JP2021032562A - Preparation method and analysis method of analytical sample - Google Patents
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Abstract
Translated fromJapaneseDescription
Translated fromJapanese本発明は、分析用試料の調製方法および分析方法に関する。 The present invention relates to a method for preparing a sample for analysis and a method for analysis.
糖鎖を含む試料を質量分析等により分析することが行われている。この分析のための分析用試料の調製では、試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動によりゲルの内部において分離し、糖鎖を含むゲル断片から質量分析用試料を調製することが行われている（非特許文献１参照）。 Samples containing sugar chains are analyzed by mass spectrometry or the like. In the preparation of the analytical sample for this analysis, the sample is separated inside the gel by electrophoresis such as SDS-PAGE, and the mass analysis sample is prepared from the gel fragment containing a sugar chain. (See Non-Patent Document 1).
発明者は、上述の質量分析用試料の質量分析において、糖鎖に付随する望ましくないピークが検出されることを発見した。 The inventor has found that in the mass spectrometry of the above-mentioned mass spectrometric sample, an undesired peak associated with a sugar chain is detected.
本発明の第１の態様は、糖鎖を含む試料をゲルの内部で電気泳動に供することと、前記電気泳動により分離された前記糖鎖を含むゲル断片を切り出すことと、切り出した前記ゲル断片から前記糖鎖を含む分子を液体に分散させ、前記分子を含む溶液を調製することと、前記溶液に含まれる前記分子を乾固させずに分析用試料を調製するか、または、前記分子を乾固させずに前記電気泳動における不純物が除去される前処理に供することとを備える分析用試料の調製方法に関する。
本発明の第２の態様は、第１の態様の分析用試料の調製方法により分析用試料を調製することと、調製した前記分析用試料を分析に供することとを備える分析方法に関する。The first aspect of the present invention is to subject a sample containing a sugar chain to electrophoresis inside a gel, to cut out a gel fragment containing the sugar chain separated by the electrophoresis, and to cut out the gel fragment. To prepare a solution containing the molecule by dispersing the molecule containing the sugar chain in a liquid, and to prepare a sample for analysis without drying the molecule contained in the solution, or to prepare the molecule. The present invention relates to a method for preparing a sample for analysis, which comprises subjecting the sample to a pretreatment for removing impurities in the electrophoresis without drying.
A second aspect of the present invention relates to an analytical method comprising preparing an analytical sample by the method for preparing an analytical sample of the first aspect and subjecting the prepared analytical sample to analysis.
本発明によれば、糖鎖に付随する望ましくない分子の検出を抑制することができる。 According to the present invention, it is possible to suppress the detection of unwanted molecules associated with sugar chains.
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。 Hereinafter, embodiments for carrying out the present invention will be described with reference to the drawings.
−第１実施形態−
図１は、本実施形態の分析用試料の調製方法に係る分析方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ１００１において、糖鎖を含む試料が用意される。− First Embodiment −
FIG. 1 is a flowchart showing a flow of an analysis method according to the method for preparing an analysis sample of the present embodiment. In step S1001, a sample containing a sugar chain is prepared.
（試料について）
糖鎖を含む試料は、特に限定されず、糖鎖、遊離糖鎖、糖ペプチド、糖タンパク質、ならびに糖脂質からなる群から選択される少なくとも一つの分子を含むことができる。糖ペプチドは、２以上５０未満のアミノ酸からなるペプチド主鎖を備えるとし、糖タンパク質は、５０以上のアミノ酸からなるペプチド主鎖を備えるとすることができる。しかし、慣用的な例外もあり、糖ペプチドと糖タンパク質の範囲の境界はこれに限定されない。試料中の糖鎖は、Ｎ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖または糖脂質型糖鎖を含むことが好ましく、Ｎ−結合型糖鎖を含むことがより好ましい。Ｎ−結合型糖鎖はＮ型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖はＯ型糖鎖とも呼ばれる。(About the sample)
The sample containing a sugar chain is not particularly limited, and may contain at least one molecule selected from the group consisting of a sugar chain, a free sugar chain, a glycopeptide, a glycoprotein, and a glycolipid. Glycoproteins may comprise a peptide backbone consisting of 2 or more and less than 50 amino acids, and glycoprotein may comprise a peptide backbone consisting of 50 or more amino acids. However, there are conventional exceptions, and the boundaries of the range of glycopeptides and glycoproteins are not limited to this. The sugar chain in the sample preferably contains an N-linked sugar chain, an O-linked sugar chain or a glycolipid-type sugar chain, and more preferably contains an N-linked sugar chain. The N-linked sugar chain is also called an N-type sugar chain, and the O-linked sugar chain is also called an O-type sugar chain.
以下では、試料が糖ペプチド、糖タンパク質および糖脂質の少なくとも一つを含むとして説明するが、これに特に限定されず、電気泳動を行ったゲルの内部の糖鎖を含む分子を分析する場合には本実施形態の方法を適用することができる。分析対象の糖ペプチド、糖タンパク質または糖脂質を、分析対象の分子と呼ぶ。分析対象の分子は、液体に分散された状態で用意される。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３が開始される。 In the following, the sample will be described as containing at least one of a glycopeptide, a glycoprotein and a glycolipid, but the present invention is not particularly limited thereto, and when analyzing a molecule containing a sugar chain inside an electrophoresed gel. Can apply the method of this embodiment. The glycopeptide, glycoprotein or glycolipid to be analyzed is called the molecule to be analyzed. The molecule to be analyzed is prepared in a state of being dispersed in a liquid. When step S1001 is completed, step S1003 is started.
ステップＳ１００３において、試料が電気泳動に供され、試料に含まれる分子が分離される。本実施形態において行われる電気泳動は、分析対象の分子を分離可能であって、試料がゲルの内部を移動するゲル電気泳動であり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis; ＰＡＧＥ）が好ましく、ドデシル硫酸ナトリウム（Sodium Dodecyl Sulfate;ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）がより好ましい。本ステップの電気泳動では、分析対象の分子が単一のバンドに分離される等、所望の精度で試料に含まれる分子の分離ができればその条件は特に限定されない。試料に含まれる分子は、クマシーブリリアントブルー（Coomassie Brilliant Blue;ＣＢＢ）染色等の任意の染色法により染色される。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５が開始される。 In step S1003, the sample is subjected to electrophoresis and the molecules contained in the sample are separated. The electrophoresis performed in the present embodiment is gel electrophoresis in which the molecule to be analyzed can be separated and the sample moves inside the gel, and poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) is used. Preferably, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) -polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) is more preferred. In the electrophoresis of this step, the conditions are not particularly limited as long as the molecules contained in the sample can be separated with desired accuracy, such as the molecules to be analyzed being separated into a single band. Molecules contained in the sample are stained by an arbitrary staining method such as Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining. When step S1003 is completed, step S1005 is started.
ステップＳ１００５において、ゲルの内部において、糖鎖を切断する処理が行われる。具体的には、例えばゲルに糖鎖を切断する試薬が加えられる。以下では、糖鎖を切断する処理を切断処理、糖鎖を切断する試薬を切断試薬と呼ぶ。切断試薬は、ゲルの内部に存在する糖鎖をペプチド鎖または脂質等から遊離させることができれば特に限定されない。切断試薬は、酵素であることが好ましく、Ｎ‐グリコシダーゼ、Ｏ‐グリコシダーゼ、またはエンドグリコセラミダーゼがより好ましい。ヒドラジン分解または、アルカリ処理によるβ脱離等の化学的遊離法を用いて糖鎖の切断を行ってもよい。糖ペプチドおよび糖タンパク質のペプチド鎖からＮ‐結合型糖鎖を遊離させる場合は、ペプチド‐Ｎ‐グリコシダーゼＦ(PNGase F)、ペプチド‐Ｎ‐グリコシダーゼＡ(PNGase A)、またはエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Endo M）等の酵素が好適に用いられる。上述の切断試薬を組み合わせて用いてもよい。切断処理により、ゲル内部の分析対象の分子から、糖鎖が遊離される。以下では、ステップＳ１００５における切断で生成した糖鎖を、分析対象の糖鎖と呼ぶ。ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７が開始される。 In step S1005, a process of cleaving the sugar chain is performed inside the gel. Specifically, for example, a reagent for cleaving a sugar chain is added to a gel. Hereinafter, the process of cleaving the sugar chain is referred to as a cleaving treatment, and the reagent for cleaving the sugar chain is referred to as a cleavage reagent. The cleaving reagent is not particularly limited as long as the sugar chain existing inside the gel can be released from the peptide chain, lipid, or the like. The cleaving reagent is preferably an enzyme, more preferably N-glycosidase, O-glycosidase, or endoglycoceramidelase. The sugar chain may be cleaved by using a chemical liberation method such as hydrazine decomposition or β-elimination by alkali treatment. When releasing N-linked sugar chains from peptide chains of glycopeptides and glycoproteins, peptide-N-glycosidase F (PNGase F), peptide-N-glycosidase A (PNGase A), or endo-β-N- Enzymes such as acetylglucosaminidase (Endo M) are preferably used. The above-mentioned cutting reagents may be used in combination. The cleavage treatment releases sugar chains from the molecule to be analyzed inside the gel. Hereinafter, the sugar chain generated by the cleavage in step S1005 is referred to as the sugar chain to be analyzed. When step S1005 is completed, step S1007 is started.
