JP2011088935A - Optically-active nucleoside 3'-phosphoroamidite for production of phosphorus atom modified nucleotide analog - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide optically-active nucleoside 3'-phosphoroamidite for efficiently producing a highly stereoregular phosphorous atom-modified nucleotide analogue. <P>SOLUTION: Optically-active nucleoside 3'-phosphoroamidite represented by formula (1) is used for a method, for producing a highly stereoregular phosphorus atom-modified nucleotide analogue, comprising condensing with nucleoside using an activator, followed by reaction with an electrophilic reagent and deprotection. <P>COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

Translated fromJapanese

本発明は、立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体の製造法に関し、更に詳しくは、立体制御された光学純度の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体の製造法に関するものである。  The present invention relates to a method for producing a phosphorus atom-modified nucleotide analog having high stereoregularity, and more specifically, to a method for producing a phosphorus atom-modified nucleotide analog having high stereo purity that is stereocontrolled.

近年、遺伝子治療の分野で注目されている手法の一つに、アンチセンス法がある。アンチセンス法とは、ｍRNAに対して、相補的な塩基配列をもつアンチセンス分子を細胞内に導入し、標的のｍRNAに選択的に二重鎖を形成させることにより、翻訳を阻害し、標的とする蛋白質の合成を制御する方法である。  In recent years, one of the methods attracting attention in the field of gene therapy is an antisense method. Antisense method introduces an antisense molecule having a complementary base sequence to mRNA, and selectively forms a double strand in the target mRNA, thereby inhibiting translation and targeting. This is a method for controlling the synthesis of the protein.

アンチセンス分子が生体内で有効に機能するためには、
（１）相補的なRNAに対して塩基配列特異的に結合する、
（２）相補的なRNAとの間で形成する二重鎖が安定である、
（３）相補的なRNAとの間で形成する二重鎖がRNaseHの基質となる、
（４）化学的、生化学的に安定である、
（５）高い細胞膜透過性を有している、
といった性質が求められる。これらの性質を具備するものとして、ホスホロチオエートRNA（例えば非特許文献１参照）が挙げられる。しかし、ホスホロチオエートRNAは、蛋白質と非特異的に相互作用するという問題点を有する。In order for antisense molecules to function effectively in vivo,
(1) base sequence specific binding to complementary RNA,
(2) The duplex formed with complementary RNA is stable.
(3) The double strand formed with complementary RNA serves as a substrate for RNaseH.
(4) chemically and biochemically stable,
(5) having high cell membrane permeability,
These properties are required. Examples of those having these properties include phosphorothioate RNA (see, for example, Non-Patent Document 1). However, phosphorothioate RNA has the problem of interacting non-specifically with proteins.

一方、数あるホスフェートの中でも、特にボラノホスフェートDNAは、
（１）相補的なRNAに対して塩基配列特異的に結合する、
（２）相補的なRNAとの間で形成する二重鎖がRNaseHの基質となる、
（３）ヌクレアーゼに対する耐性が高い、
（４）塩基性条件下又は酸性条件下で安定である、
（５）天然型DNAよりも脂溶性が高いため、高い細胞膜透過性が期待できる、
といった特徴を有し、アンチセンス核酸としての応用が期待されている。On the other hand, boranophosphate DNA, among other phosphates,
(1) base sequence specific binding to complementary RNA,
(2) The double strand formed with complementary RNA serves as a substrate for RNaseH.
(3) high resistance to nucleases,
(4) Stable under basic or acidic conditions,
(5) Since it has higher lipid solubility than natural DNA, high cell membrane permeability can be expected.
Therefore, application as an antisense nucleic acid is expected.

リン酸ジエステル結合に修飾を施したボラノホスフェートDNAは、リン原子上に不斉点が存在するため、その立体規則性の違いにより、異なる物性値や生化学的性質を持つと考えられる。そのため、立体規則性の高いボラノホスフェートDNAの製造法が必要である。  Boranophosphate DNA modified with a phosphodiester bond has an asymmetric point on the phosphorus atom, and therefore has different physical property values and biochemical properties due to the difference in stereoregularity. Therefore, a method for producing boranophosphate DNA with high stereoregularity is required.

現在知られている製造法としては、ホスホロアミダイド法を利用する方法（例えば非特許文献２参照）と、H−ホスホネート法を利用する方法（例えば非特許文献３参照）がある。  Currently known production methods include a method using a phosphoramidide method (see, for example, Non-Patent Document 2) and a method using an H-phosphonate method (see, for example, Non-Patent Document 3).

非特許文献２の方法は、キラルなインドール−オキサザホスホリン中間体を不斉補助基として使用し、立体選択的に３価のホスファイト中間体を合成した後、ボラノ化を行なう方法である。  The method of Non-Patent Document 2 is a method in which a chiral indole-oxazaphosphorine intermediate is used as an asymmetric auxiliary group, and a trivalent phosphite intermediate is synthesized stereoselectively and then boranoated. .

非特許文献３の方法は、ジアステレオマー混合物のＨ−ホスホネートをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって立体化学的に純粋なジアステレオマーを分離し、Rp体とSp体のそれぞれに対して、in situでシリル化を行ない、３価のホスファイトを経由し、ボラノ化を行なうという方法である。この方法によって、ジアステレオマー比９８：２でボラノホスフェートDNAの合成が可能である。
Cohen, J. S. In Antisense Research and Application; Crooke, S. T.; Lebleu, B., Ed,;CRC Press Inc.: Boca Raton, 1993, 205 - 221Jin, Y.; Just, G. Tetrahedron Lett., 1998, 39, 6433-6436Surgueeva, Z. A.; Sergueev, D. S.; Shaw, B. R. Tetrahedron Lett. 1999, 40, 2041 - 2044In the method of Non-Patent Document 3, a stereochemically pure diastereomer is separated by silica gel column chromatography of H-phosphonate in a diastereomeric mixture, and silylated in situ for each of the Rp and Sp forms. This is a method of performing boranoization via trivalent phosphite. By this method, boranophosphate DNA can be synthesized with a diastereomeric ratio of 98: 2.
Cohen, JS In Antisense Research and Application; Crooke, ST; Lebleu, B., Ed ,; CRC Press Inc .: Boca Raton, 1993, 205-221 Jin, Y .; Just, G. Tetrahedron Lett., 1998, 39, 6433-6436 Surgueeva, ZA; Sergueev, DS; Shaw, BR Tetrahedron Lett. 1999, 40, 2041-2044

非特許文献２の方法では、ボラノ化を行なう前の３価のホスファイトの段階でジアステレオマー比が９４：６になっており、ボラノ化後のジアステレオマー比は９０：１０にとどまっている。  In the method of Non-Patent Document 2, the diastereomeric ratio is 94: 6 at the stage of trivalent phosphite before boranoylation, and the diastereomeric ratio after boranolation remains 90:10. Yes.

非特許文献３の方法では、P−キラルなＨ−ホスホネートを得ることができるのは二量体までであるため、この方法は固相法によるオリゴマーの合成には適さない。  In the method of Non-Patent Document 3, P-chiral H-phosphonate can be obtained up to a dimer, so this method is not suitable for the synthesis of oligomers by a solid phase method.

本発明は、リン原子上の立体を制御した立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチドの効率的な製造法を提供することを課題とする。  An object of the present invention is to provide an efficient method for producing a phosphorus atom-modified nucleotide having a high stereoregularity in which the stereo on the phosphorus atom is controlled.

本発明は、課題の解決手段として、一般式（１）で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトと、一般式（２）で表されるヌクレオシドとを、一般式（３）で表される活性化剤を用いて縮合した後、求電子試薬との反応及び脱保護を行うことを特徴とする、一般式（４）又は（５）で表される立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体の製造法を提供するものである。  As a means for solving the problem, the present invention provides an optically active nucleoside 3′-phosphoramidite represented by the general formula (1) and a nucleoside represented by the general formula (2) in the general formula (3). A phosphorus atom having a high stereoregularity represented by the general formula (4) or (5), characterized by performing a reaction with an electrophile and deprotection after condensation using the activator represented Methods for producing modified nucleotide analogs are provided.

［一般式（１）中の記号の意味は下記のとおり。[Meanings of symbols in general formula (1) are as follows.

