JP2009036694A

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Publication number: JP2009036694A
Application number: JP2007202560A
Authority: JP
Inventors: Kenji Yasuda; 賢二安田; Kentetsu Kin; 賢徹金; Mamoru Fukushima; 守福島
Original assignee: Tokyo Medical and Dental University NUC
Current assignee: Tokyo Medical and Dental University NUC
Priority date: 2007-08-03
Filing date: 2007-08-03
Publication date: 2009-02-19

Abstract

【課題】細胞間や細胞内で局在化しているｍＲＮＡやタンパク質を、局在空間情報を失わずに定量測定を行うことのできる方法を提供すること。
【解決手段】細胞あるいは試料薄片を所定の太さの棒状の等電点電気泳動用ゲルの間に挟み電気泳動を行わせる。これにより、細胞間や細胞内で局在化しているｍＲＮＡやタンパク質を２次元投影した形の分布の状態を保って、これらのｐＫ値に応じた位置まで等電点電気泳動用ゲル内を移動させる。その後、棒状の等電点電気泳動用ゲルをｐＫ値に応じた位置で薄膜状に切り取り、その位置にある内容物を調べて、局在空間情報を失わずに定量測定を行う。
【選択図】図１An object of the present invention is to provide a method capable of quantitatively measuring mRNA and protein localized between cells and within cells without losing localized spatial information.
Electrophoresis is performed by sandwiching a cell or sample flake between rod-shaped isoelectric focusing gels having a predetermined thickness. This maintains the state of distribution in the form of two-dimensional projection of mRNA and protein localized between cells and within cells, and moves within the gel for isoelectric focusing to a position corresponding to these pK values. Let Thereafter, the rod-shaped isoelectric focusing gel is cut into a thin film at a position corresponding to the pK value, the contents at that position are examined, and quantitative measurement is performed without losing the localized spatial information.
[Selection] Figure 1

Description

Translated fromJapanese

本発明は細胞内生体物質を細胞内の空間分布（二次元配置）を保った状態で解析する方法に関するものである。 The present invention relates to a method for analyzing intracellular biological material in a state in which the intracellular spatial distribution (two-dimensional arrangement) is maintained.

ゲノム計画の進展とともにＤＮＡレベルで生体を理解し、病気の診断や生命現象の理解をしようとする動きが活発化してきた。生命現象の理解や遺伝子の働きを調べるには遺伝子の発現状況を調べることが有効である。この有力な方法として、固体表面上に数多くのＤＮＡプローブを種類毎に区分けして固定したＤＮＡプローブアレー、あるいはＤＮＡプローブチップ（実際には固定されているのはオリゴヌクレオチドの誘導体であるのでオリゴチップと呼ぶこともある）が用いられている。ＤＮＡプローブのかわりに抗体や抗原を基板上にアレイ状に固定したプロテインチップの概念も実用化されている。たとえば、基板上にアレルギーを起こす数十から数百の抗原（アレルゲン）を固定したデバイスに検体血清を反応させ、各抗原と抗原抗体反応を起こす血清中に存在するＩｇＭを特異的に捕捉し、ＩｇＭに結合する酵素標識２次抗体を反応させ、酵素活性を化学発光と組み合わせることで測定して、アレルゲンを検出するアレルゲン検査用のシステムが医療検査用に実用化されている。 Along with the progress of the genome project, the movement to understand living organisms at the DNA level, to diagnose diseases and to understand life phenomena has become active. It is effective to investigate the expression status of genes in order to understand life phenomena and investigate the functions of genes. As an effective method, a DNA probe array in which a large number of DNA probes are classified and fixed on a solid surface or a DNA probe chip (in practice, an oligonucleotide derivative is used because an oligonucleotide derivative is actually immobilized). Is sometimes used). A protein chip concept in which antibodies and antigens are immobilized on a substrate in an array instead of a DNA probe has been put into practical use. For example, the sample serum is reacted with a device in which tens to hundreds of antigens (allergens) causing allergy on the substrate are immobilized, and IgM present in the serum causing antigen-antibody reaction with each antigen is specifically captured. An allergen test system that detects an allergen by reacting an enzyme-labeled secondary antibody that binds to IgM and measuring enzyme activity in combination with chemiluminescence has been put to practical use for medical tests.

ＤＮＡチップを作るには光化学反応と半導体工業でよく用いられるリソグラフィーを用いて区画された多数のセルに、設計された配列のオリゴマーを一塩基ずつ合成して行く方法（非特許文献１：Science 251, 767-773(1991)）、あるいはＤＮＡプローブやタンパク質プローブを各区画に一つ一つ植え込んでいく方法（非特許文献２：Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918 (1996)）などがある。 In order to make a DNA chip, a method of synthesizing oligomers of designed sequences one by one in a large number of cells partitioned using photochemical reaction and lithography often used in the semiconductor industry (Non-patent Document 1: Science 251). , 767-773 (1991)) or a method of implanting DNA probes or protein probes one by one in each compartment (Non-patent Document 2: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918 (1996) )and so on.

これらチップは、いずれもスライドガラスなどの平面上に区画を区切り、多数のプローブを、アレイ状に整列させた構造をしている。どのプローブがどの位置にあるかは、プローブが固定されている物理的な位置のみでインデクシングされるのが一般的である。 Each of these chips has a structure in which a plurality of probes are aligned in an array by dividing a section on a flat surface such as a slide glass. In general, which probe is located at which position is indexed only at a physical position where the probe is fixed.

検出には、ＤＮＡチップの類では標識物に蛍光色素を用いるケースが圧倒的に多い。プロテインチップでは上記したとおり、酵素標識物を用いて化学発光ないし生物発光の系で検出するケースが多いが、蛍光標識検出や、電気化学発光検出を行うケースと多様な方法が実用化されている。 For detection, in the case of DNA chips, there are overwhelmingly many cases of using a fluorescent dye as a label. As mentioned above, protein chips are often detected by chemiluminescence or bioluminescence systems using enzyme-labeled substances, but a variety of methods have been put into practical use, such as fluorescent label detection and electrochemiluminescence detection. .

電気化学発光法では、電極表面に抗原捕捉用の抗体が存在する。サンドイッチ用抗体の標識物にはルテニウム錯体を用いる（非特許文献３：Clin. Chem., 37, 1534-1539 (1991)）。電極表面ではルテニウムが酸化され、ＴＰＡのレドックス反応とカップルさせて還元するときに励起状態となったルテニウムの電子が基底状態に落ちる時に光を発する。 In the electrochemiluminescence method, an antigen capturing antibody is present on the electrode surface. A ruthenium complex is used as the label for the sandwich antibody (Non-patent Document 3: Clin. Chem., 37, 1534-1539 (1991)). Ruthenium is oxidized on the electrode surface, and emits light when the ruthenium electrons, which are excited when they are reduced by being coupled with the redox reaction of TPA, fall to the ground state.

これらに加えて、本願の発明者らにより、細胞を２次元投影した形で基板あるいは電極上に、細胞の内容物を捕捉する。このために、電気泳動的な力を利用する、あるいは、細胞の水分を瞬時に蒸発させて固定する。２次元平面に固定されたｍＲＮＡを、これにハイブリダイズする標識物付きの標識プローブで同定する方法により、細胞間や細胞内で局在化しているｍＲＮＡやタンパク質を、局在空間情報を失わずに定量測定を行うことが提案された（特許文献１）。
Science 251, 767-773(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918(1996)Clin. Chem., 37, 1534-1539 (1991)特開２００７−１４２９７In addition to these, the inventors of the present application capture the contents of the cells on the substrate or electrode in the form of a two-dimensional projection of the cells. For this purpose, electrophoretic force is used, or the moisture of the cells is instantly evaporated and fixed. By identifying mRNA immobilized on a two-dimensional plane using a labeled probe with a label that hybridizes to it, mRNA and proteins localized between cells and within cells are not lost. It has been proposed to perform quantitative measurement (Patent Document 1).
Science 251, 767-773 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4613-4918 (1996) Clin. Chem., 37, 1534-1539 (1991) JP2007-14297

上記非特許文献１〜３で開示される従来技術では、ＤＮＡプローブチップあるいはプロテインチップを用いる遺伝子転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるタンパク質の識別や検出法に関してはよく検討されており、何らかの方法で溶液状の試料が準備できていれば測定ができる。上記従来技術で説明した検体血清からのアレルゲン検査では、血清試料を用いる。ｍＲＮＡ検査では予め十分多量な細胞検体からＲＮＡ成分を抽出し、リバーストランスクリプターゼによる逆転写反応でｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅やｃＲＮＡ合成により増幅を行う。また相補鎖合成時に標識ｄＮＴＰを取り込ませて多量の標識ＤＮＡ鎖を得る。最近ではアミノアリルｄＮＴＰを取り込ませて、その後にアミノ基に蛍光色素を反応させて蛍光標識ＤＮＡ鎖を得る方法が主流となっている。このようにして得られた蛍光標識ＤＮＡ鎖を、いわゆる、ＤＮＡチップとハイブリダイズさせて各種発現遺伝子の解析を行う。このように、予め溶液試料が得られる場合のみ解析が可能となる。 In the prior art disclosed in the above non-patent documents 1 to 3, a method for identifying and detecting mRNA that is a gene transcription product using a DNA probe chip or a protein chip and a protein that is a translation product is well studied. Measurement is possible if a solution-like sample is prepared. In the allergen test from the sample serum described in the above prior art, a serum sample is used. In mRNA testing, RNA components are extracted from a sufficiently large amount of cell specimens in advance, cDNA is synthesized by reverse transcription reaction using reverse transcriptase, and amplification is performed by PCR amplification or cRNA synthesis. In addition, a labeled dNTP is incorporated during complementary strand synthesis to obtain a large amount of labeled DNA strand. Recently, a method in which aminoallyl dNTP is incorporated and then a fluorescent dye is reacted with an amino group to obtain a fluorescently labeled DNA strand has become the mainstream. The fluorescently labeled DNA strand thus obtained is hybridized with a so-called DNA chip to analyze various expressed genes. Thus, analysis can be performed only when a solution sample is obtained in advance.

