JP2022059154A - Analytical equipment and analytical method - Google Patents

Abstract

To provide a technology that accurately calculates the concentration of a measurement object in a specimen.SOLUTION: An analyzer comprises: a measurement container that includes a first block into which a solution containing a specimen and a reactive particle modified with a substance specifically binding to a measurement object substance is introduced, a second block into which the solution is introduced, and a thin film provided with a pore for connecting the first and the second blocks; a first electrode provided in the first block; a second electrode provided in the second block; a voltage source for applying voltage between the electrodes; an ammeter for measuring the current flowing between the electrodes; and a processor for processing current data. The processor executes a process of extracting from the current data a blockage current waveform that is generated when the reactive particles pass through the pore, a process of identifying on the basis of the blockade current waveform the number of coagulates when three or more reactive particles coagulate, and a process of calculating the concentration of the measurement object substance in the specimen, on the basis of the passage number of aggregates of monomer, dimmer, trimmer or higher having passed through the pore during a unit time.SELECTED DRAWING: Figure 3

Description

Translated fromJapanese

本開示は、分析装置及び分析方法に関する。 The present disclosure relates to an analyzer and an analysis method.

免疫分析装置は、抗原抗体反応を利用してサンプル溶液中に占める計測対象物質（抗原や抗体等）の濃度を計測する装置であり、生化学分析装置及び遺伝子検査装置と並ぶ重要な臨床検査装置である。免疫分析装置において、主に化学発光や電気化学発光といった微弱な光を定量的に検出する方式が広く用いられてきた。上記方式の免疫分析装置には、高感度な光検出器である光電子増倍管を搭載する必要がある。しかしながら、光電子増倍管は一般に高額であり、かつ光量過多により壊れやすいという特徴があるため、小型で持ち運び可能な免疫分析装置への適用は困難である。また、これらの免疫分析装置の計測可能な濃度レンジは１０^－１５ｍｏｌ／Ｌ以上であり、より低濃度の計測対象物質を計測するためには、更に高感度な検出方式が必要である。The immunoassay device is a device that measures the concentration of the substance to be measured (antigen, antibody, etc.) in the sample solution by using the antigen-antibody reaction, and is an important clinical test device along with the biochemical analyzer and the genetic test device. Is. In immunoassays, a method of quantitatively detecting faint light such as chemiluminescence or electrochemical luminescence has been widely used. The immunoassay device of the above method needs to be equipped with a photomultiplier tube, which is a highly sensitive photodetector. However, photomultiplier tubes are generally expensive and fragile due to excessive light intensity, which makes them difficult to apply to small and portable immunoassays. In addition, the measurable concentration range of these immunoassays is^10-15 mol / L or more, and a more sensitive detection method is required to measure a substance to be measured at a lower concentration.

高感度な免疫分析装置として、計測対象物質を１つ１つカウントするデジタルカウント方式が注目を集めている。中でも、抵抗パルス法（非特許文献１）を原理とする計測方式は、計測対象物質と試薬中の抗体修飾粒子との反応生成物が、検出部であるポアを通過するときのイオン電流変化を計測する方式であり、光検出ではなく電流計測を原理とするため、小型化だけでなく低コスト化も期待できる方式として注目されている。 As a highly sensitive immunoassay device, a digital counting method that counts substances to be measured one by one is attracting attention. Among them, the measurement method based on the resistance pulse method (Non-Patent Document 1) changes the ion current when the reaction product between the substance to be measured and the antibody-modified particles in the reagent passes through the pore, which is the detection unit. Since it is a measurement method and is based on current measurement rather than light detection, it is attracting attention as a method that can be expected not only to reduce size but also to reduce costs.

Takakura, T., et al., Single-molecule detection of proteins with antigen-antibody interaction using resistive-pulse sensing of submicron latex particles, Appl. Phys. Lett. 108, 123701 (2016).Takakura, T., et al., Single-molecule detection of proteins with antigen-antibody interaction using resultant-pulse sensing of submicron latex particles, Appl. Phys. Lett. 108, 123701 (2016).

非特許文献１には、計測対象物質と抗体修飾粒子との反応生成物がポアを通過したときのパルス信号の大きさが、抗体修飾粒子の単量体（非凝集体）と２量体（凝集体）とで異なることを利用して、凝集体比率を算出する方式が開示されている。非特許文献１に記載の方式では、パルス信号の最大変動幅（＝封鎖電流量）のみで判定するため、簡便なアルゴリズムで非凝集体と凝集体の比率を算出できる。本文献では、サンプルの抗原濃度によって凝集体比率が変わることを示し、十分な時間の反応後（エンドポイント）における凝集体比率から抗原濃度が算出される。 InNon-Patent Document 1, the magnitude of the pulse signal when the reaction product of the substance to be measured and the antibody-modified particles passes through the pores is the monomer (non-aggregate) and the dimer (non-aggregate) of the antibody-modified particles. A method for calculating the agglomerate ratio by utilizing the difference between the agglomerates and the agglomerates is disclosed. In the method described inNon-Patent Document 1, since the determination is made only by the maximum fluctuation width (= blocking current amount) of the pulse signal, the ratio of non-aggregates to aggregates can be calculated by a simple algorithm. In this document, it is shown that the aggregate ratio changes depending on the antigen concentration of the sample, and the antigen concentration is calculated from the aggregate ratio after the reaction (endpoint) for a sufficient time.

図１は、反応性粒子１０３及び計測対象物質１０１の凝集反応を示す模式図である。図１に示すように、反応性粒子１０３の表面には複数の反応サイト１０４があるため、反応性粒子１０３の単量体１０２と計測対象物質１０１との凝集反応が進むと、２量体１０５だけなく、３量体１０６などの多量体も生成される。非特許文献１では、サンプルに計測対象物質として抗原が極微量含まれる場合のデータが示されているが、抗原濃度が高い条件になると、短時間でこのような多量体（凝集体）が生成される。なお、単量体１０２には、１つの反応性粒子１０３と１つの計測対象物質１０１とが結合したものも含まれる。 FIG. 1 is a schematic diagram showing the agglutination reaction of thereactive particles 103 and the substance to be measured 101. As shown in FIG. 1, since there are a plurality ofreaction sites 104 on the surface of thereactive particles 103, when the agglutination reaction between themonomer 102 of thereactive particles 103 and the substance to be measured 101 proceeds, thedimer 105 Not only multimers such astrimer 106 are also produced. Non-PatentDocument 1 shows data when the sample contains a very small amount of antigen as a substance to be measured, but when the antigen concentration is high, such a multimer (aggregate) is generated in a short time. Will be done. Themonomer 102 also includes one in which onereactive particle 103 and one substance to be measured 101 are bonded.

図２は、反応性粒子及び計測対象物質の反応時間の経過に伴う単量体～３量体の数の変化を示す模式図である。図２に示すように、凝集反応が進むことで、２量体数はある時間までは徐々に増加するが、３量体以上の凝集体が生成されることでやがて２量体数は低減する。したがって、非特許文献１に記載の方式のように封鎖電流量に基づき単量体と２量体の数を計数するだけでは、計測精度が低減しやすい。 FIG. 2 is a schematic diagram showing changes in the number of monomers to trimers with the passage of reaction time of the reactive particles and the substance to be measured. As shown in FIG. 2, as the agglutination reaction progresses, the number of dimers gradually increases until a certain time, but the number of dimers decreases due to the formation of aggregates of trimeric or more. .. Therefore, the measurement accuracy can be easily reduced only by counting the number of the monomer and the dimer based on the amount of the blocking current as in the method described inNon-Patent Document 1.

そこで、本開示は、検体中の計測対象物質の濃度を正確に算出する技術を提供する。 Therefore, the present disclosure provides a technique for accurately calculating the concentration of the substance to be measured in the sample.

上記課題を解決するために、本開示の分析装置は、検体と、前記検体に含まれ得る計測対象物質に対して特異的に結合する物質が修飾された反応性粒子とを含む第１の溶液が導入される第１の区画と、第２の溶液が導入される第２の区画と、前記第１の区画と前記第２の区画を接続する細孔を備えた薄膜と、を有する計測容器と、前記第１の区画の内部に設けられた第１の電極と、前記第２の区画の内部に設けられた第２の電極と、前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧を印加する電圧源と、前記第１の電極と前記第２の電極との間に流れる電流を計測する電流計と、前記電流計により得られた電流データを処理するプロセッサと、を備え、前記プロセッサは、前記電流データから、前記反応性粒子が前記細孔を通過する際に生じる封鎖電流波形を抽出する処理と、前記封鎖電流波形に基づき、３つ以上の前記反応性粒子が凝集したときの凝集数を識別する処理と、単位時間中に前記細孔を通過した単量体、２量体及び３量体以上の凝集体の通過数に基づいて、前記検体中の前記計測対象物質の濃度を算出する処理と、を実行することを特徴とする。 In order to solve the above problems, the analyzer of the present disclosure includes a sample and a first solution containing reactive particles modified with a substance that specifically binds to a measurement target substance that can be contained in the sample. A measuring container having a first compartment into which a second compartment is introduced, a second compartment into which a second solution is introduced, and a thin film having pores connecting the first compartment and the second compartment. Between the first electrode provided inside the first compartment, the second electrode provided inside the second compartment, and the first electrode and the second electrode. A voltage source for applying a voltage to the current, a current meter for measuring the current flowing between the first electrode and the second electrode, and a processor for processing the current data obtained by the current meter are provided. The processor extracts the blockage current waveform generated when the reactive particles pass through the pores from the current data, and three or more of the reactive particles aggregate based on the blockage current waveform. The measurement target in the sample is based on the process of identifying the number of aggregates when the current is formed and the number of aggregates of the monomer, dimer, and trimer or more that have passed through the pores during a unit time. It is characterized by performing a process of calculating the concentration of a substance and performing.

本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される特許請求の範囲の様態により達成され実現される。
本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではない。Further features relating to this disclosure will be apparent from the description herein and the accompanying drawings. In addition, the aspects of the present disclosure are achieved and realized by the combination of elements and various elements, the detailed description below, and the aspects of the appended claims.
The description of the present specification is merely a typical example, and does not limit the scope of claims or application examples of the present disclosure in any sense.

本開示の技術によれば、検体中の計測対象物質の濃度を正確に算出することができる。上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。 According to the technique of the present disclosure, the concentration of the substance to be measured in the sample can be accurately calculated. Issues, configurations and effects other than those described above will be clarified by the following description of the embodiments.

反応性粒子及び計測対象物質の凝集反応を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the agglutination reaction of a reactive particle and a substance to be measured.反応性粒子及び計測対象物質の反応時間の経過に伴う単量体～３量体の数の変化を示す図である。It is a figure which shows the change of the number of monomers to a trimer with the passage of a reaction time of a reactive particle and a substance to be measured.第１の実施形態に係る免疫分析装置を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the immunoassay apparatus which concerns on 1st Embodiment.反応性粒子の単量体、２量体及び３量体、並びに異常サイズの反応性粒子が細孔を通過する様子と、そのときに得られる電流データを示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the appearance of the monomer of the reactive particles, the dimer and the trimer, and the reactive particles of abnormal size passing through the pores, and the current data obtained at that time.抽出された封鎖電流波形の代表的な例を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the typical example of the extracted blockage current waveform.検体中の計測対象物質の濃度を算出する方法を説明するためのグラフである。It is a graph for demonstrating the method of calculating the concentration of the substance to be measured in a sample.複数の反応性粒子が凝集した状態を説明するための模式図である。It is a schematic diagram for demonstrating the state in which a plurality of reactive particles were aggregated.免疫分析装置の他の構成例を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the other configuration example of an immunoassay apparatus.免疫分析装置の他の構成例を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the other configuration example of an immunoassay apparatus.免疫分析装置の他の構成例を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the other configuration example of an immunoassay apparatus.反応性粒子の２量体が細孔の中心を通過するときの断面模式図である。It is sectional drawing when the dimer of a reactive particle passes through the center of a pore.実験例１における細孔を通過する電流量のシミュレーション結果を示すグラフである。It is a graph which shows the simulation result of the amount of current passing through a pore in Experimental Example 1.実験例２において得られた封鎖電流波形の一例を示すグラフである。It is a graph which shows an example of the blockage current waveform obtained in Experimental Example 2.実験例２において計測対象物質濃度ごとに得られた凝集体比率ｎ（％）の近似直線を示すグラフである。It is a graph which shows the approximate straight line of the aggregate ratio n (%) obtained for each measurement target substance concentration in Experimental Example 2.実験例３及び比較例に係る凝集体比率の算出結果を示すグラフである。It is a graph which shows the calculation result of the aggregate ratio which concerns on Experimental Example 3 and Comparative Example.

本開示の実施の形態を説明するための全図において、同一機能を有するものには同一の符号を付すようにし、その繰り返しの説明は可能な限り省略するようにしている。また、本開示は以下に示す実施の形態の記載内容に限定して解釈されるものではない。本開示の思想ないし趣旨から逸脱しない範囲で、その具体的構成を変更し得ることは当業者であれば容易に理解される。 In all the drawings for explaining the embodiments of the present disclosure, those having the same function are designated by the same reference numerals, and the repeated description thereof is omitted as much as possible. In addition, the present disclosure is not construed as being limited to the description of the embodiments shown below. It is easily understood by those skilled in the art that the specific composition can be changed without departing from the idea or purpose of the present disclosure.

