本発明のシクロデキストリン化合物は、一般式１で表される。
一般式１において、ｍは６〜８の整数を表す。
ｍが６の場合、α−シクロデキストリン環が構成され、ｍが７の場合、β−シクロデキストリン環が構成され、ｍが８の場合、γ−シクロデキストリンが構成される。本発明のシクロデキストリン化合物はリポソームや高分子ミセル（１００ｎｍ）に比し小さく（１〜１０ｎｍ）細胞表面からの浸透、組織内あるいは脳関門を動きやすい。
ｍは、後述するように入手の容易さを考慮して決められるが、７を表すことが好ましい。
一般式１において、Ｒ１は一般式２で表される基、水酸基、グリコシル基を有する置換基又は親水性基を表す。但し、一般式１において、ｍ個のＲ１のうち少なくとも２つは一般式２で表される基であり、少なくとも（ｍ−１）個のＲ１が一般式２で表される基であることが好ましく、ｍ個のＲ１の全てが一般式２で表される基であることがより好ましい。
一般式２中、※はシクロデキストリンを構成するグルコピラノースの６位炭素原子との結合位置を表す。ｎは０〜３の整数を表し、ｎが０の場合、カルボニル炭素原子とアミノ窒素原子を結ぶ部分は単結合を表す。後述するように、ｎは１又は２を表すことが好ましく、２を表すことが特に好ましい。
一般式２中、下記式で表される部分は、後述するようにスペーサーアームとしてのアミノカプロン酸に由来する繰り返しユニットである。
よって、本明細書において、以下、単に、前記式で表される部分を「ｃａｐ」で表すこともある。したがって、前記一般式２は下記のように表すこともできる。
前記一般式２中の※及びｎは前述のとおりである。
本明細書において、ｎが２の場合、前記繰り返しユニットを単にｃａｐ２といい、ｎが１の場合、前記繰り返しユニットを単にｃａｐ１ということもある。
スペーサーアームとしてのアミノカプロン酸に由来する前記繰り返しユニットは、複数の葉酸と複数の葉酸レセプター（例えば、がん細胞表層）との同時的な会合、いわゆる「ナノクラスター効果」を達成するために適切な長さを提供することができる観点から好ましい。
なお、葉酸レセプターの高次構造について、葉酸を阻害剤とする酵素グリシンＮ−メチルトランスフェラーゼの結晶構造解析から、その４量体のサブユニット間に２個の葉酸結合サイトを有することが報告されている（例えば、Ｚ．Ｌｕｋａ，Ｓ．Ｐａｋｈｏｍｏｖａ，Ｌ．Ｖ．Ｌｏｕｋａｃｈｅｖｉｔｃｈ，Ｍ．Ｅｇｌｉ，Ｍ．Ｅ．Ｎｅｗｃｏｍｅｒ，Ｃ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８２，４０６９−４０７５（２００７）.参照。）。したがって、がん細胞での葉酸レセプターも生物学的相同性から、糖クラスター効果と同様な構造が予測され、複数の葉酸が結合サイトとの複数の同時的な相互作用を発揮しているものと考えられる。このような効果は、糖鎖の空間配置とレセプターのトポロジー効果、すなわち糖クラスター効果になぞらえて、「ナノクラスター効果」ということができる。
Ｒ１で表されるグリコシル基を有する置換基としては特に制限はない。しかし、例えば、標的指向性薬物送達システム（ＴＤＤＳ）に本発明の化合物を用いる場合、前記置換基中のグリコシル基は特定の標的疾患（肝臓がん、大腸がん、炎症等）の標的タンパク質によって特異的に認識されるものであることが好ましく、入手の容易性および合成の容易性の点から、好ましくはオリゴ糖（糖１〜４個の糖）ないしは糖鎖であり、より好ましくは単糖、すなわちＴＤＤＳの標的疾患に合わせて、ガラクトシル基、フコシル基、グルコシル基及び／又はマンノシル基等とすることが好ましい。グリコシル基を有する置換基の具体例としては、１−グリコシル−オキシプロピルチオエチルアミド基、並びにスペーサーアームとしての前記ｃａｐを有する、１−グリコシル−オキシプロピルチオエチルアミドヘキサノイルアミド基及び１−グリコシル−オキシプロピルチオエチルアミドヘキサノイルアミドヘキサノイルアミド基等が挙げられる。本発明において、前記置換基中のグリコシル基が、α−Ｄ−ガラクトシル、α−Ｌ−フコシル、α−Ｄ−マンノシル又はα−Ｄ−グルコシルであることが好ましい。