検体の内、かなりの部分を占める細胞を扱う場合、測定対象となる細胞構成物質を溶液状態にする操作そのものが問題となるケースがある。多細胞生物においては、細胞は隣接する細胞群との相互インタラクションにより全体の調和を成立させているので、細胞群をすりつぶして均一な状態としてしまうと各細胞の持つ局在的な情報が失われる。さらに、個々の細胞内においても発現遺伝子であるｍＲＮＡは局在化しているし、最終産物であるタンパク質も細胞内でその機能に従い局在している。これら局在ｍＲＮＡやタンパク質は、細胞の活動状態すなわち隣接する細胞群とのコミュニケーションにより変化するし、おかれている環境に対しても変動する。すなわち、生体機能をより正確に記述し、医療向けの検査や創薬に役立つ情報を得ようとすると、細胞間や細胞内で局在化しているｍＲＮＡやタンパク質を、局在空間情報を保持した状態で定量検出する必要がある。 When handling cells that occupy a significant portion of the specimen, there are cases where the operation itself of bringing the cell constituent material to be measured into solution is problematic. In multicellular organisms, cells establish overall harmony by mutual interaction with adjacent cell groups, so if the cell groups are ground to a uniform state, the localized information of each cell is lost. . Furthermore, mRNA that is an expressed gene is localized in individual cells, and proteins that are end products are also localized in the cells according to their functions. These localized mRNAs and proteins change depending on the cell activity state, that is, communication with adjacent cell groups, and also vary depending on the environment in which they are placed. That is, when describing biological functions more accurately and obtaining information useful for medical examinations and drug discovery, mRNAs and proteins localized between cells and within cells were retained. It is necessary to detect the quantity quantitatively.

特開２００７−１４２９７に開示されたように、細胞を２次元投影した形で基板あるいは電極上に、細胞の内容物を捕捉することによりこの課題は達成できる。具体的には、電気泳動的な力を利用する。すなわち、極薄い間隔からなる２枚の電極で細胞を挟み、電界をかけることで細胞を破壊すると同時に細胞の内容物を電極表面に引き寄せる。あるいは、細胞の破壊にＵＶ光を用いることも効果的である。３５０ｎｍ程度のＵＶ光は溶媒である水では吸収されず、細胞で吸収される。このため、溶媒を沸騰させること無く細胞を可溶化することができる。このときも生体物質の内容物を２次元投影した形で捕捉するには電気泳動力を用いる。 As disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-14297, this problem can be achieved by capturing the contents of cells on a substrate or an electrode in a two-dimensional projection form. Specifically, an electrophoretic force is used. That is, a cell is sandwiched between two electrodes having a very thin interval, and an electric field is applied to destroy the cell and at the same time draw the cell contents to the electrode surface. Alternatively, it is also effective to use UV light for cell destruction. UV light of about 350 nm is not absorbed by water as a solvent but absorbed by cells. For this reason, cells can be solubilized without boiling the solvent. At this time, the electrophoretic force is used to capture the contents of the biological material in a two-dimensionally projected form.

いずれの場合でも、生体物質の内容物を捕捉する基板、あるいは、電極表面にはｍＲＮＡの捕捉用にポリＴのようなｍＲＮＡに結合する物質（プローブ）を固定しておき、電気泳動力で移動する生体物質の内容物をプローブに結合させることが必要である。そのため、測定対象に応じた適当なプローブを固定した基板、あるいは、電極を準備する必要がある。生体物質の内容物によっては、狭い領域に内容物が偏在して十分な精度での測定ができないことが起こりうる。 In either case, a substance (probe) that binds to mRNA, such as poly-T, is immobilized on the surface of the substrate or electrode surface that captures the contents of biological material, and moves by electrophoresis force. It is necessary to bind the contents of the biological material to the probe. Therefore, it is necessary to prepare a substrate or an electrode on which an appropriate probe according to the measurement target is fixed. Depending on the contents of the biological material, it may happen that the contents are unevenly distributed in a narrow region and measurement with sufficient accuracy cannot be performed.

本発明の目的は、上記問題点を克服し、適当なプローブを固定した基板、あるいは、電極の準備を不要とし、細胞間や細胞内で生体物質が局在化している場合にも、局在空間情報を失わずに定量測定を高精度で行うことのできる空間分布を保った細胞内生体物質の解析方法を提供することにある。 The object of the present invention is to overcome the above-mentioned problems, eliminate the need for the preparation of a substrate on which an appropriate probe is fixed, or an electrode, and even when biological substances are localized between cells or within cells. An object of the present invention is to provide a method for analyzing intracellular biological material that maintains a spatial distribution that enables high-precision quantitative measurement without losing spatial information.