図面等において示す各構成の位置、大きさ、形状、範囲などは、発明の理解を容易にするため、実際の位置、大きさ、形状、範囲などを表していない場合がある。このため、本開示は、必ずしも、図面等に開示された位置、大きさ、形状、範囲などに限定されない。本明細書で引用した刊行物、特許公報は、そのまま本明細書の説明の一部を構成する。本明細書において単数形で表される構成要素は、特段文脈で明らかに示されない限り、複数形を含むものとする。 The position, size, shape, range, etc. of each configuration shown in the drawings and the like may not represent the actual position, size, shape, range, etc. in order to facilitate understanding of the invention. Therefore, the present disclosure is not necessarily limited to the position, size, shape, range, etc. disclosed in the drawings and the like. The publications and patent gazettes cited herein constitute a part of the description of the present specification as they are. The components represented in the singular form herein are intended to include the plural, unless explicitly stated in the context.

以下の実施形態において、分析装置の一例として免疫分析装置について説明するが、本開示の技術は免疫分析装置以外の分析装置にも適用可能である。本開示の分析装置における計測に用いられる反応性粒子は、計測対象物質と特異的に結合する。このような結合には、例えば抗原抗体反応による結合、アビジン－ビオチン結合、磁気による結合など、任意の化学的結合及び物理的結合が含まれる。また、反応性粒子の表面には、計測対象物質と特異的に結合する物質が修飾されていてもよい。 In the following embodiment, the immunoassay device will be described as an example of the analyzer, but the technique of the present disclosure can be applied to an analyzer other than the immunoassay device. The reactive particles used for measurement in the analyzer of the present disclosure specifically bind to the substance to be measured. Such binding includes any chemical and physical binding, such as, for example, antigen-antibody reaction binding, avidin-biotin binding, magnetic binding, and the like. Further, the surface of the reactive particles may be modified with a substance that specifically binds to the substance to be measured.

［第１の実施形態］
＜免疫分析装置の構成例＞
図３は、第１の実施形態に係る免疫分析装置１００の構成例を示す模式図である。図３に示すように、免疫分析装置１００は、薄膜３、第１の槽１１（第１の区画）、第２の槽１２（第２の区画）、第１の電極１３、第２の電極１４、電源装置１５（電圧源）、電流計１６及び演算処理部１７（プロセッサ）を備える。[First Embodiment]
<Configuration example of immunoassay device>
FIG. 3 is a schematic diagram showing a configuration example of theimmunoassay device 100 according to the first embodiment. As shown in FIG. 3, theimmunoanalyzer 100 includes athin film 3, a first tank 11 (first compartment), a second tank 12 (second compartment), afirst electrode 13, and a second electrode. A power supply device 15 (voltage source), anammeter 16 and an arithmetic processing unit 17 (processor) are provided.

薄膜３には細孔２が設けられている。薄膜３は、片面が第１の槽１１に配置され、もう一方の面が第２の槽１２に配置されている。第１の槽１１及び第２の槽１２は、薄膜３によって分離され、細孔２を通じて連通している。これにより、薄膜３、第１の槽１１及び第２の槽１２により計測容器が構成される。第１の槽１１及び第２の槽１２には電解質を含む溶液１が充填されている。第１の槽１１中の溶液１と第２の槽１２中の溶液１とは、組成が異なっていてもよい。第１の電極１３は第１の槽１１の内部に設けられ、第１の槽１１内の溶液１に接している。第２の電極１４は第２の槽１２の内部に設けられ、第２の槽１２内の溶液１に接している。第１の電極１３及び第２の電極１４は配線と接合されており、電流計１６へと電気信号が送られる。電流計１６は、細孔２を通過する電流を計測する。電源装置１５は、第１の電極１３と第２の電極１４との間に電圧を印加する。 Thethin film 3 is provided withpores 2. One side of thethin film 3 is arranged in thefirst tank 11, and the other side is arranged in thesecond tank 12. Thefirst tank 11 and thesecond tank 12 are separated by thethin film 3 and communicate with each other through thepores 2. As a result, the measuring container is composed of thethin film 3, thefirst tank 11, and thesecond tank 12. Thefirst tank 11 and thesecond tank 12 are filled with thesolution 1 containing an electrolyte. The composition of thesolution 1 in thefirst tank 11 and thesolution 1 in thesecond tank 12 may be different. Thefirst electrode 13 is provided inside thefirst tank 11 and is in contact with thesolution 1 in thefirst tank 11. Thesecond electrode 14 is provided inside thesecond tank 12 and is in contact with thesolution 1 in thesecond tank 12. Thefirst electrode 13 and thesecond electrode 14 are joined to the wiring, and an electric signal is sent to theammeter 16. Theammeter 16 measures the current passing through thepores 2. Thepower supply device 15 applies a voltage between thefirst electrode 13 and thesecond electrode 14.

第１の電極１３及び第２の電極１４は、溶液１中の電解質と電子授受反応（ファラデー反応）を行うことが可能な材質で作製することができ、典型的にはハロゲン化銀又はハロゲン化アルカリ銀で作製することができる。電位安定性及び信頼性の観点からは、第１の電極１３及び第２の電極１４として銀／銀塩化銀電極を使用することができる。第１の電極１３及び第２の電極１４は、分極電極となる材質で作製されてもよく、例えば金や白金などで作製されてもよい。その場合は、安定的なイオン電流を確保するために、溶液１に電子授受反応を補助することができる物質、例えばフェリシアン化カリウム又はフェロシアン化カリウムなどを添加することができる。あるいは、電子授受反応を行うことが可能な物質、例えばフェロセン類をその分極電極の表面に固定化することができる。第１の電極１３及び第２の電極１４の構造は、その全てが前記材質で構成されていてもよく、あるいは前記材質が銅、アルミニウムなどの下地材の表面に被覆されていてもよい。第１の電極１３及び第２の電極１４の形状は特に限定されるものではないが、溶液１と接液する表面積が大きくなる形状を採用することができる。 Thefirst electrode 13 and thesecond electrode 14 can be made of a material capable of performing an electron transfer reaction (Faraday reaction) with the electrolyte in thesolution 1, and is typically silver halide or halogenated. It can be made of alkali silver. From the viewpoint of potential stability and reliability, a silver / silver silver chloride electrode can be used as thefirst electrode 13 and thesecond electrode 14. Thefirst electrode 13 and thesecond electrode 14 may be made of a material to be a polarization electrode, or may be made of, for example, gold or platinum. In that case, in order to secure a stable ionic current, a substance capable of assisting the electron transfer reaction, such as potassium ferricyanide or potassium ferrocyanide, can be added to thesolution 1. Alternatively, a substance capable of carrying out an electron transfer reaction, such as ferrocene, can be immobilized on the surface of the polarization electrode. The structures of thefirst electrode 13 and thesecond electrode 14 may be all made of the above-mentioned material, or the material may be coated on the surface of a base material such as copper or aluminum. The shapes of thefirst electrode 13 and thesecond electrode 14 are not particularly limited, but a shape having a large surface area in contact with thesolution 1 can be adopted.

薄膜３の材質は、例えば半導体微細加工技術で細孔２を形成可能な無機材料とすることができる。このような無機材料として、典型的には窒化ケイ素、酸化ケイ素、酸化ハフニウム、二硫化モリブデン及びグラフェンなどが挙げられる。中でも、窒化ケイ素及び酸化ケイ素は、半導体プロセスで量産可能なＳｉ化合物である。薄膜３に設けられる細孔２は、大量生産ができるよう半導体プロセスによって形成することができる。あるいは、ガラス管をピペット状に加工することで、微小体積を有する細孔を作製してもよい。あるいは、細孔２が設けられていない状態の薄膜３の両側に対し、電源装置１５により電位差を印加することによって、絶縁破壊現象を利用して細孔２を形成することもできる。 The material of thethin film 3 can be, for example, an inorganic material capable of formingpores 2 by semiconductor microfabrication technology. Examples of such an inorganic material include silicon nitride, silicon oxide, hafnium oxide, molybdenum disulfide, graphene and the like. Among them, silicon nitride and silicon oxide are Si compounds that can be mass-produced in a semiconductor process. Thepores 2 provided in thethin film 3 can be formed by a semiconductor process so that they can be mass-produced. Alternatively, the glass tube may be processed into a pipette shape to form pores having a minute volume. Alternatively, thepores 2 can be formed by utilizing the dielectric breakdown phenomenon by applying a potential difference to both sides of thethin film 3 in a state where thepores 2 are not provided by thepower supply device 15.

薄膜３は、支持基板により支持されていてもよい。例えば、７２５μｍの厚さのシリコンの支持基板により、厚さ１０μｍ以下、面積１０ｍｍ^２以下のＳｉＮの薄膜３を支持したデバイスを使用することができる。Thethin film 3 may be supported by a support substrate. For example, a device that supports a SiNthin film 3 having a thickness of 10 μm or less and an area of 10 mm² or less can be used by using a silicon support substrate having a thickness of 725 μm.

少なくとも第１の槽１１中の溶液１には、検体（検体中の計測対象物質１０１）と反応性粒子１０３とを反応させた物質が含まれる。また、溶液１は、イオン電流を計測できるように１ｍＭ以上の塩を含む溶液とすることができる。電流計測時におけるシグナルを向上させるためには、電気伝導度が上がるように塩濃度を高くすればよく、例えば１０ｍＭ以上又は５０ｍＭ以上とすることができる。溶液１に含まれるカチオンとしては、電離するカチオン類を用いることができ、典型的にはＬｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ及びＢａなどの一族元素又は二族元素を用いることができる。溶液１に含まれるアニオンとしては、電離するアニオン類を用いることができ、電極の材質との相性によって選定することができる。例えば電極の材質としてハロゲン化銀を用いた場合、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌなどのハロゲン化物のイオンをアニオンとして用いることができる。また、アニオンは、グルタミン酸イオン等に代表される有機アニオン類であってもよい。溶液１に含まれる検体と反応性粒子１０３は、第１の槽１１及び第２の槽１２の双方に含まれていても良いが、検体量の削減や試薬コストを考慮すると、片方のみに導入することもできる。 At least thesolution 1 in thefirst tank 11 contains a substance obtained by reacting the sample (measurement target substance 101 in the sample) with thereactive particles 103. Further, thesolution 1 can be a solution containing a salt of 1 mM or more so that the ionic current can be measured. In order to improve the signal at the time of current measurement, the salt concentration may be increased so as to increase the electrical conductivity, for example, 10 mM or more or 50 mM or more. As the cation contained in thesolution 1, ionizing cations can be used, and typically a group element or a group element such as Li, Na, K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr and Ba is used. be able to. As the anions contained in thesolution 1, ionizing anions can be used and can be selected depending on the compatibility with the material of the electrode. For example, when silver halide is used as the material of the electrode, ions of a halide such as I, Br, and Cl can be used as an anion. Further, the anion may be an organic anion represented by glutamic acid ion or the like. The sample and thereactive particles 103 contained in thesolution 1 may be contained in both thefirst tank 11 and thesecond tank 12, but are introduced into only one of them in consideration of the reduction of the sample amount and the reagent cost. You can also do it.

反応性粒子１０３の大きさは、反応確率を高めるために、例えば粒径１０～１００ｎｍ程度であってもよく、封鎖信号量を高めるためには粒径５００～１０００ｎｍであってもよいが、典型的な免疫凝集法では、粒径１００～５００ｎｍ程度の粒子が用いられる。一般によく販売される粒径３００ｎｍ程度の粒子を用いてもよい。反応性粒子１０３の材質には、典型的には比較的安価で使用例も多いラテックス粒子が用いられる。ただし、免疫検査装置等で広く用いられるＢ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離を実施できるように、超常磁性等の磁気特性を有する磁性粒子を用いてもよい。 The size of thereactive particles 103 may be, for example, a particle size of about 10 to 100 nm in order to increase the reaction probability, and may be a particle size of 500 to 1000 nm in order to increase the amount of the blocking signal, which is typical. In a typical immunoaggregation method, particles having a particle size of about 100 to 500 nm are used. Particles having a particle size of about 300 nm, which are generally sold well, may be used. As the material of thereactive particles 103, latex particles, which are relatively inexpensive and are often used, are typically used. However, magnetic particles having magnetic properties such as superparamagnetism may be used so that B / F (Bound / Free) separation widely used in immunoassays and the like can be performed.

