本発明は、細胞培養容器に関する。本発明はまた、本発明の細胞培養容器を用いた細胞継代培養方法に関する。本発明はさらに、本発明の細胞培養容器を備えた細胞継代培養システムに関する。 The present invention relates to a cell culture container. The present invention also relates to a cell subculture method using the cell culture container of the present invention. The present invention further relates to a cell subculture system provided with the cell culture container of the present invention.
接着培養では、細胞は、酵素処理またはセルスクレイパーなどを用いて培養容器の接着面から剥離し、新鮮な培地を含む培養容器に継代される。多能性幹細胞は、単一細胞にまで解離させると死滅してしまうことが知られており（非特許文献１）、継代の際には、細胞塊の状態で継代することが必須となっている。そのため、多能性幹細胞の継代においては、培養容器から細胞を剥離する際には、多能性幹細胞をコロニーとして剥離し、ピペッティング等で適当な大きさの細胞塊に砕き、その後に新しい培養容器に播種している。 In the adhesion culture, the cells are detached from the adhesion surface of the culture container using an enzyme treatment or a cell scraper, and subcultured to a culture container containing a fresh medium. It is known that pluripotent stem cells are killed when dissociated into single cells (Non-patent Document 1), and it is essential to pass in the state of a cell mass during passage. It has become. Therefore, in the passage of pluripotent stem cells, when detaching the cells from the culture vessel, the pluripotent stem cells are detached as colonies, crushed into a cell mass of an appropriate size by pipetting, etc., and then new Seeded in culture vessel.
しかしながら、このような方法には、ピペッティングの技術によって細胞塊の大きさが変化し、また、得られる細胞塊のサイズが均等にはなりにくいという問題がある。継代の際のピペッティング操作により細胞塊のサイズがばらつくと、継代後の培養において生じるコロニーのサイズにもばらつきが生じ、細胞の品質管理の観点では万全とは言い切れない。また、各コロニーのサイズにばらつきが生じていると、あるコロニーが継代すべき一定サイズに達したとしても、他のコロニーでは細胞が十分に増殖できていないという問題が起こりうる。そして、培養中のコロニーサイズのばらつきは、細胞の生産効率の観点で悪影響を及ぼす。 However, such a method has a problem that the size of the cell mass is changed by the pipetting technique, and the size of the obtained cell mass is difficult to be uniform. If the size of the cell mass varies due to pipetting operation at the time of passage, the size of the colony generated in the culture after the passage also varies, which is not perfect from the viewpoint of cell quality control. Also, if the sizes of the colonies vary, there may arise a problem that even if a certain colony reaches a certain size to be passaged, the cells cannot be sufficiently grown in other colonies. And the dispersion | variation in the colony size during culture | cultivation has a bad influence from a viewpoint of the production efficiency of a cell.
ここで、多能性幹細胞から一定サイズの細胞集塊を得る手法が知られている（非特許文献２）。これらの方法で得られる細胞集塊は胚様体構造を有しているが、胚様体は、細胞を分化させるときに形成させるものである。特に、細胞に胚様体を形成させて培養すると細胞が分化を開始するが、この手法は、細胞の分化多能性を調べる一般的な方法の一つとして知られる。従って、非引用文献２などの方法では、得られた細胞集塊は、分化し易い状態に変化していると考えられている。また、胚様体の形成は、細胞を分化させるための前処理として有用であることも知られている（非特許文献２および３）。 Here, a technique for obtaining a cell cluster of a certain size from pluripotent stem cells is known (Non-Patent Document 2). The cell clump obtained by these methods has an embryoid body structure, and the embryoid body is formed when cells are differentiated. In particular, when an embryoid body is formed in a cell and cultured, the cell starts to differentiate. This technique is known as one of general methods for examining the pluripotency of a cell. Therefore, in the method such as Non-cited Document 2, it is considered that the obtained cell clump is changed to a state that is easily differentiated. It is also known that the formation of embryoid bodies is useful as a pretreatment for differentiating cells (Non-patent Documents 2 and 3).
一方、多能性幹細胞は、分化し易いことでも知られ、細胞の未分化状態を維持することは、多能性幹細胞の継代培養において最も重要な課題である。多能性幹細胞は特に、一度分化を開始すると未分化状態に戻すことが困難である。そのため、多能性幹細胞は、維持培養において、細胞を分化しやすい状態に変化させてはならない。 On the other hand, pluripotent stem cells are also known to be easily differentiated, and maintaining the undifferentiated state of cells is the most important issue in subculture of pluripotent stem cells. Pluripotent stem cells are particularly difficult to return to an undifferentiated state once differentiation has begun. Therefore, pluripotent stem cells should not be changed to a state in which cells are easily differentiated in maintenance culture.
大量の多能性幹細胞の維持培養のためには、できるだけ簡便な手段で多能性幹細胞を効率的かつ均質に継代できる方法を確立する必要があるが、未分化状態を維持させたまま多能性幹細胞を均質に継代培養する方法は確立されていない。大量の多能性幹細胞の維持培養のためにはまた、全自動化に適した多能性幹細胞の継代培養の方法を確立する必要があるが、そのような方法も知られていない。 For the maintenance culture of a large number of pluripotent stem cells, it is necessary to establish a method that allows efficient and homogeneous passage of pluripotent stem cells by the simplest possible means. A method for homogeneously subculturing competent stem cells has not been established. For maintenance culture of a large amount of pluripotent stem cells, it is necessary to establish a method for subculturing pluripotent stem cells suitable for full automation, but such a method is not known.
本発明は、細胞、特に多能性幹細胞の効率的かつ均質な継代培養のための細胞培養容器、その細胞培養容器を用いた細胞の継代培養方法、および、その培養容器を用いた細胞継代培養システムを提供する。 The present invention relates to a cell culture container for efficient and homogeneous subculture of cells, particularly pluripotent stem cells, a cell subculture method using the cell culture container, and a cell using the culture container A subculture system is provided.
（１）細胞培養容器であって、
一方の基板と、
一方の基板に対向して配置された他方の基板と、
一方の基板と他方の基板との間に介在されて、一方の基板および他方の基板のうち少なくとも一方により形成される細胞接着面を持つ培養室と流路とを形成する側壁と、
を備え、
一方の基板は伸縮性材料からなる、
細胞培養容器。
（２）一方の基板の内壁は細胞非接着性を持ち、他方の基板の内壁は細胞接着性を持つ、上記（１）に記載の細胞培養容器。
（３）伸縮性材料が、ポリジメチルシロキサンまたはシリコーンである、上記（１）または（２）に記載の細胞培養容器。
（４）一方の基板が、０．０１ｍｍ〜０．３ｍｍの厚みを有する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞培養容器。
（５）細胞継代培養システムであって、
上記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養容器と、
細胞培養容器の一方の基板の外方に設けられ、一方の基板に対向する対向面に凹凸形状を有する囲い体とを備え、
囲い体の対向面に真空源が接続され、この真空源を動作させることにより囲い体の凹凸形状を有する対向面を真空引きして一方の基板を囲い体の凹凸形状を有する対向面に吸着させて一方の基板に凹凸形状を形成させる、
細胞継代培養システム。
（６）真空源は、対向面の各凹状部底面に接続されている、上記（５）に記載の継代培養システム。
（７）細胞継代培養システムであって、
上記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養容器と、
細胞培養容器の一方の基板の外方に設けられ、一方の基板に対向する対向面に複数の突起をもつ囲い体とを備え、
囲い体の対向面に真空源が接続され、この真空源を動作させることにより囲い体の凹凸形状を有する対向面を真空引きして一方の基板に突起により凹凸形状を形成させる、
細胞継代培養システム。
（８）細胞培養容器であって、
一方の基板と、
一方の基板に対向して配置された他方の基板と、
一方の基板と他方の基板との間に介在されて、一方の基板および他方の基板のうち少なくとも一方により形成される細胞接着面を持つ培養室と流路とを形成する側壁と、
を備え、
一方の基板は、複数の開口を形成する硬質フレーム部と、フレームの各開口内に延びる伸縮部からなり、
一方の基板に外方から陰圧を付与した場合、一方の基板のフレーム内の伸縮部が伸びて、一方の基板に凹凸形状を形成する、細胞培養容器。
（９）細胞培養容器であって、
一方の基板と、
一方の基板に対向して配置された他方の基板と、
一方の基板と他方の基板との間に介在されて、一方の基板および他方の基板のうち少なくとも一方により形成される細胞接着面を持つ培養室と流路とを形成する側壁と、
を備え、
一方の基板は、複数の硬質部と、硬質部分間に延びる伸縮部とからなり、
一方の基板に外方から陰圧を付与した場合、一方の基板の伸縮部が伸びて、一方の基板に凹凸形状を形成する、細胞培養容器。
（１０）細胞培養システムであって、
上記（８）または（９）に記載の細胞培養容器と、
細胞培養容器の一方の基板の外方に、一方の基板との間に真空室を形成する囲い体とを備え、
真空室に真空源が接続され、この真空源を動作させることにより真空室を真空引きすることにより一方の基板に凹凸形状が形成される、
細胞継代培養システム。
（１１）上記（５）〜（７）および（１０）のいずれかに記載の細胞継代培養システムであって、囲い体は、細胞培養容器に対して取り外し自在となっており、選択された所望の囲い体を細胞培養容器に対して取り付けることができる、
細胞継代培養システム。
（１２）上記（５）〜（７）、（１０）および（１１）のいずれかに記載の細胞継代培養システムであって、
細胞培養容器と囲い体を、真空室を形成するように接触させた状態で保持する固定具をさらに備え、
固定具は、回転機構に連結され、この回転機構により細胞培養容器と囲い体を回転させて天地反転させる、
細胞継代培養システム。(1) a cell culture container,
One substrate,
The other substrate disposed opposite the one substrate;
A side wall that is interposed between one substrate and the other substrate to form a culture chamber having a cell adhesion surface formed by at least one of the one substrate and the other substrate and a flow path;
With
One substrate is made of stretchable material,
Cell culture container.
(2) The cell culture container according to (1) above, wherein the inner wall of one substrate has cell non-adhesiveness and the inner wall of the other substrate has cell adhesiveness.
(3) The cell culture container according to (1) or (2) above, wherein the stretchable material is polydimethylsiloxane or silicone.
(4) The cell culture container according to any one of (1) to (3), wherein one substrate has a thickness of 0.01 mm to 0.3 mm.
(5) a cell subculture system,
The cell culture container according to any one of the above (1) to (4);
Provided outside the one substrate of the cell culture container, and having an enclosure having a concavo-convex shape on the facing surface facing the one substrate,
A vacuum source is connected to the opposing surface of the enclosure, and by operating this vacuum source, the opposing surface having the uneven shape of the enclosure is evacuated to adsorb one substrate to the opposing surface having the uneven shape of the enclosure. To form an uneven shape on one of the substrates,
Cell subculture system.
(6) The subculture system according to (5), wherein the vacuum source is connected to the bottom surface of each concave portion on the opposing surface.
(7) A cell subculture system,
The cell culture container according to any one of the above (1) to (4);
Provided outside the one substrate of the cell culture container, and an enclosure having a plurality of protrusions on the facing surface facing the one substrate,
A vacuum source is connected to the opposing surface of the enclosure, and by operating this vacuum source, the opposing surface having the uneven shape of the enclosure is evacuated to form an uneven shape with protrusions on one substrate.
Cell subculture system.
(8) a cell culture container,
One substrate,
The other substrate disposed opposite the one substrate;
A side wall that is interposed between one substrate and the other substrate to form a culture chamber having a cell adhesion surface formed by at least one of the one substrate and the other substrate and a flow path;
With
One substrate consists of a rigid frame part that forms a plurality of openings, and a stretchable part that extends into each opening of the frame,
A cell culture container in which when a negative pressure is applied to one substrate from the outside, an expansion / contraction portion in the frame of one substrate extends to form an uneven shape on one substrate.
(9) a cell culture container,
One substrate,
The other substrate disposed opposite the one substrate;
A side wall that is interposed between one substrate and the other substrate to form a culture chamber having a cell adhesion surface formed by at least one of the one substrate and the other substrate and a flow path;
With
One substrate is composed of a plurality of hard portions and a stretchable portion extending between the hard portions,
A cell culture container in which, when a negative pressure is applied to one substrate from the outside, a stretchable portion of one substrate extends to form an uneven shape on one substrate.
(10) A cell culture system,
The cell culture container according to (8) or (9) above,
The outside of the one substrate of the cell culture container, and a enclosure that forms a vacuum chamber between the one substrate,
A vacuum source is connected to the vacuum chamber, and by operating this vacuum source, the vacuum chamber is evacuated to form an uneven shape on one substrate.
Cell subculture system.
(11) The cell subculture system according to any one of (5) to (7) and (10) above, wherein the enclosure is removable from the cell culture container and selected A desired enclosure can be attached to the cell culture vessel,
Cell subculture system.
(12) The cell subculture system according to any one of (5) to (7), (10) and (11) above,
A fixture that holds the cell culture vessel and the enclosure in contact with each other so as to form a vacuum chamber;
The fixture is connected to a rotating mechanism, and the rotating mechanism rotates the cell culture container and the enclosure to invert the ground.
Cell subculture system.
（１３）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養容器の一方の基板に凹凸形状を形成させる方法であって、
上記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養容器を準備することと、
一方の基板と、一方の基板に対向する対向面に凹凸形状を有する囲い体とを、一方の基板と囲い体との間に真空室を形成するよう接触させることと、
真空室を真空引きして一方の基板を囲い体の凹凸形状を有する対向面に吸着させて一方の基板に凹凸形状を形成させること
を含んでなる、方法。
（１４）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞培養容器の一方の基板に凹凸形状を形成させる方法であって、
一方の基板と、一方の基板に対向する対向面に複数の突起をもつ囲い体とを、一方の基板と囲い体との間に真空室を形成させるように接触させることと、
真空室を真空引きして一方の基板に突起により凹凸形状を形成させること
を含んでなる、方法。
（１５）複数の突起は、平面上、格子形状の各交点に配置されている、上記（１４）に記載の方法。
（１６）各突起は、Ｒ０．４ｍｍ〜０．６ｍｍの丸み形状の先端を有する円柱体からなる、上記（１５）に記載の方法。
（１７）各突起は、１ｍｍ〜５ｍｍの間隔で配置された、上記（１５）または（１６）に記載の方法。
（１８）各突起は、配置間隔以上の高さを有する、上記（１５）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９）上記（１）〜（４）、（８）および（９）のいずれかに記載の細胞培養容器を用いた細胞の継代方法であって、
（Ａ）継代時に細胞を分散させる工程と、
（Ｂ）分散させた細胞を細胞培養容器の培養室に注入する工程と、
（Ｃ）請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法を用いて、細胞培養容器の培養室に面する一方の基板に凹凸形状を形成させる工程と、
（Ｄ）一方の基板に形成させた凹凸形状の凹みに播種された細胞に細胞集塊を形成させる工程とを含んでなる、方法。
（２０）（Ｅ）細胞培養容器を天地反転させて、形成させた細胞集塊を他方の基板に播種する工程
をさらに含んでなる上記（１９）に記載の方法。
（２１）工程（Ｅ）において、
真空室の真空引きを解除し一方の基板に形成した凹凸形状を解消して、工程（Ｄ）で形成させた細胞集塊を一方の基板から剥離させるか、
真空室に気体を供給して一方の基板を培養室内に押し込むことにより工程（Ｄ）で形成させた細胞集塊を一方の基板から剥離させるか、または、
真空室の真空引きの操作と真空室に気体を供給する操作を繰り返して一方の基板に振動を与えることにより、工程（Ｄ）で形成させた細胞集塊を一方の基板から剥離させる、
上記（２０）に記載の方法。
（２２）上記（１）〜（４）、（８）および（９）のいずれかに記載の細胞培養容器を用いた細胞の継代培養方法であって、
（Ａ）継代時に細胞を分散させる工程と、
（Ｂ）分散させた細胞を細胞培養容器の培養室に注入する工程と、
（Ｃ）請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法を用いて、細胞培養容器の培養室に面する一方の基板に凹凸形状を形成させる工程と、
（Ｄ）一方の基板に形成させた凹凸形状の凹みに播種された細胞に細胞集塊を形成させる工程と、
（Ｅ）細胞培養容器を天地反転させて、形成させた細胞集塊を他方の基板に播種する工程および（Ｅ’）細胞を培養する工程、または、（Ｆ）工程（Ｄ）で形成させた細胞集塊を一方の基板を細胞接着面として用いて培養する工程と
を含んでなる、方法。
（２３）閉鎖系の細胞培養容器であって、
伸縮性材料からなる第一の面と、
前記第一の面に対向して配置された第二の面と、
前記第一の面と前記第二の面との間に配置された側壁と、
前記第一の面、前記第二の面、および、前記側壁によって画設された前記溶液の流路を兼ねる培養室と、
溶液の注入口と、
を備えた閉鎖系の細胞培養容器。
（２４）前記第一の面は、細胞集塊を形成するように凹状に変形可能であることを特徴とする上記（２３）に記載の閉鎖系の細胞培養容器。
（２５）前記第二の面は、細胞接着性を持つことを特徴とする上記（２３）または（２４）に記載の閉鎖系の細胞培養容器。(13) A method of forming an uneven shape on one substrate of the cell culture container according to any one of (1) to (4) above,
Preparing the cell culture container according to any one of (1) to (4) above;
Contacting one substrate and an enclosure having a concavo-convex shape on the opposite surface facing the one substrate so as to form a vacuum chamber between the one substrate and the enclosure;
A method comprising evacuating a vacuum chamber and adsorbing one substrate to an opposing surface having an uneven shape of a surrounding body to form the uneven shape on the one substrate.
(14) A method of forming an uneven shape on one substrate of the cell culture container according to any one of (1) to (4) above,
Contacting one substrate and an enclosure having a plurality of protrusions on an opposing surface facing the one substrate so as to form a vacuum chamber between the one substrate and the enclosure;
Evacuating the vacuum chamber to form a concavo-convex shape on one substrate by protrusions.
(15) The method according to (14), wherein the plurality of protrusions are arranged at intersections of the lattice shape on a plane.
(16) The method according to (15) above, wherein each protrusion is formed of a cylindrical body having a rounded tip having a radius of R 0.4 mm to 0.6 mm.
(17) The method according to (15) or (16), wherein the protrusions are arranged at intervals of 1 mm to 5 mm.
(18) The method according to any one of (15) to (17), wherein each protrusion has a height equal to or greater than an arrangement interval.
(19) A cell passage method using the cell culture vessel according to any one of (1) to (4), (8) and (9) above,
(A) a step of dispersing cells during passage;
(B) injecting the dispersed cells into the culture chamber of the cell culture container;
(C) using the method according to any one of claims 13 to 18, a step of forming an uneven shape on one substrate facing the culture chamber of the cell culture container;
(D) forming a cell clump on the cells seeded in the concavo-convex recess formed on one substrate.
(20) The method according to (19), further comprising the step of (E) inverting the cell culture container upside down and seeding the formed cell mass on the other substrate.
(21) In step (E),
Release the evacuation of the vacuum chamber to eliminate the uneven shape formed on one substrate, and peel off the cell conglomerate formed in step (D) from one substrate,
Supplying a gas to the vacuum chamber and pushing one substrate into the culture chamber to peel off the cell conglomerate formed in step (D) from one substrate, or
By repeating the operation of evacuation of the vacuum chamber and the operation of supplying gas to the vacuum chamber and applying vibration to one of the substrates, the cell conglomerate formed in the step (D) is peeled from the one substrate.
The method according to (20) above.