Ｒ¹及びＲ²は同一又は異なって、水素原子、炭素数１〜３の直鎖若しくは分岐アルキル基、又は炭素数６〜１４のアリール基を示す。R¹ and R² are the same or different and each represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or an aryl group having 6 to 14 carbon atoms.

Ｒ³は炭素数１〜３の直鎖又は分岐アルキル基を示す。R³ represents a linear or branched alkyl group having 1 to³ carbon atoms.

Ｒ²とＲ³は窒素原子と窒素原子に隣接する炭素原子と共に炭素数３〜１６の環状構造を形成しても良い。R² and R³ may form a cyclic structure having 3 to 16 carbon atoms together with a nitrogen atom and a carbon atom adjacent to the nitrogen atom.

Ｒ⁴は水酸基の保護基を示す。R⁴ represents a hydroxyl-protecting group.

Ｂｓは式：  Bs is the formula:

で表されるチミン、アデニン、シトシン、グアニンあるいはそれらから誘導される基を示す。］Or a group derived from thymine, adenine, cytosine, guanine, or ]

［一般式（２）中、Ｒ⁵は水酸基の保護基、Ｂｓは前記と同じ意味を示す。[In General Formula (2), R⁵ represents a protecting group for a hydroxyl group, and Bs represents the same meaning as described above.

一般式（３）中の記号の意味は下記のとおり。  The meanings of symbols in the general formula (3) are as follows.

Ｘ^-はＢＦ₄^-、ＰＦ₆^-、ＴｆＯ^-（ＴｆはＣＦ₃ＳＯ₂を表す。以下同じ。）、Ｔｆ₂Ｎ^-、ＡｓＦ₆^-又はＳｂＦ₆^-を示す。X⁻ represents BF₄⁻ , PF₆⁻ , TfO⁻ (Tf represents CF₃ SO₂ , the same shall apply hereinafter), Tf₂ N⁻ , AsF₆⁻ or SbF₆⁻ .

Ｒ⁶及びＲ⁷は同一又は異なって、水素原子、炭素数１〜５の直鎖若しくは分岐アルキル基、又は炭素数６〜１４のアリール基を示す。R⁶ and R⁷ are the same or different and each represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or an aryl group having 6 to 14 carbon atoms.

Ｒ⁶及びＲ⁷は窒素原子と共に炭素数３〜７のモノシクロ又はビシクロ構造を形成しても良い。］R⁶ and R⁷ may form a monocyclo or bicyclo structure having 3 to 7 carbon atoms together with the nitrogen atom. ]

［一般式（４）及び一般式（５）中の記号の意味は下記のとおり。[The meanings of the symbols in general formula (4) and general formula (5) are as follows.

Ｙは炭素数１〜３の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１〜３の直鎖又は分岐鎖のヒドロキシアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、炭素数１~５のアシル基、又はY＝Y’Z⁺を示す（Y’はＳｅ^-、ＢＨ₃^-を、Z⁺はアンモニウムイオン、第１級〜第４級の低級アルキルアンモニウムイオン又は1価金属イオンを示す）。Y is a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, a linear or branched hydroxyalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, an aryl group having 6 to 14 carbon atoms, or an alkylthio group having 1 to 5 carbon atoms. , An acyl group having 1 to 5 carbon atoms, or Y = Y′Z⁺ (Y ′ is Se⁻ , BH₃⁻ , Z⁺ is an ammonium ion, primary to quaternary lower alkyl ammonium ion or Indicates a monovalent metal ion).

Ｂｓは前記と同じ意味を示し、各式中の２個のＢｓは同一でも異なっていても良い。］  Bs has the same meaning as described above, and two Bs in each formula may be the same or different. ]

本発明によれば、アンチセンス分子として有効な立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体及びそのオリゴマーを高い収率で得ることができる。  According to the present invention, a highly stereoregular phosphorus atom-modified nucleotide analog and its oligomer effective as an antisense molecule can be obtained in high yield.

以下、本発明の製造法を、縮合反応（第１反応工程）と、求電子試薬との反応及び脱保護反応（第２反応工程）に分けて説明する。第１及び第２の分け方は説明の便宜のためだけのものであり、これに限定されるものではなく、また必要に応じて精製処理等の公知の処理工程を付加することもできる。  Hereinafter, the production method of the present invention will be described by dividing it into a condensation reaction (first reaction step), a reaction with an electrophilic reagent, and a deprotection reaction (second reaction step). The first and second dividing methods are only for the convenience of explanation, and are not limited to these, and a known processing step such as a purification treatment can be added as necessary.

〔第１反応工程〕
一般式（１）で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトと、一般式（２）で表されるヌクレオシド〔以下「ヌクレオシド（２）」という〕とを、一般式（３）で表される活性化剤〔以下「活性化剤（３）」という〕の存在下で縮合反応させる。[First reaction step]
An optically active nucleoside 3′-phosphoramidite represented by general formula (1) and a nucleoside represented by general formula (2) [hereinafter referred to as “nucleoside (2)”] are represented by general formula (3). The condensation reaction is carried out in the presence of the represented activator [hereinafter referred to as “activator (3)”].

一般式（１）で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトは、下記のとおり、適当な１，２−アミノアルコールから公知の方法で合成することができる（例えばTetrahedron：Asymmetry, 1995, 6, 1051-1054参照）。  The optically active nucleoside 3′-phosphoramidite represented by the general formula (1) can be synthesized from an appropriate 1,2-aminoalcohol by a known method as described below (for example, Tetrahedron: Asymmetry, 1995). , 6, 1051-1054).

即ち、一般式（６）で表される光学活性な１，２−アミノアルコール〔以下「アミノアルコール（６）」という〕と、三塩化リンを反応させて得られる一般式（７）で表される光学活性なホスフィチル化剤〔以下「ホスフィチル化剤（７）」という〕と、一般式（８）で表されるヌクレオシドを反応させて得ることができる。  That is, it is represented by the general formula (7) obtained by reacting the optically active 1,2-aminoalcohol represented by the general formula (6) (hereinafter referred to as “aminoalcohol (6)”) with phosphorus trichloride. An optically active phosphitylating agent [hereinafter referred to as “phosphitylating agent (7)”] and a nucleoside represented by the general formula (8) can be obtained.

［式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＢｓは、一般式（１）と同じ意味を示す。］
アミノアルコール（６）としては、（Ｓ）−及び（Ｒ）−２−メチルアミノ−１−フェニルエタノール、（１Ｒ，２Ｓ）−エフェドリン、（１Ｒ，２Ｓ）−２−メチルアミノ−１，２−ジフェニルエタノール等が挙げられる。[Wherein R¹ , R² , R³ , R⁴ and Bs have the same meaning as in general formula (1). ]
As amino alcohol (6), (S)-and (R) -2-methylamino-1-phenylethanol, (1R, 2S) -ephedrine, (1R, 2S) -2-methylamino-1,2- Examples include diphenylethanol.

ヌクレオシド（８）において、Ｂｓはチミン、アデニン、シトシン又はグアニンあるいはそれらから誘導される基を示すが、具体的には、アデニン、シトシン及びグアニンのアミノ基を保護基で保護したもの等が挙げられ、更に具体的には、下記一般式で表される化合物が挙げられる。  In the nucleoside (8), Bs represents thymine, adenine, cytosine or guanine or a group derived therefrom, and specific examples include those in which the amino group of adenine, cytosine and guanine is protected with a protecting group. More specifically, compounds represented by the following general formula can be mentioned.

［式中、Ｒ⁸は炭素数１〜１５の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、アリール基、アラルキル基、アリールオキシアルキル基を示し、中でもメチル基、イソプロピル基、フェニル基、ベンジル基、フェノキシメチル基が好ましく、特にフェニル基が好ましい。また、Ｒ⁹及びＲ¹⁰は、それぞれ炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示し、特にメチル基が好ましい。］
ヌクレオシド（８）は、チミジン、アデノシン、シチジン、グアノシン又はそれらの誘導体の５位の水酸基を、tert−ブチルジフェニルシリル基（ＴＢＤＰＳ）、tert−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、４，４’−ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）、４−メトキシトリチル基（ＭＭＴｒ）等の保護基で保護したものである。[Wherein R⁸ represents a linear or branched alkyl group having 1 to 15 carbon atoms, an aryl group, an aralkyl group, or an aryloxyalkyl group, and among them, a methyl group, an isopropyl group, a phenyl group, a benzyl group, a phenoxymethyl group. Group is preferable, and a phenyl group is particularly preferable. R⁹ and R¹⁰ each represent a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and a methyl group is particularly preferable. ]
Nucleoside (8) is a 5-position hydroxyl group of thymidine, adenosine, cytidine, guanosine or derivatives thereof, tert-butyldiphenylsilyl group (TBDPS), tert-butyldimethylsilyl group (TBDMS), 4,4′-dimethoxy. It is protected with a protecting group such as a trityl group (DMTr) or 4-methoxytrityl group (MMTr).