反応性粒子１０３は、計測対象物質１０１と抗原抗体反応により結合する。例えば抗原を計測対象物質１０１とする場合は、表面に抗体が修飾された反応性粒子１０３を用いることができる。このような抗体は抗原抗体反応によって凝集反応が生じるものであればよく、モノクローナル抗体であってもよいしポリクローナル抗体であってもよい。また、反応性粒子１０３には、異なる抗体が修飾された粒子が混在していてもよい。一方、抗体を計測対象物質１０１とする場合には、表面に抗原が修飾された反応性粒子１０３を用いることができる。また、反応性粒子１０３は表面電荷を帯びていてもよい。さらに、粒径や表面電荷が異なる複数種類の反応性粒子１０３の凝集反応を活用することで、複数種類の抗原又は抗体を異なる種類の反応性粒子１０３に反応させる方式を採用することもできる。異なる粒径を用いると細孔２の封鎖量の大きさが異なり、また表面電荷の大きさが異なることで細孔２の通過時間が異なるため、これを利用することで多項目の抗原又は抗体の濃度を同時に計測することが可能である。多項目同時検出により、１つの検体から複数項目を同時に計測できることから、試薬代の低コスト化、計測時間の短時間化、検体量の低減等の多方面における効果をもたらす。 Thereactive particles 103 bind to the substance to be measured 101 by an antigen-antibody reaction. For example, when the antigen is the substance to be measured 101, thereactive particles 103 having an antibody modified on the surface can be used. Such an antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody as long as it causes an agglutination reaction by an antigen-antibody reaction. Further, thereactive particles 103 may contain particles modified with different antibodies. On the other hand, when the antibody is used as themeasurement target substance 101, thereactive particles 103 having an antigen-modified surface can be used. Further, thereactive particles 103 may be charged with a surface charge. Further, by utilizing the agglutination reaction of a plurality of types ofreactive particles 103 having different particle sizes and surface charges, it is possible to adopt a method in which a plurality of types of antigens or antibodies are reacted with different types ofreactive particles 103. If different particle sizes are used, the size of the blockage amount of thepore 2 will be different, and the passage time of thepore 2 will be different due to the difference in the size of the surface charge. It is possible to measure the concentration of. Since multiple items can be measured simultaneously from one sample by simultaneous detection of multiple items, it brings about various effects such as reduction of reagent cost, shortening of measurement time, and reduction of sample amount.

免疫分析装置１００に導入される検体と反応性粒子１０３の、第１の槽１１又は第２の槽１２への導入方法は、一態様としては、予め混合及び撹拌した後に第１の槽１１又は第２の槽１２に導入するものである。ただし、免疫分析装置１００内に混合及び撹拌機構を一体化させて、第１の槽１１又は第２の槽１２内で、混合及び撹拌を実施してもよい。また、検体と反応性粒子１０３を反応させる前に、検体中に含まれる比較的大きな計測対象外の物質を除去する処理を施してもよい。一般に検体サンプル中には、血小板やタンパク質の凝集体等が多数含まれているため、これらを遠心分離処理等によって除去するとよい。また遠心分離以外にも、例えば４００ｎｍ以下の物質や２００ｎｍ以下の物質のみを通すようなフィルタ処理を施すことで、夾雑物由来の信号発生を抑制できる。このような遠心分離やフィルタ処理等を施した後に、検体を反応性粒子１０３と反応させることができる。 The method for introducing the sample and thereactive particles 103 to be introduced into theimmunoassay device 100 into thefirst tank 11 or thesecond tank 12 is, in one embodiment, in thefirst tank 11 or thefirst tank 11 or after being mixed and stirred in advance. It is to be introduced into thesecond tank 12. However, the mixing and stirring mechanism may be integrated in theimmunoassay device 100, and the mixing and stirring may be carried out in thefirst tank 11 or thesecond tank 12. Further, before the sample and thereactive particles 103 are reacted, a treatment for removing a relatively large non-measurement target substance contained in the sample may be performed. Generally, a large number of platelets, protein aggregates, and the like are contained in the sample sample, and these may be removed by centrifugation or the like. In addition to centrifugation, it is possible to suppress the generation of signals derived from contaminants by performing a filter treatment that allows only substances of 400 nm or less or substances of 200 nm or less to pass through. After performing such centrifugation, filtering, or the like, the sample can be reacted with thereactive particles 103.

電流計１６は、電圧の印加によって第１の電極１３及び第２の電極１４間に流れる電流を増幅するアンプと、増幅された電流信号（アナログ）をデジタル信号に変換するＡＤコンバータ（Analog to Digital Converter）と、を有していてもよい。電流計１６は、取得した電流データを演算処理部１７に出力する。 Thecurrent meter 16 includes an amplifier that amplifies the current flowing between thefirst electrode 13 and thesecond electrode 14 by applying a voltage, and an AD converter (Analog to Digital) that converts the amplified current signal (analog) into a digital signal. Converter) and may have. Theammeter 16 outputs the acquired current data to thearithmetic processing unit 17.

演算処理部１７は、電流計１６からの電流データの入力を受け付け、電流データを処理する。演算処理部１７は、電流データから反応性粒子１０３が細孔２を通過する時の電流波形（封鎖電流波形）を抽出する処理と、封鎖電流波形に基づいて反応性粒子１０３の凝集数を識別する処理と、計測対象物質１０１の濃度を算出する処理と、を実行する。これらの処理の詳細は後述する。演算処理部１７は、単一の装置（プロセッサ）で構成されていてもよいが、例えば、一部の演算処理までは電気回路やＦＰＧＡで実装されており、残りの後段処理はＰＣで実装するといったように、複数の装置で実装する形態であってもよい。 Thearithmetic processing unit 17 receives the input of the current data from theammeter 16 and processes the current data. Thearithmetic processing unit 17 identifies the number of aggregates of thereactive particles 103 based on the process of extracting the current waveform (blocking current waveform) when thereactive particles 103 pass through thepores 2 from the current data and the blocking current waveform. And the process of calculating the concentration of thesubstance 101 to be measured are executed. Details of these processes will be described later. Thearithmetic processing unit 17 may be configured by a single device (processor), but for example, some arithmetic processing is implemented by an electric circuit or FPGA, and the rest of the subsequent processing is implemented by a PC. As such, it may be mounted on a plurality of devices.

電流計測の一態様としては、例えば、第１の電極１３及び第２の電極１４の端子に１～１０００ｍＶ程度の電位差を与えることができる。第１の電極１３及び第２の電極１４の端子はアンプに接続して、利得１０^６～１０^１２倍程度、カットオフ周波数１ｋＨｚ～１０ＭＨｚ程度で電圧信号に変換する。電圧信号は、ＡＤコンバータによりサンプリング周波数１０ｋＨｚ～１００ＭＨｚ程度でデジタル信号に変換して、演算処理部１７（ＰＣ等）に保存する。カットオフ周波数が大きくなると、高周波ノイズが増幅しやすいというトレードオフがあることから、カットオフ周波数は、特に１０ｋＨｚ～１ＭＨｚとすることができる。これに合わせて、サンプリング周波数は１００ｋＨｚ～１０ＭＨｚとするとよい。細孔２を通過する電流の主成分は高周波ノイズであり、高周波ノイズは主にデバイス（薄膜３）の静電容量の大きさに依存することから、静電容量は可能な限り小さくするとよい。典型的には、デバイスの静電容量は１ｎＦ以下であるが、場合に応じて１００ｐＦ以下、又は１０ｐＦ以下とすることができる。静電容量の低減方法としては、一態様として、デバイスと溶液１との接液面積を狭める方法か、又はデバイス表面に絶縁膜を塗布する方法を用いることができる。As one aspect of current measurement, for example, a potential difference of about 1 to 1000 mV can be applied to the terminals of thefirst electrode 13 and thesecond electrode 14. The terminals of thefirst electrode 13 and thesecond electrode 14 are connected to an amplifier and converted into a voltage signal with a gain of about 10⁶ to 10¹² times and a cutoff frequency of about 1 kHz to 10 MHz. The voltage signal is converted into a digital signal at a sampling frequency of about 10 kHz to 100 MHz by an AD converter and stored in the arithmetic processing unit 17 (PC or the like). Since there is a trade-off that high frequency noise is likely to be amplified when the cutoff frequency is increased, the cutoff frequency can be particularly set to 10 kHz to 1 MHz. In line with this, the sampling frequency may be 100 kHz to 10 MHz. The main component of the current passing through thepores 2 is high-frequency noise, and the high-frequency noise mainly depends on the magnitude of the capacitance of the device (thin film 3). Therefore, the capacitance should be as small as possible. Typically, the capacitance of the device is 1 nF or less, but can be 100 pF or less, or 10 pF or less, depending on the case. As a method for reducing the capacitance, as one aspect, a method of narrowing the contact area between the device and thesolution 1 or a method of applying an insulating film to the surface of the device can be used.

＜電流データの処理方法＞
（ｉ）封鎖電流波形の抽出
図４Ａは、反応性粒子１０３の単量体、２量体及び３量体、並びに異常サイズの反応性粒子１０３が細孔２を通過する様子と、そのときに得られる電流データを示す模式図である。図４Ａにおいては、一例として、単量体（ａ）、２量体（ｂ）、３量体（ｃ）及び異常サイズ（ｄ）の順に細孔２を通過した場合の電流データが示されている。図４Ａの電流データに示すように、反応性粒子１０３が細孔２を通過すると、細孔２が封鎖されることにより電流が低下し、このときの電流波形（封鎖電流波形）は反応性粒子１０３の凝集数や大きさに応じて異なっている。<Current data processing method>
(I) Extraction of blocking current waveform FIG. 4A shows a state in which the monomer of thereactive particle 103, the dimer and the trimer, and thereactive particle 103 of an abnormal size pass through thepore 2, and at that time. It is a schematic diagram which shows the obtained current data. In FIG. 4A, as an example, the current data when the monomer (a), the dimer (b), the trimer (c), and the abnormal size (d) pass through thepores 2 in this order is shown. There is. As shown in the current data of FIG. 4A, when thereactive particle 103 passes through thepore 2, the current decreases due to the blockage of thepore 2, and the current waveform (blocking current waveform) at this time is the reactive particle. It differs depending on the number and size of aggregates of 103.

演算処理部１７は、得られた電流データから封鎖電流波形を抽出することによって、より効率的に後段処理を進めることができる。封鎖電流波形の抽出方法としては、例えば、細孔２を通過する電流量（＝ベース電流量）からある閾値以上の変動が生じたときに細孔２中を物体が通過したと判断し、このときの波形を封鎖電流波形として抽出することができる。 Thearithmetic processing unit 17 can proceed with the subsequent stage processing more efficiently by extracting the blockage current waveform from the obtained current data. As a method for extracting the blockage current waveform, for example, it is determined that an object has passed through thepores 2 when a fluctuation of a certain threshold or more occurs from the amount of current passing through the pores 2 (= base current amount). The waveform of the time can be extracted as the blockage current waveform.

（ｉｉ）反応性粒子の凝集数識別
図４Ｂは、抽出された封鎖電流波形の代表的な例を示す模式図である。演算処理部１７は、抽出された封鎖電流波形に基づいて、細孔２を通過した反応性粒子１０３の凝集数を識別する。(Ii) Identification of Aggregation Number of Reactive Particles FIG. 4B is a schematic diagram showing a typical example of the extracted blockage current waveform. Thearithmetic processing unit 17 identifies the number of aggregates of thereactive particles 103 that have passed through thepores 2 based on the extracted blockage current waveform.

なお、反応性粒子１０３の凝集数を識別する処理の前又は同時に、細孔２を通過した物体が評価対象の反応性粒子１０３であるか、その他の物質であるかの判定を行うことができる。溶液１中には異常サイズの粒子や検体由来のタンパク質等が含まれており、これらの夾雑物由来の封鎖信号が発生する。こうした夾雑物由来の封鎖信号を評価対象から除外する信号処理を行うことにより、凝集数の識別処理の精度を向上させることができる。 Before or at the same time as the process of identifying the number of aggregates of thereactive particles 103, it is possible to determine whether the object that has passed through thepores 2 is thereactive particles 103 to be evaluated or another substance. .. Thesolution 1 contains particles of abnormal size, proteins derived from the sample, and the like, and a blockade signal derived from these impurities is generated. By performing signal processing for excluding the blockade signal derived from such contaminants from the evaluation target, the accuracy of the aggregation number identification processing can be improved.