(22) A cell subculture method using the cell culture vessel according to any one of (1) to (4), (8) and (9) above,
(A) a step of dispersing cells during passage;
(B) injecting the dispersed cells into the culture chamber of the cell culture container;
(C) using the method according to any one of claims 13 to 18, a step of forming an uneven shape on one substrate facing the culture chamber of the cell culture container;
(D) forming a cell conglomerate on cells seeded in a concave-convex recess formed on one substrate;
(E) The cell culture container is turned upside down, and the formed cell conglomeration is seeded on the other substrate and (E ′) the step of culturing the cells, or (F) formed in step (D). Culturing the cell agglomeration using one substrate as a cell adhesion surface.
(23) a closed cell culture vessel,
A first surface made of elastic material;
A second surface disposed opposite the first surface;
A sidewall disposed between the first surface and the second surface;
A culture chamber serving also as a flow path of the solution defined by the first surface, the second surface, and the side wall;
A solution inlet;
A closed cell culture vessel equipped with
(24) The closed-system cell culture container according to (23), wherein the first surface is deformable into a concave shape so as to form a cell clump.
(25) The closed cell culture vessel according to (23) or (24) above, wherein the second surface has cell adhesiveness.
第一の実施形態
以下、第一の実施形態について説明する。First Embodiment Hereinafter, a first embodiment will be described.
（細胞培養容器）
本発明の第一の実施形態における細胞培養容器は、浮遊細胞または接着細胞用の細胞培養容器である。接着細胞としては特に限定されないが、多能性幹細胞、幹細胞、前駆細胞、体細胞および生殖細胞などの接着細胞が挙げられ、好ましくは、多能性幹細胞（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）および誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である。浮遊細胞としては、血球系細胞、好ましくは、Ｔ細胞およびＢ細胞が挙げられる。(Cell culture vessel)
The cell culture container in the first embodiment of the present invention is a cell culture container for floating cells or adherent cells. Although it does not specifically limit as an adherent cell, Adherent cells, such as a pluripotent stem cell, a stem cell, a progenitor cell, a somatic cell, and a germ cell, are mentioned, Preferably, a pluripotent stem cell (Pluripotent stem cell), for example, an embryonic stem cell (ES cells) and inducible pluripotent stem cells (iPS cells). Suspension cells include blood cells, preferably T cells and B cells.
本発明の第一の実施形態における細胞培養容器１０は、図１〜３に示すように、一方の基板１５と、一方の基板に対向して配置された他方の基板２０と、一方の基板と他方の基板との間に介在されて、培養室１７と流路１３とを形成する側壁１６とを備えている。また、培養室１７に接する一方の基板１５および他方の基板２０のうち少なくとも一方、例えば、他方の基板２０が細胞接着面２０ａを形成する。一方の基板１５は、少なくとも培養室１７の平面形状に対応する領域（すなわち、培養室１７に面した領域）では伸縮性材料からなる。 As shown in FIGS. 1 to 3, the cell culture container 10 according to the first embodiment of the present invention includes one substrate 15, the other substrate 20 disposed to face the one substrate, and the one substrate. A side wall 16 that forms a culture chamber 17 and a flow path 13 is provided between the other substrate. Further, at least one of the one substrate 15 and the other substrate 20 in contact with the culture chamber 17, for example, the other substrate 20 forms the cell adhesion surface 20 a. One substrate 15 is made of a stretchable material at least in a region corresponding to the planar shape of the culture chamber 17 (that is, a region facing the culture chamber 17).
細胞培養容器１０は、図１〜３に示すように、細胞培養容器１０内に複数の培養室１７を備えていてもよいが、特に限定されず、培養室１７は１つのみであってもよい。細胞培養容器１０が培養室１７を複数備えている場合には、それぞれの培養室１７は図１に示されるように流路１３によって連結されていてもよいが、特に限定されず、培養室がそれぞれ独立して入口１１および出口１２を備えていてもよい。ここで、入口１１とは、送液される溶液の入口であり、出口１２とは送液される溶液の出口である。また、入口１１と出口１２は必ずしも別々に設けられている必要はなく、一体として設けられていてもよい。 As shown in FIGS. 1 to 3, the cell culture container 10 may include a plurality of culture chambers 17 in the cell culture container 10, but is not particularly limited, and there may be only one culture chamber 17. Good. When the cell culture container 10 includes a plurality of culture chambers 17, each culture chamber 17 may be connected by a flow path 13 as shown in FIG. 1, but is not particularly limited. The inlet 11 and the outlet 12 may be provided independently of each other. Here, the inlet 11 is an inlet of the solution to be sent, and the outlet 12 is an outlet of the solution to be sent. Moreover, the inlet 11 and the outlet 12 do not necessarily need to be provided separately, and may be provided integrally.
培養室１７は、対向して設置された２つの流路１３と接続され、一方の流路１３から溶液が導入され、他方の流路１３から溶液が廃液される。このようにすることで、培養室１７内において送液される溶液に一方向性の安定した流れを生じさせることができる。細胞培養容器１０が複数の培養室１７を備える場合には、送液される溶液の流れが一方向性を示すように、例えば、図１のような流路配置で培養室１７および流路１３を配置することができる。一方向性の安定した流れは、細胞懸濁液を培養容器内に均一に播種する上で、または細胞培養液を均一に灌流する上で好ましい。 The culture chamber 17 is connected to the two flow paths 13 installed opposite to each other, and the solution is introduced from one flow path 13 and the solution is discharged from the other flow path 13. By doing so, a unidirectional and stable flow can be generated in the solution fed in the culture chamber 17. When the cell culture vessel 10 includes a plurality of culture chambers 17, for example, the culture chamber 17 and the flow channel 13 are arranged in a flow channel arrangement as shown in FIG. Can be arranged. Unidirectional and stable flow is preferable for uniformly seeding the cell suspension in the culture vessel or for uniformly perfusing the cell culture medium.
細胞培養容器１０の一方の基板１５は、伸縮性材料で形成される。これにより、後述するように、一方の基板１５に凹凸形状を形成させたり、凹凸形状を解消させたりすることが可能である。一方の基板１５は、顕微鏡観察を容易にする観点で透明であることが好ましく、無色透明であることがより好ましい。このような伸縮性材料としては、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）およびシリコーンが挙げられる。 One substrate 15 of the cell culture vessel 10 is formed of a stretchable material. Thereby, as will be described later, it is possible to form a concavo-convex shape on one substrate 15 or to eliminate the concavo-convex shape. One substrate 15 is preferably transparent from the viewpoint of facilitating microscopic observation, and more preferably colorless and transparent. Examples of such stretchable materials include polydimethylsiloxane (PDMS) and silicone.
一方の基板１５は、特に限定されないが、例えば、０．０１ｍｍ〜０．３ｍｍ、０．０５ｍｍ〜０．１ｍｍの厚みを有する。また、一方の基板１５の硬度は、タイプＡデュロメーター硬度で２０〜６５、好ましくは２０〜３０とすることができる。 Although one board | substrate 15 is not specifically limited, For example, it has the thickness of 0.01 mm-0.3 mm, 0.05 mm-0.1 mm. Moreover, the hardness of one board | substrate 15 can be 20-65 in the type A durometer hardness, Preferably it can be 20-30.
細胞接着面以外の培養室１７の内面、例えば、細胞接着面２０ａ以外の培養室１７の内面は、細胞非接着性であることが好ましく、細胞の接着を防ぐ目的で、細胞非接着コーティングがなされていてもよい。培養室１７と接する領域において細胞の接着を防ぐことにより、例えば、後述するように細胞集塊を形成した後に、細胞集塊を効率良く一方の基板１５から剥離することができる。細胞非接着コーティングは、細胞非接着性を有するコーティングであれば特に限定されないが、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース類；ポリエチレンオキサイド；カルボキシビニルポリマー；ポリビニルピロリドン；ポリエチレングリコール；ポリ乳酸；ポリアクリルアミド、ポリＮ−イソプロピルアクリルアミド等のポリアミド；キチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、デンプン、ペクチン、カラギーナン、グアーガム、アラビアゴム、デキストラン等の多糖類、およびこれらの細胞非接着性の誘導体によるコーティングが挙げられる。透明性が高く視認性がよいという観点では、ポリエチレングリコールが好ましい。 The inner surface of the culture chamber 17 other than the cell adhesion surface, for example, the inner surface of the culture chamber 17 other than the cell adhesion surface 20a is preferably non-cell-adhesive and is coated with a cell non-adhesion coating for the purpose of preventing cell adhesion. It may be. By preventing cell adhesion in a region in contact with the culture chamber 17, for example, after forming a cell clump as described later, the cell clump can be efficiently peeled from one substrate 15. The cell non-adhesive coating is not particularly limited as long as it is a cell non-adhesive coating, but celluloses such as methylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose; polyethylene oxide; carboxyvinyl polymer; polyvinyl Polypyrrole; Polyethylene glycol; Polylactic acid; Polyamides such as polyacrylamide and polyN-isopropylacrylamide; Polysaccharides such as chitin, chitosan, hyaluronic acid, alginic acid, starch, pectin, carrageenan, guar gum, gum arabic, dextran, and cells thereof A coating with a non-adhesive derivative is mentioned. From the viewpoint of high transparency and good visibility, polyethylene glycol is preferred.
他方の基板２０の細胞接着面２０ａは、細胞接着性であることが好ましく、細胞接着性を付与する目的で細胞接着性コーティングがなされていてもよい。例えば、マトリゲル（商標）（ＢＤファルコン社製）などの細胞接着性の基底膜マトリックスを用いると接着面に細胞接着性コーティングを施すことができる。コーティングは、当業者に周知の方法を用いて行うことができ、市販されているコーティング剤を用いる場合には製造者マニュアルの記載に従ってコーティングすることができる。 The cell adhesion surface 20a of the other substrate 20 is preferably cell adhesion, and may be coated with a cell adhesion coating for the purpose of imparting cell adhesion. For example, when a cell-adhesive basement membrane matrix such as Matrigel (trademark) (manufactured by BD Falcon) is used, a cell-adhesive coating can be applied to the adhesive surface. The coating can be performed by a method well known to those skilled in the art. When a commercially available coating agent is used, it can be coated according to the description in the manufacturer's manual.
また、他方の基板２０は、顕微鏡観察を容易にする観点で透明であることが好ましい。他方の基板２０は、特に限定されないが、培養室内の酸素濃度および二酸化炭素濃度を保つ観点から、ガス透過膜であることが好ましく、例えば、細胞培養用のガス透過膜として細胞培養用にポリスチレン製ガス透過膜が市販されている。ガス透過膜は、培養室１７内の培地に酸素などを供給する上で重要な役割を果たす。また、ガス透過膜を用いると、超音波振動により効果的に細胞を膜表面から剥離できるため、細胞の剥離方法に選択肢が増える点で有利である。他方の基板２０は、非伸縮性材料で形成されていてもよいが、一方の基板１５と同様に伸縮性材料で形成されていてもよい。このように一方の基板１５および他方の基板２０の両面ともを伸縮性材料とすると、一方の基板１５が凹凸形状を形成することによる培養室１７の容積変動を、他方の基板２０が伸縮することにより吸収することができる。これにより、ゴム栓等を用いて出口および入口を封止してから一方の基板１５に凹凸を形成させても、出口および入口からの液漏れリスクを抑制できる。 The other substrate 20 is preferably transparent from the viewpoint of facilitating microscopic observation. The other substrate 20 is not particularly limited, but is preferably a gas permeable membrane from the viewpoint of maintaining the oxygen concentration and carbon dioxide concentration in the culture chamber. For example, it is made of polystyrene for cell culture as a gas permeable membrane for cell culture. Gas permeable membranes are commercially available. The gas permeable membrane plays an important role in supplying oxygen or the like to the culture medium in the culture chamber 17. In addition, the use of a gas permeable membrane is advantageous in that the cells can be effectively peeled off from the membrane surface by ultrasonic vibration, so that the choice of the method for peeling the cells increases. The other substrate 20 may be formed of a non-stretchable material, but may be formed of a stretchable material like the one substrate 15. As described above, when both surfaces of one substrate 15 and the other substrate 20 are made of an elastic material, the other substrate 20 expands and contracts due to the volume fluctuation of the culture chamber 17 caused by the formation of the uneven shape of the one substrate 15. Can be absorbed. Thereby, even if the outlet and the inlet are sealed using a rubber plug or the like and the unevenness is formed on one of the substrates 15, the risk of liquid leakage from the outlet and the inlet can be suppressed.
細胞培養容器１０の側壁１６は、特に限定されないが、例えば、プラスチック製とすることができ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、または、アクリルとすることができる。他方の基板２０が伸縮性でない場合、他方の基板２０は、例えば、プラスチック製とすることができ、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、または、アクリルとすることができる。 The side wall 16 of the cell culture vessel 10 is not particularly limited, but can be made of, for example, plastic, and can be made of, for example, polystyrene, polypropylene, polycarbonate, or acrylic. If the other substrate 20 is not stretchable, the other substrate 20 can be made of, for example, plastic, for example, polystyrene, polypropylene, polycarbonate, or acrylic.
細胞培養容器１０の一方の基板１５は、伸縮性材料から形成され、後述するように様々な凹凸形状を形成させることができ、また、容易に解消させることができる。これにより、細胞培養容器１０は、必要なときにだけ凹凸形状を形成させることができ、培養細胞の観察時には凹凸形状を解消させることで高い視認性を確保することができる。凹凸形状を解消させることで、培地、試薬および試料を節約することができる。 One substrate 15 of the cell culture vessel 10 is made of a stretchable material, and can be formed with various uneven shapes as described later, and can be easily eliminated. Thereby, the cell culture container 10 can form an uneven shape only when necessary, and high visibility can be secured by eliminating the uneven shape when observing the cultured cells. By eliminating the uneven shape, it is possible to save the medium, reagent and sample.
（細胞継代培養システム）
次に、図１〜４により、第一の実施形態における細胞継代培養システムについて説明する。(Cell subculture system)
Next, the cell subculture system in the first embodiment will be described with reference to FIGS.
本発明の第一の実施形態における細胞継代培養システムは、図４に示すように、本発明の第一の実施形態における細胞培養容器１０（図１〜３参照）と、細胞培養容器１０の一方の基板１５の外方に設けられ、一方の基板１５に対向する対向面に凹凸形状３２を有する囲い体３０とを備えている。第一の実施形態における細胞継代培養システムでは、囲い体の対向面に真空源９２が接続され、この真空源９２を動作させることにより囲い体３０の凹凸形状３２を有する対向面を真空引きして一方の基板１５を囲い体３０の凹凸形状３２を有する対向面に吸着させ、一方の基板１５に凹凸形状３４を形成させることができる。真空源９２は、好ましくは、対向面の各凹状部底面３３に接続する。 As shown in FIG. 4, the cell subculture system in the first embodiment of the present invention includes a cell culture container 10 (see FIGS. 1 to 3) and a cell culture container 10 in the first embodiment of the present invention. An enclosure 30 provided on the outer side of one substrate 15 and having a concavo-convex shape 32 on an opposing surface facing the one substrate 15 is provided. In the cell subculture system in the first embodiment, a vacuum source 92 is connected to the opposing surface of the enclosure, and the opposing surface having the concavo-convex shape 32 of the enclosure 30 is evacuated by operating the vacuum source 92. Thus, the one substrate 15 can be adsorbed to the opposing surface of the enclosure 30 having the concavo-convex shape 32, and the concavo-convex shape 34 can be formed on the one substrate 15. The vacuum source 92 is preferably connected to the bottom surface 33 of each concave portion on the opposing surface.
すなわち、一方の基板に形成される凹凸形状３４は、一方の基板１５と、一方の基板に対応する対向面に凹凸形状３２を有する囲い体３０とを、一方の基板と囲い体との間に真空室３５を形成させるように接触させ、真空室３５を真空引きすることにより、一方の基板１５を囲い体３０の凹凸形状３２を有する対向面に吸着させて形成される形状であり、凹凸形状３２に対応する形状である。一方の基板に形成される凹凸形状３４は、細胞集塊を形成させるために用いるマイクロウェルとして用いることができる。 That is, the concavo-convex shape 34 formed on one substrate includes one substrate 15 and the enclosure 30 having the concavo-convex shape 32 on the opposing surface corresponding to the one substrate, between the one substrate and the enclosure. It is a shape formed by contacting the substrate 15 so as to form a vacuum chamber 35 and evacuating the vacuum chamber 35 so that one substrate 15 is adsorbed to the opposing surface having the concavo-convex shape 32 of the surrounding body 30. The shape corresponds to 32. The concavo-convex shape 34 formed on one substrate can be used as a microwell used to form a cell clump.
本実施形態における細胞継代培養システムは、図４（ｃ）に示すように、細胞培養容器１０と囲い体３０とを保持する固定具８０を備えている。固定具８０は、一方の基板１５と囲い体３０との間に真空室３５を形成させるように接触させた状態で細胞培養容器１０と囲い体３０とを動かないように固定することができる。固定具８０としては、例えば、細胞培養容器１０と囲い体３０とを挟持する固定具、例えば、クランプを用いることができる。固定具８０は、細胞培養容器１０と囲い体３０とを回転により天地反転させる回転機構８０Ａに回転軸８１を介して連結され得る。 The cell subculture system in this embodiment includes a fixture 80 that holds the cell culture container 10 and the enclosure 30 as shown in FIG. The fixture 80 can fix the cell culture container 10 and the enclosure 30 so as not to move in a state where the fixture 80 is in contact with the substrate 15 so as to form a vacuum chamber 35 between the enclosure 30. As the fixture 80, for example, a fixture that clamps the cell culture container 10 and the enclosure 30, for example, a clamp can be used. The fixture 80 can be connected via a rotation shaft 81 to a rotation mechanism 80A that reverses the cell culture container 10 and the enclosure 30 by rotation.
後述するように、回転機構８０Ａを備えた固定具８０を有する本実施形態における細胞継代培養システムは、接着系細胞の培養に好ましく用いることができる。従って、回転機構８０Ａを備えた固定具８０を有する本実施形態における細胞培養継代システムは、接着系細胞の培養のための細胞培養継代システムとすることができる。接着系細胞の培養のための細胞培養継代システムにおいては、細胞培養容器として、好ましくは、一方の基板１５の内面が細胞非接着性を持ち、他方の基板２０の内面が細胞接着性を持つ細胞培養容器を用いる。 As will be described later, the cell subculture system in the present embodiment having the fixture 80 provided with the rotation mechanism 80A can be preferably used for culturing adhesive cells. Therefore, the cell culture passage system in this embodiment having the fixture 80 provided with the rotation mechanism 80A can be a cell culture passage system for culturing adhesive cells. In the cell culture passage system for culturing adhesive cells, the inner surface of one substrate 15 preferably has cell non-adhesiveness and the inner surface of the other substrate 20 has cell adhesiveness as a cell culture container. Use cell culture vessels.
本実施形態における細胞継代培養システムは、真空室３５を真空引きした後に、真空ライン９１を塞いでその真空状態を維持するバルブ９０を備えていてもよい。真空源９２の駆動中にバルブ９０を閉じることにより、真空源９２による真空引きを停止した後でも一方の基板１５上の凹凸形状３４を維持することができる。その後、細胞培養容器１０と囲い体３０をバルブ９０部分を介して真空源９２に接続された真空ライン９１から離し、細胞培養容器１０と囲い体３０とバルブ９０を別の場所に搬送してもよい。真空ライン９１およびバルブ９０は、囲い体３０から取り外し自在に取り付けられていてもよいし、囲い体３０と一体となっていてもよい。なお、真空とは大気圧から減圧された状態を指す。 The cell subculture system in the present embodiment may include a valve 90 that closes the vacuum line 91 and maintains the vacuum state after the vacuum chamber 35 is evacuated. By closing the valve 90 while the vacuum source 92 is being driven, the uneven shape 34 on the one substrate 15 can be maintained even after the vacuuming by the vacuum source 92 is stopped. Thereafter, the cell culture container 10 and the enclosure 30 are separated from the vacuum line 91 connected to the vacuum source 92 through the valve 90 portion, and the cell culture container 10, the enclosure 30 and the valve 90 are transported to another place. Good. The vacuum line 91 and the valve 90 may be detachably attached to the enclosure 30 or may be integrated with the enclosure 30. In addition, a vacuum refers to the state decompressed from atmospheric pressure.