したがって、本発明は、下記の空間分布を保った細胞内生体物質の解析方法、および解析のための電気泳動装置を提供する。
（１）試料細胞あるいは試料薄片から所定の形態の試料を準備する工程、
該所定の形態の試料の位相差顕微鏡像を得る工程、
所定の太さと長さの円筒内に保持された棒状の等電点電気泳動用ゲルを準備する工程、
該等電点電気泳動用ゲルを上記円筒ごと長さ方向の所定の位置で二つに分割する工程、
上記二つに分割された等電点電気泳動用ゲルの分割面に上記所定の形態の試料を挟んで上記二つに分割された等電点電気泳動用ゲルを長さ方向に一体化して試料計測用等電点電気泳動用ゲルを形成する工程、
上記試料細胞あるいは試料薄片を分割面に挟んだ二つに分割された等電点電気泳動用ゲルと実質同一の素材で実質同一の長さの円筒内に保持された棒状のｐＨ計測用等電点電気泳動用ゲルを準備する工程、
上記試料計測用等電点電気泳動用ゲルおよび上記ｐＨ計測用等電点電気泳動用ゲルを負極用の電解液を保持している電気泳動用負電極板および正極用の電解液を保持している電気泳動用正電極板の間に、各上記ゲルが各上記円筒の両端でそれぞれの上記電解液に接するように配置する工程、
上記電気泳動用負電極板および電気泳動用正電極板の間に所定の電気泳動用電圧を印加する工程、
上記電圧印加後、上記ｐＨ計測用等電点電気泳動用ゲルからゲルの長さ方向の位置とｐＨ値との関係を同定する工程、
上記試料細胞あるいは試料薄片の細胞内に存在する生体物質と結合するプローブをナノ粒子で標識する工程、
上記同定されたｐＨ値を基準として上記試料計測用等電点電気泳動用ゲルを所定の位置で切り出してその位置のゲル切断面にある生体物質に上記ナノ粒子で標識されたプローブを結合させて、上記プローブの標識ナノ粒子を走査型電子顕微鏡像として観察する工程、
上記試料の位相差顕微鏡像と上記標識ナノ粒子の走査型電子顕微鏡像とを照合する工程、
よりなることを特徴とする空間分布を保った細胞内生体物質の解析方法。
（２）上記ｐＨ計測用等電点電気泳動用ゲルが上記試料計測用等電点電気泳動用ゲルと同じ二分割構成である上記（１）記載の空間分布を保った細胞内生体物質の解析方法。
（３）上記正極用の電解液は上記計測用等電点電気泳動用ゲルの長さ方向で該ゲルの半分の長さを覆う深さを有するものである上記（１）記載の空間分布を保った細胞内生体物質の解析方法。
（４）試料細胞あるいは試料薄片は金属線によるメッシュにより支持された細胞接着性の基質の上に載置されるとともに、上記試料測定用等電点電気泳動用ゲルと実質同一の素材で実質同一の太さのゲルを内部に保持する円筒の薄片上に載置されて上記所定の形態の試料とされた上記（１）記載の空間分布を保った細胞内生体物質の解析方法。
（５）試料細胞あるいは試料薄片から所定の形態の試料を準備する工程、
該所定の形態の試料の位相差顕微鏡像を得る工程、
所定の太さと長さの円筒内に保持された棒状の試料計測用等電点電気泳動用ゲルを準備する工程、
上記試料計測用等電点電気泳動用ゲルと実質同一の素材で実質同一の長さの円筒内に保持された棒状のｐＨ計測用等電点電気泳動用ゲルを準備する工程、
上記試料計測用等電点電気泳動用ゲルおよび上記ｐＨ計測用等電点電気泳動用ゲルを負極用の電解液を保持している電気泳動用負電極板および正極用の電解液を保持している電気泳動用正電極板の間に、各上記ゲルが各上記円筒の両端でそれぞれの上記電解液に接するように配置する工程、
上記試料を、上記電気泳動用正電極板と上記試料計測用等電点電気泳動用ゲルとの間に配置する工程、
上記電気泳動用負電極板および電気泳動用正電極板の間に所定の電気泳動用電圧を印加する工程、
上記電圧印加後、上記ｐＨ計測用等電点電気泳動用ゲルからゲルの長さ方向の位置とｐＨ値との関係を同定する工程、
上記試料細胞あるいは試料薄片の細胞内に存在する生体物質と結合するプローブをナノ粒子で標識する工程、
上記同定されたｐＨ値を基準として上記試料計測用等電点電気泳動用ゲルを所定の位置で切り出してその位置のゲル切断面にある生体物質に上記ナノ粒子で標識されたプローブを結合させて、上記プローブの標識ナノ粒子を走査型電子顕微鏡像として観察する工程、
上記試料の位相差顕微鏡像と上記標識ナノ粒子の走査型電子顕微鏡像とを照合する工程、
よりなることを特徴とする空間分布を保った細胞内生体物質の解析方法。
（６）所定の太さと長さの円筒内に保持された棒状の試料測定用等電点電気泳動ゲル、
上記試料測定用等電点電気泳動ゲルと実質同一の素材からなり、上記円筒と実質同一の長さの円筒内に保持された棒状のｐＨ計測用等電点電気泳動ゲル、
負電極板と該負電極板上に形成された壁とによって規定された、負極用の電解液を保持するための負極電解液容器、および
正電極板と該正電極板上に形成された壁とによって規定された、正極用の電解液を保持するための正極電解液容器とを備え、
上記試料測定用等電点電気泳動ゲルおよび上記ｐＨ測定用等電点電気泳動ゲルが、負極電解液容器と正極電解液容器との間に、各上記ゲルが各上記円筒の両端でそれぞれの上記電解液に接するように配置され、
上記試料測定用の等電点電気泳動ゲルが、長さ方向の所定の位置で２つの棒状ゲルに上記円筒ごと分割可能であり、
試料細胞あるいは試料薄片からの所定の形態の試料が、上記二つに分割された上記試料測定用等電点電気泳動ゲルの分割面に挟持される、空間分布を保った細胞内生体物質の解析のための電気泳動装置。
（７）上記ｐＨ計測用等電点電気泳動用ゲルが、上記試料計測用等電点電気泳動用ゲルと同じ二分割構成である上記（６）記載の電気泳動装置。
（８）上記正極電解液容器内の電解液は上記計測用等電点電気泳動用ゲルの長さ方向で該ゲルの半分の長さを覆う深さを有するものである上記（６）記載の電気泳動装置。
（９）試料細胞あるいは試料薄片は金属線によるメッシュにより支持された細胞接着性の基質の上に載置されるとともに、等電点電気泳動用ゲルと実質同一の素材で実質同一の太さのゲルを内部に保持する円筒の薄片上に載置されて上記所定の形態の試料とされた上記（６）記載の電気泳動装置。
（１０）所定の太さと長さの円筒内に保持された棒状の試料測定用等電点電気泳動ゲル、
上記試料測定用等電点電気泳動ゲルと実質同一の素材からなり、上記円筒と同じ長さの円筒内に保持された棒状のｐＨ計測用等電点電気泳動ゲル、
負電極板と該負電極板上に形成された壁とによって規定された、負極用の電解液を保持するための負極電解液容器、および
正電極板と該正電極板上に形成された壁とによって規定された、正極用の電解液を保持するための正極電解液容器とを備え、
上記試料測定用等電点電気泳動ゲルおよび上記ｐＨ測定用等電点電気泳動ゲルが、負極電解液容器と正極電解液容器との間に、各上記ゲルが各上記円筒の両端でそれぞれの上記電解液に接するように配置され、
試料細胞あるいは試料薄片からの所定の形態の試料が上記正電極板と上記試料計測用等電点電気泳動用ゲルとの間に配置されている、空間分布を保った細胞内生体物質の解析のための電気泳動装置。Therefore, the present invention provides a method for analyzing intracellular biological material that maintains the following spatial distribution, and an electrophoresis apparatus for analysis.
(1) preparing a sample of a predetermined form from a sample cell or sample slice,
Obtaining a phase contrast microscopic image of the sample of the predetermined form,
Preparing a rod-shaped isoelectric focusing gel held in a cylinder having a predetermined thickness and length;
Dividing the isoelectric focusing gel into two at a predetermined position in the length direction together with the cylinder,
A sample in which the two isoelectric focusing gels are integrated in the length direction by sandwiching the sample of the predetermined form on the split surface of the two isoelectric focusing gels. Forming a measurement isoelectric focusing gel;
A rod-shaped isoelectric for pH measurement that is held in a cylinder of substantially the same length with the same material as the gel for isoelectric focusing divided into two with the sample cell or sample slice sandwiched between the dividing surfaces. Preparing a gel for point electrophoresis,
The gel for isoelectric focusing for sample measurement and the gel for isoelectric focusing for pH measurement are held in a negative electrode plate for electrophoresis holding an electrolyte for negative electrode and an electrolyte for positive electrode. Between the positive electrode plates for electrophoresis, each gel is arranged so as to be in contact with each electrolyte at both ends of each cylinder,
Applying a predetermined voltage for electrophoresis between the negative electrode plate for electrophoresis and the positive electrode plate for electrophoresis,
Identifying the relationship between the position in the length direction of the gel and the pH value from the gel for pH measurement isoelectric focusing after the voltage application,
A step of labeling with a nanoparticle a probe that binds to a biological substance present in the cell of the sample cell or sample slice,
The isoelectric focusing gel for sample measurement is cut out at a predetermined position on the basis of the identified pH value, and the probe labeled with the nanoparticles is bound to the biological material on the gel cutting surface at the position. , A step of observing the labeled nanoparticles of the probe as a scanning electron microscope image,
Collating the phase contrast microscopic image of the sample with the scanning electron microscopic image of the labeled nanoparticle,
A method for analyzing intracellular biological material having a spatial distribution characterized by comprising:
(2) Analysis of intracellular biological material having the spatial distribution as described in (1) above, wherein the gel for isoelectric focusing for pH measurement has the same two-part configuration as the gel for isoelectric focusing for sample measurement Method.
(3) The electrolyte solution for the positive electrode has a spatial distribution according to the above (1), which has a depth covering the half length of the gel for measurement isoelectric focusing gel. Analysis method of intracellular biological material kept.
(4) Sample cells or sample flakes are placed on a cell-adhesive substrate supported by a metal wire mesh, and are substantially the same material as the above-mentioned isoelectric focusing gel for sample measurement. A method for analyzing an intracellular biological material having a spatial distribution as described in (1) above, wherein the sample is placed on a cylindrical thin piece holding a gel of a thickness of 5 mm and used as the sample of the predetermined form.
(5) a step of preparing a sample of a predetermined form from a sample cell or a sample flake,
Obtaining a phase contrast microscopic image of the sample of the predetermined form,
A step of preparing a rod-shaped isoelectric focusing gel for sample measurement held in a cylinder having a predetermined thickness and length;
Preparing a rod-shaped isoelectric focusing gel for pH measurement held in a cylinder of substantially the same length with the same material as the isoelectric focusing gel for sample measurement,
The gel for isoelectric focusing for sample measurement and the gel for isoelectric focusing for pH measurement are held in a negative electrode plate for electrophoresis holding an electrolyte for negative electrode and an electrolyte for positive electrode. Between the positive electrode plates for electrophoresis, each gel is arranged so as to be in contact with each electrolyte at both ends of each cylinder,
Arranging the sample between the positive electrode plate for electrophoresis and the gel for isoelectric focusing for sample measurement,
Applying a predetermined voltage for electrophoresis between the negative electrode plate for electrophoresis and the positive electrode plate for electrophoresis,
Identifying the relationship between the position in the length direction of the gel and the pH value from the gel for pH measurement isoelectric focusing after the voltage application,
A step of labeling with a nanoparticle a probe that binds to a biological substance present in the cell of the sample cell or sample slice,
The isoelectric focusing gel for sample measurement is cut out at a predetermined position on the basis of the identified pH value, and the probe labeled with the nanoparticles is bound to the biological material on the gel cutting surface at the position. , A step of observing the labeled nanoparticles of the probe as a scanning electron microscope image,
Collating the phase contrast microscopic image of the sample with the scanning electron microscopic image of the labeled nanoparticle,
A method for analyzing intracellular biological material having a spatial distribution characterized by comprising:
(6) An isoelectric focusing gel for measuring a rod-like sample held in a cylinder having a predetermined thickness and length,
The isoelectric focusing gel for pH measurement, which is made of a material substantially the same as the isoelectric focusing gel for sample measurement and is held in a cylinder having substantially the same length as the cylinder,
A negative electrode electrolyte container for holding an electrolyte for negative electrode, defined by a negative electrode plate and a wall formed on the negative electrode plate, and a wall formed on the positive electrode plate and the positive electrode plate And a positive electrode electrolyte container for holding a positive electrode electrolyte,
The isoelectric focusing gel for sample measurement and the isoelectric focusing gel for pH measurement are between the negative electrode electrolyte container and the positive electrode electrolyte container, and each gel is at each end of each cylinder. Placed in contact with the electrolyte,
The isoelectric focusing gel for sample measurement can be divided together with the cylinder into two rod-shaped gels at predetermined positions in the length direction,
Analysis of intracellular biological material with a spatial distribution, in which a sample of a predetermined form from a sample cell or sample slice is sandwiched between the two split surfaces of the sample measurement isoelectric focusing gel Electrophoresis device for.
(7) The electrophoresis apparatus according to (6), wherein the pH measurement isoelectric focusing gel has the same two-part configuration as the sample measurement isoelectric focusing gel.
(8) The electrolyte solution in the positive electrode electrolyte container has a depth that covers half the length of the gel for measurement isoelectric focusing gel in the length direction. Electrophoresis device.
(9) Sample cells or sample flakes are placed on a cell-adhesive substrate supported by a metal wire mesh, and are substantially the same material and the same thickness as the isoelectric focusing gel. The electrophoresis apparatus according to the above (6), wherein the electrophoresis apparatus is placed on a cylindrical thin piece holding the gel therein to form the sample of the predetermined form.
(10) An isoelectric focusing gel for measuring a rod-like sample held in a cylinder having a predetermined thickness and length,
The isoelectric focusing gel for pH measurement, which is made of substantially the same material as the isoelectric focusing gel for sample measurement and is held in a cylinder having the same length as the cylinder,
A negative electrode electrolyte container for holding an electrolyte for negative electrode, defined by a negative electrode plate and a wall formed on the negative electrode plate, and a wall formed on the positive electrode plate and the positive electrode plate And a positive electrode electrolyte container for holding a positive electrode electrolyte,
The isoelectric focusing gel for sample measurement and the isoelectric focusing gel for pH measurement are between the negative electrode electrolyte container and the positive electrode electrolyte container, and each gel is at each end of each cylinder. Placed in contact with the electrolyte,
A sample of a predetermined form from a sample cell or a sample flake is placed between the positive electrode plate and the gel for isoelectric focusing for sample measurement. Electrophoresis device for.