演算処理部１７は、少なくとも３つ以上の反応性粒子１０３の凝集数を識別する。演算処理部１７は、封鎖電流波形から得られる複数の特徴量を用いて凝集数を識別することができる。図４Ｂに示すように、封鎖電流波形の特徴量の一例としては、封鎖電流波形の極大値における時間及び電流値、封鎖電流波形の極小値における時間及び電流値、封鎖電流波形の最大変動幅（＝封鎖電流量）などが挙げられる。非特許文献１に記載の方法のように、封鎖電流量のみを特徴量に用いると、各凝集体と同程度の体積を持つ物質（コンタミネーション）が細孔２を通過した際に、凝集体とコンタミネーションとの区別が困難になる。比較的サイズが揃っているサイズ標準粒子を用いても、図４Ａの（ｄ）に示すような体積３～４倍程度の異常サイズの反応性粒子１０３が僅かに含まれるため、封鎖電流量のみによる凝集数の識別では、細孔２を通過した物体が異常サイズの反応性粒子１０３であるか、通常サイズの反応性粒子１０３の凝集体であるかを正確に識別することは困難である。そのため、演算処理部１７は、封鎖電流量だけではなく、時間変化する波形の形状に基づいて、反応性粒子１０３の凝集数を識別することができる。例えば、細孔２の封鎖の開始から例えば０．０１秒後の電流値、０．１秒後の電流値といった、封鎖電流波形全体のうち特定の時刻の電流値を複数点取得して、得られる特徴量を用いることができる。本実施形態では、一例として、反応性粒子１０３の凝集数の数だけピーク値（極大値）が出現するような波形を取得し、封鎖電流波形中に占める極大値の数によって凝集数を識別する手法を説明する。 Thearithmetic processing unit 17 identifies the number of aggregates of at least three or morereactive particles 103. Thearithmetic processing unit 17 can identify the number of aggregates by using a plurality of feature quantities obtained from the blockade current waveform. As shown in FIG. 4B, as an example of the feature amount of the blocking current waveform, the time and current value at the maximum value of the blocking current waveform, the time and current value at the minimum value of the blocking current waveform, and the maximum fluctuation range of the blocking current waveform ( = Blocking current amount) and the like. When only the amount of blocking current is used as the feature amount as in the method described inNon-Patent Document 1, when a substance (contamination) having the same volume as each aggregate passes through thepores 2, the aggregate It becomes difficult to distinguish between and contamination. Even if standard particles of relatively uniform size are used, only the amount of blocking current is contained because thereactive particles 103 having an abnormal size of about 3 to 4 times the volume as shown in FIG. 4A (d) are slightly contained. It is difficult to accurately identify whether the object that has passed through thepores 2 is an agglomerate of an abnormally sizedreactive particle 103 or an agglomerate of a normal-sizedreactive particle 103. Therefore, thearithmetic processing unit 17 can identify the number of aggregates of thereactive particles 103 based not only on the amount of the blocking current but also on the shape of the waveform that changes with time. For example, a plurality of current values at a specific time in the entire closed current waveform, such as a current value 0.01 seconds after the start of theclosed pores 2 and a current value 0.1 seconds later, are acquired and obtained. Can be used. In the present embodiment, as an example, a waveform in which peak values (maximum values) appear as many as the number of aggregates of thereactive particles 103 is acquired, and the number of aggregates is identified by the number of maximum values in the blockage current waveform. The method will be explained.

後述するように、細孔２の寸法を適切にコントロールすることによって、複数の反応性粒子１０３が一本の鎖状に繋がった凝集体が細孔２を通過する時、１つの封鎖電流波形中に凝集数の数だけ下に凸のピークが生じる。反応性粒子１０３の中心部が細孔２を通過する時、すなわち細孔２の内部に占める反応性粒子１０３の体積比率が大きい時に、最も電流値が減少する（極小値が得られる）。これに対し、反応性粒子１０３同士の接合部にあたる箇所が細孔２を通過する時に電流値が一時的に増加する（極大値が得られる）。図４Ｂ（ａ）に示すように、単一の反応性粒子１０３が細孔２を通過した場合は単一ピークが生じ、図４Ｂ（ｂ）に示すように、２つの反応性粒子１０３の凝集体が細孔２を通過した場合は２ピークが生じ、図４Ｂ（ｃ）に示すように、３つの反応性粒子１０３の凝集体が細孔２を通過した場合は３ピークが生じており、以下同様に凝集数の数だけピーク数が増加する。図４Ｂ（ｄ）に示すように、異常サイズの反応性粒子１０３が細孔２を通過した場合には、ピークの封鎖電流量は増加するものの、ピーク数は１つであるため、２粒子や３粒子の凝集体による封鎖電流波形と区別できる。このように、演算処理部１７は、ピーク数（極大値の数）と封鎖電流量とに基づいて、細孔２を通過した反応性粒子１０３の凝集数を識別することができる。演算処理部１７には、ソフトウェアによる自動識別アルゴリズムを構築してもよく、この場合は、前処理として移動平均フィルタ等で封鎖電流波形を平滑化した後、閾値等を設定して極大値と極小値を識別することができる。 As will be described later, by appropriately controlling the dimensions of thepores 2, when an aggregate in which a plurality ofreactive particles 103 are connected in a chain shape passes through thepores 2, it is included in one blockage current waveform. A convex peak is generated downward by the number of aggregates. When the central portion of thereactive particles 103 passes through thepores 2, that is, when the volume ratio of thereactive particles 103 occupying the inside of thepores 2 is large, the current value is most reduced (minimum value is obtained). On the other hand, the current value temporarily increases (a maximum value can be obtained) when the portion corresponding to the junction between thereactive particles 103 passes through thepores 2. As shown in FIG. 4B (a), when a singlereactive particle 103 passes through thepore 2, a single peak occurs, and as shown in FIG. 4B (b), the tworeactive particles 103 are coagulated. When the aggregate passes through thepores 2, 2 peaks occur, and as shown in FIG. 4B (c), when the aggregates of the threereactive particles 103 pass through thepores 2, 3 peaks occur. Similarly, the number of peaks increases by the number of aggregates. As shown in FIG. 4B (d), when thereactive particles 103 having an abnormal size pass through thepores 2, the peak blocking current amount increases, but the number of peaks is one, so that two particles or the like It can be distinguished from the blockade current waveform due to the aggregate of three particles. In this way, thearithmetic processing unit 17 can identify the number of aggregates of thereactive particles 103 that have passed through thepores 2 based on the number of peaks (the number of maximum values) and the amount of blocking current. An automatic identification algorithm by software may be constructed in thearithmetic processing unit 17. In this case, after smoothing the blockage current waveform with a moving average filter or the like as preprocessing, a threshold value or the like is set to a maximum value and a minimum value. The value can be identified.

なお、極大値の数によって凝集数を識別する手法を説明したが、当然のことながら、複数の極小値及び極大値を検出して、それらの電流値又は時間に基づいて凝集数を識別するようにしてもよい。また、実際の計測で得られる電流データから、極小値及び極大値が誤って検出される場合もあり、このような誤った情報も用いて機械学習等により凝集数を識別するようにしてもよい。 Although the method of identifying the number of aggregates by the number of maximum values has been described, it is natural that a plurality of minimum and maximum values should be detected and the number of aggregates should be identified based on their current values or time. You may do it. In addition, the minimum value and the maximum value may be erroneously detected from the current data obtained by actual measurement, and the number of aggregates may be identified by machine learning or the like using such erroneous information. ..

上記した以外の封鎖電流波形の特徴量として、封鎖電流波形全体の時間（細孔２の封鎖による電流値の立ち下りの開始時から立ち上がりの終了までの時間）、封鎖電流波形の中間時刻での封鎖電流値、ピークの半値幅、異なる点間の電流値の差分又は積分値等の特徴量を用いてもよく、複数の特徴量の組み合わせにより凝集数を識別してもよい。さらに、その他の手法として、封鎖電流波形のデータ全体を入力として、凝集数を識別するような機械学習を用いたアプローチであってもよく、データベース中に保存されている封鎖電流波形との相関性から凝集数を識別するアルゴリズムであってもよい。 The characteristic quantities of the blockage current waveform other than the above are the time of the entire blockage current waveform (the time from the start of the fall of the current value due to the blockage of thepore 2 to the end of the rise) and the intermediate time of the blockage current waveform. Feature quantities such as the blockage current value, the half-value width of the peak, the difference between the current values between different points, or the integrated value may be used, or the aggregate number may be identified by a combination of a plurality of feature quantities. Furthermore, as another method, an approach using machine learning that identifies the number of aggregates by using the entire data of the blockage current waveform as an input may be used, and the correlation with the blockage current waveform stored in the database may be used. It may be an algorithm for discriminating the number of aggregates from.

（ｉｉｉ）計測対象物質の濃度の算出
演算処理部１７は、単位時間中に細孔２を通過した各凝集体の通過数に基づいて、検体中の計測対象物質の濃度を算出する。より具体的には、単位時間中に細孔２を通過した全反応性粒子１０３中に占める各凝集体の通過数の比率に基づいて、検体中の計測対象物質の濃度を算出することができる。この場合、演算処理部１７は、細孔２を通過した各反応性粒子１０３の凝集数を識別した後、例えば次式（１）によって凝集体比率ｎを算出する。(Iii) Calculation of Concentration of Substance to be Measured Thearithmetic processing unit 17 calculates the concentration of the substance to be measured in the sample based on the number of passages of each aggregate that has passed through thepores 2 during a unit time. More specifically, the concentration of the substance to be measured in the sample can be calculated based on the ratio of the number of passages of each aggregate to the totalreactive particles 103 that have passed through thepores 2 in a unit time. .. In this case, thearithmetic processing unit 17 identifies the number of aggregates of eachreactive particle 103 that has passed through thepores 2, and then calculates the aggregate ratio n by, for example, the following equation (1).

ただし、Ｎ_ｋは単位時間中に細孔２を通過したｋ量体の数であり、ｍは評価対象とする最大凝集数であり、３以上の整数とする。式（１）の分母は封鎖イベントの総数を示しており、分子は反応性粒子１０３間の結合部の総数（＝計測対象物質の数）を示している。凝集体比率ｎを精度よく算出するためには、式（１）のようにｋ量体に（ｋ－１）個の結合部があることを考慮する必要があるため、各ｋ量体の数Ｎ_ｋを正確に計数する必要がある。このように各封鎖イベント中に占める結合部数を考慮した算出方法により、正確な凝集体比率ｎを算出できる。However, N_k is the number of k-dimers that have passed through thepores 2 during a unit time, and m is the maximum number of aggregates to be evaluated, which is an integer of 3 or more. The denominator of the formula (1) indicates the total number of blockade events, and the numerator indicates the total number of bonds between the reactive particles 103 (= the number of substances to be measured). In order to calculate the aggregate ratio n accurately, it is necessary to consider that the k-dimer has (k-1) coupling portions as in the equation (1), so the number of each k-dimer It is necessary to count N_k accurately. As described above, the accurate aggregate ratio n can be calculated by the calculation method considering the number of bound parts occupying each blockage event.

図４Ｃは、検体中の計測対象物質の濃度を算出する方法を説明するためのグラフである。図４Ｃは、反応時間毎に得られた反応性粒子１０３の凝集数のデータから凝集体比率ｎを算出し、グラフ中にプロットしたものである。図４Ｃ中の点線は、それぞれ計測対象物質の濃度１、１０、１００及び１０００ｐｍｏｌ／Ｌでのキャリブレーションデータを示している。演算処理部１７は、予め取得した反応曲線や、反応曲線式より予測される理論曲線に対し、計測データ（算出した凝集体比率ｎ）をフィッティングさせることで、計測対象物質の濃度を推定できる。図４Ｃに示す例では、未知濃度の計測対象物質を含む検体のデータ（＃１～４）をプロットしており、プロット点が濃度１０ｐｍｏｌ／Ｌの反応曲線に従ったことから、計測対象物質の濃度が１０ｐｍｏｌ／Ｌであると推定できる。 FIG. 4C is a graph for explaining a method of calculating the concentration of the substance to be measured in the sample. FIG. 4C shows an aggregate ratio n calculated from the data of the number of aggregates of thereactive particles 103 obtained for each reaction time and plotted in a graph. The dotted line in FIG. 4C shows the calibration data at the concentrations of 1, 10, 100 and 1000 pmol / L of the substance to be measured, respectively. Thearithmetic processing unit 17 can estimate the concentration of the substance to be measured by fitting the measurement data (calculated aggregate ratio n) to the reaction curve acquired in advance or the theoretical curve predicted from the reaction curve equation. In the example shown in FIG. 4C, the data (# 1 to 4) of the sample containing the substance to be measured at an unknown concentration are plotted, and since the plot points follow the reaction curve at the concentration of 10 pmol / L, the substance to be measured is plotted. It can be estimated that the concentration is 10 pmol / L.

ある一点のデータのみで計測対象物質の濃度を推定しても良く、例えば、反応が収束したエンドポイントにあたる＃４のデータのみを用いて、濃度を推定してもよい。ただし、反応時間が異なる２点以上のデータに基づいて濃度を推定することで、精度を向上することができる。なお、凝集体比率ｎの反応曲線理論式は、反応時間や溶液状態によって異なるが、時間（ｔ）に対して線形に変化する式（ｎ（ｔ）＝αｔ、αは比例定数）、及び、指数関数に従う式（ｎ（ｔ）＝ｎ_ｅｎｄ（１－ｅｘｐ（－ｋｔ）、ｎ_ｅｎｄは終状態での凝集体比率、ｋは反応速度定数）等が考えられる。The concentration of the substance to be measured may be estimated using only the data at a certain point, and for example, the concentration may be estimated using only the data of # 4, which is the endpoint where the reaction has converged. However, the accuracy can be improved by estimating the concentration based on the data of two or more points having different reaction times. The reaction curve theoretical formula of the aggregate ratio n varies depending on the reaction time and the solution state, but it changes linearly with respect to time (t) (n (t) = αt, α is a proportional constant), and An equation according to an exponential function (n (t) =_nend (1-exp (-kt),_nend is the aggregate ratio in the final state, k is the reaction rate constant) and the like can be considered.