ステップＳ１００７において、遊離された糖鎖を含むゲルからゲル断片が切り出される。以下において、ゲル断片とは、ステップＳ１００５で遊離された糖鎖を含む電気泳動で用いたゲルの断片を指す。分析対象の分子に対応するバンドを囲むように、分析対象の糖鎖が含まれるゲル断片が、かみそり等の任意の切断器具により切り出される。切り出されたゲル断片は、チューブ等の任意の容器に配置される。ステップＳ１００７が終了したら、ステップＳ１００９が開始される。 In step S1007, a gel fragment is cut out from the gel containing the released sugar chain. In the following, the gel fragment refers to a gel fragment used in electrophoresis containing a sugar chain released in step S1005. A gel fragment containing the sugar chain to be analyzed is cut out by an arbitrary cutting instrument such as a razor so as to surround the band corresponding to the molecule to be analyzed. The cut out gel fragment is placed in an arbitrary container such as a tube. When step S1007 is completed, step S1009 is started.
ステップＳ１００９において、ステップＳ１００７において切り出したゲル断片から、分析対象の糖鎖を含む溶液が調製される。以下では、ステップＳ１００９において調製される分析対象の糖鎖を含む溶液を試料溶液と呼ぶ。ステップＳ１００９では、分析対象の糖鎖を乾固させずに、ゲル断片から試料溶液が調製される。例えば、ゲル断片に水または溶出緩衝液等の液体を加え、数分〜一晩等インキュベーションすることにより分析対象の糖鎖を液体に抽出することができる。必要に応じて、インキュベーションの際の温度を数十℃等まで上げたり、ゲル断片を乳棒等の撹拌用器具を用いて細かくしたり、超音波処理を行うことができる。インキュベーション後、分析対象の糖鎖が抽出および分散された上記液体は、試料溶液として、ピペット等の任意の器具を用いて他のチューブ等の容器に移される。 In step S1009, a solution containing the sugar chain to be analyzed is prepared from the gel fragment cut out in step S1007. Hereinafter, the solution containing the sugar chain to be analyzed prepared in step S1009 is referred to as a sample solution. In step S1009, a sample solution is prepared from the gel fragment without drying the sugar chain to be analyzed. For example, the sugar chain to be analyzed can be extracted into a liquid by adding a liquid such as water or an elution buffer to the gel fragment and incubating for several minutes to overnight. If necessary, the temperature during incubation can be raised to several tens of degrees Celsius or the like, the gel fragment can be finely divided using a stirring device such as a pestle, or ultrasonic treatment can be performed. After the incubation, the liquid in which the sugar chain to be analyzed is extracted and dispersed is transferred as a sample solution to a container such as another tube using an arbitrary instrument such as a pipette.
以下の実施形態において、「乾固」の語は、減圧濃縮等の濃縮により溶液の液体成分が除去される場合の他、凍結乾燥により液体成分が凍結され除去される場合も含む。 In the following embodiments, the term "dry solid" includes the case where the liquid component of the solution is removed by concentration such as concentration under reduced pressure, and the case where the liquid component is frozen and removed by freeze-drying.
試料溶液を、乾固させないように、減圧濃縮に供することが好ましい。これにより、試料溶液における分析対象の糖鎖の濃度を、次に行う前処理に適切な濃度へと調製し、より精度よい分析を可能にすることができる。減圧濃縮は、遠心エバポレータ等の濃縮機等により行うことができる。ステップＳ１００９が終了したら、ステップＳ１０１１が開始される。 It is preferable that the sample solution is concentrated under reduced pressure so as not to dry out. As a result, the concentration of the sugar chain to be analyzed in the sample solution can be adjusted to a concentration suitable for the next pretreatment, and more accurate analysis can be performed. Concentration under reduced pressure can be performed by a concentrator such as a centrifugal evaporator. When step S1009 is completed, step S1011 is started.
ステップＳ１０１１において、糖鎖を乾固させずに、不純物を除去する。発明者は、実施例に示したように、電気泳動のゲルから抽出した糖鎖を質量分析した際、糖鎖に対応する硫酸付加イオンよりもｍ／ｚの値が３６小さいイオンが検出されることを観察した。以下では、糖鎖に対応する硫酸付加イオンよりもｍ／ｚの値が３６小さいイオンを、糖鎖に付随して検出されるイオンとして、付随イオンと呼ぶ。分析した糖鎖の構造を考えると、このような値のｍ／ｚに対応する糖鎖が存在するとは考えにくく、また、付随イオンは、電気泳動を行わず、溶液内で切断処理により遊離された糖鎖の質量分析では観察されなかった。従って、付随イオンは、前処理で生じた、試料の分析において望ましくない分子に対応するイオンと考えられた。付随イオンは、糖鎖に付随して検出されるため、糖鎖に不純物が結合した分子に由来すると考えられる。 In step S1011, impurities are removed without drying the sugar chains. As shown in the examples, when the sugar chain extracted from the electrophoretic gel is mass-spectrometrically analyzed, the inventor detects an ion having a m / z value 36 smaller than that of the sulfate-added ion corresponding to the sugar chain. I observed that. Hereinafter, an ion having a m / z value 36 smaller than that of the sulfate-added ion corresponding to the sugar chain is referred to as an accompanying ion as an ion detected associated with the sugar chain. Considering the structure of the analyzed sugar chain, it is unlikely that a sugar chain corresponding to such a value of m / z exists, and the accompanying ions are released by cleavage treatment in the solution without electrophoresis. It was not observed by mass spectrometry of the sugar chains. Therefore, the associated ions were considered to correspond to the molecules generated in the pretreatment that were not desirable in the analysis of the sample. Since the associated ion is detected associated with the sugar chain, it is considered to be derived from a molecule in which an impurity is bound to the sugar chain.
発明者は、ゲル断片に含まれる分析対象の糖鎖を乾固させずに分析用試料を調製するか、または、当該糖鎖を乾固させずに電気泳動における不純物が除去される前処理に供することで、付随イオンが検出されなくなることを見出した。乾固の際の濃縮では、不純物が高濃度になるため糖鎖と結合しやすくなり、これが付随イオンとなる分子が生成する一因と考えられる。従って、乾固を行わないことで、不純物が高濃度にならず、付随イオンとなる分子の生成を抑制できると考えられる。 The inventor prepares a sample for analysis without drying the sugar chains to be analyzed contained in the gel fragment, or for pretreatment in which impurities in electrophoresis are removed without drying the sugar chains. It was found that the accompanying ions could not be detected by using the sample. When concentrated during drying, impurities become high in concentration, which makes it easier to bind to sugar chains, which is considered to be one of the causes for the formation of molecules that serve as accompanying ions. Therefore, it is considered that by not performing drying, impurities do not become high in concentration and the formation of molecules as accompanying ions can be suppressed.
以下では、ステップＳ１０１１の不純物を除去する前処理として、脱塩を行う。脱塩の方法は、付随イオンの生成に関与する不純物を除去することができれば特に限定されない。脱塩の方法は、担体に分析対象の糖鎖を吸着させた後、当該担体を洗浄液で洗浄し、その後分析対象の糖鎖を溶出液に溶出させることにより行うことができる。 In the following, desalting is performed as a pretreatment for removing impurities in step S1011. The desalting method is not particularly limited as long as impurities involved in the formation of associated ions can be removed. The desalting method can be carried out by adsorbing the sugar chain to be analyzed on the carrier, washing the carrier with a washing solution, and then eluting the sugar chain to be analyzed into the eluate.
