本発明は、磁気スポットアレイチップを用いる抗原特異的リンパ球などの生体細胞の回収方法に関する。特に、本発明の方法は、末梢血など血液試料から、Bリンパ球を精製操作などすることなく、磁気スポットアレイチップの各スポットに固定化し、スポットに固定した細胞の中から、所望の細胞を回収する方法に関する。 The present invention relates to a method for recovering biological cells such as antigen-specific lymphocytes using a magnetic spot array chip. In particular, in the method of the present invention, from a blood sample such as peripheral blood, B lymphocytes are immobilized on each spot of a magnetic spot array chip without performing purification operation, and desired cells are selected from the cells immobilized on the spots. It relates to the method of recovery.
従来、抗原特異的リンパ球は、例えば、96穴プレートを用いて、1穴あたり約200,000個のリンパ球を加えて3日から1週間、抗原の存在下で培養することにより検出していた（非特許文献1および2）。この方法では、約200,000個というリンパ球集団の中に抗原特異的リンパ球が存在することは確認出来た。しかし、リンパ球集団中に存在する個々の抗原特異的リンパ球を同定することは出来なかった。 Conventionally, antigen-specific lymphocytes were detected by, for example, using a 96-well plate and adding about 200,000 lymphocytes per well and culturing in the presence of the antigen for 3 days to 1 week ( Non-patent documents 1 and 2). In this method, it was confirmed that antigen-specific lymphocytes were present in a population of about 200,000 lymphocytes. However, it was not possible to identify individual antigen-specific lymphocytes present in the lymphocyte population.
これに対して近年、蛍光色素で標識した抗原分子をリンパ球と混ぜ合わせることにより、抗原特異的リンパ球の抗原受容体に蛍光標識抗原を結合させ、蛍光標識抗原を結合したリンパ球を、フローサイトメータを用いることにより検出する方法が開発され利用されている（非特許文献３）。この方法では抗原に結合する１個のリンパ球を同定することが可能である。さらに抗原に結合する１個のリンパ球を分取することも可能である。 On the other hand, in recent years, antigen molecules labeled with a fluorescent dye are mixed with lymphocytes to bind the antigen-specific lymphocytes to the antigen receptor of the antigen-specific lymphocytes, and the lymphocytes bound to the fluorescence-labeled antigens are flowed. A method of detecting by using a cytometer has been developed and used (Non-Patent Document 3). This method makes it possible to identify a single lymphocyte that binds to an antigen. It is also possible to sort out one lymphocyte that binds to the antigen.
しかしながら、上記検出方法では、分取するためにはセルソーターという高価で複雑な機器が必要である上に、以下の問題もある。
（１）分取するための機器の条件設定が難しく、細胞を分取させるためには機器操作の熟練を要する。
（２）バックグラウンドが高いため抗原特異的リンパ球の頻度が0.1 %以下の場合は抗原特異的リンパ球を検出出来ない。
（３）細胞を分取する効率は低い。
（４）頻度の低い細胞を分取するには時間がかかる。
（５）抗原が結合することは確認出来るが、抗原が結合したリンパ球の反応を解析することは難しい。However, the above-described detection method requires an expensive and complicated device such as a cell sorter for sorting, and also has the following problems.
(1) It is difficult to set the conditions of the instrument for sorting, and skill in instrument operation is required to sort the cells.
(2) Since the background is high, antigen-specific lymphocytes cannot be detected when the frequency of antigen-specific lymphocytes is 0.1% or less.
(3) The efficiency of sorting cells is low.
(4) It takes time to sort out infrequent cells.
(5) Although it can be confirmed that the antigen is bound, it is difficult to analyze the reaction of the lymphocyte bound with the antigen.
別の抗原特異的リンパ球検出方法として、磁気ビーズに結合した抗原分子をリンパ球と混ぜ合わせることにより、抗原特異的リンパ球の抗原受容体に磁気ビーズ結合抗原を結合させ、磁石を用いて抗原特異的リンパ球を分取する方法も開発されている（非特許文献４）。
この方法では、複雑な装置は必要とせず、細胞の分取の時間は短時間であり、抗原が結合することも確認出来る。しかし、抗原が結合したリンパ球が抗原に反応（細胞内シグナル伝達、RNA合成、タンパク質合成などの細胞の代謝生理反応）するかを分析することは出来なかった。また、抗原特異的リンパ球の頻度が0.1 %以下の場合は抗原特異的リンパ球を検出出来なかった。As another antigen-specific lymphocyte detection method, magnetic beads-bound antigen is bound to the antigen receptor of antigen-specific lymphocytes by mixing antigen molecules bound to magnetic beads with lymphocytes, and the antigen is then detected using a magnet. A method for sorting specific lymphocytes has also been developed (Non-patent Document 4).
In this method, a complicated apparatus is not required, the cell sorting time is short, and it can be confirmed that the antigen is bound. However, it was not possible to analyze whether the lymphocytes to which the antigen was bound responded to the antigen (intracellular signal transduction, RNA synthesis, protein synthesis, etc.). In addition, when the frequency of antigen-specific lymphocytes was 0.1% or less, antigen-specific lymphocytes could not be detected.
