a vector, an rAAV particle, a pharmaceutical composition) thereby treating the subject. As used herein, the term "treating" includes preventing or delaying the onset of a neurodegenerative disease (e.g., SCA2, ALS/FTLD, Huntington's disease, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, etc.), reducing the severity of a neurodegenerative disease, reducing or preventing the onset of symptoms characteristic of a neurodegenerative disease, preventing the worsening of symptoms characteristic of a neurodegenerative disease, or any combination thereof.
本開示の組成物を使用して対象で治療され得る神経変性疾患としては、ＡＴＸＮ２が原因物質（例えば、ＳＣＡ２）である神経変性疾患、ならびにＡＴＸＮ２が原因物質（例えば、直接的な原因）ではないが、ＴＤＰ－４３の病理学的凝集を変更する神経変性疾患が挙げられる。Neurodegenerative diseases that can be treated in a subject using the compositions of the present disclosure include neurodegenerative diseases in which ATXN2 is a causative agent (e.g., SCA2), as well as neurodegenerative diseases in which ATXN2 is not a causative agent (e.g., a direct cause) but alters the pathological aggregation of TDP-43.
ＴＤＰ－４３プロテオパチーに関連する神経変性疾患としては、ＡＬＳ、ＦＴＬＤ、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、大脳辺縁系優位型老年期ＴＤＰ－４３脳症、慢性外傷性脳症、レビー小体を伴う認知症、皮質基底核変性、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、グアム複合パーキンソン認知症（Ｇ－ＰＤＣ）、ピック病、ペリー症候群、脳加齢関連ＴＤＰ－４３硬化症（ＣＡＲＴＳ）、海馬硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、及びアルツハイマー病が挙げられる。Neurodegenerative diseases associated with TDP-43 proteopathy include ALS, FTLD, primary lateral sclerosis, progressive muscular atrophy, limbic-predominant senile TDP-43 encephalopathy, chronic traumatic encephalopathy, dementia with Lewy bodies, corticobasal degeneration, progressive supranuclear palsy (PSP), Guam Parkinsonism-Dementia Complex (G-PDC), Pick's disease, Perry syndrome, cerebral aging-related TDP-43 sclerosis (CARTS), hippocampal sclerosis, Huntington's disease, Parkinson's disease, and Alzheimer's disease.
いくつかの実施形態では、神経変性疾患は、ＳＣＡ２である。いくつかの実施形態では、ＳＣＡ２を有する対象は、ＡＴＸＮ２遺伝子座に複数のＣＡＧトリヌクレオチドリピート変異、例えば、少なくとも３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００のＣＡＧリピートを有する対象であり得る。ＡＴＸＮ２は、Ｇｉｕｎｔｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｒａｉｎ １２１， ４５９－４６７ （１９９８）に記載されるように、ＳＣＡ２を治療するための確認された標的である。In some embodiments, the neurodegenerative disease is SCA2. In some embodiments, a subject with SCA2 can have multiple CAG trinucleotide repeat mutations at the ATXN2 locus, e.g., at least 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or 100 CAG repeats. ATXN2 is a validated target for treating SCA2, as described in Giunti et al. Brain 121, 459-467 (1998).
いくつかの実施形態では、神経変性疾患は、ＡＬＳである。いくつかの実施形態では、ＡＬＳを有する対象は、ＡＴＸＮ２遺伝子座に複数のＣＡＧトリヌクレオチドリピート変異、例えば、少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０のＣＡＧリピートを有する対象であり得る。ＡＴＸＮ２は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（８）： ｅ１０５５３４ （２０１４））に記載されるように、ＡＬＳを治療するための確認された標的である。In some embodiments, the neurodegenerative disease is ALS. In some embodiments, the subject with ALS can be a subject with multiple CAG trinucleotide repeat mutations at the ATXN2 locus, e.g., at least 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, or 40 CAG repeats. ATXN2 is a validated target for treating ALS, as described in Wang et al. PLoS ONE 9(8): e105534 (2014).
いくつかの実施形態では、神経変性疾患は、ハンチントン病である。いくつかの実施形態では、ハンチントン病を有する対象は、上方制御されたＡＴＸＮ２を有する対象であり得る。ＡＴＸＮ２は、Ｘｕ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ １５（１０）： ｅ１００８３５６ （２０１９）に記載されるように、ハンチントン病を治療するための確認された標的である。In some embodiments, the neurodegenerative disease is Huntington's disease. In some embodiments, the subject with Huntington's disease can be a subject with upregulated ATXN2. ATXN2 is a validated target for treating Huntington's disease, as described in Xu et al. PLoS Genet 15(10): e1008356 (2019).
いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または超のＣＡＧトリヌクレオチド（ポリグルタミン）リピートを有する、ＡＴＸＮ２アレルを有すると特徴とする。いくつかの実施形態では、対象は、約２２、もしくは２３のリピート、２４～３２のリピート、または３３～１００、もしくは超のリピートを有する、ＡＴＸＮ２アレルを有することを特徴とする。In some embodiments, the subject is characterized as having an ATXN2 allele having at least 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, or more CAG trinucleotide (polyglutamine) repeats. In some embodiments, the subject is characterized as having an ATXN2 allele having about 22 or 23 repeats, 24-32 repeats, or 33-100 or more repeats.
いくつかの実施形態では、本開示の治療方法は、神経変性疾患に特徴的な１つ以上の症状の発症、または進行を、軽減、予防、または遅延させる。神経変性疾患に特徴的な症状の例としては、運動機能障害、認知機能障害、情動／行動機能障害、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。麻痺、振戦、フラフラ、硬直、剛直、痙攣、筋力低下、筋痙攣、筋肉硬直、筋萎縮、嚥下困難、呼吸困難、発話、及び言語困難（例えば、不明瞭な発話）、動作緩慢、歩行困難、認知症、抑うつ、不安、またはそれらの任意の組み合わせ。In some embodiments, the therapeutic methods of the present disclosure reduce, prevent, or delay the onset or progression of one or more symptoms characteristic of a neurodegenerative disease. Examples of symptoms characteristic of a neurodegenerative disease include motor dysfunction, cognitive dysfunction, emotional/behavioral dysfunction, or any combination thereof. Paralysis, tremors, dizziness, stiffness, rigidity, convulsions, muscle weakness, muscle spasms, muscle rigidity, muscle atrophy, difficulty swallowing, difficulty breathing, speech and language difficulties (e.g., slurred speech), slowness of movement, difficulty walking, dementia, depression, anxiety, or any combination thereof.
いくつかの実施形態では、本開示の本開示の治療方法は、単剤療法として、または神経変性疾患の治療のための１つ以上の追加の治療と組み合わせて投与することを含む。併用療法は、本開示の組成物（例えば、阻害性核酸、阻害性核酸をコードする発現構築物を含む単離された核酸、ベクター、ｒＡＡＶ粒子、医薬組成物）を対象に、１つ以上の更なる療法と同時に、その前に、その後に投与することを意味し得る。併用療法の同時投与は、本開示の組成物（例えば、阻害性核酸、阻害性核酸をコードする発現構築物を含む単離された核酸、ベクター、ｒＡＡＶ粒子、医薬組成物）、及び追加の療法が、同一の剤形で投与されるように、または別々の剤形で投与されるように製剤化されることを意味し得る。In some embodiments, the therapeutic methods of the present disclosure include administration as a monotherapy or in combination with one or more additional therapies for the treatment of a neurodegenerative disease. Combination therapy can refer to the administration of a composition of the present disclosure (e.g., an inhibitory nucleic acid, an isolated nucleic acid comprising an expression construct encoding an inhibitory nucleic acid, a vector, an rAAV particle, a pharmaceutical composition) to a subject simultaneously with, before, or after one or more additional therapies. Simultaneous administration of a combination therapy can refer to the administration of a composition of the present disclosure (e.g., an inhibitory nucleic acid, an isolated nucleic acid comprising an expression construct encoding an inhibitory nucleic acid, a vector, an rAAV particle, a pharmaceutical composition) and an additional therapy formulated to be administered in the same dosage form or in separate dosage forms.
いくつかの実施形態では、本開示の阻害性核酸と組み合わせて使用され得る、１つ、または追加の療法としては、神経変性疾患関連遺伝子、もしくは転写産物を標的とする、阻害性核酸、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、神経変性関連遺伝子を標的とする遺伝子編集剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮベースの系）、酸化ストレスを低下させる薬剤、例えば、フリーラジカルスカベンジャー（例えば、Ｒａｄｉｃａｖａ（エダラボン）、ブロモクリプチン）、抗グルタミン酸剤（例えば、リルゾール、トピラメート、ラモトリジン、デキストロメトルファン、ガバペンチン、及びＡＭＰＡ受容体拮抗薬（例えば、タランパネル））、抗アポトーシス剤（例えば、ミノサイクリン、フェニル酪酸ナトリウム、アリモクロモール）、抗炎症剤（例えば、ガングリオシド、セレコキシブ、シクロスポリン、ニメスリド、アザチオプリン、シクロホスファミド、プラズマフェレーシス、酢酸グラチメラマー、及びサリドマイド）、ベータ－ラクタム系抗生物質（ペニシリン、及びその誘導体、セフトリアクソン、及びセファロスポリン）、ドーパミンアゴニスト（プラミペキソール、デエクスプラミペキソール）、及び神経栄養因子（例えば、ＩＧＦ－１、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＴＮＦ、ＶＥＧＦ、コリベリン、ザリプロデン、チロトロフィン放出ホルモン、及びＡＤＮＦ）が挙げられる。In some embodiments, one or more additional therapies that may be used in combination with the inhibitory nucleic acids of the present disclosure include inhibitory nucleic acids or antisense oligonucleotides that target neurodegenerative disease-associated genes or transcripts, gene editing agents that target neurodegeneration-associated genes (e.g., CRISPR-, TALEN-, and ZFN-based systems), agents that reduce oxidative stress, such as free radical scavengers (e.g., Radicava (edaravone), bromocriptine), antiglutamate agents (e.g., riluzole, topiramate, lamotrigine, dextromethorphan, gabapentin, and AMPA receptor antagonists (e.g., talampanel)). , anti-apoptotic agents (e.g., minocycline, sodium phenylbutyrate, arimoclomol), anti-inflammatory agents (e.g., gangliosides, celecoxib, cyclosporine, nimesulide, azathioprine, cyclophosphamide, plasmapheresis, glatimelamer acetate, and thalidomide), beta-lactam antibiotics (penicillin and its derivatives, ceftriaxone, and cephalosporins), dopamine agonists (pramipexole, dexpramipexole), and neurotrophic factors (e.g., IGF-1, GDNF, BDNF, CTNF, VEGF, colivelin, zaliproden, thyrotrophin-releasing hormone, and ADNF).
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかで治療される対象は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット）、好ましくは、霊長類（例えば、サル、チンパンジー）、またはヒトである。In some embodiments, the subject treated with any of the methods described herein is a mammal (e.g., mouse, rat), preferably a primate (e.g., monkey, chimpanzee), or a human.
本明細書に記載の治療方法のいずれかでは、本開示の組成物（例えば、阻害性核酸、阻害性核酸をコードする発現構築物を含む単離された核酸、ベクター、ｒＡＡＶ粒子、医薬組成物）を、視床内、髄腔内、下層、実質内、線条体内、頭蓋内、大槽内、脳内、脳室内、眼内（例えば、硝子体内）、心室内、腰部内、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内、経皮、非経口、鼻腔内、経皮、気管内、動脈内、血管内、及び経口投与、吸入、灌流、洗浄、またはそれらの任意の組み合わせを含む経路によって、対象に投与することができる。In any of the treatment methods described herein, the compositions of the present disclosure (e.g., inhibitory nucleic acids, isolated nucleic acids comprising expression constructs encoding inhibitory nucleic acids, vectors, rAAV particles, pharmaceutical compositions) can be administered to a subject by routes including intrathalamic, intrathecal, sublingual, intraparenchymal, intrastriatal, intracranial, intracisternal, intracerebral, intraventricular, intraocular (e.g., intravitreal), intraventricular, intralumbar, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, intradermal, transdermal, parenteral, intranasal, transdermal, intratracheal, intraarterial, intravascular, and oral administration, inhalation, perfusion, lavage, or any combination thereof.
いくつかの実施形態では、本開示の組成物（例えば、阻害性核酸、阻害性核酸をコードする発現構築物を含む単離された核酸、ベクター、ｒＡＡＶ粒子、医薬組成物）は、対象のＣＮＳに直接注入される。いくつかの実施形態では、ＣＮＳへの直接注入は、視床内注入、脳内注入、実質内注入、髄腔内注入、線条体内注入、軟膜下注入、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＣＮＳへの直接注入は、対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）への直接注入であり、任意選択的に、直接注入は、胸腔内注入、脳室内注入、腰部内注入、またはそれらの任意の組み合わせである。In some embodiments, a composition of the present disclosure (e.g., an inhibitory nucleic acid, an isolated nucleic acid comprising an expression construct encoding an inhibitory nucleic acid, a vector, an rAAV particle, a pharmaceutical composition) is directly injected into the CNS of a subject. In some embodiments, the direct injection into the CNS is intrathalamic, intracerebral, intraparenchymal, intrathecal, intrastriatal, subpial, or any combination thereof. In some embodiments, the direct injection into the CNS is direct injection into the cerebrospinal fluid (CSF) of a subject; optionally, the direct injection is intrapleural, intraventricular, intralumbar, or any combination thereof.