上記のような方法で得られた一般式（１）で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトにおいて、Ｒ¹及びＲ²としては、Ｒ¹及びＲ²のいずれか一方が水素原子で他方がフェニル基、Ｒ¹及びＲ²のいずれか一方がメチル基で他方がフェニル基、あるいはＲ¹及びＲ²が共にフェニル基の組合わせが好ましく、Ｒ¹がフェニル基、Ｒ²が水素原子の組合わせが更に好ましい。Ｒ³はメチル基が好ましい。Ｒ⁴はＴＢＤＰＳ、ＴＢＤＭＳが好ましく、ＴＢＤＰＳが更に好ましい。In the optically active nucleoside 3'- phosphoramidite represented by the general formula obtained in the above-described method (1), as R¹ and R^2, either one hydrogen atom of R¹ and R² And the other is a phenyl group,^one of R¹ and R² is a methyl group and the other is a phenyl group, or a combination of R¹ and R² are both a phenyl group, R¹ is a phenyl group, and R² is a hydrogen group. A combination of atoms is more preferred. R³ is preferably a methyl group. R⁴ is preferably TBDPS or TBDMS, more preferably TBDPS.

ヌクレオシド（２）は、チミジン、アデノシン、シチジン、グアノシン又はそれらの誘導体の３位の水酸基を保護したものであり、Ｂｓで示されるチミン、アデニン、シトシン、グアニン又はそれらの誘導体から誘導される基は、ヌクレオシド（８）で例示したものが挙げられる。ヌクレオシド（２）とヌクレオシド（８）のＢｓは同一でも異なっていても良い。Ｒ⁵で示される水酸基の保護基としては、ＴＢＤＰＳ、ＴＢＤＭＳ，アセチル基（Ａｃ）、ベンジル基（Ｂｚ）、ＤＭＴｒ、ＭＭＴｒ等が挙げられ、ＴＢＤＭＳが好ましい。Nucleoside (2) is a group in which the hydroxyl group at the 3-position of thymidine, adenosine, cytidine, guanosine or a derivative thereof is protected, and a group derived from thymine, adenine, cytosine, guanine or a derivative thereof represented by Bs is And those exemplified for nucleoside (8). Bs of nucleoside (2) and nucleoside (8) may be the same or different. Examples of the hydroxyl protecting group represented by R⁵ include TBDPS, TBDMS, acetyl group (Ac), benzyl group (Bz), DMTr, MMTr and the like, and TBDMS is preferred.

活性化剤（３）は、一般式（１）で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトの窒素原子に対するプロトン供給能力を有し、求核試薬としては働かないものである。  The activator (3) has a proton supplying ability to the nitrogen atom of the optically active nucleoside 3'-phosphoramidite represented by the general formula (1) and does not function as a nucleophile.

活性化剤（３）中、Ｘ^-はＢＦ₄^-、ＰＦ₆^-、ＴｆＯ^-、Ｔｆ₂Ｎ^-が好ましい。Ｒ⁶及びＲ⁷は窒素原子と共に炭素数３〜７のモノシクロ又はビシクロ構造を形成しても良く、中でも炭素数４又は５のモノシクロ又はビシクロ構造が好ましい。In the activator (3), X⁻ is preferably BF₄⁻ , PF₆⁻ , TfO⁻ , or Tf₂ N⁻ . R⁶ and R⁷ may form a monocyclo or bicyclo structure having 3 to 7 carbon atoms with a nitrogen atom, and among them, a monocyclo or bicyclo structure having 4 or 5 carbon atoms is preferable.

活性化剤（３）は、式（11）で表されるアミンと、式（12）で表される化合物とを反応させることにより、容易に得ることができる。  The activator (3) can be easily obtained by reacting the amine represented by the formula (11) with the compound represented by the formula (12).

［一般式（11）中、R⁶及びR⁷は前記と同じ意味を示し、一般式（12）中、Ｘ^-は一般式（３）と同じ意味を示す。］
活性化剤（３）は、特にアセトニトリルに良い溶解性を示すので、一般式（１）で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトとヌクレオシド（２）との反応は、アセトニトリル等の溶媒中で行うことが好ましい。[In general formula (11), R⁶ and R⁷ have the same meaning as described above, and in general formula (12), X⁻ has the same meaning as in general formula (3). ]
Since the activator (3) exhibits particularly good solubility in acetonitrile, the reaction between the optically active nucleoside 3′-phosphoramidite represented by the general formula (1) and the nucleoside (2) It is preferable to carry out in a solvent.

一般式（１）で表される光学活性なヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトとヌクレオシド（２）は、一般式（１）で表されるホスホロアミダイトに対し、ヌクレオシド（２）を０．５〜２．０当量倍で反応させることが好ましく、０．５〜１．２当量倍の割合で反応させることがより好ましい。反応温度は０〜４０℃が好ましい。反応圧力は１気圧が好ましい。  The optically active nucleoside 3′-phosphoramidite represented by the general formula (1) and the nucleoside (2) have a nucleoside (2) of 0.5 to 0.5 with respect to the phosphoramidite represented by the general formula (1). It is preferable to make it react by 2.0 equivalent times, and it is more preferable to make it react by the ratio of 0.5-1.2 equivalent times. The reaction temperature is preferably 0 to 40 ° C. The reaction pressure is preferably 1 atmosphere.

以上の第１反応工程により、下記の一般式（10）で表されるホスファイト〔以下「ホスファイト（10）」という〕を得ることができる。  By the above first reaction step, a phosphite represented by the following general formula (10) [hereinafter referred to as “phosphite (10)]” can be obtained.

［一般式（10）中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＢｓは一般式（１）、（２）と同じ意味を示す。］
〔第２反応工程〕
まず、第１反応工程で得られたホスファイト（10）を無水酢酸等でＮ−アセチル化した後、求電子剤と反応させて、下記の一般式（13）で表される化合物〔以下「化合物（13）」という〕を得る。[In General Formula (10), R¹ , R² , R³ , R⁴ , R⁵ and Bs have the same meanings as in General Formulas (1) and (2). ]
[Second reaction step]
First, the phosphite (10) obtained in the first reaction step is N-acetylated with acetic anhydride or the like and then reacted with an electrophile to produce a compound represented by the following general formula (13) [hereinafter “ Compound (13) ”is obtained.

［一般式（13）中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｂｓは一般式（１）、（２）と同じ意味を示し、Ｙは炭素数１〜３の直鎖又は分岐鎖のアルキル基、炭素数１〜３の直鎖又は分岐鎖のヒドロキシアルキル基、炭素数６〜１４のアリール基、アルキルチオ基、アシル基、又はY＝Y’Z⁺を示し、Y’はＳｅ^-、ＢＨ₃^-を、Z⁺はアンモニウムイオン、第１級〜第４級の低級アルキルアンモニウムイオン又は1価金属イオンを示し、Ｒ¹¹は水素原子又は窒素
原子の保護基を示す。］
Ｒ¹¹で示される窒素原子の保護基としては、アセチル基（Ａｃ）、ベンジル基（Ｂｚ）、トリメチルシリル基等が挙げられ、トリメチルシリル基が好ましいが、保護基が導入されていなくても良い。[In General Formula (13), R¹ , R² , R³ , R⁴ , R⁵ and Bs have the same meanings as in General Formulas (1) and (2), and Y is a straight chain having 1 to 3 carbon atoms. Or a branched alkyl group, a linear or branched hydroxyalkyl group having 1 to 3 carbon atoms, an aryl group having 6 to 14 carbon atoms, an alkylthio group, an acyl group, or Y = Y′Z⁺ , Represents Se⁻ , BH₃^— , Z⁺ represents an ammonium ion, a primary to quaternary lower alkyl ammonium ion or a monovalent metal ion, and R¹¹ represents a protecting group for a hydrogen atom or a nitrogen atom. ]
Examples of the protecting group for the nitrogen atom represented by R¹¹ include an acetyl group (Ac), a benzyl group (Bz), a trimethylsilyl group, and the like. A trimethylsilyl group is preferable, but a protecting group may not be introduced.