固相担体を用いる場合、糖鎖等を固定可能な固相担体であれば、特に制限なく用いることができる。例えば、固相担体は、グラファイトカーボンまたはアモルファスカーボンを含むことが好ましい。この場合、これらの少なくともいずれかのカーボンを含むカーボンカラム、カーボンチップまたはカーボンカートリッジを用いて脱塩を行うことができる。 When a solid-phase carrier is used, any solid-phase carrier capable of immobilizing a sugar chain or the like can be used without particular limitation. For example, the solid phase carrier preferably contains graphite carbon or amorphous carbon. In this case, desalting can be performed using a carbon column, carbon chip or carbon cartridge containing at least one of these carbons.
糖鎖が吸着された担体を洗浄するための洗浄液は、特に限定されない。しかし、発明者の分析により、付随イオンの生成に関与する不純物はアニオン性を有すると考えられるため、洗浄液は酸等のイオン性物質を含むことが好ましい。洗浄液は、水等の水性溶媒若しくは有機溶媒またはこれらの混合液とすることができる。洗浄液は、トリフルオロ酢酸（trifluoroacetic acid; ＴＦＡ）を含む溶液が好ましく、ＴＦＡ水溶液がより好ましい。ＴＦＡ水溶液等のＴＦＡを含む溶液におけるＴＦＡの濃度は、分析に悪影響を及ぼさなければ特に限定されないが、例えば０．０１〜５％とすることができ、０．０５〜０．２％とすることが好ましい。溶出液は、用いた担体に適合する種類の液体を用いればよい。例えば、カーボンの担体の場合、上記濃度のＴＦＡ水溶液で担体を洗浄し、当該担体にアセトニトリル等の有機溶媒を含む溶出液を加えることにより、糖鎖の溶出を行うことができる。
なお、固相担体として、ヒドラジド基またはアミノオキシ基等をリガンドとして有する担体を用いてもよい。また、糖鎖を親水性相互作用クロマトグラフィ（Hydrophilic Interaction Chromatography; ＨＩＬＩＣ）用の担体、すなわち固定相に吸着させてもよく、このＨＩＬＩＣ用の担体はアミド基を含むことができる。ヒドラジド基を有する固相担体に結合している糖鎖は、弱酸性溶液により遊離させて回収することができる。ＨＩＬＩＣ用の担体では、水等の水系溶液により糖鎖を溶出することができる。The cleaning solution for cleaning the carrier on which the sugar chain is adsorbed is not particularly limited. However, according to the inventor's analysis, impurities involved in the formation of accompanying ions are considered to have anionic properties, so it is preferable that the cleaning solution contains an ionic substance such as an acid. The cleaning solution can be an aqueous solvent such as water, an organic solvent, or a mixture thereof. The cleaning solution is preferably a solution containing trifluoroacetic acid (TFA), and more preferably an aqueous TFA solution. The concentration of TFA in a solution containing TFA, such as an aqueous TFA solution, is not particularly limited as long as it does not adversely affect the analysis, but can be, for example, 0.01 to 5%, and 0.05 to 0.2%. Is preferable. As the eluate, a liquid of a type compatible with the carrier used may be used. For example, in the case of a carbon carrier, the sugar chain can be eluted by washing the carrier with a TFA aqueous solution having the above concentration and adding an eluate containing an organic solvent such as acetonitrile to the carrier.
As the solid phase carrier, a carrier having a hydrazide group, an aminooxy group or the like as a ligand may be used. Further, the sugar chain may be adsorbed on a carrier for hydrophilic interaction chromatography (HILIC), that is, a stationary phase, and the carrier for HILIC may contain an amide group. The sugar chain bonded to the solid-phase carrier having a hydrazide group can be liberated and recovered by a weakly acidic solution. In the carrier for HILIC, sugar chains can be eluted with an aqueous solution such as water.
ステップＳ１０１１が終了したら、ステップＳ１０１３が開始される。
なお、後述のステップＳ１０１５における分析を所望の精度で行うことができれば、不純物を除去する前処理を行わなくてもよい。当該前処理を行わない場合でも、乾固をさせないようにしながら適宜他の前処理を行って分析用試料を調製すれば、付随イオンとなる糖鎖の生成を防ぐことができる。ここで、上記他の前処理とは、乾固を行う必要がなければ特に限定されないが、誘導体化または精製等が含まれる。他の前処理を行わずに分析用試料を調製してもよい。試料溶液を乾固させずに減圧濃縮を行った後、他の前処理を行わずに、乾固させずに分析用試料を調製してもよい。When step S1011 is completed, step S1013 is started.
If the analysis in step S1015 described later can be performed with desired accuracy, the pretreatment for removing impurities may not be performed. Even when the pretreatment is not performed, the formation of sugar chains as accompanying ions can be prevented by appropriately performing other pretreatments to prepare a sample for analysis while preventing the sample from drying out. Here, the above-mentioned other pretreatment is not particularly limited as long as it is not necessary to carry out drying, but includes derivatization, purification and the like. Analytical samples may be prepared without any other pretreatment. After the sample solution is concentrated under reduced pressure without being dried, a sample for analysis may be prepared without being dried without any other pretreatment.
ステップＳ１０１３において、分析用試料が調製される。分析用試料の調製方法は特に限定されない。マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization; ＭＡＬＤＩ）によりイオン化を行う質量分析（ＭＡＬＤＩ−Mass Spectrometry; ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を行う場合は以下のように質量分析用試料が調製される。ステップＳ１０１１で得られた分析対象の糖鎖を含む溶液がＭＡＬＤＩ用試料プレートに滴下される。滴下された溶液にマトリックス溶液が滴下され、乾燥に供されて試料およびマトリックスの混合結晶が生成される。この混合結晶が質量分析用試料となる。マトリックス溶液は、マトリックスを含む溶液であり、さらに添加剤を含んでもよい。マトリックスの種類は、所望の精度で質量分析を行うことができれば特に限定されず、３−アミノキノリン／ｐ−クマル酸（3-Aminoquinoline/p-coumaric acid; ３ＡＱ／ＣＡ)等を用いることができる。添加剤の種類は、感度が上がったりノイズが低減される等、質量分析において何らかの効果があれば特に限定されない。他の質量分析または他の分析を行う場合にも、分析対象の糖鎖を含む溶液を用いて公知の方法等で分析用試料の調製を行えばよい。ステップＳ１０１３が終了したら、ステップＳ１０１５が開始される。 In step S1013, a sample for analysis is prepared. The method for preparing the sample for analysis is not particularly limited. When mass spectrometry (MALDI-Mass Spectrometry; MALDI-MS), in which ionization is performed by Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization (MALDI), is performed, a sample for mass spectrometry is prepared as follows. The solution containing the sugar chain to be analyzed obtained in step S1011 is dropped onto the MALDI sample plate. The matrix solution is added dropwise to the added solution and subjected to drying to form a mixed crystal of the sample and the matrix. This mixed crystal serves as a sample for mass spectrometry. The matrix solution is a solution containing a matrix and may further contain additives. The type of matrix is not particularly limited as long as mass spectrometry can be performed with a desired accuracy, and 3-aminoquinoline / p-coumaric acid (3-Aminoquinoline / p-coumaric acid; 3AQ / CA) or the like can be used. .. The type of additive is not particularly limited as long as it has some effect in mass spectrometry, such as increasing sensitivity and reducing noise. When performing other mass spectrometry or other analysis, a sample for analysis may be prepared by a known method or the like using a solution containing the sugar chain to be analyzed. When step S1013 is completed, step S1015 is started.
ステップＳ１０１５において、ステップＳ１０１３で調製された分析用試料の分析が行われる。分析は、分析対象の糖鎖を測定するものであれば特に限定されない。質量分析、液体クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィー／質量分析（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry; ＬＣ／ＭＳ）等により分析を行うことができる。 In step S1015, the analysis sample prepared in step S1013 is analyzed. The analysis is not particularly limited as long as it measures the sugar chain to be analyzed. The analysis can be performed by chromatography such as mass spectrometry and liquid chromatography or by liquid chromatography / mass spectrometry (LC / MS) or the like.