阻害性核酸の送達用ベクター
阻害性核酸送達用ウイルスベクター
ウイルスゲノムは、患者内の標的細胞（例えば、ヒト細胞等の哺乳動物細胞）のゲノムへの、目的の遺伝子の効率的な送達のために使用され得る、ベクターの豊富な供給源を提供する。ウイルスゲノムは、そのゲノム内に含有されるポリヌクレオチドが、典型的には、一般形質導入、または特殊形質導入によって、標的細胞のゲノムに組み込まれるため、特に有用な遺伝子送達用ベクターである。これらのプロセスは、天然のウイルス複製サイクルの一部として発生し、遺伝子組み込みを誘導するために、追加のタンパク質、または試薬を必要としない。本明細書に記載の組成物、及び方法と組み合わせて使用され得る、ウイルスベクターの例としては、ＡＡＶ、レトロウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄ５、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、及びＡｄ４８）、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルス、及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹、及びセンダイ）、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、ピコルナウイルス、及びアルファウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型、及び２型、エプスタイン－バーウイルス、サイトメガロウイルス）、及びポックスウイルス（例えば、ワクシニア、変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、鶏痘、及びカナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられる。本明細書に記載の組成物、及び方法と組み合わせて使用され得る、他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫ウイルス、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ－ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプマウイルスが挙げられる（Ｃｏｆｆｉｎ， Ｊ． Ｍ．， Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ： Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｂ． Ｎ． Ｆｉｅｌｄｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９６）。他の例としては、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内因性ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、マソン・ファイザー（Ｍａｓｏｎ Ｐｆｉｚｅｒ）サルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、及びレンチウイルスが挙げられる。ベクターの他の例としては、例えば、米国特許第５，８０１，０３０号に記載されており、その開示は、遺伝子療法における使用のためのウイルスベクターに関して、参照により本明細書に組み込まれる。 Vectors for Delivery of Inhibitory Nucleic Acids Viral Vectors for Delivery of Inhibitory Nucleic Acids Viral genomes provide a rich source of vectors that can be used for efficient delivery of genes of interest into the genomes of target cells (e.g., mammalian cells, such as human cells) within a patient. Viral genomes are particularly useful gene delivery vectors because the polynucleotides contained within their genomes are typically integrated into the genome of target cells by general transduction or specific transduction. These processes occur as part of the natural viral replication cycle and do not require additional proteins or reagents to induce gene integration. Examples of viral vectors that may be used in conjunction with the compositions and methods described herein include AAV, retroviruses, adenoviruses (e.g., Ad5, Ad26, Ad34, Ad35, and Ad48), parvoviruses (e.g., adeno-associated viruses), coronaviruses, negative-strand RNA viruses such as orthomyxoviruses (e.g., influenza viruses), rhabdoviruses (e.g., rabies virus and vesicular stomatitis virus), paramyxoviruses (e.g., measles and Sendai), positive-strand RNA viruses such as picornaviruses and alphaviruses, as well as double-stranded DNA viruses, including adenoviruses, herpesviruses (e.g., herpes simplex virus types 1 and 2, Epstein-Barr virus, cytomegalovirus), and poxviruses (e.g., vaccinia, mutant vaccinia Ankara (MVA), fowlpox, and canarypox). Other viruses that may be used in combination with the compositions and methods described herein include, for example, Norwalk virus, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus, and hepatitis virus. Examples of retroviruses include avian leukosis sarcoma viruses, mammalian type C, type B, and type D viruses, the HTLV-BLV complex, lentiviruses, and spumaviruses (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996). Other examples include murine leukemia viruses, murine sarcoma viruses, mouse mammary tumor virus, bovine leukemia virus, feline leukemia virus, feline sarcoma virus, avian leukemia virus, human T-cell leukemia virus, baboon endogenous virus, gibbon leukemia virus, Mason-Pfizer monkey virus, simian immunodeficiency virus, simian sarcoma virus, Rous sarcoma virus, and lentivirus. Other examples of vectors are described, for example, in U.S. Patent No. 5,801,030, the disclosure of which is incorporated herein by reference with respect to viral vectors for use in gene therapy.
核酸送達用ＡＡＶベクター
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の干渉ＲＮＡ構築物（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））等の阻害性核酸構築物は、細胞内へのそれらの導入を容易にするために、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターに組み込まれる。本明細書に記載の組成物、及び方法と組み合わせて有用なｒＡＡＶベクターとしては、（１）本明細書に記載の干渉ＲＮＡ構築物（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ等）のような阻害性核酸構築物をコードする導入遺伝子、及び（２）異種遺伝子の発現を促進する１つ以上の核酸を含有する、組み換え核酸構築物を含む。ウイルス核酸は、ビリオンへの、ＤＮＡの複製、及びパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）のためにシスで必要とされる、ＡＡＶのそれらの配列を含み得る。そのようなｒＡＡＶベクターは、マーカー遺伝子、またはレポーター遺伝子も含有し得る。有用なｒＡＡＶベクターは、１以上の天然ＡＡＶ遺伝子の全体、または一部を欠失しているが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持するものを含む。ＡＡＶ ＩＴＲは、特定の用途に好適な、任意の血清型（例えば、血清型２に由来するもの）であり得る。ｒＡＡＶベクターを使用するための方法は、例えば、Ｔａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｓｃｉ． ７：２７９－２９１ （２０００）， ａｎｄ Ｍｏｎａｈａｎ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ， Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ７：２４－３０ （２０００）に記載されており、これらの各々の開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関するので、参照により本明細書に組み込まれる。 AAV Vectors for Nucleic Acid Delivery In some embodiments, inhibitory nucleic acid constructs, such as the interfering RNA constructs described herein (e.g., small interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), or microRNA (miRNA)), are incorporated into recombinant AAV (rAAV) vectors to facilitate their introduction into cells. rAAV vectors useful in combination with the compositions and methods described herein include recombinant nucleic acid constructs containing (1) a transgene encoding an inhibitory nucleic acid construct, such as an interfering RNA construct described herein (e.g., siRNA, shRNA, or miRNA), and (2) one or more nucleic acids that drive the expression of a heterologous gene. The viral nucleic acid may include those sequences of AAV required in cis for DNA replication and packaging (e.g., functional ITRs) into virions. Such rAAV vectors may also contain a marker gene or reporter gene. Useful rAAV vectors include those lacking all or part of one or more native AAV genes but retaining functional flanking ITR sequences. AAV ITRs can be of any serotype suitable for a particular application, such as those derived from serotype 2. Methods for using rAAV vectors are described, for example, in Tal et al., J. Biomed. Sci. 7:279-291 (2000), and Monahan and Samulski, Gene Delivery 7:24-30 (2000), the disclosures of each of which are incorporated herein by reference as they relate to AAV vectors for gene delivery.
本明細書に記載の核酸、及びベクターは、核酸、またはベクターの細胞への導入を容易にするために、ｒＡＡＶビリオンに組み込むことができる。ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ビリオンの外側の非核酸部分を構成し、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子によってコードされている。ｃａｐ遺伝子は、ビリオンのアセンブリに必要な、３つのウイルスコートタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。ｒＡＡＶビリオンの構築は、例えば、米国特許第５，１７３，４１４号、同第５，１３９，９４１号、同第５，８６３，５４１号、同第５，８６９，３０５号、同第６，０５７，１５２号、及び同第６，３７６，２３７号、ならびにＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７６：７９１－８０１ （２００２）、及びＢｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７７：４２３－４３２ （２００３）に記載されており、それらの各々の開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。The nucleic acids and vectors described herein can be incorporated into rAAV virions to facilitate the introduction of the nucleic acids or vectors into cells. The AAV capsid protein constitutes the outer, non-nucleic acid portion of the virion and is encoded by the AAV cap gene. The cap gene encodes three viral coat proteins, VP1, VP2, and VP3, required for virion assembly. Construction of rAAV virions is described, for example, in U.S. Patent Nos. 5,173,414, 5,139,941, 5,863,541, 5,869,305, 6,057,152, and 6,376,237, as well as Rabinowitz et al., J. Virol. 76:791-801 (2002), and Bowles et al. , J. Virol. 77:423-432 (2003), the disclosures of each of which are incorporated herein by reference as they relate to AAV vectors for gene delivery.
本発明に記載される組成物、及び方法と組み合わせて有用なｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、及び９を含む、様々なＡＡＶ血清型に由来するものを含む。異なる血清型のＡＡＶベクター、及びＡＡＶタンパク質の、構築、及び使用は、例えば、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２：６１９－６２３ （２０００）、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７：３４２８－３４３２ （２０００）、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：２２２４－２２３２ （１９９８）、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４：１５２４－１５３２ （２０００）、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：６６１５－６６２４ （２００１）、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ． １０：３０７５－３０８１ （２００１）に記載され、これらの各々の開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関するので、参照により本明細書に組み込まれる。rAAV virions useful in combination with the compositions and methods described herein include those derived from various AAV serotypes, including AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, and 9. The construction and use of AAV vectors and AAV proteins of different serotypes are described, for example, in Chao et al., Mol. Ther. 2:619-623 (2000), Davidson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3428-3432 (2000), Xiao et al., J. Virol. 72:2224-2232 (1998), and Halbert et al., J. Virol. 74:1524-1532 (2000), Halbert et al., J. Virol. 75:6615-6624 (2001), and Auricchio et al., Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081 (2001), the disclosures of each of which relate to AAV vectors for gene delivery and are incorporated herein by reference.
偽型ｒＡＡＶベクターもまた、本明細書に記載の組成物、及び方法と組み合わせて有用である。偽型化ベクターとしては、所定の血清型のＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ９）が、所定の血清型以外の血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８等）に由来するカプシド遺伝子で偽型化されたＡＡＶベクターが挙げられる。例えば、代表的な偽型ベクターは、ＡＡＶ血清型８、またはＡＡＶ血清型９に由来するカプシド遺伝子で偽型化された、治療用タンパク質をコードするＡＡＶ２ベクターである。いくつかの実施形態では、偽型ＡＡＶは、１つのＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ２）のＩＴＲと、異なるＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶｒｈ７４）に由来するＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３カプシドタンパク質とを有する。偽型ｒＡＡＶウイルスビリオンの構築、及び使用を含む技術は、当技術分野で既知であり、例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：７６６２－７６７１ （２００１）、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４：１５２４－１５３２ （２０００）、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２８：１５８－１６７ （２００２）、Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ．， １０：３０７５－３０８１ （２００１）に記載される。Pseudotyped rAAV vectors are also useful in combination with the compositions and methods described herein. Pseudotyped vectors include AAV vectors of a given serotype (e.g., AAV9) pseudotyped with a capsid gene from a serotype other than the given serotype (e.g., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, etc.). For example, a representative pseudotyped vector is an AAV2 vector encoding a therapeutic protein pseudotyped with a capsid gene from AAV serotype 8 or AAV serotype 9. In some embodiments, the pseudotyped AAV has ITRs from one AAV serotype (e.g., AAV2) and VP1, VP2, and/or VP3 capsid proteins from a different AAV serotype (e.g., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrhlO, or AAVrh74). Techniques for constructing and using pseudotyped rAAV viral virions are known in the art, and are described, for example, in Duan et al., J. Virol. 75:7662-7671 (2001); Halbert et al., J. Virol. 74:1524-1532 (2000); Zolotukhin et al. , Methods, 28:158-167 (2002), and Auricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081 (2001).
いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、例えば、ＷＯ２０１７／２１８８４２号で開示されるカプシドを含み、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ １３：１３８ （２０２０）で開示されるカプシドタンパク質を含み、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ２－レトロ、またはＡＡＶ９－レトロカプシドタンパク質を含む。In some embodiments, the AAV comprises a capsid disclosed, for example, in WO 2017/218842, the disclosure of which is incorporated herein by reference. In some embodiments, the AAV comprises a capsid protein disclosed in Lin et al. Mol Brain 13:138 (2020), the disclosure of which is incorporated herein by reference. In some embodiments, the AAV comprises an AAV2-retro or AAV9-retro capsid protein.
ビリオンカプシド内に変異を有するＡＡＶビリオンは、特定の細胞型に、非変異カプシドビリオンよっても効果的に感染させるために使用され得る。例えば、好適なＡＡＶ変異体は、ＡＡＶの、特異的細胞型への標的化を促進するために、リガンド挿入変異を有し得る。挿入変異体、アラニンスクリーニング変異体、及びエピトープタグ変異体を含む、ＡＡＶカプシド変異体の構築、及び特徴付けは、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７４：８６３５－４５ （２０００）に記載される。本発明の方法で使用することができる他のｒＡＡＶビリオンとしては、ウイルスの分子育種、ならびにエキソンシャッフリングによって生成されたカプシドハイブリッドが挙げられる。例えば、以下を参照のこと：Ｓｏｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， ２５：４３６－４３９ （２０００）、及びＫｏｌｍａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９：４２３－４２８ （２００１）。AAV virions with mutations within the virion capsid can be used to efficiently infect specific cell types even with non-mutated capsid virions. For example, suitable AAV mutants can have ligand insertion mutations to facilitate targeting of AAV to specific cell types. Construction and characterization of AAV capsid mutants, including insertion mutants, alanine screening mutants, and epitope tag mutants, are described in Wu et al., J. Virol. 74:8635-45 (2000). Other rAAV virions that can be used in the methods of the present invention include capsid hybrids generated by molecular breeding of viruses and exon shuffling. See, for example, Soong et al., Nat. Genet., 25:436-439 (2000), and Kolman and Stemmer, Nat. Biotechnol. 19:423-428 (2001).
阻害性核酸の送達のための追加の方法
形質移入技術
本明細書に記載の阻害性核酸をコードする導入遺伝子等の導入遺伝子を、標的細胞（例えば、ＲＮＡ優性を患っているヒト患者由来、またはヒト患者内の標的細胞）に導入するために使用することができる技術は、当該技術分野で知られている。例えば、エレクトロポレーションを使用して、目的の細胞に静電ポテンシャルを印加することによって、哺乳動物細胞（例えば、ヒト標的細胞）を透過化することできる。このようにして外部電場に供された、ヒト細胞等の哺乳類細胞は、その後、外来性核酸を取り込みやすくなる。哺乳類細胞のエレクトロポレーションは、例えば、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：１３１１ （１９８７）に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。同様の技術であるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（登録商標）は、外来性ポリヌクレオチドの、真核細胞の核への取り込みを刺激するために印加される電場を利用する。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（登録商標）、及びこの技術を実施するのに有用なプロトコルは、例えば、Ｄｉｓｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １４：３１５ （２００５）、及びＵＳ２０１０／０３１７１１４号に詳細に記載されており、これらの各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。 Additional Methods for Delivery of Inhibitory Nucleic Acids Transfection Techniques Techniques that can be used to introduce transgenes, such as those encoding the inhibitory nucleic acids described herein, into target cells (e.g., target cells from or within a human patient suffering from RNA dominance) are known in the art. For example, electroporation can be used to permeabilize mammalian cells (e.g., human target cells) by applying an electrostatic potential to the cells of interest. Mammalian cells, such as human cells, subjected to an external electric field in this manner are then susceptible to the uptake of exogenous nucleic acids. Electroporation of mammalian cells is described in detail, for example, in Chu et al., Nucleic Acids Research 15:1311 (1987), the disclosure of which is incorporated herein by reference. A similar technique, Nucleofection®, utilizes an applied electric field to stimulate the uptake of exogenous polynucleotides into the nucleus of a eukaryotic cell. Nucleofection® and protocols useful for carrying out this technique are described in detail, for example, in Distler et al., Experimental Dermatology 14:315 (2005), and US 2010/0317114, the disclosures of each of which are incorporated herein by reference.