Ｒ１で表される親水性基としては特に制限はないが、本発明のシクロデキストリン化合物に親水性を付与する観点から、ヒドロキシ酢酸とエステル化反応して得られるヒドロキシメチルカルボニル基（−ＯＣＯＣＨ２ＯＨ）、グルコン酸とエステル化反応して得られるグルコン酸エステル基等が好ましい。
Ｒ１で表される一般式２で表される基、グリコシル基を有する置換基及び親水性基は、さらにグリコシル基を有する置換基及び／又は親水性基で置換されていてもよい。
一般式１において、ｍ個のＸ1及びｍ個のＸ2は各々独立に水酸基、又はトシルオキシ基、−ＮＨ−Ｙ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｒ−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ２、−Ｏ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−Ｙ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−Ｙ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｙ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｒ−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｒ−ＣＯＮＨＮＨ＝ＣＲ’Ｒ”及び−ＮＨ−Ｒ−ＣＯＮＨＮＨ＝ＣＲ’Ｒ”からなる群より選ばれる１つの基を表す。但し、ｍ個のＸ1及びｍ個のＸ2のうち少なくとも１つはトシルオキシ基、−ＮＨ−Ｙ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｒ−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ２、−Ｏ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−Ｙ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−Ｙ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｙ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｒ−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｒ−ＣＯＮＨＮＨ＝ＣＲ’Ｒ”及び−ＮＨ−Ｒ−ＣＯＮＨＮＨ＝ＣＲ’Ｒ”からなる群より選ばれる１つの基を表す。
一般式１において、ｍ個のＸ1及びｍ個のＸ2のうち、少なくとも１つは水酸基であり、少なくとも１つはトシルオキシ基、−ＮＨ−Ｙ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｒ−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ２、−Ｏ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−Ｙ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−Ｙ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｙ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｒ−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｒ−ＣＯＮＨＮＨ＝ＣＲ’Ｒ”及び−ＮＨ−Ｒ−ＣＯＮＨＮＨ＝ＣＲ’Ｒ”からなる群より選ばれる１つの基であることが好ましい
一般式１において、Ｙは制がん剤、又はＸ線ＣＴ造影剤、蛍光造影剤、ＳＰＥＣＴ造影剤、ＭＲＩ造影剤等の造影剤としての機能を有する基であることが好ましく、ドキソルビシン、マイトマイシン、タキソール、カンプトテシン若しくはこれらの誘導体、フルオロセイン、ローダミン、インドシアニングリーン、アミドトリゾ酸、及びＥＤＴＡ等が挙げられる。
