JP2007155585A - Probe cartridge with biochemical reaction cartridge, cover member and reaction chamber - Google Patents
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Abstract
Translated fromJapaneseDescription
Translated fromJapanese本発明は、核酸プローブなど標的物質検出に使用される生化学反応カートリッジに関する。より詳しくは、基板上の既知の位置に核酸プローブを配置したプローブ担体と標的物質とのハイブリダイゼーション反応とその反応検出を容易に行うための生化学反応カートリッジに関する。 The present invention relates to a biochemical reaction cartridge used for detecting a target substance such as a nucleic acid probe. More specifically, the present invention relates to a biochemical reaction cartridge for easily performing a hybridization reaction between a probe carrier having a nucleic acid probe arranged at a known position on a substrate and a target substance and detecting the reaction.
また本発明は、当該生化学反応カートリッジと共に用いる反応チャンバー付プローブ担体、それに用いるカバー部材に関する。 The present invention also relates to a probe carrier with a reaction chamber used together with the biochemical reaction cartridge and a cover member used therefor.
核酸の塩基配列の決定、検体試料中の目的とする特定の塩基配列をもつ核酸の検出、各種細菌の同定を行なうことが求められている。迅速・正確に行い得る技術のひとつとして、ハイブリダイゼーション反応により標的核酸と特異的に結合する、プローブと呼ばれる物質を固相支持体上に多数並べたプローブ媒体（プローブアレイ）の使用が提案されている。 There is a need to determine the base sequence of a nucleic acid, to detect a nucleic acid having a specific base sequence of interest in a specimen sample, and to identify various bacteria. As one of the techniques that can be performed quickly and accurately, the use of a probe medium (probe array) in which many substances called probes that bind specifically to a target nucleic acid by a hybridization reaction are arranged on a solid support is proposed. Yes.
プローブアレイは所望の遺伝子配列を基に設計された複数のプローブにより、感染症起炎菌の病原菌の識別や癌など病状の診断やＳＮＰ識別による体質判定に応用されてきている。一方、プローブアレイを用いた検査は、従来は、高度の熟練が要求されていた。プローブアレイを診断のような臨床分野、法医科学、その他の分野に応用展開するためには、試料の前処理工程（ゲノムの抽出・増幅）とその後のハイブリダイゼーションから検出までを、熟練性を不要にすることが望まれている。 Probe arrays have been applied to identification of pathogens of infectious pathogens, diagnosis of pathologies such as cancer, and constitution determination by SNP identification by using a plurality of probes designed based on a desired gene sequence. On the other hand, the inspection using the probe array has conventionally required a high level of skill. In order to apply the probe array to clinical fields such as diagnostics, forensic science, and other fields, skill is not required from sample pretreatment (genome extraction / amplification) and subsequent hybridization to detection. It is hoped that.
熟練性を不要にするためには、試料の前処理工程（ゲノムの抽出・増幅）、その後のハイブリダイゼーションから検出の手順を自動化し、標準化し、単純化して、熟練度の低い作業者でも行うことができるようにすることが必要である。同時に、プローブアレイの小型化とハイブリダイゼーション反応を行う反応チャンバーの小型化も望まれている。 To eliminate the need for skill, automate, standardize and simplify the sample pretreatment process (genome extraction / amplification) and subsequent hybridization to detection procedures, even for less skilled workers It is necessary to be able to do that. At the same time, miniaturization of the probe array and miniaturization of the reaction chamber for performing the hybridization reaction are also desired.
特許文献１に、ウォーターバスを温度制御に使用し、チャンバーに液体入出の連通孔を付与したハイブリダイゼーション・チャンバー装置およびそれを使用した核酸ハイブリダイゼーション方法が開示されている。特許文献１では、チャンバーの中にＤＮＡ断片を結合させたメンブレンを多孔質フィルターでサンドウィッチした担体が使われている。
特許文献２に、ウェハ上にオリゴヌクレオチド・プローブを多数配置したチップ・プレートをハイブリダイゼーションに使用するため、多数の隔壁ウェルからなるマイクロプレートが開示されている。
特許文献３には、液体入出口・流路で連通した反応チャンバーを含むパッケージに、プローブアレイを取り付けたバイオアレイチップ反応装置およびその製造方法が開示されている。パッケージには、反応チャンバーでのハイブリダイゼーション後、検出部に搬送・検出のための位置決めマーカーが設けられている。
特許文献４および５には、プローブアレイと可撓層で反応空間を形成し、反応空間を連通孔で連通したハイブリダイゼーション・チャンバーが開示されている。
更に、特許文献６には、スライドガラス型のバイオチップを収納する弾性材料で形成されたカートリッジが開示されている。バイオチップ用カートリッジは、スライドガラスを挿入してハイブリダイゼーション、前処理、洗浄処理ができ、それらの処理後にスライドガラス型のバイオチップを取外し、汎用の読取装置検出にかけることが可能な構造をしている。
特許文献１に開示されているように、ハイブリダイゼーション・チャンバーの基本的な構成は、「封止構造をした反応チャンバーとそれに連結する連通孔・流路および温度制御部」である。 As disclosed in
特許文献１で開示されているチャンバーは、容量が大きく反応溶液もチャンバー容量に合わせて多く必要となるという問題があり、特許文献２以降ではチャンバーの小型化と取り扱いの容易性が追求されている。取り扱いを容易にするために、処理装置が自動化された加熱機構、流体制御機構、検出機構などの処理機構を組合せてシステム化した様々な提案がなされている。 The chamber disclosed in
特に、特許文献３では、バイオチップアレイ上に連通孔・流路を含む反応チャンバーを構成し、一体パッケージとし、検出機構を含む検査システム装置と組み合わせたシステムが開示されている。バイオチップをパッケージ化することで、操作性は非常に便利になった。一方、検査システム装置でのハンドリングに必要なパッケージ位置マーキング、すべり防止のパッケージ・ラインの付与、液漏れ防止の隔壁付与などにより、パッケージの小型化・低コスト化・形状変更が困難になっている。 In particular,
また、特許文献６のように、現行のスライドガラス型のバイオチップをそのまま使用し、反応チャンバーを構成するように専用のカートリッジに挿入して、一連の反応処理を行えるようにしたカートリッジも開示されている。 Further, as disclosed in Patent Document 6, a cartridge in which a current slide glass type biochip is used as it is and inserted into a dedicated cartridge so as to constitute a reaction chamber so that a series of reaction processes can be performed is also disclosed. ing.
従来の検出装置がそのまま使用できる利便性があり、実験室レベルでは優れているが、バイオチップの小型化やシステム装置としての自動化には向いているとは言い難い。 Although there is the convenience that a conventional detection device can be used as it is and it is excellent at the laboratory level, it is difficult to say that it is suitable for miniaturization of a biochip or automation as a system device.
本発明の目的は、上記の課題を解決するものであり、ハイブリダイゼーション処理を行う反応チャンバー部分と検査システム装置に必要とされるハンドリング機構を機能分離することにより、チャンバー部の設計の自由度を向上させた構造を有する生化学反応カートリッジを提供することにある。 The object of the present invention is to solve the above-mentioned problems, and by separating the function of the reaction chamber part for performing the hybridization process and the handling mechanism required for the inspection system apparatus, the degree of freedom in designing the chamber part is increased. An object of the present invention is to provide a biochemical reaction cartridge having an improved structure.