標的細胞のトランスフェクションに有用な更なる技術にとしては、スクイーズポレーション（ｓｑｕｅｅｚｅ－ｐｏｒａｔｉｏｎ）法が挙げられる。この技術は、印加されたストレスに応答して形成される膜状の細孔を介した、外来性ＤＮＡの取り込みを刺激するために、細胞の急速な機械的変形を誘発する。この技術は、ヒト標的細胞等の細胞への核酸の送達に、ベクターを必要としないという点で有利である。スクイーズポレーションは、例えば、Ｓｈａｒｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ８１：ｅ５０９８０ （２０１３）に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。An additional technique useful for transfection of target cells is squeeze-poration, which induces rapid mechanical deformation of cells to stimulate the uptake of exogenous DNA through membranous pores that form in response to the applied stress. This technique is advantageous in that it does not require a vector to deliver nucleic acids to cells, such as human target cells. Squeeze-poration is described in detail, for example, in Sharei et al., Journal of Visualized Experiments 81:e50980 (2013), the disclosure of which is incorporated herein by reference.
リポフェクションは、標的細胞のトランスフェクションに有用な別の技術を表す。この方法は、多くの場合に第四級、またはプロトン化アミン等のカチオン性官能基をリポソーム外部に向かって提示する、リポソームに、核酸をローディングすることを伴う。細胞膜がアニオン性であるので、これによって、リポソームと細胞との間の静電相互作用が促進され、最終的に、例えば、リポソームと細胞膜との直接的な融合によって、または複合体のエンドサイトーシスによって、外因性核酸が取り込まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第７，４４２，３８６号に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。外来核酸の取り込みを誘発するために細胞膜とのイオン相互作用を利用する同様の技法としては、細胞とカチオン性ポリマー－核酸複合体との接触が挙げられる。細胞膜との相互作用に有利な正電荷を付与するように、ポリヌクレオチドと会合させる例示的なカチオン性分子は、活性化デンドリマー（例えば、Ｄｅｎｎｉｇ， Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２８：２２７ （２００３）に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）、及びジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－デキストランであり、トランスフェクション剤としてのこれらの使用は、例えば、Ｇｕｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４０：Ｉ：９．２：９．２．１ （１９９７）に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。磁気ビーズは、この方法では、核酸の取り込みを誘導するために磁場印加を利用するので、穏やかで、かつ効率的な方法で、標的細胞をトランスフェクトするのに使用することができる別のツールである。この技術は、例えば、ＵＳ２０１０／０２２７４０６号に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。Lipofection represents another technique useful for transfection of target cells. This method involves loading nucleic acids into liposomes, which often present cationic functional groups, such as quaternary or protonated amines, toward the exterior of the liposome. Because cell membranes are anionic, this facilitates electrostatic interactions between the liposome and the cell, ultimately leading to uptake of the exogenous nucleic acid, for example, by direct fusion of the liposome with the cell membrane or by endocytosis of the complex. Lipofection is described in detail, for example, in U.S. Pat. No. 7,442,386, the disclosure of which is incorporated herein by reference. Similar techniques that utilize ionic interactions with the cell membrane to induce uptake of exogenous nucleic acids include contacting cells with cationic polymer-nucleic acid complexes. Exemplary cationic molecules that can be associated with polynucleotides to impart a positive charge that favors interaction with cell membranes are activated dendrimers (e.g., as described in Dennig, Topics in Current Chemistry 228:227 (2003), the disclosure of which is incorporated herein by reference), and diethylaminoethyl (DEAE)-dextran, the use of which as transfection agents is described in detail, for example, in Gulick et al., Current Protocols in Molecular Biology 40:1:9.2:9.2.1 (1997), the disclosure of which is incorporated herein by reference. Magnetic beads are another tool that can be used to transfect target cells in a gentle and efficient manner, as this method utilizes the application of a magnetic field to induce uptake of nucleic acids. This technology is described in detail, for example, in US 2010/0227406, the disclosure of which is incorporated herein by reference.
標的細胞による外来性核酸の取り込みを誘導するための別の有用なツールは、レーザーフェクションであり、これは、細胞を穏やかに透過処理し、ポリヌクレオチドが細胞膜に浸透できるようにするために、細胞を、特定の波長の電磁放射線に曝露することを含む技術である。この技術は、例えば、Ｒｈｏｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８２：３０９ （２００７）に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。Another useful tool for inducing the uptake of exogenous nucleic acids by target cells is laser infection, a technique that involves exposing cells to electromagnetic radiation of a specific wavelength to gently permeabilize the cells and allow polynucleotides to penetrate the cell membrane. This technique is described in detail, for example, in Rhodes et al., Methods in Cell Biology 82:309 (2007), the disclosure of which is incorporated herein by reference.
マイクロベシクルは、本明細書に記載の方法に従って標的細胞のゲノムを改変するために使用することができる、別の潜在的なビヒクルを表す。例えば、糖タンパク質ＶＳＶ－Ｇと、例えば、ヌクレアーゼ等のゲノム修飾タンパク質との同時過剰発現によって誘導されたマイクロベシクルを使用して、タンパク質を効率的に細胞に送達し、その後、内因性ポリヌクレオチド配列の部位特異的切断を触媒して、遺伝子、または調節配列等の目的のポリヌクレオチドを共有結合的に組み込むために細胞のゲノムを調製することができる。真核細胞を遺伝子改変するための、Ｇｅｓｉｃｌｅとも称されるそのようなベシクルの使用は、例えば、Ｑｕｉｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ［ａｂｓｔｒａｃｔ］．に詳細に記載される。Ｉｎ： Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ［ａｂｓｔｒａｃｔ］， ｉｎ： Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １８ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ；２０１５ Ｍａｙ １３， Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ． １２２．に詳細に記載される。Microvesicles represent another potential vehicle that can be used to modify the genome of target cells according to the methods described herein. For example, microvesicles induced by co-overexpression of the glycoprotein VSV-G and a genome-modifying protein, such as a nuclease, can be used to efficiently deliver proteins to cells and subsequently catalyze site-specific cleavage of endogenous polynucleotide sequences to prepare the cellular genome for covalent integration of a polynucleotide of interest, such as a gene or regulatory sequence. The use of such vesicles, also referred to as gesicles, to genetically modify eukaryotic cells is described in detail, for example, in Quinn et al., Genetic Modification of Target Cells by Direct Delivery of Active Protein [abstract]. This is described in detail in: "Methylation changes in early embryonic genes in cancer [abstract]," in: Proceedings of the 18th Annual Meeting of the American Society of Gene and Cell Therapy; May 13, 2015, Abstract No. 122.
遺伝子編集による阻害性核酸をコードする遺伝子の組み込み
上記に加えて、干渉ＲＮＡ構築物（例えば、本明細書に記載の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））等の阻害性核酸構築物をコードする導入遺伝子などの、標的細胞、及び特にヒト細胞への組み込みに使用できる、様々なツールが開発されている。阻害性核酸をコードするポリヌクレオチドを標的細胞に組み込むために使用することができる、そのような１つの方法に、トランスポゾンの使用がある。トランスポゾンは、トランスポザーゼ酵素をコードし、５’、及び３’切断部位によって挟まれた目的のポリヌクレオチド配列、または遺伝子を含有する、ポリヌクレオチドである。トランスポゾンが細胞に送達されると、トランスポザーゼ遺伝子の発現が開始し、トランスポゾンから目的の遺伝子を切断する活性酵素が生じる。この活性は、トランスポザーゼによるトランスポゾン切断部位の部位特異的認識によって媒介される。いくつかの事例では、これらの切断部位は、末端リピート配列、または末端逆位リピート配列であり得る。トランスポゾンから切断されると、目的の遺伝子は、細胞の核ゲノム内に存在する同様の切断部位がトランスポザーゼの触媒によって切断され、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれ得る。これによって、目的の遺伝子は、切断された核ＤＮＡの相補的な切断部位に挿入され、その後、目的の遺伝子を哺乳動物細胞ゲノムのＤＮＡに接続するホスホジエステル結合の共有結合的なライゲーションがなされ、組み込みのプロセスが完了する。特定の事例では、トランスポゾンは、標的遺伝子をコードする遺伝子が、まずＲＮＡ産物に転写され、次いで、ＤＮＡに逆転写された後に、哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれる、レトロトランスポゾンであり得る。例示的なトランスポゾン系は、ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾン（例えば、ＷＯ２０１０／０８５６９９号に詳細に記載される）、及びｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾン（例えば、ＵＳ２００５／０１１２７６４号に詳細に記載される）であり、その各々の開示は、目的の細胞への遺伝子送達に使用するためのトランスポゾンに関して、参照により本明細書に組み込まれる。 Incorporation of Genes Encoding Inhibitory Nucleic Acids by Gene Editing In addition to the above, various tools have been developed that can be used to incorporate into target cells, and particularly human cells, transgenes encoding inhibitory nucleic acid constructs, such as interfering RNA constructs (e.g., short interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), and microRNA (miRNA) as described herein). One such method that can be used to incorporate polynucleotides encoding inhibitory nucleic acids into target cells is the use of transposons. Transposons are polynucleotides that encode a transposase enzyme and contain a polynucleotide sequence, or gene, of interest flanked by 5' and 3' cleavage sites. Once the transposon is delivered to a cell, expression of the transposase gene begins, resulting in an active enzyme that cleaves the gene of interest from the transposon. This activity is mediated by site-specific recognition of the transposon cleavage site by the transposase. In some cases, these cleavage sites may be terminal repeat sequences or inverted terminal repeat sequences. Once excised from the transposon, the gene of interest can be integrated into the genome of a mammalian cell by transposase-catalyzed cleavage of a similar cleavage site present in the nuclear genome of the cell. This allows the gene of interest to be inserted into the complementary cleavage site of the cleaved nuclear DNA, followed by covalent ligation of a phosphodiester bond connecting the gene of interest to the DNA of the mammalian cell genome, completing the integration process. In certain cases, the transposon may be a retrotransposon, in which the gene encoding the target gene is first transcribed into an RNA product and then reverse-transcribed into DNA before being integrated into the mammalian cell genome. Exemplary transposon systems are the piggybac transposon (described in detail, e.g., in WO 2010/085699) and the sleeping beauty transposon (described in detail, e.g., in US 2005/0112764), the disclosures of each of which are incorporated herein by reference with respect to transposons for use in gene delivery to cells of interest.
標的細胞のゲノムに標的遺伝子を組み込むための別のツールは、クラスター化規則的空間間短パリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ系であり、この系は、元々、細菌、及び古細菌のウイルス感染に対する適応的防御機構として進化した系である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、プラスミドＤＮＡ内の短パリンドロームリピートと、関連するＣａｓ９ヌクレアーゼを含む。このＤＮＡとタンパク質の複合体は、まず、外来ＤＮＡをＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込むことによって、標的配列の部位特異的なＤＮＡ切断を誘導する。これらの外来配列、及びＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のリピートスペーサーエレメントを含有するポリヌクレオチドが、宿主細胞で転写されてガイドＲＮＡが生成され、その後、ガイドＲＮＡが、標的配列にアニーリングして、この部位に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを局在させることができる。このように、ｃａｓ９が標的ＤＮＡ分子に近接する相互作用は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションによって支配されているので、ｃａｓ９を介した高度に部位特異的なＤＮＡ切断を、外来ポリヌクレオチドに起こすことができる。その結果、目的とする任意の標的ＤＮＡ分子を切断するように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を設計することができる。この技法は、真核生物ゲノムを編集するために利用されており（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１：２２７ （２０１３））、ＤＮＡを切断した後に、標的遺伝子をコードする遺伝子を組み込むために、標的細胞ゲノムを部位特異的に編集する効率的な手段として使用することができる。遺伝子発現を調整するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの使用は、例えば、米国特許第８，６９７，３５９号に記載されており、その開示は、ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の使用に関して、参照により本明細書に組み込まれる。ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断した後に目的の遺伝子を標的細胞に組み込むための代替としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系とは異なり、これらの酵素は、特定の標的配列に局在化させるガイドポリヌクレオチドを含有しない。その代わりに、標的特異性は、これらの酵素内のＤＮＡ結合ドメインによって制御される。ゲノム編集用途におけるＺＦＮ、及びＴＡＬＥＮの使用は、例えば、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１：６３６ （２０１０）、及びＪｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４：４９ （２０１３）に記載され、その各々の開示は、ゲノム編集のための組成物、及び方法に関して、参照により本明細書に組み込まれる。Another tool for integrating target genes into the genome of target cells is the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas system, which originally evolved as an adaptive defense mechanism against bacterial and archaeal viral infections. The CRISPR/Cas system contains short palindromic repeats within plasmid DNA and the associated Cas9 nuclease. This DNA-protein complex first integrates foreign DNA into the CRISPR locus, thereby inducing site-specific DNA cleavage of the target sequence. Polynucleotides containing these foreign sequences and the repeat spacer element of the CRISPR locus are transcribed in the host cell to generate guide RNAs, which then anneal to the target sequence and localize the Cas9 nuclease to that site. In this way, the interaction of cas9 with the target DNA molecule is governed by RNA:DNA hybridization, allowing highly site-specific DNA cleavage via cas9 to occur in exogenous polynucleotides. As a result, the CRISPR/Cas system can be designed to cleave any target DNA molecule of interest. This technique has been used to edit eukaryotic genomes (Hwang et al., Nature Biotechnology 31:227 (2013)), and can be used as an efficient means of site-specific editing of the target cell genome to integrate a gene encoding a target gene after DNA cleavage. The use of CRISPR/Cas to regulate gene expression is described, for example, in U.S. Patent No. 8,697,359, the disclosure of which is incorporated herein by reference with respect to the use of the CRISPR/Cas system for genome editing. Alternatives for site-specifically cleaving genomic DNA and then integrating a gene of interest into target cells include the use of zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs).Unlike the CRISPR/Cas system, these enzymes do not contain guide polynucleotides that localize to specific target sequences.Instead, target specificity is controlled by the DNA binding domain within these enzymes.The use of ZFNs and TALENs in genome editing applications is described, for example, in Urnov et al., Nature Reviews Genetics 11:636 (2010) and Joung et al. , Nature Reviews Molecular Cell Biology 14:49 (2013), the disclosures of each of which are incorporated herein by reference with respect to compositions and methods for genome editing.
