JP2023105453A - Biological Nucleic Acid Recovery Method and Biological Nucleic Acid Recovery Device - Google Patents
Biological Nucleic Acid Recovery Method and Biological Nucleic Acid Recovery DeviceDownload PDFInfo
- Publication number
- JP2023105453A JP2023105453AJP2022006287AJP2022006287AJP2023105453AJP 2023105453 AJP2023105453 AJP 2023105453AJP 2022006287 AJP2022006287 AJP 2022006287AJP 2022006287 AJP2022006287 AJP 2022006287AJP 2023105453 AJP2023105453 AJP 2023105453A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- biological
- recovery
- recovering
- acid recovery
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Translated fromJapaneseDescription
Translated fromJapanese本開示は、生物由来核酸回収方法、および、生物由来核酸回収装置に関する。 The present disclosure relates to a biological nucleic acid recovery method and a biological nucleic acid recovery device.
環境中に存在する生物種を調査あるいはモニタリングする方法として、環境中から生物由来核酸を回収し、回収した核酸を解析して、この核酸が由来する生物種を特定する方法が挙げられる。生物由来核酸とは、生物の遺伝情報を含み、生物から環境中へと放出された核酸であり、環境ＤＮＡ等の環境中に存在する核酸に含まれる。このような生物由来核酸を環境中から回収して解析する方法としては、例えば、河川等の水域から採取した水試料（環境水試料）を、環境ＤＮＡ分析に供する方法が知られている（例えば、特許文献１および特許文献２参照）。また、陸生哺乳類を検出する方法としては、定点カメラの映像解析結果と組み合わせて、カメラの近傍で土壌を採取（例えば、２ｍごとに深さ２ｃｍで土壌をサンプリング）して、環境ＤＮＡ解析を行う方法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。 Examples of methods for investigating or monitoring biological species present in the environment include methods for recovering biological nucleic acids from the environment, analyzing the recovered nucleic acids, and identifying the biological species from which the nucleic acids are derived. An organism-derived nucleic acid is a nucleic acid containing genetic information of an organism and released into the environment from the organism, and is included in nucleic acids present in the environment such as environmental DNA. As a method for collecting and analyzing such biological nucleic acids from the environment, for example, a method of subjecting a water sample (environmental water sample) collected from a water area such as a river to environmental DNA analysis is known (e.g. , see Patent Documents 1 and 2). In addition, as a method for detecting terrestrial mammals, in combination with the video analysis results of a fixed-point camera, soil is sampled near the camera (for example, soil is sampled at a depth of 2 cm every 2 m), and environmental DNA analysis is performed. A method is known (see, for example, Non-Patent Document 1).
しかしながら、水試料を分析する場合には、試料を採取した水域に生息する魚類や水鳥、あるいは、水域を訪れた動物などの核酸しか回収できないため、水域から離れて生息する陸生生物についても、生物由来核酸を回収して解析することが望まれていた。特に、水中では核酸は分解されやすい性質を有するため、比較的分解され難い乾燥状態で生物由来核酸が存在する陸上から生物由来核酸を回収することにより、網羅的に存在する生物種を調査・モニタリング可能になることが期待される。陸域の生物由来核酸の回収方法として、非特許文献１に記載のように解析対象として土壌を採取する場合には、広範囲にサンプリングを行うことが困難であった。そのため、広い範囲を対象として、陸上の生物に由来する核酸を回収できる技術が望まれていた。 However, when analyzing water samples, nucleic acids can only be recovered from fish and waterfowl that live in the water area where the sample was collected, or from animals that have visited the water area. It has been desired to recover and analyze the derived nucleic acid. In particular, since nucleic acids are easily degraded in water, by recovering biological nucleic acids from land where biological nucleic acids exist in a dry state where they are relatively difficult to decompose, comprehensively survey and monitor the existing biological species. expected to be possible. When collecting soil as an analysis target as described in Non-Patent Document 1 as a method for collecting biological nucleic acids in terrestrial areas, it has been difficult to perform sampling over a wide area. Therefore, there has been a demand for a technique capable of recovering nucleic acids derived from terrestrial organisms over a wide range.
本開示は、以下の形態として実現することが可能である。
（１）本開示の一形態によれば、環境中から生物由来核酸を回収する生物由来核酸回収方法が提供される。この生物由来核酸回収方法は、環境中の核酸を回収する対象として、地表および物表面のうちの少なくとも一方を含む回収対象区域を設定し、前記回収対象区域に対して、前記生物由来核酸を含む核酸含有堆積物を回収するための核酸回収体を接触させて、前記回収対象区域の表面に存在する前記核酸含有堆積物を前記核酸回収体に付着させ、前記核酸回収体に付着した前記核酸含有堆積物を液中に懸濁させて懸濁液を作製し、前記懸濁液を、フィルタを用いてろ過し、ろ過の残渣が付着する前記フィルタから核酸を抽出する。
この形態の生物由来核酸回収方法によれば、設定された回収対象区域に対して、生物由来核酸回収装置が備える核酸回収体を接触させることによって、回収対象区域の表面に存在する生物由来核酸を含む核酸含有堆積物を核酸回収体に付着させて、核酸含有堆積物を回収する。このように、回収対象区域の核酸含有堆積物を回収するために、回収対象区域に核酸回収体を接触させるという簡便な動作を行えばよいため、回収対象区域において、陸上の生物に由来する核酸を、広い範囲から網羅的にサンプリングすることが可能になる。また、回収対象区域の表面から回収される核酸含有堆積物は、回収対象区域の表面で生息する生物に由来する核酸だけでなく、大気中に放出された生物由来核酸も含み得るため、回収対象区域に生息あるいは滞在したより広い生物種の生物由来核酸を回収することが可能になる。さらに、回収した核酸含有堆積物から核酸を抽出する際に、抽出の工程に先立って、核酸回収体に付着した核酸含有堆積物の懸濁液を作製し、得られた懸濁液を、フィルタを用いてろ過することにより、フィルタ上で核酸含有堆積物を濃縮して、核酸の抽出に供している。そのため、核酸含有堆積物から抽出した核酸を解析する際に、回収した核酸含有堆積物のうちのより多くを対象として核酸抽出することができ、解析対象となる核酸の網羅性を高めることができる。
（２）上記形態の生物由来核酸核酸回収方法において、前記ろ過は、平均孔径が０．２２～１０μｍであって、シリンジを取り付け可能なハウジングを備えたカートリッジ式フィルタあるいはディスクフィルタを用いることとしてもよい。このような構成とすれば、生物由来核酸を含有する核酸含有堆積物を、効率よく回収することができる。また、設定した回収対象区域からのサンプリングによる生物種の網羅的な解析を、比較的小スケールで抽出処理を行うことにより実行可能になる。また、懸濁液のろ過の工程における不純物の混入を抑えることが容易になる。
（３）上記形態の生物由来核酸核酸回収方法において、ろ過の残渣が付着する前記フィルタからの核酸の抽出は、攪拌処理、ビーズ破砕処理、超音波処理、加熱処理のうちの少なくとも一つを含む処理により行われることとしてもよい。このような構成とすれば、核酸含有堆積物からの核酸抽出の効率を高めることができる。
（４）上記形態の生物由来核酸核酸回収方法において、前記核酸回収体は、前記核酸回収体を前記回収対象区域に接触させるための接触面を有する本体部の前記接触面を覆うように、前記本体部に対して着脱可能に取り付けられており、前記核酸回収体に覆われた前記本体部の前記接触面を前記回収対象区域に接触させて、前記核酸含有堆積物を前記核酸回収体に付着させ、前記核酸含有堆積物が付着した前記回収体を前記本体部から取り外して前記液に加え、前記懸濁液を作製することとしてもよい。このような構成とすれば、核酸回収体が着脱可能に取り付けられた本体部を備える装置を用いることで、回収対象区域の表面から核酸含有堆積物を回収する動作を容易に行うことができる。
（５）上記形態の生物由来核酸核酸回収方法において、前記核酸回収体として、シート状の核酸回収体を用いることとしてもよい。このような構成とすれば、核酸回収体に核酸含有堆積物を付着させる動作、および、核酸回収体に付着した核酸含有堆積物を液中に懸濁させて懸濁液を作製する動作を、容易に行うことができる。
（６）上記形態の生物由来核酸核酸回収方法において、前記懸濁液の作製は、前記核酸回収体のうち、前記回収対象区域に接触させた部位の全体を前記液に加えて行うこととしてもよい。このような構成とすれば、解析対象となる核酸の網羅性をさらに高めることができる。
（７）上記形態の生物由来核酸核酸回収方法において、前記懸濁液をろ過する際に、前記フィルタとして、目の粗さが異なる複数のフィルタを用いると共に、目の粗さが次第に細かくなる順で、前記複数のフィルタの各々を用いたろ過を行い、ろ過の残渣が付着する前記複数のフィルタを合わせて、前記複数のフィルタから核酸を抽出することとしてもよい。このような構成とすれば、回収できる核酸含有堆積物の粒径の範囲を広く確保すると共に、ろ過できる懸濁液の量をより多くして、回収できる核酸量を増加させ、生物種の検出精度を向上させることができる。
（８）本開示の他の一形態によれば、環境中に存在する生物種をモニタリングする生物種モニタリング方法が提供される。この生物種モニタリング方法は、（１）から（７）までのいずれか一項に記載の核酸回収方法により生物由来核酸を抽出し、抽出した前記生物由来核酸を解析して、前記生物由来核酸が由来する生物種を特定する工程を含む。
この形態の生物種モニタリング方法によれば、回収対象区域として設定した範囲から網羅的にサンプリングされた核酸を用いて、回収対象区域に生息あるいは滞在した陸生生物についてのモニタリングを行うことが可能になる。
（９）本開示のさらに他の一形態によれば、環境中から生物由来核酸を回収する核酸回収装置が提供される。この核酸回収装置は、前記生物由来核酸を回収する対象である回収対象区域に存在する核酸含有堆積物を付着させるための核酸回収体と、前記核酸回収体を前記回収対象区域に接触させるための接触面を有し、前記接触面を覆うように前記核酸回収体が着脱可能に取り付けられた本体部と、前記核酸回収体および前記本体部とは別体で設けられ、前記核酸回収体を前記本体部に固定する取り付け具と、を備える。
この形態の核酸回収装置によれば、核酸回収体を回収対象区域に接触させて、回収対象区域に存在する核酸含有堆積物を回収体に付着させる動作を、容易に行うことができる。また、核酸回収体および本体部とは別体で設けられた取り付け具を用いて、核酸回収体を本体部に固定するため、例えば取り付け具を単回使用する場合には、取り付け具の材料の選択の自由度を確保しつつ、前回使用時に取り付け具に付着した生物由来核酸が残留することを容易に抑えることができる。また、前回使用時に付着した生物由来核酸が残留することを抑える処理を取り付け具に施して、取り付け具を再使用する場合であっても、取り付け具を別体とすることで、核酸回収体を本体部に取り付けるための形状を単純化して、上記処理を容易化することができる。
（１０）本開示のさらに他の一形態によれば、環境中から生物由来核酸を回収する核酸回収装置が提供される。この核酸回収装置は、前記生物由来核酸を回収する対象である回収対象区域に存在する核酸含有堆積物を付着させるための核酸回収体と、前記核酸回収体を前記回収対象区域に接触させるための接触面を有し、前記接触面を覆うように前記核酸回収体が着脱可能に取り付けられる本体部と、を備え、前記本体部のうち、少なくとも前記接触面を含む部位は、ポリエチレン、シリコーン、熱可塑性エラストマ（ＴＰＥ）から選択される材料により構成される。
この形態の核酸回収装置によれば、核酸回収体を回収対象区域に接触させて、回収対象区域に存在する核酸含有堆積物を回収体に付着させる動作を、容易に行うことができる。また、本体部のうち、少なくとも上記接触面を含む部位は、ポリエチレン、シリコーン、熱可塑性エラストマ（ＴＰＥ）から選択される材料、すなわち、生物由来核酸の残留を抑える処理が可能な材料の中でも、比較的柔らかい材料により構成している。そのため、地表などの凹凸のある回収対象区域の表面に本体部の接触面を押し当てて、核酸含有堆積物を核酸回収体に付着させる際に、接触面の形状を回収対象区域の表面の形状に沿わせて、核酸含有堆積物の回収効率を高めることが可能になる。
本開示は、上記以外の種々の形態で実現可能であり、例えば、生物由来核酸の抽出方法や、生物由来核酸の解析方法などの形態で実現することが可能である。The present disclosure can be implemented as the following forms.