本発明の一態様によれば、少なくとも検体を生化学処理するための溶液が内蔵された、あるいは溶液を供給するカートリッジと、検体中の標的物質を検出するプローブが担持されたプローブ担体が載置され、生化学処理された検体中の標的物質の検出反応を行なうための反応チャンバーとを嵌合させた生化学反応カートリッジであって、
前記カートリッジは、前記反応チャンバーに前記溶液を注入する第１の注入口と、前記チャンバーから排出される前記溶液を受ける第１の排出口と、前記プローブ担体が載置された前記反応チャンバーを載置する載置部とを有し、
注入口と排出口を有する前記反応チャンバーは、前記プローブ担体に載置することにより、前記溶液と前記プローブ担体に担持されたプローブとを反応させる反応空間を構成し、
前記第１の注入口および前記第１の排出口とが接続されていることを特徴とする生化学反応カートリッジが提供される。According to one aspect of the present invention, a cartridge containing at least a solution for biochemical treatment of a specimen or supplying a solution and a probe carrier carrying a probe for detecting a target substance in the specimen are placed. A biochemical reaction cartridge fitted with a reaction chamber for performing a detection reaction of a target substance in a biochemically processed specimen,
The cartridge has a first inlet for injecting the solution into the reaction chamber, a first outlet for receiving the solution discharged from the chamber, and the reaction chamber on which the probe carrier is mounted. And a placement part to be placed,
The reaction chamber having an inlet and an outlet constitutes a reaction space for reacting the solution and the probe carried on the probe carrier by placing the reaction chamber on the probe carrier,
A biochemical reaction cartridge is provided in which the first inlet and the first outlet are connected.
また本発明の他の一態様によれば、（ｉ）少なくとも検体を生化学処理するための溶液が内蔵された、あるいは溶液を供給するカートリッジと、
（ｉｉ）検体中の標的物質を検出するプローブが配置されている領域を有しているプローブ担体と、該プローブ担体と共に該領域を内包する反応チャンバーを構成するカバー部材とによって構成されている反応チャンバー付プローブ担体と、
を嵌合させた生化学反応カートリッジであって、
前記カートリッジは、前記反応チャンバーに前記溶液を注入する第１の注入口と、前記チャンバーから排出される前記溶液を受ける第１の排出口と、前記反応チャンバー付プローブ担体を載置する載置部とを有し、
前記カバー部材は、該反応チャンバーと外部との液体の授受を行う少なくとも２つの連通孔を備え、
前記第１の注入口および前記第１の排出口との各々は、前記カバー部材の２つの連通孔の開口部の各々と接続されている、ことを特徴とする生化学反応カートリッジが提供される。According to another aspect of the present invention, (i) a cartridge containing at least a solution for biochemical treatment of a specimen or a cartridge for supplying a solution;
(Ii) Reaction constituted by a probe carrier having a region in which a probe for detecting a target substance in a specimen is arranged, and a cover member constituting a reaction chamber containing the region together with the probe carrier. A probe carrier with a chamber;
A biochemical reaction cartridge fitted with
The cartridge includes a first inlet for injecting the solution into the reaction chamber, a first outlet for receiving the solution discharged from the chamber, and a mounting portion for mounting the probe carrier with the reaction chamber. And
The cover member includes at least two communication holes for exchanging liquid between the reaction chamber and the outside.
A biochemical reaction cartridge is provided in which each of the first inlet and the first outlet is connected to each of openings of two communication holes of the cover member. .
また本発明の他の態様によれば、検体中の標的物質を検出するプローブが配置されている領域を有しているプローブ担体と共に用いられるカバー部材であって、
前記プローブ担体の嵌合スペースと、該嵌合スペースに前記プローブ担体を嵌合することによって前記領域を内包する反応チャンバーを構成する空間と、を具備し、
更に、前記嵌合スペースへの前記プロ−ブ担体の嵌合によって形成される反応チャンバーへの液体の授受のための連通孔を具備していることを特徴とするカバー部材が提供される。According to another aspect of the present invention, there is provided a cover member used together with a probe carrier having a region in which a probe for detecting a target substance in a specimen is disposed,
A fitting space for the probe carrier; and a space constituting a reaction chamber that encloses the region by fitting the probe carrier in the fitting space;
Furthermore, a cover member is provided, which is provided with a communication hole for transferring liquid to the reaction chamber formed by fitting the probe carrier into the fitting space.
更にまた本発明の他の態様によれば、反応チャンバー付プローブ担体であって、
（ｉ）検体中の標的物質を検出するプローブが配置されている領域を有しているプローブ担体と、
（ｉｉ）上記カバー部材と、
を含み、前記プローブ担体が、前記カバー部材の嵌合スペースに嵌合し、前記プローブ担体と前記カバー部材とで反応チャンバーが構成されていることを特徴とする反応チャンバー付プロ−ブ担体が提供される。Furthermore, according to another aspect of the present invention, there is provided a probe carrier with a reaction chamber,
(I) a probe carrier having a region where a probe for detecting a target substance in a specimen is disposed;
(Ii) the cover member;
A probe carrier with a reaction chamber is provided, wherein the probe carrier is fitted in a fitting space of the cover member, and the reaction chamber is constituted by the probe carrier and the cover member Is done.
このような目的を達成するための手段を以下説明する。 Means for achieving such an object will be described below.
少なくともひとつのプローブ担体アレイを含む基板に反応チャンバーが構成できるような所定のサイズを標準化（規格化）する。規格化されたサイズの該プローブ担体アレイ上に反応チャンバーを形成するために、反応空間と流路とポートを有するカバー部材を作製するが、少なくともポート位置は規格化されている。該プローブ担体アレイと該カバー部材を接着することにより、ハイブリダイゼーション処理を行う反応チャンバー部分が構成される。 A predetermined size is standardized so that a reaction chamber can be formed on a substrate including at least one probe carrier array. In order to form a reaction chamber on the probe carrier array having a standardized size, a cover member having a reaction space, a flow path, and a port is prepared. At least the port position is standardized. By adhering the probe carrier array and the cover member, a reaction chamber portion for performing a hybridization process is configured.
上記の反応チャンバー部分のままでハンドリングしてもよいが、検出システム装置に対応するように、該反応チャンバー部分を設置できる機構を有すると同時に、ハンドリング機構を備えた専用のカートリッジに設置して使用することもできる。カートリッジには反応チャンバーを固定するための機構、検出システム装置内での搬送用の機構、検出部での位置マーキング機構などが備えられる。 The above reaction chamber part may be handled as it is, but it has a mechanism that can install the reaction chamber part so that it corresponds to the detection system device, and at the same time, it is installed in a dedicated cartridge equipped with a handling mechanism. You can also The cartridge is provided with a mechanism for fixing the reaction chamber, a transport mechanism within the detection system apparatus, a position marking mechanism at the detection unit, and the like.
基板上に少なくともひとつのプローブアレイを形成したプローブ担体であり、該プローブアレイに対向して反応チャンバーを構成するカバー部材からなり、該基板の大きさおよび該カバー部材の大きさと液体連通孔の位置が規格化され、該プローブアレイを着脱交換可能に嵌合する構成にしたことにより、反応チャンバーの規格内での設計変更であれば、検査システム装置の搬送ガイド・位置ガイドの設計を変更せずに対応することが可能になる。 A probe carrier having at least one probe array formed on a substrate, comprising a cover member that constitutes a reaction chamber facing the probe array, the size of the substrate, the size of the cover member, and the position of the liquid communication hole If the design of the reaction chamber is changed within the standards of the reaction chamber, the design of the transport guide and position guide of the inspection system device is not changed. It becomes possible to cope with.
また、反応チャンバーを含むプローブ担体のみを交換することにより、カートリッジについては再利用が可能であり、繰り返し使用できるので、省資源・低コスト化が可能である。 Further, by exchanging only the probe carrier including the reaction chamber, the cartridge can be reused and can be used repeatedly, so that resource saving and cost reduction are possible.
まず、本発明に係る生化学反応カートリッジは、反応チャンバー付プローブ担体と共に用いられる。反応チャンバーは、図３及び図４において図番３４で示す空間であり、該反応チャンバーは、カバー部材３２の嵌合スペース３５にプローブ担体１３を嵌合させることによって形成され、プローブ担体上のプローブが配置されている領域（プローブアレイ１２）を内包している。カバー部材３２は、該チャンバー３４への液体の注入及び排出のための連通孔３３を有している。 First, the biochemical reaction cartridge according to the present invention is used together with a probe carrier with a reaction chamber. The reaction chamber is a space indicated by a reference numeral 34 in FIGS. 3 and 4. The reaction chamber is formed by fitting the
そして、本発明に係る生化学反応カートリッジは、少なくとも生化学処理するための溶液が内蔵された、あるいは該溶液を供給するカートリッジと、上記反応チャンバー付プローブ担体とを嵌合させることにより構成されている。 A biochemical reaction cartridge according to the present invention is configured by fitting at least a solution for biochemical treatment or a cartridge for supplying the solution with the probe carrier with a reaction chamber. Yes.