それらに対し、本発明者らはすでに、複雑な装置は必要とせず、細胞の分取の時間は短時間であり、抗原が結合することも確認出来、頻度の低い抗原特異的リンパ球(0.001%以上)も検出でき、抗原が結合したリンパ球が抗原に反応するかを解析することが出来、しかも抗原特異的リンパ球を分取出来る抗原特異的リンパ球検出法として、１つ１つのリンパ球の抗原特異性を個別に検出し、さらに検出された抗原特異的リンパ球を回収出来るマイクロウェルアレイチップを開発した（特許出願中）。 On the other hand, the present inventors already do not require a complicated device, the cell sorting time is short, it can be confirmed that the antigen is bound, antigen-specific lymphocytes (0.001 less frequently) As a method for detecting antigen-specific lymphocytes, it is possible to analyze whether antigen-bound lymphocytes react with the antigen, and to collect antigen-specific lymphocytes. A microwell array chip was developed (patent pending) that can individually detect the antigen specificity of spheres and recover the detected antigen-specific lymphocytes.
しかしながら、上記マイクロウェルアレイチップでは、ウェルへの細胞の効率よい注入には技術的に問題があること、及びウェルに格納したリンパ球を回収する際、細胞がウェルの側壁に付着して回収が困難になる場合があり、チップの材料や形状に検討を加える必要が出てきている。 However, in the above microwell array chip, there is a technical problem in the efficient injection of cells into the well, and when collecting the lymphocytes stored in the well, the cells adhere to the side wall of the well and cannot be recovered. It may be difficult, and it is necessary to consider the material and shape of the chip.
また、ウェルへ注入するために用いる細胞(リンパ球)の生体試料からの単離にも、従来は非常に手間がかかっている。そこで、生体試料からの単離操作を行うことなくリンパ球を固定し、１つ１つのリンパ球の抗原特異性を個別に検出し、さらに検出された抗原特異リンパ球を回収する方法の出現が望まれている。
そこで本発明の目的は、生体試料から、そこに含まれる個々細胞を生体試料から分離することなしにチップに固定し、１つ１つの細胞を個別に検出し、さらに検出された細胞を1つ単位で回収できる方法を提供することにある。 Therefore, an object of the present invention is to fix individual cells contained in a biological sample to a chip without separating them from the biological sample, detect each individual cell, and further detect one detected cell. It is to provide a method that can be recovered in units.
上記課題を解決するための発明は以下の通りである。
［請求項1］
基板の少なくとも一方の主表面に複数の磁性体からなるスポットを有するスポットアレイチップの前記スポットを磁化し、
前記スポットを有するスポットアレイチップの表面に、磁気修飾した細胞を含む生体試料を置いて、前記スポットに前記磁気修飾した細胞を付着させ、
スポットアレイチップの表面を洗浄して付着しなかった生体試料を除去し、
前記スポットに付着させた磁気修飾した細胞を、吸引することで、または前記スポットを消磁することで、回収する
ことを含む細胞の回収方法。
[請求項2]
磁気修飾した細胞を含む生体試料が、回収したい細胞に特異的な抗体を結合させた磁気ビーズを、細胞を含む生体試料と混合して、磁気ビーズを修飾した細胞を形成することで得る請求項1に記載の方法。
[請求項3]
回収したい細胞がリンパ球であり、細胞を含む生体試料が末梢血であり、リンパ球に特異的な抗体を結合させた磁気ビーズを、末梢血を含む試料と混合して、磁気ビーズを修飾したリンパ球を形成し、リンパ球を末梢血に含まれる他の細胞から回収する請求項1に記載の方法。
[請求項4]
前記スポットは、１つのスポットに１つの磁気修飾した細胞が付着する形状および寸法を有する請求項1〜3のいずれか１項に記載の方法。
[請求項5]
前記スポットに付着させた磁気修飾した細胞の回収を、特定のスポットを消磁することで、特定の細胞を選択的に回収する請求項1〜4のいずれか１項に記載の方法。
[請求項6]
細胞が特定の抗原で刺激されたBリンパ球であり、前記特定の抗原に特異的なBリンパ球を回収する請求項5に記載の方法。Inventions for solving the above problems are as follows.
[Claim 1]
Magnetizing the spot of the spot array chip having a spot made of a plurality of magnetic bodies on at least one main surface of the substrate;
A biological sample containing magnetically modified cells is placed on the surface of the spot array chip having the spots, and the magnetically modified cells are attached to the spots,
Clean the surface of the spot array chip to remove the biological sample that did not adhere,
A method for recovering cells, comprising collecting the magnetically modified cells attached to the spots by sucking or demagnetizing the spots.
[Claim 2]
A biological sample containing magnetically modified cells is obtained by mixing magnetic beads with antibodies specific for the cells to be collected mixed with biological samples containing cells to form cells modified with magnetic beads. The method according to 1.
[Claim 3]
The cells to be collected are lymphocytes, the biological sample containing the cells is peripheral blood, and magnetic beads to which antibodies specific for lymphocytes are bound are mixed with the sample containing peripheral blood to modify the magnetic beads. 2. The method according to claim 1, wherein lymphocytes are formed and the lymphocytes are recovered from other cells contained in peripheral blood.
[Claim 4]
The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the spot has a shape and a size in which one magnetically modified cell is attached to one spot.
[Claim 5]
5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein specific cells are selectively recovered by demagnetizing specific spots of the magnetically modified cells attached to the spots.