なお、計測対象物質の濃度を簡易に推定するため、各凝集体の数から凝集体比率ｎを算出する方法を説明したが、計測対象物質の濃度を推定する際に凝集体比率ｎの算出は必須ではない。例えば、様々な濃度の計測対象物質を含むサンプルを用いて、各サンプルにて所定の反応時間毎に得られる単量体、２量体、３量体及び４量体等の比率をデータセットとして予め取得しておくといった手法も採用することができる。この手法の場合には、演算処理部１７は、未知濃度のサンプルを計測した際に、所定の反応時間毎に得られる単量体、２量体、３量体及び４量体等の比率に基づく多次元パラメータを入力値として、例えば機械学習等を用いて計測対象物質の濃度を推定することができる。本手法は、予め多数のデータセットを用意しておく必要があるものの、凝集体比率ｎを算出する手法と比較して、より高精度な濃度計測が可能となる。 In order to easily estimate the concentration of the substance to be measured, the method of calculating the agglomerate ratio n from the number of each agglomerate has been described. However, when estimating the concentration of the substance to be measured, the agglomerate ratio n is calculated. Not required. For example, using samples containing substances to be measured at various concentrations, the ratio of the monomer, dimer, trimer, tetramer, etc. obtained in each sample for each predetermined reaction time is used as a data set. It is also possible to adopt a method such as acquiring in advance. In the case of this method, thearithmetic processing unit 17 sets the ratio of the monomer, dimer, trimer, tetramer, etc. obtained at each predetermined reaction time when measuring a sample of unknown concentration. Using a multidimensional parameter based on the input value as an input value, the concentration of the substance to be measured can be estimated using, for example, machine learning. Although it is necessary to prepare a large number of data sets in advance in this method, it is possible to measure the concentration with higher accuracy than the method for calculating the aggregate ratio n.

＜反応性粒子の凝集体の構造＞
図５は、複数の反応性粒子１０３が凝集した状態を説明するための模式図である。立体的な回転を考慮すると、図５（ａ）及び（ｂ）に示すように、単量体と２量体は単一構造のみを取りうるのに対して、図５（ｃ）～（ｅ）に示すように、３量体以上では、反応性粒子１０３同士の結合方向によって、複数種類の構造を取りうる。図５（ｃ）に示す３量体を例にとると、一直線に繋がった３量体ｃ－１だけでなく、３量体ｃ－２のように折れ曲がった構造も取りうる。ただし、３量体ｃ－２のような構造も一本の鎖状構造であるため、立体的な回転をしながら細孔２中を通過し、図４Ｂ（ｃ）に示したような、３つのピークを有する封鎖電流波形が得られる。これらに対して、図５（ｄ）に示すように、４粒子になると、４量体ｄ－３のように１粒子の周囲（３方向）に粒子が結合した状態が発生する。細孔２の直径が粒径と同程度（２倍以下）である場合には、４量体ｄ－３の構造の凝集体は細孔２を通過できずに、細孔２を閉塞させる。５粒子以上の状態においても同様であり、５量体ｅ－３及びｅ－４のような構造は、細孔２を通過せずに閉塞させる。このように、多数の粒子が凝集すると、一本の鎖状構造を形成する確率は低下するため、極端に大きな凝集塊においては、その凝集数を識別することは困難である。本発明者らの実験によると、式（１）における最大凝集数ｍを４～６程度に設定することにより、凝集数の識別が容易となる。また、式（１）は、３量体以上の凝集体数を計測できた場合における凝集体比率計算の一例であり、計算式は必ずしもこの方法に限定されない。例えば、式（１）の分母及び分子の各パラメータに、ある定数等を加算、減算、乗算又は除算等を施した場合にも、同様の効果が得られる。<Structure of agglomerates of reactive particles>
FIG. 5 is a schematic diagram for explaining a state in which a plurality ofreactive particles 103 are aggregated. Considering the steric rotation, as shown in FIGS. 5 (a) and 5 (b), the monomer and the dimer can have only a single structure, whereas FIGS. 5 (c) to 5 (e). ), A plurality of types of structures can be obtained depending on the bonding direction between thereactive particles 103 in the trimer or more. Taking the trimer shown in FIG. 5 (c) as an example, not only the trimer c-1 connected in a straight line but also a bent structure such as the trimer c-2 can be taken. However, since a structure such as the trimer c-2 is also a single chain structure, it passes through thepores 2 while rotating three-dimensionally, and as shown in FIG. 4B (c), 3 A blockage current waveform with two peaks is obtained. On the other hand, as shown in FIG. 5D, when four particles are formed, a state in which the particles are bonded to the periphery (three directions) of one particle is generated as in the tetramer d-3. When the diameter of thepore 2 is about the same as the particle size (twice or less), the aggregate having the structure of the tetramer d-3 cannot pass through thepore 2 and closes thepore 2. The same applies to the state of 5 or more particles, and structures such as the pentamers e-3 and e-4 block thepores 2 without passing through them. As described above, when a large number of particles are aggregated, the probability of forming a single chain structure decreases, and it is difficult to identify the number of aggregates in an extremely large aggregate. According to the experiments by the present inventors, by setting the maximum aggregate number m in the formula (1) to about 4 to 6, it becomes easy to identify the aggregate number. Further, the formula (1) is an example of the agglomerate ratio calculation when the number of agglomerates of a trimer or more can be measured, and the calculation formula is not necessarily limited to this method. For example, the same effect can be obtained when a certain constant or the like is added, subtracted, multiplied, or divided to each parameter of the denominator and the numerator of the equation (1).

＜細孔の寸法＞
細孔２の直径（薄膜３の表面に沿った方向の寸法）は、典型的には５０～５０００ｎｍ程度とすることができ、細孔２の厚さは例えば１～１０μｍ程度とすることができるが、封鎖電流波形中の極小値及び極大値を高精度に検出するためには、細孔２の寸法を適切に設定する必要がある。後述の実験例に示すとおり、極小値と極大値との電流値差分が、細孔２を通過する電流量（ベース電流量）の少なくとも１％以上となるためには、細孔２の直径は粒径の１．７倍以下、厚さは粒径の０．７倍以下とすることができる。また、極小値と極大値との電流値差分をベース電流量の５％以上とするためには、細孔２の直径は粒径の１．４倍以下、厚さは粒径の０．３５倍以下とすることができる。細孔２の直径を粒径の２倍以上に設計すると、２つ以上の粒子が細孔２を水平方向に並んだ状態で通過するため、例えば図５（ｄ）に示す４量体ｄ－３、図５（ｅ）に示す５量体ｅ－３及びｅ－４のような鎖状構造でない凝集体も通過するため、封鎖信号の種類が多岐に渡り、通過物体の推定が極めて困難になる。そのため、このように細孔２の直径を小さく設定することは非常に重要である。また、細孔２の直径を小さくするほど、反応性粒子の通過位置の水平方向のばらつきを低減できるという利点も有する。一方で、細孔２の直径が小さいほど不純物、粒子凝集体、複数粒子の同時通過現象等によって細孔２が閉塞しやすいため、典型的には細孔２の直径は粒径の１．０５倍以上とすることができる。細孔２の厚さについても、薄くなるほど通過物体の形状をより高分解能に計測できる利点があるが、薄くなるほど細孔２の製造時に壊れやすいといったトレードオフがあるため、典型的には厚さ１ｎｍ以上とすることができる。<Dimensions of pores>
The diameter of the pores 2 (dimensions along the surface of the thin film 3) can typically be about 50 to 5000 nm, and the thickness of thepores 2 can be, for example, about 1 to 10 μm. However, in order to detect the minimum value and the maximum value in the blockage current waveform with high accuracy, it is necessary to appropriately set the dimensions of thepore 2. As shown in the experimental example described later, in order for the current value difference between the minimum value and the maximum value to be at least 1% or more of the amount of current (base current amount) passing through thepore 2, the diameter of thepore 2 is set. The particle size can be 1.7 times or less and the thickness can be 0.7 times or less the particle size. Further, in order to make the current value difference between the minimum value and themaximum value 5% or more of the base current amount, the diameter of thepore 2 is 1.4 times or less the particle size, and the thickness is 0.35 of the particle size. It can be doubled or less. If the diameter of thepore 2 is designed to be at least twice the particle size, two or more particles pass through thepore 2 in a horizontally aligned state. Therefore, for example, the tetramer d-shown in FIG. 5 (d). 3. Since agglomerates that do not have a chain structure such as the pentamers e-3 and e-4 shown in FIG. 5 (e) also pass through, there are various types of blocking signals, and it is extremely difficult to estimate the passing object. Become. Therefore, it is very important to set the diameter of thepore 2 small in this way. Further, the smaller the diameter of thepores 2, the more the horizontal variation in the passing position of the reactive particles can be reduced. On the other hand, the smaller the diameter of thepores 2, the more easily thepores 2 are blocked due to impurities, particle aggregates, simultaneous passage of a plurality of particles, etc. Therefore, the diameter of thepores 2 is typically 1.05. It can be doubled or more. Regarding the thickness of thepores 2, the thinner the pores, the more the shape of the passing object can be measured with higher resolution. However, the thinner the pores, the more fragile thepores 2 are during manufacturing. It can be 1 nm or more.

＜免疫分析装置の他の構成例＞
図６は、他の免疫分析装置２００の構成例を示す模式図である。免疫分析装置２００は、第１の槽１１に圧力制御機構２１が設けられ、第２の槽１２が大気圧開放されている点で、図３に示した免疫分析装置１００と異なっている。その他の構成については免疫分析装置１００と同様である。<Other configuration examples of immunoassay device>
FIG. 6 is a schematic diagram showing a configuration example of anotherimmunoassay device 200. Theimmunoassay device 200 is different from theimmunoassay device 100 shown in FIG. 3 in that thepressure control mechanism 21 is provided in thefirst tank 11 and thesecond tank 12 is open to the atmospheric pressure. Other configurations are the same as those of theimmunoassay device 100.

図６に示すように、圧力制御機構２１は、例えば加圧ポンプとすることができる。反応性粒子１０３を細孔２に通す際に、圧力制御機構２１を用いて圧力勾配を与えて反応性粒子１０３を搬送させることができる。反応性粒子１０３（ラテックス粒子）は一般に負電荷を帯びていることから、電圧勾配を与えることで電気泳動によっても搬送できるが、例えば粒径５０ｎｍ以上では、圧力勾配を与えることで、より効率よく反応性粒子１０３を搬送できる。圧力勾配の与え方としては、例えば反応性粒子１０３を細孔２中に導入する方向に圧力を与えることができる（図６では第１の槽１１から第２の槽１２に反応性粒子１０３が流れるように、圧力勾配を設定する）。圧力制御機構２１の動作は、演算処理部１７により制御することができるが、ユーザがマニュアルで制御してもよい。 As shown in FIG. 6, thepressure control mechanism 21 can be, for example, a pressure pump. When thereactive particles 103 are passed through thepores 2, a pressure gradient can be applied by using thepressure control mechanism 21 to transport thereactive particles 103. Since the reactive particles 103 (latex particles) are generally negatively charged, they can be conveyed by electrophoresis by applying a voltage gradient, but for example, when the particle size is 50 nm or more, applying a pressure gradient makes it more efficient.Reactive particles 103 can be conveyed. As a method of applying the pressure gradient, for example, pressure can be applied in the direction of introducing thereactive particles 103 into the pores 2 (in FIG. 6, thereactive particles 103 are provided in thefirst tank 11 to the second tank 12). Set the pressure gradient to flow). The operation of thepressure control mechanism 21 can be controlled by thearithmetic processing unit 17, but the user may manually control the operation.

圧力を与える機構は、ポンプによる圧力制御を用いてもよいが、細孔２の上下に満たした水溶液量（液面高さ）に差を生じさせることで、圧力流を与えてもよい。図６では、第２の槽１２を大気圧に開放し、第１の槽１１を加圧することで圧力流を与えているが、圧力の与え方はこの限りではない。例えば、第１の槽１１を大気圧開放して、第２の槽１２に陰圧を与えるといった方法でも良い。圧力勾配の大きさは、０．１～１０００ｈＰａ程度とすることができる。電気泳動や圧力勾配以外の反応性粒子１０３の搬送方法として、反応性粒子１０３の自重を活用する方法や、細孔２の上下に満たした溶液１に濃度勾配を与えるといった手法等であってもよい。圧力勾配を高めすぎると、反応性粒子１０３の通過速度が速くなり、前述したような複数ピークの波形を捉えることが困難になる。本発明者らの実験の結果、反応性粒子１０３の通過時間を０．０１～１ｍｓ程度に調整することにより、通過速度、頻度ともに効率よく計測できることが分かった。 As the mechanism for applying pressure, pressure control by a pump may be used, but a pressure flow may be applied by causing a difference in the amount of aqueous solution (liquid level height) filled above and below thepores 2. In FIG. 6, thesecond tank 12 is opened to the atmospheric pressure and thefirst tank 11 is pressurized to apply a pressure flow, but the method of applying the pressure is not limited to this. For example, a method may be used in which thefirst tank 11 is opened to atmospheric pressure and a negative pressure is applied to thesecond tank 12. The magnitude of the pressure gradient can be about 0.1 to 1000 hPa. As a method of transporting thereactive particles 103 other than electrophoresis or a pressure gradient, even a method of utilizing the weight of thereactive particles 103 or a method of giving a concentration gradient to thesolution 1 filled above and below thepores 2 may be used. good. If the pressure gradient is too high, the passing speed of thereactive particles 103 becomes high, and it becomes difficult to capture the waveform of a plurality of peaks as described above. As a result of the experiments by the present inventors, it was found that by adjusting the passing time of thereactive particles 103 to about 0.01 to 1 ms, both the passing speed and the frequency can be efficiently measured.