求電子剤としては、ＢＨ₃・ＴＨＦ、ＢＨ₃・（ＣＨ₃）₂Ｓ等のホウ素化剤、ジスルフィド、ＣＨ₃Ｉ等のアルキル化剤、ＣＨ₂＝Ｏ等のアルデヒド、酸クロリド又はセレン等が挙げられる。Examples of electrophiles include boronating agents such as BH₃ · THF and BH₃ · (CH₃ )₂ S, alkylating agents such as disulfide and CH₃ I, aldehydes such as CH₂ ═O, acid chloride, selenium and the like Is mentioned.

次に、リン酸修飾後、化合物（１３）のキラル補助物質を１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）等で処理して除き、一般式（14）で表される保護されたジヌクレオチドホスフェート誘導体を得る。  Next, after the phosphoric acid modification, the chiral auxiliary substance of the compound (13) is removed by treatment with 1,8-diazabicyclo [5,4,0] undec-7-ene (DBU) or the like. The protected dinucleotide phosphate derivative represented is obtained.

［一般式（14）中、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｂｓ及びＹは一般式（１）、（２）と同じ意味を示す。］ 最後に、水酸基の保護基を、（ＣＨ₃ＣＨ₂）₃Ｎ・３ＨＦ等で除くことにより、一般式（４）又は一般式（５）で表される立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体を効率的に得ることができる。[In General Formula (14), R⁴ , R⁵ , Bs and Y have the same meanings as in General Formulas (1) and (2). Finally, a phosphorus atom-modified nucleotide with high stereoregularity represented by the general formula (4) or the general formula (5) is obtained by removing the protective group for the hydroxyl group with (CH₃ CH₂ )₃ N · 3HF or the like. Analogues can be obtained efficiently.

また、本発明においては、上記した第１反応工程と第２反応工程を繰り返すことにより、一般式（９）で表されるオリゴマー〔以下「オリゴマー（９）」という〕を製造することができる。  In the present invention, an oligomer represented by the general formula (9) [hereinafter referred to as “oligomer (9)”] can be produced by repeating the first reaction step and the second reaction step.

［式中、Ｙ及びＢｓは一般式（１）、（４）、（５）と同じ意味を示し、ｎは１〜１５０の整数（但し、１は含まない）を示す。構成単位中の２個のＢｓは同一でも異なっていても良い。］
オリゴマー（９）の製造は、溶液中で行っても固相上で行っても良い。固相上で行う場合は、有機高分子系担体又は無機高分子担体をベースポリマーとして用いる。有機高分子系担体としては、ポリスチレン、ポリエチレングリコール−ポリスチレングラフト重合体が挙げられ、アミノメチルポリスチレンが好ましい。無機高分子担体としては、シシカゲル担体であるコントロールドポリグラス（ＣＰＧ）が挙げられ、アミノプロピルＣＰＧが好ましい。また、リンカー部分としては、サクリネートリンカー（−ＣＯ−ＣＨ₂―ＣＨ₂―ＣＯ−）、オキサリルリンカー（−ＣＯ−ＣＯ−）が挙げられる。リンカー部分とヌクレオチドとは、エステル結合を介して結合していることが好ましい。[Wherein Y and Bs have the same meanings as in general formulas (1), (4) and (5), and n represents an integer of 1 to 150 (however, 1 is not included). Two Bs in the structural unit may be the same or different. ]
The oligomer (9) may be produced in a solution or on a solid phase. When carried out on a solid phase, an organic polymer carrier or an inorganic polymer carrier is used as the base polymer. Examples of the organic polymer carrier include polystyrene and polyethylene glycol-polystyrene graft polymer, and aminomethyl polystyrene is preferable. Examples of the inorganic polymer carrier include controlled polygrass (CPG) which is a Shishika gel carrier, and aminopropyl CPG is preferred. Examples of the linker moiety include a succinate linker (—CO—CH₂ —CH₂ —CO—) and an oxalyl linker (—CO—CO—). The linker moiety and the nucleotide are preferably bonded via an ester bond.

一般式（９）におけるｎは１〜１５０の整数を示し、好ましいｎの範囲は１０〜１００であり、より好ましい範囲は１０〜５０、更に好ましい範囲は１５〜３０である。  N in General formula (9) shows the integer of 1-150, the range of preferable n is 10-100, a more preferable range is 10-50, and a still more preferable range is 15-30.

本発明の製造法により得られる立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体は、遺伝子治療の分野で注目されている手法の一つであるアンチセンス法に使用することができる。  The highly stereoregular phosphorus atom-modified nucleotide analog obtained by the production method of the present invention can be used in an antisense method, which is one of the methods that are attracting attention in the field of gene therapy.

本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。  EXAMPLES The present invention will be described in detail by examples, but the present invention is not limited to these examples.

製造例１〔N−シアノメチルピロリジウムトリフルオロメタンスルホネートの製造；活性化剤（3）の製造〕
N―シアノメチルピロリジン０．５５１ｇ（５．００ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（５．００ｍｌ）溶液を０℃に冷却し、攪拌しつつトリフルオロメタンスルホン酸０．４４２ｍｌ（５．００ｍｍｏｌ）を滴下した後、エチルエーテル（１０ｍｌ）を加えた。Production Example 1 [Production of N-cyanomethylpyrrolidinium trifluoromethanesulfonate; Production of activator (3)]
A solution of 0.551 g (5.00 mmol) of N-cyanomethylpyrrolidine in dichloromethane (5.00 ml) was cooled to 0 ° C., 0.442 ml (5.00 mmol) of trifluoromethanesulfonic acid was added dropwise with stirring, and then ethyl ether was added. (10 ml) was added.

生じた固体を吸引ろ過によって集め、エチルエーテル（１ｍｌ×３回）で洗浄した後、減圧下で乾燥し白色粉末状の目的物１１．１ｇ（４．２７ｍｍｏｌ、収率８５％）を得た。
・ＩＲ（ＫＢｒ）ν_max：2996, 2841, 2651, 2477, 2347, 2282, 1637, 1462, 1437, 1269, 1228, 1168, 1033, 985, 911, 849, 761, 641 cm^-1
・¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ， ＣＤ₃ＣＮ）δ：8.16(br,1H), 4.30(s,2H), 3.50(br,4H), 2.14〜2.09(m,4H)
・¹³Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ， ＣＤ₃ＣＮ）δ：121.2(q,¹J_CF=320Hz), 55.9, 42.0, 23.5
製造例２〔（５Ｒ）−２−クロロ−３−メチル−５−フェニル−１，３，２−オキサアザホスホリジンの製造；ホスフィチル化剤（7）の製造〕
（Ｒ）−２−メチルアミノ−１−フェニルエタノール〔アミノアルコール（6）〕２．２７ｇ（１５．０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン５．５８ｍｌ（４０．０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２０．０ｍｌ）溶液を、０℃に冷却した三塩化リン１．７５ｍｌ（２０．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０．０ｍｌ）溶液に対して、攪拌しつつ滴下し、温度を室温にして３０分間攪拌した。The resulting solid was collected by suction filtration, washed with ethyl ether (1 ml × 3 times), and then dried under reduced pressure to obtain 11.1 g (4.27 mmol, yield 85%) of the desired product as a white powder.
IR (KBr) ν_max : 2996, 2841, 2651, 2477, 2347, 2282, 1637, 1462, 1437, 1269, 1228, 1168, 1033, 985, 911, 849, 761, 641 cm^-1
・¹ H-NMR (300 MHz, CD₃ CN) δ: 8.16 (br, 1H), 4.30 (s, 2H), 3.50 (br, 4H), 2.14 to 2.09 (m, 4H)
^{· 13 C-NMR (75MHz,} CD 3 CN) δ: 121.2 (q, 1 J CF = 320Hz), 55.9, 42.0, 23.5
Production Example 2 [Production of (5R) -2-chloro-3-methyl-5-phenyl-1,3,2-oxaazaphosphoridine; Production of phosphitylating agent (7)]
(R) -2-methylamino-1-phenylethanol [amino alcohol (6)] 2.27 g (15.0 mmol), triethylamine 5.58 ml (40.0 mmol) in tetrahydrofuran (THF) (20.0 ml) The solution was added dropwise to a THF (20.0 ml) solution of 1.75 ml (20.0 mmol) of phosphorus trichloride cooled to 0 ° C. with stirring, and the temperature was brought to room temperature and stirred for 30 minutes.