[Claim 6]
6. The method according to claim 5, wherein the cell is a B lymphocyte stimulated with a specific antigen, and the B lymphocyte specific for the specific antigen is recovered.
本発明によれば、磁気スポットアレイチップを用い、かつ生体試料に含まれる細胞を磁気修飾して、生体試料に含まれる個々の細胞を生体試料から分離することなしに磁気スポットアレイチップの各スポットに固定し、固定した１つ１つの細胞を個別に検出し、さらに検出された細胞を1つ単位で回収できる方法を提供することができる。 According to the present invention, each spot of a magnetic spot array chip is used without magnetic separation of cells contained in a biological sample by using a magnetic spot array chip and separating individual cells contained in the biological sample from the biological sample. It is possible to provide a method in which each of the fixed cells is individually detected and the detected cells can be recovered in units.
その結果、例えば、検出され取り出された抗原特異的リンパ球から、抗原特異的抗体遺伝子やT細胞受容体遺伝子をクローニングすることも可能になる。さらに、例えば、抗原特異的抗体遺伝子がクローニング出来ると、それを用いて大量にヒト型モノクローナル抗体を生産することが出来る。この抗体を感染症などの患者に投与することにより、感染症などの治療、予防に用いることが出来ると考えられる。 As a result, for example, an antigen-specific antibody gene or a T cell receptor gene can be cloned from the antigen-specific lymphocyte detected and removed. Furthermore, for example, if an antigen-specific antibody gene can be cloned, it is possible to produce human monoclonal antibodies in large quantities using the gene. It is considered that this antibody can be used for treatment and prevention of infectious diseases by administering it to patients with infectious diseases.
［スポットアレイチップ］
本発明の方法に用いるスポットアレイチップは、基板の少なくとも一方の主表面に複数の磁性体からなるスポットを有する。後述するように、各スポットに磁気ビーズ修飾した１個の被検体生体細胞を磁力により固定する。そのため、前記スポットは、１つのスポットに１個の生体細胞のみが固定される形状及び寸法を有する。[Spot array chip]
The spot array chip used in the method of the present invention has spots made of a plurality of magnetic bodies on at least one main surface of the substrate. As will be described later, one subject biological cell whose magnetic beads are modified at each spot is fixed by a magnetic force. Therefore, the spot has a shape and size in which only one living cell is fixed to one spot.
スポットの形状や寸法には特に制限はないが、スポットの形状は、例えば円形であることが出来、円形以外に、複数の辺により構成される多角形（例えば長方形、六角形、八角形等）、楕円形などであることも出来、これらの形状の二つ以上を組み合わせた形状であることも出来る。例えば、一部が円形であり、残りが方形であることが出来る。スポットの表面は通常、平坦であるが、曲面（凸面や凹面）とすることも出来る。 The shape and size of the spot are not particularly limited, but the shape of the spot can be, for example, a circle. In addition to a circle, a polygon composed of a plurality of sides (for example, a rectangle, a hexagon, an octagon, etc.) The shape may be an ellipse or the like, or may be a combination of two or more of these shapes. For example, some can be circular and the rest can be square. The surface of the spot is usually flat, but can also be a curved surface (convex surface or concave surface).
スポットの形状や寸法は、スポットに固定されるべき細胞の種類（細胞の形状や寸法など）を考慮して、１つのスポットに１つの細胞が固定(付着)され、回収出来るように適宜決定される。
１つのスポットに１つの細胞が固定され、回収されるようにするためには、例えば、スポットの形状に内接する最大円の直径が、スポットに固定させようとする細胞の直径に対して0.1〜1.5倍の範囲、好ましくは0.2〜1.0倍の範囲、より好ましくは0.3〜0.8倍の範囲であることが適当である。
また、スポットの厚さ(高さ)は、スポットに固定しようとする細胞の直径に対して0.5 倍以下の範囲、好ましくは0.2倍の以下の範囲であることが適当である。The shape and dimensions of the spot are appropriately determined so that one cell can be fixed (attached) to one spot and collected in consideration of the type of cells (cell shape and dimensions, etc.) to be fixed to the spot. The
In order to allow one cell to be fixed and collected in one spot, for example, the diameter of the largest circle inscribed in the shape of the spot is 0.1 to the diameter of the cell to be fixed to the spot. The range is 1.5 times, preferably 0.2 to 1.0 times, more preferably 0.3 to 0.8 times.
In addition, the thickness (height) of the spot is suitably in the range of 0.5 times or less, preferably 0.2 times or less the diameter of the cells to be fixed to the spot.
スポットが円形の場合、その寸法は、例えば、直径1〜100 μmであることが出来、細胞がBリンパ球の場合、好ましくは、直径1〜8 μm である。また、厚さは、例えば、0.1〜4μmであることが出来る。但し、スポットの寸法は、上述のように、スポットに固定し、回収しようとする生体細胞の直径とのスポットの寸法に対する好適な比を考慮して適宜決定する。 If the spot is circular, its dimensions can be, for example, 1-100 μm in diameter, and preferably 1-8 μm in diameter when the cells are B lymphocytes. The thickness can be, for example, 0.1 to 4 μm. However, as described above, the size of the spot is appropriately determined in consideration of a suitable ratio of the diameter of the living cell to be collected to the spot size with respect to the spot size.