反応チャンバー付プローブ担体は、カートリッジに嵌合される。嵌合された状態においては、カートリッジに設けられた、反応チャンバー３４に溶液を注入する注入口と、反応チャンバーに形成され、反応チャンバーに外部から溶液が注入される注入口（連通孔）とが接続されている。また、反応チャンバーに設けられた、反応チャンバーから溶液を排出する排出口と、該排出口から排出された溶液を受け、チャンバーの外部へ溶液を排出する、該カートリッジに設けられた、排出口とが接続されている。 The probe carrier with the reaction chamber is fitted into the cartridge. In the fitted state, there are an inlet provided in the cartridge for injecting the solution into the reaction chamber 34 and an inlet (a communication hole) formed in the reaction chamber for injecting the solution from the outside into the reaction chamber. It is connected. A discharge port provided in the reaction chamber for discharging the solution from the reaction chamber; a discharge port provided in the cartridge for receiving the solution discharged from the discharge port and discharging the solution to the outside of the chamber; Is connected.
カートリッジは、検査システム装置に必要とされるハンドリング機構や動作同期するためのマーキング部などの位置が決まっている。 The cartridge has a predetermined position such as a handling mechanism required for the inspection system apparatus and a marking portion for synchronizing operation.
反応チャンバー付プローブ担体の外形は、カートリッジに嵌合させるために一定の形状・機構が必要がある。更に、カートリッジと嵌合させた時に、反応チャンバーに形成された外部から溶液を反応チャンバーに供給する供給口と、反応チャンバーから溶液を外部に排出する排出口との位置が一定になるようにカートリッジの勘合位置合わせ機構が必要である。 The outer shape of the probe carrier with the reaction chamber needs to have a certain shape / mechanism to be fitted into the cartridge. Further, when the cartridge is fitted with the cartridge, the position of the supply port for supplying the solution to the reaction chamber from the outside formed in the reaction chamber and the position of the discharge port for discharging the solution from the reaction chamber to the outside are constant. The fitting alignment mechanism is required.
一方、反応チャンバー内の溶液とプローブ担体との反応を行わせるための反応空間の広さおよびプローブ担体の大きさは、カートリッジに嵌合可能な外形寸法の内であれば特に規制されるものではない。 On the other hand, the width of the reaction space and the size of the probe carrier for causing the reaction between the solution in the reaction chamber and the probe carrier are not particularly limited as long as they are within the outer dimensions that can be fitted into the cartridge. Absent.
プローブを担持する基材は、プローブを担持し、基材に担持されたプローブを用いて検知物質（標的物質）を検出する。プローブを担持する基材は、検知物質（標的物質）を検出するのに支障のないものであれば特に限定されるものではないが、例えば無機材料または高分子材料などがあげられる。 The substrate carrying the probe carries the probe and detects the detection substance (target substance) using the probe carried on the substrate. The substrate carrying the probe is not particularly limited as long as it does not interfere with detection of the detection substance (target substance), and examples thereof include inorganic materials and polymer materials.
無機材料を使用する場合は、検知物質（標的物質）を検出するため、塩基性基を導入するので、基材表面を例えばアミノ基を有するシランカップリング剤で処理したものが好ましい。 When an inorganic material is used, a basic group is introduced in order to detect a detection substance (target substance). Therefore, it is preferable to treat the substrate surface with, for example, a silane coupling agent having an amino group.
シランカップリング剤で処理する場合、特には石英、石英ガラス、ガラス、シリコン（単結晶あるいはポリシリコン）、シリカ、アルミナ、タルク、クレー、アルミニウム、水酸化アルミニウム、鉄、マイカ等のシランカップリング剤で効率的に処理できるような基板が好ましいが、表面OH基があるので、反応効率は低くなるが酸化チタン、亜鉛華、酸化鉄などの酸化物などを使用することもできる。 When treating with a silane coupling agent, especially silane coupling agents such as quartz, quartz glass, glass, silicon (single crystal or polysilicon), silica, alumina, talc, clay, aluminum, aluminum hydroxide, iron, mica, etc. A substrate that can be processed efficiently is preferable, but since there are surface OH groups, the reaction efficiency is lowered, but oxides such as titanium oxide, zinc oxide, and iron oxide can also be used.
標的物質の検出や材料としての汎用性を考慮すると、アルカリ成分を含まない、無アルカリガラスや石英基板材料が特に好ましい。 In consideration of detection of a target substance and versatility as a material, an alkali-free glass or a quartz substrate material that does not contain an alkali component is particularly preferable.
シリコンは、後述の小片に切断する際に、スクライブ＆ブレーキング法を用いることを考慮すると単結晶シリコンであることが好ましい。ポリシリコンの場合には、ダイシング法の適用が好ましい。 The silicon is preferably single crystal silicon in consideration of using a scribing and breaking method when cutting into small pieces to be described later. In the case of polysilicon, it is preferable to apply a dicing method.
アミノ基を有するシランカップリング剤としては、Ｎ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルトリアルコキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルメチルジアルコキシシラン、γ−アミノプロピルトリアルコキシシラン、γ−アミノプロピルメチルジアルコキシシランなどがあげられる。アルコキシシリル基としては、加水分解が速やかに行えるメトキシシリル基もしくはエトキシシリル基が好ましい。 Examples of the silane coupling agent having an amino group include N-β (aminoethyl) γ-aminopropyltrialkoxysilane, N-β (aminoethyl) γ-aminopropylmethyldialkoxysilane, γ-aminopropyltrialkoxysilane, Examples thereof include γ-aminopropylmethyl dialkoxysilane. The alkoxysilyl group is preferably a methoxysilyl group or an ethoxysilyl group that can be rapidly hydrolyzed.
高分子材料としては、アミノ基などの塩基性基を有する高分子材料、あるいは、塩基性基を容易に導入できる高分子材料が好ましい。例えば、末端にアミノ基を持つポリアミドなどを利用する方法、保護したアミノ基とビニル基を持つ物質を共重合させ、保護基を外した材料等がある。ポリカーボネート系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、ポリアクリルアミド系樹脂、ポリエステル系樹脂などを基材として表面にアミノ基を導入した高分子材料も使用できる。この場合には、シランカップリング剤による処理は必要ない。 As the polymer material, a polymer material having a basic group such as an amino group or a polymer material into which a basic group can be easily introduced is preferable. For example, there are a method using a polyamide having an amino group at the terminal, a material obtained by copolymerizing a protected amino group and a substance having a vinyl group, and removing the protecting group. A polymer material in which an amino group is introduced on the surface of a polycarbonate resin, polystyrene resin, polyolefin resin, polyacrylamide resin, polyester resin or the like can also be used. In this case, treatment with a silane coupling agent is not necessary.
なお、上述のシランカップリング剤とは、樹脂などの有機化合物と反応しうる有機官能基と、ガラスなどの無機化合物とシロキサン結合を介して結合しうる部分を併せ持つ化合物のことを言う。 The above-mentioned silane coupling agent refers to a compound having both an organic functional group capable of reacting with an organic compound such as a resin and a portion capable of binding via an siloxane bond to an inorganic compound such as glass.
また、プローブを担持する基材の形状は制約されるものではないが、ＤＮＡチップを例として挙げるならば検出方法および装置などの汎用性から基板形状であることが好ましい。更に、材料の表面の平滑性が高い材料であることが好ましく、市販されている標準的な検出装置を用いる上では、具体的には１インチ×３インチ、厚さ０．７〜１．５ｍｍ程度の基板形状をしていることが好ましい。 In addition, the shape of the base material supporting the probe is not limited, but if a DNA chip is taken as an example, a substrate shape is preferable in view of versatility such as a detection method and an apparatus. Furthermore, it is preferable that the material has a high surface smoothness. Specifically, when using a commercially available standard detection apparatus, specifically, 1 inch × 3 inches and a thickness of 0.7 to 1.5 mm. It is preferable that the substrate has a shape of a certain degree.