生じた塩をグラスフィルターでアルゴン雰囲気下ろ過し、ＴＨＦ（１ｍｌ×３回）で洗浄した。ろ液を濃縮し、残渣を減圧下で蒸留することにより、無色透明液体の目的物２．５９ｇ（１２．０ｍｍｏｌ、収率６０％）を得た。
・¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：7.08〜7.05(m,6H), 6.91〜6.81 (m,4H), 6.15(br,4H),6.15(d,J=8.3Hz,1H),4.64(dd,J_HH=8.3Hz,³J_HP=4.2Hz,1H),2.64(d,³J_HP=15.3Hz,3H)
・³¹Ｐ−ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ,ＣＤＣｌ₃）δ：171.7
製造例３〔（２Ｒ,５Ｒ）−２−（５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル）−３−メチル−５−フェニル−１，３，２−オキサアザホスホリジンの製造；一般式（1）の化合物の製造〕
５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン〔ヌクレオシド（8）〕２．１８ｇ（４．５５ｍｍｏｌ）をピリジン及びトルエンで共沸乾燥し、ＴＨＦ７．５０ｍｌに溶解した。これに、トリエチルアミン３．１７ｍｌ（２２．７３ｍｍｏｌ）を加え、−７８℃に冷却した。The resulting salt was filtered through a glass filter under an argon atmosphere and washed with THF (1 ml × 3 times). The filtrate was concentrated, and the residue was distilled under reduced pressure to obtain 2.59 g (12.0 mmol, yield 60%) of the desired product as a colorless transparent liquid.
¹ H-NMR (300 MHz, CDCl₃ ) δ: 7.08 to 7.05 (m, 6H), 6.91 to 6.81 (m, 4H), 6.15 (br, 4H), 6.15 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 4.64 (dd, J_HH = 8.3Hz,³ J_HP = 4.2Hz, 1H), 2.64 (d,³ J_HP = 15.3Hz, 3H)
³¹ P-NMR (121 MHz, CDCl₃ ) δ: 171.7
Production Example 3 [(2R, 5R) -2- (5′-O-tert-butyldiphenylsilylthymidin-3′-yl) -3-methyl-5-phenyl-1,3,2-oxaazaphosphoridine Production; Production of Compound of General Formula (1)]
2.18 g (4.55 mmol) of 5′-O-tert-butyldiphenylsilylthymidine [nucleoside (8)] was azeotropically dried with pyridine and toluene, and dissolved in 7.50 ml of THF. To this, 3.17 ml (22.73 mmol) of triethylamine was added and cooled to -78 ° C.

この溶液に、アルゴン雰囲気下、製造例２で得られた化合物〔ホスフィチル化剤（7）〕のＴＨＦ溶液７．５ｍｌ（４．５５ｍｍｏｌ）滴下した後、室温で３０分間攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液７５ｍｌ及びクロロホルム７５ｍｌを加えた。  To this solution, 7.5 ml (4.55 mmol) of the THF solution of the compound [phosphitylating agent (7)] obtained in Production Example 2 was added dropwise under an argon atmosphere, followed by stirring at room temperature for 30 minutes, and saturated sodium bicarbonate. 75 ml of solution and 75 ml of chloroform were added.

有機相を分離後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（７５ｍｌ×２回）で洗浄し、集めた洗浄液をクロロホルム（７５ｍｌ×２回）で抽出した。次に、集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下で濃縮した。  The organic phase was separated, washed with saturated sodium hydrogen carbonate solution (75 ml × 2 times), and the collected washings were extracted with chloroform (75 ml × 2 times). Next, the collected organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure.

残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル−トリエチルアミン、３０：７０：３、v/v/v）で分離精製した。得られたフラクションを集めて飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１００ｍｌ）で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下で濃縮することにより無色非晶質である目的物９５７．０ｍｇ（収率３２％）を得た。
・¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：8.12（br,1H）,7.66〜7.62（m,4H）,7.46〜7.16（m,12H）,6.39（dd,J=2.4,5.7Hz,1H）,5.55（dd,J=6.9,7.2Hz,1H）,4.95〜4.90
（m,1H）,4.04〜4.02（m,1H）,3.95（dd,²J_H=18.2Hz,³J_H=1.1Hz,1H）,3.89（dd,²J_H=18.2Hz,³J_H=1.1Hz,1H）,3.51〜3.46（m,1H）,2.93〜2.86（m,1H）,2.75〜2.71（d,J=6Hz,3H）,2.46〜2.40（m,1H）,2.28〜2.17（m,1H）,1.58（d,J=0.6Hz,3H）,1.10（s,9H）
・³¹Ｐ−ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ,ＣＤＣｌ₃）δ：143.5(s)
実施例１〔（Ｒ）トリエチルアンモニウム ５’−Ｏ−tert−ブチルジフェニルシリルチミジン−３’−イル ３’−Ｏ−ブチルジメチルシリルチミジン−５’−イル ボラノフォスフェートの製造〕
製造例３で得られた化合物〔一般式（1）の化合物〕４９．５ｍｇ（７５μｍｏｌ）と３’−Ｏ−tert−ブチルジメチルシリルチミジン〔ヌクレオシド（2）〕１７．８ｍｇ（５０μｍｏｌ）とを五酸化二リン存在下で１２時間乾燥した。The residue was separated and purified by silica gel column chromatography (hexane-ethyl acetate-triethylamine, 30: 70: 3, v / v / v). The obtained fractions were collected, washed with a saturated sodium hydrogen carbonate solution (100 ml), dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure to give 957.0 mg (yield) of a colorless amorphous target product. 32%).
・¹ H-NMR (300 MHz, CDCl₃ ) δ: 8.12 (br, 1H), 7.66 to 7.62 (m, 4H), 7.46 to 7.16 (m, 12H), 6.39 (dd, J = 2.4, 5.7 Hz, 1H ), 5.55 (dd, J = 6.9, 7.2Hz, 1H), 4.95-4.90
(M, 1H), 4.04 to 4.02 (m, 1H), 3.95 (dd,² J_H = 18.2Hz,³ J_H = 1.1Hz, 1H), 3.89 (dd,² J_H = 18.2Hz,³ J_H = 1.1Hz, 1H), 3.51 to 3.46 (m, 1H), 2.93 to 2.86 (m, 1H), 2.75 to 2.71 (d, J = 6Hz, 3H), 2.46 to 2.40 (m, 1H), 2.28 to 2.17 (M, 1H), 1.58 (d, J = 0.6Hz, 3H), 1.10 (s, 9H)
^{· 31 P-NMR (121MHz,} CDCl 3) δ: 143.5 (s)
Example 1 (Production of (R) triethylammonium 5′-O-tert-butyldiphenylsilylthymidine-3′-yl 3′-O-butyldimethylsilylthymidine-5′-yl boranophosphate)
The compound obtained in Production Example 3 [compound of general formula (1)] 49.5 mg (75 μmol) and 3′-O-tert-butyldimethylsilylthymidine [nucleoside (2)] 17.8 mg (50 μmol) Dried for 12 hours in the presence of diphosphorus oxide.

ここに、モレキュラーシーブ（ＭＳ３Ａ）で８時間乾燥させた製造例１で得られた化合物〔活性化剤（3）〕２００μｌ（１００μｍｏｌ）の０．５Ｍアセトニトリル溶液をアルゴン雰囲気下で加え、５分静置した。  To this was added a 0.5 M acetonitrile solution of 200 [mu] l (100 [mu] mol) of the compound [activator (3)] obtained in Production Example 1 dried for 8 hours with molecular sieve (MS3A) in an argon atmosphere, and allowed to stand for 5 minutes. I put it.