本発明では、細胞あるいは試料薄片を所定の太さの棒状の等電点電気泳動用ゲルの間に挟み電気泳動を行わせる。これにより、細胞間や細胞内で局在化している細胞内生体物質を２次元投影した形の分布の状態を保って、これら細胞内生体物質のｐＫ値に応じた位置まで等電点電気泳動用ゲル内を移動させる。その後、棒状の等電点電気泳動用ゲルをｐＫ値に応じた位置で薄膜状に切り取り、その位置にある内容物を調べて、局在空間情報を失わずに定量測定を行う。 In the present invention, electrophoresis is performed by sandwiching cells or sample flakes between rod-shaped isoelectric focusing gels having a predetermined thickness. Thus, isoelectric focusing is performed up to a position corresponding to the pK value of the intracellular biological material while maintaining the state of distribution in the form of a two-dimensional projection of the intracellular biological material localized between cells or within the cell. Move through the gel. Thereafter, the rod-shaped isoelectric focusing gel is cut into a thin film at a position corresponding to the pK value, the contents at that position are examined, and quantitative measurement is performed without losing the localized spatial information.

第２の方法では、細胞あるいは試料薄片を電気泳動用の電極面に置き、この上に所定の太さの棒状の等電点電気泳動用ゲルを置いて電気泳動を行わせる。この方法においても、棒状の等電点電気泳動用ゲルをｐＫ値に応じた位置で薄膜状に切り取り、その位置にある内容物を調べて、局在空間情報を失わずに定量測定を行うことができる。 In the second method, cells or sample flakes are placed on an electrode surface for electrophoresis, and a rod-shaped isoelectric focusing gel having a predetermined thickness is placed thereon to perform electrophoresis. Also in this method, a rod-shaped isoelectric focusing gel is cut into a thin film at a position corresponding to the pK value, and the contents at that position are examined to perform quantitative measurement without losing the local spatial information. Can do.

本発明により、細胞内の局在ｍＲＮＡやタンパク質等の生体物質を結合させるための基板あるいは電極を準備する必要が無いのみならず、局在ｍＲＮＡやタンパク質等の細胞内および細胞間の位置情報と量を高精度に検出できる。 According to the present invention, it is not necessary to prepare a substrate or an electrode for binding biological substances such as localized mRNA and protein in a cell, The amount can be detected with high accuracy.

（実施例１）
図１は本発明の細胞内生体物質の解析方法の実施例１の等電点電気泳動用ゲル計測システムの構成の概念を示す斜視図である。１は電気泳動用負電極板であり、その上に壁２を備え、壁２とともに負極用の電解液を保持するための容器（reservoir）を規定する。３は電気泳動用正電極板であり、その上に壁４を備え、壁４とともに正極用の電解液を保持するための容器を規定する。５_1u、５_1dおよび５_2u、５_2dは、それぞれ、上下に２分割された円筒である。それぞれの円筒内部には等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1dおよび６_2u、６_2dを保持する。上下に２分割された円筒５_1u、５_1dでは分割面に被計測試料８が挟まれて、一体化されＯリングあるいはパラフイルム７₁、７₂により強固に支持される。円筒５_2u、５_2dでは分割面にｐＫ計測用試料１０が挟まれて、一体化されＯリングあるいはパラフイルム７₁、７₂により強固に支持される。円筒５_1u、５_1dおよびその内部に保持された等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1dは試料計測用であり、円筒５_2u、５_2dおよびその内部に保持された等電点電気泳動用ゲル６_2u、６_2dはｐＫ計測用である。円筒５_1dおよび５_2dは、壁４で囲われた領域内で電気泳動用正電極板３の上面に載置される。円筒５_1uおよび５_2uは、電気泳動用負電極板１の図示しない開口を通して壁２で囲われた領域内で電気泳動用負電極板１の上面まで連なっている。９₁、９₂は切り欠きであり、試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1dを保持している円筒５_1u、５_1dの外面に形成される。この切り欠きは被計測試料８およびその内部の局在ｍＲＮＡやタンパク質等の生体物質の位置を同定するために使用される。ｐＫ計測用試料１０は任意の化学物質でよいが、電気泳動されるときに負電極板１から正電極板３までのゲル位置に応じたｐＫ値に対して万遍無く分布されるものとされるのがよい。Example 1
FIG. 1 is a perspective view showing the concept of the configuration of a gel measurement system for isoelectric focusing of Example 1 of the method for analyzing intracellular biological material of the present invention. Reference numeral 1 denotes an electrophoretic negative electrode plate, which has awall 2 thereon and defines a reservoir for holding the negative electrode electrolyte together with thewall 2.Reference numeral 3 denotes a positive electrode plate for electrophoresis. Thepositive electrode plate 3 has awall 4 thereon, and defines a container for holding the positive electrode electrolyte together with thewall 4. Each of 5_1u , 5_1d and 5_2u , 5_2d is a cylinder that is divided into two vertically.Isoelectric focusing gels 6_1u , 6_1d and 6_2u , 6_2d are held inside each cylinder. In thecylinders 5_1u and 5_1d divided into two vertically, thesample 8 to be measured is sandwiched between the divided surfaces and integrated, and is firmly supported by O-rings or parafilms 7₁ and 7₂ . In thecylinders 5_2u and 5_2d , thesample 10 for pK measurement is sandwiched between the divided surfaces and integrated, and is firmly supported by O-rings or parafilms 7₁ and 7₂ . Thecylinders 5_1u , 5_1d and the isoelectric focusinggels 6_1u , 6_1d held inside are used for sample measurement, and thecylinders 5_2u , 5_2d and the isoelectric focusing electrophoresis held inside thereof are used. Thegels 6_2u and 6_2d are for pK measurement. Thecylinders 5_1d and 5_2d are placed on the upper surface of the electrophoresispositive electrode plate 3 in the region surrounded by thewall 4. Thecylinders 5_1u and 5_2u are connected to the upper surface of the electrophoresis negative electrode plate 1 in an area surrounded by thewall 2 through an opening (not shown) of the electrophoresis negative electrode plate 1. 9_1, 9₂ are notches are formed on the outer surface of thecylinder 5_1u, 5_1d that holds the isoelectric point for the samplemeasurement electrophoresis gel 6_1u, 6_1d. This notch is used to identify the position of thesample 8 to be measured and the location of biological substances such as localized mRNA and protein therein. ThepK measurement sample 10 may be an arbitrary chemical substance, but is assumed to be uniformly distributed with respect to the pK value corresponding to the gel position from the negative electrode plate 1 to thepositive electrode plate 3 when electrophoresis is performed. It is better.