質量分析の場合、四重極型、イオントラップ型、飛行時間型等の任意の質量分析を１以上適宜組み合わせて用いることができる。従って、質量分析を行う質量分析計としては、四重極型、イオントラップ型、飛行時間型等の任意の質量分析器を１以上適宜組み合わせて有するものを用いることができる。質量分析におけるイオン化の方法は特に限定されず、ＭＡＬＤＩ、エレクトロスプレー（Electrospray ionization; ＥＳＩ）法、ナノエレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏ−ＥＳＩ）法等を用いることができる。イオン化の方法は特にＭＡＬＤＩ法が好ましい。質量分析におけるイオン化では、正イオンモードおよび負イオンモードのいずれを用いてもよい。イオンの解離またはイオンへの原子若しくは原子団の付加等も適宜行うことができる。 In the case of mass spectrometry, one or more arbitrary mass spectrometrys such as a quadrupole type, an ion trap type, and a time-of-flight type can be appropriately combined and used. Therefore, as the mass spectrometer for mass spectrometry, one having one or more arbitrary mass spectrometers such as a quadrupole type, an ion trap type, and a time-of-flight type can be used. The ionization method in mass spectrometry is not particularly limited, and MALDI, electrospray ionization (ESI) method, nano-electrospray ionization (nano-ESI) method and the like can be used. The MALDI method is particularly preferable as the ionization method. For ionization in mass spectrometry, either positive ion mode or negative ion mode may be used. Dissociation of ions or addition of atoms or atomic groups to ions can also be performed as appropriate.
液体クロマトグラフィーの場合、ナノ液体クロマトグラフ（nano-liquid chromatograph; ｎａｎｏＬＣ）、マイクロ液体クロマトグラフ（micro-liquid chromatograph; ｍｉｃｒｏＬＣ）、高速液体クロマトグラフ（high-performance liquid chromatograph; ＨＰＬＣ）、または超高速液体クロマトグラフ（ultra high performance liquid chromatograph; ＵＨＰＬＣ）等の任意の液体クロマトグラフを用いることができる。分離に用いるカラムは特に限定されず、Ｃ３０、Ｃ１８、Ｃ８、Ｃ４等の疎水性逆相カラムやカーボンカラム、ＨＩＬＩＣ（Hydrophilic Interaction Chromatography）用の順相カラムなどを適宜用いることができる。ＬＣ／ＭＳを行う場合、ＥＳＩまたはｎａｎｏ−ＥＳＩ等によりイオン化することがより好ましい。 For liquid chromatography, nano-liquid chromatograph (nanoLC), micro-liquid chromatograph (microLC), high-performance liquid chromatograph (HPLC), or ultra-fast liquid Any liquid chromatograph such as ultra high performance liquid chromatograph (ULHPLC) can be used. The column used for separation is not particularly limited, and hydrophobic reversed-phase columns such as C30, C18, C8, and C4, carbon columns, and normal-phase columns for HILIC (Hydrophilic Interaction Chromatography) can be appropriately used. When performing LC / MS, it is more preferable to ionize by ESI, nano-ESI, or the like.
分析で得られたデータは、データ解析される。データ解析では、検出された信号に対応する分子の同定および定量等が行われる。質量分析の場合、例えばｍ／ｚと検出量を対応させたマススペクトルに対応するデータが作成され、マススペクトルのピークの強度または面積等により、ピークに対応する分子の定量を行うことができる。予め得られた糖鎖を構成する糖の質量情報およびピークのｍ／ｚに基づいて、ピークに対応する分析対象の糖鎖の構造を推定することもできる。２段階以上の質量分析を行った場合には、解離により生成されたイオンを解析することにより、さらに詳細に糖鎖の構造についての情報を得ることができる。データ解析の方法は分析対象の糖鎖についての情報が得られれば特に限定されず、クロマトグラフィーでは、保持時間と検出量を対応させたクロマトグラムに対応するデータが作成され、クロマトグラムのピークの強度または面積等により、ピークに対応する分子の定量を行うことができる。ＬＣ／ＭＳでは、マススペクトルまたはクロマトグラムを解析することができる。ステップＳ１０１５が終了したら、処理が終了される。 The data obtained by the analysis is analyzed. In the data analysis, the molecule corresponding to the detected signal is identified and quantified. In the case of mass spectrometry, for example, data corresponding to a mass spectrum corresponding to m / z and a detected amount is created, and the molecule corresponding to the peak can be quantified based on the intensity or area of the peak of the mass spectrum. It is also possible to estimate the structure of the sugar chain to be analyzed corresponding to the peak based on the mass information of the sugar constituting the sugar chain obtained in advance and the m / z of the peak. When two or more steps of mass spectrometry are performed, information on the structure of the sugar chain can be obtained in more detail by analyzing the ions generated by the dissociation. The method of data analysis is not particularly limited as long as information on the sugar chain to be analyzed can be obtained. In chromatography, data corresponding to a chromatogram in which the retention time and the detection amount are associated is created, and the peak of the chromatogram is obtained. The molecule corresponding to the peak can be quantified based on the strength, area, or the like. LC / MS can analyze mass spectra or chromatograms. When step S1015 is completed, the process is completed.
上述の実施形態では、糖タンパク質等を電気泳動した後、ゲルの内部で糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を分析する例を説明した。しかし、ゲル断片に含まれる糖鎖を含む分子を、乾固させずに分析用試料を調製するか、または、乾固させずに電気泳動における不純物が除去される前処理に供すれば、上述の実施形態と同様に、付随イオンとなる糖鎖を含む分子の生成を抑制することができる。 In the above-described embodiment, an example in which a glycoprotein or the like is electrophoresed, a sugar chain is released inside the gel, and the released sugar chain is analyzed has been described. However, if the molecule containing the sugar chain contained in the gel fragment is prepared as an analytical sample without being dried, or is subjected to a pretreatment for removing impurities in electrophoresis without being dried, the above-mentioned Similar to the above embodiment, the formation of a molecule containing a sugar chain as an accompanying ion can be suppressed.
（態様）
上述した複数の例示的な実施形態またはその変形は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。(Aspect)
It will be understood by those skilled in the art that the plurality of exemplary embodiments or variations thereof described above are specific examples of the following embodiments.
（第１項）一態様に係る分析用試料の調製方法は、糖鎖を含む試料をゲルの内部で電気泳動に供することと、前記電気泳動により分離された前記糖鎖を含むゲル断片を切り出すことと、切り出した前記ゲル断片から前記糖鎖を含む分子を液体に分散させ、前記分子を含む溶液を調製することと、前記溶液に含まれる前記分子を乾固させずに分析用試料を調製するか、または、前記分子を乾固させずに前記電気泳動における不純物が除去される前処理に供することとを備える。これにより、糖鎖に付随する望ましくない分子の検出を抑制することができる。(Item 1) The method for preparing a sample for analysis according to one embodiment is to subject a sample containing a sugar chain to electrophoresis inside the gel and to cut out a gel fragment containing the sugar chain separated by the electrophoresis. In addition, the molecule containing the sugar chain is dispersed in a liquid from the cut out gel fragment to prepare a solution containing the molecule, and a sample for analysis is prepared without drying the molecule contained in the solution. Alternatively, the molecule may be subjected to a pretreatment from which impurities in the electrophoresis are removed without drying. This makes it possible to suppress the detection of unwanted molecules associated with sugar chains.
（第２項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項に記載の分析用試料の調製方法において、前記溶液を、乾固させない減圧濃縮に供した後、乾固させずに分析用試料を調製するかまたは乾固させずに前記前処理に供する。これにより、試料が含まれる溶液における液体成分の量を調整し、より正確に分析用試料を調製することができる。(Item 2) In the method for preparing an analytical sample according to another aspect, in the method for preparing an analytical sample according to item 1, the solution is subjected to vacuum concentration without drying and then dried. A sample for analysis is prepared without or subjected to the pretreatment without drying. Thereby, the amount of the liquid component in the solution containing the sample can be adjusted, and the sample for analysis can be prepared more accurately.