Ｒは、メチレン基、フェニレン基、−Ｏ−、−Ｓ−、及びこれらの組み合わせからなる群より選ばれる基を表し、Ｒ’及びＲ”はそれぞれメチル基、フェニル基、及びこれらの組み合わせからなる群より選ばれる基を表す。
一般式１におけるＸ1及びＸ2の具体例下記に示す。しかし、本発明はこれらに限定するものではない。
本発明のシクロデキストリン化合物は、単に下記一般式ｂで表すことができる。
前記一般式ｂ中、ｍ及びｎは、一般式１及び２と同義である。ｐは２以上ｍ以下の整数であり、（ｍ−ｐ）個のＡは各々独立に水酸基、グリコシル基を有する置換基又は親水性基を表す。ｑは１以上（２×ｍ）以下の整数であり、ｑ個のＸは各々独立にトシルオキシ基、−ＮＨ−Ｙ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｒ−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ２、−Ｏ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−Ｙ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−Ｙ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｙ、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｒ−ＣＯＮＨＮＨ２、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｒ−ＣＯＮＨＮＨ＝ＣＲ’Ｒ”及び−ＮＨ−Ｒ−ＣＯＮＨＮＨ＝ＣＲ’Ｒ”からなる群より選ばれる基を表す。Ｒ、Ｒ’及びＲ”は、一般式１と同義である。
本発明のシクロデキストリン化合物の製造方法について説明する。しかし、本発明はこれらに制限するものではない。
本発明のシクロデキストリン化合物は、下記一般式３で表されるシクロデキストリン化合物（本明細書において、「ＮＤ１」ともいう）を構成する各グルコピラノース分子の２位及び３位の第２級水酸基と、所望の化合物とを縮合させることにより得ることができる。
一般式３中、Ｒ１及びｍは一般式１と同義である。
前記化合物ＮＤ１は、例えば、国際公開第２００９／０４１６６６号パンフレットを参考に合成することができる。
前記化合物ＮＤ１の第２級水酸基と、所望の化合物とを縮合させる際、前記化合物ＮＤ１と所望の化合物の混合割合に特に制限はないが、１：１〜１：１．２が好ましい。
前記縮合反応の温度に特に制限はないが、１０℃〜３０℃が好ましい。また、反応時間に特に制限はないが、２４時間〜７２時間が好ましい。
反応溶媒としては、化合物の溶解性に応じて、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、水、メタノール、イソプロピルアルコール、ｔ−ブチルアルコール、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）等を使用することができる。
上記縮合反応において使用しうる縮合剤としては、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、水溶性カルボジイミド（以下「ＷＳＣ」という）等が挙げられる。
反応生成物は、アセトン再沈処理等による未反応物の除去のあと、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により生成物を精製・単離することが好ましい。ＧＰＣに用いるゲルは、Ｂｉｏ ｇｅｌ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＴＯＳＯ−ＰＷ ｇｅｌ（いずれも商品名）などが用いられるが、分離精製能の観点から、Ｂｉｏ ｇｅｌ（例えば、Ｐ４、Ｐ６）が好ましい。溶出溶媒としては、水、アンモニア水等が挙げられ、未反応の葉酸等の夾雑物との分離性の観点から水であることが好ましい。
製造された本発明のシクロデキストリン化合物の同定は、当業界における任意の方法によって行うことができる。