マイクロウェルの形状としては、市販されているＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）（STEM CELL TECHNOLOGIES社製）のプレート底面に刻まれたマイクロウェルの形状（すなわち、四角錐形状）が挙げられる。マイクロウェルを用いた細胞培養では以下の原理を用いて細胞集塊を形成させることができる。まず、細胞をマイクロウェル内に播種すると細胞は細胞培養液中で重力により自然と沈降する。従って、傾斜を有するマイクロウェル（凹み）中に細胞を播種すると、マイクロウェル中では細胞がウェルの傾斜を利用して集まる。細胞は、その後、隣り合う細胞と細胞接着を形成して細胞集塊を形成する。従って、細胞に細胞集塊を形成させるためには、マイクロウェルは、細胞が沈んだときに集まる形状、例えば、その内周が底面に近づくほどすぼんだ形状を有していることが好ましい。すなわち、マイクロウェルは、例えば、錐形状、丸底、Ｖ底およびＵ底を有していることが好ましい。また、培養室に向けて開口する各ウェルの開口部の形状は、加工の容易性やウェルを大量に配置できる形状を考慮して適宜選択することができるが、例えば、三角形、四角形若しくは六角形などの多角形の形状または円の形状を有することができる。 Examples of the shape of the microwell include the shape of a microwell carved on the bottom surface of a commercially available AggreWell (trademark) (manufactured by STEM CELL TECHNOLOGIES) (that is, a quadrangular pyramid shape). In cell culture using microwells, cell clumps can be formed using the following principle. First, when cells are seeded in microwells, the cells naturally settle by gravity in the cell culture medium. Therefore, when cells are seeded in a microwell (indent) having an inclination, the cells gather in the microwell by utilizing the inclination of the well. The cells then form cell clumps by forming cell adhesions with neighboring cells. Therefore, in order for cells to form cell clumps, it is preferable that the microwell has a shape that collects when the cells sink, for example, a shape that becomes deeper as the inner circumference approaches the bottom surface. That is, the microwell preferably has, for example, a cone shape, a round bottom, a V bottom, and a U bottom. In addition, the shape of the opening of each well that opens toward the culture chamber can be appropriately selected in consideration of ease of processing and the shape in which a large number of wells can be arranged. For example, a triangle, a quadrangle, or a hexagon Can have a polygonal shape or a circular shape.
本明細書では、細胞集塊を形成させるためのウェルは、通常の細胞培養に用いるマルチプレートの培養室を区画するためのウェルと区別するために「マイクロウェル」と呼ぶ。「マイクロウェル」は、一辺または直径１ｍｍ以上の開口部を有するウェルを除外することを意図する用語ではなく、「マイクロウェル」には、一辺または直径１ｍｍ以上の開口部を有するウェルが含まれる。本明細書では、マイクロウェルを「凹み」と呼ぶことがある。マイクロウェルの開口部の大きさは、形成させる細胞集塊の大きさにより決定することができ、例えば、直径１００μｍ〜３ｍｍ、直径２００μｍ〜８００μｍ、または直径４００μｍ〜６００μｍの円と同等の面積を有する開口部を備えることができる。 In this specification, a well for forming a cell clump is referred to as a “microwell” in order to distinguish it from a well for partitioning a culture chamber of a multiplate used for normal cell culture. “Microwell” is not a term intended to exclude wells having openings with a side or diameter of 1 mm or more, and “microwell” includes wells with openings with a side or diameter of 1 mm or more. In the present specification, the microwell is sometimes referred to as a “dent”. The size of the opening of the microwell can be determined by the size of the cell clump to be formed, and has an area equivalent to a circle having a diameter of 100 μm to 3 mm, a diameter of 200 μm to 800 μm, or a diameter of 400 μm to 600 μm, for example. An opening can be provided.
本発明では、形成させる細胞集塊は一定の大きさに揃っていることが好ましい。形成させる細胞集塊の大きさを揃える観点からは、細胞培養容器の一方の基板に形成させるマイクロウェルの形状は均一であることが好ましい。このようにすることで、細胞を比較的均一にマイクロウェル中に分散させることが容易となり、結果として均一な大きさの細胞集塊を形成させることが可能となる。 In the present invention, the cell clumps to be formed are preferably arranged in a certain size. From the viewpoint of uniforming the size of the cell clumps to be formed, it is preferable that the shape of the microwell formed on one substrate of the cell culture container is uniform. By doing so, it becomes easy to disperse the cells in the microwells relatively uniformly, and as a result, it becomes possible to form a cell aggregate having a uniform size.
細胞集塊を大量に取得可能とする観点では、マイクロウェルは、容器の底面に多数配置されていることが好ましく、マイクロウェルは隙間無く（隣り合うウェルの間に平坦な部分が存在しないように）またはマイクロウェル間の隙間を最小限とするように配置されていることが好ましい。 From the viewpoint of obtaining a large amount of cell clumps, it is preferable that a large number of microwells are arranged on the bottom surface of the container, and the microwells have no gaps (so that there is no flat portion between adjacent wells). ) Or the gap between the microwells is preferably arranged to be minimized.
また、後述するように、形成した細胞集塊を培養面に均一に播種する観点では、マイクロウェルは平面上に等間隔で整列されていることが好ましい。 Further, as will be described later, from the viewpoint of uniformly seeding the formed cell clumps on the culture surface, it is preferable that the microwells are aligned on the plane at equal intervals.
凹凸形状３４は、囲い体３０の凹凸形状３２によって決定されるので、囲い体３０の凹凸形状３２は、凹凸形状３２に吸着して形成される凹み３４の形状および配置が上記マイクロウェルの形状および配置となるように形成されていることが好ましい。 Since the concavo-convex shape 34 is determined by the concavo-convex shape 32 of the enclosure 30, the concavo-convex shape 32 of the enclosure 30 has the shape and arrangement of the recesses 34 formed by being adsorbed to the concavo-convex shape 32, and the shape of the microwell. It is preferable that it is formed so as to be arranged.
第一の実施形態における細胞継代培養システムでは、囲い体は取り外し自在であり、囲い体を所望の囲い体に取り替えることができる。これにより、第一の実施形態における細胞継代培養システムでは、異なる凹凸形状３２を有する囲い体３０を用いることで、同一の細胞培養容器１０の一方の基板１５に様々な凹凸形状３４を形成させることができる。例えば、大きな細胞集塊を得たい場合には、凹凸形状の一つ一つの凹みが大きい囲い体を用いることができるし、小さな細胞集塊を得たい場合には、一つ一つの凹みが小さい囲い体を用いることができる。 In the cell subculture system in the first embodiment, the enclosure is removable, and the enclosure can be replaced with a desired enclosure. Thereby, in the cell subculture system in 1st embodiment, various uneven | corrugated shapes 34 are formed in one board | substrate 15 of the same cell culture container 10 by using the enclosure 30 which has different uneven | corrugated shape 32. FIG. be able to. For example, if you want to obtain a large cell clump, you can use an enclosure with a large concave and convex shape, and if you want to obtain a small cell clump, each concave is small. An enclosure can be used.
第一の実施形態における細胞継代培養システムでは、一方の基板１５の凹凸形状３４を用いて形成させた細胞集塊は、細胞培養容器を天地反転することにより他方の基板２０に播種することができる。従って、第一の実施形態における細胞継代培養システムは、細胞培養容器１０と囲い体３０とを回転させて天地反転させる細胞培養容器の回転機構８０Ａをさらに備えていてもよい。 In the cell subculture system in the first embodiment, the cell conglomerate formed using the uneven shape 34 of one substrate 15 can be seeded on the other substrate 20 by inverting the cell culture container upside down. it can. Therefore, the cell subculture system in the first embodiment may further include a cell culture container rotation mechanism 80 </ b> A that rotates the cell culture container 10 and the enclosure 30 to invert the top and bottom.
第一の実施形態における細胞継代培養システムは、細胞懸濁液、細胞培養培地、細胞剥離液および細胞回収液などの溶液を流路および培養室に送液する送液手段をさらに備えていてもよい。第一の実施形態における細胞継代培養システムはさらに、培養室の温度または培養室周辺の温度を制御する温度制御手段をさらに備えていてもよい。第一の実施形態における細胞継代培養システムはさらにまた、培養室周辺の湿度を制御する湿度制御手段をさらに備えていてもよい。第一の実施形態における細胞継代培養システムでは、細胞培養容器は細胞継代培養システムの他の部分から取り外し可能な細胞培養容器であってもよい。第一の実施形態における細胞継代培養システムは、内部の温度および湿度を細胞の培養に適した温度および湿度に制御することができる雰囲気制御手段を備えたインキュベーターを備えていてもよい。 The cell subculture system in the first embodiment further includes a liquid feeding means for feeding a solution such as a cell suspension, a cell culture medium, a cell detachment solution, and a cell recovery solution to the channel and the culture chamber. Also good. The cell subculture system in the first embodiment may further include temperature control means for controlling the temperature of the culture chamber or the temperature around the culture chamber. The cell subculture system in the first embodiment may further include humidity control means for controlling the humidity around the culture chamber. In the cell subculture system in the first embodiment, the cell culture container may be a cell culture container that is removable from other parts of the cell subculture system. The cell subculture system in the first embodiment may include an incubator including an atmosphere control unit capable of controlling the internal temperature and humidity to a temperature and humidity suitable for cell culture.
（第一の実施形態における作用）
次に、図４（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）により、第一の実施形態における細胞継代培養システムを用いて、第一の実施形態における細胞培養容器の一方の基板に凹凸形状を形成させる方法を説明する。第一の実施形態における細胞培養システムでは、接着細胞を播種し、一方の基板１５および他方の基板２０の少なくとも一方、例えば、他方の基板２０により形成される細胞接着面２０ａ上で培養することができる。(Operation in the first embodiment)
Next, according to FIGS. 4 (a), (b), (c), (d), and (e), the cell culture vessel in the first embodiment is used by using the cell subculture system in the first embodiment. A method of forming a concavo-convex shape on one of the substrates will be described. In the cell culture system in the first embodiment, adherent cells are seeded and cultured on at least one of the one substrate 15 and the other substrate 20, for example, on the cell adhesion surface 20a formed by the other substrate 20. it can.
ここで、図４（ａ）は、第一の実施形態における細胞培養システムに用いられる囲い体３０の平面図であり、図４（ｂ）は、そのＡ−Ａ断面における側方断面図である。図４（ｃ）は、第一の実施形態における細胞培養システムにおいて、第一の実施形態における細胞培養容器と囲い体３０とを接触させた状態の、図４（ａ）に示すＡ−Ａ断面における側方断面図である。また、図４（ｄ）は、第一の実施形態における細胞培養システムにおいて、一方の基板１５を囲い体３０の凹凸形状３２に吸着させて一方の基板１５に凹凸形状３４を形成させた状態の細胞継代培養システムの上方平面図であり、図４（ｅ）はそのＡ−Ａ断面における側方断面図である。通常は、細胞培養容器１０の培養室１７および流路１３は細胞培養培地で満たされている。 Here, Fig.4 (a) is a top view of the enclosure 30 used for the cell culture system in 1st embodiment, FIG.4 (b) is a sectional side view in the AA cross section. . FIG. 4C is a cross-sectional view taken along line AA shown in FIG. 4A in a state in which the cell culture container and the enclosure 30 in the first embodiment are brought into contact with each other in the cell culture system in the first embodiment. FIG. FIG. 4D shows a state in which the concave / convex shape 34 is formed on one substrate 15 by adsorbing the one substrate 15 to the concave / convex shape 32 of the enclosure 30 in the cell culture system according to the first embodiment. It is an upper top view of a cell subculture system, and FIG.4 (e) is a side sectional view in the AA cross section. Usually, the culture chamber 17 and the flow path 13 of the cell culture container 10 are filled with the cell culture medium.
まず、図４（ｃ）に示すように、第一の実施形態における細胞培養容器１０の一方の基板１５の外方に真空室３５が形成されるように囲い体３０を接触させる。次に、囲い体３０の各凹状部底面３３に接続された真空源９２を動作させ、囲い体３０の凹凸形状を有する対向面を真空引きする。すると、図４（ｄ）および（ｅ）に示すように、一方の基板１５に凹凸形状３４が形成される。第一の実施形態における細胞継代培養システムが、真空室３５を真空引きした後に、その真空状態を維持するバルブ９０を備える場合には、一方の基板１５に凹凸形状３４が形成されたら、バルブ９０を閉じることができる。すると、真空室３５の真空引きを停止しても、凹凸形状３４を維持することができる。その後、細胞培養容器１０と囲い体６０をバルブ９０部分を介して真空源９２に接続された真空ライン９１から離し、細胞培養容器１０と囲い体６０とバルブ９０を別の場所（例えば、インキュベーター）まで搬送してもよい。一方の基板１５に凹凸形状３４を形成および解消させると凹凸形状の形成に伴い培養室１７の容積が変動し、必要培地量が変化するため、凹凸形状の形成および解消の際には、培養室１７への培地の送液または培養室１７からの培地の排出により培養室１７中の培地量を調整してもよい。例えば、一方の基板１５に陰圧を付与する場合、凹凸形状の形成に伴い必要培地量は増加する。従って、凹凸形状の形成の際には、培養室１７へ培地を送液して必要培地量の増加分を補ってもよい。 First, as shown in FIG. 4C, the enclosure 30 is brought into contact so that the vacuum chamber 35 is formed outside the one substrate 15 of the cell culture container 10 in the first embodiment. Next, the vacuum source 92 connected to each concave-part bottom face 33 of the enclosure 30 is operated, and the opposing surface having the uneven shape of the enclosure 30 is evacuated. Then, as shown in FIGS. 4D and 4E, the uneven shape 34 is formed on one substrate 15. In the case where the cell subculture system in the first embodiment includes the valve 90 that maintains the vacuum state after the vacuum chamber 35 is evacuated, if the uneven shape 34 is formed on one substrate 15, the valve 90 can be closed. Then, even if the evacuation of the vacuum chamber 35 is stopped, the uneven shape 34 can be maintained. Thereafter, the cell culture container 10 and the enclosure 60 are separated from the vacuum line 91 connected to the vacuum source 92 through the valve 90 portion, and the cell culture container 10, the enclosure 60 and the valve 90 are separated from each other (for example, an incubator). May be conveyed. When the concave / convex shape 34 is formed and eliminated on one substrate 15, the volume of the culture chamber 17 varies with the formation of the concave / convex shape, and the required medium amount changes. The amount of the medium in the culture chamber 17 may be adjusted by feeding the medium to 17 or discharging the medium from the culture chamber 17. For example, when a negative pressure is applied to one of the substrates 15, the required amount of medium increases with the formation of the uneven shape. Therefore, when the uneven shape is formed, the medium may be fed to the culture chamber 17 to compensate for the increase in the necessary medium amount.
また、第一の実施形態における細胞継代培養システムでは、一方の基板１５は伸縮性材料からなり、一方の基板１５に形成させた凹凸形状３４は、真空引きを解除することにより容易に解消される。一方の基板１５の陰圧を解除する際には、凹凸形状の解消に伴い、必要培地量は減少する。従って、凹凸形状の解消の際には、培養室１７から培地を排出して必要培地量の減少分を調整してもよい。 In the cell subculture system in the first embodiment, one substrate 15 is made of a stretchable material, and the uneven shape 34 formed on one substrate 15 is easily eliminated by releasing the vacuum. The When the negative pressure on one substrate 15 is released, the required amount of medium decreases as the uneven shape is eliminated. Therefore, when the uneven shape is eliminated, the medium may be discharged from the culture chamber 17 to adjust the amount of decrease in the necessary medium amount.
このようにして、第一の実施形態における細胞培養容器１０と囲い体３０を備えた第一の実施形態における細胞継代培養システムは、一方の基板１５に凹凸形状３４を形成させ、形成させた凹凸形状３４を解消させることができる。 Thus, the cell subculture system in the first embodiment provided with the cell culture container 10 and the enclosure 30 in the first embodiment has the uneven shape 34 formed on one substrate 15 and formed. The uneven shape 34 can be eliminated.
上述の通り、第一の実施形態における細胞継代培養システムでは、細胞培養容器の一方の基板１５に凹凸形状３４を形成させることができる。そして、凹凸形状３４は囲い体の対向面の凹凸形状３２に対応した形状となる。後述するように、凹凸形状を一定の形状とし、この凹凸形状により形成される凹み（マイクロウェル）に細胞を播種すると、細胞は一定の大きさの細胞集塊を形成するが、細胞に一定の大きさの細胞集塊を形成させてから培養により細胞を増殖させることで、それぞれの細胞集塊が同じ増殖速度を示し、各コロニーの継代のタイミングを同期させることが可能になる。従って、この方法は、全自動の細胞の継代培養システムを確立する上で非常に有利である。 As described above, in the cell subculture system in the first embodiment, the uneven shape 34 can be formed on one substrate 15 of the cell culture container. And the uneven | corrugated shape 34 becomes a shape corresponding to the uneven | corrugated shape 32 of the opposing surface of an enclosure. As will be described later, when the irregular shape is made into a certain shape and cells are seeded in the recess (microwell) formed by this irregular shape, the cells form a cell agglomeration of a certain size. By forming a cell clump of a size and then proliferating the cells by culture, each cell clump exhibits the same growth rate, and the passage timing of each colony can be synchronized. Therefore, this method is very advantageous in establishing a fully automated cell subculture system.
以下、図８〜１０により第一の実施形態において細胞を継代培養する方法を説明する。例えば、第一の実施形態における細胞継代培養システムを用いれば、多能性幹細胞の閉鎖系培養を簡便に行うことができる。 Hereinafter, a method for subculturing cells in the first embodiment will be described with reference to FIGS. For example, if the cell subculture system in the first embodiment is used, closed system culture of pluripotent stem cells can be easily performed.
図８（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）により、第一の実施形態における細胞継代培養システムを用いた場合の細胞を継代培養する方法を説明する。図８では、後述する第二の実施形態における細胞継代培養システムが図示されているが、一方の基板１５に凹凸形状を形成させる原理が異なるのみであり、細胞を継代培養する原理および工程は第一の実施形態において細胞を継代培養する方法と変わらない。 With reference to FIGS. 8A, 8B, 8C, 8D, and 8E, a method for subculturing cells when the cell subculture system in the first embodiment is used will be described. In FIG. 8, the cell subculture system in the second embodiment to be described later is illustrated, but only the principle of forming the irregular shape on one substrate 15 is different, and the principle and process of subculturing cells. Is the same as the method of subculturing cells in the first embodiment.