プローブが担持された基板を所定のサイズに切断してＤＮＡチップを作製する場合、基板の形状、サイズは特に制約されない。 When a DNA chip is manufactured by cutting a substrate carrying a probe into a predetermined size, the shape and size of the substrate are not particularly limited.
プローブを担持する基板の表面をシランカップリング剤で処理する際には、基板表面を予め洗浄しておくことが好ましい。洗浄方法としては、水による洗浄，薬液による洗浄，プラズマによる洗浄，ＵＶオゾンによる洗浄など多くの方法が知られているが、簡易的に尚且つ均一に洗浄する方法としては、薬液による洗浄方法が適当である。 When the surface of the substrate carrying the probe is treated with a silane coupling agent, the substrate surface is preferably washed in advance. As cleaning methods, many methods such as cleaning with water, cleaning with chemicals, cleaning with plasma, cleaning with UV ozone, etc. are known, but cleaning methods with chemicals are simple and uniform cleaning methods. Is appropriate.
基板に用いる基材の種類によっても好適な洗浄方法は異なるが、例えば基材としてガラスを用いる場合は、所定濃度の水酸化ナトリウム水溶液を用いて基材表面を十分に洗浄し、基材上に付着した汚れを除去する方法が挙げられる。 A suitable cleaning method varies depending on the type of base material used for the substrate. For example, when glass is used as the base material, the surface of the base material is sufficiently cleaned using a sodium hydroxide aqueous solution of a predetermined concentration, A method for removing the attached dirt is mentioned.
ガラスを、プローブを担持する基板として用いる場合、６０℃程度に加温した１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用意し、水溶液中で基材表面をワイピングするもしくは水溶液をシャワーリングしながらブラッシングすることにより基材上に付着した汚れを確実に除去する。汚れを除去した後、余分な水酸化ナトリウム分を十分に水で洗い流す。最後にＮ2などの不活性ガスでブローするなどの方法で水分除去を行う。When glass is used as a substrate for supporting a probe, a base material is prepared by preparing a 1M sodium hydroxide aqueous solution heated to about 60 ° C. and wiping the base material surface in the aqueous solution or brushing the aqueous solution while showering. Make sure to remove dirt on the top. After removing the dirt, thoroughly wash away excess sodium hydroxide with water. Finally, moisture is removed by blowing with an inert gas such as N2 .
シランカップリング剤のコーティングの方法は、浸漬法（ディッピング法）、スピンコート法、スプレーコート法などの方法が利用できる。特に簡便且つ均一に処理できる浸漬法が好ましい。 As a method for coating the silane coupling agent, a dipping method (dipping method), a spin coating method, a spray coating method, or the like can be used. In particular, a dipping method that allows simple and uniform treatment is preferred.
浸漬法は、例えば、濃度が０．１〜２．０ｗｔ％の水に溶解させたシランカップリング剤水溶液に、洗浄した基材を浸漬し、反応終了後余分なシランカップリング剤を含む溶液を洗い流すことでシランカップリング剤を基材表面にコーティングすることができる。 In the dipping method, for example, the cleaned substrate is immersed in an aqueous solution of a silane coupling agent dissolved in water having a concentration of 0.1 to 2.0 wt%, and a solution containing an excess silane coupling agent is obtained after the reaction is completed. By washing away, the surface of the substrate can be coated with the silane coupling agent.
シランカップリング剤を基材表面にコーティング後、１００〜１２０℃くらいの温度で乾燥させることが好ましい。 It is preferable to dry at a temperature of about 100 to 120 ° C. after coating the surface of the substrate with the silane coupling agent.
プローブとしては、タンパク質（複合タンパク質を含む）、核酸、糖鎖（複合糖質を含む）、脂質（複合脂質を含む）等の生体高分子などが含まれる。具体的には、酵素、ホルモン、フェロモン、抗体、抗原、ハプテン、ペプチド、合成ペプチド、ＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ＰＮＡ、合成ＰＮＡ、ガングリオシド、レクチンなどがあげられる。 Probes include biopolymers such as proteins (including complex proteins), nucleic acids, sugar chains (including complex carbohydrates), lipids (including complex lipids), and the like. Specific examples include enzymes, hormones, pheromones, antibodies, antigens, haptens, peptides, synthetic peptides, DNA, synthetic DNA, RNA, synthetic RNA, PNA, synthetic PNA, ganglioside, lectin and the like.
媒体中に含まれるプローブの量は、例えば核酸プローブの場合、プローブ安定性を考慮すると、媒体中に、好ましくは鎖長２ｍｅｒ〜５００ｍｅｒ、より好ましくは２ｍｅｒ〜８０ｍｅｒの核酸プローブの濃度が、０．０５〜５００μＭとなるように調整することが好ましく、０．５〜５０μＭの濃度となるように調整することがより好ましい。 The amount of the probe contained in the medium is, for example, in the case of a nucleic acid probe, in consideration of probe stability, the concentration of the nucleic acid probe having a chain length of preferably 2 mer to 500 mer, more preferably 2 mer to 80 mer is preferably 0. It is preferable to adjust so that it may become 05-500 micromol, and it is more preferable to adjust so that it may become a density | concentration of 0.5-50 micromol.
プローブにチオール基を導入する際、例えば、自動合成するＤＮＡをプローブとする場合にはＤＮＡ自動合成機での合成時にチオールモディファイア（Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（グレンリサーチ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）社製）を用いる事ができる。なお、効率良くチオール基の導入することができれば、特にチオールモディファイアに限定されるものではない。 When introducing a thiol group into a probe, for example, when a DNA to be synthesized automatically is used as a probe, a thiol modifier (manufactured by Glen Research) should be used for synthesis with an automatic DNA synthesizer. Can do. The thiol modifier is not particularly limited as long as the thiol group can be efficiently introduced.
基板へのプローブの付与は、プローブを水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、インクジェット法、ピン法あるいはピン＆リング法などにより表面に塩基性基を有する基板にスポットする。 For applying the probe to the substrate, an aqueous liquid in which the probe is dissolved or dispersed in an aqueous medium is spotted on a substrate having a basic group on the surface by an inkjet method, a pin method, a pin & ring method, or the like.
スポッティング方法に関し、上述した方法の中でも特にインクジェット法は高密度で尚且つ正確なスポッティングができることから好適なスポッティング方法である。インクジェット法とは、ごく細いノズルの中にプローブを含む溶媒を入れ、ノズルの先端近くを瞬間的に加圧ないし加熱し、ノズルの先端から正確に極微量のプローブを含む溶媒を飛び出させ、基材面に付着させるというものである。 Regarding the spotting method, among the above-described methods, the inkjet method is a preferred spotting method because high-density and accurate spotting can be performed. The ink jet method is a method in which a solvent containing a probe is placed in a very thin nozzle, the pressure near the tip of the nozzle is momentarily pressurized or heated, and the solvent containing a very small amount of probe is ejected from the tip of the nozzle accurately. It adheres to the surface of the material.