標的遺伝子をコードするポリヌクレオチドを標的細胞のゲノムに組み込むために使用することができる、更なるゲノム編集技術としては、ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断するように合理的に設計することができる、ＡＲＣＵＳ（商標）メガヌクレアーゼの使用が挙げられる。これらの酵素を使用して、標的遺伝子をコードする遺伝子を哺乳動物細胞のゲノムに組み込むことは、そのような酵素について確立されている明確な構造活性関係の観点から有利である。単鎖メガヌクレアーゼを特定のアミノ酸位置で改変することによって、所望の位置でＤＮＡを選択的に切断するヌクレアーゼを生成することができ、それによって、標的遺伝子を標的細胞の核ＤＮＡに部位特異的に組み込むことが可能となる。これらの単鎖ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８，０２１，８６７号、及び同第ＵＳ８，４４５，２５１号に広範に記載され、その各々の開示は、ゲノム編集のための組成物、及び方法に関して、参照により本明細書に組み込まれる。 Additional genome editing techniques that can be used to integrate a polynucleotide encoding a target gene into the genome of atarget cell include the use of ARCUS™ meganucleases, which can be rationally designed to site-specifically cleave genomic DNA. Using these enzymes to integrate a gene encoding a target gene into the genome of a mammalian cell is advantageous in light of the clear structure-activity relationship established for such enzymes. By modifying single-chain meganucleases at specific amino acid positions, nucleases can be generated that selectively cleave DNA at desired positions, thereby enabling site-specific integration of the target gene into the nuclear DNA of the target cell. These single-chain nucleases are extensively described, for example, in U.S. Patent Nos. 8,021,867 and 8,445,251, the disclosures of which are incorporated herein by reference with respect to compositions and methods for genome editing.
ＲＮＡ転写産物の発現を検出する方法
野生型、または変異型ＡＴＸＮ２ ＲＮＡ転写産物等の、野生型、または変異型ＲＮＡ転写産物の発現レベルは、例えば、様々な核酸検出技術によって確認することができる。更に、または代替的に、ＲＮＡ転写産物の発現は、ＲＮＡ転写産物の翻訳によって産生されるコードされたタンパク質の、濃度、または相対的存在量を評価することによって推定することができる。タンパク質濃度もまた、例えば、機能アッセイを使用して評価することができる。これらの技術を使用して、コードされたタンパク質の発現をモニタリングしながら、本明細書に記載の組成物、及び方法に応答した、野生型、または病原ＲＮＡ転写産物の濃度の減少を観察することができる。以下のセクションでは、野生型、または病原ＲＮＡ転写産物、及びその下流のタンパク質産物の発現レベルを測定するために使用され得る、例示的な技法について記載する。核酸シーケンシング、マイクロアレイ分析、プロテオミクス、ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ））、増幅ベースアッセイ、ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ｍＲＮＡのノーザン分析、及び／またはＰＣＲ分析を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の、多数の方法論によって、導入遺伝子の発現を評価することができる。 Methods for Detecting Expression of RNA Transcripts The expression level of a wild-type or mutant RNA transcript, such as a wild-type or mutant ATXN2 RNA transcript, can be confirmed, for example, by various nucleic acid detection techniques. Additionally or alternatively, expression of an RNA transcript can be estimated by assessing the concentration or relative abundance of the encoded protein produced by translation of the RNA transcript. Protein concentration can also be assessed, for example, using functional assays. These techniques can be used to monitor the expression of the encoded protein while observing a decrease in the concentration of a wild-type or pathogenic RNA transcript in response to the compositions and methods described herein. The following section describes exemplary techniques that can be used to measure the expression levels of a wild-type or pathogenic RNA transcript and its downstream protein product. Expression of the transgene can be assessed by a number of methodologies known in the art, including, but not limited to, nucleic acid sequencing, microarray analysis, proteomics, in-situ hybridization (e.g., fluorescent in-situ hybridization (FISH)), amplification-based assays, in-situ hybridization, fluorescence-activated cell sorting (FACS), Northern analysis of mRNA, and/or PCR analysis.
核酸検出
ＲＮＡ転写産物発現を検出するための核酸ベースの方法としては、イメージングベースの技法（例えば、ノーザンブロッティング、またはサザンブロッティング）が挙げられ、これは、例えば、阻害性核酸構築物（例えば、本明細書に記載の干渉ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））をコードするベクターの投与後に、またはそのような阻害性核酸構築物を含有する組成物の投与後に、患者から得られた細胞と組み合わせて使用され得る。ノーザンブロット解析は、当該技術分野で既知の従来技法であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｃｈ， Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １０ Ｓｋｙｌｉｎｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， ＮＹ １１８０３－２５００に記載される。遺伝子、及び遺伝子産物の状態を評価するための典型的なプロトコルとしては、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９９５， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｔｓ ２ （Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）， ４ （Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）， １５ （Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ） ａｎｄ １８ （ＰＣＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ）で見出される。 Nucleic Acid Detection Nucleic acid-based methods for detecting RNA transcript expression include imaging-based techniques (e.g., Northern blotting or Southern blotting), which may be used in combination with cells obtained from a patient, for example, after administration of a vector encoding an inhibitory nucleic acid construct (e.g., an interfering RNA, small interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), or microRNA (miRNA) described herein) or a composition containing such an inhibitory nucleic acid construct. Northern blot analysis is a conventional technique known in the art and is described, for example, in Molecular Cloning, a Laboratory Manual, second edition, 1989, Sambrook, Fritch, Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 10 Skyline Drive, Plainview, NY 11803-2500. Exemplary protocols for assessing the status of genes and gene products are described, for example, in Ausubel et al., eds. , 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) and 18 (PCR Analysis).
本明細書に記載の組成物、及び方法と共に使用して、ＲＮＡ転写産物、例えば、ＡＴＸＮ２ ＲＮＡ転写産物の発現を評価することができる、ＲＮＡ検出技術としては、マイクロアレイシークエンシング実験（例えば、ハイスループット配列決定、またはディープ配列決定としても知られている、Ｓａｎｇｅｒ配列決定、及び次世代配列決定法）を更に挙げることができる。例示的な次世代配列決定技術としては、限定されないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ配列決定、４５４配列決定、ＳＯＬｉＤ配列決定、及びナノポア配列決定プラットフォームが挙げられる。当該技術分野で既知の、更なる配列決定法もまた、使用することができる。例えば、ｍＲＮＡレベルでの導入遺伝子発現は、（例えば、Ｍｏｒｔａｚａｖｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ５：６２１－６２８ （２００８）に記載されるような、その開示が、本明細書に参照により組み込まれる）ＲＮＡ－Ｓｅｑを使用して測定することができる。ＲＮＡ－Ｓｅｑは、試料内でのＲＮＡ分子の直接シークエンシングによって発現を監視するためのロバストな技術である。簡潔に述べると、本方法論は、ＲＮＡを２００ヌクレオチドの平均長に断片化すること、ランダムプラミングによるｃＤＮＡへの転換、及び（例えば、Ｊｕｓｔ ｃＤＮＡ ＤｏｕｂｌｅＳｔｒａｎｄｅｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ ｆｒｏｍ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）を使用する）二本鎖ｃＤＮＡの合成を伴うことができる。次に、各ライブラリー用の（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）／Ｓｏｌｅｘａからの）配列アダプターを添加することによって、ｃＤＮＡをシークエンシング用の分子ライブラリーに転換し、得られた５０～１００ヌクレオチドリードをゲノム上にマッピングする。RNA detection techniques that can be used with the compositions and methods described herein to assess expression of RNA transcripts, e.g., ATXN2 RNA transcripts, can further include microarray sequencing experiments (e.g., Sanger sequencing, also known as high-throughput sequencing or deep sequencing, and next-generation sequencing). Exemplary next-generation sequencing techniques include, but are not limited to, Illumina sequencing, Ion Torrent sequencing, 454 sequencing, SOLiD sequencing, and nanopore sequencing platforms. Additional sequencing methods known in the art can also be used. For example, transgene expression at the mRNA level can be measured using RNA-Seq (e.g., as described in Mortazavi et al., Nat. Methods 5:621-628 (2008), the disclosure of which is incorporated herein by reference). RNA-Seq is a robust technique for monitoring expression by directly sequencing RNA molecules within a sample. Briefly, this methodology involves fragmenting RNA to an average length of 200 nucleotides, converting it to cDNA by random priming, and synthesizing double-stranded cDNA (e.g., using the Just cDNA DoubleStranded cDNA Synthesis Kit from Agilent Technology®). The cDNA is then converted into molecular libraries for sequencing by adding sequence adapters (e.g., from Illumina®/Solexa) for each library, and the resulting 50-100 nucleotide reads are mapped onto the genome.
マイクロアレイ技術が高解像度をもたらすために、マイクロアレイベースのプラットフォーム（例えば、シングルヌクレオチド多型アレイ）を使用して、ＲＮＡ現レベルを測定することができる。様々なマイクロアレイ法の詳細は、文献に見出すことができる。例えば、米国特許第６，２３２，０６８号、及びＰｏｌｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２３：４１－４６ （１９９９）（各々の開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。核酸マイクロアレイを使用して、ｍＲＮＡ試料を逆転写し、標識してｃＤＮＡを生成する。プローブを、次いで、整列されて固体支持体上に固定化された、１つ以上の相補性核酸にハイブリダイズさせることができる。アレイは、例えば、アレイの各要素の配列、及び位置が分かるように構成することができる。特定のアレイメンバーとの標識プローブのハイブリダイゼーションは、プローブが由来する試料が、その遺伝子を発現することを示す。発現レベルは、ハイブリダイズしたプローブ－試料複合体から検出したシグナルの量に従い定量化することができる。典型的なマイクロアレイ実験は、以下の工程：１）試料から単離したＲＮＡからの、蛍光標識した標的の調製、２）標識した標的のマイクロアレイへのハイブリダイゼーション、３）アレイの洗浄、染色、及び走査、４）走査画像の分析、ならびに５）遺伝子発現プロファイルの生成を伴う。マイクロアレイプロセッサの一例は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）システムであり、これは、市販されており、ガラス表面でのオリゴヌクレオチドの直接合成によって製造されるアレイを含む。当業者に既知である他の系を、使用してもよい。Due to the high resolution afforded by microarray technology, microarray-based platforms (e.g., single nucleotide polymorphism arrays) can be used to measure RNA levels. Details of various microarray methods can be found in the literature. See, for example, U.S. Patent No. 6,232,068 and Pollack et al., Nat. Genet. 23:41-46 (1999), the entire disclosures of each of which are incorporated herein by reference. Using nucleic acid microarrays, mRNA samples are reverse transcribed and labeled to generate cDNA. The probes can then be hybridized to one or more complementary nucleic acids that are aligned and immobilized on a solid support. Arrays can be constructed, for example, such that the sequence and location of each element of the array are known. Hybridization of a labeled probe with a particular array member indicates that the sample from which the probe was derived expresses that gene. Expression levels can be quantified according to the amount of signal detected from the hybridized probe-sample complex. A typical microarray experiment involves the following steps: 1) preparation of fluorescently labeled targets from RNA isolated from a sample, 2) hybridization of the labeled targets to the microarray, 3) washing, staining, and scanning the array, 4) analysis of the scanned image, and 5) generation of a gene expression profile. One example of a microarray processor is the Affymetrix GENECHIP® system, which is commercially available and includes arrays manufactured by direct synthesis of oligonucleotides on a glass surface. Other systems known to those skilled in the art may also be used.
増幅ベースのアッセイを使用して、野生型、または変異型ＡＴＸＮ２転写産物等の、特定のＲＮＡ転写産物の発現レベルを測定することもできる。そのようなアッセイでは、遺伝子の核酸配列は、増幅反応（例えば、ｑＰＣＲ等のＰＣＲ）で鋳型として機能する。定量的増幅では、増幅産物の量は、元の試料中の鋳型の量に比例する。適切な対照との比較によって、本明細書に記載する原理に従い、使用する特定のプローブに対応する、対象の転写産物の遺伝子の発現レベルの測定がもたらされる。ＴａｑＭａｎプローブを使用するリアルタイムｑＰＣＲ法が、当該技術分野で既知である。リアルタイムｑＰＣＲのための詳細なプロトコルが、例えば、Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：９９５－１００１ （１９９６）、及びＨｅｉｄ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：９８６－９９４ （１９９６）に提供され、その各々の開示が、全体として参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のＲＮＡ転写産物発現のレベルは、ＲＴ－ＰＣＲ技術によって測定することができる。ＰＣＲに使用するプローブは、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、または酵素等の検出可能なマーカーで標識されてもよい。Amplification-based assays can also be used to measure the expression level of a specific RNA transcript, such as a wild-type or mutant ATXN2 transcript. In such assays, the nucleic acid sequence of the gene serves as a template in an amplification reaction (e.g., PCR, such as qPCR). In quantitative amplification, the amount of amplified product is proportional to the amount of template in the original sample. Comparison with appropriate controls provides a measurement of the expression level of the gene of interest transcript corresponding to the particular probe used, according to the principles described herein. Real-time qPCR methods using TaqMan probes are known in the art. Detailed protocols for real-time qPCR are provided, for example, in Gibson et al., Genome Res. 6:995-1001 (1996) and Heid et al., Genome Res. 6:986-994 (1996), the disclosures of each of which are incorporated herein by reference in their entireties. The levels of RNA transcript expression described herein can be measured by RT-PCR techniques. The probes used for PCR may be labeled with a detectable marker, such as a radioisotope, a fluorescent compound, a bioluminescent compound, a chemiluminescent compound, a metal chelator, or an enzyme.