本発明のシクロデキストリン化合物は、例えば、下記のスキームにしたがって、合成することができる。
前記スキーム中、ＴＯＳはトシル基を表し、ＤＯＸはドキソルビシンを表す。
トシルイミダゾールはシクロデキストリンの２級位Ｃ−２位水酸基に対する反応性が高いことが知られている（Ｈ．Ｙｕ，ｅｔ ａｌ.，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ２００６，４７，８８３７−８８４０）。したがって、前記化合物ＮＤ１を出発原料とし、トシルイミダゾールの仕込みモル比の他、添加物（炭酸セシウム）の量、反応時間によって、１個または複数の２級位Ｃ−２位水酸基をトシルオキシ基に置換し、前記例示化合物ＮＤ４を合成することができる。
また、Ｃ−２位トシルオキシ基は、塩基存在下で２級位Ｃ−３位水酸基と反応し、隣接のＣ２位とＣ３位間でマンノエポキシド環を形成する。これはアミンなどの求核試薬の反応によりＣ３位置換基の反転を伴いながら反応する。この結果Ｃ３位に置換基が導入された生成物を得ることができる。
なお、反応の進行は、分析ＨＰＬＣのピークの変化に基づき確認することができる。また、トシルオキシ基の導入量は、精製物のＮＭＲスペクトルから定量することができる。
前記スキームからも明らかなように、本発明によれば、フルオレセイン、ローダミン、ＥＤＴＡ、アミドトリゾ酸、ドキソルビシン、18Ｆ、123Ｉなどを導入したシクロデキストリン化合物を製造することができる。なお、ＥＤＴＡを導入したシクロデキストリン化合物には、容易にＳＰＥＣＴ造影剤やＭＲＩ造影剤として知られている111ＩｎやＧｄを導入することができる。
本発明のシクロデキストリン化合物は、その葉酸のナノクラスター効果に基づく標的細胞に対する会合性に優れている。さらに、本発明のシクロデキストリン化合物は、制がん剤や造影剤がシクロデキストリン環に化学結合により結合しているので、標的細胞に到達するまでに分解・解離が起こらない。したがって、本発明のシクロデキストリン化合物は、標的指向性の優れた制がん剤、蛍光造影剤、Ｘ線ＣＴ造影剤、核医学造影剤、ＭＲＩ造影剤として好適に用いることができる。
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ 例示化合物ＮＤ４の製造
下記に示すシクロデキストリン化合物（ＮＤ１）をＷＯ2009/041666に従い合成した。
前記式において、Ｒaは下記式で表される基である。
前記式中、※はシクロデキストリンを構成するグルコピラノースの６位炭素原子との結合位置を表す。
前記シクロデキストリン化合物（ＮＤ１）５００ｍｇを秤量し、遮光性の褐色反応容器にて、マグネットで攪拌しながら２０ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。これにトシルイミダゾール２０．５ｍｇ（１．０４モル当量）及び炭酸セシウム９．５ｍｇ（０．３モル当量）加えて室温で穏やかに攪拌した。反応の進行状況はＳＥＣカラムを付した分析ＨＰＬＣを用いて下記の条件下で確認し、２２時間で反応の進行が終了したことを確認した。
ＨＰＬＣ分析条件
カラム：ＳＥＣ型（体積排除カラム）ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０−Ａ（商品名、日本分析工業株式会社製）、φ７×５００ｍｍ
溶離液：リン酸緩衝液／メタノール＝２／１（体積比）
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２３０ｎｍ
生成した化合物が例示化合物ＮＤ４であることをＳＥＣ−ＨＰＬＣでの波長２３０ｎｍによる分離と分析により確認した。保持時間８．１０分で、出発物質のシクロデキストリン化合物（保持時間８．２６分）由来のピークとは異なるピークが観測された。（カラム：ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０−Ａ（商品名、日本分析工業株式会社製）、φ７×２５０ｍｍ、溶離液：リン酸緩衝液／メタノール＝２／１、流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ）