１１は電気泳動用電源であり、負電極および正電極がそれぞれ電気泳動用負電極板１および電気泳動用正電極板２に接続される。電気泳動用負電極板１の上面まで連なっている円筒５_1u、５_2uの内部に保持されている等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_2uは円筒５_1u、５_2uの上端面で壁２で囲われた領域内に保持された負極用の塩基性電極液に接している。電気泳動用正電極板３の上面に載置された円筒５_1dおよび５_2dは壁４で囲われた領域内に配置される。壁４の高さは等電点電気泳動用ゲル６_1uおよび６_1dの接合面、６_2uおよび６_2dの接合面よりも電気泳動用負電極板１の方に延伸されていて、壁４内に保持される正極用の酸性電極液が電気泳動中の等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1dおよび６_2u、６_2dを冷却する機能を果たすために利用される。Reference numeral 11 denotes a power source for electrophoresis, and the negative electrode and the positive electrode are connected to the negative electrode plate 1 for electrophoresis and thepositive electrode plate 2 for electrophoresis, respectively.Cylinder 5_1u which is continuous to the upper surface of the negative electrode plate 1 for electrophoresis, 5_2u gel for isoelectric focusing held within 6_1u, 6_2u wall at the upper end surface of the cylindrical 5_1u, 5_2u 2 is in contact with the basic electrode solution for the negative electrode held in the region surrounded by 2. Thecylinders 5_1d and 5_2d placed on the upper surface of the electrophoresispositive electrode plate 3 are arranged in a region surrounded by thewall 4. The height of thewall 4 is extended toward the electrophoretic negative electrode plate 1 from the joint surfaces of the isoelectric focusinggels 6_1u and 6_{1d and} the joint surfaces of 6_2u and 6_2d . The acidic electrode solution for the positive electrode held in is used for cooling the isoelectric focusinggels 6_1u , 6_1d and 6_2u , 6_2d during electrophoresis.

図２（Ａ）〜（Ｃ）は円筒５およびその中に保持された試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1dを２分割形として形成する工程の一例を示す図である。まず、図２（Ａ）に示すように、例えば、５〜１０ｍｍφの合成樹脂の円筒５を準備する。円筒５の肉厚は１ｍｍ程度とする。円筒５の内部に、定法に従って、等電点電気泳動用ゲル６を充填する。次いで、図２（Ｂ）に示すように、等電点電気泳動用ゲル６が充填された円筒５を、中央部分で分割して、円筒５_1u、等電点電気泳動用ゲル６_1uおよび円筒５_1d、等電点電気泳動用ゲル６_1dとする。次いで、図２（Ｃ）に示すように、試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1dの上面に被計測試料８を載置して、試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1uが充填された円筒５_1uを、円筒５_1dの上に載置する。その後、円筒５_1uと円筒５_1dの接合面の周囲を粘着テープ７₁でしっかりと固める。ここでは、図示しないが、被計測試料８を、図３（Ｄ）に示すような試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1dと円筒５_1dの薄片２０の上に載置しているときは、円筒５_1uと円筒５_1dの接合面の間に薄片２０を入れて周囲を粘着テープ７₁でしっかりと固めることは当然である。FIGS. 2A to 2C are views showing an example of a process of forming thecylinder 5 and the sample measurementisoelectric focusing gels 6_1u and 6_1d held in thecylinder 5 into two-divided shapes. First, as shown in FIG. 2A, for example, asynthetic resin cylinder 5 of 5 to 10 mmφ is prepared. The thickness of thecylinder 5 is about 1 mm. An isoelectric focusinggel 6 is filled in thecylinder 5 according to a conventional method. Next, as shown in FIG. 2 (B), thecylinder 5 filled with the isoelectric focusinggel 6 is divided at the central portion to obtain the cylindrical 5_1u , the isoelectric focusing gel_{61 u} and the cylinder. 5_1d , isoelectric focusing gel_{61 1d} . Then, as shown in FIG. 2 (C), is placed to be measured thesample 8 on the upper surface of thegel 6_1d for isoelectric electrophoresis sample measurement,gel 6_1u is for isoelectric focusing sample measurement the filledcylinder 5_1u, placed on thecylinder 5_1d. Then, harden firmly around the joint surface of thecylinder 5_1u and the cylindrical 5_1d with adhesive tape_71. Here, when the not shown, to be measuredsample 8, which is placed on the FIG. 3 (D) in the sample measurementisoelectric electrophoresis gel 6_1d shown acylinder 5_1dflakes 20 is naturally to consolidate firmly around putlamina 20 between the joint surface of thecylinder 5_1u and the cylindrical 5_1d with adhesive tape_71.

ｐＫ計測用等電点電気泳動用ゲル６_2u、６_2dは分割面に被計測試料８に代えてｐＫ計測用試料１０が挟まれる点を除けば試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1dと同じであるから、図示は省略した。The isoelectric focusinggels 6_2u and 6_2d for pK measurement are isoelectric focusinggels 6_1u for sample measurement except for the point where thesample 10 for pK measurement is sandwiched between the divided surfaces instead of thesample 8 to be measured. , 6_1d , the illustration is omitted.

図３（Ａ）〜（Ｆ）は実施例１により等電点電気泳動される試料の作成方法の具体例を説明する図である。図３（Ａ）はサンプルとしての細胞８を示す。ここでは５個の細胞８が準備された例である。図３（Ｂ）はサンプルとしての細胞８を載せるための細胞接着性の基質、たとえば、コラーゲンフイルム１２を示す。図３（Ｃ）はコラーゲンフイルム１２を支持するための金属線によるメッシュ１３を示す。金属としては、金または白金がよい。メッシュ１３は試料を取り扱うときの試料支持体として利用されるものであるから、円筒５の内径より小さいものであることが必要である。図３（Ｄ）は試料の位相差顕微鏡像の基準位置を示すための試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1dと円筒５_1dの薄片２０である。この薄片２０は、例えば、図２で説明した試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1dを２分割形として形成する工程の中で、二つに分割する時に切り出すものとすればよい。図３（Ｅ）は試料の作成時に補助ベースとして使用されるガラス板１４を示す。図３（Ｆ）は、図３（Ａ）〜（Ｆ）に示す材料によって等電点電気泳動される試料を作成した状態を示す図である。すなわち、まず、ガラス板１４の上に試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1dと円筒５_1dの薄片２０を載せ、次いで、金属線によるメッシュ１３を載せ、その上にコラーゲンフイルム１２を載せてから、細胞８を載せる。その後、必要に応じて、ガラス板１４に試料を載せたまま、細胞８を培養する。試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1dの上面に試料を載置するときは、ガラス板１４の上面から薄片２０ごと細胞８を剥がして試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1dと円筒５_1dの上面に試料を載置する。3A to 3F are diagrams for explaining a specific example of a method for preparing a sample to be subjected to isoelectric focusing according to the first embodiment. FIG. 3A shows acell 8 as a sample. In this example, fivecells 8 are prepared. FIG. 3B shows a cell-adhesive substrate for placingcells 8 as a sample, for example, acollagen film 12. FIG. 3C shows amesh 13 made of a metal wire for supporting thecollagen film 12. The metal is preferably gold or platinum. Since themesh 13 is used as a sample support when a sample is handled, themesh 13 needs to be smaller than the inner diameter of thecylinder 5. Figure 3 (D) is a thin 20 samples measuredisoelectric electrophoresis gel 6_1d and the cylindrical 5_1d to indicate the reference position of the phase-contrast microscope image of the sample. For example, thethin piece 20 is cut out when it is divided into two in the step of forming the isoelectric focusinggels 6_1u and 6_1d for sample measurement described in FIG. Good. FIG. 3E shows aglass plate 14 used as an auxiliary base when a sample is prepared. FIG. 3 (F) is a diagram showing a state in which a sample to be subjected to isoelectric focusing by the materials shown in FIGS. 3 (A) to 3 (F) is prepared. That is, first, place the sample measuring isoelectric focusinggels 6_1d and the cylindrical 5_1dflakes 20 on theglass plate 14, then place themesh 13 by a metal wire, placing thecollagen film 12 thereon Then, thecell 8 is loaded. Thereafter, thecells 8 are cultured with the sample placed on theglass plate 14 as necessary. When placing the sample on the upper surface of the sample for measurement isoelectric focusinggels 6_1d includes agel 6_1d for top peel off theflakes 20 eachcell 8 isoelectric sample measurement from the electrophoresis of the glass plate 14 A sample is placed on the upper surface of the cylinder_51d .

ｐＫ計測用試料１０は、薄片２０を作成する必要はなく、分割された状態の等電点電気泳動用ゲル６_2dの上面に滴下する等の簡便な方法で実装できるから図示および説明は省略する。ThepK measurement sample 10 does not need to be prepared as athin piece 20, and can be mounted by a simple method such as dropping onto the upper surface of the separated isoelectric focusing gel_62d , so that illustration and description are omitted. .