ここで、図８は、第二の実施形態における細胞培養容器の一方の基板１５上に細胞集塊を形成させ、細胞集塊を他方の基板２０上に播種する方法を示す図である。まず、図８（ａ）に示すように、第二の実施形態における細胞培養容器が細胞懸濁液で満たす。次に、図８（ｂ）に示すように、真空室６４を真空引きして細胞培養容器の一方の基板に多数のマイクロウェルを形成させる。すると、細胞懸濁液中の細胞は、形成させたマイクロウェルに落下して、細胞集塊を形成する。なお、マイクロウェルを形成は、培養室１７の容積増大に対応するため、培養室１７に培地または細胞懸濁液をさらに送液しながら行うことができる。その後、図８（ｃ）に示すように、回転機構８０Ａを駆動させて固定具８０を回転させることにより、本発明の細胞培養容器１０および囲い体６０を天地反転して、形成させた細胞集塊を他方の基板２０上に播種する。一部の細胞集塊が依然一方の基板１５に付着して他方の基板２０上に播種されていない場合（例えば、図８（ｃ））には、その後さらに図８（ｄ）に示すように、真空室６４の真空引きを解除して一方の基板１５の凹凸形状を解消し、それにより、一方の基板１５に付着した細胞集塊を他方の基板２０上に落下させる。図８（ｅ）は、その後、細胞を培養し、各細胞集塊がコロニーを形成した状態を示す図である。図８（ｂ）〜（ｅ）では、培養室１７は培地で満たされている。なお、図８（ｃ）〜（ｄ）の工程は、繰り返して行ってもよい。 Here, FIG. 8 is a diagram showing a method of forming a cell clump on one substrate 15 of the cell culture container in the second embodiment and seeding the cell clump on the other substrate 20. First, as shown to Fig.8 (a), the cell culture container in 2nd embodiment is satisfy | filled with a cell suspension. Next, as shown in FIG. 8B, the vacuum chamber 64 is evacuated to form a large number of microwells on one substrate of the cell culture container. Then, the cells in the cell suspension fall into the formed microwells to form cell clumps. The formation of the microwell can be performed while further supplying a medium or a cell suspension to the culture chamber 17 in order to cope with an increase in the volume of the culture chamber 17. Thereafter, as shown in FIG. 8C, the rotation mechanism 80A is driven to rotate the fixture 80, so that the cell culture container 10 and the enclosure 60 of the present invention are turned upside down and formed into a cell collection. The mass is seeded on the other substrate 20. If some cell clumps still adhere to one substrate 15 and are not seeded on the other substrate 20 (for example, FIG. 8 (c)), then as shown in FIG. 8 (d). Then, the vacuuming of the vacuum chamber 64 is released to eliminate the uneven shape of the one substrate 15, thereby dropping the cell clump attached to the one substrate 15 onto the other substrate 20. FIG. 8 (e) is a diagram showing a state in which cells are then cultured and each cell clump has formed a colony. In FIGS. 8B to 8E, the culture chamber 17 is filled with a medium. In addition, you may repeat the process of FIG.8 (c)-(d).
従って、第一の実施形態における細胞継代培養システムを用いた細胞の継代方法は、
（Ａ）継代時に細胞を分散させる工程と、
（Ｂ）分散させた細胞を細胞培養容器１０の培養室１７に注入する工程と、
（Ｃ）細胞培養容器の培養室１７に面する一方の基板１５に凹凸形状３４を形成させる工程と、
（Ｄ）一方の基板１５に形成させた凹凸形状の凹み３４に播種された細胞に細胞集塊を形成させる工程とを含んでなる。上記工程（Ｂ）および（Ｃ）はどちらを先に行ってもよい。Therefore, the cell passage method using the cell passage culture system in the first embodiment is:
(A) a step of dispersing cells during passage;
(B) injecting the dispersed cells into the culture chamber 17 of the cell culture vessel 10;
(C) forming a concavo-convex shape 34 on one substrate 15 facing the culture chamber 17 of the cell culture container;
(D) forming a cell clump in the cells seeded in the concave / convex recesses 34 formed on one substrate 15. Either of the steps (B) and (C) may be performed first.
すなわち、第一の実施形態における細胞継代培養システムを用いた細胞の継代方法は、
（Ａ）継代時に細胞を分散させる工程と、
（ｂ）工程（Ａ）で分散させた細胞を細胞培養容器１０の培養室１７に注入する工程と、
（ｃ）細胞培養容器の培養室１７に面する一方の基板１５に凹凸形状を形成させて、凹凸形状の凹み３４に細胞を播種する工程と、
（Ｄ）一方の基板１５に形成させた凹凸形状の凹み３４に播種された細胞に細胞集塊を形成させる工程とを含んでなるものとしてよい。That is, the cell passage method using the cell passage culture system in the first embodiment is:
(A) a step of dispersing cells during passage;
(B) a step of injecting the cells dispersed in step (A) into the culture chamber 17 of the cell culture vessel 10;
(C) forming a concavo-convex shape on one substrate 15 facing the culture chamber 17 of the cell culture container, and seeding cells in the concavo-convex recess 34;
(D) and a step of forming a cell clump in the cells seeded in the concave-convex recess 34 formed on one substrate 15.
また、第一の実施形態における細胞継代培養システムを用いた細胞の継代方法は、一方の基板１５に凹凸形状を形成させた後に細胞懸濁液を培養室１７内に注入してもよい。すなわち、第一の実施形態における細胞継代培養システムを用いた細胞の継代方法は、
（Ａ）継代時に細胞を分散させる工程と、
（ｂ’）細胞培養容器の培養室１７に面する一方の基板１５に凹凸形状を形成させる工程と、
（ｃ’）工程（Ａ）で分散させた細胞を細胞培養容器１０の培養室１７に注入して、一方の基板１５に形成させた凹凸形状の凹み３４に播種する工程と、
（Ｄ）一方の基板１５に形成させた凹凸形状の凹み３４に播種された細胞に細胞集塊を形成させる工程とを含んでなるものとしてもよい。In the cell subculture method using the cell subculture system in the first embodiment, the cell suspension may be injected into the culture chamber 17 after the concave and convex shape is formed on one substrate 15. . That is, the cell passage method using the cell passage culture system in the first embodiment is:
(A) a step of dispersing cells during passage;
(B ′) forming a concavo-convex shape on one substrate 15 facing the culture chamber 17 of the cell culture container;
(C ′) a step of injecting the cells dispersed in the step (A) into the culture chamber 17 of the cell culture vessel 10 and seeding in the concave / convex shaped recesses 34 formed on the one substrate 15;
(D) It is good also as a thing including the process of forming a cell clump in the cell seed | inoculated by the uneven | corrugated shaped dent 34 formed in one board | substrate 15.
本発明の細胞の継代方法は、工程（Ａ）〜（Ｄ）の後に、（Ｅ）細胞培養容器を天地反転させて、形成させた細胞集塊を他方の基板に播種する工程をさらに含んでいてもよい。 The cell passage method of the present invention further comprises, after steps (A) to (D), (E) a step of inverting the cell culture vessel and seeding the formed cell clump on the other substrate. You may go out.
本発明の細胞の継代方法はまた、工程（Ｅ）の後に、培養の工程、すなわち、（Ｅ’）播種した細胞を他方の基板２０上で培養する工程をさらに含んでいてもよく、あるいは、工程（Ａ）〜（Ｄ）の後に、（Ｆ）工程（Ｄ）で形成させた細胞集塊を一方の基板１５上で培養する工程をさらに含んでいてもよく、従って、細胞を継代し培養する方法とすることができる。本発明の細胞の継代方法はまた、（Ｇ）培養した細胞を回収する工程をさらに含んでいてもよい。 The cell passage method of the present invention may further include a step of culturing after step (E), that is, (E ′) culturing the seeded cells on the other substrate 20, or After the steps (A) to (D), the method may further include (F) a step of culturing the cell clump formed in the step (D) on one substrate 15, and thus the cells are passaged. And culturing. The cell passage method of the present invention may further include a step (G) of recovering the cultured cells.
以下、第一の実施形態における細胞継代培養システムを用いた細胞の継代方法について、各工程を詳細に説明する。 Hereinafter, each process is demonstrated in detail about the subculture method of the cell using the cell subculture system in 1st embodiment.
（Ａ）継代時に細胞を分散させる工程
（細胞接着面からの細胞の剥離）
第一の実施形態では、接着培養において、生理学的にまたは物理的に細胞接着面から剥離させた多能性幹細胞を用いることができる。本発明では、多能性幹細胞を細胞接着面から剥離させる酵素としては、常法で用いられる酵素を用いることができ、例えば、トリプシン、ディスパーゼ、アキュターゼまたはコラゲナーゼなどの酵素を用いることができる。多能性幹細胞の細胞接着面からの剥離はまた、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの二価イオン（特にＭｇ２＋）のキレート剤など、細胞剥離作用を有する化学物質を用いて行ってもよく、これらを上記酵素と組み合わせて用いて行ってもよい。本発明ではまた、多能性幹細胞を細胞接着面から剥離させるために、細胞の接着表面に高周波振動などの振動を与えてもよく、および／または、セルスクレイパーを用いてもよい。本発明では更に、上記の生理学的な剥離法と物理的な剥離法を組み合わせて細胞を剥離してもよい。当業者であれば、細胞接着面からの多能性幹細胞の剥離は上記のような周知の剥離法を用いて適宜行うことができるであろう。(A) Step of dispersing cells at the time of passage ( detachment of cells from the cell adhesion surface)
In the first embodiment, pluripotent stem cells that are physiologically or physically detached from the cell adhesion surface can be used in the adhesion culture. In the present invention, as an enzyme for detaching pluripotent stem cells from the cell adhesion surface, an enzyme used in a conventional method can be used, and for example, an enzyme such as trypsin, dispase, actase or collagenase can be used. The detachment of pluripotent stem cells from the cell adhesion surface may also be performed using a chemical substance having a cell detaching action, such as a chelating agent of divalent ions (particularly Mg2+ ) such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), These may be performed in combination with the above enzyme. In the present invention, in order to detach pluripotent stem cells from the cell adhesion surface, vibration such as high-frequency vibration may be applied to the cell adhesion surface, and / or a cell scraper may be used. In the present invention, the cells may be detached by combining the above physiological detachment method and physical detachment method. Those skilled in the art will be able to appropriately remove the pluripotent stem cells from the cell adhesion surface using the well-known peeling method as described above.
第一の実施形態では、細胞塊は単一細胞レベルにまで解離させることができる。細胞塊の解離は、細胞の培養面からの剥離と同時に行ってもよいし、細胞塊として剥離させた後に行ってもよい。 In the first embodiment, the cell mass can be dissociated to the single cell level. The dissociation of the cell mass may be performed simultaneously with the detachment of the cell from the culture surface, or may be performed after the cell mass is detached.
（細胞の分散）
接着面から剥離させた細胞が細胞塊の形状を保っている場合には、剥離させた細胞塊は、例えば、ピペッティングの水流により単一細胞レベルにまで解離させてから分散させることができる。本明細書では、「単一細胞レベルにまで分散させる」とは、細胞塊１つ当りに含まれる細胞数の平均が、１〜１００個、好ましくは、１〜１０個となるように細胞塊を解離させてから分散させることを意味し、完全に単一細胞にまで解離させてから分散させることを含むものとする。従って、本発明では、細胞塊は完全に単一細胞にまで解離させてから分散させてもよいし、大部分が単一細胞となるように解離させてから分散させてもよいし、大部分が１〜１００個、好ましくは、１〜１０個の細胞からなる細胞塊となるように解離させてから分散させてもよい。分散後の細胞塊が大きい場合は、細胞塊をマイクロウェルに播種する際に、それぞれのマイクロウェルに播種される細胞数にばらつきが生じやすくなるため、分散後の細胞塊は小さい方が好ましい。(Cell dispersion)
When the cells detached from the adhesive surface maintain the shape of the cell mass, the exfoliated cell mass can be dispersed after being dissociated to a single cell level by, for example, pipetting water flow. In this specification, “dispersing to a single cell level” means that the average number of cells contained in one cell mass is 1 to 100, preferably 1 to 10 Is dissociated and then dispersed, and includes completely dissociating into single cells and then dispersing. Therefore, in the present invention, the cell mass may be dissociated after being completely dissociated into single cells, or may be dispersed after being dissociated so that most of the cells become single cells. May be dissociated so as to form a cell mass composed of 1 to 100 cells, preferably 1 to 10 cells, and then dispersed. When the cell mass after dispersion is large, when the cell mass is seeded in the microwell, the number of cells seeded in each microwell tends to vary, and thus the cell mass after dispersion is preferably small.
また、培養面から剥離させた細胞塊は、酵素を用いてさらに処理することにより単一細胞レベルにまで分散させてもよい。細胞を単一細胞レベルにまで解離させるために用いることができる酵素としては、細胞−細胞間の結合を切断することのできる酵素や細胞−細胞外基質（ＥＣＭ）間の結合を切断することのできる酵素を挙げることができ、これらの酵素は、当業者に周知である。酵素や水流を用いた細胞塊の解離は、自動化が可能であり、工程（Ａ）は自動化が可能である。 Moreover, the cell mass exfoliated from the culture surface may be dispersed to a single cell level by further processing using an enzyme. Enzymes that can be used to dissociate cells to the single cell level include those that can break cell-cell bonds and cell-extracellular matrix (ECM) bonds. Can be mentioned and these enzymes are well known to those skilled in the art. Dissociation of the cell mass using an enzyme or a water flow can be automated, and the process (A) can be automated.
細胞を単一細胞レベルにまで解離させ分散させた後は、分散させた細胞の懸濁液に、細胞を分散させたことによる細胞への悪影響（例えば、細胞死等）を抑制する化合物、例えば、Ｙ−２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤を添加することができる。 After dissociating and dispersing the cells to a single cell level, a compound that suppresses adverse effects (eg, cell death) on the cells caused by dispersing the cells in the dispersed cell suspension, for example, ROCK inhibitors such as Y-27632 can be added.
以下、工程（Ｂ）を行った後に工程（Ｃ）を行う場合の方法、すなわち、工程（ｂ）および（ｃ）について説明する。 Hereinafter, the method in the case of performing the step (C) after performing the step (B), that is, the steps (b) and (c) will be described.
（ｂ）工程（Ａ）で分散させた細胞を細胞培養容器１０の培養室１７に注入する工程
本工程では、工程（Ａ）で分散させた細胞の懸濁液を細胞培養容器１０の入口１１から培養室１７に注入することができる。細胞の懸濁液は、入口１１に接続された注入装置（図示せず）により細胞培養容器内に注入される。(B) Step of injecting the cells dispersed in the step (A )into the culture chamber 17 of the cell culture vessel 10 In this step, the suspension of the cells dispersed in the step (A ) is added to the inlet 11 of the cell culture vessel 10. To the culture chamber 17. The cell suspension is injected into the cell culture vessel by an injection device (not shown) connected to the inlet 11.
（ｃ）細胞培養容器の培養室１７に面する一方の基板１５に凹凸形状を形成させて、凹凸形状の凹み３４に細胞を播種する工程
工程（Ａ）で分散させて得られた細胞または細胞塊（以下、単に「細胞」ということがある）は、細胞集塊を形成させた後に継代するとその後良好に増殖させることができる。細胞集塊の形成は、得られた細胞を一方の基板１５上に凹凸形状（マイクロウェル）を形成させてその凹みに播種することにより行うことができる。工程（Ａ）で分散させて得られた細胞は、培養液中では重力により自然と沈む。従って、傾斜を有するウェル（凹み）中に細胞を播種すると、ウェル中では細胞がウェルの傾斜を利用して集まる。その後、細胞は、隣り合う細胞と接着して細胞集塊を形成する。工程（ｂ）で細胞の懸濁液が注入した後に一方の基板１５上に凹凸形状させれば、懸濁液中の細胞は、その凹凸形状に落下して、ウェルの底に集まる。(C) Cells or cells obtained by dispersing in the step (A ) offorming a concavo-convex shape on one substrate 15 facing the culture chamber 17 of the cell culture container and seeding cells in the concavo-convex dent 34 A clump (hereinafter sometimes simply referred to as a “cell”) can be successfully grown after passage after forming a cell clump. Formation of a cell clump can be performed by forming the concavo-convex shape (microwell) on one substrate 15 and seeding the obtained cells in the dent. The cells obtained by dispersing in the step (A ) naturally sink by gravity in the culture solution. Accordingly, when cells are seeded in a well (indent) having a slope, the cells gather in the well by utilizing the slope of the well. Thereafter, the cells adhere to neighboring cells to form a cell clump. If the concavo-convex shape is formed on one substrate 15 after the cell suspension is injected in the step (b), the cells in the suspension fall into the concavo-convex shape and gather at the bottom of the well.
第一の実施形態では、作製する細胞集塊は一定の大きさに揃っていることが好ましい。ここで、作製する細胞集塊の大きさは、凹凸形状の各凹みに播種される細胞数により決定されるので、工程（ｃ）では、各凹みに播種される細胞数は一定量に揃えられていることが好ましい。ここで、一定量とは、工程（ｃ）で各マイクロウェルに播種される細胞数の平均が、例えば、１０〜３，５００個（すなわち、形成される細胞集塊の平均直径は３５〜３５０μｍである）、好ましくは、２５〜８７０個（すなわち、形成される細胞集塊の平均直径は５０〜２００μｍである）、より好ましくは、４０〜５００個（すなわち、形成される細胞集塊の平均直径は６０〜１６０μｍである）、さらに好ましくは、５５〜２２０個（すなわち、形成される細胞集塊の平均直径は６９〜１１５μｍである）であることを意味する。工程（ｃ）で各マイクロウェルに播種される細胞数を一定量に揃えるためには、細胞懸濁液中の細胞の濃度を調整した後に、懸濁液中で細胞を十分に懸濁してから培養室に送液すればよい。送液された細胞は、重力によりマイクロウェル中に自然落下し得る。第一の実施形態における細胞継代培養システムが、固定具８０を備える場合には、細胞培養容器の一方の基板と、一方の基板に対向する面に凹凸形状を有する囲い体６０とを接触させた後に、固定具８０により、細胞培養容器１０と囲い体６０を固定する。また、第一の実施形態における細胞継代培養システムが、真空室３５の真空状態を維持するバルブを備える場合には、一方の基板１５に凹凸形状３４が形成されたら、バルブ９０を閉じて真空室３５と真空源９２とをつなぐ真空ライン（ガスの流路）９１を塞いで真空引きを停止すると、真空引き停止後も凹凸形状３４を維持することができる。 In the first embodiment, it is preferable that the cell agglomerates to be prepared have a uniform size. Here, since the size of the cell conglomerate to be produced is determined by the number of cells to be seeded in each concave and convex shape, in step (c), the number of cells to be seeded in each concave is made uniform. It is preferable. Here, the fixed amount means that the average number of cells seeded in each microwell in step (c) is, for example, 10 to 3,500 (that is, the average diameter of the formed cell clump is 35 to 350 μm). Preferably, 25-870 (ie, the average diameter of the formed cell clumps is 50-200 μm), more preferably 40-500 (ie, the average of the formed cell clumps). It means that the diameter is 60 to 160 μm), more preferably 55 to 220 (that is, the average diameter of the formed cell clump is 69 to 115 μm). In order to make the number of cells seeded in each microwell in step (c) uniform, after adjusting the concentration of cells in the cell suspension, the cells are sufficiently suspended in the suspension. What is necessary is just to liquid-feed to a culture room. The sent cells can spontaneously fall into the microwell by gravity. When the cell subculture system in the first embodiment includes the fixture 80, one substrate of the cell culture container is brought into contact with the enclosure 60 having an uneven shape on the surface facing the one substrate. After that, the cell culture container 10 and the enclosure 60 are fixed by the fixing tool 80. In addition, when the cell subculture system in the first embodiment includes a valve that maintains the vacuum state of the vacuum chamber 35, when the uneven shape 34 is formed on one substrate 15, the valve 90 is closed to perform vacuum. When the evacuation is stopped by closing the vacuum line (gas flow path) 91 connecting the chamber 35 and the vacuum source 92, the uneven shape 34 can be maintained even after the evacuation is stopped.
一方の基板１５に凹凸形状３４を形成させると、培養室１７が体積変化を起こす。培養室１７が体積変化に対応するためには、培養室１７への送液を行いながら一方の基板１５に凹凸形状３４を形成させることができる。 When the concavo-convex shape 34 is formed on one substrate 15, the culture chamber 17 undergoes a volume change. In order for the culture chamber 17 to respond to the volume change, the concave-convex shape 34 can be formed on one substrate 15 while feeding the culture chamber 17.