プローブ媒体に含まれる成分はプローブ媒体としてインクジェットヘッドから吐出させた時にプローブに対して実質的に影響を与えないものであって、且つインクジェットヘッドを用いて基材上に正常に吐出可能である媒体組成を満たすものであれば、特に限定されるものではない。例えば、インクジェットヘッドが媒体に熱エネルギーを付与して吐出させる機構を備えるバブルジェットヘッドである場合、グリセリン、チオジグリコール、イソプロピルアルコール、アセチレンアルコールを含む液体はプローブ媒体に含まれる成分として好ましいものである。更に具体的に述べるのであれば、グリセリン５〜１０ｗｔ％、チオジグリコール５〜１０ｗｔ％、アセチレンアルコール０．５〜１ｗｔ％を含む液体がプローブ媒体として好適に用いられる。 The component contained in the probe medium is a medium that does not substantially affect the probe when ejected from the ink jet head as the probe medium, and can be normally ejected onto the substrate using the ink jet head. As long as the composition is satisfied, there is no particular limitation. For example, when the inkjet head is a bubble jet head having a mechanism for applying a thermal energy to the medium and ejecting the liquid, a liquid containing glycerin, thiodiglycol, isopropyl alcohol, or acetylene alcohol is preferable as a component contained in the probe medium. is there. More specifically, a
また、インクジェットヘッドが圧電素子を用いて媒体を吐出させるピエゾジェットヘッドである場合、エチレングリコール、イソプロピルアルコールを含む液体はプローブ媒体に含まれる成分として好ましいものである。更に具体的には、エチレングリコール５〜１０ｗｔ％、イソプロピルアルコール０．５〜２ｗｔ％を含む液体がプローブ媒体として好適に用いられる。 When the inkjet head is a piezo jet head that ejects a medium using a piezoelectric element, a liquid containing ethylene glycol and isopropyl alcohol is preferable as a component contained in the probe medium. More specifically, a liquid containing 5 to 10 wt% ethylene glycol and 0.5 to 2 wt% isopropyl alcohol is preferably used as the probe medium.
このようにして得られたプローブ媒体は、インクジェットヘッドより吐出させ基材上に付着させた時、スポットの形状が円形で、また吐出された範囲が広がることがない。高密度にプローブ媒体をスポッティングした場合にも、隣接するスポットとの連結を有効に抑えることができる。なお、本発明のプローブ媒体の特性は上記のものに限定されるものではない。 When the probe medium obtained in this way is ejected from an inkjet head and deposited on a substrate, the spot shape is circular and the ejected range does not widen. Even when the probe medium is spotted at a high density, the connection with adjacent spots can be effectively suppressed. The characteristics of the probe medium of the present invention are not limited to the above.
また、予めプローブと塩基性基を有するシランカップリング剤を水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、インクジェット法もしくはピン法などの方法により、基板表面に接触させ、基板表面への塩基性基の導入と、プローブの固定担持を同時に行っても良い。 In addition, an aqueous liquid in which a probe and a silane coupling agent having a basic group are dissolved or dispersed in an aqueous medium is brought into contact with the substrate surface by a method such as an ink jet method or a pin method, so that the basic group on the substrate surface is removed. The introduction and the fixed loading of the probe may be performed simultaneously.
さらにスポットのプローブの乾燥を低減するために、プローブが溶解あるいは分散してなる水性液中に、高沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、プローブが溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し得るもので、かつ粘性の大きくない物質であることが好ましい。このような物質としては、グリセリン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、チオジグリコール、ジメチルスルホキシドおよび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親水性ポリマーとしては、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、パオゲン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、デキストラン、プルラン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げることができる。 Further, in order to reduce the drying of the spot probe, a substance having a high boiling point may be added to an aqueous liquid in which the probe is dissolved or dispersed. The substance having a high boiling point is preferably a substance that can be dissolved in an aqueous liquid in which the probe is dissolved or dispersed and that is not highly viscous. Such materials include glycerin, ethylene glycol, diethylene glycol, thiodiglycol, dimethyl sulfoxide and low molecular weight hydrophilic polymers. Examples of the hydrophilic polymer include polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, paogen, carboxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, dextran, pullulan, polyacrylamide, polyethylene glycol, and sodium polyacrylate.
高沸点の物質としては、エチレングリコールまたはジエチレングリコールを用いることがさらに好ましい。高沸点の物質の濃度は、プローブの水性液中、０．１〜１０容量％の範囲にあることが好ましい。また、プローブを付与した後の固相担体を、９０％以上の湿度および２０〜５０℃の温度範囲の環境にいてもよい。 More preferably, ethylene glycol or diethylene glycol is used as the high boiling point substance. The concentration of the high-boiling substance is preferably in the range of 0.1 to 10% by volume in the probe aqueous solution. Moreover, the solid phase carrier after application of the probe may be in an environment having a humidity of 90% or more and a temperature range of 20 to 50 ° C.
スポッティング後、過剰のプローブを洗浄して除去することが好ましい。プローブの種類にもよるが、チオール基を導入した１本鎖ＤＮＡプローブを用いた場合１分以内でプローブは固定担持されるが、１０分以上放置した後に除去することが好ましい。 After spotting, it is preferable to remove excess probe by washing. Although depending on the type of probe, when a single-stranded DNA probe into which a thiol group is introduced is used, the probe is immobilized and supported within 1 minute, but it is preferable to remove it after leaving it to stand for 10 minutes or longer.
このようにして得られたプローブ担持基板は、標的物質を検出するためのプローブ担持担体として好適である。 The probe-carrying substrate thus obtained is suitable as a probe-carrying carrier for detecting the target substance.
プローブ担持担体を用い、標的物質の検出等を行う場合、プローブを固相表面に担持した後、基材上のプローブ非結合部分が検体（サンプル）中に含まれる標的物質等と結合しないようにブロッキングを行って検出精度（Ｓ／Ｎ比）の向上を図ることができる。 When detecting a target substance using a probe-supporting carrier, after the probe is supported on the solid phase surface, the probe non-binding portion on the substrate should not be bound to the target substance contained in the sample (sample). The detection accuracy (S / N ratio) can be improved by blocking.
ブロッキングは例えば、基材を１〜２％ウシ血清アルブミン水溶液中に、２時間程度浸すことにより行なわれる。この場合、基材上のプローブ担持部位以外への標識物質の吸着を防ぐ効果からすると、ウシ血清アルブミン水溶液が好適である。 The blocking is performed, for example, by immersing the base material in a 1-2% bovine serum albumin aqueous solution for about 2 hours. In this case, an aqueous bovine serum albumin solution is preferable from the viewpoint of preventing the labeling substance from being adsorbed to other than the probe-carrying site on the substrate.
なお、ブロッキングの工程は必要に応じて行えば良く、例えばサンプルのプローブ担持基材への供給を各々のスポットに対して限定的に行い、スポット以外の部位へのサンプルの付着が実質的にない場合には行わなくても良い。スポット以外の部位へのサンプルが付着される場合は、基材となる材料や、シランカップリング剤の種類によって異なる。また、基材がガラス，石英などである場合において、塩基性基を有するシランカップリング剤のような物質とチオール基を有するプローブを含むプローブ媒体をスポッティングする場合にも、ブロッキング操作は必要ない。 The blocking step may be performed as necessary. For example, the supply of the sample to the probe-supporting substrate is limited to each spot, and the sample does not substantially adhere to a portion other than the spot. In some cases, this is not necessary. When a sample is attached to a site other than the spot, it depends on the material used as the base material and the type of the silane coupling agent. Further, when the base material is glass, quartz or the like, a blocking operation is not necessary when spotting a probe medium containing a probe having a thiol group and a substance such as a silane coupling agent having a basic group.
この様にして作製するプローブ担持基材はその用途に応じて、例えば同じプローブを含む複数のスポットを有するように構成しても良く、また異種のプローブを各々含む複数のスポットを有する様に構成してもよい。プローブの種類，数量，配置は必要に応じて適宜変更することが可能である。そしてこの様な方法によってプローブが高密度に配置されたプローブ担持基材は、その後標的物質の検出や、標的物質塩基配列の特定等に用いられる。 The probe-supporting substrate produced in this way may be configured to have, for example, a plurality of spots including the same probe, or a plurality of spots each including different types of probes, depending on the application. May be. The type, quantity, and arrangement of the probes can be changed as necessary. The probe-supporting substrate on which the probes are arranged at high density by such a method is then used for detection of the target substance, identification of the target substance base sequence, and the like.