図４は作成された試料の位相差顕微鏡像の一例を模式的に示す図である。５は円筒、９₁、９₂は円筒５_1dの外面に形成されている切り欠き、８は細胞、１３は金属線によるメッシュである。コラーゲン１２およびガラス板１４は顕微鏡像としては認識できない。細胞８内には局在ｍＲＮＡやタンパク質、遺伝子等各種の生体物質がさまざまに分布しているが、これらは位相差顕微鏡像として見えるわけではなく、細胞８は外形が認識できるだけである。ここでは、しかしながら、細胞８内に局在ｍＲＮＡやタンパク質等各種の生体物質がさまざまに分布していることを示す意味で、これらの物質を模式的に丸、三角およびひし形として表示したものである。FIG. 4 is a diagram schematically showing an example of a phase contrast microscope image of the created sample. 5 is a cylinder, 9₁ and 9₂ are notches formed on the outer surface of thecylinder 5_1d , 8 is a cell, and 13 is a mesh made of a metal wire.Collagen 12 andglass plate 14 cannot be recognized as a microscopic image. Various biological materials such as localized mRNA, protein, and gene are distributed in thecell 8 in various ways, but these are not visible as phase contrast microscopic images, and thecell 8 can only recognize the outer shape. Here, however, these substances are schematically displayed as circles, triangles, and rhombuses in order to indicate that various biological substances such as localized mRNA and protein are distributed in thecell 8 in various ways. .

試料の位相差顕微鏡像は、試料を等電点電気泳動したときの局在ｍＲＮＡやタンパク質等各種の生体物質の２次元構造の評価の基礎となるものである。等電点電気泳動の結果として得られる画像に現れる切り欠き９₁、９₂の位置は、基準位置となる試料の位相差顕微鏡像の切り欠き９₁、９₂に対応する。等電点電気泳動の結果として得られる画像の局在ｍＲＮＡやタンパク質等各種の生体物質に対応する位置を切り欠き９₁、９₂を基準点として評価することにより、試料の細胞８の位置を基準とした２次元構造の評価が可能となる。The phase contrast microscopic image of the sample is the basis for evaluating the two-dimensional structure of various biological materials such as localized mRNA and protein when the sample is subjected to isoelectric focusing. As a result the position of thenotch 9_1, 9₂ appears in the image obtained of isoelectric focusing,notches 9₁ of a phase-contrast microscope image of a sample as a reference position, corresponding to the 9_2. The position of thecell 8 of the sample is determined by evaluating the positions corresponding to various biological materials such as localized mRNA and protein of the image obtained as a result of isoelectric focusing by usingnotches 9₁ and 9₂ as reference points. It is possible to evaluate a two-dimensional structure as a reference.

図５は実施例１による計測結果の評価方法を説明する図である。図１の構成において、電源１１を電気泳動用負電極板１と電気泳動用正電極板３との間に印加すると、試料である細胞８は即座に破砕され、細胞内生体物質は、そのｐＫ値に応じて、等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1d内に分布する。図の左側に試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1d内に、細胞内で局在化しているｍＲＮＡやタンパク質等の細胞内生体物質が局在空間情報を保持した状態で検出されている状態を模式的に示す。図の右側に、試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1dの位置に対応させてｐＨ計測用等電点電気泳動用ゲル６_2u、６_2dによって得られたゲルの位置とｐＨ値との関係を示す。この例では、ｐＨ計測用等電点電気泳動用ゲルの最上段がｐＨ＝８、最下段がｐＨ＝３．５で、位置に対してほぼ直線的な関係である。FIG. 5 is a diagram for explaining a measurement result evaluation method according to the first embodiment. In the configuration of FIG. 1, when thepower supply 11 is applied between the negative electrode plate 1 for electrophoresis and thepositive electrode plate 3 for electrophoresis, thecell 8 as a sample is immediately crushed, and the intracellular biological material is its pK. Depending on the value, it is distributed in the isoelectric focusinggels 6_1u and 6_1d . On the left side of the figure, intracellular biomaterials such as mRNA and protein localized in the cells are detected in the isoelectric focusinggels 6_1u and 6_1d for sample measurement while holding the spatial information. The state where it is done is shown schematically. On the right side of the figure, the position and the pH of the resulting gel by the sample measurementisoelectric electrophoresis gel 6_1u, 6_1d for gel to correspond to the position of isoelectric focusingpH measurement 6_2u, 6_2d Indicates the relationship with the value. In this example, the pH measurement isoelectric focusing gel has an uppermost level of pH = 8 and a lowermost level of pH = 3.5, which is a substantially linear relationship with respect to the position.

したがって、ｐＨ計測用等電点電気泳動用ゲル６_2u、６_2dによってゲルの位置とｐＨ値との関係を知った後、ｐＨ値に応じた位置の試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1dを薄く切り出すと、その表面に、試料細胞のそのｐＨ値の局在ｍＲＮＡやタンパク質等各種の生体物質をゲル６の切断面に二次元情報を保った状態で得ることが出来る。すなわち、ｐＨ₁は試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1dの位置ｈ₁に対応し、ｐＨ₂は位置ｈ₂に対応し、ｐＨ₃は位置ｈ₃に対応するのであるから、それぞれの位置で試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1dを薄く切り出せばよい。図５では、試料細胞のそれぞれのｐＫに対応する生体物質のみがそれぞれの位置のゲルの切断表面に得られていることを、細胞８の外形を示す線とともに、丸、三角およびひし形で表示している。もちろん、細胞８の外形を示す生体物質が、薄く切り出された試料計測用等電点電気泳動用ゲルの切断表面に表れているわけではないが、図４で細胞８の外形と各種の生体物質とを一緒に表示したのと同様に、参考に示した。Therefore, after knowing the relationship between the position of the gel and the pH value by the pH measuring isoelectric focusinggels 6_2u and 6_2d , the sample measuring isoelectric focusinggel 6 at the position corresponding to the pH value is used._{When 1u} and 6_1d are cut out thinly, various biological substances such as localized mRNA and protein of the pH value of the sample cell can be obtained on the surface of thegel 6 while keeping the two-dimensional information on the cut surface of thegel 6. That is, pH₁ corresponds to the position h₁ of the isoelectric focusinggels 6_1u and₆₁_d for sample measurement, pH₂ corresponds to the position h₂ , and pH₃ corresponds to the position h_3. The sample measurementisoelectric focusing gels 6_1u and 6_1d may be cut out thinly at the respective positions. In FIG. 5, the fact that only the biological material corresponding to each pK of the sample cell is obtained on the cut surface of the gel at each position is indicated by a circle, a triangle and a rhombus along with a line indicating the outer shape of thecell 8. ing. Of course, the biological material showing the outer shape of thecell 8 does not appear on the cut surface of the gel for isoelectric focusing for sample measurement cut out thinly, but the outer shape of thecell 8 and various biological materials in FIG. It was shown for reference as well as

薄く切り出された試料計測用等電点電気泳動用ゲルの切断表面に表れている各種の生体物質は、これら生体物質の個々に特異的に結合するプローブを利用して認識することが出来る（例えば、生体物質が核酸であればそれに特異的にハイブリダイズする核酸プローブ、タンパク質であればそれに対する抗体など）。すなわち、プローブをサイズあるいは組成を異にする金をベースにした、例えば粒子径が１０ｎｍから５０ｎｍの、ナノ粒子で標識する。このナノ粒子で標識されたプローブを薄く切り出された試料計測用等電点電気泳動用ゲルの切断表面に作用させ、生体物質とプローブとを結合させると、ゲルの切断表面には、ゲルの切断表面に表れている各種の生体物質に結合したプローブを標識しているナノ粒子が配列される。これを、走査型電子顕微鏡像としてナノ粒子を検出することにより、各種の生体物質の二次元配列情報が得られる。ナノ粒子で標識されたプローブによる生体物質の検出については、例えば、特開２００６−１５３８２６に開示されるように、ナノ粒子の構成を工夫すれば、走査型電子顕微鏡像と特性Ｘ線をエネルギー分散型特性Ｘ線検出器により元素分析像を組み合わせた形で非常に多種類の生体物質を一挙に検出できる。 Various biological substances appearing on the cut surface of the gel for isoelectric focusing for sample measurement cut out thinly can be recognized using probes that specifically bind to these biological substances (for example, A nucleic acid probe that specifically hybridizes to a biological substance if it is a nucleic acid, an antibody to it if it is a protein, etc.). That is, the probe is labeled with nanoparticles based on gold having a different size or composition, for example, a particle diameter of 10 nm to 50 nm. When the probe labeled with the nanoparticle is allowed to act on the cut surface of the gel for isoelectric focusing for sample measurement, which is cut out thinly, and the biological substance and the probe are combined, the gel is cut on the cut surface of the gel. Nanoparticles labeled with probes bound to various biological substances appearing on the surface are arranged. By detecting the nanoparticles as scanning electron microscopic images, two-dimensional array information of various biological materials can be obtained. As for detection of biological substances using a probe labeled with nanoparticles, for example, as disclosed in JP-A-2006-153826, if the configuration of the nanoparticles is devised, a scanning electron microscope image and characteristic X-rays are dispersed in energy. With a mold characteristic X-ray detector, it is possible to detect a great variety of biological substances at once in a form of combining elemental analysis images.