第一の実施形態では、凹みへの細胞の接着を防ぎたい場合（例えば、以下の工程（Ｅ）を実施する場合）には、一方の基板１５の表面は、細胞に対して非接着性のコーティングを施しておくことができる。 In the first embodiment, when it is desired to prevent adhesion of cells to the recess (for example, when the following step (E) is performed), the surface of one substrate 15 is non-adhesive to the cells. A coating can be applied.
各凹みに播種する細胞の数は、適宜調整することができる。また、マイクロウェルへの細胞の播種は、細胞を十分に懸濁することにより均一に行うことができる。これらの操作は自動化が可能であるから、工程（ｃ）において、一定量の細胞をマイクロウェルに播種する工程も全自動化が可能である。 The number of cells seeded in each dent can be adjusted as appropriate. In addition, seeding of the cells in the microwell can be performed uniformly by sufficiently suspending the cells. Since these operations can be automated, the step of seeding a certain amount of cells in a microwell in step (c) can also be fully automated.
次に、工程（Ｃ）を行った後に工程（Ｂ）を行う場合の方法、すなわち、工程（ｂ’）および（ｃ’）について説明する。 Next, a method in which the step (B) is performed after performing the step (C), that is, the steps (b ′) and (c ′) will be described.
（ｂ’）細胞培養容器の培養室１７に面する一方の基板１５に凹凸形状を形成させる工程
第一の実施形態における細胞培養容器は、上記のように、一方の基板１５に凹凸形状を形成させることができる。すなわち、上述のように、細胞培養容器の一方の基板と、一方の基板に対向する面に凹凸形状を有する囲い体とを接触させて、一方の基板と囲い体との間に真空室を形成させ、真空室を真空引きして一方の基板を囲い体の凹凸形状に吸着させて一方の基板に凹凸形状を形成させることができる。工程（ｂ’）は全自動化が可能である。(B ′) Step of forming an uneven shape on one substrate 15 facing the culture chamber 17 of the cell culture container The cell culture container in the first embodiment forms an uneven shape on one substrate 15 as described above. Can be made. That is, as described above, a vacuum chamber is formed between one substrate and the enclosure by bringing one substrate of the cell culture container into contact with an enclosure having a concavo-convex shape on the surface facing the one substrate. Then, the vacuum chamber is evacuated and one substrate is adsorbed to the uneven shape of the surrounding body to form the uneven shape on the one substrate. Step (b ′) can be fully automated.
（ｃ’）工程（Ａ）で分散させた細胞を細胞培養容器１０の培養室１７に注入して、工程（ｂ’）で形成させた凹凸形状の凹みに播種する工程
工程（Ａ）で分散させて得られた細胞または細胞塊（以下、単に「細胞」ということがある）は、細胞集塊を形成させた後に継代するとその後良好に増殖させることができる。細胞集塊の形成は、得られた細胞を一方の基板１５上のマイクロウェルに播種することにより行うことができる。一方の基板１５上のマイクロウェルへの細胞の播種は、一方の基板１５を下にして培養室１７内に細胞懸濁液を送液することにより行うことができる。工程（Ａ）で分散させて得られた細胞は、培養液中では重力により自然と沈む。従って、傾斜を有するウェル（凹み）中に細胞を播種すると、ウェル中では細胞がウェルの傾斜を利用して集まる。その後、細胞は、隣り合う細胞と接着して細胞集塊を形成する。(C ′) The cells dispersed in the step (A) are injected into the culture chamber 17 of the cell culture vessel 10 and seeded in the concave and convex shape formed in the step (b ′), and dispersed in the step (A). Cells or cell masses obtained in this manner (hereinafter sometimes simply referred to as “cells”) can be proliferated well after passage after forming a cell clump. Formation of a cell clump can be performed by seeding the obtained cells in a microwell on one substrate 15. The seeding of the cells in the microwells on one substrate 15 can be performed by feeding the cell suspension into the culture chamber 17 with one substrate 15 facing down. The cells obtained by dispersing in step (A) naturally sink due to gravity in the culture solution. Accordingly, when cells are seeded in a well (indent) having a slope, the cells gather in the well by utilizing the slope of the well. Thereafter, the cells adhere to neighboring cells to form a cell clump.
第一の実施形態では、作製する細胞集塊は一定の大きさに揃っていることが好ましい。ここで、作製する細胞集塊の大きさは、凹凸形状の各凹みに播種される細胞数により決定されるので、工程（ｃ’）では、各凹みに播種される細胞数は一定量に揃えられていることが好ましい。ここで、一定量とは、工程（ｃ’）で各マイクロウェルに播種される細胞数の平均が、例えば、１０〜３，５００個（すなわち、形成される細胞集塊の平均直径は３５〜３５０μｍである）、好ましくは、２５〜８７０個（すなわち、形成される細胞集塊の平均直径は５０〜２００μｍである）、より好ましくは、４０〜５００個（すなわち、形成される細胞集塊の平均直径は６０〜１６０μｍである）、さらに好ましくは、５５〜２２０個（すなわち、形成される細胞集塊の平均直径は６９〜１１５μｍである）であることを意味する。工程（ｃ’）で各マイクロウェルに播種される細胞数を一定量に揃えるためには、細胞懸濁液中の細胞の濃度を調整した後に、懸濁液中で細胞を十分に懸濁してから培養室に送液すればよい。送液された細胞は、重力によりマイクロウェル中に自然落下し得る。第一の実施形態における細胞継代培養システムが、固定具８０を備える場合には、細胞培養容器の一方の基板と、一方の基板に対向する面に凹凸形状を有する囲い体６０とを接触させた後に、固定具８０により、細胞培養容器１０と囲い体６０を固定する。また、第一の実施形態における細胞継代培養システムが、真空室３５の真空状態を維持するバルブを備える場合には、一方の基板１５に凹凸形状３４が形成されたら、バルブ９０を閉じて真空室３５と真空源９２とをつなぐ真空ライン（ガスの流路）９１を塞いで真空引きを停止すると、真空引き停止後も凹凸形状３４を維持することができる。 In the first embodiment, it is preferable that the cell agglomerates to be prepared have a uniform size. Here, since the size of the cell conglomerate to be produced is determined by the number of cells seeded in each concavo-convex recess, in step (c ′), the number of cells seeded in each recess is uniform. It is preferable that Here, the fixed amount means that the average number of cells seeded in each microwell in the step (c ′) is, for example, 10 to 3,500 (that is, the average diameter of the formed cell cluster is 35 to 35). 350 μm), preferably 25-870 (ie, the average diameter of the formed cell clumps is 50-200 μm), more preferably 40-500 (ie, the cell clumps formed). Mean diameter is 60 to 160 μm), more preferably 55 to 220 (that is, the average diameter of the formed cell clumps is 69 to 115 μm). In order to make the number of cells seeded in each microwell constant in step (c ′), after adjusting the concentration of the cells in the cell suspension, the cells are sufficiently suspended in the suspension. To the culture chamber. The sent cells can spontaneously fall into the microwell by gravity. When the cell subculture system in the first embodiment includes the fixture 80, one substrate of the cell culture container is brought into contact with the enclosure 60 having an uneven shape on the surface facing the one substrate. After that, the cell culture container 10 and the enclosure 60 are fixed by the fixing tool 80. In addition, when the cell subculture system in the first embodiment includes a valve that maintains the vacuum state of the vacuum chamber 35, when the uneven shape 34 is formed on one substrate 15, the valve 90 is closed to perform vacuum. When the evacuation is stopped by closing the vacuum line (gas flow path) 91 connecting the chamber 35 and the vacuum source 92, the uneven shape 34 can be maintained even after the evacuation is stopped.
第一の実施形態では、凹みへの細胞の接着を防ぎたい場合（例えば、以下の工程（Ｅ）を実施する場合）には、一方の基板１５の表面は、細胞に対して非接着性のコーティングを施しておくことができる。 In the first embodiment, when it is desired to prevent adhesion of cells to the recess (for example, when the following step (E) is performed), the surface of one substrate 15 is non-adhesive to the cells. A coating can be applied.
各凹みに播種する細胞の数は、適宜調整することができる。また、マイクロウェルへの細胞の播種は、細胞を十分に懸濁することにより均一に行うことができる。これらの操作は自動化が可能であるから、工程（ｃ’）において、一定量の細胞をマイクロウェルに播種する工程も全自動化が可能である。 The number of cells seeded in each dent can be adjusted as appropriate. In addition, seeding of the cells in the microwell can be performed uniformly by sufficiently suspending the cells. Since these operations can be automated, the step of seeding a certain amount of cells in a microwell in step (c ′) can also be fully automated.
さらに、上記工程（Ｂ）および（Ｃ）に続く工程について説明する。 Furthermore, the process following the said process (B) and (C) is demonstrated.
（Ｄ）一方の基板に形成させた凹凸形状の凹みに播種された細胞に細胞集塊を形成させる工程
図８（ｂ）に示すように、一方の基板に形成させた凹凸形状の凹みに播種された細胞は、そのまま静置しておくことで重力により各凹みの底に集まり、細胞同士が接着し、細胞集塊を形成する。細胞は、本発明の細胞培養容器を遠心分離の手法を用いて遠心することによって凹みの底に集めてもよい。(D) Process of forming cell clumps on cells seeded in the concave-convex recess formed on one substrate As shown in FIG. 8 (b), seeding in the concave-convex recess formed on one substrate The left cells are allowed to stand and gather at the bottom of each dent by gravity, and the cells adhere to form a cell cluster. The cells may be collected at the bottom of the recess by centrifuging the cell culture container of the present invention using a centrifugation technique.
遠心分離の手法を用いる場合には、特に限定されないが、４００ｇ〜３０００ｇで１分〜１０分間の遠心分離を行うことができる。このようにすることで、細胞を凹みの底面に効果的に集めることができる。 When using the method of centrifugation, although it does not specifically limit, Centrifugation for 1 minute-10 minutes can be performed at 400g-3000g. By doing in this way, a cell can be effectively collected on the bottom face of a dent.
第一の実施形態によれば、遠心分離の手法を用いて細胞集塊を形成させると、細胞を密に凝集させることができると考えられるが、第一の実施形態では、必ずしも遠心分離の手法を用いる必要は無い。すなわち、凹みに単一細胞レベルまで分散させた細胞を播種した後、遠心分離の手法を用いることなく、例えば、凹み中で細胞を静置するだけでも数時間以内に多能性幹細胞に細胞集塊を形成させることができる。このように、第一の実施形態では、遠心分離の手法を用いることなく細胞集塊を形成させることができる。 According to the first embodiment, it is considered that cells can be densely aggregated when a cell clump is formed using a centrifugation technique. However, in the first embodiment, the centrifugation technique is not necessarily used. There is no need to use. That is, after seeding cells that have been dispersed to the single cell level in the dent and then using a method of centrifugation, for example, the cells can be collected in pluripotent stem cells within a few hours just by leaving the cells in the dent. A lump can be formed. Thus, in the first embodiment, cell clumps can be formed without using a centrifugation technique.
第一の実施形態では、凹み中で静置することにより多能性幹細胞に細胞集塊を形成させることができる。静置時間は、多能性幹細胞が細胞集塊を形成させるために必要な時間以上であればよく、例えば、８時間以上である。細胞集塊の形成時間を短縮する観点では、静置時間は、例えば、８時間〜２４時間、好ましくは８時間〜１６時間、さらに好ましくは８時間〜１２時間とすることができる。細胞培養容器１０は、真空室３５の真空状態を維持するバルブ９０を備える場合には、バルブ９０を閉じて真空室３５の真空状態を維持したまま、静置中は、細胞培養容器１０と囲い体６０をバルブ９０部分を介して真空源９２に接続された真空ライン９１から離し、細胞培養容器１０と囲い体６０とバルブ９０をインキュベーターまで搬送してインキュベーター内で静置してもよい。第一の実施形態では、静置時間が短いほど細胞集塊中の細胞間の結合は緩いため、細胞集塊が壊れやすい一方、培養容器への播種後は細胞集塊が素早く展開するという利点がある。 In the first embodiment, a cell clump can be formed in a pluripotent stem cell by standing in a dent. The standing time may be longer than the time necessary for the pluripotent stem cells to form a cell clump, for example, 8 hours or longer. From the viewpoint of shortening the cell aggregate formation time, the standing time can be, for example, 8 hours to 24 hours, preferably 8 hours to 16 hours, and more preferably 8 hours to 12 hours. When the cell culture vessel 10 includes a valve 90 that maintains the vacuum state of the vacuum chamber 35, the cell culture vessel 10 is enclosed with the cell culture vessel 10 during standing while the valve 90 is closed and the vacuum state of the vacuum chamber 35 is maintained. The body 60 may be separated from the vacuum line 91 connected to the vacuum source 92 through the valve 90 portion, and the cell culture vessel 10, the enclosure 60, and the valve 90 may be transported to the incubator and left in the incubator. In the first embodiment, the shorter the standing time, the looser the connection between the cells in the cell clump, so that the cell clump is more fragile, while the cell clump develops quickly after seeding in the culture vessel. There is.
第一の実施形態では、工程（Ｄ）で作製する細胞集塊は、作製する細胞集塊は一定の大きさに揃っていることが好ましい。上記のように、それぞれの細胞集塊に含まれる平均細胞数は、例えば、１０〜３，５００個（すなわち、細胞集塊の平均直径は３５〜３５０μｍである）、好ましくは、２５〜８７０個（すなわち、細胞集塊の平均直径は５０〜２００μｍである）、より好ましくは、４０〜５００個（すなわち、細胞集塊の平均直径は６０〜１６０μｍである）、さらに好ましくは、５５〜２２０個（すなわち、細胞集塊の平均直径は６９〜１１５μｍである）であり、細胞集塊の平均直径は、凹みのサイズと播種する細胞数により適宜調整することができる。また、凹みは、作製したい細胞集塊のサイズより大きいサイズのものを選択することができる。 In 1st embodiment, it is preferable that the cell clump produced by process (D) arranges the cell clump to produce in a fixed magnitude | size. As described above, the average number of cells contained in each cell clump is, for example, 10 to 3,500 (that is, the average diameter of the cell clump is 35 to 350 μm), preferably 25 to 870. (That is, the average diameter of the cell clump is 50 to 200 μm), more preferably 40 to 500 (that is, the average diameter of the cell clump is 60 to 160 μm), more preferably 55 to 220. (That is, the average diameter of the cell clump is 69 to 115 μm), and the average diameter of the cell clump can be appropriately adjusted according to the size of the dent and the number of cells to be seeded. In addition, the dent can be selected to be larger than the size of the cell clump to be produced.
凹みに播種された細胞は、遠心分離工程を行って、あるいは行わずに単に静置するだけで細胞集塊を形成する。従って、工程（Ｄ）は全自動化が可能である。 The cells seeded in the dents form a cell clump by simply allowing them to stand with or without a centrifugation step. Therefore, the process (D) can be fully automated.
（Ｅ）細胞培養容器を天地反転させて、形成させた細胞集塊を他方の基板に播種する工程
第一の実施形態における細胞培養容器において工程（Ｄ）により一方の基板１５に形成された凹凸形状の凹みの中で形成された細胞集塊は、その後、細胞培養容器の他方の基板２０に播種することができる。工程（Ｅ）は、例えば、接着系細胞の培養の際に好ましく行うことができ、他方の基板２０の細胞接着面２０ａは細胞接着性とすることができる。(E) Step of inverting the cell culture container upside down and seeding the formed cell agglomeration on the other substrate The irregularities formed on the one substrate 15 in step (D) in the cell culture container in the first embodiment The cell agglomerate formed in the shape recess can then be seeded on the other substrate 20 of the cell culture vessel. The step (E) can be preferably performed, for example, when culturing adhesive cells, and the cell adhesion surface 20a of the other substrate 20 can be made cell adhesive.
図８（ｃ）に示すように、第一の実施形態では、工程（Ｅ）において、細胞集塊の精密播種が可能である。具体的には、固定具８０により細胞培養容器１０と囲い体６０とを固定した状態で、固定具８０に備わった回転機構を駆動させて細胞培養容器１０を天地反転させて細胞集塊を他方の基板２０上に落下させることにより、細胞集塊を細胞培養容器の培養面（例えば、他方の基板２０）に精密播種することができる。工程（Ｅ）において細胞培養容器を天地反転させると、細胞集塊は、各凹みからほぼ垂直に培養容器の培養面に落下するため、天地反転させた凹みの配置と鏡映しの配置で培養面上に播種されることになる。従って、凹みは、培養面上に落下した後の細胞集塊の配置に基づいて設計することができる。これにより、培養容器の培養面上に細胞集塊を均一に播種することができ、細胞を培養面上で均一に増殖させ得る。播種された細胞集塊は、播種後速やかに展開し、その後、多能性を維持した状態で良好に培養することができる。細胞集塊を培養容器の培養面上に均一に播種する観点では、細胞集塊を含む細胞懸濁液は、十分に懸濁してから播種することが好ましい。 As shown in FIG. 8C, in the first embodiment, in the step (E), cell seeding can be precisely seeded. Specifically, in a state where the cell culture container 10 and the enclosure 60 are fixed by the fixing tool 80, the rotation mechanism provided in the fixing tool 80 is driven to turn the cell culture container 10 upside down so that the cell agglomeration is transferred to the other side. The cell agglomeration can be precisely seeded on the culture surface (for example, the other substrate 20) of the cell culture container. When the cell culture container is turned upside down in step (E), the cell agglomerates fall almost vertically from the dents onto the culture surface of the culture container. Will be sown on top. Therefore, the dent can be designed based on the arrangement of cell clumps after dropping on the culture surface. Thereby, the cell clumps can be uniformly seeded on the culture surface of the culture container, and the cells can be uniformly propagated on the culture surface. The seeded cell cluster can be rapidly developed after seeding, and then cultured well in a state where pluripotency is maintained. From the viewpoint of uniformly seeding the cell clumps on the culture surface of the culture vessel, it is preferable to seed the cell suspension containing the cell clumps after sufficient suspension.
重力による細胞集塊の沈降速度はそれほど速くないので、凹みの表面と細胞集塊とが接着していない場合であっても、第一の実施形態における細胞培養容器を天地反転させれば、比較的良好に細胞集塊を他方の基板の培養面上で整列させることができる。 Since the sedimentation rate of the cell clumps due to gravity is not so fast, even if the surface of the dent and the cell clumps are not adhered, if the cell culture container in the first embodiment is inverted, the comparison Cell clumps can be aligned on the culture surface of the other substrate.
図８（ｃ）に示すように、天地反転した後にも依然細胞集塊が凹みの表面に接着している場合には、一方の基板１５に付与している陰圧を解除して、一方の基板に形成させた凹凸形状を解消し、それにより細胞集塊と一方の基板１５との接触面の面積を低減させることにより解離させてもよい。 As shown in FIG. 8C, when the cell conglomeration still adheres to the surface of the dent after the top-and-bottom inversion, the negative pressure applied to one substrate 15 is released, It may be dissociated by eliminating the uneven shape formed on the substrate, thereby reducing the area of the contact surface between the cell conglomerate and one substrate 15.
図９に示すように、天地反転した後にも依然として細胞集塊が凹みの表面に接着している場合には、細胞集塊と一方の基板との解離は、様々な手法で行い得る。 As shown in FIG. 9, when the cell clump is still adhered to the surface of the dent even after the top-and-bottom reversal, the cell clump and the one substrate can be dissociated by various methods.