タンパク質検出
ＲＮＡ構築物の発現は、構築物によってコードされるタンパク質の発現を分析することによっても推測され得る。タンパク質レベルは、当該技術分野で既知の標準的な検出技術を使用して評価することができる。本明細書に記載する組成物、及び方法と組み合わせて使用するのに好適なタンパク質発現アッセイとしては、プロテオミクスアプローチ、免疫組織化学、及び／またはウェスタンブロット分析、免疫沈降、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫濾過アッセイ（ＥＬＩＦＡ）、質量分析、質量分析イムノアッセイ、ならびに生化学的酵素活性アッセイが挙げられる。特に、プロテオミクス法を使用して、マルチプレックスでの、大規模スケールタンパク質発現データセットを生成することができる。プロテオミクス法は、質量分析を利用して、ポリペプチド（例えば、タンパク質）を検出、及び定量化することができ、及び／または標的タンパク質のパネルに特異的な捕捉試薬（例えば、抗体）を利用するペプチドマイクロアレイを利用して、試料（例えば、シングルセル試料、またはマルチセル集団）で発現するタンパク質を識別し、この発現レベルを測定することができる。 Protein Detection Expression of an RNA construct can also be inferred by analyzing the expression of the protein encoded by the construct. Protein levels can be assessed using standard detection techniques known in the art. Protein expression assays suitable for use in conjunction with the compositions and methods described herein include proteomic approaches, immunohistochemistry and/or Western blot analysis, immunoprecipitation, molecular binding assays, ELISA, enzyme-linked immunofiltration assays (ELIFAs), mass spectrometry, mass spectrometry immunoassays, and biochemical enzyme activity assays. In particular, proteomic methods can be used to generate multiplexed, large-scale protein expression datasets. Proteomic methods can utilize mass spectrometry to detect and quantify polypeptides (e.g., proteins) and/or peptide microarrays that utilize capture reagents (e.g., antibodies) specific to a panel of target proteins to identify and measure the expression levels of proteins expressed in a sample (e.g., a single-cell sample or a multi-cell population).
例示的なペプチドマイクロアレイは、基質に結合した複数のポリペプチドを有し、オリゴヌクレオチド、ペプチド、またはタンパク質の、複数の結合ポリペプチドの各々への結合は、別個に検出可能である。あるいは、ペプチドマイクロアレイは、特定のオリゴヌクレオチド、ペプチド、またはタンパク質の検出を特異的に検出可能な、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ファージディスプレイ結合剤、イーストツーハイブリッド結合剤、アプタマーを含むがこれらに限定されない、複数の結合剤を含むことができる。ペプチドアレイの例は、米国特許第６，２６８，２１０号、同第５，７６６，９６０号、及び同第５，１４３，８５４号に見出すことができ、その各々の開示が、全体として参照により本細書に組み込まれる。An exemplary peptide microarray has multiple polypeptides bound to a substrate, and the binding of an oligonucleotide, peptide, or protein to each of the multiple binding polypeptides is separately detectable. Alternatively, a peptide microarray can include multiple binding agents, including, but not limited to, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, phage display binding agents, yeast two-hybrid binding agents, and aptamers, that are specifically capable of detecting a particular oligonucleotide, peptide, or protein. Examples of peptide arrays can be found in U.S. Patent Nos. 6,268,210, 5,766,960, and 5,143,854, the disclosures of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.
質量分析（ＭＳ）を、本明細書に記載の方法と組み合わせて使用して、導入遺伝子の送達後の、患者（例えば、ヒト患者）由来の細胞内での導入遺伝子発現を、識別し、特徴付けることができる。当該技術分野で既知のＭＳの任意の方法を使用して、対象のタンパク質、またはペプチド断片、例えば、ＬＣ－ＭＳ、ＥＳＩ－ＭＳ、ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ－ＭＳ、タンデムＭＳ等を、決定、検出、及び／または測定することができる。質量分析計は、一般に、イオン源、及び光学素子、質量分析器、ならびにデータ処理電子機器を含有する。飛行時間型（ＴＯＦ）、及び四重極（Ｑ）等の、走査、及びイオンビーム質量分析計、ならびにイオントラップ（ＩＴ）、Ｏｒｂｉｔｒａｐ等のトラップ型質量分析計、ならびにフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ－ＩＣＲ）を含む質量分析器を、本明細書に記載の方法で使用することができる。様々なＭＳ法の詳細は、文献に見出すことができる。例えば、Ｙａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． １１：４９－７９， ２００９（その開示が、全体として、本発明で、参照により組み込まれる）を参照のこと。Mass spectrometry (MS) can be used in combination with the methods described herein to identify and characterize transgene expression in cells from a patient (e.g., a human patient) following transgene delivery. Any method of MS known in the art can be used to determine, detect, and/or measure proteins or peptide fragments of interest, e.g., LC-MS, ESI-MS, ESI-MS/MS, MALDI-TOF-MS, MALDI-TOF/TOF-MS, tandem MS, etc. Mass spectrometers generally contain an ion source and optics, a mass analyzer, and data processing electronics. Mass analyzers including scanning and ion beam mass analyzers, such as time-of-flight (TOF) and quadrupole (Q), as well as trap-type mass analyzers, such as ion trap (IT) and Orbitrap, and Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR), can be used in the methods described herein. Details of various MS methods can be found in the literature. See, for example, Yates et al. , Annu. Rev. Biomed. Eng. 11:49-79, 2009, the disclosure of which is incorporated by reference in its entirety.
ＭＳ分析の前に、患者から入手した試料中のタンパク質を、まず、化学的（例えば、臭化シアン切断によって）、または酵素的（例えば、トリプシン）分解によって、より小さなペプチドに分解することができる。複雑なペプチド試料はまた、フロントエンド分離技術、例えば、２Ｄ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＲＰＬＣ、及び親和性クロマトグラフィーの使用から利益を得る。分解、及び任意選択的に分離した試料を、次に、イオン源を使用してイオン化し、更なる分析用の荷電分子を作製する。試料のイオン化は、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、電子イオン化、高速原子衝撃法（ＦＡＢ）／液体二次イオン化（ＬＳＩＭＳ）、マトリックス補助レーザー脱着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イオン化、電解脱着、熱スプレー／プラズマスプレーイオン化、及び、粒子ビームイオン化によって実施することができる。イオン化法の選択に関する追加情報は、当業者に既知である。Prior to MS analysis, proteins in samples obtained from patients can first be degraded into smaller peptides by chemical (e.g., cyanogen bromide cleavage) or enzymatic (e.g., trypsin) digestion. Complex peptide samples also benefit from the use of front-end separation techniques, such as 2D-PAGE, HPLC, RPLC, and affinity chromatography. The degraded and optionally separated sample is then ionized using an ion source to generate charged molecules for further analysis. Sample ionization can be performed by, for example, electrospray ionization (ESI), atmospheric pressure chemical ionization (APCI), photoionization, electron ionization, fast atom bombardment (FAB)/liquid secondary ionization (LSIMS), matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI), field ionization, field desorption, thermospray/plasma spray ionization, and particle beam ionization. Additional information regarding the selection of ionization methods is known to those skilled in the art.
イオン化の後、分解したペプチドを断片化し、シグネチャーＭＳ／ＭＳスペクトルを生成する。ＭＳ／ＭＳとしても知られているタンデムＭＳを、特に、複合体混合物を分析するために使用することができる。タンデムＭＳは、複数の工程のＭＳ選択を伴い、何らかのイオン断片化形態が、段階の間で生じ、これは、空間的に分離した個別の質量分析計要素を使用して、または時間的に分離したＭＳ工程による単一の質量分析器を使用して、実現することができる。空間的に分離したタンデムＭＳでは、要素は、物理的に分離されていて個別であり、高真空を保つために、要素同士は物理的に接続されている。時間的に分離したタンデムＭＳでは、分離は、同一の場所でトラップされたイオンによって実現され、複数の分離工程が経時的に生じる。シグネチャーＭＳ／ＭＳスペクトルを、次いで、ペプチド配列データベース（例えば、ＳＥＱＵＥＳＴ）に対して比較した。ペプチドへの翻訳後修飾もまた、例えば、特定のペプチド修飾を可能にしながら、データベースに対してスペクトルを調査することによって測定することができる。After ionization, the resolved peptides are fragmented to generate a signature MS/MS spectrum. Tandem MS, also known as MS/MS, can be used, particularly for analyzing complex mixtures. Tandem MS involves multiple steps of MS selection, with some form of ion fragmentation occurring between steps. This can be achieved using spatially separated, individual mass analyzer elements, or using a single mass analyzer with time-separated MS steps. In spatially separated tandem MS, the elements are physically separated and distinct, and are physically connected to maintain a high vacuum. In time-separated tandem MS, separation is achieved by co-located trapped ions, with multiple separation steps occurring over time. The signature MS/MS spectrum is then compared against a peptide sequence database (e.g., SEQUEST). Post-translational modifications to the peptide can also be determined, for example, by searching the spectrum against the database, enabling specific peptide modifications.
医薬組成物
干渉ＲＮＡ構築物（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））等の阻害性核酸構築物、ならびにそのような構築物をコードするか、またはそれを含有する、ベクター、及び組成物は、患者、例えば、本明細書に記載の障害を患うヒト患者への投与のためのビヒクルに組み込まれる。本明細書に記載の阻害性核酸構築物をコードするウイルスベクター等のベクターを含有する医薬組成物は、当技術分野で既知の方法を使用して調製することができる。例えば、そのような組成物は、例えば、生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ． （１９８０）；参照により本明細書に組み込まれる）を使用して、所望の形態、例えば、凍結乾燥製剤、または水溶液の形態で調製することができる。 Pharmaceutical Compositions Inhibitory nucleic acid constructs, such as interfering RNA constructs (e.g., small interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), or microRNA (miRNA)), as well as vectors and compositions encoding or containing such constructs, are incorporated into vehicles for administration to patients, e.g., human patients suffering from disorders described herein. Pharmaceutical compositions containing vectors, such as viral vectors, encoding the inhibitory nucleic acid constructs described herein can be prepared using methods known in the art. For example, such compositions can be prepared in a desired form, e.g., a lyophilized formulation or an aqueous solution, using, e.g., physiologically acceptable carriers, excipients, or stabilizers (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980); incorporated herein by reference).
本明細書に記載の核酸、及びウイルスベクターの混合物は、１つ以上の賦形剤、担体、または希釈剤と好適に混合された水中で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物中、ならびに油中で調製され得る。これらの調製物は、通常の保存条件、及び使用条件下で、微生物の発育を防止するための防腐剤を含有し得る。注入用途に好適な医薬形態として、注入可能な無菌溶液、または無菌分散液を即時調製するための、無菌水溶液、または無菌分散液、及び無菌粉末が挙げられる（ＵＳ５，４６６，４６８号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。任意の事例では、製剤は、無菌であってもよく、容易に注入できる程度の流動性を有していてもよい。製剤は、製造、及び貯蔵の条件下で安定であり得、細菌、及び真菌等の微生物の混入作用から保存され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコール等）、その好適な混合物、ならびに／または植物油を含有する、溶媒、または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の抑制は、様々な抗細菌剤、及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらされ得る。多くの事例では、等張剤、例えば、糖、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注入可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、及びゼラチンを、組成物中で使用することによってもたらされ得る。Mixtures of the nucleic acids and viral vectors described herein can be prepared in water, suitably mixed with one or more excipients, carriers, or diluents. Dispersions can also be prepared in glycerol, liquid polyethylene glycols, and mixtures thereof, as well as in oils. These preparations may contain preservatives to prevent the growth of microorganisms under ordinary storage and use conditions. Pharmaceutical forms suitable for injection use include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersions (as described in U.S. Pat. No. 5,466,468, the disclosure of which is incorporated herein by reference). In any case, the formulation may be sterile and may have sufficient fluidity for easy injection. The formulation may be stable under the conditions of manufacture and storage and preserved against the contaminating action of microorganisms, such as bacteria and fungi. The carrier can be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (e.g., glycerol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol, and the like), suitable mixtures thereof, and/or vegetable oils. Proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersions, and by the use of surfactants. Prevention of microbial action can be brought about by various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars or sodium chloride. Prolonged absorption of injectable compositions can be brought about by the use in the compositions of agents delaying absorption, for example, aluminum monostearate and gelatin.