図７は、他の免疫分析装置３００の構成例を示す模式図である。免疫分析装置３００は、第１の槽１１に温調機構２２が設けられている点で、図６に示した免疫分析装置２００と異なっている。図７に示すように、温調機構２２を用いて溶液１の温度を調整することにより、第１の槽１１内の検体と反応性粒子１０３とを効率よく反応させることができる。温調機構２２としては、例えば簡便な機構であるペルチェ等を用いることができる。あるいは、ヒーターを用いて、計測容器（薄膜３、第１の槽１１及び第２の槽１２）全体の雰囲気温度を調整してもよい。温調機構２２の出力は、演算処理部１７により制御することができる。目標温度は、抗原抗体反応を促進可能な温度であり、一般には３７℃（±２℃）程度に設定する。計測方法の一例としては、この３７℃の温度条件下にて抗原抗体反応を進めながら、同時並行で圧力制御機構２１によって反応性粒子１０３を細孔２中に導入し、封鎖電流波形を電流計１６によって計測する方法である。電流計測、反応及び圧力勾配印加を同時に実行することで、より短時間で計測結果を出力することができるが、例えばシーケンシャルに動作するようにしてもよい。具体的には、温調機構２２により一度３７℃に保って検体と反応性粒子１０３とを一定時間反応させた後に、温度を下げて反応を止め、圧力制御機構２１により圧力勾配印加をさせながら電流計測を行う方法が挙げられる。この場合、一度反応を止めているため、所定時間反応させたときの凝集体比率をより高精度に計測できる利点がある。 FIG. 7 is a schematic diagram showing a configuration example of anotherimmunoassay device 300. Theimmunoassay device 300 is different from theimmunoassay device 200 shown in FIG. 6 in that the temperature control mechanism 22 is provided in thefirst tank 11. As shown in FIG. 7, by adjusting the temperature of thesolution 1 using the temperature control mechanism 22, the sample in thefirst tank 11 and thereactive particles 103 can be efficiently reacted. As the temperature control mechanism 22, for example, a simple mechanism such as Pelche can be used. Alternatively, a heater may be used to adjust the atmospheric temperature of the entire measuring container (thin film 3,first tank 11 and second tank 12). The output of the temperature control mechanism 22 can be controlled by thearithmetic processing unit 17. The target temperature is a temperature at which the antigen-antibody reaction can be promoted, and is generally set to about 37 ° C. (± 2 ° C.). As an example of the measurement method, while advancing the antigen-antibody reaction under the temperature condition of 37 ° C., thereactive particles 103 are introduced into thepores 2 by thepressure control mechanism 21 at the same time, and the blockage current waveform is measured by an ammeter. It is a method of measuring by 16. By simultaneously executing the current measurement, the reaction, and the pressure gradient application, the measurement result can be output in a shorter time, but the operation may be performed sequentially, for example. Specifically, after the sample and thereactive particles 103 are reacted at 37 ° C. for a certain period of time by the temperature control mechanism 22, the temperature is lowered to stop the reaction, and the pressure gradient is applied by thepressure control mechanism 21. A method of measuring the current can be mentioned. In this case, since the reaction is stopped once, there is an advantage that the aggregate ratio when the reaction is carried out for a predetermined time can be measured with higher accuracy.

以上説明した免疫分析装置１００～３００では、いずれも単一の細孔２を用いた計測方法を採用していたが、２個以上の複数の細孔２を用いて計測するようにしてもよい。本実施形態の手法では、単位時間あたりに得られた封鎖イベント中に占める、凝集体の通過イベントの比率を算出する。水溶液中に占める計測対象物質の濃度が薄い場合や、反応初期段階では、凝集体比率は０．１％程度以下と非常に低濃度になりうることから、凝集体比率を正しく算出するためには、十分な数の封鎖イベントを得る必要がある。封鎖イベント数を増やす方法としては、圧力勾配を高めて細孔２への導入効率を高める方法も有効であるが、同時に粒子通過速度も速くなるため、封鎖信号の判定が困難になりやすい。これに対し、細孔２の数を増やす手法は、圧力勾配を与える手法と比較して、簡易に通過イベント数を増加できる。細孔２の数は、例えば４以上、場合に応じて１０以上とすることができる。低濃度サンプルでも計測できることは、免疫計測において重要度が高く、また、反応初期段階でも凝集体比率を算出できることは、計測時間を短縮させる利点もある。 In theimmunoassay devices 100 to 300 described above, the measurement method using asingle pore 2 has been adopted, but the measurement may be performed using a plurality of two ormore pores 2. .. In the method of the present embodiment, the ratio of the agglomerate passage event to the blockage event obtained per unit time is calculated. When the concentration of the substance to be measured in the aqueous solution is low, or in the initial stage of the reaction, the agglomerate ratio can be as low as about 0.1% or less. , You need to get enough blockage events. As a method of increasing the number of blocking events, a method of increasing the pressure gradient to increase the introduction efficiency into thepore 2 is also effective, but at the same time, the particle passing speed is also increased, so that it tends to be difficult to determine the blocking signal. On the other hand, the method of increasing the number ofpores 2 can easily increase the number of passing events as compared with the method of giving a pressure gradient. The number ofpores 2 can be, for example, 4 or more, and in somecases 10 or more. Being able to measure even a low-concentration sample is of high importance in immunoassay, and being able to calculate the aggregate ratio even in the initial stage of the reaction has the advantage of shortening the measurement time.

図８は、他の免疫分析装置４００の構成例を示す模式図である。免疫分析装置４００においては、薄膜３に複数（図８では３つ）の細孔２が設けられている。また、第２の槽１２に複数の隔壁４１と複数の第２の電極１４が設けられ、各細孔２に対して個別チャンバが形成されている。第１の槽１１は全ての細孔２に対して共通チャンバとし、第１の槽１１側に検体（計測対象物質）が導入される。計測時には、圧力制御機構２１により共通チャンバ全体を加圧することで、全ての細孔２に同時に反応性粒子１０３を導入できる。第１の槽１１にも個別チャンバを設ける構造としてもよいが、その場合、個別チャンバへの検体サンプル導入や圧力制御機構が困難になる。図８に示すように、共通チャンバと個別チャンバを用いた構成とすることで、複数の細孔２を用いた計測を簡便に実現できる。 FIG. 8 is a schematic diagram showing a configuration example of anotherimmunoassay device 400. In theimmunoassay apparatus 400, thethin film 3 is provided with a plurality of (three in FIG. 8) pores 2. Further, a plurality ofpartition walls 41 and a plurality ofsecond electrodes 14 are provided in thesecond tank 12, and individual chambers are formed for eachpore 2. Thefirst tank 11 is a common chamber for all thepores 2, and the sample (measurement target substance) is introduced into thefirst tank 11. At the time of measurement, thereactive particles 103 can be introduced into all thepores 2 at the same time by pressurizing the entire common chamber by thepressure control mechanism 21. A structure may be provided in which thefirst tank 11 is also provided with an individual chamber, but in that case, it becomes difficult to introduce the sample sample into the individual chamber and the pressure control mechanism. As shown in FIG. 8, by using a common chamber and an individual chamber, measurement using a plurality ofpores 2 can be easily realized.

＜第１の実施形態のまとめ＞
以上のように、第１の実施形態の免疫分析装置は、検体と、検体に含まれ得る計測対象物質１０１に対して特異的に結合する物質が修飾された反応性粒子１０３とを含む溶液１（第１の溶液）が導入される第１の槽１１（第１の区画）と、溶液１（第２の溶液）が導入される第２の槽１２（第２の区画）と、第１の槽１１及び第２の槽１２を接続する細孔２を有する薄膜３と、第１の槽１１の内部に設けられた第１の電極１３と、第２の槽１２の内部に設けられた第２の電極１４と、第１の電極１３と第２の電極１４との間に電圧を印加する電源装置１５（電圧源）と、第１の電極１３と第２の電極１４との間に流れる電流を計測する電流計１６と、電流計１６により得られる電流データを処理する演算処理部１７（プロセッサ）と、を備える。演算処理部１７は、電流データから、反応性粒子１０３が細孔２を通過する際に生じる封鎖電流波形を抽出する処理と、封鎖電流波形に基づき、３つ以上の反応性粒子が凝集したときの凝集数を識別する処理と、単位時間中に細孔２を通過した単量体、２量体及び３量体以上の凝集体の通過数に基づいて、検体中の計測対象物質１０１の濃度を算出する処理と、を実行する。<Summary of the first embodiment>
As described above, the immunoanalyzer of the first embodiment is asolution 1 containing a sample and areactive particle 103 modified with a substance that specifically binds to themeasurement target substance 101 that can be contained in the sample. The first tank 11 (first compartment) into which the (first solution) is introduced, the second tank 12 (second compartment) into which the solution 1 (second solution) is introduced, and the first. Thethin film 3 havingpores 2 connecting thetank 11 and thesecond tank 12, thefirst electrode 13 provided inside thefirst tank 11, and the inside of thesecond tank 12. Between thesecond electrode 14, the power supply device 15 (voltage source) that applies a current between thefirst electrode 13 and thesecond electrode 14, and between thefirst electrode 13 and thesecond electrode 14. Acurrent meter 16 for measuring the flowing current and an arithmetic processing unit 17 (processor) for processing the current data obtained by thecurrent meter 16 are provided. Thearithmetic processing unit 17 extracts the blockage current waveform generated when thereactive particles 103 pass through thepores 2 from the current data, and when three or more reactive particles aggregate based on the blockage current waveform. The concentration of thesubstance 101 to be measured in the sample based on the process of identifying the number of aggregates of the sample and the number of aggregates of the monomer, dimer, and trimer or more that passed through thepore 2 during the unit time. And the process of calculating.

このように、単量体及び２量体だけでなく、３量体以上の凝集体（多量体）を個々にカウントし、計測対象物質１０１の濃度の算出に用いることにより、単量体及び２量体の数のみを用いる場合と比較して、計測対象物質の濃度をより正確に計測することができる。 In this way, not only the monomers and dimers but also aggregates (multimers) of trimers or more are individually counted and used to calculate the concentration of thesubstance 101 to be measured, so that the monomers and 2 are used. Compared with the case where only the number of dimers is used, the concentration of the substance to be measured can be measured more accurately.

また、反応性粒子１０３の各凝集体の数から、式（１）により凝集体比率ｎ（単位時間中に細孔２を通過した全反応性粒子中に占める単量体、２量体及び３量体以上の凝集体の通過数の比率）を算出することにより、凝集体比率ｎという１つの情報を用いて計測対象物質の濃度を推定することができるので、処理が簡単である。したがって、演算処理部１７の製造コストも抑制できる。 Further, from the number of each aggregate of thereactive particles 103, the aggregate ratio n (monomer, dimer and 3 in the total reactive particles that have passed through thepores 2 during the unit time) according to the formula (1). By calculating (the ratio of the number of passages of the aggregates above the dimer), the concentration of the substance to be measured can be estimated using one piece of information called the aggregate ratio n, so that the processing is simple. Therefore, the manufacturing cost of thearithmetic processing unit 17 can be suppressed.

［実験例］
以下、第１の実施形態の効果を検証した実験例（計算例）を示す。以下で述べる検討では、薄膜３として、細孔を有するＳｉＮ膜を用い、反応性粒子１０３として粒径２９０ｎｍのラテックス粒子を用いた場合について説明するが、その他の細孔や粒子を用いた場合においても同様の結果を期待できる。[Experimental example]
Hereinafter, an experimental example (calculation example) for verifying the effect of the first embodiment is shown. In the study described below, a case where a SiN film having pores is used as thethin film 3 and latex particles having a particle size of 290 nm are used as thereactive particles 103 will be described, but when other pores or particles are used, the case will be described. Can expect similar results.

＜実験例１：細孔の寸法の検証＞
図９は、反応性粒子１０３の２量体１０５が細孔２の中心を通過するときの断面模式図である。図９において、鉛直上向き方向をＺ軸と定義し、原点を細孔２の中心とした。計測対象物質の大きさは、反応性粒子に対して十分に小さいため、図９では計測対象物質の図示を省略した。２量体１０５の重心位置（結合部）の座標ｚ（μｍ）をＺ軸方向に掃引して、細孔２を通過する電流量を、マクスウェル方程式を用いて計算した。<Experimental example 1: Verification of pore dimensions>
FIG. 9 is a schematic cross-sectional view when thedimer 105 of thereactive particles 103 passes through the center of thepores 2. In FIG. 9, the vertical upward direction is defined as the Z axis, and the origin is the center of thepore 2. Since the size of the substance to be measured is sufficiently small with respect to the reactive particles, the illustration of the substance to be measured is omitted in FIG. The coordinate z (μm) of the center of gravity position (joint portion) of thedimer 105 was swept in the Z-axis direction, and the amount of current passing through thepore 2 was calculated using Maxwell's equations.