ここで、図９（ａ）は、図８（ｄ）に対応する状態を示す図である。図９（ａ）では、一方の基板１５の凹凸形状を解消した後も依然として一部の細胞集塊が一方の基板１５に接着し続けている。図９（ｂ）は、真空室に気体を供給して一方の基板１５を培養室１７に押し込み、これにより細胞集塊を一方の基板１５から解離し、他方の基板２０上へ落下させる方法を説明する図である。図９（ｃ）は、真空室の真空引きと真空室への気体の供給を繰り返し、これにより細胞集塊を一方の基板１５から解離し、他方の基板２０上へ落下させる方法を説明する図である。図９（ａ）、（ｂ）および（ｃ）では、培養室１７は培地で満たされている。また、図９（ａ）、（ｂ）および（ｃ）では、細胞培養容器１０と囲い体６０とは、固定具８０により固定されている。 Here, FIG. 9A is a diagram illustrating a state corresponding to FIG. In FIG. 9A, some cell clumps continue to adhere to one substrate 15 even after the uneven shape of one substrate 15 is eliminated. FIG. 9B shows a method in which gas is supplied to the vacuum chamber and one substrate 15 is pushed into the culture chamber 17, whereby the cell clump is dissociated from one substrate 15 and dropped onto the other substrate 20. It is a figure explaining. FIG. 9C illustrates a method of repeatedly evacuating the vacuum chamber and supplying the gas to the vacuum chamber, thereby dissociating the cell clump from one substrate 15 and dropping it onto the other substrate 20. It is. In FIGS. 9A, 9B, and 9C, the culture chamber 17 is filled with a medium. 9A, 9B, and 9C, the cell culture container 10 and the enclosure 60 are fixed by a fixture 80.
図９（ｂ）に示すように、一方の基板と細胞集塊との接着は、真空室に気体を供給して一方の基板１５を培養室１７内に押し込んで細胞集塊と一方の基板１５との接触面の面積を低減させることにより解離させてもよく、図９（ｃ）に示すように、真空室の真空引きと真空室への気体の供給を繰り返すことにより解離させてもよい。 As shown in FIG. 9B, the adhesion between the one substrate and the cell aggregate is performed by supplying a gas to the vacuum chamber and pushing the one substrate 15 into the culture chamber 17 so that the cell aggregate and the one substrate 15 are bonded. The surface may be dissociated by reducing the area of the contact surface, and may be dissociated by repeatedly evacuating the vacuum chamber and supplying the gas to the vacuum chamber as shown in FIG.
工程（Ｅ）の後には、（Ｅ’）細胞を他方の基板２０上で培養する工程をさらに行ってもよい。また、工程（Ｅ）では、培養細胞の顕微鏡観察を容易にする観点で、一方の基板１５に外方から陰圧を付与することにより形成させていた凹凸形状を解消する工程をさらに行ってもよい。凹凸形状を解消する工程を行う際には、培養室１７の体積が変化するため、必要培地量が変化する。工程（Ｅ）凹凸形状を解消する工程を行う際には、好ましくは、培地を培養室１７へ送液して、または培養室１７から排出して培養室１７の培地量を適正量に調節することができる。 After the step (E), (E ′) a step of culturing cells on the other substrate 20 may be further performed. Further, in the step (E), from the viewpoint of facilitating the microscopic observation of the cultured cells, a step of eliminating the uneven shape formed by applying a negative pressure to the one substrate 15 from the outside may be further performed. Good. When performing the process of eliminating the uneven shape, the volume of the culture chamber 17 changes, so the amount of required medium changes. Step (E) When performing the step of eliminating the concavo-convex shape, the medium is preferably fed to the culture chamber 17 or discharged from the culture chamber 17 to adjust the amount of the culture medium in the culture chamber 17 to an appropriate amount. be able to.
一方の基板１５からの細胞集塊の剥離の状況は、例えば、ＣＣＤカメラ（図示せず）などを用いてモニターすることができる。 The state of separation of cell clumps from one substrate 15 can be monitored using, for example, a CCD camera (not shown).
（Ｆ）凹みに播種して形成させた細胞集塊を一方の基板上で培養する工程
工程（Ｆ）では、第一の実施形態における細胞培養容器を天地反転させることなく、細胞を培養する（例えば、図１０）。工程（Ｆ）は、一方の基板１５は、例えば、細胞非接着コーティングがなされており、例えば、浮遊系細胞の細胞培養で好ましく行うことができる。(F) In the step (F)of culturing the cell clump formed by seeding in the dent on one substrate , the cells are cultured without inverting the cell culture container in the first embodiment ( For example, FIG. In the step (F), one of the substrates 15 is, for example, coated with a cell non-adhesive coating, and can be preferably performed, for example, in cell culture of floating cells.
ここで、図１０（ａ）は、第一の実施形態における細胞培養容器に細胞懸濁液が満たされた状態を示す図である。図１０（ｂ）に示すように、真空室６４を真空引きして第一の実施形態における細胞培養容器の一方の基板に多数のマイクロウェルを形成させ、形成させたマイクロウェルに細胞を播種して、細胞から細胞集塊を形成させる。次に、図１０（ｃ）に示すように、培養容器の天地反転操作をせずに、真空室の真空引きを解除して一方の基板に形成された凹凸形状を解消し、そのまま、一方の基板上１５上の細胞接着表面１５ａで細胞を培養する。図１０（ｂ）および（ｃ）では、培養室１７は培地で満たされている。 Here, Fig.10 (a) is a figure which shows the state with which the cell suspension liquid was filled with the cell culture container in 1st embodiment. As shown in FIG. 10B, the vacuum chamber 64 is evacuated to form a number of microwells on one substrate of the cell culture container in the first embodiment, and cells are seeded in the formed microwells. Cell aggregates from the cells. Next, as shown in FIG. 10 (c), without performing the top-and-bottom inversion operation of the culture vessel, the vacuuming of the vacuum chamber is released to eliminate the uneven shape formed on one substrate, Cells are cultured on the cell adhesion surface 15 a on the substrate 15. In FIGS. 10B and 10C, the culture chamber 17 is filled with the medium.
工程（Ｆ）では、細胞を培養する工程をさらに行ってもよい。工程（Ｆ）では、培養中の細胞の顕微鏡観察を容易にする観点で、一方の基板１５に外方から陰圧を付与することにより形成させていた凹凸形状を解消する工程をさらに行ってもよい。凹凸形状を解消する工程を行う際には、培養室１７の体積が変化するため、必要培地量が変化する。工程（Ｆ）凹凸形状を解消する工程を行う際には、好ましくは、培地を培養室１７へ送液して、または培養室１７から排出して培養室１７の培地量を適正量に調節することができる。 In the step (F), a step of culturing cells may be further performed. In the step (F), from the viewpoint of facilitating microscopic observation of cells in culture, a step of eliminating the uneven shape formed by applying a negative pressure to the one substrate 15 from the outside may be further performed. Good. When performing the process of eliminating the uneven shape, the volume of the culture chamber 17 changes, so the amount of required medium changes. Step (F) When performing the step of eliminating the uneven shape, preferably, the medium is fed to the culture chamber 17 or discharged from the culture chamber 17 to adjust the amount of the culture medium in the culture chamber 17 to an appropriate amount. be able to.
（Ｇ）培養した細胞を回収する工程
第一の実施形態における細胞培養容器の一方の基板１５または他方の基板２０に接着した細胞は、例えば、流路１３および培養室１７に細胞剥離液を送液することにより、および／または、細胞が接着した一方の基板１５または他方の基板２０に高周波振動を付与することにより、一方の基板１５または他方の基板２０から剥離して回収することができる。工程（Ｅ）または工程（Ｆ）で一方の基板１５の凹凸形状を解消した場合には、細胞剥離液の送液量を低減できる。(G) Step of collecting cultured cells For example, cells adhered to one substrate 15 or the other substrate 20 of the cell culture container in the first embodiment send a cell detachment solution to the flow path 13 and the culture chamber 17, for example. It can be peeled off from one substrate 15 or the other substrate 20 and collected by applying high frequency vibration to one substrate 15 or the other substrate 20 to which cells are adhered. When the uneven shape of one substrate 15 is eliminated in the step (E) or the step (F), the amount of the cell detachment solution fed can be reduced.
細胞剥離液としては、様々な細胞剥離液が知られ、当業者であれば適当な細胞剥離液を選択して用いることができる。例えば、細胞剥離液は、トリプシンおよび／または２価金属イオンキレート剤を含む、細胞培養培地または生理食塩水とすることができる。また、細胞培養培地を用いる場合には、血清を含まないものを用いることができる。 Various cell detachment solutions are known as the cell detachment solution, and those skilled in the art can select and use an appropriate cell detachment solution. For example, the cell detachment solution can be a cell culture medium or physiological saline containing trypsin and / or a divalent metal ion chelator. Moreover, when using a cell culture medium, what does not contain serum can be used.
高周波振動付与手段は、高周波振動として超音波を用いることができ、超音波は、例えば、市販の細胞破砕用の超音波発生器および超音波洗浄機用の超音波発生器を高周波振動発生源として用いて発生させることができる。高周波振動は、高周波振動発生源を閉鎖系培養容器の外方から一方の基板１５または他方の基板２０に近接させるか接触させると、一方の基板１５または他方の基板２０の培養室１７に接する面から細胞を剥離させることができる。高周波振動を細胞接着面に付与して剥離した細胞には物理的ダメージはほとんど見られず、その後も剥離した細胞を良好に培養することができる。高周波振動は、細胞と細胞接着面との接着を弱めるためにも用いることができるであろう。すなわち、細胞剥離液の送液と同時に高周波振動を与えることも可能である。 The high-frequency vibration applying means can use ultrasonic waves as the high-frequency vibrations, and the ultrasonic waves are generated using, for example, commercially available ultrasonic generators for cell disruption and ultrasonic generators for ultrasonic cleaners as high-frequency vibration sources. Can be generated. When the high frequency vibration generating source is brought close to or in contact with one substrate 15 or the other substrate 20 from the outside of the closed culture vessel, the surface contacting the culture chamber 17 of the one substrate 15 or the other substrate 20 is used. Cells can be peeled off. The cells detached by applying high-frequency vibration to the cell adhesion surface hardly show physical damage, and the detached cells can be cultured well thereafter. High frequency vibration could also be used to weaken the adhesion between cells and cell adhesion surfaces. That is, high-frequency vibration can be applied simultaneously with the feeding of the cell detachment solution.
このようにして、第一の実施形態では、第一の実施形態における細胞培養容器を用いて細胞を継代培養することができる。また、第一の実施形態では、第一の実施形態における細胞継代培養システムを用いて細胞を継代培養することができる。 Thus, in 1st embodiment, a cell can be subcultured using the cell culture container in 1st embodiment. Moreover, in 1st embodiment, a cell can be subcultured using the cell subculture system in 1st embodiment.
第二の実施形態
以下、第二の実施形態について説明する。Second embodiment Hereinafter, a second embodiment will be described.
（細胞培養容器）
第二の実施形態における細胞培養容器は、第一に実施形態における細胞培養容器１０と同じである。(Cell culture vessel)
The cell culture container in the second embodiment is the same as the cell culture container 10 in the first embodiment.
（細胞継代培養システム）
以下、図７により、第二の実施形態における細胞継代培養システムを説明する。第二の実施形態における細胞継代培養システムは、囲い体の構造が異なるのみであり、その他の構成は、図４に示す第一の実施形態における細胞継代培養システムと同様である。(Cell subculture system)
Hereinafter, the cell subculture system in the second embodiment will be described with reference to FIG. The cell subculture system in the second embodiment is different only in the structure of the enclosure, and the other configuration is the same as that of the cell subculture system in the first embodiment shown in FIG.
第二の実施形態における細胞継代培養システムは、図７（ｄ）に示すように、細胞培養容器１０と、細胞培養容器の一方の基板の外方に設けられ、一方の基板に対向する対向面に複数の突起をもつ囲い体６０とを備えている。第二の実施形態における細胞継代培養システムでは、囲い体の対向面に真空源９２が接続され、この真空源９２を動作させることにより囲い体の複数の突起を有する対向面を真空引きして一方の基板に突起により凹凸形状を形成させることができる。 As shown in FIG. 7D, the cell subculture system in the second embodiment is provided outside the cell culture container 10 and one substrate of the cell culture container, and is opposed to the one substrate. And an enclosure 60 having a plurality of protrusions on the surface. In the cell subculture system in the second embodiment, a vacuum source 92 is connected to the opposing surface of the enclosure, and the vacuum source 92 is operated to evacuate the opposing surface having a plurality of protrusions of the enclosure. An uneven shape can be formed on one substrate by protrusions.
ここで、図７（ａ）は、囲い体６０の上方平面図を示し、図７（ｂ）は、そのＡ−Ａ断面における側方断面図を示す。また、図７（ｃ）は、一方の基板１５と囲い体６０とを、一方の基板１５と囲い体６０との間に真空室６４を形成させるように接触させ、その後、真空源９２を動作させることにより一方の基板に突起により凹凸形状を形成させている状態の細胞継代培養システムの上方平面図を示し、図７（ｄ）は、そのＡ−Ａ断面における側方断面図を示す。 Here, Fig.7 (a) shows the upper top view of the enclosure 60, FIG.7 (b) shows the side sectional drawing in the AA cross section. FIG. 7C shows that one substrate 15 and the enclosure 60 are brought into contact with each other so as to form a vacuum chamber 64 between the one substrate 15 and the enclosure 60, and then the vacuum source 92 is operated. FIG. 7 (d) shows a side cross-sectional view of the AA cross-section of the cell subculture system in a state in which an uneven shape is formed on one substrate by protrusions.
まず、図７に示すように囲い体６０は、細胞培養容器１０の一方の基板１５と接触させて真空室６４を形成するように接触させた場合に、一方の基板１５に対向する対向面に複数の突起６１を有する。真空室６４は、真空源９２との接続口６２を介して、真空源９２と接続され、この真空源９２を動作させて真空室６４を真空引きすることにより一方の基板１５に突起６１により凹み６５を形成させることができる（図７（ｃ）および（ｄ））。 First, as shown in FIG. 7, when the enclosure 60 is brought into contact with one substrate 15 of the cell culture container 10 so as to form a vacuum chamber 64, the enclosure 60 faces the opposite surface facing the one substrate 15. A plurality of protrusions 61 are provided. The vacuum chamber 64 is connected to the vacuum source 92 via the connection port 62 with the vacuum source 92, and the vacuum chamber 92 is operated to evacuate the vacuum chamber 64, so that one substrate 15 is recessed by the protrusion 61. 65 can be formed (FIGS. 7 (c) and (d)).
突起６１は、すべてが同じ高さを有する必要は必ずしも無いが、好ましくは図７（ｂ）および（ｄ）に示すように、すべての突起６１が同じ高さを有し、より好ましくは囲い体の側壁６３とほぼ同じ高さであり、これにより、一方の基板１５と囲い体６０とを接触させると、突起６１は、一方の基板１５に接触するか、一方の基板１５の近傍に複数の突起６１の先端部が位置する。 The protrusions 61 do not necessarily have to have the same height, but preferably, as shown in FIGS. 7B and 7D, all the protrusions 61 have the same height, and more preferably an enclosure. Accordingly, when the one substrate 15 and the enclosure 60 are brought into contact with each other, the protrusion 61 comes into contact with one substrate 15 or a plurality of members near the one substrate 15. The tip of the protrusion 61 is located.
突起６１の形状は、真空室６４を真空引きしたときに一方の基板１５に凹み６５が形成される形状であれば特に限定されない。突起６１の形状は、成形の容易さや必要な材料量の低減の観点からは、例えば、錐形状（例えば、円錐）または柱状（例えば、円柱）とすることができる。また、突起６１との接触による一方の基板１５の損傷を防ぐ観点で、例えば、突起１６の先端部は、Ｒ０．３ｍｍ〜０．７ｍｍ、またはＲ０．４ｍｍ〜０．６ｍｍの丸み形状とすることができる。 The shape of the protrusion 61 is not particularly limited as long as the recess 65 is formed in one substrate 15 when the vacuum chamber 64 is evacuated. The shape of the protrusion 61 can be, for example, a cone shape (for example, a cone) or a columnar shape (for example, a cylinder) from the viewpoint of ease of molding and reduction of a necessary amount of material. Further, from the viewpoint of preventing damage to one of the substrates 15 due to contact with the protrusion 61, for example, the tip of the protrusion 16 has a round shape of R0.3 mm to 0.7 mm or R0.4 mm to 0.6 mm. Can do.
突起６１の配置は、形成する凹み６５の平面配置に応じて当業者であれば適宜設定することができる。例えば、突起６１は碁盤の目状に整列させることにより、碁盤状に整列した凹み６５を形成させることができる（例えば、図７）。また、例えば、突起６１はハニカム状に平面を埋め尽くした平行六角形（例えば、正六角形）の各頂点に配置することで、一方の基板１５にハニカム状に整列した凹み６５を形成させることができる。 The arrangement of the protrusions 61 can be appropriately set by those skilled in the art according to the planar arrangement of the recesses 65 to be formed. For example, the protrusions 61 can be aligned in a grid pattern to form a recess 65 aligned in a grid pattern (for example, FIG. 7). Further, for example, the protrusions 61 are arranged at the apexes of parallel hexagons (for example, regular hexagons) in which the plane is filled in a honeycomb shape, so that the recesses 65 aligned in the honeycomb shape can be formed on one substrate 15. it can.
突起６１の配置間隔は、例えば０．４ｍｍ〜５ｍｍ、例えば０．８ｍｍ〜３ｍｍ、または例えば１ｍｍ〜２ｍｍとすることができる。このようにすることで、一方の基板１５に形成される凹み６５に細胞を播種して、多能性幹細胞に５０μｍ〜３５０μｍ程度の直径を有する細胞集塊（細胞数で約２５個〜約３，５００個）を形成させることができる。 The arrangement interval of the protrusions 61 can be set to, for example, 0.4 mm to 5 mm, for example, 0.8 mm to 3 mm, or for example, 1 mm to 2 mm. In this way, cells are seeded in the dent 65 formed on one substrate 15, and pluripotent stem cells have a cell clump having a diameter of about 50 μm to 350 μm (about 25 to about 3 cells). , 500) can be formed.
囲い体６０は、真空源９２との接続口６２を一つ有していても複数有していてもよい。囲い体６０と本発明の細胞培養容器１０との接合面には、真空室６４の気密性を向上させる観点で、Ｏリングなどのシール材を介在させることができる（例えば、図８（ｂ）のシール材２１）。 The enclosure 60 may have one or more connection ports 62 with the vacuum source 92. From the viewpoint of improving the airtightness of the vacuum chamber 64, a sealing material such as an O-ring can be interposed at the joint surface between the enclosure 60 and the cell culture vessel 10 of the present invention (for example, FIG. 8B). Sealing material 21).
（第二の実施形態における作用）
次に、図７（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）により細胞培養容器１０の一方の基板１５に凹凸形状を形成させる方法を説明する。(Operation in Second Embodiment)
Next, a method of forming a concavo-convex shape on one substrate 15 of the cell culture vessel 10 will be described with reference to FIGS. 7 (a), (b), (c) and (d).
まず、図７（ｃ）および（ｄ）に示すように、細胞培養容器１０の一方の基板１５の外方に真空室６４が形成されるように囲い体６０を接触させる。次に、囲い体６０の一方の基板に対向する面には真空源９２との接続口６２が設けられ、真空源９２を動作させ、真空室６４を真空引きする。すると、図７（ｃ）および（ｄ）に示すように、一方の基板１５に凹凸形状６５が形成される。細胞培養容器１０では、一方の基板１５は伸縮性材料からなり、一方の基板１５に形成させた凹凸形状６５は、真空引きを解除することにより容易に解消される。このようにして、細胞培養容器１０と囲い体６０を備えた第二の実施形態における細胞培養システムは、一方の基板１５に凹凸形状を形成させ、形成させた凹凸形状を解消させることができる。 First, as shown in FIGS. 7C and 7D, the enclosure 60 is brought into contact so that the vacuum chamber 64 is formed outside the one substrate 15 of the cell culture container 10. Next, a connection port 62 with a vacuum source 92 is provided on the surface of the enclosure 60 facing the one substrate, the vacuum source 92 is operated, and the vacuum chamber 64 is evacuated. As a result, as shown in FIGS. 7C and 7D, an uneven shape 65 is formed on one substrate 15. In the cell culture container 10, one substrate 15 is made of a stretchable material, and the uneven shape 65 formed on the one substrate 15 is easily eliminated by releasing the vacuum. In this manner, the cell culture system according to the second embodiment including the cell culture container 10 and the enclosure 60 can form an uneven shape on one substrate 15 and eliminate the formed uneven shape.