１つのスポットアレイチップが有するスポットの数は、特に制限はないが、生体細胞がリンパ球の場合、抗原特異的リンパ球の頻度が100,000個に１個から多い場合には約500個であるという観点から、1 cm2あたり、例えば2,000〜1,000,000個の範囲であることが出来る。The number of spots that one spot array chip has is not particularly limited, but when the living cells are lymphocytes, the number of antigen-specific lymphocytes is about 500 when the frequency of antigen-specific lymphocytes is more than 1 in 100,000. From the viewpoint, it can be in the range of, for example, 2,000 to 1,000,000 per cm2 .
スポットの材料は、磁気ビーズ修飾した細胞を固定し、回収するため、例えば、ニッケルや酸化鉄などの金属、合金、及び酸化物等の単層膜、あるいはそれらを複数組み合わせた多層膜等を挙げることができる。 Examples of the material of the spot include a single-layer film such as a metal such as nickel or iron oxide, an alloy, and an oxide, or a multilayer film obtained by combining a plurality of them in order to fix and recover magnetic beads-modified cells. be able to.
図1は、本発明に用いるスポットアレイチップの実施形態例である。パイレックス基板1a上にパターニングされた磁性体薄膜1bを磁化させ、磁気ビーズ1cで修飾した生体細胞1dを磁力によって固定することが出来、必要に応じて生体細胞を回収することが出来る。 FIG. 1 shows an embodiment of a spot array chip used in the present invention. The magnetic thin film 1b patterned on the Pyrex substrate 1a can be magnetized, and the living cells 1d modified with the magnetic beads 1c can be fixed by magnetic force, and the living cells can be collected as necessary.
[細胞の回収方法]
まず、スポットアレイチップの各スポットを磁化する。
スポットの磁化は、以下のように行うことができる。永久磁石や電磁石によってチップに配列されたスポットに磁界を加える。このとき、磁力線は、スポットに収束していくのでスポット上の磁力は、スポットの無いところに比較して大きくなる。また、保持力の大きなスポット材料を選択することで、磁界を取り除いても磁力は保持される。スポットに加える磁界は、スポットに対して垂直でも水平でもかまわない。スポット上に細胞を固定するためには、垂直磁界によって磁化することが好ましい。[Cell recovery method]
First, each spot of the spot array chip is magnetized.
The magnetization of the spot can be performed as follows. A magnetic field is applied to the spots arranged on the chip by permanent magnets or electromagnets. At this time, the magnetic lines of force converge on the spot, so that the magnetic force on the spot becomes larger than that where there is no spot. Further, by selecting a spot material having a large coercive force, the magnetic force is retained even if the magnetic field is removed. The magnetic field applied to the spot may be perpendicular or horizontal to the spot. In order to fix a cell on a spot, it is preferable to magnetize by a perpendicular magnetic field.
永久磁石としては、例えば、KS鋼、フェライト、ネオジム・鉄・ボロン、アルニコ、サマリウム・コバルト、プラセオジム等が挙げられる。
また、スポットを選択的に磁化することも可能である。例えば、スポットチップ全体に、一定の磁界をかけて磁化しておき、レーザー光をあてた部分だけを消磁して行くことによって、任意位置のスポットを磁化させることができる。Examples of the permanent magnet include KS steel, ferrite, neodymium / iron / boron, alnico, samarium / cobalt, and praseodymium.
It is also possible to selectively magnetize the spot. For example, a spot at an arbitrary position can be magnetized by magnetizing the entire spot chip by applying a constant magnetic field and demagnetizing only the portion to which the laser light is applied.
次いで、磁化したスポットを有するスポットアレイチップの表面に、磁気修飾した細胞を含む生体試料を置く。
磁気修飾した細胞を含む生体試料は、例えば、回収したい細胞に特異的な抗体を結合させた磁気ビーズを、細胞を含む試料と混合して、磁気ビーズを修飾した細胞を形成することで得ることができる。Next, a biological sample containing magnetically modified cells is placed on the surface of a spot array chip having magnetized spots.
A biological sample containing magnetically modified cells can be obtained, for example, by mixing magnetic beads with antibodies specific to the cells to be recovered and mixing the samples containing cells to form cells with modified magnetic beads. Can do.
より具体的には、回収したい細胞がBリンパ球であり、細胞を含む生体試料が末梢血であり、Bリンパ球特異的な抗体を結合させた磁気ビーズを、末梢血を含む試料と混合して、磁気ビーズを修飾したBリンパ球を形成することで、磁気修飾した細胞を含む生体試料を調製することができる。この方法によれば、Bリンパ球を末梢血から分離することなしに、末梢血に含まれる他の細胞から回収することができる。
Bリンパ球特異的な抗体を結合させた磁気ビーズとしては、例えば、フナコシ（株）抗CD20抗体標識磁気ビーズ（米国、Clemente Associates社製）、ダイナル社（ノルウェイ）抗CD19抗体標識磁気ビーズなどを挙げることができる。More specifically, the cells to be collected are B lymphocytes, the biological sample containing the cells is peripheral blood, and magnetic beads bound with antibodies specific to B lymphocytes are mixed with the sample containing peripheral blood. Thus, a biological sample containing magnetically modified cells can be prepared by forming B lymphocytes modified with magnetic beads. According to this method, B lymphocytes can be recovered from other cells contained in the peripheral blood without being separated from the peripheral blood.