図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃは、それぞれ、位置ｈ₁、ｈ₂およびｈ₃で試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1dを薄く切り出して得たナノ粒子の走査型電子顕微鏡像を模式的に示す図である。試料の位相差顕微鏡像の一例を模式的に示す図４と対比して明らかなように、円筒５の切り欠き９₁、９₂を基準位置として試料細胞のどの位置に、どのような生体物質が存在したか知ることが出来る。FIGS. 6A, 6B, and 6C show scanning electron microscopes of nanoparticles obtained by thinly cutting the isoelectric focusinggels 6_1u and 6_1d for sample measurement at positions h₁ , h_2, and h₃ , respectively. It is a figure which shows an image typically. As apparent from comparison with FIG. 4 schematically showing an example of a phase contrast microscopic image of the sample, what biological material is located at which position of the sample cell with thenotches 9₁ and 9₂ of thecylinder 5 as reference positions. Can know if existed.

図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃは、図を簡単にするために、切り出された試料計測用等電点電気泳動用ゲルの表面には、それぞれ、一つの生体物質のみが表れているように表示したが、実際は多数の物質が表れるものであることはいうまでも無い。 6A, 6B, and 6C are displayed so that only one biological material appears on the surface of the sampled isoelectric focusing gel for sample measurement for the sake of simplicity. However, it goes without saying that many substances actually appear.

（実施例２）
実施例１では、等電点電気泳動される試料を２分割された等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1dの接合面に配置するものとした。このことは、電気泳動の電圧印加が試料に与えるかもしれない悪影響を避けるうえで、有用である。しかし、等電点電気泳動用ゲルを２分割することが必要であるのみならず、２分割された等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1dの接合面に試料を配置する作業も必要であり、計測の作業が煩雑である。(Example 2)
In Example 1, it was assumed to place a sample to be isoelectric focusing on joint surfaces of the two divided isoelectric focusinggels 6_1u, 6_1d. This is useful in avoiding the adverse effects that electrophoresis voltage application may have on the sample. However, it is not only necessary to divide the isoelectric focusing gel into two parts, but it is also necessary to place a sample on the joint surface of the two divided isoelectric focusinggels 6_1u and 6_1d. Yes, the measurement work is complicated.

このため、実施例２では、図１に示す等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1dは、図２（Ａ）に示すように一体のままとして使用することとし、試料は電極３の面に直接載せてその上に等電点電気泳動用ゲル６を載せる。この場合、試料と電極３が直接接触するから、試料によっては悪影響を受けることあるが、試料を選択すれば、実用的に支障なく、等電点電気泳動用ゲルによる本発明の効果を得ることが出来る。もっとも、この場合でも、図４に示す試料の位相差顕微鏡像は準備する必要があるのはいうまでも無い。For this reason, in Example 2, the isoelectric focusinggels 6_1u and 6_1d shown in FIG.₁ are used as they are integrated as shown in FIG. And the isoelectric focusinggel 6 is placed on the substrate. In this case, since the sample and theelectrode 3 are in direct contact with each other, it may be adversely affected depending on the sample. However, if the sample is selected, the effect of the present invention by the gel for isoelectric focusing can be obtained without any practical problem. I can do it. However, even in this case, it is needless to say that the phase contrast microscopic image of the sample shown in FIG. 4 needs to be prepared.

上記の実施例では、試料計測用等電点電気泳動用ゲルおよびｐＨ計測用等電点電気泳動用ゲルがそれぞれ一つの形で示したが、複数、例えば、２０本程度の試料計測用等電点電気泳動用ゲルに一つのｐＨ計測用等電点電気泳動用ゲルを備える形で装置を構成して計測のスループットを上げることが出来る。 In the above embodiment, the isoelectric focusing gel for sample measurement and the isoelectric focusing gel for pH measurement are shown in one form, but a plurality of, for example, about 20 isoelectric focusing gels for sample measurement are shown. The apparatus can be configured to include one isoelectric focusing gel for pH measurement in the point electrophoresis gel, thereby increasing the measurement throughput.

本発明の細胞内生体物質の解析方法の実施例１の等電点電気泳動用ゲル計測システムの構成の概念を示す斜視図である。It is a perspective view which shows the concept of a structure of the gel measurement system for isoelectric focusing of Example 1 of the analysis method of the intracellular biological material of this invention.（Ａ）〜（Ｃ）は円筒５およびその中に保持された等電点電気泳動用ゲル６を２分割形として形成する工程の一例を示す図である。(A)-(C) is a figure which shows an example of the process of forming thecylinder 5 and thegel 6 for isoelectric focusing which was hold | maintained in it as a 2 division type.（Ａ）〜（Ｆ）は実施例１により等電点電気泳動される試料の作成方法の具体例を説明する図である。(A)-(F) is a figure explaining the specific example of the preparation method of the sample electrophoresed by Example 1. FIG.作成された試料の顕微鏡像の一例を模式的に示す図である。It is a figure which shows typically an example of the microscope image of the produced sample.実施例１による計測結果の評価方法を説明する図である。It is a figure explaining the evaluation method of the measurement result by Example 1. FIG.位置ｈ₁で試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1dを薄く切り出して得た顕微鏡像を模式的に示す図である。The microscopic image obtained by thinly cutting out thegel 6_1u, 6_1d for isoelectric focusing sample measured at a position h₁ is a diagram schematically showing.位置ｈ₂で試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1dを薄く切り出して得た顕微鏡像を模式的に示す図である。The microscopic image obtained by thinly cutting out thegel 6_1u, 6_1d for isoelectric focusing sample measured at a position h₂ is a diagram schematically showing.位置ｈ₃で試料計測用等電点電気泳動用ゲル６_1u、６_1dを薄く切り出して得た顕微鏡像を模式的に示す図である。The microscopic image obtained by thinly cutting out a sample measurementisoelectric electrophoresis gel 6_1u, 6_1d at position h₃ is a diagram schematically illustrating.

符号の説明Explanation of symbols

１…電気泳動用負電極板、２…負極用の電解液を保持するための壁、３…電気泳動用正電極板、４…正極用の電解液を保持するための壁、５_1u，５_1dおよび５_2u，５_2d…上下に２分割された円筒、６_1u，６_1dおよび６_2u，６_2d…等電点電気泳動用ゲル、７₁，７₂…Ｏリングあるいはパラフイルム、８…被計測試料、９₁，９₂…円筒５の外面に形成された切り欠き、１１…電気泳動用電源、１２…コラーゲンフイルム、１３…金属線によるメッシュ、１４…ガラス板。_{DESCRIPTION OF SYMBOLS} 1 ... Negative electrode plate for electrophoresis, 2 ... Wall for hold | maintaining electrolyte solution for negative electrodes, 3 ... Positive electrode plate for electrophoresis, 4 ... Wall for hold_| maintaining electrolyte solution for positive electrodes, 5_1u , 5_1d and 5_2u , 5_2d ... Cylindrical divided into two vertically, 6_1u , 6_1d and 6_2u , 6_2d ... gel for isoelectric focusing, 7₁ , 7₂ ... O-ring or parafilm, 8. Samples to be measured, 9₁ , 9₂ ... Notches formed on the outer surface of thecylinder 5, 11. Electrophoresis power supply, 12. Collagen film, 13. Metal mesh, 14.

Claims

Translated fromJapanese

前記ｐＨ計測用等電点電気泳動用ゲルが前記試料計測用等電点電気泳動用ゲルと同じ二分割構成である請求項１記載の空間分布を保った細胞内生体物質の解析方法。 The method for analyzing an intracellular biological material having a spatial distribution according to claim 1, wherein the pH measurement isoelectric focusing gel has the same two-part configuration as the sample measurement isoelectric focusing gel.

前記正極用の電解液は前記計測用等電点電気泳動用ゲルの長さ方向で該ゲルの半分の長さを覆う深さを有するものである請求項１記載の空間分布を保った細胞内生体物質の解析方法。 The intracellular electrolyte maintaining the spatial distribution according to claim 1, wherein the electrolyte solution for positive electrode has a depth that covers half the length of the gel for isoelectric focusing electrophoresis for measurement. Analysis method of biological material.

試料細胞あるいは試料薄片は金属線によるメッシュにより支持された細胞接着性の基質の上に載置されるとともに、前記試料測定用等電点電気泳動用ゲルと実質同一の素材で実質同一の太さのゲルを内部に保持する円筒の薄片上に載置されて前記所定の形態の試料とされた請求項１記載の空間分布を保った細胞内生体物質の解析方法。 Sample cells or sample flakes are placed on a cell-adhesive substrate supported by a metal wire mesh, and are substantially the same material and the same thickness as the sample measurement isoelectric focusing gel. The method for analyzing an intracellular biological material having a spatial distribution according to claim 1, wherein the sample is placed on a thin cylindrical piece that holds the gel inside thereof and used as the sample having the predetermined form.