例えば、本明細書に記載の医薬組成物を含有する溶液は、必要に応じて好適に緩衝化され、まず、液体希釈剤を、十分な生理食塩水、またはグルコースで等張にする。これらの特定の水溶液は、視床内、髄腔内、脳下垂体内、胸膜内、脳内、頭蓋内、胸骨内、大脳内、脳室内、眼内（例えば、硝子体内）、脳室内、腰椎内、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内、経皮、非経口、鼻内、経皮、気管内、動脈内、血管内、及び経口投与、吸入、灌流、洗浄、またはそれらの任意の組み合わせから選択される経路による投与に特に好適である。これに関して、採用することができる無菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に知られているであろう。例えば、１用量を、１ｍｌのＮａＣｌ等張液中に溶解し、１０００ｍｌの皮下注入液に添加するか、または注入予定部位に注入してもよい。用量については、治療がなされる対象の状態に応じて、いくらかの変動が必然的に生じ得る。いずれにせよ、投与を担当する者が、各々の対象に適切な用量を決定する。更に、ヒト投与のために、調製物は、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの基準によって要求される、無菌性、発熱性、一般的な安全性、及び純度の基準を満たし得る。For example, solutions containing the pharmaceutical compositions described herein may be suitably buffered, if necessary, and the liquid diluent first rendered isotonic with sufficient saline or glucose. These particular aqueous solutions are particularly suitable for administration by a route selected from intrathalamic, intrathecal, intrapituitary, intrapleural, intracerebral, intracranial, intrasternal, intracerebral, intraventricular, intraocular (e.g., intravitreal), intracerebroventricular, intralumbar, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, intradermal, transdermal, parenteral, intranasal, transdermal, intratracheal, intraarterial, intravascular, and oral administration, inhalation, perfusion, irrigation, or any combination thereof. In this regard, sterile aqueous vehicles that can be employed will be known to those skilled in the art in light of the present disclosure. For example, one dose may be dissolved in 1 ml of isotonic NaCl solution and added to 1000 ml of subcutaneous infusion solution or injected at the intended infusion site. Some variation in dosage may necessarily occur depending on the condition of the subject being treated. The person responsible for administration will, in any event, determine the appropriate dose for each subject. Moreover, for human administration, preparations may meet sterility, pyrogenicity, general safety, and purity standards as required by FDA Office of Biologics standards.
医薬組成物は、例えば、本明細書に記載の阻害性核酸を含有し、典型的には、薬学的に許容可能な希釈剤、または担体を含む。医薬組成物は、例えば、滅菌生理的食塩水溶液、及び核酸を含んでもよい（例えば、それらからなってもよい）。滅菌生理的食塩水は、典型的には、医薬品グレードの生理的食塩水である。医薬組成物は、例えば、滅菌水、及び核酸を含んでもよい（例えば、それらからなってもよい）。滅菌水は、典型的には、医薬品グレードの水である。医薬組成物は、例えば、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）、及び核酸を含んでもよい（例えば、それらからなってもよい）。滅菌ＰＢＳは、典型的には、医薬品グレードのＰＢＳである。A pharmaceutical composition contains, for example, an inhibitory nucleic acid described herein and typically includes a pharmaceutically acceptable diluent or carrier. A pharmaceutical composition may comprise (e.g., consist of), for example, a sterile saline solution and a nucleic acid. The sterile saline is typically pharmaceutical-grade saline. A pharmaceutical composition may comprise (e.g., consist of), for example, sterile water and a nucleic acid. The sterile water is typically pharmaceutical-grade water. A pharmaceutical composition may comprise (e.g., consist of), for example, phosphate-buffered saline (PBS) and a nucleic acid. The sterile PBS is typically pharmaceutical-grade PBS.
特定の実施形態では、医薬組成物は、１つ以上の組成物、または核酸分子、及び１つ以上の賦形剤を含む。特定の実施形態では、賦形剤は、水、食塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミラーゼ、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンから選択される。
特定の実施形態では、核酸分子は、医薬組成物、または製剤を調製するために、薬学的に許容可能な活性、及び／または不活性物質と混合され得る。医薬組成物を製剤化するための組成物、及び方法は、投与経路、疾患の程度、または投与される用量を含むが、これらに限定されないいくつかの基準に依存する。 In certain embodiments, pharmaceutical compositions comprise one or more compositions or nucleic acid molecules and one or more excipients, hi certain embodiments, the excipients are selected from water, saline, alcohol, polyethylene glycol, gelatin, lactose, amylase, magnesium stearate, talc, silicic acid, viscous paraffin, hydroxymethylcellulose, and polyvinylpyrrolidone.
In certain embodiments, the nucleic acid molecules can be mixed with pharmaceutically acceptable active and/or inactive substances to prepare pharmaceutical compositions or formulations. The compositions and methods for formulating pharmaceutical compositions depend on several criteria, including, but not limited to, the route of administration, the extent of the disease, or the dose to be administered.
特定の実施形態では、医薬組成物は、阻害剤の任意の薬学的に許容可能な塩、阻害剤のエステル、または、このようなエステルの塩を包含する、核酸分子を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、核酸分子を含み、対象（例えば、ヒト）への投与時、生物学的に活性な代謝産物、またはその残渣を（直接的、または間接的に）提供することができるしたがって、例えば、本開示はまた、阻害剤の薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、そのようなプロドラッグの薬学的に許容可能な塩、及び他の生物学的等価物から導かれる。適した薬学的に許容可能な塩としては、限定されないが、ナトリウム、及びカリウム塩が挙げられる。特定の実施形態では、プロドラッグは、オリゴヌクレオチドに結合した１つ以上のコンジュゲート基を含み、コンジュゲート基は、体内の内在酵素によって切断される。In certain embodiments, the pharmaceutical composition comprises a nucleic acid molecule, including any pharmaceutically acceptable salt of the inhibitor, an ester of the inhibitor, or a salt of such an ester. In certain embodiments, the pharmaceutical composition comprises a nucleic acid molecule and, upon administration to a subject (e.g., a human), can provide (directly or indirectly) a biologically active metabolite or residue thereof. Thus, for example, the present disclosure also encompasses pharmaceutically acceptable salts of the inhibitor, prodrugs, pharmaceutically acceptable salts of such prodrugs, and other bioequivalents. Suitable pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, sodium and potassium salts. In certain embodiments, the prodrug comprises one or more conjugate groups attached to the oligonucleotide, where the conjugate groups are cleaved by endogenous enzymes in the body.
脂質部分は、核酸療法に、さまざまな方法で使用されてきた。特定のそのような方法では、核酸は、カチオン性脂質、及び中性脂質の混合物から作成された、事前形成されたリポソーム、またはリポプレックスに導入される。特定の方法では、モノ、またはポリカチオン性脂質とのＤＮＡ複合体は、中性脂質の存在なしで形成される。特定の実施形態では、脂質部分は、特定の細胞、または組織への、医薬品の分布を増加させるように選択される。特定の実施形態では、脂質部分は、脂肪組織への、医薬品の分布を増加させるように選択される。特定の実施形態では、脂質部分は、筋肉組織への、医薬品の分布を増加させるように選択される。Lipid moieties have been used in a variety of ways in nucleic acid therapy. In certain such methods, nucleic acids are introduced into preformed liposomes, or lipoplexes, made from a mixture of cationic and neutral lipids. In certain methods, DNA complexes with mono- or polycationic lipids are formed without the presence of neutral lipids. In certain embodiments, the lipid moiety is selected to increase distribution of the pharmaceutical agent to specific cells or tissues. In certain embodiments, the lipid moiety is selected to increase distribution of the pharmaceutical agent to adipose tissue. In certain embodiments, the lipid moiety is selected to increase distribution of the pharmaceutical agent to muscle tissue.
特定の実施形態では、医薬組成物は、送達系を含む。送達系の例としては、限定されるものではないが、リポソーム、及びエマルジョンが挙げられる。疎水性化合物を含むもの等の特定の医薬組成物を調製するために、特定の送達系が有用である。特定の実施形態では、ジメチルスルホキシド等の、特定の有機溶媒が使用される。In certain embodiments, the pharmaceutical composition comprises a delivery system. Examples of delivery systems include, but are not limited to, liposomes and emulsions. Certain delivery systems are useful for preparing certain pharmaceutical compositions, such as those containing hydrophobic compounds. In certain embodiments, certain organic solvents, such as dimethyl sulfoxide, are used.
医薬組成物は、１つ以上の本発明の医薬品を、特定の組織、または細胞タイプに送達するために設計された、１つ以上の組織特異的な送達分子を含んでもよい。例えば、特定の実施形態では、医薬組成物は、組織特異的抗体でコーティングされたリポソームを含む。The pharmaceutical composition may also include one or more tissue-specific delivery molecules designed to deliver one or more pharmaceutical agents of the present invention to a particular tissue or cell type. For example, in certain embodiments, the pharmaceutical composition includes a liposome coated with a tissue-specific antibody.
特定の実施形態では、医薬組成物は、共溶媒系を含む。特定のそのような共溶媒系は、例えば、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー、及び水相を含む。特定の実施形態では、そのような共溶媒系は、疎水性化合物に使用される。このような共溶媒系の非限定例は、３％ｗ／ｖのベンジルアルコール、８％ｗ／ｖの非極性界面活性剤Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０（商標）、及び６５％ｗ／ｖのポリエチレングリコール３００を含む、無水エタノールの溶液である、ＶＰＤ共溶媒系である。そのような共溶媒系の割合は、その溶解性、及び毒性特性を著しく変えることなく、大幅に変化する場合もある。更に、共溶媒構成成分の同一性は、変化する場合もあり、例えば、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０（商標）の代わりに、その他の界面活性剤が使用されてもよく、ポリエチレングリコールの分割量は変化することもあり、他の生体適合性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンが、ポリエチレングリコールに置き換わってもよく、デキストロースを、他の糖、または多糖類で置換してもよい。In certain embodiments, the pharmaceutical composition includes a cosolvent system. Certain such cosolvent systems include, for example, benzyl alcohol, a nonpolar surfactant, a water-miscible organic polymer, and an aqueous phase. In certain embodiments, such cosolvent systems are used for hydrophobic compounds. A non-limiting example of such a cosolvent system is the VPD cosolvent system, which is a solution of 3% w/v benzyl alcohol, 8% w/v of the nonpolar surfactant Polysorbate 80™, and 65% w/v polyethylene glycol 300 in absolute ethanol. The proportions of such a cosolvent system may vary significantly without significantly altering its solubility and toxicity characteristics. Furthermore, the identity of the cosolvent components may be varied; for example, other surfactants may be used in place of Polysorbate 80™, the fraction of polyethylene glycol may be varied, other biocompatible polymers, such as polyvinylpyrrolidone, may replace polyethylene glycol, and dextrose may be replaced with other sugars or polysaccharides.
特定の実施形態では、医薬組成物は、経口投与のために調製される。特定の実施形態では、医薬組成物は、頬投与のために調製される。特定の実施形態では、医薬組成物は、注入（例えば、眼内（例えば、硝子体内）、静脈内、皮下、筋肉内、視床内、脳下垂体、髄腔内、脳室内等）による投与のために調製される。特定のそのような実施形態では、医薬組成物は、担体を含み、水溶液、例えば、水、または生理学的に相溶性の緩衝液、例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理学的生理食塩水緩衝液等の中で製剤化される。特定の実施形態では、他の成分（例えば、溶解に役立つか、または防腐剤の役目を果たす成分）が含まれる。特定の実施形態では、注入可能な懸濁液は、適切な液体担体、懸濁化剤等を用いて調製される。特定の注入用医薬組成物は、単位剤形として、例えば、アンプルに入れて、または複数用量容器に入れて提示される。注入用の特定の医薬組成物は、油性、または水性ビヒクル中の、懸濁液、溶液、またはエマルジョンであり、懸濁化剤、安定化剤、及び／または分散剤等の製剤化剤を含有し得る。注入用の医薬組成物における使用に好適な特定の溶媒としては、限定されないが、親油性溶媒、及び脂肪油、例えば、ゴマ油、合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル、またはトリグリセリド、及びリポソームが挙げられる。In certain embodiments, the pharmaceutical composition is prepared for oral administration. In certain embodiments, the pharmaceutical composition is prepared for buccal administration. In certain embodiments, the pharmaceutical composition is prepared for administration by injection (e.g., intraocular (e.g., intravitreal), intravenous, subcutaneous, intramuscular, intrathalamic, intrapituitary, intrathecal, intracerebroventricular, etc.). In certain such embodiments, the pharmaceutical composition includes a carrier and is formulated in an aqueous solution, e.g., water, or a physiologically compatible buffer, e.g., Hank's solution, Ringer's solution, physiological saline buffer, or the like. In certain embodiments, other ingredients (e.g., ingredients that aid in solubility or act as preservatives) are included. In certain embodiments, injectable suspensions are prepared using appropriate liquid carriers, suspending agents, etc. Certain injectable pharmaceutical compositions are presented in unit dosage form, e.g., in ampoules or in multi-dose containers. Certain pharmaceutical compositions for injection are suspensions, solutions, or emulsions in oily or aqueous vehicles and may contain formulatory agents such as suspending, stabilizing, and/or dispersing agents. Specific solvents suitable for use in pharmaceutical compositions for injection include, but are not limited to, lipophilic solvents and fatty oils such as sesame oil, synthetic fatty acid esters such as ethyl oleate or triglycerides, and liposomes.
投与の経路及び用量
本開示の阻害性核酸をコードする導入遺伝子を含有するウイルスベクター、例えば、本明細書に記載のＡＡＶベクター、及び他のベクターは、様々な投与経路によって、患者（例えば、ヒト患者）に投与され得る。投与経路は、例えば、疾患の発症及び重症度によって異なり得、例えば、皮内、経皮、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮、気管内、腹腔内、動脈内、血管内、吸入、灌流、洗浄、及び経口投与を挙げることができる。血管内投与には、患者の血管系への送達が含まれる。いくつかの実施形態では、投与は、静脈（静脈内）と見なされる血管への投与であり、いくつかの投与では、投与は、動脈（動脈内）と見なされる血管への投与である。静脈には、内頸静脈、末梢静脈、冠状静脈、肝臓静脈、門脈、大伏在静脈、肺静脈、上大静脈、下大静脈、胃静脈、脾臓静脈、下腸間膜静脈、上腸間膜静脈、頭側静脈、及び／または大腿静脈が含まれるが、これらに限定されない。動脈には、冠状動脈、肺動脈、上腕動脈、内頸動脈、大動脈弓、大腿動脈、末梢動脈、及び／または毛様体動脈が含まれるが、これらに限定されない。送達は、細動脈、または毛細血管を介して、またはそれらに対するのであり得ることが企図される。 Routes of Administration and Dosages Viral vectors, e.g., AAV vectors described herein, and other vectors containing a transgene encoding an inhibitory nucleic acid of the present disclosure, can be administered to a patient (e.g., a human patient) by a variety of routes of administration. The routes of administration can vary, for example, depending on the onset and severity of the disease, and can include, for example, intradermal, transdermal, parenteral, intravenous, intramuscular, intranasal, subcutaneous, transdermal, intratracheal, intraperitoneal, intraarterial, intravascular, inhalation, perfusion, lavage, and oral administration. Intravascular administration includes delivery to a patient's vascular system. In some embodiments, administration is into a blood vessel considered a vein (intravenous), while in some administrations, administration is into a blood vessel considered an artery (intraarterial). Veins include, but are not limited to, the internal jugular vein, peripheral veins, coronary veins, hepatic veins, portal vein, saphenous vein, pulmonary veins, superior vena cava, inferior vena cava, gastric vein, splenic vein, inferior mesenteric vein, superior mesenteric vein, cephalic vein, and/or femoral vein. Arteries include, but are not limited to, coronary arteries, pulmonary arteries, brachial arteries, internal carotid arteries, aortic arches, femoral arteries, peripheral arteries, and/or ciliary arteries. It is contemplated that delivery may be via or to arterioles or capillaries.