実施例２ 例示化合物ＮＤ７の製造
実施例１で得られた例示化合物ＮＤ４に、１，４−ジアザビシクロ（２，２，２）オクタン（ＤＡＢＣＯ）１０ｍｇ（１モル当量）及びヘキサンジアミン１０．５ｍｇ（１モル当量）を加えて、室温で攪拌した。その後、１時間後、２時間後及び３時間後に、上記と同じＨＰＬＣ条件にて反応の進行を確認した。その結果、保持時間７．４３分に出発物質である例示化合物ＮＤ１由来のピークが、保持時間８．６３分に生成物由来のピークが見られた。保持時間１４．４７分にトシルオキシ基を有する化合物のフラグメントのピークが見られた。保持時間８．６３分のピークは反応後３時間で成長が止まり、反応後２４時間でもピークに変化はなかった。このことから反応後３時間程度で反応は終了していることがわかった。
次にＳＥＣ分取型ＨＰＬＣカラム ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０（商品名、日本分析工業製、φ２５×５００ｍｍ）、流速５．０ｍＬ／分、溶離液：水／メタノール（混合比率：２／１（体積比））、検出ＵＶ波長：２３０ｎｍにて、反応混合物を分取精製し、保持時間１５．５〜２６．５分の成分を一括して回収した。
４０℃でロータリーエバポレーターにて減圧（３３ｈｐａ）乾固した。凍結乾燥は−７８．８℃で冷却した装置で２４時間、６．３Ｐａ減圧下で行い、例示化合物ＮＤ７を得た（収量：１３２ｍｇ、収率２６％）。
得られた化合物が例示化合物ＮＤ７の同定は、ＳＥＣ型分析ＨＰＬＣによる生成ピークの追跡から、出発原料であるシクロデキストリン化合物由来のピーク（保持時間８．２分）に対し保持時間９．０分のピークが新たに増加したことにより確認した。さらに、得られた化合物が例示化合物ＮＤ７であることは、下記に示す実施例３において、イソチオシアノベンジルＥＤＴＡとの反応性を有することからも明らかであった。
実施例３ 例示化合物ＮＤ１６の製造
実施例２で得られた例示化合物ＮＤ７ １３２ｍｇ（０．０２３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ３ｍｌに溶解し、ＤＡＢＣＯ４．５ｍｇ（０．０４０５ｍｍｏｌ、１．７６モル当量）を添加した。さらに、イソチオシアノベンジルＥＤＴＡ１０ｍｇ（０．０２３ｍｍｏｌ、１．００モル当量）をＤＭＳＯ３ｍｌで容器を洗いながら添加した。さらにマイクロシリンジでジブチルＳｎジラウレート５０μＬを添加した。反応の進行は、上記の方法と同じくＳＥＣ型分析ＨＰＬＣにて確認を行った。
次にＳＥＣ型ＨＰＬＣカラム ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０（商品名、日本分析工業株式会社製、φ２５×５００ｍｍ）、流速１．０ｍＬ／分、溶離液：ＰＢＳ／ＭｅＯＨ（混合比率：２／１（体積比））検出ＵＶ波長：２３０ｎｍにて分取精製を行った。
その結果、保持時間６８〜１１０分のフラクションにはシクロデキストリン化合物（ＮＤ１）が含まれていた。次に、保持時間１２５分〜１４８分のフラクションをＨＰＬＣ装置の切り替え操作によりリサイクル操作にかけて再分取した。その保持時間は２２０分〜２４８分となった。このフラクションをさらに２回目のリサイクル再分取して２４８分〜３００分のフラクションを回収し、エバポレーター濃縮したのち、凍結乾燥した。
次にＳＥＣ型ＨＰＬＣカラム ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０（商品名、日本分析工業株式会社製、φ２５×５００ｍｍ）２本を用いて脱塩のためのＨＰＬＣ精製を行った。溶離液は水／メタノール（混合比率：２／１（体積比））溶液を用い、流速は５．０ｍＬ／ｍｉｎで行い、フラクションコレクターを用いて、検出ＵＶ波長：２３０ｎｍで観測し、電導度チェックして塩が含まれない成分であることを確認し、フラクションＮｏ．１０〜１３（保持時間２０〜２６分）を、エバポレーターで乾固して、凍結乾燥し、例示化合物ＮＤ１６を得た（収量：５．７ｍｇ、収率８．３％）。その結果（吸光度プロファイル）を図１に示す。図１に示す吸光度プロファイルから明らかなように、検出ＵＶ波長２３０ｎｍにおいて単一ピークであり、ピーク面積の定量から９１％の純度で例示化合物ＮＤ１６が得られたことがわかった。