(1) According to one aspect of the present disclosure, there is provided a biological nucleic acid recovery method for recovering biological nucleic acids from the environment. In this method for recovering nucleic acids in the environment, a recovery target area including at least one of the surface of the earth and the surface of an object is set as a target for recovering nucleic acids in the environment, and the target recovery area includes the biological nucleic acid. A nucleic acid recovery material for recovering nucleic acid-containing deposits is brought into contact with the nucleic acid-containing deposit present on the surface of the recovery target area to adhere to the nucleic acid recovery material, and the nucleic acid-containing material attached to the nucleic acid recovery material is attached to the nucleic acid recovery material. A suspension is prepared by suspending the sediment in a liquid, the suspension is filtered using a filter, and nucleic acid is extracted from the filter to which the filtration residue adheres.
According to the method for isolating biological nucleic acid of this aspect, the nucleic acid recovering material provided in the apparatus for isolating biological nucleic acid is brought into contact with the set target area for recovery, thereby removing the biological nucleic acid present on the surface of the target area for recovery. The nucleic acid-containing deposit is attached to a nucleic acid recovery material to recover the nucleic acid-containing deposit. In this way, in order to recover the nucleic acid-containing deposits in the recovery target area, a simple operation of bringing the nucleic acid recovery material into contact with the recovery target area is performed. can be comprehensively sampled from a wide range. In addition, the nucleic acid-containing sediments recovered from the surface of the recovery target area may contain not only nucleic acids derived from organisms living on the surface of the recovery target area, but also organism-derived nucleic acids released into the atmosphere. It becomes possible to recover organism-derived nucleic acids of a wider range of organisms that inhabited or stayed in the area. Furthermore, when extracting nucleic acids from the collected nucleic acid-containing deposits, prior to the extraction step, a suspension of the nucleic acid-containing deposits attached to the nucleic acid recovery material is prepared, and the obtained suspension is filtered. is used to concentrate the nucleic acid-containing deposits on the filter for nucleic acid extraction. Therefore, when analyzing the nucleic acids extracted from the nucleic acid-containing deposits, nucleic acids can be extracted from more of the collected nucleic acid-containing deposits, and the comprehensiveness of the nucleic acids to be analyzed can be improved. .
(2) In the biological nucleic acid isolation method of the above embodiment, the filtration may be performed using a cartridge filter or disc filter having an average pore size of 0.22 to 10 μm and having a housing to which a syringe can be attached. good. With such a configuration, nucleic acid-containing deposits containing biological nucleic acids can be efficiently collected. In addition, exhaustive analysis of biological species by sampling from the set recovery target area can be performed by performing extraction processing on a relatively small scale. In addition, it becomes easy to suppress the contamination of impurities in the step of filtering the suspension.
(3) In the method for isolating nucleic acid of biological origin according to the above aspect, the extraction of nucleic acid from the filter to which the residue of filtration is attached includes at least one of stirring treatment, bead crushing treatment, ultrasonic treatment, and heat treatment. It may be performed by processing. With such a configuration, the efficiency of nucleic acid extraction from nucleic acid-containing deposits can be enhanced.
(4) In the method for recovering nucleic acid of the above aspect, the nucleic acid recovery material covers the contact surface of the main body having a contact surface for bringing the nucleic acid recovery material into contact with the recovery target area. The contact surface of the main body, which is detachably attached to the main body and is covered with the nucleic acid recovery material, is brought into contact with the recovery target area to attach the nucleic acid-containing deposit to the nucleic acid recovery material. Then, the collection body to which the nucleic acid-containing deposit has adhered may be removed from the main body and added to the liquid to prepare the suspension. With such a configuration, the operation of recovering nucleic acid-containing deposits from the surface of the area to be recovered can be easily performed by using an apparatus having a main body to which the nucleic acid recovery material is detachably attached.
(5) In the above-described method for recovering nucleic acid derived from organisms, a sheet-like recovered nucleic acid may be used as the recovered nucleic acid. With such a configuration, the operation of attaching the nucleic acid-containing deposits to the nucleic acid recovery material, and the operation of suspending the nucleic acid-containing deposits attached to the nucleic acid recovery material in a liquid to prepare a suspension are performed by: It can be done easily.
(6) In the above-described method for isolating nucleic acid of biological origin, the suspension may be prepared by adding the entire portion of the recovered nucleic acid material that is in contact with the area to be recovered to the solution. good. With such a configuration, coverage of nucleic acids to be analyzed can be further enhanced.
(7) In the biological nucleic acid isolation method of the above aspect, when filtering the suspension, a plurality of filters with different meshes are used as the filter, and the meshes are gradually finer. , filtration using each of the plurality of filters may be performed, and the plurality of filters to which filtration residues adhere may be combined to extract nucleic acids from the plurality of filters. With such a configuration, a wide range of particle diameters of the nucleic acid-containing deposits that can be recovered is ensured, and the amount of the suspension that can be filtered is increased to increase the amount of nucleic acids that can be recovered, thereby detecting biological species. Accuracy can be improved.
(8) According to another aspect of the present disclosure, there is provided a biological species monitoring method for monitoring biological species present in the environment. In this biological species monitoring method, the biological nucleic acid is extracted by the nucleic acid recovery method according to any one of (1) to (7), the extracted biological nucleic acid is analyzed, and the biological nucleic acid is It includes a step of identifying the originating organism species.
According to this form of species monitoring method, it is possible to monitor terrestrial organisms that inhabited or stayed in the recovery target area using nucleic acids comprehensively sampled from the range set as the recovery target area. .
(9) According to still another aspect of the present disclosure, there is provided a nucleic acid recovery device for recovering biological nucleic acids from the environment. This nucleic acid recovery apparatus includes a nucleic acid recovery body for adhering nucleic acid-containing deposits present in a recovery target area from which the biological nucleic acid is recovered, and a nucleic acid recovery body for bringing the nucleic acid recovery body into contact with the recovery target area. A body portion having a contact surface and to which the nucleic acid recovery material is detachably attached so as to cover the contact surface; and a fixture for fixing to the main body.
According to the apparatus for recovering nucleic acid of this embodiment, it is possible to easily carry out the operation of bringing the nucleic acid recovery material into contact with the recovery target area and causing the nucleic acid-containing deposits present in the recovery target area to adhere to the recovery material. In addition, since the nucleic acid recovery product is fixed to the main body using a fixture provided separately from the nucleic acid recovery product and the main body, for example, when the fixture is used only once, the material of the attachment is limited. While securing the degree of freedom of selection, it is possible to easily suppress the remaining of the biological nucleic acid attached to the attachment during the previous use. In addition, even if the fixture is subjected to a treatment to suppress the remaining of the biological nucleic acid that adhered during the previous use, and the fixture is reused, the nucleic acid recovery material can be recovered by separating the fixture. The above processing can be facilitated by simplifying the shape for attachment to the main body.
(10) According to still another aspect of the present disclosure, there is provided a nucleic acid recovery device for recovering biological nucleic acids from the environment. This nucleic acid recovery apparatus includes a nucleic acid recovery body for adhering nucleic acid-containing deposits present in a recovery target area from which the biological nucleic acid is recovered, and a nucleic acid recovery body for contacting the recovery target area. a main body portion having a contact surface and to which the nucleic acid recovery material is detachably attached so as to cover the contact surface; Constructed from a material selected from plastic elastomers (TPE).
According to the apparatus for recovering nucleic acid of this form, it is possible to easily carry out the operation of bringing the nucleic acid recovery material into contact with the recovery target area and causing the nucleic acid-containing deposits present in the recovery target area to adhere to the recovery material. In addition, of the main body, the portion including at least the contact surface is made of a material selected from polyethylene, silicone, and thermoplastic elastomer (TPE), that is, among materials that can be treated to suppress residual biological nucleic acids, comparison Constructed from soft material. Therefore, when the contact surface of the main body is pressed against the surface of the collection target area with unevenness such as the ground surface to adhere the nucleic acid-containing deposits to the nucleic acid recovery material, the shape of the contact surface is adjusted to the shape of the surface of the collection target area. , it is possible to improve the recovery efficiency of nucleic acid-containing deposits.
The present disclosure can be realized in various forms other than those described above, for example, it can be realized in the form of a method for extracting biological nucleic acids, a method for analyzing biological nucleic acids, and the like.
Ａ．第１実施形態：
（Ａ－１）生物由来核酸回収方法の概要：
図１は、第１実施形態の生物由来核酸回収方法を表すフローチャートである。ここで、生物由来核酸とは、生物の遺伝情報を含む核酸として、生物を構成していた物質である。回収する生物由来核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とすればよいが、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む生物由来核酸を、回収および解析の対象としてもよい。本実施形態では、生物由来核酸を回収するために、生物由来核酸回収装置を用いて、生物由来核酸を回収する対象となる回収対象区域から、生物由来核酸を含む核酸含有堆積物を回収している。回収対象区域は、地表および物表面のうちの少なくとも一方を含む。すなわち、回収対象区域は、屋外の地表や、屋内の床の表面を含む物の表面を含み得る。核酸含有堆積物には、種々の生物体から剥がれた細胞や組織片、排泄物由来物質、生物の死骸に由来する物質（破片など）などが含まれる。回収対象区域に存在する核酸含有堆積物には、回収対象区域の表面よりも上方（地表、地上、床面を含む物の表面、空中など）に存在する種々の生物種に由来する生物由来核酸が含まれる。以下では、図１を用いて、生物由来核酸回収方法の概要について説明する。A. First embodiment:
(A-1) Overview of biological nucleic acid recovery method:
FIG. 1 is a flow chart showing the biological nucleic acid recovery method of the first embodiment. Here, the organism-derived nucleic acid is a substance that constitutes an organism as a nucleic acid containing the genetic information of the organism. The biological nucleic acid to be collected may be deoxyribonucleic acid (DNA), but biological nucleic acid including ribonucleic acid (RNA) may be collected and analyzed. In the present embodiment, in order to recover the biological nucleic acid, a biological nucleic acid recovery apparatus is used to recover nucleic acid-containing deposits containing the biological nucleic acid from the recovery target area from which the biological nucleic acid is to be recovered. there is The recovery target area includes at least one of the ground surface and the object surface. That is, the collection target area may include surfaces of objects, including outdoor ground surfaces and indoor floor surfaces. Nucleic acid-containing deposits include cells and tissue fragments detached from various organisms, excrement-derived substances, substances derived from dead bodies of organisms (debris, etc.), and the like. Nucleic acid-containing sediments existing in the recovery target area contain biological nucleic acids derived from various species existing above the surface of the recovery target area (surface of the ground, surface of objects including floor surfaces, air, etc.). is included. The outline of the biological nucleic acid recovery method will be described below with reference to FIG.