Examples of magnetic beads to which antibodies specific to B lymphocytes are bound include Funakoshi Co., Ltd., anti-CD20 antibody-labeled magnetic beads (Clemente Associates, USA), Dynal (Norway) anti-CD19 antibody-labeled magnetic beads, etc. Can be mentioned.
生体試料は、上述のように、血液(末梢血)であることができ、細胞は、Ｂリンパ球以外に、Ｔリンパ球であることもできる。細胞は、それ以外に扁桃腺(リンパ節)、脾臓等のリンパ組織由来リンパ球、がん浸潤リンパ球などの病変部位浸潤リンパ球等を挙げることができ、各リンパ球は各組織を生体試料として得られる。 As described above, the biological sample can be blood (peripheral blood), and the cells can be T lymphocytes in addition to B lymphocytes. Examples of cells include tonsils (lymph nodes), lymphoid tissue-derived lymphocytes such as spleen, and lesion-site infiltrating lymphocytes such as cancer-infiltrating lymphocytes. As obtained.
磁気修飾した細胞を含む生体試料を置くことで、磁化したスポットに磁気修飾した細胞を付着させる。次いで、スポットアレイチップの表面を洗浄して付着しなかった生体試料を除去する。例えば、洗浄水により生体試料を除去し、スポットに細胞が付着したスポットアレイチップを得る。洗浄水は例えば、Phosphate buffered saline (PBS)、RPMI1640、含血清PBS、含血清RPMI1640等であることができる。また、洗浄方法は、例えば、以下の方法であることができる。
1) チップ表面の液をピペットを用いて除去する。
2) 洗浄液をピペットを用いてチップに添加する。
3) １)および２)を繰り返す。By placing a biological sample containing magnetically modified cells, the magnetically modified cells are attached to the magnetized spot. Next, the surface of the spot array chip is washed to remove the biological sample that has not adhered. For example, a biological sample is removed with washing water to obtain a spot array chip with cells attached to the spots. The washing water can be, for example, Phosphate buffered saline (PBS), RPMI1640, serum-containing PBS, serum-containing RPMI1640, and the like. Moreover, the washing | cleaning method can be the following methods, for example.
1) Use a pipette to remove the tip surface liquid.
2) Add the cleaning solution to the tip using a pipette.
3) Repeat 1) and 2).
次いで、スポットに付着させた細胞を、そのままの状態、或いはスポットを消磁することで、回収することができる。スポットの消磁は、例えば、以下の様に行うことができる。
チップを一様に加熱あるいは交流磁界に挿入することで消磁が可能である。しかしこの際は、すべてのスポットが消磁される。
また磁化されたスポットは、選択的に消磁することが可能である。その方法として、キューリー点以上に加熱することによって消磁する加熱法、交流磁界によって消磁をおこなう減磁界法が挙げられる。前者は、レーザー加熱法等により実現でき、後者は消磁コイルなどにより実現可能である。Next, the cells attached to the spots can be recovered as they are or by demagnetizing the spots. The demagnetization of the spot can be performed as follows, for example.
Demagnetization is possible by uniformly heating the chip or inserting it into an alternating magnetic field. However, at this time, all spots are demagnetized.
The magnetized spot can be selectively demagnetized. Examples of the method include a heating method in which demagnetization is performed by heating above the Curie point, and a demagnetization method in which demagnetization is performed by an alternating magnetic field. The former can be realized by a laser heating method or the like, and the latter can be realized by a demagnetizing coil or the like.
さらに、本発明では、スポットに付着させた細胞の回収を、特定のスポットを消磁することで、特定の細胞を選択的に回収することができる。
この場合、スポットに細胞を付着させた後、例えば、細胞がBリンパ球の場合、スポットアレイチップに特定の抗原を含む溶液を散布して、Bリンパ球を抗原の存在下で培養して刺激し、この抗原に特異的に反応するBリンパ球を検出し、この抗原特異的Bリンパ球を選択的に回収することができる。Furthermore, in the present invention, specific cells can be selectively recovered by degaussing the specific spots of the cells attached to the spots.
In this case, after attaching the cells to the spot, for example, when the cells are B lymphocytes, a solution containing a specific antigen is sprayed on the spot array chip, and the B lymphocytes are cultured in the presence of the antigen to stimulate. Then, B lymphocytes that react specifically with the antigen can be detected, and the antigen-specific B lymphocytes can be selectively recovered.
利用される抗原には、特に制限はないが、例えば、タンパク質、ペプチド、DNA、RNA、脂質、糖鎖、または有機高分子化合物(例えば、環境ホルモン)等であることができる。あるいは、細菌、ウィルス、自己抗原、がん抗原またはアレルゲン等であることができる。 The antigen to be used is not particularly limited, and can be, for example, a protein, peptide, DNA, RNA, lipid, sugar chain, organic polymer compound (for example, environmental hormone), or the like. Alternatively, it can be a bacterium, virus, autoantigen, cancer antigen or allergen.
細胞の培養は、例えば、スポットアレイチップの表面を培養液で覆い、室温あるいは37℃にて、空気中あるいはCO2インキュベータ内にて培養することで行うことができる。The cells can be cultured, for example, by covering the surface of the spot array chip with a culture solution and culturing at room temperature or 37 ° C. in air or in a CO2 incubator.