（第３項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項または第２項に記載の分析用試料の調製方法において、前記分子は、遊離糖鎖であり、前記電気泳動の後、前記糖鎖を切断する処理を行い、前記ゲルの内部において前記遊離糖鎖を生成することを備える。これにより、特定の糖タンパク質または糖ペプチド等を含むバンドから、遊離された糖鎖を得ることができる。(Section 3) In the method for preparing an analytical sample according to another aspect, in the method for preparing an analytical sample according to the first or second paragraph, the molecule is a free sugar chain and the electrophoresis. After that, a treatment for cutting the sugar chain is performed to generate the free sugar chain inside the gel. As a result, a free sugar chain can be obtained from a band containing a specific glycoprotein, glycopeptide, or the like.
（第４項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項から第３項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法において、前記前処理として、脱塩が行われる。これにより、ゲル電気泳動に伴う不純物を効率よく除去することができる。(Item 4) In the method for preparing an analytical sample according to another aspect, desalting is performed as the pretreatment in the method for preparing an analytical sample according to any one of items 1 to 3. Will be. As a result, impurities associated with gel electrophoresis can be efficiently removed.
（第５項）他の一態様に係る分析用試料の調製方法では、第１項から第４項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法において、前記分析用試料は、質量分析用試料またはクロマトグラフィー用試料である。これにより、質量分析またはクロマトグラフィーにおいて、糖鎖に付随する望ましくない分子を検出することを抑制することができる。(Section 5) In the method for preparing an analytical sample according to another aspect, in the method for preparing an analytical sample according to any one of paragraphs 1 to 4, the analytical sample is for mass analysis. A sample or a sample for chromatography. This can prevent the detection of unwanted molecules associated with sugar chains in mass spectrometry or chromatography.
（第６項）一態様に係る分析方法は、第１項から第５項までのいずれかに記載の分析用試料の調製方法により分析用試料を調製することと、調製した前記分析用試料を分析に供することとを備える。これにより、糖鎖に付随する望ましくない分子の検出を抑制し、より正確な分析を実現することができる。(Section 6) The analysis method according to one embodiment is to prepare an analysis sample by the method for preparing an analysis sample according to any one of paragraphs 1 to 5, and to prepare the prepared analysis sample. Prepare for analysis. This makes it possible to suppress the detection of unwanted molecules associated with sugar chains and realize more accurate analysis.
（第７項）他の一態様に係る分析方法では、第６項に記載の分析方法において、前記分析は、質量分析およびクロマトグラフィーの少なくとも一つにより行われる。これにより、糖鎖に付随する望ましくない分子の検出を抑制し、より正確な質量分析またはクロマトグラフィーによる分離分析を実現することができる。(Section 7) In the analysis method according to another aspect, in the analysis method according to paragraph 6, the analysis is performed by at least one of mass spectrometry and chromatography. This makes it possible to suppress the detection of unwanted molecules associated with sugar chains and realize more accurate mass spectrometry or chromatographic separation analysis.
本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。 The present invention is not limited to the contents of the above embodiment. Other aspects conceivable within the scope of the technical idea of the present invention are also included within the scope of the present invention.
以下に、本実施形態に係る実施例を示すが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。なお、以下において、％の記載は特に言及が無い限り体積／体積％を示す。 Examples of the present embodiment are shown below, but the present invention is not limited to the following examples. In the following, the description of% indicates volume / volume% unless otherwise specified.
（実施例１）
ヒト血清からIgGを単離し、電気泳動後のゲルの内部でN型糖鎖を遊離させる処理を行った。一方、ヒト血清由来IgG標準試薬から溶液内でN型糖鎖を遊離させる処理を行った。以下では、溶液内での当該処理を溶液内消化、ゲルの内部での当該処理をゲル内消化と適宜呼ぶ。溶液内消化およびゲル内消化のそれぞれで得られたN型糖鎖を質量分析した。(Example 1)
IgG was isolated from human serum and treated to release N-type sugar chains inside the gel after electrophoresis. On the other hand, a treatment was performed to release the N-type sugar chain in the solution from the human serum-derived IgG standard reagent. Hereinafter, the treatment in the solution is appropriately referred to as in-solution digestion, and the treatment in the gel is appropriately referred to as in-gel digestion. Mass spectrometric analysis of N-type sugar chains obtained by in-solution digestion and in-gel digestion was performed.
（ゲル内消化）
＜ヒト血清からのIgGの単離＞
番号順に、以下の1-5の手順により、ヒト血清からIgGを単離した。
1. 25 μＬの担体Protein G Sepharose(GE Healthcare)に1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(Phosphate Buffered Salts; PBS, Takara Bio)を加えて軽く攪拌後、12,000 rpmで30 秒遠心して上清を除いた。これを三回繰り返した。
2. 上記担体にPBSを500 μＬ加え、次いで血清を5 μＬ加え、撹拌した。
3. 撹拌後の溶液を12,000 rpmで30 秒遠心して上清を除いた。
4. 遠心後の担体を含むペレットをPBSで洗浄後、12,000 rpmで30 秒遠心して上清を除いた。
5. ペレットを30 μＬの50 mM DTT 緩衝液に懸濁し、95℃で2分間熱処理を行い、12,000 rpmで30 秒遠心し、上清を、IgGを含む試料とした。(In-gel digestion)
<Isolation of IgG from human serum>
In numerical order, IgG was isolated from human serum by the following steps 1-5.
1. Add 1 mL of Phosphate Buffered Salts (PBS, Takara Bio) to 25 μL of carrier Protein G Sepharose (GE Healthcare), stir gently, and centrifuge at 12,000 rpm for 30 seconds to prepare the supernatant. Excluded. This was repeated three times.
2. 500 μL of PBS was added to the above carrier, then 5 μL of serum was added, and the mixture was stirred.
3. The stirred solution was centrifuged at 12,000 rpm for 30 seconds to remove the supernatant.
4. The pellet containing the carrier after centrifugation was washed with PBS and then centrifuged at 12,000 rpm for 30 seconds to remove the supernatant.
5. The pellet was suspended in 30 μL of 50 mM DTT buffer, heat-treated at 95 ° C. for 2 minutes, centrifuged at 12,000 rpm for 30 seconds, and the supernatant was used as a sample containing IgG.
＜電気泳動＞
IgGを含む試料を、番号順に、以下の1-4の手順で電気泳動に供した。
1. SDS-PAGE用ゲル(NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Gel, Invitrogen)にIgGを含む試料を25 μＬ導入し、200 V、50分間電気泳動を行った。
2. ゲルを水で洗浄した後、CBB(Nacalai tesque)により30分間染色し、水を用いて一夜脱染した。
3. ゲルからIgGの重鎖に対応するバンドに対応する部分を切り出し、1.0-1.5mmの幅に切り、チューブに配置した。
4. 脱染液(200mM 炭酸水素アンモニウム 40% ACN 水溶液)を用いてゲルの脱染を行い、SpeedVac(Thermo Fisher Scientific)を用いてゲルを乾燥させた。<Electrophoresis>
Samples containing IgG were subjected to electrophoresis in the order of numbers according to the following procedure 1-4.
1. 25 μL of a sample containing IgG was introduced into a gel for SDS-PAGE (NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Gel, Invitrogen), and electrophoresis was performed at 200 V for 50 minutes.
2. The gel was washed with water, stained with CBB (Nacalai tesque) for 30 minutes, and decontaminated with water overnight.
3. The part corresponding to the band corresponding to the heavy chain of IgG was cut out from the gel, cut into a width of 1.0-1.5 mm, and placed in a tube.
4. The gel was decontaminated with a decontamination solution (200 mM
＜糖鎖の切断処理＞
番号順に、以下の1-3の手順で糖鎖の切断処理を行った。
1. 乾燥させたゲルに、20 μＬ PNGase F(Sigma-Aldrich)を加え、37℃で10分間インキュベーションした後、さらに水を加えて一夜インキュベーションした。
2. ゲルに150 μＬの水を加え、氷上で超音波処理を行った。
3. 超音波処理後の溶液の液体成分を回収し、回収した糖鎖を含む溶液に対し、SpeedVacで乾固を行った。<Cut processing of sugar chains>
In numerical order, the sugar chains were cleaved according to the following steps 1-3.
1. To the dried gel, 20 μL PNGase F (Sigma-Aldrich) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 10 minutes, then water was further added and the mixture was incubated overnight.
2. 150 μL of water was added to the gel and sonicated on ice.
3. The liquid component of the solution after ultrasonic treatment was recovered, and the solution containing the recovered sugar chains was dried with SpeedVac.