生物由来核酸を回収する際には、生物種の調査・モニタリングを行う調査者は、まず、生物由来核酸を回収する対象とするための回収対象区域を設定する（工程Ｔ１００）。回収対象区域は、生息する生物種を調査・モニタリングする対象となる区域であり、設定した回収対象区域から生物由来核酸を回収して解析することにより、当該区域に生息する生物種を調査・モニタリングすることが可能になる。 When collecting biological nucleic acids, an investigator who conducts research and monitoring of biological species first sets a collection target area for collection of biological nucleic acids (step T100). The recovery target area is the target area for surveying and monitoring the species that inhabit the area. it becomes possible to
次に、調査者は、生物由来核酸回収装置を用意する（工程Ｔ１１０）。生物由来核酸回収装置は、回収対象区域に存在する核酸含有堆積物を付着させるための核酸回収体と、核酸回収体を回収対象区域に接触させるための接触面を有し、この接触面を覆うように核酸回収体が着脱可能に取り付けられた本体部と、を備える。生物由来核酸回収装置の具体的な構成については、後に詳しく説明する。 Next, the investigator prepares a biological nucleic acid recovery device (step T110). The biological nucleic acid recovery apparatus has a nucleic acid recovery material for adhering nucleic acid-containing deposits present in the recovery target area, and a contact surface for bringing the nucleic acid recovery material into contact with the recovery target area, and the contact surface is covered. and a main body to which the nucleic acid recovery material is detachably attached. A specific configuration of the biological nucleic acid isolation device will be described later in detail.
次に、調査者は、工程Ｔ１００で設定した回収対象区域に核酸回収体を接触させつつ、すなわち、核酸回収体を回収対象区域の表面に押し当てつつ、回収対象区域内を移動する（工程Ｔ１２０）。これにより、回収対象区域の表面に存在する核酸含有堆積物が、核酸回収体に付着される。 Next, the investigator moves within the recovery target area while bringing the nucleic acid recovery material into contact with the recovery target area set in step T100, that is, pressing the nucleic acid recovery material against the surface of the recovery target area (step T120). ). As a result, nucleic acid-containing deposits present on the surface of the area to be recovered are attached to the nucleic acid recovery material.
工程Ｔ１２０において核酸回収体の表面に核酸含有堆積物を付着させる動作を開始した後、調査者は、工程Ｔ１３０において、回収対象区域内における生物由来核酸回収の動作が完了していないと判断するときには（工程Ｔ１３０；ＮＯ）、工程Ｔ１２０の動作を継続する。例えば、生物由来核酸回収装置を回収対象区域内で移動させる際の移動距離や、生物由来核酸回収装置の移動時間等が、予め定めた基準値に達したときに、生物由来核酸の回収の動作が完了したと判断することができる。あるいは、回収対象区域内で生物由来核酸回収装置が移動するパターンを予め設定しておき、このパターンに従った移動が終了したときに、生物由来核酸の回収の動作が完了したと判断することができる。生物由来核酸回収装置の移動距離を長くして、核酸回収体と回収対象区域の表面とが接触する機会が増えるほど、核酸回収体に付着する生物由来核酸の量を増加させることができる。 After starting the operation of attaching nucleic acid-containing deposits to the surface of the nucleic acid recovery material in step T120, when the investigator determines in step T130 that the operation of recovering biological nucleic acid in the recovery target area has not been completed, (Step T130; NO), the operation of step T120 is continued. For example, when the movement distance when moving the biological nucleic acid isolation device within the recovery target area, the movement time of the biological nucleic acid isolation device, etc. reaches a predetermined reference value, the operation of recovering biological nucleic acid can be determined to be complete. Alternatively, a pattern in which the apparatus for isolating biological nucleic acid moves within the recovery target area may be set in advance, and when the movement according to this pattern is completed, it may be determined that the operation of recovering the biological nucleic acid has been completed. can. The amount of biological nucleic acid attached to the nucleic acid recovery material can be increased by increasing the moving distance of the biological nucleic acid recovery apparatus and increasing the chances of contact between the nucleic acid recovery material and the surface of the area to be recovered.
工程Ｔ１３０において、回収対象区域内における生物由来核酸回収の動作が完了したと判断するときには（工程Ｔ１３０；ＹＥＳ）、調査者は、核酸含有堆積物が付着した核酸回収体を核酸回収装置から回収する（工程Ｔ１４０）。その後、調査者は、回収した核酸回収体から核酸を抽出する動作を行う（工程Ｔ１５０～工程Ｔ１７０）。核酸抽出の動作については、後に詳しく説明する。以下では、まず、生物由来核酸回収装置の具体的な構成について説明し、さらに、このような生物由来核酸回収装置から回収した核酸回収体を用いた核酸抽出の動作について説明する。 In step T130, when it is determined that the operation of recovering biological nucleic acid in the area to be recovered has been completed (step T130; YES), the investigator recovers the nucleic acid recovery material to which the nucleic acid-containing deposit adheres from the nucleic acid recovery apparatus. (Step T140). After that, the investigator performs an operation of extracting nucleic acid from the collected nucleic acid recovery material (steps T150 to T170). The nucleic acid extraction operation will be described later in detail. In the following, first, the specific configuration of the apparatus for isolating biological nucleic acid will be described, and then the operation of nucleic acid extraction using the recovered nucleic acid recovered from such an apparatus for isolating biological nucleic acid will be described.
（Ａ－２）生物由来核酸回収装置の構成：
図２は、第１実施形態の生物由来核酸回収装置１０の概略構成を表す説明図である。生物由来核酸回収装置１０は、本体部２０と、核酸回収体３０と、取り付け具４０と、を備える。既述したように、核酸回収体３０は、回収対象区域に存在する核酸含有堆積物を付着させるための部材であり、本体部２０は、核酸回収体３０を回収対象区域に接触させるための接触面２５を有し、この接触面２５を覆うように核酸回収体３０が着脱可能に取り付けられる部材である。(A-2) Configuration of biological nucleic acid recovery device:
FIG. 2 is an explanatory diagram showing a schematic configuration of the biological nucleic
図２に示すように、本体部２０は、接触面２５を有する接触部２１と、把持部２２と、を備える。本実施形態の接触部２１は、上面視矩形の板状部材であり、一方の面が接触面２５となっており、接触面２５の裏面である他方の面には把持部２２が取り付けられている。接触部２１の外周部において、矩形形状の外周を構成する４辺の各々の近傍には、核酸回収体３０を本体部２０に取り付けるための係合部２３が設けられている。係合部２３は、後述するように、取り付け具４０が係合可能な形状となっている。把持部２２は、棒状に形成されており、一端が、上記した接触部２１の他方の面に取り付けられている。把持部２２は、生物由来核酸回収装置１０を用いて核酸含有堆積物を回収する動作を行う際に、調査者によって把持される部位である。 As shown in FIG. 2 , the
生物由来核酸を回収する動作を行う際に、本体部２０を再利用して繰り返し使用する場合には、前回使用時に付着した生物由来核酸が残留することを抑える処理、具体的には、本体部２０を洗浄する処理や、塩素系漂白剤（例えば、次亜塩素酸ナトリウム溶液）や核酸分解剤等を用いた核酸除去処理を繰り返し行うことができる材料により、本体部２０を構成すればよい。このような生物由来核酸の残留を抑える処理を容易にする観点から、本体部２０は、例えば、ステンレス鋼や、ポリエチレン、シリコーン、熱可塑性エラストマ（ＴＰＥ）等の高分子材料により形成することが望ましい。本体部２０のうち、少なくとも接触面２５を含む部位は、ポリエチレン、シリコーン、熱可塑性エラストマ（ＴＰＥ）から選択される材料により構成されることが望ましい。これらポリエチレン、シリコーン、熱可塑性エラストマ（ＴＰＥ）から選択される材料は、生物由来核酸の残留を抑える上記処理が可能な材料の中でも、比較的柔らかい材料である。このように柔らかい材料により接触面２５を構成することで、地表などの凹凸のある回収対象区域の表面に本体部２０の接触面２５を押し当てて、核酸含有堆積物を核酸回収体３０に付着させる際に、接触面２５の形状を回収対象区域の表面の形状に沿わせて、核酸含有堆積物の回収効率を高めることが可能になる。本体部２０は、再利用して繰り返し使用するのではなく、単回使用の部材としてもよい。 When the
核酸回収体３０は、シート状の部材であり、本実施形態では、図２に示すように、接触面２５よりも一回り大きく形成されている。核酸回収体３０は、核酸回収体３０を本体部２０に取り付けたときに接触面２５を覆う部位である回収部３２と、回収部３２よりも外周側の部位である外周部３３と、を備える。回収対象区域から核酸含有堆積物を回収する動作を行う際には、核酸回収体３０の回収部３２を、本体部２０の接触面２５と重ね合わせる。そして、外周部３３を、接触部２１の外周に沿って折り曲げ、折り曲げられた外周部３３を間に介して、接触部２１に設けられた係合部２３に取り付け具４０を係合させることによって、核酸回収体３０を接触部２１に固定する。図２では、回収部３２を接触面２５に重ねる様子を、上向きの白抜き矢印によって示している。また、図２では、係合部２３に取り付け具４０を取り付ける様子を、下向きの矢印によって示している。本実施形態では、接触面２５全体を核酸回収体３０で覆うことにより、核酸回収体３０において核酸含有堆積物を採取するための面積を確保している。 The nucleic
核酸回収体３０を構成する材料は、例えば、ゴム、樹脂、不織布のうちの少なくともいずれかとすることができる。核酸回収体３０を、帯電しやすい材料により形成する場合には、核酸回収体３０で発生する静電気を利用して、核酸含有堆積物が核酸回収体３０の表面に付着する効率を高めることができる。また、核酸回収体３０を、表面に比較的高い粘着性を有する樹脂やゴムにより形成する場合には、上記粘着性を利用して、核酸含有堆積物が核酸回収体３０の表面に付着する効率を高めることができる。核酸回収体３０を構成する材料は、核酸含有堆積物を回収するために核酸回収体３０が回収対象区域の表面に接触する際に、回収対象区域の表面が有する水分等により変質し難い材料とすることが望ましい。また、核酸回収体３０の表面に、さらに、粘着性物質を配置して、核酸含有堆積物が核酸回収体３０の表面に付着する効率を高めることとしてもよい。例えば、フィルム上に粘着性物質を配置して核酸回収体３０を構成する場合には、基材となるフィルムは、水分の影響を受け難いポリエチレンフィルム等を用いることが望ましい。水分の影響を受け難く、核酸回収体３０の内部にまで核酸含有堆積物が入り込んで、核酸含有堆積物の回収率が高まるという観点から、核酸回収体３０は、不織布により構成することが特に好ましい。なお、核酸回収体３０は、単回使用とすることが望ましいが、既述した生物由来核酸の残留を抑える処理が可能な材料により核酸回収体３０を構成して、核酸回収体３０を再使用することとしてもよい。核酸回収体３０を再使用する場合には、例えばゴムや樹脂のように、内部に核酸含有堆積物が入り込み難い材質によって核酸回収体３０を構成することが望ましく、これにより、前回使用時に付着した核酸含有堆積物の残留を抑えることができる。 The material constituting the nucleic
核酸回収体３０であるシート状部材の厚みは、本体部２０の接触部２１に取り付けることができる柔軟性を確保すると共に、後述するように核酸回収体３０を洗浄して核酸含有堆積物の懸濁液を作製する操作を容易にする観点から、薄く形成することが望ましい。また、本体部２０に取り付けた状態で回収対象区域に押し付けて核酸含有堆積物を付着させる動作に耐える強度を確保する観点から、厚く形成することが望ましい。核酸回収体３０の厚みは、核酸回収体３０を構成する材料の柔軟性や強度を考慮して、適宜設定すればよい。核酸回収体３０の厚みは、例えば、１ｍｍ以下とすることができる。 The thickness of the sheet-like member, which is the nucleic
係合部２３への取り付け具４０の取り付けは、種々の態様を採用可能である。例えば、接触部２１の裏面に設けた凹部によって係合部２３を構成し、この凹部を覆うように核酸回収体３０の外周部３３を配置しつつ、外周部３３を間に挟みながら、凹部に取り付け具４０を嵌め込むこととしてもよい。係合部２３は、凹部以外の形状であってもよく、取り付け具４０が係合可能であればよい。また、係合部２３の配置や数も、任意に設定することができる。 Various modes can be adopted for attaching the