例えば、サンプル中に含まれている可能性のある、塩基配列が既知の標的物質である一本鎖核酸の検出に用いる場合は、標的物質の一本鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸をプローブとして用いる。標的物質として、プローブを含む複数のスポットが固相上に配置されているプローブ担持基材を用意し、プローブ担持基材の各々のスポットに、検知物質を含むサンプルを付与して該標的物質の一本鎖核酸とプローブとがハイブリダイズするような条件下に置いた後、各々のスポットにおけるハイブリッドの有無を、例えば蛍光、電波、磁力による検出等の既知の方法で検出する。それによって、サンプル中における標的物質の有無の検出を行うことができる。 For example, when it is used for detection of a single-stranded nucleic acid having a known target substance whose base sequence may be contained in a sample, it is complementary to the base sequence of the single-stranded nucleic acid of the target substance. A single-stranded nucleic acid having a base sequence is used as a probe. As a target substance, a probe-supporting base material in which a plurality of spots containing probes are arranged on a solid phase is prepared, and a sample containing a detection substance is applied to each spot of the probe-supporting base material to After being placed under conditions such that the single-stranded nucleic acid and the probe are hybridized, the presence or absence of a hybrid at each spot is detected by a known method such as detection by fluorescence, radio waves, or magnetic force. Thereby, the presence or absence of the target substance in the sample can be detected.
また、サンプル中に含まれている標的物質の一本鎖核酸における塩基配列の特定に用いる場合は、標的物質の一本鎖核酸における塩基配列の複数の候補を設定し、塩基配列群に対して各々相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸をプローブとして基材上にスポッティングする。次いで、各々のスポットにサンプルを供給して標的物質の一本鎖核酸とプローブとがハイブリダイズするような条件下に置いた後、各々のスポットにおけるハイブリッドの有無を蛍光検出等の既知の方法で検出する。これにより、標的物質である一本鎖核酸の塩基配列の特定を行うことができる。また本発明に係わるプローブ担持基材の他の用途としては、例えばＤＮＡ結合蛋白質が認識する特異的な塩基配列のスクリーニングやＤＮＡに結合する性質を有する化学物質のスクリーニングへの適用が考えられる。 In addition, when using to specify the base sequence of a single-stranded nucleic acid of a target substance contained in a sample, multiple candidates for the base sequence of a single-stranded nucleic acid of the target substance are set, and Single-stranded nucleic acids each having a complementary base sequence are spotted on a substrate as a probe. Next, after supplying a sample to each spot and placing under conditions such that the single-stranded nucleic acid of the target substance and the probe hybridize, the presence or absence of the hybrid in each spot is determined by a known method such as fluorescence detection. To detect. Thereby, the base sequence of the single-stranded nucleic acid which is a target substance can be specified. As other uses of the probe-supporting substrate according to the present invention, for example, application to screening of a specific base sequence recognized by a DNA-binding protein and screening of a chemical substance having a property of binding to DNA can be considered.
ハイブリダイゼーションは標識した試料核酸断片が溶解あるいは分散した水性液を、上記で作製したＤＮＡチップ上に付与することによって実施することが好ましい。 Hybridization is preferably carried out by applying an aqueous solution in which the labeled sample nucleic acid fragment is dissolved or dispersed on the DNA chip prepared above.
ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で、そして２〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去することが好ましい。 Hybridization is preferably carried out in the temperature range of room temperature to 70 ° C. and in the range of 2 to 20 hours. After completion of the hybridization, it is preferable to remove the unreacted sample nucleic acid fragment by washing with a mixed solution of a surfactant and a buffer solution.
界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。 As the surfactant, sodium dodecyl sulfate (SDS) is preferably used. As the buffer solution, a citrate buffer solution, a phosphate buffer solution, a borate buffer solution, a Tris buffer solution, a Good buffer solution, and the like can be used, and it is particularly preferable to use a citrate buffer solution.
ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーションの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に少ないことである。そのため、固相担体に担持するＤＮＡ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハイブリダーゼーションの最適条件を設定する必要がある。 The feature of hybridization using a DNA chip is that the amount of labeled sample nucleic acid fragments used is very small. Therefore, it is necessary to set optimum conditions for hybridization according to the chain length of the DNA fragment carried on the solid phase carrier and the type of the labeled sample nucleic acid fragment.
遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。１塩基ミスマッチ（１塩基変異）の検出には、短時間のハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を２種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比較や定量ができる特徴もある。 For analysis of gene expression, it is preferable to perform hybridization for a long time so that low-expressing genes can be sufficiently detected. For detection of single-base mismatch (single-base mutation), it is preferable to perform hybridization for a short time. In addition, by preparing two types of sample nucleic acid fragments labeled with different fluorescent substances and using them simultaneously for hybridization, the expression level can be compared and quantified on the same DNA chip.
プローブを担持した基板を切断（ダイシング）してプローブ担体を形成する方法は、
１．ダイヤモンド・カッターを用いて基板表面を罫書いて、基板の表面にスクライブ・ラインを形成し、衝撃ブレーキングによりスクライブ・ラインで破断し、小チップ化する、
２．ダイシング装置を使って切断する、
３．ダイシング装置を用いて切り代を残して切断し、その後、破断する、
４．レーザー切断法による切断する、
５．高分子材料の場合には、切削カッターによる切断方法が適用できる、
また、射出成型法の場合には、その形状・サイズに対応した金型を使用することによって可能である。A method of forming a probe carrier by cutting (dicing) a substrate carrying a probe is as follows:
1. Scribing the surface of the substrate using a diamond cutter, forming a scribe line on the surface of the substrate, breaking the scribe line by impact braking, and making a small chip,
2. Cutting with a dicing machine,
3. Use a dicing machine to cut the cutting allowance, and then break.
4). Cutting by laser cutting method,
5. In the case of a polymer material, a cutting method using a cutting cutter can be applied.
In the case of the injection molding method, it is possible to use a mold corresponding to the shape and size.
１〜４の方法は、半導体のダイシングでよく使われている方法で、シリコン基板、石英基板および石英ガラスのような材料のダイシングに適している。 The
一方、ダイシング装置を用いる場合、ダイシング中のブレードを冷却するためにブレードに冷却水を供給する必要がある。更に、ダイシング中に生成される基板の切削粒子によりプローブ担体の剥離や特性変化がないことが必要である。 On the other hand, when using a dicing apparatus, it is necessary to supply cooling water to the blade in order to cool the blade during dicing. Further, it is necessary that the probe carrier is not peeled off or changed in characteristics by the cutting particles of the substrate generated during dicing.
スクライブ＆ブレーキング法はウェット・プロセスを含まないドライ・プロセスなので、プローブ担体の切断加工には適している。 Since the scribing and breaking method is a dry process that does not include a wet process, it is suitable for cutting a probe carrier.
反応チャンバーは、ハイブリダイゼーション反応に影響しない材料で、反応空間の加工性があれば、特に制限はないが、一般には射出成型に適した高分子材料、例えば、ポリカーボネート樹脂、ポリオレフィン系樹脂、ポリアクリル系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリエチレン系樹脂などのプラスティックが用いられる。 The reaction chamber is a material that does not affect the hybridization reaction and is not particularly limited as long as the reaction space can be processed. Generally, a polymer material suitable for injection molding such as polycarbonate resin, polyolefin resin, polyacrylic is used. Plastics such as polypropylene resin, polypropylene resin, and polyethylene resin are used.
プローブ担体と反応チャンバーとの接着には、基板材料・カバー材料・ハイブリダイゼーション処理に影響を与えない接着剤であれば、特に制限はない。基板材料およびカバー材料が両方ともプラスティックである場合には、超音波溶着やレーザー溶着も使用することができる。 The adhesion between the probe carrier and the reaction chamber is not particularly limited as long as it is an adhesive that does not affect the substrate material, the cover material, and the hybridization treatment. If the substrate material and the cover material are both plastic, ultrasonic welding or laser welding can also be used.
以下、本発明の好ましい一実施例を添付図面に基づき更に詳細に説明する。これらは説明目的で記載され、本発明を限定するものではない。 Hereinafter, a preferred embodiment of the present invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings. These are described for illustrative purposes and do not limit the invention.