その後、１．０４Ｍボランテトラヒドロフラン錯体のテトラヒロドフラン溶液（求電子試薬）０．５ｍｌ（５００μｌ）を加えた。添加後１０分間静置し、減圧下でアセトニトリルと過剰のボラノ化剤を留去した。その後、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデカ−７−エン７４．６μｌ（５００μｍｏｌ）を加え、５０℃で２６時間放置した。  Thereafter, 0.5 ml (500 μl) of a tetrahydrofuran solution (electrophilic reagent) of 1.04 M borane tetrahydrofuran complex was added. The mixture was allowed to stand for 10 minutes after the addition, and acetonitrile and excess boranoting agent were distilled off under reduced pressure. Thereafter, 74.6 μl (500 μmol) of 1,8-diazabicyclo [5,4,0] undec-7-ene was added and left at 50 ° C. for 26 hours.

その後、室温に戻し、クロロホルム１０ｍｌで希釈し、ｐＨ＝７．０の０．２Ｍリン酸緩衝液１０ｍｌで洗浄した。洗浄液をクロロホルム（１０ｍｌ×３回）で抽出した後、集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下で濃縮した。  Thereafter, the temperature was returned to room temperature, diluted with 10 ml of chloroform, and washed with 10 ml of 0.2 M phosphate buffer having a pH of 7.0. The washing solution was extracted with chloroform (10 ml × 3 times), and the collected organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure.

残渣を薄相クロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール：トリメチルアミン＝９９：１：０．５、v/v/vで３回、９６：４：０．５、v/v/vで２回）で分離精製し、得られた生成物をクロロホルム／１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸緩衝液により塩交換することで（脱保護）、無色非晶質である目的物２５．６ｍｇ（収率５１％）を得た。
・¹Ｈ−ＮＭＲ（300ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：9．3〜8.8（br,1H）,7.69〜7.64（m,6H）,7.52〜7.36（m,6H）,6.44〜6.31（m,2H）,5.19〜5.10（m,1H）,4.39（s,1H）,3.98〜3.89
（m,4H）,3.06（q,J=7.2Hz,6H）,2.59〜2.56（m,1H）,2.25〜2.20（m,1H）,1.98（s,1H）,1.56（s,3H）,1.32（t,J=6.9Hz,9H）,1.10（s,9H）,0.87（s,9H）,0.05（s,6H）,1.0〜0（br,3H）
・³¹Ｐ−ＮＭＲ（121ＭＨｚ,ＣＤＣｌ₃）δ：95.0(br)
実施例２〔（Ｒ）トリエチルアンモニウム チミジン−３’−イル チミジン−５'−イル−ボラノフォスフェートの製造〕
実施例１で得られた化合物２５．６ｍｇ（２５．５μｍｍｏｌ）をピリジン及びトルエンで共沸乾燥し、トリエチルアミン−３フッ化水素（５００μｌ）に溶解した。この溶液を室温で２４時間攪拌した後、０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液３ｍｌを加え、逆相カラムクロマトグラフィー〔０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）アセトニトリル０〜１０％の線形的グラディエント〕により精製し、無色非晶質である目的物１０．６ｍｇ（収率６１％）を得た。
・¹Ｈ−ＮＭＲ（300ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ）δ：7.69（s,1H）,7.63（s,1H）,6.30〜6.18（m,2H）,4.87（br,1H）,4.55〜4.54（m,1H）,4.14〜4.05（m,4H）,3.80〜3.77（m,2H）,3.18（q,J=3.6Hz,6H）,2.49〜2.46（m,1H）,1.90（s,3H）,1.87（s,3H）,1.27（t,J=7.2Hz,9H）,1.0〜0（br,3H）
・³¹Ｐ−ＮＭＲ（121ＭＨｚ,Ｄ₂Ｏ）δ：93.0(br)
実施例３
5’-O-〔ビス（4-メトキシフェニル）フェニルメチル〕-3’-O-〔（2R,5R）-3-メチル-5-フェニル-1,3,2-オキサザホスホリジン-2-イル〕-2’-デオキシアデノシン[(Rp)-1]の
製造
5’-O-〔ビス（4-メトキシフェニル）フェニルメチル〕-2’-デオキシアデノシン（0.80 g, 1.50 mmol）をピリジン、トルエンと繰り返し共沸することによって乾燥し、THF（7.50 ml） 溶液とした。Separation and purification of the residue by thin phase chromatography (dichloromethane: methanol: trimethylamine = 99: 1: 0.5, 3 times at v / v / v, 96: 4: 0.5, 2 times at v / v / v) Then, the obtained product was subjected to salt exchange with chloroform / 1M triethylammonium acetate buffer (deprotection) to obtain 25.6 mg (yield 51%) of the desired product which was colorless and amorphous.
・¹ H-NMR (300 MHz, CDCl₃ ) δ: 9.3 to 8.8 (br, 1H), 7.69 to 7.64 (m, 6H), 7.52 to 7.36 (m, 6H), 6.44 to 6.31 (m, 2H) , 5.19-5.10 (m, 1H), 4.39 (s, 1H), 3.98-3.89
(M, 4H), 3.06 (q, J = 7.2Hz, 6H), 2.59 to 2.56 (m, 1H), 2.25 to 2.20 (m, 1H), 1.98 (s, 1H), 1.56 (s, 3H), 1.32 (t, J = 6.9Hz, 9H), 1.10 (s, 9H), 0.87 (s, 9H), 0.05 (s, 6H), 1.0 to 0 (br, 3H)
・³¹ P-NMR (121 MHz, CDCl₃ ) δ: 95.0 (br)
Example 2 [Production of (R) triethylammonium thymidine-3′-yl thymidine-5′-yl-boranophosphate]
25.6 mg (25.5 μmmol) of the compound obtained in Example 1 was azeotropically dried with pyridine and toluene, and dissolved in triethylamine-3 hydrogen fluoride (500 μl). After stirring this solution at room temperature for 24 hours, 3 ml of 0.1 M ammonium acetate buffer was added, and reverse phase column chromatography [0.1 M ammonium acetate buffer (pH = 7.0) acetonitrile 0-10% linear To obtain 10.6 mg (yield 61%) of the target product which is colorless and amorphous.
^{· 1 H-NMR (300MHz,} D 2 O) δ: 7.69 (s, 1H), 7.63 (s, 1H), 6.30~6.18 (m, 2H), 4.87 (br, 1H), 4.55~4.54 (m, 1H), 4.14 to 4.05 (m, 4H), 3.80 to 3.77 (m, 2H), 3.18 (q, J = 3.6Hz, 6H), 2.49 to 2.46 (m, 1H), 1.90 (s, 3H), 1.87 (S, 3H), 1.27 (t, J = 7.2Hz, 9H), 1.0 to 0 (br, 3H)
・³¹ P-NMR (121 MHz, D₂ O) δ: 93.0 (br)
Example 3
5'-O- [Bis (4-methoxyphenyl) phenylmethyl] -3'-O-[(2R, 5R) -3-methyl-5-phenyl-1,3,2-oxazaphospholidine-2- Il] -2'-deoxyadenosine [(Rp) -1]
5'-O- [Bis (4-methoxyphenyl) phenylmethyl] -2'-deoxyadenosine (0.80 g, 1.50 mmol) was dried by repeated azeotropy with pyridine and toluene, and THF (7.50 ml) solution was added. did.

これにトリエチルアミン（1.47 ml, 10.5 mmol）を加え、−78 ℃に冷却した後、アルゴン雰囲気下、下記式15の0.22 M THF溶液（10.0 ml, 2.25 mmol）を滴下した。反応混合物を−78℃に保ったまま１時間撹拌した後、飽和重曹水（75 ml）及びクロロホルム（75 ml）を加えた。  Triethylamine (1.47 ml, 10.5 mmol) was added thereto, and after cooling to −78 ° C., a 0.22 M THF solution (10.0 ml, 2.25 mmol) of the following formula 15 was added dropwise under an argon atmosphere. The reaction mixture was stirred for 1 hour while maintaining at -78 ° C, and then saturated aqueous sodium hydrogen carbonate (75 ml) and chloroform (75 ml) were added.