あるいは、接触部２１は、係合部２３としての特別な構造を有しない平坦な板状部材としてもよい。この場合には、取り付け具４０は、例えば、接触部２１の外周部を核酸回収体３０の外周部３３ごと挟んで固定するクリップ形状とすればよい。このように、接触部２１の形状を単純化するならば、前回使用時に本体部２０に付着した生物由来核酸が残留することを抑える処理を行うために、本体部２０を液中に浸漬して上記処理を行うことが容易になる。なお、例えば接触部２１の裏面において、核酸回収体３０の外周部３３を係合させて固定するための構造を設けて、取り付け具４０を用いないことも可能である。ただし、この場合には、接触部２１の形状が複雑化することにより、生物由来核酸の残留を抑える上記処理が困難化する可能性がある。そのため、上記処理を容易化する観点からは、取り付け具４０を用いて核酸回収体３０を本体部２０に固定することにより、本体部２０の形状を単純化することが好ましい。 Alternatively, the
取り付け具４０は、単回使用を想定した部材としてもよいが、取り付け具４０を再使用する場合には、前回使用時に付着した生物由来核酸が残留することを抑えるための既述した処理を繰り返し行うことができる材料により、取り付け具４０を構成すればよい。取り付け具４０は、例えば、ステンレス鋼や樹脂等により構成することができる。 The
また、取り付け具４０を用いない構成として、例えば、外周部３３に予め付着させた接着剤を用いて核酸回収体３０を接触部２１に固定することとしてもよい。このとき、核酸回収体３０に付着した接着剤が、後の核酸抽出の工程に影響することを抑えるために、核酸抽出の工程に先立って、核酸回収体３０から接着剤の付着部位を除去することとしてもよい。ただし、接着剤に起因して生物由来核酸が本体部２０に残留する可能性が高まるため、本体部２０の再使用時に生物由来核酸の残留を抑える観点からは、別部材の取り付け具４０を用いて核酸回収体３０を本体部２０に取り付けることが望ましい。 In addition, as a configuration that does not use the
生物由来核酸回収装置１０の形状は、図２に示す形状以外の種々の形状を採用可能である。また、接触面２５は、矩形以外の形状でもよく、接触部２１は、板状以外の形状であってもよい。また、把持部２２は、一端が接触部２１に接続された棒状以外の形状であってもよく、調査者が生物由来核酸回収装置１０を把持可能になる形状であればよい。生物由来核酸回収装置は、少なくとも、核酸回収体と、核酸回収体が着脱可能な接触面を有する本体部と、を備えていればよい。 Various shapes other than the shape shown in FIG. 2 can be adopted for the shape of the biological nucleic
このような生物由来核酸回収装置１０を用いて、工程Ｔ１２０において核酸含有堆積物を回収する際には、調査者は、把持部２２を把持しつつ、核酸回収体３０が取り付けられた接触面２５を回収対象区域の表面に押し当てる動作を行う。このとき、接触面２５を押し当てる箇所を変更しながら、予め定めた回収対象区域内において、接触面２５を回収対象区域の表面に押し当てる動作を継続して行えばよい。これにより、回収対象区域の表面に存在する種々の核酸含有堆積物が、核酸回収体に付着される。例えば、回収対象区域が屋外である場合には、核酸回収体３０に核酸含有堆積物が付着する状態は、天候等の影響を受け得る。具体的には、例えば雨天の後には、地表の核酸含有堆積物が流されて消失していたり、晴天時とは異なる生物種が地表に表れたりすることにより、核酸含有堆積物の状態が変化し得る。そのため、回収した生物由来核酸を解析することにより、例えば、回収対象区域における生物種のモニタリングを繰り返し行う場合には、回収対象区域において核酸含有堆積物を回収する際の条件を揃えることが望ましい。 When recovering nucleic acid-containing deposits in step T120 using such a biological nucleic
（Ａ－３）生物由来核酸の抽出および解析：
以下では、核酸回収体３０によって回収した核酸含有堆積物から生物由来核酸を抽出する動作、および、これを用いた解析の概要について説明する。(A-3) Extraction and Analysis of Biological Nucleic Acids:
The operation of extracting biological nucleic acid from the nucleic acid-containing deposits recovered by the nucleic
既述したように、工程Ｔ１３０において、回収対象区域内における生物由来核酸回収の動作が完了したと判断するときには（工程Ｔ１３０；ＹＥＳ）、調査者は、核酸含有堆積物が付着した核酸回収体３０を生物由来核酸回収装置１０から回収する（工程Ｔ１４０）。核酸回収体３０の回収は、例えば、取り付け具４０と係合部２３との係合を解除して、本体部２０から核酸回収体３０を取り外すことにより行う。 As described above, in step T130, when it is determined that the operation of recovering biological nucleic acids in the recovery target area has been completed (step T130; is recovered from the biological nucleic acid recovery apparatus 10 (step T140). Recovery of the nucleic
その後、上記核酸回収体３０を、液中で洗浄し、核酸回収体３０に付着した核酸含有堆積物を上記液中に懸濁させて、懸濁液を作製する（工程Ｔ１５０）。ここで用いる液は、核酸分解酵素を含まない、ヌクレアーゼフリーバッファーや、ヌクレアーゼフリー水とすればよい。このような液中で核酸回収体３０を洗浄することで、核酸回収体３０から核酸含有堆積物が剥がれて上記液中に移り、懸濁液となる。このとき、液中で洗浄する核酸回収体３０は、本体部２０に取り付けていた核酸回収体３０の全体であってもよく、一部であってもよい。ただし、本体部２０に取り付けていた核酸回収体３０のうち、回収対象区域に接触させた部位の全体を液中に加えて懸濁液を作製することが望ましい。具体的には、図２に示した核酸回収体３０のうちの回収部３２を含む部位を用いて、懸濁液を作製することが望ましい。これにより、生物由来核酸回収装置１０を用いて回収した核酸含有堆積物全体を含む懸濁液を得ることができる。 After that, the nucleic
核酸回収体３０を上記液中で洗浄して懸濁液を得た後、洗浄後の核酸回収体３０を懸濁液から除去し、核酸含有堆積物を含む懸濁液をろ過して、核酸含有堆積物を含む残渣を得ることにより、フィルタ上で核酸含有堆積物を濃縮する（工程Ｔ１６０）。ここで用いるフィルタの孔径は、核酸回収体３０に付着した物質に含まれる核酸含有堆積物を、効率よく回収できるように適宜選択すればよい。フィルタによってろ過される物質（粒子）の粒径は、フィルタ孔径だけでなく、フィルタの材質とろ過される粒子との組み合わせ等によっても変化し得る。懸濁液中の粒子量や粒径の分布、予測される核酸含有堆積物の粒子の態様等により、回収効率等を考慮して、適宜、フィルタ孔径を選択すればよい。After washing the nucleic
核酸含有堆積物を濃縮するためのフィルタの孔径は、例えば、０．２２～１０μｍとすることが好ましく、０．２２～５μｍとすることがより好ましい。フィルタ孔径が上記範囲よりも大きいと、フィルタを通過する核酸含有堆積物の量が増加する。また、フィルタ孔径が上記範囲よりも小さいと、フィルタが早くに目詰まりして、１つのフィルタを用いて処理できる懸濁液量が制限される可能性がある。上記のような孔径のフィルタを用いることにより、核酸回収体３０に付着した物質から、核酸含有堆積物を効率よく回収することができる。ろ過の際には、例えば、真空ポンプ等を用いて陰圧にする、あるいは、ポンプ等を用いて加圧することにより、ろ過効率を高めることとしてもよい。 The pore size of the filter for concentrating the nucleic acid-containing deposits is, for example, preferably 0.22-10 μm, more preferably 0.22-5 μm. If the filter pore size is larger than the above range, the amount of nucleic acid-containing deposits that pass through the filter increases. Also, if the filter pore size is smaller than the above range, the filter may clog early, limiting the amount of suspension that can be processed using one filter. By using a filter with the above pore size, it is possible to efficiently recover the nucleic acid-containing deposits from the substance adhering to the nucleic
工程Ｔ１６０において核酸含有堆積物を含む懸濁液をろ過する際に用いるフィルタは、シリンジを取り付け可能なハウジングを備えた、カートリッジ式フィルタあるいはディスクフィルタを用いることが望ましい。このようなフィルタを用いるならば、シリンジを用いてフィルタに懸濁液を供給することで、簡便な動作によって懸濁液のろ過を容易に行うことができる。このとき、例えばフィルタの目詰まりによりろ過が困難化するまで、シリンジを用いたろ過の動作を繰り返すことで、フィルタにおける核酸含有堆積物の回収量を最大化することが望ましい。上記のようなフィルタを用いることにより、フィルタサイズを抑えつつ、核酸回収体３０に付着した核酸含有堆積物を濃縮する動作を効率よく行うことができる。また、上記のようにハウジングを備えたフィルタを用いることで、懸濁液のろ過の工程における不純物の混入を抑えることが容易になり、単回使用のフィルタを用いることで、コンタミネーションを抑えることができる。 The filter used for filtering the suspension containing nucleic acid-containing deposits in step T160 is desirably a cartridge-type filter or disk filter equipped with a housing to which a syringe can be attached. If such a filter is used, the suspension can be easily filtered by a simple operation by supplying the suspension to the filter using a syringe. At this time, it is desirable to maximize the recovery amount of the nucleic acid-containing deposits in the filter by repeating the filtration operation using the syringe until the filtration becomes difficult due to clogging of the filter, for example. By using the filter as described above, the operation of concentrating the nucleic acid-containing deposit adhering to the nucleic
なお、核酸回収体３０に付着した物質としては、生物由来核酸の抽出対象として用い難い不要な物質も含まれ得る。そのため、上記したろ過による核酸含有堆積物の濃縮の効率、および、その後の核酸抽出の効率を高めるために、核酸含有堆積物の濃縮のためのろ過に先立って、上記した不要な物質を除去することとしてもよい。不要な物質の除去のためには、例えば、上記した核酸含有堆積物の濃縮のために用いるフィルタよりも目の粗いフィルタ（例えば孔径１００μｍ程度）を用いて、核酸含有堆積物の濃縮に先だって、上記懸濁液をろ過することとすればよい。そして、得られたろ液を、核酸含有堆積物の濃縮のためのろ過に供すればよい。上記不要な物質としては、例えば、葉などの比較的大きな植物の破片、昆虫等の生物の死骸、石等が挙げられる。 Substances attached to the nucleic
工程Ｔ１６０において核酸含有堆積物が濃縮されたフィルタを得た後、ろ過の残渣から核酸を抽出する工程Ｔ１７０は、攪拌処理、ビーズ破砕処理、超音波処理、加熱処理のうちの少なくとも一つを含むことが望ましい。工程Ｔ１７０では、核酸含有堆積物が濃縮されたフィルタを液中に加えて、核酸含有堆積物中に含まれる生物由来核酸を液中に溶解させる。ここで用いる生物由来核酸を溶解させるための液は、細胞や組織を溶解する溶解バッファー（Lysis buffer）とすればよい。攪拌処理は、溶解バッファーに上記フィルタを加えて溶解バッファーを攪拌する処理である。ビーズ破砕処理は、溶解バッファーに、上記フィルタと共に例えばセラミックビーズ等を加えて攪拌する処理である。超音波処理は、溶解バッファーに上記フィルタを加えて超音波振動を加える処理である。加熱処理は、溶解バッファーに上記フィルタを加えて、溶解バッファーが失活しない程度の温度（例えば５０～６０℃）に加熱する処理である。これらの処理により、溶解バッファーへの核酸の溶解を促進することができる。上記のような処理を行うことで、フィルタ上で濃縮された核酸含有堆積物がフィルタから剥がされると共に、生物由来核酸が溶解バッファー中に溶出する。このとき、攪拌処理やビーズ破砕処理や超音波処理を行う場合には、フィルタが溶解バッファー中で破砕されて懸濁液となる。 After obtaining a filter enriched with nucleic acid-containing deposits in step T160, step T170 of extracting nucleic acids from the residue of filtration includes at least one of agitation, bead crushing, sonication, and heat treatment. is desirable. In step T170, the filter in which the nucleic acid-containing deposits are concentrated is added to the liquid to dissolve the biological nucleic acid contained in the nucleic acid-containing deposits in the liquid. The liquid for dissolving the biological nucleic acid used here may be a lysis buffer that dissolves cells and tissues. The stirring process is a process of adding the filter to the dissolution buffer and stirring the dissolution buffer. The bead crushing process is a process of adding, for example, ceramic beads together with the filter to the dissolution buffer and stirring the mixture. Ultrasonic treatment is a treatment in which the filter is added to the lysis buffer and ultrasonic vibration is applied. The heat treatment is a treatment in which the filter is added to the dissolution buffer and heated to a temperature (for example, 50 to 60° C.) at which the dissolution buffer is not deactivated. These treatments can facilitate the lysis of nucleic acids into the lysis buffer. By performing the treatment as described above, the nucleic acid-containing deposit concentrated on the filter is peeled off from the filter, and the biological nucleic acid is eluted into the lysis buffer. At this time, when stirring treatment, bead crushing treatment, or ultrasonic treatment is performed, the filter is crushed in the dissolution buffer to form a suspension.