さらに、得られた例示化合物ＮＤ１６をＯＤＳ逆相系カラムで分析した結果（吸光度プロファイル）を図２に示す。図２から分かるように、反応生成物は単一のピークを示した。ピーク面積の定量から、９４％の純度を示すものであった。
上記で示すように、例示化合物ＮＤ７を出発原料とした例示化合物ＮＤ１６の製造では、ＳＥＣ分取型ＨＰＬＣカラムによる分取精製において新たに出現したピーク（分子量の最も高い成分）に注目し、リン酸緩衝液を含む溶離液で分取し、カラムを繰り返して通すリサイクル分取を行った後に、リン酸塩を含まない水とメタノールのみの溶離液で脱塩操作を行った。２つのＨＰＬＣモードで確認したところ、例示化合物ＮＤ１６が得られたことを確認し、同定した。
これによって、ヘキサンアミン基を有する例示化合物ＮＤ７と、イソチオシアノベンジルＥＤＴＡとが反応して得られた化合物で、ＨＰＬＣ精製で用いたリン酸緩衝液の塩を含まない例示化合物ＮＤ１６が得られた。
実施例４ 例示化合物ＮＤ９の製造
シスタミン二塩酸塩１．１２６ｇ（０．００５モル）のＤＭＳＯ溶液２０ｍＬにトリエチルアミン１．０１２ｇを添加し、さらに無水コハク酸０．５００３ｇ（０．００５モル）を加えて終夜攪拌した。生成した沈殿は濾別し、ＳＥＣ型分取ＨＰＬＣカラム ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０（商品名、日本分析工業株式会社製、φ２５×５００ｍｍ）、溶離液：水／メタノール（混合比率：２／１（体積比））を用い、検出ＵＶ波長：２３０ｎｍで観測し、保持時間６６分の独立したピークを分取した。これを凍結乾燥してシスタミンモノこはく酸アミド１４０ｍｇを得た。この成分はＭＡＬＤＩ ＴＯＦ-ＭＳ測定により同定した。
ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：２５２．０５
実測値：２５２．１６０
実施例１で得られた例示化合物ＮＤ４にＤＡＢＣＯ１３．５ｍｇ（６倍モル当量）及びシスタミンモノコハク酸アミド８．８ｍｇ（２倍モル当量）を加えて、室温で２３時間攪拌した。実施例１と同じＨＰＬＣ条件にて反応の進行を確認した。この結果、反応開始後２０分では保持時間９．７分付近の先頭のピークには変化がなかったが、反応開始４時間後では前記先頭のピークが保持時間９．０７分と９．６９分の２本に割れ、かつ保持時間９．０７分のピーク面積が増加した。
反応時間４時間のＨＰＬＣ分析で、保持時間９．０７分に生成した化合物由来のピークが、保持時間９．６９分にシクロデキストリン化合物（ＮＤ１）由来のピークが見られた。しかし２３時間経過後の分析でも保持時間９．０７分と９．７分付近に完全には分離できない２成分を確認した。反応時間４時間から２３時間での生成物は殆ど変わらないことは、ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣでも確認できた。
次にＳＥＣ分取型ＨＰＬＣカラム ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０（商品名、日本分析工業株式会社製、φ２５×５００ｍｍ）２本を用いて精製し（流速５．０ｍｌ／ｍｉｎ、溶離液：水／メタノールＭｅＯＨ（混合比率：２／１（体積比））、検出ＵＶ波長：２３０ｎｍ）、保持時間３７〜５６分の成分を一括して回収した。４０℃でロータリーエバポレーターにて減圧（３３ｈｐａ）乾固した。凍結乾燥は−７８．８℃で冷却した装置で６．３Ｐａ減圧下で行い、例示化合物ＮＤ９を得た（収量：４０ｍｇ、収率：４０％）。
得られた化合物が例示化合物ＮＤ９であることを上記の精製により単一ピーク精製物が得られていることをＳＥＣ型分析ＨＰＬＣによる確認とともに、ここにアミドトリゾ酸をアミド結合生成縮合剤とともに反応させてその生成物に対して蛍光Ｘ線スペクトルを取り、イオウ原子、ヨード原子ともに含まれていることを観測することにより確認した。
実施例５ 例示化合物ＮＤ２９の製造