図１０は、実験例１における細孔２を通過する電流量のシミュレーション結果を示すグラフである。図１０（ａ）～（ｄ）は、それぞれ細孔２の直径Ｄ［ｎｍ］が３００ｎｍ（ａ）、４００ｎｍ（ｂ）、５００ｎｍ（ｃ）及び６００ｎｍ（ｄ）の４つの条件のシミュレーション結果を示している。細孔２の直径の各条件について、細孔２の厚さＴ［ｎｍ］を２５ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、４００ｎｍ及び８００ｎｍに設定して、各設定で得られる電流量を計算した。図１０の横軸は２量体１０５の重心位置の座標ｚを示し、縦軸はベース電流量を基準（＝１００％）としたときの規格化電流値を示している。本シミュレーション結果から、直径Ｄ及び厚さＴが小さい値のときに、極小値と極大値との差分は大きくなることが分かった。極大値と極小値の差分を１％以上とするためには、直径Ｄは５００ｎｍ以下（粒径の１．７倍以下）、厚さＴは２００ｎｍ以下（粒径の０．７倍以下）である必要があることがわかる。また極大値と極小値の差分を５％以上とするためには、直径Ｄは４００ｎｍ以下（粒径の１．４倍以下）、厚さＴは１００ｎｍ以下（粒径の０．３５倍以下）である必要があることがわかる。本結果から、免疫分析装置に用いる最適な細孔２の寸法を確認できた。 FIG. 10 is a graph showing a simulation result of the amount of current passing through thepore 2 in Experimental Example 1. 10 (a) to 10 (d) show simulation results under four conditions in which the diameter D [nm] of thepore 2 is 300 nm (a), 400 nm (b), 500 nm (c) and 600 nm (d), respectively. ing. For each condition of the diameter of thepore 2, the thickness T [nm] of thepore 2 was set to 25 nm, 50 nm, 100 nm, 200 nm, 400 nm and 800 nm, and the amount of current obtained by each setting was calculated. The horizontal axis of FIG. 10 shows the coordinate z of the position of the center of gravity of thedimer 105, and the vertical axis shows the normalized current value when the base current amount is used as a reference (= 100%). From the results of this simulation, it was found that the difference between the minimum value and the maximum value becomes large when the diameter D and the thickness T are small values. In order to make the difference between the maximum value and theminimum value 1% or more, the diameter D should be 500 nm or less (1.7 times or less of the particle size) and the thickness T should be 200 nm or less (0.7 times or less of the particle size). It turns out that there needs to be. In order to make the difference between the maximum value and theminimum value 5% or more, the diameter D is 400 nm or less (1.4 times or less of the particle size), and the thickness T is 100 nm or less (0.35 times or less of the particle size). It turns out that it needs to be. From this result, it was possible to confirm the optimum size of thepore 2 used in the immunoassay device.

＜実験例２：封鎖電流波形の抽出及び凝集体比率ｎの算出＞
図１０のシミュレーション結果を踏まえて、細孔２の寸法を厚さ３５ｎｍ、直径４００ｎｍに設計して、計測対象物質の濃度を変えたときに得られる封鎖電流波形を計測した。本実験例２では、計測対象物質（ＡＦＰ抗原）濃度が２．２５ｐｍｏｌ／Ｌ、２２．５ｐｍｏｌ／Ｌ及び２２５ｐｍｏｌ／Ｌになるようトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で調整した。本実験例２においては、シリンジポンプ（圧力制御機構）を用いて、第１の槽１１及び第２の槽１２間に１～２０ｈＰａ程度の圧力勾配を与え、反応性粒子の通過時間が０．０１～１ｍｓになるように調整した。温調機構により計測容器全体を３７℃の恒温槽内に配置し、恒温槽内で反応性粒子と計測対象物質とを免疫凝集させながら、同時にシリンジポンプで圧力勾配を印加して反応生成物を細孔内に搬送した。電流計測時のカットオフ周波数は３４ｋＨｚに設定し、サンプリング周波数は５００ｋＨｚに設定した。<Experimental example 2: Extraction of blockage current waveform and calculation of aggregate ratio n>
Based on the simulation results of FIG. 10, the dimensions of thepore 2 were designed to have a thickness of 35 nm and a diameter of 400 nm, and the blockage current waveform obtained when the concentration of the substance to be measured was changed was measured. In Experimental Example 2, the concentration of the substance to be measured (AFP antigen) was adjusted in Tris-buffered saline (TBS) so as to be 2.25 pmol / L, 22.5 pmol / L and 225 pmol / L. In Experimental Example 2, a syringe pump (pressure control mechanism) is used to apply a pressure gradient of about 1 to 20 hPa between thefirst tank 11 and thesecond tank 12, and the passage time of the reactive particles is 0. It was adjusted to be 01 to 1 ms. The entire measuring container is placed in a constant temperature bath at 37 ° C by the temperature control mechanism, and the reaction product is produced by applying a pressure gradient with a syringe pump at the same time while immunoaggregating the reactive particles and the substance to be measured in the constant temperature bath. It was carried into the pores. The cutoff frequency at the time of current measurement was set to 34 kHz, and the sampling frequency was set to 500 kHz.

図１１は、実験例２において得られた封鎖電流波形の一例を示すグラフである。電流データから封鎖電流波形を抽出する際には、一定の閾値（本実験例２では５ｎＡ程度）以上の封鎖電流量を有する封鎖イベントを抽出した。また、得られた封鎖電流波形に移動平均フィルタによる波形平滑化処理を施し、極小値及び極大値をソフトウェアのプログラムで自動抽出した。図１１（ａ）～（ｄ）の各封鎖電流波形に含まれる極小値及び極大値の数は、順に１つずつ大きくなり、それぞれ（ａ）単量体、（ｂ）２量体、（ｃ）３量体、（ｄ）４量体を反映したものと考えられる。本結果から封鎖電流波形を自動抽出でき、また凝集状態を反映した複数ピークを有する封鎖電流波形が得られることを確認できた。 FIG. 11 is a graph showing an example of the blockage current waveform obtained in Experimental Example 2. When extracting the blocking current waveform from the current data, a blocking event having a blocking current amount equal to or higher than a certain threshold value (about 5 nA in this experimental example 2) was extracted. Further, the obtained blockage current waveform was subjected to waveform smoothing processing by a moving average filter, and the minimum value and the maximum value were automatically extracted by a software program. The number of minimum values and maximum values included in each of the blockage current waveforms of FIGS. 11 (a) to 11 (d) increases by one in order, and the (a) monomer, (b) dimer, and (c) are respectively. ) It is considered to reflect the trimer and (d) tetramer. From this result, it was confirmed that the blockage current waveform could be automatically extracted and that the blockage current waveform having multiple peaks reflecting the aggregated state could be obtained.

次に、計測対象物質の濃度２．２５ｐｍｏｌ／Ｌ、２２．５ｐｍｏｌ／Ｌ及び２２５ｐｍｏｌ／Ｌの各条件で、それぞれ単位時間中に得られた全封鎖電流波形を、ソフトウェア処理により単量体～４量体又は粒子以外信号と判定した。さらに、反応時間毎に、式（１）より凝集体比率ｎを算出し、パーセントに換算した。 Next, the total blockage current waveforms obtained during the unit time under the conditions of the concentration of the substance to be measured of 2.25 pmol / L, 22.5 pmol / L and 225 pmol / L were subjected to software processing to obtain a monomer to 4 of the total block current waveform. It was determined to be a signal other than a substance or a particle. Further, for each reaction time, the aggregate ratio n was calculated from the formula (1) and converted into a percentage.

図１２は、実験例２において計測対象物質濃度ごとに得られた凝集体比率ｎ（％）の近似直線を示すグラフである。図中のネガティブコントロールのプロットは、計測対象物質を含まないサンプル（トリス緩衝生理食塩水）の結果を示したものである。本結果から明らかなとおり、計測対象物質濃度の増加に伴って、凝集体比率ｎの増加速度（傾き）は単調に増加した。図１２に示す各近似直線をキャリブレーションデータとして用いて、計測対象物質が未知濃度含まれる検体の計測時に算出される凝集体比率ｎのデータをフィッティングすることで、濃度を推定することが可能である。本結果から、抗原抗体反応を起こしながら、リアルタイムで凝集体比率ｎを計測して、計測対象物質の濃度を算出できることを確認できた。 FIG. 12 is a graph showing an approximate straight line of the aggregate ratio n (%) obtained for each concentration of the substance to be measured in Experimental Example 2. The plot of the negative control in the figure shows the result of the sample (Tris buffered saline) containing no substance to be measured. As is clear from this result, the rate of increase (slope) of the aggregate ratio n increased monotonically as the concentration of the substance to be measured increased. Using each approximate straight line shown in FIG. 12 as calibration data, it is possible to estimate the concentration by fitting the data of the aggregate ratio n calculated at the time of measurement of the sample containing the unknown concentration of the substance to be measured. be. From this result, it was confirmed that the concentration of the substance to be measured can be calculated by measuring the aggregate ratio n in real time while causing the antigen-antibody reaction.

＜実験例３：模擬検体を用いた凝集体比率の算出＞
模擬検体（血漿サンプル溶液）中に計測対象物質（ＡＦＰ抗原）を２２．５ｐｍｏｌ／Ｌ溶かし、細孔２の寸法及び計測条件を実験例２と同様にして、反応時間毎の凝集体比率ｎを式（１）により算出した。なお、模擬検体には予め孔径１００ｎｍのシリンジフィルタを適用して、検体中に含まれるタンパク質や血小板等の異物は除去した後、反応性粒子と混和した。また、比較例として、従来法と同様に単量体の数（Ｎ_１）と２量体の数（Ｎ_２）のみを用いて凝集体比率（ｎ＝Ｎ_２／（Ｎ_１＋Ｎ_２））を算出した。<Experimental example 3: Calculation of aggregate ratio using simulated sample>
The substance to be measured (AFP antigen) was dissolved in a simulated sample (plasma sample solution) at 22.5 pmol / L, the dimensions of thepores 2 and the measurement conditions were the same as in Experimental Example 2, and the aggregate ratio n for each reaction time was set. Calculated by equation (1). A syringe filter having a pore size of 100 nm was applied to the simulated sample in advance to remove foreign substances such as proteins and platelets contained in the sample, and then miscible with the reactive particles. Further, as a comparative example, as in the conventional method, the aggregate ratio (n = N₂ / (N₁ + N₂ )) using only the number of monomers (N₁ ) and the number of dimers (N₂ )). Was calculated.

図１３は、実験例３及び比較例に係る凝集体比率の算出結果を示すグラフである。図１３から明らかなとおり、比較例のように単量体と２量体の数のみで凝集体比率を計算した際には、時間経過に伴って途中で凝集体比率が減衰したのに対して、式（１）を用いて算出すると、単調に増加する様子が得られた。本実験に用いた模擬検体は、トリス緩衝生理食塩水と比較して塩濃度が高いために短時間で反応が進み、２量体だけでなく３量体以上の凝集体が速やかに生成された。図１３において、２０分を超えた時点では、２量体数は減少傾向に転じており、したがって比較例における凝集体比率の値が減少した。このように、２量体数から凝集体比率を算出すると、時間経過に伴って減少する場合があることから、濃度計測の精度が低減しやすい。特に、計測対象物質の濃度が高い検体になるほど（例えば１ｎｍｏｌ／Ｌ程度）、２量体比率は減少傾向に転じやすく、１分未満の反応時間で２量体比率がピーク値に到達して減衰することも想定できる。一般に凝集体比率ｎを算出するためには、１０００個以上の封鎖イベントを取得する必要があり、これには数秒～数十秒以上の計測時間を要する。そのため、短時間で減少傾向に転じやすい２量体比率のみでは、高濃度サンプルの凝集体比率及び計測対象物質濃度を精度よく算出することは困難である。一般に免疫分析装置ではダイナミックレンジは２～３桁以上、検査項目によっては４桁以上必要な場合もあり、高濃度帯域のサンプルも精度よく計測できることは非常に重要である。本結果から、２量体だけでなく３量体以上の凝集体も計数し、また３量体以上の凝集体数を用いて濃度判定するという、本開示の手法の有効性が示された。 FIG. 13 is a graph showing the calculation results of the aggregate ratio according to Experimental Example 3 and Comparative Example. As is clear from FIG. 13, when the aggregate ratio was calculated only by the number of monomers and dimers as in the comparative example, the aggregate ratio decreased in the middle with the passage of time. , When calculated using the equation (1), it was obtained that the increase was monotonous. Since the simulated sample used in this experiment had a higher salt concentration than Tris-buffered saline, the reaction proceeded in a short time, and not only dimers but also aggregates of trimers or more were rapidly produced. .. In FIG. 13, after 20 minutes, the number of dimers turned to a decreasing tendency, and therefore the value of the aggregate ratio in the comparative example decreased. As described above, when the aggregate ratio is calculated from the number of dimers, it may decrease with the passage of time, so that the accuracy of concentration measurement is likely to be reduced. In particular, the higher the concentration of the substance to be measured (for example, about 1 nmol / L), the more easily the dimer ratio tends to decrease, and the dimer ratio reaches the peak value and attenuates in a reaction time of less than 1 minute. It can be assumed that it will be done. Generally, in order to calculate the aggregate ratio n, it is necessary to acquire 1000 or more blockade events, which requires a measurement time of several seconds to several tens of seconds or more. Therefore, it is difficult to accurately calculate the aggregate ratio of the high-concentration sample and the concentration of the substance to be measured only by the dimer ratio that tends to decrease in a short time. In general, an immunoassay device requires a dynamic range of 2 to 3 digits or more, and depending on the test item, 4 digits or more may be required, and it is very important to be able to accurately measure a sample in a high concentration band. From this result, the effectiveness of the method of the present disclosure, in which not only the dimer but also the aggregates of the trimer or more are counted and the concentration is determined by using the number of aggregates of the trimer or more, is shown.