その後、生物由来核酸が溶出した上記懸濁液から、生物由来核酸を抽出する。生物由来核酸の抽出は、例えば、上記懸濁液を遠心分離して、生物由来核酸が溶解した液を上清液として回収し、適切なカラムを選択して不純物を除去し、その後、核酸を吸着するカラムを用いて生物由来核酸を精製すればよい。上記した不純物としては、例えば、後述するＰＣＲの工程に含まれる反応を阻害する物質を挙げることができる。このような工程Ｔ１７０における核酸抽出の工程は、公知の方法であり、例えば、市販の土壌ＤＮＡ抽出キットを用いることとしてもよい。 After that, the biological nucleic acid is extracted from the suspension from which the biological nucleic acid has been eluted. Extraction of biological nucleic acid can be carried out, for example, by centrifuging the suspension, collecting a liquid in which the biological nucleic acid is dissolved as a supernatant, selecting an appropriate column to remove impurities, and then extracting the nucleic acid. Biological nucleic acids may be purified using an adsorbing column. Examples of the impurities described above include substances that inhibit the reaction involved in the PCR process described below. The step of nucleic acid extraction in step T170 is a known method, and for example, a commercially available soil DNA extraction kit may be used.
このようにして抽出された生物由来核酸を用いて、公知の種々の方法により解析を行うことができる。生物由来核酸の解析は、例えば、生物由来核酸が由来する生物種を特定する工程を含むこととすればよい。具体的には、例えば、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ；quantitative PCR）による特定の生物種の有無判定や存在量の定量などの、種特異的な解析を行うことができる。このとき、例えば、鳥類、哺乳類等、特定の生物種のグループに着目して適宜プライマーを選択してＰＣＲを行うことで、上記特定の生物種のグループに絞り込んだ解析が可能になる。また、適切なプライマーを選択してＰＣＲを行うことで、より広い範囲の生物種を一度に特定することも可能である。また、次世代シーケンサー等を用いて得られた塩基配列をデータベースと照合することにより、生物種の同定を行う網羅的解析を行うこととしてもよく、同種内でのハプロタイプ解析を行うこととしてもよい。このようにして、回収対象区域に生息あるいは滞在した生物情報を得ることができる。 Using the organism-derived nucleic acids thus extracted, analysis can be performed by various known methods. Analysis of the biological nucleic acid may include, for example, a step of identifying the biological species from which the biological nucleic acid is derived. Specifically, for example, species-specific analysis such as determining the presence or absence of a specific biological species by quantitative PCR (qPCR; quantitative PCR) and quantifying the abundance can be performed. At this time, for example, by focusing on a group of specific species such as birds and mammals and performing PCR by appropriately selecting primers, it is possible to narrow down the analysis to the specific group of species. In addition, by selecting appropriate primers and performing PCR, it is possible to identify a wider range of organisms at once. In addition, by matching the base sequence obtained using a next-generation sequencer or the like with a database, exhaustive analysis for identifying the species may be performed, or haplotype analysis within the same species may be performed. . In this way, it is possible to obtain information on organisms that inhabited or stayed in the collection target area.
以上のように構成された本実施形態の生物由来核酸回収方法、および、生物由来核酸回収装置１０によれば、生物由来核酸回収装置１０が備える核酸回収体３０の表面を、設定された回収対象区域の表面に接触させる動作を繰り返すことによって、回収対象区域に存在する生物由来核酸を含む核酸含有堆積物を、核酸回収体３０の表面に付着させて回収する。このように、核酸回収体３０と回収対象区域の表面とを接触させる動作を繰り返すことによって、回収対象区域に存在する核酸含有堆積物を回収することができるため、設定した回収対象区域という比較的広い範囲から、陸上の生物に由来する核酸を、網羅的にサンプリングすることが可能になる。具体的には、核酸回収体３０と回収対象区域の表面とを接触させる動作を繰り返すことにより、回収対象区域において、実際にサンプルが採取される箇所の偏りを抑えることができる。例えば、土壌を採取対象物とする場合には、一般に、サンプルの採取箇所は回収対象区域内で分散されることになるが、本実施形態のように核酸回収体３０と回収対象区域の表面とを接触させる動作を繰り返す場合には、回収対象区域内において、例えば連続的に広がるような、より広い範囲からのサンプリングが可能になる。また、予め定めた距離を空けて行うサンプリングを、より広い範囲で行うことも可能になる。そのため、回収対象区域についての生息する生物種の調査・モニタリング等の解析を、網羅的に行うことが可能になる。さらに、屋外に限らず屋内を含む種々の区域でのサンプリングが可能になる。 According to the biological nucleic acid isolation method and the biological nucleic
また、本実施形態において回収対象区域から回収する核酸含有堆積物は、地表や床面を含む物の表面などの回収対象区域の表面で生息する生物に由来する核酸だけでなく、大気中に放出された生物由来核酸も含み得る。生物組織や排泄物等のように、生物由来核酸を含んでいて、ある程度の重量がある物質は、地表や床面を含む物の表面に集積するためである。そのため、本実施形態によれば、回収対象区域の表面よりも上に存在する種々の生物種の解析が可能になる。例えば、土壌からのサンプリングであれば、得られる生物由来核酸は、サンプリングした土壌中に生息する生物由来の核酸に限られる可能性が高いが、本実施形態によれば、回収対象区域に生息あるいは滞在したより広い生物種の生物由来核酸を回収することが可能になる。特に本実施形態では、陸域の乾燥環境から核酸含有堆積物をサンプリングしており、例えば水域からサンプリングする場合に比べて、核酸がより安定して存在しうる環境からのサンプリングであるため、生物由来核酸の回収効率を高めることができる。 In addition, the nucleic acid-containing deposits recovered from the recovery target area in this embodiment are not only nucleic acids derived from organisms living on the surface of the recovery target area, such as the surface of objects including the ground surface and floor surface, but also released into the atmosphere. It can also contain biologically derived nucleic acids that have been modified. This is because substances containing biological nucleic acids and having a certain amount of weight, such as biological tissues and excreta, accumulate on surfaces including the ground surface and floor surface. Therefore, according to this embodiment, it is possible to analyze various biological species present above the surface of the area to be collected. For example, in the case of sampling from soil, the obtained organism-derived nucleic acids are likely to be limited to organism-derived nucleic acids that live in the sampled soil. It becomes possible to recover organism-derived nucleic acids of a wider range of species that have stayed. In particular, in this embodiment, the nucleic acid-containing sediment is sampled from the dry environment of the land area, for example, compared to the case of sampling from the water area. The recovery efficiency of the derived nucleic acid can be enhanced.