＜脱塩精製＞
番号順に、以下の1-9の手順で糖鎖の脱塩精製を行った。Stage Tip Carbonは、エムポアディスクカーボン（3M製）を、直径約1 mmに切り抜き、200 μＬのチップに詰めたカーボンカラムである。
1. Stage Tip Carbon を遠心アダプターに通し、2.0 mL チューブに入れ遠心機にセットした。
2. Stage Tip Carbonにアセトニトリル（ACN） 100μＬを加え、1800 xgで2.0 min遠心し通液させた。
3. Stage Tip Carbonに80% ACN, 0.1% TFA 溶液を100 μＬ加え、1800 xgで2.0 min遠心し通液させた。これを二回繰り返した。
4. Stage Tip Carbonに水 100 μＬを加え、1800 xgで3.0 min遠心し通液させた。
5. 上記切断処理により得られた糖鎖を含む溶液100 μＬをStage Tip Carbonに加え、1800 xgで3.0 min遠心し通液させた。
6. 残りの糖鎖を含む溶液をStage Tip Carbonに加え、1800 xgで2.0 min遠心し通液させた。
7. Stage Tip Carbonに0.1% TFA 溶液 150 μＬを加え、1800 xgで4.0 min遠心し通液させた。これを三回繰り返した。
8. Stage Tip Carbonに溶出溶媒である60% ACN 0.1% TFA 溶液を20 μＬ加え、1800 xgで1.5 min遠心し溶出した。これを二回繰り返した。
9. 溶出液をSpeedVacを用いて乾固した。<Desalination and purification>
In numerical order, sugar chains were desalted and purified according to the following steps 1-9. Stage Tip Carbon is a carbon column made by cutting out Empore Disc Carbon (made by 3M) to a diameter of about 1 mm and packing it in a 200 μL chip.
1. Pass the Stage Tip Carbon through the centrifuge adapter, put it in a 2.0 mL tube, and set it in the centrifuge.
2. 100 μL of acetonitrile (ACN) was added to Stage Tip Carbon, and the mixture was centrifuged at 1800 xg for 2.0 min to pass the solution.
3. 100 μL of 80% ACN, 0.1% TFA solution was added to Stage Tip Carbon, and the solution was centrifuged at 1800 xg for 2.0 min. This was repeated twice.
4. 100 μL of water was added to Stage Tip Carbon, and the mixture was centrifuged at 1800 xg for 3.0 min and passed through.
5. 100 μL of the solution containing the sugar chain obtained by the above cutting treatment was added to Stage Tip Carbon, and the solution was centrifuged at 1800 xg for 3.0 min to pass the solution.
6. The solution containing the remaining sugar chains was added to Stage Tip Carbon and centrifuged at 1800 xg for 2.0 min to pass the solution.
7. 150 μL of 0.1% TFA solution was added to Stage Tip Carbon, and the solution was centrifuged at 1800 xg for 4.0 min. This was repeated three times.
8. 20 μL of 60% ACN 0.1% TFA solution, which is the elution solvent, was added to Stage Tip Carbon, and the mixture was centrifuged at 1800 xg for 1.5 min to elute. This was repeated twice.
9. The eluate was dried using SpeedVac.
＜誘導体化＞
脱塩精製後の糖鎖試料に対し、番号順に、以下の1-3の手順で糖鎖に含まれるシアル酸のメチルアミド化を行った。
1. ジメチルスルホキシド(DMSO)を溶媒として、1 M(Mはmol/L) メチルアミン塩酸塩(TCI)溶液を調製した。
2. N-メチルモルホリン(N-Methylmorpholine; NMM) 55 μＬと、945μＬDMSOとの混合溶媒を用いて、100 mM PyAOP(Sigma) 溶液を調製した。
3. 1.および2.で調製した溶液を1:1で混合した混合溶液を乾固させた糖鎖試料に加え、撹拌させながら1時間以上反応させた。<Derivatization>
The sugar chain samples after desalting and purification were methylamidated with sialic acid contained in the sugar chains in the order of numbers according to the following steps 1-3.
1. A 1 M (M is mol / L) methylamine hydrochloride (TCI) solution was prepared using dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent.
2. A 100 mM PyAOP (Sigma) solution was prepared using a mixed solvent of 55 μL of N-Methylmorpholine (NMM) and 945 μL DMSO.
3. The mixed solution prepared in 1 and 2 was mixed 1: 1 was added to the dried sugar chain sample, and the mixture was reacted for 1 hour or more with stirring.
＜アミド精製＞
誘導体化後の糖鎖試料を、番号順に、以下の1-9の手順でアミド精製に供した。アミドチップとしては、アミド担体Inertsil Amide（ジーエルサイエンス）と同じ担体が充填されたものを用いた。
1. アミドチップを遠心アダプターに通し、2.0 mL チューブに入れ遠心機にセットした。
2. アミドチップに水 100 μＬを加え、4000 xgで2.0 min遠心し通液させた。これを二回行った。
3. アミドチップに50% ACN 0.1 ％ TFA 水溶液 100 μＬを加え、4000 xgで2.0 min遠心し通液させた。
4. アミドチップに95% ACN 0.1 ％ TFA 水溶液 100 μＬを加え、4000 xgで1.0 min遠心し通液させた。
5. 誘導体化後の糖鎖を含む溶液にACNおよび2％ TFA水溶液を加え、全体で200μＬとした。
6. アミドチップに5.で得られた溶液を半量加え、4000 xgで2.0 min遠心した。これを二回繰り返した。
7. アミドチップに95% ACN 0.1% TFA 水溶液 150 μＬを加え4000 xgで2.0 min遠心し通液させた。これを二回行った。
8. アミドチップに50% ACN 0.1% TFA 水溶液 20 μＬを加え、4000 xgで1.0 min遠心し溶出させた。これを三回行った。
9. 溶出液をSpeedVacで乾固させた。<Amide purification>
The derivatized sugar chain samples were subjected to amide purification in the order of numbers according to the following procedures 1-9. As the amide chip, one packed with the same carrier as the amide carrier Inertsil Amide (GL Sciences) was used.
1. The amide tip was passed through a centrifuge adapter, placed in a 2.0 mL tube and set in a centrifuge.
2. 100 μL of water was added to the amide tip, and the mixture was centrifuged at 4000 xg for 2.0 min to pass the solution. I did this twice.
3. 100 μL of 50% ACN 0.1% TFA aqueous solution was added to the amide chip, and the mixture was centrifuged at 4000 xg for 2.0 min to pass the solution.
4. 100 μL of 95% ACN 0.1% TFA aqueous solution was added to the amide chip, and the mixture was centrifuged at 4000 xg for 1.0 min to pass the solution.
5. ACN and 2% TFA aqueous solution were added to the solution containing the derivatized sugar chains to make a total of 200 μL.
6. Half of the solution obtained in step 5 was added to the amide chip, and the mixture was centrifuged at 4000 xg for 2.0 min. This was repeated twice.
7. 150 μL of 95% ACN 0.1% TFA aqueous solution was added to the amide chip, and the mixture was centrifuged at 4000 xg for 2.0 min to pass the solution. I did this twice.
8. 20 μL of 50% ACN 0.1% TFA aqueous solution was added to the amide chip, and the mixture was centrifuged at 4000 xg for 1.0 min to elute. This was done three times.
9. The eluate was dried with SpeedVac.
＜カーボン精製＞
アミド精製後の糖鎖試料を、番号順に、以下の1-8の手順で精製を行った。
1. Stage Tip Carbon を遠心アダプターに通し、2.0 mL チューブに入れ遠心機にセットした。
2. Stage Tip CarbonにACN 50 μＬを加え、1800 xgで1.5 min遠心し通液させた。
3. Stage Tip Carbonに80% ACN, 0.1% TFA 溶液を50 μＬ加え、1800 xgで2.0 min遠心し通液させた。これを二回繰り返した。
4. Stage Tip Carbonに水 50 μＬを加え、1800 xgで3.0 min遠心し通液させた。
5. アミド精製後の糖鎖を0.1 % TFA 20 μＬに再溶解させて得た溶液をStage Tip Carbonに加え、1800 xgで2.0 min遠心し通液させた。
6. Stage Tip Carbonに0.1% TFA 溶液 50 μＬを加え、1800 xgで3.0 min遠心し通液させた。これを三回繰り返した。
7. Stage Tip Carbonに溶出溶媒である60% ACN 0.1% TFA 溶液を10 μＬ加え、1000 xgで1.0 min遠心し溶出した。これを二回繰り返した。
8. 溶出液をSpeedVacを用いて乾固した。<Carbon refining>
The sugar chain samples after amide purification were purified in numerical order according to the following procedures 1-8.