抗原に反応する細胞の検出は、例えば、(1)Ｃａイオン依存性蛍光色素を用いて行う、(2)抗原により刺激され活性化した被検体リンパ球細胞の表面に発現する活性化マーカータンパク質を指標として行う、(3)被検体リンパ球細胞内蛍光物質が発する蛍光の偏光度を指標として行うことができる。 For example, (1) a Ca ion-dependent fluorescent dye is used to detect cells that react with an antigen. (2) An activation marker protein expressed on the surface of a subject lymphocyte cell stimulated and activated by an antigen is used. (3) The degree of polarization of fluorescence emitted by the fluorescent substance in the subject lymphocyte can be used as an index.
より具体的には、例えば、Bリンパ球の抗原受容体（免疫グロブリン）に抗原が結合すると細胞内シグナル伝達が起こる。従って、細胞内シグナル伝達を種々の方法により検知することにより、抗原に反応する細胞を検出することができる。あるいは、例えば、Tリンパ球の抗原受容体に抗原が結合すると細胞内シグナル伝達が起こる。従って、細胞内シグナル伝達を種々の方法により検知することにより、抗原に反応する細胞を検出することができる。 More specifically, for example, intracellular signaling occurs when an antigen binds to an antigen receptor (immunoglobulin) of B lymphocytes. Therefore, cells that react with antigens can be detected by detecting intracellular signal transduction by various methods. Alternatively, for example, intracellular signaling occurs when an antigen binds to an antigen receptor of T lymphocytes. Therefore, cells that react with antigens can be detected by detecting intracellular signal transduction by various methods.
細胞内シグナル伝達を検出することによる、抗原に反応する細胞の検出は、例えば、細胞内Caイオンの濃度変化をCaイオン依存性の蛍光色素を用いることにより行うことができる。
細胞内Caイオン濃度変化は、蛍光色素としてFura-2、Fluo-3あるいは Fluo-4を用い、検出装置として蛍光顕微鏡あるいはマイクロアレイスキャナーを用いる。Detection of a cell that reacts with an antigen by detecting intracellular signal transduction can be performed, for example, by changing the concentration of intracellular Ca ions by using a Ca ion-dependent fluorescent dye.
For intracellular Ca ion concentration change, Fura-2, Fluo-3 or Fluo-4 is used as a fluorescent dye, and a fluorescence microscope or a microarray scanner is used as a detection device.
具体的には、Bリンパ球にCaイオン依存性蛍光色素であるFluo-3を導入する。次いで抗原でBリンパ球を刺激すると、Bリンパ球内Caイオン濃度が上昇する。その結果、CaイオンがCaイオン依存性蛍光色素に結合し、蛍光強度が増強される。Caイオン濃度が低いと青っぽい色、高いと赤っぽい色で示されている。この方法では、抗原で刺激されることにより細胞内Caイオンが上昇したBリンパ球（抗原特異的）を、スポットアレイチップを用いて検出できる。 Specifically, Fluo-3, which is a Ca ion-dependent fluorescent dye, is introduced into B lymphocytes. Next, when B lymphocytes are stimulated with an antigen, the Ca ion concentration in the B lymphocytes increases. As a result, Ca ions bind to the Ca ion-dependent fluorescent dye, and the fluorescence intensity is enhanced. A low Ca ion concentration indicates a bluish color, and a high Ca ion concentration indicates a reddish color. In this method, B lymphocytes (antigen-specific) in which intracellular Ca ions are increased by stimulation with an antigen can be detected using a spot array chip.
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例１
（フォトリソグラフィ技術を利用した例）
基板、例えばガラス基板上に堆積したニッケル薄膜を半導体作製工程技術であるフォトリソグラフィ技術を利用してスポットアレイチップを作製する方法を図２に示す。
（１）ガラス基板2aを用意する。
（２）基板2a上に、例えば、磁性材料の一つであるニッケル材料を真空蒸着法あるいはスパッタリング法などによって堆積し、膜厚約100nmのニッケル薄膜2bを作製する。
（３）この表面上に、例えば東京応化工業（株）o−ナフトキノンジアジド−ノボラック系ポジ型フォトレジストOFPR-800 2cを塗布する。
（４）紫外線露光などによって直径10ミクロンのフォトレジストパターン2cを形成する。
（５）ニッケル・エッチャントである硝酸第２アンモニウムなどによって、ニッケル薄膜2bが露出した部分を選択的にエッチングする。
（６）レジスト剥離液などによってフォトレジスト2cを除去することによって、スポットアレイチップが完成する。Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.
Example 1
(Example using photolithography technology)
FIG. 2 shows a method for producing a spot array chip using a nickel thin film deposited on a substrate, for example, a glass substrate, using a photolithography technique which is a semiconductor production process technique.
(1) A glass substrate 2a is prepared.
(2) For example, a nickel material, which is one of magnetic materials, is deposited on the substrate 2a by a vacuum evaporation method or a sputtering method to produce a nickel thin film 2b having a thickness of about 100 nm.
(3) On this surface, for example, Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd. o-naphthoquinonediazide-novolak positive photoresist OFPR-800 2c is applied.
(4) A photoresist pattern 2c having a diameter of 10 microns is formed by ultraviolet exposure or the like.
(5) The portion where the nickel thin film 2b is exposed is selectively etched by using a nickel etchant such as diammonium nitrate.