また、本実施形態によれば、回収した核酸含有堆積物から核酸を抽出する際に、抽出の工程に先立って、核酸回収体３０に付着した核酸含有堆積物を液中で懸濁して懸濁液を作製し、得られた懸濁液をろ過することにより、フィルタ上で核酸含有堆積物を濃縮している。そのため、核酸回収体３０を用いて回収した核酸含有堆積物のうちのより多くを対象として核酸抽出することができるため、抽出した核酸を解析する際に、解析対象となる核酸の網羅性を高めることができる。解析対象となる核酸の網羅性を高めることができる理由は、具体的には以下のように考えられる。本実施形態の生物由来核酸回収装置１０を用いる場合には、核酸回収体３０と回収対象区域の表面とを接触させる動作を繰り返すことにより、回収対象区域中に存在する生物由来核酸を広く含む核酸含有堆積物を核酸回収体３０に付着させることが可能になる。しかしながら、このようにして核酸回収体３０に付着させた核酸含有堆積物の一部のみを取り出して、核酸抽出および解析の工程に供する場合には、対象とする生物由来核酸に偏りが生じる可能性がある。本実施形態では、核酸含有堆積物が付着した核酸回収体３０を液中で洗浄して核酸含有堆積物の懸濁液を作製することにより、回収対象区域の広い範囲から採取した種々の核酸含有堆積物を含む懸濁液を得ることができる。そして、このような懸濁液をろ過して得られる残渣から核酸を抽出することにより、回収対象区域の広い範囲から採取した種々の核酸含有堆積物の混合物を解析対象とすることができ、解析対象となる核酸の網羅性を高めることができる。特に、核酸回収体３０のうち、回収対象区域に接触させた部位の全体を液に加えて懸濁液を作製することにより、上記効果を高めることができる。 Further, according to the present embodiment, when nucleic acids are extracted from the collected nucleic acid-containing deposits, the nucleic acid-containing deposits adhering to the nucleic
Ｂ．第２実施形態：
図３は、第２実施形態の生物由来核酸回収装置１１０を用いて、生物由来核酸を回収する様子を模式的に表す説明図である。生物由来核酸回収装置１１０は、本体部１２０と、核酸回収体１３０と、取り付け具１４０と、を備える。B. Second embodiment:
FIG. 3 is an explanatory view schematically showing how biological nucleic acids are recovered using the biological nucleic
本体部１２０は、本体部１２０の移動に伴って、地表などの回収対象区域の表面に接触しつつ回転する走行用の車輪である回転体１２１を備える陸上移動体である。本体部１２０は、図３に示すような四輪車とする他、三輪車、二輪車、あるいは一輪車とするなど、異なる構成としてもよい。また、本体部１２０は、自走式の移動体であってもよく、非自走式の移動体であってもよい。また、本体部１２０は、有人の装置であってもよく、無人の装置であってもよい。本体部１２０が備える回転体１２１は、生物由来核酸回収装置１１０の移動に伴って回収対象区域の表面で回転する。各々の回転体１２１は、回収対象区域に接触させるための接触面１２５を有し、この接触面１２５を覆うように、核酸回収体１３０が着脱可能に取り付けられる。なお、第２実施形態では、生物由来核酸回収装置１１０が備える回転体を区別しないときには回転体１２１と総称し、区別するときには回転体１２１ａ、１２１ｂのように区別する。 The
核酸回収体１３０は、回転体１２１の接触面１２５を被覆するように、回転体１２１に対して着脱可能に取り付けられており、回転体１２１の回転に伴って回収対象区域に接触するときに、回収対象区域の表面に存在する生物由来核酸を含む核酸含有堆積物１５が付着される部材である。図３（Ａ）では、回転体１２１ａについては、回転体１２１ａに核酸回収体１３０が取り付けられる前の様子を表しており、回転体１２１ｂについては、回転体１２１ｂに核酸回収体１３０が取り付けられた後の様子を表す。核酸回収体１３０は、回転体１２１の接触面１２５を被覆できる形状であればよく、例えば、図３（Ａ）に示すように、核酸回収体１３０をシート状に形成された部材として、このシート状部材を、回転体１２１の接触面１２５上に巻き付ける構成とすることができる。このとき、接触面１２５全体、すなわち、回転体１２１の側面の全周を覆うように核酸回収体１３０を配置することにより、核酸回収体１３０における生物由来核酸を回収可能な面積を、より大きく確保することができる。核酸回収体１３０は、シート状以外の形状としてもよく、例えば、回転体１２１の表面を覆うフィルム状としてもよい。あるいは、核酸回収体１３０は、円筒状のスポンジ部材（発泡樹脂）によって形成して、回転体１２１の側面の全周（回収対象区域に対向する接触面）を覆うように回転体１２１にかぶせることとしてもよい。 The nucleic
核酸回収体１３０を構成する材料は、第１実施形態の核酸回収体３０と同様の種々の材料を採用することができる。また、核酸回収体１３０であるシート状部材の厚みは、回転体１２１に巻き付けることができる柔軟性を確保すると共に、核酸含有堆積物を付着させた後の核酸回収体１３０を洗浄して核酸含有堆積物の懸濁液を作製する操作を容易にする観点から、薄く形成することが望ましい。また、回転体１２１に巻き付けた状態で回転体１２１を回転させて核酸含有堆積物を付着させる動作に耐える強度を確保する観点から、厚く形成することが望ましい。核酸回収体１３０の厚みは、核酸回収体１３０を構成する材料の柔軟性や強度を考慮して、適宜設定すればよい。核酸回収体１３０の厚みは、例えば、１ｍｍ以下とすることができる。 Various materials similar to those of the nucleic
取り付け具１４０は、核酸回収体１３０および本体部１２０とは別体で設けられ、核酸回収体１３０を本体部１２０の回転体１２１に固定するための部材である。図３（Ａ）では、回転体１２１ａへの取り付け前の核酸回収体１３０において、核酸回収体１３０の一端に取り付け具１４０を取り付けた様子を示しているが、取り付け具１４０を用いた取り付けは、種々の態様を採用可能である。取り付け具１４０は、回転体１２１に対して核酸回収体１３０を着脱可能であって、回転体１２１に核酸回収体１３０を巻き付けた状態で回転体１２を回転させて核酸含有堆積物を付着させる動作に支障が無い構成であればよい。取り付け具１４０は、単回使用を想定した部材としてもよいが、取り付け具１４０を再使用する場合には、前回使用時に付着した生物由来核酸が残留することを抑える処理、具体的には、取り付け具１４０を洗浄する処理や、塩素系漂白剤や核酸分解剤等を用いた核酸除去処理を繰り返し行うことができる材料により、取り付け具１４０を構成すればよい。取り付け具１４０は、例えば、ステンレス鋼や樹脂等により構成することができる。また、取り付け具１４０を再使用する場合には、前回使用時に付着した生物由来核酸が残留することを抑える処理を容易化するために、取り付け具１４０を液中に浸漬して上記処理を行うことが容易になるような比較的単純な形状、例えば、核酸回収体１３０の端部同士を回転体１２１ごと挟んで固定するクリップ形状とすることが望ましい。 The
なお、生物由来核酸回収装置１１０が備える回転体１２１に核酸回収体１３０を取り付ける構成は、核酸回収体１３０および本体部１２０とは別体の部材である取り付け具１４０を用いる以外の態様を採用してもよい。例えば、取り付け具１４０に代えて接着剤を用いる構成や、取り付けのための特別な構造を用いることなく、既述した円筒状のスポンジ部材としての核酸回収体１３０を回転体１２１の外周側面にかぶせる構成などを採用することも可能である。 The configuration for attaching the nucleic
本体部１２０が備える回転体１２１は、生物由来核酸回収装置１１０の走行に支障が無い材料により構成すればよく、回転体１２１を再使用する場合には、前回使用時に付着した生物由来核酸が残留することを抑えるための既述した処理を繰り返し行うことができる材料により構成すればよい。回転体１２１は、例えば、ステンレス鋼やシリコーン樹脂等の樹脂材料により形成することができる。ただし、回転体１２１は、単回使用の部材としてもよい。 The rotating body 121 included in the
上記のような生物由来核酸回収装置１１０を用いた生物由来核酸の回収の動作は、図１と同様にして行うことができる。具体的には、図１の工程Ｔ１００で回収対象区域を設定し、工程Ｔ１１０で生物由来核酸回収装置１１０を用意した後（図３（Ａ）参照）、工程Ｔ１２０において、生物由来核酸回収装置１１０を回収対象区域内で移動させると、回転体１２１が備える核酸回収体１３０の表面に、核酸含有堆積物１５が付着する（図３（Ｂ）参照）。そして、工程Ｔ１３０において回収動作が完了したと判断すると、工程Ｔ１４０において、回転体１２１から核酸回収体１３０を取り外して、生物由来核酸を回収する。図３（Ｃ）では、回転体１２１ａについては核酸回収体１３０が取り外された後の様子を表しており、回転体１２１ｂについては、核酸回収体１３０が取り外される前の様子を表している。 The operation of recovering biological nucleic acids using the biological nucleic
核酸回収体１３０から生物由来核酸を回収して生物由来核酸を抽出する動作は、図１に基づいて説明した工程Ｔ１５０～工程Ｔ１７０と同様に行うことができる。 The operation of recovering the biological nucleic acid from the nucleic
このような第２実施形態の生物由来核酸回収装置１１０を用いる場合であっても、第１実施形態と同様にして核酸回収体１３０に付着した核酸含有堆積物から核酸を抽出することにより、第１実施形態と同様の効果が得られる。 Even when using the biological nucleic
Ｃ．第３実施形態：
第１および第２実施形態では、工程Ｔ１６０において、核酸含有堆積物を含む懸濁液をろ過により濃縮する際に、特定のフィルタ孔径を有する単一のフィルタを用いているが、異なる構成としてもよい。以下では、第３実施形態として、複数のフィルタを用いて懸濁液を濃縮する方法について説明する。C. Third embodiment:
In the first and second embodiments, in step T160, a single filter having a specific filter pore size is used when concentrating the suspension containing nucleic acid-containing deposits by filtration. good. A method of concentrating a suspension using a plurality of filters will be described below as a third embodiment.
第３実施形態では、工程Ｔ１６０において懸濁液を濃縮するために、目の粗さ（孔径）が異なる複数のフィルタを用いており、目の粗さが次第に細かくなる順で、上記複数のフィルタの各々を用いたろ過を行っている。目の粗さが異なる複数のフィルタの各々の孔径は、例えば、既述した０．２２～１０μｍ、好ましくは０．２２～５μｍの範囲で、適宜設定すればよい。 In the third embodiment, a plurality of filters with different mesh sizes (pore diameters) are used to concentrate the suspension in step T160. Filtration using each of The pore size of each of the plurality of filters with different mesh sizes may be appropriately set, for example, within the range of 0.22 to 10 μm, preferably 0.22 to 5 μm.
工程Ｔ１６０において核酸含有堆積物が濃縮された複数のフィルタを得た後、工程Ｔ１７０では、上記したろ過の残渣が付着する複数のフィルタを合わせて、これらの複数のフィルタから核酸を抽出する。ここでは、例えば、既述した第１および第２実施形態と同様に、溶解バッファー中に上記複数のフィルタを加えて、攪拌処理、ビーズ破砕処理、超音波処理、加熱処理のうちの少なくとも一つを含む処理により、核酸含有堆積物中に含まれる生物由来核酸を液中に溶解させればよい。そして、例えば既述した公知の方法により、生物由来核酸を精製し、得られた生物由来核酸を解析すればよい。 After obtaining a plurality of filters in which nucleic acid-containing deposits are concentrated in step T160, in step T170, the plurality of filters to which the above-described filtration residue adheres are combined, and nucleic acids are extracted from these filters. Here, for example, as in the first and second embodiments described above, the plurality of filters are added to the dissolution buffer, and at least one of stirring treatment, bead crushing treatment, ultrasonic treatment, and heat treatment is performed. The biological nucleic acid contained in the nucleic acid-containing deposit may be dissolved in the liquid by the treatment including. Then, the organism-derived nucleic acid may be purified by, for example, the known method described above, and the obtained organism-derived nucleic acid may be analyzed.
このような構成とすれば、核酸含有堆積物を含む懸濁液をろ過により濃縮する際に、目の粗さが次第に細かくなる順で、複数のフィルタの各々を用いたろ過を行うため、最も目の細かいフィルタの孔径に応じた十分に粒径が小さい核酸含有堆積物も回収可能となると共に、このように目の細かいフィルタが早くに目詰まりすることを抑えることができる。そのため、回収できる核酸含有堆積物の粒径の範囲を広く確保すると共に、ろ過できる懸濁液の量をより多くして、回収できる核酸量を増加させ、生物種の検出精度を向上させることができる。 With such a configuration, when concentrating the suspension containing the nucleic acid-containing deposits by filtration, filtration is performed using each of the plurality of filters in order of gradually finer mesh, so the Nucleic acid-containing deposits with a sufficiently small particle size corresponding to the pore size of a fine filter can be recovered, and early clogging of such a fine filter can be suppressed. Therefore, it is possible to secure a wide range of particle diameters of deposits containing nucleic acid that can be recovered, increase the amount of suspension that can be filtered, increase the amount of nucleic acids that can be recovered, and improve the detection accuracy of biological species. can.
また、上記した複数のフィルタとして、シリンジを取り付け可能なハウジングを備えた、カートリッジ式フィルタあるいはディスクフィルタを用いるならば、用いるフィルタのサイズを抑えることができるため、複数のフィルタを用いる場合であっても、核酸回収体に付着した核酸含有堆積物を濃縮する動作を効率よく行うことができる。なお、用いるフィルタの数に特に制限は無いが、フィルタに付着する残渣から核酸を抽出する際の溶解バッファーの液量を抑え、核酸の濃度の希釈を抑えることにより生物種の検出精度を高める観点からは、フィルタの数は、例えば７つ以下とすればよく、５つ以下とすることが好ましく、３つ以下とすることがより好ましい。 Further, if a cartridge type filter or disk filter having a housing to which a syringe can be attached is used as the plurality of filters described above, the size of the filter to be used can be suppressed. Also, the operation of concentrating the nucleic acid-containing deposits adhering to the recovered nucleic acid can be efficiently performed. The number of filters used is not particularly limited, but the amount of the lysis buffer when extracting nucleic acids from the residue adhering to the filters is suppressed, and the dilution of the concentration of nucleic acids is suppressed, thereby increasing the detection accuracy of biological species. Therefore, the number of filters may be, for example, 7 or less, preferably 5 or less, and more preferably 3 or less.