1. Pass the Stage Tip Carbon through the centrifuge adapter, put it in a 2.0 mL tube, and set it in the centrifuge.
2.
3. 50 μL of 80% ACN, 0.1% TFA solution was added to Stage Tip Carbon, and the solution was centrifuged at 1800 xg for 2.0 min. This was repeated twice.
4. 50 μL of water was added to Stage Tip Carbon, and the mixture was centrifuged at 1800 xg for 3.0 min and passed through.
5. The solution obtained by redissolving the amide-purified sugar chain in 20 μL of 0.1% TFA was added to Stage Tip Carbon, and the solution was centrifuged at 1800 xg for 2.0 min.
6. 50 μL of 0.1% TFA solution was added to Stage Tip Carbon, and the solution was centrifuged at 1800 xg for 3.0 min. This was repeated three times.
7. 10 μL of 60% ACN 0.1% TFA solution, which is the elution solvent, was added to Stage Tip Carbon, and the mixture was centrifuged at 1000 xg for 1.0 min to elute. This was repeated twice.
8. The eluate was dried using SpeedVac.
＜質量分析＞
乾固した糖鎖を10 μＬの水に再溶解させた。再溶解により得られた溶液 1 μＬをμフォーカスプレート（Hudson Surface Technology）に滴下した。滴下した溶液に、3AQ/CAをマトリックスとして50% ACN 溶液に溶解させた3AQ/CA 1 mM 硫酸アンモニウム溶液を0.5 μＬ加え、プレートごとヒートブロック上で75℃1.5時間反応させた（3AQで糖鎖の還元末端をラベル化した）。反応終了後、プレートを室温まで戻し、MALDI-四重極イオントラップ（Quadrupole Ion Trap）-飛行時間型（Time of Flight）質量分析計（MALDI-QIT-TOF-MS）(AXIMA-Resonance, Shimadzu/Kratos) を用い負イオンモードで測定した。<Mass spectrometry>
The dried sugar chains were redissolved in 10 μL of water. 1 μL of the solution obtained by redissolving was added dropwise to a μ focus plate (Hudson Surface Technology). To the dropped solution, 0.5 μL of 3AQ / CA 1 mM ammonium sulfate solution in which 3AQ / CA was dissolved in a 50% ACN solution as a matrix was added, and the whole plate was reacted at 75 ° C. for 1.5 hours (at 3AQ, sugar chains Labeled reducing ends). After completion of the reaction, the plate was returned to room temperature, and MALDI-Quadrupole Ion Trap-Time of Flight mass analyzer (MALDI-QIT-TOF-MS) (AXIMA-Resonance, Shimadzu / It was measured in negative ion mode using Kratos).
（溶液内消化）
番号順に、以下の1-10の手順で、上述の＜ヒト血清からのIgGの単離＞において調製されたIgGを含む試料を溶液内消化に供し、N型糖鎖を含む分析用試料を調製した。
1. ヒト血清由来IgG標準試薬(Sigma)、DTT、重炭酸アンモニウム、およびSDSを、それぞれ1 μｇ/μＬ、10 mM、20 mMおよび0.02%の濃度で含む溶液を調製した。
2. 1.で調製された溶液を熱処理(100℃ 3分)に供した後、氷上で冷却した。
3. 冷却後の溶液100 μＬに対して、16 μＬの0.5U/μＬ PNGase Fを加え、タッピングして37℃で一夜インキュベーションした。
4. インキュベーション後の溶液に300 μＬの水を加えた後、100 μＬずつStage Tip Carbonを用いて精製した。カーボンカラムの洗浄液は、水を用い、60 ％ アセトニトリル(ACN) 0.1 ％ TFA 溶液を用いて糖鎖試料を溶出した。
5. 糖鎖試料を含む溶出液をSpeedVacを用いて乾固した。
6. 乾固された糖鎖試料を、ゲル内消化の場合の上記誘導体化と同様の方法により誘導体化に供し、糖鎖に含まれるシアル酸をメチルアミド化した。
7. 誘導体化後の糖鎖試料を、ゲル内消化の場合の上記アミド精製と同様の方法によりアミド精製に供した後、SpeedVacにより乾固させた。
8. 乾固させた糖鎖試料を、Stage Tip Carbonを用いて精製した。カーボンカラムの洗浄液は、0.1 ％ TFA 水溶液を用い、60 ％ アセトニトリル(ACN) 0.1 ％ TFA 溶液を用いて糖鎖試料を溶出した。
9. 糖鎖試料を含む溶出液をSpeedVacを用いて乾固した。
10. 乾固させた糖鎖試料を、ゲル内消化の場合の上記質量分析と同様の方法により質量分析した。(Digestion in solution)
In numerical order, the IgG-containing sample prepared in <Isolation of IgG from human serum> described above is subjected to in-solution digestion in the following steps 1-10 to prepare an analytical sample containing an N-type sugar chain. did.
1. Solutions containing human serum-derived IgG standard reagent (Sigma), DTT, ammonium bicarbonate, and SDS at concentrations of 1 μg / μL, 10 mM, 20 mM, and 0.02%, respectively, were prepared.
2. The solution prepared in 1. was subjected to heat treatment (100 ° C for 3 minutes) and then cooled on ice.
3. To 100 μL of the cooled solution, 16 μL of 0.5 U / μL PNGase F was added, tapped and incubated overnight at 37 ° C.
4. After adding 300 μL of water to the solution after incubation, 100 μL of water was purified using Stage Tip Carbon. Water was used as the cleaning solution for the carbon column, and the sugar chain sample was eluted with a 60% acetonitrile (ACN) 0.1% TFA solution.
5. The eluate containing the sugar chain sample was dried using SpeedVac.
6. The dried sugar chain sample was subjected to derivatization by the same method as the above derivatization in the case of in-gel digestion, and the sialic acid contained in the sugar chain was methylamided.
7. The derivatized sugar chain sample was subjected to amide purification by the same method as the above-mentioned amide purification in the case of in-gel digestion, and then dried by SpeedVac.
8. The dried sugar chain sample was purified using Stage Tip Carbon. As the cleaning solution for the carbon column, a 0.1% TFA aqueous solution was used, and a 60% acetonitrile (ACN) 0.1% TFA solution was used to elute the sugar chain sample.
9. The eluate containing the sugar chain sample was dried using SpeedVac.
10. The dried sugar chain sample was mass-analyzed by the same method as the above-mentioned mass spectrometry in the case of in-gel digestion.
（結果）
図２は、溶液内消化（上段（ａ））およびゲル内消化（下段（ｂ））のそれぞれにより調製した糖鎖試料を質量分析して得られたマススペクトルを示す図である。以降の図におけるマススペクトルは、横軸に検出したイオンのm/z、縦軸に検出したイオンの検出量を示す。本実施例の条件ではシアル酸は中性化しており、3AQ/CAマトリックスを用いて負イオンモードで測定しているので、検出されているイオン種は糖鎖の硫酸付加体[M+HSO4]-である。(result)
FIG. 2 is a diagram showing mass spectra obtained by mass spectrometry of sugar chain samples prepared by in-solution digestion (upper stage (a)) and in-gel digestion (lower stage (b)). In the following figures, the mass spectrum shows the m / z of the detected ions on the horizontal axis and the detected amount of the detected ions on the vertical axis. Under the conditions of this example, sialic acid is neutralized and measured in the negative ion mode using a 3AQ / CA matrix. Therefore, the detected ion species is a sulfate adduct of sugar chain [M + HSO4]. ]- .
溶液内消化で切り出した糖鎖試料の質量分析では、IgGに一般的に付加しているN型糖鎖の硫酸付加体([M+HSO4]-)とこの硫酸付加体からの脱水生成物(-H2O)が観測された。硫酸付加は質量分析計のイオン化時に起こるものであり、実際に硫酸付加体が糖鎖試料内に存在しているわけではない。硫酸付加体からの脱水もイオン化時に起こるものである。In mass spectrometry of sugar chain samples cut out by in-solution digestion, the sulfated prism of N-type sugar chain ([M + HSO4 ]- ) generally added to IgG and the dehydrated product from this sulfated prism (-H2 O) was observed. Sulfation addition occurs during ionization of the mass spectrometer, and the sulfated prism is not actually present in the sugar chain sample. Dehydration from the sulfate adduct also occurs during ionization.