次に、第二の実施形態における細胞の継代方法を説明する。第二の実施形態における細胞の継代培養方法は、工程（Ｂ）において細胞培養容器の一方の基板に凹凸形状を形成させる原理が異なるのみであり、それ以外の部分は、第一の実施形態と同様である。 Next, the cell passage method in the second embodiment will be described. The cell subculture method in the second embodiment is different only in the principle of forming a concavo-convex shape on one substrate of the cell culture container in the step (B), and other parts are the same as those in the first embodiment. It is the same.
具体的には、第二の実施形態における細胞の継代培養方法では、工程（Ｂ）において第二の実施形態における継代培養システムに備わる囲い体６０を用いて細胞培養容器の一方の基板に凹凸形状を形成させる。 Specifically, in the cell subculture method in the second embodiment, in step (B), the enclosure 60 provided in the subculture system in the second embodiment is used on one substrate of the cell culture container. An uneven shape is formed.
第三の実施形態
以下、第三の実施形態について説明する。Third Embodiment Hereinafter, a third embodiment will be described.
（細胞培養容器）
以下、図５により、本発明の第三の実施形態について説明する。図５に示す第三の実施形態における細胞培養容器は、一方の基板１５の形状が異なるのみであり、その他の構成は、図１〜３に示す第一の実施形態における細胞培養容器と同様である。図５において、図１〜３に示す第一の実施形態における細胞培養システムと同一部分には同一符号を付して説明は省略する。(Cell culture vessel)
Hereinafter, a third embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. The cell culture container in the third embodiment shown in FIG. 5 is different only in the shape of one substrate 15, and the other configuration is the same as the cell culture container in the first embodiment shown in FIGS. is there. In FIG. 5, the same parts as those in the cell culture system in the first embodiment shown in FIGS.
ここで、図５（ａ）は、第三の実施形態における細胞培養容器４０の一方の基板１５Ａの上方平面図を示し、図５（ｂ）は、そのＡ−Ａ断面における側方断面図を示す。また、図５（ｅ）は、第三の実施形態における細胞培養容器４０において一方の基板１５Ａに一方の基板１５Ａの外方から陰圧を付与して一方の基板１５Ａに凹凸形状を形成させることができることを示す図である。図５（ｆ）は、第三の実施形態における細胞培養容器４０の、図２のＡ−Ａ断面に相当する断面での側方断面図である。 Here, Fig.5 (a) shows the upper top view of one board | substrate 15A of the cell culture container 40 in 3rd embodiment, FIG.5 (b) shows the side sectional view in the AA cross section. Show. FIG. 5E shows that in the cell culture container 40 according to the third embodiment, a negative pressure is applied to the one substrate 15A from the outside of the one substrate 15A to form an uneven shape on the one substrate 15A. It is a figure which shows that it can do. FIG. 5F is a side cross-sectional view of the cell culture container 40 according to the third embodiment, taken along a cross section corresponding to the AA cross section of FIG.
第三の実施形態における細胞培養容器では、一方の基板１５Ａは、複数の開口を形成する硬質フレーム部４２と、フレームの各開口内に延びる伸縮部４１からなり、一方の基板１５Ａに外方から陰圧を付与した場合、一方の基板のフレーム内の伸縮部４１が伸びて、一方の基板１５Ａに凹み４３（マイクロウェル）凹凸形状を形成する（例えば、図５（ｅ））。硬質フレーム部４２および伸縮部４１は、凹み４３の所望の形状および配置に応じて設計することができ、図５（ａ）および（ｂ）に示すように碁盤状に硬質フレーム部４２および伸縮部４１を配置すると凹みは碁盤状に形成される。 In the cell culture container according to the third embodiment, one substrate 15A includes a hard frame portion 42 that forms a plurality of openings, and a stretchable portion 41 that extends into each opening of the frame. When a negative pressure is applied, the stretchable part 41 in the frame of one substrate extends to form a recess 43 (microwell) uneven shape on one substrate 15A (for example, FIG. 5E). The hard frame portion 42 and the stretchable portion 41 can be designed according to the desired shape and arrangement of the recesses 43, and as shown in FIGS. 5A and 5B, the hard frame portion 42 and the stretchable portion are shaped like a grid. If 41 is arrange | positioned, a dent will be formed in a grid shape.
一方の基板１５Ａにおいては、少なくとも伸縮部４１は、伸縮性材料からなり、一定の陰圧により伸縮部４１を細胞培養容器４０の外方に引込むことができる。硬質フレーム部４２は、一定の陰圧により実質的に形態変化を起こさない程度の硬度を有する限り、材質は問わず、材質は伸縮部４１と同一でも異なっていてもよい。好ましい態様では、硬質フレーム部４２は、伸縮部４１と同じ伸縮性材料からなるが、一定の陰圧により形態変化を実質的に起こさない程度の厚みを有する。このようにすることで、一方の基板１５の外方から細胞培養容器４０に陰圧を付与すると、一方の基板１５Ａは、各伸縮部４１において凹み４３を形成することができる。なお、培養室１７に面する部分の平面性を確保する観点で、一方の基板１５Ａの凹凸加工は、細胞培養容器４０の外方に施されることが好ましい（図５（ｅ））。 In one substrate 15A, at least the stretchable portion 41 is made of a stretchable material, and the stretchable portion 41 can be pulled out of the cell culture container 40 by a certain negative pressure. The hard frame portion 42 may be the same as or different from the stretchable portion 41 regardless of the material, as long as the hard frame portion 42 has a hardness that does not substantially change its shape due to a certain negative pressure. In a preferred embodiment, the hard frame portion 42 is made of the same stretchable material as the stretchable portion 41, but has a thickness that does not substantially cause a shape change due to a certain negative pressure. In this way, when a negative pressure is applied to the cell culture container 40 from the outside of the one substrate 15, the one substrate 15 </ b> A can form a recess 43 in each of the stretchable portions 41. In addition, from the viewpoint of ensuring the flatness of the portion facing the culture chamber 17, it is preferable that the uneven processing of the one substrate 15A is performed outside the cell culture vessel 40 (FIG. 5 (e)).
本発明の細胞培養容器４０では、硬質フレーム部と伸縮部の硬度は、一方の基板１５に付与する陰圧との関係で適宜設定することができ、例えば、伸縮部の硬度をタイプＡデュロメーター硬度で２０〜６５、好ましくは、２０〜３０（単位）とすることができる。 In the cell culture container 40 of the present invention, the hardness of the hard frame portion and the stretchable portion can be appropriately set in relation to the negative pressure applied to the one substrate 15. For example, the hardness of the stretchable portion is the type A durometer hardness. 20 to 65, preferably 20 to 30 (unit).
第三の実施形態における細胞培養容器は、一方の基板１５Ａに対して外部から陰圧を付与するだけで、一方の基板１５Ａに凹凸形状を形成させ、陰圧を解除することにより凹凸形状を解消できる点で、複雑な形状の囲い体を必要とする第一の実施形態における細胞培養容器よりも有利である。 In the cell culture container according to the third embodiment, the concave / convex shape is eliminated by forming a concave / convex shape on one substrate 15A and releasing the negative pressure only by applying a negative pressure from the outside to the one substrate 15A. This is advantageous over the cell culture vessel in the first embodiment that requires a complex-shaped enclosure.
（細胞継代培養システム）
以下、図５により、第三の実施形態における細胞継代培養システムについて説明する。第三の実施形態における細胞継代培養システムは、細胞培養容器および囲い体の構造において異なるのみであり、その他の構成は、図１に示す第一の実施形態における細胞継代培養システムと同様である。(Cell subculture system)
Hereinafter, the cell subculture system in the third embodiment will be described with reference to FIG. The cell subculture system in the third embodiment is different only in the structure of the cell culture container and the enclosure, and the other configuration is the same as that of the cell subculture system in the first embodiment shown in FIG. is there.
すなわち、第三の実施形態における細胞継代培養システムは、第三の実施形態における細胞培養容器と、細胞培養容器の一方の基板の外方に、一方の基板との間に真空室を形成する囲い体４５とを備えている。第三の実施形態における細胞継代培養システムでは、真空室４４には、真空源９２が接続され、この真空源９２を動作させて真空室を真空引きすることにより一方の基板に凹凸形状４３が形成される。囲い体４５は、一方の基板１５Ａまたは１５Ｂと囲い体との間に真空室４４を形成するが、囲い体３０または囲い体６０とは異なり、一方の基板に向かう対向面に一方の基板にウェルを形成させるための凹凸形状を有する必要は無い。 That is, the cell subculture system in the third embodiment forms a vacuum chamber between the cell culture container in the third embodiment and one substrate outside the cell culture container. And an enclosure 45. In the cell subculture system according to the third embodiment, a vacuum source 92 is connected to the vacuum chamber 44. By operating the vacuum source 92 and evacuating the vacuum chamber, the uneven shape 43 is formed on one substrate. It is formed. The enclosure 45 forms a vacuum chamber 44 between one of the substrates 15A or 15B and the enclosure. Unlike the enclosure 30 or the enclosure 60, the enclosure 45 has a well on the opposite surface facing the one substrate. It is not necessary to have a concavo-convex shape for forming.
（第三の実施形態の作用）
次に、第三の実施形態における細胞培養容器の一方の基板に凹凸形状を形成させる方法を説明する。第三の実施形態における細胞継代培養システムでは、第三の実施形態における細胞培養容器は、一方の基板に対して外方から陰圧を付与するだけで、一方の基板に所望の凹凸形状が形成されるように構成されている。(Operation of the third embodiment)
Next, a method for forming an uneven shape on one substrate of the cell culture container in the third embodiment will be described. In the cell subculture system in the third embodiment, the cell culture container in the third embodiment has a desired uneven shape on one substrate only by applying a negative pressure from the outside to one substrate. It is comprised so that it may be formed.
次に、第三の実施形態における細胞の継代培養方法を説明する。第三の実施形態における細胞の継代培養方法は、工程（Ｂ）において細胞培養容器の一方の基板に凹凸形状を形成させる原理が異なるのみであり、その他の構成は、第一の実施形態と同様である。 Next, the cell subculture method in the third embodiment will be described. The cell subculture method in the third embodiment is different from the first embodiment only in the principle of forming an uneven shape on one substrate of the cell culture container in the step (B). It is the same.
具体的には、第三の実施形態における細胞の継代培養方法では、工程（Ｂ）において、第三の実施形態における細胞培養容器と第三の実施形態の継代培養システムに備わる囲い体４５を用いて、細胞培養容器の一方の基板に凹凸形状を形成させる。 Specifically, in the cell subculture method in the third embodiment, in the step (B), the enclosure 45 provided in the cell culture container in the third embodiment and the subculture system in the third embodiment is provided. Is used to form an uneven shape on one substrate of the cell culture vessel.
（第三の実施形態の変形例）
次に、第三の実施形態の変形例を説明する。第三の実施形態の変形例では、細胞培養容器の一方の基板１５の構造が異なるのみであり、その他の部分は図５（ａ）、（ｂ）、（ｅ）および（ｆ）に示す第三の実施形態と同一である。具体的には、第三の実施形態の変形例では、図５（ａ）および（ｂ）に示す第一の基板１５Ａの代わりに、図５（ｃ）および（ｄ）に示す構造を有する第一の基板１５Ｂを備えた細胞培養容器を用いる。(Modification of the third embodiment)
Next, a modification of the third embodiment will be described. In the modification of the third embodiment, only the structure of one substrate 15 of the cell culture container is different, and the other parts are the first shown in FIGS. 5 (a), (b), (e) and (f). This is the same as the third embodiment. Specifically, in the modification of the third embodiment, instead of the first substrate 15A shown in FIGS. 5A and 5B, the first structure having the structure shown in FIGS. 5C and 5D is used. A cell culture vessel provided with one substrate 15B is used.
第三の実施形態の変形例で用いる細胞培養容器の一方の基板１５の構造を図５（ｃ）および（ｄ）により説明する。ここで、図５（ｃ）は、第三の実施形態における細胞培養容器４０の一方の基板１５Ｂの上方平面図を示し、図５（ｄ）は、そのＡ−Ａ断面における側方断面図を示す。 The structure of one substrate 15 of the cell culture container used in the modification of the third embodiment will be described with reference to FIGS. Here, FIG.5 (c) shows the upper top view of one board | substrate 15B of the cell culture container 40 in 3rd embodiment, FIG.5 (d) shows the side sectional view in the AA cross section. Show.
第三の実施形態の変形例で用いる細胞培養容器では、図５（ｃ）および（ｄ）に示すように、一方の基板１５Ｂは、一方の基板１５Ｂに陰圧を付与して形成させる凹みの底端を鋭くする観点で、伸縮部４１ｂは厚みを徐々に変化させることができ、具体的には、凹みの底端部を形成する部分が最も薄くなるように加工することができる。 In the cell culture container used in the modification of the third embodiment, as shown in FIGS. 5C and 5D, one substrate 15B is formed with a recess formed by applying a negative pressure to one substrate 15B. From the viewpoint of sharpening the bottom end, the stretchable portion 41b can be gradually changed in thickness, and specifically, can be processed so that the portion forming the bottom end portion of the recess becomes the thinnest.
第三の実施形態の変形例で用いる細胞培養容器は、一方の基板１５Ｂに対して外部から陰圧を付与するだけで、一方の基板１５Ｂに凹凸形状を形成させ、陰圧を解除することにより凹凸形状を解消できる点で、複雑な形状の囲い体を必要とする第一の実施形態における細胞培養容器よりも有利である。 In the cell culture container used in the modification of the third embodiment, by only applying negative pressure from the outside to one substrate 15B, an uneven shape is formed on one substrate 15B, and the negative pressure is released. It is more advantageous than the cell culture container in the first embodiment that requires a complex-shaped enclosure in that the uneven shape can be eliminated.
次に、第三の実施形態のさらなる変形例を説明する。第三の実施形態のさらなる変形例では、用いる細胞培養容器の一方の基板１５の構造が異なるのみであり、その他の部分は図５（ａ）、（ｂ）、（ｅ）および（ｆ）に示す第三の実施形態と同一である。具体的には、第三の実施形態のさらなる変形例では、図５（ａ）および（ｂ）に示す一方の基板１５Ａの代わりに、図６（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）に示す構造を有する一方の基板１５Ｃを備えた細胞培養容器を用いる。 Next, a further modification of the third embodiment will be described. In a further modification of the third embodiment, only the structure of one substrate 15 of the cell culture container to be used is different, and the other parts are shown in FIGS. 5 (a), (b), (e) and (f). This is the same as the third embodiment shown. Specifically, in a further modification of the third embodiment, instead of the one substrate 15A shown in FIGS. 5A and 5B, FIGS. 6A, 6B, 6D and 6D are used. A cell culture vessel provided with one substrate 15C having the structure shown in e) is used.
ここで、図６（ａ）は、第三の実施形態のさらなる変形例で用いる細胞培養容器５０の一方の基板１５Ｃの上方平面図を示し、図６（ｂ）は、そのＡ−Ａ断面における側方断面図を示す。また、図６（ｅ）は、第三の実施形態のさらなる変形例で用いる細胞培養容器５０の、図２のＡ−Ａ断面に対応する断面における側方断面図である。 Here, Fig.6 (a) shows the upper top view of one board | substrate 15C of the cell culture container 50 used in the further modification of 3rd embodiment, FIG.6 (b) is in the AA cross section. A side sectional view is shown. Moreover, FIG.6 (e) is a side sectional view in the cross section corresponding to the AA cross section of FIG. 2 of the cell culture container 50 used in the further modification of 3rd embodiment.
一方の基板１５Ｃは、複数の開口を形成する硬質部５２と、硬質部の各開口内に延びる伸縮部５１からなり、一方の基板１５Ｃに外方から陰圧を付与した場合、一方の基板のフレーム内の伸縮部５１が伸びて、一方の基板１５Ｃに凹み５３（マイクロウェル）凹凸形状を形成する（例えば、図６（ｄ））。硬質部５２および伸縮部５１は、凹み５３の所望の形状および配置に応じて設計することができ、図５（ａ）および（ｂ）に示すように碁盤状に硬質部５２および伸縮部５１を配置すると凹みは碁盤状に形成される。 One substrate 15C includes a hard portion 52 that forms a plurality of openings, and a stretchable portion 51 that extends into each opening of the hard portion. When negative pressure is applied to one substrate 15C from the outside, The stretchable part 51 in the frame extends to form a concave 53 (microwell) uneven shape on one substrate 15C (for example, FIG. 6D). The hard part 52 and the expansion / contraction part 51 can be designed according to the desired shape and arrangement of the recesses 53, and the hard part 52 and the expansion / contraction part 51 are arranged in a grid pattern as shown in FIGS. 5 (a) and 5 (b). When arranged, the recess is formed in a grid shape.
一方の基板１５Ｃにおいては、少なくとも伸縮部５１は、伸縮性材料からなり、一定の陰圧により伸縮部５１を細胞培養容器５０の外方に引込むことができる。硬質部５２は、一定の陰圧により実質的に形態変化を起こさない程度の硬度を有する限り、材質は問わず、材質は伸縮部５１と同一でも異なっていてもよい。好ましい態様では、硬質部５２は、伸縮部５１と同じ伸縮性材料からなるが、一定の陰圧により形態変化を実質的に起こさない程度の厚みを有する。このようにすることで、一方の基板１５の外方から細胞培養容器５０に陰圧を付与すると、一方の基板１５Ｃは、各伸縮部５１において凹み５３を形成することができる。 In one substrate 15C, at least the stretchable part 51 is made of a stretchable material, and the stretchable part 51 can be pulled out of the cell culture container 50 by a constant negative pressure. The hard part 52 may be the same as or different from the stretchable part 51 regardless of the material, as long as the hard part 52 has a hardness that does not substantially cause a shape change due to a certain negative pressure. In a preferred embodiment, the hard portion 52 is made of the same stretchable material as that of the stretchable portion 51, but has a thickness that does not substantially cause a shape change due to a certain negative pressure. In this way, when a negative pressure is applied to the cell culture container 50 from the outside of the one substrate 15, the one substrate 15 </ b> C can form a recess 53 in each stretchable part 51.
第三の実施形態のさらなる変形例で用いる細胞培養容器５０は、一方の基板１５Ｃに対して外部から陰圧を付与するだけで、一方の基板１５Ｃに凹凸形状を形成させ、陰圧を解除することにより凹凸形状を解消できる点で、複雑な形状の囲い体を必要とする第一の実施形態における細胞培養容器よりも有利である。 The cell culture container 50 used in the further modification of the third embodiment forms an uneven shape on one substrate 15C and releases the negative pressure only by applying a negative pressure from the outside to one substrate 15C. This is advantageous over the cell culture vessel in the first embodiment that requires a complex-shaped enclosure in that the uneven shape can be eliminated.