なお、第３実施形態では、残渣が付着する複数のフィルタを合わせて核酸を抽出することとしたが、異なる構成としてもよい。例えば、核酸含有堆積物の粒径によって含まれる生物由来核酸が由来する生物種が異なることが予想される場合には、孔径の異なるフィルタごとに別々に、核酸の抽出および抽出した生物由来核酸の解析を行ってもよい。 In the third embodiment, nucleic acids are extracted by combining a plurality of filters to which residues are attached, but a different configuration may be adopted. For example, when it is expected that the biological species from which the biological nucleic acids contained in the nucleic acid-containing deposits are derived differ depending on the particle size of the nucleic acid-containing deposits, nucleic acid extraction and extraction of the extracted biological nucleic acids are performed separately for filters with different pore sizes. Analysis may be performed.
Ｄ．他の実施形態：
上記した各実施形態では、生物由来核酸回収装置は、回収対象区域に接触させるための接触面を有する本体部と、接触面を覆うように本体部に着脱可能に取り付けられた核酸回収体と、を備えることとしたが、異なる構成としてもよい。例えば、本体部を用いることなく、核酸回収体のみを用いて核酸含有堆積物を核酸回収体に付着させる動作を行うこととしてもよい。D. Other embodiments:
In each of the above-described embodiments, the apparatus for isolating biological nucleic acid includes a main body having a contact surface for contact with the area to be recovered, a nucleic acid recovering body detachably attached to the main body so as to cover the contact surface, , but may have a different configuration. For example, the operation of attaching the nucleic acid-containing deposit to the nucleic acid recovery material may be performed using only the nucleic acid recovery material without using the main body.
本開示の生物由来核酸の回収方法に従って生物由来核酸を環境中から回収し、得られた生物由来核酸から生物種の同定を行った。具体的には、愛知県内の特定箇所において、１５ｃｍ×１０ｃｍ程度の芝生上の領域を、回収対象区域として設定した。そして、２０２１年４月と２０２１年６月に、この回収対象区域において、生物由来核酸の回収を行った。ここでは、上記した回収対象区域において、図２に示す生物由来核酸回収装置１０であって、表面が不織布製のシート状の核酸回収体３０を備える装置を用いた。核酸回収体３０に覆われた本体部２０の接触面２５を回収対象区域の地表に押し当てて離す動作を繰り返すことで、生物由来核酸を含む核酸含有堆積物を核酸回収体３０に付着させて回収した。 Biological nucleic acids were collected from the environment according to the method for collecting biological nucleic acids of the present disclosure, and biological species were identified from the obtained biological nucleic acids. Specifically, in a specific location in Aichi Prefecture, an area on the lawn of about 15 cm x 10 cm was set as the collection target area. Then, in April 2021 and June 2021, biological nucleic acids were collected in this collection target area. Here, the biological nucleic
核酸含有堆積物を付着させた核酸回収体３０を、単回使用の密閉容器内で、ヌクレアーゼフリーバッファーにて洗浄し、核酸含有堆積物を含む懸濁液を得た。その後、孔径５μｍのディスクフィルタを用いて懸濁液をろ過した。そして、ろ過の残渣が付着するフィルタを溶解バッファー中でビーズ破砕処理した後に、溶解バッファー中に溶出した核酸を抽出した。ここでは、市販の土壌サンプル用ＤＮＡ抽出キット（NucleoSpin Soil、タカラバイオ株式会社）（NucleoSpinは登録商標）を用いて、上記したＤＮＡ抽出に係る処理を行った。 The nucleic
上記キットを用いて得られた核酸抽出液を、回収対象区域の環境ＤＮＡサンプルとし、所定のプライマー（既存の鳥類ユニバーサルプライマー）を用いて、ＰＣＲ法により１２ＳｒＲＮＡ配列を増幅した。増幅にはKapa Hifi PCR Kit（KAPABIOSYSTEMS社製）を用い、ＰＣＲは４反復行った。さらに、配列解析用のインデックスを付加するためのＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物のビーズ精製を行った。その後、次世代シーケンサーにより配列取得を行った。使用したシーケンサーは、Illumina iSeq100（イルミナ株式会社製）（iSeqは登録商標）である。 The nucleic acid extract obtained using the above kit was used as an environmental DNA sample of the recovery target area, and the 12S rRNA sequence was amplified by PCR using a predetermined primer (existing avian universal primer). Kapa Hifi PCR Kit (manufactured by KAPABIOSYSTEMS) was used for amplification, and PCR was repeated 4 times. Furthermore, PCR was performed to add an index for sequence analysis, and bead purification of the PCR product was performed. After that, sequence acquisition was performed using a next-generation sequencer. The sequencer used was Illumina iSeq100 (manufactured by Illumina Inc.) (iSeq is a registered trademark).
図４は、上記の環境ＤＮＡサンプルを解析した解析結果を示す説明図である。取得した配列については、ＤＮＡ解析用のパイプラインであるMiFish Pipeline により生物種を抽出し、さらに、得られた配列についてＢＬＡＳＴ相同検索を行うことにより、生物種の同定を試みた。その中で、データベースとの相同性が９７％以上の生物種のみを、図４においてリスト化している。図４では、属のレベルで生物種を同定した結果を示した。図４に示すように、本開示の生物由来核酸の回収方法により、陸生の多種多様な鳥類が生息する、あるいは滞在したことを確認することができた。 FIG. 4 is an explanatory diagram showing the analysis results of analyzing the above environmental DNA samples. From the obtained sequences, species were extracted by MiFish Pipeline, which is a pipeline for DNA analysis, and BLAST homology search was performed on the obtained sequences to attempt to identify the species. Among them, only species with 97% or more homology with the database are listed in FIG. FIG. 4 shows the results of species identification at the genus level. As shown in FIG. 4 , it was confirmed that a wide variety of terrestrial birds inhabited or stayed there by the method for recovering biological nucleic acids of the present disclosure.
本開示は、上述の実施形態等に限られるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において種々の構成で実現することができる。例えば、発明の概要の欄に記載した各形態中の技術的特徴に対応する実施形態中の技術的特徴は、上述の課題の一部又は全部を解決するために、あるいは、上述の効果の一部又は全部を達成するために、適宜、差し替えや、組み合わせを行うことが可能である。また、その技術的特徴が本明細書中に必須なものとして説明されていなければ、適宜、削除することが可能である。 The present disclosure is not limited to the above-described embodiments and the like, and can be implemented in various configurations without departing from the scope of the present disclosure. For example, the technical features in the embodiments corresponding to the technical features in the respective modes described in the Summary of the Invention column may be used to solve some or all of the above problems, or Substitutions and combinations may be made as appropriate to achieve part or all. Also, if the technical features are not described as essential in this specification, they can be deleted as appropriate.
１０，１１０…生物由来核酸回収装置
１２…回転体
１５…核酸含有堆積物
２０，１２０…本体部
２１…接触部
２２…把持部
２３…係合部
２５，１２５…接触面
３０，１３０…核酸回収体
３２…回収部
３３…外周部
４０，１４０…取り付け具
１２１，１２１ａ，１２１ｂ…回転体DESCRIPTION OF SYMBOLS 10,110... Biological nucleic acid isolation|separation apparatus 12...
Claims (10)
Translated fromJapanese環境中の核酸を回収する対象として、地表および物表面のうちの少なくとも一方を含む回収対象区域を設定し、
前記回収対象区域に対して、前記生物由来核酸を含む核酸含有堆積物を回収するための核酸回収体を接触させて、前記回収対象区域の表面に存在する前記核酸含有堆積物を前記核酸回収体に付着させ、
前記核酸回収体に付着した前記核酸含有堆積物を液中に懸濁させて懸濁液を作製し、
前記懸濁液を、フィルタを用いてろ過し、
ろ過の残渣が付着する前記フィルタから核酸を抽出する
生物由来核酸回収方法。A biological nucleic acid recovery method for recovering biological nucleic acids from the environment,
setting a recovery target area including at least one of the ground surface and the surface of an object as a target for recovering nucleic acids in the environment;
A nucleic acid recovery body for recovering the nucleic acid-containing deposits containing the biological nucleic acid is brought into contact with the recovery target area, and the nucleic acid-containing deposits present on the surface of the recovery target area are removed by the nucleic acid recovery body. attach to
suspending the nucleic acid-containing deposit attached to the nucleic acid recovery material in a liquid to prepare a suspension;
filtering the suspension using a filter;
A method for collecting nucleic acid of biological origin, comprising extracting nucleic acid from the filter to which residue from filtration adheres.
前記ろ過は、平均孔径が０．２２～１０μｍであって、シリンジを取り付け可能なハウジングを備えたカートリッジ式フィルタあるいはディスクフィルタを用いる
生物由来核酸回収方法。The biological nucleic acid recovery method according to claim 1,
The filtration uses a cartridge-type filter or disk filter having an average pore size of 0.22 to 10 μm and a housing to which a syringe can be attached.
ろ過の残渣が付着する前記フィルタからの核酸の抽出は、攪拌処理、ビーズ破砕処理、超音波処理、加熱処理のうちの少なくとも一つを含む処理により行われる
生物由来核酸回収方法。The biological nucleic acid recovery method according to claim 1 or 2,
A method for recovering nucleic acids of biological origin, wherein extraction of nucleic acids from the filter to which the residue of filtration is attached is performed by a treatment including at least one of stirring treatment, bead crushing treatment, ultrasonic treatment, and heat treatment.
前記核酸回収体は、前記核酸回収体を前記回収対象区域に接触させるための接触面を有する本体部の前記接触面を覆うように、前記本体部に対して着脱可能に取り付けられており、
前記核酸回収体に覆われた前記本体部の前記接触面を前記回収対象区域に接触させて、前記核酸含有堆積物を前記核酸回収体に付着させ、
前記核酸含有堆積物が付着した前記回収体を前記本体部から取り外して前記液に加え、前記懸濁液を作製する
生物由来核酸回収方法。The biological nucleic acid recovery method according to any one of claims 1 to 3,
The nucleic acid recovery material is detachably attached to the main body so as to cover the contact surface of the main body having a contact surface for bringing the nucleic acid recovery material into contact with the recovery target area,
bringing the contact surface of the main body covered with the nucleic acid recovery material into contact with the recovery target area to attach the nucleic acid-containing deposit to the nucleic acid recovery material;
A method for recovering biological nucleic acid, wherein the recovered body to which the nucleic acid-containing deposit has adhered is removed from the main body and added to the liquid to prepare the suspension.
前記核酸回収体として、シート状の核酸回収体を用いる
生物由来核酸回収方法。The biological nucleic acid recovery method according to any one of claims 1 to 4,
A method for recovering biological nucleic acid, wherein a sheet-like nucleic acid recovering material is used as the nucleic acid recovering material.
前記懸濁液の作製は、前記核酸回収体のうち、前記回収対象区域に接触させた部位の全体を前記液に加えて行う
生物由来核酸回収方法。The biological nucleic acid recovery method according to any one of claims 1 to 5,
The method for recovering biological nucleic acid, wherein the preparation of the suspension is carried out by adding the entire portion of the recovered nucleic acid that has been brought into contact with the area to be recovered to the solution.