実施例４で製造した例示化合物ＮＤ９ ４０ｍｇに対し、ドキソルビシン塩酸塩４．０ｍｇ（等モル）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）１０ｍｇ（２倍モル）、ＤＡＢＣＯ２０ｍｇ（４倍モル）及びＤＭＳＯ１ｍＬを加え、室温にて４日間攪拌した。
次にＳＥＣ型ＨＰＬＣ分析カラム：ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０−Ａ（商品名、日本分析工業株式会社製、φ７×５００ｍｍ）、溶離液：リン酸緩衝液／メタノール（混合比率：２／１（体積比））、検出波長：４９５ｎｍにて、反応混合物を分取精製した。その結果（吸光度プロファイル）を図３に示す。ドキソルビシンは４９５ｎｍにＵＶの特性吸収を持つので、他の成分と区別ができる。図３に示すように、保持時間が８．６０分と１３．９分の場合にのみピークが見られ、それぞれ、例示化合物ＮＤ２９由来のピークと未反応のドキソルビシン由来のピークであることが分かった。これらのピーク面積比は８４：１４であった。
同じ反応生成物について、ＨＰＬＣによる検出を同条件で検出波長２３０ｎｍに変更して行った。その結果（吸光度プロファイル）を図４に示す。その結果、保持時間が８．６０分のピークとは別に、保持時間１０．２分にシャープなピークが見られ、保持時間１０．２分のピークは例示化合物ＮＤ９由来のピークと同定された。
同じ反応生成物について、ＳＥＣ分取型ＨＰＬＣカラム ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０（商品名、日本分析工業株式会社製、φ２５×５００ｍｍ）１本を用いて、溶離液：水／メタノール（混合比率：２／１（体積比）））、検出波長：３６０ｎｍ、流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで精製した。その結果（吸光度プロファイル）を図５に示す。ＳＥＣ型カラムの特性として分子量の最も大きな物質が一番最初に流出するので、保持時間３０〜３５分のフラクションを回収し、濃縮、凍結乾燥し、反応系で最も分子量の大きい前記例示化合物ＮＤ２９を得た（収量：２３ｍｇ、収率：５８％）。なお、図５において４０分経過後、流速を１．５ｍｌ／ｍｉｎから５．０ｍｌ／ｍｉｎに変更して同様に精製を行ったところ、保持時間４４．６分のピークは未反応のドキソルビシン、保持時間５０．８分のピークはＤＭＳＯ溶媒を主とするその他の成分由来と考えられる。
このように得られた例示化合物ＮＤ２９をＯＤＳカラムで分析したところ単一ピークが得られており、純度は非常に高いものであった。
実施例６ 例示化合物ＮＤ５の製造
ヘキサンジアミンをドキソルビシンに変える以外の条件は、実施例２と同様にして例示化合物ＮＤ５を製造した。生成物由来の４９５ｎｍのＨＰＬＣピークを捉えて反応を行い、精製した。シクロデキストリン化合物（ＮＤ１）１０ｍｇに対し、収量４ｍｇ、収率４０％であった。
実施例７ 例示化合物ＮＤ８の製造
シクロデキストリン化合物（ＮＤ１）１００ｍｇ、Ｎ−トシルイミダゾール４ｍｇ、炭酸セシウム１ｍｇ、及びＤＭＳＯ３ｍＬを混合し、遮光下室温で１７時間反応させた。
次にＳＥＣ分取型ＨＰＬＣカラム ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０（商品名、日本分析工業製、φ２５×５００ｍｍ）、流速５．０ｍＬ／分、溶離液：水／メタノール（混合比率：２／１（体積比））、検出ＵＶ波長：２３０ｎｍにて、反応精製物を分取精製し、分子量の最も高いピークを含むフラクションを回収し、４０℃にてエバポレーションして濃縮し凍結乾燥し、中間体を得た（収量：３１．２ｍｇ、収率：３１％）。
前記中間体に、ＤＡＢＣＯ４ｍｇ及びシスタミン二塩酸塩４ｍｇを添加し、遮光下、室温で２日間攪拌した。
次にＳＥＣ分取型ＨＰＬＣカラム ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０（商品名、日本分析工業製、φ２５×５００ｍｍ）、流速５．０ｍＬ／分、溶離液：水／メタノール（混合比率：２／１（体積比））、検出ＵＶ波長：２３０ｎｍにて、反応精製物を分取精製し、分子量の最も高いピークを含むフラクションを回収して濃縮し凍結乾燥し、例示化合物ＮＤ８を得た（収量：２３ｍｇ、収率：７３％）。