(6) The spot array chip is completed by removing the photoresist 2c with a resist stripping solution or the like.
実施例２
（マスク蒸着法を利用した例）
基板、例えばガラス基板上にマスク蒸着法によってスポットアレイを作製する方法を図３に示す。
（１）ガラス基板3aを用意する。
（２）ガラス基板3a表面にスポット状の微細穴の開いたマスク3bを密着させ、薄膜作製装置にセッティングする。
（３）マスク3b付基板3a上に、例えば、磁性材料の一つであるニッケル材料を真空蒸着法あるいはスパッタリング法などによって堆積し、膜厚約100nmのニッケル薄膜3cを作製する。
（４）薄膜作製装置より基板を取り出し、マスクを取り外す。
（５）これにより、スポットアレイ3dが形成される。Example 2
(Example using mask vapor deposition)
FIG. 3 shows a method for producing a spot array on a substrate, for example, a glass substrate, by mask vapor deposition.
(1) A glass substrate 3a is prepared.
(2) A mask 3b having spot-like fine holes is brought into close contact with the surface of the glass substrate 3a and set in a thin film production apparatus.
(3) On the substrate 3a with the mask 3b, for example, a nickel material, which is one of magnetic materials, is deposited by a vacuum evaporation method or a sputtering method to produce a nickel thin film 3c having a thickness of about 100 nm.
(4) Remove the substrate from the thin film production apparatus and remove the mask.
(5) Thereby, the spot array 3d is formed.
以上の方法に作製したスポットアレイチップの磁化の方法を図４に示す。スポットアレイ4aは、図中矢印方向の磁界4bにさらすことで磁化される。磁界の方向4bは、チップ表面上に配置されたスポット4aに対して垂直あるいは平行でもよくスポットを磁化したい方向や細胞の固定化方法（4c、4d）によって適宜選択される。上記の磁化の方法としては、例えば、ＫＳ鋼、フェライト、ネオジム・鉄・ボロン、アルニコ、サマリウム・コバルト、プラセオジム等を材料とする永久磁石や、空芯コイルや磁気抵抗の少ない鉄芯を挿入したコイルによって構成される電磁石等によって形成される磁界中に挿入することなどが挙げられる。 FIG. 4 shows a magnetization method of the spot array chip manufactured by the above method. The spot array 4a is magnetized by exposure to a magnetic field 4b in the direction of the arrow in the figure. The direction 4b of the magnetic field may be perpendicular or parallel to the spot 4a arranged on the chip surface, and is appropriately selected depending on the direction in which the spot is to be magnetized and the cell immobilization method (4c, 4d). As the above-mentioned magnetization method, for example, a permanent magnet made of KS steel, ferrite, neodymium / iron / boron, alnico, samarium / cobalt, praseodymium, etc., an air core coil, or an iron core with low magnetic resistance is inserted. For example, it may be inserted into a magnetic field formed by an electromagnet constituted by a coil.
磁化したスポットアレイチップに、磁気ビーズを結合させたＢリンパ球を播種、採取する方法を図５とともに以下に示す。尚、図５の（A）は、下記の工程(2)についての説明図であり、(B)は、下記の工程(7) についての説明図である。 A method for seeding and collecting B lymphocytes bound with magnetic beads on a magnetized spot array chip will be described below with reference to FIG. 5A is an explanatory diagram for the following step (2), and FIG. 5B is an explanatory diagram for the following step (7).
（１）末梢血をヘパリン採血したものを100μLチューブに入れ、そこへカルシウム指示薬Fluo-4/AM（Molecular Probe社）最終濃度4μM、CellTracker Orange（Molecular Probe社）最終濃度１μM、Pluronic F-127（Molecular Probe社）最終濃度0.02%となるように加え室温で３０分インキュベーションした。この時同時に5μLの抗CD20抗体が結合した磁気ビーズ（250nm、Clemente Associates, Madison, CT）を加え、インキュベーションを行った。この操作により、細胞にFluo-4およびCellTracker Orangeを負荷し、同時にBリンパ球にのみ磁気ビーズが結合させることができる。細胞内に取り込まれなかったFluo-4、CellTracker OrangeはRPMI1640/10% FCS溶液で細胞洗浄することにより除去し、その後細胞をRPMI1640/10% FCS溶液に懸濁した。
（２）スポットアレイチップ5a上に、（１）で蛍光色素を付加しさらに磁気ビーズを結合させた血液検体を滴下し、チップ5aに対して一様な垂直磁界下に暴露し、スポット5bを表面に対して垂直方向に磁化させた。この操作によって磁気ビーズ修飾されたBリンパ球5cはスポット上に吸着される。なお、Bリンパ球5cの直径は約８ミクロンである。
（３）スポットアレイチップ5a上の不要な検体は、ピペットによる吸引操作や洗浄操作によって除去する。スポット5bは磁化されたままであるので、これらの操作によって吸着しているBリンパ球5cが取り除かれず、吸着していない不要な顆粒球、Tリンパ球等は除去される。以上（２）（３）の操作を適宜回数繰り返す。
（４）スポットアレイチップ5aをマイクロスキャナーCRBIOIIe-FITC（日立ソフトウェアエンジニアリング（株））に挿入し、解像度2.5μmでスキャンしデータを保存する（抗原刺激前の蛍光のデータ：A）。
（５）次に、スポットアレイチップ5a上のRPMI1640/10% FCS溶液を除き、そこへRPMI1640/10% FCS溶液に溶解させた抗原（10μg/mL）を加える。抗原を加えて１分後にスポットアレイチップをマイクロアレイスキャナーに挿入し、解像度2.5μmでスキャンしデータを保存する（抗原刺激後の蛍光のデータ：B）。
（６）ここで刺激前後の蛍光強度の比（B/A）を計算し、比の大きいスポットを特定する。このスポット上に抗原特異的Bリンパ球が存在する。