前記懸濁液をろ過する際に、前記フィルタとして、目の粗さが異なる複数のフィルタを用いると共に、目の粗さが次第に細かくなる順で、前記複数のフィルタの各々を用いたろ過を行い、
ろ過の残渣が付着する前記複数のフィルタを合わせて、前記複数のフィルタから核酸を抽出する
生物由来核酸回収方法。The biological nucleic acid recovery method according to any one of claims 1 to 6,
When filtering the suspension, a plurality of filters having different mesh sizes are used as the filters, and filtration is performed using each of the plurality of filters in order of decreasing mesh size. ,
A method for recovering nucleic acid of biological origin, comprising combining the plurality of filters to which filtration residues adhere and extracting nucleic acids from the plurality of filters.
請求項１から７までのいずれか一項に記載の核酸回収方法により生物由来核酸を抽出し、
抽出した前記生物由来核酸を解析して、前記生物由来核酸が由来する生物種を特定する工程を含む
生物種モニタリング方法。A biological species monitoring method for monitoring biological species present in the environment, comprising:
Extracting biological nucleic acids by the method for recovering nucleic acids according to any one of claims 1 to 7,
A biological species monitoring method, comprising the step of analyzing the extracted biological nucleic acid to identify the biological species from which the biological nucleic acid is derived.
前記生物由来核酸を回収する対象である回収対象区域に存在する核酸含有堆積物を付着させるための核酸回収体と、
前記核酸回収体を前記回収対象区域に接触させるための接触面を有し、前記接触面を覆うように前記核酸回収体が着脱可能に取り付けられた本体部と、
前記核酸回収体および前記本体部とは別体で設けられ、前記核酸回収体を前記本体部に固定する取り付け具と、
を備える核酸回収装置。A nucleic acid recovery device for recovering biological nucleic acids from the environment,
a nucleic acid recovering body for adhering nucleic acid-containing deposits present in a recovery target area from which the biological nucleic acid is to be recovered;
a main body having a contact surface for bringing the nucleic acid recovery material into contact with the recovery target area, and to which the nucleic acid recovery material is detachably attached so as to cover the contact surface;
a fixture provided separately from the nucleic acid recovery material and the main body for fixing the nucleic acid recovery material to the main body;
A nucleic acid recovery device.
前記生物由来核酸を回収する対象である回収対象区域に存在する核酸含有堆積物を付着させるための核酸回収体と、
前記核酸回収体を前記回収対象区域に接触させるための接触面を有し、前記接触面を覆うように前記核酸回収体が着脱可能に取り付けられる本体部と、
を備え、
前記本体部のうち、少なくとも前記接触面を含む部位は、ポリエチレン、シリコーン、熱可塑性エラストマ（ＴＰＥ）から選択される材料により構成される
核酸回収装置。A nucleic acid recovery device for recovering biological nucleic acids from the environment,
a nucleic acid recovering body for adhering nucleic acid-containing deposits present in a recovery target area from which the biological nucleic acid is to be recovered;
a body portion having a contact surface for bringing the nucleic acid recovery material into contact with the recovery target area, and to which the nucleic acid recovery material is detachably attached so as to cover the contact surface;
with
A nucleic acid isolation device, wherein a portion of the main body that includes at least the contact surface is made of a material selected from polyethylene, silicone, and thermoplastic elastomer (TPE).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022006287AJP2023105453A (en) | 2022-01-19 | 2022-01-19 | Biological Nucleic Acid Recovery Method and Biological Nucleic Acid Recovery Device |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022006287AJP2023105453A (en) | 2022-01-19 | 2022-01-19 | Biological Nucleic Acid Recovery Method and Biological Nucleic Acid Recovery Device |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023105453Atrue JP2023105453A (en) | 2023-07-31 |
Family
ID=87468896
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022006287APendingJP2023105453A (en) | 2022-01-19 | 2022-01-19 | Biological Nucleic Acid Recovery Method and Biological Nucleic Acid Recovery Device |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2023105453A (en) |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002131196A (en)* | 2000-09-26 | 2002-05-09 | General Electric Co <Ge> | Device for detecting microparticle contaminant on surface |
| JP2002514916A (en)* | 1997-01-15 | 2002-05-21 | ニュー ホライズンズ ダイアグノスティックス コーポレーション | Pollutant detection method |
| JP2005532072A (en)* | 2002-07-10 | 2005-10-27 | マサチューセッツ・インスティテュート・オブ・テクノロジー | Apparatus and method for isolating nucleic acids from a sample |
| JP2006149215A (en)* | 2004-11-25 | 2006-06-15 | Asahi Kasei Corp | Nucleic acid detection cartridge and nucleic acid detection method |
| JP2009100742A (en)* | 2007-10-16 | 2009-05-14 | F Hoffmann La Roche Ag | Reagent and method for detecting gonococci |
| JP2013514810A (en)* | 2009-12-22 | 2013-05-02 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | Microbial concentration process and thickener for use in the process |
| JP2016188804A (en)* | 2015-03-30 | 2016-11-04 | エヌ・ティ・ティ・エイ・ティ・クリエイティブ株式会社 | Wiping tool of organism-related substance |
| WO2016194463A1 (en)* | 2015-05-29 | 2016-12-08 | 株式会社村田製作所 | Extraction method, analysis method, extraction apparatus, and analysis apparatus |
| JP2017099376A (en)* | 2015-11-19 | 2017-06-08 | 株式会社日吉 | Pretreatment method of environmental water sample, pretreatment agent for environmental water sample and estimation method of amount of biota or organisms |
| JP2020092645A (en)* | 2018-12-12 | 2020-06-18 | 大成建設株式会社 | Method for monitoring species in water area |
| JP2020534525A (en)* | 2017-09-21 | 2020-11-26 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ | Hazardous pollutant collection kit and rapid testing |
| JP2023105452A (en)* | 2022-01-19 | 2023-07-31 | 株式会社豊田中央研究所 | Organism-derived nucleic acid collecting method and organism-derived nucleic acid collecting device |
- 2022
- 2022-01-19JPJP2022006287Apatent/JP2023105453A/enactivePending
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002514916A (en)* | 1997-01-15 | 2002-05-21 | ニュー ホライズンズ ダイアグノスティックス コーポレーション | Pollutant detection method |
| JP2002131196A (en)* | 2000-09-26 | 2002-05-09 | General Electric Co <Ge> | Device for detecting microparticle contaminant on surface |
| JP2005532072A (en)* | 2002-07-10 | 2005-10-27 | マサチューセッツ・インスティテュート・オブ・テクノロジー | Apparatus and method for isolating nucleic acids from a sample |
| JP2006149215A (en)* | 2004-11-25 | 2006-06-15 | Asahi Kasei Corp | Nucleic acid detection cartridge and nucleic acid detection method |
| JP2009100742A (en)* | 2007-10-16 | 2009-05-14 | F Hoffmann La Roche Ag | Reagent and method for detecting gonococci |
| JP2013514810A (en)* | 2009-12-22 | 2013-05-02 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | Microbial concentration process and thickener for use in the process |
| JP2016188804A (en)* | 2015-03-30 | 2016-11-04 | エヌ・ティ・ティ・エイ・ティ・クリエイティブ株式会社 | Wiping tool of organism-related substance |
| WO2016194463A1 (en)* | 2015-05-29 | 2016-12-08 | 株式会社村田製作所 | Extraction method, analysis method, extraction apparatus, and analysis apparatus |
| JP2017099376A (en)* | 2015-11-19 | 2017-06-08 | 株式会社日吉 | Pretreatment method of environmental water sample, pretreatment agent for environmental water sample and estimation method of amount of biota or organisms |
| JP2020534525A (en)* | 2017-09-21 | 2020-11-26 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ | Hazardous pollutant collection kit and rapid testing |
| JP2020092645A (en)* | 2018-12-12 | 2020-06-18 | 大成建設株式会社 | Method for monitoring species in water area |
| JP2023105452A (en)* | 2022-01-19 | 2023-07-31 | 株式会社豊田中央研究所 | Organism-derived nucleic acid collecting method and organism-derived nucleic acid collecting device |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GRACE TUNG-THOMPSON ET AL.: ""Evaluation of a Surface Sampling Method for Recovery of Human Noroviruses Prior to Detection Using", JOURNAL OF FOOD PROTECTION, vol. 80, no. 2, JPN6025033667, February 2017 (2017-02-01), pages 231 - 236, ISSN: 0005665221* |
| KEVIN LEEMPOEL ET AL.: ""A comparison of eDNA to camera trapping for assessment of terrestrial mammal diversity"", PROCEEDINGS OF THE ROYAL SOCIETY B: BIOLOGICAL SCIENCES, vol. 287, no. 1918, JPN6025033668, 15 January 2020 (2020-01-15), pages 20192353, ISSN: 0005665222* |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102094079B1 (en) | Composition for extracting viral RNA using silica-coated magnetic beads and method for extracting viral RNA using the same | |
| US20090043087A1 (en) | DNA purification and recovery from high particulate and solids samples | |
| CN103443275B (en) | The method of spermanucleic acid is reclaimed by forensic samples | |
| US9770742B2 (en) | Method for decontaminating soil and the like and system for decontaminating soil and the like | |
| CN104531879A (en) | Environment DNA identification method for fish community structure researching | |
| US20070077573A1 (en) | Method for extracting DNA from sample of organism | |
| US20210363514A1 (en) | Syringe-type nucleic acid extraction apparatus, nucleic acid extraction kit and nucleic acid extraction method therewith | |
| JP2023105452A (en) | Organism-derived nucleic acid collecting method and organism-derived nucleic acid collecting device | |
| JP2023105453A (en) | Biological Nucleic Acid Recovery Method and Biological Nucleic Acid Recovery Device | |
| JP2009118780A (en) | Microorganism detection method and filtration apparatus | |
| JP7260901B2 (en) | Arthropod trace investigation method and liquid collector | |
| Gutiérrez-López et al. | Monitoring mosquito richness in an understudied area: can environmental DNA metabarcoding be a complementary approach to adult trapping? | |
| CN108672491B (en) | Method for efficiently repairing heavy metal ions in wetland soil | |
| CN115627295B (en) | Kit and whale species identification method | |
| WO2011068465A1 (en) | A method and apparatus for recovering cells and their analysis | |
| JP2023158885A (en) | Biological nucleic acid recovery attachment | |
| JP2024113888A (en) | Apparatus and method for extracting nucleic acid from organisms | |
| JP7359632B2 (en) | Bacterial flora collection device and bacterial flora collection method | |
| JP2025011879A (en) | Environmental Nucleic Acid Monitoring Methods | |
| CN105200039A (en) | Extraction method of atmospheric particulate matter genome DNA | |
| JP2008505326A (en) | Cell collection method and apparatus for polymer analysis | |
| Arango | First Record of the Arid-Land Termite Reticulitermes tibialis Banks, in Wisconsin | |
| CN102229927A (en) | Method and reagent for improving rate of extraction of DNAs of castoff cells in case trace sample | |
| CN112501163B (en) | Method for purifying nucleic acid and nucleic acid purification apparatus | |
| Pepin et al. | Première évaluation de la diversité des communautés microbiennes planctoniques au cours d'épisodes de mortalité des moules bleues en France: utilisation de l'approche de métabarcoding pour l'analyse de l'ADN environnemental |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination | Free format text:JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date:20241007 | |
| A977 | Report on retrieval | Free format text:JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date:20250728 | |
| A131 | Notification of reasons for refusal | Free format text:JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date:20250819 |