なお、分析ＨＰＬＣによりシクロデキストリン化合物（ＮＤ１）とは異なる保持時間に新たなピークを生じたこと、及びアミドトリゾ酸とアミド結合生成を反応し、生成したピークの精製物に対して得られた成分に蛍光Ｘ線スペクトロメーターにてイオウとヨードが十分に含まれていることから、得られた化合物が例示化合物ＮＤ８であることを確認した。
実施例８ 例示化合物ＮＤ１７の製造
実施例７で製造した例示化合物ＮＤ８ １０ｍｇをＤＭＳＯ１．５ｍＬに溶解した。さらに、ジアゾトリゾ酸１ｍｇを添加し、ＤＭＴ−ＭＭ０．５ｍｇ及びＤＡＢＣＯ２ｍｇを加えて超音波攪拌したのち、室温で３日間放置した。反応生成物をＳＥＣ型カラム型ＨＰＬＣカラム ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０（商品名、日本分析工業株式会社製、φ２５×５００ｍｍ）２本を用いて精製し（溶離液：水／メタノールＭｅＯＨ（混合比率：２／１（体積比））、流速３．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出ＵＶ波長：２３０ｎｍ）、先頭の分子量の最も高い成分を回収し、濃縮し、凍結乾燥し、例示化合物ＮＤ１７を得た（収量：５ｍｇ、収率：５０％）。この化合物の確認は蛍光Ｘ線にて、イオウおよびヨードが十分に含まれていることを確認した。
実施例９ 例示化合物ＮＤ２の製造
シクロデキストリン化合物（ＮＤ１）１０ｍｇをＤＭＳＯ６００μＬに溶解し遮光下マグネチックスターラーで一夜攪拌した。そこへフルオロセイン−４−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）６．９ｍｇのＤＭＳＯ溶液２ｍＬを加えた。ＤＡＢＣＯ ５ｍｇをＤＭＳＯ ５ｍＬに溶解し、そのうちの５０μＬを前記混合液に加えた。さらにジブチルＳｎラウレート２００μＬをアセトン２ｍｌに溶解し、そのうち５０μＬ加えて攪拌した。３時間後にアセトン中で再沈殿させ、不溶物を濾過で回収し、水に溶解した。エバポレーターで乾固の後、再度水に溶かして凍結乾燥し、生成物４．９ｍｇを得た。
この生成物の同定をＨＰＬＣにより行った。同定は、カラム：ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０−Ａ（商品名、日本分析工業株式会社製、７×３００ｎｍ）、溶離液：リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）／メタノール（混合比率：２／１（体積比））、流速：０．６０ｍｌ／ｍｉｎ、検出：ＵＶ２７５ｎｍで行った。その結果メインピークは保持時間７．８８分で９０％以上の純度で得られた。この生成物は溶液中で黄緑色の蛍光色を発した。これは原料のＦＩＴＣと類似した蛍光色であった。生成物のＵＶ波長スキャンスペクトルでも４９２ｎｍ付近にＦＩＴＣ特有の吸収ピークが見られた。
実施例１０ 例示化合物ＮＤ１０の製造
シクロデキストリン化合物ＮＤ１ １００ｍｇをＤＭＳＯ３ｍＬに溶解し、トシルイミダゾール４ｍｇと炭酸セシウム１ｍｇ加えて、遮光下室温で１７時間反応させた。その後、ＤＡＢＣＯ２ｍｇと１，６−へキサンジアミン２ｍｇを加えて、３０分間の超音波で溶解操作の後、遮光下室温にて５日間攪拌した。これを分取ＨＰＬＣ（ＳＥＣカラム、ＪＡＩＧＥＬ−ＧＳ３１０ 水／メタノール ２／１）にかけて生成物６６ｍｇを得た。得られた生成物に対して、フルオロセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）を等モル加え、ＤＡＢＣＯ１ｍｇ及びジブチルＳｎジラウレート１ｍｇをさらに加えて、例示化合物ＮＤ１０を得た（収量：１６ｍｇ）。４７５ｎｍまたは３６０ｎｍの検出波長を用いて、感受性のピークを濃縮し、凍結乾燥した。
得られた化合物が例示化合物ＮＤ１０であることをＳＥＣ型カラムで最も分子量の高い成分となる先頭のピークがフルオロセイン特有のピーク４７５ｎｍを有することから確認した。