治療レジメンは、変動し、多くの場合、疾患重症度、ならびに患者の年齢、体重、及び性別に応じて異なり得る。治療には、導入遺伝子を様々な単位用量で標的細胞に導入するのに有用であると本明細書に記載のベクター（例えば、ウイルスベクター）、または他の薬剤の投与が含まれ得る。各単位用量は、通常、所定量の治療用組成物を含有する。Treatment regimens may vary and often depend on the severity of the disease, as well as the age, weight, and sex of the patient. Treatment may include administration of vectors (e.g., viral vectors) or other agents described herein as useful for introducing transgenes into target cells in various unit doses. Each unit dose typically contains a predetermined amount of the therapeutic composition.
以下の実施例は、本明細書に記載の組成物、及び方法がどのように使用し評価され得るかについての記載を、当業者に提供するために示すものであり、本発明の純粋な例示であることが意図され、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定することは意図されていない。The following examples are presented to provide one of ordinary skill in the art with a description of how the compositions and methods described herein may be used and evaluated, and are intended to be purely illustrative of the invention and are not intended to limit the scope of what the inventors regard as their invention.
実施例１．二重ルシフェラーゼレポーターアッセイを介した、ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＴＸＮ２特異的ｍｉＲＮＡ構築物のノックダウン有効性の決定Example 1. Determining the knockdown efficacy of an ATXN2-specific miRNA construct in HEK293 cells via a dual-luciferase reporter assay
目的
本試験の目的は、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイを介して、ＨＥＫ２９３細胞におけるいくつかのＡＴＸＮ２ ｍｉＲＮＡ候補のノックダウン有効性を評価することであった。この試験は、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡのサイレンシングにおけるｍｉＲＮＡ構築物の効率を決定するように設計された。 The purpose of this study was to evaluate the knockdown efficacy of several ATXN2 miRNA candidates in HEK293 cells via a dual-luciferase reporter assay. This study was designed to determine the efficiency of the miRNA constructs in silencing ATXN2 mRNA.
材料及び方法
ＨＥＫ２９３細胞は、ｍｉＲＮＡ送達、及びその後のＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡのノックダウンのために、ＡＴＸＮ２ ｍｉＲＮＡ候補が組み込まれたＡＡＶベクターで形質導入された。次いで、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイを実施して、ｍｉＲＮＡ構築物で得られたノックダウンの有効性を、有意なサイレンシングをもたらさない陰性対照と比較して測定した。
試験したｍｉＲＮＡ構築物を、以下の表に示す：
The miRNA constructs tested are shown in the table below:
結果
結果として、本発明者らは、ＡＴＸＮ２ ｍｉＲＮＡ候補が、ＡＴＸＮ２を様々な程度サイレンシングでき（図１）、いくつかのｍｉＲＮＡ構築物（ｍｉＲＮＡ１、２、３、４、６、１９、２０、２４、２５、３７、３８、３９、４５、５１）は、他のｍｉＲＮＡ構築物と比較して、よって高いノックダウン効率を達成することを観察した。 Results As a result, we observed that ATXN2 miRNA candidates could silence ATXN2 to varying degrees (Figure 1), and some miRNA constructs (miRNAs 1, 2, 3, 4, 6, 19, 20, 24, 25, 37, 38, 39, 45, 51) achieved higher knockdown efficiency compared to other miRNA constructs.
実施例２．プラスミドトランスフェクション後の二重ルシフェラーゼレポーターアッセイを介した、ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＴＸＮ２特異的ｍｉＲＮＡ構築物のノックダウン有効性の決定Example 2. Determining the knockdown efficacy of ATXN2-specific miRNA constructs in HEK293 cells via a dual-luciferase reporter assay after plasmid transfection.
目的
本試験の目的は、プラスミドトランスフェクション後の二重ルシフェラーゼレポーターアッセイを介して、ＨＥＫ２９３細胞におけるいくつかのＡＴＸＮ２ ｍｉＲＮＡ候補のノックダウン有効性を評価することであった。この試験は、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡのサイレンシングにおけるｍｉＲＮＡ構築物の効率を決定するように設計された。 The purpose of this study was to evaluate the knockdown efficacy of several ATXN2 miRNA candidates in HEK293 cells via a dual-luciferase reporter assay after plasmid transfection. This study was designed to determine the efficiency of the miRNA constructs in silencing ATXN2 mRNA.
材料及び方法
ＨＥＫ２９３細胞に、ＡＴＸＮ２特異的ｍｉＲＮＡ構築物をコードするプラスミドをトランスフェクトした。次いで、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイを実施して、ｍｉＲＮＡ構築物で得られたノックダウンの有効性を、有意なサイレンシングをもたらさない陰性対照と比較して測定した。この実施例における構築物の番号付けは、実施例１と同一である。 Materials and Methods HEK293 cells were transfected with a plasmid encoding an ATXN2-specific miRNA construct. A dual-luciferase reporter assay was then performed to measure the knockdown efficacy of the miRNA construct compared to a negative control that did not result in significant silencing. The numbering of the constructs in this example is the same as in Example 1.
結果
結果として、本試験のために選択したｍｉＲＮＡ構築物が、ＡＴＸＮ２をサイレンシングできることが観察された。陰性対照に対するルシフェラーゼ活性のパーセンテージは、２０％～５４％の範囲であり（図２Ａ）、ｍｉＲＮＡ構築物１は、試験したもののうち最も良好なノックダウン有効性を示した。ノックダウンの有効性は、陰性対照と比較したルシフェラーゼ活性のパーセンテージの逆数であるため、陰性対照と比較してルシフェラーゼ活性のパーセンテージ値が低いほど、ノックダウンの有効性は高い。対照（ＣＯＮＴ）は、非標的化ｍｉＲＮＡであり、ノックダウンを示さない。 Results As a result, it was observed that the miRNA constructs selected for this study were able to silence ATXN2. The percentage of luciferase activity relative to the negative control ranged from 20% to 54% (Figure 2A), with miRNA construct 1 showing the best knockdown efficacy among those tested. Since knockdown efficacy is the inverse of the percentage of luciferase activity compared to the negative control, the lower the percentage of luciferase activity compared to the negative control, the higher the knockdown efficacy. The control (CONT) is a non-targeting miRNA and shows no knockdown.
実施例３．プラスミドトランスフェクション後のプローブベースの定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイを介した、ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＴＸＮ２特異的ｍｉＲＮＡ構築物のノックダウン有効性の決定Example 3. Determining the knockdown efficacy of ATXN2-specific miRNA constructs in HEK293 cells via a probe-based quantitative PCR (qPCR) assay after plasmid transfection.
目的
本試験の目的は、プラスミドトランスフェクション後にプローブベースのｑＰＣＲアッセイを介して、ＨＥＫ２９３細胞におけるいくつかの内因性ＡＴＸＮ２ ｍｉＲＮＡ構築物のノックダウン有効性を評価することであった。この試験は、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡのサイレンシングにおけるｍｉＲＮＡ構築物の効率を決定するように設計された。 The purpose of this study was to evaluate the knockdown efficacy of several endogenous ATXN2 miRNA constructs in HEK293 cells via a probe-based qPCR assay after plasmid transfection. This study was designed to determine the efficiency of the miRNA constructs in silencing ATXN2 mRNA.
材料及び方法
ＨＥＫ２９３細胞に、ＡＴＸＮ２特異的ｍｉＲＮＡ構築物をコードするプラスミドをトランスフェクトした。プローブベースのｑＰＣＲアッセイを実施して、各ｍｉＲＮＡ構築物によって達成されたノックダウンの有効性を、陰性対照と比較して測定した。この実験を、２回実施した。第１ラウンドの実験では、第２ラウンドと比較して、よって多くの数のＡＴＸＮ２特異的ｍｉＲＮＡ構築物を試験した。この実施例における構築物の番号付けは、実施例１と同一である。 Materials and Methods HEK293 cells were transfected with plasmids encoding ATXN2-specific miRNA constructs. A probe-based qPCR assay was performed to measure the knockdown efficacy achieved by each miRNA construct compared to a negative control. This experiment was performed twice. A larger number of ATXN2-specific miRNA constructs were tested in the first round of experiments compared to the second round. The numbering of the constructs in this example is the same as in Example 1.
結果
結果として、本試験のために選択したｍｉＲＮＡ構築物が、ＡＴＸＮ２をサイレンシングできることが観察された。ＡＴＸＮ２－ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡシグナルは、一般に、２５％～７４％の範囲であった（図２Ｂ）。ｍｉＲＮＡ構築物２は、試験したもののうちで最良のノックダウン効果を示した。ノックダウン有効性は、ＡＴＸＮ２対ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡシグナルの比の逆数であるため、ＡＴＸＮ２対ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡシグナルのパーセンテージ値が低いほど、ノックダウン有効性が高い。対照（ＣＯＮＴ）は、非標的化ｍｉＲＮＡであり、ノックダウンを示さない。 Results: As a result, it was observed that the miRNA constructs selected for this study were able to silence ATXN2. The ATXN2-GAPDH mRNA signals generally ranged from 25% to 74% (Figure 2B). miRNA construct 2 showed the best knockdown effect among those tested. Since the knockdown efficacy is the inverse of the ratio of ATXN2 to GAPDH mRNA signals, the lower the percentage value of ATXN2 to GAPDH mRNA signals, the higher the knockdown efficacy. The control (CONT) is a non-targeting miRNA and shows no knockdown.
更に、第２ラウンドで選択されたｍｉＲＮＡ構築物もまた、ＡＴＸＮ２をサイレンシングできたことを観察した（図２Ｃ）。ｍｉＲＮＡ構築物２は、対照（ＣＯＮＴ）と比較したｍＲＮＡ発現のパーセンテージが最も低いことから明らかなように、試験したもののうちで最良のノックダウン効果を示した。対照（ＣＯＮＴ）は、非標的化ｍｉＲＮＡであり、ノックダウンを示さない。Furthermore, we observed that the miRNA constructs selected in the second round were also able to silence ATXN2 (Figure 2C). miRNA construct 2 showed the best knockdown effect among those tested, as evidenced by the lowest percentage of mRNA expression compared to the control (CONT), a non-targeting miRNA that showed no knockdown.
実施例４．ウイルストランスフェクション後のプローブベースのｑＰＣＲアッセイを介した、ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＴＸＮ２特異的ｍｉＲＮＡ構築物のノックダウン有効性の決定Example 4. Determining the knockdown efficacy of ATXN2-specific miRNA constructs in HEK293 cells via a probe-based qPCR assay after viral transfection.
目的
本試験の目的は、ウイルストランスフェクション後のプローブベースのｑＰＣＲアッセイを介して、ＨＥＫ２９３細胞におけるいくつかの内因性ＡＴＸＮ２ ｍｉＲＮＡ構築物のノックダウン有効性を評価することであった。 Objective The objective of this study was to evaluate the knockdown efficacy of several endogenous ATXN2 miRNA constructs in HEK293 cells via a probe-based qPCR assay after viral transfection.
材料及び方法
ＨＥＫ２９３細胞に、上記実施例１～３に記載されるＡＴＸＮ２特異的ｍｉＲＮＡ構築物のいくつかをコードするＡＡＶベクターを形質導入した。プローブベースのｑＰＣＲアッセイを実施して、各ベクターによって達成されたノックダウンの有効性を、陰性対照と比較して測定した。この実施例における構築物の番号付けは、実施例１と同一である。 Materials and Methods HEK293 cells were transduced with AAV vectors encoding several of the ATXN2-specific miRNA constructs described in Examples 1-3 above. Probe-based qPCR assays were performed to measure the efficacy of knockdown achieved by each vector compared to a negative control. The numbering of constructs in this example is the same as in Example 1.
結果
結果として、本試験のために選択したｍｉＲＮＡ構築物が、ＡＴＸＮ２をサイレンシングできることが観察された。ＡＴＸＮ２－ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡシグナルは、一般に、５４％～８６％の範囲であった（図３）。ｍｉＲＮＡ構築物２は、試験したもののうちで最良のノックダウン効果を示した。ノックダウン有効性は、ＡＴＸＮ２対ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡシグナルの比の逆数であるため、ＡＴＸＮ２対ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡシグナルのパーセンテージ値が低いほど、ノックダウン有効性が高い。対照（ＣＯＮＴ）は、非標的化ｍｉＲＮＡであり、ノックダウンを示さない。 Results: As a result, it was observed that the miRNA constructs selected for this study were able to silence ATXN2. The ATXN2-GAPDH mRNA signals generally ranged from 54% to 86% (Figure 3). miRNA construct 2 showed the best knockdown effect among those tested. Since the knockdown efficacy is the inverse of the ratio of ATXN2 to GAPDH mRNA signals, the lower the percentage value of ATXN2 to GAPDH mRNA signals, the higher the knockdown efficacy. The control (CONT) is a non-targeting miRNA and shows no knockdown.