有機相を分離後、飽和重曹水で洗浄（75 ml×2）し、集めた洗液をクロロホルム（75 ml ×2）で抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー〔2.5 × 16 cm,シリカゲル50g,ジクロロメタン−ヘキサン−ピリジン−トリエチルアミン（57:29:14:2, v/v/v/v）〕で分離精製した。  The organic phase was separated, washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate (75 ml × 2), and the collected washings were extracted with chloroform (75 ml × 2). The collected organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure. The residue was separated and purified by silica gel column chromatography [2.5 × 16 cm, silica gel 50 g, dichloromethane-hexane-pyridine-triethylamine (57: 29: 14: 2, v / v / v / v)].

(Rp)-1を含むフラクションを集め、飽和重曹水水溶液（100 ml）で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮乾燥して、下記式の(Rp)-1（469.1 mg, 44％）を得た。薄黄色非晶質。
¹H-NMR (CDCl₃) δ 8.28 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.40 - 7.13 (m, 9H), 6.76 - 6.73 (m, 4H), 6.46 - 6.42 (t, 1H), 6.02 (s, 1H), 5.59 - 5.57 (br, 2H), 5.04 - 4.99 (m,
1H), 4.23 - 4.20 (m, 1H), 3.72 - 3.53 (m, 6H), 3.53 - 3.49 (m, 1H), 3.41 - 3.34 (m, 1H), 2.96 - 2.84 (m, 2H), 2.71, 2.67 (d, 3H), 2.63 - 2.55 (m, 1H).³¹P-NMR (CDCl₃) δ 141.4.Fractions containing (Rp) -1 were collected, washed with a saturated aqueous sodium bicarbonate solution (100 ml), dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated to dryness under reduced pressure to give (Rp) -1 (469.1 mg , 44%). Pale yellow amorphous.
¹ H-NMR (CDCl₃ ) δ 8.28 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.40-7.13 (m, 9H), 6.76-6.73 (m, 4H), 6.46-6.42 (t, 1H), 6.02 (s, 1H), 5.59-5.57 (br, 2H), 5.04-4.99 (m,
1H), 4.23-4.20 (m, 1H), 3.72-3.53 (m, 6H), 3.53-3.49 (m, 1H), 3.41-3.34 (m, 1H), 2.96-2.84 (m, 2H), 2.71, 2.67 (d, 3H), 2.63 -. 2.55 (m, 1H) 31 P-NMR (CDCl 3) δ 141.4.

実施例４
5’-O-〔ビス（4-メトキシフェニル）フェニルメチル〕-3’-O-〔（2R,5R）-3-メチル-5-フェニル-1,3,2-オキサザホスホリジン-2-イル〕-2’-デオキシシチジン[(Rp)-2]の製
造
5’-O-〔ビス（4-メトキシフェニル）フェニルメチル〕-2’-デオキシシチジン（0.79 g, 1.50 mmol）をピリジン、トルエンと繰り返し共沸することによって乾燥し、THF (7.50 ml) 溶液とした。Example 4
5'-O- [Bis (4-methoxyphenyl) phenylmethyl] -3'-O-[(2R, 5R) -3-methyl-5-phenyl-1,3,2-oxazaphospholidine-2- Il] -2'-deoxycytidine [(Rp) -2]
5'-O- [Bis (4-methoxyphenyl) phenylmethyl] -2'-deoxycytidine (0.79 g, 1.50 mmol) was dried by repeated azeotropy with pyridine and toluene, and THF (7.50 ml) solution was added. did.

これにトリエチルアミン（1.47 ml, 10.5mmol）を加え、−78℃に冷却した後、アルゴン雰囲気下、上記の15の0.22 M THF溶液（10.0 ml, 2.25 mmol）を滴下した。反応混合物を−78℃に保ったまま１時間撹拌した後、飽和重曹水（75 ml）及びクロロホルム（75 ml）を加えた。  Triethylamine (1.47 ml, 10.5 mmol) was added thereto, and after cooling to −78 ° C., the above-mentioned 15 0.22 M THF solution (10.0 ml, 2.25 mmol) was added dropwise under an argon atmosphere. The reaction mixture was stirred for 1 hour while maintaining at -78 ° C, and then saturated aqueous sodium hydrogen carbonate (75 ml) and chloroform (75 ml) were added.

有機相を分離後、飽和重曹水で洗浄（75 ml×2）し、集めた洗液をクロロホルム（75ml×2）で抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー〔2.5×16cm,シリカゲル50g,ジクロロメタン−ヘキサン−ピリジン−トリエチルアミン（71:14:14:2, v/v/v/v）〕で分離精製した。  The organic phase was separated, washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate (75 ml × 2), and the collected washings were extracted with chloroform (75 ml × 2). The collected organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure. The residue was separated and purified by silica gel column chromatography [2.5 × 16 cm, silica gel 50 g, dichloromethane-hexane-pyridine-triethylamine (71: 14: 14: 2, v / v / v / v)].

(Rp)-2を含むフラクションを集め、飽和重曹水水溶液 (100 ml) で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮乾燥して、下記式の(Rp)-2（452.1 mg, 42％）を得た。薄黄色非晶質。
¹H-NMR (CDCl₃) δ 7.89, 7.87 (d, 1H), 7.40 - 7.10 (m, 9H), 6.79 - 6.77 (m, 4H), 6.28 - 6.24 (t, 1H), 5.52 - 5.43 (m, 2H), 4.87 - 4.82 (m, 1H), 4.06 - 4.05 (m, 1H), 3.77 - 3.66 (m, 4H), 3.46 - 3.41 (m, 3H), 2.87 - 2.82 (m, 1H), 2.69, 2.65 (d, 3H), 2.58 - 2.34 (m, 1H), 2.32 - 2.23 (m, 1H).³¹P-NMR (CDCl₃) δ 143.5.Fractions containing (Rp) -2 were collected, washed with a saturated aqueous sodium bicarbonate solution (100 ml), dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated to dryness under reduced pressure to give (Rp) -2 (452.1 mg , 42%). Pale yellow amorphous.
¹ H-NMR (CDCl₃ ) δ 7.89, 7.87 (d, 1H), 7.40-7.10 (m, 9H), 6.79-6.77 (m, 4H), 6.28-6.24 (t, 1H), 5.52-5.43 (m , 2H), 4.87-4.82 (m, 1H), 4.06-4.05 (m, 1H), 3.77-3.66 (m, 4H), 3.46-3.41 (m, 3H), 2.87-2.82 (m, 1H), 2.69 , 2.65 (d, 3H), 2.58 - 2.34 (m, 1H), 2.32 -. 2.23 (m, 1H) 31 P-NMR (CDCl 3) δ 143.5.

実施例５
5’-O-〔ビス（4-メトキシフェニル）フェニルメチル〕-3’-O-〔（2R,5R）-3-メチル-5-フェニル-1,3,2-オキサザホスホリジン-2-イル〕-2’-デオキシグアノシン[(Rp)-3]の
製造
5’-O-〔ビス（4-メトキシフェニル）フェニルメチル〕-2’-デオキシグアノシン（0.85g,1.50mmol）をピリジン、トルエンと繰り返し共沸することによって乾燥し、THF （7.50 ml）溶液とした。Example 5
5'-O- [Bis (4-methoxyphenyl) phenylmethyl] -3'-O-[(2R, 5R) -3-methyl-5-phenyl-1,3,2-oxazaphospholidine-2- Il] -2'-deoxyguanosine [(Rp) -3]
5′-O- [Bis (4-methoxyphenyl) phenylmethyl] -2′-deoxyguanosine (0.85 g, 1.50 mmol) was dried by repeated azeotropy with pyridine and toluene, and a THF (7.50 ml) solution was added. did.