次に、第三の実施形態のさらなる変形例を説明する。第三の実施形態のさらなる変形例では、用いる細胞培養容器の一方の基板１５の構造が異なるのみであり、その他の部分は図６（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）に示す構造を有する第一の基板１５Ｃを備えた細胞培養容器と同じである。具体的には、第三の実施形態のさらなる変形例では、図６（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）に示す構造を有する一方の基板１５Ｃの代わりに、図６（ｃ）に示す構造を有する一方の基板１５Ｄを備えた細胞培養容器を用いる。 Next, a further modification of the third embodiment will be described. In a further modification of the third embodiment, only the structure of one substrate 15 of the cell culture container to be used is different, and the other parts are shown in FIGS. 6 (a), (b), (d) and (e). This is the same as the cell culture vessel provided with the first substrate 15C having the structure shown. Specifically, in a further modification of the third embodiment, instead of one substrate 15C having the structure shown in FIGS. 6A, 6B, 6D and 6E, FIG. The cell culture vessel provided with one substrate 15D having the structure shown in FIG.
ここで、図６（ｃ）は、第五の実施形態における細胞培養容器の一方の基板１５Ｄの、図６（ｂ）に対応する側方断面図である。 Here, FIG.6 (c) is a side sectional view corresponding to FIG.6 (b) of one board | substrate 15D of the cell culture container in 5th embodiment.
第三の実施形態のさらなる変形例では、細胞培養容器では、図６（ｃ）に示すように伸縮部５１は、形成されるマイクロウェルの底端を鋭くする観点で、例えば、膜の硬度を徐々に変化させる、具体的には、５１ｂから５１ａにかけて膜の硬度が徐々に低くなり、マイクロウェルの底端を形成する部分（例えば、５１ａ）が最も硬度が低くなるように加工することができる。このようにすることで、一方の基板１５Ｄの外方から細胞培養容器に陰圧を付与すると、一方の基板１５Ｄは、伸縮部５１において凹み５３を形成することができる。硬質部５２および伸縮部５１を有する一方の基板１５Ｄは、当業者であればインサート成形手法などの公知の手法により容易に作製することができる。 In a further modification of the third embodiment, in the cell culture container, as shown in FIG. 6C, the stretchable part 51 has, for example, the hardness of the film from the viewpoint of sharpening the bottom end of the formed microwell. The hardness of the film is gradually decreased from 51b to 51a, and the portion forming the bottom end of the microwell (for example, 51a) can be processed to have the lowest hardness. . In this way, when a negative pressure is applied to the cell culture container from the outside of one substrate 15 </ b> D, the one substrate 15 </ b> D can form a recess 53 in the stretchable part 51. One board | substrate 15D which has the hard part 52 and the expansion-contraction part 51 can be easily produced by well-known methods, such as an insert molding method, if it is those skilled in the art.
第三の実施形態のさらなる変形例では、一方の基板１５Ｄに対して外部から陰圧を付与するだけで、一方の基板１５Ｄに凹凸形状を形成させ、陰圧を解除することにより凹凸形状を解消できる点で、複雑な形状の囲い体を必要とする第一の実施形態における細胞培養容器よりも有利である。 In a further modification of the third embodiment, the concave / convex shape is eliminated by forming a concave / convex shape on one substrate 15D and releasing the negative pressure only by applying a negative pressure from the outside to one substrate 15D. This is advantageous over the cell culture vessel in the first embodiment that requires a complex-shaped enclosure.
実施例１：ヒトｉＰＳ細胞の単一細胞化とその後の継代方法の検討
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞は、継代の際に単一細胞にまでばらばらにすると細胞死が誘導される。また、胚様体様にすると細胞が分化を開始することが懸念される。本実施例では、単一細胞にまでばらばらにした後に、速やかに細胞集塊を形成させてから、継代を行った場合に細胞死や分化の問題が生じるか否かを検討した。Example 1: Examination of human iPS cells into single cells and subsequent passage methods When pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells are separated into single cells during passage, cell death is induced. Is done. In addition, there is a concern that cells may start to differentiate when embryoid bodies are formed. In this example, it was examined whether cell death or differentiation problems would occur when cell clumps were rapidly formed after being dissociated into single cells and then passaged.
本実施例では、細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞（公益財団法人 先端医療振興財団 細胞評価グループ 川真田研究室による樹立株）を用いた。培養は、フィーダーレスの条件で行った。培地は、ＲｅｐｒｏＦＦ２培地（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社製、製品番号：ＲＣＨＥＭＤ００６）にｂＦＧＦ（和光純薬工業社製、製品番号：０６４−０４５４１）最終濃度５ｎｇ／ｍＬを添加した培地を用いた。また、培養容器としては、１０ｍｍ細胞培養ディッシュ（ＢＤ社製、製品番号：ＲＥＦ３５３００３）を用い、ｉＰＳ細胞の培養容器への接着性を担保するため、製造業者の取扱説明書に記載の方法に従って、培養前に培養容器内をＥＣＭでコーティングした。ＥＣＭは、ＢＤマトリゲル（ＢＤ社製、製品番号：３５６２３４）を用いた。 In this example, human iPS cells (established strain by Kawasada Laboratory, Cell Evaluation Group, Advanced Medical Promotion Foundation) were used as cells. The culture was performed under feeder-less conditions. As the medium, a medium in which bFGF (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, product number: 064-04541) final concentration of 5 ng / mL was added to ReproFF2 medium (manufactured by ReproCell, product number: RCHEMD006). Further, as a culture vessel, a 10 mm cell culture dish (manufactured by BD, product number: REF353003) is used, and in order to ensure adhesion of iPS cells to the culture vessel, according to the method described in the manufacturer's instruction manual, Before culturing, the inside of the culture vessel was coated with ECM. For ECM, BD Matrigel (manufactured by BD, product number: 356234) was used.
細胞は常法によりコンフルエントになるまで培養した。その後、継代のために培地を吸引除去し、１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、製品番号：１４１９０）で細胞を１回洗浄した。その後、１ｍＬのアキュターゼ溶液（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、製品番号：ＡＴ１０４）で３７℃で５分間処理し、細胞をチューブに回収した。 Cells were cultured until confluent by conventional methods. Thereafter, the medium was removed by aspiration for passage, and the cells were washed once with 10 mL of phosphate buffered saline (manufactured by Life technologies, product number: 14190). Thereafter, the cells were treated with 1 mL of an actase solution (manufactured by Innovative cell technologies, product number: AT104) at 37 ° C. for 5 minutes, and the cells were collected in a tube.
遠心分離（４４０ｇ、５分）により細胞を回収し、上清を吸引除去して細胞を１ｍＬの培地に再懸濁し、培地にＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２（ＳＴＥＭＧＥＮＴ社製、製品番号：０４−００１２）を最終濃度１０μＭとなるように添加して細胞懸濁液を得た。その後、細胞は、単一細胞レベルになるまでピペッティングの水流により細胞塊を砕いた。細胞懸濁液中の細胞濃度を調整し、細胞懸濁液をアグリウェル（ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ） ８００（STEMCELL Technologies社製）のウェルに注入した。その後、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ ８００の遠心分離（２０００ｇ、５分）を行い、または、行わないで、３７℃で一晩培養して細胞集塊を形成させた。遠心を行った場合および行わなかった場合の播種直後および１日後の細胞の状態は、図１１Ａに示される通りであった。すなわち、遠心を行った場合には、播種直後から逆ピラミッド形状のウェルの底に細胞が集まっていたが（図１１Ａ−左上）、遠心を行わなかった場合には、細胞は集まっていなかった（図１１Ａ−右上）。しかし、１日経過すると遠心を行った場合（図１１Ａ−左下）も行わなかった場合（図１１Ａ−右下）も細胞はウェルの底に集まり細胞集塊を形成していた。また、得られた細胞集塊は、ほぼ均一なサイズを有していた（図１１Ｂ）。また、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌのウェル中での静置時間は８時間および１２時間でもそれぞれ細胞集塊を形成し、８時間〜１２時間で十分であった（データ省略）。 The cells were collected by centrifugation (440 g, 5 minutes), the supernatant was removed by aspiration, and the cells were resuspended in 1 mL of medium. ROCK inhibitor Y-27632 (manufactured by STEMGENT, product number: 04-0012) was added to the medium. ) Was added to a final concentration of 10 μM to obtain a cell suspension. The cells were then crushed by pipetting water flow until single cell level. The cell concentration in the cell suspension was adjusted, and the cell suspension was injected into the wells of Aggrewell 800 (manufactured by STEMCELL Technologies). Then, AggreWell 800 was centrifuged (2000 g, 5 minutes) or not, and cultured at 37 ° C. overnight to form cell clumps. The state of the cells immediately after seeding and after 1 day when the centrifugation was performed and when the centrifugation was not performed was as shown in FIG. 11A. That is, when centrifugation was performed, cells gathered at the bottom of the inverted pyramid-shaped well immediately after seeding (FIG. 11A—upper left), but when centrifugation was not performed, cells were not collected ( FIG. 11A-top right). However, after one day, the cells gathered at the bottom of the well to form a cell clump even when centrifugation was performed (FIG. 11A—lower left) or not (FIG. 11A—lower right). Moreover, the obtained cell clump had a substantially uniform size (FIG. 11B). In addition, cell agglomeration was formed at 8 hours and 12 hours in the wells of AggreWell, and 8 to 12 hours was sufficient (data not shown).
得られた細胞集塊は、できるだけ壊さないようにピペットで回収し、６ウェルプレートに播種した（３００個の細胞集塊／ウェル）。播種後の細胞の成長を位相差顕微鏡にて観察すると、遠心分離を行った場合でも行わなかった場合でも、細胞集塊は良好に展開し、その後も細胞は良好に成長した（図１２）。 The obtained cell clumps were collected with a pipette so as not to break as much as possible, and seeded in a 6-well plate (300 cell clumps / well). When the growth of the cells after seeding was observed with a phase-contrast microscope, the cell conglomerate developed well and the cells grew well even when centrifugation was performed or not (FIG. 12).
本実施例で得られた細胞集塊は人工的に集積させた立体構造を有することから、通常の継代培養とは状況が大きく異なるが、本実施例では、意外にもこのように作製した多層の細胞集塊であっても培養をすると自然に展開し、その後、通常の培養で見られる多能性幹細胞のコロニーを形成し好適に培養を行うことが可能であった。 Since the cell conglomerate obtained in this example has a three-dimensional structure artificially accumulated, the situation is greatly different from that of normal subculture, but in this example, it was unexpectedly produced in this way. Even when a multi-layered cell agglomeration was cultured, it naturally developed, and after that, it was possible to form a colony of pluripotent stem cells found in normal culture and to carry out the culture suitably.
細胞集塊の形成の際に遠心を行わなかった場合には、遠心を行った場合よりも細胞の展開が早かった（図１２、播種２日後）。図１２では、細胞集塊または細胞コロニーの色の濃い部分は細胞が多層になっている部分である。このように、ｉＰＳ細胞の継代培養においては、遠心分離を行わない方がよい結果となり得ることが示唆された。 When centrifugation was not performed during the formation of cell clumps, cell development was faster than when centrifugation was performed (FIG. 12, 2 days after seeding). In FIG. 12, the dark portions of the cell clumps or cell colonies are the portions where the cells are multilayered. Thus, it was suggested that in subculture of iPS cells, it may be better not to perform centrifugation.
さらに詳細に解析するために、６ウェルプレートに播種してからの細胞の成長を成長曲線により比較したが、細胞の成長速度に関しては両者に大きな違いは見られなかった（図１３）。細胞の成長は、ディッシュ上の細胞が占める面積（ｍｍ２）を測定することにより求めた。For further detailed analysis, cell growth after seeding in a 6-well plate was compared using a growth curve, but there was no significant difference in the cell growth rate (FIG. 13). Cell growth was determined by measuring the area (mm2 ) occupied by cells on the dish.
その後、継続して培養した細胞が未分化状態を保っていることを確認するために、６ウェルプレートに播種して５日後に細胞を回収し、パラホルムアルデヒドで固定してから蛍光免疫染色を行った。核染色は、１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩを含むリン酸緩衝生理食塩水で細胞を１５分ほどインキュベートして行った。蛍光免疫染色は、Ｎａｎｏｇの発現を確認するために抗体として抗Ｎａｎｏｇ抗体（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社製、製品番号：ＲＣＡＢ０００３Ｐ）を用い、Ｏｃｔ３／４は、抗Ｏｃｔ３／４抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、製品番号：ｓｃ−５２７９）を用いて常法に従って免疫染色した。明視野画像は、位相差顕微鏡（オリンパス社製、製品番号：ＩＸ−８１）を用いて取得した。 Thereafter, in order to confirm that the continuously cultured cells are maintained in an undifferentiated state, the cells are seeded on a 6-well plate, collected 5 days later, fixed with paraformaldehyde, and then subjected to fluorescent immunostaining. It was. Nuclear staining was performed by incubating the cells for 15 minutes in phosphate buffered saline containing 1 μg / mL DAPI. Fluorescent immunostaining uses an anti-Nanog antibody (ReproCell, product number: RAB0003P) as an antibody to confirm Nanog expression. Oct3 / 4 is an anti-Oct3 / 4 antibody (Santa Cruz Biotechnology, product number) : Sc-5279) according to a conventional method. The bright field image was acquired using a phase contrast microscope (Olympus, product number: IX-81).
その結果、すべての未分化マーカーが良好に発現していることが明らかとなった（図１４）。 As a result, it was revealed that all undifferentiated markers were expressed well (FIG. 14).
これらの結果から、細胞を単一細胞レベルまでばらばらにくずして培養した場合でも、その後、細胞集塊を形成させることにより細胞死を起こすことがないこと、細胞集塊は迅速に（〜１日）形成すること、得られた細胞集塊からは良好な多能性幹細胞コロニーが得られ、また、良好な未分化状態で培養できることが示された。 From these results, even when cells were crushed to the single cell level, cell death was not caused by forming cell clumps thereafter, and cell clumps were rapidly (~ 1 day). ) It was shown that good pluripotent stem cell colonies can be obtained from the cell clusters obtained and formed and can be cultured in a good undifferentiated state.
実施例２：培養容器の培養面への細胞集塊の播種方法の検討
上記実施例では、マイクロウェル中で形成された細胞集塊は、ピペットで回収することにより新しい培養容器に継代したが、細胞集塊を壊さないために時間をかけた慎重なピペッティング操作が求められた。そこで、本実施例では、より簡便な細胞集塊の播種法を検討した。Example 2: Examination of seeding method of cell agglomeration on culture surface of culture vessel In the above example, the cell agglomerate formed in the microwell was passaged to a new culture vessel by collecting with a pipette. Careful pipetting operation was required, taking time to avoid breaking the cell conglomerate. Therefore, in this example, a simpler cell agglomeration method was examined.
ここで発明者らは、マイクロウェルを有する面と培養面とを備え、これら２つの面が対向して配置された閉鎖系培養容器を用いることを検討した。この閉鎖系培養容器のマイクロウェルを有する面は、角取平面底形状で開口部が１０００μｍ×１０００μｍの四角形形状のマイクロウェルが碁盤状に整列したものとした。また、培養面は、ＢＤマトリゲル（商標）によりコーティングしたものとした。 Here, the inventors examined the use of a closed culture vessel having a surface having a microwell and a culture surface, and these two surfaces are arranged to face each other. The surface of the closed culture vessel having the microwells was formed by arranging square-shaped microwells having a square bottom shape and an opening of 1000 μm × 1000 μm in a grid shape. The culture surface was coated with BD Matrigel (trademark).
次に、実施例１に記載の方法により、単一細胞にまで分散させたｉＰＳ細胞の細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液を上述の閉鎖系培養容器に注入し、マイクロウェルを有する面を下にして３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間静置した。光学顕微鏡を用いて細胞集塊が形成されたのを確認した後に、培養面が下になるよう閉鎖系培養容器を天地反転させると、細胞集塊はマイクロウェル内から培養面に垂直に落下した。図１５は、培養面に落下した細胞集塊の配置を示す図である。図１５に示されるように、細胞集塊は培養面上で規則正しく整列した。これらの細胞集塊の配置は、用いたマイクロウェルの配置パターンを反映しており、図１５の細胞集塊の間隔は、本実施例で用いた閉鎖系培養容器のマイクロウェルのピッチ（１０００μｍ）と一致した。Next, by the method described in Example 1, a cell suspension of iPS cells dispersed into single cells was obtained. The obtained cell suspension was poured into the above-mentioned closed culture vessel, and left to stand at 37 ° C. in a 5% CO2 atmosphere for 24 hours with the side having the microwells facing down. After confirming the formation of cell clumps using an optical microscope, the cell clumps fell vertically from inside the microwell to the culture surface when the closed culture vessel was inverted so that the culture surface was down . FIG. 15 is a diagram showing the arrangement of cell clumps dropped on the culture surface. As shown in FIG. 15, the cell clumps were regularly aligned on the culture surface. The arrangement of these cell agglomerates reflects the arrangement pattern of the used microwells, and the interval between the cell agglomerates in FIG. Matched.
このことから、マイクロウェル中の細胞集塊は、マイクロウェルの配置パターンを維持したまま、培養容器の培養面に落下させることが可能であることが明らかとなった。マイクロウェルの配置を変えることにより、細胞集塊の播種位置は自在に制御し得るものと考えられる。また、播種および播種位置の制御は、容器を天地反転させるという、非常に容易な操作により行うことができることが明らかとなった。 From this, it became clear that the cell agglomeration in the microwell can be dropped onto the culture surface of the culture vessel while maintaining the arrangement pattern of the microwell. It is considered that the seeding position of the cell cluster can be freely controlled by changing the arrangement of the microwells. In addition, it became clear that the sowing and the sowing position can be controlled by a very easy operation of turning the container upside down.
実施例１によれば、多能性幹細胞は単一細胞にまで分散させても、その後すぐに細胞集塊を形成させることにより、未分化状態を維持させたまま良好に培養することが可能であった。また、細胞懸濁液を複数のマイクロウェルが配置された面を有する培養容器に播種することにより、簡便に均一なサイズの細胞集塊を形成させることができた。さらに、細胞集塊は、培養容器への播種後速やかに展開し、細胞は良好に増殖した。形成させた細胞集塊のサイズは均一であったため、細胞集塊の展開速度およびその後の増殖速度も均一であった。また、実施例２によれば、マイクロウェル中の細胞集塊は、簡便な操作により培養容器の培養面に播種することができた。播種した細胞集塊の配置パターンは、マイクロウェルの配置パターンを反映しており、簡便な操作により細胞集塊の精密播種が可能であることが示された。このように、本発明の方法により、均一な細胞集塊の形成や細胞集塊の均一な播種などが極めて単純な機械的操作により可能となった。本発明の方法は、これにより多能性幹細胞の品質維持を容易なものとするのみならず、多能性幹細胞の継代培養の全自動化への途を切り拓くものであると言える。 According to Example 1, even when pluripotent stem cells are dispersed into single cells, cell clumps are formed immediately thereafter, so that it can be well cultured while maintaining an undifferentiated state. there were. Further, by seeding the cell suspension in a culture vessel having a surface on which a plurality of microwells are arranged, it was possible to easily form a cell aggregate having a uniform size. Furthermore, the cell clumps developed rapidly after seeding in the culture vessel, and the cells proliferated well. Since the size of the formed cell clump was uniform, the cell clump development rate and the subsequent growth rate were also uniform. Further, according to Example 2, the cell clumps in the microwells could be seeded on the culture surface of the culture vessel by a simple operation. The arrangement pattern of the seeded cell agglomeration reflects the arrangement pattern of the microwells, and it was shown that the cell agglomeration can be precisely seeded by a simple operation. As described above, according to the method of the present invention, formation of a uniform cell clump, uniform seeding of the cell clump, and the like can be performed by a very simple mechanical operation. Thus, it can be said that the method of the present invention not only facilitates maintaining the quality of pluripotent stem cells, but also opens the way to full automation of subculture of pluripotent stem cells.
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