実施例５．ＢＡＣ－Ｑ７２マウスの視床内へＡＡＶ ｍｉＲ－ＡＴＸＮ２構築物の送達した後、マウス組織におけるＡＴＸＮ２特異的ｍｉＲＮＡ構築物のノックダウン有効性の決定Example 5. Determining the knockdown efficacy of an ATXN2-specific miRNA construct in mouse tissues after delivery of an AAV miR-ATXN2 construct into the thalamus of BAC-Q72 mice.
目的
本試験の目的は、ＢＡＣ－Ｑ７２マウスの視床内へＡＡＶ ｍｉＲ－ＡＴＸＮ２構築物を送達した後、マウス組織におけるＡＴＸＮ２特異的ｍｉＲＮＡ構築物のノックダウン有効性を評価することであった。 Objectives The objective of this study was to evaluate the knockdown efficacy of an ATXN2-specific miRNA construct in mouse tissues after delivery of the AAV miR-ATXN2 construct into the thalamus of BAC-Q72 mice.
材料及び方法
ＡＡＶ、またはＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を、８～１２週齢のＢＡＣ－Ｑ７２マウスの視床内に、定位注入によって注入した。ＢＡＣ－Ｑ７２マウスは、ＡＴＸＮ２遺伝子にＣＡＧ７２リピートを発現している、トランスジェニックマウスである。これらのマウスでは、調節領域を含む１５０ｋｂのヒトＡＴＸＮ２遺伝子座全体を含有する１６９ｋｂのヒトＢＡＣ（ＲＰ１１－７９８Ｌ５）を操作して、内因性ＡＴＸＮ２エクソン－１のＣＡＧ２２をＣＡＧ７２リピートで置き換えた。一方の半球からの視床、及び大脳皮質下部を、視床内投与の６週間後に採取し、ｑＰＣＲを使用して、マウス、及びヒトのＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ発現について分析した。 Materials and Methods: AAV or phosphate-buffered saline (PBS) was injected into the thalamus of 8- to 12-week-old BAC-Q72 mice by stereotactic injection. BAC-Q72 mice are transgenic mice expressing the CAG72 repeat in the ATXN2 gene. In these mice, a 169-kb human BAC (RP11-798L5) containing the entire 150-kb human ATXN2 locus, including the regulatory region, was engineered to replace CAG22 in endogenous ATXN2 exon-1 with the CAG72 repeat. The thalamus and hypocortex from one hemisphere were harvested 6 weeks after intrathalamic injection and analyzed for mouse and human ATXN2 mRNA expression using qPCR.
組織の回収後、ホモジナイズしたマウス組織を使用して、プローブベースのｑＰＣＲアッセイを実施し、各ＡＴＸＮ２特異的ｍｉＲＮＡ構築物によって達成されたノックダウンの有効性を、陰性対照と比較して測定した。ベクター発現は、視床では、ｑＰＣＲを使用してウイルスゲノムの量（ｖｇ）を測定することによって確認した（データは示さず）。After tissue collection, probe-based qPCR assays were performed using homogenized mouse tissue to measure the efficacy of knockdown achieved by each ATXN2-specific miRNA construct compared to a negative control. Vector expression was confirmed in the thalamus by measuring viral genome quantity (vg) using qPCR (data not shown).
本試験における実験は、構築物２を用いた小スケールのパイロット試験と、続いて複数のＡＴＸＮ２特異的ｍｉＲＮＡ構築物を含む大規模試験との２回実施した。小規模パイロット試験では、マウス視床、及び大脳皮質下部で、マウス、及びヒトＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡの両方を測定したが、大スケール試験では、ヒトＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡのみを測定した。実験群は、パイロット試験では、１ｅ８ウイルスゲノム／半休（ｖｇ／ｈｅｍ）、または１ｅ９ｖｇ／ｈｅｍの用量を含むＡＡＶ注入を受けたが、大規模試験では、１ｅ９ｖｇ／ｈｅｍのＡＡＶ用量のみを注入した。小規模パイロット試験では、ＰＢＳ群を、対照として使用した。ＰＢＳ群は、内因性ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡのサイレンシングを行わず、ベースラインとした。大規模試験では、３つの対照群が存在した：ダルベッコリン酸緩衝食塩水を注入したＰＢＳ－マウス、ナイーブ－非注入マウス、及びＡＴＸＮ２ ｍｉＲＮＡに特異的ではないｍｉＲＮＡカセットを注入したｎｅｇ－マウスである。３つの対照群全ての内因性ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡのサイレンシングは無視できる程度であり、ＰＢＳ群が、ベースラインとして機能した。この実施例における構築物の番号付けは、実施例１と同一のである。This study was conducted twice: a small-scale pilot study using construct 2, followed by a larger-scale study involving multiple ATXN2-specific miRNA constructs. In the small-scale pilot study, both mouse and human ATXN2 mRNA were measured in the mouse thalamus and hypocortex, whereas in the larger-scale study, only human ATXN2 mRNA was measured. Experimental groups received AAV injections containing a dose of 1e8 viral genomes/half-life (vg/hem) or 1e9 vg/hem in the pilot study, whereas in the larger-scale study, only the 1e9 vg/hem AAV dose was injected. In the small-scale pilot study, a PBS group served as a control. The PBS group did not silence endogenous ATXN2 mRNA and served as a baseline. In the large-scale study, there were three control groups: PBS-mice injected with Dulbecco's phosphate-buffered saline, naive-uninjected mice, and neg-mice injected with a miRNA cassette not specific to ATXN2 miRNA. Silencing of endogenous ATXN2 mRNA was negligible in all three control groups, and the PBS group served as the baseline. The numbering of the constructs in this example is the same as in Example 1.
結果
その結果、パイロット試験用に選択されたｍｉＲＮＡ構築物２は、マウス視床（図４Ａ、及び図４Ｂの左パネル）、ならびに大脳皮質下部（図４Ａ、及び図４Ｂの右パネル）では、ヒトＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ（図４Ａ）、及びマウスＡｔｘｎ２ ｍＲＮＡ（図４Ｂ）の両方を、用量依存的にサイレンシングすることができたことが観察された。ｍｉＲＮＡ構築物２を注入した動物は、対照と比較して、マウス、及びヒトＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡのパーセンテージが低いことを示した。ＰＢＳ群は、内因性ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡのサイレンシングを行わず、ベースラインとした。 Results: The results showed that miRNA construct 2, selected for the pilot study, was able to dose-dependently silence both human ATXN2 mRNA ( FIG. 4A ) and mouse Atxn2 mRNA ( FIG. 4B ) in the mouse thalamus ( FIG. 4A and FIG. 4B , left panels) and the hypocortex ( FIG. 4A and FIG. 4B , right panels). Animals injected with miRNA construct 2 showed lower percentages of mouse and human ATXN2 mRNA compared with controls. The PBS group did not silence endogenous ATXN2 mRNA and served as the baseline.
複数のＡＴＸＮ２特異的ｍｉＲＮＡ構築物を含む大規模試験では、本試験のために選択したｍｉＲＮＡ構築物の各々が、対照と比較してＡＴＸＮ２をサイレンシングすることができたことが観察され、ｍｉＲＮＡ構築物２は、試験したもののうちで最良のノックダウン有効性を示した。対照と比較したヒトＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡ発現の最低パーセンテージ（図５）。投与した特定のｍｉＲＮＡで観察されたノックダウンのパーセンテージは、１２％～４５％の範囲であった。ＰＢＳ群は、内因性ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡのサイレンシングを行わず、ベースラインとした。In a large-scale study including multiple ATXN2-specific miRNA constructs, it was observed that each of the miRNA constructs selected for this study was able to silence ATXN2 compared to the control, with miRNA construct 2 demonstrating the best knockdown efficacy among those tested, resulting in the lowest percentage of human ATXN2 mRNA expression compared to the control (Figure 5). The percentage of knockdown observed for the specific miRNAs administered ranged from 12% to 45%. The PBS group did not silence endogenous ATXN2 mRNA and served as the baseline.
他の実施形態
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも独立した刊行物、または特許出願の各々が具体的に別に参照により組み込まれることが示されているものと同様にして、参照により本明細書に組み込まれる。 Other Embodiments All publications, patents, and patent applications mentioned in this specification are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication or patent application was specifically and separately indicated to be incorporated by reference.
本発明をその特定の実施形態と共に記載してきたが、本発明は、更なる変更が可能であり、かつ、本出願が、一般的に本発明の原理に従った、本発明が関係する当該技術分野では知られる、または慣例的な実施の範囲内の本発明からの逸脱を含む、本発明のあらゆる変形、使用、または適応を網羅するが意図され、上記に記載した本質的な特徴に適用可能であり、特許請求の範囲に従うことが理解されよう。
他の実施形態は、特許請求の範囲内である。 While the invention has been described in connection with particular embodiments thereof, it will be understood that the invention is capable of further modifications, and that this application is intended to cover any variations, uses, or adaptations of the invention which generally follow the principles of the invention and include departures from the invention within known or customary practice in the art to which the invention pertains, as applicable to the essential features described above, and which comply with the scope of the claims.
Other embodiments are within the scope of the following claims.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5139941A (en) | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
| US5766960A (en) | 1987-07-27 | 1998-06-16 | Australian Membrane And Biotechnology Research Institute | Receptor membranes |
| US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
| US5466468A (en) | 1990-04-03 | 1995-11-14 | Ciba-Geigy Corporation | Parenterally administrable liposome formulation comprising synthetic lipids |
| US5173414A (en) | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
| EP0752248B1 (en) | 1992-11-13 | 2000-09-27 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma |
| US5869305A (en) | 1992-12-04 | 1999-02-09 | The University Of Pittsburgh | Recombinant viral vector system |
| US6204059B1 (en) | 1994-06-30 | 2001-03-20 | University Of Pittsburgh | AAV capsid vehicles for molecular transfer |
| US6001650A (en) | 1995-08-03 | 1999-12-14 | Avigen, Inc. | High-efficiency wild-type-free AAV helper functions |
| US5801030A (en) | 1995-09-01 | 1998-09-01 | Genvec, Inc. | Methods and vectors for site-specific recombination |
| US6268210B1 (en) | 1998-05-27 | 2001-07-31 | Hyseq, Inc. | Sandwich arrays of biological compounds |
| US6232068B1 (en) | 1999-01-22 | 2001-05-15 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Monitoring of gene expression by detecting hybridization to nucleic acid arrays using anti-heteronucleic acid antibodies |
| DE10120829A1 (en) | 2000-04-27 | 2001-12-20 | Max Delbrueck Centrum | Gene transfer method, useful in therapy, diagnosis and preparing transgenic animals, uses both components of the Sleeping Beauty transfer system |
| JP5170934B2 (en) | 2001-08-16 | 2013-03-27 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | Synthesis and use of reagents for improved DNA lipofection and / or sustained release prodrugs and drug therapy |
| KR20070085113A (en)* | 2004-05-11 | 2007-08-27 | 가부시키가이샤 알파젠 | Polynucleotides causing RNA interference, and gene expression inhibition method using the same |
| ES2384440T3 (en) | 2005-10-18 | 2012-07-04 | Precision Biosciences | Rationally designed meganucleases with sequence specificity and altered DNA binding affinity |
| WO2008143786A1 (en) | 2007-05-14 | 2008-11-27 | The Rockefeller University | Production of artificial micrornas using synthetic microrna precursors |
| EP1995316A1 (en) | 2007-05-25 | 2008-11-26 | Qiagen GmbH | Method for gentle purification of cells, cell production and cell transfection |
| EP2009095A1 (en) | 2007-06-28 | 2008-12-31 | Innovalor AG | Method of generating glucose-responsive cells |
| CA2704383A1 (en) | 2007-10-31 | 2009-05-07 | James Jefferson Smith | Rationally-designed single-chain meganucleases with non-palindromic recognition sequences |
| WO2010085699A2 (en) | 2009-01-23 | 2010-07-29 | The Johns Hopkins University | Mammalian piggybac transposon and methods of use |
| US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
| MA44546B1 (en) | 2016-06-15 | 2021-03-31 | Univ California | Variant adeno-associated viruses and methods of use |
| MX2021000922A (en)* | 2018-07-25 | 2021-03-31 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Compounds and methods for reducing atxn2 expression. |
| WO2021159008A2 (en)* | 2020-02-07 | 2021-08-12 | Maze Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating neurodegenerative diseases |
| US20240294906A1 (en)* | 2020-07-29 | 2024-09-05 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Atxn2 irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing atxn2-associated neurodegenerative diseases |
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2023342734A1 (en) | 2025-03-27 |
| WO2024056902A2 (en) | 2024-03-21 |
| EP4587568A2 (en) | 2025-07-23 |
| WO2024056902A3 (en) | 2024-04-18 |
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2019227726B2 (en) | Novel adeno-associated virus (AAV) vectors, aav vectors having reduced capsid deamidation and uses therefor | |
| AU2019228504B2 (en) | Novel adeno-associated virus (AAV) vectors, AAV vectors having reduced capsid deamidation and uses therefor | |
| US20210269825A1 (en) | Compositions and methods for reducing spliceopathy and treating rna dominance disorders | |
| US20230407333A1 (en) | Aav capsids and compositions containing same | |
| JP7500429B2 (en) | Compositions and methods for the treatment of dominantly inherited catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia - Patent Application 20070123333 | |
| US20240376497A1 (en) | Frataxin gene therapy | |
| JP2025531201A (en) | Compositions and methods for treating neurological disorders | |
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| AU2023392154A1 (en) | Compositions and methods for treating neurological diseases | |
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| US20230119699A1 (en) | Diagnostic methods using sirt1 expression | |
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| US20250235513A1 (en) | Vectors and methods for the treatment of neurodegeneration, delaying cognitive decline, and improving memory | |
| TW202409290A (en) | Compositions and methods for the treatment of myotonic dystrophies | |
| WO2024154102A1 (en) | Compositions and methods for administration of therapeutic and diagnostic agents to the central nervous system | |
| EA049701B1 (en) | NEW VECTORS BASED ON ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAV), AAV VECTORS WITH REDUCED CAPSID DEAMIDATION, AND THEIR APPLICATION |
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