（７）スポット5bに固定された抗原特異的なBリンパ球5eをマイクロキャピラリーピペット5dで吸引回収する。あるいは、任意のスポット5bを消磁させ、洗浄により回収してもよいし、逆に必要のないBリンパ球5cが固定されたスポット5bを消磁させ、洗浄、目的のBリンパ球5eを残す方法でもよい。(1) Peripheral blood collected from heparin is put into a 100 μL tube, and calcium indicator Fluo-4 / AM (Molecular Probe) final concentration 4 μM, CellTracker Orange (Molecular Probe) final concentration 1 μM, Pluronic F-127 ( Molecular Probe) was added to a final concentration of 0.02% and incubated at room temperature for 30 minutes. At the same time, 5 μL of anti-CD20 antibody-bound magnetic beads (250 nm, Clemente Associates, Madison, CT) were added and incubated. By this operation, the cells can be loaded with Fluo-4 and CellTracker Orange, and at the same time, magnetic beads can be bound only to B lymphocytes. Fluo-4 and CellTracker Orange that were not taken up into the cells were removed by washing the cells with RPMI1640 / 10% FCS solution, and then the cells were suspended in RPMI1640 / 10% FCS solution.
(2) On the spot array chip 5a, drop a blood sample to which a fluorescent dye has been added in (1) and further bound with magnetic beads, and expose it to the chip 5a in a uniform vertical magnetic field. Magnetization was performed in a direction perpendicular to the surface. By this operation, B lymphocyte 5c modified with magnetic beads is adsorbed on the spot. The diameter of B lymphocyte 5c is about 8 microns.
(3) Unnecessary specimens on the spot array chip 5a are removed by a suction operation or a washing operation using a pipette. Since the spot 5b remains magnetized, the adsorbed B lymphocytes 5c are not removed by these operations, and unnecessary unadsorbed granulocytes, T lymphocytes, and the like are removed. The operations (2) and (3) are repeated as appropriate.
(4) The spot array chip 5a is inserted into the micro scanner CRBIOIIe-FITC (Hitachi Software Engineering Co., Ltd.), scanned at a resolution of 2.5 μm and stored (fluorescence data before antigen stimulation: A).
(5) Next, the RPMI1640 / 10% FCS solution on the spot array chip 5a is removed, and the antigen (10 μg / mL) dissolved in the RPMI1640 / 10% FCS solution is added thereto. One minute after adding the antigen, the spot array chip is inserted into a microarray scanner, scanned at a resolution of 2.5 μm, and data is stored (fluorescence data after antigen stimulation: B).
(6) Here, the ratio (B / A) of fluorescence intensity before and after stimulation is calculated, and a spot having a large ratio is specified. Antigen-specific B lymphocytes are present on this spot.
(7) The antigen-specific B lymphocyte 5e fixed to the spot 5b is collected by aspiration with a microcapillary pipette 5d. Alternatively, any spot 5b may be demagnetized and recovered by washing, or conversely, a spot 5b to which unnecessary B lymphocytes 5c are fixed is demagnetized and washed to leave the target B lymphocyte 5e. Good.
図6 に、図5に示した、リンパ球細胞回収実験結果の例を示す。図6 (A) は回収前の蛍光顕微鏡像を示しており、10 μmφのスポットアレイ 6a に、直径約250 nm の磁気ビーズで修飾されたヒト検体リンパ球細胞 6b が固定されている。マイクロキャピラリーピペット 6c によって細胞を回収した後の観察図を、図6 (B) に示す。この時、リンパ球細胞 6b を固定する磁力はピペットの吸引圧力に対して十分低下しており、リンパ球細胞 6bがピペットにより回収された。 FIG. 6 shows an example of the lymphocyte cell recovery experiment result shown in FIG. FIG. 6 (A) shows a fluorescence microscopic image before recovery. Human specimen lymphocyte cells 6b modified with magnetic beads having a diameter of about 250 nm are immobilized on a 10 μmφ spot array 6a. FIG. 6 (B) shows an observation after the cells are collected by the microcapillary pipette 6c. At this time, the magnetic force for fixing the lymphocyte cell 6b was sufficiently reduced with respect to the suction pressure of the pipette, and the lymphocyte cell 6b was recovered by the pipette.
本発明のスポットアレイチップでは、細胞が確実に回収出来る細胞チップとして、免疫医療器具として将来需要が高まると考えられる。また、作製時に複雑で高価な設備を利用することなく大量生産することが出来るため、産業化も容易である。 In the spot array chip of the present invention, it is considered that demand in the future will increase as an immunomedical device as a cell chip capable of reliably collecting cells. Moreover, since it can be mass-produced without using complicated and expensive equipment at the time of production, industrialization is also easy.
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