＜実施例＞
プローブ担体の作製
◎基板の洗浄
プローブ担持担体の基材として、図１に示す７２ｍｍ角（厚さ０．７ｍｍ）の合成石英ガラス基板１１もしくは図２に示す３インチφ（厚さ０．７ｍｍ）のシリコンウェハ２１を用いた。基板の洗浄は、純水ブラシ洗浄→純水リンス→アルカリ性洗剤超音波洗浄→純水リンス→純水超音波洗浄→純水リンス→窒素ブロー乾燥の順に行い、清浄面を有する基板を用意した。<Example>
Preparation of probe carrier ◎ Substrate cleaning As a base material for the probe carrier, 72 mm square (thickness 0.7 mm) synthetic
◎表面処理
アミノシランカップリング剤（商品名：ＫＢＭ−９０３；信越化学工業（株）社製）を０．１ｗｔ％になるように溶解し、３０分間撹拌してメトキシ基を加水分解させた。この水溶液をスピンコーターにて基材に塗布した後、取り出し、オーブン中１２０℃で１時間ベーク処理を行った。A surface-treated aminosilane coupling agent (trade name: KBM-903; manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) was dissolved to 0.1 wt% and stirred for 30 minutes to hydrolyze the methoxy group. This aqueous solution was applied to a substrate with a spin coater, then taken out and baked in an oven at 120 ° C. for 1 hour.
次いで、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（Ｄｏｊｉｎ社製；以後、ＥＭＣＳと略す）を２．７ｍｇ秤量し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１溶液に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。前記のベーク処理したアミノ基導入基板に該ＥＭＣＳ溶液をスピンコーターにて塗布し、表面にマレイミド基を導入した。 Next, 2.7 mg of N-maleimidocaproyloxysuccinimide (manufactured by Dojin; hereinafter abbreviated as EMCS) is weighed to a final concentration of 0.3 mg / ml in a 1: 1 solution of dimethyl sulfoxide (DMSO) / ethanol. An EMCS solution dissolved as described above was prepared. The EMCS solution was applied to the baked amino group-introduced substrate with a spin coater to introduce maleimide groups on the surface.
◎プローブ担持
メルカプト（ＳＨ）基を導入した合成一本鎖ＤＮＡプローブ断片をグリセリン７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、アセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥ１００；川研ファインケミカル（株）社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液に、０．６ＯＤになるよう溶解させた。該プローブ含有溶液をインクジェット法により、図１および図２に示す通り、前記基板にスポッティングしてプローブ担持アレイ１２（２２）を形成した後、基板を３０分間、恒温恒湿チャンバー内に静置して、基板表面のマレイミド基とＤＮＡプローブ末端のメルカプト基とを反応させた。次いで、１Ｍ−ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）で洗浄し、純水で軽く洗浄した後、窒素ブロー乾燥してプローブ担持担体を得た。◎ Probe support A synthetic single-stranded DNA probe fragment into which a mercapto (SH) group was introduced was glycerin 7.5 wt%, urea 7.5 wt%, thiodiglycol 7.5 wt%, acetylene alcohol (trade name: acetylenol E100; Kawaken) It was dissolved in an aqueous solution containing 1.0 wt% (manufactured by Fine Chemical Co., Ltd.) to 0.6 OD. The probe-containing solution is spotted on the substrate by an inkjet method as shown in FIGS. 1 and 2 to form the probe-carrying array 12 (22), and then the substrate is left in a constant temperature and humidity chamber for 30 minutes. Then, the maleimide group on the substrate surface was reacted with the mercapto group at the end of the DNA probe. Subsequently, it was washed with a 1M NaCl / 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.0), lightly washed with pure water, and then blown with nitrogen to obtain a probe-supporting carrier.
◎プローブ担体の切断・小チップ化
プローブ担持した合成石英ガラス基板１１を接着シートに貼り付け、ダイヤモンド・カッターにてスクライブ・ライン１４を罫書き、破断して、プローブ担持アレイ１２を含む小チップ（例えば、１８ｍｍ角）１３を得た。Cutting of probe carrier / miniaturization of chip A synthetic
プローブ担持したシリコン基板２１を接着シートに貼り付け、ダイシング装置によりライン２４に沿って切断して、プローブ担持アレイ２２を含む小チップ（例えば、１８ｍｍ角）２３を得た。 The
反応チャンバーの作製
●カバー部材は、プローブ担体を載置する手段と反応空間に溶液を蓄え、プローブと溶液とを反応させる反応空間と溶液を注入・排出する開孔を持っているので、反応チャンバーと称させていただきます。●⇒プローブ担体とカバー部材を組合せて（接合して）反応チャンバーの反応空間を形成するので、一律に反応チャンバーとしてしまうと紛らわしいと思います。区別していただきたいと思います。Production of reaction chamber-The cover member stores the solution in the reaction space and means for mounting the probe carrier, and has a reaction space for reacting the probe and the solution and an opening for injecting and discharging the solution. I will call it. ● ⇒ Since the reaction space of the reaction chamber is formed by combining (joining) the probe carrier and the cover member, it would be confusing if the reaction chamber is uniformly formed. I want you to distinguish.
図３は、プローブ担体とカバー部材を示すとともに、それらを接合して形成されてなる反応チャンバー付プローブ担体を示す模式図で、図３（ａ）は、カバー部材を俯瞰した模式的平面図である。カバー部材３２は、外から溶液を反応チャンバー３４に注入あるいは、反応チャンバー３４から溶液を排出する流路となる連通孔３３が形成されている。 FIG. 3 is a schematic diagram showing a probe carrier with a reaction chamber formed by joining the probe carrier and the cover member, and FIG. 3A is a schematic plan view overlooking the cover member. is there. The
図３（ｂ）は、カバー部材３２を載置するプローブ担体１３（２３）を俯瞰した模式的平面図である。プローブ担体１３（２３）を構成する基材上にプローブアレイ１２が形成されている。プローブアレイ１２の拡大図に示すように、基材上にプローブ３１がマトリックス状に担持されている。 FIG. 3B is a schematic plan view overlooking the probe carrier 13 (23) on which the
図３（ｃ）は、プローブ担体１３上に形成されたプローブアレイ１２がカバー部材と接合されて反応チャンバー３４に対向するように載置した状態を示す模式的平面図である。 FIG. 3C is a schematic plan view showing a state in which the
図４（a）は、図３のＡ−Ａ'の断面を示す模式的断面である。カバー部材３２はプローブ担体の嵌合スペース３５を有し、該嵌合スペース３５にプローブ担体を嵌合することにより、反応チャンバー３４が形成される。 FIG. 4A is a schematic cross section showing a cross section taken along line AA ′ of FIG. The
図４（ｂ）は、図３のＢ−Ｂ'の断面を示す模式的断面である。反応チャンバー３４は、連通孔３３を介して反応チャンバー３４の外部と連通している。 FIG. 4B is a schematic cross section showing a cross section taken along line BB ′ of FIG. The reaction chamber 34 communicates with the outside of the reaction chamber 34 through the communication hole 33.
カバー部材３２に設けた１対の連通孔３３により、検体となる溶液を反応チャンバー３４に注入し、反応チャンバー３４から排出される。カバー部材３２は、アクリル樹脂基板を削り出し加工する、あるいは、金型を作製し、射出成型機により、大量に生産することも可能である。 Through a pair of communication holes 33 provided in the
カバー部材３２表面の連通孔３３の開口部の位置は図示しないが規格化されている必要がある。一方、検体の量あるいは検出する検体の種類等の状況にあわせて連通孔３３から検体を反応チャンバー３４に注入および排出が可能な範囲で反応チャンバー３４およびプローブ担体１３の大きさを変えることができる。 Although the position of the opening of the communication hole 33 on the surface of the
この結果、同一のカートリッジを用いて異なる寸法のプローブ担体、および／あるいは、異なる体積の反応空間を持った反応チャンバー３２を、同一形状のカートリッジを用いて検査することができる。 As a result, it is possible to inspect the probe carrier having different dimensions using the same cartridge and / or the
プローブ担体と反応チャンバーとの接着
カバー部材３２の反応チャンバー３４となる空間以外の部分（図４（ａ）のＣ部）に紫外線硬化型樹脂を塗布し、プローブ担体１３もしくは２３をプローブ担体の嵌合スペース３５に嵌合し、貼り合せた後、所定量の紫外線を照射して、硬化・接着して、反応チャンバー付プローブ担体３６が得られる。A portion of the
反応チャンバー付プローブ担体のカートリッジへの取付け
カートリッジの構成は検査システム装置の構成にも依存するが、プローブ担体の大きさが変っても、反応チャンバー付プローブ担体の外形寸法が規格に則ったものであって、カバー部材の連通孔の開口部が決められた位置に形成されているのでカートリッジを変えることなく反応や検査を行うことができる。Mounting the probe carrier with reaction chamber to the cartridge The configuration of the cartridge also depends on the configuration of the inspection system device, but the external dimensions of the probe carrier with reaction chamber conform to the standard even if the size of the probe carrier changes. And since the opening part of the communicating hole of a cover member is formed in the determined position, reaction and a test | inspection can be performed without changing a cartridge.