試料細胞あるいは試料薄片から所定の形態の試料を準備する工程、
該所定の形態の試料の位相差顕微鏡像を得る工程、
所定の太さと長さの円筒内に保持された棒状の試料計測用等電点電気泳動用ゲルを準備する工程、
前記試料計測用等電点電気泳動用ゲルと実質同一の素材で実質同一の長さの円筒内に保持された棒状のｐＨ計測用等電点電気泳動用ゲルを準備する工程、
前記試料計測用等電点電気泳動用ゲルおよび前記ｐＨ計測用等電点電気泳動用ゲルを負極用の電解液を保持している電気泳動用負電極板および正極用の電解液を保持している電気泳動用正電極板の間に、各前記ゲルが各前記円筒の両端でそれぞれの前記電解液に接するように配置する工程、
前記試料を、前記電気泳動用正電極板と前記試料計測用等電点電気泳動用ゲルとの間に配置する工程、
前記電気泳動用負電極板および電気泳動用正電極板の間に所定の電気泳動用電圧を印加する工程、
前記電圧印加後、前記ｐＨ計測用等電点電気泳動用ゲルからゲルの長さ方向の位置とｐＨ値との関係を同定する工程、
前記試料細胞あるいは試料薄片の細胞内に存在する生体物質と結合するプローブをナノ粒子で標識する工程、
前記同定されたｐＨ値を基準として前記試料計測用等電点電気泳動用ゲルを所定の位置で切り出してその位置のゲル切断面にある生体物質に前記ナノ粒子で標識されたプローブを結合させて、前記プローブの標識ナノ粒子を走査型電子顕微鏡像として観察する工程、
前記試料の位相差顕微鏡像と前記標識ナノ粒子の走査型電子顕微鏡像とを照合する工程、
よりなることを特徴とする空間分布を保った細胞内生体物質の解析方法。Preparing a sample of a predetermined form from a sample cell or sample flake,
Obtaining a phase contrast microscopic image of the sample of the predetermined form,
A step of preparing a rod-shaped isoelectric focusing gel for sample measurement held in a cylinder having a predetermined thickness and length;
Preparing a rod-shaped isoelectric focusing gel for pH measurement held in a cylinder of substantially the same length with the same material as the sample measuring isoelectric focusing gel;
The gel for isoelectric focusing for sample measurement and the gel for isoelectric focusing for pH measurement hold the negative electrode plate for electrophoresis holding the electrolyte for negative electrode and the electrolyte for positive electrode Between the positive electrode plates for electrophoresis being disposed so that each gel is in contact with each electrolyte at both ends of each cylinder,
Placing the sample between the positive electrode plate for electrophoresis and the gel for isoelectric focusing for sample measurement;
Applying a predetermined electrophoresis voltage between the negative electrode plate for electrophoresis and the positive electrode plate for electrophoresis,
Identifying the relationship between the position in the length direction of the gel and the pH value from the isoelectric focusing gel for pH measurement after the application of the voltage;
A step of labeling with a nanoparticle a probe that binds to a biological material present in the cell of the sample cell or sample flake,
The isoelectric focusing gel for sample measurement is cut out at a predetermined position on the basis of the identified pH value, and the probe labeled with the nanoparticles is bound to the biological substance on the gel cutting surface at the position. Observing the labeled nanoparticles of the probe as a scanning electron microscope image,
Collating the phase contrast microscopic image of the sample with the scanning electron microscopic image of the labeled nanoparticle,
A method for analyzing intracellular biological material having a spatial distribution characterized by comprising:

所定の太さと長さの円筒内に保持された棒状の試料測定用等電点電気泳動ゲル、
前記試料測定用等電点電気泳動ゲルと実質同一の素材からなり、前記円筒と実質同一の長さの円筒内に保持された棒状のｐＨ計測用等電点電気泳動ゲル、
負電極板と該負電極板上に形成された壁とによって規定された、負極用の電解液を保持するための負極電解液容器、および
正電極板と該正電極板上に形成された壁とによって規定された、正極用の電解液を保持するための正極電解液容器とを備え、
前記試料測定用等電点電気泳動ゲルおよび前記ｐＨ測定用等電点電気泳動ゲルが、負極電解液容器と正極電解液容器との間に、各前記ゲルが各前記円筒の両端でそれぞれの前記電解液に接するように配置され、
前記試料測定用の等電点電気泳動ゲルが、長さ方向の所定の位置で２つの棒状ゲルに前記円筒ごと分割可能であり、
試料細胞あるいは試料薄片からの所定の形態の試料が、前記二つに分割された前記試料測定用等電点電気泳動ゲルの分割面に挟持される、空間分布を保った細胞内生体物質の解析のための電気泳動装置。An isoelectric focusing gel for rod-like sample measurement held in a cylinder of a predetermined thickness and length,
The isoelectric focusing gel for pH measurement, which is made of a material substantially the same as the isoelectric focusing gel for sample measurement and is held in a cylinder having the same length as the cylinder,
A negative electrode electrolyte container for holding an electrolyte for negative electrode, defined by a negative electrode plate and a wall formed on the negative electrode plate, and a wall formed on the positive electrode plate and the positive electrode plate And a positive electrode electrolyte container for holding a positive electrode electrolyte,
The isoelectric focusing gel for sample measurement and the isoelectric focusing gel for pH measurement are provided between a negative electrode electrolyte container and a positive electrode electrolyte container, respectively, and each gel is provided at each end of each cylinder. Placed in contact with the electrolyte,
The isoelectric focusing gel for sample measurement can be divided together with the cylinder into two rod-shaped gels at predetermined positions in the length direction,
Analysis of intracellular biological material with a spatial distribution in which a sample of a predetermined form from a sample cell or a sample flake is sandwiched between two divided surfaces of the isoelectric focusing gel for sample measurement divided into the two Electrophoresis device for.

前記ｐＨ計測用等電点電気泳動用ゲルが、前記試料計測用等電点電気泳動用ゲルと同じ二分割構成である請求項６記載の電気泳動装置。 The electrophoresis apparatus according to claim 6, wherein the pH measuring isoelectric focusing gel has the same two-part configuration as the sample measuring isoelectric focusing gel.

前記正極電解液容器内の電解液は前記計測用等電点電気泳動用ゲルの長さ方向で該ゲルの半分の長さを覆う深さを有するものである請求項６記載の電気泳動装置。 The electrophoretic device according to claim 6, wherein the electrolytic solution in the positive electrode electrolytic solution container has a depth that covers a half length of the gel in the length direction of the isoelectric focusing gel for measurement.

試料細胞あるいは試料薄片は金属線によるメッシュにより支持された細胞接着性の基質の上に載置されるとともに、等電点電気泳動用ゲルと実質同一の素材で実質同一の太さのゲルを内部に保持する円筒の薄片上に載置されて前記所定の形態の試料とされた請求項６記載の電気泳動装置。 Sample cells or sample flakes are placed on a cell-adhesive substrate supported by a metal wire mesh, and a gel of the same material and thickness as that of the isoelectric focusing gel is contained inside. The electrophoresis apparatus according to claim 6, wherein the sample is placed on a thin cylindrical piece held in a tube and used as the sample of the predetermined form.

所定の太さと長さの円筒内に保持された棒状の試料測定用等電点電気泳動ゲル、
前記試料測定用等電点電気泳動ゲルと実質同一の素材からなり、前記円筒と同じ長さの円筒内に保持された棒状のｐＨ計測用等電点電気泳動ゲル、
負電極板と該負電極板上に形成された壁とによって規定された、負極用の電解液を保持するための負極電解液容器、および
正電極板と該正電極板上に形成された壁とによって規定された、正極用の電解液を保持するための正極電解液容器とを備え、
前記試料測定用等電点電気泳動ゲルおよび前記ｐＨ測定用等電点電気泳動ゲルが、負極電解液容器と正極電解液容器との間に、各前記ゲルが各前記円筒の両端でそれぞれの前記電解液に接するように配置され、
試料細胞あるいは試料薄片からの所定の形態の試料が前記正電極板と前記試料計測用等電点電気泳動用ゲルとの間に配置されている、空間分布を保った細胞内生体物質の解析のための電気泳動装置。An isoelectric focusing gel for rod-like sample measurement held in a cylinder of a predetermined thickness and length,
The isoelectric focusing gel for pH measurement, which is made of substantially the same material as the isoelectric focusing gel for sample measurement and is held in a cylinder having the same length as the cylinder,
A negative electrode electrolyte container for holding an electrolyte for negative electrode, defined by a negative electrode plate and a wall formed on the negative electrode plate, and a wall formed on the positive electrode plate and the positive electrode plate And a positive electrode electrolyte container for holding a positive electrode electrolyte,
The isoelectric focusing gel for sample measurement and the isoelectric focusing gel for pH measurement are provided between a negative electrode electrolyte container and a positive electrode electrolyte container, respectively, and each gel is provided at each end of each cylinder. Placed in contact with the electrolyte,
A sample of a predetermined form from a sample cell or a sample flake is placed between the positive electrode plate and the isoelectric focusing gel for sample measurement. Electrophoresis device for.