これにトリエチルアミン（1.47 ml, 10.5 mmol）を加え、−78 ℃に冷却した後、アルゴン雰囲気下、上記の15の0.22 M THF溶液（10.0 ml, 2.25 mmol）を滴下した。反応混合物を−78℃に保ったまま１時間30分撹拌した後、飽和重曹水（75 ml）及びクロロホルム
（75ml）を加えた。Triethylamine (1.47 ml, 10.5 mmol) was added thereto, and the mixture was cooled to −78 ° C., and then the above-mentioned 15 0.22 M THF solution (10.0 ml, 2.25 mmol) was added dropwise under an argon atmosphere. The reaction mixture was stirred for 1 hour and 30 minutes while maintaining at -78 ° C, and saturated aqueous sodium hydrogen carbonate (75 ml) and chloroform (75 ml) were added.

有機相を分離後、飽和重曹水で洗浄（75 ml×2）し、集めた洗液をクロロホルム（75ml×2）で抽出した。集めた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー〔2.5×16cm,シリカゲル50g,ジクロロメタン−ピリジン−トリエチルアミン（83:17:2, v/v/v）〕で分離精製した。  The organic phase was separated, washed with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate (75 ml × 2), and the collected washings were extracted with chloroform (75 ml × 2). The collected organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure. The residue was separated and purified by silica gel column chromatography [2.5 × 16 cm, silica gel 50 g, dichloromethane-pyridine-triethylamine (83: 17: 2, v / v / v)].

(Rp)-3を含むフラクションを集め、飽和重曹水水溶液（100ml）で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮乾燥して、下記式の(Rp)-3（332.7mg,30％）を得た。薄黄色非晶質。
¹H-NMR (CDCl₃) δ 11.0 - 10.4 (br, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.34 - 7.19 (m, 9H), 6.81 - 6.78 (m, 4H), 6.48 (br, 1H), 6.15 - 6.11 (m, 1H), 5.59 - 5.54 (m, 1H), 4.85 - 4.80 (m, 1H), 3.95 - 3.93(m, 1H), 3.71 - 3.68 (m, 4H), 3.48 - 3.35 (m, 1H), 2.85
- 2.71 (m, 1H), 2.58 - 2.48 (m, 3H), 2.38 - 2.27 (m, 1H).³¹P-NMR (CDCl₃) δ 137.5.Fractions containing (Rp) -3 were collected, washed with a saturated aqueous sodium bicarbonate solution (100 ml), dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated to dryness under reduced pressure to give (Rp) -3 (332.7 mg, 30%). Pale yellow amorphous.
¹ H-NMR (CDCl₃ ) δ 11.0-10.4 (br, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.34-7.19 (m, 9H), 6.81-6.78 (m, 4H), 6.48 (br, 1H), 6.15-6.11 (m, 1H), 5.59-5.54 (m, 1H), 4.85-4.80 (m, 1H), 3.95-3.93 (m, 1H), 3.71-3.68 (m, 4H), 3.48-3.35 (m , 1H), 2.85
- 2.71 (m, 1H), 2.58 - 2.48 (m, 3H), 2.38 -. 2.27 (m, 1H) 31 P-NMR (CDCl 3) δ 137.5.

Claims (3)

Translated fromJapanese

一般式（３）で表される活性化剤を用いて一般式（２）で表されるヌクレオシドと縮合した後、求電子試薬との反応及び脱保護を行うことにより一般式（４）又は（５）で表される立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体を製造する方法に用いるための一般式（１）で表される光学活性なヌクレオシド３'−ホスホロアミダイト。

［一般式（１）中の記号の意味は下記のとおり。
Ｒ¹は炭素数１〜３の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、又は炭素数６〜１４のアリール基を示す。
Ｒ²は水素原子、炭素数１〜３の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、又は炭素数６〜１４のアリール基を示す。
Ｒ³は炭素数１〜３の直鎖又は分岐アルキル基を示す。
Ｒ⁴は水酸基の保護基を示す。
Ｂｓは式：

で表されるチミン、アデニン、シトシン、若しくはグアニン、又はアミノ基が保護されたアデニン、シトシン、若しくはグアニンを示す。］

［一般式（２）中、Ｒ⁵は水酸基の保護基、Ｂｓは一般式（１）と同じ意味を示す。
一般式（３）中の記号の意味は下記のとおり。
Ｘ^-はＢＦ₄^-、ＰＦ₆^-、ＴｆＯ^-（ＴｆはＣＦ₃ＳＯ₂を表す。以下同じ。）、Ｔｆ₂Ｎ^-、ＡｓＦ₆^-又はＳｂＦ₆^-を示す。
Ｒ⁶及びＲ⁷は同一又は異なっていてもよい、炭素数１〜５の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基を示す。
Ｒ⁶及びＲ⁷は窒素原子と共に炭素数３〜７のモノシクロ構造を形成しても良い。］

［一般式（４）及び一般式（５）中の記号の意味は下記のとおり。
ＹはＢＨ₃^- Ｚ⁺を示す（Ｚ⁺はアンモニウムイオン、第１級〜第４級の低級アルキルアンモニウムイオン又は1価金属イオンを示す）。
Ｂｓは一般式（１）と同じ意味を示し、各式中の２個のＢｓは同一でも異なっていても良い。］After condensing with the nucleoside represented by the general formula (2) using the activator represented by the general formula (3), the reaction with the electrophile and the deprotection are carried out to perform the general formula (4) or ( An optically active nucleoside 3′-phosphoramidite represented by the general formula (1) for use in the method for producing a highly stereoregular phosphorus atom-modified nucleotide analog represented by 5).

[Meanings of symbols in general formula (1) are as follows.
R¹ represents a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or an aryl group having 6 to 14 carbon atoms.
R² represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or an aryl group having 6 to 14 carbon atoms.
R³ represents a linear or branched alkyl group having 1 to³ carbon atoms.
R⁴ represents a hydroxyl-protecting group.
Bs is the formula:

Or adenine, cytosine, or guanine in which the amino group is protected. ]

[In General Formula (2), R⁵ represents a hydroxyl-protecting group, and Bs has the same meaning as in General Formula (1).
The meanings of symbols in the general formula (3) are as follows.
X⁻ represents BF₄⁻ , PF₆⁻ , TfO⁻ (Tf represents CF₃ SO₂ , the same shall apply hereinafter), Tf₂ N⁻ , AsF₆⁻ or SbF₆⁻ .
R⁶ and R⁷ represent a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, which may be the same or different.
R⁶ and R⁷ may form a monocyclo structure having 3 to 7 carbon atoms together with the nitrogen atom. ]

[The meanings of the symbols in general formula (4) and general formula (5) are as follows.
Y represents BH₃⁻ Z⁺ (Z⁺ represents an ammonium ion, a primary to quaternary lower alkyl ammonium ion or a monovalent metal ion).
Bs has the same meaning as in general formula (1), and two Bs in each formula may be the same or different. ]一般式（１）で表される光学活性なヌクレオシド３'−ホスホロアミダイトが、一般式（６）で表される光学活性な１，２−アミノアルコールと三塩化リンを反応させて得られる一般式（７）で表される光学活性なホスフィチル化剤と、一般式（８）で表されるヌクレオシドを反応させて得られるものである請求項１記載のヌクレオシド３'−ホスホロアミダイト。

［式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴及びＢｓは、一般式（１）と同じ意味を示す。］An optically active nucleoside 3′-phosphoramidite represented by the general formula (1) is obtained by reacting an optically active 1,2-aminoalcohol represented by the general formula (6) with phosphorus trichloride. The nucleoside 3'-phosphoramidite according to claim 1, which is obtained by reacting an optically active phosphitylating agent represented by the formula (7) with a nucleoside represented by the general formula (8).

[Wherein R¹ , R² , R³ , R⁴ and Bs have the same meaning as in general formula (1). ]請求項１記載の製造法における反応を繰り返す工程を含む一般式（９）で表される立体規則性の高いリン原子修飾ヌクレオチド類縁体の製造に用いるための請求項１記載のヌクレオシド３'−ホスホロアミダイト。

［式中、Ｙ及びＢｓは一般式（１）、（４）、（５）と同じ意味を示し、ｎは１〜１５０の整数（但し、１は含まない）を示す。］The nucleoside 3'-phospho of claim 1 for use in the production of a highly stereoregular phosphorus atom-modified nucleotide analog represented by the general formula (9), comprising the step of repeating the reaction in the production method of claim 1. Loamidite.

[Wherein Y and Bs have the same meanings as in general formulas (1), (4) and (5), and n represents an integer of 1 to 150 (however, 1 is not included). ]