カートリッジに反応チャンバーを載置した例を図５に示す。 An example in which the reaction chamber is mounted on the cartridge is shown in FIG.
図５（Ａ）は、反応チャンバー付プローブ担体をカートリッジに１つ設置するタイプである。図５（Ｂ）は反応チャンバー付きプローブ担体をカートリッジに４つ設置するタイプである。それぞれ反応チャンバー付プローブ担体の固定機構および開口４２があり、カートリッジにプローブ担体を設置した状態で、検査システム装置内での加熱処理が可能である。またカートリッジの開口部が、検出のためのウィンドウ（窓）としても機能する。更に、カートリッジ図面には示していないが、カートリッジ状態での検査システム装置内の移動や検出のためのガイドをカートリッジに設けることも可能である。もちろん、カートリッジ導入した後に検査システム装置内で、プローブ担体３６が分離して処理されるように装置構成してもよい。 FIG. 5A shows a type in which one probe carrier with a reaction chamber is installed in a cartridge. FIG. 5B shows a type in which four probe carriers with reaction chambers are installed in a cartridge. Each has a fixing mechanism for the probe carrier with a reaction chamber and an
１１ 角型基板
１２ プローブアレイ
１３ 規格化された大きさのプローブ担体
１４ 切断ライン、
２１ 丸型ウェハ
２３ 規格化された大きさのプローブ担体、２４ 切断ライン、
３１ 基板に付与したプローブ
３２ カバー部材
３３ ポート孔
３４ 反応チャンバー
３５ プローブ担体の嵌合スペース
３６ 反応チャンバー付与プローブ担体
４１ 反応チャンバー付与プローブ担体１つを嵌合するカートリッジ
４２ ウィンドウ（窓）
４３ 反応チャンバー付与プローブ担体４つを嵌合するカートリッジ
11
21
31 Probe provided to
43 Cartridge for fitting four reaction chamber imparting probe carriers
Claims (10)
Translated fromJapanese前記カートリッジは、前記反応チャンバーに前記溶液を注入する第１の注入口と、前記チャンバーから排出される前記溶液を受ける第１の排出口と、前記プローブ担体が載置された前記反応チャンバーを載置する載置部とを有し、
注入口と排出口を有する前記反応チャンバーは、前記プローブ担体に載置することにより、前記溶液と前記プローブ担体に担持されたプローブとを反応させる反応空間を構成し、
前記第１の注入口および前記第１の排出口とが接続されていることを特徴とする生化学反応カートリッジ。At least in a biochemically processed specimen in which a cartridge containing at least a solution for biochemical treatment of a specimen or a cartridge for supplying a solution and a probe carrier carrying a probe for detecting a target substance in the specimen are mounted A biochemical reaction cartridge fitted with a reaction chamber for performing a target substance detection reaction of
The cartridge has a first inlet for injecting the solution into the reaction chamber, a first outlet for receiving the solution discharged from the chamber, and the reaction chamber on which the probe carrier is mounted. And a placement part to be placed,
The reaction chamber having an inlet and an outlet constitutes a reaction space for reacting the solution and the probe carried on the probe carrier by placing the reaction chamber on the probe carrier,
The biochemical reaction cartridge, wherein the first inlet and the first outlet are connected.
（ｉｉ）検体中の標的物質を検出するプローブが配置されている領域を有しているプローブ担体と、該プローブ担体と共に該領域を内包する反応チャンバーを構成するカバー部材とによって構成されている反応チャンバー付プローブ担体とを嵌合させた生化学反応カートリッジであって、
前記カートリッジは、前記反応チャンバーに前記溶液を注入する第１の注入口と、前記チャンバーから排出される前記溶液を受ける第１の排出口と、前記反応チャンバー付プローブ担体を載置する載置部とを有し、
前記カバー部材は、該反応チャンバーと外部との液体の授受を行う少なくとも２つの連通孔を備え、
前記第１の注入口および前記第１の排出口との各々は、前記カバー部材の２つの連通孔の開口部の各々と接続されていることを特徴とする生化学反応カートリッジ。(I) a cartridge containing at least a solution for biochemical treatment of a specimen or a cartridge for supplying the solution;
(Ii) Reaction constituted by a probe carrier having a region in which a probe for detecting a target substance in a specimen is arranged, and a cover member constituting a reaction chamber containing the region together with the probe carrier. A biochemical reaction cartridge in which a probe carrier with a chamber is fitted,
The cartridge includes a first inlet for injecting the solution into the reaction chamber, a first outlet for receiving the solution discharged from the chamber, and a mounting portion for mounting the probe carrier with the reaction chamber. And
The cover member includes at least two communication holes for exchanging liquid between the reaction chamber and the outside.
Each of the said 1st injection port and the said 1st discharge port is connected with each of the opening part of the two communicating holes of the said cover member, The biochemical reaction cartridge characterized by the above-mentioned.
前記プローブ担体の嵌合スペースと、該嵌合スペースに前記プローブ担体を嵌合することによって前記領域を内包する反応チャンバーを構成する空間と、を具備し、
更に、前記嵌合スペースへの前記プロ−ブ担体の嵌合によって形成される反応チャンバーへの液体の授受のための連通孔を具備していることを特徴とするカバー部材。A cover member used together with a probe carrier having a region in which a probe for detecting a target substance in a specimen is arranged,
A fitting space for the probe carrier; and a space constituting a reaction chamber that encloses the region by fitting the probe carrier in the fitting space;
The cover member further comprises a communication hole for transferring liquid to the reaction chamber formed by fitting the probe carrier into the fitting space.
（ｉ）検体中の標的物質を検出するプローブが配置されている領域を有しているプローブ担体と、
（ｉｉ）請求項９に記載のカバー部材とを含み、
前記プローブ担体が、前記カバー部材の嵌合スペースに嵌合し、前記プローブ担体と前記カバー部材とで反応チャンバーが構成されていることを特徴とする反応チャンバー付プロ−ブ担体。A probe carrier with a reaction chamber,
(I) a probe carrier having a region where a probe for detecting a target substance in a specimen is disposed;
(Ii) including the cover member according to claim 9,
A probe carrier with a reaction chamber, wherein the probe carrier is fitted into a fitting space of the cover member, and a reaction chamber is constituted by the probe carrier and the cover member.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005353369AJP2007155585A (en) | 2005-12-07 | 2005-12-07 | Probe cartridge with biochemical reaction cartridge, cover member and reaction chamber |
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| JP2007155585Atrue JP2007155585A (en) | 2007-06-21 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009250698A (en)* | 2008-04-03 | 2009-10-29 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | Plastic substrate for microarray |
| EP4187230A1 (en)* | 2021-11-26 | 2023-05-31 | ICHORtec GmbH | Sensor vessel for the optical detection of biomarkers |
- 2005
- 2005-12-07JPJP2005353369Apatent/JP2007155585A/enactivePending
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| EP4187230A1 (en)* | 2021-11-26 | 2023-05-31 | ICHORtec GmbH | Sensor vessel for the optical detection of biomarkers |
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