以上の実験例では、特定の寸法及び材質の細孔、粒子、並びに検体を用いた場合の実験結果を例示したが、当然のことながら、本開示の技術は上述の実験例に限定されるものではない。例えば、細孔と粒子の寸法比率が同様であれば、各実験例とはサイズの異なる細孔及び粒子を用いても、同様の結果が得られる。 In the above experimental examples, the experimental results when pores, particles, and specimens of specific dimensions and materials are used are exemplified, but as a matter of course, the technique of the present disclosure is limited to the above-mentioned experimental examples. is not. For example, if the dimensional ratios of the pores and the particles are the same, the same results can be obtained even if the pores and particles having different sizes from those of the experimental examples are used.

［変形例］
本開示は、上述した実施形態に限定されるものでなく、様々な変形例を含んでいる。例えば、上述した実施形態は、本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備える必要はない。また、ある実施形態の一部を他の実施形態の構成に置き換えることができる。また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることもできる。また、各実施形態の構成の一部について、他の実施形態の構成の一部を追加、削除又は置換することもできる。[Modification example]
The present disclosure is not limited to the embodiments described above, but includes various modifications. For example, the embodiments described above have been described in detail in order to explain the present disclosure in an easy-to-understand manner, and do not necessarily have all the configurations described. In addition, a part of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment. It is also possible to add the configuration of another embodiment to the configuration of one embodiment. Further, it is possible to add, delete, or replace a part of the configuration of another embodiment with respect to a part of the configuration of each embodiment.

１ 溶液
２ 細孔
３ 薄膜
１１ 第１の槽
１２ 第２の槽
１３ 第１の電極
１４ 第２の電極
１５ 電源装置
１６ 電流計
１７ 演算処理部
２１ 圧力制御機構
２２ 温調機構
４１ 隔壁
１０１ 計測対象物質
１０２ 単量体
１０３ 反応性粒子
１０４ 反応サイト
１０５ ２量体
１０６ ３量体1Solution 2Pore 3Thin film 111st tank 122nd tank 131st electrode 142nd electrode 15Power supply device 16Ammeter 17Calculation processing unit 21 Pressure control mechanism 22Temperature control mechanism 41Partition wall 101Measurement target Substance 102Monomer 103Reactive particle 104Reaction site 105Dimer 106 Dimer

Claims (15)

Translated fromJapanese

検体と、前記検体に含まれ得る計測対象物質に対して特異的に結合する物質が修飾された反応性粒子とを含む第１の溶液が導入される第１の区画と、第２の溶液が導入される第２の区画と、前記第１の区画と前記第２の区画を接続する細孔を備えた薄膜と、を有する計測容器と、
前記第１の区画の内部に設けられた第１の電極と、
前記第２の区画の内部に設けられた第２の電極と、
前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧を印加する電圧源と、
前記第１の電極と前記第２の電極との間に流れる電流を計測する電流計と、
前記電流計により得られた電流データを処理するプロセッサと、を備え、
前記プロセッサは、
前記電流データから、前記反応性粒子が前記細孔を通過する際に生じる封鎖電流波形を抽出する処理と、
前記封鎖電流波形に基づき、３つ以上の前記反応性粒子が凝集したときの凝集数を識別する処理と、
単位時間中に前記細孔を通過した単量体、２量体及び３量体以上の凝集体の通過数に基づいて、前記検体中の前記計測対象物質の濃度を算出する処理と、を実行することを特徴とする分析装置。The first section into which the first solution containing the sample and the reactive particles modified with the substance specifically bound to the substance to be measured that can be contained in the sample is introduced, and the second solution A measuring container having a second compartment to be introduced and a thin film having pores connecting the first compartment and the second compartment.
With the first electrode provided inside the first compartment,
A second electrode provided inside the second compartment, and
A voltage source that applies a voltage between the first electrode and the second electrode,
An ammeter that measures the current flowing between the first electrode and the second electrode,
A processor that processes the current data obtained by the ammeter is provided.
The processor
A process of extracting the blockage current waveform generated when the reactive particles pass through the pores from the current data, and
A process of identifying the number of aggregates when three or more of the reactive particles aggregate based on the blockage current waveform.
A process of calculating the concentration of the substance to be measured in the sample based on the number of passages of the monomer, the dimer, and the aggregate of the trimer or more that passed through the pores in a unit time is executed. An analyzer characterized by 前記プロセッサは、
前記単位時間中に前記細孔を通過した全ての前記反応性粒子中に占める前記単量体、前記２量体及び前記３量体以上の凝集体の通過数の比率に基づいて、前記検体中の前記計測対象物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１に記載の分析装置。The processor
In the sample, based on the ratio of the number of passages of the monomer, the dimer and the aggregates of the trimer or more to all the reactive particles that have passed through the pores during the unit time. The analyzer according to claim 1, wherein the concentration of the substance to be measured is calculated. 前記プロセッサは、
前記封鎖電流波形に基づき、前記細孔を通過した物質が、計測対象である前記単量体、前記２量体及び前記３量体以上の凝集体であるか、前記第１の溶液中に含まれる前記計測対象以外の物質であるかを識別する処理をさらに実行することを特徴とする請求項１に記載の分析装置。The processor
Based on the blockage current waveform, the substance that has passed through the pores is the monomer to be measured, the dimer, and the aggregate of the trimer or more, or is contained in the first solution. The analyzer according to claim 1, further performing a process of identifying whether the substance is a substance other than the measurement target. 前記プロセッサは、
前記反応性粒子と前記検体との反応時間が異なる、少なくとも２点以上の反応時間において前記比率を取得し、前記計測対象物質の濃度を算出することを特徴とする請求項２に記載の分析装置。The processor
The analyzer according to claim 2, wherein the ratio is acquired at at least two or more reaction times in which the reaction times of the reactive particles and the sample are different, and the concentration of the substance to be measured is calculated. .. 前記プロセッサは、
前記封鎖電流波形に含まれる極大値及び極小値の数に基づいて前記反応性粒子の凝集数を識別することを特徴とする請求項１に記載の分析装置。The processor
The analyzer according to claim 1, wherein the number of aggregates of the reactive particles is identified based on the number of maximum values and minimum values included in the blockage current waveform. 前記細孔の直径が前記反応性粒子の粒径の１．０５倍以上かつ１．７倍以下であり、前記細孔の厚さが１ｎｍ以上かつ前記反応性粒子の粒径の０．７倍以下であることを特徴とする請求項５に記載の分析装置。 The diameter of the pores is 1.05 times or more and 1.7 times or less the particle size of the reactive particles, and the thickness of the pores is 1 nm or more and 0.7 times the particle size of the reactive particles. The analyzer according to claim 5, wherein the analyzer is as follows. 前記細孔の直径が前記反応性粒子の粒径の１．０５倍以上かつ１．４倍以下であり、前記細孔の厚さが１ｎｍ以上かつ前記反応性粒子の粒径の０．３５倍以下であることを特徴とする請求項６に記載の分析装置。 The diameter of the pores is 1.05 times or more and 1.4 times or less the particle size of the reactive particles, and the thickness of the pores is 1 nm or more and 0.35 times the particle size of the reactive particles. The analyzer according to claim 6, wherein the analyzer is as follows. 前記プロセッサは、
下記式（１）に基づいて凝集体比率ｎを算出し、所定の反応時間ｔだけ前記反応性粒子と前記検体中の前記計測対象物質を反応させ、前記反応時間ｔと前記凝集体比率ｎの値に基づいて、前記検体中の前記計測対象物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１に記載の分析装置。

ただし、Ｎ_ｋは単位時間中に前記細孔を通過した前記反応性粒子のｋ量体の数であり、ｍは評価対象とする最大凝集数であり、３以上の整数とする。The processor
The aggregate ratio n is calculated based on the following formula (1), the reactive particles are reacted with the substance to be measured in the sample for a predetermined reaction time t, and the reaction time t and the aggregate ratio n are set. The analyzer according to claim 1, wherein the concentration of the substance to be measured in the sample is calculated based on the value.

However, N_k is the number of k-dimers of the reactive particles that have passed through the pores during a unit time, and m is the maximum number of aggregates to be evaluated, which is an integer of 3 or more. 前記最大凝集数ｍが４以上６以下の整数であることを特徴とする請求項８に記載の分析装置。 The analyzer according to claim 8, wherein the maximum aggregation number m is an integer of 4 or more and 6 or less. 前記電流計のカットオフ周波数が１０ｋＨｚ以上１ＭＨｚ以下であり、サンプリング周波数が１００ｋＨｚ以上１０ＭＨｚ以下であることを特徴とする請求項１に記載の分析装置。 The analyzer according to claim 1, wherein the cutoff frequency of the ammeter is 10 kHz or more and 1 MHz or less, and the sampling frequency is 100 kHz or more and 10 MHz or less. 前記第１の溶液の温度を３５℃～３９℃の範囲に調整する温度調整機構をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の分析装置。 The analyzer according to claim 1, further comprising a temperature adjusting mechanism for adjusting the temperature of the first solution in the range of 35 ° C to 39 ° C. 前記第１の区画と前記第２の区画との間に圧力勾配を印加して、前記細孔を通過する前記反応性粒子の通過時間を０．０１ｍｓ～１ｍｓに調整する圧力制御機構をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の分析装置。 Further provided is a pressure control mechanism that applies a pressure gradient between the first compartment and the second compartment to adjust the passage time of the reactive particles passing through the pores to 0.01 ms to 1 ms. The analyzer according to claim 1. 前記第１の区画と前記第２の区画との間に圧力勾配を印加して、前記細孔を通過する前記反応性粒子の通過時間を０．０１ｍｓ～１ｍｓに調整する圧力制御機構をさらに備え、
前記プロセッサは、前記圧力制御機構による前記反応性粒子の前記細孔への搬送と、前記温度調整機構による前記第１の溶液の温度の調整を同時に実行することを特徴とする請求項１１に記載の分析装置。Further provided is a pressure control mechanism that applies a pressure gradient between the first compartment and the second compartment to adjust the passage time of the reactive particles passing through the pores to 0.01 ms to 1 ms. ,
11. The processor according to claim 11, wherein the processor simultaneously carries out the transfer of the reactive particles to the pores by the pressure control mechanism and the temperature adjustment of the first solution by the temperature adjustment mechanism. Analyzer. 前記細孔の数が２以上であり、
前記プロセッサは、
複数の前記細孔を通過した全ての前記反応性粒子中に占める前記単量体、前記２量体及び前記３量体以上の凝集体の通過数の比率に基づいて、前記検体中の前記計測対象物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１に記載の分析装置。The number of the pores is 2 or more,
The processor
The measurement in the sample based on the ratio of the number of passages of the monomer, the dimer and the aggregates of the trimer or more to all the reactive particles that have passed through the plurality of pores. The analyzer according to claim 1, wherein the concentration of the target substance is calculated. 分析装置のプロセッサにより実行される分析方法であって、
前記分析装置は、
検体と、前記検体に含まれ得る計測対象物質に対して特異的に結合する物質が修飾された反応性粒子とを含む第１の溶液が導入される第１の区画と、第２の溶液が導入される第２の区画と、前記第１の区画と前記第２の区画を接続する細孔を備えた薄膜と、を有する計測容器と、
前記第１の区画の内部に設けられた第１の電極と、
前記第２の区画の内部に設けられた第２の電極と、
前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧を印加する電圧源と、
前記第１の電極と前記第２の電極との間に流れる電流を計測する電流計と、を備え、
前記分析方法は、
前記プロセッサにより、前記電流計により得られる電流データから、前記反応性粒子が前記細孔を通過する際に生じる封鎖電流波形を抽出することと、
前記プロセッサにより、前記封鎖電流波形に基づき、３つ以上の前記反応性粒子が凝集したときの凝集数を識別することと、
前記プロセッサにより、単位時間中に前記細孔を通過した単量体、２量体及び３量体以上の凝集体の通過数に基づいて、前記検体中の前記計測対象物質の濃度を算出することと、を含む、分析方法。An analytical method performed by the processor of an analyzer,
The analyzer is
The first section into which the first solution containing the sample and the reactive particles modified with the substance specifically bound to the substance to be measured that can be contained in the sample is introduced, and the second solution A measuring container having a second compartment to be introduced and a thin film having pores connecting the first compartment and the second compartment.
With the first electrode provided inside the first compartment,
A second electrode provided inside the second compartment, and
A voltage source that applies a voltage between the first electrode and the second electrode,
An ammeter for measuring the current flowing between the first electrode and the second electrode is provided.
The analysis method is
Extracting the blockage current waveform generated when the reactive particles pass through the pores from the current data obtained by the ammeter by the processor, and
The processor identifies the number of aggregates when three or more of the reactive particles aggregate based on the blockage current waveform.
Using the processor, the concentration of the substance to be measured in the sample is calculated based on the number of passages of the monomer, the dimer, and the aggregate of the trimer or more that have passed through the pores in a unit time. And, including, analysis methods.

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