ゲル内消化で切り出した糖鎖試料の質量分析では、硫酸付加体に対して36 Da少ない分子量に対応するm/zにピークが付随していることが分かる。以降の図では、このピークを黒三角で示した。IgGのN型糖鎖の構造はほぼ明らかになっており、このようなm/zに対応する糖鎖が存在しているとは考え難く、溶液内消化の場合には観測されていないことから、分析用試料の調製のどこかの段階で生じたアーティファクトと考えられた。また、硫酸付加体[M+97]-に対してm/zが36少ないことから、[M+61]-として検出されるようにアニオン性の不純物が糖鎖に対して結合しているものと考えられた。尚、糖鎖として得られた試料をさらに脱塩精製するなどの精製を加えてもこのシグナルは抑制できなかったので、残存しているアニオン性の不純物がイオン化時に付加するといった質量分析特有の現象ではなく、分析用試料の調製の途中でアニオン性の物質が共有結合的に付加しているものと考えられた。Mass spectrometry of sugar chain samples excised by in-gel digestion reveals that a peak is attached to m / z corresponding to a molecular weight 36 Da less than that of the sulfate adduct. In the following figures, this peak is indicated by a black triangle. The structure of the N-type sugar chain of IgG has been almost clarified, and it is unlikely that a sugar chain corresponding to such m / z exists, and it has not been observed in the case of in-solution digestion. , It was considered to be an artifact that occurred at some stage in the preparation of the sample for analysis. In addition, since m / z is 36 less than that of the sulfate adduct [M + 97]- , anionic impurities are bound to the sugar chain so that it can be detected as[M + 61]-. It was considered. Since this signal could not be suppressed even if the sample obtained as a sugar chain was further purified by desalting, a phenomenon peculiar to mass spectrometry such that residual anionic impurities were added at the time of ionization. Rather, it was considered that anionic substances were covalently added during the preparation of the sample for analysis.
（実施例２）
上述の実施例１のゲル内消化の場合と略同様に、糖鎖を含む質量分析用試料を調製したが、以下のように調製の際の条件を異ならせた。第1の条件では、切断処理後の上記脱塩精製の7.における洗いを水で行った。第2の条件では、上記糖鎖の切断処理の3.において、回収した糖鎖を含む溶液に対し、SpeedVacで乾固しない程度に濃縮を行い、また、上記脱塩精製の7.における洗いを水で行った。第3の条件では、上記糖鎖の切断処理の3.において、回収した糖鎖を含む溶液に対し、SpeedVacで乾固しない程度に濃縮を行い、上記脱塩精製の7.における洗いは、実施例１と同様0.1% TFA 溶液を用いて行った。(Example 2)
A sample for mass spectrometry containing a sugar chain was prepared in substantially the same manner as in the case of in-gel digestion of Example 1 described above, but the conditions for preparation were different as follows. Under the first condition, the washing in step 7 of the above desalination purification after the cutting treatment was carried out with water. Under the second condition, in step 3 of the above-mentioned sugar chain cleavage treatment, the solution containing the recovered sugar chains is concentrated to the extent that it does not dry out with SpeedVac, and the washing in step 7 of the above desalination purification is performed. I went with water. Under the third condition, the solution containing the recovered sugar chain in 3. of the above-mentioned sugar chain cleavage treatment is concentrated to the extent that it does not dry out with SpeedVac, and the washing in 7. of the above desalting and purification is carried out. As in Example 1, a 0.1% TFA solution was used.
（結果）
図３は、第1の条件により調製した質量分析用試料（上段（ａ））、第2の条件により調製した質量分析用試料（中段（ｂ））、および、第3の条件により調製した質量分析用試料（下段（ｃ））のそれぞれを質量分析して得たマススペクトルである。脱塩精製の前に乾固を行った第1の条件では、付随イオンに対応するピークが観察された。切断処理後、脱塩精製の前に乾固を行わなかった第2の条件および第3の条件では、付随イオンに対応するピークが無いか、その強度が大きく減少していた。(result)
FIG. 3 shows a sample for mass spectrometry prepared under the first condition (upper stage (a)), a sample for mass spectrometry prepared under the second condition (middle stage (b)), and a mass prepared under the third condition. It is a mass spectrum obtained by mass spectrometry of each of the samples for analysis (lower stage (c)). Under the first condition of drying before desalting and purification, peaks corresponding to associated ions were observed. Under the second and third conditions, in which drying was not performed after the cutting treatment and before desalting and purification, there was no peak corresponding to the associated ion, or its intensity was greatly reduced.
図４の上段（ａ）、中段（ｂ）および下段（ｃ）は、それぞれ、図３における（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の各マススペクトルの拡大図である。図４では、第2の条件でも、付随イオンに対応する小さなピークが観察されたことがわかる。しかし、脱塩精製時の洗いを水ではなく0.1% TFA水溶液で行った第3の条件では、付随イオンの生成は略完全に抑制できた。 The upper (a), middle (b), and lower (c) of FIG. 4 are enlarged views of the mass spectra of (a), (b), and (c) in FIG. 3, respectively. In FIG. 4, it can be seen that even under the second condition, a small peak corresponding to the accompanying ion was observed. However, under the third condition in which washing during desalting and purification was performed with a 0.1% TFA aqueous solution instead of water, the formation of associated ions could be suppressed almost completely.
Claims (7)
Translated fromJapanese前記電気泳動により分離された前記糖鎖を含むゲル断片を切り出すことと、
切り出した前記ゲル断片から前記糖鎖を含む分子を液体に分散させ、前記分子を含む溶液を調製することと、
前記溶液に含まれる前記分子を乾固させずに分析用試料を調製するか、または、前記分子を乾固させずに前記電気泳動における不純物が除去される前処理に供することとを備える分析用試料の調製方法。The sample containing sugar chains is subjected to electrophoresis inside the gel, and
Cutting out the gel fragment containing the sugar chain separated by the electrophoresis and
Molecules containing the sugar chains are dispersed in a liquid from the cut out gel fragment to prepare a solution containing the molecules.
For analysis, which comprises preparing a sample for analysis without drying the molecules contained in the solution, or subjecting the molecules to a pretreatment for removing impurities in the electrophoresis without drying the molecules. Sample preparation method.
前記溶液を、乾固させない減圧濃縮に供した後、乾固させずに分析用試料を調製するか、または、乾固させずに前記前処理に供する分析用試料の調製方法。In the method for preparing an analytical sample according to claim 1,
A method for preparing an analytical sample which is subjected to vacuum concentration without drying, and then subjected to the pretreatment without drying.
前記分子は、遊離糖鎖であり、
前記電気泳動の後、前記糖鎖を切断する処理を行い、前記ゲルの内部において前記遊離糖鎖を生成することを備える分析用試料の調製方法。In the method for preparing an analytical sample according to claim 1 or 2.
The molecule is a free sugar chain and
A method for preparing an analytical sample, which comprises performing a treatment for cleaving the sugar chain after the electrophoresis to generate the free sugar chain inside the gel.
前記前処理として、脱塩が行われる、分析用試料の調製方法。In the method for preparing an analytical sample according to any one of claims 1 to 3,
A method for preparing a sample for analysis, in which desalting is performed as the pretreatment.
前記分析用試料は、質量分析用試料またはクロマトグラフィ−用試料である、分析用試料の調製方法。In the method for preparing an analytical sample according to any one of claims 1 to 4.
The method for preparing a sample for analysis, wherein the sample for analysis is a sample for mass spectrometry or a sample for chromatography.
調製した前記分析用試料を分析に供することとを備える分析方法。To prepare an analytical sample by the method for preparing an analytical sample according to any one of claims 1 to 4.
An analytical method comprising providing the prepared analytical sample for analysis.
前記分析は、質量分析およびクロマトグラフィーの少なくとも一つにより行われる分析方法。In the analysis method according to claim 6,
The analysis is an analytical method performed by at least one of mass spectrometry and chromatography.
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